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CN108815160A - 一种雷帕霉素脂质体纳米粒及其制备方法 - Google Patents

一种雷帕霉素脂质体纳米粒及其制备方法 Download PDF

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CN108815160A
CN108815160A CN201810792191.8A CN201810792191A CN108815160A CN 108815160 A CN108815160 A CN 108815160A CN 201810792191 A CN201810792191 A CN 201810792191A CN 108815160 A CN108815160 A CN 108815160A
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nano granule
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Abstract

本发明公开了一种雷帕霉素脂质体纳米粒及其制备方法。所述纳米粒按质量份数计由以下原料制成：雷帕霉素1份，磷脂1‑20份。所述纳米粒还可以包括胆固醇等稳定剂，与雷帕霉素的配比按为：1:0.1‑0.8。其制备方法为：将原料雷帕霉素、磷脂或稳定剂按配比溶于有机溶剂中，得油相溶液；将油相溶液加入水相溶液中，室温搅拌，超声破碎，40℃旋转蒸发，即得所述纳米粒。本发明大幅度地提高了雷帕霉素在体内的生物利用度，具有缓释作用和靶向作用，减少毒副作用；可通过注射给药，使雷帕霉素给药方式不再受支架的限制，从而可根据病情的不同时限，调整给药剂量，具有重大的意义。

Description

一种雷帕霉素脂质体纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及雷帕霉素的剂型改进，尤其是一种雷帕霉素脂质体纳米粒及其制备方法。
背景技术
动脉粥样硬化所导致的心脑血管疾病严重威胁人类健康，晚期患者致死致残率高，造成巨大的社会负担和医疗支出，而缺乏特异性的靶向治疗一直是动脉粥样硬化治疗的瓶颈问题之一。目前对于动脉粥样硬化的发生机制学说较多，但具体机制仍尚不明确，而血管平滑肌细胞的病理改变被认为是动脉粥样硬化的重要病理特征。经皮心脏介入术和血管内支架放置是目前治疗血管内狭窄的主要手段，但支架内再狭窄率仍高达15％～25％。临床大多以雷帕霉素等药物涂层支架解决再狭窄问题，但仍然存在以下弊端：1.晚期支架血栓形成。被认为与支架上的抗增殖药物在抑制血管平滑肌细胞过度增殖的同时，也抑制血管内皮层的生长，影响血管损伤处的自然愈合有关；2、支架内再狭窄。当药物涂层完全释放后，药效消失，导致再狭窄发生率逐渐上升。研究报道，药物涂层支架置入36个月，MACE(支架内再狭窄、心肌梗塞、心源性死亡)的发生率由12个月的4.2％上升至15.7％。
雷帕霉素是一种疏水性大环内酯类免疫抑制剂，通过与相应免疫嗜素RMBP结合抑制细胞周期G0期和G1期，阻断G1进入S期而发挥作用。是具有低毒性的强有力的免疫抑制剂，广泛应用于移植手术中。研究发现，雷帕霉素还能有效抑制血管损伤后血管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而减少血管再狭窄的发生，故是药物洗脱支架中最常用的药物。由于雷帕霉素的水溶性极差，影响了其在胃肠道的吸收率，导致口服液和片剂的生物利用度都很低，口服给药的生物利用度仅有15％，故该药物全身给药的疗效不佳。在治疗动脉粥样硬化相关的疾病中一直采用药物涂层于支架的方法，局部用药于动脉粥样硬化病变，虽广泛应用于临床，但由于给药方式、剂量、给药时间受到限制等因素，且易造成晚期支架内血栓形成和支架内再狭窄等临床安全性问题，故研发出新的给药剂型，给药方式，使雷帕霉素治疗动脉粥样硬化引起的相关疾病不再受支架的限制，从而根据病情的不同时限，调整给药剂量，具有重大的意义。
发明内容
本发明提供了一种雷帕霉素脂质体纳米粒及其冻干粉针剂，并进一步公开其制备方法。该纳米粒具有均一且稳定的粒径分布，稳定的包封率和载药量，大幅度提高了药物的水溶性和安全性及生物利用度。
本发明的雷帕霉素脂质体纳米粒，按质量份数计由以下原料制成：雷帕霉素1份，磷
脂1-20份，优选配比为：雷帕霉素1份，磷脂3-10份。
所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、二磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
所述纳米粒还包括稳定剂，所述稳定剂与雷帕霉素的配比按为：1:0.1-0.8，所述稳定剂为胆固醇、胆固醇硫酸酯钠，或多烯酸乙酯中的一种或几种。
所述纳米粒优选平均粒径为50-200nm，载药量为1-15％，包封率为85％以上的纳米粒。
所述纳米粒的制备方法包括以下步骤：
(1)将原料雷帕霉素、磷脂或稳定剂按配比溶于有机溶剂中，得油相溶液；
(2)将上述油相溶液缓慢加入水相溶液中，室温搅拌，均质，40℃旋转蒸发，即得所述纳米粒。
所述有机溶剂优选二氯甲烷。所述水相溶液优选蒸馏水、生理冲液，细胞培养液，体液，组织液，缓冲液或葡萄糖注射液。
本发明所述冻干粉针剂，还包括冻干保护剂，占纳米粒的质量比为：3％-10％，所述冻干保护剂为乳糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖中的一种或几种。其制备方法为：将本发明纳米粒按配比加入冻干保护剂，经无菌过滤，冷冻干燥，即得。
本发明相对于现有的雷帕霉素药用产品，具有以下优点：
1、本发明的雷帕霉素脂质体纳米粒，大幅度提高了雷帕霉素在水相中的溶解度，进而提高其在体内的生物利用度。
2、可通过注射给药，使雷帕霉素给药方式不再受支架的限制，从而可根据病情的不同时限，调整给药剂量，具有重大的意义。
3、本发明的纳米粒，具有缓释作用，减少毒副作用。而作为雷帕霉素载体的磷脂类和胆固醇类，在体内的生理条件下可以自然降解，从而被吸收并通过代谢排出体内，不会对机体产生刺激或异物反应，安全有效。
4、经动物实验证明，雷帕霉素脂质体纳米粒注射液，能有效地预防和治疗动脉粥样硬化相关的疾病和血管损伤后狭窄，有效预防血管过度增生。
5、制备方法简单，工艺稳定，适合规模生产，产品稳定，保质期长。
附图说明
图1是雷帕霉素脂质体纳米粒的时效曲线；
图2是雷帕霉素脂质体纳米粒的量效曲线；
图3是雷帕霉素脂质体对动脉粥样硬化的治疗结果分析图；
图4是雷帕霉素脂质体对血管内狭窄的作用结果分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，以下实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，40mg磷脂，3.75mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入24mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例2：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取15mg雷帕霉素，90mg磷脂，11.25mg胆固醇，溶于4mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入40mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例3：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取20mg雷帕霉素，100mg磷脂，15mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例4：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取100mg雷帕霉素，500mg磷脂，75mg胆固醇，溶于10mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入100mL水相中，机械搅拌120min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例5：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取50mg雷帕霉素，350mg磷脂，31.5mg胆固醇，溶于10mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入100mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例6：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取50mg雷帕霉素，400mg磷脂，31.5mg胆固醇，溶于7mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入100mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例7：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取150mg雷帕霉素，750mg磷脂，112.5mg胆固醇，溶于15mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入150ml水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例8：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取15mg雷帕霉素，105mg磷脂，11.25mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例9：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取40mg雷帕霉素，200mg磷脂，30mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌100min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例10：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取40mg雷帕霉素，280mg磷脂，30mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌100min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例11：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取80mg雷帕霉素，400mg磷脂，60mg胆固醇，溶于10mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入100mL水相中，机械搅拌100min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例12：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，60mg磷脂，2.14mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入24mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例13：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，65mg磷脂，2.14mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入24mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例14：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取40mg雷帕霉素，400mg磷脂，30mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例15：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取15mg雷帕霉素，150mg磷脂，11.25mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例16：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，15mg磷脂，0.5mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入30mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例17：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取15mg雷帕霉素，45mg磷脂，12mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例18：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取40mg雷帕霉素，120mg磷脂，32mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。，加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例19：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，30mg磷脂，0.5mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入30mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例20：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，15mg磷脂，2.14mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入24mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例21：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取40mg雷帕霉素，120mg磷脂，17.12mg胆固醇，溶于5mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入50mL水相中，机械搅拌120min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例22：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，20mg磷脂，2.14mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入24mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实施例23：雷帕霉素脂质体纳米粒的制备
精密称取5mg雷帕霉素，30mg磷脂，3.75mg胆固醇，溶于3mL二氯甲烷中。然后将该有机混合液缓慢逐滴滴加入30mL水相中，机械搅拌60min，搅拌完后，均质机(900bar)均质3次，40℃旋转蒸发15min。得雷帕霉素脂质体纳米粒。加入5％的乳糖，无菌过滤，罐装，冷冻干燥即可。
实验例1：评价实施例1-23所制备的雷帕霉素置换字体纳米粒冻干品，评价标准为外观，再分散性，平均粒径和包封率。
外观：以维持原体积，不坍陷，不皱缩，色泽均匀，无花斑，质地细腻为佳。
再分散性：取各实施例的冻干脂质体样品一只，加入注射用水复溶，震摇分散后，能很快得到均匀的溶液者为佳，震摇次数越少，在分散性越好。
平均粒径：采用马尔文激光粒度仪测定脂质体的粒径及粒径分布，其原理为利用粒子被光照射时发生光散射以及光发生衍射的特征，并光的散射强度和衍射强度与粒子大小以及光学特征有关的原理来测定粒子大小。
包封率：包封率在80％以上较佳。
包封率测定方法：将脂质体过0.22μm滤膜，取滤液测包封进去的药量；同时，参照含量测定项方法，测定药物总含量。
药物含量采用高效液相色谱法测定，以甲醇-乙腈-水(体积比为43：:40:17)为流动相，流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长为278nm。
包封率计算公式为：包封率＝包封的药量/主药总含量X 100％
表1.脂质体的包封率，载药量和平均粒径的变化
以上结果表明，本发明的雷帕霉素脂质体纳米粒的包封率在80％以上，根据本领域的认识，药物包封率在80％以上就说明产品合格。
实验例2长期稳定性考察
将得到合格的脂质体冻干品放置在2-8℃的恒温恒湿环境中放置24个月，并分别考察其平均粒径，包封率和含量的变化情况，结果见下表2。
实验例3特殊安全性实验
血管刺激性实验：取健康新西兰大白兔6只，随机分成2组，每组3只新西兰大白兔，二元静脉分别注射氯化钠注射液和本发明的脂质体纳米粒注射液，注射量为0.5ml。每日注射一次，连续3天，观察兔耳缘静脉刺激反应。与氯化钠注射组相比，脂质体纳米粒注射液组的3只新西兰大白兔的耳缘静脉均管壁完整，血管无明显扩张，管壁及周围无明显炎症细胞浸润，管壁内未见血栓形成等病变。
溶血性实验：用0.9％氯化钠注射液配成2％红细胞混悬液，0.9％氯化钠溶液作空白对照组，蒸馏水作阳性对照组，在37℃温育0.5,1,2,3小时后分别观察结果。判定结果：全部溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明红色或棕红色，管底有少量红细胞；无溶血：红细胞全部下沉，上层液透明乳白色。溶血性实验结果见下表3。
项目 0.5h 1h 2h 3h
阴性对照组 全部溶血 全部溶血 全部溶血 全部溶血
阳性对照组 无溶血 无溶血 无溶血 无溶血
实验组 无溶血 无溶血 无溶血 无溶血
实验例4：雷帕霉素脂质体纳米粒的平滑肌细胞增值实验
1、取以上方法制备包封率80％以上，平均粒径为50-200nm，载药量为1-15％的纳米粒，使用MTT试剂盒法以及人肿瘤源性平滑肌细胞进行细胞增值实验，人肿瘤源性平滑肌细胞以1x103个/孔的接种量接种于96孔板中，5％CO2，37℃培养箱中培养24小时，分别按给药浓度为60，40，30，20,10,1,0.1，0.01ug/ml给药，连续观察不同浓度药物和加药后培养不同时间的细胞活性。结果显示，与雷帕霉素原料药组对比，雷帕霉素脂质体刚开始时抑制率突然增大，然后再降低，24小时后，又开始上升，在50小时时又开始缓慢下降。表明把雷帕霉素包裹在脂质体中，增加了其对细胞膜的亲和力，使药物能在短时间内快速起效，然后药物再缓慢释放，使其对细胞的作用在突释完后再持续作用，而雷帕霉素原料药因为游离状态下，要被细胞吸收后才能起作用，故起作用缓慢。而且把雷帕霉素制备成脂质体，对细胞的抑制作用大大增强。表明雷帕霉素脂质体纳米粒具有一定的缓释增效和增加了雷帕霉素水溶性的作用。其中原料配比为雷帕霉素1份，磷脂5-8份的纳米粒的药效明显优于原料药组及其他配比组。实验的时效曲线和量效曲线见图1及图2。
实验例5.雷帕霉素脂质体纳米粒注射剂对小鼠动脉粥样硬化的预防作用
动物：载脂蛋白基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)，18-25g，购自北京大学实验动物部。
动脉粥样硬化模型小鼠的制备：在SPF级环境(室温：23℃，相对湿度：65％，12h明暗交替)饲养至8周龄后，开始喂养高脂饲料和静脉注射给药。给药方案见组别和给药方案，取血管染色，计算斑块面积所占分数，斑块面积分数计算公式为:AA∶AA＝P/P0。数据用均值土标准差表示，统计学分析采用t检验，P〈0.05有显著性差异，所有数据均通过软件进行分析。
组别及给药方案：空白组：生理盐水，静脉注射，每两天注射一次，体积为0.2ml；对照组：雷帕霉素原溶液，用生理盐水稀释到所需浓度(给药量0.5mg/kg)，静脉注射，每两天注射一次；药物组：分为高中低剂量组(给药量：高剂量组1.5mg/kg,中剂量组0.5mg/kg，低剂量组0.25mg/kg)，静脉注射，每两天注射一次，连续3个月。期间，观察小鼠状态变化。
对动脉粥样硬化的预防结果：斑块面积占整条主动脉面积的百分比A0/A分别为：正常对照组：0；造模组：40.07％±11.55％；雷帕霉素原料药组：6.2％±1.21％；雷帕霉素纳米给药系统低剂量组：10.61％±4.58％；雷帕霉素纳米给药系统中剂量组：7.10％±4.22％；雷帕霉素纳米给药系统高剂量组：8.97％±3.22％；数据进行方差分析，p<0.05，差异具有统计学意义。从预防动脉粥样硬化结果来看，本发明药物雷帕霉素脂质体纳米粒注射剂具有良好的预防动脉粥样硬化的作用。
实验例6.雷帕霉素脂质体纳米粒注射剂对小鼠动脉粥样硬化的治疗作用
动物：载脂蛋白基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)，18-25g，购自北京大学实验动物部。
动脉粥样硬化模型小鼠的制备：在SPF级环境(室温：23℃，相对湿度：65％，12h明暗交替)饲养至8周龄后，开始喂养高脂饲料，喂食高脂饲料12周后，建模成功，开始给药。给药方案见组别和给药方案，取血管染色，计算斑块面积所占分数，斑块面积分数计算公式为:AA∶AA＝P/P0。数据用均值土标准差表示，统计学分析采用t检验，P〈0.05有显著性差异，所有数据均通过软件进行分析。
组别及给药方案：空白组：生理盐水，静脉注射，每两天注射一次，体积为0.2ml；对照组：雷帕霉素原溶液，用生理盐水稀释到所需浓度(给药量0.5mg/kg)，静脉注射，每两天注射一次；药物组：分为高中低剂量组(给药量：高剂量组1.5mg/kg,中剂量组0.5mg/kg，低剂量组0.25mg/kg)，静脉注射，每两天注射一次，连续3个月。期间，观察小鼠状态变化。
对动脉粥样硬化的预防结果见图3，斑块面积占整条主动脉面积的百分比A0/A分别为：正常对照组：；造模组：40.49％±6.29％；雷帕霉素原料药组：26.94％±4.71％；雷帕霉素纳米给药系统低剂量组：26.94％±4.71％；雷帕霉素纳米给药系统中剂量组：19.90％±9.34％；雷帕霉素纳米给药系统高剂量组：20.21％±8.12％；方差分析，p<0.05，差异具有统计学意义。从治疗动脉粥样硬化结果来看，本发明药物雷帕霉素脂质体纳米粒注射剂具有良好的治疗动脉粥样硬化的作用。
实验例7.雷帕霉素脂质体纳米粒注射剂对大鼠血管狭窄的预防作用
动物：SD大鼠，180-250g，购自南方医科大学
血管狭窄模型的制备：大鼠普通环境饲养一周后，10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠后，称重。固定大鼠于手术台上，颈部皮肤消毒，于拟定切口剪开皮肤，逐层钝性分离肌肉，找到左颈总动脉，分离左颈总动脉，结扎远心端，用止血夹临时关闭近心端。检查2F Fogarty球囊导管是否漏气，肝素生理盐水润洗。在结扎段左颈总动脉剪出一“U”型切口，于切口处插入球囊导管，充盈球囊后回拉导管，重复拉伤3-4次。拉出导管，结扎血管，缝合皮肤，并肌肉注射硫酸庆大霉素，归笼等大鼠苏醒。苏醒后，立即给药。
组别和给药方案：空白组：生理盐水，静脉注射，每两天注射一次，体积为0.2ml；对照组：雷帕霉素原溶液，用生理盐水稀释到所需浓度(给药量0.5mg/kg)，静脉注射，每两天注射一次；药物组：分为高中低剂量组(给药量：高剂量组1.5mg/kg,中剂量组0.5mg/kg，低剂量组0.25mg/kg)，静脉注射，每两天注射一次，连续2个月。期间，观察大鼠状态变化。数据用均值土标准差表示，统计学分析采用t检验，P〈0.05有显著性差异，所有数据均通过软件进行分析。
对血管内狭窄的预防结果见图4，通过对整条血管进行苏丹Ⅳ染色观察发现，空白组血管薄而富有弹性；造模组血管内膜明显增厚；雷帕霉素纳米给药系统组的中剂量组和高剂量组的内膜几乎没有增厚，血管壁柔软有弹性；雷帕霉素原料药组和低剂量组有轻微增厚。病理切片HE染色后观察发现，造模组内膜增厚明显，给药组中剂量组和高剂量组几乎没有发现内膜增厚，雷帕霉素原料药组和低剂量组内膜有小量增厚。各组的I/M值为:空白组0；造模组162.8％±0.8％；雷帕霉素原料药组2.44％±1.58％，雷帕霉素纳米给药系统低剂量组49.16％±27.88％；雷帕霉素纳米给药系统中剂量组0.63％±0.19％；雷帕霉素纳米给药系统高剂量组0.205％±0.005％。方差分析p<0.05，差异具有统计学意义。从预防血管内狭窄的结果来看，本发明药物雷帕霉素脂质体纳米粒注射剂具有良好的预防血管内狭窄的作用。

Claims (10)

1.一种雷帕霉素脂质体纳米粒，其特征在于，所述纳米粒按质量份数计由以下原料制成：雷帕霉素1份，磷脂1-20份。
2.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述原料配比为：雷帕霉素1份，磷脂5-8份。
3.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、二磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、氢化卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒还包括稳定剂，所述稳定剂与雷帕霉素的配比按为：1:0.1-0.8，所述稳定剂为胆固醇、胆固醇硫酸酯钠，或多烯酸乙酯中的一种或几种。
5.如权利要求1至4任一权利要求所述的纳米粒，其特征在于，其平均粒径为50-200nm，载药量为1-15％，包封率为85％以上。
6.如权利要求1所述纳米粒的冻干粉针剂，其特征在于，所述冻干粉针剂还包括冻干保护剂，占纳米粒的质量比为：3％-10％，所述冻干保护剂为乳糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖中的一种或几种。
7.如权利要求1或4所述纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将原料雷帕霉素、磷脂或稳定剂按配比溶于有机溶剂中，得油相溶液；
(2)将上述油相溶液缓慢加入水相溶液中，室温搅拌，均质，40℃旋转蒸发，即得所述纳米粒。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水相溶液为蒸馏水、生理冲液，细胞培养液，体液，组织液，缓冲液或葡萄糖注射液。
10.如权利要求6所述纳米粒冻干粉针剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将原料雷帕霉素、磷脂或稳定剂按配比溶于有机溶剂中，得油相溶液；
(2)将上述油相溶液缓慢滴入水相溶液中，室温搅拌，均质，40℃旋转蒸发，即得所述纳米粒；
(3)将上述纳米粒按配比加入冻干保护剂，经无菌过滤，冷冻干燥，得目标产品。
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