NO20120398L

NO20120398L - Humane monoklonale antistoff mot CTLA-4

Info

Publication number: NO20120398L
Application number: NO20120398A
Authority: NO
Inventors: Jose Ramon Corvalan; Douglas Charles Hanson; Mark Joseph Neveu; Eileen Elliott Mueller; Jeffrey Herbert Hanke; Steven Christopher Gilman; C Geoffrey Davis
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2001-08-23
Also published as: MXPA01006422A; HRP20010551A2; HRP20010551B1; IS8950A; CY1121451T1; NO20013147L; EE200100336A; GEP20053594B; HRP20130077A2; IL143797A; PL214003B1; ATE458008T1; JP3793693B2; CN1328571A; HU229566B1; ES2706547T3; CA2356215A1; IL143797A0; CZ302706B6; BG105722A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår humane monoklonale antistoffer mot humant cytotoksisk T-lymfocytt antigen 4 (CTLA-4), hvilket monoklonale antistoff omfatter de trekk som går frem av krav 1. Nukleotidsekvenser som koder for og aminosyresekvenser omfattende tunge og lette kjeder av immunoglobulinmolekyler, spesielt tilstøtende tunge- og lette kjede sekvenser som spenner over de komplementaritetsbestemmende områder (CDRer), spesifikt fra innen FRI og/eller CDR1 t.o.m. CDR3 og/eller innen FR4 er tilveiebragt. Videre tilveiebringes fremgangsmåte for fremstilling av slikt antistoff som angitt i krav 11, farmasøytiske sammensetninger omfattende slike antistoffer som angitt i krav 13. Cellelinjer som danner de aktuelle antistoffene som angitt i krav 14, nukleinsyre som koder for antistoffene som angitt i krav 15 og anvendelse av antistoffene som angitt i krav 18-22.

Teknologiens bakgrunn

Regulering av immunrespons hos pasienter ville kunne gi en ønsket behandling av mange menneskesykdommer, som kunne føre til en virkningsspesifisitet som sjelden finnes ved bruk av konvensjonelle legemidler. Både oppregulering og nedregulering av immunsystemets respons ville være mulig. T- og B-cellers roller er blitt utførlig undersøkt ogkarakteriserti forbindelse med reguleringen av immunrespons. Basert på disse undersøkelser kan det synes som om T-cellenes rolle i mange tilfeller er spesielt viktig når det gjelder forebygging og behandling av sykdom.

T-celler har meget komplekse systemer for å styre vekselvirkningene seg i mellom. Vekselvirkninger mellom T-celler bruker et stort antall reseptorer og løselige faktorer for prosessen. Derfor er den effekt som ethvert bestemt signal kan ha på immunresponsen, generelt varierende og avhengig av de spesielle faktorer, reseptorer og motreseptorer som er forbundet med veien. Veiene for nedregulering av responser er like viktig som de som kreves for aktivering. Thymisk læring som fører til T-celletoleranse er én mekanisme for å forhindre en immunrespons på et bestemt antigen. Andre mekanismer som for eksempel sekresjon av suppressive cytokiner, er også kjent.

Aktivering av T-celler krever ikke bare stimulering gjennom antigenreseptoren (T-cellereseptor (TCR)), men ytterligere signalisering gjennom kostimulerende overflatemolekyler som f.eks. CD28. Ligandene for CD28 er B7-1(CD80) og B7-2 (CD86)-proteinene, som uttrykkes på antigenpresenterende celler som f.eks. dendrittiske celler, aktiverte B-celler eller monocytter som vekselvirker med T-celle CD28 eller CTLA-4 for å levere et kostimulerende signal. Den kostimulerende signaliseringens funksjon ble undersøkt i eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) av Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995). EAE er en autoimmun forstyrrelse indusert ved hjelp av Thl-celler rettet mot myelinantigener, som gir en in wVo-modell for undersøkelse av hvilken rolle B7-mediert kostimulering har i induksjon av en patologisk immunrespons. Ved å bruke en løselig fusjons-proteinligand for B7-reseptorene i tillegg til monoklonale antistoffer som er spesifikke for enten CD80 eller CD86, viste Perrin et al. at B7-kostimulering spiller en fremtredende rolle når det gjelder å avgjøre klinisk sykdomsutfall i EAE.

Vekselvirkningen mellom B7 og CD28 er én av flere kostimulerende signalveier som synes å være tilstrekkelige til å utløse modningen og proliferasjonen av

antigenspesifikke T-celler. Mangel på kostimulering, og den ledsagende mangelfulle produksjon av IL-2, forhindrer etterfølgende proliferasjon av T-cellen og forårsaker en ikke-reaktiv tilstand kalt "anergi". Et mangfold av virus og tumorer kan blokkere aktivering og proliferasjon av T-celler, noe som fører til utilstrekkelig aktivitet eller ikke-reaktivitet i vertens immunsystem mot de infiserte eller transformerte celler. Blant mange mulige T-celleforstyrrelser kan anergi i det minste delvis være årsak til at verten ikke klarer bli kvitt de patogene eller tumorgene celler.

Bruk av B7-proteinet for å mediere anti-tumor immunitet blir beskrevet i Chen et al. Cell 71:1093-1102 (1992) og Townsend og Allison Science 259:368 (1993). Schwartz Cell 71:1065 (1992) vurderer rollen til CD28, CTLA-4 og B7 i produksjon av IL-2 og immunterapi. Harding et al. Nature 356:607-609 (1994) viser at CD28-mediert signalisering costimulerer murine T-celler og forhindrer induksjon av anergi i T-cellekloner. Se også U.S. patenter nr. 5 434 131, 5 770 197 og 5 773 253, og internasjonale patentsøknader nr. WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 og WO 95/33770.

Basert på ovennevnte var det tydelig at T-celler krevet to typer signaler fra den antigenpresenterende celle (APC) for aktivering og påfølgende differensiering til effektorfunksjon. Først genereres et antigenspesifikt signal gjennom vekselvirkninger mellom TCR'en på T-cellen og MHC-molekyler som presenterer peptider på APCen. Deretter medieres et antigenuavhengig signal gjennom vekselvirkningen mellom CD28 og medlemmer av B7-familien (B7-1 (CD80) eller B7-2(CD86)). Nøyaktig hvor CTLA-4 passer inn i immunresponsmiljøet var til å begynne med uklart. Murint CTLA-4 ble først identifisert og klonet av Brunet et al. Nature 328:267-270 (1987) som en del av en søken etter molekyler som fortrinnsvis uttrykkes på cytotoksiske T-lymfocytter. Humant CTLA-4 ble kort tid etter identifisert og klonet av Dariavach et al. Eur 3 Immunol. 18:1901-1905

(1988). De murine og humane CTLA-4-molekyler har ca. 76% samlet sek-venshomologi og nærmer seg fullstendig sekvensidentitet i sine cytoplasmiske områder (Dariavach et al. Eur J Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4 er et medlem i immunoglobulinets (lg) superfamilie av proteiner. Ig-superfamilien er en gruppe proteiner som deler strukturelle nøkkeltrekk enten i et variabelt (V) eller konstant (C) Ig-molekylområde. Medlemmer i Ig-superfamilien inkluderer, men begrenser seg ikke til selve immunoglobulinene, større histokompatibili-tetskompleks(MHC)-klasse molekyler (dvs. MHC klasse I og II) og TCR-molekyler.

I 1991 foreslo Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991) at CTLA-4 var en andre reseptor for B7. Harper et al. J Immunol 147:1037-44 (1991) viste på lignende vis at CTLA-4- og CD28-molekylene er nært beslektet både hos mus og mennesker, både når det gjelder sekvens, meddelerekspresjon, genstruktur og kromosom-lokalitet. Se også Balzano et al. IntJ Cancer Suppl 7:28-32 (1992). Ytterligere bevis for denne rollen kom som et resultat av funksjonsstudier. For eksempel viste Lenschow et al. Science 257:789-792 (1992) at CTLA-4-Ig induserte langtidsoverlevelse av implanterte langerhanske øyer. Freeman et al. Science 262: 907-909 (1993) undersøkte funksjonen av CTLA-4 hos mus som mangler B7. Undersøkelse av ligandene for CTLA-4 beskrives i Lenschow et al. P. N. A. S. 90:11054-11058 (1993). Linsley et al. Science 257:792-795 (1992) beskriver immunosuppresjon in vivo ved hjelp av en løselig form for CTLA-4. Linsley et al. 3 Exp Med 176:1595-604 (1992) fremstilte antistoffer som bandt CTLA-4, og som ikke var kryss-reaktive med CD28, og konkluderte at CTLA-4 uttrykkes sammen med CD28 på aktiverte T-lymfocytter og sammen regulerer de T-celleadhesjon og aktivering med B7. Kuchroo et al. Cell 80:707-18 (1995) viste at de kostimulerende molekyler B7-1 og B7-2 differensialaktiverte Thl/Th2-utviklingsveiene. Yiqun et al. Int Immunol 8:37-44 (1996) viste at det er forskjellige krav til kostimulerende signaler fra medlemmer av B7-familien hos hvilende versus nylig aktiverte hukommelses-T-celler mot løselige gjenkjente antigener. Se også de Boer et al. Eur J Immunol 23:3120-5 (1993).

Flere grupper foreslo alternative eller forskjellige reseptor/ligand-vekselvirkninger for CTLA-4 i forhold til CD28, og foreslo til og med et tredje B7-kompleks som ble gjenkjent av et BBl-antistoff. Se for eksempel Hathcock et al. Science 262:905-7

(1993), Freeman et al. Science 262:907-9 (1993), Freeman et al. J Exp Med 178:2185-92 (1993), Lenschow et al. Proe Nati Acad Sei U S A 90:11054-8 (1993), Razi-Wolf et al. Proe Nati Acad Sei USA 90:11182-6 (1993) og Boussiotis et al. Proe Nati Acad Sei USA 90:11059-63 (1993). Men se Freeman et al. 3 Immunol 161:2708-15 (1998), som drøfter funn som viser at BBl-antistoff binder et molekyl som er identisk med celleoverflateformen til CD74, og derfor binder BB1 mAb seg til et protein som er forskjellig fra B7-1, og denne epitop er også tilstede på B7-1-proteinet. Derfor krevde denne observasjon at området måtte revurdere undersøkelser som benyttet BB1 mAb i analysen av CD80-ekspresjon og -funksjon.

Med start i 1993 og kulminasjon i 1995, begynte forskere å videre skissere opp CTLA-4's rolle i stimulering av T-celler. Først fremskaffet Walunas et al. Immunity 1:405-13 (1994), ved bruk av monoklonale antistoffer mot CTLA-4, bevis for at CTLA-4 kan fungere som en negativ regulator for aktivering av T-celler. Deretter viste Waterhouse et al. Science 270:985-988 (1995) at mus som manglet CTLA-4 akkumulerte T-celleblaster med oppregulerte aktiveringsmarkører i lymfekjertler og milt. Blastcellene infiltrerte også lever-, hjerte-, lunge- og bukspyttkjertel vev, og mengder av serum immunoglobulin ble forhøyet og deres T-celler vokste spontant og kraftig ved stimulering gjennom T-cellereseptoren; imidlertid var de følsomme overfor celledød forårsaket av kryssbinding av Fas-reseptoren og av gammastråling. Waterhouse et al. konkluderte at CTLA-4 virker som en negativ regulator for aktivering av T-celler og er vital for kontrollen av lymfocytthomeostase. I en kommentar i samme utgave drøfter Allison og Krummel Science 270:932-933 (1995) arbeidet til Waterhouse et al. som bevis for at CTLA-4 virker slik at det nedregulerer T-cellenes reaksjonsfølsomhet eller har en hemmende signaliseringsrolle i aktivering og utvikling av T-celler. Tivol et al. Immunity 3:541-7 (1995) utviklet også CTLA-4-manglende mus og viste at slike mus raskt utvikler lymfoproliferativ sykdom med multiorgan lymfocyttinfiltrasjon og vevsødeleggelse, med spesielt alvorlig myokardittog pankreatitt. De konkluderte med at CTLA-4 spiller en nøkkelrolle når det gjelder å nedregulere aktivering av T-celler og opprettholde immunologisk homeostase. Krummer og Allison 3 Exp Med 182:459-65 (1995) presiserte også videre at CD28 og CTLA-4 har motsatt virkning av hverandre på T-cellenes respons på stimulering. De utviklet et antistoff mot CTLA-4 og undersøkte effekten av dettes binding til CTLA-4 i et system med meget rene T-celler. I rapporten viste de at nærværet av små mengder B7-2 på nylig eksplanterte T-celler delvis kan hemme T-cellers proliferasjon, og denne hemmingen ble mediert av vekselvirkninger med CTLA-4. Kryssbinding av CTLA-4 med TCR og CD28 virker sterkt hemmende på proliferasjon og IL-2-sekresjon av T-celler. Til slutt viste resultatene at CD28 og CTLA-4 gir motsatte signaler som synes å bli integrert av T-cellen for å bestemme reaksjonen til antigen. Således konkluderte de med at utfallet av T-celle antigen reseptorstimulering reguleres ved CD28-costimulerende signaler, og også hemmende signaler avledet fra CTLA-4. Se også Krummel et al. Int Immunol 8:519-23 (1996) og U.S. patent nr. 5 811 097 og internasjonal patentsøknad nr. WO 97/20574.

Internasjonal patentpublikasjon WO 98/42752 beskriver peptider innbefattende antistoff, som binder til CTLA-4. Her spekuleres det over om slike peptider kan benyttes for å ko-stimulere T-celle-proliferasjon.

En mengde andre eksperimenter er blitt utført, som kaster ytterligere lys over den ovennevnte funksjon hos CTLA-4. For eksempel foreslo Walunas et al. J Exp Med 183:2541-50 (1996), gjennom bruken av anti-CTLA-4-antistoff, at CTLA-4-signalisering ikke regulerer celleoverlevelse eller reaksjonsfølsomhet overfor IL-2, men hemmer CD28-avhengig IL-2-produksjon. Perrin et al. 3 Immunol 157:1333-6

(1996) viste også at anti-CTLA-4-antistoff i eksperimentell allergisk encefamyelitt (EAE) forverret sykdommen og økte dødeligheten. Sykdomsforverring ble forbundet med økt produksjon av de encefalitogene cytokiner TNF-alfa, IFN-gamma og IL-2. Dermed konkluderte de at CTLA-4 regulerer intensiteten av autoimmunresponsen i EAE, hvor det svekker produksjonen av betennelsescytokiner og kliniske sykdomsutslag. Se også Hurwitz et al. J Neuroimmunol 73:57-62 (1997) og Cepero et al. J Exp Med 188:199-204 (1998) (et anti-CTLA-4 hårnålsribosym som spesielt opphever CTLA-4 ekspresjon etter genoverføring inn i en murin T-cellemodell).

I tillegg vurderte Blair et al. J Immunol 160:12-5 (1998) de funksjonelle virkninger av en liste med CTLA-4 monoklonale antistoffer (mAb'er) på hvilende humane CD4+ T-celler. Deres resultater viste at enkelte CTLA-4 mAb'er kunne hemme proliferative responser hos hvilende CD4+-celler og cellesyklusovergang fra G0 til Gl. De hemmende virkninger av CTLA-4 viste seg innen 4 timer, på et tidspunkt hvor ekspresjon av CTLA-4 på celleoverflaten forble udetekterbar. Andre CTLA-4 mAb'er hadde imidlertid ingen detekterbar hemmende virkning, noe som tydet på at binding av mAb'er til CTLA-4 alene ikke var tilstrekkelig til å mediere nedregulering av T-celleresponser. Det som er interessant, er at mens produksjonen av IL-2 var koplet ut, tillot hemmende anti-CTLA-4 mAb'er induksjon og ekspresjon av celleoverlevelsesgenet bcl-X(L). I samsvar med denne observasjon forble celler levedyktige, og apoptose ble ikke påvist etter CTLA-4-ligasjon.

Nar det gjelder anergi, viste Perez et al. Immunity 6:411-7 (1997) at induksjonen av T-celle-anergi ble forhindret ved å blokkere CTLA-4, og konkluderte med at resultatet av antigen-gjenkjennelse ved T-celler bestemmes av vekselvirkningen mellom CD28 eller CTLA-4 på T-cellene med B7-molekyler. I tillegg undersøkte Van Parijs et al. J Exp Med 186: 1119-28 (1997) den rolle som spilles av interleukin 12 og costimulatorer i T-celle-anergi in vivo, og fant at ved å hemme CTLA-4-engasjement under anergiinduksjon, ble T-celle proliferasjon blokkert, og full Thl-differensiering ble ikke fremmet. Imidlertid ble T-celler eksponert for tolerogene antigener i nærvær av både IL-12 og anti-CTLA-4-antistoff ikke anergisert, og oppførte seg på samme vis som T-celler som har støtt på immunogene antigener. Disse resultater antydet at to prosesser bidrar til induksjonen av anergi in vivo: CTLA-4-engasjement, som fører til en blokkering av T-cellenes evne til proliferasjon, og fravær av en prototypisk inflammatorisk cytokin, IL-12, som forhindrer differensiering av T-celler til Thl effektorceller. Kombinasjonen av IL-12 og anti-CTLA-4-antistoff var tilstrekkelig til å omdanne en normalt tolerogen stimulus til en immunogen stimulus.

Når det gjelder infeksjoner, viste McCoy et al. J Exp Med 186:183-7 (1997) at anti-CTLA-4-antistoff i stor grad økte og akselererte T-cellenes immunrespons på Nippostrongylus brasiliensis, noe som førte til en stor reduksjon i antallet voksne ormer og en tidlig stopp i produksjonen av parasittegg. Se også Murphy et al. J Immunol. 161:4153-4160 81998) { Leishmania donovani)

Når det gjelder kreft, etablerte Kwon et al. PNAS USA 94:8099-103 (1997) en

synergetisk murin prostata kreftmodell og undersøkte to forskjellige manipuleringer med den hensikt å utløse en anti-prostata kreftreaksjon gjennom økt kostimulering av T-celler: (i) anordning av direkte kostimulering ved hjelp av prostata kreftceller som er transdusert for å uttrykke B7.1-liganden og (ii) in vivo antistoffmediert blokkering av T-celle-CTLA-4, som forhindrer nedregulering av T-celler. Det ble demonstrert at in vivo antistoffmediert blokkering av CTLA-4 forsterket anti-prostata kreft-immunresponsen. I tillegg undersøkte Yang et al. Cancer Res 57:4036-41 (1997) om blokkering av CTLA-4-funksjonen fører til forsterkning av antitumor T-celle responser på ulike stadier av tumorens vekst. Basert på in vitro- og in vivo-resultater fant de at CTLA-4-blokkering hos tumorbærende individer økte evnen til å generere antitumorresponser i T-cellene, men uttrykket av en slik for-bedringseffekt var i deres modell begrenset til tidlige stadier i tumorens vekst. Videre undersøkte Hurwitz et al. Proe Nati Acad Sei USA 95:10067-71 (1998) om generering av en T-cellemediert antitumorrespons avhenger av T-celle-

reseptorengasjement med større histokompatibilitetkompleks/ antigen i tillegg til CD28-ligasjon av B7. Enkelte tumorer, som foreksempel SMI brystkarsinomet, var refraktært mot anti-CTLA-4-immunoterapi. Således ble det, gjennom bruk av en kombinasjon av CTLA-4-blokkering og en vaksine bestående av SMI celler som uttrykker granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktorer, observert regresjon av SMl-mortumorer til tross for at behandlingene hver for seg var virkningsløse. Denne kombinasjonsterapi resulterte i langtidsimmunitet mot SMI, og var avhengig både av CD4(+) og CD8(+) T-celler. Funnene tydet på at CTLA-4-blokkering virker som en vertsderivert antigenpresenterende celle.

Når det gjelder diabetes, injiserte Luhder et al. 3 Exp Med 187:427-32 (1998) et anti-CTLA-4 mAb i en TCR-transgen musemodell av diabetes på ulike stadier av sykdommen. De fant at engasjement med CTLA-4 på det tidspunkt hvor potensielt diabetogene T-celler først aktiveres, er et vendepunkt. Dersom dette engasjement tillates, finner det sted en invasjon av øyene, men denne er ganske ufarlig i månedsvis. Dersom den ikke tillates, er insulinitt mye mer aggressiv, og diabetes følger raskt.

Når det gjelder immunisering gjennom vaksine, fant Horspool et al. 3 Immunol 160:2706-14 (1998) at intakt anti-CTLA-4 mAb, men ikke Fab-fragmenter, supprimerte den primære humorale respons på pCIA/beta gal uten å innvirke på hukommelsesresponser, noe som tydet på at aktivering av CTLA-4 hemmet produksjonen av Ab, men ikke priming av T-celler. Blokkering av ligandene for CD28 og CTLA-4, CD80 (B7-1) og CD86 avslørte tydelig og ikke-overlappende funksjon. Blokkering av CD80 ved første immunisering opphevet helt primære og sekundære Ab-responser, mens blokkering av CD86 supprimerte primære, men ikke sekundære responser. Samtidig blokkering av CD80 + CD86 var mindre effektiv når det gjaldt å undertrykke Ab-responser enn hver av dem alene. Økning av costimulering via coinjeksjon av plasmider som uttrykker B7, økte CTL-responser, men ikke Ab-responser, og uten bevis for forskyvning fra Thl til Th2. Disse funnene antyder komplekse og tydelige roller for CD28, CTLA-4, CD80 og CD86 i costimulering av T-celler etter nukleinsyrevaksinasjon.

Når det gjelder allograftavvisning, fant Markees et al. 3 Clin Invest 101:2446-55

(1998), i en musemodell av hud- allograftavvisning, at aksept til å begynne med var avhengig av tilstedeværelsen av IFN-gamma, CTLA-4 og CD4(+) T-celler. Tilføring av anti-CTLA-4 eller anti-IFN-gamma mAb til protokollen ble forbundet med omgående graftavvisning, mens anti-IL-4 mAb ikke hadde noen virkning. Når det gjelder CTLA-4's rolle i forhold til CD28, utviklet Fallarino et al. J Exp Med 188:205-10 (1998) TC R transgene/rekombinase-aktiverende gen 2-manglende/CD28 vill type eller CD28-manglende mus som ble immunisert med en tumor som uttrykte antigener. Forhåndsaktiverte T-celler fra begge musetypene produserte cytokiner og vokste som en respons på stimulatorceller som manglet uttrykk for B7, mens responsen til CD28+/+ T-cellene ble forsterket av kostimulering med B7-1, ble imidlertid responsen til CD287- T-cellene sterkt hemmet. Denne hemmingen ble reversert ved hjelp av monoklonalt antistoff mot B7-1 eller CTLA-4. Således kan CTLA-4 hemme aktivering av T-celler kraftig i fravær av CD28, noe som tyder på at antagonismen til et TCR-mediert signal er tilstrekkelig til å forklare CTLA-4's hemmende effekt. Lin et al. J Exp Med 188:199-204 (1998) undersøkte også hjerte-allograftavvisning hos CD28-manglende mus. H-2(q)-hjerter ble transplantert inn i allogene vill-type mus eller mus med CD28-mangel (H-2(b)). Graftavvisning opptrådte senere hos mus med CD28-mangel enn hos vill-type mus. Behandling av vill-type mottakere med CTLA-4-immunoglobulin (lg) eller med anti-B7-l og anti-B7-2 mAb'er ga en betydelig forlengelse av allograft-overlevelse. I motsetning til dette induserte behandling av CD-28 manglende mus med CTLA-4-Ig, anti-B7-l og anti-B7-2 mAb'er, eller en blokkerende anti-CTLA-4 mAb, allograftavvisningen. Denne økte graftavvisningen ble forbundet med mer alvorlig mononukleær celleinfiltrasjon og økte nivåer av IFN-gamma og IL-6-transkripter i donorhjerter hos ubehandlede vill-type og CTLA-4-Ig- eller anti-CTLA-4 mAb-behandlede mus med CD28-mangel. Således går CTLA-4's anti-regulerende rolle utover dettes potensielle evne til å forhindre CD28-aktivering gjennom ligandkonkurranse. Selv ved fravær av CD28 har CTLA-4 en hemmende funksjon i regulering av allograftavvisning.

Ytterligere karakterisering av ekspresjonen for CTLA-4 er også blitt utført. For eksempel foreslo Alegre et al. J Immunol 157:4762-70 (1996) at overflate-CTLA-4 raskt interniseres, noe som kan forklare de lave ekspresjonsnivåer som i alminnelighet påvises på celleoverflaten. De konkluderte med at både CD28 og IL-2 spiller viktige roller i oppreguleringen av CTLA-4-ekspresjon. I tillegg syntes akkumuleringen av CTLA-4 på celleoverflaten primært å være regulert ved hjelp av dennes raske endocytose. Castan et al. Immunology 90:265-71 (1997) foreslo i tillegg, på grunnlag av in situ immunhistologiske analyser av ekspresjonen av CTLA-4, at germinal senter-T-celler, som var CTLA-4-positive, kunne være viktige for immunregulering.

Følgelig ville det, i lys av den store nøkkelrolle som CTLA-4 synes å ha innenfor immunrespons, være ønskelig å utvikle antistoffer mot CTLA-4 som kan brukes effektivt i immunterapi. Videre ville det være ønskelig å utvikle antistoffer mot CTLA-4 som kan brukes ved kronisk sykdom der det er nødvendig å administrere antistoffene gjentatte ganger.

Kort beskrivelse av tegninqsfigurene

Figur 1 gir en rekke nukleotid- og aminosyresekvenser av immunoglobulinmolekyler med tunge kjeder og kappa lette kjeder i henhold til oppfinnelsen: 4.1.1 (figur IA), 4.8.1 (Figur IB), 4.14.3 (Figur 1C), 6.1.1 (Figur ID), 3.1.1 (Figur 1E), 4.10.2 (Figur 1F), 2.1.3 (Figur 1G), 4.13.1 (Figur 1H), 11.2.1 (Figur II), 11.6.1 (Figur 1J), 11.7.1 (Figur IK), 12.3.1.1. (Figur IL) og 12.9.1.1 (Figur IM). Figur 2 gir en oppstilling av sekvenser mellom de beregnede tungkjede aminosyresekvenser fra klonene 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1 og arvelighetslinje (germline) DP-50 (3-33)- aminosyresekvensen. Forskjeller mellom DP-50 arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonene er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som skyggelagt. Figur 3 gir en oppstilling av sekvenser mellom den beregnede tungkjede aminosyresekvens i klon 2.1.3 og arvelighetslinje-DP-65-aminosyresekvensen. Forskjeller mellom DP-65-arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonen er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som understreket. Figur 4 gir en oppstilling av sekvenser mellom den beregnede kappa-lettkjede aminosyresekvens i kloner 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 og 4.13.1 og arvelighetslinje-A27-aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A27-arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonen er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som understreket. Forekommende slettinger i CDRl'ere hos kloner 4.8.1, 4.14.3 og 6.1.1 er vist med "0'er". Figur 5 giren oppstilling av sekvenser mellom den beregnede kappa-lettkjede aminosyresekvens i kloner 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 og 11.7.1 og arvelighetslinje-012-aminosyresekvensen. Forskjeller mellom 012-arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonen er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som understreket. Figur 6 gir en oppstilling av sekvenser mellom den beregnede kappa-lettkjede aminosyresekvens i klonen 2.1.3 og arvelighetslinje-A10/A26-aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A10/A26-arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonen er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som understreket. Figur 7 gir en oppstilling av sekvenser mellom den beregnede kappa-lettkjede aminosyresekvens i klonen 12.3.1 og arvelighetslinje-A17-aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A17-arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonen er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som understreket. Figur 8 gir en oppstilling av sekvenser mellom den beregnede kappa-lettkjede aminosyresekvens i klonen 12.9.1 og arvelighetslinje-A3/A19-aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A3/A19-arvelighetslinje-sekvensen og sekvensen i klonen er vist med uthevet skrift. Figuren viser også posisjonene for CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvenser i antistoffet som understreket. Figur 9 gir en oppsummering av N-terminale aminosyresekvenser generert gjennom direkte proteinsekvensering av de tunge og lette kjeder i antistoffene. Figur 10 gir en del ekstra karakteriserende informasjon om enkelte av antistoffene i henhold til oppfinnelsen. Figur 10A oppsummerer data vedrørende kloner 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 og 6.1.1. Det oppgis data som vedrører konsentrasjon, isoelektrisk fokusering (IEF), SDS-PAGE, størrelsesutelukkende kromatografi, væskekromatografi/massespektroskopi (LCMS), massespektroskopi (MALDI) og lettkjede N-terminale sekvenser. Mer detaljert informasjon vedrørende IEF gis på figur 10B, vedrørende SDS-PAGE i figur 10C, og SEC for 4.1.1-antistoffet i figur 10D. Figur 11 viser ekspresjon av B7-1 og B7-2 på Raji-celler ved bruk av anti-CD80-PE og anti-CD86-PE mAb'er. Figur 12 viser den konsentrasjonsavhengige økning av IL-2-produksjonen i T-celleblast-/Raji-analysen som induseres ved hjelp av anti-CTLA-4-blokkerende antistoffer (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 og 6.1.1). Figur 13 viser den konsentrasjonsavhengige økning av IFN-y-produksjonen i T-celleblast-/Raji-analysen som induseres ved hjelp av anti-CTLA-4-blokkerende antistoffer (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 og 6.1.1) (samme donor-T-celler). Figur 14 viser den midlere økning av IL-2-produksjon i T-celler fra seks donorer indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-blokkerende antistoffer i T-celleblast-/Rajianalysen. Figur 15 viser den midlere økning av IFN-y-produksjon i T-celler fra seks donorer indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-blokkerende antistoffer i T-celleblast-/Rajianalysen. Figur 16 viser økningen av IL-2-produksjon i hPBMC fra fem donorer indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-blokkerende mAb'er, målt 72 timer etter stimulering med SEA. Figur 17 viser økningen av IL-2-produksjon i helt blod fra tre donorer indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-blokkerende mAb'er, målt 72 timer og 96 timer etter stimulering med SEA. Figur 18 viser hemmingen av tumorvekst med et anti-murint CTLA-4-antistoff i en murin fibrosarkom-tumormodell. Figur 19 viser økningen av IL-2-produksjon indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-antistoffer (4.1.1 og 11.2.1) ifølge oppfinnelsen i en 72-timers T-blast-/Raji og Superantigen- (helt blod og perifere mononukleære blodceller fra seks donorer) analyse. Figur 20 viser doseavhengig økning av IL-2-produksjon indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-antistoffer (4.1.1 og 11.2.1) ifølge oppfinnelsen i en 72 timers T blast-/Raji-analyse. Figur 21 viser doseavhengig økning av IL-2-produksjon indusert ved hjelp av anti-CTLA-4-antistoffer (4.1.1 og 11.2.1) ifølge oppfinnelsen i en 72 timers Superantigen helt blod-analyse stimulert med 100 ng/ml superantigen. Figur 22 gir en rekke ekstra nukleotidsekvenser og aminosyresekvenser for følgende anti-CTLA-4-antistoffkjeder: Full lengde 4.1.1 tung kjede (cDNA 22(a), genomisk 22(b) og aminosyre 22(c)), full lengde aglykosylert 4.1.1 tung kjede (cDNA 22(d) og aminosyre 22 (e)), 4.1.1 lett kjede (cDNA 22(f) og aminosyre 22(g))), full lengde 4.8.1 tung kjede (cDNA 22(h) og aminosyre 22(i)), 4.8.1 lett kjede (cDNA 22(j) og aminosyre 22(k)), full lengde 6.1.1 tung kjede (cDNA 22(1) og aminosyre 22(m)), 6.1.1 lett kjede (cDNA 22(n) og aminosyre 22(o)), full lengde 11.2.1 tung kjede (cDNA 22(p) og aminosyre 22(q)), og 11.2.1 lett kjede (cDNA 22(r) og aminosyre 22(s)).

Oppsummering av oppfinnelsen

I henhold til en første utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et monoklonalt antistoff som angitt i krav 1 og som er i stand til å binde CTLA-4, hvilket antistoff omfatter en tungkjede aminosyresekvens med variabelt område, som omfatter en tilgrensende aminosyresekvens fra innen en FRl-sekvens t.o.m. en FR3-sekvens som er kodet for av et humant VH3-33 familiegen, og som omfatter minst én av aminosyresubstitusjonene i CDRl-sekvensene, CDR2-sekvensene, eller rammesekvensene vist på figur 2. I en foretrukket utførelse omfatter aminosyresekvensen en sekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:9. I en annen foretrukket utførelse omfatter antistoffet videre en lettkjede variabel region aminosyresekvens, omfattende en sekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:22.

I henhold til en femte utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et isolert, humant monoklonalt antistoff som er i stand til å binde seg til CTLA-4. I en foretrukket utførelse er antistoffet i stand til å konkurrere om binding til CTLA-4 med et antistoff valgt fra gruppen som består av 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1. I en annen foretrukket utførelse har antistoffet en i det vesentlige lignende bindingsspesifisitet til CTLA-4 som et antistoff valgt fra gruppen som består av 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1. I en annen foretrukket utførelse velges antistoffet fra gruppen som består av 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1. I en annen foretrukket utførelse er antistoffet ikke kryssreaktivt med CTLA-4 fra laverestående pattedyrarter, hvor de laverestående pattedyrarter fortrinnsvis omfatter mus, rotte og kanin, og mer fortrinnsvis mus og rotte. I en annen foretrukket utførelse er antistoffet kryssreaktivt med CTLA-4 fra primater, hvor primatene fortrinnsvis omfatter cynomolgous og rhesusaper. I en annen foretrukket utførelse har antistoffet en selektivitet overfor CTLA-4 fremfor CD28, B7-2, CD44, og hlgGl på mer enn ca. 100:1, og fortrinnsvis omkring 500:1 eller mer. I en annen foretrukket utførelse er antistoffets bindingsaffinitet omkring 10"<9>M eller mer, og fortrinnsvis omkring 10"<10>M eller mer. I en annen foretrukket utførelse hemmer antistoffet binding mellom CTLA-4 og B7-2 med en IC50på mindre enn 100 nM og fortrinnsvis mindre enn 0,38 nM. I en annen foretrukket utførelse inhiberer antistoffet binding mellom CTLA-4 og B7-1 med en 1C50på lavere enn omkring 100 nM eller større og foretrukket lavere enn omkring 0,50 nM. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet produksjonen av IL-2 i en T-celleblast-/Raji-analyse med omtrent 500 pg/ml eller mer, og fortrinnsvis med omkring 3846 pg/ml eller mer. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet IFN-y-produksjonen i en T-celleblast-/Raji-analyse med omkring 500 pg/ml eller mer, og fortrinnsvis med omkring 1233 pg/ml eller mer. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet produksjonen av IL-2 i en hPBMC eller helt blod superantigenanalyse med omkring 500 pg/ml eller mer. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet IL-2-produksjonen i en hPBMC eller helt blod superantigenanalyse med omkring 500 pg/ml eller fortrinnsvis 1500 pg/ml eller mer, eller med mer enn omkring 30% eller fortrinnsvis 50% i forhold til en kontroll.

I henhold til en sjette utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et humanisert antistoff som har en i det vesentlige lignende bindingsspesifisitet til CTLA-4 som et antistoff valgt fra gruppen som består av 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1. I en foretrukket utførelse er antistoffet ikke kryssreaktivt med CTLA-4 fra laverestående pattedyrarter, hvor de laverestående pattedyrarter fortrinnsvis omfatter mus, rotte og kanin, og mer fortrinnsvis mus og rotte. I en annen foretrukket utførelse er antistoffet kryssreaktivt med CTLA-4 fra primater, hvor primatene fortrinnsvis omfatter cynomolgous og rhesusaper. I en annen foretrukket utførelse har antistoffet en selektivitet overfor CTLA-4 fremfor CD28, B7-2, CD44, og hlgGl på mer enn ca. 100:1, og fortrinnsvis 500:1 eller mer. I en annen foretrukket utførelse er antistoffets bindingsaffinitet omkring 10"<9>M eller mer, og fortrinnsvis omkring

10"<10>eller mer. I en annen foretrukket utførelse hemmer antistoffet binding mellom CTLA-4 og B7-2 med en IC50på mindre enn 100 nM og fortrinnsvis mindre enn 0,38 nM. I en annen foretrukket utførelse inhiberer antistoffet binding mellom CTLA-4 og B7-1 med en 1C50på lavere enn omkring 100 nM eller større og foretrukket lavere enn omkring 0,50 nM. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet produksjonen av IL-2 i en T-celleblast-/Raji-analyse med omtrent 500 pg/ml eller

mer, og fortrinnsvis med omkring 3846 pg/ml eller mer. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet IFN-y-produksjonen i en T-celleblast-/Raji-analyse med omkring 500 pg/ml eller mer, og fortrinnsvis med omkring 1233 pg/ml eller mer. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet produksjonen av IL-2 i en hPBMC eller helt blod superantigenanalyse med omkring 500 pg/ml eller mer. I en annen foretrukket utførelse øker antistoffet IL-2-produksjonen i en hPBMC eller helt blod superantigenanalyse med omkring 500 pg/ml eller fortrinnsvis 1500 pg/ml eller mer, eller med mer enn omkring 30% eller fortrinnsvis 50% i forhold til en kontroll.

I henhold til en syvende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et antistoff som binder seg til CTLA-4, hvilket antistoff omfatter en tungkjede aminosyresekvens omfattende humane FRI-, FR2- og FR3-sekvenser som er kodet for ved en human VH 3-33 genfamilie som er funksjonsmessig forbundet i ramme med en CDR1-, en CDR2- og en CDR3-sekvens, CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensene velges uavhengig av hverandre fra CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensene som er vist på figur 2. I en foretrukket utførelse, omfatter antistoffet ifølge krav 32, videre en hvilken som helst av de somatiske mutasjoner til FRI-, FR2- og FR3-sekvensene som vist på figur 2.

I henhold til en åttende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et antistoff som binder seg til CTLA-4, hvilket antistoff omfatter en tungkjede aminosyresekvens omfattende humane FRI-, FR2- og FR3-sekvenser som er kodet for ved en human VH 3-33 genfamilie som er funksjonsmessig forbundet i ramme med en CDR1-, en CDR2- og en CDR3-sekvens, hvilket antistoff har følgende egenskaper: En bindingsaffinitet for CTLA-4 på omkring 10"<9>eller mer; hemmer binding mellom CTLA-4 og B7-1 med en IC50på omkring 100 nM eller mindre; hemmer binding mellom CTLA-4 og B7-2 med en IC50på omkring 100 nM eller mindre; og øker cytokinproduksjonen i en analyse av humane T-celler med 500 pg/ml eller mer.

I henhold til en niende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et antistoff som binder seg til CTLA-4, hvilket antistoff omfatter en tungkjede aminosyresekvens omfattende FRI-, FR2- og FR3-sekvenser som er funksjonsmessig forbundet i ramme med en CDR1-, en CDR2- og en CDR3-sekvens som velges uavhengig av hverandre fra CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensene som er vist på figurene 2 og 3, hvilket antistoff har følgende egenskaper: En bindingsaffinitet for CTLA-4 på omkring IO"<9>eller mer; hemmer binding mellom CTLA-4 og B7-1 med en IC50på omkring 100 nM eller mindre; hemmer binding mellom CTLA-4 og B7-2 med en IC50på omkring 100 nM eller mindre; og øker cytokinproduksjonen i en analyse av humane T-celler med 500 pg/ml eller mer.

I henhold til en tiende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et cellekultursystem for analysering av T-cellestimulering, omfattende en kultur av humane T-celleblaster dyrket sammen med en Raji-cellelinje. I en foretrukket utførelse vaskes T-celleblastene før dyrking med Raji-cellelinjen.

I henhold til en ellevte utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en analyse for måling av T-cellestimulering, omfattende: Tilveiebringe en kultur med humane T-celleblaster og en Raji-cellelinje; bringe kulturen i kontakt med et middel ; og måling av cytokinproduksjon i kulturen.

I henhold til en tolvte utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en funksjonsanalyse for å screene en gruppe for T-cellestimulerende virkning, omfattende: Tilveiebringe en kultur med humane T-celleblaster og en Raji-cellelinje; bringe kulturen i kontakt med gruppen; og estimering av cytokinproduksjon i kulturen.

I henhold til en trettende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en T-cellestimulerende analyse for CTLA-4-hemmende funksjon, omfattende det å bringe en kultur omfattende humane T-celleblaster og en Raji-cellelinje i kontakt med et middel og estimering av kulturens cytokinproduksjon.

I henhold til et fjortende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en fremgangsmåte for å screene et middel for T-cellestimulerende aktivitet, omfattende: Å bringe middelet i kontakt med en cellekultur omfattende humane T-celleblaster og en Raji-cellelinje, og estimere kulturens cytokinproduksjon.

I hvert av den tiende til og med fjortende utførelser av foreliggende oppfinnelse vaskes T-celleblastene i en foretrukket utførelse før dyrking med Raji-cellelinjen. I en annen foretrukket utførelse er cytokinet IL-2 eller IFN-y. I en foretrukket utførelse måles cytokinproduksjon i supernatant isolert fra kulturen. I en foretrukket utførelse er middelet et antistoff og binder seg fortrinnsvis til CTLA-4.

I henhold til en femtende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en analyse for måling av T-cellestimulering, omfattende: Tilveiebringe en populasjon av humane perifere mononukleære blodceller eller humant, helt blod stimulert med staphylococcus enterotoxin A; bringe kulturen i kontakt med et middel ; og måle cellepopulasjonens cytokinproduksjon.

I henhold til en sekstende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en funksjonsanalyse for å screene en gruppe for T-cellestimulerende virkning, omfattende: Tilveiebringe en populasjon av humane, perifere mononukleære blodceller eller humant helt blod stimulert med staphylococcus enterotoxin A; bringe kulturen i kontakt med gruppen; og estimere cellepopulasjonens cytokinproduksjon.

I henhold til en syttende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en T-cellestimulerende analyse for CTLA-4-hemmende funksjon omfattende det å bringe en populasjon av humane, perifere mononukleære blodceller eller humant helt blod stimulert med staphylococcus enterotoxin A i kontakt med et middel og estimere cellepopulasjonens cytokinproduksjon.

I henhold til en attende utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en fremgangsmåte for å screene et middel for T-cellestimulerende aktivitet, omfattende: bringe middelet i kontakt med en populasjon av humane, perifere, mononukleære blodceller eller humant helt blod stimulert med staphylococcus enterotoxin A; og å estimere cellepopulasjonens cytokinproduksjon.

I hver av den femtende til og med attende utførelse av foreliggende oppfinnelse er cytokinet i en foretrukket utførelse IL-2. I en annen foretrukket utførelse måles cytokinproduksjon i supernatant isolert fra kulturen. I en foretrukket utførelse er middelet et antistoff og binder seg fortrinnsvis til CTLA-4.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt humane monoklonale antistoffer mot humant CTLA-4. Nukleotidsekvenser som koder for, og aminosyresekvenser som omfatter tungkjede og lettkjede immunoglobulinmolekyler, spesielt sekvenser som korresponderer til tilgrensende tung- og lettkjede sekvenser fra FRI og CDR1 til og med CDR3 og FR4 er tilveiebragt. Videre fremskaffes antistoffer med lignende bindingsegenskaper og antistoffer (eller andre antagonister) med lignende funksjonalitet som antistoffer beskrevet i dette skrift. Det fremskaffes også hybridomer som uttrykker slike immunoglobulinmolekyler og monoklonale antistoffer.

Definisjoner

Med mindre de defineres på annen måte i dette skrift, skal vitenskapelige og tekniske termer som benyttes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse ha de betydninger som normalt forstås av fagfolk med normale kunnskaper på området. Videre skal entallstermer innbefatte flertallstermer, og flertallstermer skal innbefatte entallstermer med mindre sammenhengen krever noe annet. Som regel er nomenklatur som benyttes i sammenheng med, og teknikker for, celle- og vevs-kulturer, molekylærbiologi, og protein- og oligo- eller polynukleotidkjemi og hybridisering som beskrives i dette skrift, velkjente og i alminnelig bruk innen fagområdet. Det benyttes standardteknikker for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese og vevskultur og transformasjon (f.eks. elektroporering, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker utføres ifølge produsentens spesifikasjoner eller på den måte de normalt utføres innen fagområdet, eller som beskrevet i dette skrift. De ovennevnte teknikker og prosedyrer utføres vanligvis ifølge konvensjonelle fremgangsmåter som er velkjente innen fagområdet og som beskrevet i ulike allmenne og mer spesifikke referanser som nevnes og diskuteres gjennom hele den foreliggende beskrivelse. Se f.eks. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nomenklaturen som benyttes i forbindelse med, og laboratorieprosedyrer og -teknikker for analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi, og medisinsk og farmasøytisk kjemi som beskrives i dette skrift, er velkjent og i alminnelig bruk innenfor fagområdet. Det benyttes standardteknikker for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk tilberedning, formulering og levering, og behandling av pasienter.

Slik de benyttes i henhold til den foreliggende beskrivelse skal følgende termer, med mindre noe annet angis, forstås som å ha følgende betydninger: Termen "isolert polynukleotid", slik den benyttes i dette skrift, skal bety et nukleotid av genomisk, cDNA eller syntetisk opprinnelse eller en kombinasjon av disse, hvilket i kraft av sin opprinnelse det "isolerte polynukleotid" (1) ikke er forbundet med hele eller en del av et polynukleotid i hvilket det "isolerte polynukleotid" finnes i naturen, (2) er funksjonsmessig forbundet med et polynukleotid som det ikke er forbundet med i naturen, eller (3) ikke finnes i naturen som en del av en større sekvens.

Termen "isolert protein" som henvises til i dette skrift, betyr et protein av cDNA, rekombinant RNA eller syntetisk opprinnelse eller en kombinasjon av disse, hvilket i kraft av sin opprinnelse, eller avledningskilde, det "isolerte protein" (1) ikke er forbundet med proteiner som finnes i naturen, (2) er fritt for andre proteiner fra samme kilde, f.eks. fritt for murine proteiner, (3) uttrykkes av en celle fra en annen spesie, eller (4) ikke finnes i naturen.

Termen "polypeptid", slik den benyttes i dette skrift, er en generisk term som refererer til naturlig forekommende proteiner, fragmenter eller analoger av en polypeptidsekvens. Derfor er naturlig forekommende proteiner, fragmenter og analoger spesier av polypeptidslekten. Foretrukne polypeptider i henhold til oppfinnelsen omfatter de humane tungkjede immunoglobulinmolekyler og de humane kappa lettkjede immunoglobulinmolekyler som vises på figur 1, i tillegg til antistoffmolekyler som dannes ved hjelp av kombinasjoner som omfatter tungkjede immunoglobulinmolekylene med lettkjede immunoglobulinmolekylene, som for eksempel kappa lettkjede immunoglobulinmolekylene og vice versa, og også fragmenter og analoger av disse.

Termen "naturlig forekommende", slik den benyttes i dette skrift og brukt om et objekt, henviser til det faktum at et objekt kan finnes i naturen. For eksempel et polypeptid eller en polynukleotidsekvens som er tilstede i en organisme (inkludert virus), som kan isoleres fra en kilde i naturen og som ikke med hensikt er blitt modifisert av mennesker i laboratoriet, eller på annen måte er naturlig forekommende.

Termen "funksjonsmessig forbundet", slik den benyttes i dette skrift, henviser til at posisjoner for komponenter som beskrives på denne måte, er i et forhold som gjør det mulig for dem å fungere på den måte som er ment. En kontrollsekvens som er "funksjonsmessig forbundet" med en kodende sekvens, er ligert på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvensen oppnås under forhold som er kompatible med kontrollsekvensen.

Termen "kontrollsekvens", slik den benyttes i dette skrift, henviser til polynukleotidsekvenser som er nødvendige for å bevirke ekspresjonen og behandlingen av kodende sekvenser de er ligert med. Slike kontrollsekvensers beskaffenhet er forskjellig avhengig av vertsorganismen; i prokaryoter inkluderer slike kontrollsekvenser som oftest promotor, ribosomalt bindingssted og transkripsjonsterminerinsekvens; i eukaryoter inkluderer slike kontrollsekvenser som oftest promotorer og transkripsjonstermineringsekvens. Termen "kontrollsekvens" er ment å skulle inkludere, som et minimum, alle komponenter hvis tilstedeværelse er vesentlig for ekspresjon og behandling, og kan også inkludere ekstra komponenter hvis tilstedeværelse er fordelaktig, for eksempel ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser.

Termen "polynukleotid", slik den refereres til i dette skrift, betyr en polymer form av nukleotider med en lengde på minst 10 baser, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av den ene eller den andre typen nukleotid. Termen inkluderer enkelt- og dobbelt-kjedete DNA former.

Termen "oligonukleotid", slik den refereres til i dette skrift, innbefatter naturlig forekommende og modifiserte nukleotider som er forbundet med hverandre ved hjelp av naturlig forekommende og ikke naturlig forekommende oligonuk-leotidbindinger. Oligonukleotider er et delsett av polynukleotider som vanligvis omfatter en lengde på 200 baser eller færre. Oligonukleotider har fortrinnsvis en lengde på 10 til 60 baser, og mest fortrinnsvis en lengde på 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 til 40 baser. Oligonukleotider er normalt enkeltkjedete, f.eks. for prober, skjønt oligonukleotider kan være dobbeltkjedete, f.eks. for bruk ved konstruksjon av en genmutant. Oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan være enten sense- eller anti-sense-oligonukleotider.

Termen "naturlig forekommende oligonukleotider", slik den refereres til i dette skrift, innbefatter deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Termen "modifiserte nukleotider", slik den refereres til i dette skrift, innbefatter nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og lignende. Termen "oligonukleotide bindinger", slik den refereres til i dette skrift, innbefatter oligonukleotide bindinger som for eksempel fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat, fosforamidat og lignende. Se f.eks. LaPlanche et al. Nucl. Acids res. 14:9081 (1986); Stec et al. J Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti- Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonukleotides and Analogues: A Practical Approach pp.87-108 (F. Eckstein, Red. Oxford University Press, Oxford, England (1991)); Stec et al. U.S. patent nr. 5 151 510; Uhlman og Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Et oligonukleotid kan om ønskelig innbefatte en markør for deteksjon.

Termen "selektivt hybridisere", slik den refereres til i dette skrift, betyr å binde på en detekterbar og spesifikk måte. Polynukleotider, oligonukleotider og fragmenter av disse i henhold til oppfinnelsen hybridiserer selektivt til nukleinsyretråder under hybridiserings- og vaskeforhold som minimerer merkbare mengder av detekterbar binding til ikke-spesifikke nukleinsyrer. Det kan benyttes meget strenge forhold for å oppnå selektive hydridiseringsforhold som er kjent innenfor fagområdet drøftet i dette skrift. Som regel vil nukleinsyresekvenshomologien mellom polynukleotidene, oligonukleotidene og fragmentene ifølge oppfinnelsen, og en aktuell nukleinsyresekvens være minst 80%, og mer typisk med fortrinnsvis økende homologier på minst 85%, 90%, 95%, 99% og 100%. To aminosyresekvenser er homologe dersom det eksisterer delvis eller full identitet mellom disses sekvenser. For eksempel betyr 85% homologi at 85% av aminosyrene er identiske når de to sekvenser stilles opp for maksimal sammenpasning. Mellomrom (i den ene av eller begge de to sekvenser som sammenpasses) tillates ved maksimering av sammenpasning. Det foretrekkes at lengden på mellomrommene er 5 eller mindre, og 2 eller mindre foretrekkes mer. Alternativt og fortrinnsvis er to proteinsekvenser (eller polypeptidsekvenser avledet fra disse med en lengde på minst 30 aminosyrer) homologe, slik denne term benyttes i dette skrift, dersom de har et oppstillingsresultat på mer enn 5 (i standardavviksenheter) ved bruk av programmet ALIGN med mutasjonsdatamatrisen og et mellomromsfradrag på 6 eller mer. Se Dayhoff, M.O., i Atlas of Protein Sequence and Structure, s. 101-110 (Bind 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) og Vedlegg 2 til bind 2, s. 1-10. De to sekvenser eller deler av disse er mer fortrinnsvis homologe dersom deres aminosyrer er mer enn eller lik 50% identiske når de er optimalt oppstilt ved bruk av ALIGN-programmet. Termen "korresponderer med" benyttes i dette skrift i den betydning at en polynukleotidsekvens er homolog (dvs. er identisk, ikke strengt utviklingsmessig beslektet) med hele eller en del av en referanse-polynukleotidsekvens, eller at en polypeptidsekvens er identisk med en referanse-polypeptidsekvens. I motsetning til og til forskjell fra dette benyttes termen "komplementær med" i dette skrift i den betydning at den komplementære sekvens er homolog med hele eller en del av en referanse-polynukleotidsekvens. Som en illustrasjon korresponderer nukleotidsekvensen "TATAC" med en referansesekvens "TATAC" og er komplementær med en referansesekvens "GTATA".

Følgende termer benyttes for å beskrive sekvensforholdene mellom to eller flere polynukleotid- eller aminosyresekvenser: "referansesekvens", "sammenligningsvindu", "sekvensidentitet", "prosent sekvensidentitet" og "betydelig identitet". En "referansesekvens" er en definert sekvens som danner et grunnlag for en sekvenssammenligning; en referansesekvens kan være et delsett av en større sekvens, for eksempel som et segment av en full-lengde cDNA eller gensekvens gitt i en sekvensliste, eller kan omfatte en hel cDNA eller gensekvens. Vanligvis har en referansesekvens en lengde på minst 18 nukleotider eller 6 aminosyrer, hyppig en lengde på minst 24 nukleotider eller 8 aminosyrer, og ofte en lengde på minst 48 nukleotider eller 16 aminosyrer. Siden to polynukleotider eller aminosyresekvenser hver kan (1) omfatte en sekvens (dvs. en del av det komplette polynukleotid eller aminosyresekvensen) som er lik mellom de to molekyler, og (2) videre omfatte en sekvens som avviker mellom de to polynukleotider eller aminosyresekvenser, utføres sekvenssammenligninger mellom to (eller flere) molekyler typisk ved å sammenligne sekvenser i de to molekyler over et "sammenligningsvindu" for å identifisere og sammenligne lokale områder med sekvenslikhet. Et "sammenligningsvindu", slik termen benyttes i dette skrift, viser til et begrepssegment med minst 18 tilgrensende nukleotidposisjoner eller 6 aminosyrer, hvor en polynukleotidsekvens eller aminosyresekvens kan sammenlig-nes med en referansesekvens på minst 18 tilgrensende nukleotider eller 6 aminosyresekvenser, og hvor delen av polynukleotidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner, slettinger, substitusjoner og lignende (dvs. mellomrom) på 20% eller mindre sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter addisjoner eller slettinger) for optimal oppstilling av de to sekvenser. Optimal oppstilling av sekvenser for oppstilling av et sammenligningsvindu kan utføres ved hjelp av den lokale homologialgoritme ifølge Smith og Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), ved hjelp av homologioppstillingsalgoritmen ifølge Needleman og Wunsch J. Mol. Biol. 48:443

(1970), ved hjelp av "Search for similarity" metoden ifølge Pearson og Lipman Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), ved hjelp av dataimplementeringer av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetic Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, eller MacVector programpakker), eller ved inspeksjon, og den beste oppstilling (dvs. den som resulterer i den høyeste homologiprosent over sammenligningsvinduet) som frembringes ved hjelp av de ulike fremgangsmåter velges.

Termen "sekvensidentitet" betyr at to polynukleotid- eller aminosyresekvenser er identiske (dvs. på en nukleotid-for-nukleotid- eller rest-for-rest-basis) over sammenligningsvinduet. Termen "prosent sekvensidentitet" beregnes ved å sammenligne to optimalt oppstilte sekvenser over sammenligningsvinduet, bestemme antall posisjoner ved hvilke den identiske nukleinsyrebase (f.eks. A, T, C, G, U eller I) eller rest opptrer i begge sekvenser for å gi antallet sammenpassede posisjoner, dividere antallet sammenpassede posisjoner på det totale antall posisjoner i sammenligningsvinduet (dvs. vindusstørrelsen), og multiplisere resultatet med 100 for å gi prosent sekvensidentitet. Termen "betydelig identitet", slik den benyttes i dette skrift, betegner en karakteristisk egenskap ved en polynukleotid- eller aminosyresekvens, hvor polynukleotidet eller aminosyren omfatter en sekvens som har minst 85% sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90 til 95% sekvensidentitet, mer vanlig minst 99% sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens over et sammenligningsvindu på minst 18 nukleotid- (6 aminosyre-) posisjoner, ofte over et vindu på minst 24-48 nukleotid (8-16 aminosyre-) posisjoner, hvor prosent sekvensidentitet beregnes ved å sammenligne referansesekvensen med sekvensen, som kan inkludere slettinger eller addisjoner som utgjør 20% eller mindre av referansesekvensen over sammenligningsvinduet. Referansesekvensen kan være et delsett av en større sekvens.

Slik de benyttes i dette skrift, følger de tyve tradisjonelle aminosyrer og deres forkortelser tradisjonell bruk. Se Immunology - A Synthesis (2. utg., E.S. Golub og D. R. Gren, Red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoisomerer (f.eks. D-aminosyrer) av de tyve tradisjonelle aminosyrer, unaturlige aminosyrer som for eksempel a-, a-disubstituerte aminosyrer, N-alkyl-aminosyrer, melkesyre og andre konvensjonelle aminosyrer kan også være egnede komponenter for aktuelle polypeptider. Eksempler på utradisjonelle aminosyrer innbefatter: 4-hydroksyprolin, y-karboksyg luta mat, e-N,N,N-trimetyllysin, e-N-acetyllysin, 0-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, cr-N-metylarginin og andre lignende aminosyrer og iminosyrer (f.eks. 4-hydroksyprolin). I polypeptidnotasjonen som benyttes i dette skrift, er venstreretningen aminoterminal-retningen og høyreretningen karboksyterminal-retningen, i samsvar med standard bruk og konvensjon.

På lignende vis, med mindre annet er angitt, er venstre ende av enkeltkjedete polynukleotidsekvenser 5'-enden, og venstreretningen av dobbeltkjedete polynukleotidsekvenser refereres til som 5'-retningen. Retningen for 5'til 3'-addisjon av nascente RNA-transkripter refereres til som transkripsjonsretningen; sekvensområder på DNA-tråden med samme sekvens som RNA'en og som er 5' til 5'-enden av RNA-transkriptet, refereres til som "oppstrøms sekvenser", sekvensom råder på DNA-tråden med samme sekvens som RNA'en og som er 3' til 3'-enden av RNA-transkriptet, refereres til som "nedstrømssekvenser".

Brukt om polypeptider betyr termen "betydelig identitet" at to peptidsekvenser, når disse er optimalt oppstilt, som for eksempel ved hjelp av programmene GAP eller BESTFIT med bruk av standard mellomromsvekt, deler minst 80% sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90% sekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst 95% sekvensidentitet, og mest fortrinnsvis minst 99% sekvensidentitet. Restdeler som ikke er identiske, er fortrinnsvis forskjellige gjennom konservative aminosyresubstitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner henviser til om byttbar heten av rester med lignende sidekjeder. For eksempel er en gruppe aminosyrer med alifatiske sidekjeder glysin, alanin, valin, leucin og isoleucin; en gruppe aminosyrer med alifatiske hydroksyl-sidekjeder er serin og treonin; en gruppe aminosyrer med amidholdige sidekjeder er asparagin og glutamin; en gruppe aminosyrer med aromatiske sidekjeder er fenylalanin, tyrosin og tryptofan; en gruppe aminosyrer med basiske sidekjeder er lysin, arginin og histidin; og en gruppe aminosyrer med svovelholdige sidekjeder er cystein og metionin. Foretrukne konservative aminosyresubstitusjonsgrupper er: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutaminsyre-asparaginsyre og asparagin-glutamin.

Slik de drøftes i dette skrift, betraktes små variasjoner i aminosyresekvensene i antistoffer eller immunoglobulinmolekyler som å være omfattet av den foreliggende oppfinnelse, forutsatt at variasjonene i aminosyresekvensene opprettholder minst 90%, 95%, og mest fortrinnsvis 99%. Konservative aminosyreutskiftninger betraktes spesielt. Konservative utskiftninger er de som finner sted innenfor en aminosyrefamilie som er beslektet i sine sidekjeder. Genetisk kodete aminosyrer deles som regel i familier: (1) sur=aspartat, glutamat; (2) basisk=lysin, arginin, histidin; (3) ikke-polar=alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin, tryptofan; og (4) uladet polar=glysin, asparagin, glutamin, cystein, serin, treonin, tyrosin. Mer foretrukne familier er: Serin og treonin er alifatisk hydroksyfamilie; asparagin og glutamin er en amidholdig familie; alanin, valin, leucin og isoleucin er en alifatisk familie; og fenylalanin, tryptofan og tyrosin er en aromatisk familie. Det er for eksempel rimelig å forvente at en enkeltstående utskiftning av en leucin med en isoleucin eller valin, en aspartat med en glutamat, en treonin med en serin eller en lignende utskiftning av en aminosyre med en strukturelt beslektet aminosyre, ikke vil ha noen større innvirkning på bindingen eller egenskapene til det resulterende molekyl, spesielt dersom utskiftningen ikke involverer en aminosyre innenfor et rammested. Hvorvidt en aminosyreforandring resulterer i et funksjonelt peptid, kan enkelt fastslås ved å analysere polypeptidderivatets spesifikke aktivitet. Analyser beskrives nærmere i dette skrift. Fragmenter eller analoger av antistoffer eller immunoglobulinmolekyler kan enkelt fremstilles av fagfolk med vanlig kunnskap på området. Foretrukne amino- og karboksytermini av fragmenter eller analoger opptrer nær avgrensningene for funksjonsområder. Struktur- og funksjonsområder kan identifiseres ved sammenligning av nukleotid- og/eller aminosyresekvensdata med offentlige eller private sekvensdata baser. Det benyttes fortrinnsvis datastyrte sammenligningsmetoder for å identifisere sekvensmønstre eller beregnede proteinkonformitetsområder som finnes i andre proteiner med kjent struktur og/eller funksjon. Metoder for å identifisere proteinsekvenser som bretter seg sammen til en tredimensjonal struktur, er kjent. Bowie et al. Science 253:164

(1991). Således viser de ovennevnte eksempler at fagfolk på området kan gjenkjenne sekvensmønstre og strukturelle konformiteter som kan brukes for å definere struktur- og funksjonsområder i henhold til oppfinnelsen.

Foretrukne aminosyresubstitusjoner er de som: (1) reduserer tilbøyelighet til proteolyse, (2) reduserer tilbøyelighet til oksidasjon, (3) endrer bindingsaffinitet for danning av proteinkomplekser, (4) endrer bindingsaffiniteter, og (4) gir eller modifiserer andre fysisk-kjemiske eller funksjonelle egenskaper hos slike analoger. Analoger kan inkludere ulike muteiner av en sekvens annen enn den naturlig forekommende peptidsekvens. For eksempel kan enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner (fortrinnsvis konservative aminosyresubstitusjoner) gjøres i den naturlig forekommende sekvens (fortrinnsvis i den del av polypeptidet som ligger utenfor området/-ene som danner intermolelylære kontakter). En konservativ aminosyresubstitusjon bør ikke gi noen vesentlig endring i modersekvensens strukturelle egenart (f.eks. bør en erstatningsaminosyre ikke ha tendens til å bryte en spiral som finnes i modersekvensen eller bryte opp andre typer sekundærstruktur som karakteriserer modersekvensen). Eksempler på polypeptid-sekundær- eller tertiærstrukturer anerkjent innenfor området beskrives i Proteins, Structures and Molecular Prinpciples (Creighton, Red., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden og J.Tooze, red. Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)), og Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

Termen "polypeptidfragment", slik den benyttes i dette skrift, refererer til et polypeptid som haren aminoterminal- og/eller karboksyterminalsletting, men hvor resten av aminosyresekvensen er identisk med de tilsvarende posisjoner i den naturlig forekommende sekvens, for eksempel avledet fra en full-lengde cDNA-sekvens. Fragmenter har typisk en lengde på minst 5, 6, 8 eller 10 aminosyrer, fortrinnsvis en lengde på minst 14 aminosyrer, mer fortrinnsvis en lengde på minst 20 aminosyrer, normalt en lengde på minst 50 aminosyrer, og enda mer fortrinnsvis en lengde på minst 70 aminosyrer. Termen "analog", slik den benyttes i dette skrift, referer til polypeptider som er omfattet av et segment med minst 25 aminosyrer som har betydelig identitet med en del av en utledet aminosyresekvens, og som har minst én av følgende egenskaper: (1) spesifikk binding til CTLA-4 under hensiktsmessige bindingsforhold, (2) evne til å blokkere CTLA-4 med sine reseptorer, eller (3) evne til å hemme CTLA-4-uttrykkende cellevekst in vitro eller in vivo. Polypeptidanaloger omfatter typisk en konservativ aminosyresubstitusjon (eller addisjon eller sletting) i forhold til den naturlig forekommende sekvens. Analoger har typisk en lengde på minst 20 aminosyrer, fortrinnsvis en lengde på minst 50 aminosyrer eller mer, og kan ofte være like lange som et full-lengde, naturlig forekommende polypeptid.

Peptidanaloger brukes vanligvis i farmasøytisk industri som ikke-peptidiske legemidler med egenskaper som er analoge med de hos templatpeptidet. Disse typer ikke-peptidforbindelser kalles "peptidhermere" eller "peptidohermere". Fauchere, 3. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber og Freidinger TINS s.392 (1985); og Evans et al. 3. Med. Chem. 30:1229 (1987). Slike forbindelser utvikles ofte ved hjelp av datastyrt molekylmodellering. Peptidhermere som strukturelt ligner på terapeutisk nyttige peptider, kan brukes for å gi en ekvivalent terapeutisk eller profylaktisk effekt. Peptidhermere ligner som oftest strukturelt på et paradig-mepolypeptid (dvs. et polypeptid som har en biokjemisk egenskap eller farmakologisk aktivitet), som for eksempel et humant antistoff, men hvor én eller flere peptidbindinger er blitt valgfritt erstattet av en binding valgt fra gruppen som består av: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis og trans), -COCH2-,

-CH(OH)CH2- og -CH2SO-, gjennom fremgangsmåter som er velkjente innen fagområdet. Systematisk substitusjon av én eller flere aminosyrer i en konsensussekvens med en D-aminosyre av samme type (f.eks. D-lysin i stedet for L-lysin) kan benyttes for å danne mer stabile peptider. I tillegg kan tvungne peptider som omfatter en konsensussekvens eller en i det vesentlige identisk konsensussekvensvariasjon, frembringes ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet (Rizo og Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387

(1992)), for eksempel ved å tilsette interne cysteinrester som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som sykliserer peptidet.

"Antistoff" eller "antistoffpeptid(er)" refererer til et intakt antistoff eller et bindingsfragment av dette som konkurrerer med det intakte antistoff om spesifikk binding. Bindingsfragmenter produseres ved rekombinante DNA-teknikker, eller ved

enzymatisk eller kjemisk spalting av intakte antistoffer. Bindingsfragmenter innbefatter Fab, Fab', F(ab')2/Fv og enkeltkjede antistoffer. Det er underforstått at hos et antistoff annet enn "bispesifikt" eller "bifunksjonelt", er hvert av bindingsstedene identiske. Et antistoff hemmer i vesentlig grad adhesjon av en reseptor til en motreseptor når et overskudd av antistoff reduserer mengden av reseptorer som er bundet til motreseptorer med minst omkring 20%, 40%, 60% eller 80%, og mer vanlig mer enn omkring 85% (målt i en in vitro analyse av konkurrerende binding).

Termen "epitop" inkluderer enhver proteindeterminant som er i stand til spesifikk binding til et immunoglobulin eller en T-cellereseptor. Epitopiske determinanter består normalt av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler, som for eksempel aminosyrer eller sukkersidekjeder, og har normalt bestemte tredimensjonale strukturelle karakteristika, i tillegg til spesifikke ladningskarakte-ristika. Et antistoff sies spesifikt å binde et antigen når dissosiasjonskonstanten er < 1 (iM, fortrinnsvis < 100 nM, og mest fortrinnsvis < 10 nM.

Termen "middel " benyttes i dette skrift til å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl, eller en ekstrakt laget av biologisk materiale.

Slik de benyttes i dette skrift, refererer termene "markør" eller "merket" til inkorporering av en påviselig markør, f.eks. ved inkorporering av en radiomerket aminosyre eller festing til et polypeptid av biotinylgrupper som kan påvises med merket avidin (f.eks. streptavidin inneholdende en fluorescerende markør eller enzymatisk aktivitet som kan påvises ved hjelp av optiske eller kolorimetriske metoder). I visse situasjoner kan merkingen eller markøren også være terapeutisk. Ulike metoder for merking av polypeptider og glykoproteiner er kjent innen fagområdet, og kan benyttes. Eksempler på markører for polypeptider inkluderer eksempelvis følgende: Radioisotoper eller radionuklider (f.eks.<3>H,<14>C,15N,35S,90Y, "Tc,<U1>ln,<125>I,<131>I), fluorescerende markører (f.eks. FITC, rodamin, lantanid, fosforer), enzymatiske markører (f.eks. pepperrotperoksidase, p-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminens, biotinylgrupper, forhåndsbestemte polypeptidepitoper som gjenkjennes av en sekundær markør (f.eks. glidelås par-sekvenser av leucin, bindingssteder for sekundære antistoffer, metallbindingsområder, epitopemarkører). I enkelte utførelser festes markører ved hjelp av avstandsarmer med ulik lengde for å redusere potensiell sterisk hindring. Termen "farmasøytisk middel eller legemiddel", slik den benyttes i dette skrift, refererer til en kjemisk forbindelse eller sammensetning som er i stand til å gi en ønsket terapeutisk effekt når det administreres til en pasient på riktig måte. Andre kjemitermer i dette skrift brukes i samsvar med tradisjonell bruk innen fagområdet, noe McGraw- Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S. Red., McGraw-Hill, San Francisco (1985) gir eksempler på.

Termen "antineoplastisk middel " brukes i dette skrift til å referere til midler som har den funksjonelle egenskap at de hemmer utvikling eller progresjon av et neoplasma hos et menneske, spesielt en ondartet (cancerøs)lesjon som for eksempel et karsinom, sarkom, lymfom eller leukemi. Inhibisjon av metastase er ofte en egenskap hos antineoplastiske agenser.

Slik den benyttes i dette skrift, betyr termen "i det vesentlige ren" at en objektspesie er den dominerende spesie av de som er tilstede (dvs. at den på molarbasis forekommer i større mengde enn enhver annen spesie i sammensetningen), og fortrinnsvis er en i det vesentlige renset fraksjon en sammensetning i hvilken objektspesien omfatter minst omkring 50% (på molarbasis) av alle makromolekylære spesier som er tilstede. Som oftest vil en i det vesentlige ren sammensetning omfatte mer enn 80% av alle makromolekylære spesier som er tilstede i sammensetningen, mer fortrinnsvis mer enn omkring 85%, 90%, 95% og 99%. Mest fortrinnsvis er objektspesien renset til vesentlig homogeneitet (foruren-sende spesier ikke kan detekteres i sammensetningen ved hjelp av konvensjonelle deteksjonsmetoder) hvor sammensetningen i det vesentlige består av en enkelt makromolekylær art.

Termen pasient innbefatter mennesker og dyr.

Antistoffstruktur

Det er kjent at den strukturelle grunnenhet hos antistoff omfatter en tetramer. Hver tetramer består av to identiske par med polypeptid kjeder, hvor hvert part har én "lett" (ca. 25 kDa) og én "tung" (ca. 50-70 kDa) kjede. Aminoterminaldelen av hver kjede innbefatter et variabelt område med ca. 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigengjenkjenning. KarboksyterminaIdelen av hver kjede definerer et konstant område som primært er ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lette kjeder klassifiseres som kappa og lambda lette kjeder. Tunge kjeder klassifiseres som my, delta, gamma, alfa eller ypsilon, og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgM, IgD, IgG, IgA og IgE. Innenfor de lette og tunge kjeder er de variable og konstante områder knyttet sammen ved hjelp av et "J"-område på omkring 12 eller flere aminosyrer, hvor de tunge kjeder også innbefatter et "D"-område på 10 eller flere aminosyrer. Se i alminnelighet Fundamental Immunology Kap. 7 (Paul, W. red. 2. utg. red. Raven Press, N.Y. (1989)). De variable områder i hvert lette/tunge kjedepar utgjør antistoffets bindingssted.

Dermed har et intakt IgG-antistoff to bindingssteder. Med unntak av hos bifunksjonelle eller bispesifikke antistoffer, er de to bindingssteder like.

Kjedene fremviser alle den samme generelle struktur med forholdsvis konserverte rammeområder (FR) som knyttes sammen ved hjelp av tre hypervariable områder, også kalt komplementaritetbestemmende områder (CDR). CDR'ene fra de to kjedene i hvert par stilles opp ved hjelp av rammeområdene, noe som muliggjør binding til en bestemt epitop. Fra N-terminal til C-terminal omfatter både lette og tunge kjeder områdene FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Anvisningen av aminosyrer til hvert område er i samsvar med definisjonene ifølge Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.

(1987 og 1991), eller Chotia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chotia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Et bispesifikt eller bifunksjonelt antistoff er et kunstig hybridantistoff med to ulike tung/lettkjede par og to ulike bindingssteder. Bispesifikke antistoffer kan produseres ved hjelp av ulike fremgangsmåter, inkludert fusjon av hybridomer eller sammenknytting av Fab'-fragmenter. Se f.eks. Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1533 (1992). I tillegg kan bispesifikke antistoffer utformes som "diastoffer" (Hollinger et al. "'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993) eller "Janusiner" (Traunecker et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV-infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) og Traunecker et al. "Janusins: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)). Produksjon av bispesifikke antistoffer kan være en forholdsvis arbeidsintensiv prosess sammenlignet med produksjon av konvensjonelle antistoffer, og utbytte og renhetsgrad er som oftest lavere for bispesifikke antistoffer. Bispesifikke antistoffer eksisterer ikke i form av fragmenter med et enkelt bindingssted (f.eks. Fab, Fab' og Fv).

Humane antistoffer og humanisering av antistoffer

Humane antistoffer unngår enkelte av problemene som knytter seg til antistoffer som inneholder murine eller rotte variable og/eller konstante områder. Tilstedeværelsen av slike murine- eller rotteavledede proteiner kan føre til rask fjerning av antistoffene eller kan føre til at en pasient utvikler en immunrespons mot antistoffet. For å unngå bruk av murine- eller rotteavledede antistoffer, er det blitt postulert at man kan utvikle humaniserte antistoffer eller frembringe helt humane antistoffer gjennom innføring av human antistoffunksjon i en gnager, slik at gnageren vil kunne produsere antistoff med helt humane sekvenser.

Humane antistoffer

Evnen til å klone og rekonstruere humane posisjoner i megabase-størrelse i YACer og å innføre disse i mus-arvelighetslinjen tilveiebringer en effektfull innfallsvinkel når det gjelder å kaste lys over de funksjonelle komponenter i meget store eller grovt kartlagte posisjoner, og også når det gjelder å fremskaffe nyttige modeller for menneskesykdom. Videre vil bruken av slik teknologi for substitusjon av museposisjoner med de humane ekvivalenter kunne gi en unik innsikt i ekspresjon og reguleringen av humane genprodukter i løpet av utvikling, deres kommunikasjon med andre systemer, og deres befatning med sykdomsinduksjon og progresjon.

En viktig praktisk anvendelse av en slik strategi er "humaniseringen" av musens humorale immunsystem. Innføringen av humane immunoglobulin(Ig)-posisjoner i mus i hvilke endogene Ig-gener er blitt inaktivert, gir en mulighet for å studere mekanismene som ligger til grunn for programmert ekspresjon og sammenstilling av antistoffer, i tillegg til deres rolle i utviklingen av B-celler. Videre vil en slik strategi kunne tilveiebringe en ideell kilde til produksjon av helt humane monoklonale antistoffer (Mab'er), noe som er en viktig milepæl på veien mot å oppfylle målet om antistoff-terapi i menneskesykdom. Det er ventet at helt humane antistoffer vil minimere de immunogene og allergiske reaksjoner som er iboende i muse- eller musederiverte Mab'er, og derved øke effektiviteten og sikkerheten hos de administrerte antistoffer. Bruken av helt humane antistoffer kan forventes å gi en betydelig fordel i behandlingen av kroniske og periodiske humane sykdommer, som for eksempel betennelser, autoimmunitet og kreft, som nødvendiggjør gjentatte antistoffadmininstrasjoner.

Én måte å nærme seg dette målet på var å utvikle museraser som manglet produksjon av museantistoff, med store fragmenter av den humane Ig-posisjon, i forventning om at slike mus ville produsere et stort repertoar av humane antistoffer ved fravær av museantistoffer. Store humane Ig-fragmenter ville bevare det store mangfold av variable gener, og også riktig regulering av ekspresjon og produksjon av antistoffer. Ved å utnytte musemaskineriet for antistoffdiversifisering og -valg og mangelen på immunologisk toleranse overfor humane proteiner, skulle det reproduserte humane antistoff-repertoar i disse museraser gi høyaffinitetsantistoff mot et hvilket som helst aktuelt antigen, inklusive humane antigener. Ved bruk av hybridom-teknologien kunne antigenspesifikke, humane Mab'er med den ønskede spesifisitet enkelt kunne bli produsert og valgt ut.

Denne generelle strategi ble demonstrert i forbindelse med nærværende søkeres utvikling av de første XenoMouse™-raser som publisert i 1994. Se Green et al. Nature Genettes 7:13-21 (1994). XenoMouse™-rasene ble utviklet med kunstige gjærkromosomer (YACer) inneholdende arvelighetslinje konfigurasjonfragmenter inneholdende henholdsvis 245 kb og 190 kb størrelses arvelighetslinje konfigurasjonsfragmenter av den humane tungkjede posisjon og kappa lettkjede posisjon, hvilke inneholdt variable og konstante kjerneområdesekvenser. Id. De human-Ig-inneholdende YACer viste seg å være kompatible med musesystemet, både når det gjaldt rearrangering og ekspresjon av antistoffer, og var i stand til å substituere for de inaktiverte muse-Ig-gener. Dette ble vist gjennom deres evne til å indusere utvikling av B-celler, til å produsere et voksen-lignende repertoar av helt humane antistoffer, og til å utvikle antigenspesifikke humane Mab'er. Disse resultater tydet også på at innføring av store mengder av den humane Ig-posisjon inneholdende et større antall V-gener, ytterligere reguleringselementer og humane-Ig-konstante områder kanskje i det vesentlige kunne sammenfatte hele repertoaret som er karakteristisk for den humane humorale respons på infeksjon og immunisering. Arbeidet til Green et al. ble nylig utvidet til å omfatte innføring av mer enn ca. 80% av det humane antistoff-repertoar gjennom innføring av megabase-størrelse arvelighetslinje konfigurasjon YAC-fragmenter av henholdsvis den humane tungkjede posisjon og kappa lettkjede posisjon for å produsere XenoMouse™-mus. Se Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green og Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) og U.S. patentsøknad med serienummer 08/759620, innlevert 3.desember 1996.

En slik måte å nærme seg problemet på drøftes videre og skisseres opp i amerikanske patentsøknader med serienumre 07/466008, innlevert 12.januar 1990, 07/610515, innlevert 8.november 1990, 07/919297, innlevert 24.juli 1992, 07/922649, innlevert 30.juli, 1992, 08/031801, innlevert 15.mars 1993, 08/112848, innlevert 27.august 1993, 08/234145, innlevert 28.april 1994, 08/376279, innlevert 20.januar 1995, 08/430938, innlevert 27.april 1995, 08/464584, innlevert 5.juni 1995, 08/464582, innlevert 5.juni 1995, 08/463191, innlevert 5.juni 1995, 08/462837, innlevert 5.juni 1995, 08/486853, innlevert S.juni 1995, 08/486857, innlevert 5.juni 1995, 08/486859, innlevert 5.juni 1995, 08/462513, innlevert 5.juni 1995, 08/724752, innlevert 2.oktober 1996 og 08/759620, innlevert 3.desember 1996. Se også Mendez et al. Nature Genettes 14:146-156 (1997) og Green og Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Se også europeisk patent nr. EP 0 463 151 Bl, meddelelse publisert 12.juni 1996, internasjonal patentsøknad nr. WO 94/02602, publisert 3.februar 1994, internasjonal patentsøknad nr. WO 96/34096, publisert 31.oktober 1996, og WO 98/24893, publisert ll.juni 1998.

I en alternativ måte å nærme seg problemet på har andre, deriblant GenPharm International Inc., benyttet en "miniposisjon"-fremgangsmåte. I miniposisjon-fremgangsmåten etterlignes en eksogen Ig-posisjon gjennom inkludering av stykker (enkeltgener) fra Ig-posisjonen. Således formes ett eller flere VH-gener, ett eller flere DH-gener, ett eller flere JH-gener, et my-konstant område, og et andre konstant område (fortrinnsvis et gamma-konstant område) til en konstruksjon for innføring i et dyr. Denne fremgangsmåten beskrives i U.S. patent nr. 5 545 807 til Surani et al. og amerikanske patenter nummer 5 545 806, 5 625 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016, 5 770 429, 5 789 650 og 5 814 318, alle til Lonberg og Kay, U.S. patent nr. 5 591 669 til Krimpenfort og Berns, amerikanske patenter nr. 5 612 205, 5 721 367, 5 789 215 til Berns et al. og U.S. patent nr. 5 643 763 til Choi og Dunn, og GenPharm Internationals amerikanske patentsøknader med serienummer 07/574748, innlevert 29.august 1990, 07/575962, innlevert 31.august 1990, 07/810279, innlevert 17.desember 1991, 07/853408, innlevert 18.mars 1992, 07/904068, innlevert 23.juni 1992, 07/990860, innlevert 16.desember 1992, 08/053131, innlevert 26.april 1993, 08/096762, innlevert 22.juli 1993, 08/155301, innlevert 18.november 1993, 08/161739, innlevert 3.desember 1993, 08/165699, innlevert 10.desember 1993, 08/209741, innlevert 9.mars 1994. Se også europeiske patent nr. 0 546 073, internasjonale patentsøknader nr. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 og WO 98/24884. Se videre Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al. (1994) og Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

Oppfinnerne i Surani et al., som er nevnt ovenfor og er tilknyttet Medical Research Councel (MRC), produserte en transgen mus med en Ig-posisjon gjennom bruk av miniposisjon-fremgangsmåten. Oppfinnerne i GenPharm International-arbeidet, Lonberg og Kay, som nevnes ovenfor, fulgte nærværende oppfinneres eksempel og foreslo en inaktivering av den endogene muse-Ig-posisjon kombinert med vesentlig duplisering av arbeidet til Surani et al.

En fordel ved miniposisjon-fremgangsmåten er hurtigheten med hvilken konstrukter inkludert deler av Ig-posisjonen kan frembringes og innføres i dyr. Samtidig er det imidlertid en stor ulempe ved miniposisjon-fremgangsmåten at det i teorien innføres utilstrekkelig diversitet gjennom inkludering av et lite antall V-, D- og J-gener. Og faktisk understøtter det publiserte arbeid disse bekymringer. Utvikling av B-celler og antistoffproduksjon hos dyr som er produsert gjennom bruk av miniposisjon-fremgangsmåten synes å være hemmet. Forskning rundt den foreliggende oppfinnelse har derfor konsekvent vært rettet mot innføring av større mengder av Ig-posisjonen for å oppnå større diversitet og i et forsøk på å rekonstituere dyrenes immunrepertoar.

Humane antimus-antistoff responser (HAMA) har fått industrien til å fremstille chimeriske eller på annen måte humaniserte antistoffer. Mens chimeriske antistoffer har et humant konstant område og et murint variabelt område, er det ventet at enkelte human anti-chimeriske antistoff (HACA)-responser vil bli observert, spesielt i kroniske eller multidose-anvendelser av antistoffet. Således ville det være ønskelig å kunne tilveiebringe helt humane antistoffer mot CTLA-4 for å sette til side bekymringer om og/eller effekter av HAMA- eller HACA-responser.

Humanisering og Avbildninqsteknoloqier

Som diskutert ovenfor i forbindelse med utvikling av humane antistoffer, finnes det fordeler ved å produsere antistoffer med redusert immunogenitet. Dette kan til en viss grad oppnås i forbindelse med humaniseringsteknikker og avbildningsteknikker ved bruk av egnete biblioteker. Det vil forstås at murine antistoffer eller antistoffer fra andre spesier kan humaniseres eller primatiseres ved bruk av teknikker som er velkjente innen fagområdet. Se f.eks. Winter og Harris Immunol Today 14:43-46

(1993) og Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992). Det aktuelle antistoff kan utvikles ved hjelp av rekombinante-DNA-teknikker for å substituere CH1, CH2 og CH3 hengsel-områdene og/eller rammeområdene med den tilsvarende humane sekvens (se WO 92/02190 og U.S.patenter nr. 5 530 101, 5 585 089, 5 693 761, 5 693 792, 5 714 350 og 5 777 085). Bruken av Ig-cDNA for konstruksjon av chimeriske immunoglobulingener er også kjent innen fagområdet (Liu et al. P. N. A. S. 84:3439 (1987) og J. Immunol. 139:3521 (1987). mRNA isoleres fra et hybridom eller en annen celle som produserer antistoffet, og brukes til å produsere cDNA. Det aktuelle cDNA kan forsterkes gjennom polymerasekjedereaksjonen ved bruk av bestemte primere (U.S. patenter nr. 4 683 195 og 4 683 202). Alternativt kan det lages et bibliotek som screenes for å isolere den aktuelle sekvens. DNA-sekvensen som koder for det variable område av antistoffet, blir så kondensert til humane konstant-områdesekvenser. Sekvensene med humane konstant-områdegener kan finnes i Kabat et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", N.I.H.-publikasjon nr. 91-3242. Humane C-område-gener er lett tilgjengelige fra kjente kloner. Valget av isotype styres av de ønskede effektorfunksjoner, som for eksempel komplementfiksering, eller aktivitet i antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet. Foretrukne isotyper er IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4. Spesielt foretrukne isotyper for antistoffer ifølge oppfinnelsen er IgG2 og IgG4. Begge de humane lettkjede konstante områder, kappa eller lambda, kan brukes. Det chimeriske, humaniserte antistoff uttrykkes så ved hjelp av tradisjonelle fremgangsmåter.

Antistoffragmenter som for eksempel Fv, F(ab')2og Fab kan fremstilles ved spaltning av det intakte protein, f.eks. gjennom protease eller kjemisk spaltning. Alternativt utvikles et avkortet gen. For eksempel ville et chimerisk gen som koder for en del av F(ab')2-fragmentet inkludere DNA-sekvenser som koder for CH1-området og hengsel-området til H-kjeden, etterfulgt av et translasjons-stoppkodon for å gi det avkortede molekyl.

I én fremgangsmåte kan konsensussekvenser som koder for tung- og lettkjede J-områdene brukes til å utvikle oligonukleotider som skal brukes som primere for å innføre nyttige restriksjonsseter i J-området for påfølgende binding av V-områdesegmenter til humane C-områdesegmenter. C-område-cDNA kan modifiseres ved hjelp av seterettet mutagenese for å plassere et restriksjonssted ved den analoge posisjon i den humane sekvens.

Ekspresjonsvektorer inkluderer plasmider, retrovirus, cosmider, YACer, EBV-avledede episomer og lignende. En hensiktsmessig vektor er én som koder en funksjonsmessig komplett human CH- eller CL-immunoglobulinsekvens, med dertil egnede restriksjonsseter som er utformet slik at en hvilken som helst VH- eller VL-sekvens lett kan tilføyes og uttrykkes. I slike vektorer forekommer spleising normalt mellom spleisdonorstedet i det tilføyde J-område og spleiseakseptorstedet som kommer før det humane C-område, og også ved spleiseområdene som opptrer i de humane CH-eksoner. Polyadenylering og transkripsjonsterminering finner sted ved naturlig forekommende kromosomsteder nedstrøms dekodende områdene. Det resulterende chimeriske antistoff kan føyes sammen med en kraftig promotor, inklusive retrovirale LTR'er, f.eks. SV-40 tidlig promotor, (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), Rous sarkomvirus LTR (Gorman et al. P. N. A. S. 79:6777

(1982)), og moloney murint leukemivirus LTR (Grosschedl et al. Cell 41:885

(1985)); naturlig forekommende lg-promotorer etc.

Videre kan humane antistoffer eller antistoffer fra andre spesier frembringes gjennom teknologier av avbildningstypen, inkludert, fagavbildning, retroviral avbildning, ribosomal avbildning og andre teknikker, ved bruk av teknikker som er velkjente innen fagområdet, og de molekyler som resulterer, kan utsettes for ekstra modning som for eksempel affinitetsmodning, da slike teknikker er velkjente innenfor fagområdet. Wright og Harris, supra., Hanes og Pluchtau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomal avbildning), Parmley og Smith Gene 73:305-318

(1988) (fagavbildning), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell og McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), og U.S. patentsøknad nr. 5 733 743. Dersom avbildningteknologi benyttes for å produsere antistoffer som ikke er humane, kan slike antistoffer humaniseres på ovenfor beskrevne måte.

Ved bruk av disse teknikker kan det frembringes antistoffer mot CTLA-4-uttrykkende celler, CTLA-4 i seg selv, former for CTLA-4, epitoper eller peptider av disse, og ekspresjons-bibliotek for disse (se f.eks. U.S. patent nr. 5 703 057), hvilke deretter kan screenes på ovenfor beskrevne måte for å finne de ovenfor beskrevne virkninger.

Ytterligere kriterier for antistoff terapeutika

Som vil forstås, er det som regel ikke ønskelig å drepe CTLA-4-uttrykkende celler. I stedet er det vanligvis bare ønskelig å hindre at CTLA-4 binder seg til sine ligander for å avhjelpe nedregulering av T-celler. Én av de større mekanismer gjennom hvilke antistoffer dreper celler er gjennom fiksering av komplement og deltagelse i CDC. Det konstante område av et antistoff spiller en viktig rolle i forbindelse med et antistoffs evne til å fiksere komplement og delta i CDC. Derfor velger man som regel et antistoffs isotype på en slik måte at den enten gir komplementfikse-ringsevne eller ikke. I tilfellet av foreliggende oppfinnelse foretrekkes det generelt, som nevnt over, ikke bruk av et antistoff som dreper cellene. Det finnes flere isotyper av antistoffer som kan foreta komplementfiksering og CDC, inklusive følgende: murint IgM, murint IgG2a, murint IgG2b, murint IgG3, humant IgM, humant IgGl og humant IgG4. De isotyper som ikke inkluderer, uten begrensning, humant IgGl og IgG4.

Det vil forstås at antistoffer som frembringes ikke nødvendigvis må ha en ønsket isotype til å begynne med, men i stedet kan antistoffet som frembrakt ha en hvilken som helst isotype, og antistoffets isotype kan byttes om senere ved bruk av konvensjonelle teknikker som er velkjente innenfor fagområdet. Slike teknikker innbefatter blant annet bruk av direkte rekombinante teknikker (se f.eks. U.S. patent nr. 4 816 397), celle-cellefusjonsteknikker (se f.eks. amerikansk patentsøknad nr. 08/730 639, innlevert 11.oktober 1996).

I celle-cellefusjonsteknikken fremstilles et myelom eller annen cellelinje som har en tung kjede med en hvilken som helst ønsket isotype, og det fremstilles et annet myelom eller en cellelinje som har den lette kjede. Slike celler kan deretter kondenseres, og en cellelinje som utrykker et intakt antistoff kan isoleres.

Som et eksempel er de fleste CTLA-4-antistoffer som drøftes i dette skrift humane anti-CTLA-4 IgG2-antistoffer. Siden slike antistoffer har den ønskede binding til CTLA-4-molekylet, kan et hvilket som helst slik antistoff enkelt isotype-byttes for å frembringe f.eks. en human IgG4-isotype, mens det fremdeles har det samme variable område (som definerer antistoffets spesifisitet og noe av dets affinitet).

Følgelig kan antistoff kandidater som oppfyller ønskede "strukturelle" attributter som diskutert ovenfor, etter hvert som de produseres, utstyres med i det minste enkelte ekstra ønskede "funksjonelle" attributter gjennom isotype-bytting.

Design og dannelse av andre terapeutika

I henhold til foreliggende oppfinnelse og på grunnlag av aktiviteten til de antistoffer som produseres og karakteriseres i dette skrift med hensyn til CTLA-4, blir utformingen av andre terapeutiske modaliteter inkludert andre antistoffer, andre antagonister, eller kjemiske grupper, andre enn antistoffer, gjort lettere. Slike modaliteter inkluderer, antistoffer med lignende bindingsaktivitet eller funksjonalitet, avanserte antistoffterapeutika som for eksempel bispesifikke antistoffer, immunotoksiner, og radiomerkede terapeutika, produksjon av peptidterapeutika, genterapier, i særdeleshet intralegemer, antisense terapeutika og små molekyler. Videre kan effektorfunksjonen til antistoffene ifølge oppfinnelsen, som diskutert ovenfor, endres gjennom isotype-bytting til en IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE eller IgM for ulik terapeutisk bruk.

I forbindelse med utvikling av avanserte antistoffterapeutika, hvor komplementfiksering er en ønskelig attributt, kan det være mulig å gå utenom avhengigheten av komplement for celledreping gjennom for eksempel å bruke bispesifika, immunotoksiner eller radiomerking.

Når det gjelder bispesifikke antistoffer, kan det frembringes bispesifikke antistoffer som omfatter (i) to antistoffer, ett med en spesifisitet mot CTLA-4 og et annet mot et andre molekyl, som blir konjugert sammen, (ii) ett enkelt antistoff som har én kjede som er spesifikk mot CTLA-4 og en andre kjede som er spesifikk mot et andre molekyl, eller (iii) et enkeltkjedet antistoff som har spesifisitet mot CTLA-4 og det andre molekyl. Slike bispesifikke antistoffer kan frembringes ved hjelp av teknikker som for eksempel er velkjente i sammenheng med (i) og (ii), se Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) og Wright og Harris, supra. og i sammenheng med (iii), se f.eks. Traunecker et al. IntJ Cancer ( Suppl.) 7:51-52 (1992).

I tillegg kan det også fremstilles "Kappalegemer" (III et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain

variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), "Minilegemer" (Martin et al. 'The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6" EMBO J 13: 5303-9 (1994)), "Dialegemer" (Holliger et al. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) eller "Janusiner"

(Traunecker et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV-infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) og Traunecker et al. "Janusins: new molecular design for bispecific reagents" IntJ Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

Når det gjelder immunotoksiner, kan antistoffer modifiseres slik at de virker som immunotoksiner, ved bruk av teknikker som er velkjente innen fagområdet. Se f.eks. Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Se også U.S. patent nr. 5 194 594. Når det gjelder fremstilling av radiomerkede antistoffer, kan slike modifiserte antistoffer også enkelt fremstilles ved bruk av teknikker som er velkjente innenfor fagområdet. Se f.eks. Junghans et al. i Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2. utg., Chafner og Longo, red., Lippincott Raven (1996)). Se også U.S. patenter nr.4 681 581, 4 735 210, 5 101 827, 5 102 990 (RE 35 500), 5 648 471 og 5 697 902. Det er sannsynlig at hver av immunotoksiner og radiomerkede molekyler ville drepe celler som uttrykker CTLA-4, og spesielt de celler i hvilke antistoffene ifølge oppfinnelsen er effektive.

Når det gjelder produksjonen av terapeutiske peptider, kan det, gjennom å gjøre bruk av strukturinformasjon vedrørende CTLA-4 og antistoffer for dette, som for eksempel antistoffer ifølge oppfinnelsen (som diskutert nedenfor i forbindelse med små molekyler), eller ved screening av peptidbiblioteker, fremstilles terapeutiske peptider som retter seg mot CTLA-4. Utforming og screening av peptidterapeutika drøftes i forbindelse med Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake og Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Immunotoksiner og radiomerkede molekyler kan også fremstilles, og på lignende vis, i forbindelse med peptidgrupper som diskutert ovenfor i sammenheng med antistoffer.

Viktig informasjon vedrørende bindingen av et antistoff til et antigen kan samles gjennom eksperimentering med fagavbildning. Slike eksperimenter utføres som regel ved å undersøke et fagarkiv som uttrykker tilfeldige peptider for binding til antistoffene ifølge oppfinnelsen, for å fastslå om det kan isoleres bindende peptider. Dersom dette er vellykket, kan det trekkes informasjon ut av de bindende peptider.

Fagbiblioteker som uttrykker tilfeldige peptider, kan i alminnelighet skaffes fra New England Biolabs (7-mer- og 12-merbiblioteker, henholdsvis Ph.D.-7 Peptide 7-mer Library Kit og Ph.D.-12 Peptide 12-mer Library Kit), basert på et bakteriofag-M13-system. 7-merbiblioteket representerer en diversitet på ca. 2,0 x 10<9>uavhengige kloner, som representerer de fleste av, om ikke alle, de 20<7>= 1,28 x IO<9>mulige 7-mersekvenser. 12-merarkivet inneholder ca. 1,9 x 10<9>uavhengige kloner og representerer kun en liten prøve på det potensielle sekvensrom på 20<12>= 4,1 x IO<15>12-mersekvenser. Hvert av 7-mer- og 12-merarkivene undersøkes eller screenes i samsvar med produsentens anbefalinger, hvor plater ble dekket med et lag antistoff for å fange opp det riktige antistoff (for eksempel et geite anti-human-IgFcfor et IgG-antistoff), etterfulgt av vasking. Bundet fag elueres med 0,2 M glysin-HCI, pH 2,2. Etter tre runder med seleksjon/forsterkning ved en konstant stringens (0,5% Tween), kan man gjennom bruk av DNA-sekvensering karakte- risere de kloner fra bibliotekene som reagerer med ett eller flere av antistoffene. Peptidenes reaktivitet kan bestemmes ved hjelp av ELISA. For mer diskusjon angående epitopeanalyse av peptider, se også Scott, J.K og Smith, G.P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990); Felici et al. J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991) og Kuwabara et al. Nature Biotechnology 15:74-78

(1997).

Utformingen av gen- og/eller antisenseterapeutika gjennom konvensjonelle teknikker muliggjøres også gjennom foreliggende oppfinnelse. Slike modaliteter kan benyttes for å modulere CTLA-4's funksjon. I forbindelse med dette gjør antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse det mulig å utforme og bruke funksjonsanalyser som vedrører dette. En utforming og strategi for antisenseterapeutika diskuteres nærmere i internasjonal patentsøknad nr. WO 94/29444. Utforming og strategi for genterapi er godt kjent. Imidlertid kan bruk av genterapiteknikker som involverer intrastoffer vise seg å være spesielt fordelaktig. Se f.eks. Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) og Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). Generell utforming av og hensyn i forhold til genterapi diskuteres også i internasjonal patentsøknad nr. WO 97/38137. Genetisk materiale som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen (som f.eks. 4.1.1, 4.8.1 eller 6.1.1 eller andre) kan inkluderes i et passende ekspresjonssystem (enten det er viralt, svekket viralt, ikke-viralt, blankt eller annet) og gis til en vert for in vivo-produksjon av antistoffet i verten.

Man kan også se for seg småmolekylterapeutika i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Legemidler kan utformes slik at de modulerer aktiviteten til CTLA-4 på grunnlag av foreliggende oppfinnelse. Kunnskap som er samlet inn fra CTLA-4-molekylets struktur og dettes vekselvirkning med andre molekyler i henhold til den foreliggende oppfinnelse, som for eksempel antistoffer ifølge oppfinnelsen, CD28, B7, B7-1, B7-2 og andre, kan benyttes for på rasjonell måte å utforme ytterligere terapeutiske modaliteter. I dette henseende kan det gjøres bruk av teknikker for utforming av rasjonelle legemidler, som for eksempel røntgenkrystallografi, datamaskinassistert molekylmodellering (CAMM), kvantitativ eller kvalitativ struktur-til-aktivitetsforhold (QSAR) og lignende teknikker for å fokusere anstrengelsene for å finne legemidler. Rasjonell utforming gjør det mulig å forutsi protein- eller syntetiske strukturer som kan samvirke med molekylet eller bestemte former av dette, hvilke kan benyttes for å modifisere eller modulere aktiviteten til CTLA-4. Slike strukturer kan syntetiseres kjemisk eller uttrykkes i biologiske systemer. Denne fremgangsmåten er blitt drøftet i Capsey et al Gentically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Faktisk har den rasjonelle utforming av molekyler (enten peptider, peptidhermere, små molekyler eller lignende) basert på kjente, eller skisserte, struktur-aktivitetsforhold med andre molekyler (som for eksempel antistoffer i henhold til oppfinnelsen), i det store og hele blitt rutine. Se f.eks. Fry et al. "Spesific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new dass of tyrosine kinase inhibitor" Proe Nati Acad Sei U SA 95:12022-7 (1998); Hoffman et al. "A model of Cdc25-phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodane homology domain" J Mol Biol 282:195-208 (1998); Ginalski et al. "Modelling of active forms of protein kinases: p38 - a case study" Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997); Jouko et al. "Identification of esk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure" Biochem J 322:927-35 (1997); Singh et al. "Structure-based design of a potent, selective and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB-reseptor subfamily of protein tyrosin kinases" 3 Med Chem 40:1130-5 (1997); Mandel et al. "ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modelling" Nat Biotechnol 14:323-8 (1996); Monfardini et al. "Rational design, analysis and potential utility of GM-CSF-antagonists" Proe Assoc Am Physicians 108:420-31

(1996); Furet et al. "Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 5411" J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995).

Videre kan kombinatoriske biblioteker utformes og syntetiseres og benyttes i screeningprogrammer som for eksempel høykapasitetsscreening.

Terapeutisk administrasjon oa formuleringer

Det vil forstås at administrasjon av terapeutiske midler i henhold til oppfinnelsen vil bli foretatt med egnede bærere, eksipienter og andre midler som inkorporeres i en formulering for å gi bedre overføring, levering, toleranse og lignende. Et stort antall dertil egnede formuleringer finnes i katalogen som er kjent for alle farmasøyter: Remington's Pharmaceutical Sciences (15. utg., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), spesielt kapittel 87 i denne, av Blaug, Seymour. Disse formuleringer inkluderer for eksempel pulvere, pastaer, salver, geléer, voks, oljer, lipider, lipid-(kationinsk eller anionisk) inneholdende vesikler (som f.eks. Lipofectin™), DNA-konjugater, vannfrie absorpsjonspastaer, olje-i-vann- og vann-i-olje-emulsjoner, emulsjons karbovoks (polyetylenglykoler med ulike molekylvekter), halvfaste geléer og halvfaste blandinger inneholdende karbovoks. En hvilken som helst av de ovennevnte blandinger kan egne seg for behandling og terapi, forutsatt at den aktive ingrediens i formuleringen ikke blir inaktivert av formuleringen og formuleringen er fysiologisk kompatibel med og tolereres av måten entiteten administreres på. Se også Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sei Technol. 52: 238-311 (1998) og referansene deri for ytterligere informasjon angående eksipienter og bærere velkjent for farmasøytiske kjemikere.

Fremstilling av antistoffer

Antistoffer i henhold til oppfinnelsen fremstilles fortrinnsvis gjennom bruk av en transgen mus som har en betydelig del av det humane antistoff-produserende genom satt inn, men som er gjort manglende i produksjonen av endogene, murine antistoffer. Slike mus er så i stand til å produsere humane immunoglobulinmolekyler og antistoffer, og er manglende i produksjonen av murine immunoglobulinmolekyler og antistoffer. Teknologier som brukes for å oppnå det samme beskrives i patentene, søknadene og referansene som beskrives i bakgrunnsmaterialet i dette skrift. Imidlertid beskrives det spesielt en foretrukket utførelse av transgen produksjon av mus og antistoffer fra disse i U.S. pa-tentsøknad med serienummer 08/759620, innlevert 3.desember 1996. Se også Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Gjennom bruken av slik teknologi har nærværende søkere produsert helt humane monoklonale antistoffer mot forskjellige typer antigener. I realiteten immuniseres XenoMouse™-linjer av mus med et aktuelt antigen, deretter samles lymfatiske celler (som f.eks. B-celler) fra musene som uttrykker antistoffer, slike innsamlede celler kombineres med en myeloid-type cellelinje for å fremstille udødelige hybridom-cellelinjer, og slike hybridom-cellelinjer screenes og velges ut for å identifisere hybridom-cellelinjer som produserer antistoffer som er spesifikke for det aktuelle antigen. Disse teknikker ble brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse for fremstilling av antistoffer som er spesifikke for CTLA-4. I dette skrift beskrives produksjonen av flere hybridom-cellelinjer som produserer antistoffer som er spesifikke for CTLA-4. Videre anordnes en karakterisering av antistoffene som produseres av slike cellelinjer, deriblant nukleotid- og aminosyresekvensanalyser av de tunge og lette kjeder hos slike antistoffer.

Antistoffene som er avledet fra hybridom-cellelinjer som er diskutert i dette skrift, betegnes som 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1. Hvert av antistoffene som produseres av ovennevnte cellelinjer er enten helt humane IgG2 eller IgG4 tunge kjeder med kappa lette kjeder. Antistoffer i henhold til oppfinnelsen har i alminnelighet meget høye affiniteter, typisk med Kd'er på fra ca. IO"<9>til og med ca. IO"<11>M, ved måling enten i faststoff-fase eller løsningsfase.

Som det vil forstås, kan antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse uttrykkes i cellelinjer andre enn hybridom-cellelinjer. Sekvenser som koder for cDNA'ene eller genomklonene for de bestemte antistoffer kan brukes for transformasjon av egnede pattedyr- eller ikke-pattedyrvertsceller. Transformasjon kan skje ved hjelp av hvilken som helst kjent fremgangsmåte for innføring av polynukleotider i en vertscelle, inklusive for eksempel pakking av polynukleotidet i et virus (eller i en viralvektor) og overføring av viruset (eller vektoren) til en vertscelle, eller transfeksjonprosedyrer som er kjent innen fagområdet, eksempler på hvilke gis i U.S. patenter nr. 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461 og 4 959 455. Transformasjonsprosedyren som brukes avhenger av verten som skal transformeres. Fremgangsmåter for innføring av heterologe polynukleotider i pattedyrceller er velkjent innen fagområdet, og inkluderer dekstranmediert transfeksjon, kalsiumfosfatutskilling, polybrenmediert transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, partikkelbombardement, innkapsling av polynukleotidet/-ene i liposomer, peptidkonjugater, dendrimerer og direkte mikroinjeksjon av DNA-materialet i cellekjernen.

Pattedyr-cellelinjer som er tilgjengelige som verter for ekspresjon, er velkjente innen fagområdet, og kan innbefatte mange udødeliggjorte cellelinjer som er tilgjengelige fra "the American Type Culture Collection" - (ATCC), inklusive kinesisk hamsterovariumceller (CHO-celler), NSO0, HeLa-celler, hamsterbarn-nyreceller (BHK-celler), apenyreceller (COS), humane hepatocellulære karsinomceller (f.eks. Hep G2) og flere andre cellelinjer. Ikke-pattedyrceller, inklusive bakterie-, gjær, insekt- og planteceller kan også brukes for å uttrykke rekombinante antistoffer. Seterettet mutagenese av antistoffets CH2-område for å eliminere glykosylering kan foretrekkes for å forhindre forandringer enten i immunogenisitets-, farmakokinetikk-, og/eller effektorfunksjonene som følger av ikke-human glykosylering. Ekspresjonssmetodene velges ved å finne ut hvilket system som produserer de høyeste ekspresjonsnivåer og produserer antistoffer med konstitutive CTLA-4-bindingsegenskaper.

Videre kan ekspresjonen av antistoffer ifølge oppfinnelsen (eller andre grupper av disse) fra produksjonscellelinjer økes ved bruk av flere kjente teknikker. For eksempel er glutaminsyntetase- og DHFR genekspresjonssystemer vanlige fremgangsmåter for å øke ekspresjonen under bestemte forhold. Høyekspresjons cellekloner kan identifiseres ved bruk av konvensjonelle teknikker som for eksempel begrenset fortynningskloning og Microdrop-teknologi. GS-systemet diskuteres helt eller delvis i europeiske patenter nr. 0 216 846, 0 256 055 og 0 323 997, og europeisk patentsøknad nr. 89303964.4.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også produseres transgenetisk gjennom fremstilling av et pattedyr eller en plante som er transgen for de aktuelle tung- og lettkjedete immunoglobulinsekvenser, og produksjon av antistoffet i en utvinnbar form fra dette. I forbindelse med den transgene produksjon i pattedyr, kan antistoffer produseres i og utvinnes fra melk fra geiter, kuer eller andre pattedyr. Se f.eks. amerikanske patenter nr. 5 827 690, 5 756 687, 5 750 172 og 5 741 957.

Antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse er blitt analysert med hensyn til struktur og funksjonalitet. Når det gjelder antistoffenes struktur, er aminosyresekvenser av de tunge og kappa lette kjeder blitt beregnet på grunnlag av cDNA-sekvenser oppnådd gjennom RT-PCR av hybridomene. Se eksempler 3 og 4 og figurer 1-8. N-terminal sekvensering av antistoffene ble også utført i bekreftelse av resultatene som diskuteres i eksempler 3 og 4. Se eksempel 5 og figur 9. Kinetisk analyse av antistoffene ble utført for å bestemme affinitet. Se eksempel 2. Antistoffer i henhold til oppfinnelsen (og spesielt 4.1.1-, 4.8.1- og 6.1.1-antistoffene ifølge oppfinnelsen) har høy affinitet (4.1.4: 1,63 x 10<10>l/M; 4.8.1: 3,54 x 10<10>l/M; og 6.1.1: 7,2 x IO<9>l/M). Videre ble antistoffer analysert ved hjelp av isoelektrisk fokusering (IEF), reduserende gel-elektroforese (SDS-PAGE), størrelsesutelukkende kromatografi, væskekromatografi/massespektroskopi og massespektroskopi, og antistoffproduksjon hos hybridomene ble estimert. Se eksempel 6 og figur 10.

Når det gjaldt funksjonell analyse av antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse, viste slike antistoffer seg å være kraftige hemmere av CTLA-4 og dettes bindinger til sine ligander i B7-molekylfamilien. For eksempel ble det vist at antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse blokkerte CTLA-4-binding enten til B7-1 eller B7-2. Se eksempel 7. Faktisk har mange av antistoffene i henhold til oppfinnelsen nanomolare og submolare IC50'er med hensyn til å hemme CTLA-4-binding til B7- og B7-2. Videre har antistoffer ifølge oppfinnelsen utmerket selektivitet for CTLA-4 sammenlignet med CD28, CD44, B7-2 eller hlgGl. Se eksempel 8. Selektivitet er et forholdstall som reflekterer graden av foretrukket binding av et molekyl med et første middel sammenlignet med binding av molekylene med et andre, og eventuelt andre molekyler. Selektivitet refererer i dette skrift til graden av foretrukket binding av et antistoff ifølge oppfinnelsen til CTLA-4 sammenlignet med antistoffets binding til andre molekyler som for eksempel CD28, CD44, B7-1 eller hlgGl. Det er vanlig med selektivitetsverdier på mer enn 500:1 for antistoffer ifølge oppfinnelsen. Det er også blitt vist at antistoffer ifølge oppfinnelsen induserer eller øker ekspresjon av enkelte cytokiner (som for eksempel IL-2 og IFN-y) hos dyrkede T-celler i en T-celleblastmodell. Se eksempler 9 og 10 og figurer 12-17. Videre er det ventet at antistoffer ifølge oppfinnelsen vil hemme veksten av tumorer i egnede in vivo tumormodeller. Utformingen av disse modeller diskuteres i eksempel 11 og 12.

Resultatene som vises i samsvar med den foreliggende oppfinnelse tyder på at antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse har visse egenskaper som kan gjøre de foreliggende antistoffer mer effektive enn nåværende terapeutiske antistoffer mot CTLA-4.

Spesielt har 4.1.1-, 4.8.1- og 6.1.1-antistoffene ifølge oppfinnelsen meget ønskelige egenskaper. Deres strukturelle egenskaper, funksjoner eller aktiviteter tilveiebringer kriterier som muliggjør utforming eller seleksjon av ekstra antistoffer eller andre molekyler som diskutert ovenfor. Slike kriterier innbefatter ett eller flere av de følgende: Evne til å konkurrere med ett eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen om binding til CTLA-4;

Lignende bindingsspesifisitet til CTLA-4 som ett eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen;

En bindingsaffinitet for CTLA-4 på ca. IO"<9>M eller mer og fortrinnsvis 10"<10>eller mer;

Kryssreagerer ikke med lavere pattedyr-CTLA-4, deriblant fortrinnsvis mus-, rotte-eller kanin- og fortrinnsvis mus- eller rotte-CTLA-4;

Kryssreagerer med primat-CTLA-4, fortrinnsvis inklusive cynomolgous og rhesus-CTLA-4;

En selektivitet for CTLA-4 fremfor CD28, B7-2, CD44 eller hlgGl på minst ca. 100:1 eller mer, fortrinnsvis ca. 300, 400 eller 500:1 eller mer;

En IC50ved blokkering av CTLA-4-binding til B7-2 på ca. 100 nM eller mindre og fortrinnsvis 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 eller 0,38 nM eller mindre;

En IC50ved blokkering av CTLA-4-binding til B7-1 på ca. 100 nM eller mindre og fortrinnsvis 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 eller 0,50 nM eller mindre;

En økning av cytokinproduksjonen i én eller flere in wfro-analyser, for eksempel: En økning av IL-2-produksjon i en T-celleblast-/Rajianalyse på ca. 500 pg/ml eller mer og fortrinnsvis 750, 1000, 1500, 2000, 3000 eller 3846 pg/ml eller mer;

En økning av IFN-y-produksjon i en T-celleblast-/Rajianalyse på ca. 500 pg/ml eller mer og fortrinnsvis 750, 1000 eller 1233 pg/ml eller mer; eller

En økning av IL-2-produksjon i en hPBMC- eller helt blod-superantigenanalyse på ca. 500 pg/ml eller mer og fortrinnsvis 750, 1000, 1200 eller 1511 pg/ml eller mer. Sagt på en annen måte er det ønskelig at IL-2-produksjonen økes med omkring 30, 35, 40, 45, 50 prosent eller mer i forhold til kontrollen i analysen.

Det forventes at antistoffer (eller molekyler utformet eller syntetisert fra disse) med én eller flere av disse egenskaper vil ha en effekt lignende antistoffene som beskrives i den foreliggende oppfinnelse.

De ønskelige funksjonsegenskaper som diskuteres ovenfor kan ofte være et resultat av binding til og hemming av CTLA-4 av et annet molekyl (dvs. antistoff, antistoffragment, peptid eller lite molekyl) på lignende vis som et antistoff ifølge oppfinnelsen (dvs. binding til den samme eller lignende epitop av CTLA-4-molekylet). Molekylet kan enten administreres direkte (dvs. slike molekyler administreres direkte til en pasient). Eller, som et alternativ, kan molekylet "administreres" indirekte (dvs. et peptid eller lignende som gir en immunrespons i en pasient (lignende en vaksine), hvor immunresponsen inkluderer produksjon av antistoffer som binder seg til den samme eller lignende epitop eller et antistoff eller fragment som produseres in situ etter administrasjon av genetisk materiale som koder for slike antistoffer eller fragmenter av disse, som binder seg til den samme eller lignende epitop). Således vil det forstås at epitopen på CTLA-4 til hvilken antistoffer ifølge oppfinnelsen binder seg, ofte kan være nyttig i forbindelse med fremstilling og/eller utforming av terapeutika i henhold til oppfinnelsen. Ved utforming av legemidler er negativ informasjon ofte også nyttig (dvs. det faktum at et antistoff som binder seg til CTLA-4 ikke synes å binde seg til en epitop som virker som en hemmer av CTLA-4, er nyttig). Således kan epitopen til hvilken antistoffene ifølge oppfinnelsen som ikke gir den ønskede virkning, binder seg, også være meget nyttig. Følgelig betraktes i henhold til foreliggende oppfinnelse også molekyler (og spesielt antistoffer) som binder seg til den samme eller lignende epitoper som antistoffer ifølge oppfinnelsen.

I tillegg til det faktum at antistoffer ifølge oppfinnelsen og epitopene til hvilke de binder seg betraktes i henhold til oppfinnelsen, har nærværende søkere utført visse preliminære epitopkartleggingsstudier av enkelte antistoffer i henhold til oppfinnelsen og spesielt 4.1.1- og 11.2.1-antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Som et første trinn ble det utført BIAcore konkurransestudier for å frembringe en grov kartlegging av binding mellom enkelte antistoffer ifølge oppfinnelsen i forbindelse med deres evne til å konkurrere om binding til CTLA-4. I denne hensikt ble CTLA-4 bundet til en BIAcore chip, og et første antistoff ble under metningsforhold bundet til dette, og konkurransen mellom påfølgende sekundære antistoffers binding til CTLA-4 ble målt. Denne teknikk muliggjorde dannelse av en grov kartlegging i hvilke antistoffamilier kan klassifiseres.

Gjennom denne prosess ble det konstatert at enkelte antistoffer i henhold til oppfinnelsen kunne kategoriseres i følgende epitope kategorier:

Som et neste trinn ble det forsøkt bestemt om antistoffene ifølge oppfinnelsen gjenkjente en lineær epitop på CTLA-4 under reduserende og ikke-reduserende forhold på Westernblot. Det ble observert at ingen av 4.1.1-, 3.1.1-, 11.7.1-, 11.6.1- eller 11.2.1-antistoffene ifølge oppfinnelsen syntes å gjenkjenne en redusert form for CTLA-4 på Westernblot. Følgelig virket det sannsynlig at epitopen til hvilken hvert av disse antistoffene bandt seg ikke var en lineær epitop, men mer sannsynlig en konformasjonell epitop hvis struktur kan ha blitt opphevet under reduserende forhold.

Derfor ble det forsøkt bestemt om det var mulig å lære om rester innen CTLA-4-molekylet som er viktige for binding av antistoffer ifølge oppfinnelsen. Én måte som ble brukt var å utføre kinetisk evaluering av slipp-hastighet mellom humant CTLA-4 og to sterkt konserverte primat-CTLA-4-molekyler (cynomolgous og marmosett-CTLA-4). BIAcore studier viste at 4.1.1-antistoffet ifølge oppfinnelsen bandt seg til humant, cynomolgous og marmosett-CTLA-4 ved samme hastighet. I forhold til slipp-forhold (affinitet) hadde imidlertid 4.1.1-antistoffet den høyeste affinitet (laveste slipp-hastighet) for humant, en raskere slipp-hastighet for cynomolgous og en mye raskere slipp-hastighet for marmosett. På den annen side binder 11.2.1-antistoffet ifølge oppfinnelsen seg til humant, cynomolgous og marmosett-CTLA-4 ved omtrent samme hastighet og har omtrent samme relative slipp-forhold for hvert av de tre. Denne informasjon tyder videre på at 4.1.1- og 11.2.1-antistoffene ifølge oppfinnelsen binder seg til forskjellige epitoper på CTLA-4.

For å foreta videre studier av epitopen til hvilken kategori B- og C-antistoffene ifølge oppfinnelsen binder seg, ble det utført seterettede mutagenesestudier. Marmosett-CTLA-4 har to viktige forandringer ved rester 105 og 106 i forhold til humant CTLA-4. Slike forskjeller er en leucin-til-metioninforandring ved rest 105 og en glysin-til-serinforandring ved rest 106. I overensstemmelse med dette ble cDNA som koder for humant CTLA-4 mutert til å kode for et mutert CTLA-4 med L105M- og L106M-forandringene. Den homologe erstatningsmutant-CTLA-4 hadde ingen effekt på bindingen av et B7.2-IgGl fusjonsprotein. Videre ble binding med 11.2.1-antistoffet ifølge oppfinnelsen ikke påvirket. Et slikt molekyl ble imidlertid sterkt hemmet i sin evne til å binde seg til 4.1.1-antistoffet ifølge oppfinnelsen (lignende marmosett). Deretter ble et cDNA som koder for marmosett-CTLA-4 mutert for å skape et mutant-marmosett-CTLA-4 med en S106G-forandring. En slik forandring resulterte i gjenoppretting av stabil binding mellom 4.1.1-antistoffet og marmosett-CTLA-4-mutanten. I tillegg ble et cDNA som koder for marmosett-CTLA-4 mutert for å skape et mutant-marmosett-CTLA-4 med en M105L-forandring. En slik forandring ga delvis gjenoppretting av binding mellom 4.1.1-antistoffet og mutant-CTLA-4.

Hvert av kategori B- til og med D-antistoffene ifølge oppfinnelsen synes å inneha lignende funksjonsegenskaper og synes å ha potensialet for å virke som sterke anti-CTLA-4 terapeutiske midler. Videre har hvert av molekylene en viss krysskonkurranse i sin binding mot CTLA-4. Imidlertid synes det, som vil ses fra ovennevnte diskusjon, som om hvert av molekylene i de ulike kategorier binder seg til separate konformasjonsepitoper på CTLA-4.

Basert på ovennevnte vil det forstås at epitopinformasjonen som diskuteres ovenfor, tyder på at antistoffer (eller andre molekyler, som diskutert ovenfor) som krysskonkurrerer med antistoffer ifølge oppfinnelsen sannsynligvis vil ha et visst terapeutisk potensiale i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Videre er det ventet at antistoffer (eller andre molekyler, som diskutert ovenfor) som krysskonkurrerer med antistoffer ifølge oppfinnelsen (dvs. krysskonkurrerer med antistoffer i kategori B, C og/eller D) sannsynligvis vil ha et visst ekstra terapeutisk potensiale i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I tillegg er det ventet at antistoffer (eller andre molekyler, som diskutert ovenfor) som krysskonkurrerer med antistoffer ifølge oppfinnelsen (dvs. krysskonkurrerer med antistoffer i kategori B, C og/eller D) og som (i) ikke reduseres ved binding til marmosett-CTLA-4 (lignende 11.2.1-antistoffet) eller (ii) reduseres ved binding til marmosett-CTLA-4 (lignende 4.1.1-antistoffet), sannsynligvis vil ha et visst ekstra terapeutisk potensiale i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Antistoffer (eller andre molekyler, som diskutert ovenfor) som konkurrerer med kategorier A og E kan også ha et visst terapeutisk potensiale.

Eksempel 1

Generering av anti-CTLA-4-antistoffproduserende hybridomer.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen ble fremstilt, valgt og analysert i henhold til foreliggende eksempel.

Antiaenfremstillina: Tre distinkte immunogener ble fremstilt for immunosering av XenoMouse™ mus: (i) et CTLA-4-IgG fusjonsprotein, (ii) et CTLA-4-peptid og (iii) 300,19 murin lymfomceller transfektert med en mutant CTLA-4(Y201V) som blir grunnleggende uttrykt på celleoverflaten. (i) CTLA- 4- IgGl fusjonsprotein:

Ekspresjonsvektorkonstruksjon:

Det cDNA som koder for det ferdige ekstracellulære domene av CTLA-4 ble PCR-amplifisert fra human tymus cDNA-bibliotek (Clontech) ved anvendelse av primere designet til publisert sekvens { Eur. J. Immunol 18: 1901- 1905 ( 1988)). Fragmentet ble rettet subklonet inn i pSR5, et Sindbis virusekspresjonsplasmid (In Vitrogen), mellom det humane onkostatin M signalpeptidet og human IgG-gamma 1 (IgGl) CHl/CH2/CH3-domenene. Fusjonsproteinet inneholder ikke et hengsledomene, men inneholder cystein 120 i ekstracellulære domene av CTLA-4 for å danne en kovalent dimer. Den resulterende vektor ble kalt CTLA-4-IgGl/pSR5. Den full-stendige CTLA-4-IgGl cDNA i vektoren ble sekvensbekreftet i begge strengene. Aminosyresekvensen til CTLA-4-Ig-proteinet er vist under. Det ferdige ekstracellulære domene for CD44 ble PCR-amplifisert fra human lymfocytt-bibliotek (Clontech) og subklonet inn i pSinRep5 for å generere et kontrollprotein med den identiske IgGl-hale.

OM-CTLA-4-IgGl-fusjonsprotein:

Understreket: signalpeptid

Fet: CTLA-4 ekstracellulært domene

cDNAene for ferdig ekstracellulært domene av CD28 ble PCR-amplifisert fra human lymfocytt-bibliotek (Clontech) og deretter subklonet inn i pCDM8 ( J. Immunol, 151:5261-71 (1993)) for å produsere et humant IgGl-fusjonsprotein inneholdende både trombinspalte og hengsleregioner. Marmosett, cynomologous og rhesus CTLA-4 ble klonet fra mRNA isolert fra PHA-stimulerte PBMCer ved anvendelse av standardteknikker for degenererende PCR. Sekvensering demonstrerte at rhesus og cynomologous aminosyresekvens var identisk med tre forskjeller fra ferdig human CTLA-4 ekstracellulært domene (S13N, I17T og L105M). Marmosett demonstrerte ti aminosyreforskjeller fra den ferdige humane CTLA-4 ekstracellulære domene (V21A, V33I, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M og G106S). Seterettet mutagenese ble anvendt for å gjøre enkeltpunkt mutasjoner av alle aminosyrer forskjellige i marmosett CTLA-4 for å kartlegge aminosyrer viktige for vekselvirkning av antistoffene med human CTLA-4-IgG. Mutasjoner av human og marmosett CTLA-IgG for epitopekartlegging ble generert ved "matchmaker" seterettet mutagenese (Promega). IgG-fusjonsproteinene ble produsert ved transient transfeksjon av Cos7-celler og renset ved anvendelse av standard protein A-teknikker. Mutante CTLA-4-IgG-proteiner ble evaluert for binding til antistoffer ved immunoblotting og ved anvendelse av BIAcore-a na lyser.

Rekombinant proteinekspresjon/rensing:

Rekombinant sindbisvirus ble generert ved å elektroporere (Gibco) babyhamsternyreceller med SP6 in vitro transkriberte CTLA-4-IgGl-pSR5-mRNA og DH-26S hjelper mRNA som beskrevet av InVitrogen. Førtiåtte timer senere ble rekombinant virus høstet og titrert for optimal proteinekspresjon i kinesisk hamster ovarieceller (CHO-K1). CHO-Kl-cellene ble kultivert i suspensjon i DMEM/F12 (Gibco) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovinserum (Gibco), ikke-essensielle aminosyrer (Gibco), 4 mM glutamin (Gibco), penicillin/streptomycin (Gibco), 10 mM Hepes pH 7,5 (Gibco). For å produsere CTLA-4-IgG ble CHO-Kl-cellene resuspendert ved lxl0<7->celler/ml i DMEM/F12 og inkubert med sindbis virus i en time ved romtemperatur. Celler ble deretter fortynnet til lxl06/ml i DMEM/F12 inneholdende 1% føtalt bovinserum utarmet på bovin IgG ved anvendelse av protein A sefarose (Pharmacia), ikke-essensielle aminosyrer, 4 mM glutamin, 12,5 mM Hepes pH 7,5 og penicillin/streptomycin. Førtiåtte timer etter infeksjon ble celler pelletisert og kondisjonert media ble høstet og supplementert med fullstendig proteaseinhibitortabletter (Boehringer Mannheim), pH justert til 7,5, og filtrert 0,2D (Nalgene). FPLC (Pharmacia) ble anvendt for å affinitetsrense fusjonsproteinet ved anvendelse av en 5 ml protein A HiTrap-kolonne (Pharmacia) ved en 10 ml/min strømningshastighet. Kolonnen ble vasket med 30 skiktvolumer PBS og eluert med 0,1 M glysin/HCI pH 2,8 ved 1 ml/min. Fraksjoner (1 ml) ble umiddelbart nøytralisert til pH 7,5 med Tris pH 9. Fraksjonene inneholdende CTLA-4-IgGl ble identifisert ved SDS-PAGE og deretter konsentrert ved anvendelse av centriplus 50 (Amicon) før påføring til sefarose 200-kolonne (Pharmacia) ved 1 ml/min ved anvendelse av PBS som løsningsmidlet. Fraksjoner inneholdende CTLA-4-IgGl ble slått sammen sterilfiltrert 0,2D (Millipore), alikvotet og frosset ved - 80°C. CD44-IgGl ble uttrykt og renset ved anvendelse av de samme metoder. CD28-IgGl ble renset fra kondisjonert media fra transient transfekterte Cos7-celler.

Karakterisering av CTLA-4-IgGl:

Den rensede CTLA-4-IgGl migrerte som et enkelt bånd på SDS-PAGE ved anvendelse av kolloidal coomassie-farging (Novex). Under ikke-reduserende betingelser var CTLA-4-IgGl en dimer (100kDa) som reduserte til en 50kDa-monomer når behandlet med 50mM DTT. Aminosyresekvensering av den rensede CTLA-4-IgGl i oppløsning bekreftet N-terminus av CTLA-4 (MHVAQPAWLAS) og at onkostatin-M signalpeptidet ble spaltet fra det ferdige fusjonsprotein.

CTLA-4-IgGl bandt til immobilisert B7,l-IgG på en konsentrasjonsavhengig måte og bindingen ble blokkert av en hamster-anti-human-anti-CTLA-4 antistoff (BNI3: PharMingen). Den sterile CTLA-4-IgGl var endotoksinfri og kvantifisert ved OD280 ved anvendelse av 1,4 som ekstinsjonskoeffisienten. Utbytte av renset CTLA-4-IgGl spente mellom 0,5-3 mg/l CHO-Kl-celler.

(ii) CTLA- 4- peptid:

Det følgende CTLA-4-peptid ble fremstilt som beskrevet under:

Forkortelser/ Materialer:

NMP, N-metylpyrrolidinon; TFE, 2,2,2-trifluoretanol; DCM, diklormetan; FMOC, fluorenyl metoksykarbonyl. Alle reagenser ble levert av Perkin Eimer med de følgende unntak: TFE, Aldrich Chemical, FMOC-PAL-PEG-resin, Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH og FMOC-Tyr(tBu)-OH ble anvendt for de aminosyrer som har bindende sidekjedegrupper.

Peptidsyntese:

Peptidsyntese ble utført på en Perkin-Elmer 431A, retrofittet med tilbakemeldingsregistrering via UV-absorbans ved 301nm (Perkin-Elmer modell 759A-detektor). Peptidsekvensen ble satt sammen på en FMOC-PAL-PEG-resin ved anvendelse av kondisjonen dobbelkoblingssykluser. Tvungede doble koblinger ble utført ved syklene 10, 11, 18, 19, 20 og 28 til 33. Resinen ble vasket med en 50% blanding av DCM og TFE ved fullførelsen av hver acyleringssyklus fulgt av avslut-ning av ureagerte aminogrupper med eddiksyreanhydrid i NMP. Resin ble fjernet fra reaktoren etter fullførelse av cyklus 49 og resten fortsatte til fullførelse. Peptidspalting fra resinen ble utført ved anvendelse av reagens K (King et al., International Journal of Protein and Peptide Research 36: 255-266 (1990)) i 6 timer på 415 mg av resin, hvilket gir 186 mg ubearbeidet CTLA-4-peptid.

Peptidkarakterisering:

25 mg alikvoter av det ubearbeidede CTLA-4-peptid ble oppløst i 5 ml 6M guanidin HCI/100 mM K2P03ved pH 6,4 og eluert over en Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 kolonne (16 mm x 600 mm, 120 ml sjikt volum) med 2 M Guanidin.HCI/lOOmM K2P03ved pH 6,4 ved 2 ml/min i 180 minutter ved å samle 5 ml fraksjoner. Fraksjonene ble analysert ved å fylle 1,7 pl fraksjoner på en NuPAGE Laemeligel som kjøres med MES løpende buffer og visualisering via Daichii sølvfargeprotokoll. De fraksjoner som viser en molekylvekt på 12 KDa, som vurdert mot molekylvektstandarder ble slått sammen og lagret ved 4°C. De kombinerte fraksjoner ble analysert ved UV og gelelektroforese. Aminosyresekvensering ble utført ved å absorbere en 100 mi kro liter prøve i en ProSorb-patron (absorbert på en PVDF-membran) og vasket for å fjerne buffersaltene. Sekvensering ble utført på en Applied Biosystems 420. Den forventede N-terminale sekvensen (M H V A Q P A V V L A) ble observert. Immunoblotting demonstrerte at peptidet ble gjenkjent av BNI3 anti-human CTLA-4 (PharMingen). For avsalting, ble en alikvot inneholdende 648 ug materiale plassert i 3500 Da MWCO dialysetubing og dialysert mot 0,1% TFA/H20 ved 4°C i 9 dager med røring. Alt innholdet i dialyseposen ble frysetørket til et pulver.

(iii) 300,19 celler transfektert med CTLA-4 (Y201V)

Full-lengde CTLA-4 cDNA ble PCR-amplifisert fra human tymus cDNA-bibliotek (Stratagene) og subklonet inn i pIRESneo (Clontech). En mutasjon av CTLA-4 som resulterer i konstruktiv celleoverflateekspresjon ble introdusert ved anvendelse av "MatchMaker Mutagenesis System" (Promega). Mutasjon av tyrosin, Y201 til valin inhiberer binding av adaptinproteinet AP50 som er ansvarlig for den hurtige in-ternaliseringen CTLA-4 (Chuang et al., J. Immunol 159; 144-155(1997)). Mykoplasmafri 300,19 murine lymfomceller ble kultivert i RPMI-1640 inneholdende 10% føtalt kalveserum, ikke-essensielle aminosyrer, penicillin/streptomycin, 2mM glutamin, 12,5mM Hepes pH 7,5 og 25 uM beta-merkaptoetanol. Celler ble elektroporert (3xl0<6>/0,4 ml serumfri RPMI) i et 1 ml kammer med 20 ug CTLA-4-Y201V/pIRESneo ved anvendelse av 200V/1180uF (Gibco CellPorator). Celler ble hvilt i 10 minutter og deretter 8 ml fullstendig forvarmet RPMI media. Ved 48 timer ble celler fortynnet til 0,5xl0<6>/ml i fullstendig RPMI-media inneholdende lmg/ml G418 (Gibco). Resistente celler ble ekspandert og vist for å uttrykke CTLA-4 på celleoverflaten ved anvendelse av BNI3 antistoff konjugert med fykoerytrin (PharMingen). Høynivåuttrykkende celler ble isolert ved steril sortering.

Immunisering av hybridomagenerering:

XenoMouse-mus (8 til 10 uker gamle) ble immunisert (i) subkutant ved haleroten med lxlO<7>300,19-celler som ble transfektert for å uttrykke CTLA-4 som beskrevet over, resuspendert i fosfatbufret saltløsning (PBS) med Freunds komplette adjuvant, eller (ii) subkutant ved haleroten med (a) 10 ug av CTLA-4 fusjonsproteinet eller (b) 10 ug CTLA-4-peptid emulgert med Freunds komplette adjuvant. I hvert tilfelle ble dosen repetert tre eller fire ganger i Freunds innkomplette adjuvant. Fire dager før fusjon, fikk musene en siste injeksjon av immunogenet eller cellene i PBS. Milt og/eller lymfeknutelymfocytter fra immuniserte mus ble kondensert med [murin ikke-sekretorisk myelom P3 cellelinje] og ble utsatt for HAT-seleksjon som tidligere beskrevet (Galfre, G. og Milstein, C, "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures". Methods Enzymol. 73:3-46(1981)). Et stort panel av hybridomer som alle utskiller CTLA-4-spesifikk human IgG2Keller IgG4K(som detektert under) antistoffer ble gjenvunnet.

ELISA-analyse: ELISA for bestemmelse av antigenspesifikke antistoffer i museserum og i hybridomasupernatanter ble utført som beskrevet i (Coligan et al., Unit 2,1) "Enzyme-linked immunosorbent assays," i Current protocols in immunology( 1994)) ved anvendelse av CTLA-4-Ig-fusjonsprotein for å fange antistoffene. Dyrene som blir immunisert med CTLA-4-Ig-fusjonsproteinet ble i tillegg screenet for ikke-spesifikk reaktivitet mot den humane Ig-delen av fusjonsproteinet. Dette blir utført ved anvendelse av ELISA-plater belagt med human IgGl som er negativ kontroll for spesifisitet.

I en foretrukket ELISA-analyse ble de følgende teknikker anvendt:

ELISA-plater blir belagt med 100 pl/brønn av antigenet i platebeleggingsbuffer (0,1 M karbonatbuffer, pH 9,6 og NaHC03(MW 84)8,4g/l). Plater blir deretter inkubert ved 4°C over natten. Etter inkubering blir beleggingsbuffer fjernet og platen blir blokkert med 200 pl/brønn blokkeringsbuffer (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Timerosal i lxPBS) og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Alternativt blir platene lagret i kjøleskap med blokkeringsbuffer og plateforseglere. Blokkeringsbuffer blir fjernet og 50 pl/brønn hybridomsupernatant, serum eller annen hybridomsupernatant (positiv kontroll) og HAT-media eller blokkeringsbuffer (negativ kontroll) tilsatt. Platene blir inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Etter inkubering ble platen vasket med vaskebuffer (lxPBS). Det detekterende antistoff (dvs. museantihuman IgG2-HRP (SB, #9070-05) for IgG2 antistoffer eller museantihuman IgG4-HRP (SB #9200-05) for IgG4 antistoffer) blir tilsatt ved 100 pl/brønn (museantihuman IgG2-HRP ved 1:2000 eller museantihuman IgG4-HRP ved 1:1000 (hver fortynnet i blokkeringsbuffer)). Platene blir inkubert ved romtemperatur i 1 time og deretter vasket med vaskebuffer. Deretter blir 100 pl/brønn nylig fremstilt utviklende oppløsning (10 ml substratbuffer, 5 mg OPD (o-fenylendiamin, Sigma Cat No. P-7288), og 10 pl 30% H202(Sigma)) tilsatt til brønnene. Platene blir tillatt å utvikle i 10-20 minutter inntil negative kontrollbrønner så vidt begynner å vise farge. Deretter blir 100 pl/brønn stoppløsning (2 M H2S04) tilsatt og platene blir avlest på en ELISA plateavleser ved bølgelengde 490 nm.

Bestemmelse av affinitetkonstanter til helt humane Mabs ved BIAcore: Affinitetsmåling av rensede humane monoklonale antistoffer, Fab-fragmenter eller hybridomasupernatanter ved plasmonresonans ble utført ved anvendelse av BIAcore 2000 instrumentet ved anvendelse av generelle prosedyrer skissert av produsentene.

Kinetisk analyse av antistoffene ble utført ved anvendelse av antigener immobilisert på sensoroverflaten ved en lav tetthet. Tre overflater av BIAcore sensorchipen ble immobilisert med CTLA-4-Ig fusjonsprotein ved en tetthet som spenner fra omkring 390-900 ved anvendelse av CTLA-4-Ig fusjonsprotein ved 20 eller 50 Dg/ml i 10 mM natriumacetat ved pH 5,0 ved anvendelse av aminkoplingskit levert av produsenten (BIAcore, Inc.). Den fjerde overflaten til BIAcore sensorchipen ble immobilisert med IgGl (900 RU) og ble anvendt som en negativ kontrolloverflate for ikke-spesifikk binding. Kinetisk analyse ble utført ved en strømningshastighet på 25 eller 50 mikroliter pr. min. og dissosiasjon (kd eller koff) og assosiasjon (ka eller kon) hastigheter ble bestemt ved anvendelse av programvaren levert av produsenten (BIA evaluation 3,0) som tillater globale tilpasningsberegninger.

Eksempel 2

Affinitetsmålinger av anti-CTLA-4-antistoffer.

I den følgende tabell er affinitetsmålinger for noen av antistoffene valgt på denne måten gitt:

Som det vil bli observert innehar antistoffer fremstilt i henhold til oppfinnelsen høye affiniteter og bindingskonstanter.

Eksempel 3

Strukturer av anti-CTLA-4-antistoffer fremstilt i henhold til oppfinnelsen.

I den følgende diskusjon er strukturell informasjon som omhandler antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen gitt.

For å analysere strukturer av antistoffer produsert ifølge oppfinnelsen klonet vi gener som koder for de tunge og lette kjedef rag mentene ut av det spesielle hybridom. Genkloning og sekvensering ble utført som følger: Poly(A)<+>mRNA ble isolert fra omkring 2xl0<5>hybridomceller avledet fra immuniserte XenoMouse-mus ved anvendelse av en Fast-Track-kit (Invitrogen). Genereringen av tilfeldig primede cDNA ble fulgt av PCR. Human VH eller human VKfamiliespesifikke variable regionprimere (Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes." Eur. J. Immunol. 21:985-991(1991)) eller en universal human VH primer, MG-30

(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) ble anvendt i sammenheng med primere spesifikke for den humane Cy2 konstante region (MG-40d;5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') eller Ck konstante region (hicP2; som tidligere beskrevet i Green et al., 1994). Sekvenser av humane Mabs-avledede tunge og kappa-kjede transkripter fra hybridomer ble oppnådd ved direkte sekvensering av PCR-produkter generert fra poly(A<+>)RNA ved anvendelse av primerene beskrevet over. PCR-produktene ble også klonet inn i pCRII ved anvendelse av en TA kloningskit (Invitrogen) og begge strenger ble sekvensert ved anvendelse av Prism fargeterminator-sekvenseringskit og en ABI 377 sekvenseringsmaskin. Alle sekvenser ble analysert ved oppstilling til "V BASE sequence directory" (Tomlinson et al., MCR Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) ved anvendelse av MacVector og Geneworks programvare.

Videre ble hvert av antistoffene 4,1,1, 4,8,1, 11,2,1 og 6,1,1 utsatt for full lengde DNA-sekvenser. For hver sekvensering ble Poly(A)<+>mRNA isolert fra omkring 4xl0<6>hybridomceller ved anvendelse av mRNA Direct kit (Dynal). mRNA ble revers transkribert ved anvendelse av oligo-dT(18) og Advantage RT/PCR kitten (Clonetech). Variabel region-databasen (V Base) ble anvendt for å designe amplifiseringsprimere som begynner ved ATG startsetet til tungkjede DP50-genet

(5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3') og til

stoppkodonet til den IgG2 konstante regionen (5<1->

TTCrCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3'). En optimal Kozak sekvens (ACCGCCACC) ble tilsatt 5' til ATG startsetet. Den samme metode ble anvendt for å designe en primer til ATG-setet til kappa-kjede A27-genet (5<1->TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3') og stoppkodonet til den kappakonstante region (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAA-CACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'). 012-cDNAen ble klonet ved anvendelse av en primer til ATG-startsetet (5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT-3') og kappa konstantregion stoppkodonprimeren over. Tungkjede cDNAene ble også klonet som genomiske konstrukter ved seterettet mutagenese for å tilsette et Nhel-sete ved enden av det variable J-domenet og subklone et Nhel-fragment inneholdende de genomiske IgG2 CHl/Hinge/CH2/CH3-regionene. Punktmutasjonen for å generere Nhel-setet endrer ikke aminosyresekvensen fra arvelighetslinje. Primerparene ble anvendt for å amplifisere cDNAene ved anvendelse av Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). Sekvens av PCRen ble oppnådd ved retningssekvensering ved anvendelse av farge-terminatorsekvenseringskit og en ABI-sekvenseringsmaskin. PCR-produktet ble klonet inn i pEE glutaminsyntetase pattedyrekspresjonsvektorer (Lonza) og tre kloner ble sekvensert for å bekrefte somatiske mutasjoner. For hver klon ble sekvensen bekreftet på begge kjeder i minst tre reaksjoner. Et aglykosylert 4,1,1 antistoff ble generert ved seterettet mutagenese av N294Q i CH2-domenet. Rekombinante antistoffer ble produsert ved transient transfektering av Cos7-celler i IgG-utarmet FCS og renset ved anvendelse av standard Protein A sefaroseteknikker. Stabile transfektanter ble generert ved elektroporering av murine NSO-celler og seleksjon i glutaminfritt media. Rekombinant 4,1,1 med eller uten glykosylering utviste identisk spesifitet og affinitet for CTLA-4 i in vitro ELISA og BIAcore analysene.

Genbenyttelsesanalyse.

Den følgende tabell fremlegger gen benyttelsen bevist ved utvalgte hybridomakloner av antistoffer i henhold til oppfinnelsen:

Som man kan se, ble antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse generert med en sterk tilbøyelighet mot utnyttelse av den DP-50 tungkjede variable regionen. DP-50-genet er også referert til som et VH 3-33 familiegen. Kun ett antistoff som ble valgt på basis av CTLA-4 binding og preliminære in vitro funksjonelle analyser, viste en tungkjede genbenyttelse annen enn DP-50. Den klonen, 2.1.3, utnytter en DP-65 tungkjede variabel region og er en IgG4 isotype. DP-65-genet er også referert til som et VH 4-31 familiegen. På den annen side, vil klonen 4.9.1, som innehar en DP-47 tungkjede variabel region bindes til CTLA-4, men forhindrer ikke binding til B7-1 eller B7-2. I XenoMouse-mus er det mer enn 30 distinkte funksjonelle tungkjede variable gener fra hvilke antistoffer kan genereres. Tilbøyeligheten er derfor en indikator på et foretrukket bindingsmotiv til antistoff-antigen samvirkningen med henblikk på de kombinerte egenskaper til å binde antigenet og funksjonell aktivitet.

Mutasjonsanalyse

Som vil forstås, tilveiebringer genbenyttelsesanalyse kun et begrenset overblikk av antistoffstruktur. Etter som B-cellene i XenoMouse-dyr stokastisk genererer V-D-J tung- eller V-J kappa lett-kjedetranskripter, er det flere sekundære prosesser som forekommer, inkludert somatisk hypermutasjon, n-addisjoner, og CDR3-forlengelser. Se, for eksempel, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) og US patentsøknad nr. 08/759,620 levert 3. desember 1996. Følgelig, for å ytterligere undersøke antistoffstrukturen ble beregnede aminosyresekvenser til antistoffene generert fra cDNAene oppnådd fra klonene. I tillegg, ble N-terminale aminosyresekvenser oppnådd gjennom proteinsekvensering. Figur 1 gir nukleotid og beregnede aminosyresekvenser til de tunge og kappa lette kjedene til klonene 4.1.1 (Figur la), 4.8.1 (Figur IB), 4.14.3 (Figur 1C), 6.1.1 (Figur ID), 3.1.1. (Figur 1E), 4.10.2 (Figur 1F), 2.1.3 (Figur 1G), 4.13.1 (Figur 1H), 11.2.1 (Figur II), 11.6.1 (Figur 1J), 11.7.1 (Figur IK), 12.3.1.1.(Figur IL), og 12.9.1.1. (Figur IM). I figurene IA, IB og ID ble forlengede sekvenser til antistoffene 4.1.1, 4.8.1 og 6.1.1 oppnådd ved fullengdekloning av cDNAene som beskrevet over. I slike figurer er signalpeptidsekvensen indikert i fet tekst og sekvenser utnyttet for 5' PCT-reaksjon en er understreket. Figur 2 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom de beregnede tungkjedeaminosyresekvensene fra klonene 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 og 12.9.1.1 arvelighetslinje DP-50 (3-33) aminosyresekvensen. Forskjeller mellom DP-50 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonene er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffene som skyggelagt. Figur 3 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom de beregnede tungkjede aminosyresekvenser til klonen 2.1.3 og arvelighetslinje DP-65 (4-31) aminosyresekvensen. Forskjeller mellom DP-65 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonen er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffet som understreket. Figur 4 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom den beregnede kappa og lettkjede aminosyresekvensen til klonene 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 og 4.13.1 og arvelighetslinje A27 aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A27 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonen er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffet som understreket. Åpenbare slettinger i CDRlene til klonene 4.8.1, 4.14.3 og 6.1.1 er indikert med "O-er". Figur 5 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom den beregnede kappa lettkjede aminosyresekvensen til klonene 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 og 11.7.1 og arvelighetslinje 012 aminosyresekvensen. Forskjeller mellom 012 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonen er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffet som understreket. Figur 6 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom den beregnede kappa lettkjede aminosyresekvensen til klonen 2.1.3 og arvelighetslinje A10/A26 aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A10/A26 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonen er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffet som understreket. Figur 7 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom den beregnede kappa lettkjede aminosyresekvensen til klonen 12.3.1 og arvelighetslinje A17 aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A17 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonen er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffet som understreket. Figur 8 tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom den beregnede kappa lettkjede aminosyresekvensen til klonen 12.9.1 og arvelighetslinje A3/A19 aminosyresekvensen. Forskjeller mellom A3/A19 arvelighetslinjesekvensen og den til sekvensen i klonen er indikert med fet tekst. Figuren viser også posisjonene til CDR1, CDR2 og CDR3-sekvensene til antistoffet som understreket. Figur 22 tilveiebringer en rekke ytterligere nukleotid og aminosyresekvenser til de følgende anti-CTLA-4 antistoff kjede r: 4.1.1: full lengde 4.1.1 tung kjede (cDNA 22(a), genomisk 22(b), og aminosyre 22(c)); full lengde aglykosylert 4.1.1 tung kjede (cDNA 22(d) og aminosyre 22(e)); 4.1.1. lett kjede (cDNA 22(f) og aminosyre 22(g)); 4.8.1: full lengde 4.8.1 tung kjede (cNDA 22(h) og aminosyre 22(i)); 4.8.1 lett kjede (cDNA 22(j) og aminosyre 22(k)); 6.1.1: full lengde 6.1.1 tung kjede (cDNA 22(1) og aminosyre 22 (m)); 6.1.1 lett kjede (cDNA 22(n) og aminosyre 22(o)); 11.2.1: full lengde 11.2.1 tung kjede (cDNA 22(p) og aminosyre 22 (q)); og 11.2.1 lett kjede (cDNA 22(r) og aminosyre 22(s)).

Signalpeptidsekvenser er vist med fet og stor tekst. De åpne avlesningsrammene i fullengde 4.1.1 genomisk DNA-sekvensen (figur 22(b)) er understreket. I tillegg er mutasjonene introdusert for å lage den aglykosylerte 4.1.1 tunge kjede og den resulterende endring (N294Q) vist med dobbel understreking og fet tekst (cDNA (fig. 22(b) og aminosyre (fig. 22(c)).

Eksempel 4

Analyse av tunge og lette kiede aminosyresubstitusjoner

I figur 2, som tilveiebringer en sekvensoppstilling mellom den beregnede tungkjede aminosyresekvensen fra klonene 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1, og 12.9.1 og arvelighetslinje DP-50 (3-33) aminosyresekvensen, oppstår det et interessant mønster. I tillegg til det faktum av det systematiske avvik for tungkjede DP-50 i hovedandelen av klonene, er den relativt begrensede hypermutasjon i antistoffene i forhold til arvelighetslinje DP-50 genet. Foreksempel, har klonene 3.1.1 og 11.2.1 ingen mutasjoner. Videre er mutasjonene i de andre klonene generelt konservative endringer som involverer substitusjoner av aminosyrer med lignende egenskaper til aminosyrene i arvelighetslinjen. Mutasjoner innen mange av CDR1 og CDR2-sekvensene er spesielt konservative i natur. Tre av de tunge kjedene som er presentert i figur 2, 4.10.2, 4.13.1 og 4.14.3 er klart avledet fra en enkelt rekombinant hendelse (dvs. avledes fra et identisk germinalt senter) og er nær identisk i sekvens. Hvis disse tre blir betraktet som en enkelt sekvens, så, blant de 10 forskjellige antistoffer inneholdende den DP-50 tunge kjeden, i CDR1 og CDR2 er det tre posisjoner i hvilke en ikke-polar residu blir erstattet med en annen ikke-polar residu, 12 i hvilke en polar uladet residu blir erstattet med en annen polar uladet residu, og 1 i hvilken en polar ladet residu blir erstattet med en annen polar ladet residu. Videre er det to posisjoner i hvilke to residuer som er svært strukturelt like, glysin og alanin, blir substituert for hverandre. De eneste mutasjonene som ikke er strengt konservative involverer 3 substitusjoner av en polar ladet residu for en polar uladet residu og en substitusjon av en upolar residu for en polar residu.

De lette kjedene til disse antistoffene er avledet fra 5 ulike Vk-gener. A27-genet er det som er tyngst representert og er kilde til seks ulike lette kjeder. Sammenligning av disse 6 sekvensene avslører to merkbare trekk. Først, tre av dem, inneholder 4.8.1, 4.14.3 og 6.1.1 slettinger av en eller to residuer i CDR1, en sjelden hendelse. For det andre, er det en sterk fordom mot arvelighetslinjeserinen ved posisjon seks i CDR3 fordi serinen har blitt erstattet i hver sekvens. Dette foreslår at en serin i denne posisjonen er inkompatibel med CTLA4-binding.

Det vil bli forstått at mange av de ovenfor identifiserte aminosyresubstitusjoner eksisterer i tett nærhet til eller innen en CDR. Slike substitusjoner vil forekomme å bære noe virkning på bindingen av antistoffet til CTLA-4-molekylet. Videre kunne slike substitusjoner ha signifikant effekt på affiniteten til antistoffene.

Eksempel 5

N- terminal aminosyresekvensanalyse av antistoffer i henhold til oppfinnelsen

For å ytterligere verifisere sammensetningen og strukturen av antistoffene i samsvar med oppfinnelsen identifisert over, sekvenserte vi visse av antistoffene ved anvendelse av en Perkin-Elmer sekvenser. Både tunge og kappa lette kjeder til antistoffene ble isolert og renset ved anvendelse av preparativ gelelektroforese og elektroblottingsteknikker og deretter direkte sekvensert som beskrevet i eksempel 6. En hoveddel av de tunge kjedesekvensene ble blokkert på deres aminoterminus. Derfor ble slike antistoffer først behandlet med pyroglutamat aminopeptidase og deretter sekvensert.

Resultatene fra dette eksperimentet er vist i figur 9. Figur 9 tilveiebringer også molekylvekten til de tunge og lette kjedene som bestemt ved massespektroskopi

(MALDI).

Eksempel 6

Ytterligere karakterisering av antistoffer i henhold til oppfinnelsen

Figur 10 tilveiebringer en viss ytterligere karakteriseringsinformasjon omkring visse av antistoffene ifølge oppfinnelsen. I figuren er data relatert til klonene 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 og 6.1.1 oppsummert. De følgende data er gitt: konsentrasjon, isoelektrisk fokusering (IEF), SDS-PAGE,

størrelseseksklusjonskromatografi, FACS, massespektroskopi (MALDI), og lett kjede N-terminale sekvenser.

Generelt ble dataene generert som følger:

Materialer og metoder

Proteinkonsentrasion ble bestemt ved 280 nm fra et UV-skann (200-350 nm), hvor 1,58 absorbansenheter ved 280 nm var lik 1 mg/ml.

SDS- PAGE ble utført ved anvendelse av Novex NuPAGE elektroforesesystemet med en 10% NuPAGE-gel og MES løpende buffer. Prøver ble fremstilt ved å fortynne 3:1 med 4x NuPAGE prøvebuffer (+/-) beta-merkaptoetanol, oppvarmet og~5 pg protein ble fylt på gelen. Gelen ble deretter farget med Brilliant Blue R fargeløsning (Sigma kat.#B-6529) og molekylærstørrelsesestimater ble gjort ved å sammenligne fargede bånd med "Perfect Protein Markers" (Novagen kat.# 69149-3).

For N- terminalsekvenserino ble prøver kjørt som over på NuPAGE-geler, overført til Pro Blot immobiliseringsmembran (Applied Biosystems) deretter farget med Coomassie Blue R-250. De fargede proteinbånd ble skåret ut og utsatt for se-kvensanalyse ved automatisert Edman-degradering på en Applied Biosystems 494 Procise HT sekvensator.

Isoelektrisk fokusering (IEF) ble utført ved anvendelse av Pharmacia IEF 3-9 pHast geler (kat.# 17-0543-01). Prøver ble fortynnet i 10% glyserol til -0,8 mg/ml og 1 pl ble fylt på gelen og deretter sølvfarget, pl-estimatene ble gjort ved å sammenligne fargede bånd til bredområdet (pH3-10) IEF-standarder (Pharmacia cat.#17-0471-01).

Størrelseseksklusionskromatoqrafi (SEC) ble utført i fosfatbufret saltløsning (PBS) på Pharmacia SMART systemet ved anvendelse av Superdex 75 PC 3,2/30 kolonnen. Molekylstørrelsesestimater ble gjort ved å sammenligne toppretensjons-tid med retensjonstidene til gel.

For FACS- studier ble humane perifere T-celler preparert og stimulert i 48 timer. T-celler ble vasket en gang, resuspendert i FACS-buffer ved lxlO<6>celler/100 pl og farget for CD3 overflateekspresjon med 10 pl anti-CD3-FITC (Immunotech, Marseille, Frankrike) i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket to ganger, deretter fiksert, permeabilisert (Fix and Perm, Caltag), og farget for intracellulær CTLA-4 ekspresjon med 10 pl anti-CD152-PE (Pharmingen). Strømningscytometri ble utført ved anvendelse av en Becton Dickinson FACSort. Kvadranter ble satt ved analyse av relevante isotype kontrollantistoffer (Caltag).

Som ble diskutert over, har anti-CTLA-4 antistoffer blitt demonstrert å inneha visse kraftige immunmoduleringsaktiviteter. De følgende eksperimenter ble utført for å bestemme om antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse innehadde slike aktiviteter. Generelt ble eksperimentene designet for å analysere evnen til antistoffene til å inhibere vekselvirkningen mellom CTLA-4 og B7-molekyler, være selektive som mellom CTLA-4 og B7-molekyler og CD28, og fremme T-celle cytokinproduksjon, inkludert, men ikke begrenset til IL-2 og/eller IFN-y ekspresjon. Ytterligere undersøkelse av kryssreaktivitet av antistoffer ifølge oppfinnelsen med visse humane vev og CTLA-4 molekyler i andre spesier (for eksempel mus og primat) ble gjort.

Eksempel 7

Konkurrerende ELISA: Inhibislon av CTLA- 4/ B7- 1 eller B7- 2 vekselvirkning ved antistoffer ifølge oppfinnelsen

En in vitro analyse ble utført for å bestemme om antistoffer i henhold til den foreliggende oppfinnelse var i stand til å inhibere bindingen av CTLA-4 med enten B7-1 eller B7-2. Som vil bli forstått, vil antistoffer ifølge oppfinnelsen som er i stand til å inhibere bindingen av CTLA-4 med B7-molekyler, forventes å være kandidater for immunregulering gjennom CTLA-4-reaksjonsveien. I analysen ble de følgende materialer og metoder utnyttet:

Materialer og metoder

3 nM B7.1-Ig(Gl) eller B7.2-Ig(Gl) (Repligen, Inc. Needham, MA) i Dulbeccos PBS ble belagt på 96-brønn MaxiSorp-plater (Nunc, Danmark #439454) og inkubert ved 4°C over natten. På dag to ble B7-Ig fjernet og platene ble blokkert med 1% BSA pluss 0,05% Tween-20 i D-PDS). Plater ble vasket 3x med vaskebuffer (0,05% Tween-20 i D-PBS). Antistoff ved passende testkonsentrasjoner og CTLA-4-lg(G4)

(0,3 nM slutt kons.) (Repligen, Inc. Needham, MA) ble forblandet i 15 minutter og deretter tilsatt til den B7-Ig belagte plate (60 pl totalvolum) og inkubert ved RT i 1,5 timer. Plater ble vasket 3x og 50 pl av en 1 til 1000 fortynning av HRP-merket museanti-human IgG4 antistoff (Zymed, San Francisco, CA #05-3820), ble tilsatt og inkubert ved RT i 1 time. Plater ble vasket 3x og 50 pl TMB Microwell peroksidasesubstrat (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, #50-76-04), ble tilsatt og inkubert ved RT i 20 minutter, og deretter ble 50 pl IN H2S04tilsatt til platen.

Plater ble avlest ved 450 nm ved anvendelse av en Molecular Devices plateavleser (Sunnyvale, CA). Alle prøver ble testet i duplikat. Maksimalt signal ble definert som CTLA-4-Ig binding i fravær av testantistoff. Ikke-spesifikk binding ble definert som absorbans i fravær av CTLA-4-Ig og testa nti stoff.

Resultatene fra analysen er tilveiebrakt i tabell HIA og UIB. I tabell HIA er resultatene vist for flere ulike antistoffer i henhold til oppfinnelsen. I tabell UIB er resultater vist som sammenligner 4.1.1 antistoffer ifølge oppfinnelsen med 11.2.1 antistoff ifølge oppfinnelsen fra et separat eksperiment.

Eksempel 8

Selektivitetsforhold av antistoffer ifølge oppfinnelsen med hensyn til CTLA- 4 mot enten CD28 eller B7- 2

En annen in vitro analyse ble utført for å bestemme selektiviteten til antistoffer ifølge oppfinnelsen med hensyn til CTLA-4 mot enten CD28 eller B7-2. De følgende materialer og metoder ble utnyttet i forbindelse med eksperimentene:

CTLA-4 selektivitets ELISA: materialer og metoder

En 96-brønn Fluoro NUNC-plate (Nunc kat. nr. 475515) ble platebelagt med fire antigener: CTLA-4/Ig, CD44/Ig, CD28/Ig og B7.2/Ig (antigener fremstilt på huset). Antigenene ble platebelagt over natten ved +4°C ved 1 pg/ml 100 pl/brønn i 0,1 M natrium bikarbonat buffer, pH 9,6. Platen ble deretter vasket med PBST (PBS + 0,1% Tween-20) tre ganger ved anvendelse av en NUNC-platevasker. Platen ble blokkert med PBST+0,5%BSA ved 150 pl/brønn. Platen ble inkubert ved RT i 1 time deretter vasket med PBST tre ganger. Deretter ble anti-CTLA-4-antistoffene ifølge oppfinnelsen fortynnet i blokk ved 1 pg/ml og ble tilsatt til platen. Platen ble inkubert ved RT i 1 time deretter vasket med PBST tre ganger. Brønnene som inneholdt antistoffene ifølge oppfinnelsen, ble deretter behandlet med 100 pl/brønn antihuman IgG2-HRP (Southern Biotech Kat. Nr. 9070-05) ved en 1:4000 fortynning i blokk. I tillegg ble en rekke behandlet med antihuman IgG (Jackson Kat. nr.. 209-035-088) for å normalisere for platebelegging. Dette antistoff ble fortynnet til 1:5000 i blokk og tilsatt ved 100 pl/brønn. Dessuten ble en rekke behandlet med antihuman CTLA-4-HRP (Pharmingen Kat. Nr. 345815/vanlig HRP konjugert) som en positiv kontroll. Dette antistoff ble anvendt ved 0,05 pg/ml fortynnet i blokk. Platen ble inkubert ved RT i 1 time deretter vasket med PBST tre ganger. LBA kjemilumiscent substrat (Pierce) ble tilsatt ved 100 pl/brønn og platen ble inkubert på en platelister i 5 min. Platen ble deretter avlest ved anvendelse av en lumi-avbilder for en 2 min. eksponering.

IGEN CTLA-4-Ig selektivitetsbindingsanalyse: materialer og metoder M-450 Dynabeads (Dynal A.S, Oslo, Norge #140.02) ble vasket 3x med Na fosfatbuffer, pH 7,4 og resuspendert i Na fosfatbuffer. 1,0 pg CTLA-4-Ig(Gl), 1,0 pg CD28-Ig(Gl) eller 1,0 til 3,0 pg B7,2-Ig(Gl) Repligen, Inc. Needham, MA) ble tilsatt til 100 pl perler og inkubert over natten på en rotator ved 4°C. Dag 2 ble perlene vasket 3x i 1% BSA pluss 0,05% Tween-20 i Dulbeccos PBS og blokkert i 30 minutter. Perler ble fortynnet 1 til 10 med blokkerende buffer og 25 pl av de belagte perlene ble tilsatt til 12x75 mm polypropylentuber. Alle prøvene ble testet i duplikat. 50 pl testantistoff (1 pg/ml sluttkonsentrasjon) eller blokkerende buffer ble tilsatt til tubene og inkubert i 30 minutter på Origen 1,5 analysekarusellen (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) RT, virvlende ved 100 rpm. 25 pl rutenylert murin antihuman IgGl, IgG2 eller IgG4 (Zymed, Inc. San Francisco, CA #05-3300, 05-3500 og 05-3800) (sluttkonsentrasjon på 3 pg/ml i 100 pl totalvolum) ble tilsatt til rørene. Rørene ble inkubert i 30 minutter ved RT på sentrifugen virvlende ved 100 rpm. 200 pl Origen analysebuffer (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD #402-050-03) per rør ble tilsatt og kort virvlet og deretter ble rørene talt i Origen analysatoren og ECL (elektrokjemiluminescens)-enheter ble bestemt for hvert rør. Normaliseringsfaktorer ble bestemt for å korrigere for forskjeller i binding av fusjonsproteiner til dynoperler, og ECL-enheter ble korrigert for ikke-spesifikk binding før beregning av selektivitetsforhold.

Resultatene fra analysene er gitt i tabeller IVA og IVB.

Eksempel 9

Human T- celle siqnalmodell

For å ytterligere definere aktiviteten til antistoffer ifølge oppfinnelsen for å virke som immunregulatorer, utviklet vi visse T-celle-analyser for å kvantifisere forbedringen av T-celle IL-2-produksjon etter blokkering av CTLA-4-signal med anti stoffer. De følgende materialer og metoder ble utnyttet i forbindelse med eksperimentene:

Materialer og metoder

Nylig isolerte humane T-celler ble preparert ved anvendelse av Histopaque (Sigma, St. Louis, MO #A-70543) og T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50-T), og stimulert med PHA (1 pg/ml) (renset fytohemagglutinin, Murex Diagnostics Ltd. Dartford, England, #HA 16) i medium (RPMI 1640 inneholdende L-glutamin, MEM ikke-essensielle aminosyrer, penicillin, streptomycin, 25 mM Hepes og 10% FBS) ved en konsentrasjon på lxlO<6>celler/ml og inkubert ved 37°C i to dager. Cellene ble vasket og fortynnet i medium til 2xl0<6>celler/ml. Rajiceller (Burkitt lymfom, Human ATCC Nr.: CCL 86 klasse II American Type Culture Collection Rockville, MD) ble behandlet med mitomycin C (Sigma St. Louis, MO, # M-4287)(25 pg/ml) i en time ved 37°C. Rajicellene ble vasket 4x i PBS og resuspendert ved 2xl0<6>celler/ml. Humane T-celleblaster (5xl0<5>/ml), Rajiceller (5xl0<5>/ml) og anti-CTLA-4 antistoffer eller et isotypet-matchet kontrollantistoff ved ulike konsentrasjoner ble tilsatt til 96-brønn mikrotiterplater og platene ble inkubert ved 37°C i 72 timer. Totalvolum per brønn var 200 pl. Syttito timer etter stimulering ble platene spunnet ned og supernatant fjernet og frosset for senere bestemmelse av IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, #D2050) og IFN-y (Quantikine IFN-g ELISA kit, R&D Systems). Cytokinforsterkning ble definert som forskjellen mellom cytokinnivåer i kulturer inneholdende en anti-CTLA-4 blokkering mAb mot et isotype-matchet kontrollantistoff. For strømningscytometrieksperimenter ble Rajiceller vasket lx med FACS-buffer (PBS inneholdende 2% varmeinaktivert FCS, 0,025% natriumacid). Cellepellets ble resuspendert i FACS-buffer ved lxlO<6>celler/100 pl inkubert med 10 pl av anti-CD80-PE (Becton Dickinson, San Jose, CA) eller anti-CD86-PE (Pharmingen, San Diego, CA) i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket to ganger og resuspendert i 1 ml FACS-buffer. Strøm ni ngscytometri ble utført ved anvendelse av en Becton Dickinson FACSort. Histogrammarkerere ble satt ved analyse av relevante isotype kontrollantistoffer (Caltag, Burlingame, CA).

Generelt har vi utviklet en analyse som kan anvendes for hurtig bestemmelse av T-celle IL-2 oppregulering. Som vil bli forstått, er stimulering av T-celler B7- og CD28-avhengig. Videre lager ikke vaskede T-blaster detekterbare IL-2 og Rajiceller lager ikke detekterbar IL-2 selv når stimulert med LPS eller PWM. Imidlertid, i kombinasjon, kan T-blastene kokultivert med Rajiceller modellere B7, CTLA-4, og CD28 signalgivende hendelser og virkningene av antistoffene derpå kan analyseres. Figur 11 viser ekspresjonen av B7-1 og B7-2 på Rajiceller ved anvendelse av anti-CD80-PE og anti-CD86-PE mAber ved anvendelse av strømningscytometri (FACer) som beskrevet i eksempel 6. Figur 12 viser den konsentrasjonsavhengige forbedring av IL-2 produksjon i T-celleblastene/Rajianalysen indusert ved CTLA-4 blokkerende antistoffer (BNI3 (PharMingen) og 4.1.1, 4.8.1 og 6.1.1 antistoffene ifølge oppfinnelsen). Figur 13 viser den konsentrasjonsavhengige forbedring av IFN-y produksjon i T-celleblastene /Rajianalysen indusert ved CTLA-4 blokkerende antistoffer (BNI3 (PharMingen) og 4.1.1, 4.8.1 og 6.1.1 antistoffene ifølge oppfinnelsen) (samme donor T-celler). Figur 14 viser den gjennomsnittlige forbedring av IL-2 produksjon i T-celler fra 6 donorer indusert ved CTLA-4 blokkerende antistoffer i T-celleblasten/Rajianalysen. Det er interessant å betrakte at mAb, CT4.9.1, binder til CTLA4, men ikke blokkerer B7-binding. Derfor er ganske enkelt binding til CTLA-4 utilstrekkelig i seg selv for å tilveiebringe et funksjonelt antistoff ifølge oppfinnelsen. Figur 15 viser gjennomsnittsforbedringen av IFN-y produksjon i T-celler fra 6 donorer indusert ved CTLA-4 blokkerende antistoffer i T-celleblasten/Rajianalysen. Figur 19 viser en sammenligning mellom 4.1.1 og 11.2.1 antistoffene ifølge oppfinnelsen ved en konsentrasjon på 30 pg/ml i 72 timers T-celleblast/Rajianalyse som beskrevet i dette eksempel 9 og Superantigenanalysen beskrevet i eksempel 10. Figur 20 viser den konsentrasjonsavhengige forbedring av IL-2 produksjon i T-celleblasten /Rajianalysen indusert av 4.1.1 og 11.2.1 CTLA4 antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Den følgende tabell IVc tilveiebringer informasjon relatert til gjennomsnittlig forbedring og område av forbedring av cytokinrespons i Raji- og SEA-analysene ifølge oppfinnelsen. Hvert av eksperimentene som er inkludert i resultatene er basert på antistoff med en dose på 30 pg/ml og målt ved 72 timer. Antall donorer anvendt i eksperimentene så vel som responser er vist.

Eksempel 10

Human T- celle siqnalmodell

Vi utviklet en andre cellulære analyse for å kvantifisere forbedringen av T-celle IL-2 oppregulering etter blokkering av CTLA-4 signal med antistoffene. De følgende materialer og metoder ble utnyttet i forbindelse med eksperimentene:

Materialer og metoder

Human PBMC ble preparert ved anvendelse av Accuspin. Mikrotiterplater ble forbelagt med et anti-CD3 antistoff (Ieu4, Becton Dickinson) (60 p/ml) og inkubert i 2 timer ved 37°C. hPBMC ble tilsatt til brønnene ved 200 000 celler per brønn. Staphylococcus enterotoksin A (SEA) (Sigma) ble tilsatt til brønnene ved 100 ng/ml. Antistoffer ble tilsatt til brønnene, vanligvis ved 30 pg/ml. Celler ble deretter stimulert i 48, 72 eller 96 timer. Plater ble sentrifugert ved det ønskede tidspunkt og supernatanter ble fjernet fra brønnene. Deretter ble supernatanter sjekket for IL-2 produksjon ved anvendelse av ELISA (R&D Systems).

Resultater fra disse eksperimentene er vist i figurene 16, 17 og 21. I figur 16, ved induksjon av IL-2 produksjon i hPBMC fra 5 donorer målt 72 timer etter stimulering. I figur 17 er resultater vist fra målinger av full-blod, ved å analysere forskjellen i induksjon av IL-2 produksjon i blodet til 3 donorer som målt ved 72 og 96 timer etter stimulering.

I figur 21, er forbedringen av IL-2 produksjon i full-blod til 2 donorer målt ved 72 timer etter stimulering.

Eksempel 11

Tumor dyremodell

Vi har etablert en antitumormodell for in vivo-analysen av anti-murin-CTLA-4 antistoffer til å inhibere tumorvekst. I modellen blir en murin fibrosarkomtumor dyrket og dyrene blir behandlet med anti-murin-CTLA-4 antistoffer. Materialene og metodene for å etablere modellen er tilveiebrakt under:

Materialer og metoder

Hunn A/J mus (6-8 uker gamle) ble injisert subkutant på dorsalsiden av nakken med 0,2 ml SalN tumorceller (lxlO<6>) (Baskar 1995). Anti-murin CTLA-4 eller et isotype matchet kontrollantistoff (PharMingen, San Diego, CA, 200 pg/dyr) ble injisert intraperitonealt på dager 0, 4, 7 og 14 etter injeksjonen av tumorceller. Tumormålinger ble tatt i løpet av forløpet til det 3-4 ukers eksperimentet ved anvendelse av en Starrett SPC Plus elektronisk passer (caliper) (Athol, MA) og tumorstørrelse ble uttrykt ved som overflateareal dekket av tumorvekst (mm<2>).

Figur 18 viser inhibisjonen av tumorvekst med et anti-murin CTLA-4 antistoff i en

murin fibrosarkom tumormodell. Som vist i figur 18, hadde dyr behandlet med anti-CTLA-4 en reduksjon i tumorvekst sammenlignet med dyr behandlet med et isotype kontrollantistoff. Følgelig er anti-murin CTLA4 mABer i stand til å inhibere vekst av et fibrosarkom i en musetumormodell.

Det er forventet at antistoffer som er kryssreaktive med murin CTLA-4 vil oppføre seg lignende i modellen. Imidlertid, av antistoffene ifølge oppfinnelsen som har blitt sjekket for kryss-reaktivitet, er ingen kryssreaktive med murin CTLA-4.

Eksempel 12

Tumordyremodell

For å ytterligere undersøke aktiviteten til antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble en xenograft CSID musemodell designet for å undersøke eradikasjonen av etablerte tumorer og deres avledede metastaser. I modellen blir SCID mus utstyrt med podede humane T-celler og blir implantert med pasientavledede ikke-små cellelungeceller (NSCL) eller kolorektale karsinom (CC) celler. Implantasjon blir gjort inn i de gonodale fettputene til SCID mus. Tumorene ble tillatt å vokse, og deretter fjernet. Musene utvikler humanaktige tumor og levermetastaser. En slik modell er beskrevet i Bumpers et al., J. Surgical Res. 61; 282-288 (1996).

Det er forventet at antistoffer ifølge oppfinnelsen vil inhibere vekst av tumorer dannet i slike mus.

Opplisting av referanser

Alegre et al. J Immuno/ IS7:4762- 70 (1996)

Allison and Krummel Science 270:932-933 (1995)

Balzano et al. / nr J Cancer SuppI7:28- 32 (1992)

Blair et al. J JmmunoI160:l2- 5 (1998)

Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)

Boussiotis et al. Proe Nati Acad Sei USA 90: 11059-63 (1993)

Bowie et al. Science 253: I 64 ( 1991 )

Bruggeman et al. PNAS VSA 86:6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. and Neuberger, M.S. in Methods: A companion to Methods in Enzymology 2:159-165 {Lemer et al. eds. Academic Press (1991)

Bruggemann et al., Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus." Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991)

Bruggemann, M. and Neuberger, M.S. "Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice." Immunology Today 17:391-397 (1996)

Brunet et al. Nature 328:267-270 (1987)

Bumpers et al 1: Surgical Res. 61 :282-288 ( 1996)

Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988»

Castan et al. Immunology 90~265- 71 ( 1997)

Cepero et al. JExp Med 188:199-204 (1998)

Chen et al. "Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus" International Immunology 5:647- 656 (1993)

Chen et al. Cell71 : 1093-1102 (1992)

Chen et al. Human Gene Therap)' 5:595-601 (1994)

Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)

Choi et al. "Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome" Nature Genetics 4: 117- 123

(1993)

Chathia & Lesk J. Mol. Rio/. 196:901-917 (1987)

Chathia et al. Nature 342:878-883 (1989)

Chuang et al. J. Immunol. 159:144-151(1997)

Coligan et al., Unit 2.1, ""Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current protocols in immunology (1994)

Cwirla et al. PNAS VSA 87:6378-6382 (1990)

Dariavach et al. Eur. J. Immullol. 18:1901-1905 (1988)

Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972») and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10

de Boer et al. Eur J ImmunoI23:3120- 5 (1993)

Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)

Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)

Fallarino et al. J Exp Med 188:205-10 (1998)

Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994)

Fauchere, J. Adv. Drog Res. 15:29 (1986)

Fishwild et al., "High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice." Nature Biotech. 14:845-851 (1996).

Freeman et al. J Exp Med 178:2185-92 (1993)

Freeman et al. J JmnzunoI161:2708-15 (1998)

Freeman et al. Science 262:907-9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W ., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)

Galfre, G. and Milstein, C, "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures." Methods Enzynzol. 73:3-46 (1981)

Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)

Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)

Grosschedl et al. Cell41 :885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS VSA 94:4937-4942 (1997)

Harding et al. Nature 356:607-609 (1994)

Harper et al. J ImmunoI147:1037-44 (1991)

Hathcock et al. Science 262:905-7 (1993)

Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)

Horspool et al. J Immunol 160:2706-14 (1998)

Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992)

Houghten PNAS VSA 82:5131-5135 (1985)

Hurwitz et al. J NeuroimmunoI73:57-62 (1997)

Hurwitz et al. Proe Nati Acad Sei US A 95:10067- 71 (1998)

Immunology -A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. ( 1991))

Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)

Jakobovits et al., "Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome." Nautre 362:255-258 ( 1993)

Jakobovits, A. et al., "Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production." Proe. Nati. Acad. Sei. VSA 90:2551-2555 (1993)

Jakobovits, A., (1994) "Humanizing the mouse genome." Current Biology 4:761-763

Jakobovits, A., "Production of fully human antibodies by transgenic mice." Current Opinion in Biotechnology 6:561-566 (1995)

Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))

Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H.

publication no.91-3242

Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)

Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)

Krummel and Allison J Exp Med 182:459-65 (1995)

Krum mel et al. In! ImmunoW: 519- 23 (1996)

Kuchroo et al. Cell80:707- 18 (1995)

Kwon et al. PNAS VSA 94:8099-103 (1997)

LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)

Lenschow et al. Proe Nati Acad Sei VSA 90:11054-8 (1993)

Lenschow et al. Science 257:789-792 (1992)

Lin et al. J Exp Med 188:199-204 (1998)

Linsley et al. J Exp Med 176: 1595-604 ( 1992)

Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)

Linsley et al. Science 257:792-795 (1992)

Lill et al. J. Immunol. 139:3521 (1987)

Liu et al. P. N. A. S. 84:3439 (1987)

Lonberg et al., "Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications." Nature 368:856-859 (1994).

Luhder et al. J Exp Med 187:427-32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4: 11-15 ( 1997)

Markees et al. J Clin Invest 101 :2446-55 (1998)

Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes." Eur. J: Immunol. 21 :985-991 ( 1991 )

McCoy et al. J Exp Med 186: 183- 7 (1997)

Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)

Needleman and Wunsch 3. Mol. Biol. 48:443 (1970)

Okayarna et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)

Pannley and Smith Gene 73:305-318 (1988)

Pearson and Lipman Proe. Nal/. Acad. Sei. ( U. S. A.) 85:2444 (1988)

Perez et al. Immunity 6:411- 7 ( 1997)

Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995)

Perrin et al. J Jmmunoll57:1333- 6 (1996)

Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)

Razi-Wolf et al. Proe Nati Acad Sei VSA 90:11182-6 (1993)

Remington's Pharmaceutical Sciences (I5th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularly Chapter 87 by Blaug, Seymour

Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)

Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)

Scott TIBS 17:241-245 (1992)

Smith and Watennan Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)

Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)

Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)

Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)

Taylor et al., " A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins." Nucleic Acids Research 20:6287-6295

(1992) Taylor et al., "Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM." International Immunology 6:579-591 (1994)

The McGraw- Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985»

Thornton et at. Nature 354:105 (1991)

Tivol et al. Immunity 3:541-7 (1995)

Townsend and Allison Science 259:368 (1993)

Traunecker et al. In!. J. Cancer ( Suppl.) 7:51-52 (1992)

Tuaillon et al. "Analysis of direct and inverted DJH rearrangements in a human lg heavy chain transgenic minilocus" J. Immunol. 154:6453-6465 (1995)

Tuaillon et al., "Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in □ and y transcripts." Proe. Nati. Acad. Sei.

VSA 90:3720-3724 (1993)

Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)

Van Parijs et al. J Exp Med 186:1119-28 (1997)

Veber and Freidinger TINSp. 392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)

Walunas et al. Immunity 1:405-13 (1994)

Walunas et al. J Exp Med 183:2541-50 (1996)

Waterhouse et al. Science 270:985~988 (1995)

Winter and Hams Immunol Today 14:43-46 (1993)

Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992)

Vang et al. CancerRes 57:4036-41 (1997)

Yi-qun et al. Int Immunol 8:37-44 (1996)

Zon et al. Anti- CancerDrug Design 6:539 (1991)

Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 ( p. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991»

Fry et al. "Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new dass of tyrosine kinase inhibitor" Proe Nati Acad Sei U SA 95:12022-7 (1998)

Hoffman et al... A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain" J Mol Biol 282:195-208 (1998)

Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p38—a case study" Acta Biochem Pol 44:557-64 (1997)

Jouko et al. "Identification of esk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure" Biochem J 322:927-35 (1997)

Singh et al. "Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases" J Med Chem 40:1130-5 (1997)

Mandel et al. "ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling" Nal Biolechnol 14:323-8 (1996)

Monfardini et al. "Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists" ProcAssocAm Physicians 108:420-31 (1996)

Furet et al. "Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411" J Comput Aided Mol nes 9:465-72 (1995)

III et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949- 57

(1997)

Martin et al. "The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6" EMBO J 13:5303-9 (1994)

U.S. Patent Application Serial No. 07/466,008, filed January 12, 1990

U.S. Patent Application Serial No. 07/574,748, filed August 29, 1990

U.S. Patent Application Serial No. 07/575,962, filed August 31, 1990

U.S. Patent Application Serial No. 07/610,515, filed November 8, 1990 U.S. Patent Application Serial No. 07/810,279, filed December 17, 1991 U.S. Patent Application Serial No. 07/853,408, filed March 18, 1992 U.S. Patent Application Serial No. 07/904,068, filed June 23, 1992

U.S. Patent Application Serial No. 07/919,297, filed July 24,1992

U.S. Patent Application Serial No. 07/922,649, filed July 30, 1992

U.S. Patent Application Serial No. 07/990,860, filed December 16, 1992 U.S. Patent Application Serial No. 08/031,801, filed March 15,1993 U.S. Patent Application Serial No. 08/053,131, filed April 26, 1993

U.S. Patent Application Serial No. 08/096,762, filed July 22, 1993

U.S. Patent Application Serial No. 08/112,848, filed August 27, 1993 U.S. Patent Application Serial No. 08/155,301, filed November 18,1993 U.S. Patent Application Serial No. 08/161,739, filed December 3,1993 U.S. Patent Application Serial No. 08/165,699, filed December 10, 1993 U.S. Patent Application Serial No. 08/209,741, filed March 9,1994

U.S. Patent Application Serial No. 08/234,145, filed April28, 1994

U.S. Patent Application Serial No. 08/724, 752, filed October 2, 1996 U.S. Patent Application Serial No. 08/730,639, filed October 11, 1996 U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, filed December 3, 1996 U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, filed December 3, 1996

U.S. Patent No. 4,399,216

U.S. Patent No. 4,681,581

U.S. Patent No. 4,683,195

U.S. Patent No. 4,683,202

U.S. Patent No.4, 735,210

U.S. Patent No.4, 740,461

U.S. Patent No. 4,816,397

U.S. Patent No. 4,912,040

U.S. Patent No. 4,959,455

U.S. Patent No. 5,101,827

U.S. Patent No. 5,102,990 (RE 35,500)

U.S. Patent No. 5,151,510

U.S. Patent No.5, 194,594

U.S. Patent No. 5,434,131

U.S. Patent No. 5,530,101

U.S. Patent No. 5,545,806

U.S. Patent No. 5,545,807

U.S. Patent No. 5,585,089

U.S. Patent No. 5,591,669

U.S. Patent No. 5,612,205

U.S. Patent No. 5,625,126

U.S. Patent No. 5,625,825

U.S. Patent No. 5,633,425

U.S. Patent No. 5,643,763

U.S. Patent No. 5,648,471

U.S. Patent No. 5,661,016

U.S. Patent No. 5,693,761

U.S. Patent No. 5,693,792

U.S. Patent No. 5,697,902

U.S. Patent No.5, 703,057

U.S. Patent No. 5,714,350

U.S. Patent No.5, 721,367

U.S. Patent No.5, 733,743

U.S. Patent No. 5,770,197

U.S. Patent No.5, 770,429

U.S. Patent No.5, 773,253

U.S. Patent No.5, 777,085

U.S. Patent No. 5,789,215

U.S. Patent No.5, 789,650

U.S. Patent No. 5,811,097

European Patent No. EP O 546 073 B 1

European Patent No. EP 0463151 Bl, grant published June 12,1996

International Patent Application No. WO 92/02190

International Patent Application No. WO 92/03918

International Patent Application No. WO 92/22645

International Patent Application No. WO 92/22647

International Patent Application No. WO 92/22670

International Patent Application No. WO 93/00431

International Patent Application No. WO 93/12227

International Patent Application No. WO 94/00569

International Patent Application No. WO 94/02602, published February 3, 1994 International Patent Application No. WO 94/25585

International Patent Application No. WO 94/29444

International Patent Application No. WO 95/01994

International Patent Application No.. WO 95/03408

International Patent Application No. WO 95/24217

International Patent Application No. WO 95/33770

International Patent Application No. WO 96/14436

International Patent Application No. WO 96/34096, published October 31,1996 International Patent Application No. WO 97/13852

International Patent Application No. WO 97/20574

International Patent Application No. WO 97/38137

International Patent Application No. WO 98/24884

International Patent Application no. WO 98/24893, published June 11, 1998

Claims

1. Monoklonalt antistoff som binder til cytotoksisk T-lymfocytt antigen 4 (CTLA-4) eller et antigenbindende fragment derav, hvor nevnte antistoff omfatter et tungkjede variabelt områdesom er minst 85% identisk med det tungkjede variable område i SEQ ID NO: 63; og hvor nevnte antistoff omfatter et lettkjede variabelt område som er minst 90% identisk med det lettkjede variable område i SEQ ID NO: 65.

2. Antistoff eller fragment ifølge krav 1, hvor nevnte antistoff omfatter et tungkjede variabelt område som er minst 90% identisk med det tungkjede variable område i SEQ ID NO: 63.

3. Antistoff eller fragment ifølge krav 1, hvor nevnte antistoff eller fragment binder til CTLA-4 med en KD på 10" <9> M eller større affinitet.

4. Antistoff eller fragment ifølge krav 1, hvor nevnte antistoff eller fragment inhiberer binding mellom CTLA-4 og B7-2 med en IC50 på 100 nM eller lavere.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet ifølge krav 1, omfattende trinnene å: a) immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen omfattende CTLA-4 hvor pattedyret er i stand til å uttrykke humane antistoffer i sine B-celler; b) isolere B-celler fra pattedyret; c) undersøke nevnte B-celler eller cellelinjer avledet fra disse, for antistoff som binder til CTLA-4; d) dyrke en cellelinje som uttrykker antistoffer som binder til CTLA-4; og e) isolere antistoffene som binder til CTLA-4.

6. Farmasøytisk sammensetning omfattende antistoffet eller fragmentet ifølge krav 1 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

7. Cellelinje som danner antistoffet eller fragmentet ifølge krav 1.

8. Isolert nukleinsyre som koder for en tunge kjeden eller et antigenbindende fragment derav, og/eller den lette kjeden eller antigenbindende fragment derav, av et antistoff eller fragment ifølge krav 1.

9. Vertscelle omfattende en isolert nukleinsyre som koder for den tunge kjede eller et antigenbindende fragment derav, og/eller en isolert nukleinsyre som koder for den lette kjede eller et antigenbindende fragment derav, av et antistoff eller fragment ifølge krav 1.

10. Transgent pattedyr eller plante omfattende en isolert nukleinsyre som koder for den tunge kjede eller et antigenbindende fragment derav, og/eller enn isolert nukleinsyre som koder for den lette kjede eller antigenbindende fragment derav, av et antistoff eller fragment ifølge krav 1, hvor det transgene pattedyr eller plante omfatter nevnte nukleinsyre(r).

11. Anvendelse av antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller farmasøytisk sammensetning ifølge krav 6 for fremstilling av et medikament til behandling av kreft.

12. Anvendelse av antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller farmasøytisk sammensetning ifølge krav 6 for fremstilling av et medikament til behandling av melanom.

13. Anvendelse av en sammensetning omfattende et antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 6, samt celler som uttrykker granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor, for fremstilling av et medikament til behandling av en tumor.