BRPI0907701A2 - anticorpo anti-fator d, polipeptídeo e método de tratamento de um distúrbio associado ao complemento - Google Patents

Abstract

anticorpo anti-fator d, polipeptídeo e método de tratamento de um distúrbio associado ao complemento a invenção refere-se a anticorpos anti-fator d, suas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos, as células e vetores que abrigam esses anticorpos e sua produção e utilização na preparação de composições e medicamentos para o tratamento de doenças e distúrbios associados com a ativação excessiva ou descontrolada do complemento. estes anticorpos são úteis no diagnóstico, profilaxia e tratamento de doenças.

Description

“ANTICORPOS ANTI-FATOR D, POLIPEPTÍDEOS, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-FATOR D E DE UM POLIPEPTÍDEO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, ARTIGO DE MANUFATURA, KIT, USOS DO ANTICORPO E DO POLIPEPTÍDEO E ANTICORPO”

Referência Cruzada para os Pedidos Relacionados [001] Este pedido de patente não provisório depositado sob o título 37 § 1.53(b) do CFR reivindica o benefício com base no título 35 § 119(e) do USC ao pedido de patente provisório US 61/048.431, depositado em 28 de abril de 2008 e ao pedido de patente provisório US 61/048.689 depositado em 29 de abril de 2008, conteúdo dos quais são integralmente incorporados ao presente pela referência.

Antecedentes da Invenção [002] O sistema complemento desempenha um papel central na depuração de imunocomplexos e na resposta imune a agentes infecciosos, antígenos estranhos, células infectadas por vírus e células tumorais. No entanto, o complemento também está envolvido na inflamação patológica e nas doenças autoimunes. Desse modo, a inibição da ativação excessiva ou descontrolada da cascata do complemento podería fornecer um benefício clínico para pacientes com doenças e condições.

[003] O sistema complemento compreende duas vias de ativação distintas, denominadas de via clássica e via alternativa (V.M. Holers, Em Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). A via clássica é uma cascata dependente de cálcio/magnésio, que normalmente é ativada pela formação de complexos antígeno-anticorpo. A via alternativa é uma cascata dependente de magnésio que é ativada pela deposição e ativação de C3 em determinadas superfícies sensíveis (por

2/149 exemplo, polissacarídeos da parede celular de leveduras e bactérias, e certos materiais biopoliméricos). A ativação da via do complemento gera fragmentos biologicamente ativos das proteínas do complemento, por exemplo, C3a, C4a e anafilatoxinas C5a e complexos de ataque à membrana C5b-9 (MAC), que medeiam atividades inflamatórias que envolvem a quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastócitos e células endoteliais, a permeabilidade vascular, citólise e lesão tecidual.

[004] O fator D é uma serina protease altamente específicas essencial para a ativação da via alternativa do complemento. Ela cliva o fator B ligado a C3b, gerando a enzima C3b/Bb que é o componente ativo da via alternativa das convertases C3/C5. O fator D pode ser um alvo adequado para a inibição, uma vez que sua concentração no plasma em humanos é muito baixa (1,8 pg/ml), e tem se mostrado uma enzima limitante para a ativação da via alternativa do complemento (P.H. Lesavre e H.J. Müller-Eberhard J. Exp Med, 1978; 148:1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med 1985;312:395-401).

[005] A infraregulação da ativação do complemento tem sido demonstrada como eficaz em várias indicações de tratamento de doenças em modelos animais e em estudos ex vivo, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite (Y. Wang et al., Proc Natl Acad Sei; 1996, 93: 8563-8568), artrite reumatoide (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1995; 92: 8955-8959), circulação extracorpórea ea hemodiálise (C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572), rejeição hiperaguda em transplante de órgãos (T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), infarto do miocárdio (J. W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151), lesão de reperfusão (E.A. Amsterdam et ai., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457), e síndrome da angústia respiratória do adulto (R. Rabinovici et a!., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750). Além disso,

3/149 outras condições inflamatórias e doenças do complexo autoimune/imune, também estão intimamente associadas com a ativação do complemento (V.M. holers, ibid, B.P. Morgan Eur. J. Clin Invest, 1994; 24:219-228), incluindo a lesão térmica, asma grave, choque anafilático, inflamação do intestino, urticária, angioedema, vasculite, esclerose múltipla, miastenia grave, glomerulonefrite membranoproliferativa e síndrome de Sjõgren.

[006] Há uma necessidade de anticorpos terapêuticos no campo dos distúrbios mediados pelo complemento, e anticorpos anti-fator-D humanizados, e anticorpos variantes dos mesmos, e fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), da presente invenção fornecem anticorpos de alta afinidade úteis para atender a essa necessidade.

Descrição Resumida da Invenção [007] Em um aspecto, a presente invenção refere-se de maneira geral aos anticorpos capazes de inibir as atividades biológicas associadas ao Fator D.

[008] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos anti-fator D humanizados, possuindo uma variedade de características terapêuticas desejadas. A presente invenção inclui as sequências de aminoácidos das HVRs destes anticorpos anti-fator D humanizados, e suas sequências de ácidos nucleicos correspondentes. A invenção inclui as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos anti-fator D humanizados, e suas sequências de ácidos nucleicos correspondentes. A invenção inclui as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve dos anticorpos anti-fator D humanizados, e suas sequências de ácidos nucleicos correspondentes.

[009] Em um aspecto, anticorpos específicos no escopo da presente invenção incluem, sem se limitarem, a anticorpos anti-fator D humanizados, que compreendem HVRs de Fab anti-fator D humanizado clones

4/149 # 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ou 238-11. Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-fator D humanizados compreendem os domínios variáveis de cadeia pesada e/ou cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado clones # 238, 238-1,238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ou 238-11. Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-fator D humanizados compreendem as cadeias pesadas e/ou leves do Fab anti-fator D humanizado clones # 238, 238-

I, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ou 238-11. Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui o Fab anti-fator D humanizado clones # 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ou 238-11. Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) de anticorpos de comprimento total de Fab anti-fator D humanizado clones # 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ou 238-11. Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos de comprimento total ou fragmentos de ligação ao antígeno destes, que compreende as sequências de ligação ao antígeno da cadeia pesada e/ou cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado clones # 238, 238-1,238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ou 238-

II. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem de pelo menos, uma, duas ou três das HVRs da cadeia pesada. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem de pelo menos, uma, duas ou três HVRs da cadeia leve. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma parte ou a totalidade do domínio variável de cadeia pesada. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma parte ou a totalidade do domínio variável de cadeia leve.

5/149 [010] Em um aspecto, a presente invenção fornece fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou anticorpos de comprimento total anti-fator D humanizados clone #111, que compreende pelo menos uma modificação na sequência do Fab anti-fator D humanizado clone # 111, em que tais anticorpos de comprimento total ou tais fragmentos de ligação ao antígeno incluem as sequências de ligação ao antígeno da cadeia pesada e/ou a cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado clone #111. Em um exemplo de realização, os fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou anticorpos de comprimento total Fab anti-fator D humanizado clone #111, que compreende pelo menos uma modificação na sequência do Fab anti-fator D humanizado clone #111, que compreende as sequências de ligação ao antígeno de cadeia leve e/ou cadeia pesada do Fab anti-fator D humanizado clone #111, ligam-se mais essencialmente ao mesmo epítopo que o anticorpo Fab humanizado clone #111. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem de pelo menos, uma, duas ou três HVRs da cadeia pesada. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem de pelo menos, uma, duas ou três HVRs da cadeia leve. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma parte ou a totalidade do domínio variável de cadeia pesada. Em um exemplo de realização, tais sequências de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma parte ou a totalidade do domínio variável de cadeia leve. Em um exemplo de realização, tal modificação nos ditos fragmentos de anticorpo ou anticorpos de comprimento total, está na cadeia pesada. Em um exemplo de realização, tal modificação nos ditos fragmentos de anticorpo ou anticorpos de comprimento total, está na cadeia leve. Em um exemplo de realização, tal modificação nos ditos fragmentos de anticorpo ou anticorpos de comprimento total, está no domínio variável de cadeia pesada. Em um exemplo de

6/149 realização, tal modificação nos ditos fragmentos de anticorpo ou anticorpos de comprimento total, está no domínio variável de cadeia leve. Em um exemplo de realização, tal modificação nos ditos fragmentos de anticorpo ou anticorpos de comprimento total, está em pelo menos uma, duas ou três HVRs da cadeia pesada. Em um exemplo de realização, tal modificação nos ditos fragmentos de anticorpo ou anticorpos de comprimento total, está em pelo menos uma, duas ou três HVRs da cadeia leve.

[011] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos da presente invenção, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), que se ligam a fator D com uma afinidade de ligação de pelo menos, cerca de 10'⁹ a 10'¹²M.

[012] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), onde um fragmento Fab de tais anticorpos inibe uma função biológica do fator D em uma relação molar de fragmento Fab ao Fator D de cerca de 0,05:1 (0,05) a cerca de 10:1 (10), ou cerca de 0,09:1 (0,09) a cerca de 8:1 (8), ou cerca de 0,1:1 (0,1) a cerca de 6:1 (6), ou cerca de 0,15:1 (0,15) a cerca de 5:1 (5), ou cerca de 0,19:1 (0,19) a cerca de 4:1 (4), ou cerca de 0,2:1 (0,2) a cerca de 3:1 (3), ou cerca de 0,3:1 (0,3) a cerca de 2:1 (2), ou cerca de 0,4:1 (0,4) a cerca de 1:1 (1), ou cerca de 0,5:1 (0,5) a cerca de 1:2 (0,5), ou cerca de 0,6:1 (0,6) a cerca de 1:3 (0,33), ou cerca de 0,7:1 (0,7) a cerca de 1:4 (0,25), ou cerca de 0,8:1 (0,8) a cerca de 1:5 (0,2) ou cerca de 0,9:1 (0,9) a cerca de 1:6 (0,17).

[013] Em um aspecto, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos.

[014] Em outro aspecto, a presente invenção inclui fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) de anticorpos anti-fator D humanizados. Os fragmentos de anticorpo da presente invenção

7/149 podem, por exemplo, ser Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, fragmentos de regiões determinantes de complementaridade (CDR), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única, minicorpos, diacorpos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[015] Em outros aspectos da presente invenção, a presente invenção inclui composições que compreende um anticorpo da presente invenção, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece linhagens de células e vetores que codificam pelo menos uma porção de um anticorpo da presente invenção, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Em um aspecto, a presente invenção inclui um método de fabricação, método de produção, e método de uso dos anticorpos, fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação aos antígenos) e composições da presente invenção. Em um exemplo de realização, o método de fabricação de um anticorpo da presente invenção, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação de antígeno), em que o método compreende:

(a) o cultivo de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula eucariótica ou CHO, que compreende um vetor, que compreende adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção, ou um fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação de antígeno), sob condições adequadas para a expressão do polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno); e (b) o isolamento do anticorpo, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[016] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se uma composição de matéria que compreende um anticorpo da presente invenção, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno),

8/149 conforme descrito no presente, em combinação com um veículo. Opcionalmente, o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.

[017] Outro aspecto da presente invenção é o uso destes anticorpos humanizados ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), para a preparação de um medicamento ou composição para a prevenção e/ou tratamento de doenças associadas com a ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Elas incluem a ativação do complemento durante as operações de circulação extracorpórea, a ativação do complemento devido à isquemia e reperfusão após o infarto agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão por esmagamento, falência de múltiplos órgãos, choque hipovolêmico, isquemia intestinal ou outros eventos causadores de isquemia. A ativação do complemento também foi demonstrada por estar associada com condições inflamatórias, tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, síndrome da angústia respiratória do adulto, hemodiálise, choque anafilático, asma grave, angioedema, doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. Os distúrbios podem ser resultado de uma reação adversa ao medicamento, alergia ao medicamento, síndrome de extravasamento vascular induzida por IL-2 ou alergia ao meio de contraste radiológico. Ele também inclui doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla. Em outro exemplo de realização, a ativação do complemento também está associada com a rejeição de transplantes. Em outro exemplo de realização, a ativação do complemento também está associada com doenças oculares (todas as condições e doenças e patologias oculares nas quais o complemento está envolvido, incluindo a via clássica e alternativa do complemento), como, por exemplo, sem se limitar, a doença degenerativa da mácula, tais como todas as fases da degeneração macular relacionada com

9/149 a idade (DMRI), inclusive as formas seca e úmida (não exsudativa e exsudativa), retinopatia diabética e outras retinopatias isquêmicas, neovascularização de coroide (NVC), uveite, edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (OVCR), neovascularização da córnea e neovascularização da retina. Em um exemplo, as condições oculares associadas ao complemento incluem a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a não exsudativa (por exemplo, DMRI seca ou atrofia geográfica (AG)) e exsudativa (por exemplo, a DMRI exsudativa (DMRI com neovascularização de coroide (NVC)), retinopatia diabética (RD), endoftalmite e uveíte. Em outro exemplo, a DMRI não exsudativa pode incluir a presença de drusas duras, drusas moles, atrofia geográfica e/ou hiperpigmentação (pigment clumping). Em outro exemplo, condições oculares associadas ao complemento incluem a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a DMRI precoce (por exemplo, inclui múltiplas drusas pequenas e uma ou mais de tamanho médio não extensa), a DMRI intermediária (por exemplo, inclui extensas drusas médias a uma ou mais drusas grandes) e DMRI avançada (por exemplo, inclui a atrofia geográfica ou DMRI avançada úmida (VNC). Em outro exemplo, a DMRI seca intermediária pode incluir grandes drusas confluentes. Em outro exemplo, a atrofia geográfica pode incluir a perda de fotorreceptores e/ou do epitélio pigmentado da retina (EPR). Em outro exemplo, a área de atrofia geográfica pode ser pequena ou grande e/ou pode ser na área da mácula na retina periférica. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI seca intermediária. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a atrofia geográfica. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI úmida (neovascularização da coroide (NVC)).

10/149 [018] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende um anticorpo da presente invenção, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um kit que compreende um anticorpo da presente invenção, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) e instruções para uso. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um kit que compreende um anticorpo da presente invenção, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) e instruções para a administração do dito anticorpo, para tratar um distúrbio associada ao complemento. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente que contém uma composição que compreende um ou mais anticorpos da presente invenção ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno); e um segundo recipiente que compreende um tampão. Em uma realização, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em um exemplo de realização, uma composição que compreende um anticorpo da presente invenção ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) que contém adicionalmente de um veículo, que em alguns exemplos de realização é farmaceuticamente aceitável. Em um exemplo de realização, um kit compreende adicionalmente de instruções para a administração da composição (por exemplo, anticorpo ou fragmento deste anticopo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno)) a um indivíduo. Em um exemplo de realização, um kit compreende adicionalmente de instruções para o uso do kit.

[019] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbio associado ao complemento. Em um exemplo de realização, a composição está relacionada a um artigo de manufatura que compreende: (a) um recipiente, (b) um rótulo sobre o recipiente, e (c) uma

11/149 composição de matéria que compreende um anticorpo, ou variante deste ou um fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) da presente invenção, contida no recipiente, de modo que o rótulo sobre o referido recipiente indica que a composição pode ser usada para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios associados ao complemento.

[020] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-fator D da presente invenção, ou fragmento de anticorpo deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), ácidos nucleicos da presente invenção, vetor de expressão da presente invenção ou célula hospedeira da presente invenção, na preparação de um medicamento para a terapia e/ou tratamento profilático de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento. Em um exemplo de realização, a condição ocular associada ao complemento é selecionada a partir de: degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a não exsudativa (por exemplo, DMRI seca ou atrofia geográfica (AG)) e exsudativa (por exemplo, a DMRI exsudativa (DMRI com neovascularização de coroide (NVC)), retinopatia diabética (RD), endoftalmite e uveíte. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI seca intermediária. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a atrofia geográfica. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI úmida (neovascularização da coroide (NVC)).

[021] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um artigo de manufatura da presente invenção para a preparação de um medicamento para a terapêutica e/ou tratamento profilático de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento. Em um exemplo de realização, a condição ocular associada ao complemento é selecionada a partir de: degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a não exsudativa (por exemplo, DMRI seca ou atrofia geográfica (AG)) e exsudativa

12/149 (por exemplo, a DMRI exsudativa (DMRI com neovascularização de coroide (NVC)), retinopatia diabética (RD), endoftalmite e uveíte. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI seca intermediária. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a atrofia geográfica. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI úmida (neovascularização da coroide (NVC)).

[022] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um kit da presente invenção na preparação de um medicamento para a terapêutica e/ou tratamento profilático de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento. Em um exemplo de realização, a condição ocular associada ao complemento é selecionada a partir de: degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a não exsudativa (por exemplo, DMRI seca ou atrofia geográfica (AG)) e exsudativa (por exemplo, a DMRI exsudativa (DMRI com neovascularização de coroide (NVC)), retinopatia diabética (RD), endoftalmite e uveíte. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI seca intermediária. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a atrofia geográfica. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI úmida (neovascularização da coroide (NVC)).

Breve Descrição das Figuras [023] As Figuras 1A-1C exibem o alinhamento das sequências dos domínios variáveis de cadeia leve para os seguintes: Fab Anti-fator D humanizado clone #111 (SEQ ID No: 1), Fabs anti-fator D humanizados, 238, 238-1,238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 e 238-11 (SEQ ID Nos: 6-17, respectivamente) e sequência consenso I kappa VL (SEQ ID No: 65). As posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (de acordo com as definições de HVR de Kabat + Chothia) estão indicadas em caixas (HVRs: (1) HVR-L1 identificado como A1-A11

13/149 (ITSTDIDDDMN (SEQ ID No: 30), ITSTDIDDDLN (SEQ ID No: 31), ITSTDIDDDfN (SEQ ID No: 32), ITSTDIDDDMA (SEQ ID No: 33) ou ITSTDIDDDMQ (SEQ ID No: 34)), (2) HVR-L2 identificado como B1-B7 (GGNTLRP (SEQ ID No: 35), GGSTLRP (SEQ ID No: 36) ou GGATLRP (SEQ ID No: 37)), (3) HVR-L3 identificado como C1-C9 (LQSDSLPYT (SEQ ID No: 38)). Mudanças de aminoácidos em cada Fab anti-fator D humanizado está em negrito e itálico.

[024] As Figuras 2A-C exibem o alinhamento das sequências dos domínios variáveis de cadeia pesada para os seguintes: Fab anti-fator D humanizado clone #111 (SEQ ID No: 2), Fabs anti-fator D humanizados, 238, 238-1,238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 e 238-11 (SEQ ID Nos: 18-29, respectivamente) e sequência consenso VH subgrupo 7 (SEQ ID No: 66). As posições são numeradas de acordo com Kabat e regiões hipervariáveis (de acordo com as definições de HVR de Kabat + Chothia) estão indicadas em caixas (HVRs: (1) HVR-L1 identificado como D1-D10 (GYTFTNYGMN (SEQ ID No: 39), (2) HVR-H2 identificado como E1-E19 (WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID No: 40), (3) HVR-H3 identificado como F1F6 (EGGVNN (SEQ ID No: 41), EGGVAN (SEQ ID No: 42), EGGVQN (SEQ ID No: 43), EGGVNA (SEQ ID No: 44) ou EGGVNQ (SEQ ID No: 45)) Mudanças de aminoácidos em cada Fab anti-fator D humanizado está em negrito e itálico.

[025] A Figura 3 exibe a sequência de nucleotídeos (SEQ ID No:

46) da cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado 238. A sequência de nucleotídeos para a codificação da cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado 238 com o códon de início e de parada exibidos em negrito e sublinhado. O códon correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 4 (SEQ ID No: 47) está em negrito e itálico.

[026] A Figura 4 exibe a sequência de aminoácidos (SEQ ID No:

47) da cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado 238. A sequência de

14/149 aminoácidos não tem a sequência de sinal N-terminal do polipeptídeo codificado pela SEQ ID No: 46, exibida na Figura 3. As sequências HVRs estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões que não estão sublinhadas enquanto que o primeiro domínio constante CL1 está sublinhado. A região estrutural (framework) (FR) e regiões HVR são exibidas: FR1-LC (SEQ ID No: 48), FR2-LC (SEQ ID No: 49), FR3-LC (SEQ ID No: 50), FR4-LC (SEQ ID No: 51), HVR1-LC (SEQ ID No: 30 (ITSTDIDDDMN)), HVR2-LC (SEQ ID No: 35 (GGNTLRP)), HVR3-LC (SEQ ID No: 38 (LQSDSLPYT)) e CL1 (SEQ ID No: 52).

[027] A Figura 5 exibe a sequência nucleotídicas (SEQ ID No:

53) da cadeia pesada do Fab anti-fator D humanizado 238. A sequência de nucleotídeos para a codificação da cadeia pesada do Fab anti-fator D humanizado 238 com o códon de início e de parada é exibida em negrito e sublinhado. O códon correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 6 (SEQ ID No: 54) está em negrito e itálico.

[028] A Figura 6 exibe a sequência de aminoácidos (SEQ ID No:

54) da cadeia pesada para o Fab anti-fator D humanizado 238. A sequência de aminoácidos não tem a sequência de sinal N-terminal do polipeptídeo codificado pela SEQ ID No: 53 exibida na Figura 5. As sequências HVRs estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões que não estão sublinhadas enquanto que o primeiro domínio constante CH1 está sublinhado. A região estrutural (framework) (FR) e regiões HVR são exibidas: FR1-HC (SEQ ID No: 55), FR2-HC (SEQ ID No: 56), FR3-HC (SEQ ID No: 57), FR4-HC (SEQ ID No: 58), HVR1-HC (SEQ ID No: 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2-HC (SEQ ID No: 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC (SEQ ID No: 41 (EGGVNN)) e CH1 (SEQ ID No: 59).

[029] A Figura 7 exibe a sequência de nucleotídeos (SEQ ID No:

60) da cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado 238-1. A sequência de

15/149 nucleotídeos que codifica a cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado 238-1 com o códon de início e de parada é exibida em negrito e sublinhado. O códon correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 8 (SEQ ID No: 61) está em negrito e itálico.

[030] A Figura 8 exibe a sequência de aminoácidos (SEQ ID No:

61) da cadeia leve do Fab anti-fator D humanizado 238-1. A sequência de aminoácidos não tem a sequência de sinal N-terminal do polipeptídeo codificado pela SEQ ID No: 60 exibida na Figura 7. As sequências HVRs estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões que não estão sublinhadas enquanto que o primeiro domínio constante CL1 está sublinhado. A região estrutural (framework) (FR) e regiões HVR são exibidas: FR1-LC (SEQ ID No: 48), FR2-LC (SEQ ID No: 49), FR3-LC (SEQ ID No: 50), FR4-LC (SEQ ID No: 51), HVR1-LC (SEQ ID No: 30 (ITSTDIDDDMN)), HVR2-LC (SEQ ID No: 35 (GGNTLRP)), HVR3-LC (SEQ ID No: 38 (LQSDSLPYT)) e CL1 (SEQ ID No: 52).

[031] A Figura 9 exibe a sequência nucleotídicas (SEQ ID No:

62) da cadeia pesada do Fab anti-fator D humanizado 238-1. A sequência de nucleotídeos para a codificação da cadeia pesada do Fab anti-fator D humanizado 238-1 com o códon de início e de parada é exibida em negrito e sublinhado. O códon correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 10 (SEQ ID No: 63) está em negrito e itálico.

[032] A Figura 10 exibe a sequência de aminoácidos (SEQ ID No: 63) da cadeia pesada para o Fab anti-fator D humanizado 238-1. A sequência de aminoácidos não tem a sequência de sinal N-terminal do polipeptídeo codificado pela SEQ ID No: 62 exibida na Figura 9. As sequências HVRs estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões que não estão sublinhadas enquanto que o primeiro domínio constante CH1 está sublinhado. A região estrutural (framework) (FR) e regiões HVR são exibidas:

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FR1-HC (SEQ ID No: 64), FR2-HC (SEQ ID No: 56), FR3-HC (SEQ ID No: 57), FR4-HC (SEQ ID No: 58), HVR1-HC (SEQ ID No: 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2HC (SEQ ID No: 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC (SEQ ID No: 41 (EGGVNN)) e CH1 (SEQ ID No: 59).

[033] A Figura 11 exibe os resultados do ensaio hemolítico, mostrando inibição da atividade do complemento alternativa, para Fab anti-fator D humanizado clone #111 e Fabs anti-fator D humanizados 238 e 238-1. Os valores de IC50 são exibidos.

[034] A Figura 12 exibe os resultados do ensaio hemolítico, mostrando inibição da atividade da via alternativa (VA) do complemento, para Fab anti-fator D humanizado 238, em três concentrações de soro (9,7 nM, 16,2 nM e 26,5 nM) de Fator D.

[035] As Tabelas A (abaixo) e 3 mostram os valores de IC50 (nM) e IC90 (nM) (valores representam a média de três experimentos repetidos), correspondentes às três concentrações séricas de Fator D.

Tabela A

Fab Anti fD	Concentração de Fator D (nM)
92	16,2	26,5
IC50 (nM)	4,4	10,2	23,9
IC90 (nM)	14,0	38,0	72,6

[036] A relação molar de anticorpo para fator D também é mostrada na Tabela 3.

[037] A Figura 13 exibe a duração simulada da inibição da ativação da via alternativa (AP) do complemento em um olho humano utilizando uma única injeção intravítrea (IVT) de Fab anti-fator D 238 na dose de 2,5 mg (assumindo uma meia-vida (tv₂) de Fab anti-fator D 238 = 11,5 dias, com base na escala interespécies a partir do coelho). Uma única injeção IVT de Fab anti

17/149 fator D 238 foi estimado por inibir a ativação da VA do complemento no tecido da retina por pelo menos cerca de 74 dias e no humor vítreo por pelo menos cerca de 97 dias. Na Figura 13, a linha tracejada mostra a concentração simulada de Fab anti-fator D 238 no humor vítreo após a administração intravítrea. Na Figura 13, a linha sólida mostra a concentração simulada de Fab anti-fator D 238 no tecido da retina após a administração intravítrea. A diferença na concentração no humor vítreo e no tecido da retina é baseada em uma estimativa do coeficiente de partição do tecido da retina de 20%, ou seja, 20% do total de droga administrada ao humor vítreo terá acesso ao tecido da retina.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições [038] Os termos usados em todo este pedido devem ser interpretados no sentido comum e típico para os técnicos hábeis no assunto. No entanto, os requerentes desejam que seja dada uma definição especifica aos seguintes termos, tal como definido abaixo.

[039] A frase substancialmente idêntica em relação a uma sequência polipeptídica de cadeia de anticorpo pode ser interpretada como uma cadeia de anticorpo que exibe pelo menos 70%, ou 80%, ou 90% ou 95% de identidade de sequência com a sequência polipeptídica de referência. Quando a expressão se refere a uma sequência de ácido nucleico, ela pode ser interpretada como uma sequência de nucleotídeos exibindo pelo menos cerca de 85%, ou 90%, ou 95% ou 97%> de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de referência.

[040] O termo identidade ou homologia deve ser interpretado no sentido de percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de uma sequência correspondente com o qual eles são comparados, após o alinhamento das sequências e

18/149 introdução dos gaps, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade para toda a sequência, e não considerando eventuais substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. Nem a extensão Nnem a C-terminal devem ser entendidas como sequências que reduzem a identidade ou homologia. Métodos e programas de computadores para o alinhamento são bem conhecidos no estado da técnica. A identidade de sequência pode ser mensurada utilizando um software de análise de sequência.

[041] O termo “anticorpo” é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Anticorpos (Acs) e imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas que possuem as mesmas características estruturais. Apesar dos anticorpos exibirem uma especificidade de ligação a um antígeno específico, as imunoglobulinas incluem tanto anticorpos quanto outras moléculas similares a anticorpo que geralmente não tem especificidade ao alvo. Anticorpos e imunoglobulinas nativas são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (Vh), seguido por um número de domínios constante. Cada cadeia leve tem em uma extremidade um domínio variável (Vl), seguido por um número de domínios constante.

[042] Um anticorpo “isolado” é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderíam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou

19/149 não proteináceos. Em um exemplo, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método Lowry, e mais preferencialmente, em mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal pelo uso de um sequenciador do tipo spinning cup; ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado é preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

[043] Conforme utilizado no presente, a expressão anticorpo anti-fator D humano significa um anticorpo que se liga especificamente ao fator D humano de tal maneira que inibe ou reduz substancialmente a ativação do complemento.

[044] O termo Fator D é utilizado no presente para se referir aos polipeptídeos do Fator D de sequência nativa e variantes.

[045] Um fator D de “sequência nativa é um polipeptídeo que possui a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo do Fator D derivado da natureza. Assim, a dita sequência nativa do fator D pode ser isolada da natureza ou pode ser produzida por métodos recombinantes e/ou sintéticos. Além de uma proteína madura de Fator D, tal como uma proteína madura de fator D humano (NM_001928), o termo Fator D de sequência nativa, abrange especificamente as formas precursoras do Fator D que ocorrem naturalmente (por exemplo, uma pré-proteína inativa, que é proteoliticamente clivada para produzir a forma ativa), formas variantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas que sofreram splicing alternativo) e variantes alélicos do Fator D que ocorrem naturalmente, bem como variantes

20/149 estruturais conformacional de moléculas de Fator D possuindo a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo Fator D derivado da natureza. Polipeptídeos do Fator D de animais não humanos, incluindo primatas superiores e mamíferos não humanos estão expressamente incluídos nesta definição.

[046] Fator D variante significa um polipeptídeo Fator D ativo conforme definido abaixo, possuindo pelo menos cerca de 80% identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência nativa do polipeptídeo de Fator D, tal como a sequência nativa do polipeptídeo do Fator D humana nativo (NM_001928). Normalmente, um fator D variante terá pelo menos cerca de 80% identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 85% identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 90% identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 95% identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos comparada com a sequência de aminoácido humana madura (NM_001928).

[047] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácido” é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência do fator D de referência, após o alinhamento das sequências e introdução dos intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte de identidade de sequência. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, tais como o uso de softwares de computador disponíveis ao público, tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign

21/149 (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. A identidade de sequência é então calculada em relação à sequência mais longa, ou seja, mesmo que uma sequência curta demonstre 100% de identidade de sequência com uma porção de uma sequência mais longa, a identidade de sequência total será inferior a 100%.

[048] “Percentual (%) de identidade de sequência de ácido nucleico” é definido como o percentual de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos na sequência de referência que codifica o fator D, após o alinhamento das sequências e introdução dos gaps, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de ácidos nucleicos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. A identidade de sequência é então calculada em relação à sequência mais longa, ou seja, mesmo que uma sequência curta demonstre 100% de identidade de sequência com uma porção de uma sequência mais longa, a identidade de sequência total será inferior a 100%.

[049] Uma molécula isolada de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está comumente associada à fonte

22/149 natural de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente, sob a forma ou a configuração em que é encontrado na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas são moléculas, por conseguinte, distintas das moléculas de ácidos nucleicos naturais, uma vez que existe em células. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui moléculas de ácidos nucleicos contidas nas células que normalmente expressam um polipeptídeo codificado onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está localizada em um cromossomo diferente daquele encontrado nas células naturais.

[050] Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fator D isolada é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está comumente associada na fonte natural de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fator D. Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fator D isolada é diferente na forma ou configuração daquela que é encontrada na natureza. Moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo de fator D são moléculas, que, portanto, são distintas da(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) um polipeptídeo de fator D da forma como ocorrem nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico codificadora de fator D isolada inclui moléculas de ácido nucleico codificadoras de fator D contidas nas células que normalmente expressam fator D onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está localizada em um local no cromossomo diferente daquele encontrado naturalmente nas células.

[051] O termo antagonista é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que seja capaz de neutralizar, bloquear total ou parcialmente, inibir, revogar, reduzir ou interferir com a atividade biológica do fator D. Antagonistas do Fator D incluem, sem se limitar, aos anticorpos antifator D, e anticorpos variantes destes, fragmentos de ligação ao antígeno dos

23/149 mesmos, outros polipeptídeos de ligação, pequenas moléculas peptídicas e não peptídicas, que se ligam ao fator D e são capazes de neutralizar, bloquear total ou parcialmente, inibir, revogar, reduzir ou interferir com as atividades do fator D, como a capacidade do Fator D de participar na patologia de uma condição ocular associada ao complemento.

[052] Uma pequena molécula é definida na presente invenção como uma molécula que possui um peso molecular abaixo de cerca de 1000 Daltons.

[053] Ativo ou atividade ou atividade biológica, no contexto de um antagonista do fator D da presente invenção é a capacidade de antagonizar (inibir parcial ou totalmente) a atividade biológica do fator D. Um exemplo de atividade biológica de um antagonista do fator D é a habilidade de conseguir uma melhora mensurável no estado, por exemplo, patológico, de uma doença ou distúrbio associado ao fator D, como, por exemplo, uma condição ocular associada ao complemento. A atividade pode ser determinada em testes in vitro ou in vivo, incluindo ensaios de ligação, ensaios de hemólise pela via alternativa (por exemplo, ensaios mensurando a inibição da atividade ou ativação da via alternativa do complemento), utilizando um modelo animal relevante, ou por ensaios clínicos em humanos.

[054] O termo distúrbio associado ao complemento é usado no sentido mais amplo e abrange as doenças associadas com a ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Elas incluem a ativação do complemento durante as operações de circulação extracorpórea, a ativação do complemento devido à isquemia e reperfusão após o infarto agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão por esmagamento, falência de múltiplos órgãos, choque hipovolêmico, isquemia intestinal ou outros eventos causadores de isquemia. A ativação do complemento também foi demonstrada por estar associada às condições

24/149 inflamatórias, tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, síndrome da angústia respiratória do adulto, hemodiálise, choque anafilático, asma grave, angioedema, doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. Os distúrbios podem ser resultado de uma reação adversa ao medicamento, alergia ao medicamento, síndrome de extravasamento vascular induzida por IL-2 ou alergia ao meio de contraste radiológico. Ele também inclui doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla. A ativação do complemento também está associada com a rejeição de transplantes. A ativação do complemento também está associada com doenças oculares, tal como a degeneração macular relacionada, à idade, retinopatia diabética e outras retinopatias isquêmicas, neovascularização coroidal (NVC), uveíte, edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão da veia central da retina (OVCR), neovascularização da córnea, e neovascularização da retina.

[055] O termo condição ocular associada ao complemento é usado no sentido mais amplo e inclui todas as doenças oculares de patologias que envolvem o complemento, incluindo as vias clássica e alternativa do complemento e, em particular, a via alternativa do complemento. Condições oculares associadas ao complemento incluem, sem se limitar, a doenças maculares degenerativas, como todos os estágios da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), inclusive as formas seca e úmida (não exsudativa e exsudativa), neovascularização da coroide (NVC), uveites, retinopatia diabética e outras retinopatias isquêmicas, e outras doenças intra-oculares neovasculares, tais como o edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão da veia central da retina (OVCR), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.

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Em um exemplo, as doenças oculares associadas ao complemento inclui a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a não exsudativa (por exemplo, DMRI seca ou atrofia geográfica (AG)) e exsudativa (por exemplo, a DMRI exsudativa (DMRI com neovascularização de coroide (NVC)), retinopatia diabética (RD), endoftalmite e uveíte. Em outro exemplo, a DMRI não exsudativa pode incluir a presença de drusas duras, drusas moles, atrofia geográfica e/ou hiperpigmentação (pigment clumping). Em um exemplo, doenças oculares associadas ao complemento incluem a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a DMRI precoce (por exemplo, inclui múltiplas drusas pequenas e uma ou mais de tamanho médio não extensa), a DMRI intermediária (por exemplo, inclui extensas drusas médias a uma ou mais drusas grandes) e DMRI avançada (por exemplo, inclui a atrofia geográfica ou DMRI avançada úmida (VNC). (Ferris et al., AREDS Report N^Q. 18, ; Sallo et al., Eye Res., 34(3): 238-40 (2009); Jager et al., New Engl. J. Med., 359(1): 1735 (2008)). Em outro exemplo, a DMRI seca intermediária pode incluir grandes drusas confluentes. Em outro exemplo, a atrofia geográfica pode incluir a perda de fotorreceptores e/ou do epitélio pigmentado da retina (EPR). Em outro exemplo, a área de atrofia geográfica pode ser pequena ou grande e/ou pode ser na área da mácula na retina periférica. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI seca intermediária. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a atrofia geográfica. Em um exemplo, a condição ocular associado ao complemento é a DMRI úmida (neovascularização da coroide (NVC)).

[056] Tratamento é uma intervenção realizada com a intenção de impedir o desenvolvimento ou alteração da patologia de um distúrbio. Portanto, o termo tratamento refere-se tanto a tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tais tratamentos incluem aqueles que já estão com a doença, bem como aqueles

26/149 em que a doença deve ser evitada. No tratamento de uma doença imuno relacionada, um agente terapêutico pode alterar diretamente a magnitude da resposta de um componente da resposta imune, ou tornar a doença mais suscetível ao tratamento por outros agentes terapêuticos, por exemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes anti-inflamatórios, quimioterápicos, etc.

[057] A “patologia” de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento, inclui todos os fenômenos que comprometem o bem-estar do paciente. Isso inclui, sem se limitar, o crescimento celular incontrolável ou anormal (neutrofílico, eosinofílico, de monócitos, e células linfocitárias), a produção de anticorpos, autoprodução de anticorpos, produção de complemento, interferência no funcionamento normal das células vizinhas, liberação de citocinas ou outros produtos de secreção em níveis anormais, a supressão ou agravamento de qualquer resposta inflamatória ou imunológica, infiltração de células inflamatórias (neutrófilos, eosinófilos, monócitos, linfócitos) em espaços celulares, e etc.

[058] O termo mamífero, conforme utilizado no presente, referese a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo, sem se limitar, os seres humanos, primatas superiores, animais domésticos e agrícolas, e animais de zoológico, animais de esportes ou animais de estimação, tais com eqüinos, suínos, bovinos, cães, gatos, furões e etc. Em um exemplo de realização da presente invenção, o mamífero é um ser humano.

[059] A administração em combinação com um ou mais agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) inclui a administração simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem.

[060] Quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade de um antagonista de Fator D que é necessária para alcançar uma melhora mensurável no estado, por exemplo, patologia, de uma doença ou condição alvo como, por exemplo, a condição ocular associada ao complemento.

27/149 [061] A expressão “sequências controle” designa sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As sequências de controle que são apropriadas para procariotos incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um sítio de ligação ao ribossomo. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadenilação e amplificadores.

[062] Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando este é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder de secreção está operacionalmente ligado ao DNA que codifica um polipeptídeo se caso este seja expresso na forma de pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificadores está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação caso este afete a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomos está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação caso este esteja posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, “operacionalmente ligado” indica que as sequências de DNA ligadas são contíguas e, no caso do líder de secreção, é contígua e está dentro do quadro de leitura. Os amplificadores, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é realizada por meio de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso estes sítios não existam, adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.

[063] Estringência de hibridação é facilmente determinável por um técnico no assunto, e, geralmente, é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, as sondas mais longas requerem temperaturas mais altas para o anelamento adequado, enquanto que as sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. Hibridação geralmente depende da capacidade de

28/149 desnaturação do DNA para o re-anelamento quando fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejada entre a sonda e a sequência hibridizável, maior a temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, conclui-se que temperaturas relativas mais elevadas tenderíam a tornar as condições de reação mais estringentes, enquanto que temperaturas mais baixas, menos estringentes. Para detalhes adicionais e explicação sobre a estringência das reações de hibridização, vide Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

[064] A expressão condições de estringência elevada ou “condições de estringência elevadas”, conforme definido no presente, pode ser identificada por aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e temperatura elevada para lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M / citrato de sódio 0.0015 M / dodecil sulfato de sódio 0.1% a 50 °C; (2) empregam durante hibridização um desnaturante, como a formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com 0,1% de albumina de soro bovino / 0.1% de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/50mM de tampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3) hibridização overnight em uma solução que emprega 50% de formamida, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS, 10% de dextran sulfato a 42 °C, com uma lavagem de 10 minutos a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio / citrato de sódio), seguida por uma lavagem de alta estringência de 10 minutos constituído por 0,1 x SSC contendo EDTA a 55O.

[065] A expressão condições de estringência moderada, conforme definido no presente, pode ser identificada como descrito por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold

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Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso da solução de lavagem e condições de hibridização menos estringentes do que as descritas acima (por exemplo, temperatura, força iônica e % de SDS).

[066] Um exemplo de condições de estringência moderada é a incubação overnight a 37 °C em uma solução que compreende:

- 20% formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x Solução de Denhardt, 10% de dextrano sulfato, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, seguido pela lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37-50 O. Os técnicos hábeis no assunto irão reconhecer como ajustar a temperatura, força iônica, etc, quando isto for necessário, para ajustar fatores como o comprimento da sonda e similares.

[067] O termo variável no contexto do domínio variável de anticorpos refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem amplamente na sequência entre os anticorpos e são utilizados na especificidade de ligação de cada anticorpo específico para o seu alvo específico. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais (frameworks) (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem 4 regiões de FRs, adotando em grande parte uma configuração em folha-β, conectadas por 3 CDRs, que formam conexões em alças (loops) e, em alguns casos, fazem parte da estrutura em folha-β. As CDRs de cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuindo para a formação do

30/149 sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (vide Kabat et al.). Conforme usado no presente, a numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulina é feita de acordo com o sistema de numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulina de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987), salvo quando indicado de outra forma.

[068] O termo região hipervariável, HVR, ou HV, quando utilizado no presente refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Diversos delineamentos da região hipervariável são utilizados e englobados neste documento. As regiões determinantes de complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade das sequências e são as mais comumente usadas (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991). Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). A extremidade do loop CDR-H1 de Chothia quando numerada usando o sistema de numeração de Kabat varia entre H32 e H34, dependendo do tamanho do loop (isto é porque o sistema de numeração Kabat coloca as inserções em H35A e H35B, mesmo se 35A ou 35B não estão presentes o loop termina em 32, se apenas 35A estiver presente o loop termina em 33, se ambos 35A e 35B estão presentes o loop termina em 34). As regiões hipervariável do AbM representam um acordo entre os CDRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa “Oxford Molecular AbM antibody modeling software”. O contato das regiões hipervariáveis é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino

31/149 disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são descritas a seguir.

Alça (Loop)	Kabat	AbM	Chothia	Contato
L1	L24-L34	L24-L34	L24-L34	L30-L36
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L56	L46-L55
L3	L89-L97	L89-L97	L89-L97	L89-L96
H1	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32..34	H30-H35B

(Numeração de Kabat)

H1	H31-H35	H26-H35	H26-H32	H30-H35
(Numeração de Chothia)
H2	H50-H65	H50-H58	H52-H56	H47-H58
H3	H95-H102	H95-H102	H95-H102	H93-H101

[069] As regiões hipervariáveis podem compreender regiões hipervariáveis alongadas, como as seguintes: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93102, 94-102 ou 95-102 ou 95 a 102 (H3) no VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com a Kabat et al., supra para cada uma dessas definições.

[070] Resíduos da região estrutural (framework) ou FR são aqueles resíduos do domínio variável que não são resíduos da região hipervariável ou resíduos CDR definidos no presente.

[071] As expressões “numeração de resíduos do domínio variável como em Kabat ou numeração da posição dos aminoácidos como em Kabat, e variantes destas, referem-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou cadeia leve da compilação dos anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Usando este sistema de

32/149 numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos, o que corresponde a redução ou inserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c, etc., de acordo com Kabat), após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat padrão.

[072] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, os resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al. Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) expressamente incorporado ao presente pedido pela referência). O sistema de numeração EU ou índice EU é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat etal., Supra; a região de dobradiça no domínio constante da cadeia pesada é aproximadamente os resíduos de 216230 (numeração EU) da cadeia pesada). O “índice EU como em Kabat” referese a numeração do resíduo do anticorpo humano lgG1 EU. Salvo quando disposto de outra maneira no presente documento, referência aos números de resíduos no domínio variável de anticorpos significa a numeração de resíduos utilizando o sistema de numeração de Kabat. Salvo quando expresso de outra maneira na presente invenção, as referências aos números de resíduos no domínio constante de anticorpos referem-se a numeração de resíduos pelo sistema de numeração EU (vide, por exemplo, pedido de patente provisório US 60/640.323, Figuras para a numeração EU).

33/149 [073] Conforme usado no presente, polipeptídeo refere-se em geral aos peptídeos e proteínas possuindo mais de cerca de dez aminoácidos. Em um exemplo, o polipeptídeo é uma proteína de mamífero, cujos exemplos incluem o fator D e fragmentos e/ou variantes do Fator D. Em outro exemplo, o polipeptídeo é um anticorpo de corpo inteiro, ou fragmento de anticorpo deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), que se liga ao Fator D humano, exemplos dos quais incluem Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[074] Uma variante ou sequência de aminoácidos variante de um polipeptídeo de partida é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos diferente daquela do polipeptídeo partida. Geralmente, uma variante possui pelo menos 80% de identidade de sequência, e de preferência pelo menos 90% de identidade de sequência, e mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência, e mais preferivelmente ainda pelo menos 98% identidade de sequência com o polipeptídeo nativo. O percentual de identidade de sequência é calculado por exemplo,como em Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:1382-1386 (1983), versão do algoritmo descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:. 443-453 (1970), após o alinhamento das sequências para fornecer o máximo de homologia. sequências de aminoácidos variantes de um polipeptídeo podem ser preparadas através da introdução de alterações nucleotídicas apropriadas para codificação de DNA do polipeptídeo, ou pela síntese de peptídeos. Essas variantes incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de, resíduos dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As

34/149 modificações de aminoácidos também podem alterar os processos póstradução do polipeptídeo, tal como alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação. Métodos para a geração de variantes de sequências de aminoácidos dos polipeptídeos estão descritos, por exemplo, na Patente US 5.534.615, expressamente incorporada ao presente pedido pela referência.

[075] Um anticorpo variante ou anticorpo modificado de um anticorpo de partida é um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos diferente daquela do anticorpo de partida, em que um ou mais resíduos de aminoácidos do anticorpo foram modificados. Geralmente, um anticorpo variante possui pelo menos 80% de identidade de sequência, e de preferência pelo menos 90% de identidade de sequência, e mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência, e mais preferivelmente ainda pelo menos 98% identidade de sequência com o anticorpo de partida. O percentual de identidade de sequência é determinado, por exemplo, como em Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:1382-1386 (1983), versão do algoritmo descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:. 443-453 (1970), após o alinhamento das sequências do anticorpo de partida e o anticorpo variante candidato para fornecer máximo de homologia. Identidade ou similaridade com relação a sequência parental é definida no presente como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência variante candidata que são idênticos (ou seja, o mesmo resíduo) ou similares (ou seja, resíduos de aminoácido do mesmo grupo com base nas propriedades da cadeia lateral, vide abaixo) com os resíduos de anticorpos parentais, após o alinhamento das sequências e a introdução de gaps, se necessário, para atingir a percentagem máxima de identidade de sequência. As sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de alterações nucleotídicas apropriadas no DNA que codifica o anticorpo ou pela síntese de peptídeos. Essas variantes incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou

35/149 substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos do anticorpo de interesse. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As modificações de aminoácidos também podem alterar os processos pós-tradução do anticorpo, tal como alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação. Métodos para a geração de sequências de anticorpos variantes são similares aquelas para a geração de sequências de aminoácidos variantes de polipeptídeos descrito na Patente US 5.534.615, expressamente incorporada ao presente pedido pela referência.

[076] Uma variante “desaminada de uma molécula de polipeptídeo é um polipeptídeo em que um ou mais resíduos de aspargina (N ou Asn) do polipeptídeo original foi convertida em asparato (D ou Asp), ou seja, a cadeia lateral amida neutra foi trocada por um resíduo com característica ácida geral. A desaminação pode ser prevenidas através da conversão da asparagina (N ou Asn) em glutamina (Q ou Gin) ou alanina (A ou Ala) ou serina (S ou Ser) (Amphlett, G. etal. Pharm. Biotechnol., 09:01 -140 (1996)).

[077] Uma variante oxidada de uma molécula polipeptídica é um polipeptídeo onde um ou mais resíduo(s) de metionina (M ou Met) ou triptofano (W ou Trp) do polipeptídeo original foi(foram) convertido(s) para sulfona ou sulfóxido através do enxofre da metionina. A oxidação pode ser evitada através da conversão da metionina (M ou Met) por leucina (L ou Leu) ou isoleucina (I ou He) (Amphlett, G. etal. Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)).

[078] Uma variante piroglutamato de uma molécula polipeptídica é um polipeptídeo onde um ou mais resíduo(s) de glutamina (Q ou Gin) do polipeptídeo original foi(foram) convertido(s) para piroglutamato que ocorre quando os resíduos de glutamina, por exemplo, resíduos de glutamina N-terminal, ciclizam de forma espontânea resultando em piroglutamato. A conversão em piroglutamato pode ser evitada pela conversão do(s) resíduo(s)

36/149 de glutamina (Q ou Gin) por glutamato (E ou Glu) (Amphlett, G. et al. Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)).

[079] O termo fragmento de anticorpo refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral, a região variável ou de ligação ao alvo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv. A expressão fragmento funcional ou análogo de um anticorpo é um composto com atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo de comprimento total. Por exemplo, um fragmento funcional ou análogo de um anticorpo anti-fator D humano é aquele que pode se ligar ao Fator D de tal maneira que possa prevenir ou reduzir substancialmente a ativação do complemento. Como usado no presente, fragmentar funcional com relação a anticorpos, refere-se a fragmentos Fv, F(ab) e F(ab')2. Um fragmento “Fv” é um fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação ao alvo. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em estreita associação não covalente (dímero Vh-Vl). É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao alvo sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao alvo. No entanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um alvo) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao alvo. Fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv”compreendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um polipeptídeo ligante entre os domínios Vh e Vl, permitindo que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao alvo.

[080] O fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (Ch1) da cadeia pesada. Os fragmentos

37/149

Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na extremidade carbóxi-terminal do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas a partir da região de articulação do anticorpo. Fragmentos F(ab') são produzidos pela divagem das pontes de dissulfeto nas cisteínas da região de dobradiça como produto da digestão pela pepsina do F(ab')2. Acoplamentos químicos adicionais de fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) são conhecidos pelos técnicos do assunto.

[081] Conforme utilizado na presente invenção, o termo biblioteca refere-se a uma variedade de sequências de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), ou os ácidos nucleicos que codificam essas sequências, sendo estas sequências diferentes na combinação de aminoácidos variantes que são introduzidas nessas sequências de acordo com os métodos da presente invenção.

[082] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que poderíam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio do alvo. Além disso, ao contrário de preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no alvo. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos a medida em que podem ser sintetizados por cultura de hibridomas, livres de contaminação por outros anticorpos. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como a necessidade de se produzir qualquer

38/149 anticorpo por um método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para uso com a presente invenção podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpos usando as técnicas conhecidas. Os anticorpos monoclonais parentais para serem utilizados de acordo com a presente invenção, podem ser produzidos pelo método do hibridoma primeiramente descrito por Kohler e Milstein, Nature 256, 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos recombinantes.

[083] Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao alvo) que contêm sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDRs correspondem a de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode também compreender de pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

[084] Os termos célula, linhagem celular e cultura de células incluem a progênie. Deve se compreender também que toda progênie pode não ser exatamente idêntica quanto ao conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou acidentais. São incluídas as progênies variantes que possuem a mesma função ou propriedade biológica, conforme selecionado na célula transformada inicial. As células hospedeiras, utilizadas na presente invenção geralmente são hospedeiras procarióticas ou eucarióticas.

[085] O termo vetor significa uma construção de DNA contendo uma sequência de DNA que é operacionalmente ligada a uma sequência

39/149 controle adequada capaz de efetivar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para o controle de tal transcrição, uma sequência de codificação dos sítios de ligação adequados do RNAm ao ribossomo, e as sequências que controlam o término da transcrição e tradução. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode, em alguns casos, integrar-se ao genoma. De acordo com o presente relatório descritivo, os termos “plasmídeo” e “vetor” são algumas vezes utilizados de forma alternada, sendo que o termo “plasmídeo” é a forma de vetor mais comumente utilizada. No entanto, a presente invenção pretende abranger outras formas de vetores que apresentam função equivalente e que são ou se tornarão conhecidos no estado da técnica.

[086] A palavra marcador, quando utilizada no presente referese a um composto ou composição detectável que pode ser conjugado, direta ou indiretamente a uma molécula ou proteína, por exemplo, um anticorpo. O marcador pode ser ele mesmo detectável (por exemplo, marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes), ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.

[087] Conforme utilizado no presente fase sólida significa matriz não aquosa ao qual o anticorpo da presente invenção pode aderir. Exemplos de fases sólidas abrangidas na presente invenção incluem aquelas formadas parcialmente ou integralmente de vidro (por exemplo, vidros de poros controlados), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno álcool polivinílico e silicones. Em alguns exemplos de realização, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa

40/149 de ensaio, em outros, é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade).

[088] Exibição por fagos é uma técnica na qual polipeptídeos variantes são exibidos como proteínas de fusão em pelo menos uma porção da proteína da cápside na superfície do fago, por exemplo, fago filamentoso, partículas. A utilidade da exibição por fagos reside no fato de que grandes bibliotecas de proteínas variantes aleatorizadas podem ser rapidamente e eficazmente classificadas para aquelas sequências que se ligam a um antígeno alvo com alta afinidade. A exposição do peptídeo e da biblioteca de proteína por fago tem sido utilizada para a triagem de milhões de polipeptídeos pra selecionar aqueles com propriedades de ligação específicas. Métodos de exibição por fago polivalente foram utilizados para exibir pequenos peptídeos aleatorizados e pequenas proteínas através de fusões tanto com gene III quanto com o gene VIII de fago filamentoso. Wells e Lowman (1992), Curr. Opin. Struct. Biol, 3:355-362, e as referências nele citada. Em uma exibição por fago monovalente, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é fundida com um gene III ou parte deste, e expresso em níveis baixos na presença do gene da proteína III do tipo selvagem de modo que as partículas do fago exibem uma cópia ou nenhuma das proteínas de fusão. Os efeitos da avidade são relativamente reduzidos no fago polivalente de modo que a classificação é com base na afinidade intrínseca do ligante, e são utilizados vetores de fagomídeos, o que simplifica as manipulações do DNA. Lowman e Wells (1991), “Methods: A companion to Methods in Enzymology’’, 3:205-0216.

[089] Um fagomídeo” é um vetor plasmidial possuindo uma origem de replicação bacteriana, por exemplo, Co1E1, e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. O fagomídeo pode ser utilizado em qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambdoide. O plasmídeo geralmente também irá conter um

41/149 marcador selecionável para a resistência aos antibióticos. Segmentos de DNA clonados nestes vetores podem ser propagados como plasmídeos. Quando células contendo os vetores são fornecidas com todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o modo de replicação do plasmídeo altera o rolamento do círculo replicação para gerar cópias de uma cepa do DNA plasmidial e partículas do envelope do fago. O fagomídeo pode formar partículas de fago infecciosas e não infecciosas. Este termo inclui fagomídeos que contêm um gene da proteína da cápside do fago ou um fragmento deste ligado a um polipeptídeo heterólogo, como um gene de fusão, de tal forma que o polipeptídeo heterólogo é exibido na superfície da partícula do fago.

[090] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de outra região Fc em virtude de pelo menos uma “modificação de aminoácido” conforme definido na presente invenção. Preferivelmente, a região Fc variante possui pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparada a uma região Fc de sequência nativa ou a uma região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou em uma região Fc do anticorpo parental. A região Fc variante da presente invenção, irá possuir preferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma sequência da região Fc nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta. Exemplos de sequência nativa de regiões Fc humana são exibidos na FIG. 23 do documento WO 00/42072 e incluem uma sequência nativa da região Fc do lgG1 humano (alótipos não A e A); sequência nativa da região Fc da lgG2 humana; sequência nativa da região Fc da lgG3 humana e sequência nativa da região Fc da lgG4 humana, bem como as variantes de ocorrência natural

42/149 destas. A sequência nativa das regiões Fc murina é exibida na FIG. 22A do documento WO 00/42072.

[091] De acordo com a presente invenção, afinidade de ligação ao FcRn alterada é aquela que possui uma atividade de ligação ao FcRn tanto aumentada quanto diminuída em relação a um polipeptídeo parental ou a um polipeptídeo que compreende uma sequência nativa da região Fc. Em um exemplo, o anticorpo com afinidade de ligação ao FcRn alterada possui um aumento na ligação ao FcRn em pH 6,0 e/ou diminuição de ligação ao FcRn em pH 7,0. O variante, que exibe um aumento na ligação ao FcR, se liga a pelo menos um FcR com melhor afinidade que o polipeptídeo parental. O variante, que exibe uma diminuição na ligação ao FcR, se liga a pelo menos um FcR com pior afinidade que o polipeptídeo parental. O variante que se liga um FCR com melhor afinidade que um polipeptídeo parental, é aquele que se liga a um FCR com afinidade de ligação substancialmente melhor do que o anticorpo parental, quando a quantidade de polipeptídeo variante e polipeptídeo parental no ensaio de ligação é essencialmente a mesma. Por exemplo, o polipeptídeo variante com afinidade de ligação a FcR melhorada pode exibir a partir de cerca de 1,15 vezes a cerca de 100 vezes, por exemplo, de cerca de 1,2 vezes a cerca de 50 vezes de melhora na afinidade de ligação ao FcR em relação ao polipeptídeo parental, onde a afinidade de ligação ao FcR é determinada.

[092] Uma alteração de aminoácido refere-se a uma mudança na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácido predeterminada. Alterações exemplares incluem a substituição de um aminoácido, a inserção e/ou deleção. Um exemplo de uma alteração de aminoácido na presente invenção é uma substituição.

[093] Uma alteração de aminoácidos em uma posição específica, por exemplo, da região Fc, refere-se a substituição ou deleção dos

43/149 resíduos especificados, ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácidos adjacente ao resíduo especificado. Por inserção adjacente a um resíduo especificado significa inserção dentro um ou dois resíduos deste. A inserção pode ser N-terminal ou C-terminal ao resíduo especificado.

[094] Uma substituição de aminoácido refere-se a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente em uma determinada sequência de aminoácido por outro resíduo de aminoácidos substituto diferente. O resíduo ou resíduos de substituição pode(m) ser resíduos de aminoácidos de ocorrência natural (ou seja, codificados pelo código genético) e selecionado(s) a partir do grupo que consiste em: Alanina (Ala), arginina (Arg); asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys), glutamina (Gin), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (He), leucina (Leu), lisina (Lis), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Vai). A substituição por um ou mais resíduo(s) de aminoácido(s) não natural(ais) também é abrangida pela definição de substituição de aminoácido da presente invenção. Um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural refere-se a um resíduo que não um daqueles resíduos de aminoácidos de ocorrência natural listados acima, e que é capaz de ligar covalentemente ao(s) resíduo(s) de aminoácidos adjacente(s) em uma cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem a norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros resíduos de aminoácidos análogos, tais como os descritos em Ellman et al. Meth. Enzym, 202: 301-336 (1991). Para gerar tais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os procedimentos de Noren etal., Science, 244:182 (1989) e Ellman etal., supra, podem ser usados. Resumidamente, esses procedimentos envolvem a ativação quimicamente de um supressor de tRNA com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural seguido pela transcrição e tradução in vitro do RNA.

44/149 [095] Uma inserção de aminoácido refere-se a incorporação de pelo menos um aminoácido em uma sequência de aminoácido predeterminada. Embora a inserção geralmente consista da inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, o presente pedido contempla inserções peptídicas maiores, por exemplo, a inserção de cerca de três a cinco ou mesmo até cerca de dez resíduos de aminoácidos. O(s) resíduo(s) inserido(s) pode(m) ser natural(is) ou não natural(is), conforme indicado acima.

[096] Uma deleção de aminoácido refere-se a remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido a partir de uma sequência de aminoácido predeterminada.

II - Descrição Detalhada [097] A presente invenção fornece antagonistas do fator D, incluindo os anticorpos anti-fator D, e variantes destes e fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) úteis para a prevenção e para o tratamento de condições associadas ao complemento, incluindo as condições oculares (todas as doenças e condições oculares cuja patologia envolve o complemento, incluindo a via clássica e via alternativa e, em particular, a via alternativa do complemento), como, por exemplo, as doenças degenerativas da mácula, como todos os estágios da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo as formas seca e úmida (não exsudativa e exsudativa), a neovascularização de coroide (NVC), uveites, retinopatia diabética e outras retinopatias isquêmicas, endoftalmite e outras doenças neovasculares intraoculares, tais como o edema macular diabético, a miopia patológica, a doença de Von Hippel-Lindau, a histoplasmose do olho, a oclusão da veia central da retina (OVCR), a neovascularização da córnea e a neovascularização da retina. Um grupo de doenças oculares associadas ao complemento inclui a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), incluindo a não exsudativa (por exemplo, DMRI seca ou atrofia geográfica

45/149 (AG)) e exsudativa (por exemplo, a DMRI exsudativa (DMRI com neovascularização de coroide (NVC)), retinopatia diabética (RD), endoftalmite e uveíte. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a DMRI seca intermediária. Em um exemplo, a condição ocular associada ao complemento é a atrofia geográfica. Em um exemplo, a condição ocular associado ao complemento é a DMRI úmida (neovascularização da coroide (NVC)).

[098] A DMRI é a degeneração macular relacionada à idade, que é a principal causa de disfunção visual irreversível em indivíduos com idade superior a 60 anos. Existem dois tipos de DMRI, a DMRI não exsudativa (seca) e a DMRI exsudativa (úmida). A forma seca ou não exsudativa envolve alterações atróficas e hipertróficas no epitélio pigmentar da retina (EPR) subjacente à retina central (mácula), bem como depósitos (drusas) sobre o EPR. Pacientes com a DMRI não exsudativa podem evoluir para a forma úmida ou exsudativa da DMRI, no qual os vasos sanguíneos anormais, denominados de membranas neovasculares coroidais (NVCs), desenvolvem sob a retina o extravazamento de fluidos e sangue, e causando finalmente a cegueira por cicatriz disciforme na retina e sob esta. A DMRI não exsudativa, que é geralmente uma precursora da DMRI exsudativa, é mais comum. A apresentação da DMRI não exsudativa varia: E podem estar presentes; drusas duras, drusas moles, atrofia geográfica do EPR, e aglomeração (clumping) de pigmentos. Os componentes do complemento são depositados no EPR e nos estágios iniciais da DMRI e são os principais constituintes das drusas.

1. Anticorpos Anti-fator D Humanizados [099] A presente invenção inclui a produção e utilização de anticorpos anti-fator D humanizados, e fragmentos destes. Métodos exemplares para a geração de anticorpos são descritos em detalhes nas seções seguintes.

46/149 [0100] Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos no estado da técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzido a partir de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados de resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et a!., Nature, 332:323327 (1988); Verhoeyen et a!., Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de sequencia(s) CDR ou CDRs pelas sequências correspondentes do anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (US 4.816.567), em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de CDR e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0101] A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e/ou resposta HAMA (anticorpo humano anticamundongo) quando o anticorpo destina-se ao uso terapêutico humano. A redução ou eliminação de uma resposta HAMA é geralmente um aspecto importante do desenvolvimento clínico adequado de agentes terapêuticos. Vide, por exemplo, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer F?es.(1990),

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50:1495. Conforme descrito no presente, a presente invenção fornece anticorpos que são humanizados de modo que a resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ainda ser obtidos através de métodos rotineiros conhecidos no estado da técnica, alguns dos quais estão descritos abaixo. De acordo com o então chamado método de “melhor adequação” (best-fit), a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecidas. A sequência de domínio V humano que é mais próxima da sequência do roedor é identificada e a sua região estrutural humana (FR) é aceita para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. A mesma região estrutural pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta etal., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

[0102] Por exemplo, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo, conforme descrito no presente, pode servir como sequência inicial (parental) para a diversificação da região estrutural e/ou sequência(s) hipervariável(eis). Uma sequência da região estrutural selecionada a qual uma sequência hipervariável de partida está ligada é referida no presente como uma região estrutural humana aceptora. Embora a região estrutural humana aceptora possa ser de, ou derivada de uma imunoglobulina humana (as regiões Vl e/ou Vh desta), a região estrutural humana aceptora pode ser de, ou derivada de uma sequência da região estrutural de consenso humano tal como as regiões estruturais que têm demonstrado possuir uma imunogenicidade mínima ou nenhuma imunogenicidade em pacientes humanos. Uma região estrutural humana aceptora para os propósitos da presente invenção é uma

48/149 região estrutural contendo a sequência de aminoácidos de uma região estrutural Vl ou Vh derivada de uma região estrutural da imunoglobulina humana, ou a partir de uma região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural humana aceptora derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido desta ou pode conter uma alteração na sequência de aminoácidos pré-existente. Quando alterações de aminoácidos pré-existentes estão presentes, preferivelmente não mais de 5 e preferivelmente 4 ou menos, ou 3 ou menos alterações de aminoácidos préexistentes estão presentes. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora Vh é idêntica em sua sequência com a sequência da região estrutural da imunoglobulina humana Vh ou sequência da região estrutural de consenso humano. Em um exemplo de realização, a região estrutural humana aceptora Vl é idêntica em sua sequência com a sequência da região estrutural da imunoglobulina humana Vl ou sequência da região estrutural de consenso humano. Uma região estrutural de consenso humano é uma região estrutural que representa os mais comumente resíduos de aminoácidos que ocorrem em uma seleção de sequências da região estrutural Vh ou Vl da imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção das sequências Vh ou VLda imunoglobulina humana é originada de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al. Em um exemplo de realização, para o Vl, o subgrupo é subgrupo kappa I como em Kabat et al. Em um exemplo de realização, para o Vl, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat etal.

[0103] Quando a região aceptora é derivada de uma imunoglobulina humana, pode-se selecionar opcionalmente uma sequência da região estrutural que é selecionada com base em sua homologia com a sequência da região estrutural doadora, pelo alinhamento da sequência da

49/149 região estrutural doadora com várias sequências de regiões estruturais humanas em uma coleção de sequências de regiões estruturais humanas, e selecionando a sequência de maior homologia da região estrutural como aceptora. A região estrutural humana aceptora pode ser de, ou derivada de sequências de linhagens germinativas de anticorpos humanos disponíveis em bases de dados públicas.

[0104] Em um exemplo de realização, as regiões estruturais de consenso humano na presente invenção são, ou derivam das sequências das regiões estruturais de consenso Vh subgrupo VII e/ou Vl kappa subgrupo I.

[0105] Em um exemplo de realização, a região estrutural molde (template) da região estrutural humana utilizada para a produção de um anticorpo anti-fator D pode compreender as sequências da região estrutural a partir de um molde que compreende uma combinação de VI-4.1 b+ (família Vh7) e JH4d para a cadeia Vh e/ou uma combinação de DPK4 (família VkI) e JK2 para a cadeia Vl.

[0106] Em um exemplo de realização, a região estrutural aceptora Vh humana compreende, duas, três ou todas as seguintes sequências da região estrutural:

FR1 que compreende QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS (aminoácidos 1 -25 da SEQ ID No: 2),

FR2 que compreende WVRQAPGQGLE (aminoácidos 36-49 da SEQ ID No: 2),

FR3 que compreende RFVFSLDTSVSTAYLQISS LKAEDTAVYYCER (aminoácidos 67-98 da SEQ ID No: 2),

RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE (aminoácidos 67-97 da SEQ ID No: 2),

RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC (aminoácidos 67-96 da SEQ ID No: 2),

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RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS (SEQ ID No: 3), ou

RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR (SEQ ID No: 4)

FR4 que compreende WGQGTLVTVSS (aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 2).

[0107] Em um exemplo de realização, a região estrutural aceptora Vl humana pode compreender uma, duas, três ou todas as seguintes sequências da região estrutural:

FR1 que compreende DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC (aminoácidos 1 -23 da SEQ ID No: 1),

FR2 que compreende WYQQKPGKVPKLLIS (aminoácidos 35-49 da SEQ ID No: 1),

FR3 que compreende GVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDVATYYC (aminoácidos 57-88 da SEQ ID No: 1),

FR4 que compreende FGQGTKLEIK (aminoácidos 98-107 da SEQ ID No: 1), ou

FGQGTKVEIK (SEQ ID No: 5).

[0108] Embora o aceptor possa ser idêntico na sequência com a região estrutural humana selecionada, seja esta proveniente de uma imunoglobulina humana ou de uma região estrutural de consenso humano, a presente invenção contempla que a sequência aceptora pode compreender substituições de aminoácidos pré-existentes em relação à sequência de imunoglobulina humana ou sequência da região estrutural de consenso humano. Estas substituições pré-existentes são preferencialmente mínimas; normalmente apenas quatro, três, dois ou uma diferença de aminoácido em relação à sequência de imunoglobulina humana ou sequência da região estrutural de consenso humano.

[0109] Os resíduos da região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados na região estrutural aceptora Vl e/ou Vh humana.

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Por exemplo, este pode incorporar resíduos correspondentes aos resíduos CDR de Kabat, resíduos da alça hipervariável de Chothia, resíduos AbM, e/ou resíduos de contato. Opcionalmente, os resíduos das regiões hipervariáveis alongadas, são incorporados da seguinte forma: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94102, ou 95-102 (H3).

[0110] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência SEQ ID No: 2. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência SEQ ID No: 1. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência SEQ ID No: 2 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência SEQ ID No: 1. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0111] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 2. Em alguns exemplos de realização, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, contém substituições, inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo que compreende tal sequência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) da SEQ ID No: 2. Em alguns

52/149 exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-fator D compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 2 Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0112] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 1. Em alguns exemplos de realização, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, contém substituições, inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo que compreende tal sequência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) da SEQ ID No: 1. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-fator D compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 1 Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0113] Um anticorpo anti-fator D pode compreender qualquer sequência do domínio variável da região estrutural adequada, desde que o anticorpo mantenha a capacidade de se ligar ao Fator D. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção

53/149 compreendem uma sequência da região estrutural do domínio variável da cadeia pesada que é uma combinação da VI.4.1 b+ e JH4d (vide Figura 3). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência de consenso da região estrutural da cadeia pesada subgrupo VII humana. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência da região estrutural do domínio variável de cadeia pesada contendo; uma FR1 que compreende os aminoácidos 1-25 da SEQ ID No: 2, uma FR2 que compreende os aminoácidos 36-49 da SEQ ID No: 2, uma FR3 que compreende os aminoácidos 67-98 da SEQ ID No: 2, e uma FR4 que compreende os aminoácidos 105-115 da SEQ ID No: 2. Em um exemplo de realização destes anticorpos, a sequência do domínio variável de cadeia pesada inclui substituição(ões) na(s) posição (ões) 40 e/ou 88 (numeração de Kabat). Em um exemplo de realização destes anticorpos, a posição 40 é cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 88 é cisteína (C) ou alanina (A). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência da região estrutural do domínio variável da cadeia leve que é uma combinação da DPK4 e JK2 (vide Figura 4). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência da região estrutural da cadeia leve kappa I (κΙ) de consenso humano. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos antifator D da presente invenção compreendem uma sequência da região estrutural do domínio variável de cadeia leve contendo; uma FR1 que compreende os aminoácidos 1-23 da SEQ ID No: 1, uma FR2 que compreende os aminoácidos 35-49 da SEQ ID No: 1, uma FR3 que compreende os aminoácidos 57-88 da SEQ ID No: 1, e uma FR4 que compreende os aminoácidos 98-107 da SEQ ID No: 1. Em um exemplo de realização destes anticorpos, a sequência da região estrutural do domínio variável da cadeia leve

54/149 compreende uma ou mais substituição(ões) na(s) posição (ões) 15, 43 e/ou 104 (numeração de Kabat). Em um exemplo de realização destes anticorpos, a posição 15 é cisteína (C) ou valina (V), a posição 43 é cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 104 é valina (V) ou leucina (L). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0114] Além disso, um anticorpo anti-fator D pode incluir qualquer sequência adequada de um domínio constante, desde que o anticorpo mantenha a capacidade de se ligar ao Fator D. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem pelo menos uma porção de um domínio constante de cadeia pesada. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência do domínio constante da cadeia pesada de cada uma ou uma combinação de cadeias pesadas α, δ, ε, γ ou μ. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (Ch), as imunoglobulinas podem ser classificadas em classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que possuem cadeias pesadas designadas de α, δ, ε, γ ou μ, respectivamente. As classes yea são ainda divididas em subclasses, com base em diferenças relativamente pequenas nas sequências do Ch e na função delas, por exemplo, os humanos expressam as seguintes subclasses: IgGi, lgG2, IgGg, lgG4, IgAi, e lgA₂. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência do domínio constante da cadeia pesada que compreende substituições nas posições de aminoácidos que resultam em um efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência do domínio constante da cadeia

55/149 pesada que compreende substituições nas posições de aminoácidos que não resultam em um efeito sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada do tipo IgG (por exemplo, IgGi, lgG₂, IgGgOu lgG4) e compreendem ainda uma substituição na posição 114 (numeração de Kabat, equivalente a posição 118 na numeração EU), 168 (numeração de Kabat; equivalente a posição 172 na numeração EU), 172 (numeração de Kabat; equivalente a 176 na numeração EU) e/ou 228 (numeração EU). Em um exemplo de realização, anticorpos antifator D da presente invenção compreende um domínio constante de cadeia pesada do tipo IgG (por exemplo, IgGi, lgG₂, IgGg ou lgG4) e compreendem ainda uma substituição na posição 114, em que a posição 114 é uma cisteína (C) ou alanina (A), a posição 168 é cisteína (C) ou alanina (A), a posição 172 é uma cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 228 é uma prolina (P), arginina (R) ou serina (S). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0115] Além disso, por exemplo, em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem de pelo menos uma porção do domínio constante de cadeia leve. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem um domínio constante de cadeia leve tanto de uma como de uma combinação de cadeia leve kappa ou lambda, como a cadeia leve de qualquer espécie de vertebrados que possa ser atribuída a um dentre os dois tipos claramente distintos, denominados de kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência do domínio constante da cadeia leve que compreende substituições nas posições

56/149 de aminoácidos que resultam em um efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem uma sequência do domínio constante da cadeia leve que compreende substituições nas posições de aminoácidos que não resultam em um efeito sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Em um exemplo de realização, anticorpos antifator D da presente invenção compreendem um domínio constante da cadeia leve do tipo kappa e compreendem adicionalmente de uma substituição na posição 110, 144, 146 e/ou 168 (numeração de Kabat). Em um exemplo de realização, anticorpos anti-fator D da presente invenção compreendem um domínio constante de cadeia leve do tipo kappa e compreendem adicionalmente de uma substituição na posição 110, em que a posição 110 é uma cisteína (C) ou alanina (A), a posição 146 é uma isoleucina (I) ou valina (V) e/ou na posição 168, em que a posição 168 é uma cisteína (C) ou serina (S). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

2. Anticorpos Anti Fator-D Modificados [0116] A presente invenção inclui a produção e utilização de anticorpos anti-fator D modificados, por exemplo, anticorpos anti-fator D humanizados modificados, e variantes destes e fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno). Métodos exemplares para a geração de anticorpos modificados estão descritos em detalhes nas seções seguintes.

[0117] Um anticorpo anti-fator D parental, incluindo um anticorpo anti-fator D humanizado, pode ser modificado para gerar anticorpos anti-fator D modificados, e variantes destes. Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-fator D modificados e variantes destes podem ter propriedades físicas, químicas, biológicas ou de homogeneidade melhoradas com relação ao

57/149 anticorpo parental. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0118] Em um exemplo de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em uma ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo parental. Alternativamente, ou adicionalmente, uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) de resíduos da região estrutural podem ser introduzidas no anticorpo parental. Exemplos de resíduos da região estrutural que podem ser modificados incluem aqueles que se ligam ao antígeno diretamente de maneira não covalente (Amit et al. (1986) Science 233:747-753); que interagem com / possuem o efeito de conformação de uma CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917), e/ou participa da interface Vl-Vh (EP 239 400B1). Em certos exemplos de realização, a modificação de um ou mais de tais resíduos da região estrutural resulta em uma amplificação da afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno. Por exemplo, cerca de um a 5 resíduos da região estrutural podem ser alterados neste exemplo de realização da presente invenção. Exemplos de resíduos da região HVR ou região estrutural para serem modificadas incluem locais, onde as modificações de tais locais resultam na geração de variantes desaminadas (por exemplo, resíduo(s) de asparagina (N ou Asn) modificado(s) por aspartato (Asp ou D), variantes de oxidação (por exemplo, resíduo(s) de metionina (M ou Met) e/ou resíduo(s) de triptofano (W ou Trp) modificado(s) por sulfona ou sulfóxido) ou variantes de piroglutamato (por exemplo, resíduo(s) de glutamina (Q ou Gin) modificado por piroglutamato). Exemplos de resíduos da região estrutural ou resíduos da região HVR para serem modificados incluem os locais de possíveis desaminação (ou seja, asparagina (Asn ou N)), locais de oxidação (isto é, metionina (M ou Met) ou triptofano (W ou Trp)) locais de conversão de

58/149 piroglutamato (ou seja, glutamina (Q ou Gin)), em que a modificação de tais locais previnem a desaminação e/ou oxidação e/ou conversão do piroglutamato, respectivamente. Para evitar a formação de variantes desaminadas, a asparagina (N ou Asn) pode ser mutada para alanina (A ou Ala), glutamina (Gin ou Q) ou serina (Ser ou S). Para evitar a formação de variantes oxidadas, a metionina (Met) ou o triptofano (W ou Trp) podem ser mutados para leucina (L) ou isoleucina (I). Para evitar a formação de variantes piroglutamato, a glutamina (Q ou Gin) pode ser mutada para glutamato (Glu ou E). (Amphlett, G. et al., Pharm. BiotechnoL, 9:1-140 (1996)). Alternativamente, ou adicionalmente, uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) de resíduos da região estrutural podem estar na região Fc no anticorpo parental. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0119] Em um exemplo de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma região Fc variante de tal forma que a meia-vida do anticorpo in vivo é aumentada ou diminuída em relação ao anticorpo do parental ou anticorpo que compreende uma sequência da região Fc nativa. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma região Fc variante que aumenta ou diminui afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) (vide documento W02000042072, incorporada ao presente pedido pela referência em sua totalidade). Por exemplo, tal anticorpo pode compreender uma modificação de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311,312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 ou 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como no Kabat. Tais variantes de polipeptídeos com redução da afinidade de ligação a um FcRn pode compreender uma modificação de aminoácido em uma ou mais das posições

59/149 de aminoácidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 ou 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc, é aquela do índice EU como em Kabat. Os polipeptídeos variantes mencionados acima podem, alternativamente, apresentar maior afinidade de ligação ao FcRn e compreenderem uma modificação de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região Fc variante, que se liga com uma meia-vida in vivo aumentada em relação ao anticorpo parental ou anticorpo que compreende uma sequência nativa da região Fc. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região Fc variante que se liga com um aumento de afinidade ao FcRn em comparação ao anticorpo parental ou anticorpo que compreende uma sequência nativa da região Fc.

[0120] A afinidade de ligação ao FcRn pode ser mensurada da seguinte forma:

[0121] A ligação de anticorpos da presente invenção contra o FcRn humano pode ser estudada pela ressonância plasmônica de superfície, utilizando, por exemplo, um instrumento BiaCore 3000. A FcRn humana é acoplada a um chip sensor usando um kit de acoplamento com amina. Por exemplo, um chip CM5 sensor pode ser ativado com EDC/NHS por 7 min. a 5 μΙ/min. 100 pg/ml de FcRn humano pode ser injetado por 30 seg a 2 min a uma velocidade de fluxo de 10ml/min sobre o chip ativado para dar uma unidade de resposta (RU) de ligação final de 100 a 200. Após a conjugação, o chip acoplado ao FcRn pode ser bloqueado por uma injeção de 35 μΙ_ de clorídrato de etanolamina 1M a 5 pL/min.

[0122] A ligação dos anticorpos da presente invenção ao FcRn humano em pH 6,0 ou pH 7,4 pode ser determinada. O tampão de corrida para

60/149 o experimento de ligação é PBS tanto pH 6,0 como pH 7,4 contendo 0,01% de P20 e 0,02% de azida sódica. Os anticorpos da presente invenção podem ser trocados de tampão em tampão de corrida tanto pH 6,0 como pH 7,4. Em um exemplo de realização, os experimentos são realizados a 25 °C. Para a execução em pH 6,0, os anticorpos, com concentrações variando de 4 μΜ a 0,7 nM, são fluídos sobre um chip revestido com FcRn a 30 pL/min durante 4min e então é deixado dissociar a partir do chip por 5min. Para a execução em pH 7,4, os anticorpos, com concentrações variando de 12 μΜ a 100 nM, são injetados sobre um chip revestido com FcRn a 20 pL/min durante 1,5min e então liberado por 2min. Os anticorpos são também fluidizados sobre um ponto não conjugado no chip sensor para permitir a subtração do fundo de ligação não específica a partir da ligação com o chip acoplado ao FcRn. O chip pode ser regenerado com 30seg de pulso de TRIS 0,1 M, pH 8,3 entre as injeções. O estado constate da RU para cada injeção pode ser gravada no final de cada fase de injeção, e as constantes de dissociação (Kd) são posteriormente calculadas plotando o estado constate da RU contra a concentração da substância injetada.

[0123] Um procedimento útil para a geração de tais anticorpos modificados e fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) é denominado “mutagênese por varredura de alanina” (Cunningham e Wells, Science, (1989) 244:1081-1085). Aqui, um ou mais resíduo(s) da região hipervariável é substituído por resíduo(s) de alanina ou polialanina para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Estes resíduos da região hipervariável demonstram sensibilidade funcional às substituições quando são refinadas pela introdução adicional ou outras mutações em, ou para, os sítios de substituição. Desta forma, enquanto o sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos é predeterminada, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser predeterminada. Os mutantes “ala” produzidos

61/149 desta forma são selecionados por suas atividades biológicas (ou seja, afinidade de ligação ou teste de hemólise) conforme descrito no presente.

[0124] Normalmente, este começaria com uma substituição conservadora, tal como as exibidas abaixo sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultam em uma mudança da atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação), então modificações mais substanciais, denominadas “substituições exemplares” na tabela seguinte, ou conforme descrito abaixo com referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos selecionados. As substituições preferidas estão listadas na tabela abaixo.

Tabela 1

Substituições Preferidas

Resíduo Original	Substituições Exemplares	Substituições Preferidas
Ala (A)	vai; leu; ile	vai
Arg (R)	lys; gin; asn	lys
Asn (N)	gin; his; lys; arg	gin
Asp (D)	Glu	glu
Cys (C)	Ser	ser
Gin (Q)	Asn	asn
Glu (E)	Asp	asp
Giy(G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gin; lys; arg	arg
lle(l)	leu; vai; met; ala; phe; norleucina	leu
Leu (L)	norleucina; ile; vai; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gin; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; vai; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	Ala	ala

62/149

Resíduo Original	Substituições Exemplares	Substituições Preferidas
Ser(S)	Thr	thr
Thr (T)	Ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Vai (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucina	leu

[0125] Modificações ainda mais substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo ou fragmentos deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) são obtidas por meio da seleção de substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral (1) Hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr, asn, gin;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.

[0126] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0127] Em outros exemplos de realização, os sítios selecionados para a modificação são modificados, e essas modificações com afinidade de ligação melhorada são selecionadas por exibição por fago.

63/149 [0128] Moléculas de ácidos nucleicos que codificam sequências mutantes de aminoácidos ou sequências de aminoácidos modificadas são preparadas por de uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese com cassete de um variante preparado anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo parental. Um método para a produção de mutantes ou variantes ou sequências de aminoácidos modificadas é a mutagênese sítiodirigida (vide, por exemplo, Kunkel (1985) Proc Natl. Acad. Sci USA. 82:488).

[0129] Em certos exemplos de realização, o anticorpo modificado terá apenas um único resíduo da região hipervariável substituído. Em outras realizações, dois ou mais resíduos da região hipervariável do anticorpo parental terá sido substituído, por exemplo, cerca de dois a dez substituições na região hipervariável. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0130] Normalmente, o anticorpo modificado terá uma sequência de aminoácidos que contém pelo menos 75% de identidade ou similaridade na sequência de aminoácidos (definido acima na seção Definições) com a sequência de aminoácidos de um domínio variável tanto de cadeia leve como de cadeia pesada de um anticorpo parental, mais preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente ainda pelo menos 95%. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos antifator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0131] Após a produção do anticorpo modificado, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), é determinada a atividade biológica desta molécula com relação ao anticorpo parental ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Como

64/149 mencionado acima, isso pode envolver a determinação da afinidade de ligação e/ou outras atividades biológicas do anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Em um exemplo de realização da presente invenção, um painel de anticorpos modificados, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) é preparado e selecionado pela afinidade de ligação para o antígeno tal como o fator D ou um fragmento deste. Um ou mais dos anticorpos mutantes ou anticorpos modificados, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), selecionados a partir deste painel inicial são, opcionalmente, submetidos a um ou mais novos ensaios de atividade biológica para confirmar que o(s) anticorpo(s) variante(s), ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) são realmente úteis, por exemplo, para estudos préclínicos.

[0132] A modificação de anticorpos anti-fator D, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) descritos no presente pode estar sujeita a novas alterações, dependendo muitas vezes do uso pretendido para o anticorpo modificado, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Tais modificações podem envolver outra alteração da sequência de aminoácidos, fusão do(s) polipeptídeo(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes, tal como aquelas elaboradas abaixo. Com relação às alterações na sequência de aminoácidos, modificações exemplares são elaboradas acima. Por exemplo, qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo modificado pode também ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar ligações aberrantes. De forma inversa, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (em especial quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv). Outro tipo de aminoácido mutante

65/149 tem um padrão de glicosilação alterado. Isto pode ser alcançado através da supressão de uma ou mais moléculas de carboidrato encontrada nos anticorpos e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) é tipicamente tanto N-ligada como O-ligada. N-ligada refere-se à ligação da unidade de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença de qualquer destas sequências de tripeptídeos no polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizados. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é acompanhada, de forma conveniente, pela alteração da sequência de aminoácido de modo que esta sequência contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

[0133] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos uma posição (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido é substituída por uma ou mais dos seguintes:

66/149 (a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

[0134] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0135] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo variante anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos uma posição (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo antifator D parental do pedido é substituída por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(b) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (c) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0136] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0137] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos uma posição (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido é substituída por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

67/149 (b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

(e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0138] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0139] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos duas posições (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido é(são) substituída(s) por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V.

[0140] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos duas posições (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido é(são) substituída(s) por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

68/149 (b) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (c) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0141] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0142] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos duas posições (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido é(são) substituída(s) por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

(e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0143] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0144] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos três posições (de acordo com a

69/149 numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido são substituídas por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V.

[0145] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0146] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos três posições (de acordo com a numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido são substituídas por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(b) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (c) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0147] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0148] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, a partir de um anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, onde o anticorpo anti-fator D modificado compreende a sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do presente pedido, em que pelo menos três posições (de acordo com a

70/149 numeração Kabat) da sequência de aminoácidos de tal anticorpo anti-fator D parental do pedido são substituídas por uma ou mais dos seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ouI;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ouQ;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ouA;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

(e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0149] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0150] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende HVRs de cadeia leve de um anticorpo de referência, em que o dito anticorpo anti-fator D compreende ainda uma substituição em uma ou mais posições no dito anticorpo de referência, em que o dito anticorpo de referência compreende HVR-1 de cadeia leve que compreende ITSTDIDDDMN (SEQ ID No: 30), HVR-2 de cadeia leve que compreende GGNTLRP (SEQ ID No: 35) e HVR-3 de cadeia leve, que compreende LQSDSLPYT (SEQ ID No: 38), e em que a dita substituição é uma ou mais das seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ouI;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ouQ;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ouA;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

(e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

71/149 [0151] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0152] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende HVRs de cadeia pesada de um anticorpo de referência, em que o dito anticorpo anti-fator D compreende ainda uma substituição em uma ou mais posições no dito anticorpo de referência, em que o dito anticorpo de referência possui HVR-1 de cadeia pesada que compreende GYTFTNYGMN (SEQ ID No: 39), HVR-2 de cadeia pesada que compreende WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID No: 40) e HVR-3 de cadeia pesada que compreende EGGVNN (SEQ ID No: 41), e em que a dita substituição é uma ou mais das seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ouI;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ouQ;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ouA;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V’ (e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0153] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0154] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D que compreende HVRs de cadeia leve e HVRs de cadeia pesada de um anticorpo de referência, em que o dito anticorpo anti-fator D compreende ainda a substituição de uma ou mais posições no anticorpo de referência, em que o dito anticorpo de referência possui HVR-1 de cadeia leve que compreende a ITSTDIDDDMN (SEQ ID No: 30), HVR-2 de

72/149 cadeia leve que compreende a GGNTLRP (SEQ ID No: 35) e HVR-3 de cadeia leve, que compreende a LQSDSLPYT (SEQ ID No: 38) e HVR-1 de cadeia pesada que compreende GYTFTNYGMN (SEQ ID No: 39), HVR-2 de cadeia pesada que compreende a WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID No: 40) e HVR-3 de cadeia pesada que compreende a EGGVNN (SEQ ID No: 41), e em que a dita substituição é uma ou mais das seguintes:

(a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

(b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

(c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

(d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

(e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

(f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q.

[0155] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0156] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende:

(a) pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de:

(I) uma HVR-H1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 39.

(ii) uma HVR-H2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 40.

73/149 (iii) uma HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 41, SEQ ID No: 42, SEQ ID No: 43, SEQ ID No: 44 e SEQ ID No: 45;

(iv) uma HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 30, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33 e SEQ ID No: 34;

(v) uma HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 35, SEQ ID No: 36 e SEQ ID No: 37; e (vi) uma HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 38; ou (b) pelo menos uma HVR variante, onde a HVR variante compreende uma modificação de pelo menos um resíduo da sequência exibida na SEQ ID No: 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38.

[0157] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0158] Em alguns exemplos de realização, uma HVR possuindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, contém

74/149 substituições, inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo que compreende tal sequência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados na sequência de referência selecionados a partir do grupo consistindo da SEQ ID No: 39, SEQ ID No: 40, SEQ ID No: 41, SEQ ID No: 42, SEQ ID No: 43, SEQ ID No: 44, SEQ ID No: 45, SEQ ID No: 30, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 34, SEQ ID No: 35, SEQ ID No: 36, SEQ ID No: 37 e SEQ ID No: 38.

[0159] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende:

(a) pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de:

(i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 39;

(ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID No: 40;

(iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 41, SEQ ID No: 42, SEQ ID

No: 43, SEQ ID No: 44 e SEQ ID No: 45;

(iv) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 30, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33 e SEQ ID No: 34;

(v) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 35, SEQ ID No: 36, SEQ ID No: 37; e (vi) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 38; ou

75/149 (b) pelo menos uma HVR variante, onde a HVR variante compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência exibida na SEQ ID No: 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38.

[0160] Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0161] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma região HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 39. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antifator D modificado que compreende uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 40. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 41. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 30. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 35. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 38. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0162] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 39, uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 40, uma HVR-H3

76/149 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 41. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0163] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 30, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 35, uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 38. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0164] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 39, uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 40, uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 41, uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 30, uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 35, uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 38. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0165] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID No: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29. Em alguns exemplos de realização, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de

77/149 identidade de sequência, contém substituições, inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo que compreende tal sequência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) em uma sequência selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID Nos: 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-fator D modificado compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID Nos: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0166] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID Nos: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17. Em alguns exemplos de realização, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, contém substituições, inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo que compreende tal sequência de aminoácidos ainda sim mantém a capacidade de se ligar ao Fator D. Em alguns exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID Nos: 6, 7, 8, 9, 10, 11,

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12, 13, 14, 15, 16 e 17. Em alguns exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-fator D modificado compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID Nos: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0167] Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 18. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 6. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 18 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 6. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 19. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 7. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 19 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 7. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 20. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID

79/149

No: 8. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 20 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 8. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 21. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 9. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 21 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 9. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 22. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo antifator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 10. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 22 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 10. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 23. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 11. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 23 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 11. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de

80/149 cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 24. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 12. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 24 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 12. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 25. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 13. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 25 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 13. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 26. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 14. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 26 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 14. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 27. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 15. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que

81/149 compreende a SEQ ID No: 27 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 15. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 28. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 16. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 28 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No:

16. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 29. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 17. Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ ID No: 29 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ ID No: 17. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos antifator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0168] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende a seguinte sequência de aminoácidos: XiVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGV X2X3WGQGTLVTVSS (SEQ ID No: 74), onde X1 é Q ou E; X₂ é N, A ou Q; e X₃ é N, A ou Q. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

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XiVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGV X2X3WGQGTLVTVSS (SEQ ID No: 74), onde Xi é Q ou E; X₂ é N, A ou Q; e X₃ é N, A ou Q. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito polipeptídeo.

[0169] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende a seguinte sequência de aminoácidos: DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6 TLRPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7 EIK (SEQ ID No: 73), onde X₄ é M, L ou I; X₅ é N, A ou Q; X₆ é N, S ou A; e X₇ é L ou V. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado que compreende 0 polipeptídeo que compreende a seguinte sequência de aminoácidos: DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6 TLRPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7 EIK (SEQ ID No: 73), onde X₄ é M, L ou I; X₅ é N, A ou Q; X₆ é N, S ou A; e X₇ é L ou V. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito polipeptídeo.

[0170] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que compreende a SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28 e SEQ ID No: 29. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que compreende a SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13,

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SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16 e SEQ ID No: 17. Em urn exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito polipeptídeo.

[0171] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência SEQ ID No: 47. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, em que o domínio de cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID No: 54. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência SEQ ID No: 61. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado, em que o domínio de cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID No: 63. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0172] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende a sequência SEQ ID No: 47. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende a sequência SEQ ID No: 54. Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende a sequência SEQ ID No: 61. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende a sequência SEQ ID No: 63. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito polipeptídeo.

[0173] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do humanizado anti-fator D #111, onde o domínio da cadeia leve variável compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16 e SEQ ID No: 17. Em um

84/149 exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0174] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, onde o domínio da cadeia pesada variável compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28 e SEQ ID No: 29. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos antifator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0175] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência SEQ ID No: 47. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID No: 54. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência SEQ ID No: 61. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID No: 63. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento do dito anticorpo anti-fator D (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0176] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 6 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 18. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D

85/149 modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 7 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 19. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 8 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 20. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 9 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 21. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 10 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 22. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 11 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 23. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 12 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 24. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 13 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 25. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D

86/149 humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 14 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 26. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 15 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 27. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 16 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 28. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência SEQ ID No: 17 e o domínio de cadeia pesada variável compreende a sequência SEQ ID No: 29. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0177] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência SEQ ID No: 47 e o domínio de cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID No: 54. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D modificado do anti-fator D humanizado #111, em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência SEQ ID No: 61 e o domínio de cadeia pesada compreende a sequência SEQ ID No: 63.

3. Afinidade e Atividade Biológica dos Anticorpos Anti-fator D [0178] A presente invenção inclui anticorpos, e variantes destes ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno),

87/149 possuindo características aqui identificadas como sendo desejáveis em um anticorpo anti-fator D. Anticorpos, e variantes destes ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), com características aqui identificadas como desejáveis em um anticorpo anti-fator D, podem ser selecionados para a atividade biológica inibidora, por exemplo, in vitro ou in vivo, ou através da medição da afinidade de ligação.

a. Afinidade [0179] Para determinar se um anticorpo anti-fator D, e variantes destes ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), se ligam ao mesmo epítopo no fator D humano ligado por um anticorpo de interesse (por exemplo, anticorpos que antagonizam a atividade do fator D), um ensaio de bloqueio cruzado pode ser realizado (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988)). Alternativamente, o mapeamento de epítopos pode ser realizado para determinar se um anticorpo anti-fator D se liga um epítopo de interesse (Champe et al., J. Biol Chem, 270:1388-1394 (1995). As afinidades de anticorpos, por exemplo, para o fator D humano, podem ser determinadas usando métodos padrão, incluindo aqueles descritos no Exemplo 3.

[0180] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, ou anticorpos variantes destes, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), que competem com um anticorpo anti-fator D murino e/ou anticorpo anti-fator D humanizado clone #111, e/ou um anticorpo que compreende um domínio variável ou sequências HVR do anticorpo anti-fator D humanizado clone #111. Anticorpos anti-fator D, ou variantes destes, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-fator D murino e/ou anticorpo anti-fator D humanizado clone #111, e/ou um anticorpo

88/149 que compreende um domínio variável ou sequências HVR do anticorpo antifator D humanizado clone #111, também são fornecidos.

[0181] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou um anticorpo variante deste, em que a afinidade monovalente do anticorpo ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é menor, por exemplo, pelo menos 1 vez ou 2 vezes menor que a afinidade monovalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, a afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab ao Fator D), que compreende, consiste, ou consiste essencialmente de um domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-fator D murino. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0182] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade bivalente do anticorpo ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é menor, por exemplo, pelo menos 1 vez ou 2 vezes menor que a afinidade bivalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, a afinidade do anticorpo quimérico como um IgG ao Fator D), que compreende, consiste, ou consiste essencialmente de um domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-fator D murino. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0183] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou um anticorpo variante deste, em que a afinidade monovalente do anticorpo ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é maior, por exemplo, pelo menos 1 vez ou 2 vezes maior que a afinidade monovalente de um anticorpo

89/149 quimérico (por exemplo, a afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab ao Fator D), que compreende, consiste, ou consiste essencialmente de um domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-fator D murino. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0184] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade bivalente do anticorpo ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é maior, por exemplo, pelo menos 1 vez ou 2 vezes maior que a afinidade bivalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, a afinidade do anticorpo quimérico como um IgG ao Fator D), que compreende, consiste, ou consiste essencialmente de um domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-fator D murino. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0185] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de 20 nM (20x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de 10 nM (10x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antifator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de 1,0 nM (1,0x10'⁹ M) ou melhor. Em outro

90/149 exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de 0,5 nM (0,5x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de 1,0 pM (1,0x10'¹² M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de 0,5 pM (0,5x10'¹² M) ou melhor. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos antifator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0186] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 10,0 nM (10,0x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antifator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 5,0 nM (5,0x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 1,0 nM (1,0x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo

91/149 como um IgG ao Fator D) é de 0,5 nM (0,5x10'⁹ M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 5,0 pM (5,0x10'¹² M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 2,0 pM (2,0x10'¹² M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 1,0 pM (1,0x10'¹² M) ou melhor. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de 0,5 pM (0,5x10'¹² M) ou melhor. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0187] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) está entre 0,5 mM (0,5x10'⁶ M) e 0,5 pM (0,5x10'¹² M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) está entre 15 nM (15x10'⁹ M) e 0,1 nM (0,1x10'⁹.M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a

92/149 afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) está entre 5,5 nM (5,5x10'⁹ M) e 1 nM (1x10'⁹ M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) está entre 0,5 pM (0,5x10'¹² M) e 2 pM (2x10'¹² M). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0188] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) está entre 0,5 mM (0,5x10'⁶ M) e 0,5 pM (0,5x10'¹² M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) está entre 10 nM (10x10'⁹ M) e 0,05 nM (0,05x10'⁹ M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) está entre 5,5 nM (5,5x10'⁹ M) e 1 nM (1x10'⁹ M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, onde a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) está entre 0,5 pM (0,5x10'¹² M) e 2 pM (2x10'¹² M). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

93/149 [0189] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de cerca de 1,4 pM (1,4x10'¹² M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de cerca de 1,1 pM (1,1x10' ¹² M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de cerca de 0,19 nM (0,19x10' ⁹ M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de cerca de 0,08 nM (0,08x10'⁹ M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo antifator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de cerca de 12,3 nM (12,3x10'⁹ M). Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de cerca de 9,0 nM (9,0x10'⁹ M). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0190] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a

94/149 afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de cerca de 1,4 pM (1,4x10'¹² M) +/- 0,5. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de cerca de 1,1 pM (1,1x10' ¹² M) +/- 0,6. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de cerca de 0,19 nM (0,19x10' ⁹ M) +/- 0,01. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de cerca de 0,08 nM (0,08x10'⁹ M) +/0,01. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) é de cerca de 12,3 nM (12,3x10' ⁹ M) +/- 2. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, em que a afinidade do anticorpo em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, a afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) é de cerca de 9,0 nM (9,0x10'⁹ M) +/- 1. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0191] Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, pode ter uma afinidade em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) de cerca de 1,4 pM (1,4x10'¹² M) +/- 2. Em outro exemplo de

95/149 realização, um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, pode ter uma afinidade em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) de cerca de 1,1 pM (1,4x10'¹² M) +/- 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, pode ter uma afinidade em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) de cerca de 0,19 nM (0,19x10'⁹ M) +/- 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, pode ter uma afinidade em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) de cerca de 0,08 nM (0,08x10'⁹ M) +/- 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, pode ter uma afinidade em sua forma monovalente ao Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab ao Fator D) de cerca de 12,3 nM (12,3x10'⁹ M) +/- 2. Em outro exemplo de realização, um anticorpo anti-fator D, ou anticorpo variante deste, pode ter uma afinidade em sua forma bivalente ao Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um IgG ao Fator D) de cerca de 9,0 nM (9,0x10'⁹ M) +/- 2. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0192] Conforme está bem estabelecido no estado da técnica, a afinidade de ligação de um ligante ao seu receptor pode ser determinada utilizando qualquer um dentre uma série de ensaios, e expressos em termos de uma variedade de valores quantitativos. Assim, em um exemplo de realização, a afinidade é expressa como valores Kd e reflete a afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com efeitos de avidez minimizados). Geralmente, e preferencialmente, a afinidade de ligação é mensurada de maneira in vitro, seja em um modo sem células ou em modo associado à célula. Conforme descrito mais detalhadamente no presente, a quantidade de diferença (em vezes) na

96/149 afinidade de ligação pode ser quantificada em termos de relação entre o valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo humanizado (por exemplo, na forma Fab) e o valor da afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência / comparador (por exemplo, na forma Fab) (por exemplo, um anticorpo murino possuindo as sequências da região hipervariável doadora), em que os valores da afinidade de ligação são determinados sob condições de ensaios semelhantes. Desse modo, em um exemplo de realização, a quantidade de diferença na afinidade de ligação é determinada como a razão entre os valores Kd do anticorpo humanizado na forma Fab e o dito anticorpo Fab de referência / de comparação. Por exemplo, em um exemplo de realização, se um anticorpo da presente invenção (A) tem uma afinidade que é três vezes menor do que a afinidade de um anticorpo de referência (M), então se o valor Kd para A é 3x, o valor Kd de M seria 1x, e a relação de Kd de A para o Kd de M seria de 3:1. Por outro lado, em um exemplo de realização, se um anticorpo da presente invenção (C) tem uma afinidade que é três vezes maior do que a afinidade de um anticorpo de referência (R), então se o valor Kd para C é 1x, o valor Kd de R seria 3x, e a relação Kd de C para Kd de R seria de 1:3. Qualquer um dentre uma série de ensaios conhecidos no estado da técnica, incluindo aquelas descritas no presente, podem ser usadas para se obter as medidas de afinidade, incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.

[0193] Além disso, os valores de Kd para um anticorpo da presente invenção pode variar dependendo das condições do ensaio especifico sendo utilizado. Por exemplo, em um exemplo de realização, as medidas da afinidade de ligação pode ser obtida em um ensaio onde o Fab ou anticorpo é imobilizado e a ligação do ligante, ou seja, o fator D, é mensurada ou, alternativamente, o ligante, ou seja, o fator D, para o Fab ou anticorpo é imobilizado e a ligação do Fab ou anticorpo é mensurada. Em um exemplo de

97/149 realização, as medidas da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que as condições de regeneração podem compreender (1) glicina 10mM ou MgCh 4M, pH 1,5, e (2) pH entre pH 1,0 e pH 7,5, incluindo o pH 1,5, pH 5,0, pH 6,0 e pH 7,2. Em um exemplo de realização, as medidas da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que as condições de ligação podem incluir (1) salina PBS ou HEPES tamponado e (2) Tw/ee/?-20, ou seja, 0,1% de Tw/ee/?-20. Em um exemplo de realização, as medidas da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio no qual a fonte do ligante, ou seja, o fator D, pode ser proveniente de fontes comercialmente disponíveis. Em um exemplo de realização, as medidas da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que (1) o Fab ou anticorpo é imobilizado e a ligação ao ligante, ou seja, o fator D é mensurada, (2) as condições de regeneração compreendem MgCh 4M, pH 7,2 e (3) as condições de ligação compreendem salina HEPES tamponada, pH 7,2 contendo 0,1% de Tween-20. Em um exemplo de realização, as medidas da afinidade de ligação podem ser obtidas em um ensaio em que (1) o ligante, ou seja, o fator D, é imobilizado e a ligação do Fab ou anticorpo é mensurada, (2) as condições de regeneração compreende glicina a 10mM em pH 1,5; e (3) as condições de ligação compreendem tampão PBS.

b. Atividade Biológica [0194] Para determinar se um anticorpo anti-fator D, ou variante deste ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é capaz de se ligar ao Fator D e exercer um efeito biológico, por exemplo, a inibição da hemólise pela via alternativa, pode-se utilizar ensaios da inibição hemolítica utilizando hemácias de coelho, incluindo aqueles descritos no Exemplo 2. Tal inibição hemolítica pode ser determinada através de ensaios padrão (Kostavasili et al., J of Immunology, 158 (4):1763-1772 (1997); Wiesmann et al., Nature, 444(7116):159-60 (2006)). A ativação do

98/149 complemento em tais testes pode ser iniciada com soro ou plasma. Concentrações adequadas de Fator D no soro ou plasma (Pascual et al., Kidney International, 34: 529-536 (1998); Complement Facts Book, editores Bernard J. Morley e Mark J. Walport, Academic Press (2000); Barnum. et al., J. Immunol Methods, 67:303-309 (1984)) podem ser rotineiramente determinadas de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo aqueles que foram descritos nas referências como Pascual et al., Kidney International, 34:529-536 (1998) e Barnum et al., J. Immunol. Methods., 67: 303-309 (1984) e Exemplo 4. A presente invenção refere-se de maneira geral aos anticorpos capazes de inibir as atividades biológicas associadas com o Fator D. Por exemplo, em uma concentração de 18 pg/ml (equivalente a cerca de 1,5 vezes a concentração molar do fator D humano no sangue; razão molar de anticorpo anti-fator D para Fator D de cerca de 1,5:1), a inibição significativa da atividade da via alternativa do complemento pelo anticorpo pode ser observada (vide, por exemplo, a Patente dos US 6.956.107).

[0195] Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tal anticorpo inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 inferior a 30 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tal anticorpo inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 inferior a 15 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 inferior a 10 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 inferior a 5 nM. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos antifator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

99/149 [0196] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 30 nM e 2 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos antifator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 25 nM e 7 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 20 nM e 12 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 30 nM e 15 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 12 nM e 8 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 7 nM e 2 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 6 nM e 3 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 8 nM e 5 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 5 nM e 2 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 10 nM e 5 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção

100/149 fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 8 nM e 2 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos antifator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 7 nM e 3 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 entre 6 nM e 4 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC50 de cerca de 4,7 nM ± 0,6 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC50 de cerca de 6,4 nM ± 0,6 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos antifator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC50 de cerca de 3,5 nM ± 0,5 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC50 de cerca de 4,4 nM ± 1,5 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC50 de cerca de 10,2 nM ± 0,8 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC50 de cerca de 23,9 nM ± 5,0 nM. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

101/149 [0197] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 inferior a 80 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 inferior a 50 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 inferior a 40 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 inferior a 20 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de IC50 inferior a 15 nM. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0198] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 80 nM e 10 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos antifator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 75 nM e 15 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 70 nM e 20 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 65 nM e 25 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece

102/149 anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 60 nM e 30 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 55 nM e 35 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 50 nM e 40 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 80 nM e 70 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 55 nM e 25 nM. Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 entre 16 nM e 12 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 de cerca de 14,0 nM ± 1,0 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos antifator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 de cerca de 38,0 nM ± 11,0 nM. Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor IC90 de cerca de 72,6 nM ± 4,8 nM. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0199] Em um exemplo de realização, a presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-fator D ou fragmento deste (por exemplo,

103/149 fragmento de ligação ao antígeno), em que um fragmento Fab de tal anticorpo inibe a hemólise pela via alternativa em uma relação molar de anticorpo para Fator D de cerca de 0,05:1 (0,05) a cerca de 10:1 (10); ou cerca de 0,09:1 (0,09) a cerca de 8:1 (8); ou cerca de 0,1:1 (0,1) a cerca de 6:1 (6); ou cerca de 0,15:1 (0,15) a cerca de 5:1 (5); ou cerca de 0,19:1 (0,19) a cerca de 4:1 (4); ou cerca de 0,2:1 (0,2) a cerca de 3:1 (3); ou cerca de 0,3:1 (0,3) a cerca de 2:1 (2); ou cerca de 0,4:1 (0,4) a cerca de 1:1 (1); ou cerca de 0,5:1 (0,5) a cerca de 1:2 (0,5); ou cerca de 0,6:1 (0,6) a cerca de 1:3 (0,33); ou cerca de 0,7:1 (0,7) a cerca de 1:4 (0,25); ou cerca de 0,8:1 (0,8) a cerca de 1:5 (0,2) ou cerca de 0,9:1 (0,9) a cerca de 1:6 (0,17). Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

[0200] Em um exemplo, a presente invenção inclui fragmentos dos anticorpos anti-fator D humanizados (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Os fragmentos de anticorpo da presente invenção podem, por exemplo, ser Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)₂, dAb, fragmentos de regiões determinantes de complementaridade (CDR), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única, minicorpos, diacorpos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento de anticorpo anti-fator D humanizado (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) que é capaz de penetrar substancialmente em toda a retina. Em um exemplo de realização adicional, a presente invenção fornece um fragmento de anticorpo anti-fator D humanizado (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) que é capaz de penetrar através de toda a espessura da retina. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos anti-fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

104/149 [0201] Em um exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos anti-fator D humanizados, em que um fragmento Fab de tais anticorpos possui uma meia-vida de pelo menos 3, 5, 7, 10 ou 12 dias após a administração em um olho de mamífero (por exemplo, de humanos), através de uma única injeção intravítrea. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos anti-fator D humanizados, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a ativação da via alternativa (AP) do complemento por pelo menos, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ou 115 dias após a administração em um olho de mamífero (por exemplo, de humano) através de uma única injeção intravítrea. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos anti-fator D humanizados, em que a concentração de um fragmento Fab de tais anticorpos que inibe a ativação da via alternativa (AP) do complemento é mantida no tecido da retina por pelo menos, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85 dias após a administração em um olho de mamífero (por exemplo, de humano) através de uma única injeção intravítrea. Em outro exemplo de realização, a presente invenção inclui anticorpos anti-fator D humanizados, em que a concentração de um fragmento Fab de tais anticorpos que inibe a ativação da via alternativa (AP) do complemento é mantida no humor vítreo por pelo menos, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ou 115 dias após a administração em um olho de mamífero (por exemplo, de humano) através de uma única injeção intravítrea. Em um exemplo, a presente invenção fornece um fragmento dos ditos anticorpos antifator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno).

Geração De Anticorpos

Seleção e Transformação De Células Hospedeiras [0202] As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou vetores de clonagem descritos no presente para produção do anticorpo anti-fator D e cultivo em meio nutriente convencional

105/149 modificado conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. As condições de cultivo, tais como o meio, temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelo técnico hábil no assunto sem a experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook etal., supra.

[0203] Os métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas, que significa a introdução de DNA no hospedeiro para que o DNA seja replicado, tanto extracromossômico como integrado ao cromossomo, são conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, CaCh, CaPCU, mediado por lipossomos, polietileno-glicol/DMSO e por eletroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada através do uso de técnicas padrões apropriadas para tais células. Para procariotos, é geralmente utilizado o tratamento com cálcio que emprega o cloreto de cálcio, conforme descrito em Sambrook et al., supra, ou a eletroporação. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de determinadas células vegetais, conforme descrito por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e pelo documento WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamíferos sem paredes celulares, pode ser empregado o método de precipitação em fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspectos gerais de sistemas de transfecções de células hospedeiras de mamíferos foram descritos na patente US 4.399.216. Transformações em leveduras são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). Entretanto, outros métodos para a introdução de DNA em células, tal como por microinjeção nuclear,

106/149 eletroporação, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, tal como polibreno e poliornitina, também podem ser utilizados. Para as diversas técnicas de transformação de células de mamíferos, vide Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

[0204] Células hospedeiras apropriadas no presente para clonagem ou expressão de DNA em vetores incluem células eucarióticas superiores, procarióticas ou leveduras. Procariontes apropriados para os propósitos da presente invenção incluem tanto os organismos Gram-negativos quanto os Gram-positivos, por exemplo, Enterobactérias, tal como a Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, a Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, a Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilos, tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgado no DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como a P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem preferido de E. coli é a E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas, como a E. coli Β, Ε. coli Χ1776 (ATCC 31537) e E. coli W3110 (ATCC 27325) e K5 772 (ATCC 53.635) sejam adequadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. A cepa W3110 é uma hospedeira particularmente preferida ou hospedeira parental, porque é uma cepa hospedeira comum para produto de DNA recombinante em fermentações. Preferencialmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC N^Q. 27.325) pode ser modificada para efeito de uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas da células hospedeira, com exemplos de tais hospedeiros, incluindo a E. coli W3110 cepa 1A2, que

107/149 tem o genótipo completo tonA ; E. coli W3110 cepa 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT karí; E. coli W3110 cepa 37D6, que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argFlac)169 degP ompT rbs7 iivG karí ; E. coli W3110 cepa 40B4, que é a cepa 37D6 com uma mutação por deleção de degP que confere não resistência a canamicina; E. coli W3110 cepa 33D3 possuindo o genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kan^R (Patente US 5.639.635) e uma cepa de E. coli possuindo uma protease periplasmica mutante divulgada na Patente US 4.946.783 depositada em 07 de agosto de 1990. Outras cepas e derivados destas, como a E. coli 294 (ATCC 31446), E. co/ZB, E. colix 1776 (ATCC 31537) e E. co//RV308 (ATCC 31.608) também são adequadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma das bactérias mencionadas acima que possuem genótipo definido são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, em Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bactérias adequadas levando em consideração a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ou Salmonella podem ser utilizadas como hospedeiras de maneira adequada, quando plasmídeos bem conhecidos, tais como os plasmídeos pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 são utilizados para a construção do replicon. Normalmente a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores da protease adicionais podem ser incorporados na cultura celular. Alternativamente, são adequados métodos in vitro de clonagem, por exemplo, por PCR ou por outras reações de polimerização do ácido nucleico.

[0205] Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) e proteínas de fusão de

108/149 anticorpo podem ser produzidos em bactéria, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o próprio imunoconjugado exibe uma atividade eficaz na destruição de células tumorais. Anticorpos de comprimento total possuem meia-vida maiores na circulação. A produção em E. coli é mais rápida e apresenta melhor custobenefício. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, a Patente US 5.648.237 (Carter et. al.), US 5.789.199 (Joly et al.), e US 5.840.523 (Simmons et al.) que descrevem a região de início de tradução (TIR) e sequências sinais para otimizar a expressão e secreção, sendo que ditas patentes são incorporadas ao presente pedido documento pela referência. Após a expressão, o anticorpo é isolado a partir do macerado celular de E. cell em uma fração solúvel e pode ser purificado através de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G, dependendo do isotipo. A purificação final pode ser realizada de forma similar ao processo para a purificação do anticorpo expresso, por exemplo, em células CHO.

[0206] Além de procariotos, micróbios eucariotos tais como, fungos filamentosos e leveduras são hospedeiros adequados para a clonagem ou expressão dos vetores que codificam o anticorpo. O Saccharomyces cerevisiae é o microorganismo eucarioto mais comumente utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucariotos inferiores. Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis para a presente invenção, tal como, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; Candida; Trichoderma; Neurospora crassa e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tais como o A. nidulans e A. niger. Leveduras metilotróficas são apropriadas no presente e incluem, sem se limitar, a leveduras capazes de crescer em metanol

109/149 selecionadas a partir dos gêneros: Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Um lista de espécies específicas que exemplificam esta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

[0207] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Em princípio, qualquer cultura de célula eucariótica superior é viável, seja a partir de uma cultura de células de vertebrados ou invertebrados. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e células de inseto, Luckow etal., Bio/Technology6, 47-55 (1988), Miller etal., Genetic Engineering, Setlow etal. Eds. Vol. 8, págs. 277-279 (Plenampublishing 1986); Mseda etal., Nature 315, 592-594 (1985). Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus e células hospedeiras de insetos variantes e correspondentes permissivos a partir de hospedeiros como, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de cepas virais para a transfecção está disponível publicamente, por exemplo, a variante L-1 da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente na transfecção de células da Spodoptera frugiperda. Além disso, culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.

[0208] Células de vertebrados e propagação de células de vertebrados, em cultura (cultura de tecidos) tornaram-se um procedimento de rotina. Vide, Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Patterson, Eds. (1973). Exemplos de linhagem de células hospedeiras de mamíferos úteis são; de rim de macaco, linhagem de células embrionárias de rim humano, células renais de hamster neonato; células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl.. Acad. USA. 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de

110/149 camundongos; células de carcinoma cervical humano (HeLa); células renais caninas; células de pulmão humano, células de fígado humano; células de tumor mamário de camundongo e células NSO.

[0209] Para a produção recombinante de um anticorpo da presente invenção, ou fragmentos de anticorpo deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno), os ácidos nucleicos (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) que codifica estes são isolados e inseridos em um vetor de clonagem replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA), ou para a expressão. O DNA que codifica o anticorpo ou fragmento deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira a ser utilizada. Em geral, as células hospedeiras preferidas são tanto de origem procariótica quanto eucariótica (geralmente de mamíferos).

[0210] O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em um(alguns) sítio(s) de restrição de endonuclease(s) apropriada(s) pelo uso de técnicas conhecidas. Os componentes do vetor incluem em geral, mas não estão limitados a, uma ou mais sequência(s) de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma sequência de término de transcrição. A construção de vetores apropriados que contém um ou mais dos ditos componentes emprega técnicas padrões de ligação que são conhecidas pelos técnicos no assunto.

111/149 [0211] O fator D pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como uma fusão de polipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência sinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de divagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA que codifica o anticorpo anti-fator D que é inserido no vetor. A sequência sinal pode ser uma sequência sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes da enterotoxina II estáveis ao calor. Para a secreção em levedura a sequência sinal pode ser, por exemplo, líder da invertase de levedura, líder do fator α (incluindo líderes do fator α da Saccharomyces e Kluyveromyces, descritos na patente US 5.010.182), ou líder da fosfatase ácida, líder da glucomilase da C. albicans (Patente EP 362.179 publicada em 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito no documento WO 90/13646 publicado em 15 de Novembro de 1990. Na expressão celular de mamíferos, as sequências sinais de mamíferos podem ser utilizadas para secreção direta da proteína, tais como sequências sinais de polipeptídeos secretados da mesma espécie, ou de espécies relacionadas, bem como líderes de secreção viral.

[0212] As células hospedeiras são transformadas com os vetores descritos acima para produção de anticorpos e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[0213] As células hospedeiras utilizadas para a produção de anticorpos, ou anticorpos variantes ou fragmentos (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) destes da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura.

112/149

a. Células Hospedeiras Procarióticas [0214] As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeos da presente invenção são cultivadas em meios conhecidos no estado da técnica e são adequadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios apropriados incluem caldo lúria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Em alguns exemplos de realização, os meios também contêm um agente de seleção, selecionado com base na construção do vetor de expressão, para permitir o crescimento seletivo de células procarióticas que contenham o vetor de expressão. Por exemplo, a ampicilina é adicionada ao meio para o crescimento de células que expressam o gene de resistência à ampicilina.

[0215] Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidas isoladamente ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

[0216] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sob temperaturas apropriadas. Para crescimento da E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia em cerca de 20 °C a 39 °C, mais preferivelmente entre 25 °C a 37°C, e mais preferivelmente ainda a cerca de 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pH que entre 5 a 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para a E. coli, o pH é preferencialmente de cerca de 6,8 a 7,4, de preferencialmente é de 7,0.

[0217] Se um promotor induzível é utilizado no vetor de expressão da presente invenção, a expressão da proteína é induzida em condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção,

113/149 promotores PhoA são usados para controlar a transcrição dos polipeptídeos. Assim, as células hospedeiras modificadas são cultivadas em um meio limitante de fosfato para a indução. Preferencialmente, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons et a!., J. Immunol. Methods. (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção do vetor utilizado, como é conhecido no estado da técnica.

[0218] Em um exemplo de realização, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados e recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. A recuperação da proteína envolve tipicamente o rompimento do micro-organismo, geralmente por meios como o choque osmótico, sonicação ou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou células inteiras podem ser removidos por meio da centrifugação ou filtragem. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia de afinidade em resina. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultivo e isoladas nele. As células podem ser removidas do cultivo e o sobrenadante da cultura filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodos comumente conhecidos, tais como a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio de Western Blot.

[0219] Em um aspecto da presente invenção, a produção do anticorpo é realizada em grande quantidade por meio de processos de fermentação. Vários procedimentos de fermentação descontínua alimentada em larga escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações em larga escala possuem capacidade de pelo menos 1000 litros, preferencialmente de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam pás agitadoras ou outros meios apropriados para

114/149 distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (uma fonte de carbono/energia preferida). A fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em um fermentador que possui capacidade volumétrica não maior que cerca de 100 litros e pode variar de cerca de um 1 litro a 100 litros.

[0220] No processo de fermentação, a indução da expressão de proteína é tipicamente iniciada após o crescimento das células sob condições adequadas até uma densidade desejada, tal como em uma OD₅₅₀ de cerca de 180 a 220, no qual as células estão iniciando a fase estacionária. Uma série de indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregado, conforme é sabido no estado da técnica e descrito anteriormente. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células normalmente são induzidas durante cerca de 12 a 50 horas, embora possa ser utilizado um tempo maior ou menor de indução.

[0221] Para melhorar adicionalmente o rendimento de produção e a qualidade dos polipeptídeos da presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Para melhorar a montagem e enovelamento adequado do anticorpo secretado, por exemplo, vetores adicionais que superexpressam proteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (peptidilprolil cis, transisomerase com atividade de chaperona) podem ser utilizados para cotransformar as células hospedeiras procarióticas. Demonstrou-se que as proteínas de chaperona facilitam o enovelamento adequado e solubilidade de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente US 6.083.715; Georgiou et al., Patente US 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

115/149 [0222] Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis) certas linhagens hospedeiras com deficiência de enzimas proteolíticas podem ser utilizadas para a presente invenção. Por exemplo, linhagens de células hospedeiras procarióticas podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, TonA, PhoA, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações destas. Algumas linhagens de E. Coli com deficiência de protease estão disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et a!., (1998) supra; Georgiou et al. Patente US 5.264.365, Georgiou et al. Patente US 5.508.192; Hara etal., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

[0223] Em um exemplo de realização, as cepas de E. coli deficientes de enzimas proteolíticas e transformadas com um ou mais plasmídeos que superexpressam proteínas chaperonas são utilizadas como células hospedeiras no sistema de expressão da presente invenção.

b. Células Hospedeiras Eucarióticas [0224] Meios de crescimento comercialmente disponíveis, tais como o meio Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para o cultivo de células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.560.655; US 5.122.469; US 5.712.163 ou US 6.048.728 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado, se necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloretos de X, onde X é sódio, cálcio, magnésio e fosfatos), tampões (como o HEPES), nucleotídeos (como a adenosina e

116/149 timidina), antibióticos (como droga GENTAMICINA®), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa do micromolar) e glicose ou fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura tais como, temperatura, pH, e similares são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o técnico hábil no assunto.

Purificação De Anticorpo [0225] Formas de anticorpos anti-fator D e fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) podem ser recuperadas a partir de meio de cultura ou de lisados das células hospedeiras. Se o anticorpo estiver ligado a membrana, ele pode ser liberado da membrana utilizando uma solução detergente apropriada (tal como Triton-X 100) ou através de divagem enzimática. As células empregadas na expressão do anticorpo ou polipeptídeo podem ser rompidas através de vários meios químicos e físicos, tais como ciclagem a frio (freeze-thaw cycling), sonicação, ruptura mecânica ou pelo uso de agentes de lise celular.

[0226] Pode-se desejar purificar o anticorpo anti-fator D a partir de proteínas ou polipeptídeos de células recombinantes. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação adequados: Pelo fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa; cromatografia em silica ou em uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromatofocusação; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amônio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes de metais para ligar formas epítopo-marcadas do anticorpo anti-fator D. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais

117/149 métodos são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nova Iorque (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada dependerá, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do anticorpo anti-fator D específico produzido.

[0227] Quando técnicas recombinantes são utilizadas, o anticorpo ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático ou secretados diretamente no meio. Se o anticorpo ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, tanto de células hospedeiras quanto de fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, pela centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos secretados no espaço periplasmático da E. coll. Em resumo, a pasta celular é fundida na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante 30 min. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é secretado no meio, o sobrenadante destes sistemas de expressão são, em geral, primeiramente concentrados pelo uso de um filtro de concentração proteica comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de utrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como o PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes indesejados.

[0228] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada pelo uso, por exemplo, da cromatografia em hidroxilapatita,

118/149 eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo uma técnica de purificação. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) deste. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas da IgGi, lgG₂, ou lgG₄ humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Metri 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para a IgGs humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz ao qual o ligante de afinidade é acoplado é mais freqüentemente, agarose, mas também outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem velocidade de fluxo mais rápida e tempo de processamento mais curto do que aqueles que podem ser alcançados com a agarose. Quando o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) compreende um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para a purificação de proteína tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em silica, cromatografia em heparina SEPHAROSE®, cromatografia em uma resina de troca catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocusação, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amônio também estão disponíveis e dependem do anticorpo ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) a ser recuperado.

[0229] Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) de interesse

119/149 e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo utilizando uma eluição tamponada em um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (tal como, cerca de 0 a 0,25 M de sal).

Formulações Farmacêuticas [0230] Formulações terapêuticas do polipeptídeo ou anticorpo, ou fragmento de anticorpo deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), ou anticorpo variante deste podem ser preparadas na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas pela mistura do polipeptídeo possuindo o grau desejado de pureza com veículos “farmaceuticamente aceitáveis” opcionais, excipientes ou estabilizantes tipicamente empregados no estado da técnica (todos os quais são denominados “excipientes”). Por exemplo, agentes de tamponamento, agentes estabilizantes, agentes conservantes, isotonificantes, detergentes não iônicos, antioxidantes e outros aditivos diversos. (Vide, Flemington's Pharmaceutical Sciences, 16^â Edição, Ed. A. Osol, (1980)). Tais aditivos devem ser atóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas.

[0231] Agentes de tamponamento ajudam a manter o pH no intervalo que se aproxima das condições fisiológicas. Eles estão presentes preferencialmente em um intervalo de concentração variando em cerca de 2 mM a 50 mM. Agentes de tamponamento adequados para uso na presente invenção incluem tanto ácidos orgânicos quanto inorgânicos e seus sais como, por exemplo, o tampão citrato (por exemplo, mistura de citrato-monossódio e citrato disódico, mistura de ácido cítrico e citrato trissódico, mistura de ácido cítrico e citrato monossódio, etc), tampões succinato (por exemplo, mistura de ácido succínico e succinato monossódio, mistura de ácido succínico e hidróxido de sódio, mistura de ácido succínico e succinato dissódico, etc), tampões tartarato (por exemplo, mistura de ácido tartárico e tartarato de sódio, mistura

120/149 de ácido tartárico e tartarato de potássio, mistura de ácido tartárico e hidróxido de sódio, etc), tampões fumarato (por exemplo, mistura de ácido fumárico e fumarato monossódio, etc), tampões fumarato (por exemplo, mistura de ácido fumárico e fumarato monossódio, mistura de ácido fumárico e fumarato disódico, mistura de fumarato monossódio e fumarato disódico, etc), tampões gluconato (por exemplo, mistura de ácido glucônico e gliconato de sódio, mistura de ácido glucônico e hidróxido de sódio, mistura de ácido glucônico e gliconato de potássio, etc), tampões oxalato (por exemplo, mistura de ácido oxálico e oxalato de sódio, mistura de ácido oxálico e hidróxido de sódio, mistura de ácido oxálico e oxalato de potássio, etc), tampões lactato (por exemplo, mistura de ácido láctico e lactato de sódio, mistura de ácido láctico e hidróxido de sódio, mistura de ácido lático e lactato de potássio, etc) e tampões acetato (por exemplo, mistura de ácido acético e acetato de sódio, mistura de ácido acético e hidróxido de sódio, etc.). Além disso, podem ser mencionados os tampões fosfato, tampões histidina e sais trimetilamina como, por exemplo, o Tris.

[0232] Conservantes podem ser adicionados para retardar o crescimento microbiano, e podem ser adicionados em quantidades variando de 0,2% -1% (p/v). Conservantes adequados para o uso com a presente invenção incluem fenol, álcool benzílico, meta-cresol, metil parabeno, propilparabeno, cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, benzalcônio halogenatos (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de hexametônio, alquil parabenos, tal como metil- ou propil-parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol e 3-pentanol.

[0233] Isotonificantes por vezes conhecidos como estabilizantes podem ser adicionados para garantir a isotonicidade de composições líquidas da presente invenção e incluem alcoóis de açúcar polihidrico, de preferência trihídrico ou superiores, tais como a glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.

121/149 [0234] Estabilizantes referem-se a uma vasta categoria de excipientes que podem variar na função desde um agente de volume até um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a evitar desnaturação ou aderência nas paredes do recipiente. Estabilizantes típicos podem ser alcoois açúcar polihídricos (referidos acima); aminoácidos como a arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2fenilalanina, ácido glutâmico, treonina e etc. açúcares orgânicos ou alcoois de açúcar, como a lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e similares, incluindo ciclitois, como inositol; polietileno glicol; polímeros aminoácido; enxofre contendo agentes redutores, como a ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol,. alfamonotioglicerol e tiosulfato de sódio; polipeptídeos de baixo peso molecular (ou seja, <10 resíduos); proteínas como a albumina humana, albumina sérica bovina, gelatina ou imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona monossacáride, tal como a xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídios como a lactose, maltose, sacarose e trisacarídeos como a rafinose; polissacarídeos como o dextrano. Estabilizantes podem estar presentes no intervalo de 0,1 a 10.000 em peso por parte de massa ativa de proteína.

[0235]Tensoativos não iônicos ou detergentes (também conhecidos como agentes umidificantes) podem ser adicionados para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem como para proteger as proteínas terapêuticas contra a agregação induzida pela agitação, que também permite a formulação ser exposta ao estresse de cisalhamento da superfície sem causar a desnaturação da proteína. Tensoativos não iônicos apropriados inclui polissorbatos (20, 80, etc), polioxamêros (184, 188 etc), Pluronic®. poliois, polioxietileno sorbitano monoéteres (Tween-20®, Tween-80®, etc.). Tensoativos não iônicos podem estar presentes em um intervalo de cerca de 0,05 mg/ml a

122/149 cerca de 1,0 mg/ml, preferencialmente cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml.

[0236] Diversos excipientes adicionais incluem agentes de volume (por exemplo, amido), agentes quelantes (por exemplo, EDTA), antioxidantes (por exemplo, o ácido ascórbico, metionina, vitamina E), e co-solventes. A presente formulação também pode conter mais de um composto ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não prejudique um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer ainda um agente imunossupressor. Tais moléculas estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Os ingredientes ativos podem também ser armazenados em microcápsula preparada, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através da polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Flemington's Pharmaceutical Sciences, 16^â Edição, Osol, A. Ed. (1980).

[0237] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtragem estéreis. Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo ou anticorpo variante ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), em que as matrizes se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem

123/149 poliésteres, hidrogeis (tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcool poli-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido Lglutâmico e L-glutamato de etila, acetato de etilenovinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogeis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo período, eles podem desnaturar ou se agregarem como resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando na perda da atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se é descoberto que mecanismo de agregação é a formação de pontes S-S intermoleculares através do intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização podería ser obtida pela modificação de resíduos sufidrila, liofilização de soluções ácidas, controlando o conteúdo de umidade, utilizando aditivos adequados e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas.

[0238] Os compostos da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença ou condição ocular são geralmente administrados por injeção ocular, intraocular e/ou injeção intravítrea, e/ou injeção justascleral, e/ou injeção subtenoniana e/ou supercoroidal e/ou administração tópica sob a forma de colírios e/ou pomada. Tais compostos da presente invenção podem ser entregues por uma diversidade de métodos, por exemplo, intravítrea como um dispositivo e/ou um depósito que permite a liberação lenta do composto para ao vítreo, incluindo aqueles descritos em referências como Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton e Pearson, Eds, Taylor & Francis (Março

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2006). Em um exemplo, um dispositivo pode estar na forma de uma minibomba e/ou uma matriz e/ou um sistema de difusão passiva e/ou células encapsuladas que liberam o composto por um período de tempo prolongado (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton e Pearson, Eds, Taylor & Francis (Março 2006)). Outros métodos de administração também podem ser usados, que incluem, mas não estão limitados a, administração tópica, parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal e intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea.

[0239] Formulações para a administração ocular, intraocular ou intravítrea podem ser preparadas pelo uso de métodos e ingredientes conhecidos no estado da técnica. A principal exigência para o tratamento eficaz é a penetração adequada através do olho. Ao contrário das doenças da parte frontal do olho, onde as drogas podem ser entregues por via tópica, doenças da retina exigem uma abordagem mais sítio-específica. Os colírios e pomadas raramente penetram na parte posterior do olho, e a barreira hemato-ocular impede a penetração das drogas administradas sistemicamente para o tecido ocular. Consequentemente, o método de escolha para a entrega da droga para tratar doenças da retina, como a DMRI e a VNC, normalmente é injeção intravítrea direta. As injeções intravítreas são geralmente repetidas em intervalos que dependem da condição do paciente, e as propriedades de meiavida da droga entregue. Para a penetração intraocular (por exemplo, intravítrea), normalmente são preferidas moléculas de menor tamanho.

[0240] A eficácia do tratamento das doenças oculares associadas ao complemento, como a DMRI ou a VNC, pode ser mensurada por vários parâmetros utilizados na avaliação das doenças intraoculares. Por exemplo, pode ser avaliada a perda da visão. A perda de visão pode ser avaliada por, mas não se limitando a, por exemplo, a medição pela variação média da

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Melhor Acuidade Visual Corrigida (MAVC) desde o tempo basal até o período desejado (por exemplo, onde a MAVC é baseada nos gráficos e critérios de avaliação da acuidade visual do estudo “Early Treatment Diabetic Retinopathy Study - (ETDRS)” a uma distância de ensaio de 4 metros), medindo a proporção de indivíduos que perdem menos de 15 letras na acuidade visual em um ponto de tempo desejado em comparação com o ao valor basal, medindo a proporção de indivíduos que ganham mais ou igual a 15 letras na acuidade visual em um ponto de tempo desejado em comparação ao valor basal, avaliando a proporção de indivíduos com uma acuidade visual equivalente de Snellen de 20/2000 ou pior no período de tempo, avaliando pelo questionário de função visual (NEI), avaliando o tamanho e quantidade de extravasamento do VNC em um período tempo desejado, por exemplo, por angiofluoresceinografia e etc. Avaliações oculares podem ser feitas, por exemplo, incluindo mas não se limitando a, por exemplo, a realização de exame de vista, aferição da pressão intraocular, avaliação da acuidade visual, medição de pressão com lâmpada de fenda (slit lamp), avaliação da inflamação intraocular e etc.

[0241] A quantidade de polipeptídeo, anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) terapêutico que será eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição irá depender da natureza da doença ou condição, e pode ser determinado por técnicas clínicas padrão. Sempre que possível, é desejável primeiramente determinar a curva dose-resposta e as composições farmacêuticas da presente invenção in vitro, e em seguida em sistemas de modelos animais úteis antes do ensaio em seres humanos.

[0242] Em um exemplo de realização, uma solução aquosa terapêutica de polipeptídeo, anticorpo, ou anticorpo variante, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), é administrada por

126/149 injeção subcutânea. Em outro exemplo de realização, uma solução aquosa terapêutica de polipeptídeo, anticorpo, ou anticorpo variante, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), é administrada por injeção intravítrea. Cada dose pode variar de cerca de 0,5 pg a cerca de 50 pg por quilo de peso corporal, ou mais preferencialmente, cerca de 3 pg a cerca de 30 pg por quilo de peso corporal.

[0243] O esquema de administração para administração subcutânea pode variar de uma vez por mês até a administração diária, dependendo de uma série de fatores clínicos, incluindo o tipo de doença, a gravidade da doença e a sensibilidade do indivíduo ao agente terapêutico.

[0244] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam, de forma alguma, a limitar o escopo da presente invenção.

[0245] Todas as patentes e referências bibliográficas citadas no presente relatório descritivo são claramente incorporadas ao presente pedido pela referência em sua totalidade.

Artigos de Manufatura e Kits [0246] Outro exemplo de realização da presente invenção é um artigo de manufatura que contem materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das condições alvos pelos anticorpos da presente invenção, ou variantes destes ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno). Por exemplo, a presente invenção refere-se a um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios associados ao complemento. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que

127/149 é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição associada ao complemento e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-fator D, ou fragmento deste (por exemplo, fragmentos de ligação de antígeno) da presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é útil para o tratamento prevenção e/ou diagnóstico de uma condição específica.

[0247] A bula se refere às instruções habitualmente incluídas nos pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências sobre o uso de tais produtos terapêuticos. Em um exemplo de realização, rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para tratar distúrbios associados ao complemento, como, por exemplo, qualquer uma das condições mencionadas anteriormente, incluindo distúrbios oculares como, por exemplo, a degeneração macular relacionadas com a idade (DMRI). O rótulo ou bula compreenderá adicionalmente de instruções para a administração da composição de anticorpo ao paciente.

[0248] Adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[0249] Em outro exemplo de realização, também são fornecidos kits que são úteis para diversas finalidades, por exemplo, para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios associados ao complemento, para ensaios de hemólise associados ao complemento, para a purificação ou

128/149 imunoprecipitação do polipeptídeo Fator D a partir de células. Para o isolamento e purificação do polipeptídeo Fator D, o kit pode conter um anticorpo anti-fator D acoplado a esferas (por exemplo, esferas de Sepharose). Podem ser fornecidos kits que contenham os anticorpos para a detecção e quantificação do polipeptídeo fator D in vitro, por exemplo, em um ensaio de ELISA ou Western blot. Assim como o artigo de manufatura, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula inserida na embalagem ou associada ao recipiente. O recipiente guarda uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-fator D, ou fragmento deste (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) da presente invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais contendo, por exemplo, diluentes e tampões e anticorpos controle. O rótulo ou bula inserida na embalagem pode fornecer uma descrição da composição bem como instruções para seu uso in vitro ou na detecção pretendida. A rótulo ou bula poderá fornecer instruções para a administração (por exemplo, do anticorpo, ou fragmento deste (por exemplo, fragmentos de ligação de antígeno) a um indivíduo.

Uso para O Anticorpo Humanizado [0250] Os anticorpos humanizados, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou um variante deste, da presente invenção são úteis em testes diagnósticos, por exemplo, para detectar a expressão de um alvo de interesse em células, tecidos ou soro específicos. Para aplicações diagnosticas, o anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento de anticorpo deste (por exemplo, fragmento de ligação de antígeno), normalmente será marcado com uma fração detectável. Uma variedade de marcadores está disponível. Técnicas para a quantificação de uma alteração na fluorescência estão descritas acima. O substrato quimioluminescente tornase excitado eletronicamente por uma reação química e pode, então, emitir luz que pode ser mensurada (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doa

129/149 energia para um aceptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, Luciferase firefly e Luciferases bacterianas (Patente US 4.737.456), Luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidases como, por exemplo, peroxidase do rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarina oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicas para a conjugação de enzimas aos anticorpos estão descritas em O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay em: Methods in Enzym., Ed. J.J. Langone e H. Van Vunakis, Academic Press, Nova Iorque, vol. 73, págs. 147-166 (1981).

[0251] Algumas vezes, o marcador é conjugado indiretamente com o anticorpo ou anticorpo variante, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Os técnicos hábeis no assunto terão conhecimento de diversas técnicas para se chegar a isso. Por exemplo, o anticorpo variante pode ser conjugado com biotina e qualquer um das três grandes categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugado com a avidina, ou vice-versa. A biotina se liga seletivamente a avidina e, assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) de forma indireta. Alternativamente, para atingir a conjugação indireta do marcador com o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digloxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno variante ou anticorpo variante deste (por exemplo, anticorpos anti-digloxina) ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Assim, a conjugação indireta do marcador

130/149 com o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) pode ser alcançada.

[0252] Em outro exemplo de realização da presente invenção, o anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) não precisa ser marcado, e a presença deste pode ser detectada utilizando um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno).

[0253] Os anticorpos, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios do tipo sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs.. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

[0254] Ensaios de ligação competitivos contam com a capacidade de um marcador padrão competir com a amostra teste pela ligação com uma quantidade limitada de anticorpo, ou anticorpo variante ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). A quantidade de alvos na amostra teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que estará ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que se tornará ligada, os anticorpos são geralmente insolubilizados antes ou depois da competição. Como resultado, o padrão e a amostra teste que estão ligados aos anticorpos podem convenientemente ser separados do padrão e a amostra teste continuará ligada.

[0255] Ensaios do tipo sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, ou fragmento destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), todos capazes de se ligar a outra porção imunogênica, ou epítopo, ou proteína a ser detectada. Em um ensaio do tipo sanduíche, a amostra a ser

131/149 analisada é ligada a um primeiro anticorpo que está imobilizado em um suporte sólido, e, posteriormente, um segundo anticorpo liga-se a amostra, formando um complexo insolúvel em três partes. Vide, por exemplo, a Patente US 4.376.110. O segundo anticorpo pode ele mesmo ser marcado com uma molécula detectável (ensaio sanduíche direto) ou pode ser mensurado utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma molécula detectável (ensaio sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio sanduíche é um ensaio ELISA, no caso a molécula detectável é uma enzima.

[0256] Para a imuno-histoquímica, a amostra de tumor pode ser fresca ou congelada ou pode ser emblocada em parafina e fixada com conservantes, como o formol, por exemplo.

[0257] Os anticorpos, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação de antígeno) também podem ser utilizados para ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, o anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação de antígeno) é marcado com um radionucleotídeo (tal como, In¹¹¹, Tc, C¹⁴, I¹³¹, H³, P³² ou S³⁵) de modo que o tumor possa ser localizado utilizando a imunocintilografia. Por exemplo, uma anticorpo anti-lgE de alta afinidade da presente invenção pode ser utilizado para detectar a quantidade de IgE presente, por exemplo, nos pulmões de um paciente asmático.

[0258] O anticorpo, ou anticorpo variante deste ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) da presente invenção pode ser oferecido em um kit, ou seja, combinação de reagentes embalados em quantidades predeterminadas com instruções para a realização do teste diagnóstico. Quando o anticorpo, ou anticorpo variante deste ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é marcado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e co-fatores exigidos pela enzima (por exemplo, um substrato precursor que fornece o cromóforo ou fluoróforo

132/149 detectável). Além disso, podem ser incluídos outros aditivos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, tampão de bloqueio ou tampão de lise) e similares. As quantidades relativas dos vários reagentes podem variar amplamente para fornecer concentrações na solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos na forma de pó seco, geralmente liofilizado, incluindo excipientes sobre o qual a dissolução irá fornecer uma solução reagente contendo a concentração adequada.

Usos In Vivo para O Anticorpo [0259] É contemplado que os anticorpos, ou anticorpos variantes destes, ou fragmentos destes (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) da presente invenção podem ser usados para tratar um mamífero. Em um exemplo de realização o anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmentos deste é administrado a um mamífero não humano com o propósito de se obter dados pré-clínicos, por exemplo. Exemplos de mamíferos não humanos para serem tratados incluem primatas não humanos, cães, gatos, roedores e outros mamíferos nos quais os estudos pré-clínicos são realizados. Esses mamíferos podem ser modelos estabelecidos de animais para uma doença a ser tratada com o anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmentos deste ou podem ser utilizados para o estudo de toxicidade do anticorpo de interesse. Em cada um destes exemplos de realização, os estudos da curva de dose podem ser realizados no mamífero.

[0260] O anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou polipeptídeo é administrado por qualquer via adequada, incluindo a parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonares, e intranasal, e, se desejado para o tratamento imunossupressivo local, a administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal

133/149 ou subcutânea. Além disso, o anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é administrado adequadamente por meio de infusão pulsada, especialmente com doses decrescentes do anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno). Preferencialmente a dosagem é dada por injeções, mais preferencialmente por injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, se a administração é breve ou crônica.

[0261] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dose adequada de anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou polipeptídeo dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e evolução da doença, se o anticorpo variante é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), e do critério do médico.

[0262] Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de

0,1 mg/kg a 150 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) é uma dose inicial candidata para ser administrada ao paciente seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar entre cerca de 1 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para as administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra a supressão pretendida dos sintomas da doença. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e

134/149 ensaios convencionais. Um regime de dosagem exemplar está divulgado no documento WO 94/04188.

[0263] As composições de anticorpo podem ser formuladas, dosadas e administradas de uma forma consistente com a boa prática médica. Fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente o local de entrega do agente, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O termo quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) a ser administrado será regido por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para prevenir, atenuar ou tratar uma doença ou distúrbio. O anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) não é necessariamente, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) presente na formulação, o tipo de doença ou distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados na mesma dosagem e com as vias de administração utilizadas conforme mencionado anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagens até então empregadas.

[0264] Os anticorpos, ou anticorpo variante deste, ou fragmento deste (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) da presente invenção que reconhecem o Fator D como seu alvo podem ser utilizados para tratar distúrbios mediados pelo complemento. Estes distúrbios estão associados com a ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Eles incluem: a ativação do complemento durante operações com circulação extracorpórea;

135/149 ativação do complemento devido à isquemia e reperfusão após infarto agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão por esmagamento, falência múltipla de órgãos, choque hipovolêmico e isquemia intestinal. Estes distúrbios podem também incluir doenças ou condições em uma condição inflamatória, tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, síndrome do desconforto respiratório do adulto, hemodiálise; choque anafilático, asma grave, angioedema, doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. Os distúrbios podem ser resultado de uma reação adversa ao medicamento, alergia ao medicamento, síndrome de extravasamento vascular induzida por IL2 ou alergia ao meio de contraste radiológico. Ele também inclui doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla. A ativação do complemento também está associada com a rejeição de transplante. Recentemente foi demonstrada uma forte correlação entre a ativação do complemento com as doenças oculares, tais como a degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética e outras retinopatias relacionadas com a isquemia, neovascularização coroidal (NVC), uveíte, edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão da veia central da retina (OVCR), neovascularização da córnea, e neovascularização da retina.

Exemplos [0265] Os exemplos seguintes são oferecidos com o objetivo de ilustrar e não de limitar a presente invenção Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, salvo quando indicado ao contrário. A fonte das células identificadas nos exemplos a seguir, e em todo o relatório descritivo,

136/149 pelos números de acesso ATCC é da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209.

Exemplo 1

Modificação De Acs Anti-fator D [0266] Para identificar anticorpos anti-fator D modificados, e variantes destes e fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que possuiríam características comercialmente desejáveis, tais como homogeneidade durante a fabricação e produção ou para fins de caracterização analítica, foi utilizada uma abordagem de mutagênese sítiodirigida para gerar anticorpos anti-fator D humanizados modificados, e variantes destes e fragmentos destes (por exemplo, fragmentos de ligação de antígeno). Primeiro, os domínios de cadeia leve e pesada variável do Fab antifator D humanizado clone #111 (SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 1, respectivamente) foram subclonados em um plasmídeo de expressão. Em seguida, as mutações pontuais codificando oligonucleotídeos foram aneladas ao plasmídeo de expressão resultante para introduzir as mutações sítiodirigidas.

[0267] Inicialmente, os domínios variáveis de cadeia leve e pesada do Fab anti-fator D humanizado clone #111 foram subclonados no plasmídeo pAEP1 (pAEP1 é um plasmídeo para expressão de anticorpos Fab em E.coli.), com a subclonagem resultando na introdução de uma valina (V) na posição 104 (numeração de acordo com Kabat, vide figura 10) do domínio variável de cadeia leve.

[0268] A subclonagem do domínio variável da cadeia leve da Fab anti-fator D humanizado clone #111 no pAEP1 envolveu a ligação de dois fragmentos de DNA. O primeiro fragmento foi o vetor pAEP1 no qual o pequeno fragmento EcoRV/Kpnl foi removido. O segundo fragmento era um fragmento de PCR EcoRV-Kpnl de aproximadamente 300 pares de bases gerados a partir

137/149 da cadeia leve do plasmídeo para o Fab anti-fator D humanizado clone #111, utilizando os seguintes primers:

5’ - TTTCCCTTTGATATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCT-3’ (SEQ ID No: 67)

5’ - TTTCCCTTTGGTACCCTGGCCAAACGTGTACGGCAA

AGAATC-3’ (SEQ ID No: 68).

[0269] A subclonagem do domínio variável de cadeia leve do antifator D humanizado clone #111 no pAEP1 introduziu uma valina (V) na posição 104 por pois a posição 104 é 2 aminoácidos a jusante dos sítios de restrição das endonucleases EcoFN e Kpn\, que foram utilizadas para inserir o domínio variável da cadeia leve do anti-fator D humanizado clone #111 no pAEP1 e, portanto, a estrutura principal do plasmídeo pAEP1. Este plasmídeo intermediário resultante é referido no presente como pAEP1-283-VL.

[0270] A subclonagem do domínio variável de cadeia pesada do anti-fator D humanizado clone #111 no pAEP1-238-VL envolveu a ligação de dois fragmentos de DNA. O primeiro fragmento foi o vetor pAEP1-238-VL no qual um pequeno fragmento BsiWI/PspOMI foi removido. O segundo fragmento era um fragmento gerado por PCR BsiWI-PspOMI de aproximadamente 364 pares de bases a partir do plasmídeo de cadeia pesada para o Fab anti-fator D humanizado clone #111, utilizando os seguintes primers:

5’ - TTTGGGTTTCGTACGCTCAGGTCCAGCTGGTGCAAT

CTGGG-3’ (SEQ ID No: 69)

5’ - TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACG GTGACCAGGGT-3’ (SEQ ID No: 70).

[0271] Esta ligação dos dois fragmentos de DNA resultou no plasmídeo para o anticorpo variante Fab 238 anti-fator D humanizado (também referida no presente como 238; o plasmídeo é referido no presente como p238).

138/149 [0272] Após a subclonagem dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anti-fator D humanizado clone #111, a mutagênese sítio-dirigida por PCR foi utilizada para mutar a glutamina (Q) na posição 1 (segundo a numeração de Kabat, vide Figura 1) da cadeia pesada variável do variante de anticorpo Fab 238 anti-fator D humanizado por um glutamato (E), resultando no anticorpo variante Fab 238-1 anti-fator D humanizado (também referido no presente como 238-1). A construção do plasmídeo para anticorpo variante Fab 238-1 anti-fator D humanizado (plasmídeo referido no presente como p238-1) envolveu a ligação de dois fragmentos de DNA. O primeiro fragmento foi o vetor p238 em que o pequeno fragmento BsiWI/PspOMI foi removido. O segundo fragmento foi um fragmento gerado por PCR BsiWI-PspOMI de aproximadamente 364 pares de base a partir do plasmídeo p238, utilizando os seguintes primers:

5’ - TTTGGGTTTCGTACGCTGAAGTCCAGCTGGTGCAATCT GGG-3’ (SEQ ID No: 71)

5’ - TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT GACCAGGGT-3’ (SEQ ID No: 72).

[0273] Esta ligação dos dois fragmentos de DNA resultou no plasmídeo para o anticorpo variante Fab 238-1 anti-fator D humanizado (também referido no presente como 238-1; plasmídeo é referido no presente como p238-1), que incluiu a mutação sítio-dirigida da posição 1 para o glutamato (E). Esta mutação foi encontrada por inibir a conversão parcial da glutamina (Q) no anticorpo variante Fab 238-1 anti-fator D humanizado para piroglutamato (Amphlett, G. etal. Pharm. BiotechnoL, 9:1-140 (1996)).

[0274] Além disso, mutagênese por PCR sítio-dirigida pode ser usada para modificar os resíduos metionina (Met ou M) ou triptofano (W ou Trp) para evitar a oxidação ou para modificar resíduos de asparagina (Asn ou N) para evitar a desaminação. Para evitar a formação de variantes oxidados dos

139/149 anticorpos anti-fator D humanizados, as metioninas (M ou Met), por exemplo, na posição 33 da cadeia leve pode ser alterada para leucina (L ou Leu), que é mais similar em tamanho e hidrofobicidade com a metionina, mas carece de enxofre para a oxidação, ou, alternativamente, alterada para isoleucina (I ou He) (Amphlett, G. et al. Pharm. BiotechnoL, 9:1-140 (1996)). Para evitar a formação de variantes desaminadas dos anticorpos anti-fator D humanizados, a asparagina (N ou Asn), por exemplo, na posição 34 e 52 da cadeia leve ou posição 99 ou 100 da cadeia pesada podem ser alteradas para glutamina (Q ou Gin), que é mais semelhante quimicamente com a asparagina (N ou Asn), ou alterando para alanina (A ou Ala) e serina (Ser ou S), que são substituições comuns a essas posições em outros anticorpos (Amphlett, G. et al., Pharm. BiotechnoL, 9:1-140 (1996)).

[0275] As figuras 1-2 exibem as sequências do domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada para o anticorpo variante Fab 238 anti-fator D humanizado (SEQ ID Nos: 6 e 18, respectivamente) e anticorpo variante Fab 238-1 anti-fator D humanizado (SEQ ID Nos: 7 e 19, respectivamente). A Figura 4 e Figura 6 exibem as sequências de cadeia leve e de cadeia pesada (SEQ ID Nos: 47 e 54, respectivamente) para o anticorpo variante Fab 238 anti-fator D humanizado. As Figura 8 e Figura 10 exibem as sequências de cadeia leve e de cadeia pesada (SEQ ID Nos: 61 e 63, respectivamente) para o anticorpo variante Fab 238-1 anti-fator D humanizado.

[0276] Os dados de Biacore demonstraram afinidade anticorpo variante Fab 238 anti-fator D humanizado para o Fator Humano D, bem como a afinidade do mAb anti-fator D humanizado de comprimento total versão do clone #111 (mAb 234 anti-fator D humanizado de comprimento total) (referido no presente como 234 ou mAb 234 anti-fator D de comprimento total ou mAb 234 anti-fator D humanizado de comprimento total) (Tabela 2). Os anticorpos anti-fator D humanizados variantes Fab 238 e 238-1 também foram

140/149 testados no ensaio de inibição da hemólise (Figura 11) para avaliar a inibição da via alternativa (vide Exemplo 3).

Exemplo 2

Ensaio De Hemólise AP [0277] A função biológica dos Acs modificados anti-fator D foi determinada utilizando o ensaio de inibição da hemólise usando soro humano C1q-depletado e análise por BIAcore (vide Exemplo 3 abaixo). O ensaio hemolítico foi realizado de acordo com o seguinte procedimento:

[0278] Para a determinação da atividade da via alternativa, eritrócitos de coelho (Er, Colorado soro) foram lavados 3x em GVB e resuspensos em 2 x 10⁹/mL. Inibidores (50μΙ) e 20 μΙ de suspensão Er foram misturados 1:1 com GVB/0,1M EGTA/0,1M MgCh. A ativação do complemento foi iniciada pela adição de soro huamno com C1q depletado (para evitar a ativação do complemento pela via clássica) (Comptech, 30 ml diluídos em GVB 1:3). Após a incubação de 30 minutos em temperatura ambiente, 200 μΙ de GVB/10 mM EDTA foram adicionados para parar a reação e as amostras foram centrifugadas por 5 min a 500 g. Hemólise foi determinada em 200 μΙ de sobrenadante, medindo a absorbância a 412 nm. Os dados foram expressos em % de hemólise induzida na ausência do inibidor.

[0279] A Figura 11 mostra a inibição do anti-fator D humanizado Fab clone #111 (IC50 = 4,7 ± 0,6 nM), anti-fator D humanizado Fab modificado 238 (IC50 = 6,4 ± 0,6 nM) e anti-fator D humanizado Fab modificodo 238-1 (IC50 = 3,5 ± 0,5 nm) sobre a hemólise pela via alternativa usando um ensaio de hemólise celular com eritrócitos de coelhos utilizando soro humano com C1q depletado como fonte de complemento. Os controles foram Fator H (Human FH) (da Comptech) e anticorpos anti-glicoproteína 120 (xgp120).

Exemplo 3

Análise Cinética do Fab Anti-fator D Humano Por Biacore

141/149 [0280] A cinética e constantes de afinidade para a ligação do fator D humano (Advanced Research, Inc.) para o anti-fator D Fab modificado 238 imobilizado (referido no presente como 238; vide Exemplo 1) foram determinadas por medições de ressonância plasmônica de superfície em ambos instrumentos Biacore 3000 e Biacore A100. Para os valores na Tabela 2, que estão listados como resultados Biacore 3000/BiaCore A100, experimentos separados foram feitos para cada instrumento, os dados a partir dos experimentos separados foram analisados separadamente para se obter as constantes cinéticas, e as constantes cinéticas foram calculadas para se obter os valores exibidos na Tabela 2. Alternativamente, a cinética e as constantes de afinidade para a ligação do fator D humano, pode ser mensurada por meio da imobilização do fator D humano e, em seguida, mensurando a ligação do mAb ou Fab, que pode ser mensurado usando diferentes condições de regeneração (por exemplo, que compreende 4M de MgCh) e/ou pode ser mensurado usando tampões de ligação diferentes (por exemplo, que compreende PBS). O mAb anti-fator D humanizado de comprimento total versão de clone #111 (referido no presente como 234 ou mAb 234 anti-fator D de comprimento total ou mAb 234 anti-fator D humanizado de comprimento total) também foi analisado.

1. Imobilização [0281] O mAb ou Fab foram imobilizados utilizando um método de ligação com a amina usando um protocolo padrão fornecido pelo fabricante. A densidade da ligação foi regulada pelo ajustamento da concentração e do pH das soluções de mAb ou Fab injetadas, de modo que o sinal total para saturar a ligação do fator D humano foi entre 50 e 150 unidades de ressonância (RU). Após o acoplamento da quantidade desejada de mAb ou Fab, os grupos funcionais que não reagiram sobre o chip sensor foram bloqueados pela injeção de etanolamina.

142/149

2. Análise Cinética [0282] Os experimentos de ligação foram conduzidos injetando alíquotas de 60 μΙ de uma série de soluções de fator D humano de diferentes concentrações a partir de 500 nM até 0,98 nM em incrementos de 2 vezes. Todas as amostras foram diluídas em tampão de corrida composto por 150 mM de NaCI, 0,01% de Tween-20 e um dos seguintes componentes do tampão: (a) pH 7,2 (HEPES 10 mM (4-(2-hidroxietil)-1 -ácido piperazinaetanosulfônico); (b) pH = 6,0 (10 mM MES (2-[N-morfolino] ácido etanosulfônico) ou pH 5,0 (10 mM acetato de sódio). A velocidade de fluxo foi de 30 pL/min e a dissociação foi monitorada por 10 minutos para cada concentração de fator D humano testada. O sinal (sensorgrama) observado para a injeção das mesmas soluções sobre uma célula de referência (bloqueado com etanolamina) foi subtraída do sensorgrama. Entre os sensorgramas a superfície foi regenerado pela injeção de 30 μΙ_ de MgCI₂ 4 M para causar a dissociação de qualquer fator humano D restante ligado ao anticorpo imobilizado. O sensorgrama registrado para a injeção controle apenas com tampão sobre a superfície do chip sensor foi subtraído dos sensorgramas do fator D humano.

[0283] Estes dados foram analisados por regressão não linear de acordo com um modelo de ligação de Langmuir 1:1 usando o software BIAevaluation v4.1. A cinética e as constantes de afinidade são fornecidas na Tabela 2 abaixo. A tecnologia Biacore é limitada e não é capaz de medir com precisão as velocidades de associação (o/?-rate) que são muito rápidas (u seja, valores Kd menores do que cerca de 10 pM) (Safsten et al., Anal Biochem, 353:181 (2006)).

Tabela 2

Resultados do Biacore

Fab ou Anticorpo	ka (M'1s‘1)	kd (s1)	KD (M)

143/149

Fab ou Anticorpo	ka (M'1s‘1)	kd (s1)	KD (M)
Anti-fator D modificado Fab 238 (pH 7,2; A100)	1,5x108	1,7x10-4	1,0x10'12 (1,0pM±0,05)
Anti-fator D modificado Fab 238 (pH 7,2; 3000/A100)	8,4±9x108	1,4±1,7x10-3	1,4x10-12 (1,4 pM ± 0,5)
Anti-fator D modificado Fab 238 (pH 6; 3000)	1,9x106	3,6x10'4	0,19x10'9 (0,19 nM ± 0,01)
Anti-fator D modificado Fab 238 (pH 5; A100)	1,2x106	0,02	12,3x10'9 (12,3 nM ±2)
Anti-fator D de comprimento total mAb 234 (pH 7,2; A100)	1,9x108	1,3x10 4	0,7x10'12 (0,7 pM ±0,04)
Anti-fator D de comprimento total mAb 234 (pH 7,2; 3000/A100)	9,5±10x108	1,3±1,7x10-3	1,1 x10’12 (1,1 pM ± 0,6)
Anti-fator D de comprimento total mAb 234 (pH 6; 3000)	2,8x106	2,2x10'4	0,08x10'9 (0,08 nM ± 0,01)
Anti-fator D de comprimento total mAb 234 (pH 5; A100)	2,2x106	2,0x10'2	9x10'9 (9,0 nM ±1,0)

Exemplo 4

Ensaio De Hemólise AP Com Diferentes Concentrações do Fator D [0284] A função biológica dos Acs anti-fator D modificados, incluindo o anti-fator D Fab 238, foi determinada utilizando o ensaio de inibição hemolítica utilizando soro humano com C1q depletado e análise por Biacore (vide exemplo 2 acima), na presença de três concentrações séricas de fator D.

[0285] O soro humano com C1q esgotado (Comptech), bem como o líquido do vítreo e o tecido da membrana de Bruch de olhos de pacientes com DMRI (obtidos através de uma colaboração com o Cole Eye Institute, Cleveland, OH) foram analisados em um ensaio de ELISA quantitativo para o Fator D (vide abaixo). A concentração do Fator D no soro C1q depletado foi de

144/149 nM, enquanto que o nível no fluido vítreo e no tecido da membrana de Bruch de pacientes com DMRI foi de 16,2 ± 10,3 nM (média ± DP, n = 10).

[0286] O ELISA quantitativo para fator D foi realizado diluindo o anticorpo policlonal de cabra anti-fator D do complemento humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 1 pg/mL em tampão fosfato salina (PBS) e revestindo os anticorpos policlonais anti-fator D (R&D Sistemas, Minneapolis, MN) em placas de ELISA de 384 poços (high-bind plates; Greiner Bio One pela VWR International, Bridgeport, Vova Jersey), por um período de incubação overnight a 4°C. Após a lavagem por 3 vezes com tampão de lavagem (PBS/0,05% de Tween-20), as placas foram bloqueadas por 1 a 2 h com PBS/albumina bovina (BSA) 0,5%. Esta e todas as outras incubações foram realizadas à temperatura ambiente em um agitador orbital. Uma curva padrão do fator D (Complement Technology, Inc., Tyler, Texas) foi preparada em PBS/BSA 0,5%/Tween-20 0,05% em uma faixa de 15,6 - 1.000 pg/mL. Amostras controle congeladas pré-diluídas para quantificar as regiões de a alta, média e baixa concentração da curva padrão foram descongeladas. O soro humano com C1q depletado e o líquido vítreo humano e lisados das amostras da membrana de Bruch foram diluídos com o diluente de ensaio (PBS/BSA 0,5%/Tween-20 0,5%). Após a etapa de bloqueio, as placas foram lavadas e as amostras diluídas (soro, fluido vítreo e lisado da membrana de Bruch), os padrões e controles foram adicionados e incubados por 2 horas. Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas, e o fator D ligado foi detectado durante uma incubação de 1 a 2 horas com um anticorpo monoclonal anti-fator D biotinilado (clone 9G7.1.16, produzido pela Genentech, diluído a 62,5 ng/ml) seguido por uma incubação de 30 min com estreptavidina-peroxidase de rábano (AS-HRP) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), diluído 1/10000 em diluente de ensaio. Após a lavagem final, tetrametil benzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) foi adicionada, e a

145/149 cor foi deixado desenvolver a cor por 5 a 7 min. A reação foi interrompida pela adição de 1 M de ácido fosfórico. A densidade óptica foi lida em de um leitor de microplacas (450 nm, 650 nm de referência), e as concentrações das amostras foram calculadas a partir de ajustes de quatro parâmetros da curva padrão. A concentração mínima mensurável de fator D no fluido vítreo humano e no lisado de amostras da membrana de Bruch foram de 780 pg/mL (1/50 da diluição mínima) e 156 pg/mL (1/10 da diluição mínima), respectivamente.

[0287] A fim de determinar os valores de IC50 θ ICgo para a inibição da via alternativa do complemento usando 0 Fab anti-fator D modificado 238 na presença de concentrações de fator D similares às concentrações de Fator D observadas no fluido vítreo e no tecidos da membrana de Bruch de olhos de pacientes com DMRI, 0 ensaio hemolítico foi realizado conforme descrito no Exemplo 2, com 10% de soro C1q depletado (9,7 nM de fator D) ou com 10% de soro C1q depletado suplementado com fator D adicional (Comptech) para alcançar concentrações de fator D que representam a concentração média (16,2 nM) ou a concentração média ± DP (26,5 nM) observada no fluido vítreo e nos tecidos da membrana de Bruch de olhos de pacientes com DMRI.

[0288] Os dados foram expressos como % de hemólise induzida na ausência do inibidor (Figura 12). As concentrações de Fab 238 anti-fator D causando 50% e 90% de inibição da reação hemolítica (valores de IC50 θ ICgo, respectivamente) foram determinadas para três experimentos repetidos por regressão não linear de curvas de inibição usando um modelo de ajuste de quatro parâmetros (KaleidaGraph Software, Synergy, Reading, PA). As razões molares de IC50 θ ICgo versus a concentração relativa de fator D também foram calculadas. Os valores médios de IC50 θ ICgo e as razões molares estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

146/149

ICso E ICgo para O Fab Anti-fator D

Concentração de Fator D (nM)	Fab Anti-fator D (238)
IC5Q	IC90
nM	Razão Molar (IC50/fD)	nM	Razão Molar (IC90/fD)
9,7 (nM)	4,4 ± 1,5	0,454	14,0 ±1,0	1,443
16,2(nM)	10,2 ± 0,8	0,630	38,0 ±11,0	2,346
26,5 (nM)	23,9 ± 5,0	0,902	72,6 ±4,8	2,740

Exemplo 5

Duração da Inibição da Via Alternativa De Ativação do Complemento [0289] Foi mensurado o tempo simulado de inibição da via alternativa (AP) de ativação do complemento em um olho humano usando uma único injeção intravítrea (IVT) de anti-fator D Fab 238 na dose de 2,5 mg (assumindo uma meia-vida (ti/₂) do anti-fator D Fab 238 de 11,5 dias, com base em escala interespécies do coelho) (Exemplo 13). Os dados simulados baseiam-se na expansão a partir de um estudo farmacocinético de dose única intravítrea de Fab 238 em coelhos brancos Nova Zelândia.

[0290] Para estimar a meia-vida do anti-fator D Fab 238 nos seres humanos, a meia-vida do anti-fator D 238 nos coelhos foi calculada. Foi administrado em doze (12) coelhos da raça Branco Nova Zelândia uma única dose de 1 mg de Fab 238 por via intravítrea em cada olho. O humor vítreo e as amostras de tecido da retina foram coletados de ambos os olhos de um número determinado de animais nos seguintes tempos, 3 animais em 4, 24 e 96 horas (n = 6 amostras em cada um desses instantes) e um animal em 216 horas (n = 2 amostras neste instante) e 2 animais em 240 horas (n = 4 amostras neste instante). As concentrações de Fab 238 nas matrizes oculares foram mensuradas em um ELISA de ligação para fator D.

147/149 [0291] Os dados de tempo-concentração do humor vítreo de todos os animais foram analisados para estimar parâmetros farmacocinéticos utilizando uma abordagem naive agrupado com o modelo de entrada por bolus

I.V. (modelo 201, WinNonlin Pro versão 5.2.1; Pharsight Corporation, Mountain View, CA) para fornecer uma meia-vida terminal estimada (Τ_Ί/₂) de 3,83 dias. O coeficiente de partição da retina foi calculado como a relação entre a concentração no tecido da retina pela média do humor vítreo para todos os olhos em todos os instantes, e foi igual a 0,24. Os parâmetros farmacocinéticos para o humor vítreo foram extrapolados para a saúde humana, utilizando os mesmos fatores de escala observados para o ranibizumab. Assume-se que olho humano possui um Vi de 4 mL, assume-se que a a razão da meia-vida do ser humano para o coelho seja de 3, produzindo uma estimativa de ti/₂ nos humanos de 11,5 dias. Isto produziu a estimativa para a concentração vítrea e as concentrações nos tecidos da retina em função do tempo como:

Concentração Vítrea = (Dose/Vi)*exp([-ln(2)/ti/₂]*tempo)

Concentração no tecido da retina = (Dose/Vi)* exp([ln(2)/ti/₂]*tempo) (coeficiente de partição da retina) [0292] Na Figura 13, o gráfico foi produzido para uma dose única ITV de 2,5 mg/olho, e representa o tempo a partir de t = 0 até t = 112 dias. A IC90 representa a concentração de Fab 238 que produz um efeito inibitório de 90% no ensaio de hemólise, conforme indicado nos Exemplos 2 e 4, em que 10% de pool de soro humano foi suplementado a uma concentração de Fator D de 16,2 nM. O resultado do ensaio foi um IC90 = 38 nM de Fab 238. Para comparar com as concentrações humor vítreo & retina, um molar para a massa de conversão foi feita utilizando a seguinte equação:

IC90 = 38 x 10-9 moles/L

MW de Fab 238 = 50.000 gramas/mole

IC90 (pg/mL) = (38 x 10'⁹ moles/L) x (50 x10³ gramas/mole) = 1,9 x

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10'⁹ gramas/L, ou 1,9 pg/mL.

[0293] Conforme exibido na Figura 13, os dias acima de IC90 foram estimados como a quantidade de tempo que era previsto que a concentração no humor vítreo ou na retina estaria acima de 1,9 pg/ml após uma única dose ITV de 2,5 mg/olho, e foi observado 0 ponto onde 0 gráfico de concentrações no humor vítreo ou na retina cruzavam a linha de 1,9 pg/mL Foi estimado que uma única injeção IVT de FAb 238 anti-fator D inibi a ativação pela AP do complemento no tecido da retina por pelo menos cerca de 74 dias e no humor vítreo por pelo menos cerca de 97 dias. A linha tracejada na Figura 13 mostra a simulação da concentração de Fab 238 anti-fator D no humor vítreo após a administração intravítrea. A linha sólida na Figura 13 mostra a simulação da concentração de Fab 238 anti-fator D no tecido da retina após a administração intravítrea. A diferença na concentração no humor vítreo e no tecido da retina é baseada em uma estimativa do coeficiente de partição do tecido da retina de 20%, ou seja, 20% do total da droga administrada no humor vítreo terá acesso ao tecido da retina.

[0294] Os técnicos hábeis no assunto irão reconhecer, ou serão capazes de verificar pelo uso de não mais do que a experimentação de rotina, que existem muitos equivalentes para os exemplos de realizações específicos da presente invenção. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações anexas.

[0295] Embora a presente invenção acima divulgada tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustrações e exemplos para fins de clareza de entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. A divulgação de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente são expressamente incorporadas em sua totalidade pela referência.

149/149 [0296] O relatório descritivo descrito acima é considerado como sendo suficiente para permitir que técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas construção depositadas, uma vez que as realizações depositadas são destinadas a uma única ilustração de certos aspectos da presente invenção e quaisquer construções que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (55)

1. Reivindicações

   1 ANTICORPO ANTI-FATOR D, caracterizado pelo fato de que compreende regiões hipervariáveis de cadeia leve (HVRs) de um anticorpo de referência, em que o dito anticorpo anti-fator D compreende ainda uma substituição em uma ou mais posições no dito anticorpo de referência, em que o dito anticorpo de referência compreende (1) uma cadeia leve variável que compreende HVR-1 compreendendo ITSTDIDDDMN (SEQ ID No: 30), HVR-2 compreendendo GGNTLRP (SEQ ID No: 35) e HVR-3 compreendendo LQSDSLPYT (SEQ ID No: 38) e/ou (2) uma cadeia pesada variável que compreende HVR-1 compreendendo GYTFTNYGMN (SEQ ID No: 39), HVR-2 compreendendo WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID No: 40) e HVR-3 compreendendo EGGVNN (SEQ ID No: 41), e em que a dita substituição é uma ou mais das seguintes:

   (a) aminoácido na posição 33 da cadeia leve é L ou I;

   (b) aminoácido na posição 34 da cadeia leve é A ou Q;

   (c) aminoácido na posição 52 da cadeia leve é S ou A;

   (d) aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V;

   (e) aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E;

   (f) aminoácido na posição 99 da cadeia pesada é A ou Q; ou (g) aminoácido na posição 100 da cadeia pesada é A ou Q;
2. 2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substituição é aminoácido na posição 1 da cadeia pesada é E, e/ou o aminoácido na posição 104 da cadeia leve é V.
3. 3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada variável do anticorpo de referência compreende uma, duas, três ou quatro regiões estruturais (framework) (FR), e/ou em que a cadeia leve variável do anticorpo de referência compreende uma, duas, três ou quatro FRs.

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4. 4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve variável do anticorpo de referência compreende uma FR4 que compreende aminoácidos 98-107 da SEQ ID No: 1, e/ou em que a cadeia pesada variável do anticorpo de referência compreende uma FR1 que compreende aminoácidos 1-25 da SEQ ID No: 2.
5. 5. ANTICORPO ANTI-FATOR D, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir do grupo que compreende:

   (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 39;

   (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 40;

   (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 41, SEQ ID No: 42, SEQ ID No: 43, SEQ ID No: 44 e SEQ ID No: 45;

   (iv) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 30, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33 e SEQ ID No: 34;

   (v) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 35, SEQ ID No: 36 e SEQ ID No: 37; e (vi) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 38; ou (b) pelo menos uma HVR variante, onde a HVR variante compreende modificação de pelo menos um resíduo da sequência exibida na SEQ ID No: 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38.
6. 6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5,

   3/11 caracterizado pelo fato de que compreende (1) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 39, uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 40, e uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 41, e/ou (2) uma HVRL1 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 30, uma HVRL2 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 35, e uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 38.
7. 7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 19, e/ou um domínio variável de cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID No: 6 ou SEQ ID No: 7.
8. 8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende (1) um domínio variável de cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 18 e um domínio variável de cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 6, ou (2) um domínio variável de cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 19 e um domínio variável de cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 7.
9. 9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir da SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQ

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   ID No: 25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28 e SEQ ID No: 29, e/ou um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir da SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16 eSEQ ID No: 17.
10. 10. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte sequência de aminoácidos: XiVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMG WINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGV X2X3WGQGTLVTVSS (SEQ ID No: 74), em que X1 é Q ou E; X₂ é N, A ou Q; e X3 é N, A ou Q.
11. 11. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte sequência de aminoácidos: DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6 TLRPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7 EIK (SEQ ID No: 73), em que X₄é M, L ou I; X₅ é N, A ou Q; X₆ é N, S ou A; e X₇ é L ou V.
12. 12. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que compreende a SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24, SEQ ID No: 25, SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28 e SEQ ID No: 29 ou uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que compreende a SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16 e SEQ ID No: 17.
13. 13. ANTICORPO ANTI-FATOR D, caracterizado pelo fato de que compreende 0 polipeptídeo conforme definido na reivindicação 10 e/ou 11.

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14. 14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID No: 18 ou da SEQ ID No: 19.
15. 15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o anticorpo que compreende uma sequência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID No: 6 ou da SEQ ID No: 7.
16. 16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID No: 18 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID No: 6.
17. 17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID No: 19 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID No: 7.
18. 18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 54 ou da SEQ ID No: 63, e/ou uma cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 47 ou da SEQ ID No: 61.
19. 19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (1) uma cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 54 e uma cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 47, ou (2) uma cadeia pesada possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 63 e uma cadeia leve possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma

    6/11 sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 61.
20. 20. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID No: 54 ou da SEQ ID No: 63.
21. 21. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve da SEQ ID No: 47 ou da SEQ ID No: 61.
22. 22. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID No: 54 e uma sequência de cadeia leve da SEQ ID No: 47.
23. 23. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID No: 63 e uma sequência de cadeia leve da SEQ ID No: 61.
24. 24. POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que compreende os aminoácidos selecionados a partir do grupo que compreende as SEQ ID Nos: 47 e 61 ou os aminoácidos selecionados a partir do grupo que compreende as SEQ ID Nos: 54 e 63.
25. 25. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9 e 13 a 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2.
26. 26. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, 13 a 23 e 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
27. 27. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a

    9, 13 a 23 e 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.

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28. 28. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, 13 a 23 e 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o fator D é um fator D de mamíferos, tal como fator D humano.
29. 29. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 9, 13 a 23 e 25 a 28, ou um polipeptídeo conforme definido em uma das reivindicações 10 a 12 e 24.
30. 30. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 29.
31. 31. MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor conforme definido na reivindicação 30, em que o micro-organismo transgênico é opcionalmente uma célula procariótica, tal como bactéria.
32. 32. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTIFATOR D, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) o cultivo do micro-organismo transgênico conforme definido na reivindicação 31 sob condições adequadas para a expressão do polinucleotídeo que codifica o anticorpo, e (b) o isolamento do anticorpo.
33. 33. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) o cultivo do microorganismo transgênico conforme definido na reivindicação 31 sob condições adequadas para a expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, e (b) o isolamento do polipeptídeo.
34. 34. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-fator D conforme definido em uma das reivindicações 1 a 9, 13 a 23 e 25 a 28, ou o polipeptídeo conforme definido em uma das reivindicações 10 a 12 e 24, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

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35. 35. ARTIGO DE MANUFATURA, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) a formulação farmacêutica conforme definida na reivindicação 34;

    (b) um recipiente; e (c) uma bula ou rótulo indicando que o composto pode ser usado para tratar um distúrbio associado ao complemento.
36. 36. KIT, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 9, 13 a 23 e 25 a 28, ou o polipeptídio conforme definido em uma das reivindicações 10 a 12 e 24 e instruções para a administração do dito anticorpo ou polipeptídeo para tratar um distúrbio associado ao complemento.
37. 37. USO DO ANTICORPO conforme definido em uma das reivindicações 1 a 9, 13 a 23 e 25 a 28, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio associado ao complemento.
38. 38. USO DO POLIPEPTÍDEO conforme definido em uma das reivindicações 10 a 12 e 24, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar um distúrbio associado ao complemento.
39. 39. ARTIGO DE MANUFATURA, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio inflamatório ou uma doença ocular.
40. 40. ARTIGO DE MANUFATURA, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é uma doença autoimune.
41. 41. ARTIGO DE MANUFATURA, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que compreende lúpus eritematoso sistêmico,

    9/11 miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla.
42. 42. ARTIGO DE MANUFATURA, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que compreende degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética, neovascularização coroidal (NVC), uveíte, edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão da veia central da retina (OVCR), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.
43. 43. ARTIGO DE MANUFATURA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular relacionada à idade é selecionada a partir do grupo que compreende a DMRI seca intermediária, atrofia geográfica e atrofia geográfica.
44. 44. KIT, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio inflamatório ou uma doença ocular.
45. 45. KIT, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é uma doença autoimune.
46. 46. KIT, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que compreende lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla.
47. 47. KIT, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que compreende degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética, neovascularização coroidal (NVC), uveíte, edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão da veia central da retina (OVCR), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.

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48. 48. KIT, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular relacionada à idade é selecionada a partir do grupo que compreende DMRI seca intermediária, atrofia geográfica e atrofia geográfica.
49. 49. USO, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio inflamatório ou uma doença ocular.
50. 50. USO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é uma doença autoimune.
51. 51. USO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que compreende lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla.
52. 52. USO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que compreende degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética, neovascularização coroidal (NVC), uveíte, edema macular diabético, miopia patológica, doença de Von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, oclusão da veia central da retina (OVCR), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.
53. 53. USO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular relacionada à idade é selecionada a partir do grupo que compreende a DMRI seca intermediária, atrofia geográfica e atrofia geográfica.
54. 54 ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de:

    (a) cultivo do micro-organismo transgênico conforme definido na reivindicação 31, e

    11/11 (b) o isolamento do anticorpo a partir das ditas células cultivadas.
55. 55 POLIPEPTÍDEO, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de:

    (a) cultivo do micro-organismo transgênico conforme definido na reivindicação 31, e (b) o isolamento do polipeptídeo a partir das ditas células cultivadas.