CN106701738A

CN106701738A - 一种等温解开双链dna及制备单链dna的方法

Info

Publication number: CN106701738A
Application number: CN201610987745.0A
Authority: CN
Inventors: 唐卓; 陈刚毅
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2036-11-10
Also published as: CN106701738B

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，提供一种等温解开双链DNA的方法以及基于该方法制备单链DNA的方法。等温解开双链DNA的技术方案为利用重组酶结合单链DNA探针形成复合物，复合物识别双链DNA中与单链DNA探针同源的序列并侵入双链DNA，从而实现双链DNA的等温开链，随后单链DNA探针和双链中一条链互补配对，而单链结合蛋白结合另一条链稳定开链结构。基于该方案及单链DNA探针3’‑末端可以被连接酶和聚合酶等酶识别的特性，本发明还提出了制备单链DNA的方案，并详细介绍了通过连接酶或延伸酶制备单链DNA的方案。以上技术方案均可在等温条件下完成，且无需ATP循环系统，甚至ATP可被dATP替代，所用酶来源广泛、易于获得，为等温技术以双链DNA作为研究对象提供了一个通用平台。

Description

一种等温解开双链DNA及制备单链DNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及双链DNA的解链和单链DNA的制备，具体涉及一种普适的利用重组酶和单链DNA等温解开双链DNA的方法及用其制备单链DNA的方法。

背景技术

DNA是基因的载体，其携带的遗传信息编码了细胞内所有结构蛋白质和功能蛋白质的氨基酸序列。除少部分病毒外生物体内基因组几乎都以双链形式存在。然而，体外以DNA为基础的诸多基本操作如DNA杂交、连接、扩增等均利用的是探针或引物与目标DNA序列之间碱基互补配对的原理。因此，将双链DNA解开是所有DNA基本操作的前提以及后续如基因检测、测序、编辑等一系列应用的关键。常用解开双链的方法分为物理法和化学法。物理法主要是通过加热使两条单链分离的热变性法。而化学法主要是利用变性剂如尿素、强碱等破坏两条单链之间形成的氢键。这两种方法虽然使双链打开彻底，但是前者受到加热装置限制，不仅增加成本且降低了便携性，后者则因为反应条件太过剧烈且成分复杂而不适于酶促反应等诸多生化反应。因此，建立一种等温、便捷、经济且生物兼容性强的双链DNA解开方法具有重要的科学意义和实用价值。

由于大多数工作仅需针对基因组DNA中的部分序列进行研究，因此，对目标序列的提取当属首要任务。常用的技术为PCR扩增，但该技术需要热变性及反复的热循环，仪器依赖性高且操作复杂。随着目前对仪器设备便携性、经济性和快捷性的要求越来越高，人们更青睐于基于等温反应的技术和设备。然而大多数等温反应仅能以单链DNA为直接的研究对象，如极具代表性的等温基因检测技术——依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、链置换扩增技术(SDA)、滚换复制技术(LRCA和HRCA)、环介导核酸等温扩增技术(LAMP)等。目前用于获得单链的方法主要有：(1)利用热变性、内外引物及链置换相结合的策略。双链DNA热变性开链，引物与模板杂交后，外引物延伸过程中将内引物的延伸产物置换出来获得单链；(2)通过不对称PCR使双链产物的其中一条链线性积累；(3)通过内切酶将长的基因组模板切割成短的核酸片段，利用Lambda、ExoIII等外切酶降解双链中的其中一条链最终获得目的单链。其中方法(1)和(2)均无法摆脱热变性和加热设备，违背了等温反应的初衷；方法(3)虽然能避免对仪器的依赖，但是内切酶需要识别特异的序列，大大降低了其通用性。因此，亟需设计一种能够在等温条件下以双链DNA为模板制备单链DNA的通用方案，以配合快速发展的等温技术，建立系统完善的适用于广泛DNA样本的等温操作体系。

发明内容

本发明目的在于提供一种等温条件下解开双链DNA的方法以及利用此方法在不依赖昂贵仪器的情况下迅速、简便地制备单链DNA的方法，为等温反应技术能直接以双链DNA为研究对象提供一种通用的解决方案。

实现以上目的的技术方案如下：

一种等温解开双链DNA的方法，其技术方案为：针对双链DNA中的目的序列的一条链设计一段互补的单链DNA探针。在高浓度ATP或dATP存在的情况下，重组酶首先与单链DNA探针形成复合物，然后向体系中加入双链DNA和单链结合蛋白SSB；复合物扫描双链DNA，当遇到与单链DNA探针同源的区域时，双链DNA被解开，单链DNA探针与其互补链配对形成异源双链，另一条链与单链结合蛋白SSB结合形成稳定的开链结构。

由于上述等温解开双链DNA的技术方案中所用单链DNA探针的3’末端可以被多种酶识别，因此，本发明提出了以双链DNA为模板，按上述等温解开双链DNA的技术方案设计单链DNA探针并解开双链，利用单链DNA探针3’-末端的特性，结合特定的酶，用于制备单链DNA的技术方案：(1)当所用酶为连接酶时，可设计两条单链DNA探针与双链DNA中目的序列的一条链(模板链)连续互补且位于下游的单链DNA探针的5’-端磷酸化，那么解开双链后这两条单链DNA探针与模板链连续互补并在中间形成一个缺口，连接酶将缺口连接即可得到一条完整的单链；(2)当所用酶为聚合酶时，分别以双链DNA的两条链为模板设计方向相对的两条单链DNA探针，双链解开后，两条单链DNA探针分别与双链DNA中的一条链互补，并被具有链置换活性的聚合酶识别、延伸，同时分别置换出双链中的另一条链，从而实现目的单链DNA的制备，这个过程循环往复可得到更多的单链。

本发明所述技术方案所用酶均为嗜温酶，可全程在等温条件下工作，无需依赖仪器控温。

本发明所述技术方案利用高浓度的ATP或dATP，不需再生体系。

本发明所涉及的单链DNA探针与双链模板同源的区域不少于24个核苷酸，单链DNA探针与双链模板可以完全互补配对也可以部分配对。

本发明所涉及的单链DNA探针用于连接反应时，下游探针的5’端必须完全互补配对且磷酸化，上游探针的3’端必须完全互补配对。如果所涉及的单链DNA探针是挂锁探针(padlock probe)时，只需保证探针5’端和3’端与模板完全互补配对后能形成一个缺口且5’端磷酸化。

本发明所涉及的单链DNA探针用于延伸反应时，3’端必须和模板完全互补配对。

本发明所涉及的重组酶蛋白和单链结合蛋白均来源于大肠杆菌。

本发明所涉及的聚合酶是嗜温聚合酶，在25℃-65℃都具有活性，且不具有5’-3’外切酶活性而具有链置换活性。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3’，5’－磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。

“PCR”：聚合酶链式反应。是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成的一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

“目的序列”：需要检测的分析物，包括DNA和RNA序列。

“复合物”：重组酶与单链DNA探针形成的一种形态类似于双链DNA的复合物，重组酶缠绕单链DNA探针呈螺旋状延伸。

“嗜温”或“嗜温蛋白”：相对于如Taq DNA聚合酶这类嗜热酶而言。此处，嗜温酶指工作温度范围在15-70℃区间内的不耐高温的酶，如Bsm DNA聚合酶(Thermo FisherTM,30-63℃)、Bst DNA聚合酶(NEB,<70℃)、T4DNA连接酶(NEB，推荐反应温度16℃、20-25℃)、T4多聚核苷酸激酶(NEB，推荐最适反应温度37℃)等。

“等温”或“等温条件”：针对所用嗜温酶的工作温度而言，可指嗜温酶工作温度范围中某一恒定的温度条件，也可指在工作温度范围内处于动态变化的温度条件。

本发明所公开的方法关键在于利用重组酶蛋白、单链DNA探针和单链结合蛋白的协同作用达到解开双链DNA的目的；形成开链结构后，单链DNA探针的3’末端能被连接酶和聚合酶所识别，通过连接和延伸反应制备单链DNA；从而使目前只能以单链作为起始模板的等温反应技术也能以双链作为研究对象。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

1.新颖性。本发明成功以体内重组酶体系为基础，建立了体外等温解开双链的方法，仅需要高浓度ATP或dATP而不需要再生体系；以等温解开双链为基础建立的单链制备策略新颖简单，在国内外尚为首创。

2.通用性。本发明所涉及解开双链DNA及用其制备单链的方案，针对不同的用途，只需要合理设计单链DNA探针的碱基互补数量和位置就能实现目的，是一种通用的方法。

3.实用性。本发明所有反应均可在等温条件下进行，无需加热或化学变性等复杂剧烈的处理，适用于几乎所有需要以双链DNA为对象的等温反应，将显著扩展现有只能以单链DNA为对象的等温反应的应用范围。

4.经济性。本发明中所涉及的关键蛋白均来自于大肠杆菌，来源广泛且易于获得。

附图说明

图1是具体实施例1基于单链DNA探针和重组酶等温解开双链DNA的流程示意图。

图2是具体实施例2等温解开双链模板进行单链DNA之间的连接反应的流程示意图。

图3是具体实施例3解开双链模板进行单链DNA的延伸反应的流程示意图。

图4是具体实施例4解开质粒为解旋酶依赖的等温扩增反应提供模板的流程示意图。

图5是具体实施例1的结果图。

图6是具体实施例2的结果图。

图7是具体实施例3的结果图。

图8是具体实施例4的结果图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1、基于单链DNA探针和重组酶等温解开双链DNA

为了便于通过放射性同位素标记和聚丙烯酰胺凝胶电泳验证基于单链DNA探针和重组酶等温解开双链DNA这一机理，本实施例设计单链DNA探针与双链DNA等长，依据本发明等温解开双链DNA的技术方案，单链DNA探针可直接完全打开双链DNA与其互补链配对并置换出另一条非互补链，无需单链结合蛋白稳定开链结构(单链结合蛋白参与稳定开链结构的相关研究请参照实施例2-4这类单链DNA探针远远短于双链DNA模板的示例)。等温解开双链DNA模板的步骤见图1。设计单链DNA探针X1，其5’末端用同位素P³²标记。在ATP或dATP存在的情况下，重组酶RecA与X1形成复合物，并解开双链DNA模板ds(由ds1和ds2退火形成)，X1与其中一条互补链形成配对并置换出另一条非互补链，从而得到P³²标记的双链和一条未标记的单链。

(1)单链DNA探针X1，双链模板ds序列

X1:5’-TAC GTT AAC AAA AAG TCA GAT ATG GAC CTT GCT GCT AAA GGT CTA GGAGCT AAA-3’

ds1:5’-TAC GTT AAC AAA AAG TCA GAT ATG GAC CTT GCT GCT AAA GGT CTAGGA GCT AAA-3’

ds2:5’-TTT AGC TCC T AG ACC TTT AGC AGC AAG GTC CAT ATC TGA CTT TTTGTT AAC GTA-3’

(2)反应体系及条件

(3)反应结果

如图5，加入RecA的反应在聚丙烯酰胺凝胶电泳中得到一条标记的双链，而不加入RecA只有少量的背景条带。

实施例2、用A组单链DNA探针(X1,X1f)解开双链模板T12(由T1,T2退火形成)，再结合连接酶通过连接反应制备单链DNA。

解开双链模板通过连接反应制备单链DNA的步骤参见图2。设计两条单链DNA探针(X1,X1f)，X1f的5’末端进行了磷酸化修饰，而X1的3’末端为羟基，5’端用同位素P³²标记。

在ATP或dATP存在的情况下，重组酶RecA能分别与单链DNA探针X1,X1f形成复合物，此复合物能扫描双链T12。当扫描到与X1,X1f同源的区域后双链T12被解开，X1,X1f分别与互补链配对并在中间形成一个缺口，X1在5’端，X1f在3’端。另外一条被置换出来的链与单链结合蛋白SSB结合，防止其重新配对导致侵入的两条单链DNA探针脱落，从而稳定了形成的开链结构。

连接酶在ATP或dATP存在的情况下使X1的3’端羟基与X1f的5’端磷酸根缩合形成磷酸二酯键，从而使X1与X1f共价连接形成一条完整的单链。

(1)单链DNA探针X1,X1f,双链模板T12序列

X1f:5’-TCA TCT TGT AGT CCA TTG TAA TTG TAA ATA GTA ATT GTC CCT ATAGTG AGT CGT-3’

T1:GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TA GGG ACA ATT ACT ATT TAC AAT TAC AATGGA CTA CAA GA TGA TTT AGC TCC TAG ACC TTT AGC AGC AAG GTC CAT ATC TGA CTTTTT GTT AAC GTA

T2:TAC GTT AAC AAA AAG TCA GAT ATG GAC CTT GCT GCT AAA GGT CTA GGAGCT AAA TCA TCT TGT AGT CCA TTG TAA TTG TAA ATA GTA ATT GTC CCT ATA GTG AGTCGT ATT AGA ATT C

(2)反应体系及条件

反应条件是：先将反应体系中除了SSB,T12,T4DNAligase的其它成分混合好，37℃孵育5分钟，再加入剩下的3种成分，继续孵育1小时。

2个阴性对照分别为：不含有RecA和SSB的体系以及不含有双链模板的体系。

(3)反应结果

如图6所示，同位素标记的X1与X1f连接成一条更长的链从而在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率降低。而不含有RecA和SSB的体系以及不含有双链模板的体系都没有得到相应的连接产物。

实施例3、用B组单链DNA探针(X1,X1r)解开双链模板T12(由T1,T2退火形成)，再结合聚合酶通过延伸反应制备单链DNA。

解开双链模板通过延伸反应制备单链DNA的步骤参见图3。设计两条单链DNA探针(X1,X1r)，X1的5’端用同位素P³²标记，与双链模板中T1链的3’下游区域互补配对。X1r与双链模板中的T2链的3’下游区域互补配对。

在ATP或dATP存在的情况下，重组酶RecA能分别与单链DNA探针X1,X1r形成复合物，此复合物能扫描双链T12。当扫描到与X1,X1r同源序列后双链T12在相应的区域被打开，X1,X1r分别与其互补链配对，两个区域中另外一条被置换出来的链与单链结合蛋白SSB结合，防止其重新配对导致侵入的两条单链DNA脱落，从而稳定了形成的开链结构。

具有链置换活性的聚合酶在dNTP混合物存在的情况下在X1和X1r的3’端逐个引入dNTP使单链DNA探针延伸，同时延伸的过程中另外一条链被完全置换出来从而获得单链DNA。探针延伸产物与其互补链形成的双链DNA又可作为新的模板，开始新的一轮开链、延伸、替换的反应过程，整个过程循环进行，使更多的单链DNA探针被延伸并获得单链DNA。(1)单链DNA探针X1,X1r，双链模板T12序列

X1r:5’-GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TA GGG ACA ATT ACT ATT TAC AAT TACAAT GGA C-3’

(2)反应体系及条件

反应条件是：先将反应体系中除了SSB、T12、dNTP和Bsm DNA polymerase的其它成分混合好，37℃孵育5分钟，再加入剩下的4种成分并补加MgCl至终浓度6mM，继续孵育1小时。

2个阴性对照分别为：不含有RecA和SSB的体系和不含有双链模板的体系。

(3)反应结果

如图7所示，X1延伸过程中置换出来的单链可以作为X1r的延伸模板，同样X1r延伸过程中置换出来的单链也可以作为X1的延伸模板，因此多轮的延伸过程中可以产生很多单链模板。同位素标记的X1在聚合酶的作用下延伸了从而在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率降低。而不含有RecA和SSB的体系和不含有双链模板的体系都没有得到相应的延伸产物。

实施例4、用B组单链DNA探针(X1,X1r)解开质粒T1-ds(将T12克隆到载体T1得到)，为解旋酶依赖的等温扩增反应提供模板。

解开质粒为解旋酶依赖的等温扩增反应提供模板的反应步骤参见图4。

在ATP或dATP存在的情况下，重组酶RecA分别与单链DNA探针X1,X1r形成复合物，此复合物扫描到质粒上与X1,X1r同源序列后，在相应的区域解开质粒，X1,X1r分别与其互补链配对，两个区域中另外一条被置换出来的链与单链结合蛋白SSB结合，防止其重新配对导致侵入的两条单链DNA脱落。具有链置换活性的聚合酶在dNTP混合物存在的情况下在X1和X1r的3’端逐个引入dNTP使寡核苷酸得到延伸，同时延伸的过程中另外一条链被完全置换出来。被置换出的另外一条链可分别又作为X1,X1r的模板发生延伸反应，经过两轮循环可以得到平末端的双链。平末端的双链可以被解旋酶解开成两条单链，引物P-X1,P-X1r可分别与这两条单链互补配对，在聚合酶的作用下延伸，如此循环，解旋酶依赖的等温扩增反应得以完全在等温条件下进行并产生最终的扩增产物。

(1)单链DNA探针X1,X1r,引物P-X1,P-X1r序列

X1:5’-TACGTTAACAAAAAGTCAGATATGGACCTTGCTGCTAAAGGTCTAGGAGCTAAA-3’

P-X1:5’-TAGTAGAGTCCTGA TAC GTT AAC AAA-3’

P-X1r:5’-CTACAGAGTCAGTC GAATTCTAAT AC-3’

(2)反应体系及条件

质粒等温解链反应体系(4ul)：

将混合好的质粒等温解链体系直接作为模板加入解旋酶依赖的等温扩增反应体系中，如下：

整个反应体系于37℃孵育1小时

2个阴性对照分别为：解旋酶依赖的等温扩增体系直接以62.5pM质粒作为模板，质粒不经质粒等温开链体系处理；解旋酶依赖的等温扩增体系不加入任何模板。

(3)反应结果

如图8所示，质粒预先与等温双链解开体系混合后再加入解旋酶依赖的等温扩增体系得到了明显的扩增条带，而在解旋酶依赖的等温扩增体系中直接加入质粒或不加入任何模板均没有得到明显的扩增条带。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种等温解开双链DNA及制备单链DNA的方法

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

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tacgttaaca aaaagtcaga tatggacctt gctgctaaag gtctaggagc taaa 54

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacgttaaca aaaagtcaga tatggacctt gctgctaaag gtctaggagc taaa 54

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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atgatttagc tcctagacct ttagcagcaa ggtccatatc tgactttttg ttaacgta 118

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<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacgttaaca aaaagtcaga tatggacctt gctgctaaag gtctaggagc taaatcatct 60

tgtagtccat tgtaattgta aatagtaatt gtccctatag tgagtcgtat tagaattc 118

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaattctaat acgactcact atagggacaa ttactattta caattacaat ggac 54

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<212> DNA

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<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctacagagtc agtcgaattc taatac 26

Claims

1.一种等温解开双链DNA的方法，其特征是：使用单链DNA探针、重组酶、单链结合蛋白以及ATP或dATP实现等温条件下双链DNA的解链；单链DNA探针以双链DNA为模板进行设计；在ATP或dATP存在的情况下，重组酶与单链DNA探针形成复合物，复合物识别双链DNA中与单链DNA探针同源的序列并侵入双链DNA，从而实现双链DNA的等温开链，随后单链DNA探针与其中一条链互补，单链结合蛋白则结合另一条链以稳定开链结构。

2.根据权利要求1所述的等温解开双链DNA的方法，其特征是：所使用重组酶和单链结合蛋白为嗜温蛋白，可在等温条件下工作。

3.根据权利要求1所述的等温解开双链DNA的方法，其特征是：高浓度的ATP或dATP即可完成反应，不需要任何再生体系。

4.根据权利要求1所述的等温解开双链DNA的方法，其特征是：所述单链DNA探针的长度不低于24个碱基。

5.如权利要求1所述的等温解开双链DNA的方法，其特征是：单链DNA探针的3’-端可被酶识别并发生反应。

6.一种制备单链DNA的方法，其特征是：制备模板为双链DNA，按权利要求1所述方案设计单链DNA探针并解开双链，利用权利要求5所述单链DNA探针3’-末端的特性，结合特定的酶，即可完成单链DNA的制备。

7.根据权利要求6所述的制备单链DNA的方法，其特征是：当所用酶为连接酶时，制备方案为以双链DNA中一条链为模板设计与模板连续互补的两条单链DNA探针，位于下游的单链DNA探针的5’-端磷酸化，探针打开双链后便能与模板连续互补，在连接酶作用下便可将两条单链DNA探针连接成一条完整的单链DNA。

8.根据权利要求6所述的制备单链DNA的方法，其特征是：当所用酶为聚合酶时，分别以双链DNA的两条链为模板设计方向相对的两条单链DNA探针，探针打开双链后分别与两条模板链互补，在聚合酶作用下发生3’-端的延伸反应并将另外一条链完全置换出来，从而获得单链DNA，探针延伸产物及其互补链则可作为新的双链DNA模板，如此循环往复，使更多的单链DNA探针被延伸并获得单链DNA；所用聚合酶是具有链置换活性的嗜温聚合酶。

9.根据权利要求6或7或8所述的制备单链DNA的方法，其特征是：所用酶为嗜温酶，方法均可在等温条件下工作。