[go: up one dir, main page]

WO2025208782A1 - Cfd-binding antibody fragments and uses thereof - Google Patents

Cfd-binding antibody fragments and uses thereof

Info

Publication number
WO2025208782A1
WO2025208782A1 PCT/CN2024/114591 CN2024114591W WO2025208782A1 WO 2025208782 A1 WO2025208782 A1 WO 2025208782A1 CN 2024114591 W CN2024114591 W CN 2024114591W WO 2025208782 A1 WO2025208782 A1 WO 2025208782A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
binding protein
antigen binding
protein
cdr1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/CN2024/114591
Other languages
French (fr)
Inventor
Mengfan PENG
Zhaozhong Han
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Linno Hangzhou Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Linno Hangzhou Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Linno Hangzhou Pharmaceuticals Inc filed Critical Linno Hangzhou Pharmaceuticals Inc
Publication of WO2025208782A1 publication Critical patent/WO2025208782A1/en
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Definitions

  • the present application relates to the field of biomedicine, and in particularly relates to some isolated antigen binding proteins specifically binding to factor D, and its applications thereof.
  • the complement system as a vital part of innate and adaptive immunity, has an important role in the clearance of pathogens; however, unregulated activation of this system probably has a key role in the pathogenesis of eye diseases and periodontal diseases, cancer, autoimmune diseases, CNS/PNS diseases, kidney diseases and chronic hemolytic diseases.
  • AMD age-related macular degeneration
  • AD Alzheimer's disease
  • gMG myasthenia gravis
  • aHUS atypical hemolytic uremic syndrome
  • IgA nephropathy IgAN
  • PNH paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
  • TMAs thrombotic microangiopathy
  • Factor D is produced by adipocytes and secreted into circulation. Once MASP-3 has cleaved off the pro-peptide and converted factor D into its mature form, factor D is ready to perform its essential function in both the initiation phase and the amplification phase of the alternative complement pathway.
  • factor D cleavage of C3-bound factor B is responsible for generation of the C3 (H 2 O) Bb convertase, which splits C3 into C3b and the pro-inflammatory signaling anaphylatoxin C3a.
  • factor D cleavage of C3b-bound factor B in the amplification loop is responsible for generation of the predominant C3 convertase C3bBb, which amplifies the signal and creates additional C3b and C3a molecules.
  • the present application provides an isolated antigen binding protein, comprising at least one CDR in a heavy-chain variable region VH; the VH comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
  • said isolated antigen binding protein may comprise CDR3, said CDR3 may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15 ⁇ SEQ ID NO: 16 ⁇ SEQ ID NO: 17 ⁇ SEQ ID NO: 18 ⁇ SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • said isolated antigen binding protein may comprise CDR2, said CDR2 may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9 ⁇ SEQ ID NO: 10 ⁇ SEQ ID NO: 11 ⁇ SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14.
  • said isolated antigen binding protein may comprise CDR1, said CDR1 may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3 ⁇ SEQ ID NO: 4 ⁇ SEQ ID NO: 5 ⁇ SEQ ID NO: 6 ⁇ SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • said isolated antigen binding protein may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3 ⁇ SEQ ID NO: 4 ⁇ SEQ ID NO: 5 ⁇ SEQ ID NO: 6 ⁇ SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, said CDR2 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9 ⁇ SEQ ID NO: 10 ⁇ SEQ ID NO: 11 ⁇ SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14, and said CDR3 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15 ⁇ SEQ ID NO: 16 ⁇ SEQ ID NO: 17 ⁇ SEQ ID NO: 18 ⁇ SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • said isolated antigen binding protein may comprise FR1, wherein the C-terminus of said FR1 is linked directly or indirectly to the N-terminus of said CDR1.
  • said isolated antigen binding protein may comprise FR4, wherein the N-terminus of said FR4 is linked directly or indirectly to the C-terminus of said CDR3.
  • said isolated antigen binding protein comprises FR1, FR2, FR3 and FR4, and said isolated antigen binding protein comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
  • FR1 SEQ ID NO: 21, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 37, FR4: SEQ ID NO: 50;
  • FR1 SEQ ID NO: 23
  • FR2 SEQ ID NO: 31
  • FR3 SEQ ID NO: 41
  • FR4 SEQ ID NO: 52;
  • FR1 SEQ ID NO: 25
  • FR2 SEQ ID NO: 33
  • FR3 SEQ ID NO: 44
  • FR4 SEQ ID NO: 53;
  • FR1 SEQ ID NO: 27, FR2: SEQ ID NO: 34, FR3: SEQ ID NO: 47, FR4: SEQ ID NO: 54;
  • FR1 SEQ ID NO: 28
  • FR2 SEQ ID NO: 35
  • FR3 SEQ ID NO: 48
  • FR4 SEQ ID NO: 55;
  • FR1 SEQ ID NO: 29, FR2: SEQ ID NO: 36, FR3: SEQ ID NO: 49, FR4: SEQ ID NO: 55;
  • FR1 SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 38, FR4: SEQ ID NO: 51;
  • FR1 SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 39, FR4: SEQ ID NO: 51;
  • FR1 SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 40, FR4: SEQ ID NO: 51;
  • FR1 SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
  • FR1 SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
  • FR1 SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
  • said linker of said isolated antigen binding protein may be a poly-glycine linker.
  • CDR1 SEQ ID NO: 6
  • CDR2 SEQ ID NO: 12
  • CDR3 SEQ ID NO: 18;
  • CDR1 SEQ ID NO: 6
  • CDR2 SEQ ID NO: 12
  • CDR3 SEQ ID NO: 18;
  • CDR1 SEQ ID NO: 7
  • CDR2 SEQ ID NO: 13
  • CDR3 SEQ ID NO: 19
  • CDR1 SEQ ID NO: 8
  • CDR2 SEQ ID NO: 14
  • CDR3 SEQ ID NO: 20.
  • said first antigen-binding domain may be indirectly linked to the second antigen-binding domain by a linker.
  • said linker of said bi-paratopic antigen-binding protein may be a poly-glycine linker.
  • said linker of said bi-paratopic antigen-binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  • the present application provides a fusion protein, comprising said isolated antigen binding protein or said bi-paratopic antigen-binding protein.
  • said isolated antigen binding protein may be directly or indirectly linked to said functionally active protein.
  • said isolated antigen binding protein may be linked to said functionally active protein by a linker.
  • said isolated antigen binding protein may be linked to said functionally active protein by more than one linker.
  • said linker of said isolated antigen binding protein and said functionally active protein may be a poly-glycine linker.
  • said linker of said isolated antigen binding protein and said functionally active protein may be more than one poly-glycine linker.
  • said linker of said isolated antigen binding protein and said functionally active protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  • said functionally active protein of said fusion protein may be a factor H protein.
  • said factor H of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 88.
  • said functionally active protein of said fusion protein may be transferrin binding protein.
  • said transferrin binding protein of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 89.
  • said transferrin inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
  • the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
  • said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 85.
  • said functionally active protein of said fusion protein may be VEGF inhibiting protein.
  • said VEGF inhibiting protein. of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 90.
  • said VEGF inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
  • the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
  • said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87.
  • the present application provides a detection kit for factor D, comprising said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
  • the present application provides a method of inhibiting alternative complement pathway, comprising administering an effective amount of said pharmaceutical combination and/or a pharmaceutically acceptable therapeutic agent.
  • said diseases may be mediated by alternative pathway.
  • said diseases may include autoimmune thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) , hemolytic uremic syndrome (HUS) , atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , C3 glomerulopathy (C3G) , asthma, Gaucher disease, Hidradentitis suppurativa, Behcet's disease, dermatomyositis, severe burn, early sepsis, pneumococcal meningitis, Alzheimer's disease, cancer metastasis, acute respiratory distress syndrome (ARDS) , acute lung injury (ACI) , transfusion-related lung injury (TRALI) , hemodialysis induced thrombosis, epidermolysis bullosa acquisita (EBA) , uveitis, Parkinson's disease, primary biliary atresia, antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) vasculitis
  • TTP
  • FIG. 2 Production of the recombinant VHH-Fc analysis on non-reducing and reducing SDS-PAGE.
  • FIG. 3 ELISA binding of the recombinant VHH-Fc to human (A) , mouse (B) or cynomolgus CFD(C) .
  • FIG. 10 Binding of the humanized VHH’s to human CFD.
  • said isolated antigen binding protein may comprise an antibody or an antigen binding fragment thereof.
  • said isolated antigen binding protein may comprise Fab, Fab’, F (ab) 2, Fv fragments, F (ab') 2, scFv, di-scFv, VHH and/or dAb.
  • said isolated antigen binding protein may be selected from the group consisting of: monoclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  • the present application provides a bi-paratopic antigen-binding protein that may comprise a first antigen-binding domain binding to factor D and a second antigen-binding domain binding to factor D.
  • said first antigen-binding domain may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
  • CDR1 SEQ ID NO: 4
  • CDR2 SEQ ID NO: 10
  • CDR3 SEQ ID NO: 16;
  • CDR1 SEQ ID NO: 5
  • CDR2 SEQ ID NO: 11
  • CDR3 SEQ ID NO: 17;
  • CDR1 SEQ ID NO: 8
  • CDR2 SEQ ID NO: 14
  • CDR3 SEQ ID NO: 20.
  • said second antigen-binding domain may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
  • CDR1 SEQ ID NO: 3
  • CDR2 SEQ ID NO: 9
  • CDR3 SEQ ID NO: 15;
  • CDR1 SEQ ID NO: 4
  • CDR2 SEQ ID NO: 10
  • CDR3 SEQ ID NO: 16;
  • CDR1 SEQ ID NO: 5
  • CDR2 SEQ ID NO: 11
  • CDR3 SEQ ID NO: 17;
  • CDR1 SEQ ID NO: 6
  • CDR2 SEQ ID NO: 12
  • CDR3 SEQ ID NO: 18;
  • CDR1 SEQ ID NO: 7
  • CDR2 SEQ ID NO: 13
  • CDR3 SEQ ID NO: 19
  • said first antigen-binding domain may be directly or indirectly linked to the second antigen-binding domain.
  • said first antigen-binding domain may be indirectly linked to the second antigen-binding domain by a linker.
  • said linker may be a poly-glycine linker.
  • said linker may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  • said bi-paratopic antigen-binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
  • said isolated antigen binding protein may comprise a heavy-chain constant region.
  • the Fc region of said bi-paratopic antigen-binding protein may be a human Fc region.
  • said human Fc region may be modified to achieve the desired property (e.g., an amino acid mutation) .
  • said human Fc region may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92.
  • the present application provides a fusion protein that may comprise the isolated antigen binding protein or the bi-paratopic antigen-binding protein of the present application.
  • said fusion protein may comprise a functionally active protein.
  • said functionally active protein of said fusion protein may be directly or indirectly linked to said isolated antigen binding protein.
  • said functionally active protein may be linked by its N-terminus or C-terminus to the N-terminus or C-terminus of said isolated antigen binding protein.
  • said functionally active protein may be linked by its N-terminus or C-terminus to the N-terminus or C-terminus of said isolated antigen binding protein with a linker.
  • said linker may be a simple covalent bond (e.g., a peptide bond) , a synthetic polymer (e.g., a polyethylene glycol (PEG) polymer) , or any kind of bond created from a chemical reaction.
  • said linker may be a poly-glycine linker.
  • said linker may comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  • said functionally active protein may be a factor H inhibiting protein.
  • said factor H may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 88.
  • said factor H of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
  • the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
  • said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 84.
  • said functionally active protein of said fusion protein may be transferrin binding protein.
  • said transferrin binding protein of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 89.
  • said transferrin inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
  • the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
  • said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 85.
  • said functionally active protein of said fusion protein may be VEGF inhibiting protein.
  • said VEGF inhibiting protein. of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 90.
  • said VEGF inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
  • the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
  • the cultures were centrifuged at 4,000 g for 20 min, and the supernatants were added to 20% (w/v) polyethylene glycol 6000/2.5M NaCl (PEG/NaCl) to precipitate the phages.
  • the samples were incubated on ice overnight and then centrifuged for 20 min at 8,000 g at 4 °C.
  • the pellets were resuspended in PBS, PEG precipitation was repeated once as described above.
  • the final phage pellets were resuspended in 1 ml of PBS, and 10 12 phages were used in subsequent rounds of panning.
  • the general panning procedure was repeated for another three rounds.
  • the variation was the antigens derived from different species to have cross-reactive and affinity matched phage clones. Panning summary was listed in Table1.
  • phage-based ELISA screening individual bacterial colonies were picked and inoculated into 200 ⁇ l 2 ⁇ YT-GA medium, cultured at 37 °C with shaking (250 rpm) for 4 ⁇ 5 h. Then 10 ⁇ l of culture was transferred into a new deep 96-well plate containing 200 ⁇ l of 2 ⁇ YT-GA medium and incubated as above till OD600 reached around 0.6. VHH expression was induced with 1 mM IPTG (Sangon Biotech) for 16 h at 30 °C with shaking (250 rpm) . After the overnight culture was spun at 4,000 rpm at 4°C for 30 min, the supernatants were collected for phage ELISA.
  • ELISA-positive clones were defined as those that exhibited at least three times stronger ELISA signals on antigen coated plates in comparison to signals on BSA-coated plates.
  • the genetic diversity of the ELISA positive clones was determined using DNA sequencing, and phages with different amino acid sequences of VHH were considered as unique clones. In total, 48 unique clones with different CDR sequences were identified as positive in target-binding assays with phage ELISA and 30 selected expression and purification in HEK293 cells.
  • VHH clones were selected for subcloning to create recombinant plasmids to produce VHH-FC proteins, degenerated primers.
  • Forward primer SEQ ID NO: 1
  • Reverse primer SEQ ID NO: 2 : AATCCAGAGGTTGATTGTCGACGTACGCTATGAGGAGACRGTGACC
  • Expi293F TM Cells in OPM-CD05 Medium 100 ml of Expi293F TM Cells in OPM-CD05 Medium (OPM, cat#81075-001) were cultured to reach a cell density of approximately 3 ⁇ 10 6 viable cells/ml with viability more than 95%. Plasmids were diluted with OPM-CD05 Medium to a concentration of 1.5 ⁇ g/ml in a total volume of 5 ml. Transfection reagent PEI was diluted with OPM-CD05 Medium to a same volume of 5 ml to have a DNA: PEI ratio as 1: 4 (m/m) when the diluted DNA and PEI were mixed.
  • the DNA/PEI complex were added onto the prepared Expi293F TM cells by swirling gently. Then the cells cultures were placed in a 37 °Cincubator with ⁇ 80%relative humidity and 5%CO 2 on an orbital shake. At 24 h post the transfection, 5%peptone (1 mg/ml) and 2%glucose (330 g/l) were added to the culture slowly. After days of culturing, the cell culture supernatant was collected by sequential centrifugations at 1, 200 rpm for 10 min and 3, 900 rpm for 20 min before being used for Protein A purification.
  • VHH-Fcs were purified with Protein A (BIOON, HZ1011-2) .
  • 1 ml of Protein A slurry were loaded onto a 20-ml column (G-bios, C006197-0025) .
  • the cell culture supernatant prepared as above were loaded and flow throw the Protein-Acolumns by gravity for 2 times.
  • 10 ml of 0.1 M Glycine-HCl buffer (pH3.0) were used to elute the VHH-Fc proteins.
  • the eluted proteins were neutralized with 100 ⁇ l of 1 M (pH 8.5) Tris-HCL buffer the pH was adjusted to 7.4.
  • the Protein A affinity column was regenerated and preserved by washing with PBS, ddH 2 O and 20%ethanol sequentially.
  • For the eluted protein it was desalted through an Amicon UltraCel 30K centrifugal device (Milipore, UFC903016) . Briefly, eluted protein was diluted in 10 ml PBS and concentrated to 1.5 ml by centrifugation for 3 times at least. The final protein solution was formulated in PBS to less than 1 ml and filtrated with 0.22- ⁇ m filters.
  • VHH-Fcs Purity of VHH-Fcs were analyzed with SDS-PAGE. Briefly, 2 ⁇ g protein in 4 ⁇ LDS Sample buffer was loaded and analyzed with SurePAGE gel in Tris-MOPS SDS buffer (Genscript, M00138) at a constant voltage of 160-V for 50 min. Proteins were visualized with Coomassie stain (TIANGEN, cat#PA101) following the manufacturer’s instructions. The purified proteins were analyzed with 4-12%gradient SDS-PAGE gel under non-reducing or reducing conditions (FIG. 2) .
  • 96-well immunoplates were coated with 100 ⁇ l/well 1 ⁇ g/ml streptavidin and incubate at 4 °C overnight.
  • Wells were washed with PBST for 3 times and blocked with 200 ⁇ l of 1%BSA/PBS at RT for 1 h. Washed with PBST for 3 times and add human CFD-biotin, and mouse CFD-biotin (1 ⁇ g/ml) 100 ⁇ l/well and incubated at RT for 1 h. Plates were washed with PBST for 3 times, 100 ⁇ l/well 5-fold serially diluted VHH-Fcs from 10 ⁇ g/ml was added. and incubate at RT for 1 h.
  • rabbit erythrocytes (4 ⁇ 10 8 /ml) were washed three times with 1 ml of 1 ⁇ AP buffer and resuspended to a final concentration of 5 ⁇ 10 7 /ml (6 ml) in 1 ⁇ AP buffer. After that, 50 ⁇ l aliquots of rabbit erythrocytes (2.5 ⁇ 10 6 cells) were added to the plate as described above, mixed well, and incubated at 37 °C for 30 min.
  • Each plate contained two wells of 50 ⁇ l of identically prepared rabbit erythrocytes, incubated with 50 ⁇ l PBS +50 ⁇ l 1 ⁇ AP buffer alone as a control for spontaneous hemolysis, two wells containing 100 ⁇ l ddH 2 O serving as a control for 100%lysis, two wells containing 100 ⁇ l 10%serum serving as a control for 100%serum lysis, two wells containing 10 mM EDTA (Thermo 15575-038) as a serum blank control. After incubating, the plate was then centrifuged at 600 rpm for 2 min and 100 ⁇ l of the supernatant transferred to a new flat bottom 96-well plate.
  • mouse alternative pathway assay For mouse alternative pathway experiments, the process is basically the same as the above process, the difference is that the final concentration of mouse serum is 30%and that of human serum is 10%, and the incubation time is replaced by 30 min for 1 h in mouse alternative pathway assay (FIG. 4) .
  • Some clones showed complement inhibitory activity in human (FIG. 4A) and mouse (FIG. 4B) serum at 500 nM.
  • Hemolysis (%) 100 ⁇ (OD sample -OD EDTA blank) / (OD 100%lysis -OD EDTA blank)
  • Eculizumab (Targetmol, T9915)
  • a recombinant humanized monoclonal antibody against the complement protein C5 was as a control also showed inhibitory ability in the CP pathway, with IC50 of 57 nM.
  • lectin pathway assay 0.3 ml aliquots of mannan solution (0.5 mg/ml) were mixed with an equal volume of CrCl3 solution (0.5 mg/ml) (Sigma 27096-100G-F, Lot#BCCB5331) , an equal volume of the chicken erythrocyte suspension (1 ⁇ l0 9 cells) was added, and the mixture was incubated with occasional mixing for 15 min at 25 °C. Then wash with 1.0 ml of ice-cold GVBS2+.
  • the erythrocytes coated with mannan (ME) (sigma M7604-100MG, Lot#SLOF4977) were washed three times by centrifugation with GVBS2+ (gelatin-Veronal-buffered saline, 5 mM Verona1 buffer, pH 7.4, containing 0.145 M NaC1, 0.1%gelatin, 0.15 M CaCl2 and 0.5 mM MgCl2) (Comp Tech, B100) , resuspended to a final concentration of 5 ⁇ l07 cells/ml in GVBS2+ and store on ice.
  • GVBS2+ gelatin-Veronal-buffered saline, 5 mM Verona1 buffer, pH 7.4, containing 0.145 M NaC1, 0.1%gelatin, 0.15 M CaCl2 and 0.5 mM MgCl2
  • Comp Tech, B100 Comp Tech, B100
  • test samples were serially diluted 1: 3 (from 500 nM to 0.2 nM) in PBS and added in duplicate (50 ⁇ l/well) to a U-bottom 96-well microtiter plate.
  • Human complement-preserved serum was diluted to 20%vol/vol with GVBS2+ and added (50 ⁇ l/well) to the rows of the same 96-well plate, such that the final concentration of human serum in each well was 10%.
  • 100 ⁇ l ddH 2 O or serum only and 50 ⁇ l PBS + 50 ⁇ l GVBS2+ was used as 100%lysis and 0%controls, respectively, 10 mM EDTA was used as serum blank.
  • VHHs from different bins were combined with G4S linker to make bi-paratopic VHH-VHH-Fc fusion proteins as listed in Table 3.
  • Plasmid construction and protein purification procedures can refer to the above. SDS-PAGE analysis and characterization result showed in FIG. 9.
  • VHH humanization was conducted by standard procedures of CDR grafting and structural refinement. Upon the humanization design, recombinant DNA constructs were created to produce recombinant constructs as described above. The humanized sequences with an affinity equal to or better than that of the original VHH to CFD having acceptable expression and stability levels were selected for further development.
  • FIG. 10 indicated that the humanized VHH variant SLN9140 possess similar profile as the parental VHH regarding its binding to human CFD (FIG. 10A) .
  • VHH variant SLN9145 possess similar profile as the parental VHH regarding its binding to human CFD (FIG. 10B) .
  • VHH variant SLN9147 possess similar profile as the parental VHH regarding its binding to human CFD (FIG. 10C) .
  • Target-binding ELISA shown in FIG. 13 indicated that such humanized bi-paratopic VHHs had negligible effect on the single VHH by human CFD binding (FIG. 13A) assay and cynomolgus CFD binding assay (FIG. 13B) .
  • Alternative pathway activity indicated that the SLN7197 and SLN7198 AP activity of bi-paratopic was better than that of single VHH (FIG. 13C) .
  • Truncated CFH (domain 1-4, 19-20) was fused to the C-terminus of SLN9180 to form SLN7180 (SEQ ID NO: 80) and SLN7177 (SEQ ID NO: 77) with his tag and FC tag respectively to make a dual functional recombinant protein inhibiting complement activation.
  • SDS-PAGE analysis and characterization result showed in FIG. 14.
  • 96-well microplates were coated with streptavidin (1 ⁇ g/ml in PBS, 100 ⁇ l/well) and incubated at 4°C overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 hr. After 3 times of washing with PBST, biotinylated mouse CFD (1 ⁇ g/ml in 1%BSA, 100 ⁇ l/well) was added and incubate at RT for 1 h.
  • the recombinant antibodies (50nM, 5xdilution, serially diluted in 1%BSA) were premixed with biotinylated human transferrin (2 ⁇ g/ml in 1%BSA) , added the mixture (100 ⁇ l/well) into the plates and incubated at RT for 1h. Then, the secondary anti-6xhis-HRP were incubated sequentially, before the plates were washed with PBST 3 times and incubated with substrate solution and stop solution as described above for ELISA. Data were showed transferrin binding activity (FIG. 18A) , SLN12089 has negligible Tf binding activity compared to the control 9056 VHH.
  • mice CFD 96-well microplates were coated with streptavidin (1 ⁇ g/ml in PBS, 100 ⁇ l/well) and incubated at 4°C overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 hr. After 3 times of washing with PBST, biotinylated mouse CFD (1 ⁇ g/ml in 1%BSA, 100 ⁇ l/well) was added and incubate at RT for 1 h.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Provided is an isolated antigen binding protein which can bind to complement factor D，a preparation method and an application thereof.

Description

CFD-binding antibody fragments and uses thereof
FIELD OF THE INTVENTION
The present application relates to the field of biomedicine, and in particularly relates to some isolated antigen binding proteins specifically binding to factor D, and its applications thereof.
BACKGROUND OF THE INVENTION
The complement system, as a vital part of innate and adaptive immunity, has an important role in the clearance of pathogens; however, unregulated activation of this system probably has a key role in the pathogenesis of eye diseases and periodontal diseases, cancer, autoimmune diseases, CNS/PNS diseases, kidney diseases and chronic hemolytic diseases. Such as age-related macular degeneration (AMD) , Alzheimer's disease (AD) , myasthenia gravis (gMG) ; atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , IgA nephropathy (IgAN) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and thrombotic microangiopathy (TMAs) .
Factor D is produced by adipocytes and secreted into circulation. Once MASP-3 has cleaved off the pro-peptide and converted factor D into its mature form, factor D is ready to perform its essential function in both the initiation phase and the amplification phase of the alternative complement pathway. First, factor D cleavage of C3-bound factor B is responsible for generation of the C3 (H2O) Bb convertase, which splits C3 into C3b and the pro-inflammatory signaling anaphylatoxin C3a. Second, factor D cleavage of C3b-bound factor B in the amplification loop is responsible for generation of the predominant C3 convertase C3bBb, which amplifies the signal and creates additional C3b and C3a molecules. The classical and lectin complement pathways converge at the amplification loop of the alternative pathway and as such their signals are also amplified by the action of factor D. Besides incorporation into C3 convertase complexes for signal amplification, C3b also functions to opsonize cells for phagocytosis and, via downstream reactions, initiates MAC formation and cell lysis. Inhibition of these activities on self-cell surfaces is controlled by a network of regulatory proteins. As factor D is the rate-limiting component of the alternative pathway, its concentration ultimately controls the activity and output of this pathway, including that of the amplification loop. This means that alternative pathway-mediated C3a production, opsonization, and cell lysis are all limited by factor D activity.
In the past ten years, drugs targeting complement have gradually received attention. By interfering with terminal pathway effector generation, the FDA approved the first complement-specific drug for C5, eculizumab (Soliris, Alexion Pharm) in 2007, for the treatment of rare disease PNH, and subsequently expanded the indication to aHUS. Inhibitors of factor D are classified as proximal complement inhibitors because they interfere with the early phases of complement activation. One inhibitor is ALXN2040, which, after showing positive results in preclinical studies for the treatment of PNH and aHUS, entered Phase I, II, and III studies. ALXN2040 as monotherapy was found to inhibit intravascular hemolysis and improve hemoglobin levels in previously untreated patients with PNH. Currently, a Phase III study (NCT04469465) examining the therapeutic value of  ALXN2040 as an add-on therapy to a C5 inhibitor is underway in patients with PNH who develop extravascular hemolysis. The other small-molecule factor D inhibitors like ALXN2050 and BCX9930 (NCT04330534) are currently being investigated in Phase II studies. One anti-factor D antibody called lampalizumab (FCFD4514S; Genentech/Roche) showed promising results in a Phase II clinical trial when administered by intravitreal injection to patients with GA secondary to age related macular degeneration, but it did not reduce GA enlargement in two Phase III randomized clinical trials.
Although inhibition or modulation of factor D is an important therapeutic strategy to mitigate symptoms and slow or prevent progression of disease associated with alternative pathway, there is no ideal factor D binding antibody protein. It’s urgent and crucial to construct factor D-binding antibody as a promising therapeutic strategy to block alternative pathway and treating related diseases.
SUMMARY OF THE INVENTION
The present disclosure provides an isolated antigen binding protein, which may have one or more of the following properties: 1) specifically binds to factor D, 2) inhibits alternative pathway by binding factor D, 3) inhibits interaction between factor D and C3, 4) selectively inhibits alternative pathway rather than classical pathway or lectin pathway, and 5) has species-crossing factor D-binding and complement-inhibitory activity in AP-specific pathways in mammal. The isolated antigen binding protein also shows serum stability both in plasma and formulation buffer. By multiple subcutaneous dosing said isolated antigen binding protein, factor D was depleted from serum and AP activity was inhibited consistently.
In one aspect, the present application provides an isolated antigen binding protein, comprising at least one CDR in a heavy-chain variable region VH; the VH comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may bind to specifically epitopes domain of factor D.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise CDR3, said CDR3 may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise CDR2, said CDR2 may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise CDR1, said CDR1 may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, said CDR2 comprises  an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14, and said CDR3 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise FR1, wherein the C-terminus of said FR1 is linked directly or indirectly to the N-terminus of said CDR1.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise FR2, wherein said FR2 is located between said CDR1 and said CDR.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise FR3, wherein said FR3 is located between said CDR2 and said CDR3.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise FR4, wherein the N-terminus of said FR4 is linked directly or indirectly to the C-terminus of said CDR3.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein comprises FR1, FR2, FR3 and FR4, and said isolated antigen binding protein comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
(1) FR1: SEQ ID NO: 21, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 37, FR4: SEQ ID NO: 50;
(2) FR1: SEQ ID NO: 23, FR2: SEQ ID NO: 31, FR3: SEQ ID NO: 41, FR4: SEQ ID NO: 52;
(3) FR1: SEQ ID NO: 25, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 44, FR4: SEQ ID NO: 53;
(4) FR1: SEQ ID NO: 27, FR2: SEQ ID NO: 34, FR3: SEQ ID NO: 47, FR4: SEQ ID NO: 54;
(5) FR1: SEQ ID NO: 28, FR2: SEQ ID NO: 35, FR3: SEQ ID NO: 48, FR4: SEQ ID NO: 55;
(6) FR1: SEQ ID NO: 29, FR2: SEQ ID NO: 36, FR3: SEQ ID NO: 49, FR4: SEQ ID NO: 55;
(7) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 38, FR4: SEQ ID NO: 51;
(8) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 39, FR4: SEQ ID NO: 51;
(9) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 40, FR4: SEQ ID NO: 51;
(10) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
(11) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
(12) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
(13) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
(14) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 31, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
(15) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
(16) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 45, FR4: SEQ ID NO: 52;
(17) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 46, FR4: SEQ ID NO: 52;
(18) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 45, FR4: SEQ ID NO: 52; and
(19) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 46, FR4: SEQ ID NO: 52.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein comprises a heavy chain variable region VH, which comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
In some embodiments, said heavy chain variable region is VHH.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise an antibody heavy-chain constant region.
In some embodiments, said heavy-chain constant region may comprise a human Fc region.
In some embodiments, said heavy-chain constant region may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may be directly or indirectly linked to a second antigen binding domain.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may be linked to a second antigen binding domain by a linker.
In some embodiments, said linker of said isolated antigen binding protein may be a poly-glycine linker.
In some embodiments, said linker of said isolated antigen binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
In some embodiments, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to factor D.
In some embodiments, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to different epitopes of factor D from said isolated antigen binding protein.
In some embodiments, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to the same epitopes of factor D with the isolated antigen binding protein.
In some embodiments, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in of any one of SEQ ID NO: 56-74.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may comprise an antibody or an antigen binding fragments thereof.
In some embodiments, said isolated antigen binding fragment may comprise Fab, Fab’, F (ab) 2, Fv fragments, F (ab') 2, scFv, di-scFv, VHH and/or dAb.
In some embodiments, said antibody may be selected from the group consisting of: monoclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
In some embodiments, said antibody may be a camelid antibody.
In another aspect, the present application provides a bi-paratopic antigen-binding protein comprising a first antigen-binding domain binding to factor D and a second antigen-binding domain binding to factor D.
In some embodiments, said first antigen-binding domain may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
(1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
(2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
(3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
(4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
(5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
(6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
In some embodiments, said second antigen-binding domain may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
(1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
(2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
(3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
(4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
(5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
(6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
In some embodiments, said first antigen-binding domain may be directly or indirectly linked to the second antigen-binding domain.
In some embodiments, said first antigen-binding domain may be indirectly linked to the second antigen-binding domain by a linker.
In some embodiments, said linker of said bi-paratopic antigen-binding protein may be a poly-glycine linker.
In some embodiments, said linker of said bi-paratopic antigen-binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
In some embodiments, said bi-paratopic antigen-binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
In another aspect, the present application provides a fusion protein, comprising said isolated antigen binding protein or said bi-paratopic antigen-binding protein.
In some embodiments, said fusion protein may comprise a functionally active protein.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may be directly or indirectly linked to said functionally active protein.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may be linked to said functionally active protein by a linker.
In some embodiments, said isolated antigen binding protein may be linked to said functionally active protein by more than one linker.
In some embodiments, said linker of said isolated antigen binding protein and said functionally active protein may be a poly-glycine linker.
In some embodiments, said linker of said isolated antigen binding protein and said functionally active protein may be more than one poly-glycine linker.
In some embodiments, said linker of said isolated antigen binding protein and said functionally active protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
In some embodiments, said functionally active protein of said fusion protein may be a factor H protein.
In some embodiments, said factor H of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 88.
In some embodiments, said factor H of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant. In some embodiments, the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
In some embodiments, said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 84.
In some embodiments, said functionally active protein of said fusion protein may be transferrin binding protein.
In some embodiments, said transferrin binding protein of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 89.
In some embodiments, said transferrin inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant. In some embodiments, the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
In some embodiments, said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 85.
In some embodiments, said functionally active protein of said fusion protein may be VEGF inhibiting protein.
In some embodiments, said VEGF inhibiting protein. of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 90.
In some embodiments, said VEGF inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant. In some embodiments, the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
In some embodiments, said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87.
In another aspect, the present application provides a polypeptide, comprising said isolated antigen binding protein or said bi-paratopic antigen-binding protein.
In another aspect, the present application provides an immunoconjugate, comprising said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
In another aspect, the present application provides an isolated nucleic acid molecule or isolated nucleic acid molecules, encoding said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
In another aspect, the present application further provides a vector, comprising said nucleic acid molecule (s) .
In another aspect, the present application provides a cell, comprising said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein, said polypeptide, said nucleic acid molecule (s) , and/or said vector.
In another aspect, the present application provides a method of producing said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide, wherein said method comprises culturing the cell under conditions that allow expression of said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
In another aspect, the present application provides a method for detecting factor D, wherein said method comprises using said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
In another aspect, the present application provides a detection kit for factor D, comprising said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
In another aspect, the present application provides the use of said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide in the preparation of a kit.
In another aspect, the present application provides a pharmaceutical composition, comprising said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein, said polypeptide, said immunoconjugate, said isolated nucleic acid molecule, said vector, said cell, and/or a pharmaceutically acceptable adjuvant and/or excipient.
In another aspect, the present application provides a pharmaceutical combination comprising said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein or said polypeptide.
In another aspect, the present application provides a method of inhibiting alternative complement pathway, comprising administering an effective amount of said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein, said polypeptide, said immunoconjugate, said isolated nucleic acid molecule, said vector, said cell, and/or said pharmaceutical composition, and/or a pharmaceutically acceptable therapeutic agent.
In another aspect, the present application provides a method of inhibiting alternative complement pathway, comprising administering an effective amount of said pharmaceutical combination and/or a pharmaceutically acceptable therapeutic agent.
In another aspect, the present application provides said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein, said polypeptide, said immunoconjugate, said isolated nucleic acid molecule, said vector, said cell and/or said pharmaceutical composition, and/or said pharmaceutical combination for use in the prevention and/or treatment of diseases.
In another aspect, the present application provides the use of said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein, said polypeptide, said immunoconjugate, said isolated nucleic acid molecule, said vector, said cell, said pharmaceutical composition, and/or pharmaceutical combination in the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of a disease.
In another aspect, the present application provides a method of preventing and/or treating a disease, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen-binding protein, said polypeptide, said immunoconjugate, said isolated nucleic acid molecule, said vector, said cell, said pharmaceutical composition, and/or said pharmaceutical combination.
In some embodiments, said diseases may be caused by factor D.
In some embodiments, said diseases may be mediated by alternative pathway.
In some embodiments, said diseases may include autoimmune thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) , hemolytic uremic syndrome (HUS) , atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , C3 glomerulopathy (C3G) , asthma, Gaucher disease,  Hidradentitis suppurativa, Behcet's disease, dermatomyositis, severe burn, early sepsis, pneumococcal meningitis, Alzheimer's disease, cancer metastasis, acute respiratory distress syndrome (ARDS) , acute lung injury (ACI) , transfusion-related lung injury (TRALI) , hemodialysis induced thrombosis, epidermolysis bullosa acquisita (EBA) , uveitis, Parkinson's disease, primary biliary atresia, antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) vasculitis, retinal degeneration, broad thrombotic microangiopathy (TMA) , broad TMA (APS) , hematopoietic stem cell therapy (HSCT) TMA, age-related macular degeneration (AMO) , pre-eclampsia, hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet (HELLP) syndrome, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome (APS) , relapsing polychondritis, ischemic injury, stroke, graft versus host disease (GvHD) , chronic obstructive pulmonary disease (COPD) , emphysema, atherosclerosis, acute coronary syndrome, hemorrhagic shock, rheumatoid arthritis, dialysis (cardiovascular risk) , cardiovascular disease, placental malaria, antiphospholipid syndrome (APS) pregnancy loss, encephalitis, brain injury, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antibody encephalitis, malaria hemolytic crisis, abdominal aortic aneurysm (AAA) , or thoracoabdominal aortic aneurysm (TAA) .
Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive.
INCORPORATION BY REFERENC
All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING
The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:
FIG. 1. Production of human, mouse and cynomolgus CFD analysis on non-reducing and reducing SDS-PAGE.
FIG. 2. Production of the recombinant VHH-Fc analysis on non-reducing and reducing SDS-PAGE.
FIG. 3. ELISA binding of the recombinant VHH-Fc to human (A) , mouse (B) or cynomolgus CFD(C) .
FIG. 4. Complement-inhibitory activities of the recombinant VHH-Fc within human (A) or mouse (B) serum.
FIG. 5. Production of bi-paratopic VHH’s analysis on non-reducing and reducing SDS-PAGE.
FIG. 6. Binding of the bi-paratopic VHH’s to human (A) or mouse (B) CFD.
FIG. 7. Complement-inhibitory activities of the bi-paratopic VHH’s within human (A) or mouse (B) serum
FIG. 8. Pathway-selectivity of bi-paratopic VHH in complement inactivation.
FIG. 9. Production of humanized VHH’s analysis on non-reducing and reducing SDS-PAGE.
FIG. 10. Binding of the humanized VHH’s to human CFD.
FIG. 11. Complement-inhibitory activities of the humanized VHH’s within human serum.
FIG. 12. Production of bi-paratopic humanized VHH’s analysis on non-reducing and reducing SDS-PAGE.
FIG. 13 Binding of the bi-paratopic humanized VHH’s to human CFD (A) and cynomolgus CFD(B) and AP inhibiting activities in human serum (C) .
FIG. 14 SDS-PAGE of the VHH fusion with CFH analysis on non-reducing and reducing.
FIG. 15 ELISA binding with mFD of VHH fusion with CFH, his-tag (A) , FC-tag (B) .
FIG. 16 AP inhibiting activities in mouse serum of VHH fusion with CFH proteins.
FIG. 17 SDS-PAGE of the VHH fusion with 9056VHH analysis on non-reducing and reducing.
FIG. 18 ELISA binding with hTf (A) , mFD (B) , and AP inhibiting activities in mouse serum (C) , of VHH fusion with CFH.
FIG. 19 SDS-PAGE of the VHH fusion with C2D2VHH analysis on non-reducing and reducing.
FIG. 20 ELISA binding with mFD of VHH fusion with C2D2VHH, his-tag (A) , FC-tag (B) .
FIG. 21 ELISA binding with hVEGF (A) , mVEGF (B) , and RBA activities with hVEFG receptor (C) , mVEGF receptor (D) of VHH-C2D2-his fusion protein.
FIG. 22 ELISA binding with hVEGF (A) , mVEGF (B) , and RBA activities with hVEFG receptor (C) , mVEGF receptor (D) of VHH-FC-C2D2 fusion protein.
FIG. 23 AP inhibiting activities in mouse serum of VHH-C2D2-his and VHH-FC-C2D2.
DETAILED DESCRIPTION
While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed.
Terms &Definitions
The term “isolated” antigen binding protein generally refers to an antigen binding protein that has been identified, isolated, and/or recovered from (e.g., native or recombinant) components of the environment in which it is produced. Contaminant components of the environment in which it is produced are generally substances that interfere with its investigational, diagnostic or therapeutic use, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. An isolated antigen binding protein or an antibody is generally prepared by at least one purification step. The isolated antigen binding protein of the present application generally specifically binds to factor D.
The term “antigen binding protein” herein generally refers to a polypeptide molecule capable of specifically recognizing and/or neutralizing a particular antigen. For example, in the present application, the term “antigen binding protein” may include an “antibody” or an “antigen binding fragment” , as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. For example, the said isolated antigen binding protein may comprise a single domain protein, for example, the said isolated antigen binding protein may include any molecule comprising an antigen-binding portion thereof. For example, the said isolated antigen binding protein may comprise a VHH-Fc protein or a Fc-VHH-VHH protein.
The term “factor D” “complement factor D” and “CFD” are used interchangeably, and generally refers to a protein required for alternative pathway. For example, the term “factor D” may be human factor D, may be mouse factor D. For example, the term “factor D” may comprise full length, truncated, and variant factor D.
The term “antibody” is used in the broadest sense, and may include but not limited to monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies containing two light chains and two heavy chains) , polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bispecific antibodies) , murine antibodies, human antibodies (fully human antibodies) , humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies (e.g., scFv) , antibody derivatives , and antibody fragments that bind to an antigen (e.g., Fab', VHH, and (Fab) 2 fragments) . The term “antibody” may also include all recombinant forms of antibodies, such as antibodies expressed in prokaryotic cells, unglycosylated antibodies, and any antigen-binding antibody fragments and derivatives thereof described herein. The “antibody” may generally comprise a protein in which at least two heavy chains (HC) and two light chains (LC) are linked to each other by disulfide bonds, or an antigen-binding fragment thereof. Each heavy chain may be composed of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region. The VH region can be further distinguished as hypervariable regions, termed complementarity determining region (CDR) , interspersed with more conserved regions termed framework region (FR) .  Each VH may be composed of three CDRs and four FRs regions, which may be arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. The variable regions of the heavy chains contain binding domains that interact with an antigen (e.g., factor D) . In the art, the CDR of an antibody may be defined by a variety of methods, for example, the Kabat definition rules based on sequence variability (see, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health, Besse Star, Maryland (1991) ) , the Chothia definition rules based on the location of the structural loop regions (see, A1-Lazikani et al., JMol Biol 273: 927-48, 1997) , and the IMGT definition rules based on the concepts in IMGT-ONTOLOGY and IMGT Scientific chart rules. In the present application, the CDRs may be defined by the Kabat definition rules.
The term “antigen binding domain” herein generally refers to a domain capable of binding to a target. For example, the binding may require some complementarity in binding sequence. For example, the binding may require special structure. For example, in the present application, the antigen binding domain of antigen binding protein may specifically bind to antigen (e.g., factor D, VEGF family, transferrin and factor H) . For example, the antigen binding domain may belong to an antibody or an antigen binding fragment, and make them bind to the target with greater affinity, avidity, easiness, and/or duration than it binds to other targets. For example, the antigen binding domain may have a measurable and reproducible interaction, such as the binding between an antigen and an antibody, whereby the existence of a target may be determined in the presence of a heterogeneous population of molecules (including biomolecules) . “Binding sequence” refers to a specific amino sequence on the target (e.g., antigen) , which is complementary to the antigen binding protein.
The term “antigen binding fragment” herein generally refers to one or more fragments of an antibody that specifically bind to antigen. The antigen binding function of an antibody can be achieved by a full-length fragment of the antibody. The antigen binding function of an antibody can also be achieved by: a heavy chain comprising a fragment of Fv, scFv, dsFv, Fab’ or F (ab’ ) 2, or a light chain comprising a fragment of Fv, scFv, dsFv, Fab’ or F (ab’ ) 2. The term “Fab” generally refers to a fragment comprising a heavy-chain variable domain and a light-chain variable domain, and also comprising a light-chain constant domain and a heavy-chain first constant domain (CH1) . The term “Fab’ ” generally refers to a fragment that is different from Fab by the addition of a few residues (comprising one or more cysteines from the hinge region of an antibody) to a carboxyl terminus of the heavy-chain CH1. The term “F (ab’ ) 2” generally refers to a dimer of Fab’, comprising an antibody fragment in which two Fab fragments are linked by a disulfide bridge on the hinge region. The term “Fv” generally refers to the smallest antibody fragment that comprises a complete antigen recognition and binding site. In some cases, this fragment may consist of a dimer in which one heavy-chain variable region and one light-chain variable region are tightly non-covalently bound. The term “dsFv” generally refers to a disulfide-stabilized Fv fragment, with a disulfide bond between a single light-chain variable region and a single heavy-chain variable region. The term “dAb fragment” generally refers to an antibody fragment consisting of a VH domain. The term “scFv” generally refers to a molecule produced by covalently linking and pairing one heavy-chain variable domain with one light-chain variable domain of an antibody by means of a flexible peptide linker. The term “Fd” generally  refers to a fragment consisting of the VH and CH domains. For example, the term “antigen binding fragment” may include one class of antibody VHHs, which lacks the antibody light chain and has only the heavy chain variable region.
The term “VHH” also known as VHH domains, VHH antibody fragments, and VHH antibodies, generally refers to the antigen binding immunoglobulin (variable) domain of “heavy chain antibodies” . For example, having the structure of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 and specifically binding to an epitope without requiring the presence of a second immunoglobulin variable domain.
The term “cell” generally refers to an individual cell, a cell line or a cell culture, which may contain or already contain a plasmid or vector comprising a nucleic acid molecule of the present application, or which is capable of expressing the antibody or antigen binding fragment thereof in the present application. The cell may include a progeny of a single host cell. Due to natural, accidental or deliberate mutations, progeny cells and original parent cells may not be necessarily identical in terms of morphology or genome, as long as they are capable of expressing the antibody or antigen-binding fragment thereof in the present application. The cells may be obtained by transfecting cells in vitro using the vector of the present application. The cells may be prokaryotic cells (e.g., Escherichia coli) , or eukaryotic cells (e.g., yeast cells; e.g., COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, HeLa cells, HEK293 cells, COS-1 cells, NS0 cells, or myeloma cells) . In some cases, the cells may be mammalian cells. For example, the mammalian cells may be CHO-K1 cells.
The term “chimeric antibodies” generally refers to an antibody in which the variable region is derived from one species and the constant region is derived from another species. Generally, the variable region is derived from an antibody ( “parent antibody” ) in an experimental animal such as a rodent, and the constant region is derived from a human antibody, such that the possibility of causing an adverse immune response in an individual human by the resulting chimeric antibody is reduced as compared with the parental (e.g., mouse-derived) antibody.
The term "derivative" “variant” or “analogue” are used interchangeably, and generally refers to a polypeptide or polynucleotide of the present application, including any substitution, variation, modification, substitution, deletion and/or addition of one (or more) amino acid residues from/to the sequence, so long as the resulting polypeptide or polynucleotide substantially retains at least one of its endogenous functions. For example, the derivative may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
The term “epitopes” generally refers to a domain or an amino acid sequence specifically bind to antigen binding protein. For example, the term “epitopes” may include chemically active surface molecular groups (e.g., a sugar side chain, a phosphoryl group, or a sulfonyl group) . For example, the term “epitope” may have specific tertiary structural features, and/or specific charge features.
The term “fully human antibodies” generally refers to an antibody that contains only the sequence of human immunoglobulin proteins. The fully human antibody can greatly reduce the side immune effects caused by heterologous antibodies on the human body. Methods for obtaining the fully  human antibody in the art may include the phage display technology, the transgenic mouse technology, the ribosome display technology, the RNA-polypeptide technology, etc.
The term “bi-paratopic antigen-binding protein” generally refers to an antigen-binding molecule comprising a first antigen-binding domain and a second antigen-binding domain. For example, the two antigen-binding domain binds to two different epitopes. For example, non-overlapping epitopes of the respective antigen. For example, the first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain may target the same antigen. For example, the first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain target different epitopes of the same antigen. The part of an antigen-binding protein that recognize the epitope is called a paratope.
The term “fusion protein” generally refers to a protein composed of two or more polypeptides. The two or more polypeptide components can be bound directly or indirectly through a peptide linker/spacer. For example, said polypeptides are not normally bound in their natural state, they are held together by peptide bonds through their respective amino and carboxyl termini to form a contiguous polypeptide. For example, the term “fusion protein” comprises an antigen binding protein which is prepared by the method described in present application, and a functionally active protein. For example, the said functionally active protein may be factor H. For example, the said functionally active protein may be VEGF inhibiting protein. For example, the said functionally active protein may be transferrin inhibiting protein. For example, the fusion protein may include a prophylactic or therapeutic drug fused to a heterologous protein, polypeptide, or peptide. Wherein, the heterologous protein, polypeptide or peptide may or may not be different types or therapeutic drugs. For example, the fusion protein may comprise two different proteins, polypeptides or peptides with immunomodulatory activity. For example, the fusion protein may retain or improve the activity compared to the activity of the original polypeptide or protein. Typically, the fusion protein can be produced by in vitro recombinant techniques well known in the art. For example, the fusion protein may comprise the antigen binding protein. For example, the fusion protein may comprise biologic molecules. For example, the fusion protein may compose of factor D binding proteins and VEGF inhibiting proteins. For example, the fusion protein may compose of factor D binding proteins and transferrin binding proteins. For example, the fusion protein may compose of factor D binding proteins and factor H proteins.
The term “blood-brain barrier (BBB) ” , generally refers to the physiological barrier between the peripheral circulation and the brain and spinal cord. It is formed by the tight junctions in the plasma membrane of brain capillary endothelial cells and constitutes a tight barrier that restricts the transport of molecules to the brain, even very small molecules such as urea (60 Daltons) . For example, the brain capillary endothelial cells may have weaker pinocytosis. For example, the blood-brain barrier may include the BBB in the brain, the blood-spinal cord barrier in the spinal cord, and the blood-retinal barrier in the retina. For example, the BBB may also include the blood-CSF barrier (choroid plexus) , where the barrier is composed of ependymal cells instead of capillary endothelial cells.
The term “humanized antibodies” generally refers to an antibody in which some or all of the amino acids outside the CDR of a non-human antibody (e.g., a mouse antibody) have been replaced  by corresponding amino acids derived from human immunoglobulins. In the CDR, small additions, deletions, insertions, substitutions, or modifications to the amino acids may also be allowed, as long as they still retain the capability of the antibody to bind to a specific antigen. The humanized antibody may optionally comprise at least a portion of a constant region of a human immunoglobulin. The “humanized antibody” reserves the antigen specificity similar to that of the original antibody. The “humanized” form of a non-human (e.g., a mouse) antibody may minimally comprise a chimeric antibody derived from a non-human immunoglobulin sequence. In some cases, CDR residues in a human immunoglobulin (receptor antibody) may be replaced with CDR residues from a non-human species (donor antibody) (e.g., a mouse, a rat, a rabbit, or a non-human primate) with the desired properties, affinity, and/or capability. In some cases, FR residues of the human immunoglobulin may be replaced with corresponding non-human residues. In addition, the humanized antibody may comprise an amino acid modification that is not present in the receptor antibody or in the donor antibody. These modifications may be made to further improve the properties such as binding affinity of the antibody.
The term “monoclonal antibodies” generally refers to an antibody obtained from a group of substantially homogeneous antibodies, that is, a cluster in which several antibodies are the same, except for a few natural mutants that may exist. The monoclonal antibody is generally highly specific for a single antigen site. Moreover, unlike conventional polyclonal antibody preparations (which generally comprise different antibodies directed against different determinants) , each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the advantage of monoclonal antibodies lies in that they may be synthesized by hybridoma culture, without being contaminated by other immunoglobulins. The modifier “monoclonal” indicates the characteristics of an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population, and is not construed as requiring the production of the antibody by any specific method. For example, the monoclonal antibodies may be prepared in hybridoma cells, or may be prepared by recombinant DNA methods.
The term “immunoconjugate” generally refers to a conjugate formed by conjugating (e.g., covalently linking via a linking molecule) the additional therapeutic agent to the isolated antigen binding protein, which conjugate can deliver the additional therapeutic agent to a target cell via specific binding of the isolated antigen binding protein to an antigen on the target cell.
The term “isolated nucleic acid molecule” generally refers to a genome, an mRNA, a cDNA, or a synthetic-origin DNA or RNA or a certain combination thereof. It is not associated with the all or some of polynucleotides found in nature, or is linked to polynucleotides to which it is not linked in nature.
The term “patient” generally refers to a human or non-human animal, including but not limited to a cat, dog, horse, pig, cow, sheep, rabbit, mouse, rat, or monkey.
The term “pharmaceutically acceptable adjuvant” generally comprises pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers, which are nontoxic for the cells or mammals that are  exposed to them at the dose and concentration used. Generally, the physiologically acceptable carrier is a PH buffered aqueous solution. Examples of the physiologically acceptable carrier may comprise: buffers, such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; low-molecular-weight (less than about 10 residues) polypeptides, and proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymers, such as polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or dextrin; chelating agents, such as EDTA; sugar alcohols, such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions, such as sodium; and/or nonionic surfactants.
The term “pharmaceutical combination” and "combination product" is used interchangeably, and generally refers to a product resulting from the admixture or combination of more than one active ingredients, and includes both fixed and non-fixed combinations of active ingredients. The term “fixed combination” means that the active ingredients, and one or more combination partners are both administered to a patient simultaneously in the form of a single entity or dose. The term "non-fixed combination" means that the active ingredients and one or more combination partners are administered to a patient simultaneously, jointly or sequentially (without a specific time limit) as separate entities, wherein such administration provides two compounds at therapeutically effective levels in the patient’s body. For example, one active ingredient of pharmaceutical combination may be an antigen binding protein prepared by the method described in present application.
The term “pharmaceutical composition” generally refers to a composition suitable for administration to a patient. For example, the term “pharmaceutical composition” contains one or more antigen binding proteins, which is generally prepared by the method described in present application. A pharmaceutical composition may also contain one or more suitable (pharmaceutically effective) carriers, stabilizers, excipients, diluents, solubilizers, surfactants, emulsifiers, preservatives and/or adjuvants. For example, an acceptable component of a composition is nontoxic to the patient at the dose and concentration used. The pharmaceutical composition in present application includes, but is not limited to liquid, frozen and lyophilized compositions.
The term “polypeptide” , “polypeptide” , “peptide” and “protein” are used interchangeably, and generally refer to a polymer of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may comprise modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. These terms also encompass amino acid polymers that have been modified. These modifications may comprise: disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation (e.g., binding to a labeling component) . The term “amino acid” includes natural and/or unnatural or synthetic amino acids, including glycine, D and L optical isomers, amino acid analogs and peptidomimetics.
The term “VEGF” , or “vascular endothelial growth factor” are used interchangeably, and generally refers to a family of signaling proteins that can stimulate for example angiogenesis, vasculogenesis and/or lymphangiogenesis. Members of the VEGF family include VEGF-A, VEGF-B,  VEGF-C, VEGF-D, and PIGF (Placental Growth Factor) . In the present application, the term “VEGF” may comprise its functional active fragment, ortholog, analogue, and variant.
The term “transferrin” generally refers to a glycoprotein which can bind to and transport multivalent ions. For example, the transferrin may be a single-chain glycoprotein. For example, the transferrin may have a molecular weight of about 77,000D. For example, the transferrin may have a polysaccharide. For example, the transferrin may have two ion binding sites. For example, the ion binding sites may have different affinity with iron ions. For example, the multivalent ion may be an iron ion, a chromium ion, a manganese ion, a cadmium ion or a nickel ion thereof. For example, each molecule of transferrin may bind two trivalent iron atoms. For example, transferrin could be iron-containing holo-transferrin, or iron-free apo-transferrin. For example, the transferrin may be a mice transferrin. For example, the amino sequence of mice transferrin may be as set forth in GenBank: EDL21066.1, AAL34533.1, or AAL34533.1. For example, the transferrin may be a human transferrin. For example, the amino sequence of human transferrin may be as set forth in GenBank: AAH59367.1, AAH59367.1, or AAB22049.1. In the present application, the term “transferrin” may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
The term “transferrin receptor” generally refers to a carrier protein of transferrin. For example, the transferrin may be a transmembrane glycoprotein. For example, the transferrin receptor may mediate endocytosis of transferrin associated to two iron ions. For example, the transferrin receptor may maintain iron homeostasis in cells. For example, the transferrin receptor may be transferrin receptor 1 (TfR1) or transferrin receptor 2 (TfR2) . For example, TfR1 and TfR2 may show homologies around 45-66%in the extracellular domain but present with different expression patterns in the body. For example, the TfR1 may have higher affinity to transferrin than that of TfR2. For example, TfR2 may have a 25-fold lower affinity with transferrin compared to that of TfR1. For example, the TfR2 may mainly express in tissues involved in regulating iron metabolism, such as the liver and small intestines, while the TfR1 is generally found on the surface of most body cells. The term “transferrin receptor 1” generally refers to a 97-kDa type2 membrane protein expressed as a homodimer in the cell membrane. TfR1-mediated transferrin internalization is classically described as the canonical iron import pathway. For example, the transferrin receptor may be a mouse transferrin receptor. For example, the amino sequence of mouse transferrin receptor may be as set forth in GenBank: AAH54522.1, CAA40624.1, or NP_001344227.1. For example, the transferrin receptor may be a human transferrin receptor. For example, the amino sequence of human transferrin receptor may be as set forth in GenBank: AAA61153.1, AAF04564.1, or AAB19499.1. In the present application, the term “transferrin receptor” may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant.
The term “ortholog” generally refers to an amino acid sequence that shares a certain percentage of sequence identity and functional similarity with the reference amino acid sequence. For example, orthologs may comprise structurally similar sequences in different species due to evolution from a common ancestor. Ortholog may be identified using any method known in the art, preferably by using the BLAST tool to compare a reference sequence to a separate second sequence or sequence fragment or sequence database. For example, the ortholog may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at  least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
The term “treatment” generally refers to the administration of an internal or external therapeutic agent to a patient who has one or more disease symptoms, and furthermore, the therapeutic agent is known to show a therapeutic effect against these symptoms. Generally, therapeutic agent is administered to the patient at an amount (therapeutically effective amount) for effectively alleviating one or more disease symptoms. The desired therapeutic effect comprises reducing the rate of disease progression, ameliorating or alleviating the disease state, and regressing or improving the prognosis.
The term “vector” generally refers to a nucleic acid molecule capable of self-replication in a suitable host. It transfers an inserted nucleic acid molecule into and/or between host cells. The vector may include a vector mainly for inserting DNA or RNA into cells, a vector mainly for replicating DNA or RNA, and a vector mainly for expressing DNA or RNA transcription and/or translation. The vector also includes a vector having a variety of the functions defined above. The vector may be a polynucleotide that may be transcribed and translated into a polypeptide when introduced into a suitable host cell. Generally, the vector may produce a desired expression product by culturing a suitable host cell containing the vector.
The term “optional” or “optionally” means that the event or situation described subsequently may occur but does not have to occur.
The term “comprise” generally refers to the meaning of including, inclusive, containing, or encompassing. In some cases, it also means “is/are” and “consist of” .
The term “about” generally refers to a variation within a range of 0.5%-10%above or below a specified value, for example, a variation within a range of 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, and 10%above or below a specified value.
Details Description of the Invention
The CDR of an antibody, also known as the complementarity determining region, is a portion of the variable region. The amino acid residues in this region may make contacts with the antigen or antigenic epitope. The CDR of an antibody can be determined by a variety of coding systems, such as CCG, Kabat, Chothia, and IMGT, and Kabat/Chothia may be preferred after comprehensive consideration. These coding systems are known in the art. Those skilled in the art can use different coding systems to determine the CDR according to the sequence and structure of the antibody. There may be differences in the CDRs using different coding systems. In this application, the CDR covers CDR sequences classified according to any CDR classification method. It also covers its variants, which are obtained by substitution, deletion and/or addition of one or more amino acids to the amino acid sequence of the CDR. The variants may include substitutions, deletions and/or additions of, for example, 1-30, 1-20 or 1-10 amino acids, and for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 amino acids, to the amino acid sequences of the CDR. The CDR may also include its homologues having amino acid  sequences at least about 85% (e.g., at least about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%or higher) identical to the amino acid sequence of the CDR.
Isolated Antigen Binding protein
In one aspect, the present application provides an isolated antigen binding protein, which may specifically bind to factor D in an ELISA binding assay with an isolated antigen binding protein concentration of about 100 ng/ml or less (e.g., said concentration is no greater than about 50 ng/ml, no greater than about 55 ng/ml, no greater than about 60 ng/ml, no greater than about 65 ng/ml, no greater than about 70 ng/ml, no greater than about 75 ng/ml, no greater than about 80 ng/ml, no greater than about 85 ng/ml, no greater than about 90 ng/ml, or no greater than about 95 ng/ml or less) . For example, said factor D may comprise human factor D, cynomolgus factor D, and mouse factor D.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise CDR3, wherein said CDR3 may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20. For example, the CDR3 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise CDR2, wherein said CDR2 may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14. For example, the CDR2 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise CDR1, wherein said CDR1 may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. For example, the CDR1 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise CDR1, CDR2 and CDR3. In the present application, said CDR1 may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; said CDR2 may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14; and said CDR3 may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise any set of HCDR1, HCDR2 and HCDR3, selected from the groups consisting of:
(1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
(2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
(3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
(4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
(5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
(6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise FR1, wherein a C terminal of said FR1 is directly or indirectly linked to an N terminal of said CDR1. For example, the FR1 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise FR2, and said FR2 is located between said CDR1 and said CDR. For example, the FR2 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise FR3, and said FR3 is located between said CDR2 and said CDR. For example, the FR3 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise FR4, wherein an N terminal of said FR4 is linked to a C terminal of said CDR. For example, the FR4 sequence of said isolated antigen binding protein may be defined according to the Kabat coding system.
In the present application, said isolated antigen binding protein may further comprise framework regions FR1, FR2, FR3, and FR.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise any set of FR1, FR2, FR3, and FR4, selected from the groups consisting of:
(1) FR1: SEQ ID NO: 21, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 37, FR4: SEQ ID NO: 50;
(2) FR1: SEQ ID NO: 23, FR2: SEQ ID NO: 31, FR3: SEQ ID NO: 41, FR4: SEQ ID NO: 52;
(3) FR1: SEQ ID NO: 25, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 44, FR4: SEQ ID NO: 53;
(4) FR1: SEQ ID NO: 27, FR2: SEQ ID NO: 34, FR3: SEQ ID NO: 47, FR4: SEQ ID NO: 54;
(5) FR1: SEQ ID NO: 28, FR2: SEQ ID NO: 35, FR3: SEQ ID NO: 48, FR4: SEQ ID NO: 55;
(6) FR1: SEQ ID NO: 29, FR2: SEQ ID NO: 36, FR3: SEQ ID NO: 49, FR4: SEQ ID NO: 55;
(7) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 38, FR4: SEQ ID NO: 51;
(8) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 39, FR4: SEQ ID NO: 51;
(9) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 40, FR4: SEQ ID NO: 51;
(10) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
(11) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
(12) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
(13) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
(14) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 31, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
(15) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
(16) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 45, FR4: SEQ ID NO: 52;
(17) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 46, FR4: SEQ ID NO: 52;
(18) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 45, FR4: SEQ ID NO: 52; and
(19) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 46, FR4: SEQ ID NO: 52.
In the present application, the isolated antigen-binding protein may comprise a heavy-chain variable region VH. In the present application, said VH may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
In the present application, said heavy-chain variable region may comprise VHH. The VHH may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
In the present application, said isolated antigen binding protein may comprise a heavy-chain constant region.
For example, the Fc region of said isolated antigen binding protein may be a human Fc region. For example, said human Fc region may be modified to achieve the desired property (e.g., an amino acid mutation) . For example, said human Fc region may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92.
In the present application, said isolated antigen binding protein may be directly or indirectly linked to a second antigen binding domain.
For example, said isolated antigen binding protein may be linked by its N-terminus or C-terminus to the N-terminus or C-terminus of said second antigen binding domain. For example, said isolated antigen binding protein may be linked by its N-terminus or C-terminus to the N-terminus or C-terminus of said second antigen binding domain with a linker. For example, said linker of said isolated antigen binding protein may be a simple covalent bond (e.g., a peptide bond) , a synthetic polymer (e.g., a polyethylene glycol (PEG) polymer) , or any kind of bond created from a chemical reaction.
For example, said linker of said isolated antigen binding protein may be a poly-glycine linker. For example, said linker of said isolated antigen binding protein may comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
In the present application, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to a different target from said isolated antigen binding protein.
In the present application, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to the same target as said isolated antigen binding protein.
For example, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to factor D. For example, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to different epitopes of factor D from the isolated antigen binding protein. For example, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may bind to the same epitopes of factor D with the isolated antigen binding protein.
For example, said second antigen binding domain of said isolated antigen binding protein may comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
For example, said isolated antigen binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 75-82.
For example, said isolated antigen binding protein may comprise an antibody or an antigen binding fragment thereof. For example, said isolated antigen binding protein may comprise Fab, Fab’, F (ab) 2, Fv fragments, F (ab') 2, scFv, di-scFv, VHH and/or dAb. For example, said isolated antigen binding protein may be selected from the group consisting of: monoclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
For example, said isolated antigen binding protein may be a camelid antibody.
Bi-paratopic Antigen-binding Protein
In another aspect, the present application provides a bi-paratopic antigen-binding protein that may comprise a first antigen-binding domain binding to factor D and a second antigen-binding domain binding to factor D.
In the present application, said first antigen-binding domain may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
(1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
(2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
(3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
(4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
(5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
(6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
In the present application, said second antigen-binding domain may comprise CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
(1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
(2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
(3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
(4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
(5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
(6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
In the present application, said first antigen-binding domain may be directly or indirectly linked to the second antigen-binding domain.
In the present application, said first antigen-binding domain may be indirectly linked to the second antigen-binding domain by a linker.
For example, said linker may be a poly-glycine linker. For example, said linker may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
For example, said bi-paratopic antigen-binding protein may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
In the present application, said isolated antigen binding protein may comprise a heavy-chain constant region.
For example, the Fc region of said bi-paratopic antigen-binding protein may be a human Fc region. For example, said human Fc region may be modified to achieve the desired property (e.g., an amino acid mutation) . For example, said human Fc region may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92.
Fusion Protein
In another aspect, the present application provides a fusion protein that may comprise the isolated antigen binding protein or the bi-paratopic antigen-binding protein of the present application.
In the present application, said fusion protein may comprise a functionally active protein.
In the present application, said functionally active protein of said fusion protein may be directly or indirectly linked to said isolated antigen binding protein.
For example, said functionally active protein may be linked by its N-terminus or C-terminus to the N-terminus or C-terminus of said isolated antigen binding protein. For example, said functionally active protein may be linked by its N-terminus or C-terminus to the N-terminus or C-terminus of said isolated antigen binding protein with a linker. For example, said linker may be a simple covalent bond (e.g., a peptide bond) , a synthetic polymer (e.g., a polyethylene glycol (PEG) polymer) , or any kind of bond created from a chemical reaction.
For example, said linker may be a poly-glycine linker. For example, said linker may comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
For example, said functionally active protein may be a factor H inhibiting protein. For example, said factor H may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 88. For example, said  factor H of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant. For example, the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
For example, said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 84.
For example, said functionally active protein of said fusion protein may be transferrin binding protein. For example, said transferrin binding protein of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 89. For example, said transferrin inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant. In some embodiments, the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
For example, said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 85.
For example, said functionally active protein of said fusion protein may be VEGF inhibiting protein. For example, said VEGF inhibiting protein. of said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 90. For example, said VEGF inhibiting protein of said fusion protein may comprise its functional active fragment, ortholog, and variant. In some embodiments, the sequence similarity may have at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 99%similarity to its corresponding sequence.
For example, said fusion protein may comprise an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 87.
For example, the fusion protein may include a prophylactic or therapeutic drug fused to a heterologous protein, polypeptide, or peptide. Wherein, the heterologous protein, polypeptide or peptide may or may not be different types or therapeutic drugs.
For example, the fusion protein may comprise two or more different proteins, polypeptides or peptides with immunomodulatory activity. For example, the fusion protein may retain or improve the activity compared to the activity of the original polypeptide or protein. Typically, the fusion protein can be produced by in vitro recombinant techniques well known in the art. For example, the fusion protein may comprise the antigen binding protein.
Polypeptides and Immunoconjugates
In another aspect, the present application provides one or more polypeptides that may comprise the isolated antigen binding protein or the bi-paratopic antigen-binding protein of the present application.
In another aspect, the present application provides one or more immunoconjugates that may comprise the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen-binding protein or the polypeptide of the present application. In certain embodiments, the immunoconjugate may further comprise a pharmaceutically acceptable therapeutic agent.
Nucleic Acid, Vector and Cell
In another aspect, the present application further provides an isolated nucleic acid molecule or isolated nucleic acid molecules. The nucleic acid molecule (s) may encode the antigen binding protein the bi-paratopic antigen-binding protein or the polypeptide of the present application. For example, each of the nucleic acid molecule (s) may encode the complete antigen binding protein, or a portion thereof (e.g., one or more of CDR1-3, FR1-4, VH, VHH or heavy chain) .
In another aspect, the present application provides a vector or vectors, each of which comprises the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen-binding protein, the polypeptide or the nucleic acid molecule (s) of the present application. Each vector may comprise one or more said nucleic acid molecule (s) . In addition, the vector may also comprise other genes, for example, a marker gene that is allowed to select this vector in a suitable host cell and under a suitable condition. In addition, the vector may also comprise an expression control element that allows a coding region to be expressed correctly in a suitable host. Such a control element is well known to those skilled in the art, which, for example, may include a promoter, a ribosome binding site, an enhancer, and other control elements that regulate gene transcription or mRNA translation. The vector may comprise, for example, a plasmid, a cosmid, a virus, a bacteriophage, or other vectors commonly used in, for example, genetic engineering. For example, the vector is an expression vector.
In another aspect, the present application provides a host cell, which may comprise the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen-binding protein, the polypeptide the nucleic acid molecule (s) of the present application and/or the vector or vectors of the present application. In some embodiments, each type of or each host cell may comprise one or one type of the nucleic acid molecule or vector of the present application. In some embodiments, each type of or each cell may comprise a plurality of (e.g., 2 or more) or a plurality of types of (e.g., 2 or more types of) vectors of the present application. For example, the vector of the present application may be introduced into the host cell, for example, a eukaryotic cell, such as a plant-originated cell, a fungal cell, or a yeast cell, etc. The vector of the present application may be introduced into the host cell by methods known in the art, such as electroporation, lipofectine transfection, lipofectamin transfection, etc.
Preparation Method
In another aspect, the present application provides a preparation method for the isolated antigen binding protein the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen-binding protein or the polypeptide of the present application. The method may comprise culturing the host cell of the present application under such a condition that the isolated antigen binding protein is expressed. For example, an appropriate medium, an appropriate temperature, a culture time and the like may be used, and these methods are understood by those of ordinary skills in the art.
Pharmaceutical Composition and Pharmaceutical Combination
In another aspect, the present application provides a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition may comprise the isolated antigen binding protein, the polypeptide, the immunoconjugate, the isolated nucleic acid molecule, the vector, the cell, and/or a pharmaceutically acceptable adjuvant and/or excipient described herein.
In the present application, the pharmaceutically acceptable adjuvant may include a buffer, an antioxidant, a preservative, a low molecular weight polypeptide, a protein, a hydrophilic polymer, an amino acid, a sugar, a chelating agent, a counter ion, a metal complex, and/or a non-ionic surfactant. Except insofar as any conventional media or agent is incompatible with the cells described herein, its use in the pharmaceutical compositions of the present application is contemplated.
In the present application, the pharmaceutically acceptable excipient may include an additive other than the main drug in the pharmaceutical preparation, and may also be referred to as an auxiliary material. For example, the excipients may include binders, fillers, disintegrants, lubricants in tablets. For example, the excipients may include wine, vinegar, medicinal juices, etc. in a traditional Chinese medicine pill. For example, the excipient may comprise a base portion of a semisolid formulation ointment, cream. For example, the excipients may include preservatives, antioxidants, flavoring agents, fragrances, cosolvents, emulsifiers, solubilizers, tonicity adjusting agents, colorants in liquid formulations. A pharmaceutical preparation should match the mode of administration. The pharmaceutical composition of the present application may be prepared into an injection form, for example, by means of a conventional method using normal saline or an aqueous solution containing glucose and other adjuvants. The pharmaceutical composition such as an injection and a solution should be manufactured under an aseptic condition. The dosage of an active ingredient is a therapeutically effective amount. In addition, the isolated antigen binding protein of the present application may also be used together with other therapeutic agents.
In another aspect, the present application provides a pharmaceutical combination comprising the isolated antigen binding protein and one or more active ingredients.
The isolated antigen binding protein, pharmaceutical composition or pharmaceutical combination described herein may be formulated, dosed, and administered in line with good medical practices. The considerations in this case comprise the specific disorder being treated, the specific mammal being treated, the clinical condition of a single patient, the cause of the disorder, the site of agent delivery, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to a medical practitioner. A therapeutic agent (e.g., factor D binding protein) does not need to be but is optionally formulated and/or administered together with one or more agents that are currently used for preventing or treating the disorder in question. The effective amount of such other agents depends on the amount of the therapeutic agent (e.g., factor D binding protein) existing in the preparation, the type of disorder or treatment, and other factors discussed above. Generally, these agents may be used at any dose that is empirically/clinically determined to be appropriate and via any route that is empirically/clinically determined to be appropriate. Compared with a single therapy, the dose of the  antibody administered in a combination therapy may be reduced. The progress of such a therapy may be easily monitored by conventional techniques.
Kit, Use and Method
In another aspect, the present application provides a method for detecting or determining factor D, which method may comprise using the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen-binding protein or the polypeptide of the present application.
In the present application, the methods may include in vitro methods, ex vivo methods, methods of non-diagnostic or non-therapeutic interest. For example, the method may include a method for detecting the presence and/or amount of factor D for non-diagnostic purposes, which may include the steps of:
(1) contacting a sample with an antigen binding protein of the present application; and
(2) detecting the presence and/or amount of the antigen binding protein bound by the sample to determine the presence and/or level of expression of factor D in the sample obtained from the subject.
For example, said isolated antigen binding protein of said method may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
For example, said bi-paratopic antigen binding protein of said method may comprise an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
In another aspect, the present application provides a kit for factor D that may include use of the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen binding protein or the polypeptide. In the present application, the kit may further comprise instructions that document a method for detecting the presence and/or amount of factor D. For example, the methods may include in vitro methods, ex vivo methods, methods of non-diagnostic or non-therapeutic interest.
In another aspect, the application provides a use of the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen binding protein or the polypeptide in the preparation of a kit for use in a method of detecting the presence and/or amount of factor D factor D. For example, the methods may include in vitro methods, ex vivo methods, methods of non-diagnostic or non-therapeutic interest.
In another aspect, the present application provides a method of inhibiting alternative complement pathway comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen binding protein, the polypeptide, the immunoconjugate, the isolated nucleic acid molecule, the vector, the cell and/or the pharmaceutical composition, and/or a pharmaceutically acceptable therapeutic agent. In the present application, the method of modulating an immune response may include in vitro methods, ex vivo methods, methods of non-diagnostic or non-therapeutic interest.
In another aspect, the present application provides a method of inhibiting alternative complement pathway comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the  pharmaceutical composition, pharmaceutical combination, and/or a pharmaceutically acceptable therapeutic agent. In the present application, the method of modulating an immune response may include in vitro methods, ex vivo methods, methods of non-diagnostic or non-therapeutic interest.
In another aspect, the present application provides a method of inhibiting factor D binding to C3 comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen binding protein, the polypeptide, the immunoconjugate, the isolated nucleic acid molecule, the vector, and/or the cell. The method may be an ex vivo or in vitro method.
In another aspect, the present application provides said isolated antigen binding protein, said bi-paratopic antigen binding protein said polypeptide, said immunoconjugate, said isolated nucleic acid molecule, said vector, said pharmaceutical composition for preventing and/or treating diseases.
In another aspect, the present application provides the use of a pharmaceutical combination for the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of diseases in the present application.
In another aspect, the present application provides a use of the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen binding protein, the polypeptide, the immunoconjugate, the isolated nucleic acid molecule, the vector, the cell and/or the pharmaceutical composition for the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of diseases in the present application.
In another aspect, the present application provides a method of preventing and/or treating a disease or disorder comprising administering the isolated antigen binding protein, the bi-paratopic antigen binding protein, the isolated nucleic acid molecule, the vector, the cell, the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
For example, said diseases may be caused by factor D. For example, said diseases may be mediated by alternative pathway.
For example, said diseases may comprise autoimmune thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) , hemolytic uremic syndrome (HUS) , atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , C3 glomerulopathy (C3G) , asthma, Gaucher disease, Hidradentitis suppurativa, Behcet's disease, dermatomyositis, severe burn, early sepsis, pneumococcal meningitis, Alzheimer's disease, cancer metastasis, acute respiratory distress syndrome (ARDS) , acute lung injury (ACI) , transfusion-related lung injury (TRALI) , hemodialysis induced thrombosis, epidermolysis bullosa acquisita (EBA) , uveitis, Parkinson's disease, primary biliary atresia, antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) vasculitis, retinal degeneration, broad thrombotic microangiopathy (TMA) , broad TMA (APS) , hematopoietic stem cell therapy (HSCT) TMA, age-related macular degeneration (AMD) , pre-eclampsia, hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet (HELLP) syndrome, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome (APS) , relapsing polychondritis, ischemic injury, stroke, graft versus host disease (GvHD) , chronic obstructive pulmonary disease (COPD) , emphysema, atherosclerosis, acute coronary syndrome, hemorrhagic shock, rheumatoid arthritis,  dialysis (cardiovascular risk) , cardiovascular disease, placental malaria, antiphospholipid syndrome (APS) pregnancy loss, encephalitis, brain injury, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antibody encephalitis, malaria hemolytic crisis, abdominal aortic aneurysm (AAA) , or thoracoabdominal aortic aneurysm (TAA) .
The pharmaceutical compositions, pharmaceutical combinations, and methods described herein can be used in conjunction with other types of therapies, such as chemotherapy, surgery, radiation, gene therapy, and the like.
In the present application, the subject and/or patients may include a human or non-human animal. For example, the non-human animal may be selected from the group consisting of: monkey, chicken, goose, cat, dog, mouse and rat. Furthermore, non-human animals may also include any animal species other than humans, such as livestock animals, or rodents, or primates, or domestic animals, or poultry animals. The human may be Caucasian, African, Asian, amphibian, or other ethnicity, or a hybrid of various ethnicities. As another example, the person may be an elderly person, an adult, a teenager, a child, or an infant. An effective amount in humans can be presumed from an effective amount in experimental animals.
Examples
The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g. amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; pl, picoliter (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i.m., intramuscular (ly) ; i. p., intraperitoneal (ly) ; s. c., subcutaneous (ly) ; and the like.
Example 1 Discovery of CFD-binding antibody fragments
1.1 Human, mouse and cynomolgus CFD protein productions
The sequence of human, mouse and cynomolgus CFD from Uniprot database synthesized by GENEWIZ were subcloned to expression vector. Protein expression was performed using transient expression of HEK293 cells transfected using PEI (Polysciences, cat#24765-1) . Cultures were grown in shaking flasks media at scales ranging from 100 ml for 5-7 days. Cells were removed by centrifugation and culture supernatants were used for protein purification by Ni sepharose with elution using a pH 7.4 PBS buffer. Purified proteins were analyzed with 4-12%SDS-PAGE under non-reduced and reduced conditions (FIG. 1) .
1.2 VHH immune library constructions
Immunization was performed using recombinant human and mouse CFD in two healthy camels. On day 60 after finishing 4 rounds of immunization, phage-displayed VHH library was constructed of PMBCs from immunized camels by following a standardized protocol. The final phage-displayed VHH library had 1.1×109 independent clones, with 93%of them encoding VHH-gp3 fusion proteins.
1.3 Phage panning method
As previously prepared, an immune VHH library was used for VHH selection and was subjected to four rounds of panning in 1.5 ml Eppendorf tubes. About 1012 CFU phages were incubated with 2 μg of biotinylated CFD within 1ml of blocking buffer (1%BSA in PBS) at RT for 1 h to make phages/target mixture. At the same time, 100 μl of streptavidin-coated Dynabeads M-280 (Invitrogen, 11206D) were washed with 1 ml of blocking buffer for five times in an Eppendorf microtube. Thereafter, the phage/target mixture was incubated with the Mag-beads prepared as above on a rotator at RT for 30 min. To recover the phages binding to the Mag-beads, the reaction tube was placed on a magnetic rack for 30 s. After the supernatant was removed, the beads were washed with PBS containing 0.5%Tween20 (0.5%PBST) for 10 times, followed by three-times by PBS. The phages were eluted with 1 ml of trypsin (10 μg/ml in PBS) at 37 ℃ for 30 min. After each round of selection, 100 μl of eluted phages were used to infect mid-log phase E. coli TG1 (OD600 = 0.6) grown at 37 ℃for phage titration. Enrichment value of CFD-specific VHHs was also assessed to monitor the progress of the selection process. Remaining eluted phages were used to infect E. coli TG1 (OD600 = 0.6) for subsequent amplification. The bacteria were subsequently superinfected with M13KO7 helper phage at a ratio of 20: 1 (phage: bacteria) to rescue phage particles. A mixture of kanamycin (50 μg/mL) and ampicillin (100 μg/mL) was added to the culture, and bacteria were further grown 4 h with shaking at 220 rpm at 30 ℃. The cultures were centrifuged at 4,000 g for 20 min, and the supernatants were added to 20% (w/v) polyethylene glycol 6000/2.5M NaCl (PEG/NaCl) to precipitate the phages. The samples were incubated on ice overnight and then centrifuged for 20 min at 8,000 g at 4 ℃. The pellets were resuspended in PBS, PEG precipitation was repeated once as described above. The final phage pellets were resuspended in 1 ml of PBS, and 1012 phages were used in subsequent rounds of panning. The general panning procedure was repeated for another three rounds. The variation was the antigens derived from different species to have cross-reactive and affinity matched phage clones. Panning summary was listed in Table1.
Table1. Panning summary

1.4 Phage screening method
For phage-based ELISA screening, individual bacterial colonies were picked and inoculated into 200 μl 2×YT-GA medium, cultured at 37 ℃ with shaking (250 rpm) for 4～5 h. Then 10 μl of culture was transferred into a new deep 96-well plate containing 200 μl of 2×YT-GA medium and incubated as above till OD600 reached around 0.6. VHH expression was induced with 1 mM IPTG (Sangon Biotech) for 16 h at 30 ℃ with shaking (250 rpm) . After the overnight culture was spun at 4,000 rpm at 4℃ for 30 min, the supernatants were collected for phage ELISA.
Following four rounds of panning, output from 2nd, 3rd and 4th round was screened by phage enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Wells of MaxiSorp 96-well plates were coated with 1 μg/ml streptavidin in coating buffer overnight at 4 ℃. An equivalent concentration of BSA was used as a control for nonspecific binding. After washing with PBST, the remaining protein-binding sites in the wells were blocked for 1 h at 37 ℃ with 1%BSA. The blocking reagent was discarded and washed by 0.05%PBST for three times. The 5 μg/ml biotin-human/mouse CFD were added in the wells for 1 h at 37 ℃. The supernatant was discarded, and washed for three times with 0.05%PBST. 100 μl supernatants prepared above were added to appropriate wells and incubated while shaking for 1 h at 37 ℃. The supernatant was discarded, and nonspecific phages were eliminated by washing three times with 0.05%PBST. Detection of the interaction between antigen and the phage-VHH was performed using a 5000-fold diluted solution of anti-Myc-HRP (Abcam, ab62928) . After incubation for 1 h at 37 ℃, plates were then washed as before and 100 μl of TMB substrate solution were added and incubated at RT for 15 min. 100 μl/well of stop solution were added to stop the reaction before the plates were scanned with a microplate reader at 450 nm. ELISA-positive clones were defined as those that exhibited at least three times stronger ELISA signals on antigen coated plates in comparison to signals on BSA-coated plates. In parallel, the genetic diversity of the ELISA positive clones was determined using DNA sequencing, and phages with different amino acid sequences of VHH were considered as unique clones. In total, 48 unique clones with different CDR sequences were identified as positive in target-binding assays with phage ELISA and 30 selected expression and purification in HEK293 cells.
Table 2. Screening summary

Example 2 Identification of CFD-binding antibodies with inhibitory effects on complement alternative pathway activation.
2.1 Expression and purification of VHHs-FC
Unique VHH clones were selected for subcloning to create recombinant plasmids to produce VHH-FC proteins, degenerated primers. (Forward primer (SEQ ID NO: 1) :
GGCGGTGGCAGCTCAGGAGGCGGCGGATCCSAKGTGCAGCTGGTGGAG. Reverse primer (SEQ ID NO: 2) : AATCCAGAGGTTGATTGTCGACGTACGCTATGAGGAGACRGTGACC) were used. After the DNA sequences were verified with DNA sequencing, the recombinant plasmids were prepared and fusion protein expressed and purified by following standard protocols.
To express the recombinant VHH-Fc proteins, 100 ml of Expi293FTM Cells in OPM-CD05 Medium (OPM, cat#81075-001) were cultured to reach a cell density of approximately 3×106 viable cells/ml with viability more than 95%. Plasmids were diluted with OPM-CD05 Medium to a concentration of 1.5 μg/ml in a total volume of 5 ml. Transfection reagent PEI was diluted with OPM-CD05 Medium to a same volume of 5 ml to have a DNA: PEI ratio as 1: 4 (m/m) when the diluted DNA and PEI were mixed. After being incubated at RT for 15 minutes, the DNA/PEI complex were added onto the prepared Expi293FTM cells by swirling gently. Then the cells cultures were placed in a 37 ℃incubator with ≥80%relative humidity and 5%CO2 on an orbital shake. At 24 h post the transfection, 5%peptone (1 mg/ml) and 2%glucose (330 g/l) were added to the culture slowly. After days of culturing, the cell culture supernatant was collected by sequential centrifugations at 1, 200 rpm for 10 min and 3, 900 rpm for 20 min before being used for Protein A purification.
VHH-Fcs were purified with Protein A (BIOON, HZ1011-2) . 1 ml of Protein A slurry were loaded onto a 20-ml column (G-bios, C006197-0025) . After the columns were equilibrated with PBS of 10-fold of CV (column volume) , the cell culture supernatant prepared as above were loaded and flow throw the Protein-Acolumns by gravity for 2 times. After the columns were washed with PBS for 10 times of CV, 10 ml of 0.1 M Glycine-HCl buffer (pH3.0) were used to elute the VHH-Fc proteins. The eluted proteins were neutralized with 100 μl of 1 M (pH 8.5) Tris-HCL buffer the pH was adjusted to 7.4. The Protein A affinity column was regenerated and preserved by washing with PBS, ddH2O and 20%ethanol sequentially. For the eluted protein, it was desalted through an Amicon  UltraCel 30K centrifugal device (Milipore, UFC903016) . Briefly, eluted protein was diluted in 10 ml PBS and concentrated to 1.5 ml by centrifugation for 3 times at least. The final protein solution was formulated in PBS to less than 1 ml and filtrated with 0.22-μm filters.
Purity of VHH-Fcs were analyzed with SDS-PAGE. Briefly, 2 μg protein in 4×LDS Sample buffer was loaded and analyzed with SurePAGE gel in Tris-MOPS SDS buffer (Genscript, M00138) at a constant voltage of 160-V for 50 min. Proteins were visualized with Coomassie stain (TIANGEN, cat#PA101) following the manufacturer’s instructions. The purified proteins were analyzed with 4-12%gradient SDS-PAGE gel under non-reducing or reducing conditions (FIG. 2) .
2.2 ELISAbinding
For binding ELISA, 96-well immunoplates were coated with 100 μl/well 1 μg/ml streptavidin and incubate at 4 ℃ overnight. Wells were washed with PBST for 3 times and blocked with 200 μl of 1%BSA/PBS at RT for 1 h. Washed with PBST for 3 times and add human CFD-biotin, and mouse CFD-biotin (1 μg/ml) 100 μl/well and incubated at RT for 1 h. Plates were washed with PBST for 3 times, 100 μl/well 5-fold serially diluted VHH-Fcs from 10 μg/ml was added. and incubate at RT for 1 h. Plates were washed with PBST for 3 times and add 100 μl goat anti-human Fc-HRP (Sigma, A0170) diluted 1/5000 in 1%BSA/PBST to each well and incubate at RT for 1 h. Plates were then washed as before and add 100 μl TMB substrate and incubate at RT for 15 min. 100 μl per well stop solution was added to stop the reaction, and the plates were read with microplate reader at 450 nm. Recombinant VHH-Fc clones were showed human CFD binding activity (FIG. 3A) , mouse CFD binding activity (FIG. 3B) and cynomolgus CFD binding activity (FIG. 3C) .
2.3 AP activity
For human alternative pathway experiments, all test samples were diluted by PBS and added in duplicate (50 μl/well) to a U-bottom 96-well microtiter plate. At the same time, human complement-preserved serum (Quidel, A113) was diluted to 20%vol/vol in GVBS-EGTA (1×AP buffer: 0.1%gelatin, 145 mM NaCl, 2.5mM sodium barbital, pH7.4 with 10 mM Mg/EGTA) , incubate on ice for 30 minutes and added (50 μl/well) to the rows of the same 96-well plate such that the final concentration of human serum in each well was 10%. Then prepare the rabbit erythrocytes (4×108/ml) were washed three times with 1 ml of 1×AP buffer and resuspended to a final concentration of 5×107/ml (6 ml) in 1×AP buffer. After that, 50 μl aliquots of rabbit erythrocytes (2.5×106 cells) were added to the plate as described above, mixed well, and incubated at 37 ℃ for 30 min. Each plate contained two wells of 50 μl of identically prepared rabbit erythrocytes, incubated with 50 μl PBS +50 μl 1×AP buffer alone as a control for spontaneous hemolysis, two wells containing 100 μl ddH2O serving as a control for 100%lysis, two wells containing 100 μl 10%serum serving as a control for 100%serum lysis, two wells containing 10 mM EDTA (Thermo 15575-038) as a serum blank control. After incubating, the plate was then centrifuged at 600 rpm for 2 min and 100 μl of the supernatant transferred to a new flat bottom 96-well plate. Hemoglobin release was determined at OD 405 nm using a microplate reader, and the percent hemolysis was determined using the following formula: 100× (OD sample -OD of EDTA) / (OD 100%lysis -OD of EDTA) .
For mouse alternative pathway experiments, the process is basically the same as the above process, the difference is that the final concentration of mouse serum is 30%and that of human serum is 10%, and the incubation time is replaced by 30 min for 1 h in mouse alternative pathway assay (FIG. 4) . Some clones showed complement inhibitory activity in human (FIG. 4A) and mouse (FIG. 4B) serum at 500 nM.
Example 3 Bi-paratopic engineering of CFD-binding antibody fragments
3.1 Production of bi-paratopic VHH’s
VHHs from different bins were combined with G4S linker to make bi-paratopic VHH-VHH-Fc fusion proteins as listed in Table 3. Plasmid construction and protein purification procedures can refer to the above. SDS-PAGE analysis and characterization result showed in FIG. 5.
Table 3. List of bi-paratopic VHHs
3.2 Characteristics of bi-paratopic VHH’s
In the target-binding assays, as is shown in FIG. 6, the 6 bi-paratopic VHHs demonstrated negligible effect than those of single VHHs whether in human (FIG. 6A) or mice (FIG. 6B) . In contrast, in the alternative pathway activity assays, as is shown in FIG. 7, bi-paratopic VHH’s shows better complement inhibitory activity than monovalent whether in human (FIG. 7A) or mice (FIG. 7B) .
Example 4 Pathway selectivity of bi-paratopic VHH’s
Pathway selectivity in complement inactivation
Complement inactivation in alternative pathway
For alternative pathway assay, procedure refer to 2.3. AS shown in Figure 8A, bi-paratopic SLN9175, SLN9176 and SLN9177 exhibited alternative pathway complement inhibitory activity with IC50 ～3nM. Eculizumab (Targetmol, T9915) , a recombinant humanized monoclonal antibody (Eculizumab) against the complement protein C5 was as a control also showed inhibitory ability in the AP pathway, with IC50 of 35 nM.
Complement inactivation in classical pathway
For classical pathway assay, all test samples were serially diluted 1: 3 in PBS and added in duplicate (50 μl/well) to a U-bottom 96-well microtiter plate. Human complement-preserved serum (Quidel A113) was diluted to 20%vol/vol with GVB2+buffer (0.1%gelatin, 141 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2, 1.8 mM sodium barbital) (Comp Tech B100) and added (50 μl/well) to the rows of the same 96-well plate such that the final concentration of human serum in each well was 10%. The plate was then incubated at RT for 30 min. Then chicken erythrocytes (1-4×108) based on the samples were washed three times with 1 ml of GVBS2+ buffer and resuspended to a final concentration of 1×108/ml in GVBS2+ buffer. After that, 1-6 ml of the chicken erythrocytes were sensitized by the addition of an anti-chicken red blood cell polyclonal antibody (Rockland, 103-4139) at 3%and the cells were incubated on ice for 15 min with frequent mixing. The cells were then washed twice with 1 ml of GVBS2+ buffer and resuspended to 1×108/ml in GVBS2+ buffer. 30 μl aliquots of chicken erythrocytes (3×106cells) were added to the plate as described above, mixed well, and incubated at 37 ℃ for 30 min. Then, each plate contained two wells of 50 μl of identically prepared chicken erythrocytes, one incubated with 50 μl PBS + 50 μl GVBS 2+ buffer alone (negative control) as a control for spontaneous hemolysis, two wells containing 10 mM EDTA (Thermo 15575-038) as the serum blank and two wells normal NHS as 100%lysis. The plate was then centrifuged at 600 rpm for 2 min and 100 μl of the supernatant transferred to a new flat bottom 96-well plate. Hemoglobin release was determined at OD 405 nm using a microplate reader, and the percent hemolysis was determined using the following formula:
Hemolysis (%) : 100 × (OD sample -OD EDTA blank) / (OD 100%lysis -OD EDTA blank)
As shown in FIG. 8B, bi-paratopic of the alternative pathway specific antibody, exhibited no inhibitory activity in the classical pathway. Eculizumab (Targetmol, T9915) , a recombinant humanized monoclonal antibody against the complement protein C5 was as a control also showed inhibitory ability in the CP pathway, with IC50 of 57 nM.
Complement inactivation in lectin pathway
For lectin pathway assay: 0.3 ml aliquots of mannan solution (0.5 mg/ml) were mixed with an equal volume of CrCl3 solution (0.5 mg/ml) (Sigma 27096-100G-F, Lot#BCCB5331) , an equal volume of the chicken erythrocyte suspension (1×l09 cells) was added, and the mixture was incubated with occasional mixing for 15 min at 25 ℃. Then wash with 1.0 ml of ice-cold GVBS2+. The erythrocytes coated with mannan (ME) (sigma M7604-100MG, Lot#SLOF4977) were washed three times by centrifugation with GVBS2+ (gelatin-Veronal-buffered saline, 5 mM Verona1 buffer, pH 7.4, containing 0.145 M NaC1, 0.1%gelatin, 0.15 M CaCl2 and 0.5 mM MgCl2) (Comp Tech, B100) , resuspended to a final concentration of 5×l07 cells/ml in GVBS2+ and store on ice. All test samples were serially diluted 1: 3 (from 500 nM to 0.2 nM) in PBS and added in duplicate (50 μl/well) to a U-bottom 96-well microtiter plate. Human complement-preserved serum was diluted to 20%vol/vol with GVBS2+ and added (50 μl/well) to the rows of the same 96-well plate, such that the final concentration of human serum in each well was 10%. 100 μl ddH2O or serum only and 50 μl PBS + 50 μl GVBS2+was used as 100%lysis and 0%controls, respectively, 10 mM EDTA was used as serum blank. 50 μl aliquots of chicken erythrocytes (2.5×106 cells) was added to the plate as  described above, mixed well, and incubated at 37 ℃ for 60 min. The plate was then centrifuged at 1,000 g for 2 min and 100 μl of the supernatant transferred to a new flat bottom 96-well plate. Hemoglobin release was determined at OD 405 nm using a microplate reader, and the percent hemolysis was determined using the following formula:
Percent hemolysis (%) : 100 × (OD sample -OD of EDTA) / (OD 100%lysis -OD of EDTA)
The inhibition curves of VHHs was shown in FIG. 8C, bi-paratopic exhibited no inhibitory activity in the lectin pathway showing specificity in the alternative pathway. Eculizumab (Targetmol, T9915) , a recombinant humanized monoclonal antibody against the complement protein C5 was as a control also showed inhibitory ability in the LP pathway, with IC50 of 45 nM.
Example 5 Humanization of the CFD-binding VHH’s
5.1 Production of humanized VHH’s
VHHs from different bins were combined with G4S linker to make bi-paratopic VHH-VHH-Fc fusion proteins as listed in Table 3. Plasmid construction and protein purification procedures can refer to the above. SDS-PAGE analysis and characterization result showed in FIG. 9.
5.2 Binding of humanized VHH’s
VHH humanization was conducted by standard procedures of CDR grafting and structural refinement. Upon the humanization design, recombinant DNA constructs were created to produce recombinant constructs as described above. The humanized sequences with an affinity equal to or better than that of the original VHH to CFD having acceptable expression and stability levels were selected for further development. FIG. 10 indicated that the humanized VHH variant SLN9140 possess similar profile as the parental VHH regarding its binding to human CFD (FIG. 10A) . VHH variant SLN9145 possess similar profile as the parental VHH regarding its binding to human CFD (FIG. 10B) . VHH variant SLN9147 possess similar profile as the parental VHH regarding its binding to human CFD (FIG. 10C) .
5.3 Complement inactivation in alternative pathway of humanized VHHs
For alternative pathway assay, procedure refer to 2.3. Humanized SLN9140 and SLN9147 possess negligible effect of complement inhibition activity in human serum (FIG. 11) , both SLN9145 and humanized VHHs showed no human alternative pathway activity.
5.4 Bi-paratopic engineering of humanized VHHs
Bi-paratopic VHHs with humanized sequences through a G4S linker, by procedures as described above were created. Purified proteins were analyzed with 4-12%SDS-PAGE under non-reduced and reduced conditions (FIG. 12) .
Target-binding ELISA shown in FIG. 13 indicated that such humanized bi-paratopic VHHs had negligible effect on the single VHH by human CFD binding (FIG. 13A) assay and cynomolgus CFD  binding assay (FIG. 13B) . Alternative pathway activity indicated that the SLN7197 and SLN7198 AP activity of bi-paratopic was better than that of single VHH (FIG. 13C) .
Example 6 Fusion protein of VHH to engineered factor H as a dual-inhibitor of alternative pathway
6.1 Fusion protein of VHH to engineered factor H
Truncated CFH (domain 1-4, 19-20) was fused to the C-terminus of SLN9180 to form SLN7180 (SEQ ID NO: 80) and SLN7177 (SEQ ID NO: 77) with his tag and FC tag respectively to make a dual functional recombinant protein inhibiting complement activation. SDS-PAGE analysis and characterization result showed in FIG. 14.
6.2 CFD binding assay with the recombinant antibodies
To test the binding activities of recombinant antibodies to mouse CFD, 96-well microplates were coated with streptavidin (1 μg/ml in PBS, 100 μl/well) and incubated at 4℃ overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 hr. After 3 times of washing with PBST, biotinylated mouse CFD (1 μg/ml in 1%BSA, 100 μl/well) was added and incubate at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, the recombinant antibodies were added and incubated at RT for 1 h (4 nM, 5xdilution, serially diluted in 1%BSA, 100μl/well) . Anti-VHH-HRP or anti-hFC-HRP (1/5000 dilution) were incubated sequentially, before the plates were washed with PBST 3 times and incubated with substrate solution and stop solution as described above for ELISA. As the data shown in FIG. 15, there was no significant difference between SLN7180 and SLN7182 protein binding to mouse CFD (FIG15A) and there was no significant difference between SLN9180 and SLN7177 protein binding to mouse CFD (FIG 15B) .
6.3 Complement inactivation in alternative pathway
For alternative pathway assay, procedure refer to 2.3. As shown in Figure 16, both SLN7177 and SLN7180 exhibited not higher activity than that of CFH only protein. In any case, both SLN7177 and SLN7180 showed mouse alternative pathway inhibition activity at nM level. AP inhibition IC50 of SLN7177 was 60.3nM, and IC50 of SLN7180 was 20nM.
Example 7 SLN9180 fusion with hTf binding VHH (9056VHH)
7.1 Production of Anti-CFD recombinant antibodies with/without 9056VHH domain
Small scale production of recombinant protein SLN12089 (9056- (G4S) 3-9180-G4S-His) was performed using transient transfection of HEK293 cells with the recombinant plasmid using PEI as transfection reagent. Cultures were grown in 100ml shaking flasks media for 5-7 days. Cells were removed by centrifugation and culture supernatants were used for protein purification by Ni-NTA or protein A sepharose. The purified proteins were analyzed with 4-12%gradient SDS-PAGE gel under non-reducing or reducing conditions (FIG. 17) .
7.2 Human transferrin binding assay with the recombinant antibodies
To test the binding activities of recombinant antibodies to human transferrin, 96-well microplates were coated with streptavidin (1 μg/ml in PBS, 100 μl/well) and incubated at 4℃overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, was added and incubate at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, the recombinant antibodies (50nM, 5xdilution, serially diluted in 1%BSA) were premixed with biotinylated human transferrin (2μg/ml in 1%BSA) , added the mixture (100 μl/well) into the plates and incubated at RT for 1h. Then, the secondary anti-6xhis-HRP were incubated sequentially, before the plates were washed with PBST 3 times and incubated with substrate solution and stop solution as described above for ELISA. Data were showed transferrin binding activity (FIG. 18A) , SLN12089 has negligible Tf binding activity compared to the control 9056 VHH.
7.3 CFD binding assay with the recombinant antibodies
To test the binding activities of recombinant antibodies to mouse CFD 96-well microplates were coated with streptavidin (1 μg/ml in PBS, 100 μl/well) and incubated at 4℃ overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 hr. After 3 times of washing with PBST, biotinylated mouse CFD (1 μg/ml in 1%BSA, 100 μl/well) was added and incubate at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, the recombinant antibodies were added and incubated at RT for 1 h (10nM, 3xdilution, serially diluted in 1%BSA, 100 μl/well) . Anti-VHH-HRP (1/5000 dilution) were incubated sequentially, before the plates were washed with PBST 3 times and incubated with substrate solution and stop solution as described above for ELISA. As the data shown in FIG. 18B, there was no significant difference between SLN12089 and SLN9180 protein binding to mouse CFD.
7.4 Inhibiting mouse AP activity with the recombinant antibodies
For alternative pathway assay, procedure refer to 2.3. Analysis of the percentage of hemolysis of the EA in the presence of the fusion proteins demonstrated that There was no significant difference between SLN12089 and SLN9180 in AP inhibitory activity in mouse serum (FIG. 18C) .
Example 8 SLN9180 fusion with VEGF inhibitors
8.1 Production of Anti-CFD recombinant antibodies with/without C2D2VHH domain
Small scale production of recombinant protein SLN8266 (C2D2- (G4S) 3-9180-G4S-His) and SLN7186 (C2D2-hIgG4FC- (G4S) 3-9180) was performed using transient transfection of HEK293 cells with the recombinant plasmid using PEI as transfection reagent. Cultures were grown in 100ml shaking flasks media for 5-7 days. Cells were removed by centrifugation and culture supernatants were used for protein purification by Ni-NTA or protein A sepharose. The purified proteins were analyzed with 4-12%gradient SDS-PAGE gel under non-reducing or reducing conditions (FIG. 19) .
8.2 CFD binding assay with the recombinant antibodies
To test the binding activities of recombinant antibodies to mouse CFD, 96-well microplates were coated with streptavidin (1 μg/ml in PBS, 100 μl/well) and incubated at 4℃ overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 hr. After 3 times of washing with PBST, biotinylated mouse CFD (1 μg/ml in 1%BSA, 100 μl/well) was added and incubate at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, the recombinant antibodies were added and incubated at RT for 1 h (4 nM, 5xdilution, serially diluted in 1%BSA, 100μl/well) . Anti-VHH-HRP or anti-hFC-HRP (1/5000 dilution) were incubated sequentially, before the plates were washed with PBST 3 times and incubated with substrate solution and stop solution as described above for ELISA. As the data shown in FIG. 20, there was no significant difference between SLN8266 and SLN7182 protein binding to mouse CFD (FIG. 20A) and there was no significant difference between SLN9180 and SLN7186 protein binding to mouse CFD (FIG. 20B) .
8.3 In vitro binding of SLN8266 and SLN7186 to human and mouse VEGFA
ELISAs were performed to determine whether proteins bind directly to VEGF. Briefly, the wells of a 96-well ELISA plate were coated with SLN12057 (Linno) and incubated at 4℃ overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, the purified antibodies with his tag include SLN7182, SLN8125, SLN8266 and the purified antibodies with FC tag include SLN6073, SLN9180, SLN7186 (serially diluted in BSA, starting from 75 nM) were added and incubated at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, biotinylated human or mouse VEGFA protein (0.5 μg/ml in BSA, 100 μL/well) was added and incubate at RT for 1 h. After 3 times of washing with PBST, SA-HRP were added to each well for incubation of 1 h. After 3 times of washing with PBST, stop reagent for TMB Substrate was added to each well, and OD absorption at 450 nm was measured. The data was analyzed by sigmoidal curve fitting using GraphPad Prism 8.0. As shown in FIG. 21 and FIG. 22, SLN8266 exhibited strong binding to human or mouse VEGFA, respectively and FIG. 21 (A and B) , there was no significant difference in binding activity after fusion with SLN9180. As shown in FIG. 22 (A and B) , SLN8176 exhibited strong binding to human or mouse VEGF respectively, there was no significant difference in binding activity after fusion with SLN9180. The Negative controls SLN7182 and SLN9180 showed no VEGFA binding activity. (Human VEGF121: Accession#: P15692-9; VEGF120: Accession#: Q00731-3)
8.4 Blocking the interaction between VEGFA and VEGFR2 of SLN8266 and SLN7186
ELISAs were performed to determine whether proteins can block the interaction between VEGFA and VEGFR2. Briefly, the wells of a 96-well ELISA plate were coated with streptavidin (1 μg/ml in CBS, 100 μl/well) and incubated at 4℃ overnight. After 3 times of washing with PBST, the plates were blocked with 1%BSA in PBST at RT for 1 hour. After 3 times of washing with PBST, biotinylated human or mouse VEGF protein (0.07 μg/mL or 0.21 in BSA) was added and incubate at RT for 1 hour. After 3 times of washing with PBST, human or mouse VEGFR2 (0.14μg/mL in BSA) mixed with purified antibodies with his tag include SLN7182, SLN8125, SLN8266 and the purified antibodies with FC tag include SLN6073, SLN9180, SLN7186 (aserially diluted in BSA, starting from 75 nM) was added and incubate at RT for 1 hour. After 3 times of washing with PBST, anti- mouse IgG Fc-HRP (Abcam, lot#GR3396448-2) were added to each well for incubation of 1 hour. After 3 times of washing with PBST, stop reagent for TMB Substrate was added to each well, and OD absorption at 450 nm was measured. The data was analyzed by sigmoidal curve fitting using GraphPad Prism 8.0. As shown in FIG. 22 (C and D) , SLN8266 can block the interaction between human or mouse VEGFA and human or mouse VEGFR2 effectively, there was no significant difference in binding activity after fusion with SLN9180. As shown in FIG. 22 (C and D) , SLN7186 can block the interaction between human or mouse VEGFA and human or mouse VEGFR2 effectively. There was no significant difference in binding activity after fusion with SLN9180. The negative controls SLN7182 and SLN9180 can’t block the interaction between human or mouse VEGFA and human or mouse VEGFR2 (FIG. 21 (C&D) and FIG. 22 (C&D) ) . (hVEGFR2: Accession#: P35968-1; mVEGFR2: Accession#: P35918-1)
8.5 Inhibition of the alternative complement pathway by SLN8266 and SLN7186
For alternative pathway assay, procedure refer to 2.3. Analysis of the percentage of hemolysis of the EA in the presence of the fusion proteins demonstrated that there was no significant difference between SLN8266 and SLN7182 in AP inhibitory activity in mouse serum (FIG. 23A) , there was no significant difference between SLN7186 and SLN9180 in AP inhibitory activity in mouse serum (FIG. 23B) . The Negative controls SLN8125 and SLN6073 cannot inhibit the AP activity in the mouse serum.
Sequences of the CFD-binding VHH’s

Sequences of bi-paratopic VHH’s for hCFD binders
Sequences of bi-paratopic VHH’s for mCFD binders
Sequences of humanized SLN9140 VHH’s
Sequences of humanized SLN9145 VHH’s
Sequences of humanized SLN9145 VHH’s
Sequences of bi-paratopic humanized VHH’s for hCFD binders
Sequences of fusion protein

While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims (66)

  1. An isolated antigen binding protein binding to factor D, wherein said isolated antigen binding protein comprises CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; said CDR2 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14, and said CDR3 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  2. The isolated antigen binding protein of claim 1, wherein said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
    (1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
    (2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
    (3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
    (4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
    (5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
    (6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
  3. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-2, wherein said isolated antigen binding protein comprises FR1, FR2, FR3 and FR4; said FR1 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29; said FR2 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36; said FR3 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、 SEQ ID NO: 44、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 46、 SEQ ID NO: 47、 SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 49, and said FR4 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 50、 SEQ ID NO: 51、 SEQ ID NO: 52、 SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55.
  4. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-3, comprising FR1, FR2, FR3 and FR4, and said isolated antigen binding protein comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
    (1) FR1: SEQ ID NO: 21, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 37, FR4: SEQ ID NO: 50;
    (2) FR1: SEQ ID NO: 23, FR2: SEQ ID NO: 31, FR3: SEQ ID NO: 41, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (3) FR1: SEQ ID NO: 25, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 44, FR4: SEQ ID NO: 53;
    (4) FR1: SEQ ID NO: 27, FR2: SEQ ID NO: 34, FR3: SEQ ID NO: 47, FR4: SEQ ID NO: 54;
    (5) FR1: SEQ ID NO: 28, FR2: SEQ ID NO: 35, FR3: SEQ ID NO: 48, FR4: SEQ ID NO: 55;
    (6) FR1: SEQ ID NO: 29, FR2: SEQ ID NO: 36, FR3: SEQ ID NO: 49, FR4: SEQ ID NO: 55;
    (7) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 38, FR4: SEQ ID NO: 51;
    (8) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 39, FR4: SEQ ID NO: 51;
    (9) FR1: SEQ ID NO: 22, FR2: SEQ ID NO: 30, FR3: SEQ ID NO: 40, FR4: SEQ ID NO: 51;
    (10) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (11) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (12) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (13) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (14) FR1: SEQ ID NO: 24, FR2: SEQ ID NO: 31, FR3: SEQ ID NO: 43, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (15) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 42, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (16) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 45, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (17) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 32, FR3: SEQ ID NO: 46, FR4: SEQ ID NO: 52;
    (18) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 45, FR4: SEQ ID NO: 52;and
    (19) FR1: SEQ ID NO: 26, FR2: SEQ ID NO: 33, FR3: SEQ ID NO: 46, FR4: SEQ ID NO: 52.
  5. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-4, wherein said isolated antigen binding protein comprises a heavy chain variable region VH, which comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
  6. The isolated antigen binding protein of claim 1-5, wherein said heavy chain variable region is VHH.
  7. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-6, wherein said isolated antigen binding protein comprises an antibody heavy-chain constant region.
  8. The isolated antigen binding protein of claim 1-7, wherein said heavy-chain constant region comprises a human Fc region.
  9. The isolated antigen binding protein of claim 8, wherein said human Fc region comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92.
  10. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-9, wherein said isolated antigen binding protein is directly or indirectly linked to a second antigen-binding domain.
  11. The isolated antigen binding protein of claim 10, wherein said second antigen-binding domain is indirectly linked to the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-9 by a linker.
  12. The isolated antigen binding protein of claim of 11, wherein said linker is a poly-glycine linker.
  13. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 10-12, wherein said linker comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  14. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 10-13, wherein said second antigen-binding domain can also bind to factor D.
  15. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 10-14, wherein said second antigen-binding domain comprises CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; said CDR2 comprises an amino acid  sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14, and said CDR3 comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  16. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 10-15, wherein said second antigen-binding domain comprises CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
    (1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
    (2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
    (3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
    (4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
    (5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
    (6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
  17. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 10-16, wherein said second antigen-binding domain comprises a heavy chain variable region VH, which comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 56-74.
  18. The isolated antigen binding protein of claim 17, wherein said heavy chain variable region is VHH.
  19. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 10-18, wherein said second antigen-binding domain comprises an amino acid sequence as set forth in any one of claims of SEQ ID NO: 56-74.
  20. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-19, comprising an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
  21. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-20, wherein said isolated antigen binding protein comprises an antibody or an antigen binding fragment thereof.
  22. The isolated antigen binding protein of claim of 21, wherein said isolated antigen binding fragment comprises Fab, Fab’, F (ab) 2, Fv fragments, F (ab') 2, scFv, di-scFv, VHH and/or dAb.
  23. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 21-22, wherein said antibody is selected from the group consisting of: monoclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  24. A bi-paratopic antigen-binding protein comprising a first antigen-binding domain binding to factor D and a second antigen-binding domain binding to factor D, wherein said first antigen-binding domain comprises CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
    (1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
    (2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
    (3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
    (4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
    (5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
    (6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
  25. The bi-paratopic antigen-binding protein of claim 24, wherein said second antigen-binding domain comprises CDR1, CDR2 and CDR3, said CDR1, CDR2 and CDR3 comprising any set of amino acid sequences selected from the group consisting of:
    (1) CDR1: SEQ ID NO: 3 CDR2: SEQ ID NO: 9, CDR3: SEQ ID NO: 15;
    (2) CDR1: SEQ ID NO: 4, CDR2: SEQ ID NO: 10, CDR3: SEQ ID NO: 16;
    (3) CDR1: SEQ ID NO: 5, CDR2: SEQ ID NO: 11, CDR3: SEQ ID NO: 17;
    (4) CDR1: SEQ ID NO: 6, CDR2: SEQ ID NO: 12, CDR3: SEQ ID NO: 18;
    (5) CDR1: SEQ ID NO: 7, CDR2: SEQ ID NO: 13, CDR3: SEQ ID NO: 19; and
    (6) CDR1: SEQ ID NO: 8, CDR2: SEQ ID NO: 14, CDR3: SEQ ID NO: 20.
  26. The bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-25, wherein said first antigen-binding domain is directly or indirectly linked to the second antigen-binding domain.
  27. The bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-26, wherein said first antigen-binding domain is indirectly linked to the second antigen-binding domain by a linker.
  28. The bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-27, wherein said linker is a poly-glycine linker.
  29. The bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-28, wherein said linker comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  30. The bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-29, comprising an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 75-82.
  31. A fusion protein, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of SEQ ID NO: 56-74 or the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of SEQ ID NO: 75-82.
  32. The fusion protein of claim 31, comprising a functionally active protein.
  33. The fusion protein of any one of claims of 31-32, wherein said isolated antigen binding protein is directly or indirectly linked to said functionally active protein.
  34. The fusion protein of claim of 33, wherein said functionally active protein is indirectly linked by a linker.
  35. The fusion protein of claim of 34, wherein said linker is a poly-glycine linker.
  36. The fusion protein of any one of claims of 33-34, wherein said linker comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 93.
  37. The fusion protein of any one of claims of 32-36, wherein said functionally active protein is a factor H protein.
  38. The fusion protein of claim of 37, wherein said factor H comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 88.
  39. The fusion protein of any one of claims of 37-38, comprising an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 83 and SEQ ID NO: 84.
  40. The fusion protein of any one of claims of 32-36, wherein said functionally active protein is a transferrin binding protein.
  41. The fusion protein of claim 40, wherein said transferrin binding protein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 89.
  42. The fusion protein of any one of claims of 40-41, comprising an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 85.
  43. The fusion protein of any one of claims of 32-36, wherein said functionally active protein is a VEGF inhibiting protein.
  44. The fusion protein of claim 43, wherein said VEGF inhibiting protein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 90.
  45. The fusion protein of any one of claims of 43-44, comprising an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87.
  46. A polypeptide, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23 or the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30.
  47. An immunoconjugate, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46.
  48. An isolated nucleic acid molecule, encoding the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46.
  49. A vector, comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 48.
  50. A cell, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the isolated nucleic acid molecule of claim 48 and/or the vector of claim 49.
  51. A method of producing the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46, comprising culturing the cell of claim 50 to express the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46.
  52. A method for detecting factor D, wherein the method comprises using the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46.
  53. A detection kit for factor D, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46.
  54. Use of the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46 in the preparation of a kit.
  55. A pharmaceutical composition, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of claim 49, the cell of claim 50, and/or a pharmaceutically acceptable adjuvant and/or excipient.
  56. A pharmaceutical combination, comprising the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30 or the polypeptide of claim 46.
  57. A method of inhibiting alternative complement pathway, comprising administering an effective amount of the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of claim 49, the cell of claim 50, the pharmaceutical composition of claim 51, and/or the pharmaceutical combination of claim 52, and/or a pharmaceutically acceptable therapeutic agent.
  58. Use of the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of  claim 49, the cell of claim 50, the pharmaceutical composition of claim 51, and/or the pharmaceutical combination of claim 52, in the manufacture of a medicament, wherein said medicament is used in the prevention, remission and /or the treatment of diseases.
  59. The use of claim of claim 58, wherein said diseases are caused by factor D or alternative pathway.
  60. The use of claim of claim 58, wherein said diseases include thrombocytopenic purpura (TTP) , hemolytic uremic syndrome (HUS) , atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , C3 glomerulopathy (C3G) , asthma, Gaucher disease, Hidradentitis suppurativa, Behcet's disease, dermatomyositis, severe burn, early sepsis, pneumococcal meningitis, Alzheimer's disease, cancer metastasis, acute respiratory distress syndrome (ARDS) , acute lung injury (ACI) , transfusion-related lung injury (TRALI) , hemodialysis induced thrombosis, epidermolysis bullosa acquisita (EBA) , uveitis, Parkinson's disease, primary biliary atresia, antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) vasculitis, retinal degeneration, broad thrombotic microangiopathy (TMA) , broad TMA (APS) , hematopoietic stem cell therapy (HSCT) TMA, age-related macular degeneration (AMD) , pre-eclampsia, hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet (HELLP) syndrome, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome (APS) , relapsing polychondritis, ischemic injury, stroke, graft versus host disease (GvHD) , chronic obstructive pulmonary disease (COPD) , emphysema, atherosclerosis, acute coronary syndrome, hemorrhagic shock, rheumatoid arthritis, dialysis (cardiovascular risk) , cardiovascular disease, placental malaria, antiphospholipid syndrome (APS) pregnancy loss, encephalitis, brain injury, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antibody encephalitis, malaria hemolytic crisis, abdominal aortic aneurysm (AAA) , or thoracoabdominal aortic aneurysm (TAA) .
  61. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of claim 49, the cell of claim 50, the pharmaceutical composition of claim 51, and/or the pharmaceutical combination of claim 52, for use in the prevention, remission and /or the treatment of diseases.
  62. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of claim 49, the cell of claim 50, the pharmaceutical composition of claim 51, and/or the pharmaceutical combination of claim 52, wherein said diseases are caused by factor D or alternative pathway.
  63. The isolated antigen binding protein of any one of claims of 11-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of claim 49, the cell of claim 50, the pharmaceutical composition of claim 51, and/or the pharmaceutical combination of claim 52, wherein said diseases include IgA nephritis (IgAN) , thrombocytopenic purpura (TTP) , hemolytic uremic syndrome (HUS) , atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , C3 glomerulopathy (C3G) , asthma, Gaucher disease, Hidradentitis suppurativa, Behcet's disease, dermatomyositis, severe burn, early sepsis, pneumococcal meningitis, Alzheimer's disease, cancer metastasis,  acute respiratory distress syndrome (ARDS) , acute lung injury (ACI) , transfusion-related lung injury (TRALI) , hemodialysis induced thrombosis, epidermolysis bullosa acquisita (EBA) , uveitis, Parkinson's disease, primary biliary atresia, antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) vasculitis, retinal degeneration, broad thrombotic microangiopathy (TMA) , broad TMA (APS) , hematopoietic stem cell therapy (HSCT) TMA, age-related macular degeneration (AMD) , pre-eclampsia, hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet (HELLP) syndrome, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome (APS) , relapsing polychondritis, ischemic injury, stroke, graft versus host disease (GvHD) , chronic obstructive pulmonary disease (COPD) , emphysema, atherosclerosis, acute coronary syndrome, hemorrhagic shock, rheumatoid arthritis, dialysis (cardiovascular risk) , cardiovascular disease, placental malaria, antiphospholipid syndrome (APS) pregnancy loss, encephalitis, brain injury, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antibody encephalitis, malaria hemolytic crisis, abdominal aortic aneurysm (AAA) , or thoracoabdominal aortic aneurysm (TAA) .
  64. A method of preventing, relieving or treating diseases, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the isolated antigen binding protein of any one of claims of 1-23, the bi-paratopic antigen-binding protein of any one of claims of 24-30, the polypeptide of claim 46, the immunoconjugate of claim 47, the isolated nucleic acid molecule of claim 48, the vector of claim 49, the cell of claim 50, the pharmaceutical composition of claim 51, and/or the pharmaceutical combination of claim 52.
  65. The method of claim of 64, wherein said diseases are caused by factor D or alternative pathway.
  66. The method of any one of claims of 64-65, wherein said diseases include IgA nephritis (IgAN) , thrombocytopenic purpura (TTP) , hemolytic uremic syndrome (HUS) , atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) , paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) , C3 glomerulopathy (C3G) , asthma, Gaucher disease, Hidradentitis suppurativa, Behcet's disease, dermatomyositis, severe burn, early sepsis, pneumococcal meningitis, Alzheimer's disease, cancer metastasis, acute respiratory distress syndrome (ARDS) , acute lung injury (ACI) , transfusion-related lung injury (TRALI) , hemodialysis induced thrombosis, epidermolysis bullosa acquisita (EBA) , uveitis, Parkinson's disease, primary biliary atresia, antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) vasculitis, retinal degeneration, broad thrombotic microangiopathy (TMA) , broad TMA (APS) , hematopoietic stem cell therapy (HSCT) TMA, age-related macular degeneration (AMD) , pre-eclampsia, hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet (HELLP) syndrome, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome (APS) , relapsing polychondritis, ischemic injury, stroke, graft versus host disease (GvHD) , chronic obstructive pulmonary disease (COPD) , emphysema, atherosclerosis, acute coronary syndrome, hemorrhagic shock, rheumatoid arthritis, dialysis (cardiovascular risk) , cardiovascular disease, placental malaria, antiphospholipid syndrome (APS) pregnancy loss, encephalitis, brain injury, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antibody encephalitis, malaria hemolytic crisis, abdominal aortic aneurysm (AAA) , or thoracoabdominal aortic aneurysm (TAA) .
PCT/CN2024/114591 2024-04-02 2024-08-26 Cfd-binding antibody fragments and uses thereof Pending WO2025208782A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2024/085423 2024-04-02
CN2024085423 2024-04-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025208782A1 true WO2025208782A1 (en) 2025-10-09

Family

ID=97265996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2024/114591 Pending WO2025208782A1 (en) 2024-04-02 2024-08-26 Cfd-binding antibody fragments and uses thereof

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025208782A1 (en)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009134711A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-factor d antibodies and uses thereof
US20120322975A1 (en) * 1998-02-20 2012-12-20 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding antibodies that bind factor d
CN106905431A (en) * 2017-04-10 2017-06-30 旭华（上海）生物研发中心有限公司 Monoclonal antibody of the anti-human complement D factors and application thereof
US20180334496A1 (en) * 2017-04-14 2018-11-22 Kodiak Sciences Inc. Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof
CN110240652A (en) * 2019-06-05 2019-09-17 百奥泰生物制药股份有限公司 Anticomplement D factor antibody and its application
WO2022040149A1 (en) * 2020-08-18 2022-02-24 Omeros Corporation Monoclonal antibodies, compositions and methods for detecting complement factor d
WO2022215054A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies targeting complement factor d and uses therof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120322975A1 (en) * 1998-02-20 2012-12-20 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding antibodies that bind factor d
WO2009134711A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-factor d antibodies and uses thereof
CN106905431A (en) * 2017-04-10 2017-06-30 旭华（上海）生物研发中心有限公司 Monoclonal antibody of the anti-human complement D factors and application thereof
US20180334496A1 (en) * 2017-04-14 2018-11-22 Kodiak Sciences Inc. Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof
CN110240652A (en) * 2019-06-05 2019-09-17 百奥泰生物制药股份有限公司 Anticomplement D factor antibody and its application
WO2022040149A1 (en) * 2020-08-18 2022-02-24 Omeros Corporation Monoclonal antibodies, compositions and methods for detecting complement factor d
WO2022215054A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies targeting complement factor d and uses therof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019238012A1 (en) Antibody capable of blocking cd47-sirpa interaction and application thereof
US7718174B2 (en) Anti-HGF/SF humanized antibody
JP7684803B2 (en) Polypeptides that bind to complement component C5 or serum albumin and fusion proteins thereof
US20220185875A1 (en) Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2
US10865247B2 (en) Anti-human CD69 antibody, and use thereof for medical purposes
KR20200119846A (en) Anti-B7 H4 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2004041863A2 (en) Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
JP2023052217A (en) Bispecific antibody against a-syn/IGF1R and uses thereof
MX2014009864A (en) Cx3cr1-binding polypeptides.
JP7348676B2 (en) Bispecific antibody against α-syn/IGF1R and its uses
CN114685666B (en) Anti-mesothelin nanobody and application thereof
CN117280034A (en) Mesothelin-binding molecules and their applications
AU2012293720A1 (en) Constitutively active uPAR variants and their use for the generation and isolation of inhibitory antibodies
AU2012294431A1 (en) Antibodies binding to phosphorylcholine (PC) and/or PC conjugates
WO2024017331A1 (en) Anti-adrenomedulin non-neutralizing antibody, method for preparing same, and use thereof
WO2022148480A1 (en) ANTIGEN-BINDING PROTEIN TARGETING STAPHYLOCOCCUS AUREUS α-HEMOLYSIS AND APPLICATION THEREOF
WO2025208782A1 (en) Cfd-binding antibody fragments and uses thereof
WO2022141378A1 (en) Anti-pd-1 single-domain antibody
US12162931B2 (en) Properdin binding protein and use thereof
WO2024109126A1 (en) Properdin binding protein and use thereof
US20250034239A1 (en) Proteins and use thereof
IL311153A (en) Bispecific antibody and application thereof
CN114641307A (en) anti-CD 19 antibodies and uses thereof
TWI843182B (en) An anti-B7-H4 antibody and its preparation method and application
TW202540175A (en) Use of anti-adrenomedullin antibodies in the prevention or treatment of stroke

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24933710

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1