RU2139349C1 - Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк - Google Patents
Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк Download PDFInfo
- Publication number
- RU2139349C1 RU2139349C1 RU96104261/13A RU96104261A RU2139349C1 RU 2139349 C1 RU2139349 C1 RU 2139349C1 RU 96104261/13 A RU96104261/13 A RU 96104261/13A RU 96104261 A RU96104261 A RU 96104261A RU 2139349 C1 RU2139349 C1 RU 2139349C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acid
- adca
- carboxymethylthio
- propionyl
- acetyl
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 14
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 title abstract 3
- CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N adipyl-7-aminodesacetoxycephalosporanic acid Natural products CC1=C(N2[C@H](SC1)[C@H](NC(=O)CCCCC(O)=O)C2=O)C(O)=O CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N 0.000 title abstract 3
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 45
- 101710104123 Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- -1 2- (carboxyethylthio) acetyl Chemical group 0.000 claims description 52
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 8
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 abstract description 19
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 abstract description 17
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- RKWPEWMDPJMQAB-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-4-oxo-4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound SC(=O)C(C)CC(O)=O RKWPEWMDPJMQAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 101150091913 cefE gene Proteins 0.000 description 43
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 40
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 19
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 241000187390 Amycolatopsis lactamdurans Species 0.000 description 14
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 9
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 8
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 101150095733 gpsA gene Proteins 0.000 description 6
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 101150022041 penDE gene Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 101150097026 facA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 2
- 240000002228 Cynara humilis Species 0.000 description 2
- 235000005921 Cynara humilis Nutrition 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=C1 JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589746 Pseudomonas sp. SE83 Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M cephalosporin C(1-) Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M 0.000 description 2
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical group OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentachloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)(Cl)Cl UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIMWXHQLMOKTMT-UHFFFAOYSA-N 5-oxo-5-sulfanylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC(S)=O QIMWXHQLMOKTMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N Isopenicillin N Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKEXHDRGMPOQQN-RZVRUWJTSA-N N[C@H](C(=O)O)CCCC(=O)O.N[C@@H](CCCC(=O)O)C(=O)O Chemical compound N[C@H](C(=O)O)CCCC(=O)O.N[C@@H](CCCC(=O)O)C(=O)O PKEXHDRGMPOQQN-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000284696 Penicillium rubens Wisconsin 54-1255 Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N dichloramine Chemical group ClNCl JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- YVSCCMNRWFOKDU-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O.OC(=O)CCCCC(O)=O YVSCCMNRWFOKDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N isopenicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Представлен завершенный эффективный процесс получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)-пропионил-7-АДЦК при использовании трансформантного штамма Penicillium chrysogenum, экспрессирующего экспандазу в сочетании с ацилтрансферазой. В качестве предшественника боковой цепи в способе используют 3-карбоксиметилтиопропионовую кислоту. Способ позволяет повысить продуктивность штаммов для получения 7-АДЦК, которая является промежуточным соединением при производстве цефалоспоринов. 4 с.п.ф-лы. 2 табл. 8 ил.
Description
Область изобретения и краткое описание известного уровня техники
Данное изобретение относится к процессу биосинтеза для получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК).
Данное изобретение относится к процессу биосинтеза для получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК).
Беталактамные антибиотики образуют наиболее важную группу антибиотических соединений с длительной историей клинического применения. В этой группе выделяются пенициллины и цефалоспорины. Эти вещества природно продуцируются нитчатыми грибами Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum соответственно.
В результате применения методов улучшения классического штамма уровня продукции антибиотиков Penicillium chrisogenum и Acremonium chrisogenum значительно увеличены за последние десятилетия. С увеличением знаний о метаболических путях биосинтеза, приводящих к продукции пенициллинов и цефалоспоринов, и приходом генной инженерии стали доступны новые средства повышения продуктивности штаммов и получения производных соединений in vivo.
Большая часть ферментов, участвующих в биосинтезе беталактамов, уже идентифицирована, и клонированы соответствующие им гены, что можно найти у Ingolia and Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245 -264 (путь биосинтеза и ферменты), и Aharonowitz, Cohen, and Vartin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461 - 495 (клонирование генов).
Первые два этапа в биосинтезе пенициллина у P. chrisogenum являются конденсацией трех аминокислот, L-5-амино-5- карбоксипентановой кислоты (L-α-аминоадипиновой кислоты) (A), L-цистеина (C) и L-валина (V) в трипептид LLD - ACV с последующей циклизацией этого трипептида с образованием изопенициллина N. Это соединение содержит типичную беталактамную структуру.
Третий этап включает замену гидрофильной боковой цепи из L- 5амино-5-карбоксипентановой кислоты на гидрофобную боковую цепь путем воздействия фермента ацетилтрансферазы (AT). При промышленном способе производства пенициллина G боковой цепью выбора является фенилуксусная кислота (ФУ). В ЕР-А-0 532 341 раскрыто применение в качестве сырья для производства адипата (5- карбоксипентаноата). Включение этого субстрата приводит к образованию пенициллинового производного с 5-карбоксипентаноиловой боковой цепью, а именно 5-карбоксипентаноил-6- аминопенициллановой кислоты. Это включение происходит благодаря тому факту, что ацетилтрансфераза обладает доказанной широкой субстратной специфичностью (Behrens et al., J. Biol. Chem. 175 (1948), 751 - 809; Cole, Process. Bichem. 1 (1966), 334 - 338; Ballio et al., Nature 185 (1960), 97 -99). Ферментативная реакция обмена, опосредуемая AT, происходит внутри клеточной органеллы, микротельца, что было описано в ЕР-А-0 488 180.
Цефалоспорины значительно более дорогостоящи, чем пенициллины. Одна из причин этого состоит в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов путем ряда химических превращений. Другой причиной является то, что до сих пор ферментации могут подвергаться только цефалоспорины с D-5-амино-5-карбоксипентаноиловой боковой цепью. Цефалоспорин C, несомненно, наиболее важный исходный материал в этом отношении, очень хорошо растворим в воде при любом pH, что подразумевает длительные и дорогие процессы выделения с использованием громоздкой и дорогостоящей колоночной хроматографии. Цефалоспорин C, полученный таким образом, необходимо превращать в терапевтически применяемые цефалоспорины с помощью ряда химических и ферментативных превращений.
Промежуточная 7-АДЦК в настоящее время производится с помощью химического получения производных пенициллина G. Необходимые этапы химического процесса получения 7-АДЦК включают расширение пятичленной структуры пенициллинового кольца до 6- членной структуры цефалоспоринового кольца. Однако фермент экспандаза из нитчатой бактерии Streptomyces clavuligerus может осуществлять подобное расширение кольца. При введении в P. chrysogenum он может превращать пенициллиновую кольцевую структуру в цефалоспориновую кольцевую структуру, как описано у Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283 - 289; и в ЕР-А- 0 532 341 и ЕР-А- 0 540 210. Фермент экспандаза хорошо охарактеризован (ЕР-А- 0 366 354) как биохимически, так и функционально, так же как и соответствующий ему ген. Были описаны как физические карты гена cefE (ЕР-А- 0 233 715), последовательность ДНК, так и исследования по трансформации P.chrysogenum с помощью cefE. Еще одним источником подходящего фермента расширения кольца является нитчатая бактерия Nocardia lactamdurans (первоначально Streptomyces lactamdurans). Описаны как биохимические свойства этого фермента, так и последовательность ДНК гена (Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3 165 - 3 174; and Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453 - 458 соответственно).
Более конкретно в ЕР-А-0 532 341 раскрывается использование фермента экспандазы в P. chrysogenum в сочетании с 5- карбоксипентаноиловой боковой цепью в качестве сырьевого источника, который используется как субстрат для ацетилтрансферазного фермента в P. chrysogenum. Это приводит к образованию 5- карбоксипентаноил-6-АПК, которая превращается с помощью фермента экспандазы, введенного в штамм P. chrysogenum, с получением 5- карбоксипентаноил-7-АДЦК. В конце предполагается удаление 5- карбоксипентаноиловой боковой цепи, дающее 7-АДЦК в качестве конечного продукта. В патентной заявке ЕР-А- 0 540 210 описывается сходный процесс получения 7-АЦК, включающий дополнительные этапы превращения 3-метильной боковой цепи кольца АДЦК в 3-атоксиметильную боковую цепь. Однако в вышеуказанных патентных заявках не раскрывается эффективный и экономически эффективный процесс, потому что прежде всего не была решена проблема своевременной экспрессии фермента экспандазы в клетке, сопутствующей экспрессии фермента ацетилтрансферазы.
В отличие от этого данное изобретение представляет эффективный способ продукции 7-АДЦК, при котором экспандаза и ацетилтрансфераза экспрессируются одновременно.
Кроме того, применение нового предшественника боковой, а именно 3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты, также раскрыто в этом изобретении. Этот предшественник очень эффективно включается P. chrysogenum в соответствующие пенициллины, кольцо которых расширяется с помощью последующего действия фермента экспандазы.
К тому же до сих пор не был описан эффективный способ выделения производного 7-АДЦК из жидкой ферментационной среды перед его диацилированием. Данное изобретение представляет эффективную процедуру экстракции растворителем для выделения производного 7-АДЦК.
С помощью данного изобретения обеспечивается эффективный завершенный процесс получения 7-АДЦК, включающий этапы реакции, не раскрытые и не предложенные в прототипах до сих пор.
Также путем применения данного изобретения и аналогично описанию, данному в ЕР-А-0540210, может быть получена 7-АЦК по завершенному эффективному процессу таким образом.
Краткое описание фигур.
Фиг.1: функциональная карта плазмиды pVcTNE.
Фиг.2: функциональная карта плазмиды pMcTSE.
Фиг.3: функциональная карта плазмиды pMcTNde.
Фиг.4: функциональная карта плазмиды pGNETA.
Фиг.5: функциональная карта плазмиды pGSETA.
Фиг.6: функциональная карта плазмиды pANETA.
Фиг.7: функциональная карта плазмиды pASETA.
Фиг. 8: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше) (нижние строки) в сравнении с последовательностью продукта I ПЦР (верхние строки).
Краткое описание перечня последовательностей
Последовательности ИД NN с 1 по 13: олигонуклеотиды, использованные в конструировании кассеты экспрессии P. chrysogenum для генов cefE Streptomyces clavuligerus и Nocardia lactamdurans.
Последовательности ИД NN с 1 по 13: олигонуклеотиды, использованные в конструировании кассеты экспрессии P. chrysogenum для генов cefE Streptomyces clavuligerus и Nocardia lactamdurans.
Последовательность ИД N 14: последовательность ДНК cefE Nocardia lactamdurans (Coque et al., выше).
Краткое изложение изобретения
Данное изобретение, таким образом, представляет способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем:
a) трансформации штамма Penicillium chrysogenum с помощью гена экспандазы под транскрипционной и трансляционной регуляцией сигналов экспрессии нитчатого гриба;
b) выращивания указанного штамма в ферментере в культуральной среде и добавления к указанной культуральной среде 3'- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира, подходящих для получения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-6-аминопенициллановой кислоты (2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-6-АПК), кольцо которых in situ расширяется с образованием 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АЛЦК;
с) выделения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК из жидкой ферментационной среды;
d) децилирования указанной 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК; и
е) выделения кристаллической 7-АДЦК.
Данное изобретение, таким образом, представляет способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем:
a) трансформации штамма Penicillium chrysogenum с помощью гена экспандазы под транскрипционной и трансляционной регуляцией сигналов экспрессии нитчатого гриба;
b) выращивания указанного штамма в ферментере в культуральной среде и добавления к указанной культуральной среде 3'- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира, подходящих для получения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-6-аминопенициллановой кислоты (2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-6-АПК), кольцо которых in situ расширяется с образованием 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АЛЦК;
с) выделения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК из жидкой ферментационной среды;
d) децилирования указанной 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК; и
е) выделения кристаллической 7-АДЦК.
Предпочтительно стадия (е) является стадией фильтрации.
Предпочтительно экспрессия гена экспандазы находится под транскрипционной и трансляционной регуляцией соответствующих контролирующих элементов АТ-гена, что обеспечивает одновременную координацию экспрессии указанных генов.
Предпочтительно 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК выделяют из жидкой ферментационной среды путем экстрагирования фильтрата среды органическим растворителем, несмешиваемым с водой при pH ниже примерно 4.5 и обратным экстрагированием тех же самых веществ водой при pH от 4 до 10.
Кроме того, представлены вектор рекомбинантной ДНК, содержащий ДНК, кодирующую экспендазу, функционально связанную с транскрипционными и трансляционными контролирующими элементами АТ- гена P. chrysogenum или gpdA гена A. nidulans, и клетки-хозяева, трансформированные такой ДНК.
Детальное описание изобретения
Данное изобретение относится к использованию функциональных генных конструкций в P. chrysogenum для расширения in vivo структуры пенициллинового кольца в сочетании с использованием нового субстрата для ферментов биосинтеза для образования производного ключевого промежуточного соединения в биосинтезе цифалоспоринов, 7-аминодезациотоксицефалоспорановой кислоты или 7-АДЦК. Это производное имеет химическое такое строение, которое дает возможность эффективной экстракции растворителем, обеспечивая таким образом экономически привлекательный процесс выделения.
Данное изобретение относится к использованию функциональных генных конструкций в P. chrysogenum для расширения in vivo структуры пенициллинового кольца в сочетании с использованием нового субстрата для ферментов биосинтеза для образования производного ключевого промежуточного соединения в биосинтезе цифалоспоринов, 7-аминодезациотоксицефалоспорановой кислоты или 7-АДЦК. Это производное имеет химическое такое строение, которое дает возможность эффективной экстракции растворителем, обеспечивая таким образом экономически привлекательный процесс выделения.
Трансформация P. chrysogenum может, в принципе, достигаться с помощью различных средств доставки ДНК, такими как опосредуемое PEG-Ca поглощение протопластов, электропорация или методы обстрела частицами и отбором трансформантов. Смотрите, например, Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991). Применение доминантных и недоминантных маркеров селекции было описано (Van den Hondel, выше). Были описаны маркеры селекции как гомологичного (происходящие из P. chrysogenum) и гетерологичного (происходящие не из P. chrysogenum) происхождения.
Применение различных маркеров селекции трансформантов, гомологичных или гетерологичных, в присутствии или в отсутствие векторных последовательностей, физически связанных или нет с неселектируемой ДНК, при селекции трансформантов хорошо известно.
Предпочтительно для селекции трансформантов P. chrysogenum используется гомологичный маркер селекции, чтобы ограничить количество гетерологичной ДНК, вводимой в P. chrysogenum. Наиболее предпочтительно использовать доминантный маркер селекции, который может селективно удаляться из трансформированного штамма, например, ген amdS A. nidulans или других нитчатых грибов (Европейская патентная заявка N 94 201 896.1). Эти предпочтительные характеристики маркера селекции трансформанта P. chrysogenum очень благоприятны для процесса и для процедур регистрации продукта, так как в процессе не участвуют маркеры, связанные с антибиотикоустойчивостью, или не будут вводиться в окружающую среду.
При наиболее предпочтительном воплощении маркер селекции amdS, который может селективно удаляться из штамма, дает возможность повторных циклов трансформации с использованием той же самой доминантной селекции снова и снова. Это свойство освобождения от маркера селекции у новых штаммов P. chrysogenum, экспрессирующих экспандазу, является определяющим для быстрой разработки высокопродуктивных штаммов по программе улучшения промышленных штаммов.
Способность к реакции расширения кольца, опосредуемая ферментом экспандазой, вводится и экспрессируется таким путем в P. chrysogenum, например, штамме Wisconsin 54-1255. Эта реакция расширения кольца происходит также и в их мутантах, дающих увеличенный выход беталактамов. Должно быть понятно, что в этом случае характеристики среды должны быть слегка адаптированы для получения эффективного роста.
Кроме того, ген cefE помещается под транскрипционный и трансляционный контроль соответствующих контролирующих ген элементов нитчатого гриба, предпочтительно происходящих из ацилтрансферазного (AT) гена P. chrysogenum, что дает возможность их экспрессии в оптимальных временных рамках, синхронизированных с действием самого фермента ацетилтрансферазы. Эти меры являются решающими для эффективности реакции расширения кольца в пенициллиновой молекуле.
В дополнение к синхронизированной экспрессии генов, кодирующих экспандазу и трансферазу, могло быть благоприятным для разработки экономичного процесса производства совместное расположение части экспандазных ферментов с ацетилтрансферазой в микротельцах (внутриклеточная локализация ацетилтрансферазы). При этих предпочтительных осуществлениях будет очень сильно снижаться количество пенициллиновых побочных продуктов, которые не допускаются в конечном продукте 7-АДЦК регистрационными органами.
Резюмируя, в данном изобретении раскрывается, как действие фермента экспандазы, введенного в P. chrysogenum, может быть нацелено на расширение пенициллинового кольца на основе синхронизированной экспрессии.
По этому изобретению промежуточные беталактамные соединения 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7- АДЦК продуцируются P. chrysogenum с помощью добавления 3- карбоксиметилтиопропионовой кислоты или ее соли или эфира. Подходящими солями, например, являются соли натрия или калия. Они же эффективно выделяются из среды путем простой экстракции растворителем, например, следующим образом.
Жидкая питательная среда отфильтровывается и к фильтрату добавляется не смешиваемый с водой органический растворитель. pH устанавливается так, чтобы проэкстрагировать цефалоспорин из водного слоя. Диапазон pH должен находиться ниже 4.5; предпочтительно в интервале от 4 до 1, более предпочтительно - от 2 до 1. Таким образом цефалоспорин отделяется от многих посторонних примесей, присутствующих в ферментационной среде. Предпочтительно используется небольшой объем органического растворителя, что дает концентрированный раствор цефалоспорина, и таким образом достигается снижение объемных скоростей потоков. Вторая возможность состоит в полной экстракции жидкой питательной среды при pH, равном 4 и ниже. Предпочтительно жидкая питательная среда экстрагируется в интервале от 4 до 1 органическим растворителем, несмешиваемым с водой.
Может использоваться любой растворитель, который не взаимодействует с молекулой цефалоспорина. Подходящими растворителями, например, являются бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, подобные бутанолу, и т.д. Предпочтительно используются 1-бутанол или изобутанол.
Затем цефалоспорин экстрагируется обратно водой при pH от 4 до 10, предпочтительно от 6 до 9. И снова конечный объем сильно снижается, выделение может проводиться при температурах от 0 до 50oC и предпочтительно при температурах окружающей среды.
Водный раствор цефалоспорина, полученный таким образом, обрабатывается подходящим ферментом для удаления 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропиониловой боковой цепи и получения желаемой 7-АДЦК.
Предпочтительно используется иммобилизированный фермент, чтобы было возможно использовать этот фермент повторно. Методология получения таких частиц и иммобилизации ферментов была подробно описана в ЕР-А-0222462. pH водного раствора имеет значение, равное, например, от pH 4 до pH 9, при котором реакция деградации цефалоспорина минимизирована, а желаемое превращение с помощью фермента оптимально. Таким образом, фермент добавляется к водному раствору цефалоспорина при поддержании в то же время pH на соответствующем уровне с помощью, например, добавления неорганического основания, такого, как раствор гидроксида калия, или применения катионообменной смолы. Когда реакция завершается, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием. Другая возможность состоит в применении иммобилизованного фермента в колонке с фиксированным или ожиженным слоем или использовании фермента в растворе и удалении продуктов с помощью мембранной фильтрации. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, несмешиваемого с водой.
Подходящие ферменты, например, получаются из микроорганизма Pseudomonas SY77, имеющего мутацию в одной или более позиций: 62, 177, 178 и 179. Также могут использоваться ферменты из других микроорганизмов Pseudomonas, предпочтительно Pseudomonas SY77, имеющих произвольно мутацию в одной или более позиций, соответствующих позициям 62, 177, 178 и 179 у Pseudomonas SY77.
После доведения pH до примерно от 0.1 до 1.5 слои разделяются и pH водного слоя доводится до примерно 2 - 5. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается.
Деацилирование может также выполняться химически известным способом, например, через образование иминохлоридной боковой цепи путем добавления пентахлорида фосфора при температуре ниже 10oC и затем изобутанола при температуре окружающей среды или ниже.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не для ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Экспрессия гена cefE Streptomyces и Nocardia в Penicillium chrysogenum.
Пример 1
Экспрессия гена cefE Streptomyces и Nocardia в Penicillium chrysogenum.
а. Общие процедуры клонирования гена и генной трансформации.
В данной заявке используются обычные методики, используемые в процедурах клонирования гена. Эти методики включают полимеразные цепные реакции (ПЦР), синтез синтетических олигонуклеотидов, анализ нуклеотидной последовательности ДНК, ферментативное лигирование и рестрикцию ДНК, субклонирование вектора в E. coli, трансформацию и селекцию трансформантов, выделение и очистку ДНК, характеристику ДНК с помощью блот-анализа по Саузерну и меченых 32P зондов, мечение ДНК 32P путем случайного примирования. Все эти методики очень хорошо известны в этой области технологии и соответственно описаны во многих источниках. Смотрите, например, Sambrook et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, U.S.A. (1989), Innes et al., PCR protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), and McPher-son et al., PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).
Общие процедуры, использованные при трансформации нитчатых грибов и селекции трансформантов, включают получение протопластов грибов, перенос ДНК и режим регенерации протопластов, очистку и определение свойств трансформантов. Все эти процедуры хорошо известны в этой области знаний и очень хорошо документированы в: Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of Filamentous Fungi, technology and products, Butter-worth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds. ), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed.). Biotechnology, second completely revised edition, VCH (1992).
Более конкретное применение технологии клонирования генов и генной трансформации в отношении Penicillium chrysogenum очень хорошо документально отражено у Bennett and Lasure (выше) и Finkelstein и Ball (выше).
- Синтетические олигонуклеотиды ДНК синтезированы с использованием коммерческого синтезатора ДНК (Applied Biosystems, CA,U.S.A.) в соответствии с инструкциями производителя.
- ПЦР выполняется с использованием коммерческого автоматического аппарата для ПЦР (Perkin Elmer, U.S.A.) и ДНК- полимеразы (Perkin Elmer, U.S.A.) по инструкциям производителя.
- Процедуру hGC ПЦР (Dutton et al., Nucleic Acids Res. 21, (No. 12) (1993) 2953-2954) использовали, чтобы сделать возможной амплификацию кодирующих областей гена cefE хромосомной ДНК N. lactamdurans и S. clavuligerus.
- Ферменты рестрикции и другие ферменты для модификации ДНК получены из BRL (MD, U.S.A.) и использовались в соответствии с инструкциями производителя.
Вектор Е. coli pBluescript получен от Stratagene (СА, U.S.A.).
- Другие использованные химреактивы все имеют аналитическую чистоту и получены от разных поставщиков.
- Анализ нуклеотидной последовательности ДНК выполняли с использованием аппарата для автоматического анализа последовательности ДНК (Applied Biosystem), основанного на детекции, специфичной для флюоресцентной метки в соответствии с инструкциями производителя.
b. Культивирование микроорганизмов
Streptomyces clavuligerus АТСС 27 064 выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).
Streptomyces clavuligerus АТСС 27 064 выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 754-765).
Nocardia Lactamdurans ATCC 27 382 также выращивается в трипсинизированном соевом бульоне (Difco). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения гена cefE (Coque et al., выше).
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (АТСС 28 089) выращивается в полной среде YPD (YPD; 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза). Хромосомная ДНК этого штамма использована для выделения 5' и 3' регуляторных областей гена penDE, необходимых для экспрессии гена cefE. Penicillium chrysogenim АТСС 28 089 также используется в качестве хозяина для гена cefE в экспериментах по трансформации. Пригодны также другие штаммы Penicillium chrysogenum, включая мутанты штамма Wisconsin 54-1255, дающие увеличенный выход беталактамов. В зависимости от использованного маркера селекции трансформанта могут использоваться штаммы P. chrysogenum, содержащие мутации в гене pyrG, niaD или facA. Эти мутантные штаммы могут быть получены с помощью методов, хорошо известных в этой области технологии (Cantoral, Bio/technol. 5(1987), 494-497; Gouka et al., J. Bioteshn. 20 (1991), 189-200; and Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).
Культивирование P. chrysogenum для образования протопластов, используемых при трансформации, также производилось в среде YPD.
Хорошо известно, что процедуры образования протопластов и регенерации могут слегка отличаться в зависимости от конкретного использования штамма Penicillium chrysogenum и примененной процедуры селекции трансформанта.
Е. coil WK6 (Zell and Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene и NB101 (Boyer and Roulland - Dssoix, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459, Bolivar and Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) сохранялись и культивировались с помощью использования стандартной среды для культивирования Е. coli, (Sambrook, выше).
с.Конструирование кассет экспрессии cefE
Кассеты экспрессии cefE перечислены в таблице 1 (см. в конце описания), которая также объясняет номенклатуру, которая была использована для этих плазмид.
Кассеты экспрессии cefE перечислены в таблице 1 (см. в конце описания), которая также объясняет номенклатуру, которая была использована для этих плазмид.
Опубликованные нуклеотидные последовательности гена cefE S.clavuligerus (Kovacevic, выше); гена cefE N. lac tamdurans (Coque, выше); гена gpdA A. nidulans (Punt et al. Gene 69 (1988), 49-57); гена penDE P. chrysogenum (Barredo et al. Gene 83 (1989), 291-300; diez et al., Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576) были использованы для создания синтетических олигонуклеотидов, перечисленных в таблице II (см. в конце описания).
с1. Конструирование плазмид экспрессии cefE Е. coli, pMCTSE и pMCTNE
ПЦР, 1: cefE N. lactamdurans
В первой ПЦР с использованием хромосомной ДНК N. lactamdurans и олигонуклеотидов 1 и 2 была получена открытая рамка считывания cefE N. lactamdurans в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт XbaI на 3'-конце.
ПЦР, 1: cefE N. lactamdurans
В первой ПЦР с использованием хромосомной ДНК N. lactamdurans и олигонуклеотидов 1 и 2 была получена открытая рамка считывания cefE N. lactamdurans в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт XbaI на 3'-конце.
ПЦР, 2: cefE S. clavuligerus
Во второй ПЦР с использованием хромосомной ДНК S. clavuligerus и олигонуклеотидов 3 и 4 была получена открытая рамка считывания cefE S. clavuligerus в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, также содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт рестрикции XbaI на 3'-конце.
Во второй ПЦР с использованием хромосомной ДНК S. clavuligerus и олигонуклеотидов 3 и 4 была получена открытая рамка считывания cefE S. clavuligerus в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, также содержащего единственный сайт рестрикции NdeI на 5'-конце и единственный сайт рестрикции XbaI на 3'-конце.
С целью получения экспрессии генов cefE в Е. coli и определения характеристик продуктов ПЦР с помощью анализа последовательности ДНК продукты ПЦР 1 и 2 клонировали в векторе pMCTNde, производный от рМС-5 (Stanssens et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Плазмида pMCTNde была получена из pMC5-8 (Европейская патентная заявка N 0351029) путем встройки фрагмента, кодирующего tac промотор, с последующим сайтом RBS и клонирующим сайтом NdeI (фигура 3).
Продукты ПЦР 1 и 2 расщепляли с помощью NdeI и XbaI и лигировали в расщепленный NdeI-XbaI вектор pMCTNde. Смесь лигирования использовали для трансформации Е. coli WK6. Трансформанты отбирали по резистентности к хлорамфениколу. Эти трансформанты используют для изоляции плазмидной ДНК. Вставку кассеты экспрессии cefE сначала анализировали с помощью расщепления рестрикционным ферментом на предсказанную генерацию рестрикционных фрагментов. Плазмиды, содержащие предсказанные сайты для рестрикционных ферментов, окончательно проанализированы с помощью автоматического анализа последовательности ДНК.
Последовательность ДНК открытой рамки считывания cefE S. clavuligerus в плазмиде pMCTSE (фигура 2) была на 100% идентична опубликованной последовательности (Kovacevic, выше).
Последовательность ДНК (фигура 8) всех клонов, которые были проанализированы, содержащая открытую рамку считывания cefE N. lactamdurans, отличалась от опубликованной последовательности (Coque, выше).
Аминокислотная последовательность, произведенная из опубликованного гена cefE N. lactamdurans, имеет пролин в положении 41 (смотрите Посл. ИД N 14). Этот пролин опущен в клонах, которые получены при ПЦР 1. Эта плазмида названа pMCTNE (фигура 1).
с2. Конструирование плазмид экспрессии cefE P. chrysogenum
ПЦР, 3: промотор gpdA
При этой третьей ПЦР с использованием плазмидной ДНК pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124), содержащей ген hph E. coli под контролем промотора gpdA A. nidulans и олигонуклеотиды 5 и 6, был получен промотор gpdA в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащий единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.
ПЦР, 3: промотор gpdA
При этой третьей ПЦР с использованием плазмидной ДНК pAN7-1 (Punt et al. Gene 56 (1987), 117-124), содержащей ген hph E. coli под контролем промотора gpdA A. nidulans и олигонуклеотиды 5 и 6, был получен промотор gpdA в виде продукта ПЦР в 0.9 kb, содержащий единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.
ПЦР, 4: AT промотор
В четвертой ПЦР хромосомная ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотиды 7 и 8 были использованы для получения AT промоторного фрагмента, равного 1.5 kb, который также содержит единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.
В четвертой ПЦР хромосомная ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотиды 7 и 8 были использованы для получения AT промоторного фрагмента, равного 1.5 kb, который также содержит единственный сайт рестрикции EcoRI на 5'-конце и единственный сайт NdeI на 3'-конце.
ПЦР, 5: AT терминатор и 3'-конец гена cefE N. lactamdurans
В пятой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область (AT) penDE с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 9 и 10 и 11 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР содержат, таким образом, 3'-концевую последовательность гена cefE с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).
В пятой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область (AT) penDE с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 9 и 10 и 11 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР содержат, таким образом, 3'-концевую последовательность гена cefE с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности ARL (Muller et al., Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).
Олигонуклеотиды сконструированы таким образом, что единственный сайт BspEl встраивается на 5'-конце продукта ПЦР и единственный сайт SreI введен на 3'-конце продукта ПЦР.
ПЦР, 6: AT терминатор и 3'-конец гена cefE S. clavuli-gerus
В этой шестой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область penDE (AT) с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 12 и 10 и 13 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР, таким образом, содержат 3'-концевую последовательность гена cefE S. clavuligerus с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).
В этой шестой ПЦР была получена 0.5 kb терминаторная область penDE (AT) с использованием хромосомной ДНК P. chrysogenum и олигонуклеотидов 12 и 10 и 13 и 10 соответственно. Эти продукты ПЦР, таким образом, содержат 3'-концевую последовательность гена cefE S. clavuligerus с или без сигнала нацеливания к микротельцу, состоящего из C-концевой аминокислотной последовательности SKL (De Hoop et al., Biochem. J. 286 (1992), 657-669).
Олигонуклеотиды сконструированы так, что единственный сайт рестрикции BqlI вводится на 5'-конце продукта ПЦР и единственный сайт SpeI получается на 3'-конце этого продукта ПЦР.
С целью получения экспрессии генов cefE в P. chrysogenum промотор gpdA и фрагмент промотора AT лигировали к фрагментам cefE из плазмид pMCTNE и pMCTSE. Эти лигированные фрагменты клонировали в вектор pBluescript II KS.
Продукт ПЦР 3 расщепляли EcoRI и NdeI. pMCTNE и pMCTSE расщепляли с помощью NdeI и XbaI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Кодирующие фрагменты 0.9 kb cefE очищали из агарозного геля. Промоторный фрагмент EcoRI- NdeI лигировали вместе с фрагментами NdeI-XbaI cefE в расщепленный EcoRI-XbaI вектор pBluescript II KS. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSE и pGNE.
Для получения оптимальной экспрессии генов cefE в Р. chrysogenum мы выбираем клонирование сигнальной последовательности терминации AT после генов cefE в плазмидах экспрессии Penicillium, упомянутых выше.
pGNETA-pGNEWA
Продукты ПЦР 5 расщепляли с помощью BspEI и SpeI и лигировали в расщепленный BspEI и SpeI вектор pGNE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Плазмиды, выделенные из этих трансформантов, охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGNEWA и pGNETA (фигура 4).
Продукты ПЦР 5 расщепляли с помощью BspEI и SpeI и лигировали в расщепленный BspEI и SpeI вектор pGNE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Плазмиды, выделенные из этих трансформантов, охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGNEWA и pGNETA (фигура 4).
pGSENA-pGSEWA
Продукты ПЦР 6 расщепляли с помощью BqlI и SpeI и лигировали в расщепленный BqlI и SpeI вектор pGSE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Выделенные из этих трансформантов плазмиды также охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSEWA и pGSETA (фигура 5).
Продукты ПЦР 6 расщепляли с помощью BqlI и SpeI и лигировали в расщепленный BqlI и SpeI вектор pGSE. Смеси лигирования использовали для трансформации Е. coli НВ101. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину. Выделенные из этих трансформантов плазмиды также охарактеризовывали с помощью анализа фрагментов рестрикции и затем анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены следующие плазмиды: pGSEWA и pGSETA (фигура 5).
pANETA, pANEWA и pASETA и pASEWA
Плазмиды pGNETA, pGNEWA, pGSETA и pGSEWA рacщeпляли с помощью EcoRI и NdeI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и из геля очищали фрагменты 4.5 kb.
Плазмиды pGNETA, pGNEWA, pGSETA и pGSEWA рacщeпляли с помощью EcoRI и NdeI. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и из геля очищали фрагменты 4.5 kb.
Продукт ПЦР 4 расщепляли с помощью EcoRI и NdeI и лигировали с очищенными фрагментами, упомянутыми выше. После трансформации лигированных смесей в Е. coli НВ101 трансформанты отбирали по резистентности к ампициллину.
Трансформанты подращивали и выделяли их плазмиды и характеризовали с помощью анализа фрагментов рестрикции и окончательно - с помощью анализа последовательности ДНК. Таким образом были получены желаемые конструкции, а именно: pANETA (фигура 6), pANEWA, pASETA (фигура 7) и pASEWA.
d. Трансформация P. chrysogenum
Использована процедура трансформации протопластов, опосредуемой Ca-PEG.
Использована процедура трансформации протопластов, опосредуемой Ca-PEG.
Следуя процедурам, описанным у Cantoral (смотрите выше), Gouka et al. (J. Biotechn., смотрите выше) и Gouka et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., смотрите выше) для трансформации штаммов P. chrysogenum использовали целую плазмиду или очищенный полигенный экспрессирующий кластер cefE (лишенный векторных последовательностей Е. coli) с генами pyrG, niaD, facA или amdS (Beri et al. , Curr. Genet. 11 (1987), 639-641) соответственно в качестве маркеров селекции.
Путем использования гомологичных маркеров селекции pyrG, niaD или facA в очищенной форме, лишенных векторных последовательностей Е. coli, были получены трансформированные штаммы P. chrysogenum, которые не содержат генов резистентности бактерий.
В Европейской патентной заявке N 94201896.1 описывается способ получения рекомбинантных штаммов, лишенных генов маркеров селекции. Этот метод был успешно использован на трансформантах P. chrysogenum, содержащих ген amdS A. nidulans в качестве доминантного маркера селекции.
В таком случае единственными элементами гетерологичного происхождения являются кодирующая область cefE 0.9 kb и произвольно промоторная область gpdA 0.9 kb.
е. Анализ трансформантов
Трансформанты P. chrysogenum очищают путем повторного культивирования на селективной среде. Единичные устойчивые колонии использованы для приготовления устойчивых косяков для получения спор и для проверки на трансформанты, содержащие кассету экспрессии cefE. Кипячение фрагмента свежего мицелия трансформантов на агаровой пластинке использовали для получения достаточного количества матричной ДНК для эффективной проверки сотен трансформантов на присутствие гена cefE при использовании метода ПЦР. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Действуя таким образом, установили эффективность трансформации.
Трансформанты P. chrysogenum очищают путем повторного культивирования на селективной среде. Единичные устойчивые колонии использованы для приготовления устойчивых косяков для получения спор и для проверки на трансформанты, содержащие кассету экспрессии cefE. Кипячение фрагмента свежего мицелия трансформантов на агаровой пластинке использовали для получения достаточного количества матричной ДНК для эффективной проверки сотен трансформантов на присутствие гена cefE при использовании метода ПЦР. (Seth, Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), Fungal Genetics Newsletter 38, 55). Действуя таким образом, установили эффективность трансформации.
Отбор трансформантов также выполняли, применяя биологические исследования. Трансформанты подращивали на агаризованной среде, которая содержала предшественника боковой цепи выбора. Е. coli ESS2231 использовали в качестве индикаторной бактерии в кроющем слое агара, который содержал Бактопеназу, чтобы было возможно отдифференцировать продукцию пенициллина и цефалоспорина по методам, хорошо известным в этой области науки и описанным, например, у Guttierez et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64.
Споры используют для посева P. chrysogenum в культуральную среду, как описано в разделе d. После 72 часов культивирования (при 25oC) из мицелия выделяют хромосомную ДНК. ДНК расщепляют рестрикционным ферментом с распознаваемой последовательность в 6 п.о., подобным EcoRI или PstI.
Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и переносили на нейлоновые мембраны Gene screen (New England nuclear). Блоттинг по Саузерну проводили гибридизацией с меченным 32P продуктом ПЦР 2 в качестве пробы для последовательностей гена cefE. Мечение 32P очищенного продукта ПЦР 2 достигается с помощью мечения случайным примированием в присутствии α32P ЦТФ при использовании коммерческого набора для мечения (Boeringer Mannheim).
Трансформанты, содержащие кодирующую последовательность cefE, испытаны на экспрессию продукта гена cefE, называемую здесь экспандазной активностью.
Отобранные трансформанты культивируются в среде для продукции пенициллина (смотрите пример 2).
В эксперименте по оценке протекания процесса во времени образцы мицелия отбирали через 48, 72 и 96 часов ферментации. Готовятся экстракты мицелия, и экспандазная активность определяется в неочищенных экстрактах, как описано у Rollins et al. Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. Трансформанты с экспандазной активностью испытывали на ацилтрансферазную активность также методами, описанными у Alvarez et al., Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682.
По этим анализам отбирали трансформанты с различными уровнями ацилтрансферазной и экспандазной ферментативной активности для ферментативной продукции производных 7-АДЦК.
Пример 2
Ферментативное получение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и их выделение
P. chrysogenum штамм Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089) трансформируется с помощью одной из конструкций ДНК, как описано в примере 1, и засевается в концентрации 2•106 конидий/мл в посевную среду, состоящую из г/л:
глюкозы - 30
(NH4)2SO4 - 10
KH2PO4 - 10
раствора микроэлементов I
(MgSO4•7H2O - 25
FeSO4•7H2O - 10
CuSO4•5H2O - 0,5
ZnSO4•7H2O - 2
Na2SO4 - 50
MnSO4•H2O - 2
CaCl2•2H2O - 5)
10 (мл/л) (pH до стерилизации 6.5).
Ферментативное получение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и их выделение
P. chrysogenum штамм Wisconsin 54-1255 (АТСС 28089) трансформируется с помощью одной из конструкций ДНК, как описано в примере 1, и засевается в концентрации 2•106 конидий/мл в посевную среду, состоящую из г/л:
глюкозы - 30
(NH4)2SO4 - 10
KH2PO4 - 10
раствора микроэлементов I
(MgSO4•7H2O - 25
FeSO4•7H2O - 10
CuSO4•5H2O - 0,5
ZnSO4•7H2O - 2
Na2SO4 - 50
MnSO4•H2O - 2
CaCl2•2H2O - 5)
10 (мл/л) (pH до стерилизации 6.5).
Посевную культуру инкубируют в течение 48-72 часов при 25- 30oC и затем используют для засева 10-20 объемов производственной среды, содержащей (г/л):
лактозы - 80
мальтозы - 20
CaSO4 - 4
мочевины - 3
(MgSO4•7H2O - 2
KH2PO4 - 7
NaCl - 0,5
(NH4)2SO4 - 6
FeSO4•7H2O - 0,1
3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты раствора микроэлементов II - 5
(CuSO4•5H2O - 0,5
ZnSO4•7H2O - 2
MnSO4•H2O - 2
Na2SO4 - 50),
10 (мл/л) (pH до стерилизации 5.5 - 6.0). Затем инкубация продолжается в течение еще 96 - 120 часов.
лактозы - 80
мальтозы - 20
CaSO4 - 4
мочевины - 3
(MgSO4•7H2O - 2
KH2PO4 - 7
NaCl - 0,5
(NH4)2SO4 - 6
FeSO4•7H2O - 0,1
3'-карбоксиметилтиопропионовой кислоты раствора микроэлементов II - 5
(CuSO4•5H2O - 0,5
ZnSO4•7H2O - 2
MnSO4•H2O - 2
Na2SO4 - 50),
10 (мл/л) (pH до стерилизации 5.5 - 6.0). Затем инкубация продолжается в течение еще 96 - 120 часов.
В конце производственной ферментации мицелий отделяется центрифугированием или фильтрованием и 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК анализируется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с обращенной фазой. Использован аппарат ВЭЖХ Beckman System Gold, состоящий из программируемой системы для растворителей модели 168, автоматического пробоотборника модели 507, диодно-сетчатого детектора модели 168 и системы для данных Gold system (5.10). В качестве стационарной фазы используются две (2) катриджных колонки Chrom-spher С18 (100 х 3 мм, Chrompack) в ряд. Подвижная фаза состоит из линейного градиента от 100% 0.07 М фосфатного буфера pH 4.8 до 25% ацетонитрила и 75% фосфатного буфера pH 4.8 через 15 минут при скорости потока, равной 0.5 мл/мин. Продукция 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК определяется количественно при 260 нм при использовании синтетических 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК в качестве веществ для сравнения.
Идентичность пиков подтверждается путем сравнения кривых ультрафиолетового и ЯМР спектров.
После отфильтровывания жидкой питательной среды к фильтрату добавляется примерно 0.1 объема 1-бутанола. Значение pH доводится до 2 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты и смесь перемешивается в течение 5 минут при комнатной температуре. После разделения органический слой или выпаривается или используется далее для химического деацилирования (пример 3) или обратно экстрагируется объемом воды, равным 0.33, с pH 8 и далее используется для ферментативного деацилирования (примеры 4 и 5).
Пример 3
Деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК
К смеси 3 г (8 ммолей) 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК, 3.5 мл (36 ммолей) N,N- диметиланилина 13 мл метиленхлорида и 2.6 мл (21 ммоль) триметилхлорсилана добавляются при комнатной температуре. После перемешивания в течение 30 минут реакционную смесь охлаждают до примерно -50oC и добавляют 1.8 г (8.5 ммоля) пентахлорида фосфора, все сразу. Температура поддерживается на уровне -40oC в течение двух часов и затем реакционную смесь охлаждают до -65oC. Затем ее обрабатывают 12 мл (137 ммолей) изобутанола с такой скоростью, чтобы температура не повышалась свыше -40oC. После дополнительного перемешивания в течение двух часов раствор выливают в 15 мл воды и потом сразу добавляют 5 мл 4.5 N аммиака. pH доводится до 4 путем медленного добавления твердого бикарбоната аммония. После охлаждения до 5oC смесь фильтруют и кристаллическую 7-АДЦК промывают 5 мл водного ацетона (1:1) и отделяют.
Деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК
К смеси 3 г (8 ммолей) 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК, 3.5 мл (36 ммолей) N,N- диметиланилина 13 мл метиленхлорида и 2.6 мл (21 ммоль) триметилхлорсилана добавляются при комнатной температуре. После перемешивания в течение 30 минут реакционную смесь охлаждают до примерно -50oC и добавляют 1.8 г (8.5 ммоля) пентахлорида фосфора, все сразу. Температура поддерживается на уровне -40oC в течение двух часов и затем реакционную смесь охлаждают до -65oC. Затем ее обрабатывают 12 мл (137 ммолей) изобутанола с такой скоростью, чтобы температура не повышалась свыше -40oC. После дополнительного перемешивания в течение двух часов раствор выливают в 15 мл воды и потом сразу добавляют 5 мл 4.5 N аммиака. pH доводится до 4 путем медленного добавления твердого бикарбоната аммония. После охлаждения до 5oC смесь фильтруют и кристаллическую 7-АДЦК промывают 5 мл водного ацетона (1:1) и отделяют.
Пример 4
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием мутантной ацилазы Pseudomonas SY77
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется в одну энзиматическую стадию с использованием специфической ацилазы, которая производится из ацилазы Pseudomonas SY77 путем направленного на определенную область мутагенеза. Конструирование и идентификация мутантной ацилазы Pseudomonas SY77 с улучшенной активностью в отношении 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионильной боковой цепи было описано в ЕР-А-0453048. В мутанте тирозин в положении 178 в α- субъединице ацилазы Pseudomonas SY77 был заменен на гистидин. Мутантная ацилаза продуцируется в Е. coli. Клетки собираются путем центрифугирования и снова суспендируются в 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4, содержащем 140 мМ NaCl. Затем клетки разрушают ультразвуком. После удаления клеточных остатков собирают супернатанты, обладающие ацилазной активностью. Дальнейшую очистку ацилазы выполняли с помощью ряда этапов хроматографии:
(1) ионообменной хроматографии на О-сефарозе с быстрым потоком при pH 8. 8;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия на фенилсефарозе;
(3) гельпроникающей хроматографии на колонке сефакрила S200HR.
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием мутантной ацилазы Pseudomonas SY77
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется в одну энзиматическую стадию с использованием специфической ацилазы, которая производится из ацилазы Pseudomonas SY77 путем направленного на определенную область мутагенеза. Конструирование и идентификация мутантной ацилазы Pseudomonas SY77 с улучшенной активностью в отношении 2- (карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионильной боковой цепи было описано в ЕР-А-0453048. В мутанте тирозин в положении 178 в α- субъединице ацилазы Pseudomonas SY77 был заменен на гистидин. Мутантная ацилаза продуцируется в Е. coli. Клетки собираются путем центрифугирования и снова суспендируются в 10 мМ фосфатном буфере pH 7.4, содержащем 140 мМ NaCl. Затем клетки разрушают ультразвуком. После удаления клеточных остатков собирают супернатанты, обладающие ацилазной активностью. Дальнейшую очистку ацилазы выполняли с помощью ряда этапов хроматографии:
(1) ионообменной хроматографии на О-сефарозе с быстрым потоком при pH 8. 8;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия на фенилсефарозе;
(3) гельпроникающей хроматографии на колонке сефакрила S200HR.
Очищенную ацилазу иммобилизировали на частицах, состоящих из смеси желатина и хитозана. Частицы обрабатывали глутаральдегидом непосредственно перед добавлением фермента.
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК проводится в реакторе с мешалкой. Сначала в реактор добавляют водный раствор цефалоспорина. Затем температуру раствора доводят до 30oC при постоянном перемешивании и pH фиксируется на 8 с помощью гидроксида калия. Затем добавляется иммобилизированный фермент и превращение начинается. Во время превращения pH в реакторе непрерывно контролируется и поддерживается на 8. 3'-карбоксиметилтиопропионовая кислота, которая выделяется во время реакции, титруется КОН. Количество КОН, которое добавляется, суммируется и регистрируется на записывающем устройстве с плоским стендом. Превращение контролируется путем отбора образцов из реактора, которые анализируются на 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК и 7-АДЦК с помощью ВЭЖХ, как описано в примере 2.
Когда реакция завершена, иммобилизированный фермент удаляется фильтрованием и pH фильтрата доводится до 1, тогда как фильтрат содержит бутилацетат. Слои разделяются, и pH водной фазы, которая содержит 7-АДЦК, доводится до 3. Кристаллическая 7-АДЦК затем отфильтровывается.
Пример 5
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием ацилазы Pseudomonas SE83
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется, как и в примере 4, однако с использованием ацилазы Pseudomonas SE83 в качестве ацилазы с получением того же самого результата.
Ферментативное деацилирование 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3- (карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК с использованием ацилазы Pseudomonas SE83
Превращение 2-(карбоксиэтилтио) ацетил- и 3-(карбоксиметилтио) пропионил-7-АДЦК выполняется, как и в примере 4, однако с использованием ацилазы Pseudomonas SE83 в качестве ацилазы с получением того же самого результата.
Claims (5)
1. Способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) путем а) трансформации штамм Penicillium chrysogenum геном экспандазы под контролем транскрипционных и трансляционных сигнальных последовательностей экспрессии нитчатых грибов; б) выращивания указанного штамма в культуральной среде и добавления в указанную среду N-ацил предшественника боковой цепи или его соли, или эфира, пригодных для образования N-ацил-6-аминопенициллановой кислоты (N-ацил-6-АПК), кольцо которой in situ расширяется с образованием N-ацил-7-АДЦК, в) выделения N-ацил-7-АДЦК из ферментационной среды, г) деацилирования указанной N-ацил-7-АДЦК и д) выделения кристаллической 7-АДЦК, отличающийся тем, что N-ацил предшественник боковой цепи представляет собой 3'-карбоксиметилтиопропионовую кислоту, пригодную для образования 2-(карбоксиэтилтио)ацетил и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-6-АПК, кольцо которой in situ расширяется с образованием 2-(карбоксиэтилтио)ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный штамм Penicillium chrysogenum трансформируется геном экспандазы под контролем транскрипционных и трансляционных сигнальных последовательностей экспрессии ацилтрансферазного гена.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадия (д) является стадией фильтрации.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (в) является стадией фильтрации и с экстрагированием фильтрата жидкой питательной среды органическим растворителем, не смешиваемым с водой при pH ниже примерно 4,5, и обратным экстрагированием тех же веществ водой при pH от 4 до 10.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что ген экспандазы получен из Streptomyces clavuligerus или Nocarlia Lactamdurans.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93202259.3 | 1993-07-30 | ||
| EP93202259 | 1993-07-30 | ||
| EP93203696.5 | 1993-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96104261A RU96104261A (ru) | 1998-05-10 |
| RU2139349C1 true RU2139349C1 (ru) | 1999-10-10 |
Family
ID=8214015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96104261/13A RU2139349C1 (ru) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2139349C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0366354B1 (en) * | 1988-10-24 | 1996-01-03 | Eli Lilly And Company | Purified deacetoxycephalosporin C synthase |
| EP0532341B1 (en) * | 1991-09-11 | 1998-11-04 | Gist-Brocades B.V. | Novel bioprocess for preparing 7-ADCA |
-
1994
- 1994-07-29 RU RU96104261/13A patent/RU2139349C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0366354B1 (en) * | 1988-10-24 | 1996-01-03 | Eli Lilly And Company | Purified deacetoxycephalosporin C synthase |
| EP0532341B1 (en) * | 1991-09-11 | 1998-11-04 | Gist-Brocades B.V. | Novel bioprocess for preparing 7-ADCA |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100336174B1 (ko) | 2-(카르복시에틸티오)아세틸-7-adca및3-(카르복시메틸티오)프로피오닐-7-adca를경유하여7-adca를제조하는효율적인방법 | |
| RU2230790C2 (ru) | Способ расширения 5-членного кольца соединения бета-лактама до 6-членного цефема | |
| EP0711348B1 (en) | Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca | |
| JP2000342289A (ja) | ペニシリン生合成遺伝子の単離法 | |
| US5919680A (en) | Process for the production of SSC's via expandase activity on penicillin G | |
| JP2954601B2 (ja) | 二次代謝産物生産増加のための生合成遺伝子又は制御遺伝子の単離法及び使用法 | |
| RU2139349C1 (ru) | Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк | |
| RU2139350C1 (ru) | Способ эффективного производства 7-адцк через 3-(карбоксиэтилтио)пропионил-7-адцк | |
| EP0716698B1 (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA | |
| EP0444758A1 (en) | Method for modification of ACV synthetase and use of the modified enzyme for production of beta-lactam antibiotics | |
| EP1675946A1 (en) | Process for producing penicillin | |
| JPH09503907A (ja) | ２−（カルボキシエチルチオ）アセチル−７−ａｄｃａ及び３−（カルボキシメチルチオ）プロピオニル−７−ａｄｃａを経由した７−ａｄｃａの効果的な製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050730 |