ES2237840T3

ES2237840T3 - Proceso mejorado para la produccion fermentativa de cefalosporina.

Info

Publication number: ES2237840T3
Application number: ES98925484T
Authority: ES
Inventors: John Krijgsman; Jan Willem Hubert Smeets; Henriette Elisabeth Anna De Braal; Erik De Vroom; Herman Pieter Fasel
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1997-04-22
Filing date: 1998-04-22
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2018-04-22
Also published as: PL330706A1; RO120653B1; RU2203323C2; CN1224470A; US6319684B1; ZA983383B; DE69828940T2; ATE288962T1; JP2000512510A; DE69828940D1; CN1137271C; WO1998048036A1; PT918878E; BR9804855A; EP0918878A1; AU7759298A; TW565612B; EP0918878B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE CEFALOSPORINAS DESACILADAS EN EL GRUPO 7 - AMINO, POR FERMENTACION DE UN MICROORGANISMO PRODUCTOR DE CEFALOSPORINA, EN PRESENCIA DE UN PRECURSOR DE CADENA LATERAL; EXTRACCION DEL COMPUESTO DE CEFALOSPORINA SUSTITUIDO EN N, PRESENTE EN EL CALDO O FLUIDO DE FERMENTACION, PARA OBTENER UN DISOLVENTE ORGANICO; REEXTRACCION DEL COMPUESTO DE CEFALOSPORINA SUSTITUIDA EN N, PARA OBTENER AGUA; TRATAMIENTO DE LA FASE ACUOSA CON UNA DICARBOXILATO ACILASA Y AISLAMIENTO DEL COMPUESTO CRISTALINO DE CAFALOSPORINA, REPRESENTADO POR LA FORMULA (1), A PARTIR DE LA SOLUCION DE CONVERSION. DICHO PROCEDIMIENTO SE CARACTERIZA PORQUE EL CALDO O FLUIDO DE CULTIVO SE INCUBA EN CONDICIONES ACIDAS Y A TEMPERATURA ELEVADA, PREVIAMENTE A LA EXTRACCION DEL COMPUESTO DE CEFALOSPORINA SUSTITUIDO EN N, PARA OBTENER UN DISOLVENTE ORGANICO. SE PUEDE MEJORAR AUN MAS EL PROCESO LAVANDO EL PRIMER EXTRACTO DE DISOLVENTE ORGANICO CON AGUA ACIDIFICADA Y/O POR EXTRACCION DE LA CADENA LATERAL EN UN DISOLVENTE ORGANICO Y/O TRATANDO UNA SOLUCION DE CEFALOSPORINA ACUOSA PRODUCIDA EN UNA DE LAS ETAPAS DE LA INVENCION, CON DIOXIDO DE CARBONO.

Description

Proceso mejorado para la producción fermentativa de cefalosporina.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la recuperación de los compuestos de cefalosporina producidos mediante fermentación.

Las rutas semisintéticas para preparar cefalosporinas comienzan principalmente a partir de productos de fermentación tales como penicilina G, penicilina V y cefalosporina C, los cuales se convierten en los núcleos \beta-lactama correspondientes, por ejemplo de la forma descrita en K. Matsumoto, Bioprocess. Techn., 16, (1993), 67-88, J.G. Shewale & Sivaraman, Process Biochemistry, Agosto 1989, 146-154, T.A. Savidge, Biotechnology of Industrial Antibiotics (Ed. E.J. Vandamme) Marcel Dekker, New York, 1984, o J.G. Shewale y col., Process Biochemistry International, Junio 1990, 97-103. Los núcleos \beta-lactama obtenidos se transforman a continuación en el antibiótico deseado mediante su acoplamiento a una cadena lateral adecuada, tal como se describe, entre otros, en los documentos EP 0 339 751, JP-A-53005185 y CH-A-640 240. Realizando diferentes combinaciones de cadenas laterales y núcleos \beta-lactama se puede obtener una variedad de antibióticos de penicilina y cefalosporina.

Es sabido que los ácidos 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA) y 7-aminocefalosporánico (7-ACA) son los intermedios más importantes para la producción de antibióticos utilizados en la industria farmacéutica.

El 7-ADCA se obtiene, por ejemplo, mediante escisión química o enzimática (desacilación) del fenilacetil-7-
ADCA, produciendo 7-ADCA y ácido fenilacético. El fenilacetil-7-ADCA se sintetiza normalmente mediante tratamiento clínico de sulfóxido de penicilina G, que a su vez se obtiene a partir de penicilina G. En este proceso de producción se requieren grandes cantidades de productos químicos para asegurar que la reacción deseada tenga lugar. Esto es caro y genera una pesada carga en lo referente al tratamiento de los residuos. Además, el rendimiento total del proceso no es tan alto como se desearía.

Para superar algunos de los inconvenientes del proceso químico, se describe un proceso fermentativo para la producción de 7-ADCA y 7-ACA que implica la producción fermentativa de \beta-lactamas N-sustituidas, tales como adipil-7-ADCA o adipil-7-ACA, mediante una cepa de Penicillium chrysogenum recombinante capaz de expresar una ácido desacetoxicefalosporánico sintasa (DAOCS), también conocida como "expandasa", a partir de un transgén (EP 0532 341, EP 0 540 210, WO 93/08287, WO 95/04148, WO 95/04149). La expandasa se encarga de la expansión del anillo de 5 miembros de ciertos ácidos penicilánicos N-acilados, produciendo así los ácidos desacetoxicefalosporánicos N-acilados correspondientes.

Los procesos conocidos para la recuperación de ácidos penicilánicos y cefalosporánicos química o enzimáticamente producidos no son efectivos para la recuperación de los intermediarios \beta-lactama N-sustituidos y las amino-\beta-lactamas desaciladas. El problema principal en la recuperación de los compuestos de cefalosporina N-sustituidos producidos fermentativamente mencionados aquí anteriormente es la complejidad del caldo o del filtrado de cultivo. Normalmente, el caldo comprende diversos ácidos penicilánicos, como ácido \alpha-aminoadipil-6-penicilánico, ácido \alpha-hidroxiadipil-6-penicilánico, ácido 6-aminopencilánico (6-APA), diversos ácidos cefalosporánicos incluyendo \alpha-aminoadipil- y \alpha-hidroxiadipil-7-ADCA y gran cantidad de material proteico. Los procesos de recuperación conocidos no proporcionan una calidad aceptable del producto de ácido cefalosporánico en términos de
pureza.

En la desacilación enzimática, esto conlleva problemas en lo que se refiere a una vida media de la enzima reducida, una velocidad de bioconversión más lenta y más gastos en la recuperación después de la bioconversión y/o niveles de contaminantes inaceptables. Además, después de la desacilación, tales impurezas impiden o al menos obstaculizan la recuperación del compuesto deseado de cefalosporina desacilada con las especificaciones deseadas.

Por tanto, en los procedimientos conocidos, las penicilinas y las cefalosporinas no dan una calidad aceptable al producto final: el producto final, por ejemplo 7-ADCA o 7-ACA, contiene una cantidad inaceptable de componentes de penicilina como impurezas.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un proceso mejorado para la producción de \beta-lactamas desaciladas, por ejemplo 7-ADCA o 7-ACA, a partir de un caldo de fermentación de un microorganismo productor de cefalosporina.

En particular, la presente invención describe un proceso mejorado para la preparación de cefalosporinas de fórmula general (I)

1

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donde:

R_{0}: es hidrógeno o alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono;

Y: es CH_{2}, O, S, o una forma oxidada de azufre; y

R_{1}: es cualquiera de uno de los grupos seleccionados entre H, OH, halógeno, alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono, alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, lineal o ramificado, saturado o insaturado, opcionalmente sustituido o que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, cicloalquilo de 5 a 8 átomos de carbono opcionalmente sustituido y que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos, o bencilo opcionalmente sustituido,

proceso que comprende:

a): la fermentación de un microorganismo productor de cefalosporina en presencia de un precursor de cadena lateral,

b): la extracción del compuesto cefalosporina N-sustituido tal como aparece en el caldo o en el fluido de fermentación con un disolvente orgánico,

c): la retroextracción del compuesto cefalosporina N-sustituido en agua,

d): el tratamiento de la fase acuosa con una dicarboxilato acilasa y

e): el aislamiento mediante cristalización del compuesto de cefalosporina según la fórmula I a partir de la conversión de la solución así obtenida,

caracterizado porque el caldo o fluido de fermentación o el retroextracto se incuba a un pH inferior a 4 y a una temperatura de 60ºC a 140ºC antes de la extracción del caldo o del fluido de fermentación con un disolvente orgánico o antes del procesamiento adicional del retroextracto.

La temperatura de procesado se sitúa, preferentemente, en el rango de 60ºC a 80ºC. El tiempo de permanencia en estas condiciones oscila entre varios días y varios minutos, preferentemente es inferior a 60 minutos, especialmente es de 1 a 30 minutos.

Se consiguen mejoras adicionales de proceso mediante lavado con agua acidificada del primer extracto en disolvente orgánico que contiene el compuesto cefalosporina N-sustituida y/o mediante tratamiento con dióxido de carbono de las soluciones acuosas de cefalosporina producidas en una o más etapas del proceso de la invención y/o mediante extracción en un disolvente orgánico de la cadena lateral enzimáticamente liberada antes de la cristalización de la cefalosporina desacilada.

El proceso según la invención proporcionará un mejor rendimiento total y una mayor calidad del producto que los procesos actualmente conocidos.

En la Publicación de Patente Internacional WO 95/04148 se describe el tratamiento ácido de un compuesto de cefalosporina N-sustituida en el proceso de producción de 7-ADCA. Sin embargo, en esta publicación las condiciones ácidas se aplican a la fase orgánica (durante la retroextracción) más que en la fase acuosa, como es el caso del proceso según la presente invención.

En los nuevos procesos de recuperación, aplicados para obtener un compuesto de cefalosporina desacilada a partir de su contrapartida N-acilada, por ejemplo 7-ADCA a partir de adipil-7-ADCA o 7-ACA a partir de adipil-7-ACA, se describen con más detalle los siguientes pasos.

Se obtiene un caldo de fermentación a partir de cualquier proceso de fermentación adecuado, por ejemplo de una fermentación utilizando una cepa de Penicillium chrysogenum en presencia de un precursor de cadena lateral adecuado, tal como se mencionó anteriormente.

La biomasa se separa del caldo de fermentación mediante cualquier técnica adecuada, como centrifugación o filtración, resultando en un fluido de fermentación que contiene cefalosporina. Preferentemente, se realiza una etapa de filtración para obtener dicha separación. Opcionalmente se lavan los sólidos residuales.

Uno de los obstáculos para la producción de ácido cefalosporánico N-sustituido es la presencia de componentes contaminantes \beta-lactama no deseados, especialmente de ácido 6-aminopencilánico (6-APA), 6-APA N-sustituido o \alpha-aminoadipil-7-ADCA.

En una realización preferente de la invención, las contaminaciones son notablemente reducidas mediante incubación, bajo condiciones ácidas y a una temperatura elevada, de una solución acuosa que contiene el compuesto de cefalosporina N-sustituida producido en cualquier etapa del proceso de la invención. La solución acuosa que contiene compuesto de cefalosporina N-sustituida se acidifica a un pH inferior a 4, preferentemente inferior a 3, utilizando uno o más ácidos conocidos, por ejemplo ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido nítrico o una combinación de los mismos.

El paso de incubación anterior según la invención puede realizarse en el caldo o fluido de fermentación o en el retroextracto acuoso que contiene la cefalosporina N-sustituida. Preferentemente, el paso de incubación se realiza en el caldo o fluido de fermentación. Además, el paso de incubación puede llevarse a cabo bien antes o bien después de la separación de la biomasa. Preferentemente, la incubación se lleva a cabo antes de la filtración para tener una ventaja en ésta.

El compuesto de cefalosporina N-sustituida se separa de la fase acuosa, por ejemplo del caldo o fluido de fermentación, mediante acidificación del caldo o fluido de fermentación y extracción subsecuente del compuesto de cefalosporina N-sustituida en un disolvente orgánico. La acidificación se realiza típicamente a un pH inferior a 4, preferentemente inferior a 3, y únicamente en caso de que el caldo o fluido de fermentación no esté ya sujeto a la incubación anteriormente mencionada bajo condiciones ácidas y a una temperatura elevada. Puede añadirse un antiemulsionante adecuado al caldo o fluido de fermentación para mejorar significativamente la extracción.

Preferentemente, el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo formado por acetato de amilo, acetato de butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutanol o n-butanol.

La extracción con un disolvente orgánico tal como se describe anteriormente no tiene una selectividad satisfactoria hacia los productos \beta-lactama no deseados tales como \alpha-aminoadipil-7-ADCA y 6-APA. Por tanto, en una realización preferente de la invención se lleva a cabo un proceso de lavado para eliminar específicamente estos compuestos. El proceso de lavado se caracteriza porque se mezcla del extracto de disolvente orgánico con una pequeña cantidad de agua acidificada, seguido por una separación de fases. El agua acidificada tiene típicamente un pH que inferior a 4, preferentemente inferior a 3, especialmente inferior a 2. Además, la proporción habitual entre las fases está entre 1:1 y 1:20 (agua:disolvente), siendo preferentemente de 1:2 (agua:disolvente).

El compuesto de cefalosporina N-sustituida es retroextraído en agua según procedimientos convencionales mediante extracción de la fase orgánica con una disolución alcalina, lo que produce un retroextracto acuoso con un pH en el intervalo 6 a 9. Típicamente, se aplica una proporción de fases de 1:10 (agua/disolvente). La disolución alcalina es una disolución acuosa que contiene una base mineral convencional, como NaOH o NH_{3}.

La extracción, lavado y retroextracción se realizan, preferentemente, en una serie de extractores de contacto intensivo continuos, por ejemplo una combinación de un mezclador intensivo, por ejemplo de alta cizalladura, con una separación centrífuga, preferentemente 2 a 8, más preferentemente 3 a 6 y en especial 4 a 5.

Después de la separación de las fases, la fase acuosa es opcionalmente depurada para eliminar el disolvente.

A continuación, la solución acuosa se pone en contacto con una enzima dicarboxilato acilasa adecuada para desacilar los compuestos de cefalosporina N-sustituidos. Por ejemplo, para formar 7-ADCA o 7-ACA a partir de los derivados N-adipilo correspondientes.

Los organismos que se ha encontrado producen dicarboxilato acilasa son especies de Alcaligenes, Arthrobacter, Achromobacter, Aspergillus, Acinetobacter, Bacillus y Pseudomonas. Más en particular, las siguientes especies proporcionan dicarboxilato acilasa muy adecuadas: Achromobacter xylosooxidans, Arthrobacter Viscosis, Arthrobacter CA128, Bacillus CA78, Bacillus megaterium ATCC53667, Bacillus cereus, Bacillus laterosporus J1, Paecilomyces C2106, Pseudomonas diminuta sp N176, Pseudomonas diminuta sp V22, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas diminuta BL072, Pseudomonas cepa C427, Pseudomonas sp SE83, Pseudomonas sp SE495, Pseudomonas ovalis ATCC950, Comamonas sp SY77, Pseudomonas GK 16, Pseudomonas SY-77-1, Pseudomonas sp A14, Pseudomonas vesicularis B965, Pseudomonas syringae, Ps putida ATCC17390, Ps aeroginosa NCTC 10701, Proteus vulgaris ATCC9634, Ps fragi DSM3881 y B. subtilus IFO3025.

La dicarboxilato acilasa puede obtenerse a partir del microorganismo de cual ésta es producida de cualquier forma adecuada, por ejemplo como se describe para la cepa SE83 de Pseudomonas sp en US 4.774.179. También, los genes, por ejemplo para las dicarboxilato acilasas de SE83 o SY77, pueden ser expresados en un huésped adecuado diferente, tal como E. coli como se describe en Matsuda y col., J. Bacteriology, 169, (1987), 5818-5820 para la cepa SE83, y en US 5.457.032 para la cepa SY77.

Las enzimas aisladas de las fuentes anteriores a menudo se denominan glutaril acilasas. No obstante, la especificidad de la cadena lateral de las enzimas no está limitada a la cadena lateral glutarilo, sino que comprende también cadenas laterales dicarboxilo más pequeñas y más grandes. Algunas de las dicarboxilato acilasas también expresan actividad gama-glutamil transpeptidasa y, por ello, algunas veces las clasifica como gama-glutamil transpeptidasas.

La dicarboxilato acilasa puede ser utilizada como enzima libre, pero también en cualquier forma inmovilizada apropiada, por ejemplo como se describe en EP 0 222 462.

En una realización de la invención, el compuesto de cefalosporina desacilada, por ejemplo 7-ADCA o 7-ACA, se aísla a partir de la solución de conversión mediante cristalización en condiciones ácidas. Típicamente, la cristalización de un compuesto de cefalosporina desacilada a partir de una solución acuosa se lleva a cabo ajustando el pH de la solución acuosa a un valor ácido, mediante adición de un titulado a la solución acuosa, hasta que el pH ha alcanzado un valor dentro del intervalo 2,5-4,5, preferentemente un valor de 3 a 4.

En una realización preferente de la invención, la cristalización de un compuesto de cefalosporina desacilada a partir de una solución acuosa se lleva a cabo añadiendo la solución acuosa a un recipiente de cristalización que se mantiene a un pH fijo dentro del rango 2,5-4,5 mediante titulación adecuada.

En una realización aún más preferente de la invención, la citada cristalización se lleva a cabo mediante un ajuste gradual del pH de la solución acuosa hasta un valor final dentro del rango 2,5-4,5 añadiendo la solución acuosa a una serie de recipientes de cristalización interconectados, por ejemplo añadiendo la solución acuosa a un primer recipiente, agregando simultáneamente el contenido del primer recipiente a un segundo, agregando simultáneamente el contenido del segundo recipiente a un tercero, etc., donde el intervalo de pH es aplica a los recipientes interconectados utilizando un titulador adecuado, comenzando a un pH, en el primer recipiente, que se desvía aproximadamente 0,5-2 unidades de pH del pH de la solución acuosa que contiene la cefalosporina desacilada, y terminando a un pH en el recipiente final con un valor dentro del intervalo 2,5-4,5. Convenientemente, el pH de la solución acuosa que contiene la cefalosporina desacilada se ajusta al valor final deseado utilizando una serie de 2 a 6 recipientes interconectados.

Por ejemplo, para conseguir la cristalización de una cefalosporina desacilada a partir de la solución de conversión, puede aplicarse un intervalo de pH que disminuye de 8 a 3 utilizando un titulador, el cual es un ácido, como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y/o ácido nítrico, aplicando una serie de 3 a 4 recipientes interconectados.

Las dos realizaciones preferentes descritas anteriormente se llevan a cabo, especialmente, en modo continuo.

En otra realización preferente de la invención, la cadena lateral, productos coloreados y trazas de compuesto no convertido se eliminan de la solución de conversión antes de la cristalización siguiendo los pasos que se indican a continuación.

La solución de conversión se acidifica y se pone en contacto con un disolvente orgánico, por ejemplo acetato de amilo, acetato de butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutanol o n-butanol, para eliminar la cadena lateral antes de la cristalización. La acidificación se realiza con un ácido como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido nítrico o una combinación de los mismos, preferentemente con ácido sulfúrico, a un pH inferior a 3, preferentemente inferior a 2. Inesperadamente, también se obtiene una alta eficiencia de eliminación de las impurezas coloreadas además de la de la cadena lateral.

Según otra realización preferente de la invención, los componentes de penicilina contaminantes, por ejemplo 6-APA anfótero, como el presente en las soluciones acuosas que contienen cefalosporina producidas en una o más etapas del proceso de la invención, por ejemplo en el caldo o fluido de fermentación, el retroextracto, la solución de conversión o la solución que contiene la cefalosporina desacilada disuelta según la fórmula (I), se reducen notablemente poniendo en contacto el fluido contaminado con penicilina, típicamente a un pH de 5 a 7, con dióxido de carbono. El dióxido de carbono puede agregarse a la solución de cualquier forma adecuada, por ejemplo en forma sólida o gaseosa o como solución de iones carbonato. La solución acuosa que contiene cefalosporina se pone en contacto con la fuente de CO_{2} a una temperatura de 10ºC a 60ºC, preferentemente de 20ºC a 40ºC, donde dicha solución se satura con CO_{2} molecular durante 4 a 10 horas. Después de reducción de los componentes de penicilina, puede llegarse a la purificación de los compuestos de cefalosporina según la fórmula (I).

Después de la extracción de la cadena lateral en un disolvente orgánico, el compuesto de cefalosporina desacilada puede cristalizarse a partir de la fase acuosa de varias maneras, por ejemplo como se ha indicado anteriormente para la cristalización de un compuesto de cefalosporina desacilada a partir de una solución acuosa.

En un modo preferente de operación, el pH de la fase acuosa es incrementado hasta un pH que dentro del intervalo de 2,5-5, preferentemente dentro del rango de 3,5-4,5, mediante adición de la solución que contiene el compuesto de cefalosporina desacilada, en un paso, a un recipiente de cristalización que se ha mantenido al pH deseado o a una serie de 2 a 6 recipientes de cristalización interconectados aplicando un intervalo de pH incremental. Estos procesos pueden llevarse a cabo convenientemente llevados en modo continuo.

Los cristales se aíslan mediante filtración o centrifugación y se secan en un secador continuo convencional o por lotes.

Todos los pasos anteriormente mencionados, es decir extracción, lavado, retroextracción y cristalización, pueden llevarse a cabo en modo continuo o por lotes, pero debido a razones de estabilidad, el método preferente es en modo continuo.

El siguiente ejemplo es únicamente ilustrativo y no debe ser considerado como una limitación de ningún tipo.

Ejemplo

Una muestra de 1 l de caldo de adipil-7-ADCA se filtró para eliminar la biomasa. El micelio se lavó con agua del grifo para obtener un volumen final del filtrado de aproximadamente 2 l.

Aproximadamente 2 l del filtrado se acidificaron a 40ºC con 250 ml de H_{2}SO_{4} 6 N hasta pH 1,5. Se agregó N-butanol a 2/3 del volumen del filtrado acidificado y, después de mezclar vigorosamente, se separó. La fase acuosa se sometió a 2 o más de estos tratamientos con n-butanol. A continuación, las fases orgánicas combinadas se lavaron con partes de 0,25 l de agua acidificada a pH 2. La fase orgánica resultante se retroextrajo con 245 ml de una disolución de hidróxido de sodio 2 N a 20ºC y después de la separación de fases se eliminaron las trazas de n-butanol de la fase acuosa mediante depuración a vacío.

Se diluyeron 135 g de fase acuosa con agua desmineralizada hasta un total de 650 ml, a 30ºC, y se mezcló con hidróxido de sodio 4 N hasta que se alcanzó un pH de 8,5. Se agregaron 50 g de la enzima de desacilación inmovilizada y, después de 2 horas a 30ºC, pH 8,5, y bajo adición de 13,5 ml de hidróxido de sodio 4 N, se recogió la fase acuosa. El filtrado se extrajo con 3 partes de 125 ml de agua saturada con n-butanol un pH 0,4. Durante la extracción se agregaron en total 50,6 ml de ácido clorhídrico al 37%. La fase acuosa remanente se neutralizó con 56,5 ml de hidróxido de sodio 8 N y el producto se cristalizó a partir de la fase acuosa, libre de gotas de n-butanol, al disminuir el pH hasta 5,3 con ácido sulfúrico 6 N. Después de 5 minutos, el pH se disminuyó adicionalmente hasta un valor final de 3,5. En total se utilizaron 15 ml de ácido. La suspensión espesa se filtró y la masa cristalina se lavó con 50 ml de agua, se secó y se obtuvieron 4,1 g de 7-ADCA con una pureza del 96%.

Claims

1. Proceso para la preparación de una cefalosporina de fórmula general (I)

2

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donde:

R_{0}: es hidrógeno o alcoxi de 1 a 3 átomos de carbono;

Y: es CH_{2}, O, S, o una forma oxidada de azufre; y

proceso que comprende:

c): la retroextracción del compuesto cefalosporina N-sustituido en agua,

d): el tratamiento de la fase acuosa con una dicarboxilato acilasa y

caracterizado porque el caldo o fluido de fermentación o el retroextracto se incuba a un pH inferior a 4 y a una temperatura de 60ºC a 140ºC antes de la extracción del caldo o del fluido de fermentación con un disolvente orgánico o antes del procesamiento adicional del retroextracto.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el caldo o fluido de fermentación o el retroextracto se incuba a una temperatura en el intervalo de 60ºC a 80ºC.

3. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el caldo o fluido de fermentación o el retroextracto se incuba a un pH inferior a 3.

4. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el tiempo de incubación a un pH inferior a 4 es menor de 60 minutos.

5. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado además porque el extracto de disolvente orgánico que contiene el compuesto de cefalosporina N-sustituida se lava con agua acidificada que tiene un pH inferior a 4 antes de la retroextracción.

6. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado además porque el extracto de disolvente orgánico que contiene el compuesto de cefalosporina N-sustituida se lava con agua acidificada que tiene un pH inferior a 3.

7. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado además porque el extracto de disolvente orgánico que contiene el compuesto de cefalosporina N-sustituida se lava con agua acidificada que tiene un pH inferior a 2.

8. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena lateral tal como está presente en la solución de conversión se extrae con un disolvente orgánico antes de la cristalización del compuesto de cefalosporina según fórmula (I).

9. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado además porque una solución acuosa que contiene cefalosporina en una o más etapas, seleccionada de entre el grupo formado por el en caldo de fermentación, el fluido de fermentación, el retroextracto, la solución de conversión y la solución que contiene disuelto el compuesto de cefalosporina según la fórmula (I), se pone en contacto con dióxido de carbono.

10. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el dióxido de carbono está en forma sólida o gaseosa, o como una disolución de iones carbonato.

11. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo formado por acetato de amilo, acetato de butilo, acetato de etilo, metil isobutil cetona, ciclohexanona, isobutanol y n-butanol.

12. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque la cristalización del compuesto de cefalosporina según la fórmula (I) a partir de la solución de conversión o de la fase acuosa se realiza mediante adición de la solución o de la fase acuosa a un recipiente de cristalización que se mantiene a un pH fijo que tiene un valor dentro de un intervalo de 2,5-4,5, utilizando un titulador adecuado.

13. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque la cristalización del compuesto de cefalosporina según la fórmula (I) a partir de la solución de conversión o de la fase acuosa se realiza mediante adición de la solución o fase acuosa a una serie de recipientes de cristalización interconectados mientras que se aplica un intervalo de pH utilizando un titulador adecuado, comenzando a un pH en el primer recipiente que se desvía aproximadamente de 0,5-2 unidades de pH del pH de la solución de 6-APA y terminando a un pH en el recipiente final que tiene un valor dentro de un intervalo de 2,5-4,5.