BRPI0706836A2 - polipeptìdeo recombinante ou isolado, molécula de ácido nucléico recombinante ou isolada, vetor, célula, linhagem celular, uso de um polipeptìdeo, uso de uma célula e processo de imortalização de uma célula - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEO RECOMBINANTE OU ISOLADO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO RECOMBINANTE OU ISOLADA, VETOR, CéLULA, LINHAGEM CELULAR, USO DE UM POLIPEPTìDEO, USO DE UMA CéLULA E PROCESSO DE IMORTALIZAçãO DE UMA CéLULA. A presente invenção refere-se em particular a novas transcriptases reversas telomerases recombinantes, a moléculas de ácido nucléico que as contêm, células que compreendem a mencionada molécula de ácido nucléico e ao uso destas células para a produção da substância de interesse.

Description

"POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE OU ISOLADO, MOLÉCULA DE ÁCIDONUCLÉICO RECOMBINANTE OU ISOLADA, VETOR, CÉLULA, LINHAGEMCELULAR, USO DE UM POLIPEPTÍDEO, USO DE UMA CÉLULA EPROCESSO DE IMORTALIZAÇÃO DE UMA CÉLULA"

A presente invenção refere-se particularmente a novastranscriptases reversas telomerases recombinantes, a moléculas de ácidonucléico que as contêm, a células que compreendem a mencionada moléculade ácido nucléico e ao uso destas células para a produção da substância deinteresse.

Em 1965, L. Hayflick descobriu que células possuem ummomento de morte programado. Como uma explicação para o envelhecimento,ele sugeriu que o número de vezes que uma célula humana se divide é limitado(Exp Cell Res. 1965 Mar; 37: 614-36). Sabe-se agora que isto é causado peloencurtamento dos telômeros na divisão celular. Os cromossomos sãoencapsulados por telômeros que consistem de uma seqüência de DNAconservada, repetida em tandem, não codificante e hexamérica, associada àproteínas de ligação de fita dupla ou simples. Os telômeros são responsáveispelas funções de estabilidade do genoma e, em particular, a replicação dosterminais dos cromossomos. Uma replicação da extremidade do cromossomobem sucedida requer a estrutura única de telômero e a enzima transcriptasereversa telomerase especializada, que é uma nucleoproteína que possui umaatividade enzimática de transcriptase reversa. A transcriptase reversatelomerase é capaz de alongar o conjunto de repetição do telômero, permitindouma replicação estendida da fita resultante complementar. Em células que nãopossuem transcriptase reversa telomerase, o encurtamento do DNA dostelômeros mediante divisões sucessivas, como síntese de DNA, enzimas sãoincapazes de replicar de forma completa os terminais dos cromossomos, umavez que o primer de RNA de início é removido. Inúmeros trabalhos reportarama evidência que o denominado "relógio do telômero" é uma característicaimportante do período de tempo de uma célula humana. A hipótese dotelômero de envelhecimento celular propõe que o encurtamento do telômeroestá relacionado à perda da atividade da transcriptase reversa telomerase, eprejudica a instabilidade cromossomal, levando à senescência, apoptose. Aatividade da transcriptase reversa telomerase é regulada de forma negativa(down-regulated) em linhagens de células somáticas durante odesenvolvimento in vivo e em células primárias in vitro, estando relacionadacom o encurtamento do telômero. Em contraste, a regulação positiva(upregulation) ou desregulação da atividade da transcriptase reversatelomerase ocorre em células transformadas e tumores. Os cDNAs datranscriptase reversa telomerase (TERT) de diversos mamíferos e um anfíbioforam clonados e estudados (Nakamura et al. 1997. Science 277, 955- 959;Greenberg et al. 1998. Oncogene 16, 1723-1730).

Como a sobreexpressão de TERT nas células leva àimortalização das mencionadas células, o uso de TERT para a produção delinhagens celulares foi proposto (McSharry et al, 2001 J Gen Virol. 82, 855-63).Entretanto, a atividade de TERT é restrita a espécies. Por exemplo, TERThumana é incompatível com o aparelho de manutenção do telômero de aves(Michailidis et al. 2005. Biochem Biophys Res Commun. 335 (1), 240-6). Destaforma, para o desenvolvimento de linhagens celulares de aves e, maisparticularmente da família Anatidae, há uma necessidade de TERT quefuncione nestas células específicas.

Linhagens de células eucarióticas são fundamentais para aprodução de vacinas virais e muitos outros produtos da biotecnologia. Produtosbiológicos produzidos em culturas celulares incluem enzimas, hormônios,produtos imuno biológicos (anticorpos monoclonais, interleucinas, linfócitos), eagentes anti-câncer. Embora muitas proteínas simples possam ser produzidasa partir do uso de células bacterianas, proteínas mais complexas, que sãoglicosiladas, geralmente precisam ser produzidas em células eucarióticas.

As linhagens celulares de ave são particularmente úteis uma vezque diversos vírus utilizados em composições farmacêuticas são capazes dese replicar nas mesmas. Mais particularmente, diversos vírus são apenascapazes de se desenvolver em células de aves. Este é, por exemplo, o caso dovírus Ankara modificado (MVA) que é incapaz de se desenvolver na maioriadas células de mamíferos. Este poxvírus, que é derivado do vírus Vacciniaatravés de mais de 500 passagens no CEF1 foi utilizado anteriormente nosanos 70 para a vacinação de pessoas imunodeficientes contra varíola. Agora, oMVA é particularmente utilizado como um vetor para terapia gênica e fins deimunoterapia. Por exemplo, o MVA é utilizado como um vetor para o geneMUC1 para a vacinação de pacientes contra tumores que expressam esteantígeno (Scholl et ai, 2003, J Biomed Biotechnol., 2003, 3, 194-201). O MVAque contém o gene que codifica antígenos de HPV é também utilizado comoum vetor para o tratamento terapêutico de lesões cervicais de alta escala. Maisrecentemente, o MVA foi o vetor escolhido para a preparação de tratamentoprofilático contra novas doenças emergentes ou possíveis armas biológicas,tais como vírus west nile e anthrax.

Portanto, há uma necessidade de uma nova transcriptase reversatelomerase capaz de imortalizar células de aves e, mais particularmente,células da família Anatidae.

Da forma utilizada em todo o presente pedido, os termos "um" e"uma" são utilizados representando "pelo menos um", "pelo menos umprimeiro", "um ou mais", ou "uma série" dos componentes ou etapas referidas,a menos que o contexto defina claramente de outra forma. Por exemplo, otermo "uma célula" inclui uma série de células, incluindo uma mistura delas.

O termo "e/ou", da forma utilizada no presente, inclui o significadode "e", "ou" e "todas ou qualquer outra combinação dos elementos relacionadospelo mencionado termo".

Da forma utilizada no presente, os termos "que compreende" e"compreendendo" indicam que os produtos, composições e métodos incluemos componentes referenciados ou etapas, mas não excluem outros."Consistindo essencialmente de", quando utilizado para definir produtos,composições e métodos, deve indicar que exclui qualquer outro componente ouetapa de qualquer significado essencial. Desta forma, uma composição queconsiste essencialmente dos componentes citados não excluiria contaminantesde traço e veículos farmaceuticamente aceitáveis. "Consistindo de" deve indicarexcluindo mais de elementos de traço de outros componentes ou etapas.

A presente invenção refere-se a um polipeptídeo recombinantee/ou isolado, que compreende uma seqüência de aminoácido que possui pelomenos 60% de identidade de seqüência de aminoácido à SEQ ID N°:l. Em umarealização preferida da presente invenção, o polipeptídeo da invençãocompreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 70%,preferencialmente pelo menos 80%, e ainda mais preferencialmente pelomenos 90% de identidade de seqüência de aminoácido à SEQ ID N°:l. Em umarealização de maior preferência, o polipeptídeo da presente invençãocompreende a seqüência de aminoácido ilustrada pela SEQ ID N°:l.

Em uma realização preferida, o polipeptídeo da presente invençãopossui uma atividade TERT e, em uma realização preferencial, da presenteinvenção, a expressão do polipeptídeo da presente invenção permite aimortalização de uma célula que pertence à família Anatidae.

Da forma utilizada no presente, o termo "isolado" e/ou"recombinante" indica que a molécula de ácido nucléico, DNA, RNA,polipeptídeos ou proteínas, desta forma designadas, foram produzidas, destaforma, por intervenção humana, e, assim, são separadas de seu ambientecelular nativo in vivo. Como resultado desta intervenção humana, os DNAs1RNAS1 polipeptídeos e proteínas recombinantes da presente invenção sãoúteis de formas descritas no presente, em que os mencionados DNAs1 RNAs1polipeptídeos ou proteínas, na sua forma natural, não são.

Em outra realização, a presente invenção refere-se a umamolécula de ácido nucléico isolada que codifica o polipeptídeo da presenteinvenção.

Em uma realização preferida da presente invenção, a molécula deácido nucléico que codifica o polipeptídeo da presente invenção compreendesubstancialmente a mesma seqüência de nucleotídeos da seqüência ilustradana SEQ ID N°:2. Moléculas de ácido nucléicos preferidas que codificam opolipeptídeo da presente invenção compreendem a mesma seqüência denucleotídeos ilustrada na SEQ ID N°:2.

Da forma empregada no presente, o termo "substancialmente amesma seqüência de nucleotídeos" refere-se a uma molécula de ácido nucléicoque possui identidade suficiente ao polipeptídeo de referência, de forma que iráhibridizar ao nucleotídeo de referencia sob condições de hibridização deestringência moderada. Em uma realização, a molécula de ácido nucléico quepossui substancialmente a mesma seqüência de nucleotídeo da seqüência denucleotídeo de referência, codifica substancialmente a seqüência deaminoácido da SEQ ID N°:l. Em outra realização, a molécula de ácido nucléicoque possui substancialmente a mesma seqüência de nucleotídeos daseqüência de nucleotídeos de referência possui pelo menos 70%,preferencialmente, pelo menos 90%, e ainda de maior preferência, pelo menos95%, de identidade à seqüência de ácido nucléico da SEQ ID N°:2.

Hibridização refere-se a ligação da fita complementar de ácidonucléico (ou seja, fitas sense:antisense ou sonda:DNA alvo) entre si, através depontes de hidrogênio, similares à ligação que ocorrem naturalmente no DNAcromossomal. Os níveis de estringência utilizados para hibridizar uma dadasonda com o DNA alvo pode ser facilmente variada pelo técnico no assunto.

O termo "hibridização estringente", da forma utilizada no presente,refere-se a condições em que os híbridos de ácido polinucléico são estáveis.

Conforme conhecido pelos técnicos no assunto, a estabilidade dos híbridos érefletida na temperatura de fusão (Tm) dos híbridos. No geral, a estabilidade deum híbrido é uma função da temperatura e concentração de íon de sódio.Tipicamente, a reação de hibridização é realizada sob condições de baixaestringência, seguida por lavagens de estringência variada, mas sempre alta. Areferência à estringência da hibridização refere-se a tais condições de lavagem.

Da forma utilizada no presente, o termo "hibridização deestringência moderada" refere-se a condições que permitam que o DNA alvo seligue a um ácido nucléico complementar que possui cerca de 60% deidentidade, de preferência, cerca de 75% de identidade, mais particularmente,cerca de 85% de identidade ao DNA alvo; sendo especialmente preferido commais do que cerca de 90% de identidade ao DNA alvo. Preferencialmente,condições de estringência moderada são condições equivalentes parahibridização em 50% de formamida, 5* de solução de Denhart, 5* de SSPE,0,2% de SDS a 42° C, seguido por lavagem em 0.2* de SSPE, 0,2% de SDS, a65° C.

A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser umaseqüência de RNA, cDNA ou DNA genômico ou ser de um tipo misturado. Amolécula de ácido nucléico da presente invenção pode, quando apropriado,conter um ou mais íntrons, sendo estes de origem nativa, heteróloga (porexemplo, o íntron de genes globina de coelhos, etc) ou sintética, para aumentara expressão em células hospedeiras.

A presente invenção refere-se ainda a um vetor que compreendeuma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção.Da forma utilizada no presente, o termo "vetor" é entendido comoum vetor de origem plasmidial ou viral, e opcionalmente um vetor combinadocom uma ou mais substancias, que aumentam a eficácia de transfecção e/ou aestabilidade do mencionado vetor, e/ou a proteção do mencionado vetor in vivocontra o sistema imune do organismo hospedeiro. Estas substâncias sãoamplamente documentadas na literatura, que é acessível aos técnicos noassunto (vide, por exemplo, Feigner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soe.32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342;Remy et al, 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). De forma ilustrativa,mas não limitativa, elas podem ser polímeros, lipídeos, em particular lipídeoscatiônicos, lipossomos, proteínas nucleares ou virais ou lipídeos neutros. Estassubstâncias podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação. Exemplosdestes compostos são, em particular, disponíveis nos pedidos de patentes WO98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP890362 ou WO 99/05183. Uma combinação que pode ser esperada é um vetorrecombinante de plasmídeo combinado com lipídeos catiônicos (DOGS, DC-CHOL, espermina-colesterol (spermine-chol), espermidina-colesterol(spermidine-chol) e similares) e lipídeos neutros (DOPE).

A escolha dos plasmídeos que podem ser utilizados no contextoda presente invenção é vasta. Eles podem ser vetores de clonagem e/ouexpressão. No geral, eles são conhecidos do técnico no assunto e uma sériedeles é comercialmente disponível, mas é também possível construí-los oumodificá-los a partir de técnicas de engenharia genética. Pode-se mencionar,como exemplo, os plasmídeos derivados de pBR322 (Gibco BRL), pUC (GibcoBRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou p Poly (Latheet al., 1987, Gene 57, 193-201). Preferencialmente, o plasmídeo utilizado nocontexto da presente invenção contém uma origem de replicação paraassegurar o início da replicação em uma célula produtora e/ou célulahospedeira (por exemplo, a origem CoIEI pode ser selecionada para umplasmídeo destinado a ser produzido em E. coli, e o sistema oriP/EBNAI podeser selecionado quando desejado que ele seja auto-replicante em uma célulahospedeira de mamífero, Lupton e Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542;

Yates et al, Nature 313, 812-815). Eles podem compreender elementosadicionais que melhoram sua manutenção e/ou sua estabilidade em uma dadacélula (seqüência cer que promove a manutenção monomérica de umplasmídeo - Summers e Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, sequences forintegration into the cell genome).

Com relação a um vetor viral, é possível imaginar um vetorderivado de um poxvírus (vírus vaccinia, em particular MVA1 vírus canarypox esimilares), de um adenovírus, de um retrovírus, de um vírus da herpes, de umalfavírus, de um vírus espumoso (foamy virus) ou de um vírus adeno-associado. Um vetor não de replicação será preferencialmente utilizado. Nestesentido, os vetores adenovirais são particularmente apropriados para arealização da presente invenção.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, ovetor de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente oselementos necessários para a expressão da molécula de ácido nucléico dapresente invenção em uma célula hospedeira.

Os elementos necessários para a expressão consiste do conjuntode elementos que permitem a transcrição da seqüência de nucleotídeo emRNA1 e a tradução do mRNA em um polipeptídeo, em particular, as seqüênciaspromotoras e/ou seqüências reguladoras que são eficazes na mencionadacélula, e opcionalmente as seqüências necessárias para permitir a excreção oua expressão do mencionado polipeptídeo na superfície de células alvo. Esteselementos podem ser reguláveis ou constitutivos. É claro que o promotor éadaptado ao vetor selecionado e à célula hospedeira. Pode-se mencionar, atítulo de exemplo, que os promotores eucarióticos dos genes PGK (fosfoglicerato quinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al, 1987, Mol. Cell Biol. 7,838-848), a-1 antitripsina, CFTR, os promotores do gene que codifica creatinaquinase do músculo, tensoativo pulmonar de actina, imunoglobulina ou ({3 -actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRa (Takebe et al., 1988,Mol. Cell. 8, 466-472), o promotor do vírus SV40 (vírus de símios), o RSV(,Rous Sarcoma Virus) LTR, o promotor MPSV, o promotor TK-HSV-1, opromotor do vírus CMV (Citomegalovírus), promotores p7.5K pH5R de vírusvaccinia, pKIL, p28, p11 e promotores E1A e MLP adenovirais, ou umacombinação destes. Os promotores de citomegalovírus (CMV) é o promotormais particularmente preferido da invenção.

De acordo com uma realização preferida, o vetor da presenteinvenção compreende adicionalmente duas seqüências que são homólogas aporções de seqüências contidas na região de uma seqüência nativa de DNAalvo ao genoma de um genoma celular. A presença das mencionadasseqüências homólogas permite a inserção do sítio específico de uma moléculade ácido nucléico da presente invenção na seqüência de DNA alvo através derecombinação homóloga.

O termo "recombinação homóloga" refere-se à troca defragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA nos sítios que apresentamseqüências de nucleotídeos essencialmente idênticas. Preferencialmente, asseqüências homólogas no vetor são 100% homólogas à região da seqüênciaalvo. Entretanto, uma baixa homologia de seqüência pode ser utilizada. Destaforma, uma homologia de seqüência tão baixa quanto 80%, pode ser utilizada.

As seqüências homólogas no vetor compreendem pelo menos25bp, regiões mais longas são preferidas, pelo menos 500 bp e, maisparticularmente, pelo menos 5000 bp.

De acordo com uma realização de maior preferência da presenteinvenção, a molécula de ácido nucléico é circundada pelas seqüênciashomólogas no vetor.

Da forma utilizada no presente, "circundada" indica que uma dasseqüências homólogas está localizada a montante da molécula de ácidonucléico da presente invenção, e uma das seqüências homólogas estálocalizada a jusante da molécula de ácido nucléico da presente invenção. Daforma utilizada no presente, "circundada" não necessariamente indica que asduas seqüências homólogas estão diretamente ligadas à extremidade 3' ou 5'da molécula de ácido nucléico, da presente invenção, a molécula de ácidonucléico da presente invenção e as seqüências homólogas podem serseparadas por um número ilimitado de nucleotídeos.

Da forma utilizada no presente, uma "seqüência de DNA alvo" éuma região no genoma de uma célula que é alvo para modificações porrecombinação homóloga com o vetor. Seqüências de DNA alvos incluem genesestruturais (tal como, seqüências de DNA que codificam polipeptídeos,incluindo, no caso de eucariotos, íntrons e éxons), seqüências reguladoras taiscomo seqüências amplificadoras, promotoras, e similares, e outras regiões nogenoma de interesse. Uma seqüência de DNA alvo pode também ser umaseqüência que, quando alvo de um vetor, não possui qualquer efeito nafuncionalidade do genoma hospedeiro.

Da forma utilizada no presente, "inserido em uma seqüência deDNA alvo" significa de forma ampla, que o processo de recombinaçãohomólogo que leva à inserção da molécula de ácido nucléico da presenteinvenção, introduz uma deleção ou uma disrupção na seqüência de DNA alvo.

Um técnico no assunto é capaz de selecionar as seqüênciashomólogas apropriadas a fim de que a seqüência de DNA específica sejainserida no genoma de uma célula. Por exemplo, uma seqüência homólogapode ser homóloga à parte da seqüência de DNA alvo, em que a outraseqüência homóloga é homóloga a uma seqüência de DNA localizada amontante ou a jusante da seqüência alvo. De acordo com outro exemplo, umadas seqüências homólogas pode se homóloga a uma seqüência de DNAlocalizada a montante da seqüência de DNA alvo, em que a outra seqüênciahomóloga é homóloga a uma seqüência de DNA localizada a jusante daseqüência de DNA alvo. Em outro exemplo, ambas as seqüências homólogassão homólogas às seqüências localizadas na seqüência de DNA alvo.

De acordo com uma realização preferencial da presente invenção,a seqüência de DNA alvo é o gene HPRT (hipoxantina fosforibosil transferase).

A seqüência genômica que compreende o promotor HPRT e ogene HPRT de cairina moschata é ilustrado na SEQ ID N°:3. A seqüência quecodifica o HPRT inicia no códon ATG na posição 8695 da seqüência de ácidonucléico da SEQ ID N°:3, a seqüência a montante a este códon ATG é aseqüência promotora de HPRT.

O técnico no assunto é capaz de selecionar as seqüênciashomólogas necessárias para a integração da molécula de ácido nucléico dapresente invenção no gene HPRT. Como entre os diversos membros dafamília, as seqüências genômicas que codificam HPRT são altamentehomólogas entre as aves, os técnicos no assunto são então capazes dedesenhar as seqüências homólogas necessárias para direcionar o gene HPRTde outras células de aves.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, asseqüências homólogas são customizadas a fim de inserir a molécula de ácidonucléico da presente invenção a jusante do promotor HPRT. Neta realizaçãoparticular, a molécula de ácido nucléico da presente invenção éoperacionalmente ligada ao promotor HPRT endógeno das células. Nocontexto da presente invenção, "operacionalmente ligado" indica que amolécula de ácido nucléico está ligada ao promotor de forma que permite suaexpressão na célula.

De acordo com esta realização particular, a seqüência homóloga,a montante da molécula de ácido nucléico da presente invenção, possuipreferencialmente uma seqüência de ácido nucléico que é homóloga a pelomenos 500 bp contíguo, e mais particularmente, pelo menos 5000 bp contíguoda seqüência de ácido nucléico, começando no nucleotídeo na posição 1 eterminando com o nucleotídeo na posição 8694 da seqüência de ácido nucléicoda SEQ ID N°:3, com a ressalva de que a mencionada seqüência homóloganão é homóloga à seqüência de ácido nucléico que inicia no nucleotídeo naposição 8695 e termina com o nucleotídeo na posição 26916 da seqüência deácido nucléico da SEQ ID N°:3. Adicionalmente, esta seqüência homóloga amontante está preferencialmente diretamente ligada ao códon de início damolécula de ácido nucléico da presente invenção. De acordo com umarealização da presente invenção ainda mais preferida, a seqüência homólogaque está à montante da molécula de ácido nucléico da presente invençãoconsiste na seqüência de ácido nucléico que se inicia no nucleotídeo naposição 1383 e termina com o nucleotídeo na posição 8694 da seqüência deácido nucléico da SEQ ID N°:3. Por exemplo, o vetor de acordo com a presenteinvenção compreende a seqüência de ácido nucléico que começa nonucleotídeo da posição 1 e termina com o nucleotídeo da posição 11227 daseqüência de ácido nucléico da SEQ ID N°:4. A seqüência homóloga, a jusanteda molécula de ácido nucléico da presente invenção, preferencialmente possuiuma seqüência de ácido nucléico que é homóloga com pelo menos 500 bpcontíguos e, mais particularmente, pelo menos 5000 bp contíguos daseqüência de ácido nucléico que se inicia no nucleotídeo da posição 10581 etermina com o nucleotídeo da posição17800 da seqüência de ácido nucléico daSEQ ID N°:3. Mais particularmente, a mencionada seqüência homóloga, ajusante da molécula de ácido nucléico da presente invenção, consiste naseqüência de ácido nucléico que se inicia no nucleotídeo da posição 10581 etermina com o nucleotídeo da posição 17800 da seqüência de ácido nucléicoda SEQ ID N°:3.

De acordo com uma realização preferida, o vetor da presenteinvenção compreende um primeiro marcador de seleção, em que este primeiromarcador de seleção é um marcador de seleção positivo, e em que esteprimeiro marcador de seleção e a molécula de ácido nucléico da presenteinvenção estão posicionados na mesma seção do vetor, sendo que amencionada seção é delimitada pelas seqüências homólogas.

Da forma utilizada no presente, o termo "marcador de seleçãopositive" refere-se particularmente a um gene que codifica um produto quepermite apenas as células que carregue o gene de sobreviver e/ou crescer sobdeterminadas condições. Marcadores de seleção típicos codificam proteínasque conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tal como, ampicilina,neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, deficiências auxotróficascomplementares, ou fornecem nutrientes essenciais que não são disponíveis apartir do meio complexo. Em uma realização preferida de acordo com apresente invenção, o primeiro marcador de seleção codifica uma proteína queconfere resistência a antibióticos.

De acordo com uma realização preferencial da presente invenção,o primeiro marcador de seleção, no vetor, está circundado por seqüências quepermitem sua supressão. As mencionadas seqüências que permitem asupressão do primeiro marcador de seleção não circundam a molécula deácido nucléico da presente invenção. Quando o vetor é circular, as seqüênciasque permitem a supressão do primeiro marcador de seleção e a molécula deácido nucléico da presente invenção são posicionadas na mesma seção dovetor de transferência, sendo que a mencionada seção do vetor é delimitadapelas seqüências homólogas.As seqüências que permitem a supressão de um fragmento deácido nucléico são bem conhecidas por um técnico no assunto (Nunes-Duby,S. et al (1998) Nucleic Acids Res. 26:391- 406). Estas seqüências podem serreconhecidas por uma ou mais enzimas específicas que induzem a supressãodo ácido nucléico compreendido entre as mencionadas seqüências, sendo queestas enzimas são denominadas "recombinase". Por exemplo, trêsrecombinases bem conhecidas que permitem a supressão de um fragmento deácido nucléico são as recombinases FLP1 ISCEI e Cre.

Uma recombinase sítio-específica típica é a recombinase Cre. Creé um produto de 38-kDa do gene cre (recombinação por ciclização) debacteriófago Pl e é uma DNA recombinase sítio-específica da família Int.Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212. Cre reconhece um sítiode 34-bp no genoma Pl denominado IoxP (locus de X-sobre de PI) e catalisa deforma eficiente a recombinação de DNA conservativa recíproca entre pares desítios IoxP. O sítio IoxP consiste de duas repetições invertidas de 13-bp queflanqueiam uma região de núcleo não-palindrômica de 8-bp. A recombinaçãomediada por Cre entre dois sítios IoxP diretamente repetidos resulta na excisãodo DNA entre elas como um círculo covalentemente fechado. A recombinaçãomediada por Cre entre pares de sítios IoxP na orientação invertida resultará nainversão do DNA de intervenção ao invés de excisão. A quebra e ligação doDNA é confinada a pequenas posições na região do núcleo e procede na fitaem um momento por meio da ligação provisória da proteína de DNA dafototirosina com a enzima.

Outra recombinase sítio-específica é a l-Scel. Outra endonucleasede íntron, por exemplo, I-Tlil1 I-Ceul1 I-Crel1 I-Ppol e Pl-Pspl1 pode ainda sersubstituída por l-Scel. Muitas estão listadas em Belfort e Roberts ((1997)Nucleic Acids Research 25:3379-3388). Muitas destas endonucleases derivamde genomas de organelas em que o uso do códon difere do uso de códonnuclear padrão. Para o uso destes genes na expressão nuclear destasendonucleases, pode ser necessário alterar a seqüência codificadora paracombinar com a seqüência dos genes nucleares. I-Scel é uma endonucleasede fita dupla que cliva o DNA no seu sítio de reconhecimento. I-Scel gera umcorte coesivo (ou corte assimétrico) de 4 pb com o 3'OH se sobressaindo.

A enzima I-Scel possui um sítio de reconhecimento conhecido. Osítio de reconhecimento de I-Scel é uma seqüência não-simétrica de mais de18 bp.

5' TAGGGATAACAGGGTAAT 3'

3' ATCCCTATTGTCCCATTA 5'

Desta forma, em uma realização preferida da presente invenção,as seqüências que permitem a supressão do primeiro marcador de seleçãocompreendem o sítio de reconhecimento de l-Scel.

Outra recombinase sítio-específica é a recombinase FLP. Arecombinase Flp reconhece um sítio mínimo de 34-bp distinto que toleraapenas a degeneração limitada de sua seqüência de reconhecimento(Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988). A interação entre a recombinase Flp euma seqüência FRT foi examinada (Panigrahi et al, 1992). Exemplos deseqüências FRT variantes são dados por Jayaram (1985) e Senecoff et al.(1988), e um ensaio para a recombinação mediada por Flp em diferentessubstratos é descrito por Snaith et al. (1996).

Em uma realização particular, onde o vetor da presente invençãocompreende seqüências que permitem a supressão do primeiro marcador deseleção, o mencionado vetor pode compreender vantajosamente, uma primeiraseqüência homóloga A e uma segunda seqüência homóloga B, em que asseqüências de homologia AeB possuem um comprimento suficiente e umahomologia suficiente que permitem a recombinação homóloga entre elas. Comrelação às seqüências homólogas A e B, o termo "homologia suficiente" refere-se, preferencialmente, a seqüências com pelo menos 70%, de preferência80%, mais preferencialmente 90%, de preferência superior pelo menos 95%, eainda mais preferencialmente pelo menos 99% e, de preferência, 100%, dehomologia nestas seqüências homólogas em um comprimento de mais de pelomenos 20 pares de bases, preferencialmente, pelo menos 50 pares de base,especialmente, pelo menos 100 pares de bases, mais preferencialmente, pelomenos 250 pares de bases, e mais preferencialmente ainda, pelo menos 500pares de base. Nesta realização, o vetor de acordo com a presente invençãocompreende, no sentido 5'-3\ como segue, a molécula de ácido nucléico dapresente invenção, s primeira seqüência homóloga A, uma seqüência quepermite a supressão do primeiro marcador de seleção, o primeiro marcador deseleção, uma seqüência que permite a supressão do primeiro marcador deseleção e a seqüência homóloga B.

De acordo com uma realização preferida, o vetor da presenteinvenção compreende um segundo marcador de seleção, que não é circundadopelas mencionadas seqüências homólogas, e em que o mencionado segundomarcador de seleção é um marcador de seleção negativo. O mencionadosegundo marcador de seleção é particularmente útil quando o vetor dapresente invenção é circular. Quando o vetor é circular, o fato do segundomarcador de seleção não ser circundado pelas mencionadas seqüênciashomólogas significa que o segundo marcador de seleção e a molécula de ácidonucléico da presente invenção não estão posicionados na mesma seção dovetor de transferência, sendo que a mencionada seção é delimitada pelasseqüências homólogas.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, ovetor da presente invenção compreende um terceiro marcador de seleção, emque o mencionado terceiro marcador de seleção é um marcador de seleçãonegativo e, em que o mencionado terceiro marcador de seleção está localizadoentre as seqüências que permitem a supressão do primeiro marcador deseleção. Quando o vetor é circular, o fato do terceiro marcador de seleção estarlocalizado entre as seqüências que permitem a supressão do primeiromarcador de seleção significa que o terceiro marcador de seleção e o primeiromarcador de seleção estão posicionados na mesma seção do vetor detransferência, em que a mencionada seção é delimitada pelas seqüências quepermitem a supressão do primeiro marcador de seleção.

Da forma utilizada no presente, o termo "marcador de seleçãonegativo" refere-se em particular a um gene que codifica um produto que mataas células que carregam o gene sob determinadas condições. Estes genescompreendem, em particular, "gene suicida". Os produtos codificados por estesgenes são capazes de transformar uma pró-droga em um composto citotóxico.

Diversos pares de gene suicida/pró-droga estão disponíveis comercialmente.Podem-se mencionar, mais particularmente, os pares:

- vírus herpes simplex tipo I timidina quinase (HSV-1 TK) eaciclovir ou ganciclovir (GCV) (Caruso et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA90, 7024-7028; Culver et al, 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al, 1997,Nat. Med. 3, 1354-1361);

- citocromo p450 e ciclofosfofamida (Wei et al., 1994, HumanGene Therapy 5, 969-978);

- nucleosídeo purina fosforilase de Escherichia coli (E. coli) e 6-metilpurina deoxiribonucleosídeo (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238);

- guanina fosforibosil transferase de E. coli e 6-tioxantina (Mzozand Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595) e

- citosina deaminase (CDase) e 5-fluorocitosina (5FC);

- FCU1 e 5-fluoro-citosina (5FC) (W09954481);

- FCU1-8 e 5-fluoro-citosina (5FC) (W02005007857).O primeiro, segundo e terceiro marcadores de seleção podem serutilizados separadamente. Por exemplo, o vetor de acordo com a presenteinvenção pode compreender o primeiro e o terceiro marcadores de seleção,mas não o segundo, ou pode compreender o segundo e o terceiro marcadoresde seleção, mas não o primeiro.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, oprimeiro, segundo e/ou o terceiro marcadores de seleção são colocados sob ocontrole de elementos necessários para sua expressão na célula hospedeira.

Estes elementos necessários para a expressão consistem noconjunto de elementos que permitem a transcrição da seqüência denucleotídeo em RNA e a tradução do mRNA em um polipeptídeo, em particular,as seqüências promotoras e/ou seqüências reguladoras, que são eficazes namencionada célula, e opcionalmente as seqüências necessárias para permitir aexcreção ou a expressão do mencionado polipeptídeo na superfície das célulashospedeiras. Estes elementos podem ser reguláveis ou constitutivos.Claramente, o promotor é adaptado ao vetor selecionado e à célula hospedeira.Podem-se citar, a título de exemplo, os promotores eucarióticos dos genesPGK (fosfo glicerato quinase), MT (metalotioneína; Mclvor et al, 1987, Mol. CellBiol. 7, 838-848), a-1 antitripsina, CFTR, os promotores do gene que codificacreatina quinase de músculo, tensoativo pulmonar de actina, imunoglobulina ou((3-actina (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 416-436), SRcc (Takebe et al,1988, Mol. Cell. 8, 466-472), o promotor do vírus SV40 (vírus símios), RSV(Rous Sarcoma Virus) LTR, o promotor de MPSV, o promotor de TK-HSV-1, opromotor do vírus CMV (citomegalovírus), os promotores do vírus vacciniap7.5K pH5R, pKIL, p28, p11 e promotores adenovirais E1A e MLP ou umacombinação destes promotores. O promotor do citomegalovírus (CMV) é maisparticularmente preferido.

A presente invenção também se refere a uma célula transfectadacom a molécula de ácido nucléico ou um vetor de acordo com a presenteinvenção e células derivadas destas. Da forma utilizada no presente, aexpressão "derivada" refere-se a células que se diferenciaram oudesenvolveram, ou possuem um ancestral, a partir de uma célula transfectadacom a molécula de ácido nucléico da presente invenção.

A presente invenção também se refere ao uso de polipeptídeos,moléculas de ácidos nucléicos e vetores de acordo com a presente invençãopara a imortalização de uma célula.

A presente invenção também se refere a uma célula quecompreende a molécula de ácido nucléico da presente invenção, em que amencionada molécula de ácido nucléico é operacionalmente ligada ao promotorHPRT endógeno de célula. "Operacionalmente ligado" indica que a molécula deácido nucléico é ligada ao promotor de uma maneira que permite suaexpressão na célula. Em uma realização preferida, a célula de acordo com apresente invenção compreende a seqüência de ácido nucléico da SEQ ID N°:4.

A presente invenção também se refere a um processo deimortalização de uma célula, que compreende a etapa de transfecção de umvetor de acordo com a presente invenção na mencionada célula.

Uma célula imortalizada, da forma utilizada ná presente invenção,refere-se a uma célula capaz de crescer em meio de cultura por mais de 35passagens.

O termo "número de passagens" refere-se ao número de vezesque uma população celular foi removida do recipiente de cultura e colocada emum processo de subcultura (passagem), a fim de manter as células a umadensidade suficientemente baixa para estimular o crescimento adicional.

Da forma utilizada no presente, o termo "transfectada" refere-se àtransfecção estável ou a transfecção transitória da célula da presente invenção.

O termo "transfecção estável" ou "transfectada de forma estável"refere-se a introdução e integração do DNA exógeno no genoma da célulatransfectada. O termo "transfectante estável" refere-se a uma célula que possuium DNA exógeno integrado de forma estável no DNA genômico.

O termo "transfecção transitória" ou "transitoriamentetransfectada" refere-se a introdução do DNA exógeno em uma célula, onde oDNA exógeno é falho na integração no genoma da célula transfectada. O DNAexógeno permanece no núcleo da célula transfectada durante vários dias. Otermo "transfectante transitório" refere-se a células que possuem o DNAexógeno, mas falharam na integração deste DNA.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, acélula da presente invenção é derivada de uma célula de aves e, maisparticularmente, de uma célula da família Anatidae ou da família Phasianidae.Entre a família Anatidae, as células pertencentes ao gênero Cairina ou Anassão particularmente preferidas. Ainda mais preferencialmente, as células deacordo com a presente invenção pertencem às espécies Cairina moschata ouAnas platyrhynchos.

Preferencialmente, a célula de acordo com a presente invenção éderivada de um organismo embriônico. Métodos de isolamento de células apartir de um organismo vivo são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

Por exemplo, os métodos descritos no exemplo 2 podem ser utilizados. Deacordo com uma realização preferida da presente invenção, a célula primária éisolada a partir de um embrião que pertence à família Anatidae, que está entreos dias 0 e 20 de idade, mais preferencialmente, entre 5 e 15 dias de idade, emais particularmente, entre 11 e 14 dias de idade.

Quando o vetor utilizado no processo da presente invençãocompreende um primeiro marcador de seleção, a integração do primeiromarcador de seleção permite a seleção de células que possuem incorporada amolécula de ácido nucléico da presente invenção. Assim, o processo de acordocom a presente invenção pode adicionalmente compreender uma etapa emque as mencionadas células são cultivadas em um meio que permite apenas ocrescimento de células que incorporaram o primeiro marcador de seleção. Porexemplo, em um meio que compreende um antibiótico.

Quando o vetor utilizado no processo da presente invençãocompreende seqüências que permitem a supressão do primeiro marcador deseleção, o processo de acordo com a presente invenção pode compreenderadicionalmente uma etapa que consiste na supressão do primeiro marcador deseleção do genoma da mencionada célula primária. Para a supressão domencionado primeiro marcador de seleção, a célula é transfectada pelo geneque codifica a recombinase específica para as seqüências, permitindo asupressão do primeiro marcador de seleção. Métodos e vetores capazes detransferir o mencionado gene na célula são bem conhecidos pelos técnicos noassunto, por exemplo, o método descrito no exemplo 4 da presente invençãopode ser utilizado.

Quando o vetor utilizado no processo da presente invençãocompreende um Segundo marcador de seleção, o processo de acordo com apresente invenção pode compreender adicionalmente uma etapa em que ascélulas são cultivadas em um meio que permite apenas o crescimento decélulas que não possuem incorporado o segundo marcador de seleção. Amencionada etapa pode ser realizada simultaneamente ou separadamente daetapa em que as mencionadas células são cultivadas em um meio que permiteapenas o crescimento das células que possuem incorporado o primeiromarcador de seleção.

O mencionado segundo marcador de seleção é particularmenteútil quando o vetor, utilizado no processo de acordo com a presente invenção écircular. A presença do mencionado segundo marcador de seleção permite adestruição das células em que o processo de recombinação homóloga levou àintrodução da seção do vetor de transferência que não compreende a moléculade ácido nucléico da presente invenção.

Quando o vetor utilizado no processo da presente invençãocompreende um terceiro marcador de seleção, o processo de acordo com apresente invenção pode adicionalmente compreender uma etapa em que amencionada célula é cultivada em um meio que não permite o crescimento dascélulas que compreendem o terceiro marcador de seleção. Por exemplo, ummeio que não permite o crescimento de células que compreendem FCU1 comoum terceiro marcador de seleção, que compreende 5-fluorocitosina.

Esta etapa permite a seleção das células nas quais a supressãodo primeiro marcador de seleção ocorreu. Isto significa que a etapa queconsiste na supressão do primeiro marcador de seleção levará também àsupressão do terceiro marcador de seleção. A presença do terceiro marcadorde seleção permite a destruição das células nas quais o primeiro marcador deseleção está presente.

A presente invenção refere-se, mais particularmente, mas sem selimitar, a um processo de imortalização de uma célula, que compreende asetapas de:

- transfecção em uma célula de um vetor que compreende:

* uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção, circundada por seqüências homólogas,

* Um primeiro marcador de seleção em que o mencionadoprimeiro marcador de seleção é um marcador de seleção positivo, e em que omencionado primeiro marcador de seleção é circundado pelas mencionadasseqüências homólogas,

* seqüências que permitem a supressão do primeiro marcador deseleção,

* um segundo marcador de seleção que não é circundado pelasmencionadas seqüências homólogas, e em que o mencionado segundomarcador de seleção é um marcador de seleção negativo,

* um terceiro marcador de seleção, em que o mencionado terceiromarcador de seleção é um marcador de seleção negativo, e em que omencionado terceiro marcador de seleção está localizado entre as seqüênciasque permitem a supressão do primeiro marcador de seleção,

- cultivo das mencionadas células em um meio que permiteapenas o crescimento das células que possuem incorporado o primeiromarcador de seleção;

. cultivo das mencionadas células em um meio que não permite ocrescimento das células que possuem incorporado o segundo marcador deseleção;

- exclusão do primeiro marcador de seleção do genoma damencionada célula;

. cultivo da mencionada célula em um meio que não permite ocrescimento de células que compreendem o terceiro marcador de seleção.

Em uma realização particularmente preferida, a presente invençãorefere-se a uma célula imortalizada que deriva de uma célula de um animalpertencente à espécie Cairina moschata e que compreende a transcriptasereversa telomerase de Cairina moschata, sob o controle do promotor HPRT de

Cairina moschata, inserido no gene HPRT da célula.

A célula de acordo com a presente invenção pode adicionalmentecompreender uma ou mais seqüência de ácido nucléico que permite apropagação de um vírus de defesa. "Vírus de defesa" refere-se a um vírus queem que um ou mais genes virais necessários para sua replicação sãodeletados ou tornados não-funcionais. O termo "seqüência de ácido nucléicoque permite a propagação de um vírus de defesa" refere-se a uma seqüênciade ácido nucléico que fornece em trans a(s) função(ões) que permite areplicação do vírus de defesa. Em outras palavras, a mencionada seqüência deácido nucléico codifica as proteínas necessárias para a replicação e aencapsidação do mencionado vírus de defesa. A título ilustrativo, para aprodução de um vetor adenoviral, que não possui a maior parte da região E1, acélula de acordo com a presente invenção pode ser transfectada de formatransitória ou permanente com uma seqüência de ácido nucléico que codifica aregião E1.

A célula de acordo com a presente invenção pode aindacompreender uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma substância deinteresse. Da forma utilizada no presente, a substância de interesse podeincluir, mas sem se limitar, uma proteína farmaceuticamente ativa, porexemplo, fatores de crescimento, reguladores do crescimento, anticorpos,antígenos, seus derivados úteis para a imunização ou vacinação e similares,interleucinas, insulina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF ou combinaçõesdestes, interferons, por exemple, interferon-a, interferon-(3, interferon-y (estáfaltando no original), fatores de coagulação sangüínea, por exemplo, Fator VIII,Fator IX, ou tPA, ou uma combinação destes. "Substância de interesse"também se refere à enzimas industriais, por exemplo, para uso na produção depapel e celulose, modificação têxtil, ou etanol. Finalmente, "substância deinteresse também se refere suplemento protéico ou um produto de valoragregado para a alimentação animal.

As células obtidas pelo processo da presente invenção, a célulada presente invenção e as células derivadas destas, são particularmente úteispara a replicação de um vírus. O mencionado vírus pode ser vivo, atenuado,recombinante ou não. Mais particularmente, as mencionadas células sãoparticularmente úteis para a replicação de poxvírus (vírus vaccinia, emparticular MVA, canarypoxvírus, etc.), um adenovírus, um retrovírus, vírus daherpes, um alfavírus, um vírus espumoso ou de um vírus associado aadenovírus.

Os retrovírus possuem a propriedade de infectar, e na maioria doscasos integrar em, dividindo as células e, neste sentido, são particularmenteapropriados para uso com relação ao câncer. Um retrovírus recombinante deacordo com a presente invenção contém geralmente as seqüências LTR1 umaregião de encapsidação e a seqüência de nucleotídeo de acordo com apresente invenção, que é colocada sob o controle do LTR retroviral ou de umpromotor interno, tal como os descritos abaixo. Um vetor retroviral pode contermodificações, em particular, nas LTRs (substituição da região promotora comum promoter eucariótico) ou na região de encapsidação (substituição com umaregião de encapsidação heteróloga, por exemplo, o tipo VL30) (vide os pedidosfranceses 94 08300 e 97 05203).

O vetor adenoviral pode não apresentar todo ou parte de pelomenos uma região que é essencial para a replicação, e que é selecionada apartir das regiões E1, E2, E4 e L1 L5. A deleção da região E1 é preferida.

Entretanto, ela pode ser combinada com outra modificação / deleção que afeta,em particular, todo ou parte das regiões E2, E4 e/ou L1 L5. A título ilustrativo, adeleção da maior parte da região E1 e da unidade de transcrição E4 é muitoparticularmente vantajosa. Para aumentar a capacidade de clonagem, o vetoradenoviral pode adicionalmente não apresentar todo ou parte da região E3não-essencial. De acordo com outra alternativa, é possível fazer uso de umvetor adenoviral mínimo que retém as seqüências que são essenciais para aencapsidação, denominadas ITRs 5' e 3' (repetição terminal invertida), e aregião de encapsidação. Os diversos vetores adenovirais, e as técnicas paraprepará-los são conhecidas (vide, por exemplo, Graham and Prevect, 1991, emMethods in Molecular Biology1 Vol 7, p 109 128; Ed: E. J. Murey, The HumanPress Inc).

A família do poxvírus compreende vírus das subfamíliasCordopoxvírus e Entomopoxvírus. Entre estes, o poxvírus de acordo com apresente invenção é preferencialmente selecionado do grupo que consiste deOrtopoxvírus, Parapoxvírus, Avipoxvírus, Capripoxvírus, Leporipoxvírus,Suipoxvírus, Molluscipoxvírus, Yatapoxvírus. De acordo com uma realizaçãoparticular, o poxvírus da presente invenção é um ortopoxvírus.

O ortopoxvírus é preferencialmente um vírus vaccinia e, emparticular, um vírus vaccinia modificado Ankara (MVA), em particular, MVA 575(ECACC V00120707) e MVA-BN (ECACC V00083008).

O termo "vírus recombinante" refere-se a um vírus quecompreende uma seqüência exógena inserida no seu genoma. Da formautilizada no presente, uma seqüência exógena refere-se a um ácido nucléicoque não está naturalmente presente no vírus parental.

Em uma realização, a seqüência exógena codifica uma moléculaque possui, direta ou indiretamente, uma função citotóxica. Por "direta ouindiretamente" citotóxica, entende-se que a molécula codificada pela seqüênciaexógena pode ser tóxica (por exemplo, rícino, fator de necrose tumoral,interleucina-2, interferon-y, ribonuclease, deoxiribonuclease, exotoxina A dePseudomonas) ou pode ser metabolizada para formar um produto tóxico, oupode atuar em alguma outra coisa para formar um produto tóxico. A seqüênciade cDNA de rícino é descrita em Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270) aqui incorporada como referência.

Em uma realização preferida da presente invenção, a seqüênciaexógena pode ser um gene suicida. Um gene suicida codifica uma proteínacapaz de converter uma pró-droga relativamente não tóxica em uma drogatóxica. Por exemplo, a enzima citosina deaminase converte 5-fluorocitosina(5FC) em 5-fluorouracila (5FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89, 33); a enzimatimidina quinase de herpes simplex sensibiliza células para o tratamento com oagente adenoviral ganciclovir (GCV) ou aciclovir (Moolten (1986) Câncer Res.46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608). A citosina deaminase dequalquer organismo, por exemplo, E. coli ou Saccharomyces cerevisiae, podeser utilizada.

Desta forma, em uma realização preferida da presente invenção,o gene codifica uma proteína que possui uma atividade citosina deaminase, emais particularmente uma proteína conforme descrita nos pedidos de patenteW02005007857 e W09954481.

Em uma realização particular, o gene exógeno codifica umaribozima capaz de clivar RNA ou DNA alvo. O RNA ou DNA alvo a ser clivadopode ser RNA ou DNA que é essencial no funcionamento da célula, e suaclivagem resulta na morte celular, ou o RNA ou DNA a ser clivado pode ser umRNA o DNA que codifica uma proteína indesejada, por exemplo, um produto deoncogene, e a clivagem deste RNA ou DNA poderá prevenir a célula de tornar-se cancerosa.

Ainda, em uma realização adicional da presente invenção, o geneexógeno codifica um RNA antisense.

Por "RNA antisense" indica-se uma molécula de RNA que sehibridiza a, e interfere na expressão de, uma molécula de mRNA que codificauma proteína, ou a outra molécula de RNA na célula, tal como pré-mRNA outRNA ou rRNA, ou hibridiza a, e interfere com a expressão de, um gene.

Em outra realização da presente invenção, a seqüência exógenasubstitui a função de um gene defeituoso em uma célula alvo. Existemcentenas de doenças genéticas herdadas de mamíferos, incluindo humanos,que são causadas por genes defeituosos. Exemplos destas doenças genéticasinclui fibrose cística, que se sabe ser uma mutação no gene CFTR; distrofiamuscular de Duchenne, em que se sabe que é uma mutação no genedistrofina; doença falciforme, que se sabe ser uma mutação no gene da HbA.Muitos tipos de cânceres são causados por genes defeituosos, especialmenteproto-oncogenes, e genes supressores de tumor que passaram por umamutação.

Exemplos de proto-oncogenes são ras, src, bcl e outros;exemplos de genes supressores de tumor são p53 e Rb.

Em uma realização adicional da presente invenção, a seqüênciaexógena codifica um antígeno associado a tumor (TAA). TAA refere-se a umamolécula que é detectada em uma freqüência ou densidade mais alta emcélulas tumorais do que em células não-tumorais, do mesmo tipo de tecido.

Exemplos de TAA incluem, mas sem se limitar, CEA1 MART-1, MAGE-1,MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, oncogene rãs com mutação pontual, p53normal ou com mutação pontual, p53 sobre expresso, CA-125, PSA1 C-erb/B2,BRCA I, BRCA II, PSMA, tirosinase, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA,HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, sobreviventes e LRP. De acordo comuma realização preferida, o TAA é MUC1.

O vírus recombinante pode compreender mais de uma seqüênciaexógena, e cada seqüência exógena pode codificar mais de uma molécula. Porexemplo, pode ser útil para associar em um mesmo poxvírus recombinante,uma seqüência exógena que codifica TAA com uma seqüência exógena quecodifica uma citosina.

Em outra realização da presente invenção, o gene exógenocodifica um antígeno. Da forma utilizada no presente, "antígeno" refere-se a umIigante que pode se ligado por um anticorpo; um antígeno precisa ser não-imunogênico.

De preferência, o antígeno é derivado de um vírus tal como, porexemplo, HIV-1, (tal como gp 120 ou gp 160), qualquer vírus deimunodeficiência de felino, vírus da herpes animal ou humano, tal como gD ouseus derivados, ou proteína de expressão precoce, tal como ICP27 de HSV1ou HSV2, citomegalovírus (tal como gB ou seus derivados), vírus varicella-zoster (tal como gpl, II ou III), ou de um vírus de hepatite, tal como vírus dahepatite B, por exemplo, antígeno de superfície de hepatite B ou um derivadodo mesmo, vírus da hepatite A, vírus da hepatite C (preferencialmente proteínanão-estrutural do genótipo 1b linhagem ja) e vírus da hepatite E, ou de outrospatógenos virais, tal como vírus de sincício respiratório, vírus de papilomahumano (preferencialmente as proteínas E6 e E7 da linhagem HPV16) ou vírusInfluenza1 ou derivado de patógenos bacterianos tais como Salmonella,Neisseria, Borrelia (por exemplo OspA ou OspB ou derivados dos mesmos), ouClamídia, ou Bordetella por exemplo P.69, PT e FHA, ou derivado de parasitas,tal como Plasmodium ou Toxoplasma.

Figura 1: vetor que compreende um gene que codifica atranscriptase reversa telomerase.

Figura 2: representação esquemática de uma inserção em sítioespecífico do gene que codifica a transcriptase reversa telomerase no geneHPRT.

Figura 3: representação esquemática da eliminação do primeiro edo terceiro marcador de seleção do genoma da célula imortalizada obtida peloprocesso da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Sistema de Expressão de TelomeraseInserção Randômica

Um plasmídeo que não compartilha qualquer seqüênciaespecífica de homologia com o genoma de pato foi utilizado para este propósito(Figura 1).

Inserção Alvo

Um plasmídeo que compreende dois fragmentos homólogos de 5kb ao gene HPRT de Cairina moschata circundando o gene da transcriptaserevprsa telomerase de cairina moschata e dois marcadores de seleção foramconstruídos. O gene HPRT que codifica a hipoxantina guanina fosforiltransferase foi selecionado como um sítio adequado para a expressãoconstitutiva da telomerase de cairina moschata.

Estes dois marcadores de seleção são o gene FCU1 (Erbs et al.Câncer Res. 2000. 15. 60. :3813-22) sob o controle de um promoter CMV(Thomsen et al. P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-63) e o gene de resistência aneomicina colocado sob o controle de um promotor SV40. O cassete deexpressão de resistência a neomicina e FCU-1 são circundados por sítios declivagem Sce 1 que permite a eliminação dos cassetes de seleção da linhagemcelular final. Além de braços do gene HPRT1 é inserido um marcador deseleção que codifica HSVTK dirigido por um promotor RSV (Figura 2).

Fxemplo 2: Preparação de Batelada CEC Batch de Ovos de Cairina

Moschata de 12 Anos e Subpopulações Descritas

25 ovos SPF fertilizados são incubados a 37,5°C. Os ovos sãoabertos após 12 dias de incubação, seguindo um protocolo disponível.

23 embriões são moídos, lavados uma vez em solução salinatamponada com fosfato - Dulbecco (PBS) e dissociados em meio TrypLESelect (Invitrogen) durante 5 horas a temperatura ambiente.

Após uma centrifugação em baixa velocidade, as células sãonovamente suspensas em meio basal Eagle (MBE) suplementado com 10% desoro de bezerro fetal (FCS)1 gentamicina 0,04 g/L, semeadas em frascos triplosde 500cm2 e incubadas a 37°C a 5% de CO2.

Após 24 horas, as células confluentes são removidas dos frascosutilizando meio TrypLE Select (5 mL/frasco triplo), parte das células sãonovamente semeadas em frascos de 175 cm2 para segunda passagem. Ascélulas restantes foram concentradas a 10rcélula/mL em meio apropriado (60%de BME1 30% de FCS e 10% de DMSO), e congeladas em um recipienteregulado de álcool isopropílico (NALGENE. ®. "Mr. Frosty" 1°C frezing.Container) a -80°C antes da transferência para nitrogênio líquido, paraarmazenagem de longo período, constituindo o banco de células inicial (50 x1,5.107células/frasco, 44 x 1.10^7células/frasco).

As células permanecidas em cultura são classicamente passadaspor 18 passagens, durante as 3 primeiras passagens, as células não ligadassão coletadas por centrifugação baixa do meio condicionado, novamentesemeadas e adicionalmente passadas da mesma forma da cultura inicial.

Subpopulações, exibindo características morfológicas diferentes,foram isoladas de forma reprodutível durante o tempo de cultura

Exemplo 3: Métodos de Transfecção

Um grande número de métodos de transfecção são conhecidosna técnica para introduzir um vetor capaz de direcionar a expressão de umaseqüência de nucleotídeo de interesse. Uma lista não-limitativa destes métodosé listada a seguir: precipitação em CaPO4, eletroporação, método detransfecção por lipofectina. Um dado exemplo é baseado no procedimento deprecipitação em CaPO4.

As células devem apresentar um confluência de cerca de 80 a50%. O meio é alterado 2 horas antes a adição de CaP04/DNA. 30 pg de DNAé novamente suspenso em 31 ul2M CaCI2 -161,3 mM Tris pH 7,6. H2O éadicionado a um volume final de 0,5 ml.

Por transfecção, 0,5 ml de 2X HEBS é distribuído em 15 ml detubo Falcon estéril e a solução de DNA é adicionada em gotas, enquanto asolução de DNA é delicadamente passada no vortex ou borbulhada (bubbling).A solução deve se tornar leitosa. A mistura é deixada repousar a temperaturaambiente por 10 a 30 minutos. A seguir, a solução é pipetada repetidas vezes,com uma pipeta estéril, no frasco de cultura, para quebrar flocos e as célulassão aplicadas em gotas. As células são então incubadas entre 6 horas por umanoite a 37°C. Um precipitado fino deve cobrir a superfície celular. Paracompletar o procedimento de transfecção, aquecer a 37°C a solução de choquede glicerol (glycerol shock solution). O meio é então aspirado, 5 ml de BME éadicionado para lavar a camada de células, o meio é então aspirado e 1 ml desolução de choque de glicerol é adicionado por 2 minutos ou menos.

Subseqüentemente, 10 ml de BME são adicionados calmamente para diluir oglicerol e BME-glicerol é completamente removido. 10 ml do meio desejado éentão adicionado e as placas são incubadas a uma temperatura apropriada.

Exemplo 4: Métodos de Seleção

Inserção Randõmica

Pressão de seleção é aplicada 48 horas após a transfecção: ascélulas são dissociadas com TrypLE selecionado, centrifugadas a baixavelocidade e novamente semeadas em BME com FCS 10%, e G418 800pg/mL.

As células são passadas de forma serial até que clones decrescimento individual possam ser isolados. Os focos de multiplicação sãoisolados e amplificados antes da quantificação da atividade da telomerase como kit de detecção de telomerase TRAPeze® XL (S7707, Chemicon) e a análisepor southern blot para estabelecer a integração no Iocus específico alvo.

Inserção Alvo

Pressão de seleção é aplicada 48 horas após a transfecção: ascélulas são dissociadas com TrypLE seletivo, centrifugadas com baixavelocidade e novamente semeadas em BME com FCS 10%, Ganciclovir 25Mg/mL, e G418 800 pg/mL.

As células são passadas de forma serial até que clones decrescimento individual possam ser isolados. Os focos de multiplicação sãoisolados e amplificados antes da quantificação da atividade da telomerase como kit de detecção de telomerase TRAPeze® XL (S7707, Chemicon) e a análisede oligos por southern blot para estabelecer a integração no Iocus específicoalvo.

Clones de células com atividade telomerase restauradadetectados e integração de Iocus HPRT alvo são subseqüentementetransfectadas com um plasmídeo de expressão meganuclease I-Scel seguindoo método descrito abaixo.

Para selecionar a eliminação dos marcadores de seleção, 5-fluorocitosina (5-FC) é aplicado 48 horas após a transfecção: as células sãodissociadas com TrypLE seletivo, centrifugadas a baixa velocidade, enovamente semeadas em meio com concentração de 5-FC variando de 10" a10"7 M e manutenção da seleção por G418 (BME com FCS 10%, 5-FC, e G418800 Mg/mL).Listagem de Seqüencias

<110> TRANSGENE SAERBS PhilippeBALLOUL Jean-MarcFCAPFER MarinaSILVESTRE Nathalie

<120> Transceptase Reversa Telomerase de Aves<130> TG167PCT

<140> PCT/EP2007/050120<141> 2007-01-05

<150> EP 06360001.9<151> 2006-01-05

<150> EP 06360047.2<151> 2006-10-13

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1<211> 1304<212> PRT

<213> Cairina moschata<4 00> 1

Met Ala Gly Ala Glu Pro Phe Gly Ala Val Leu Gly Ala Leu Arg Asp1 5 10 15

Cys Tyr Ala Gln Ala Ala Pro Leu Glu Thr Phe Leu Arg. Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Ser Gly Ala Glu Glu Ala Glu Val Val Arg Asp Asp Asp Ala Ala

35 40 45

Cys Tyr Arg Thr Phe Val Ser Gln Cys Val Val Cys Val Pro His Gly

50 55 60

Ala Arg Asp Ile Pro Arg Pro Phe Ser Leu Glu Gln Leu Ser Ser Gln65 70 75 80

Ser Glu Val Ile Ser Arg Val Met Gln Arg Leu Cys Gly Lys Lys Lys

85 90 95

Lys Asn Ile Leu Thr Tyr Gly Tyr Ser Leu Leu Asp Glu Asn Ser Ser

100 105 HO

His Phe Gln Ile Met Pro Leu Ser Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Pro Asn

115 120 125

Thr Ala Thr Glu Thr Met Arg Ile Ser Gly Leu Trp Glu Thr Leu Leu

130 135 140

Ser Arg Ile Gly Asp Asp Val Met Met Tyr Leu Leu Glu His Cys Ala145 150 155 160Ile Phe Met Leu Val Pro Pro Ser Asn Cys Tyr Gln Val Cys Gly Gln

165 170 175

Pro Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Gln Asn Val Glu Ser Ala Pro Ala Phe

180 185 190

Val Lys Gln Arg Leu Ser Lys His Lys Arg Ser Ser Leu Leu Lys Tyr

195 200 205

Thr Gln Lys Arg Leu Thr Phe His Arg Gln Tyr Leu Ser Lys Ser Arg

210 215 220

Gln Ser Lys Arg Arg Gln Arg Leu Glu Ala Asn Val Ser Ser Met Arg225 230 235 240

Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ile Gln Ser Leu Gly Ser Ala Ala Leu Glu

245 250 255

Lys Gln Ser Ser Ser Asn Ala Gly Leu Ser Ala Thr Ala Pro Ser Leu

260 265 270

Lys Arg Lys Leu Ala Arg Glu Gln Leu Glu Val Thr Ala Lys Arg Ala

275 280 285

Arg Leu Glu Glu Lys Glu Arg Glu Glu Gln Ala Cys Asn Thr Ala Pro

290 295 300

Asn Val Asn Gln Ser Ile Pro Lys Arg Tyr Gly Thr Ser Cys Val Ala305 310 315 320

Ser Arg Ser Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Gln Arg Ser

325 330 335

Asn Ser Asp Met Ser Arg Pro Ser Leu Val His Asn Ser His His Gly

340 345 350

Lys Lys Ser Val Ala Asp Lys Ser Ser Phe Leu Gln Gly Ala Glu Ser

355 360 365

Asn Arg His Leu Lys Pro Ser Ile Glu Met Gln Ala Gly Ser Ser Arg

370 375 380

Lys Arg Val Glu Ile His Arg Pro Ile Pro Arg Leu Asp Trp Ile Pro385 390 395 400

Ile Glu Pro Ala Glu Ser Ser Ser Ser Gly His Lys Lys Gln Glu Ser

405 410 415

Pro Leu Ala His Leu Ala Glu Glu Leu Pro Asn Arg Val Leu Pro Ser

420 425 430

Thr Ile Tyr Ile Asp Arg Lys Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Arg Tyr Trp

435 440 445

Gly Glu Arg Phe Pro Lys Ser Phe Leu Leu Asn Arg Leu Lys Gly Ser

450 455 460

Glu Ala Gly Val Lys Arg Leu Ile Glu Thr Ile Phe Leu Ser Gln Asn465 470 475 480Pro Phe Gly Gln Lys Arg Asn Gln Gly Leu Pro Gln Lys Lys Trp Arg

485 490 495

Lys Lys Lys Leu Pro Lys Arg Phe Trp Arg Met Arg Ser Thr Phe Gln

500 505 510

Lys Leu Leu Lys Asn His Gly Lys Phe Pro Tyr Val Ala Phe Leu Arg

515 520 525

Gln Asn Cys Pro Leu Arg Ile Ser Glu Thr Ile Leu Gly Lys Ala Lys

530 535 540

Leu Leu Ser Arg Ala Pro Leu Pro Gly Gln Ala Glu Ala His Lys Gln545 550 555 560

Ala Glu Gln Leu Gly Lys Glu Pro Ala Lys Arg Val Ala Ser Ser Arg

565 570 575

Cys Glu Ser Gly His Thr Asn Val Pro Ser Ser Val Arg Ala Pro Leu

580 585 590

Ala Ala Ser Ala Cys Val Glu Pro Gly Gly Glu Glu Gln Ile Pro Ala

595 600 605

Glu Ala Ser Asp Ser Val Leu Arg Glu Leu Leu Lys Glu His Cys Ser

610 615 620

His Phe Gln Val Tyr Leu Phe Val Arg Glu Cys Val Glu Arg Val Ile625 630 635 640

Pro Ala Glu Leu Trp Gly Ser Asn His Asn Lys Arg Arg Phe Phe Lys

645 650 655

Asn Val Lys Ala Phe Ile Ser Met Gly Lys Tyr Ala Lys Leu Ser Leu

660 665 670

Gln Val Leu Met Trp Lys Met Arg Val Asn Asp Cys Met Trp Leu Arg

675 680 685

Leu Ala Lys Gly Asn His Phe Val Pro Ala Ser Glu His Arg Tyr Arg

690 695 700

Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu Tyr Trp Leu Met Asp Thr Tyr Val705 710 715 720

Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Ile Thr Glu Thr Met Phe Gln

725 730 735

Lys Asn Met Leu Phe Tyr Tyr Arg Lys Cys Ile Trp Ala Lys Leu Gln

740 745 750

Asp Ile Gly Ile Arg Lys His Phe Ala Lys Val Gln Leu Arg Pro Leu

755 760 765

Thr Ala Glu Glu Met Glu Ala Ile His Gln Lys Lys Tyr Leu Pro Met

770 775 780

Ala Ser Lys Leu Arg Phe Ile Pro Lys Val Ser Gly Leu Arg Pro Ile785 790 795 800Val Arg Met Ser Gly Val Val Glu Ala Gln Thr Leu Ser Lys Glu Ser

805 810 815

Arg Ala Lys Lys Met Asn His Tyr Asn Met Gln Leu Lys Asn Leu Phe

820 825 830

Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Thr Ile Asn Thr Ser Tyr Ile Gly Ser

835 840 845

Ser Val Phe Gly Arg Asp Asp Ile Tyr Lys Lys Trp Lys Thr Phe Val

850 855 860

Lys Lys Val Leu Lys Ser Asp Gly Glu Ile Pro His Phe Tyr Tyr Val865 870 875 880

Lys Ala Asp Val Ser Arg Ala Phe Asp Ser Ile Pro His Asp Lys Leu

885 890 895

Val Glu Val Ile Ser Gln Val Leu Lys Pro Glu Lys Lys Thr Val Tyr

900 905 910

Cys Ile Arg Arg Tyr Ala Val Val Met Ile Thr Gly Ser Gly Lys Thr

915 920 925

Arg Lys Leu Tyr Arg Arg His Val Ser Thr Phe Lys Asp Phe Met Pro

930 935 940

Asp Met Lys Gln Phe Val Ser Arg Leu His Glu Ser Thr Ser Leu Arg945 950 955 960

Asp Ala Ile Ile Val Glu Gln Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ser Ala

965 970 975

Ser Leu Phe Asn Phe Phe Leu Gln Met Leu Asn Asn Asn Ile Leu Glu

980 985 990

Ile Glu Arg Ser Tyr Tyr Leu Gln Cys Ser Gly Ile Pro Gln Gly Ser

995 1000 1005

Leu Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu

1010 1015 1020

Asn Lys Leu Phe Ser Gly Val Gln Lys Asp Gly Val Leu Ile Arg

1025 1030 1035

Leu Ile Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala

1040 1045 1050

Arg Thr Phe Leu Arg Thr Leu Ala Met Gly Ile Pro Glu Tyr Gly

1055 1060 1065

Phe Leu Ile Asn Pro Lys Lys Thr Val Val Asn Phe Ser Val Asp

1070 1075 1080

Asp Ile Pro Glu Cys Ser Glu Phe Lys Gln Leu Pro Asn Cys Arg

1085 1090 1095

Leu Ile Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Gln Thr Leu Glu1100 1105 moVal Tyr Cys Asp Tyr Ser Ser Tyr Ser Cys Thr Ser Ile Arg Ser

1115 1120 1125

Ser Leu Ser Phe Asn Ser Asn Arg Thr Ala Gly Lys Asn Met Lys

1130 1135 1140

His Lys Leu Val Ala Val Leu Lys Leu Lys Cys His Gly Leu Phe

1145 1150 1155

Leu Asp Leu Gln Ile Asn Ser Val Lys Thr Val Phe Ile Asn Val

1160 1165 1170

Tyr Lys Ile Phe Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val

1175 1180 1185

Ile Gln Leu Pro Phe Asn Gln Lys Val Arg Asn Asn Pro Asp Phe

1190 1195 1200

Phe Leu Arg Val Ile Ala Glu Asn Ala Ser Cys Cys Tyr Ser Met

1205 1210 1215

Leu Lys Ala Lys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Gly Asn Arg Gly Ala

1220 1225 1230

Ser Gly Met Phe Pro Ser Glu Ala Ala Glu Trp Leu Cys Tyr His

1235 1240 1245

Ala Phe Thr Val Lys Leu Ser Asn His Lys Val Val Tyr Lys Cys

1250 1255 1260

Leu Leu Lys Pro Leu Lys Phe Cys Met Thr Gln Leu Phe Arg Lys

1265 1270 1275

Ile Pro Lys Asp Thr Lys Ala Leu Leu Lys Thr Val Thr Glu Pro

1280 1285 1290

Ser Ile Cys Gln Asp Phe Lys Ala Ile Leu Asp1295 1300

<210> 2<211> 3915<212> DNA

<213> Cairina moschata<400> 2

atggcgggcg cggagccctt cggcgccgtg ctgggcgccc tgcgggactg ctacgcgcag

60

gcggccccgc tggagacctt cctccggggg ctgggggaga gcggcgccga ggaagccgag 120

gtggtgcggg acgacgacgc cgcctgctac cgcaccttcg tgtcccagtg cgtggtgtgtgtcccccacg gcgcccgcga catcccccgg cccttcagct tggagcagtt atctagtcagagcgaagtca tctcaagagt catgcagagg ctgtgtggga aaaagaagaa gaacatcctcacatatggat actccttgct ggatgaaaac agttctcact tccaaatcat gccgctctca 360aacgtgtaca gctacctgcc caacaccgca acagaaacca tgcgtatcag tggcctctgg 420

180240300gaaacgctgc tgagcaggat aggggatgac gtgatgatgt atttattgga gcactgtgca 480atctttatgc tggttccccc tagtaactgt taccaagtct gtgggcaacc aatttatgaa 540cttatttcgc aaaatgtaga atcagcccca gcgtttgtta aacaacggct ttcaaagcac 600aaacgtagta gcttgcttaa gtatacgcag aaaaggctaa cgtttcacag acagtatctt 660tcaaagtcac gtcagtcgaa acgcaggcaa agacttgaag ctaatgtctc cagcatgaga 720aataaaacca gcaataatat acaaagccta gggtccgctg ctctggaaaa acagagtagc 780tccaatgcag gtttgtcagc tacagcacca tccttaaaaa ggaagcttgc tagggaacaa 840ctggaagtca cggctaagag agcaagatta gaagagaaag agagggagga acaggcttgt 900aatactgctc ctaatgtaaa ccagagtatt cccaagaggt atggaaccag ctgtgtagca 960tcacgttctg taagtcttat taaagaaaaa tacatttctc aaagaagtaa cagtgatatg 1020tctcgtcctt ctttagttca caattctcat catgggaaga agtctgtggc agacaaaagc 1080tctttcctgc aaggagctga gagtaacaga catttaaagc ccagcattga aatgcaagca 1140ggatccagca ggaagagagt agagatacac aggcctatac ctcggttgga ttggatacca 1200atcgaaccgg cggaaagtag ttcttcagga cacaaaaagc aggaaagtcc cctagctcat 1260ctggcagagg agttacçaaa tagggttttg ccatctacaa tatacattga caggaagttt 1320cttctgtatt ctcgcaggta ctggggggaa cgtttcccaa aatccttcct attgaatcgc 1380ctgaagggta gtgaggcagg tgtaaagcga ctaatagaaa cgatattctt aagccaaaat 1440ccgtttgggc aaaagcgcaa ccaaggtctg ccacagaaaa aatggagaaa gaagaagctt 1500cccaaacgct tctggagaat gagaagtacg tttcaaaaac tcttaaagaa tcatggaaag 1560ttcccttacg tagctttctt gagacaaaat tgccctcttc ggatatctga aaccattttg 1620ggaaaagcca agctgctcag tcgggcacct ttgcctgggc aagcagaggc tcacaagcaa 1680gcagaacagc ttgggaagga gcctgctaag cgtgtggcaa gcagcagatg cgaatctggt 1740cacaccaacg tgcccagcag cgtacgcgct cctctcgcag catctgcgtg cgtggagcca 1800gggggggagg agcagatccc tgcagaggcg tctgattcag tcctcaggga gcttctcaag 1860gagcactgca gccacttcca ggtgtacctc tttgtgaggg agtgcgtgga gcgggtgatc 1920cccgccgagc tctggggttc aaaccataac aagcgccggt tcttcaagaa cgtgaaagca 1980ttcatttcca tggggaagta cgctaagctt tccttgcagg tgttgatgtg gaagatgaga 2040gtaaatgact gcatgtggct tcgtctggcc aaaggtaatc actttgttcc tgçctctgaa 2100caccgttacc gtgaagaaat tttggctaaa ttcctatact ggctgatgga tacgtatgtt 2160gttgagttgc tcagatcatt tttctatatc accgagacca tgttccagaa aaatatgctt 2220ttctactacc gaaagtgtat ttgggccaag ttacaggaca ttggaattag aaagcatttt 2280gccaaagtac agctacgtcc tttaactgca gaggagatgg aagcgatcca tcagaaaaaa 2340taccttccta tggcatcaaa gctccgtttc attcccaaag tcagtggact aagacccatc 2400gtcagaatga gcggtgttgt tgaagcacaa acgttgagca aggaaagcag agcaaagaag 2460atgaatcact acaacatgca actgaaaaat ctatttagtg tgttaaatta tgaacgaact 2520ataaacacca gttacatcgg ctcttcagtg tttgggagag atgatatcta caagaagtgg 2580aagacatttg ttaaaaaggt tcttaaatca gatggtgaaa ttcctcattt ctactatgta 2640aaggccgatg tgtccagggc ttttgatagc attcctcacg ataaacttgt ggaagtgatt 2700tcacaggtct taaaacctga gaaaaaaact gtctactgca tacggcgcta tgcagtggtt 2760atgatcactg gaagtggaaa aaccaggaag ttatacagga gacatgtttc tactttcaag 2820gattttatgc cagacatgaa gcagtttgtg tcccggcttc atgagagtac ctcattgcga 2880gatgcaataa tagttgaaca gagcttaact ttcaatgaga caagtgccag tctatttaat 2940ttttttcttc aaatgctaaa taataacatc ctggaaattg agcgcagcta ctacttacag 3000tgctctggaa ttccacaggg CtGCCttttg tcaaccttgc tttgcagctt gtgctatgga 3060gacatggaaa acaaattatt cagtggggta cagaaggatg gagtcctgat ccgtctcatt 3120gatgactttt tgcttgttac accacactta acgcatgcaa gaactttcct aaggactcta 3180gcaatgggca ttcctgagta tggctttttg ataaacccca aaaagacggt ggtgaatttt 3240tctgttgacg atatcccaga gtgttccgaa tttaaacagc tgccaaactg tcgtttgatc 3300ccatggtgtg gcttattatt ggatacacag acacttgagg tttactgtga ttactccagc 3360tattcctgta cttctatcag atcaagtctt tccttcaatt caaacagaac agctgggaaa 3420aacatgaaac acaaattggt tgcagtcctt aaactgaaat gccatggctt gtttcttgat 3480ttacagatca atagcgttaa aacagttttc attaatgtct acaagatatt tttacttcag 3540gcttacaggt tccatgcctg tgttattcaa cttccattca accagaaagt taggaacaat 3600cctgatttct tcctcagagt catcgctgag aatgcatcgt gctgctattc tatgctgaaa 3660gctaaaaatc cagggtttac tttaggtaac agaggtgcat ctggcatgtt cccttctgag 3720gcagcagagt ggctctgcta tcatgccttc actgtcaaac tgtcaaacca caaagttgtt 3780tacaaatgct tgcttaagcc cctgaagttc tgtatgacac agctattccg gaagatccca 3840aaggatacta aggcactact gaagacagtg acagaaccat ctatttgtca agatttcaaa 3900

gctatcctgg actga

<210> 3<211> 26916<212> DNA

<213> Cairina moschata<400> 3gctatcactc catttcaagg aagggcaaaa ggccggttca ataccaacat ctgtgtagct 60aagtaggatg aaatagatta ggtgaccaaa atatctgctt attcagcagg tgttgatcca 120caggaggttc tacgataaag ctccagtagg agttgtacca gcgtaattcc tggagggcag 180caataagtcc accatctaca ctccacaaag tctgatcttt aggtacaaag agctgtgctg 240atctagaatg atgtggttag actgaatctg gctctaaatt tctgttatta gagtattatg 300tattattaag taagaggcct tgcttcttac tgctgcctaa atgaagatta actttacagt 360gaagcagagt gagagatgaa ggggtgataa tgtgtttgaa atatcagact taatctggca 420ggtgataatc agttcattcc aaaaacgtta atgtgctgaa tcagattgac aagaaaatga 480atcctaatta gttgaaatta atctgaagag aactgaaagt acatcatagc aaatagtaac 540tcttcttcca catcacaagg aacagattcc actgtgttag tgatggaggt ttatacaaaa 600aaaaaaaaaa aagaaaaacc agaacagctc ttaatttata tacttattga agcagattct 660atatatgcat atgtatgcac attcattaat cagcagtaca tctcaaccct taaaagatcc 720tggagaactg ttgcttgtca aaaagcactc aggttaggct aacatttgca gcttttgctc 780tagcatacat ttacattagg tgtaaagaca aggaatgtgt aaaagagggt aaatgcattc 840ctatctacaa tgttatgtat attttgttcc tgttatattg gctttacttc caaagttgta 900gtttgcagta ttagtttctt tttattggta tccttgcata tatatatatt caataaatga 960gttatgaatt tcatatttgc atatctgtcc tttttctgaa agtagaactt taaaactgac 1020acttcagtgc ataaaagcag tgttccctat tgatgttaaa gtacctcgaa agttttacca 1080gaagacaagt gagtgcatac ttaaagtatg ctacttactt ggtggtaact gcgtatttgt 1140gcattgttcc tgactttgtg taatgggtaa gttgctttgt atttaccact tgctaataat 1200gtgaagtggc tggctcacta aaggttgcca ttctcacctt tcaaggactt cttgaaggct 1260gtgtcataat aatttagagt aagacagata ctgagagcgc agagtgtaat atagttatgt 1320tgcagaagag cggatagaca caggatgcat gttagaacca tataaatgtg gtgtaaaaga 1380tcagcaaaac gaagaattgc ttggaagatg cttggttttg tccaaataaa tagctgctga 1440gagtgagaga gtgagtgagt aatattcagt atttttaaag tgtcgagaaa tgtaatgggg 1500aaaaatttaa aataaatgtt ttttgtttgt tttaaaagga gctgtgtgct tttatgttga 1560catgttgatt taattactgc ggtaggtatt tactgtgccc tgggaaacgg tatccccagt 1620caacacagac ttatttgtca ggaaaaaaat tgtcatagat catcttcaaa taagagttga 1680caaataatca aatcttgatg gagtataatt attaatactg tgattacata tccatctttg 1740caagggtttc ctgaaaaggt cagttttaag tcttctattg tcaaatctga tgtttggagt 1800agttcgctac atggtgtttg atgccatgta aatagttacc agatagacgt tttattttat 1860gtgctgtatg tttttgtttt tcattcagtc agctggaatc attgaaacag agaaggtttc 1920tcaagaaata tcctgaacct gttttgtgga tgtcttcatt gcaatagctg gtcactgaaa 1980tcttggaata acgacagagg aatccatagg cacaggacca aacacctttc attgtcctca 2040tatagcgtga tgttagggca gagtggtgag tacttcagtg gctcctgtgt ccatgcttta 2100atgaactcta cttaatctac catatgtaag agacttgcag cacaggcaaa acaagggaag 2160ttatctttgt gcctagataa tgtaccacat atggtaaaca attttcaagc ctcagagaca 2220aaagaaggat gctgtaaagt ctcaagtctc agcttgtgtc tctgtttcca cctttctgtt 2280ctttctgttc agacctctgg gccagtaatt taaactggaa aattaatgga acagagaaac 2340tgtttgtgag cctatagaaa gatcaaattg tgtcagagta atgttgctcc ttctacaccc 2400agataaactt tttgagcaga ggagaagcag tgaacagagc tttactttca tgactttgca 2460taagaaaaca tgggaatgtg gtccgagacc aatttaaaaa tagaggtttt gaaaacttgt 2520ttggaaaaca aaacttgctt 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Claims (38)

1. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE OU ISOLADO, quecompreende uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 90% deidentidade de seqüência de aminoácido à SEQ ID N°:l.

2. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, que compreende umaseqüência de aminoácido que é conforme descrita na SEQ ID N°:l

3. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE OUISOLADA, que codifica um polipeptídeo conforme descrito em uma dasreivindicações 1 a 2.

4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, de acordocom a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mencionada seqüênciade ácido nucléico compreende uma seqüência de ácido nucléico que ésubstancialmente tal como descrita pela SEQ ID N°:2.

5. VETOR, que contém uma molécula de ácido nucléicoconforme descrita em uma das reivindicações 3 ou 4.

6. VETOR, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o mencionado vetor compreende duas seqüências homólogasa uma seqüência de DNA alvo.

7. VETOR, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico é circundada pelasmencionadas seqüências homólogas.

8. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7,caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor compreende adicionalmenteum primeiro marcador de seleção, em que o mencionado primeiro marcador deseleção é um marcador de seleção positivo, e onde o mencionado marcador deseleção é circundado pelas mencionadas seqüências homólogas.

9. VETOR, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o mencionado primeiro marcador de seleção é circundado porseqüências que permitem sua supressão.

10. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 6 a 9,caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor compreende um segundomarcador de seleção que não é circundado pelas mencionadas seqüênciashomólogas, e onde o mencionado marcador de seleção é um marcador deseleção negativo.

11. VETOR, de acordo com uma das reivindicações 8 a 10,caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor compreende um terceiromarcador de seleção, onde o mencionado terceiro marcador de seleção é ummarcador de seleção negativo e em que o mencionado terceiro marcador deseleção está localizado entre as seqüências que permitem a supressão doprimeiro marcador de seleção.

12.CÉLULA, transfectada por uma molécula de ácido nucléicode acordo com uma das reivindicações 3 ou 4.

13. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadapelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico é inserida no geneHPRT da mencionada célula primária.

14. CÉLULA, que compreende uma molécula de ácido nucléicode acordo com uma das reivindicações 3 ou 4 operacionalmente ligada aomencionado promotor HPRT endógeno da célula.

15. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 12 a 14,caracterizada pelo fato de que a mencionada célula deriva de um animal quepertence a família Anatidae.

16. ÉLULA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o mencionado animal pertence à espécie cairina moschata.

17. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o animal pertence à espécie Anas platyrhynchos.

18. LINHAGEM CELULAR, de acordo com uma dasreivindicações 12 a 17, em que compreende adicionalmente uma seqüência deácido nucléico que codifica uma substancia de interesse.

19. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 12 a 18,caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente umacomplementação de cassete que permite a propagação de um vírus de defesa.

20. USO DE UM POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma dasreivindicações 1 ou 2, de uma molécula de nucleotídeo de acordo com uma dasreivindicações 3 ou 4, ou de um vetor de acordo com uma das reivindicações 5a 11, em que o uso é para a imortalização de uma célula.

21. USO DE UMA CÉLULA, de acordo com uma dasreivindicações 12 a 18, para a replicação de um vírus.

22. USO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelofato de que o mencionado vírus é selecionado do grupo que consiste em vírusCowpox, vírus Ectromelia, vírus Monkeypox, vírus Vaccinia1 vírus da varíola e MVA.

23. USO DE UMA CÉLULA, de acordo com a reivindicação 18,para a produção de uma substancia de interesse.

24. USO DE UMA CÉLULA, de acordo com uma dasreivindicações 12 a 19, para a produção de um vírus.

25. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que o vírus é poxvírus.

26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que o vírus um vírus vaccinia.

27. USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que o mencionado vírus Vaccinia é um MVA.

28. USO DE UMA CÉLULA, de acordo com uma dasreivindicações 12 a 18, para a produção de um vírus recombinante.

29. PROCESSO DE IMORTALIZAÇÃO DE UMA CÉLULA, quecompreende a etapa de transfecção na mencionada célula, de um vetordescrito em uma das reivindicações 5 a 11.

30. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa em queas mencionadas células são cultivadas em um meio que permite apenas ocrescimento das células que possuem incorporado o primeiro marcador deseleção.

31. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa emque as mencionadas células são cultivadas em um meio que não permite ocrescimento das células que possuem incorporado o segundo marcador deseleção.

32. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o mencionado processo compreendeadicionalmente uma etapa que consiste em excluir o primeiro marcador deseleção do genoma da mencionada célula.

33. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que as células, obtidas após a mencionada etapaque consiste em excluir o primeiro marcador de seleção do genoma dasmencionadas células, são cultivadas em um meio que não permite ocrescimento de células que compreendam o terceiro marcador de seleção.

34. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula é obtida de umorganismo que pertence à família Anatidae.

35. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que o mencionado organismo pertence a espéciecairína moschata.

36. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que o mencionado organismo pertence à espécieAnas platyrhynchos.

37. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 29 a-36, caracterizado pelo fato de que a mencionada molécula de ácido nucléico éinserida em uma seqüência de DNA alvo da mencionada célula.

38. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a mencionada seqüência de DNA alvo é o geneH P RT.