CN105567673A

CN105567673A - 扩增核酸的方法

Info

Publication number: CN105567673A
Application number: CN201510726154.3A
Authority: CN
Inventors: 铃木誓吾; 桐村浩哉; 浅沼浩之
Original assignee: Wan Shanhou; Nagoya University NUC; Sysmex Corp
Current assignee: Wan Shanhou; Nagoya University NUC; Sysmex Corp
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: US20160122809A1; EP3015555B1; CN105567673B; EP3015555A1; JP2016086694A; JP6491458B2; US10066261B2

Abstract

本发明涉及扩增核酸的方法。更具体而言，本发明涉及使用光应答性核酸，在基本上等温的条件下光照射依赖性地扩增核酸的方法。

Description

扩增核酸的方法

【技术领域】

本发明涉及扩增核酸的方法。

【背景技术】

PCR(聚合酶链式反应)法是在研究或医疗等的各种各样的领域中最广泛普及、利用的核酸扩增方法。在PCR法中，由重复反应液的加温和冷却的温度循环而重复双链核酸的变性、从引物的延伸链合成等，由此扩增核酸。另外，近年开发了不经温度循环，用一定的温度(大致60～70℃左右)进行的核酸扩增方法。作为那样的方法的代表例，可举出LAMP(环介导的恒温扩增)法(参照US6,410,278)。在LAMP法中，通过在一定的温度条件下引物与模板核酸结合而开始反应，一旦反应开始，则连续地进行反应，从而核酸被有效扩增。但是，由于是等温扩增，一旦反应开始，则连续地进行链取代反应，无法控制。所以，对应扩增反应中发生污染之时有困难。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明人以提供可在基本上等温的条件下扩增核酸，并且，可控制扩增反应的进行的新颖的核酸扩增方法作为课题。

【解决课题的技术方案】

本发明人为了解决上述的课题而锐意进行探讨的结果，令人惊讶地发现，光应答性核酸在一定的温度条件下与双链核酸之一方的链会合，使该双链核酸的另一链解离。于是，本发明人得到，通过使用此光应答性核酸，可光照射依赖性地控制双链核酸和引物的链交换反应及随后的核酸的扩增反应的见解，从而完成本发明。

本发明提供扩增核酸的方法。此方法包括，由第1波长的光的照射而使光应答性核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序(其中，双链核酸含第1核酸及第2核酸，第1核酸是单链，第2核酸是单链、并且有与第1核酸互补的核苷酸序列)、通过使光应答性核酸与第1核酸互补性地会合，从此第1核酸使第2核酸解离的工序、使第1引物互补性地会合于解离的第2核酸的工序、及由DNA合成酶，以第1引物作为起点而使互补链延伸的工序。此方法在基本上等温的条件下进行。

再者，本发明提供扩增核酸的方法。此方法包括，由第1波长的光的照射而使光应答性核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序(其中，双链核酸含第1核酸及第2核酸，第1核酸是单链，第2核酸是单链、并且有与第1核酸互补的核苷酸序列)、通过使光应答性核酸与第1核酸互补性地会合，从此第1核酸使第2核酸解离的工序、由作为与第1波长不同的波长的第2波长的光的照射而使光应答性核酸成为无法会合于第1核酸的形态的工序、使此光应答性核酸和第1核酸的会合解离的工序、使第2引物互补性地会合于解离的第1核酸的工序、及由DNA合成酶，以第2引物作为起点而使互补链延伸的工序。此方法在基本上等温的条件下进行。

【发明效果】

由本发明可实现可在基本上等温的条件下扩增核酸，并且，可由光照射控制扩增反应的进行的核酸扩增反应。

【附图说明】

【图1】是例示实施方式1的优选的反应原理的模式图。

【图2】是例示使偶氮苯结合的光应答性核酸的光应答的模式图。

【图3】是例示实施方式2的优选的反应原理的模式图。

【图4】是例示实施方式3的优选的反应原理的模式图。

【图5】是例示实施方式3的别的优选的反应原理的模式图。

【图6】是例示实施方式4的优选的反应原理的模式图。

【图7】是例示实施方式5的优选的反应原理的模式图。

【图8】是显示依赖于光照射而双链核酸被扩增的荧光图像。

【图9】是显示依赖于光照射的次数而双链核酸被扩增的荧光图像。

【图10】是显示依赖于光照射的次数而双链核酸被扩增的坐标图。

【实施方式】

在本实施方式的核酸扩增方法(以下也简称为“方法”)中，通过使用光应答性核酸，不经如用PCR法进行的温度循环，可由光照射控制双链核酸的扩增反应的进行。即，在本实施方式的方法中，不以用于使由模板核酸和互补链构成的双链核酸变性而解离的加热工序和用于使引物与模板核酸互补性地会合的冷却工序作为必要。从而，在基本上一定的温度温育反应系统即可。即，本实施方式的方法可在基本上等温的条件下进行。

反应系统是指，存在对于核酸扩增反应必要的因子，发生该核酸扩增反应的限定的场所或空间。在本实施方式中，作为反应系统，例如，可举出含双链核酸、光应答性核酸、引物、DNA合成酶及作为DNA合成酶的底物的dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP及dTTP的4种混合物)的、收容于可透过光的容器中的如反应液或乳液一样的微小液滴，但不限于这些。

在本说明书中，“双链核酸”是指，作为单链核酸的第1核酸和作为与该第1核酸以可会合的程度互补的单链核酸的第2核酸由氢键会合的状态的核酸。另外，形成茎－环结构的核酸也包括在“双链核酸”内。此时，以成为双链状态的“茎”部分中的一方的链作为第1核酸，另一链作为第2核酸。

在本说明书中，“互补性地会合的”的表述是指某多核苷酸的全部或一部分的区域在严格的条件下，与别的多核苷酸的全部或一部分的区域经氢键结合。在本说明书中，“互补性会合”和“杂交”在2个多核苷酸经氢键形成双链的点同义。再有，“严格的条件”只要是在进行多核苷酸的杂交时本领域技术人员一般使用的条件即可，例如，2个多核苷酸之间有至少90％、优选为至少95％的序列相同性时，可举出一个多核苷酸与另一个多核苷酸可特异性地杂交的条件。在杂交中的严格度被知是温度、盐浓度、多核苷酸的链长及GC含量、以及杂交缓冲液中含的离液剂的浓度的函数。作为严格的条件，例如，可使用Sambrook，J.等，1998，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2编)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork中记载的条件等。

在本说明书中，“完全地互补的碱基序列”是指对于某多核苷酸含的全部的碱基形成沃森-克里克模型的互补的碱基对的多核苷酸的碱基序列。

关于本实施方式的方法，接下来说明将由光应答性核酸解离的第2核酸作为模板，扩增核酸的实施方式(实施方式1)。再有，对于实施方式1，可参照在图1例示的优选的反应原理。在图1显示使用使偶氮苯结合的光应答性核酸时的反应原理。再有，在图1中，用有箭头的直线表示核酸链，在所述直线中有箭头的侧是核酸链的3'侧，其相反侧是5'侧。另外，在图1中，将双链核酸中的第1核酸以虚线表示，将第2核酸以实线表示。

在本实施方式中，首先进行，由第1波长的光的照射而使光应答性核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序。参照图1，则在此工序中，无法会合于第1核酸的形态的光应答性核酸(参照图1的(A))由可见光照射而成为可会合于第1核酸的形态(参照图1的(B))。

作为扩增对象的双链核酸也可为双链DNA、双链RNA、及单链RNA和单链DNA的杂交体之任何。另外，双链核酸的形状不特别限定，可为如质粒DNA一样的环状的双链核酸，也可为单链核酸在分子内互补性地自身会合的发夹状的双链核酸。双链核酸的来源不特别限定，可为基因组DNA等的天然来源的双链核酸，也可为自天然来源的核酸合成或扩增的双链核酸(例如mRNA-cDNA杂交体、双链cDNA等)。只要是可成为用于互补链合成的模板，双链核酸可用公知的标记物质等修饰，构成核酸的核苷酸也可被人工的衍生物取代。

在本说明书中，“光应答性核酸”是指使由指定的波长的光的照射异构化而立体结构变化的有机基结合1个以上的单链核酸。再有，使那样的有机基结合的核酸自体是在现有技术中公知的，例如，可举出WO01/21637中记载的光应答性寡核苷酸(参照WO01/21637，通过引用并入本说明书)。在本实施方式中，可利用由光照射的光应答性核酸中的有机基的立体结构的变化，可逆地进行与双链核酸的第1核酸的互补性会合及从会合状态的解离。作为用于光应答性核酸的核酸，可使用DNA或RNA。另外，也可为PS-寡核苷酸、PNA(肽核酸)、吗啉代寡核苷酸、2’O-取代RNA、BNA(桥核酸)等以往公知的人工核酸。在这些之中，也优选为DNA。

在光应答性核酸中，核酸和可给该核酸光应答性的有机基(以下也称为“光应答性有机基”)的结合样式是，只要结合至该有机基成为核酸的侧链部分，就不特别限定。其中，核酸的侧链部分是指与自构成核酸的各核苷酸的五碳糖分岐的碱基相当的部分。再有，核酸的主链是由构成核酸的核苷酸间的五碳糖和磷酸的结合构成的链。在本实施方式中，光应答性有机基与核酸的5’末端的核苷酸或3’末端的核苷酸结合时，也作为核酸的侧链部分结合的。作为光应答性有机基的与核酸的结合样式的例，可举出使有机基与核苷酸直接键合至成为核酸的侧链部分，或者，向核酸的主链插入适当的介在基，通过向此介在基连结有机基而间接向核酸结合有机基。那样的介在基可由本领域技术人员适宜确定，但例如，可举出由碳原子数1～10、优选为1～6的亚烷基、或者氨基酸或其衍生物构成的基等。

作为光应答性有机基，由指定的波长的光的照射，可从基本上平面状的结构向非平面状的结构可逆地异构化的基是适宜的。作为可作为那样的有机基使用的化合物，例如，可举出偶氮苯、均二苯乙烯、螺吡喃、及这些的衍生物等。知偶氮苯及均二苯乙烯由光照射而从反式异构化为顺式。知螺吡喃由光照射而从部花青型异构化为螺吡喃型。

在本实施方式中，作为光应答性核酸，优选为使其融解温度(Tm)与相同的碱基序列的核酸的Tm相比升高的光应答性有机基结合的核酸。作为那样的光应答性核酸，适宜地使用使选自偶氮苯及其衍生物的至少1种结合1个以上的核酸。偶氮苯的衍生物的种类只要不妨碍双链的形成，就不特别限定，但由于难发生由热的异构化，从而特别优选为二甲基偶氮苯。再有，结合偶氮苯或其衍生物的核酸自体是在现有技术中公知的，可一般制造或得到。

偶氮苯或其衍生物由波长400nm以上的可见光的照射而成平面状的反式体，由波长300～400nm的紫外光的照射而成立体的的形状的顺式体。从而，由可见光的照射，光应答性核酸中的偶氮苯成为不妨碍双链的形成的平面状的反式体，所以光应答性核酸可与指定的核酸链互补性地会合而形成双链。另一方面，由紫外光的照射，光应答性核酸中的偶氮苯或其衍生物成为立体的形状的顺式体，所以发生妨碍双链的形成的立体障碍。由此，光应答性核酸和指定的核酸链的双链解离。再有，可参照例示由结合偶氮苯或其衍生物的光应答性核酸的双链的形成和解离的模型示于图2。在示于图2的光应答性核酸中，偶氮苯经插入到核酸的主链的D-苏氨醇而结合至成为核酸的侧链部分，但本发明不限于此。

将使偶氮苯或其衍生物结合的光应答性核酸在本实施方式的方法中使用时，作为第1波长的光，可由波长400nm以上的可见光的照射，可使所述光应答性核酸成为会合于第1核酸的形态。

光应答性核酸中的光应答性有机基的数是，只要可由异构化解离双链，就不特别限定。例如，将光应答性有机基在光应答性核酸中以2～10个碱基1个光应答性有机基的比例导入即可。

在本说明书中，当言及光应答性核酸的碱基序列时，忽略与核酸结合的光应答性有机基，与通常的核酸的碱基序列同样地仅关注核苷酸的碱基部分。例如，当光应答性核酸是在指定的单链核酸结合多个偶氮苯或其衍生物之时，此光应答性核酸的碱基序列被认为是与其指定的单链核酸相同的碱基序列。

光应答性核酸的碱基序列是，只要是可与扩增对象的双链核酸的第1核酸互补性地会合的碱基序列，就不特别限定。在本实施方式中，光应答性核酸特别优选为有对于第1核酸的碱基序列完全地互补的碱基序列。

光应答性核酸的链长是，只要是可维持与第1核酸的互补会合的长度，就不特别限定，但通常有10～100核苷酸、优选为15～50核苷酸。再有，为了使光应答性核酸不提供成为互补链合成的起点的3'末端，也可在光应答性核酸的3'末端还附加1～数个与第1核酸不互补的碱基。另外，也可使用多种光应答性核酸。

在本实施方式的方法中，由光应答性核酸的碱基序列及链长确定在双链核酸的各链中的后述的第1引物及第2引物的可会合的区域。从而，光应答性核酸优选根据双链核酸中的要扩增的区域设计。

在本实施方式中，照射的光的波长(第1波长及后述的第2波长)可根据光应答性有机基的种类适宜设定。另外，光的照射时间也可根据光应答性有机基的种类适宜设定，但在偶氮苯的情况中，通常是1～300秒钟、优选为15～60秒钟。在重复扩增反应时，光的照射通常进行1～每300秒钟，优选为15～每60秒钟即可。光源是，只要是可向反应系统照射指定的波长的光，就不特别限定，例如，在偶氮苯的情况中，可举出水银灯与可见光滤光器的组合、指定的波长的LED等。

在本实施方式中，进行通过使如上述一样成为可会合于核酸链的形态的光应答性核酸与第1核酸互补性地会合，从该第1核酸使第2核酸解离的工序。参照图1，在此工序中，由双链核酸(参照图1的(C))和光应答性核酸(参照图1的(B))的链交换，光应答性核酸和第1核酸形成双链，成为第2核酸自第1核酸解离的状态(参照图1的(D))。

此工序优选为，第2核酸在可由光应答性核酸链交换的状态下进行。这样的状态可在可发生在双链核酸中碱基对间的氢键的形成和解离的两方的条件下发生。作为那样的条件的具体例，可举出在是使用的引物的融解温度(Tm)附近，并且可维持DNA合成酶的活性的温度(例如，45～70℃、优选为55～65℃)温育反应系统，或者将后述的链交换反应促进物质添加到反应系统，但本发明不限于这些。在这样的条件下，当构成双链核酸的2条核酸链解离时，光应答性核酸可由其碱基序列的互补性与该双链核酸的第1核酸互补性地会合。由此，可使双链核酸的第2核酸解离。

第2核酸中的解离的部分的链长依赖于光应答性核酸的链长(更具体而言，与光应答性核酸中的第1核酸互补性地会合的部分的链长)。即，在本实施方式中，在光应答性核酸的链长相比双链核酸的链长更短时，第2核酸之一部分自第1核酸解离。在光应答性核酸的链长相比双链核酸的链长更长时，第2核酸的全部解离。

在本实施方式中，为了使光应答性核酸和第1核酸有效会合，在扩增反应开始时，优选使光应答性核酸的浓度相比双链核酸的浓度更高。各核酸的具体的浓度可由本领域技术人员适宜设定，但特别优选使光应答性核酸的浓度成为双链核酸的浓度的10倍以上。

为了使光应答性核酸和第1核酸有效会合，将本实施方式的方法在高盐浓度的条件下进行也有利。那样的盐是，只要不损伤核酸、并且不妨碍DNA合成反应，就不特别限定。例如，可举出NaCl、KCl等。作为盐浓度，期望在可维持2条核酸链互补性地会合的状态，并且DNA合成酶发挥功能的范围内设定。例如，在使用NaCl时，可设至1M的浓度。

为了使光应答性核酸和第1核酸有效会合，将本实施方式的方法在公知的链交换反应促进物质的存在下进行也有利。那样的链交换反应促进物质是在现有技术中公知的，例如，可举出选自阳离子性均聚物及阳离子性共聚物的至少1种。作为那样的阳离子性均聚物及阳离子性共聚物，例如，可举出赖氨酸、精氨酸、组氨酸等的氨基酸、葡萄糖胺等的糖、乙烯亚胺、二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯、二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯等的可形成如合成单体一样的阳离子性基的单体来源的均聚物及共聚物。

上述的阳离子性的均聚物或共聚物优选有用亲水性高分子侧链修饰的接枝型结构。这样的侧链(接枝链)例如，由选自聚乙二醇等的水溶性聚亚烷基二醇、葡聚糖、出芽短梗孢糖、直链淀粉、阿拉伯半乳聚糖等的水溶性多糖、含丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸等的亲水性氨基酸的水溶性聚氨基酸、将丙烯酰胺及其衍生物作为单体使用合成的水溶性高分子、将甲基丙烯酸及丙烯酸以及其衍生物(例如羟乙基甲基丙烯酸酯)作为单体使用合成的水溶性高分子、聚乙烯基醇及其衍生物的1种以上的水溶性高分子形成。再有，阳离子性的均聚物或共聚物的分子量、以及侧链修饰基自体的链长及接枝的程度不特别限定，可由本领域技术人员适宜设定。

在链交换反应促进物质之中，也特别优选作为阳离子性共聚物的聚L赖氨酸-葡聚糖共聚物(PLL-g-Dex)。再有，PLL-g-Dex自体在特开2001-78769号公报中被公开。

反应系统中的链交换反应促进物质的浓度是，只要核酸扩增反应不被抑制，就不特别限定，可由本领域技术人员适宜设定。

在本实施方式中，进行使第1引物互补性地会合于如上述一样解离的双链核酸的第2核酸的工序。参照图1，在此工序中，第1引物会合于解离的第2核酸，以第2核酸作为模板的扩增反应成为可能的状态(参照图1的(D)及(E))。

第1引物只要是与第2核酸在严格的条件下杂交，可提供成为互补链合成的起点的3'末端的寡核苷酸，就不特别限定。第1引物的链长通常是5～50核苷酸、优选为10～40核苷酸。另外，第1引物可基于扩增对象的核酸链的碱基序列适宜设计。再有，引物自体可由现有技术中公知的核酸合成方法制造。

在本实施方式中，光应答性核酸有可与第1核酸互补性地会合的碱基序列，第1引物有可与第2核酸互补性地会合的碱基序列。从而，可发生第1引物和光应答性核酸互补性地会合的情况。从而，为了使第1引物和光应答性核酸互补性地会合的概率减少，例如，也可设计第1引物至与第1引物中的第2核酸互补性地会合的部分的链长相比光应答性核酸的链长更短。

在本实施方式中，引物也可用公知的标记物质标记。另外，根据需要，也可向引物的5'末端附加指定的限制性内切酶的识别序列或标签序列等的功能的序列的寡核苷酸。

在本实施方式中，进行将会合于解离的第2核酸的第1引物作为起点，由DNA合成酶使互补链延伸的工序。参照图1，在此工序中，将解离的第2核酸作为模板，第1引物由DNA合成酶延伸，生成新的双链核酸(参照图1的(E)及(C))。

此工序是本实施方式的核酸扩增反应的最终工序。其中当反应不停止时，在所述工序生成的双链核酸，与在反应系统中自当初存在的双链核酸同样地，供于至今所述的一系列的工序，重复核酸扩增反应的循环。

本实施方式中使用的DNA合成酶是，只要有依赖于模板核酸的碱基序列而合成互补链的活性，就不特别限定，但特别优选为链取代型DNA聚合酶。在本实施方式的方法中，当光应答性核酸的链长相比扩增对象的双链核酸更短时，存在不解离为双链核酸的部分，但只要使用链取代型DNA聚合酶，就可一边解离此不解离的部分一边延伸引物。再有，链取代型DNA聚合酶是在现有技术中公知的，可一般得到。作为链取代型DNA聚合酶，例如，可举出BstDNA聚合酶、AacDNA聚合酶、CsaDNA聚合酶、BcaBEST(商标)DNA聚合酶、96-7聚合酶等。它们之中也特别优选为BstDNA聚合酶。

在本实施方式的方法中，也可向反应系统加用于适宜地进行由DNA合成酶的核酸扩增反应的添加剂。作为那样的添加剂，例如，可举出缓冲剂或盐类等。缓冲剂只要给DNA合成酶适宜的pH，就不特别限定。例如，可举出Tris-HCl、MES、磷酸缓冲剂等。另外，作为盐类，例如，可举出NaCl、KCl、(NH₄)₂SO₄等。再有，一般核酸扩增反应中使用的缓冲剂或盐类等的添加剂在现有技术中公知，一般可得到根据DNA合成酶的种类的适宜的添加剂。

关于本实施方式的方法，接下来说明以与光应答性核酸互补性地会合的第1核酸作为模板，扩增核酸的实施方式(实施方式2)。再有，对于实施方式2，可参照图3例示的优选的反应原理。在图3示，使用使偶氮苯结合的光应答性核酸时的反应原理。再有，在图3中，用有箭头的直线表示核酸链，在所述直线中有箭头的侧是核酸链的3'侧，其相反侧是5'侧。另外，在图3中，将双链核酸中的第1核酸用虚线表示，将第2核酸用实线表示。

在本实施方式中，首先进行由第1波长的光的照射使光应答性核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序(参照图3的(A)及(B))。接下来进行，通过使光应答性核酸与第1核酸互补性地会合，使双链核酸的第2核酸自第1核酸解离的工序(参照图3的(B)、(C)及(D))。这些工序的细节与对于实施方式1所述的相同。

在本实施方式中，进行由第2波长的光的照射而使光应答性核酸成为无法会合于第1核酸的形态的工序(参照图3的(D)及(A))。

第2波长的光只要是有与在使光应答性核酸成为可会合于第1核酸的形态的工序中照射的第1波长的光不同的波长，可使所述光应答性核酸的有机基立体异构化，使光应答性核酸成为无法会合于核酸链的形态的光即可。例如，在使用使偶氮苯或其衍生物结合的光应答性核酸时，通过作为第2波长的光照射波长300～400nm的紫外光，偶氮苯成为立体结构的顺式体，从而可使所述光应答性核酸成为无法会合于第1核酸的形态。

从照射第1波长的光至照射第2波长的光的时间间隔不特别限定而可适宜设定，但通常是1～300秒钟、优选为15～60秒钟。另外，第2波长的光的照射时间可根据光应答性核酸中使用的有机基的种类适宜设定，但在偶氮苯的情况中，通常是1～300秒钟、优选为5～60秒钟。在重复扩增反应时，在第2波长的光的照射后，通常1～300秒钟、优选为5～60秒钟后，照射第1波长的光即可。光源只要是可向反应系统照射指定的波长的光，就不特别限定，例如，在偶氮苯的情况中，可举出水银灯和紫外光滤光器的组合，指定的波长的LED等。

在本实施方式中，进行使成为如上述一样无法会合于核酸链的形态的光应答性核酸和第1核酸的会合解离的工序。在此工序中，由光应答性核酸的有机基的立体障碍，无法维持光应答性核酸的碱基和第1核酸的碱基之间的氢键，从而光应答性核酸和第1核酸解离(参照图3的(D)、(A)及(F))。

在本实施方式中，进行使第2引物互补性地会合于如上述一样解离的第1核酸的工序。参照图3，在此工序中，第2引物会合于解离的第1核酸(参照图3的(F))，以第1核酸作为模板的扩增反应成为可能的状态(参照图3的(G))。再有，第2引物只要是与第1核酸在严格的条件下杂交，可提供成为互补链合成的起点的3'末端的寡核苷酸，就不特别限定。另外，对于第2引物的链长、碱基序列、合成法、标记等与对于第1引物所述的相同。

在本实施方式中，进行以会合于第1核酸的第2引物作为起点，由DNA合成酶使互补链延伸的工序。参照图3，在此工序中，以第1核酸作为模板，第2引物由DNA合成酶延伸，生成新的双链核酸(参照图3的(G)及(C))。再有，对于DNA合成酶，与在实施方式1中所述的相同。

此工序是本实施方式的核酸扩增反应的最终工序。其中当反应不停止时，将在所述工序生成的双链核酸，与在反应系统中自当初存在的双链核酸同样地，供于至今所述的一系列的工序，重复核酸扩增反应的循环。

在本实施方式中，可进行组合上述的实施方式1及实施方式2的实施方式的核酸扩增方法。即，是使用第1引物及第2引物之一对引物扩增核酸的实施方式。接下来，对于此实施方式(实施方式3)进行说明。再有，对于实施方式3，可参照图4及图5例示的优选的反应原理。

在图4及图5示，使用使偶氮苯结合的光应答性核酸时的反应原理。在图4中，光应答性核酸的链长是与第1核酸相同的长度，在图5中，光应答性核酸的链长相比第1核酸更短，作为DNA合成酶推定使用链取代型DNA聚合酶。再有，在图4及图5中，用有箭头的直线表示核酸链，在所述直线中有箭头的侧是核酸链的3'侧，其相反侧是5'侧。另外，在图4及5中，将双链核酸中的第1核酸用虚线表示，将第2核酸用实线表示。

参照图4及5，如下说明实施方式3的一系列的工序。首先，如实施方式1一样地，使照射第1波长的光的光应答性核酸与第1核酸互补性地会合，使第2核酸自第1核酸解离(参照图4的(A)～(D)及图5的(a)～(d))。然后，使第1引物互补性地会合于解离的第2核酸(参照图4的(D)及(E)、图5的(d)及(e))、由DNA合成酶，以第1引物作为起点而使互补链延伸(参照图4的(E)及(C)、图5的(e)及(c))。由此，以第2核酸作为模板，扩增核酸。

再者，在图4中，如实施方式2一样地，由第2波长的光的照射，使光应答性核酸和第1核酸的会合解离(参照图4的(D)、(A)及(F))。然后，使第2引物互补性地会合于解离的第1核酸(参照图4的(F)及(G))、由DNA合成酶，以第2引物作为起点而使互补链延伸(参照图4的(G)及(C))。在图5中，与图4的途径不同，第2引物会合于第1核酸，将互补链合成至途中后(参照图5的(f)、(g)及(h))、第1核酸和光应答性核酸解离，合成完全的互补链(参照图5的(h)及(c))。但是，本发明不限于图5的途径。即，在光应答性核酸的链长相比第1核酸更短时，与图4的情况同样地，也可在光应答性核酸解离后，第2引物会合于第1核酸而合成互补链。由此，以双链核酸的第1核酸作为模板，扩增核酸。再有，对各工序的细节与在实施方式1及2中所述的相同。

在实施方式3中，在反应不停止时，将新生成的双链核酸，与在反应系统中自当初存在的双链核酸同样地，供于上述的一系列的工序，重复核酸扩增反应的循环。如此，在实施方式3的扩增反应中，通过交替照射互相不同的2个的波长的光，可合成双链核酸的各自的链的互补链而扩增双链核酸。即，通过重复上述的全部的工序而进行，可扩增自第1引物的延伸链和自第2引物的延伸链互补性地会合的核酸。

对于模板核酸有茎－环结构，使用2种光应答性核酸的实施方式(实施方式4及5)进行说明。对于实施方式4及5，可参照各自图6及图7例示的优选的反应原理。再有，在图6及图7中，用有箭头的直线表示核酸链，在所述直线中有箭头的侧是核酸链的3'侧，其相反侧是5'侧。另外，在图6及7中，将双链核酸的茎部分中的第1核酸用虚线表示，将第2核酸用实线表示。

以下，(A)～(G)对应于图6中的(A)～(G)。成为模板的双链核酸(称为模板核酸)有茎－环结构。模板核酸和第1及第2光应答性核酸接触，则成为双链状态的茎部分的第1核酸及第2核酸各自与第1光应答性核酸及第2光应答性核酸杂交(A)。向其照射紫外光，则第1及第2光应答性核酸成无法与核酸杂交的状态，从而自模板核酸分离(B)。光应答性核酸杂交的区域之一部分与第1及第2引物杂交(C)。以第1及第2引物作为起点，由DNA合成酶进行核酸扩增(D)。其中通过照射可见光(E)、使成为可与核酸杂交的状态的光应答性核酸接触模板核酸和自第1及第2引物的延伸链的复合物，通过光应答性核酸与模板核酸结合，自第1及第2引物的延伸链分离而生成扩增产物(F)。将结合光应答性核酸的模板核酸供于(B)～(F)的循环，在(F)中合成扩增产物。另一方面，此扩增产物与第1及第2光应答性核酸杂交，以下，进行与实施方式3同样的扩增，发生扩增产物(G)。再有，第1光应答性核酸和第2光应答性核酸优选不完全地互补至照射可见光的2种光应答性核酸不形成二聚体。

以下，(A)～(J)对应于图7中的(A)～(J)。实施方式5的(A)～(D)与实施方式4的(A)～(D)同样。在本实施方式中，引物的延伸反应中使用链取代型聚合酶。因此，从由第2引物的延伸，自第1引物的延伸链解离，形成自第2引物的延伸链和模板核酸的双链核酸(E)。通过由可见光的照射(F)而使成为与核酸可杂交的状态的光应答性核酸与自第2引物的延伸链和模板核酸的双链核酸杂交，自第2引物的延伸链作为有茎－环结构、并且与模板核酸互补的双链核酸解离(G)。与此模板核酸互补的双链核酸的茎部分(与第1核酸及第2核酸相当)有与模板核酸的茎部分相同的序列，环部分有与模板核酸的环部分互补的序列。由于环部分与本实施方式的核酸扩增循环不直接相关，所以与模板核酸互补的双链核酸也作为(A)往后的核酸扩增循环的模板使用。另一方面，通过由链取代型聚合酶的延伸反应(E)解离的自第1引物在的延伸链与第2引物杂交(H)、通过形成延伸链而合成双链核酸(I)。以此双链核酸作为模板，进行与实施方式3同样的扩增，生成扩增产物(J)。再有，第1光应答性核酸和第2光应答性核酸优选不完全地互补至照射可见光的2种光应答性核酸不形成二聚体。

本实施方式的方法是通过使用光应答性核酸及引物，经与双链核酸的解离、向模板核酸链的引物的会合及引物的延伸的PCR法同样的扩增反应循环，扩增双链核酸的反应。从而，本实施方式的方法被期待应用于自PCR法派生的各种变化方法。例如，本实施方式的方法可活用于在照射光的位置特异性地增加基因的原位核酸扩增。

扩增产物可由电泳等检测。另外，也可通过向反应液预先添加SYBR(注册商标)GREEN等的嵌入剂来实时监测扩增的。另外，也可通过使用标记发生荧光共振能量转移(FRET)的2种荧光物质的与模板核酸互补的探针来检测扩增产物的。例如，在2种荧光物质接近时，一个荧光物质使荧光消光，可由有外切核酸酶活性的核酸合成酶而引物延伸时所述探针分解，通过2种荧光物质被隔离作为发生荧光的构成。

在上述的扩增方法中，也可使用两种以上光应答性核酸的。例如，使用2种光应答性核酸时，在要解离的双链核酸的第2核酸的碱基序列中，可还使用和与结合第1光应答性核酸的区域不同的区域结合的第2光应答性核酸。结合第1光应答性核酸的区域和结合第2光应答性核酸的区域可在双链核酸的第2核酸的碱基序列中分开的位置，也可邻接。通过使用两种以上的光应答性核酸，即使在双链核酸有长的序列时，也可精确解离。

接下来，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【实施例1：使用光应答性核酸的核酸扩增反应的光照射依赖性的验证】

在本实施例中，对于是否可使用光应答性核酸，进行依赖于光照射的核酸扩增反应进行评价。

【(1)核酸及试剂的制备】

作为光应答性核酸，委托筑波OligoService株式会社合成每2个碱基结合1个2',6'-二甲基偶氮苯的单链DNA。接下来显示此光应答性核酸的序列。

5’-CT(Z)TT(Z)AA(Z)GA(Z)AG(Z)GA(Z)GA(Z)TA(Z)TA(Z)CC(Z)TG(Z)AG(Z)TG(Z)AT(Z)CT(Z)AG(Z)TG(Z)TA(Z)CT(Z)TA-3’(SEQIDNO:1)

在上述的序列中，(Z)表示2',6'-二甲基偶氮苯的插入位置。再有，2',6'-二甲基偶氮苯经插入到单链DNA的主链的D-苏氨醇，结合至成为核酸的侧链部分。

作为模板DNA，委托LifeTechnologies日本株式会社合成含与上述的光应答性核酸相同的碱基序列的50碱基的未修饰单链DNA。接下来示此单链DNA的序列。

5’-CTTTAAGAAGGAGATATACCTGAGTGATCTAGTGTACTTAGTATGCTTCC-3’(SEQIDNO:2)

作为第1引物，委托LifeTechnologies日本株式会社合成20个碱基的未修饰单链DNA。另外，作为第2引物，委托株式会社日本BioService合成将5’末端用德克萨斯红标记的20碱基的单链DNA。接下来示各引物的序列。

第1引物：5'-GGAAGCATACTAAGTACACT-3'(SEQIDNO:3)

第2引物：5’-德克萨斯红-CTTTAAGAAGGAGATATACC-3'(SEQIDNO:4)

作为链交换促进物质，使用作为阳离子性嵌段共聚物的聚L赖氨酸-葡聚糖共聚物(PLL-g-Dex)(PLL的分子量8000、接枝率90％)。另外，作为DNA合成酶，使用BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolab公司)。再有，在反应溶液中，稀释附带的10×ThermoPol缓冲液(NewEnglandBiolab公司)而使用。

【(2)核酸扩增】

各制备2个以下的4种样品。

·含模板DNA(终浓度10nM)及光应答性核酸(终浓度500nM)的样品

·含模板DNA(终浓度10nM)，但不含光应答性核酸的样品

·含光应答性核酸(终浓度500nM)，但不含模板DNA的样品

·不含模板DNA及光应答性核酸的样品

再有，上述之任何的样品中均含1×ThermoPol缓冲液溶液、第1引物(终浓度500nM)、第2引物(终浓度500nM)、PLL-g-Dex(终浓度78μM)、BstDNA聚合酶(终浓度0.4单位/μL)。

向0.2mL管各分注20μL上述的各样品，用粘带(ThermoScientific公司)封上。然后，将管由热循环仪PC320(ASTEC公司)于60℃加热10分钟。在此操作中，通过由第1引物合成模板DNA的互补链，合成作为本实施例的扩增对象的双链DNA。

各种的样品之中，另一样品用加热至60℃的热循环仪温育20分钟。在另一样品中，进行5次以下的(i)～(iv)的操作。

(i)将管移到加热到60℃的不锈钢制管架，将水银灯(超高压UV灯USH-1030L、Olympus株式会社)作为光源，从管的上部照射1分钟通过可见光滤光器(U-MNIBA3、Olympus株式会社)的光(波长470～495nm)。

(ii)将管返回到加热到60℃的热循环仪，温育1分钟。

(iii)将管移到加热到60℃的不锈钢制管架，将水银灯(超高压UV灯USH-1030L、Olympus株式会社)作为光源，从管的上部照射1分钟通过紫外光滤器(U-MWU2、Olympus株式会社)的光(波长330～385nm)。

(iv)将管返回到加热到60℃的热循环仪，温育1分钟。

从各管各取出10μL样品，向这些添加1M聚乙烯基硫酸钾溶液至最终浓度成0.1M。然后，于4℃静置90分钟。再者，向这些添加等量的甲酰胺装载溶液(95％甲酰胺、NaOH、2％溴酚蓝)，于95℃加热5分钟，得到电泳用样品。使得到的样品在含有4％尿素的20％丙烯酰胺凝胶中电泳(300V、30分钟)。然后，用分子成像仪(Bio-Rad公司)取得电泳后的凝胶的荧光图像。得到的图像示于图8。另外，将得到的荧光图像变换为tif文件，将自第2引物来源的扩增产物的荧光信号的强度用ImageJ软件(可从美国国立卫生研究所(NIH)的网址得到)数值化。

【(3)结果】

如图8所示，在不存在光应答性核酸，或者，在无光照射的条件下，即使模板DNA存在，也无法检测显示DNA的扩增的信号。对此，在光应答性核酸的存在下光照射时，确认发生对于模板DNA特异性的DNA合成(参照图8中的箭头部)。从而显示，可进行依赖于光照射的核酸扩增反应。

【实施例2：使用光应答性核酸的核酸扩增反应的对光照射次数的依赖性的验证】

在本实施例中，验证使用光应答性核酸的核酸扩增反应依赖于光照射的次数进行与否。

【(1)核酸及试剂的制备】

在本实施例中，使用与上述的实施例1相同的光应答性核酸、模板DNA、第1引物及第2引物。另外，与实施例1同样地，作为链交换促进物质使用PLL-g-Dex(PLL的分子量8000、接枝率90％)，作为DNA合成酶，使用BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolab公司)。再有，在反应溶液，稀释附带的10×ThermoPol缓冲液(NewEnglandBiolab公司)而使用。

【(2)核酸扩增】

制备4个含1×ThermoPol缓冲液溶液、模板DNA(终浓度10nM)、光应答性核酸(终浓度500nM)、第1引物(终浓度500nM)、第2引物(终浓度500nM)、PLL-g-Dex(终浓度78μM)及BstDNA聚合酶(终浓度0.4单位/μL)的样品。

向0.2mL管各分注20μL上述的样品，用粘带(ThermoScientific公司)封上。然后，将管由热循环仪PC320(ASTEC公司)于60℃加热10分钟。在此操作中，通过由第1引物合成模板DNA的互补链，合成作为本实施例的扩增对象的双链DNA。

对于4个样品，各自进行0、2、4及6次实施例1中记载的(i)～(iv)的操作。其后，与实施例1同样地，从各样品制备电泳用样品，使得到的样品在含有4％尿素的20％丙烯酰胺凝胶中电泳(300V、30分钟)。然后，用分子成像仪(Bio-Rad公司)取得电泳后的凝胶的荧光图像。得到的图像示于图9。另外，将得到的荧光图像变换为tif文件，将自第2引物来源的扩增产物的荧光信号的强度用ImageJ软件数值化，制成坐标图。制成的坐标图示于图10。

如示于图9及图10确认，光照射次数是0次之时完全检测不到信号，但随着光照射次数增加，合成的双链DNA来源的信号强度增加。如上所述显示，每当交替照射2个波长的光时重复扩增反应的循环，通过增加光照射的次数可增加DNA扩增量。

Claims

1.扩增核酸的方法，

其包括：

由第1波长的光的照射而使光应答性核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序、

其中，上述双链核酸含第1核酸及第2核酸，上述第1核酸是单链，上述第2核酸是单链、并且有与上述第1核酸互补的核苷酸序列的，

通过使上述光应答性核酸互补性地会合于上述第1核酸，从上述第1核酸解离上述第2核酸的工序、

使第1引物互补性地会合于解离的第2核酸的工序、及

由DNA合成酶，以上述第1引物作为起点而使互补链延伸的工序，

其在基本上等温的条件下进行。

2.扩增核酸的方法，

其包括：

由作为与上述第1波长不同的波长的第2波长的光的照射而使光应答性核酸成为无法会合于上述第1核酸的形态的工序、

使上述光应答性核酸和上述第1核酸的会合解离的工序、

使第2引物互补性地会合于解离的第1核酸的工序、及

由DNA合成酶，以上述第2引物作为起点而使互补链延伸的工序，

其在基本上等温的条件下进行。

3.权利要求1所述的方法，其还包括：

由作为与上述第1波长的不同的波长的第2波长的光的照射而使上述光应答性核酸成为无法会合于上述第1核酸的形态的工序、

使上述光应答性核酸和上述第1核酸的会合解离的工序、

使第2引物互补性地会合于解离的第1核酸的工序、及

由上述DNA合成酶，以上述第2引物作为起点而使互补链延伸的工序。

4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中上述光应答性核酸是结合1个以上选自偶氮苯及其衍生物的至少1种的核酸。

5.权利要求4所述的方法，其中通过照射上述第1波长的光，使上述选自偶氮苯及其衍生物的至少1种从顺式体变形为反式体，使上述光应答性核酸成为可会合于第1核酸的形态。

6.引用权利要求2或3的权利要求4所述的方法，其中通过照射上述第2波长的光，使上述选自偶氮苯及其衍生物的至少1种从反式体变形为顺式体，使上述光应答性核酸成为无法会合于第1核酸的形态。

7.权利要求4所述的方法，其中上述偶氮苯的衍生物是二甲基偶氮苯。

8.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中上述全部的工序重复进行。

9.权利要求3所述的方法，其中通过重复上述全部的工序而进行扩增来自上述第1引物的延伸链与来自上述第2引物的延伸链互补性地会合的核酸。

10.权利要求1～3之任一项所述的方法，其在链交换反应促进物质的存在下进行。

11.权利要求10所述的方法，其中上述链交换反应促进物质是选自阳离子性均聚物及阳离子性共聚物的至少1种。

12.权利要求11所述的方法，其中上述阳离子性共聚物是聚L赖氨酸-葡聚糖共聚物(PLL-g-Dex)。

13.权利要求10所述的方法，其中上述光应答性核酸是结合二甲基偶氮苯的核酸，上述链交换反应促进物质是PLL-g-Dex。

14.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中上述DNA合成酶是链取代型DNA聚合酶。

15.权利要求14所述的方法，其中上述链取代型DNA聚合酶是BstDNA聚合酶。