NO316742B1 - Biologisk fremgangsmate for fremstilling av 7-ADCA - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

i - Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse omfatter biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-amino-deacetoksycefalosporansyre (7-ADCA) .

Foreliggende oppfinnelse angår området syntesemetoder for fremstilling av kommersielle cefalosporin-antibiotika, av hvilke det foreligger et betydelig antall, og disse terapeut- . iske midler er nå i sin fjerde generasjon. De mange, forskjellige sidekjeder som kan foreligge i kommersielle cefalosporiner, og den betydelige, økonomiske betydning av cefalosporinene, har medført økt betydning for å oppnå økonomiske og effektive metoder for fremstilling av nøkkelmellomprodukter som tillater enkel syntese av de forskjellige cefalosporiner.

Ett av disse nøkkelmellomprodukter er 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA), representert ved følgende formel .-

For tiden produseres 7-ADCA fra penicillin G og fordrer fire eller fem kjemiske trinn for å utvide penicillinringsystemet fra en 5-ring til 6-ringen som karakteriserer cefalosporiner. Som typisk for fullstendig kjemisk syntese har denne prosess alvorlige mangler. Blant disse er kravene til en flertrinns-og komplisert prosess, kostbare reagenser, dannelse av betydelige mengder biprodukter som fører til avløpsbehandlingspro-blemer, og rensing av et ytterst urent startmateriale før den kjemiske behandling begynner. Det har følgelig pågått en kontinuerlig forskning for en mikrobiologisk eller fermentativ prosess som ville gi enzymatisk ringutvidelse og sidekjede-spaltning for å tilveiebringe 7-ADCA på en mer økonomisk basis

enn den kjemiske prosess som for tiden anvendes.

Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse således området fremstilling av cefalosporin-nøkkelmellomproduk-tet 7-ADCA, og mer spesielt området biologiske fremgangsmåter for fremstilling av 7-ADCA.

Hittil har forskningen etter en vellykket biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-ADCA i stor grad vist seg forgjeves, spesielt med hensyn til en fremgangsmåte i kommer-siell skala. Mens det for eksempel har vært mulig å fremstille 6-aminopenicillansyre (6-APA) ved direkte fermentering og/eller enzymatisk behandling av penicillin G, hvilket kun etterlater nødvendig ringutvidelse for å gi 7-ADCA, er det beklageligvis funnet at Cephalosporium- eller Streptomyces-enzymene som utfører ringutvidelse i de normale metabolske reaksjonsveier for disse mikroorganismer, ikke aksepterer 6-APA som et substrat. Disse enzymer som i teknikken kollektivt refereres til som DAOCS- eller ekspandaseenzymet, defineres som enzymer som katalyserer utvidelsen av penam-ringstrukturer funnet i molekyler av penicillintypen til cef-3-em-ringer, som funnet i cefalosporinene. I det etterfølgende vil disse enzymer refereres til som "ekspandaseenzymet".

Et substrat som ekspandaseenzymet virker på, er penicillin N, hvilket ved ringutvidelse gir deacetoksycefalosporin C (DAOC). Det er her kun nødvendig å spalte (D)-a-aminoadipo-ylsidekjeden for å gi 7-ADCA, men denne sidekjede har vist seg hardnakket resistent mot enzymatisk spaltning, hvilket kun gir uakseptabelt lave utbytter.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det blitt mulig å oppnå en effektiv, biologisk fremgangsmåte hvori en penicillinforbindelse (med en adipoylsidekjede) fremstilles ved hjelp av en ny fermenteringsprosess i høye titere, idet penicillinforbindelsen er et akseptabelt substrat for ekspandaseenzymsystemet som produseres in situ av den samme mikroorganisme som produserer penicillinforbindelsen og som er transformert for å uttrykke ekspandaseenzymsystemet. Ekspandaseenzymet virker deretter til å ringutvide penicillinforbindelsen til en cefalosporinforbindelse med høye utbytter. Av stor betydning er det også at i det andre kritiske trinn kan sidekjeden i penicillinforbindelsen som nå er en cefalosporinforbindelse, fjernes ved hjelp av et annet enzymsystem med overraskende høye utbytter. Det overraskende resultat av denne enestående biologiske fremgangsmåte som utgjør foreliggende oppfinnelse, er fremstilling av 7-ADCA i overraskende høye utbytter.

2 . Kort beskrivelse av kjent teknikk

Cantwell et al., i Curr. Genet. (1990) 17:213-221, har foreslått en biologisk prosess for fremstilling av 7-ADCA ved ringutvidelse av penicillin V etterfulgt av enzymatisk hydrolyse av det resulterende deacetoksycefalosporin V for å danne 7-ADCA. Denne fremgangsmåte er basert på tilgjengelig-heten av et klonet penicillin N-ekspandasegen ( cefE) fra S. clavuligerus, Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989) 171:754-760 og US 5 070 020. Imidlertid, fordi ekspandasen virker på penicillin N, dens naturlige substrat, men ikke på penicillin V, fordrer fremgangsmåten genteknikk for å produsere et modifisert ekspandasegen som kan ringutvide penicillin V. Den fordrede modifikasjon ble imidlertid ikke oppnådd av Cantwell et al., og de lyktes kun med å transformere Penicillium chrysogenum med cef E-genet fra Sfcrepto-myces clavuligerus og oppnå lavnivåekspresjon av DAOCS-(ekspandase)-enzymet.

Ekspandaseenzymet er grundig undersøkt i teknikken, både med hensyn til dets aktivitet og genetiske sekvens. I Wolfe, US 4 510 246 og 4 536 476, ble for eksempel syklase-, epimerase- og ringekspansjonsenzymer separat isolert fra en cellefri ekstrakt av prokaryotiske fJ-laktamproduserende organismer, inkludert Strepto/nyces clavuligerus, for å tilveiebringe stabile enzymreagenser. EP-A-0 3 66 354 beskriver et isolert og renset ekspandaseenzym fra S. clavuligerus som er karakterisert, inkludert med en terminal rest og aminosyresam-mensetning, og angis å ha en molekylvekt på ca. 34.600 dalton. Dette står imidlertid i motsetning til molekylvekten på 29.000 bestemt for det som synes å være det samme enzym i US 4 536 476. EP-A-0 233 715 beskriver isolering og endonuk-leaserestriksjonskartkarakterisering av ekspandaseenzymet erholdt fra S. clavuligerus, transformasjon og ekspresjon av enzymet i en vert, og demonstrerer ringutvidelse av penicillin N-substrat ved anvendelse av dette enzym. US 5 070 020 beskriver DNA-sekvensen som koder for ekspandaseenzymet erholdt fra S. clavuligerus, og beskriver transformasjonen av en P. chrysogenum-stamme med en ekspresjonsvektor inneholdende denne DNA-sekvens og derved oppnåelse av ekspresjon av ekspandaseenzymet . Selv om det antydes at dette enzym er anvendelig for utvidelse av substrater andre enn penicillin N, foreligger det ingen virkelig demonstrasjon av en slik utvidelse.

Det ovenfor beskrevne arbeid har fokusert på ekspandaseenzymet avledet fra prokaryotisk S. clavuligerus. Dette samme enzym, eller i det minste et enzym med tilsynelatende den samme ringutvidelsesaktivitet, uttrykkes også av stammer av eukaryotisk Cephalosporium acremonium (også referert til som Acremonium chrysogenum). I slike stammer uttrykkes imidlertid ekspandaseaktivitet av et bifunksjonelt gen ( cefEF) som også uttrykker DACS-(hydroksylase)-aktivitet hvis naturlige funksjon er å omdanne deacetoksycefalosporansyre-(DAOC)-produktet av ekspandaseenzymet til deacetylcefalosporin C (DAC). Resultatet er et enkelt, men bifunksjonelt, ekspandase/hydrok-sylaseenzym. Selv om det har vært forsøk på å atskille aktivi-tetene av disse to genprodukter, har hittil ingen vært vellykket. EP-A-0 281 391 beskriver for eksempel isolering og DNA-sekvensidentifikasjon av DAOCS/DACS-genet erholdt fra C. acremonium ATCC 11550, sammen med de tilsvarende aminosyresekvenser av enzymene. En Penicillium-stamme transformeres og uttrykker enzymene, imidlertid er den forsøkte omdannelse av penicillin G og V tilede tilsvarende cefalosporiner ikke demonstrert. Til tross for en antydning at genteknologiske teknikker tilveiebringer en tilgjengelig metode for å atskille den genetiske informasjon som koder for DAOCS fra DACS, og separat uttrykke disse, fremlegges ingen reell demonstrasjon av en slik atskillelse.

DAOCS/DACS-(ekspandase/hydroksylase)-enzymet fra

C. acremonium er også grundig undersøkt i teknikken, både med hensyn til dets aktivitet og dets karakteristika og genetiske sekvens. I Demain, US 4 178 210; 4 248 966 og 4 307 192, be-handles for eksempel forskjellige startmaterialer av penicillintypen med en cellefri ekstrakt av C. acremonium som epimer-iserer og utvider ringen for å gi et cefalosporin-antibiotika-produkt. Wu-Kuang Yeh, US 4 753 881, beskriver C. acremonium-enzymet uttrykt ved dets isoelektriske punkt, molekylvekter, aminosyrerester, forhold mellom hydroksylase- og ekspandaseak-tiviteter, og peptidfragmenter.

Den ovenfor beskrevne kjente teknikk handler kun om et enkelt aspekt ved foreliggende oppfinnelse, dvs. transformasjonen av en P. chrysogenum-stamme med genet som uttrykker ekspandaseenzymet, og oppnåelse av ekspresjon av dette enzym. Kjent teknikk beskriver imidlertid kun anvendelse av det ut-trykte enzym for å ringekspandere penicillin N og ikke penicilliner G og V. Selv i det henseende har penicillin N en sidekjede i 7-posisjonen som ikke kan spaltes enzymatisk for å gi 7-ADCA, som ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse grunner seg på det overraskende funn at en adipoylsidekjede kan tilføres effektivt ved hjelp av en P. chrysogenum-stamme, at ekspandaseenzymet uttrykt in situ, kan anvende denne forbindelse effektivt som et substrat for ringutvidelse til adipoyl-7-ADCA, og at adipoylsidekjeden deretter kan fjernes effektivt av et ytterligere enzym for å gi 7-ADCA. Selv om forskjellige isolerte fragmenter av foreliggende oppfinnelse kan finnes i den kjente teknikk, har det ikke vært noen antydning om at disse fragmenter kan kombineres for å gi de uventede resultater erholdt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Produksjon av 6-adipoylpenicillansyre er for eksempel kjent i teknikken; se Ballio, A. et al., Nature (1960), 185, 97-99. Den enzymatiske utvidelse av 6-adipoylpenicillansyre på en in vitro basis, er også kjent i teknikken. Se Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014; og EP-A-0 268 343. Enzymatisk spaltning av adipoylsidekjeder er også kjent i teknikken; se Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820.

Adipoylsidekjeden har den følgende struktur: COOH-(CH2)4-CO-, mens en sidekjede med nært beslektet struktur er glutarylsidekjeden med den følgende formel: COOH-(CH2)3-CO-. Den enzymatiske spaltning av glutarylsidekjeder er kjent i teknikken. Se f.eks. Shibuya et al., Agric Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567; Matsuda og Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; jap. 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.) og jap. 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.).

EPA-A-0 453 048 beskriver dessuten metoder for å for-bedre adipoylspaltningsaktiviteten av glutarylacylase produsert av Pseudomonas SY-77-1. Ved substitusjon av forskjellige aminosyrer i bestemte posisjoner med alfa-subenheten, ble det observert en tre til fem ganger høyere hastighet for adipoyl-spaltning (fra adipoylserin). Det bør bemerkes at selv om EP-A-0 453 048 tilsynelatende demonstrerer en acylase med forbedret aktivitet overfor adipoylsidekjeder, gir den ingen beskrivelse av måter (hverken kjemisk eller ved hjelp av en biologisk prosess som på noen måte er analog med prosessen beskrevet i foreliggende patentsøknad) ved hvilke et adipoyl-cefalosporin i utgangspunktet kan dannes.

Når en (D)-a-aminoadipoylsidekjede er til stede, er det kjent i teknikken først å fjerne aminogruppen enzymatisk og forkorte sidekjeden med en (D)-aminoacidooksidase, hvilket etterlater en glutaryl-(GL-7)-sidekjede, etterfulgt av fjerning av glutarylsidekjeden ved hjelp av et andre enzym (glutarylacylase) . En slik totrinns-spaltning er beskrevet i Matsuda, US 3 960 662; EP-A-0 275 901; jap. 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.) og Isogai et al., Bio/Technology (1991) 9, 188-191.

Det refereres til patentsøknad PCT/US92/08585, innlevert 8. oktober 1992, som beskriver en biologisk prosess for fremstilling av 7-ACA som grunner seg på ekspresjon av aktiviteten av ekspandaseenzymet i en P. chrysogenum-transformant på samme måte som den biologiske fremgangsmåte for fremstilling av 7-ADCA beskrevet heri. I 7-ACA-bioprosessen fordres imidlertid ytterligere transformasjoner for ekspresjonen av ytterligere enzymatiske aktiviteter, for å oppnå en fullstendig forskjellig rekombinant, metabolsk reaksjonsvei til et bestemt sluttprodukt, av hvilke ingen er antydet i foreliggende patentsøknad.

For å lette forståelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og læren ifølge den ovenfor beskrevne, kjente teknikk, er det umiddelbart nedenfor vist en oversikt over de forskjellige trinn i den metabolske reaksjonsvei som fører til penicillin G og cefalosporin C, mellom-produktene og enzymene som utfører de involverte transformasjoner.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en ny biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-amino-deacetoksycefalosporansyre (7-ADCA),

kjennetegnet ved trinnene:

a) opprettholdelse av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium som er i stand til å underholde dens vekst, hvoretter dyrkningsmediet tilsettes et adipat-råmateriale omfattende adipinsyre, eller ett eller flere av dets salter og estere som er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum, hvori stammen av Penicillium chrysogenum er transformert ved hjelp av DNA som koder for et enzym med ekspandase-aktivitet, der enzymet er i stand til å akseptere adipoyl-6-APA som et substrat, hvori adipoyl-6-APA produsert av denne stamme, deretter også, som et resultat av dens ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA; og b) adipoyl-7-ADCA fremstilt i a), bringes i kontakt med en adipoylacylase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og

produktet 7-ADCA dannes; og deretter

c) isoleres det produserte 7-ADCA.

De følgende betegnelser anvendt heri, betyr: "adipoyl-6-APA" betyr [2S-(2a,5a,60)]-3,3-dimetyl-7-okso-6-[(heksan-1,6-dioyl)amino]-4-tia-l-azabisyklo-[3.2.0]-heptan-2-karboksylsyre; og

"adipoyl-7-ADCA" betyr 7-[(heksan-1,6-dioyl)amino]-3-metyl-8-okso-5-tia-l-azabisyklo-(4.2.0)-okt-2-en-2-karboksyl-syre.

Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse en ny, biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA) angitt ovenfor, hvori adipat-råmaterialet er dinatriumadipat, hvori DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, stammer fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, deponert ved The American Type Culture Collection at Rockville, Maryland, USA, 19.mai 1971, og hvori adipoylacylasen stammer fra Pseudomonas-arter.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det primære aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en ny, biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA), et nøkkelmellomprodukt ved fremstilling av syntetiske, kommersielle cefalosporiner, som kan representeres ved den følgende strukturformel:

I tillegg til cefalosporinkjernen er de kjennetegnende trekk ved 7-ADCA 7-aminogruppen og 3-metylgruppen. 7-aminogruppen er en gruppe som kan omdannes til ethvert antall derivatside-kjeder og danner således basis for syntetisering av forskjellige kommersielle cefalosporiner. 3-metylgruppen må vanligvis, men ikke bestandig, som i tilfellet med cefaleksin, omdannes til en annen sidekjede for å syntetisere et kommersielt cefalosporin.

7-ADCA-produktet fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan stilles opp mot cefalosporin C, et annet cefalosporin-nøkkelmellomprodukt som kan representeres ved den følgende strukturformel:

I dette mellomprodukt kan 3-acetyloksymetylsidekjeden være akseptabel for kommersielle cefalosporiner. 7-(D)-a-aminoadi-poylsidekjeden er imidlertid ikke akseptabel for ytterligere syntetisk derivatisering og må spaltes for å gi den akseptable 7-aminogruppe. Beklageligvis har 7-(D)-a-aminoadipoylside-kjeden bestandig vist seg å være vanskelig å fjerne, både med kjemiske og biokjemiske midler.

Som anvendt i foreliggende patentbeskrivelse, og spesielt avsnittet med tittel Beskrivelse av foretrukne ut-førelsesformer, betyr de følgende betegnelser: 7-ADCA = 7-aminodeacetoksycefalosporansyre 6-APA = 6-aminopenicillansyre

DAOC = Deacetoksycefalosporansyre

DAOCS = DAOC-syntetase

DAC = Deacetylcefalosporin C

DACS = DAC-syntetase

IPNS = Isopenicillin N-syntetase

Tris = Tris[hydroksymetyl]aminometan

EDTA = Etylendiamintetraeddiksyre

DEPC = Dietylpyrokarbonat

TE = Tris/EDTA-buffer

SSC = Salt (natriumklorid), natriumsitratbuffer SDS = Natriumdodecylsulfat

PEG = Polyetylenglykol

Dyrking av Penicillium chrysogenum

Det første trinn ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter opprettholdelse av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium som er i stand til å underholde dens vekst, hvorpå dyrkningsmediet tilsettes et adipat-råmateriale omfattende adipinsyre, eller dens salter og estere. Adipat-råmaterialet kan tilsettes til dyrkningsmediet etter inokulering med Penicillium chrysogenum, men det er foretrukket at det allerede er til stede i dyrkningsmediet ved tidspunktet når inokulering finner sted. Adipinsyren eller dens salter og estere er slik at de er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av P. chrysogenum for å produsere adipoyl-6-APA; hvori stammen av Penicillium chrysogenum er transformert ved hjelp av DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå adipoyl-6-APA, som et resultat av dens ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA.

Andre arter av slekten Penicillium, foruten chrysogenum- artene, produserer isopenicillin N. Historisk sett har imidlertid stammene med høyest produksjon av isopenicillin N alle blitt utviklet ved hjelp av velkjente teknikker med stam-meforedling ut fra chrysogenum-artene. Foreliggende oppfinnelse er derfor av praktiske årsaker begrenset til stammer av Penicillium chrysogenum, selv om oppfinnelsens anvendelighet på andre arter er innlysende. Enhver deponert stamme av Penicillium chrysogenum, eller en annen ålment tilgjengelig kilde for en slik stamme, er et egnet startpunkt for utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Dyrkningsmediet som er i stand til å underholde veksten av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N, er av typen som en fagmann vil være fortrolig med. Dyrkningen vil for eksempel utføres ved hjelp av den aerobe nedsenkings-fermenteringsmetode, og det anvendte medium vil være utvalgt fra et antall egnede, tilgjengelige medier. Typiske medier anvender karbonkilder som sukrose, glukose og stivelse; nitrogenkilder som soyamel og maisgryn, bomullsfrø-olje, peanøttmel og forskjellige aminosyrer, blandinger derav og peptoner. Produksjonsbehov legger vekt på utbytte og enkel isolering, og foretrukne medier for slike situasjoner kan således være melasser som karbonkilde og soyamel og aminosyrer som nitrogenkilde.

Uorganiske næringssalter tilsettes vanligvis til dyrkningsmediet og inkluderer salter som er i stand til å til-føre de følgende ionebestanddeler: natrium, kalium, ammonium, kalsium, fosfat, sulfat, klorid, bromid, nitrat, karbonat, jern(III), jern(II), magnesium, mangan, etc. Sporelementer er også vanligvis essensielle for veksten, utviklingen og meta-bolismen av Penicillium chrysogenum, og kan tilsettes direkte til dyrkningsmediet dersom de ikke allerede er tilført som forurensninger, hovedsakelig av de andre dyrkningsmediumbe-standdeler.

Penicillium chrysogenum- stammene kan dyrkes i utstyr med lite volum, slik som 1-liters ristekolber, når det ønskes å produsere kun små mengder av 7-ADCA. Når større mengder- av adipoyl-7-ADCA er ønsket, anvendes imidlertid storskala-fer-menteringstanker under aerobe nedsenkings-fermenteringsbetin-geiser.

Ved utførelse av fremstilling av adipoyl-7-ADCA i stor skala opprettholdes sporer av Penicillium chrysogenum-stammen på en skråagar. Sporene fra skråagaren anvendes for å inokulere et vegetativt medium med lite volum. Det vegetative medium inkuberes for å produsere en tykk, frisk, aktivt vok-sende kultur av mikroorganismen. Denne vegetative vekstkultur anvendes deretter som inokulat for storskala-fermenteringsmediet. I visse tilfeller kan det være ønskelig å inkludere ytterligere et vegetativt medium som inokulat for fermenteringsmediet. Slike andre-trinns-vegetative medier anvendes vanligvis når volumet av fermenteringsmediet er betydelig større enn det første vegetative medium. På denne måte blir sporene av mikroorganismene først dyrket i et lite volum av vegetativt medium for å erholde et inokulat for et vegetativt medium med større volum. Det vegetative medium med større volum tilfører deretter tilstrekkelig konsentrasjon av mikroorganismen for å initiere en hurtig start av fermenteringen i storskala-fermen-teringstanken. Det vegetative medium kan ha den samme sammensetning som fermenteringsmediet, eller det kan inneholde ytterligere bestanddeler for å tilskynde veksten og utviklingen av mikroorganismen i liten skala.

Penicillium chrysogenum-stammene anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, dyrkes mest effektivt ved temperaturer mellom 20 og 30°C, men optimale utbytter vil oppnås når temperaturen er mellom 22 og 28°C, fortrinnsvis tilnærmet 25°C.

Maksimal produksjon av adipoyl-7-ADCA finner sted når Penicillium chrysogenum-stammen dyrkes i storskalatanker i en periode mellom 10 og 30 dager, fortrinnsvis 15 til 25 dager. Ved dyrkning i liten skala, slik som i 250 ml<1>s ristekolber, er imidlertid veksten av mikroorganismen hurtigere, og den produserer adipoyl-7-ADCA i løpet av kortere tid, f.eks. 4 til 15 dager, ofte 5 til 7 dager.

Dersom den endelige pH i storskala-fermenterings-tanker når 8,0 eller høyere, kan utbyttet av adipoyl-7-ADCA påvirkes ugunstig. I slike situasjoner er det ønskelig å overvåke pH i dyrkningsmediet gjennom fermenteringen. Dersom det fremgår at pH vil nå slike nivåer før tidspunktet for at maksimal produksjon av adipoyl-7-ADCA inntreffer, kan pH justeres nedover ved å tilsette en egnet syre eller en buffer til fermenteringsmediet.

Produksjonen av adipoyl-7-ADCA kan følges ved å teste prøver av fermenteringsløsningen kromatografisk.

Som ved de fleste aerobe nedsenkningsfermenteringer passeres steril luft gjennom dyrkningsmediet for å oppnå mer effektiv vekst av Penicillium chrysogenum-stammen og økt produksjon av adipoyl-7-ADCA. Volumet av luften som presses gjen-

nom dyrkningsmediet, er vanligvis minst ca. 0,2 volumer luft pr. minutt pr. volum dyrkningsmedium. En økt luftpasserings-hastighet kan imidlertid ofte ha en fordelaktig effekt på produksjonen av adipoyl-7-ADCA.

Penicillium chrysogenum-stammen vil i tillegg til adipoyl-7-ADCA typisk produsere mange biprodukter og metabolitter. Fordi noen av disse er syrelabile, er det ved gjenvinning av adipoyl-7-ADCA fra fermenteringsmediet ønskelig å behandle hele fermenteringsløsningen ved en sur pH i et kort tidsrom for å nedbryte noen av de samtidig produserte urenheter. Adipoyl-7-ADCA-fermenteringsproduktet gjenvinnes fra den således behandlede, filtrerte fermenteringsløsning og kan eventuelt atskilles fra de andre bestanddeler av fermenteringsmediet ved kromatografering gjennom en ionebytterharpiks,

og kan om nødvendig renses ytterligere før det etterfølgende trinn med enzymatisk spaltning av adipoylsidekjeden. Det er også mulig å utføre en slik ionebytterkromatografisk atskillelse etter at sidekjedespaltningen er utført. Et av de viktigste biprodukter som gir atskillelsesproblemer, er adipoyl-6-APA, og det er mulig å nedbryte dette biprodukt kjemisk eller enzymatisk for å gjøre atskillelsen lettere. Den filtrerte fermenteringsløsning underkastes først en preliminær rensningsprosedyre som kan inkludere en innledende ekstraksjon med et ikke-vannblandbart, organisk løsningsmiddel, slik som n-butanol eller amylacetat, for å fjerne urenheter. Den eks-traherte løsning kan deretter ytterligere renses på en preliminær måte ved kromatografering på aktivert karbon.

Tilsetning av adipat- råmateriale

Ved tidspunktet når fermenteringskulturen for Penicillium chrysogenum er etablert, som beskrevet ovenfor, dvs. før inokulering, tilsettes fortrinnsvis et adipat-råmateriale til de andre bestanddeler av fermenteringskulturmediet. Adipat -råmaterialet kan eventuelt tilsettes noen tid etter inokulering, f.eks. 1, 2 og/eller 3 dager etter inokulering. Adipat -råmaterialet er definert som adipinsyre, eller ett eller flere salter eller estere av adipinsyre som er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum som dyrkes for å produsere adipoyl-6-APA. Adipinsyre, salter og estere kan anvendes alene eller i enhver kombinasjon. Di-natriumsaltet er foretrukket, selv om kaliumsaltet og blandede salter med natrium også vil være egnet. Metylesteren kan anvendes, men etylesteren er vannuoppløselig. Adipinsyresaltet eller -esteren må være slik at det kan assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum for å danne adipoyl-6-APA. Selve adipinsyren kan f.eks. være egnet, selv om den er vannuoppløselig, dersom det under passende pH-betingelser dannes et assimilerbart salt.

Egnede ekspandaseenzymer

Stammen av Penicillium chrysogenum som er dyrket og tilført et adipoyl-råmateriale som beskrevet ovenfor slik at den produserer adipoyl-6-APA, er også en stamme som er blitt transformert ved hjelp av DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå adipoyl-6-APA, som et resultat av dets ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA.

Adipoyl-6-APA produseres intracellulært av Penicillium chrysogenum dyrket med adipat-råmaterialet. I dette intracellulære miljø, dvs. på en in situ-basis, uttrykker den transformerte Penicillium chrysogenum også DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå enzymet virker på adipoyl-6-APA som et substrat og ringekspanderer dette for å danne adipoyl-7-ADCA.

Den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer innen sin ramme transformasjonen av en Penicillium chrysogenum-stamme av typen beskrevet ovenfor med ethvert DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå adipoyl-6-APA, som et resultat av dets ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA. DNA som Penicillium chrysogenum transformeres med, må således uttrykke et enzym som ikke kun besitter den aktivitet av ekspandaseenzymet som fremgår fra teknikken, dvs. evnen til å ringekspandere isopenicillin N til DAOC, men også evnen til å ringekspandere adipoyl-6-APA til adipoyl-7-ADCA. Basert på side-kj edesamsvarighet anses det imidlertid at ethvert ekspandaseenzym vil være operabelt i den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det er allerede anført under avsnittet som beskriver kjent teknikk, at ekspandaseenzymet som stammer fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, er fullstendig sekvensert og karakterisert ved hjelp av endonuklease-restriksjonskartleg-ging. Det som kunne synes å være det samme enzym, avledet fra S. clavuligerus NRRL 3585, er imidlertid rapportert å ha en forskjellig molekylvekt, men det er ikke sekvensert.

Disse ekspandaseenzymer som allerede er identifisert i teknikken, er anvendelige ved den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre ekspandaseenzymer som ikke ennå er identifisert, avledet fra forskjellige stammer av S. clavuligerus, eller til og med fra mikroorganismer av forskjellige slekter, kan også vise seg å være egnede for utførelse av den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Prosedyrene for identifisering av slike nye stammer og slekter av anvendelige mikroorganismer, og for å isolere de antatte ekspandaseenzymer og etablere at de er egnede for anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er enkle og kan lett utføres av en dyktig fagmann. Screening av cellefrie ekstrakter fra mulige nye stammer og slekter av anvendelige mikroorganismer kan utføres på en pålitelig og reproduserbar måte ved å tilsette ekstraktene til adipoyl-6-APA-substratet i nærvær av kjente DAOCS-kofaktorer som inkluderer Fe<2+->ioner, askorbat, a-ketoglutarat og adeno-sintrifosfat (ATP). Adipoyl-6-APA-substratet kan fremstilles i tilstrekkelige mengder ved å tilføre et adipat-råmateriale til en utransformert Penicillium chrysogenum på en måte som er analog med den beskrevet i detalj i det etterfølgende. Det ønskede ekspandaseenzym er til stede dersom adipoyl-7-ADCA dannes, hvis tilstedeværelse kan påvises ved kromatografi.

Ved anvendelse av velkjente rekombinant-teknikker for å danne DNA-prober basert på ekspandasesekvensen for S. clavuligerus og C. acremonium, er det f.eks. også mulig å screene DNA-innholdet i en mulig mikroorganisme som sannsynligvis vil produsere en ekspandase egnet for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Potensielle kilder for ekspandaseenzymer

Ekspandaseenzymer, som allerede anført, er enzymer som katalyserer utvidelsen av penamringstrukturer (funnet i penicillin-type molekyler) til cef-3-em-ringer (som funnet i cefalosporinene). Enhver organisme som produserer metabolitter som inneholder en cefemring, er derfor en potensiell kilde for DNA som koder for en ekspandase. Eksempler på slike organismer er oppført nedenfor, men denne liste tjener kun som eksempel

og bør ikke betraktes som uttømmende:

Sopp

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis

Paecilomyces

Scopulariopsis

Diheterospora

Spiroidium

Anoxiopsis

Actinomycetes

Streptomyces clavuligerus

S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. filipinensis cephamycini

S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya

Nocardia lactamdurans

Andre bakterier

Flavobacteriuin sp.

Alcaligenes denitrificans

Mycoplana hullata

Providencia rettgeri

Lysobacter lactamgenus

Ekspandasene fra organismene oppført ovenfor, er kun kandidater for ytterligere undersøkelse, og det kan være at ikke alle disse vil være egnede ved den nye fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Anvendelse av de enzymer som besitter både ekspandase- og hydroksylaseaktiviteter, slik som enzymet fra C. acremonium, kan f.eks. føre til syntese av hydroksylert adipoyl-7-ADCA, dvs. DAC med en adipoylsidekjede.

Isolering av DNA- fragmenter som koder for ekspandaseaktivitet

Når tilstedeværelsen av et ønsket ekspandaseenzym er påvist på måten beskrevet ovenfor, er også prosedyrer for iso-■ lering av DNA som koder for ekspandaseenzymaktiviteten, enkle og velkjente i teknikken. Det er konstruert DNA-prober basert på kjente sekvenser og partielle sekvenser av genene som koder for ekspandaseenzymene, hvilke vil hybridisere til det ønskede enzym-kodende DNA som skal isoleres. Konstruksjonen av slike prober er basert på kunnskap om aminosyresekvensen og nukleo-tidbasesekvensen som koder for ekspandaseenzymet, så vel som kodonpreferansene for den spesielle mikroorganisme involvert. En detaljert beskrivelse av typiske prosedyrer av denne type anvendt på det genomiske DNA fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, er beskrevet nedenfor.

Isolering av DNA som koder for ekspandaseenzymaktiviteten, oppnås ved anvendelse av restriksjons- og ligeringspro-sedyrer velkjente i rekombinant DNA-teknologi. Det er nødven-dig å ha endonukleaserestriksjonskart av genomet fra den involverte mikroorganisme slik at det korrekte restriksjonsfrag-ment kan produseres og isoleres. Restriksjonskart for S. clavuligerus og C. acremonium er allerede tilgjengelige; for det førstnevnte anvendes således restriksjonsenzymene Barn HI og Sal I, og elektroforese tilveiebringer de ønskede fragmenter med størrelse 1,8 til 2,2 kb.

Transformasjon av stammen Penicillium chrysogenum

Når først DNA-fragmentene som koder for ekspandase-aktiviteten er erholdt, kan de innføyes (ligeres) i et plasmid eller en annen ekspresjonsvektor, sammen med DNA-fragmenter omfattende promotorer, translasjonsaktiveringssekvenser, res-istensmarkører, regulatoriske sekvenser, kosmiddannere og alle andre DNA-sekvenser som tillater eller fremmer transformasjon, styrer ekspresjon av genproduktet og letter isolasjon av transformantene. Den således konstruerte ekspresjonsvektor anvendes deretter for å oppnå transformasjon av Penicillium chrysogenum-stammen og intracellulær ekspresjon av aktiviteten av ekspandaseenzymet. De anvendte teknikker for å oppnå transformasjon og ekspresjon er velkjente i teknikken, og en detaljert beskrivelse av slike typiske prosedyrer er beskrevet i

det etterfølgende.

Som allerede beskrevet i detalj i det foregående, uttrykker den transformerte Penicillium chrysogenum-stamme aktiviteten av ekspandaseenzymet intracellulært, hvilket deretter virker in situ på adipoyl-6-APA-substratet for å ringekspandere det til adipoyl-7-ADCA.

Ny transformant

Den spesifikke Penicillium chrysogenum-transformant som uttrykker aktiviteten av ekspandasegenet som er en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, er ny i forhold til slike konstruksjoner i den kjente teknikk, slik som i Cantwell et al. (1990), Current Genetic, 17, 213-221. I begge konstruksjoner anvendes in vitro mutagenese for å for-binde promotoren med ekspandasegenet. I Cantwell-konstruksjonen innføres det ved manipulering et Ndel-sete ved ekspandasegenets ATG som ligeres til Xbal-setet ved 3'-enden av IPNS-promotoren ved hjelp av en Xbal/Ndel-linker. I konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse dannes et Ncol-sete ved ekspandasegenets ATG og ligeres til Ncol-setet ved 3<1->enden av IPNS-linkeren. Dette danner de følgende sekvenser rundt for-bindelsesstedene for promotorgenet i disse konstruksjoner:

Cantwell-konstruksjonen erstatter en C med en T, mens i konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse bibeholdes C; sekvensen av IPNS-promotoren i umiddelbar nærhet til ATG-startkodonet tilsvarer således nøyaktig sekvensen som finnes i det naturlig forekommende IPNS-gen. Det er mulig at promotoren ifølge kjent teknikk, selv om den kun atskiller seg med en enkelt nukleotidbase, kan føre til en lavere translasjons-effektivitet og følgelig til et lavere nivå for ekspandasegen-ekspresjon.

Andre forskjeller foreligger i områdene for promotoren eller genet inkludert i konstruksjonene. Cantwell-konstruksjonen inneholder 5'BamHI-XbaI 3<1->området av IPNS-promotoren, mens vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder 5' Ncol-Ncol 3<1->området av promotoren [Diez et al.,

(1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. Dette fører til ytterligere tilnærmet 250 bp på 5<1->enden av IPNS-promotoren i Cantwell-konstruksjonen. Dette området befinner seg imidlertid i den åpne avlesningsramme for ACV-syntetasegenet oppstrøms for IPNS-genet. Cantwell-konstruksjonen inneholder også Streptomyces-genet fra ATG til BaraHI-setet 3' fra genet, mens vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder ATG til Sail-setet 3' fra genet [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760]. Dette fører til ytterligere tilnærmet 1000 bp med 3'-endesekvens i Cantwell-konstruksjonen. Konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder likevel opp-strørosområdet av ekspandasegenet til BamHI-setet 5' fra ATG; dette atskilles imidlertid fra avlesningsrammen for ekspandasegenet av IPNS-promotoren. En annen forskjell mellom konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse og konstruksjonen beskrevet i den kjente teknikk, angår den velgbare markør som anvendes. Anvendelse av en Penicillium IPNS-promotor: fleomycingenfusjon i konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse har en tendens til å velge integrasjon av mange kopier, eller integrasjon ved steder som tillater ekspresjon på høyt nivå, og kan således potensielt gi en høyere prosentdel av transformanter som uttrykker ekspandasegenet på høyt nivå. En ny transformant av typen beskrevet ovenfor, er en Penicillium chrysogenum identifisert som PC100. Dens takson-omiske kjennetegn inkluderer typisk produksjon av vidtspred-ende kolonier, blågrønne til grønne av farge, glatt fløyelsak-tige med gule dråper; gul bakside som sprer seg inn i agaren, forgrenede sporehoder hvor alle deler er glatte; elliptiske til kuleformede sporer med lengde 3-4 mm. Akseptable dyrkningsbetingelser for P. chrysogenum benytter et fast medium omfattende laktose, monohydrert 1,5% (vekt/volum); maisstøpe-væske, 0,5% (volum/volum); pepton, 0,5% (vekt/volum); NaCl, 0,4% (vekt/volum); MgS04-7HaO, 0,05% (vekt/vol um) ; KHzP04, 0,06% (vekt/volum) ; FeCl3-6H20, 0,0005% (vekt/volum); CuS04-5H20, 0,0002% (vekt/volum); agar, 3,0% (vekt/volum); i én liter destillert vann, pH 4,8. Den ovenfor beskrevne P. chrysogenum betegnet PC100, er deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, under aksesjonsnr. ATCC 74182 (deponerings-dato: mottatt 21. august 1992 og levedyktighet bekreftet 27. august 1992).

Spaltning av adipoylsidekjeden

Det neste trinn'i den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse er spaltning av adipoyl-sidekjeden fra adipoyl-7-ADCA, hvilket fordrer behandling av produktet fra det foregående trinn med et adipoylacylaseenzymsys-tem. Som allerede anført ovenfor, er et av de viktigste resultater oppnådd ved foreliggende oppfinnelse, evnen til å utføre alle trinnene som fører til dannelse av adipoyl-7-ADCA i en enkelt fermenteringskultur. Dette tilveiebringer usedvanlig forbedret effektivitet ved at mellomprodukter fra trinn til trinn i prosessen ikke må isoleres og delvis renses. I dette siste trinn er imidlertid adipoylacylaseenzymsystemet ikke tilstedeværende, dvs. at det ikke er dannet in situ i den opprinnelige fermenteringskultur.

Dersom den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse utføres på en satsvis måte, vil det være nødvendig å isolere og delvis rense produktet fra det første trinn, og preliminære prosedyrer for å utføre dette er allerede beskrevet ovenfor.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan likevel utføres på enhver måte som effektivt bringer adipoylacylasen i kontakt med adipoyl-7-ADCA, slik at enzymatisk omdannelse av denne forbindelse til 7-ADCA kan finne sted. Dette er definisjonen på betegnelsen "bringes i kontakt med" i sin bredeste sammenheng. Det er mulig å anvende en cellefri nær-ingsløsning av urenset adipoyl-7-ADCA som tilførselsstrømmen, og behandle denne på en satsvis måte med urenset adipoylacyl-aseløsning. Denne fremgangsmåte gir noe nyttevirkning fordi den ikke fordrer noen vesentlig rensing av reaktantene på for-hånd. Modifikasjoner er selvsagt mulige. Reaktantene kan f.eks. renses i enhver ønsket grad før de bringes i kontakt med hverandre. Det vil også være mulig å utføre fremgangsmåten på en kontinuerlig måte i stedet for en satsvis måte. Måten selve reaktantene bringes i kontakt med hverandre på, kan modifiseres på forskjellige måter i overensstemmelse med prosessteknologiske fremskritt. Et immobilisert enzym kan således anvendes, f.eks. i form av en kolonne inneholdende adipoylacylasen og hvor adipoyl-7-ADCA passeres gjennom kolonnen. Det immobiliserte enzym kan også tilsettes til adipoyl-7-ADCA-oppløsningen som en suspensjon. Slike immobiliserte enzymsys-temer gir fordelene med lett gjenvinning av enzym og mange gangers gjenbruk. Et annet eksempel på en slik prosesstekno-logi er den som angår membranreaktorer. Den foretrukne metode for å bringe reaktantene i kontakt med hverandre, er ved hjelp av den immobiliserte enzymkolonne.

Adipoylacylaseenzymer anvendelige i spaltningstrinnet

Det foreligger et stort antall enzymer med kjent

spesifisitet overfor adipoylsidekjeder. Resultater erholdt med en adipoylacylase, kommersielt tilgjengelig fra RAEV Corp., er beskrevet i detalj i de etterfølgende arbeidseksempler. Det er rapportert syv andre enzymer i litteraturen som fjerner adipoylsidekjeder fra molekyler av cefalosporintypen. Seks av disse syv enzymer er fra Pseudomonas-arter, og det syvende er fra en Bacillus-art. Noen likheter foreligger mellom visse av Ps eudomonas-enzymene, men alle syv atskiller seg i noen grad i sine fysiske/biologiske egenskaper. Noen av deres karakteristika er oppsummert nedenfor:

Alle de ovenfor angitte adipoylacylaseenzymer er anvendelige ved den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre adipoylacylaser anvendelige ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan lett påvises ved å teste det aktuelle enzym mot adipoyl-7-ADCA, det aktuelle substrat som enzymet må virke på. Et positivt resultat gir en pålitelig og reproduserbar metode for å bestemme at et aktuelt enzym virkelig er anvendelig ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Substratet kan fremstilles på en enkel måte fra reaksjonen av adipinsyreanhydrid med 7-ADCA ved anvendelse av en modifikasjon av prosedyren rapportert av Szewczuk og Wellman-Bednawska i Clin. Chim. Acta (1978) 84, 19-16. Adipinsyreanhydrid kan fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Albertson og Lundmark beskrevet i J. Macromol. Sei. Chem. (1990) A27, 397-412. 7-ADCA er tilgjengelig fra flere kommersielle kilder, inkludert E. R. Squibb & Sons, Ltd., NJ, og Interchetn Corp.,

NJ.

Dersom det er ønskelig å utføre en grov screening av aktuelle enzymer ved anvendelse av en hurtig kolorimetrisk metode, kan adipoyl-7-ADCA-substratet erstattes med et kolorimetrisk substrat, slik som adipoyl-PABA (para-aminobenzosyre) eller adipoyl-PNA (para-nitroanilin). Spaltning av sidekjeden gir en fargefrembringende art hvis tilstedeværelse og konsentrasjon lett bestemmes ved anvendelse av et kolorimeter. For mer detaljert informasjon angående disse og andre egnede kolorimetriske metoder, se Marelli, L.P. (1968), J. Pharm. Sei. 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969), Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, A. et al. (1980), Anal. Biochem. 103: 166-169 og Reyes, F. et al. (1989), J. Pharma. Pharmacol. 41: 136-137.

Det ble utført en sammenligning mellom de N-terminale aminosyresekvenser av RAEV-enzymet og de store subenheter av acyll og GK16-enzymene oppført i tabellen ovenfor. Resultatene fra sammenligningen er vist nedenfor (hvor parenteser indi-kerer usikre bestemmelser):

Fra de viste sekvenser fremgår det at alle tre av disse peptider er beslektet. Et protein med en N-terminal sekvens lignende de vist ovenfor, vil imidlertid ikke nødvendig-vis besitte adipoylacylaseaktivitet, noe som er tilfelle med penicillin G-acylase produsert av en stamme av Ærtiirabacter. På den annen side foreligger det adipoylacylaser anvendelige ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke oppviser signifikant homologi med den ovenfor angitte N-terminale sekvens. Asahi-enzymet acyl og Fujisawa B. laterosporus Jl-acylasen oppført i tabellen ovenfor, som er vist å ha noe adipoyl-7-ADCA-acylaseaktivitet, deler f.eks. ingen sekvens-homologi med de andre enzymer anført ovenfor. Rammen for foreliggende oppfinnelse, med hensyn til adipoylacylaser anvendelige i det andre trinn av den nye biologiske fremgangsmåte, bestemmes således av hvorvidt et aktuelt enzym er i stand til å spalte adipoylsidekjeden fra adipoyl-7-ADCA eller ikke, et spørsmål som kan løses lett og pålitelig som beskrevet i detalj ovenfor.

Andre metoder for å finne egnede adipoylacylaser er mulige. EPA-A-0 453 048 beskriver f.eks. metoder for å for-bedre adipoyl-spaltningsaktiviteten av glutarylacylasen produsert av Pseudomonas SY-77-1. Ved å bytte ut forskjellige aminosyrer ved bestemte steder innen alfa-subenheten, ble det observert en tre til fem ganger høyere adipoylspaltningshas-tighet (fra adipoyl-serin). Slike forbedrede enzymer vil også være egnede for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Det bør bemerkes at selv om EP-A-0 453 048 tilsynelatende demonstrerer en acylase med forbedret aktivitet overfor adipoylsidekjeder, gir den ingen beskrivelse av noen måter (hverken kjemiske eller gjennom en biologisk prosess på noen måte analog med den beskrevne i foreliggende patentsøknad) hvori et cefalosporin i utgangspunktet kan dannes.

Eksempel 1

Dyrkningsbetingelser for Penicillium chrysogenum

Den anvendte Penicillium chrysogenum-stamme i disse prosedyrer ble opprettholdt på plater inneholdende LCSB-medium sammensatt av laktose, monohydrert, 1,5% (vekt/volum); mais-støpevæske, 0,5% (volum/volum); pepton, 0,5% (vekt/volum); NaCl, 0,4% (vekt/volum); MgS04-7H20, 0,05% (vekt/volum); KH2P04, 0,06% (vekt/volum) ; FeCl3-6H20, 0,0005% (vekt/volum); CuS04-5H20, 0,0002% (vekt/volum); agar, 3,0% (vekt/volum); i 1 liter destillert vann, pH 4,8. Etter 12 dager ved 25°C og 65% relativ fuktighet ble enkle kolonier fjernet og tilsatt til 2 ral sterilisert vann i et rør med skrukork inneholdende glasskuler. Etter utbløtning av kulturen ved hvirvling ble suspensjonen anvendt for å inokulere riskolber. Riskolbene inneholdt 25 g/250 ml kolbe Uncle Ben's konverterte ris, naturlig lang-kornet, som var vasket med 3 til 4 volumer destillert vann i 7 minutter, blandet hvert 30. sekund, og deretter drenert inntil vannopptaket i risen var ca. 25%. Etter 12 dager ved 25°C og 65% fuktighet ble sporene vasket bort fra risen med 50 ml sterilt vann. Sporesuspensjonen ble anvendt for å inokulere flytende kulturer og også for å tilveiebringe lyofiler av kulturene for lagring ved 4°C. Sporene ble tilsatt til et like stort volum 5% skummet melk og lyofilisert i sterile ampuller.

En totrinns-fermentering av stammen i ristekolber ble anvendt for produksjon av penicilliner, eller for produksjon av mycel som en kilde for RNA eller DNA. Frøstadiet ble initiert ved tilsetning av 1 x 10B sporer til 50 ml/500 ml kolbe med medium sammensatt av glukose, 3,0% (vekt/volum); farmamedia, 1,0% (vekt/volum); maisstøpevæske, 3,0% (volum/volum); ammoniumsulfat, 0,2% (vekt/volum); CaC03# 0,5% (vekt/volum); vannfritt monokaliumfosfat, 0,05% (vekt/volum); laktose, 1,0%

(vekt/volum); primær tørrgjær, 1,0% (vekt/volum) i 1 liter destillert vann. Inkubasjon ble utført ved 25°C og 65% relativ fuktighet på et rotasjonsristeapparat med en amplitude med diameter 70 mm ved 220 rpm. Etter 48 timers inkubasjon ble produksjonstrinnet initiert ved å overføre 2 ml vegetativt frø til 35 ml/500 ml kolbe med medium med følgende sammensetning: KH2P04, 0,05% (vekt/volum); K2S04, 0,5% (vekt/volum) ; (NH4)2S04, 1,0% (vekt/volum); laktose, 12,0% {vekt/volum); farmamedia, 2,75% (vekt/volum); CaC03 (utfelt), 1,0% (vekt/volum); spekk-olje, 1,0% (volum/volum) i 1 liter destillert vann, pH 6,6. Etter autoklavering, men før inokulering, ble sterilt 25% natriumadipat (pH 6,6) tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon av natriumadipat på 2,5%. Inkubasjon, etter inokulering, ble deretter fortsatt under de samme betingelser som for frø-stadiet i 5 til 7 dager.

Når det var behov for mycel for å danne protoplaster for transformasjon, eller som en kilde for DNA, ble stammen dyrket i 50 ml/250 ml kolbe med komplett medium (CM) sammensatt av: 50 ml 20X Clutterbucks salter (120 g Na2N03, 10,4 g KC1, 10,4 g MgS04-7H20, 30,4 g KH2P04) , 2,0 ml Vogels sporelementer (0,3 M sitronsyre, 0,2 M ZnS04, 25 mM Fe (NH4) 2 (S04) 3-6H20, 10 mM CuS04, 3 mM MnS04, 8 mM borsyre, 2 mM Na2Mo04-2HaO) , 5 g trypton, 5 g gjaerekstrakt, 10 g glukose, i 1 liter destillert vann. Inkubasjonen foregikk ved 25°C på et rota-sjonsriste-apparat ved 220 rpm.

Eksempel 2

Isolering av genom- DNA og totalt RNA fra Penicillium

Det vegetative mycel fra en 48-timers kultur fremstilt som beskrevet ovenfor, ble innsamlet ved filtrering gjennom osteklede, nedfrosset i flytende nitrogen og lyofilisert over natten. Det tørkede mycel ble malt med sand ved hjelp av en morter og pistill og resuspendert i 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0 og 4% SDS. Etter oppvarming av suspensjonen til 50-55°C i et vannbad ved 60°C ble blandingen først ekstrahert med 1 M Tris (pH 8), mettet fenol, etterfulgt av Tris-mettet fenol:kloroform (1:1, volum:volum) og deretter kloroform. RNA ble utfelt fra den vandige fase ved tilsetning av et like stort volum kald 6 M LiCl, og deretter ble blandingen oppbevart ved -20°C i 2 til 3 timer. Etter sentrifugering ved 12.000xg i 20 minutter ved 4°C ble supernatanten tilsatt etanol til en konsentrasjon på 66% (volum/volum) og avkjølt til -20°C i 15 minutter for å utfelle DNA. Etter sentrifugering som beskrevet ovenfor, ble DNA-pelleten vasket med 70% etanol, tørket og resuspendert i TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA). DNA-konsentrasjonen ble beregnet ved sammenligning med kjente DNA-standarder etter farging med etidium-bromid i agarosegelelektroforese.

Kulturer av Penicillium chrysogenum,, som beskrevet

ovenfor i eksempel 1, ble dyrket i 96 timer i 35 ml fermenter-ingsmedium (fermenteringsbetingelser som tidligere beskrevet), ved 25°C på et rotasjonsristeapparat ved 220 rpm. Mycel ble innsamlet ved filtrering gjennom et Whatman nr. 1 filter under vakuum og vasket med ca. 50 ml vann. Myceliet ble umiddelbart

skrapt bort fra filteret, resuspendert i 5 ml "avbrytnings-buffer" (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 5% SDS), nedfrosset i flytende nitrogen og lyofilisert. Etter lyofilisering over natten ble det tilsatt 5 ml vann inneholdende 0,1% DEPC og 5 ml 1 M Tris (pH 8) mettet fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:50:1), og blandingen ble hensatt for tining ved 37°C i 20 minutter under omrøring. Blandingen ble sentrifugert ved 12.000xg i 10 minutter ved 4°C, og det vandige lag ble fjernet og først reekstrahert med IM Tris (pH 8) mettet fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:50:1), og deretter med 1 M Tris (pH 8) mettet fenol, og til slutt med kloroform. Et like stort volum 6 M LiCl ble kom-binert med det siste vandige lag, og oppløsningen ble hensatt ved -20°C i minst 4 timer. Det totale RNA ble pelletert ved 12.000xg i 20 minutter ved 4°C, pelleten ble oppløst i 0,3 ml TE-buffer pluss 0,03 ml 3 M natriumacetat, og 2,5 volumer etanol ble tilsatt for å gjenutfelle RNA. Den endelige pellet ble oppløst i 0,1 ml TE-buffer, og RNA-konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av absorpsjon ved 260 nm.

Eksempel 3

Dyrkningsbetingelser for Streptomyces clavuligerus

Streptomyces clavuligerus-stammen anvendt i disse prosedyrer, var ATCC 27064. Stammen ble opprettholdt på plater bestående av: gjærekstrakt, 4 g; maltekstrakt, 10 g; glukose, 4 g; agar, 20 g; i 1 liter destillert vann, pH 7,2. Etter 5 dagers dyrkning ved 30°C ble 2 ml sterilt vann tilsatt til platene, og kulturen ble skrapt bort fra agaroverflaten. Den resulterende suspensjon ble overført til et sterilt rør med skrukork inneholdende glasskuler. Etter utbløting av kulturen ved hvirvling ble suspensjonen anvendt for å inokulere flytende kulturer. Suspensjonen ble også anvendt for permanent lagring av kulturer ved -70°C ved tilsetning av glyserol til et sluttvolum på 15%.

Når det var behov for mycel for å danne protoplaster for transformasjon eller som en kilde for DNA, ble stammene dyrket i 200 ml/l liter kolbe YEME-medium sammensatt av: gjærekstrakt, 3 g; pepton, 5 g; maltekstrakt, 3 g; glukose, 10 g; sukrose, 340 g; MgCl2-6H20, 1,02 g; glysin, 5 g; agar, 18 g; i 1 liter destillert vann. Inkubasjon ble utført ved 28°C på et rotasjonsristeapparat ved 220 rpm.

Eksempel 4

Isolering av genom- DNA fra Streptomyces

Det vegetative dyrkningsprodukt fra en 48-timers kultur, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble innsamlet ved sentrifugering ved 22.100xg i 10 minutter. Cellene ble resuspendert i 10 ml TE-buffer, 10 mg lysozym ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 3 0°C i 15 minutter. 1 ml 20% SDS ble deretter tilsatt, umiddelbart etterfulgt av'10 ml TE (pH 8) mettet fenol og 1,5 ml 5 M NaCl, og blandingen ble forsiktig invertert i 2 0 minutter. Fasene ble atskilt ved 12.000xg i 10 minutter, hvoretter det vandige lag ble fjernet og overført til et nytt rør. Et like stort volum kloroform ble tilsatt, og blandingen ble forsiktig invertert i 10 minutter. Fasene ble på nytt atskilt ved sentrifugering ved 12.000xg i 10 minutter, og det vandige lag ble fjernet og på nytt overført til et nytt rør. 2 volumer isopropanol ble forsiktig tilsatt, og det ut-felte DNA ble oppspolet og på nytt oppløst i et minimalt volum TE-buffer. RNAse A ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 20 mg/ml, og oppløsningen ble inkubert ved 50°C i 1 time. Prote-ase K ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på

100 mg/ml, sammen med 100 mM NaCl og 0,4% SDS, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time. Oppløsningen ble ekstrahert på nytt med et like stort volum TE (pH 8) mettet fenol, etterfulgt av en ny ekstrahering med kloroform. DNA fra den siste ekstrahering ble oppspolet etter tilsetning av 2 volumer isopropanol, og konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av en absorpsjonsavlesning ved 2 60 nm.

Eksempel 5

Konstruksjon av et genbibliotek og isolering av et DNA- fragment inneholdende Streptomyces clavuligerus- ekspandasegenet

Genom-DNA fra Streptomyces clavuligerus erholdt fra den tidligere beskrevne prosedyre, ble oppsluttet med restriksjonsenzymene Barn HI og Sal I. Det oppsluttede DNA ble under-kastet elektroforese på en 0,8% agarosegel, og fragmenter med størrelse 1,8 til 2,2 kb ble eluert og ligert med pUC18-DNA som tidligere var oppsluttet med Barn HI og Sal I. Fortynninger av ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetente JM109-celler ved anvendelse av elektroporering ("Gene Pulser", Bio-Rad, Richmond, CA). Fremstilling av de kompetente celler og elektroporeringsbetingelser var begge i overensstemmelse med produsentens anvisninger. Transformeringsblandingen ble utspredt på LB-plater inneholdende 100 mg/ml ampicillin, og 75 ml 2% X-Gal. Etter inkubasjon over natten ved 37°C ble rekombinante kolonier identifisert ved hjelp av deres farge-løse utseende på grunn av inaktivering av plasmidvektorens beta-galaktosidasegenaktivitet. De fargeløse kolonier ble ut-plukket og overført til en ny LB-plate inneholdende 100 mg/ml ampicillin. Etter dyrkning over natten ved 37°C ble koloniene overført til nitrocellulose og hybridisert med en probe fremstilt ved hjelp av en polymerasekjedereaksjon som tilsvarte den publiserte Streptomyces clavuligrerus-ekspandasegensekvens fra baser 52-918 [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol. 171: 754-760 og US 5 070 020]. Merking av polymerasekjedereaksjons-produktet ble oppnådd ved vilkårlig primerutvidelsesreaksjon med (<32>P) dCTP og et oligomerkingssett, etter produsentens instruksjoner. Hybridiseringsreaksjonen ble utført i nærvær av 10<6> cpm radiomerket probe, 30% formamid, 5X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat, pH 7), 0,1% SDS, 5X Denhardts (5 g ficoll, 5 g polyvinylpyrrolidon og 5 g BSA for 500 ml 50X stamløsning) og 100 mg/ml kalvethymus-DNA, ved 37°C over natten. Flere transformanter hybridiserte sterkt med proben. En koloni ble ved hjelp av restriksjonsenzymanalyse bekreftet å inneholde en vektor som bærer ekspandasegenet, og dette plasmid ble betegnet pFTSO-1.

Eksempel 6

Isolering av plasmid- DNA

E. coli-kulturer inneholdende plasmidet, ble dyrket i 500 ml LB-næringsløsning (20 g/l LB-stamløsning, Gibco, Paisley, Skottland), med 15 mg/ml tetrasyklin på et rotasjonsristeapparat ved 220 rpm i 12-16 timer ved 37°C. Cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 4.000xg i 10 minutter ved 4°C. Cellepelleten ble resuspendert i 18 ml glukosebuffer (50 mM glukose, 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA), og 2 ml 40 mg/ml lysozym (Sigma, St. Louis, MO) i glukosebuffer ble tilsatt, blandet, og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. 40 ml av en nypreparert oppløsning av 0,2 N NaOH og 1% SDS ble tilsatt, og blandingen ble forsiktig hvirvlet og plassert på is i 10 minutter. 30 ml 5 M kaliumacetat, pH 4,8, ble deretter tilsatt, blandet godt, og den dannede blanding ble plassert på is i ytterligere 10 minutter. Det nedbrutte cellemateriale ble pelletert ved sentrifugering ved 4.000xg i 10 minutter ved 4°C, og supernatanten ble filtrert gjennom et osteklede. Isopropanol (0,6 volumer) ble tilsatt til den klar-ede supernatant for å utfelle plasmid-DNA, og bunnfallet ble dannet under inkubasjon ved romtemperatur i 20 minutter. Plasmid-DNA ble pelletert ved 4.000xg i 20 minutter ved 4°C og deretter vasket med 70% etanol og tørket i kort tid. Pelleten ble resuspendert i 9 ml TE-buffer, og deretter ble det tilsatt 10 g CsCl og 0,387 ml av en 10 mg/ml etidiumbromidoppløsning. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 313.100xg i 24 timer. Det resulterende plasmidbånd i cesiumkloridgradienten ble vis-ualisert med ultrafiolett lys, isolert, og deretter ble etidi-umbromidet fjernet ved ekstrahering med vannmettet butanol. CsCl i plasmidpreparatet ble deretter fjernet ved dialyse mot TE-buffer, og til slutt ble DNA konsentrert ved anvendelse av PEG (molekylvekt 8.000). Konsentrasjonen av DNA ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av en absorpsjonsavlesning ved 260 nm.

Eksempel 7

Konstruksjon av Penicillium - transformasjonsvektoren pPenFTSO

En Penicillium-transformasjonsvektor ble konstruert med et fleomycinresistent gen som en dominerende, velgbar mar-kør. Dette ble oppnådd ved først å isolere et 660 bp fragment inneholdende fleomycinresistensgenet (et fleomycinbindingspro-teingen fra Streptoalloteichus hindustanus) og også koblet til en gjær-cytokrom Cl-terminator fra en Barn HI/Bgl II-oppslutning av plasmid pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Frankrike) ved elektroforese av et eluat fra agarosegeler. Det isolerte fragment ble ligert i Barn HI-setet av vektor pSELECT<*> 1 (Promega Corporation), og orienteringen av genet ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble et 550 bp Pst I-fragment inneholdende lambda cos-setet, innføyet, hvilket muliggjør at vektoren kan anvendes for kosmiddannelse når innføyelser med passende størrelse inkluderes. Deretter ble et 1,5 kb Nco I/Barn HI-fragment, inneholdende promotorområdet av Penicillium chrysogenum-isopenicillin N-syntetase-(IPNS)-genet, isolert

(ved elektroforese på og eluering fra agarosegeler) fra en Nco I/Barn HI-oppslutning av en genom-klon inneholdende IPNS-genet. Det isolerte IPNS-promotorfragment ble ligert i den Barn HI/Nco I-oppsluttede vektor. Nco I-setet befinner seg ved ATG-startkodonet av fleomycinresistensgenet. Denne vektor er betegnet pUTZ-2.

1,645 kb-fragmentet inneholdende Streptomyces clavuligrerus-ekspandasegenet, ble renset fra en Barn HI- og Sal I-oppslutning av pFTSO-1 (tidligere beskrevet vektor) ved elektroforese på og eluering fra en 0,8% agarosegel. Det isolerte fragment ble ligert i vektor pSELECT (Promega Corporation) som også var oppsluttet med Barn HI og Sal I. Denne vektor ble betegnet pFTSO-8. Et nytt Nco I-sete ble dannet ved ATG-startkodonet av ekspandasegenet ved setestyrt mutagenese av pFTSO-8 ved anvendelse av Altered Sites<*> in vitro-mutagenesesystemet (Promega Corporation). Mutagenese ble utført etter produsentens instruksjoner. Et oligonukleotid ble konstruert for å komplementere kodingssekvensen av DNA-området ved ATG-startkodonet fra den publiserte sekvens for Streptomyces-ekspandasegenet (Kovacevic et al. (1990), Journal of Bacteriology, 171, s. 3952-3958). Oligonukleotidet ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotidsekvensen var som følger:

Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble et 1,2 kb Nco I-fragment, inneholdende promotorområdet av Penicillium chrysogenum-isopenicillin N-syntetasegenet, isolert (ved elektroforese på og eluering fra agarosegeler) fra en Nco I-oppslutning av en genomklon inneholdende IPNS-genet. IPNS-promotorområdet ble ligert i pFTSO-8-vektoren ved det nye Nco I-setet dannet ved hjelp av mutagenesen ved ATG-startkodonet av ekspandasegenet. Orientering av promotoren til ekspandasegenet ble fastslått ved restriksjonsenzymanalyse. Denne IPNS-promotor:ekspandasegenkassett ble deretter flyttet som et Barn HI/Sal I-fragment inn i den Barn HI/Sal I-spaltede Penicillium-transformasjonsvektor pUTZ-2 beskrevet ovenfor. Den ferdige konstruksjon ble betegnet pPenFTSO.

Eksempel 8

Kloning av Penicillium- p- tubulinpromotoren

Penicillium-p-tubulingenet ble klonet fra et Penicillium-lambda-genombibliotek ved anvendelse av Aspergillus niger-$-tubulingenet som en hybridiseringsprobe. Sekvensering av denne klon og sammenligning med den kjente aminosyresekvens av p-tubulingenet fra Aspergillus niger identifiserte et område med 91% homologi med start med ATG-initieringskodonet. Sekvenser som omfatter en funksjonell promotor, ble isolert mellom initieringskodonet og et Barn HI-sete 1,4 kb oppstrøms.

Konstruksjon av transformasjonsvektoren som bærer Penicillium -

{3-t ubu 1 i np r omo toren

Et 2,0 kb Xba I/Hind III-fragment inneholdende Penicillium-p-tubulinpromotoren, ble ligert i vektoren pSELECT (Promega Corporation) som også var oppsluttet med Xbal/Hind III. Et nytt Nco I-sete ble dannet ved ATG-startkodonet ved hjelp av setestyrt mutagenese ved anvendelse av Altered Sites in vivo-mutagenesesysternet (Promega Corporation). Mutagenese ble utført etter produsentens instruksjoner. Det ble konstruert et oligonukleotid komplementært med ATG-startseteområdet, men som inkorporerte flere endringer for å danne et Nco I-sete, og dette ble anvendt for mutagenese. Oligonukleotidet ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotidsekvensen var som følger:

Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble et 1,4 kb Barn HI/Nco I-fragment inneholdende Penicillium-p -tubulinpromotoren, ligert med et konstruert Nco I-sete ved ATG i Streptomyces-ekspandasegenet i den Barn HI/Nco I-oppsluttede vektor pFTSO-8 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 7). Denne vektor ble betegnet btFTSO-8. 1,4 kb Barn HI/Nco I-fragmentet inneholdende £J-tubulinpromotoren, ble også ligert i en Barn HI/Nco I-oppsluttet vektor pUTZ-2 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 7). Denne ligering posisjonerte p-tubulinpromotoren direkte foran fleomycinresistensgenet. Denne vektor ble betegnet pCI-6. Et 2,4 kb Barn HI/Hind III-fragment fra vektor btFTSO-8 som inneholdt p-tubulinpromotor-ekspandasegenkassetten, ble deretter ligert med en Barn Hl/Hind III-oppsluttet vektor pCI-6 for å gi den endelige Penicillium-transformasjonsvektor hvori Streptomyces-ekspandasegenet og fleomycin-resistensmarkøren ble uttrykt fra p-tubulinpromotoren. Denne vektor ble betegnet pTS-2.

Eksempel 9

Kloning av Penicillium -( GAP)- promotoren

Penicillium-glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase-(GAP)-genet ble klonet fra et Penicillium-lambda genom-bibliotek ved anvendelse av GAP-genet fra Aspergillus niger som en hybridiseringsprobe. Fire potensielt positive prøver ble ytterligere probet med et PCR-produkt dannet fra primere for 5'-området av Cephalosporium-GAP-genet (Kimura, H. et al.,

(1991), J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-150). De anvendte oligo-nukleotider for primerne av polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotid-sekvensene er som følger: En av de fire antatt positive prøver krysshybridiserte med PCR-produktet. Et 4 kb Bam HI-fragment fra denne genomklon ble ligert i Bam HI-oppsluttet vektor pSELECT (Promega Corporation) for sekvensering. Denne vektor ble betegnet pTS-O. Sekvensering av dette fragment identifiserte ATG-initieringskodonet ved sammenligning med den kjente sekvens av cefalosporin-GAP-genet.

Konstruksjon av transformasjonsvektoren som bærer Penicillium - GAP- promotoren

For å konstruere Penicillium-GAP-promotoren med Streptomyces-ekspandasegenet ble et nytt Nco I-sete dannet ved ATG i Penicillium-GAP-genet ved hjelp av in vitro setestyrt mutagenese ved anvendelse av vektor pTS-O. Mutagenese ble ut-ført etter produsentens instruksjoner. Det ble konstruert et oligonukleotid komplementært med kodingssekvensen av DNA-området ved GAP-genets ATG-startkodon, men baseendringer ble inkorporert for å danne et Nco I-sete. Oligonukleotidet ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotidsekvensen var som følger:

Mutagenese ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Et

1,9 kb Ncol/Bam HI-fragment fra pTS-O som inneholdt GAP-promotoren, ble deretter ligert med Ncol/Bam HI-oppsluttet vektor pFTSO-8 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 7) for å posisjonere GAP-promotoren med Streptomyces-ekspandasegenet. Denne vektor ble betegnet pTS-0-1. Et 3,0 kb Bam HI/Hind III-fragment fra vektor pTS-0-1 som inneholdt GAP-promotoren: ekspandasekassetten, ble deretter ligert med Bam Hl/Hind III-oppsluttet vektor pCI-6 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 8) for å gi den endelige Penicillium-transformasjons-

vektor pSD-1 hvori Streptomyces-ekspandasegenet ble uttrykt fra GAP-promotoren.

Eksempel 10

Transformasjon av Penicillium chrysogenum

Protoplaster fra Penicillium chrysogenum-stammen beskrevet ovenfor, ble dannet ved inokulering av 50 ml CM-nær-ingsløsning med 1 x 10<7> sporer i 67 timer ved 25°C på et rotasjonsristeapparat ved 22 0 rpm. Myceliet ble innsamlet ved filtrering gjennom ostekledefiltere, overført til 500 ml kolber og resuspendert i 25 ml KMP (0,7 M KCl, 0,8 M mannitol, 0,02 M KP04, pH 6,3), inneholdende 100 mg "Novozyme<*> 234" (Novo Bio-Labs, Bagsværd, Danmark) og inkubert ved 30°C ved 100 rpm. Sfæroplastene ble atskilt ved filtrering gjennom osteklede/- glassullfiltere og pelletert ved sentrifugering ved 350xg i 10 minutter. Sfæroplastene ble deretter vasket tre ganger med

10 ml KMP-buffer og deretter resuspendert i KMPC (KMP med

50 mM CaCl2) til en konsentrasjon på 5 x 10<1> celler/ml og hensatt ved romtemperatur i 20 minutter. For transformasjon av Penicillium ble 200 ml av sfæroplastsuspensjonen tilsatt til DNA ('5 mg vektor-DNA i 6,2 ml KMPC med 5 mg/ml heparin) sammen med 50 ml PPC (40% PEG molekylvekt 3500, 20 mM KP04, pH 6,3, 5% CaCl2 ble tilsatt like før anvendelse), og transformasjonsblandingen ble inkubert på is i 30 minutter. 1 ml nypreparert PPC ble tilsatt, og blandingen ble overført til 50 ml smeltet (50°C) regenereringsagar (CM pluss 1,3 M mannitol og 3% agar). Transformasjonsblandingen ble deretter fordelt mellom 5 petri-skåler. Etter regenerering i 24 timer ved 25"C ble platene deretter dekket med OL (1% pepton i 1% agar) inneholdende 100 mg fleomycin/50 ml OL. Mengden av dekkmateriale var like stor som mengden av regenereringsagar. Platene ble inkubert ved 25°C i 7-14 dager og observert for dannelse av transfor-mante kolonier.

Eksempel 11

HPLC- analyser av adipoyl- 6- APA- og adipoyl- 7- ADCA- fermenter-ingsprodukter

Høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) ble anvendt for å analysere produksjonen av adipoyl-6-APA i den anvendte, utransformerte P. chrysogenum-stamme, og produksjonen av adipoyl -7-ADCA i den anvendte, transformerte P. chrysogenum-stamme. Analysene ble utført på Waters system med løsningsmid-delutleveringssystem 625, 490E variabel bølgelengdedetektor innstilt ved 220 nm og 2 54 nm, 82 5 Maxima datasystem og en

Novo-C18-kolonne som den stasjonære fase. Den mobile fase (ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/min.) besto av en 5-minutters isokratisk 2% metanol/98% 0,010 M KH2P04, pH 7,0, og en 15-minutters 2 til 40% lineær gradient av metanol/0,010 M KH2P04, pH 7,0. Mengdebestemmelse av adipoyl-6-APA ble utført ved anvendelse av en standardkurve av standarden penicillin N ved 220 nm, og mengdebestemmelsen av adipoyl-7-ADCA ble utført ved anvendelse av en standardkurve av standarden deacetoksycefalosporin C ved 254 nm.

Analyser for mottakeligheten av adipoyl-6-APA og adipoyl-7-ADCA for penicillinasebehandlinger ble utført ved tilsetning av 1 enhet/ml penicillinase I eller penicillinase III til filtrater og inkubasjon ved romtemperatur i 10-30 minutter. Disse analyser ble utført under identiske HPLC-betingelser som beskrevet ovenfor.

UV-spektrumanalyse av adipoyl-6-APA- og adipoyl-7-ADCA-produktene ble utført ved anvendelse av et Waters system med løsningsmiddelutleveringssystem 510, fotodiodeseriedetektor 990, datasystem 990 og en Novo-Cl8-kolonne som den stasjonære fase. Den anvendte, mobile fase var identisk med den ovenfor beskrevne.

Isolering i stor skala av adipoyl-7-ADCA-produktet fra fullstendig fermenteringsløsning ble utført ved anvendelse av et Waters system med løsningsmiddelutleveringssystem 510, fotodiodeseriedetektor 990, datasystem 990 og en mBondapak C18 preparativ kolonne som den stasjonære fase. Den mobile fase (ved en gjennomstrømningshastighet på 5 ml/min.) besto av en isokratisk 0,010 M KH2P04, pH 7,0, i 35 minutter. Absorpsjons-toppen som tilsvarte retensjonstiden for adipoyl-7-ADCA-produktet, ble innsamlet ved anvendelse av en fraksjonssamler.

Analyser på biologisk aktivitet

En agardiffusjonsbioanalyse ble anvendt for å bestemme antibiotisk aktivitet av de HPLC-isolerte adipoyl-6-APA-og adipoyl-7-ADCA-fermenteringsprodukter. 2 0 ml isolert produkt ble applisert på 5 mm skiver på en LB-agarplate

(20 g/l LB-næringsløsningsbase med 3% agar (Gibco, Paisley, Skottland) sådd med Bacillus subtilis ATCC 33677, eller E. coli supersensitiv stamme (levert av prof. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilis ble anvendt som indikatorstamme for å bestemme adipoyl-6-APA-produktet, og den E. coli supersensi-tive stamme ble anvendt som indikatorstamme for å bestemme adipoyl-7-ADCA-produktet. Etter 15 timers inkubasjon ved 37°C indikerte en ring av inhibert vekst av indikatorbakteriene rundt skiven, produktene som viste biologisk aktivitet. Kon-trollene i dette eksperiment inkluderte deacetoksycefalosporin C, cefalosporin C, penicillin V og agar inneholdende penicillinase eller uten penicillinase, som en kontroll på bekreft-else av p-laktamstrukturer.

Eksempel 13

RAEV- enzymanalyser

Renset adipoyl-7-ADCA-produkt fra fullstendig fermen-teringsløsning ble anvendt som et substrat for å bestemme den spesifikke aktivitet av RAEV-enzymet (kommersielt tilgjengelig fra RAEV Corp.). Reaksjonsblandingen inneholdt 10 mM substrat, 1 mg RAEV-enzym, 5% glyserol, i 0,16 M KH2P04 i et totalvolum på 50 ml, og ble inkubert ved 37°C. 5 ml aliquoter ble tatt ved tidspunktene 0, 1, 3, 5, 10, 20 og 30 minutter, fortynnet med 35 ml 0,010 M KHaP04, pH 3,5, og nedfrosset ved -70°C før HPLC-analyse under tidligere beskrevne betingelser.

Aktiviteten av RAEV-enzymet overfor et kolorimetrisk adipoyl-P-aminobenzosyresubstrat ble bestemt ved anvendelse av 5 mM substrat, 8,2 5 mg RAEV-enzym, 10% glyserol, i 0,065 M KH2P04, pH 7,0, i et totalt volum på 50 ml i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble utført i en 96-brønners mikrotiterskål.

50 ml av en 1/100 fortynning av 1 M NaN02 i 0,25 M eddiksyre ble tilsatt for å stanse reaksjonen, og reaksjonsblandingen ble hensatt ved romtemperatur i 3 minutter. 100 ml av en 1/100 fortynning av 10 mg/ml 4-amino-5-hydroksy-2,7-naftalendisul-fonsyre-mononatriumsalthydrat i H20 i 0,5 M NaHC03 ble tilsatt,

og fargeutviklingen ble umiddelbart overvåket ved 515 nm ved anvendelse av en EL 312 biokinetisk plateavleser {BioTek Instruments).

Eksempel 14

HPLC- analyse av RAEV- enzymreaksjonsprodukt

Alle RAEV-enzymanalyser med anvendelse av adipoyl-7-ADCA-substratet som ble overvåket ved HPLC, ble utført ved anvendelse av et Waters system med løsningsmiddelutleverings-system 625, variabel bølgelengdedetektor 490E innstilt ved 203 nM og 254 nm, datasystem 82 5 Maxima, og en Novo-Cl8-kol-

onne som den stasjonære fase. Den mobile fase (ved en gjennom-strømningshastighet på 1 ml/min.) besto av en 5-minutters isokratisk 2% metanol/98% 0,010 M KH2P04, pH 3,5, og en 15-minut-

ters 2-40% lineær gradient av metanol/0,010 M KH2P04, pH 3,5. Standarden 7-ADCA ble anvendt for å overvåke retensjonstiden

av reaksjonsproduktet. Mengdebestemmelse av reaksjonsproduktet ble utført ved anvendelse av en standardkurve av standarden 7-

ADCA ved 254 nm.

Eksempel 15

13C- NMR- analyse av adipoyl- 7- ADCA- fermenteringsproduktet

<13>C-NMR- (bredt bånd proton-avkoblet) spektre ble erholdt ved 75,4 MHz (7,IT) på et 1BM-AF-350 spektrometer i Fourier transformeringsmodus. Prøvene besto av 50 mg adipoyl-7-ADCA-produkt fra fermenteringsløsning i 0,5 ml D20 (99,8% D, Aldrich), eller 0,5 ml DMS0-d6 (99,0% D, Aldrich), i 5 ml rør

ved 350°k. NMR-dataene bekreftet produktbetegneIsen som adipoyl -7-ADCA.

Eksempel 16

Vurdering av alternative adipoylacylaseenzymer

I tillegg til undersøkelsene med anvendelse av RAEV-enzymet ble fjerning av adipoylsidekjeden fra adipoyl-7-ADCA

(og andre adipoylforbindelser) demonstrert med enzymer produs-

ert av mange forskjellige mikrobielle kilder. I en innledende undersøkelse ble Pseudomonas sp.-stammer SE-83 og SE-495 (deponert hos Fermentation Research Institute, henholdsvis under aksesjonsnr. FERM BP-817 og FERM BP-818) og Pseudomonas-stamme SY-77-1 (deponert hos Northern Regional Research Laboratory under aksesjonsnr. NNRL B-8070) dyrket i 72 timer i et medium inneholdende HyCase SF, 2,0% (vekt/volum); mono-natriumglutamat, 0,5% (vekt/volum); gjærekstrakt, 0,5%

(vekt/volum); maisstøpepulver, 0,2% (vekt/volum); bomulls-frøolje, 0,5% (vekt/volum) og glutarsyre, 0,1% (vekt/volum). Celler ble høstet ved sentrifugering og vasket med 50 mM fosfatbuffer, pH 8,0; de ble deretter resuspendert i buffer, og de ytre membraner ble gjort permeable ved tilsetning av et lite volum kloroform. Aliquoter av cellesuspensjon ble deretter blandet med adipoyl-para-nitroanilin (ad-PNA) og inkubert ved 30°C i 2 til 18 timer. Etter inkubasjon ble blandingene surgjort ved tilsetning av 10% (volum/volum) eddiksyre. Frigjort p-nitroanilin ble deretter påvist ved kolorimetriske metoder etter at det var omdannet til en diazoforbindelse ved anvendelse av reagensene levert i settform av Sigma Chemical Company for analyse av gamma-glutamyl-transferase (Sigma produkt nr. 545-A). De relative aktiviteter for de tre stammer var 100%, 85,5% og 48%, for henholdsvis SE-495, SE-83 og SY-77-1. Ved anvendelse av lignende metoder som beskrevet for RAEV-enzymet ovenfor, ble aktivitet av SE-83- og SE-495-enzymene overfor adipoyl-7-ADCA også demonstrert. Produksjonen av beta-laktamase av SY-77-1 forhindret demonstrasjon av deacylerende aktivitet av denne stamme overfor adipoyl-7-ADCA.

Ved hjelp av lignende metoder ble adipoylacylase-produksjon også demonstrert for to soppstammer ( Alternaria sp. MA-133, ATCC nr. 20492 og Aspergillus sp. MA-13, ATCC nr. 2 04 91; ref. US 4 141 790, Meiji Seika Kaisha Ltd.) og tre ytterligere bakteriestammer (en BreviJbacterium, ATCC nr. 14.649; og Achromobacterium, ATCC nr. 14.648 og en Flavobac-terium, ATCC nr. 14.650) som ble beskrevet som produsenter av cefalosporin C-acylase i US 3 239 394, Merck & Co., Inc.

Claims (7)

1. Biologisk, fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA), karakterisert ved trinnene: a) opprettholdelse av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium som er i stand til å underholde dens vekst, hvoretter dyrkningsmediet tilsettes et adipat-råmateriale omfattende adipinsyre, eller ett eller flere av dets salter og estere som er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum, hvori stammen av Penicillium chrysogenum er transformert ved hjelp av DNA som koder for et enzym med ekspandase-aktivitet, der enzymet er i stand til å akseptere adipoyl-6-APA som et substrat, hvori adipoyl-6-APA produsert av denne stamme, deretter også, som et resultat av dens ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA; og b) adipoyl-7-ADCA fremstilt i a), bringes i kontakt med en adipoylacylase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og produktet 7-ADCA dannes; og deretter c) isoleres det produserte 7-ADCA.

2. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at adipat-råmaterialet er dinatriumadipat.

3. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, stammer fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064.

4. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at adipoylacylasen stammer fra en Pseudomonas-art.

5. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den anvendte Penicillium chrysogenum-stamme dyrkes ved temperaturer mellom 2 0 °C og 3 0 °C.

6. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den anvendte Penicillium chrysogenum-stamme dyrkes ved ,en temperatur på 2 5 °C.

7. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det adipate råmaterialet kan tilsettes før eller, alternativt, etter inokulering med Penicillium chrysogenum, fortrinnsvis før inokuleringen.