BRPI0806790B1

BRPI0806790B1 - microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BRPI0806790B1
Application number: BRPI0806790A
Authority: BR
Inventors: Takikawa Rie; Hara Yoshihiko
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2017-02-14
Also published as: CN101627110B; US20100062496A1; EP2116595B1; EP2116595A1; JPWO2008090770A1; WO2008090770A1; ES2631360T3; CN101627110A; JP5540504B2; KR20090112719A; KR101730837B1; EP2116595A4; BRPI0806790A2; US7919284B2

Abstract

microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido. um l-aminoácido pode ser produzido por: cultivar, em um meio de cultura, um microorganismo pertencente à família enterobacteriaceae, a qual é capaz de produzir o l-aminoácido e é modificada de modo que o sistema kdp possa ser potencializado, por esse meio produzindo e acumulando o l-aminoácido no meio de cultura ou em uma célula do microorganismo; e coletando-se o l-aminoácido do meio de cultura ou da célula.

Description

“MICROORGANISMO, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a um método para produzir um L-aminoácido com o uso de um microorganismo, em particular métodos para produzir um L-aminoácido em que dito L-aminoácido seja o ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-triptofano ou similar. Estes são L-aminoácidos industrialmente úteis, isto é, o ácido L-glutâmico serve como um aditivo para condimento, e a L-lisina, a L-treonina e o L-triptofano servem como aditivos para a alimentação animal, ingredientes alimentares para a saúde, infusões de aminoácidos, e assim por diante.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Os L-aminoácidos são industrialmente produzidos por fermentação, com o uso de vários microorganismos. Por exemplo, o ácido L-glutâmico é produzido principalmente pela fermentação utilizando-se bactérias produtoras do ácido L-glutâmico das assim chamadas bactérias corineiforme pertencente aos gêneros Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium, ou suas cepas mutantes (ver, por exemplo, o documento não patente 1). Como métodos para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação com o uso de outras cepas bacterianas, métodos de uso de um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium ou similar (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 1), métodos de uso de um microorganismo pertencente ao gênero Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida ou similar (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 2), métodos de uso de um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (correntemente referido como Enterobacter aerogenes) ou similar (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 3), métodos de uso de uma cepa mutante de Escherichia coli (referir-se, por exemplo, ao documento de Patente 1), e assim por diante, são conhecidos. Além disso, métodos para produzir o ácido L-glutâmico com o uso de um microorganismo pertencente aos gêneros Klebsiella, Erwinia, Pantoea ou Enterobacter, são também apresentados (referir-se, por exemplo, aos documentos de Patente 2 a 4).

Tais métodos para produzir substâncias alvo tais como os L-aminoácidos por fermentação com o uso de um microorganismo como descrito acima, incluem métodos que usam um microorganismo do tipo selvagem (cepa tipo selvagem), métodos de uso de uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa do tipo selvagem, métodos de uso de uma cepa mutante de regulação metabólica derivada de uma cepa do tipo selvagem como uma cepa resistente a qualquer dos vários medicamentos, métodos de uso de uma cepa tendo propriedades tanto da cepa auxotrófica quanto da cepa mutante de regulação metabólica, e assim por diante.

Nos últimos anos, as técnicas de DNA recombinantes são usadas na produção de substâncias alvo mediante fermentação. Por exemplo, a produtividade do L-aminoácido de um microorganismo é melhorada pela intensificação da expressão de um gene codificando uma enzima biossintética do L-aminoácido (Documentos de Patentes 5 e 6), ou pela intensificação do influxo de uma fonte de carbono dentro de um sistema de biossíntese de L-aminoácido (Documento de Patente 7). O sistema kdp é uma ATPase do tipo P que funciona para absorver íons de potássio (Documento não Patente 2). O sistema kdp é codificado pelo óperon kdp, e sua expressão é induzida quando a concentração dos íons de potássio em um meio é baixa, ou quando a cultura é realizada sob condições hiperosmótica (Documento não Patente 3). Além disso, sabe-se que a expressão é controlada por KdpD e KdpE que constituem um dos sistema de controle binário (Documento não Patente 4). Entretanto, a relação entre a intensificação do sistema kdp e a produção do L-aminoácido não foi até agora pesquisada.

Documento de Patente 1: Patente Japonesa Aberta ao Público (KOKAI) na 5-244970 Documento de Patente 2: Patente U.S. rr 3.563.857 Documento de Patente 3: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU)n2 32-9393 Documento de Patente 4: Patente Japonesa Aberta ao Público n~ 2000-189175 Documento de Patente 5: Patente U.S. na 5.168.056 Documento de Patente 6: Patente U.S. na 5.776.736 Documento de Patente 7: Patente U.S. na 5.906.925 Documento não Patente 1: Kunihiko Akashi et al., “Amino acidfermentatiorí\ pp. 195-215, 1986, Japan Scientific Societies Press Documento não Patente 2: Laimonis A. Laimins, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, julho de 1978, 75(7): 3216-3219 Documento não Patente 3: Laimonis A. Laimins, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, janeiro de 1981, 78(1): 464-468 Documento não Patente 4: Mark O. Walderhaug, J. Bacteriol., abril de 1992, 174 (7): 2152-2159 APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO OBJETO PARA SER ALCANÇADO PELA INVENÇÃO Um objeto da presente invenção é prover um microorganismo que pertença à família Enterobacteriaceae e seja capaz de eficientemente produzir um L-aminoácido, e prover um método de produzir eficientemente um L-aminoácido com o uso de um tal microorganismo. MEIOS PARA SE ALCANÇAR O OBJETO Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas a fim de alcançar o objeto acima mencionado e, como um resultado, observaram que os L-aminoácidos poderíam ser eficientemente produzidos mediante o uso de um microorganismo do qual o sistema kdp foi intensificado, e assim concluíram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção provê os seguintes itens: (1) um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, o qual tem a capacidade de produzir L-aminoácidos e foi modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado. (2) O microorganismo acima mencionado, em que o sistema kdp é intensificado pelo aumento da expressão do óperon de kdp ou um ou mais genes constituindo o óperon de kdp, e/ou aumentando a translação do óperon de kdp ou os genes. (3) O microorganismo acima mencionado, em que o sistema kdp é intensificado pelo aumento do número de cópias do óperon de kdp ou um ou mais genes constituindo o óperon de kdp, ou modificando uma sequência de controle da expressão do óperon. (4) O microorganismo acima mencionado, em que o óperon de kdp contenha pelo menos os genes kdp A, kdpB e kdpC. (5) O microorganismo acima mencionado, em que o gene kdpA é um gene codificando uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 8 ou a subunidade A do sistema kdp tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 8 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos. (6) O microorganismo acima mencionado, em que o gene kdpB é um gene codificando uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 ou 9 ou a subunidade B do sistema kdp tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 9 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos. (7) O microorganismo acima mencionado, em que o gene kdpC é um gene codificando uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 10 ou a subunidade C do sistema kdp tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 10 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos. (8) O microorganismo acima mencionado, em que o óperon de kdp é um DNA definido em qualquer um dos seguintes itens (a) a (d): (a) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 546 a 4871 da SEQ ID NO: 1, (b) um DNA que hibridiza com a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 546 a 4871 da SEQ ID NO: 1 ou uma sonda preparada com a sequência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificando o sistema kdp, (c) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7, (d) um DNA que hibridiza com a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7 ou uma sonda preparada da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes e codificando o sistema kdp. (9) O microorganismo acima mencionado, em que o L-aminoácido é uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano e L-cisteína. (10) O microorganismo acima mencionado, em que o microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae é uma bactéria Escherichia, uma bactéria Enterobacter ou uma bactéria Pantoea. (11) Um método para produzir um L-aminoácido, que compreende cultivar o microorganismo acima mencionado em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou nas células, e coletar o L-aminoácido do meio ou das células. (12) O método supramencionado, em que o L-aminoácido constitui uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L~ triptofano e L-cisteína.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um desenho que mostra a estrutura do plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER. A Figura 2 é um desenho que mostra a construção do plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER. A Figura 3 é um desenho que mostra a estrutura da região do cromossoma de P. ananatis localizando-se a montante do gene LacZ. A Figura 4 é um gráfico que mostra o crescimento da cepa substituída pelo promotor do óperon de kdp na cultura sob condição acídica no tubo de teste. A Figura 5 é um gráfico que mostra a produtividade do ácido L-glutâmico da cepa substituída pelo promotor do óperon de kdp. A Figura 6 é um desenho que mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos do KdpA de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 8) e de Escherichia coli (SEQ ID NO: 2), e da sequência de consenso delas (SEQ ID NO: 57). A Figura 7 é um desenho que mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos do K.dpB de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 9) e de Escherichia coli (SEQ ID NO: 3), e da sequência de consenso delas (SEQ ID NO: 58). A Figura 8 é um desenho que mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos do KdpC de Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 10) e de Escherichia coli (SEQ ID NO: 4), e da sequência de consenso delas (SEQ IDNO: 59).

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Daqui por diante a presente invenção será explanada em detalhes.

<1> MICROORGANISMO DA PRESENTE INVENÇÃO O microorganismo da presente invenção é um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, a qual tem uma capacidade de produzir o L-aminoácido e foi modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado. A capacidade de produzir o L-aminoácido aqui referida significa uma capacidade do microorganismo da presente invenção para produzir e acumular um L-aminoácido em um meio ou células em uma quantidade em que o L-aminoácido possa ser coletado do meio ou das células, quando o microorganismo seja cultivado no meio. O microorganismo da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir duas ou mais espécies de L-aminoácidos. O microorganismo tendo capacidade de produzir L-aminoácidos pode ser um microorganismo inerentemente tendo uma capacidade de produzir L-aminoácidos, ou um microorganismo obtido pela modificação de tais microorganismos como descrito abaixo, de modo a ter uma capacidade de produzir L-aminoácidos com o uso de um método de mutação ou de técnicas de DNA recombinantes. O tipo do L-aminoácido não é particularmente limitado, e os exemplos incluem aminoácidos básicos tais como L-lisina, L-omitina, L-arginina, L-histidina e L-citrulina, aminoácidos alifáticos tais como a L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina e L-glicina, aminoácidos que sejam ácidos hidroximonoaminocarboxílicos tais como a L-treonina e a L-serina, aminoácidos cíclicos tais como a L-prolina, aminoácidos aromáticos tais como a L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano, aminoácidos contendo enxofre tais como a L-cisteína, L-cistina e L-metionina, e aminoácidos acídicos tais como o ácido L-glutâmico, o ácido L-aspártico, a L-glutamina e a L-asparagina. O ácido L-glutâmico, a L-lisina, a L-treonina e o L-triptofano são especialmente preferidos. O microorganismo da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir duas ou mais espécies de aminoácidos.

<1-1> TRANSMISSÃO DA CAPACIDADE DE PRODUZIR L-AMINOÁCIDOS

Exemplos dos métodos para transmitir a capacidade de produzir L-aminoácidos e microorganismos utilizáveis na presente invenção, aos quais a capacidade de produzir L-aminoácidos é comunicada, serão descritos abaixo. Entretanto, o microorganismo não fica limitado a estes, contanto que um microorganismo tendo a capacidade de produzir L-aminoácidos seja usado.

Microorganismos usados para a presente invenção incluem opcionalmente substituído microorganismos pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, ou similar, contanto que eles pertençam à família Enterobacteriaceae e tenham uma capacidade de produzir L-aminoácido. Em particular as bactérias classificadas dentro da família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada pela base de dados da NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http .7Avww.ncbi.nlm.mh.gov/Taxonomy/BrowserAvwwtax.cgi?id=91347 ) podem ser usadas. Como cepas precursoras das Enterobacteriaceae que devam ser modificadas, as bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Erwinia ou Klebsiella são preferivelmente usadas. A cepa precursora das bactérias de Escherichia usadas de modo a se obter uma bactéria de Escherichia da presente invenção, não é particularmente limitada. Aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Backmann, B. J., 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, pp. 2460-2488, Tabela 1, em F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Segunda Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.) podem ser utilizadas. Entre elas, por exemplo, a Escherichia coli é exemplificada. Exemplos de Escherichia coli incluem a cepa W3110 (ATCC nfi 27325), a cepa MG1655 (ATCC n° 47076), e assim por diante, as quais são derivadas de uma cepa protótipo do tipo selvagem, a cepa Kl2.

Estas cepas acham-se disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC) (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América) Isto é, cada cepa recebe um único número de registro (http://www.atcc.org/). As cepas podem ser ordenadas pelo uso deste número de registro. O número de registro de cada cepa acha-se listado no catálogo da ATCC.

Exemplos das bactérias Enterobacter incluem, Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e assim por diante. Exemplos das bactérias Pantoea incluem a Pantoea ananatis. Nos últimos anos, algumas bactérias de Enterobacter agglomerans foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii, com base na análise da sequência de nucleotídeos dos rRNA 16S etc. Na presente invenção, o microorganismo pode pertencer ou ao gênero Enterobacter ou ao Pantoea, contanto que o microorganismo seja classificado dentro da família Enterobacteriaceae.

Em particular, as bactérias Pantoea, as bactérias Erwinia e as bactérias Enterobacter são classificadas como γ-proteobactérias, e elas se acham taxonomicamente muito próximas uma da outra (J Gen. Appl. MicrobioL, 1997, 43, 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 43, 1061-1067). Nos últimos anos, algumas bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou similar, com base nas experiências de hibridização de DNA-DNA etc. (International Journal of Systematic Bacteriology, julho de 1989, 39: 337345). Além disso, algumas bactérias pertencentes ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (referir-se ao Int. J. Syst. Bacteriol., 1993,43: 162-173).

Exemplos das bactérias de Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante. Especificamente, as cepas exemplificadas na Patente Européia Aberta ao Público n2 952221 podem ser usadas.

Uma cepa típica do gênero Enterobacter é a cepa Enterobacter agglomerans es ATCC 12287.

Cepas típicas das bactérias Pantoea incluem as Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans e Pantoea citrea. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, Patente Européia Aberta ao Público n2 0952221) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Patente Européia Aberta ao Público n2 0952221) Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, Patente Européia Aberta ao Público n2 0952221) Não obstante estas cepas terem sido identificadas e depositadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, elas são correntemente classificadas como Pantoea ananatis com base na análise da sequência de nucleotídeos do rRNA 16S etc., como descrito acima.

Exemplos das bactérias Erwinia incluem as Erwinia amylovora e as Erwinia carotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem a Klebsiella planticola. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Erwinia amylovora ATCC 15580 Erwinia carotovora ATCC 15713 Klebsiella planticola AJ13399 (FERM BP-6600, Patente Européia Aberta ao Público n2 955368) Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617, Patente Européia Aberta ao Público n2 955368).

Daqui por diante, os métodos para comunicar uma capacidade de produção de L-aminoácidos às bactérias de Enterobacteriaceae, ou métodos para intensificar uma capacidade de produção de L-aminoácidos de tais bactérias, são descritos.

Para comunicar uma capacidade de produzir um L-aminoácido, os métodos convencionalmente empregados na reprodução das bactérias corineformes ou das bactérias do gênero Escherichia (ver “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), lâ Edição, publicada em 30 de maio de 1986, pp. 77-100) podem ser usados. Tais métodos incluem a aquisição de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente analógica, ou um mutante de regulação metabólica, a construção de uma cepa recombinante em que a expressão de uma biossíntese de L-aminoácido seja intensificada, e assim por diante. Aqui, na reprodução de uma bactéria produtora de L-aminoácidos, as propriedades transmitidas, tais como uma mutação auxotrófica, a resistência analógica, ou a mutação de regulação metabólica, podem ser uma ou mais. A expressão da(s) enzima(s) de biossíntese de L-aminoácidos pode ser intensificada isoladamente ou em combinações de duas ou mais. Além disso, os métodos de comunicar propriedades tais como uma mutação auxotrófica, resistência analógica, ou mutação de regulação metabólica, podem ser combinados com os métodos de intensificar as enzimas de biossíntese.

Uma cepa mutante auxotrófica, a cepa resistente analógica de L-aminoácido, ou a cepa mutante de regulação metabólica com uma capacidade de produzir um L-aminoácido, podem ser obtidas submetendo-se uma cepa precursora ou uma cepa do tipo selvagem a mutagênese convencional, tal como a exposição dos raios-X ou a irradiação de UV, ou o tratamento com um mutágeno tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), metanossulfonato de etila (EMS), etc., depois selecionando-se aqueles que apresentem autotrofismo, resistência analógica, ou uma mutação de regulação metabólica, e que também tenham uma capacidade de produzir um L-aminoácido.

As bactérias produtoras de L-aminoácido ou os métodos de construção para tal, são exemplificados abaixo.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO

Primeiramente, as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico são explanadas como bactérias produtoras de L-aminoácido.

Exemplos das cepas precursoras para originar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção, incluem, sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como E. coli VL334thrC+ (Patente Européia n2 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica de L-isoleucina e L-treonina tendo mutações nos genes thrC e ilvA (Patente U.S. n2 4.278.765). Um alelo do tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral com o uso de um bacteriófago PI crescido nas células da cepa K12 de E. coli do tipo selvagem (VKPM B-7). Como resultado, uma cepa auxotrófica de L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B-8961) foi obtida.

Exemplos dos métodos para comunicar a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico a uma bactéria, ou intensificar a capacidade de uma bactéria, incluem, por exemplo, modificar uma bactéria de modo que a expressão de um gene codificando uma enzima envolvida na biossíntese do ácido L-glutâmico seja intensificada.

Exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese do ácido L-glutâmico incluem a glutamato desidrogenase (doravante também referida como “GDH”) (gdh), a glutamina sintetase (ginA), a glutamato sintetase (gltAB), a isocitrato desidrogenase (icdA), a aconitato hidratase (acnA, acnB), a citrato sintase (daqui por diante também referida como “CS” (gltA), metilcitrato sintase (daqui por diante também referida como “PRPC” iprpC), fosfoenolpiravato carboxilase (daqui por diante também referida como “PEPC” (ppc), a piruvato carboxilase (pyc), a piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiravato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfoffutocinase (pfkA, pfkB) e glicose fosfato isomerase (pgi), e assim por diante. As abreviaturas entre parênteses são os nomes dos genes que correspondem às enzimas, e esta convenção é usada na totalidade deste relatório descritivo. Entre estas enzimas, um ou mais dentre CS ou PRPC, PEPC e GDH são preferidas, e todas as três enzimas são mais preferidas (referir-se à WO 2006/051660). Métodos para modificar uma bactéria para aumentar a expressão dos genes alvo serão elucidados abaixo. O primeiro método é um método de aumentar o número de cópias de um gene alvo. Por exemplo, o número de cópias de um gene alvo pode ser aumentado pela clonagem do gene alvo em um plasmídeo apropriado e transformando-se uma bactéria hospedeira com o plasmídeo obtido. Por exemplo, quando o gene alvo é o gene que codifica CS (gene gltA), o gene que codifica PRPC (gene prpC), o gene que codifica PEPC (gene ppc) ou o gene que codifica GDH (gene gdhA), as sequências de nucleotídeos destes genes das bactérias Escherichia e das bactérias Corynebacterium já terão sido elucidadas (Biochemistry, vol. 22, pp. 5243-5249, 1983; J. Biochem., vol. 95, pp. 909-916, 1984; Gene, vol. 27, pp. 193-199, 1984; Microbiology, vol. 140, pp. 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., volume 218, pp. 330-339, 1989; Molecular Microbiology, volume 6, pp. 317-326, 1992) e, portanto, elas poderão ser obtidas pela sintetização de iniciadores com base nas respectivas sequências de nucleotídeos, e realizando-se a PCR com o uso de DNA cromossômico de uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae como o padrão.

Exemplos do plasmídeo usado para a transformação incluem um plasmídeo que autonomamente replica na bactéria hospedeira pertencente à família Enterobacteriaceae, tal como pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG e pSTV acham-se disponíveis da Takara Bio Inc.), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (os vetores pMW acham-se disponíveis da Nippon Gene Co., Ltd.), e assim por diante. Além disso, um DNA de fago pode também ser usado como o vetor, ao invés de um plasmídeo. Exemplos de plasmídeo para simultaneamente intensificar as atividades de CS ou PRPC, PEPC e CDH descritos acima, incluem RSFCPG incorporados com o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA (referir-se à Patente Européia Aberta ao Público n° 0952221), e RSFPPG correspondendo a RSFCPG, em que o gene gltA é substituído pelo gene prpC (referir-se aos exemplos).

Exemplos de métodos de transformação incluem o tratamento de células receptoras com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade do DNA, o que foi relatado quanto a Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., 1970, J. Mol. Biol., 53: 159-162), e preparando-se as células competentes a partir das células que se achem na fase de crescimento, seguido pela transformação com DNA, o que foi relatado quanto ao Bacillus subtilis (Duncan, C. FL, Wilson, G. A. e Young, F. E. 1977, Gene, 1: 153167). Altemativamente, um método de produzir células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver DNA recombinante, seguido pela introdução do DNA recombinante nas células, o que é conhecido como sendo aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S. N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168: 111-115; Bibb, M. J. et al., 1978, Nature, 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G. R. 1978, Proc. Natl. Sei., USA, 75: 1929-1933), pode também ser empregado. Além disso, os microorganismos podem também ser transformados pelo método do pulso elétrico (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-207791). O número de cópias de um gene pode também ser aumentado pela introdução de cópias múltiplas do gene no DNA cromossômico do microorganismo, o que pode ser realizado por recombinação homóloga (MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory) com o uso de cópias múltiplas de uma sequência como alvos no DNA cromossômico. As sequências presentes nas cópias múltiplas no DNA cromossômico incluem os DNAs respectivos, e as repetições invertidas presentes na extremidade de um elemento transponível. Igualmente, como apresentado na Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-109985, é possível incorporar o gene alvo em um transpóson, e possibilitar que ele seja transferido para introduzir cópias múltiplas do gene para o DNA cromossômico. O gene alvo pode também ser introduzido no cromossoma bacteriano por fago Mu (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-109985), ou similar. O segundo método é aumentar a expressão do gene alvo pela substituição de uma sequência reguladora da expressão do gene alvo, tal como um promotor, sobre o DNA cromossômico ou plasmídeo com um promotor mais forte. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor PR, o promotor lacUV5, etc., são conhecidos como promotores fortes. Além disso, é também possível substituir vários nucleotídeos na região do promotor de um gene, de modo que o promotor seja modificado para ser mais forte, como apresentado na Publicação da Patente Internacional WO 00/18935. Exemplos de promotores fortes e de métodos para avaliar a intensidade dos promotores, são descritos em um artigo de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128), etc. A substituição de uma sequência reguladora da expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira como na substituição do gene com o uso de um plasmídeo sensível à temperatura. Exemplos de vetores que tenham uma origem de replicação sensível à temperatura e utilizável para a bactéria da presente invenção pertencente à família Enterobacteriaceae incluem por exemplo, o plasmídeo pMAN997 descrito na Publicação Internacional WO 99/03988, e assim por diante.

Além disso, sabe-se que as substituições de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação ribossômica (RMS) e o códon de partida, em particular uma sequência imediatamente a montante do códon de partida, afetam grandemente a eficiência da translação do mRNA. Pela modificação destas, a quantidade de translação pode ser melhorada. A modificação de uma sequência de controle da expressão pode ser combinada com o método de aumentar o número de cópias de um gene descrito acima.

Exemplos dos métodos para a substituição de genes conforme descrito acima, incluem os métodos que empregam DNA linear, tais como o “Red-driven integratiorí’ [Datsenko, K. A. e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 97: 6640-6645 (2000)], e o Red-driven integration em combinação com o sistema de excisão de fago λ (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. 2002, J. Bacteriol., 184: 5200-5203) (WO 2005/010175), e assim por diante, métodos que usam um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura, métodos que usam um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, métodos que utilizam um vetor suicida que não tenha uma origem de replicação utilizável no hospedeiro escolhido (Patente U.S. n° 6.303.383, Patente Japonesa Aberta ao Público n° 05-007491) etc.

Como mostrado no Exemplo de Referência 1, uma cepa resistente ao produto de gene Red λ, por exemplo a cepa de Pantoea ananatis SC 17 (0), pode ser adequadamente usada para a integração conduzida de Red. A cepa SC 17 (0) foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Rússia, 117545 Moscou 1, Dorozhny proezd. 1) em 21 de setembro de 2005, sob o número de acesso da VKPM B-9246.

Exemplos de microorganismos modificados pelo método descrito acima, de modo que a expressão do gene da citrato sintase, do gene da citrato de metila sintase, do gene da fosfoenolpiruvato carboxilase e/ou do gene de glutamato desidrogenase seja intensificada, incluem os microorganismos descritos nas Patentes Japonesas Abertas ao Público n~ 2001-333769, 2000-106869, 2000-189169 2000-333769, 2006-129840, WO 2006/051660, e assim por diante.

Além disso, a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico pode também ser transmitida pela intensificação da atividade da 6-fosfogliconato desidratase, da atividade da 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogliconato aldolase, ou de ambas estas atividades. Exemplos do microorganismo do qual a atividade da 6-fosfogliconato desidratase e a atividade da 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogliconato aldolase são aumentadas, incluem o microorganismo apresentado na Patente Japonesa Aberta ao Público n~ 2003-274988. A modificação para transmitir a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico ou de intensificá-la, pode também ser alcançada pela redução ou eliminação da atividade de uma enzima que catalise uma reação que se ramifique da via da biossíntese do ácido L-glutâmico, e produção de um composto outro que não o ácido L-glutâmico. Exemplos de uma tal enzima que catalise uma reação que se ramifique da via de biossíntese do ácido L-glutâmico e produza um composto outro que não o ácido L-glutâmico, incluem 2-oxoglutarato desidrogenase [a-cetoglutarato desidrogenase (sucA)], isocitrato liase (aceA), fosfato acetiltransferase (pta), acetatocinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvl), formiato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (Idh), glutamato descarboxilase (gadAB), l-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase (putA), e assim por diante. É particularmente preferível reduzir ou eliminar a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase entre estas enzimas. A fim de reduzir ou eliminar as atividades das enzimas acima mencionadas, as mutações para reduzir ou eliminar as atividades intracelulares das enzimas podem ser introduzidas nos genes das enzimas supramencionadas mediante um tratamento usual de mutagênese ou uma técnica de engenharia genética. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem, por exemplo, métodos que utilizam a irradiação de raio-x ou o raio ultravioleta, métodos que utilizam o tratamento com um mutágeno tal como a N-metil-N^nitro-N-nitrosoguanidina, e assim por diante. O local do gene em que a mutação é introduzida pode ser uma região codificadora codificando uma proteína enzimática ou uma região para regular a expressão tal como um promotor. Exemplos das técnicas de engenharia genética incluem métodos que usam recombinação genética, transdução, fusão celular, e assim por diante. O decréscimo ou a deficiência da atividade intracelular de uma enzima alvo e o grau de decréscimo na atividade podem ser confirmados pela medição da atividade enzimática em um extrato celular ou uma sua fração purificada obtida de uma cepa candidata e comparando-a com aquela de uma cepa do tipo selvagem. Por exemplo, a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase pode ser medida pelo método de Reed et al. [L. J. Reed e B. B. Mukherjee, Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61 (1969)].

As bactérias pertencentes ao gênero Escherichia deficientes na atividade de 2-oxiglutarato desidrogenase ou tendo um atividade reduzida de 2-oxiglutarato desidrogenase, incluem as seguintes cepas (Patentes U.S. n— 5.378.616 e 5.573.945): E. coli W311 OsucA: :Kmr E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ12949 (FERM BP-4881) E. coli W3110sucA::Kmr é uma cepa obtida pelo rompimento do gene de 2-oxoglutarato desidrogenase (gene sucA) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente na α-cetoglutarato desidrogenase.

Especificamente, os exemplos de bactéria em que a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase é deletada ou reduzida, incluem as seguintes cepas Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, Patente Européia Aberta ao Público n° 1078989) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Patente dos Estados Unidos n° 6.331.419) Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP-8646, WO 2005/ 085419) Klebsiella planticola cepa AJ13410 (FERM BP-6617, Patente dos Estados Unidos ns 6.197.559) A cepa SC17sucA é uma cepa obtida pela seleção de uma cepa mutante (SCI7) de baixa produção de phlegm da cepa AJ13355, que foi isolada da natureza como uma cepa que podería proliferar em um meio contendo o ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em baixo pH, e rompendo o gene da 2-oxoglutarato desidrogenase (sucA) da cepa mutante. A cepa AJ13601 foi obtida pela introdução de um plasmídeo RSFCPG contendo os genes gltA, ppc e gdhA derivados de Escherichia coli e um plasmídeo pSTVCB contendo o gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum dentro da cepa SC17sucA para se obter a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, e pela seleção de uma cepa resistente ao ácido L-glutâmico de alta concentração em baixo pH, e uma cepa apresentando um elevado grau de proliferação e uma elevada capacidade de produzir o ácido L-glutâmico da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB (Patente Européia Aberta ao Público n° 0952221). A cepa AJ13356 foi obtida pela eliminação do gene da subunidade aKGDH-El (sue A) da cepa AJ13355. Além disso, a cepa NP 106 descrita nos exemplos corresponde à cepa AJ13601, da qual o plasmídeo RSFCPG+pSTVCB é eliminado.

As cepas Pantoea ananatis AJ13355 e AJ13356 foram depositadas em 19 de fevereiro de 1998 no National Institute of Bioscience and Human Technology da Agency of Industrial Science and Technology (correntemente agência administrativa independente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), com os números de depósito FERM P-16644 e FERM P-16645 respectivamente, e transferidas do depósito original para o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e foi depositados sob os números de acesso FERM BP-6644 e FERM BP-6615, respectivamente. À cepa SC17sucA foi atribuído um número individual AJ417, e foi depositado no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566) em 26 de fevereiro de 2004, tendo sido atribuído um número de acesso FERM BP-08646. A cepa de Pantoea ananatis AJ13601 foi depositada em 18 de agosto de 1999 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (correntemente uma agência administrativa independente, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), com o número de depósito FERM P17156, e transferida do depósito original para o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e foi depositada sob o número de acesso FERM BP-7207.

As cepas de Pantoea ananatis AJ13355, AJ13356 e AJ13601 e a cepa de Klebsiella planticola AJ13399 têm uma capacidade de acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que excede a quantidade que fornece a concentração de saturação do ácido L-glutâmico em um meio líquido quando é cultivado sob condições acídicas.

Além disso, de modo a melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico das bactérias de Enterobacteriaceae, o método de eliminar o gene arcA (Patente U.S. n2 7.090.998), e o método de amplificar o gene yhfK, que é um gene de secreção do ácido glutâmico (WO 2005/085419 panfleto), também pode ser usado. O método acima mencionado de intensificar ou eliminar a atividade enzimática, é de forma semelhante aplicável a outros aminoácidos produtores das bactérias, descritos abaixo.

BACTÉRIAS PRODUTORES DA L-TREONINA

Exemplos de cepas precursoras para originar as bactérias produtoras da L-treonina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patentes U.S. n~ 5.175.107, Patentes U.S. n25 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U.S. ns 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente U.S. n2 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. n2 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. no 5.376.538), E. coli MG442 [Gusyatiner et al., Genetika (em Russo), 14, 947-956 (1978)], E. coli VL643 e VL2055 (Patente Européia Aberta ao Público η2 1149911), e outras. A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, bem como assimilativa a sacarose, e o seu gene ilvA tem uma mutação permeável. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que comunica resistência às altas concentrações de treonina ou de homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40, que foi obtido pela inserção de um óperon thrA*BC que inclui um gene mutante thrA em um vetor originado de RSF1010. Este gene mutante thrA codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase I que substancialmente dessensibilizou a inibição da retroalimentação pela treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105, Moscou, Federação Russa) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd. 1) em 7 de abril de 1987, sob o número de acesso VKPM B-3996. A E. coli VKPM B-5318 (Publicação da Patente Européia n° 0593792) também pode ser usada como uma cepa precursora para originar as bactérias produtoras da L-treonina da presente invenção. A cepa B-5318 é prototrófica com respeito à isoleucina, e um repressor de λ-fago Cl sensível à temperatura e o promotor PR substituem a região reguladora do óperon da treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 3 de maio de 1990, sob o número de acesso VKPM B-5318.

Preferivelmente a bactéria da presente invenção é adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - gene mutante thrA que codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase I resistente à inibição da retroalimentação pela treonina; - gene thrB que codifica a homosserina cinase; - o gene thrC que codifica a treonina sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína putativa da transmembrana; - o gene asd gene que codifica a aspartato-P-semialdeído desidrogenase; e - o gene aspC que codifica a aspartato aminotransferase (aspartato transaminase). O gene thrA que codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (posições dos nucleotídeos 337 a 2799, acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA se localiza entre os genes thrL e thrB no cromossoma de E. coli K-12. O gene thrB que codifica a homosserina cinase de Escherichia coli foi esclarecido (posições dos nucleotídeos 2801 a 3733, acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrB se localiza entre os genes thrA e thrC no cromossoma de E. coli K-12. O gene thrC que codifica a treonina sintase de Escherichia coli foi esclarecido (posições dos nucleotídeos 3734 a 5020, acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrC se localiza entre o gene thrB e a matriz de leitura aberta yaaX no cromossoma de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um óperon de treonina único. Para intensificar a expressão do óperon da treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do óperon (WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Um gene mutante thrA, que codifica a homosserina aspartocinase desidrogenase um resistente à inibição da retroalimentação pela treonina, bem como os genes thrB e thrC, podem ser obtidos como um óperon do bem conhecido plasmídeo pVIC40 que se acha presente na cepa VKPM B-3996 de E. coli produtora da treonina. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhes na Patente U.S. n° 5.705.371. O gene rhtA existe em 18 min sobre o cromossoma de E. coli perto do óperon glnHPQ, o qual codifica os componentes do sistema de transporte da glutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORF1 (gene ybiF, posições dos nucleotídeos 764 a 1651, número de acesso do GenBank AAA218541, gi:440181) e se localiza entre os genes pexB e ompX. A unidade expressando uma proteína codificada pelo ORF1 foi designada como o gene rhtA ( rht: resistência às homosserina e treonina). Igualmente, foi revelado que a mutação de rhtA23 é uma substituição G-por-A na posição -1 em relação ao códon de partida ATG (EXTRATOS do 17° Congresso Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em combinação com o Encontro Anual da American Society for Biochemistry and Molecular Biology, São Francisco, Califórnia, em 24 a 29 de agosto de 1997, extrato n2 457, Patente Européia Aberta ao Público n2 1013765). O gene asd de E. coli já foi esclarecido (posições dos nucleotídeos 3572511 a 3571408, acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR [reação em cadeia da polimerase; referir-se a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)] utilizando os iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira semelhante.

Igualmente, o gene aspC de E. coli já foi elucidado (posições dos nucleotídeos 983742 a 984932, acesso do GenBank NC_000913.1, gi: 16128895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira semelhante.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-LISINA

Exemplos de bactérias produtoras da L-lisina, pertencentes ao gênero Escherichia, incluem mutantes tendo resistência a um análogo da L-lisina. O análogo da L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, porém esta inibição é completa ou parcialmente dessensibilizada quando a L-lisina coexiste em um meio. Exemplos do análogo da L-lisina incluem, porém sem limitar, a oxalisina, o hidroxamato de lisina, a S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), a γ-metil-lisina, a a-clorocaprolactama, e assim por diante. Os mutantes que têm resistência a estes análogos da lisina podem ser obtidos submetendo-se as bactérias pertencentes ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir a L-lisina incluem a Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B- 12185; ver a Patente U.S. n2 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nestes microorganismos, a inibição de retroalimentação da aspartocinase pela L-lisina é dessensibilizada. A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria de Escherichia coli produtora da L-lisina. Esta cepa bacteriana foi reproduzida conferindo-se resistência de AEC à cepa W3110, a qual foi derivada de Escherichia coli K-12. A cepa resultante foi designada de cepa de Escherichia coli AJ13069 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994, e recebeu um número de acesso de FERM P-14690. Posteriormente, o depósito foi transformado em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste, em 29 de setembro de 1995, e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (Patente U.S. n2 5.827.698) Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras de L-lisina da presente invenção também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-lisina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem, porém sem limitar, os genes codificando a diidrodipicolinato sintase (dapÂ), a aspartocinase {lysC), a diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (<ddh) (Patente U.S. no 6.040.160), a fosfoenolpirvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1253195). Além disso, as cepas precursoras podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1170376), do gene codificando a nucleotídeo nicotinamida transidrogenase (pntAB) (Patente U.S. n2 5.830.716), o gene ybjE (WO 2005/073390), ou combinações destes.

Exemplos de cepas precursoras para dar origem a bactérias produtoras de L-lisina da presente invenção também incluem as cepas com atividade reduzida ou eliminada de uma enzima que catalise uma reação para gerar um composto outro que não a L-lisina pela ramificação da via biossintética da L-lisina. Exemplos das enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto outro que não a L-lisina mediante ramificação da via biossintética da L-lisina, incluem a homosserina desidrogenase, a lisina descarboxilase (Patente U.S. na 5.827.698), e a enzima málica (WO 2005/010175). BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-CISTEÍNA Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-cisteína da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli JM15 que é transformado com diferentes alelos de cysE codificando as serina acetiltransferases resistentes à realimentação (Patente U.S. na 6.218.168, Pedido de Patente Russa na 2003121601); E. coli W3110 tendo genes superexpressos que codificam proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para as células (Patente U.S. na 5.972.663); cepas de E. coli tendo atividade de cisteína dessulfidrase reduzida (JP 11155571A2); E. coli W3110 com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regular a cisteína codificada pelo gene cysB (WO 0127307A1), etc. BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-LEUCINA Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-leucina da presente invenção incluem, sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como as cepas de E. coli resistentes à leucina [por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. na 6.124.121)] ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina (Publicação da Patente Japonesa na 62- 34397 e a Patente Japonesa Aberta ao Público n2 8-70879); as cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito na WO 96/06926; E. coli H-9068 (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 8-70879), e outras. A bactéria da presente invenção pode ser melhorada mediante a intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese da L-leucina. Exemplos de tais genes incluem os genes do óperon leuABCD, do qual o exemplo típico preferido é um gene mutante leuA codificando a isopropilmalato sintase dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-leucina (Patente U.S. rr 6.403.342). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificando as proteínas que excretam o L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes B2682 e b2683 (genes ygaZH) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1239041 A2).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-fflSTIDINA

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-histidina da presente invenção incluem, sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como a cepa de E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677); a cepa de E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536); E. coli NRRL B-12116 a B12121 (Patente U.S. n2 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (Patente U.S. n2 6.344.347); E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (Patente Européia n2 1085087); E. coli AI80/pFM201 (Patente U.S. n2 6.258.554) etc.

Exemplos de cepas precursoras para originar bactérias produtoras da L-histidina da presente invenção também incluem as cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-histidina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem os genes que codificam ATP fosforribosiltransferase (hisG), fosforribosil AMP cicloidrolase (hisl), fosforribosil-ATP pirofosfoidrolase QiisIE), fosforribosil-formimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase QiisÁ), amido- transferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase QiisB), histidinol desidrogenase QiisD), e assim por diante. É conhecido o fato de que enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas pela L-histidina e, portanto, uma capacidade de produzir L-histidina pode também ser eficientemente intensificada pela introdução de uma mutação conferindo resistência à inibição da retroalimentação no gene de fosfoiribosiltransferase ATP (/iisG) (Patentes Russas n- 2003677 e 2119536).

Exemplos específicos das cepas que tenham uma capacidade de produzir L-histidina incluem E. coli FERM P-5038 e 5048 que tenham sido introduzidas com um vetor carregando um DNA codificando uma enzima biossintética de L-histidina (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 56005099), as cepas de E. coli introduzidas com rht, um gene para uma exportação de aminoácido (Patente Européia Aberta ao Público n2 1016710), a cepa de 80 doada com sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina, e resistência à estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Russa n2 2119536), e assim por diante.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DE L-FENILALANINA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-fenilalanina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como a E. coli AJ12739 (tyrA::Tnl0, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) abrigando um gene mutante pheA34 (Patente U.S. n2 5.354.672); E. coli MWEClOl-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente U.S. n2 4.407.952). Igualmente, como uma cepa precursora, E. coli Kl2 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] denominada como AJ12604 (FERM BP-3579), podem ser usadas (Publicação da Patente Européia n2 488424 Bl). Além disso, as bactérias produtoras da L- fenilalanina pertencentes ao gênero Escherichia com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG, podem também ser usadas (Publicações dos Pedidos de Patentes U.S. n~ 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al, respectivamente).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DO L-TRIPTOFANO

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras do L-triptofano da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como as E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficientes na triptofanil-tRNA sintetase codificada pelo gene mutante trpS (Patente U.S. n2 5.756.345); E. coli SV164 (pGH5) tendo um alelo serA codificando a fosfoglicerato desidrogenase livre da inibição da retroalimentação pela serina e um alelo trpE codificando a antranilato sintase livre da inibição da retroalimentação pelo triptofano (Patente U.S. n2 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanase (Patente U.S. n2 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps em que a capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é intensificada (WO 97/08333, Patente U.S. n2 6.319.696), etc. As bactérias produtoras do L-triptofano pertencentes ao gênero Escherichia no qual a atividade da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG é aumentada, podem também ser usadas (Publicações dos Pedidos de Patentes U.S. n22 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras do L-triptofano da presente invenção também incluem as cepas em que uma ou mais atividades das enzimas selecionadas da antranilato sintase (trpE), da fosfoglicerato desidrogenase (serA), e do triptofano sintase (,trpAB), são intensificadas. A antranilato sintase e a fosfoglicerato desidrogenase acham-se, ambas, sujeitas à inibição da retroalimentação pelo L-triptofano e pela L-serina e, portanto, uma mutação dessensibilizando a inibição da retroalimentação pode ser introduzida nestas enzimas. Exemplos específicos das cepas tendo uma tal mutação incluem uma E. coli SV164 que abriga a antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante obtida pela introdução, na E. coli SV164, do plasmídeo pGH5 (WO 94/08031), que contém um gene ser A mutante codificando a fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada pela inibição da retroalimentação.

Exemplos de cepas precursoras para originar as bactérias produtoras do L-triptofano da presente invenção também incluem as cepas dentro das quais o óperon de triptofano contendo um gene que codifica a antranilato sintase dessensibilizada, tenha sido introduzido (Patente Japonesa Aberta ao Público n~ 57-71397, 62-244382, Patente U.S. n~ 4.371.614). Além disso, a capacidade produtora do L-triptofano pode ser transmitida pela intensificação da expressão de um gene que codifique a triptofano sintase, entre os óperons de triptofano (trpBA). A triptofano sintase consiste das subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade produtora do L-triptofano pode ser melhorada pelo aumento da expressão do óperon da isocitrato liase-malato sintase (WO 2005/103275).

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-PROLINA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras de L-prolina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (Patente Européia nfi 1172433). A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese da L-prolina. Exemplos de tais genes para as bactérias produtoras da L-prolina que são preferidos, incluem o gene proB codificando a glutamato cinase, da qual a inibição da retroalimentação pela L-prolina é dessensibilizada (Patente Alemã η2 3127361). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificando proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes são os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1239041 A2).

Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, que tenham uma atividade para produzir L-prolina, incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente Britânica n2 2075056), VKPM B-8012 (Pedido de Patente Russa n2 2000124295), mutantes plasmídeos descritos na Patente Alemã n2 3127361, plasmídeos mutantes descritos por Bloom F. R .et al. (152 simpósio de inverno de Miami, 1983, p. 34), e outras.

BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-ARGININA

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-arginina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas pertencentes ao gênero Escherichia, tais como a cepa 237 de E. coli (VKPM B-7925) (Publicação do Pedido de Patente U.S. n2 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas que abriguem a N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russa n2 2001112869), a cepa 382 de E. coli (VKPM B-7926) (Patente Européia Aberta ao Público n2 1170358 Al), uma cepa produtora da arginina em que o gene argA codificando a N-acetilglutamato sintetase é introduzido (Patente Européia Aberta ao Público n2 1170361 Al), e outras Exemplos de cepas precursoras para originar as bactérias produtoras da L-arginina da presente invenção também incluem as cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética da L-arginina são intensificados. Exemplos de tais genes incluem opcionalmente substituído genes que codificam a N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), a omitina acetil transferase (argJ), a N-acetilglutamato cinase (argB), a acetilomitina transaminase (argD), a omitiría carbamoil transferase (argF), a ácido argininossuccínico sintetase (argG), a ácido argininossuccínico liase (argH), e a carbamoil fosfato sintetase (carAB). BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-VALINA Exemplos de cepas precursoras para dar origem a bactérias produtoras da L-valina da presente invenção incluem, sem limitar, as cepas que tenham sido modificadas para superexpressar o óperon ilvGMEDA (Patente U.S. na 5.998.178). É desejável remover a região do óperon ilvGMEDA, o que é necessário para a atenuação de modo que a expressão do óperon não seja atenuada pela L-valina que é produzida. Além disso, o gene ilvA no óperon é desejavelmente rompido de modo que a atividade da treonina desaminasa seja reduzida.

Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-valina da presente invenção também incluem as cepas mutantes tendo uma mutação de aminoacil t-RNA sintetase (Patente U.S. ns 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica a isoleucina tRNA sintetase, pode ser usado. E. coli VL1970 foi depositado na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 113545 Moscou, 1 Dorozhny Proezd, 1) em 24 de junho de 1988, sob o número de acesso VKPM B-4411.

Além disso, os mutantes requerendo ácido lipóico para o crescimento e/ou carência de EÉ-ATPase, podem também ser usados nas cepas precursoras (WO 96/06926). BACTÉRIAS PRODUTORAS DA L-ISOLEUCINA Exemplos de cepas precursoras para dar origem às bactérias produtoras da L-isoleucina da presente invenção incluem, porém sem limitar, as cepas mutantes tendo resistência à 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa Aberta ao Público ns 5-304969), cepas mutantes tendo resistência a um análogo da isoleucina, tal como a tiaisoleucina e ao hidroxamato de isoleucina, e cepas mutantes adicionalmente tendo resistência à DL-etionina e/ou ao hidroxamato de arginina (Patente Japonesa Aberta ao Público na 5130882). Além disso, as cepas recombinantes transformadas com um gene codificando uma proteína envolvida na biossíntese da L-isoleucina, tal como a treonina desaminase e a acetoidroxato sintase, podem também ser usadas como cepas precursoras (Patente Japonesa Aberta ao Público n° 2-458, Patente Francesa na 0356739, e Patente U.S. rr 5.998.178). <l-2> INTENSIFICAÇÃO DO SISTEMA kdp O microorganismo da presente invenção pode ser obtido pela modificação de um tal microorganismo pertencente à família da Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade produtora do L-aminoácido como descrito acima, de modo que o sistema kdp seja intensificado. Entretanto, após um microorganismo ter sido modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado, a capacidade produtora do L-aminoácido pode ser transmitida ao microorganismo. O sistema kdp pode ser intensificado por modificação que aumente a expressão do óperon kdp ou um ou mais genes que constituam o óperon kdp, e tal aumento da expressão pode basear-se na intensificação da expressão de um gene endógeno mediante modificação de uma região de controle da expressão, tal como a modificação de um promotor ou similar, ou intensificação da expressão de um gene exógeno pela introdução de um plasmídeo contendo o óperon ou qualquer dos genes, ou similar. Estes métodos podem ser realizados em combinação. O sistema kdp pode também ser intensificado pelo aumento da translação do óperon kdp ou de qualquer dos genes que constituem o óperon kdp.

Na presente invenção, o “sistema kdp” significa uma ATPase do tipo P (ATPase do tipo P transportando potássio) que atua sobre o sistema de transporte de potássio de alta afinidade (EC 3.6.3.12). A condição de “ser modificado de modo que o sistema kdp seja intensificado” significa uma condição de que o transporte de potássio, acima mencionado, pela ATPase tipo P é intensificado, mais especialmente uma condição de que o microorganismo seja modificado de modo que a sua atividade de ATPase do tipo P seja intensificada. Uma tal condição corresponde, por exemplo, à condição de que o número das moléculas da proteína de ATPase do tipo P por célula seja aumentado em comparação com aquele da cepa precursora ou de uma cepa selvagem, ou a condição de que a atividade da ATPase do tipo P por molécula seja aumentada em comparação com aquela da cepa precursora ou de uma cepa selvagem. A modificação é preferivelmente realizada de modo que a atividade da ATPase do tipo P por célula seja melhorada até 150 % ou mais, preferivelmente 200 % ou mais, mais preferível 300 % ou mais, da atividade da cepa precursora ou de uma cepa selvagem. O microorganismo do tipo selvagem pertencente à família Enterobacteriaceae usado como uma referência para a comparação é, por exemplo, o Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6615), ou similar. O aumento da expressão do óperon kdp pode ser confirmado pela comparação da quantidade do seu mRNA com aquela de uma cepa do tipo selvagem ou não modificada. Exemplos do método para confirmar a expressão incluem a hibridização Northern e RT-PCR (.Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001). O grau do aumento na expressão não é particularmente limitado, contanto que ele aumente em comparação com aquele de uma cepa selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ela é desejavelmente aumentada, por exemplo, 1,5 vez ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferível 3 vezes ou mais, em comparação com aquela de uma cepa selvagem ou cepa não modificada. A atividade da ATPase do tipo P pode ser medida, por exemplo, pela extração do sistema kdp de um microorganismo que o possua, purificando-o [referir-se a Siebers, A. et al., Eur. J. Biochem., 178, 131 (1988)] e medindo-se a atividade da ATPase do tipo P do sistema kdp purificado [referir-se a Amold, A. et al., Anal. Biochem., 71, 209 (1976)]. O sistema kdp consiste de três subunidades codificadas pelo óperon kdp, e, no que diz respeito a E. coli, as seguintes anotações são fornecidas para os genes da subunidade: kdpA: ATPase do sistema de transporte de potássio de alta afinidade, cadeia A

kdpB: ATPase do sistema de transporte de potássio de alta afinidade, cadeia B

kdpC: ATPase do tipo P, sistema de transporte de potássio de alta afinidade, cadeia C O “óperon kdp” referido na presente invenção é um aglomerado de genes codificando as subunidades A, B e C da ATPase do tipo P descrita acima, em que a subunidade A é codificada pelo gene kdp A, a subunidade B é codificada pelo gene kdpB, e a subunidade C é codificada pelo gene kdpC. Na presente invenção, o óperon kdp pode conter um gene que não os genes kdp A, kdpB e kdpC. A sequência de nucleotídeos do óperon kdp de Escherichia coli é mostrada na SEQ ID NO: 1. Este óperon contém os seguintes seis genes, e as regiões codificadoras (incluindo o códon de parada) dos genes na SEQ ID NO: 1 são como segue. As sequências de aminoácidos codificadas por kdpA, kdpB, kdpC, kdpD e kdpE são mostradas nas SEQ ID NOS: 2 a 6, respectivamente. kdpF: 457 a 546 kdpA: 546 a 2219 kdpB: 2242 a 4290 kdpC: 4299 a 4871 kdpD: 4864 a 7548 kdpE: 7545 a 8222 A sequência de nucleotídeos do óperon kdp de Pantoea ananatis é mostrada na SEQ ID NO: 7. Este óperon contém os seguintes quatro genes, e as regiões codificadoras (incluindo o códon de parada) dos > genes na SEQ ID NO: 7 são como segue. As sequências de aminoácidos codificadas por kdpA, kdpB, kdpC e kdpD são mostradas nas SEQ ID NOS: 8 a 11, respectivamente. kdpA: 543 a 2225 kdpB: 2228 a 4273 ) kdpC: 4284 a 4853 kdpD: 4867 a 7542 Além disso, a sequência de nucleotídeos do gene kdpE de pantoea ananatis e a sequência de aminoácidos codificada por este gene, são mostradas nas SEQ ID NOS: 12 e 13, respectivamente. > Neste relatório descritivo, as proteínas codificadas por kdpA, kdpB, kdpC, kdpD e kdpE podem ser indicadas como KdpA, KdpB, KdpC, KdpD e KdpE, respectivamente.

Os alinhamentos das sequências de aminoácidos de KdpA, KdpB e KdpC de Pantoea ananatis e Escherichia coli são mostrados nas ) Figuras 6 a 8. As sequências de consenso das sequências de Pantoea ananatis e Escherichia coli são mostradas nas linhas inferiores dos alinhamentos. Além disso, as sequências de consenso de KdpA, KdpB e KdpC são mostradas nas SEQ ID NOS: 57 a 59, respectivamente.

As homologias de KdpA, KdpB e KdpC de Pantoea ananatis e > Escherichia coli são de 75,36 %, 81,35 % e 59,57 %, respectivamente.

No que diz respeito às bactérias de Escherichia, o gene kdpA é registrado no GenBank NP_415226.1 Reports potassium-transpo ... To [gi:16128674], o gene kdpB em NP_415225. Reports potassium-transpo ... [gi:16128673], o gene kdpC em NP 415224. Reports potassium-transpo ...

[gi: 16128672], o gene kdpD em NP_415223. Reports fused sensory his ... [gi: 16128671], e o gene kdpE em NP_415222. Reports DNA-binding respo ... [gi: 16128670].

Além disso, o óperon kdp pode ser um clonado de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae tal como as bactérias Escherichia, Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia e Yersinia à base das homologias aos genes exemplificados acima.

Como o óperon kdp utilizável para a presente invenção, o óperon kdp e as suas regiões de flanqueio, incluindo uma região de controle da expressão que se localize a montante do óperon, podem ser obtidos por PCR [reação em cadeia da polimerase; referir-se a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)] usando iniciadores preparados com base em uma sequência de nucleotídeos já elucidada de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, e DNA cromossômico de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae como o padrão. Os homólogos do óperon kdp de outros microorganismos também podem ser obtidos de uma maneira semelhante.

Um homólogo do óperon kdp significa um gene codificando uma ATPase do tipo P, que incorpore íons de potássio, derivada de outro microorganismo e apresentando uma alta homologia ao óperon kdp de Escherichia coli ou de Pantoea ananatis. O gene kdp A, o gene kdpB e o gene kdpC derivados de outro microorganismo significa aqueles que apresentam homologias de 80 % ou mais, preferivelmente de 90 % ou mais, mais preferível de 95 % ou mais, particularmente preferível de 97 % ou mais, às sequências totais de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 8, 9 e 10, e codificando as subunidades que constituem uma proteína tendo a atividade da ATPase do tipo P.

Cada um dos genes pode codificar variante conservativa tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 8, 9 ou 10 incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos em uma ou em várias posições, contanto que a atividade da ATPase do tipo P constituída destas subunidades não seja degradada. Não obstante o número denotado pelo termo “várias” possa diferir dependendo da posição na estrutura tridimensional ou dos tipos de resíduos de aminoácidos das proteínas, ele é preferivelmente de 2 a 20, mais preferível de 2 a 10, particularmente preferível de 2 a 5. As substituições, deleções, inserções, adições, inversões etc. dos aminoácidos descritos acima incluem aquelas causadas pelas mutações de ocorrência natural, dependendo das diferenças individuais ou das diferenças nas espécies de microorganismos.

Estas substituições são de preferência substituições conservativas que são mutações neutras não proporcionando nenhuma mudança funcional. Uma mutação conservativa é uma mutação em que a substituição tem lugar mutuamente entre Phe, Trp, Tyr, se o sítio da substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, Vai, se o sítio da substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gin, Asn, se ele for um aminoácido polar; entre Lys, Arg, His, se ele for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele for um aminoácido acídico; e entre Ser e Thr, se ele for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos específicos de substituições conservativas incluem: a substituição de Ala por Ser ou Thr; a substituição de Arg por Gin, His ou Lys; a substituição de Asn por Glu, Gin, Lys, His ou Asp; a substituição de Asp por Asn, Glu ou Gin; a substituição de Cys por Ser ou Ala; a substituição de Gin por Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg; a substituição de Glu por Gly, Asn, Gin, Lys ou Asp; a substituição de Gly por Pro; a substituição de His por Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr; a substituição de Ile por Leu, Met, Vai ou Phe; a substituição de Leu por Ile, Met, Vai ou Phe; a substituição de Lys por Asn, Glu, Gin, His ou Arg; a substituição de Met por Ile, Leu, Vai ou Phe; a substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu; a substituição de Ser por Thr ou Ala; a substituição de Thr por Ser ou Ala for Thr; a substituição de Trp por Phe ou Tyr; a substituição de Tyr por His, Phe ou Trp; e a substituição de Vai por Met, Ile ou Leu.

Além disso, o óperon kdp com o uso dos códons que possam ser facilmente usados em um microorganismo hospedeiro escolhido, no qual o gene seja introduzido, pode também ser usado, desde que a degeneração do gene varie dependendo do microorganismo hospedeiro. De forma semelhante, contanto que a produção do L-aminoácido possa ser melhorada pela amplificação do óperon kdp, o óperon kdp pode ser alongado ou encurtado ou no término N e/ou no término C de cada subunidade codificada pelo óperon, mediante, por exemplo, 50 ou menos, preferivelmente 20 ou menos, mais preferível 10 ou menos, particularmente preferível 5 ou menos, da quantidade de resíduos de aminoácidos. Mais especificamente, cada subunidade pode ter uma sequência de aminoácidos que seja encurtada em 5 a 50 resíduos de aminoácidos ou no término N e/ou no término C na sequência de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 8, 9 ou 10.

Além disso, o óperon kdp pode ser um DNA que hibridize sob condições estringentes com a sequência de nucleotídeos apresentada nas SEQ ID NOS: 1 ou 7, ou uma sequência complementar a cada região codificadora na sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 ou 7, ou uma sonda que possa ser preparada destas sequências, e que codifique o sistema kdp, isto é, proteína tendo atividade de ATPase do tipo P para incorporar íons de potássio.

As “condições estringentes” aqui referida significam condições em que um assim chamado híbrido específico seja formado e um híbrido não específico não seja formado. É difícil definir claramente as condições com valores numéricos, mas exemplos destas incluem condições em que os DNAs tendo alta homologia, por exemplo homologia de 70 % ou mais, preferível de 80 % ou mais, mais preferível de 90 % ou mais, ainda mais preferível de 95 % ou mais, particularmente preferível de 97 % ou mais, hibridizam um com o outro e os DNAs tendo uma homologia menor do que o valor não hibridizam um com o outro; e especificamente incluem condições correspondentes à concentração de sal e à temperatura das condições de lavagem na hibridização Southern típica, por exemplo, 1 x SSC, 0,1 % de SDA, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS, em 60°C. A sonda pode ser uma sonda tendo uma sequência parcial do óperon kdp. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR com o uso de oligonucleotídeos preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene de acordo com um método bem conhecido de uma pessoa habilitada na técnica, como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo o gene como o padrão. Quando o fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 pares de base seja usado como a sonda, a lavagem após a hibridização sob as condições acima mencionadas pode ser, por exemplo, a lavagem de uma vez ou duas vezes ou três vezes sob as condições de 50°C, 2 x SSC, 0,1 % de SDS.

Um tal gene homólogo ao óperon kdp pode ser obtido, por exemplo, pela modificação da região codificadora na sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 ou 7 pela mutagênese específica do sítio, de modo que a proteína codificada contenha substituições, deleções, inserções ou adições dos resíduos de aminoácidos de um sítio específico. Um tal gene pode também ser obtido pela seguinte mutagênese convencionalmente conhecida. No que diz respeito à mutagênese, um óperon codificando um sistema kdp altamente ativo pode ser obtido introduzindo-se artificialmente uma mutação no óperon kdp mediante o tratamento das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOS: 1 ou 7, ou uma região codificadora nestas sequências de nucleotídeos in vitro com hidroxilamina ou similar, ou tratando-se um microorganismo tendo o gene, por exemplo, um tal microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, com irradiação ultravioleta ou um mutágeno usado para a mutagênese usual, tal como a N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) ou metanossulfonato de etila (EMS), ou por recombinação de genes com base na PCR propensa a erro [Cadwell, R. C., PCR Meth. Appl., 2, 28 (1992)], embaralhamento do DNA [Stemmer, W. P., Nature, 370, 389 (1994)], ou StEP-PCR [Zhao, H., Nature BiotechnoL, 16, 258 (1998)]. O fato de o homólogo do óperon kdp codificar a ATPase do tipo P pode ser confirmado, por exemplo, introduzindo-se o gene em um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae e tendo capacidade de produzir L-aminoácido, e determinando-se se a capacidade de produzir L-aminoácido é melhorada ou medindo-se a atividade da ATPase do tipo P pelo método acima mencionado.

As descrições acima concernentes às variantes e homólogos são também aplicadas ao gene kdpD e ao gene kdpE descrito mais abaixo.

Tal modificação de um microorganismo pertencente à família Enterobacteriaceae, de acordo com a qual a expressão do óperon kdp ou de um ou mais genes constituindo o óperon é aumentada, pode ser alcançada pelo método acima mencionado de modificar uma bactéria de modo que a expressão de um gene alvo seja intensificada. A saber, pelo aumento do número de cópias do óperon kdp ou cada gene constituindo o óperon a ser expresso, e/ou substituindo-se a sequência de controle da expressão do óperon por uma sequência de controle da expressão mais forte, ou pelo controle de cada gene que constitui o óperon por uma sequência de controle da expressão mais forte, a expressão do óperon ou de cada gene pode ser intensificada. Não obstante a intensificação da expressão dos genes que constituem o óperon kdp possa ser realizada quanto ao óperon inteiro ou a cada gene, a intensificação é preferivelmente realizada quanto ao óperon inteiro. Quando a expressão é intensificada para cada gene individual, o gene a ser intensificado pode ser qualquer um dos genes que constituem o óperon kdp, mas é preferível intensificar a expressão de pelo menos uma ou mais espécies de genes entre os genes kdpA, kdpB e kdpC, mais preferível todos os genes kdpA, kdpB e kdpC. O sistema kdp pode também ser intensificado pela modificação de uma sequência de espaçador entre o sítio de ligação ribossômica (RBS) e o códon de partida de cada gene, de modo que a translação de cada gene que constitua o óperon kdp seja aumentada.

Além disso, sabe-se que a expressão do óperon kdp é controlada pelo sistema de controle binário KdpDE codificado pelo gene kdpD e pelo gene kdpE (J. Bacteriol., abril de 1992, 174 (7): 2152-2159), e a expressão do óperon kdp pode também ser aumentada pelo aumento da expressão do gene kdpD e do gene kdpE.

<2> MÉTODO PARA PRODUZIR O L-AMINOÁCIDO DA PRESENTE INVENÇÃO

Pelo cultivo do microorganismo da presente invenção em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio e coletar o L-aminoácido do meio, o L-aminoácido pode ser produzido.

Como o meio usado para o cultivo, um meio usual contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais minerais, assim como nutrientes orgânicos de traço como os aminoácidos e as vitaminas, quando necessário, podem ser usados. Qualquer espécie de fonte de carbono e de fonte de nitrogênio pode ser usada, contanto que elas possam ser utilizadas por uma cepa a ser cultivada. Açúcares tais como glicose, glicerol, fratose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisados de amido e melaços podem ser usados como fontes de carbono. Além disso, ácidos orgânicos tais como o ácido acético e o ácido cítrico, e álcoois tais como o etanol, podem também ser usados, cada um isoladamente ou em combinação com outras fontes de carbono. A amônia, os sais de amônio tais como o sulfato de amônio, o carbonato de amônio, o cloreto de amônio, o fosfato de amônio e o acetato de amônio, sais de ácido nítrico, e assim por diante, podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléico, esses contendo aquelas substâncias tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedura e produto da decomposição da proteína de soja, e assim por diante, podem ser usados como os nutrientes orgânicos de traço. Quando é usada uma cepa mutante auxotrófica que requeira um aminoácido ou similar para seu crescimento, é preferível suplementar o nutriente requerido.

Em particular, quando um meio líquido preparado de modo a satisfazer uma condição para precipitar o ácido L-glutâmico é usado, a adição do ácido pantotênico ao meio provê precipitação mais eficiente do ácido L-glutâmico (WO 2004/111258). Como sais inorgânicos, os sais de ácido fosfórico, os sais de magnésio, os sais de cálcio, os sais de ferro, o sal de manganês, e assim por diante, podem ser usados. A cultura é preferivelmente realizada como cultura aeróbica, enquanto a temperatura de fermentação é controlada para ser de 20 a 45°C, e o pH para ser de 3 a 9. Quando o pH é reduzido durante a cultura, carbonato de cálcio pode ser adicionado, ou a cultura é neutralizada com uma substância alcalina tal como gás amoníaco. O L-aminoácido alvo é acumulado no meio de cultura após preferivelmente 10 a 120 horas de cultura sob condições tais como descrito acima.

Além disso, a cultura pode ser realizada com a precipitação de ácido L-glutâmico em um meio, pelo uso, como o meio, de um meio líquido ajustado para satisfazer a uma condição sob a qual o ácido L-gutâmico é precipitado. Os exemplos da condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado incluem o pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente de 4,5 a 4,0, mais preferível de 4,3 a 4,0, particularmente preferível de 4,0.

Quando o ácido L-glutâmico é precipitado no meio, a adição preliminar dos cristais de ácido L-glutâmico ou de L-lisina como cristais sementes podem proporcionar cristalização mais eficiente (Patente Européia nfi 1233069, Patente Européia Aberta ao Público n° 1624069). A coleta do L-aminoácido do caldo de cultura após a cultura pode ser realizada por um método de coleta conhecido. Por exemplo, após as células terem sido removidas do meio de cultura, o L-aminoácido pode ser coletado mediante concentração do meio para cristalizar o L-aminoácido, por cromatografia de troca de íons, ou similar. Quando a cultura é realizada sob uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado, o ácido L-glutâmico precipitado no meio pode ser coletado por centrifugação ou por filtração. Neste caso, o ácido L-glutâmico dissolvendo-se no meio pode ser precipitado e depois separado junto com o ácido L-glutâmico já precipitado.

Quando um aminoácido básico é produzido, a produção pode ser realizada por um método no qual a fermentação seja realizada mediante o controle do pH do meio durante a cultura de modo a ser de 6,5 a 9,0, e do pH do meio após a conclusão da cultura de modo a ser de 7,2 a 9,0, e o controle da pressão no tanque de fermentação durante a fermentação para que seja positiva, ou provendo dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono ao meio de modo que exista um período em que os íons de bicarbonato e/ou os íons de carbonato estejam presentes em uma quantidade de pelo menos 2 g/litro no meio de cultura durante a cultura, e estes íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato sirvam como contra-íons de cátions principalmente consistindo do aminoácido básico, e o aminoácido básico alvo seja coletado (referir-se à Patente Japonesa Aberta ao Público no 2002065287, Publicação do Pedido de Patente U.S. n2 2002025564).

EXEMPLOS

Daqui por diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes mediante referência aos exemplos. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 Construção da cepa de Pantoea ananatis resistente ao produto do gene λ Red Para amplificar o óperon Mp em Pantoea ananatis, foi construída uma cepa receptora que realiza o método denominado “integração conduzida por Red” ou “integração mediada por Red” [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 6640-6645 (2000)].

Primeiramente, o novo plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER, que expressa os genes gam, bet e exo de λ (doravante referidos como “genes λ Red”) foi construído (Figura 1). Os detalhes destes serão descritos no Exemplo de Referência 2.

Este plasmídeo pode ser usado em uma ampla faixa de hospedeiros tendo diferentes fundamentos genéticos. Isto é porque 1) este plasmídeo tem o réplicon do plasmídeo RSF1010 de amplo espectro de hospedeiros (Scholz et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987), o qual pode ser estavelmente mantido por muitos tipos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, e ainda células de plantas, 2) os genes λ Red, gam, bet e exo, se acham sob o controle do promotor PlacUV5, o qual é reconhecido pelas RNA polimerases de muitos tipos de bactérias [por exemplo, Brunschwig, E. e Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)], e 3) o fator de autorregulação PlacUV5~lacI e o terminador da transcrição não dependente de p (TrrnB) do óperon rrnB de Escherichia coli inferior ao nível de expressão basal dos genes λ Red [Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus.), 5, 3-21 (2004)]. Além disso, o plasmídeo RSF-Red-TER contém o gene levansacarase e, mediante o uso deste gene, o plasmídeo pode ser coletado das células em um meio contendo sacarose.

Em Escherichia coli, a frequência de integração de um fragmento de DNA gerado por PCR junto com a região de flanqueio curta provida pelo plasmídeo RSF-Red-TER, é tão elevada quanto a frequência obtenível com o uso do plasmídeo auxiliar pKD46 [Datsenko, K. A., Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)]. Entretanto, a expressão dos genes λ Red é tóxica à Pantoea ananatis. As células transformadas com o plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER crescem de forma extremamente lenta no meio LB contendo IPTG (isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo, 1 mM) e um antibiótico apropriado (25 pg/ml de cloranfenicol ou 40 pg/ml de canamicina), e a eficiência da recombinação mediada por λ Red é extremamente lenta (10'8), se observada sob qualquer condição.

Uma cepa variante de Pantoea ananatis, que seja resistente à expressão de todos os três genes λ Red, foi selecionada. Para este fim, o plasmídeo RSF-Red-TER foi introduzido na cepa SCI7 de Pantoea ananatis (Patente U.S. n~ 6.596.517) por eletroporação. Após uma cultura de 18 horas, cerca de 106 transformantes foram obtidos e, entre estes, 10 clones formaram colônias de grande dimensão, e todo o remanescente formaram colônias extremamente pequenas. Após uma cultura de 18 horas, as grandes colônias tinham um tamanho de cerca de 0,2 mm, ao passo que as pequenas colônias não cresceram nada, mesmo que a cultura fosse estendida por outras 24 horas, as grandes colônias continuaram a crescer. Uma das cepas mutantes de Pantoea ananatis das grandes colônias e resistentes à expressão de todos os três genes λ Red (gam, bet e exo), foi usada para a outra análise. O DNA plasmídeo RSF-Red-TER foi isolado de um clone dos clones das grandes colônias, e de vários clones das colônias pequenas, e transformado novamente no Escherichia coli MG 165 5 para se examinar a capacidade do plasmídeo para sintetizar um produto ativo do gene Red. Por uma experiência de controle para integração dependente de Red nos transformantes obtidos, foi demonstrado que apenas o plasmídeo isolado do clone de grandes colônias induziu a expressão dos genes λ Red requeridos para a integração dependente de Red. De modo a pesquisar se a integração mediada por Red ocorrera no clone selecionado de grandes colônias, a eletroporação foi realizada com o uso de um fragmento linear de DNA produzido por PCR. Este fragmento foi projetado de modo contivesse um marcador KmR e uma região de flanqueio de 40 pares de base homóloga ao gene hisD. Este fragmento é integrado no gene hisD de Pantoea ananatis no sítio de reconhecimento Smal. Dois clones de colônias pequenas foram usados como controle. A sequência de nucleotídeos do gene hisD de Pantoea ananatis é mostrada na SEQID NO: 14. Para a PCR, os oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 15 e 16 foram usados como iniciadores, e o plasmídeo pMW118-^att-Kmr-Xatt) foi usado como o padrão. Os dois clones de colônias pequenas que não foram resistentes aos genes λ Red foram usados como um controle. A construção do plasmídeo pMW118-(ÀattL-Kmr-XattR) será explicada em detalhes no Exemplo de Referência 3. O plasmídeo RSF-Red-TER pode induzir a expressão dos genes Red pelo gene lacl exercida no plasmídeo. Duas espécies de condições de indução foram pesquisadas. No primeiro grupo, IPTG (1 mM) foi adicionado 1 hora antes da eletroporação, e no segundo grupo, IPTG foi adicionado no início da cultura para a preparação das células das quais a eletroporação é possível. O índice de crescimento das células abrigando o RSF-Red-TER derivado do clone das grandes colônias, não foi significativamente inferior àquele de uma cepa não tendo o plasmídeo SC 17. A adição de IPTG apenas levemente reduzir o índice de crescimento destas culturas. Por outro lado, a progênie dos clones das pequenas colônias cresceu de forma extremamente lenta, mesmo sem a adição de IPTG, e, após a indução, o crescimento foi substancialmente interrompido. Após a eletroporação das células da progênie do clone de grandes colônias, muitos clones KmR cresceram (18 clones após um curto tempo de indução, e cerca de 100 clones após um período de indução prolongado). Todos os 100 clones que foram pesquisados tinham um fenótipo His", e cerca de 20 clones foram confirmados por PCR como tendo a estrutura de cromossoma esperada nas células. Por outro lado, mesmo quando a eletroporação foi realizada com a progênie dos clones de pequenas colônias, uma cepa integrada não foi obtida. O clone de grandes colônias obtido foi cultivado sobre uma placa contendo 7 % de sacarose para eliminar o plasmídeo, e transformado novamente com RSF-Red-TER. A cepa sem o plasmídeo foi designada de SC 17 (0). Esta cepa foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms [VKPM, GNII Genetica (1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 21 de setembro de 2005, e recebeu um número de acesso de VKPM B-9246.

Todos os clones que cresceram após a retransformação acima mencionada apresentaram grandes tamanhos de colônia como o clone SC 17 (0) da cepa precursora. A experiência de integração mediada por Red foi realizada na cepa SC 17 (0) retransformada com o plasmídeo RSF-Red-TER. Três dos transformantes independentes foram pesquisados com o uso do mesmo fragmento de DNA como aquele usado para a experiência anterior. O tempo curto de indução (1 hora antes da eletroporação) foi empregado. Os clones KmR que excederam dez clones, cresceram em cada experiência. Todos os clones examinados. Todos os clones examinados tinham o fenótipo His\ Desta maneira, uma cepa mutante designada SC 17 (0) resistente à expressão dos genes λ Red foi selecionada. Esta cepa pôde ser usada como uma cepa receptora adequada para a integração dependente de Red no cromossoma de Pantoea ananatis. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO AUXILIAR RSF-Red- TER O esquema de construção do plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER é mostrado na Figura 2.

Como uma primeira etapa da construção, um vetor RSFsacBPlacMCS foi projetado. Para este fim, os fragmentos de DNA contendo o gene cat do plasmídeo pACYC184 e a região de gene estrutural do gene sacB de Bacillus subtilis foram amplificados por PCR com o uso dos oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 17 e 18, e 19 e 20, respectivamente. Estes oligonucleotídeos continham os sítios de enzimas de restrição Bglll, Saci, Xbal e BamHí, necessários e convenientes para outra clonagem, nas regiões de extremidade 5’, respectivamente. O fragmento sacB obtido de 1,5 kb foi clonado no vetor pMWl 19-P]aclacI previamente obtido no sítio Xbal-BamHI. Este vetor foi construído da mesma maneira daquele descrito quanto ao vetor pMW118-PiaclacI [Skorokhodova, A. Yu et al., Biotekhnologiya (Rus.), 5, 3-21 (2004)]. Entretanto, este vetor continha um componente poliligador derivado de pMW219 ao invés do plasmídeo pMW218.

Então, o fragmento cat acima mencionado de 1,0 kb foi tratado com Bglll e Saci, e clonado no plasmídeo RSF-PiaclacIsacB obtido na etapa anterior no sítio BamHl-Sacl. O plasmídeo obtido pMW-PiaclacIsacBcat continha o fragmento PlacUV5-lacI-sacB-cat. A fim de subclonar este fragmento no vetor RSF1010, pMW-PiaclacIsacBcat foi digerido com Bglll, a extremidade embotada com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, e sucessivamente digerido com Saci. Um fragmento BgllI-SacI de 3,8 kb do plasmídeo pMWPiaclacIsacBcat foi eluído de 1 % de gel de agarose, e ligado com o vetor RFS1010 que havia sido tratado com PstI e Saci. Escherichia coli TG1 foi transformado com a mistura de ligação, e plaqueado sobre o meio LB contendo cloranfenicol (50 mg/lítro). Os plasmídeos isolados dos clones desenvolvidos foram analisados com enzimas de restrição para se obter um plasmídeo RSFsacB. De modo a construir um vetor RSFsacBPiacMCS, um fragmento de DNA contendo o promotor Piacuv5 foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 21 e 22 como iniciadores e o plasmídeo pMW119-P]aclacI como o padrão. O fragmento obtido de 146 pares de base foi digerido com Saci e Notl, e ligado com o fragmento grande Saci-Notl do plasmídeo RSFsacB. Depois, por PCR com o uso dos oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 23 e 24 como iniciadores, e o plasmídeo pKD46 [Datsenko, K. A., Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)] como padrão, um fragmento de DNA de 2,3 kb contendo os genes kRedapy e o terminador de transcrição tL3, foi amplificado. O fragmento obtido foi clonado no vetor RSFsacBPiacMCS no sítio Pvul-NotL Deste modo, o plasmídeo RSFRed foi projetado.

De modo a eliminar a leitura através da transcrição dos genes Red, um terminador da transcrição dependente de p do óperon rrnB de Escherichia coli foi introduzido em uma posição entre o gene cat e o promotor Piacuv5· Para esta finalidade, um fragmento de DNA contendo o promotor Piacuv5 e o terminador TrmB foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 25 e 22 como iniciadores e o cromossoma de Escherichia coli BW3350 como um padrão. Estes fragmentos obtidos foram tratados com Kpnl e ligados. Depois, o fragmento de 0,5 kb contendo tanto Piacuv5 quanto TrmB foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos das SEQ ID NOS: 22 e 26 como iniciadores. O fragmento de DNA obtido foi digerido com EcoRI, a extremidade embotada por um tratamento com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, digerido com BamHI, e ligado com o grande fragmento Ecll36II-BamHI do vetor RSFsacBPlacMCS. O plasmídeo obtido foi designado RSF-Red-TER. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pMWl 18-(kattL-KmT- λattR) O plasmídeo pMW118-(XattL-Kmr^attR) foi construído do plasmídeo pMW118-attL-Tc-attR (WO 2005/010175) mediante substituição do gene marcador de resistência à tetraciclina com o gene de resistência à canamicina do plasmídeo pUC4K. Com essa finalidade, o fragmento grande EcoBI—HindLll do plasmídeo pMW118-attL-Tc-attR foi ligado a dois fragmentos do plasmídeo pUC4K: o fragmento HindUl-Pstl (676 pares de base) e o fragmento EcoBJ-Hindlll (585 pares de base). O pMWl 18-attL-Tc-attR básico foi obtido pela ligação dos seguintes quatro fragmentos: 1) 0 fragmento BgM-EcoRl (114 pares de base) incluindo attL (SEQ ID NO: 29) que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente ao attL do cromossoma de Escherichia coli W3350 (contendo o profago λ) com o uso dos iniciadores PI e P2 (SEQ ID NOS: 27 e 28) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Bglll e EcóRI). 2) O fragmento PstI-HinâUI (182 pares de base) incluindo attR (SEQ ID NO: 32) que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente ao attR do cromossoma de Escherichia coli W3350 (contendo o profago λ) com o uso dos iniciadores P3 e P4 (SEQ ID NOS: 30 e 31) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstl e Hindlll). 3) O grande fragmento BgM-Hindlll (3916 pares de base) do pMW118-ter_rmB. O plasmídeo pMW118-ter_rmB foi obtido pela ligação dos seguintes três fragmentos de DNA: - O grande fragmento de DNA (2359 pares de base) incluindo o fragmento ÀatlI-EcoRI de pMW118 que foi obtido pela digestão do pMW118 com EcoJH, tratamento com o fragmento Klenow de DNA polimerase I, e depois digestão com Aatll; - O pequeno fragmento Aatll-BgRl (1194 pares de base) de pUC19 incluindo o gene bla para resistência à ampicilina (ApR), que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente do plasmídeo pUC19 com o uso dos iniciadores P5 e P6 (SEQ ID NOS: 33 e 34) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstl, Aatll e Bglll); - O pequeno fragmento Bglll-Pstlpol (363 pares de base) do terminador da transcrição terjrnB, que foi obtido por amplificação de PCR da região correspondente do cromossoma de Escherichia coli MG1655 com o uso dos iniciadores P7 e P8 (SEQ ID NOS: 35 e 36) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstl, BglU e Pstl). 4) O pequeno fragmento EcoRI-Pstl (1388 pares de base) (SEQ ID NO: 37) de pML-Tc-ter_thrL incluindo o gene de resistência à tetraciclina e o terminador da transcrição ter_thrL; o plasmídeo pML-Tc-terJhrL foi obtido pelas seguintes duas etapas: - o plasmídeo pML-ter_//zrL foi obtido pela digestão do plasmídeo pML-MCS [Mashko, S. V. et al., Biotekhnologiya (em Russo), 2001, na 5, 3-20) com Xbal e BamUH, seguido pela ligação do grande fragmento (3342 pares de base) com o fragmento Xbal-BamHl (68 pares de base) carregando o terminador ter_thrL obtido por amplificação de PCR da região correspondente do cromossoma de Escherichia coli MG1655 com o uso dos iniciadores P9 e PIO (SEQ ID NOS: 38 e 39) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários Pstl, Xbal e BamHl); - o plasmídeo pML-Tc-ter jhrL foi obtido pela digestão do plasmídeo pML-tei_thrL com Kpnl e Xbal, seguida pelo tratamento com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, e ligado com o pequeno fragmento EcoBI-Van91l (1317 pares de base) de pBR322 incluindo o gene de resistência à tetraciclina (pBR322 foi digerido com EcoBl e Van911 e depois tratado com o fragmento Klenow da DNA polimerase I). EXEMPLO 1 AQUISIÇÃO DA CEPA SUBSTITUÍDA PELO PROMOTOR DO ÓPERON kdp (1) CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO RSFPPG

PRODUTOR DO ÁCIDO GLUTÂMICO

Um plasmídeo RSFPPG foi construído, no qual os genes do sistema da biossíntese do ácido L~glutâmico, o gene prpC (Publicação da Patente Internacional WO 2006/051660), o gene ppc e o gene gdhA (EP 0999282A), foram amplificados. O iniciador 1 (SEQ ID NO: 40) e o iniciador 2 (SEQ ID NO: 41) para amplificar uma parte do RSFCPG (EP 1233068A) outro que não ORF do gene gltA, foram projetados. Mediante o uso destes iniciadores e RSFCPG como o padrão, a PCR foi realizada para se obter um fragmento de cerca de 14,9 kb. No que diz respeito ao prpC, a PCR foi realizada com o uso do iniciador 3 (SEQ ID NO: 42) e do iniciador 4 (SEQ ID NO: 43) e do DNA cromossômico da cepa W3110 de E. coli como o padrão, para se obter um fragmento de cerca de 1,2 kb. Ambos os produtos de PCR foram tratados com Bglll e Kpnl, ligados, e depois usados para transformar a cepa JM109 de E. coli. Todas as colônias formadas foram coletadas e os plasmídeos foram extraídos das colônias como uma mistura. A cepa ME8330 de E. coli, que é uma cepa deficiente de citrato sintase (CS), foi transformada com a mistura de plasmídeos, e a suspensão celular foi aplicada no meio mínimo M9 (contendo 5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água pura) contendo 50 mg/litro de uracila e 5 mg/litro de HC1 de tiamina. Das cepas formadas, um plasmídeo foi extraído e designado RSFPPG. Este plasmídeo RSFPPG foi introduzido na cepa NP 106 de Pantoea ananatis, a qual é uma cepa produtora de ácido L-glutâmico, para construir uma cepa produtora de ácido L-glutâmico, NP106/RSFPPG (esta cepa é referida como a “cepa NA1”). A cepa NP 106 foi obtida como segue. A cepa AJ13601 de Pantoea ananatis descrita acima foi cultivada durante a noite em 34°C no meio líquido LBGM9 com agitação, e depois o meio foi diluído de modo que 100 a 200 colônias aparecessem por placa e foram aplicadas a uma placa de LBGM9 contendo 12,5 mg/litro de tetraciclina. As colônias que apareceram foram replicadas em uma placa de LBGM9 contendo 12,5 mg/litro de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, e uma cepa que foi sensível ao cloranfenicol foi selecionada para se obter uma cepa da qual o pSTVCB fosse eliminado, a qual foi designada G106S. A cepa G106S foi ainda cultivada durante a noite em 34°C no meio líquido de LBGM9 com agitação, e o meio foi diluído de modo que 100 a 200 colônias aparecessem por placa, e aplicado a uma placa de LBGM9 sem medicamentos. As colônias que apareceram foram replicadas em uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/litro de tetraciclina, e uma placa de LBGM9 sem medicamentos, e uma cepa que resultou sensível à tetraciclina foi selecionada para se obter uma cepa da qual o RSFCPG fosse eliminado, a qual foi designada NP106. A NP 106 obtida como descrito acima é uma cepa não contendo nenhum dos dois plasmídeos RSFCPG e pSTVCB, os quais são abrigados pela cepa AJ13601. (2) AQUISIÇÃO DA CEPA NA QUAL O PROMOTOR DO ÓPERON kdp FOI SUBSTITUÍDO PELO PROMOTOR tac i) A construção da cepa SC 17 (0) de P. ananatis na qual a sequência contendo TattL-KnfAattR e o promotor Ptac ligado a jusante (lattL-Kmr^attR-Ptac) foi integrada a montante do gene lacZ O promotor Ptac foi integrado no cromossoma da cepa SC 17 (0) de P. ananatis em uma posição a montante do gene lacZ. A estrutura da região do cromossoma de P. ananatis a montante do gene LacZ é mostrada na Figura 3. As sequências de nucleotídeos dos genes yghU, scrK e lacZ de Pantoea ananatis são apresentadas nas SEQ ID NOS: 44, 45 e 46. A sequência da região -35 do promotor Ptac é ttgaca. O fragmento do promotor Ptac foi amplificado por PCR com o uso do iniciador 1 de 5’ (SEQ ID NO: 47) e iniciador 2 de 3’ (SEQ ID NO: 48) correspondente ao promotor Ptac, e o plasmídeo pDR540 (Pharmacia, Suécia) como um padrão. Ambos os iniciadores continham uma sequência de reconhecimento BglII na extremidade 5’. O iniciador 2 continha 46 nucleotídeos da parte de extremidade 3 ’ de Ptac, sequência SD, e uma parte de início da região codificadora do gene lacZ.

Um fragmento de DNA contendo um gene de resistência Km removível flanqueando os sítios attL e attR de λ foi também amplificado por PCR com o uso de pMW118-(kattL-Rmr^attR) como um padrão, e o iniciador 3 (SEQ ID NO: 49) e o iniciador 4 (SEQ ID NO: 50). O fragmento obtido tinha um sítio de reconhecimento BglII para ligação com o fragmento do promotor tac em uma extremidade, e um sítio correspondente a uma : sequência homóloga ao cromossoma de Pantoea ananatis e localizando-se a montante do gene scrK para integração no genoma bacteriano na outra extremidade (Figura 3). Dois dos fragmentos do produto de PCR foram tratados com Bglll, e ligados in vitro com a DNA T4 ligase. A mistura de reação da ligação foi usada para a integração i dependente de λ no cromossoma de Pantoea ananatis. O plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER foi usado como um portador dos genes Red de fago λ. De modo a obter-se células eletrocompetentes da Pantoea ananatis, a cepa SC 17 (0) foi transformada com o plasmídeo RSF-Red-Ter, e cultivada durante a noite em 34°C em meio LB contendo 50 pg/ml de cloranfenicol. Depois, o caldo de cultura foi diluído 100 vezes com meio LB recente contendo 50 pg/ml de cloranfenicol, e o crescimento das células foi deixado em 34°C sob aeração até que a OD60o se tomasse de 0,3. Então, IPTG 1 mM foi acrescentado e a cultura prosseguiu até que a OD6oo se tomasse de 0,7. Uma amostra de 10 mM foi lavada por 3 vezes com um volume igual de água deionizada, e as células foram colocadas em suspensão em 40 pl de glicerol frio a 10 %. Imediatamente antes da eletroporação, 100 a 200 ng de fragmento de DNA amplificado in vitro dissolvido em 5 pl de água deionizada, foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi feita pelo uso de um aparelho de eletroporação de bactérias (BioRad, Estados Unidos, Catálogo número 165-2089, Versão 2-89). Os parâmetros do pulso usado foram de uma intensidade de campo de 20 kV/cm, e um tempo de pulso de 5 milissegundos.

Após a eletroporação, 1 ml de meio LB suplementado com glicose (0,5 %) foi imediatamente adicionado à suspensão celular. Depois, as células foram deixadas crescer em 34°C por 2 horas sob aeração, plaqueadas em meio sólido de mLB contendo 40 μg/ml de cloranfenicol, e incubadas durante a noite em 34°C. O integrante KmR selecionado foi estriado sobre placa de meio LB a qual IPTG (1 mM) e sacarose (5 g/litro) foram adicionados, e cultivado em 34°C para possibilitar a formação de colônias isoladas. De modo a remover o plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER do integrante, as variantes Km e Cm foram isoladas.

As estruturas cromossômicas das colônias selecionadas KmR e e Cm foram confirmadas por sequenciação de nucleotídeos. ii) SUBSTITUIÇÃO DO PROMOTOR DO ÓPERON kdp PELO PROMOTOR tac Dois iniciadores sintéticos de DNA apresentados nas SEQ ID NOS: 51 e 52 foram sintetizados de uma maneira convencional. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 51 tinha uma estrutura que uma sequência homóloga da região de montante do óperon kdp de Pantoea ananatis foi seguida por uma sequência homóloga da extremidade 5’ de AattL-Kmr-LattR-Ptac. O iniciador da SEQ ID NO: 52 tinha uma estrutura que uma sequência complementar de extremidade 5’ contendo o primeiro códon de partida do óperon kdp de Pantoea ananatis foi seguida por uma sequência complementar de extremidade 3’ de λ attL-Kmr-LattR-Ptac. Pela realização da PCR com o uso destes iniciadores e o DNA cromossômico da cepa selecionada em i) como o padrão, um fragmento de 1,6 quilopares de base da sequência LattL-Kmr^attR-Ptac tendo a sequência homóloga da região a montante do óperon kdp na extremidade 5’ e a sequência homóloga na extremidade 5’ contendo o primeiro códon de partida do óperon kdp na extremidade 3’, foi amplificado. O fragmento de PCR acima mencionado foi purificado e introduzido no SC17(0)/RSF-Red-TER por eletroporação de uma maneira convencional. A cepa SC17(0)/RSF-Red-TER, na qual o fragmento de PCR foi introduzido, foi selecionada sobre meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) contendo 40 mg/litro de canamicina para se obter cerca de 20 colônias como transformantes. A introdução do fragmento acima mencionado na região de montante do óperon kdp, foi confirmada por PCR com o uso de dois iniciadores sintéticos de DNA apresentados nas SEQ ID NOS: 53 e 54, e uma cepa para a qual a inserção do fragmento pôde ser confirmada foi designada SC17(0)::Ptac-kdp. O DNA genômico foi extraído desta cepa, e usado para transformar a cepa NAl/pSTV-yhfK por eletroporação. A cepa NAl/pSTV-yhfK foi obtida da cepa AJ13601 (referir-se à Patente Japonesa Aberta ao Público na 2001-333769) pela eliminação de dois plasmídeos, o RSFCPG e o pSTVCB, e introdução de dois plasmídeos, o plasmídeo para a produção do ácido L-glutâmico, RSFPPG, e pSTV-yhfK (referir-se à Patente Japonesa Aberta ao Público n~ 2005-278643).

Ambos os plasmídeos RSFCPG e pSTVCB são apresentados na Patente Japonesa Aberta ao Público no 2001-333769. O RSFCPG é um plasmídeo contendo os genes gltA, ppc e gdhA derivados de Escherichia coli. O pSTVCB é um plasmídeo obtido pela introdução do gene gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum no pSTV29 (Takara Shuzo). O pSTV-yhfk é um plasmídeo obtido pela introdução do gene yhfk derivado de Pantoea ananatis no pSTV29 (Takara Shuzo). A cepa NAl/pSTV-yhfK, dentro da qual o DNA genômico de SC17(0)::Ptac-kdp foi introduzido, foi selecionada em uma placa do meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) que foi suplementado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água purificada), 40 mg/litro de canamicina, 12,5 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol. Como resultado, cerca de 20 colônias foram obtidas como transformantes. Em todas estas cepas, o fragmento de ÀattL-Kmr^attR-Ptac foi introduzido a montante do óperon kdp, e um clone entre elas foi selecionado e designado NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK.

(3) AVALIAÇÃO DA CULTURA DA CEPA SUBSTITUÍDA PELO PROMOTOR DO ÓPERON kdp NO TUBO DE TESTE

Em seguida, de modo a examinar-se o efeito da intensificação do óperon kdp no crescimento, a cultura foi realizada nos tubos de teste. A cepa NALPtac-kdp/pSTV-yhfK e a cepa NAl/pSTV-yhfK como um controle foram usadas, e o crescimento delas sob uma condição acídica foi examinado. [Composição do meio para a cultura do tubo de teste] D-glicose 0,5 % Na2HP04 6,0 g/litro KH2P04 3,0 g/litro NaCl 0,5 g/litro NH4CI 1,0 g/litro MgS04-7H20 2,0 mM r Acido ε-diaminopimélico 200 mg/litro Cloridreto de L-lisina 200 mg/litro DL-Metionina 200 mg/litro Ácido L-glutâmico 30 g/litro Cloridreto de tetraciclina 12,5 mg/litro Cloranfenicol 25 mg/litro O meio foi ajustado a pH 4,5 ou pH 4,9 com amônia aquosa, e depois foi filtrado.

As cepas NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK e NAl/pSTV-yhfK foram, cada uma, pré-cultivadas no meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) que foi suplementado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água purificada), 12,5 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, e as células correspondentes a 1/8 da placa foram raspadas, lavadas duas vezes com solução salina fisiológica, e finalmente colocadas em suspensão em 1 ml de solução salina fisiológica. A suspensão, em um volume de 20 μΐ, foi inoculada em 5 ml do meio para cultura no tubo de teste contida em um tubo de teste, e cultivada em 34°C com agitação. Durante a cultura, a OD (660 nm) foi medida a cada 30 minutos com o uso de um medidor de OD automático (TN1506 BIO PHOTORECORDER, ADVANTEC). Os resultados são mostrados na Figura 4.

Em comparação com a cepa NAl/pSTV-yhfK como um controle, a cepa intensificada por kdp, a cepa NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK, apresentaram melhoramento do crescimento sob condições acídicas de pH 4,5 ou pH 4,9. Assim, o efeito da intensificação do óperon kdp para melhorar o crescimento e o índice de produção de ácido L-glutâmico, foi demonstrado por estes resultados. (4) AVALIAÇÃO DA CULTURA DA CEPA SUBSTITUÍDA PELO PROMOTOR DO ÓPERON KDP EM S-jar Então, de modo a examinar o efeito da intensificação do óperon kdp sobre a produção do ácido L-glutâmico, a cultura de produção do ácido L-glutâmico foi realizada pelo uso da cepa NA1 :Ptac-kdp/pSTV-yhíK e da cepa NAl/pSTV-yhfK. A cultura foi realizada por duas etapas de cultura de sementes para permitir a formação das células e a cultura principal para produzir ácido L-glutâmico. A cultura das sementes foi realizada com a seguinte composição de meio.

[Composição do meio de cultura das sementes] Sacarose 50 g/litro MgS04-7H20 0,4 g/litro GD113 (antiespuma) 0,1 ml/litro (NH4)2S04 4,0 g/litro KH2PO4 2,0 g/litro Extrato de levedura 4,0 g/litro FeS04-7H20 0,01 g/litro MnS04-5H20 0,01 g/litro Ácido cítrico 0,02 g/litro Cloridreto de L-lisina 0,4 g/litro DL-Metionina 0.4 g/litro Ácido ε-diaminopimélico 0,4 g/litro Pantotenato de cálcio 18mg/litro Cloridreto de tetraciclina 12,5 mg/litro Cloranfenicol 25 mg/litro O meio foi esterilizado com vapor em 120°C por 20 minutos. As cepas NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK e NAl/pSTV-yhfK foram, cada uma, pré-cultivadas no meio L (meio contendo 10 g de Bactotriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar, em 1 litro de água purificada, pH 7,0) que foi suplementado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água purificada), 12,5 mg/litro de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, e as células correspondentes a uma placa foram inoculadas em 300 ml do meio da composição acima mencionada contida em uma minijarra de 1 litro de volume, e a agitação foi controlada em 34°C e pH de 6,0 por cerca de 12 horas de modo que a aeração de 1/1 vvm e uma concentração de oxigênio de 3 % ou mais fosse obtida. Durante a cultura, ο ρΗ foi controlado de modo a ser de 6,0 com a adição de gás amoníaco. A cultura das sementes terminou no momento da depleção do sacarídeo no meio observado como um índice. A composição do meio de cultura principal é mostrada abaixo. [Composição do meio de cultura] (As concentrações são aquelas após a inoculação de 20 % do meio de cultura das sementes) Sacarose 100 g/litro MgS04*7H20 0,4 g/litro GDI 13 0,1 ml/litro (NH4)2S04 5,0 g/litro KH2P04 6,0 g/litro Extrato de levedura 6,0 g/litro FeS04-7H20 0,02 g/litro MnS04*5H20 0,02 g/litro r Acido cítrico 0,02 g/litro Betaína* 2,0 g/litro Cloridreto de L-lisina 0,8 g/litro DL-Metionina 0,6 g/litro r Acido ε-diaminopimélico 0,6 g/litro Pantotenato de cálcio 18 mg/litro Cloridreto de tetraciclina 25 mg/litro Cloranfenicol 25 mg/litro * Ν,Ν,Ν-trimetilglicina As células obtidas pela cultura das sementes em um volume de 60 ml foram inoculadas em 240 ml de meio tendo a composição acima mencionada contida em um minijarro de 1 litro de volume, e cultivadas em pH 4,7. A cultura foi terminada 16 horas após o início da cultura principal. A densidade celular e a concentração de ácido L-glutâmico no meio de cultura foram medidas através do tempo. A densidade celular foi examinada pela medição da turbidez do meio de cultura diluído 101 vezes com água em 620 nm com o uso de um espectrofotômetro (U-2000A, Hitachi). A concentração do ácido L-glutâmico foi medida quanto ao sobrenadante da cultura apropriadamente diluído com água mediante o uso do Biotech Analyzer (AS-210, Sakura SI).

Os resultados são apresentados na Tabela 1 e na Figura 5. Ficou claro que o crescimento, bem como o acúmulo do ácido L-glutâmico e o índice de produção do ácido L-glutâmico da cepa intensificada pelo óperon kdp, a cepa NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK, foram melhorados em comparação com a cepa comparativa, a cepa NAl/pSTV-yhfK. TABELA 1 EXEMPLO 2 AMPLIFICAÇÃO DO ÓPERON kdp NO Escherichia coli DE ACUMULAÇÃO DA L-TREONINA (1) CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO PARA AMPLIFICAÇÃO DO ÓPERON kdp De modo a introduzir o óperon kdp em uma bactéria de Escherichia, um plasmídeo para amplificação do óperon kdp é construído mediante o uso de um plasmídeo conhecido pMW218 (Takara Shuzo). O pMW218 é primeiro digerido com as enzimas de restrição Hindlll e BamHl, e a reação é terminada pela adição de uma solução de fenol/clorofórmio e misturando-os. A mistura de reação é centrifugada, depois a camada superior é coletada, e os DNAs são coletados pela precipitação de etanol. O óperon kdp é separadamente amplificado por PCR com o uso do cromossoma extraído do Escherichia coli MG1655 como o padrão e os iniciadores de DNA apresentados nas SEQ ID NOS: 55 e 56 (desnaturação em 94°C por 10 segundos, recozendo-se em 60°C por 30 segundos, e extensão em 72°C por 120 segundos). Para a PCR, Pyrobest DNA polimerase (Takara Shuzo) é usado. O fragmento de óperon kdp obtido é digerido com as enzimas de restrição Hindlll e BamEl, e a reação é terminada pela adição de uma solução de fenol/clorofórmio, e misturando-os. O digerido pMW218 e o fragmento da região do gene kdpABC preparados como descrito acima, são ligados pelo uso do Kit de Ligação de DNA Versão 2 (Takara Shuzo). Escherichia coli (células competentes JM109 de E. coli, Takara Shuzo) é transformado com a solução de ligação, aplicada ao meio de ágar de LB contendo 50 mg/litro de canamicina, e incubada durante a noite em 37°C. As colônias que apareceram sobre o meio de ágar são inoculadas no meio líquido de LB contendo 50 mg/litro de canamicina, e cultivadas em 37°C por 8 horas com agitação. O DNA plasmídeo é extraído de cada meio de cultura pelo método de SDS alcalino, e sua estrutura é confirmada pela digestão com as enzimas de restrição para se obter pMW218kdp. (2) INTRODUÇÃO DE pMW218kdp NO Escherichia coli B-3996 DE ACÚMULO DA TREONINA E PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDO. O pMW218kdp obtido como descrito acima é introduzido na cepa VKPM B-3996 pelo método de eletroporação \Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)]. O transformante obtido (esta cepa é denominada “B-3996/pMW218kdp”) e a cepa em que pMW218 é introduzido como um controle (esta cepa é denominada “B-3996/pMW218”) são cultivados como segue, e as concentrações de L-treonina nos sobrenadantes da cultura são examinados.

Cada transformante é inoculado em 3 ml do meio líquido de LB contendo 50 mg/litro de canamicina e 20 mg/litro de estreptomicina, e cultivado durante a noite em 37°C em um tubo de teste, depois 200 μΐ do meio de cultura são inoculados em um meio de produção de treonina (20 ml) contendo 50 mg/litro de canamicina e 20 mg/litro de estreptomicina, e a cultura é realizada em 37°C por 24 horas com agitação. Após conclusão da cultura, as células são removidas por centrifugação, e a concentração da L-treonina no sobrenadante da cultura é medida pelo uso de um analisador de aminoácido (L-8500, Hitachi). Pode-se observar que a quantidade de acúmulo da treonina no meio é melhorada na cepa amplificada pelo óperon kdp, B-3996/pMW218kdp em comparação com a cepa B-3996/pMW218 como um controle.

[MEIO DE PRODUÇÃO DA TREONINA] D-glicose 40 g/litro (NH4)2S04 16 g/litro KH2P04 1,0 g/litro MgS04-7H20 1,0 g/litro FeS04-7H20 0,01 g/litro MnS04-7H20 0,01 g/litro L-Isoleucina 50 mg/litro DL-Metionina 500 mg/litro Carbonato de cálcio 0,6 g/litro Estreptomicina 20 mg/litro Canamicina 50 mg/litro O meio é ajustado a pH 7,5 com hidróxido de potássio. O meio é esterilizado com vapor em 115°C por 10 minutos. EXPLANAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1: Sequência de nucleotídeos de óperon kdp de Escherichia coli (sequências de aminoácidos de kdp A, kdpB e kdpC são também mostradas) kdpF: 457 a 546 kdpA: 546 a 2219 kdpB: 2242 a 4290 kdpC: 4299 a 4871 kdpD: 4864 a 7548 kdpE: 7545 a 8222 SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácidos de KdpA SEQ ID NO: 3: Sequência de aminoácidos de KdpB SEQ ID NO: 4: Sequência de aminoácidos de KdpC SEQ ID NO: 5: Sequência de aminoácidos de KdpD SEQ ID NO: 6: Sequência de aminoácidos de KdpE SEQ ID NO: 5: Sequência de nucleotídeos do óperon KdpD (a sequência de aminoácidos de SDHC é também mostrada) SEQ ID NO: 7: Sequência de nucleotídeos de óperon kdp de Pantoea ananatis (as sequências de aminoácidos de kdp A, kdpB, kdpC e kdpD são também mostradas) kdpA: 543 a 2225 kdpB: 2228 a 4273 kdpC\ 4284 a 4853 kdpD: 4867 a 7542 SEQ ID NO: 8: Sequência de aminoácidos de KdpA SEQ ID NO: 9: Sequência de aminoácidos de KdpB SEQ ID NO: 10: Sequência de aminoácidos de KdpC SEQ ID NO: 11: Sequência de aminoácidos de KdpD SEQ ID NO: 12: Sequência de nucleotídeos de gene kdpE de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 13: Sequência de aminoácidos de KdpE SEQ ID NO: 14: Sequência de nucleotídeos de do gene hisD de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 15: Iniciador para amplificação do fragmento para integração do gene Kmr no gene hosD

SEQ ID NO: 16: Iniciador para amplificação do fragmento para integração do gene Kmr no gene hosD SEQ ID NO: 17: Iniciador para amplificação do gene cat SEQ ID NO: 18: Iniciador para amplificação do gene cat SEQ ID NO: 19: Iniciador para amplificação do gene sacB SEQ ID NO: 20: Iniciador para amplificação do gene sacB SEQ ID NO: 21: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 SEQ ID NO: 22: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 SEQ ID NO: 23: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo os genes λΐ^αβγ e tL3 SEQ ID NO: 24: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo os genes λΡ^αβγ e tL3 SEQ ID NO: 25: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 e TrrnB

SEQ ID NO: 26: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 e TrrnB SEQ ID NO: 27: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 28: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 29: Sequência de nucleotídeos de attL SEQ ID NO: 30: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 31: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 32: Sequência de nucleotídeos de attR SEQ ID NO: 33: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o gene bla SEQ ID NO: 34: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o gene bla SEQ ID NO: 35: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo terj-rnB

SEQ ID NO: 36: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter jrnB

SEQ ID NO: 37: Sequência de nucleotídeos de fragmento de DNA contendo o terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 38: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 39: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo o terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 40: Iniciador para amplificar parte do gene gltA outro que não ORE

SEQ ID NO: 41: Iniciador para amplificar parte do gene gltA outro que não ORF SEQ ID NO: 42: Iniciador para amplificação do gene prpC SEQ ID NO: 43: Iniciador para amplificação do gene prpC SEQ ID NO: 44: Sequência de nucleotídeos do gene yghU de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 45: Sequência de nucleotídeos do gene scrK de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 46: Sequência de nucleotídeos do gene lacZ de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 47: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor Ptac SEQ ID NO: 48: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o promotor Ptac SEQ ID NO: 49: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o gene de resistência Km SEQ ID NO: 50: Iniciador para amplificação do fragmento de DNA contendo o gene de resistência Km SEQ ID NO: 51: Iniciador para amplificação da sequência de montante do óperon kdp ligada ao promotor tac SEQ ID NO: 52: Iniciador para amplificação da sequência de montante do óperon kdp ligado ao promotor tac SEQ ID NO: 53: Iniciador para confirmar a estrutura de montante do óperon kdp SEQ ID NO: 54: Iniciador para confirmar a estrutura de montante do óperon kdp SEQ ID NO: 55: Iniciador para amplificação do óperon kdp SEQ ID NO: 56: Iniciador para amplificação do óperon kdp SEQ ID NO: 57: Sequência de consenso das sequências de aminoácidos KdpA de Pantoea ananatis e Escherichia coli SEQ ID NO: 58: Sequência de consenso das sequências de aminoácidos KdpB de Pantoea ananatis e Escherichia coli SEQ ID NO: 59: Sequência de consenso das sequências de aminoácidos KdpC de Pantoea ananatis e Escherichia coli APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Mediante o uso do microorganismo da presente invenção, um L-aminoácido tal como o ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano ou L-cisteína ou similar, pode ser eficientemente produzido por fermentação. Em uma forma de realização preferida, o microorganismo da presente invenção apresenta tanto uma quantidade de produção de L-aminoácido quanto o índice de produção, superiores.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Microrganismo recombinante pertencente à família Enterobacteriaceae, caracterizado pelo fato de que tem uma capacidade de produção de L-aminoácidos e foi modificado de modo que o sistema kdp, que é uma ATPase do tipo P transportando potássio codificado pelo opcron kdp, é intensificado, em que o microorganismo é Escherichia coli ou Pantoea ananatis, em que o sistema kdp é intensificado pelo aumento da expressão do óperon kdp ou de um ou mais genes que constituem o óperon kdp, e/ou pelo aumento da tradução do óperon kdp ou dos genes, em que a expressão do óperon kdp ou dos genes é aumentado pelo aumento do número de cópias do óperon kdp ou dos genes, ou pela modificação de uma sequência de controle de expressão do óperon, ou combinação dos mesmos, e em que o óperon kdp é um DNA definido em (a) ou (b): (a) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos de números 546 a 4871 da SEQ ID NO: 1, (d) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos de números 543 a 4853 da SEQ ID NO: 7.

2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é modificado por qualquer um dos seguintes (a) a (e): (a) pela transformação do microrganismo com um plasmídeo no qual o óperon kdp ou os genes são clonados, (b) pela introdução do óperon kdp ou dos genes no DNA cromossômico do microrganismo, (c) pela substituição de um promotor do óperon kdp ou dos genes no DNA cromossômico ou plasmídeo por um promotor forte, (d) pela substituição de vários nucleotídeos na região do promotor do óperon kdp ou dos genes, de modo que o promotor é modificado para ser mais forte, (e) combinação de qualquer um de (a) a (d).

3. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o óperon kdp contém pelo menos os genes kdpA, kdpB e kdpC.

4. Microrganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene kdpA é um gene que codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQID NOS: 2 ou 8.

5. Microrganismo de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o gene kdpB é um gene que codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 3 ou 9.

6. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o gene kdpC é um gene que codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 4 ou 10.

7. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é uma ou mais espécies de L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano e L-cisteína.

8. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é ácido L-glutâmico, L-treonina ou ambos.

9. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou nas células, e coletar o L-aminoácido do meio ou das células, em que o L-aminoácido é ácido L-glutâmico, L-treonina ou ambos.