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JP6180663B2 - Ｔｉｇｉｔに対する抗体 - Google Patents

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Description

ＴＩＧＩＴ(ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体)は、ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３またはＶｓｉｇ９としても知られる共抑制受容体タンパク質である。ＴＩＧＩＴは、Ｔ細胞上に特異的に発現されるタンパク質のゲノム検索において発見され、免疫グロブリン可変ドメイン、膜貫通ドメインおよび免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有し、ＰＶＲタンパク質ファミリーのシグネチャー配列要素を含有する。ポリオウイルス受容体(ＰＶＲ ＣＤ１５５)と、およびネクチン２(ＣＤ１１２)と相互作用するとわかっている。例えば、Stengel et al. (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 19:5399；ＷＯ２００６／１２４６６７；ＷＯ２００９／１２６６８８を参照のこと。ＰＶＲは、同時活性化受容体ＤＮＡＭ−１(ＣＤ２２６)と相互作用して腫瘍死滅を増強し得るが、高親和性ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ相互作用は、このような死滅を阻害し、同様にＰＶＲを発現する正常(自己)細胞死滅を防ぐよう作用し得る。Stanietsky et al. (2009) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 106:17858。この阻害性相互作用の優位は、抗自己免疫反応の抑制において重要であり得るが、腫瘍に関連しては、腫瘍根絶を抑制する。同著。
ＴＩＧＩＴは、成熟した免疫制御性樹状細胞の生成を促進することによってＴ細胞活性化を抑制する。Yu et al. (2009) Nat. Immunol. 10:48。ＴＩＧＩＴおよびその他のこのような共抑制分子(例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｌａｇ３およびＢＴＬＡ)は、腫瘍細胞による免疫監視の回避において役割を果たし得る。実験によって、ＰＶＲ／ＣＤ１５５は、黒色腫細胞(Inozume et al. (2014) J. Invest. Dermatol. 134:S121 - Abstract 693)および種々のその他の腫瘍で過剰発現されると示されている。ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ相互作用は、ＴおよびＮＫ細胞の抗腫瘍反応を阻害することによって免疫媒介性根絶からこのような腫瘍細胞を遮蔽し得る可能性がある。Stanietsky et al. (2009) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 106:17858およびLozano et al. (2012) J. Immunol. 188:3869。その他の実験によって、Ｔｈ１およびＴｈ１７反応を選択的に抑制する調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)のＴＩＧＩＴ＋サブセットが同定され(Joller et al. (2014) Immunity 40:569)、これは、抗ＴＩＧＩＴ抗体が抗腫瘍免疫応答を増強し得る代替機序を示唆する。
ＴＩＧＩＴは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡなどのその他の共抑制反応と同様に免疫応答を「止める」よう作用し得る。同著。この治療的アプローチを検証する、ＣＴＬＡ−４(イピリムマブ)およびＰＤ−１(ニボルマブ、ペンブロリズマブ)を標的とする抗体が、ヒト癌の治療のために承認されている。ヒトＴＩＧＩＴと結合する抗体もまた、癌の治療に使用してもよい。例えば、ＷＯ２００６／１２４６６７を参照のこと。マウスモデルでは、ＰＤ−Ｌ１およびＴＩＧＩＴ両方の抗体遮断は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性腫瘍拒絶の相乗的増強につながる。Grogan et al. (2014) J. Immunol. 192(1) Suppl. 203.15; Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:1-15。黒色腫の動物モデルにおいて同様の結果が得られている。Inozume et al. (2014) J. Invest. Dermatol. 134:S121 - Abstract 693。いくつかの実験によって、ＴＩＧＩＴ遮断は、ＰＶＲ／ＣＤ１５５との結合についてＴＩＧＩＴと競合する同時活性化受容体ＤＮＡＭ−１／ＣＤ２２６の存在下でのみ、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を増強するのに有効であることが示唆されている。Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:1-15。
最近の実験によって、Ｆａｐ２タンパク質を発現する腫瘍内細菌が、ＴＩＧＩＴとの結合によってＮＫ細胞媒介性腫瘍死滅を阻害し得ると実証されており(Gur et al. (2015) Immunity 42:344)、これは、このような細菌を排除すること、ＴＩＧＩＴのＦａｐ２との相互作用を遮断することまたはＴＩＧＩＴの活性を遮断することは、全般的に、癌、例えば、結腸直腸癌の治療において有用であり得ることを示唆する。Hampton (2015) JAMA 313:1305。
癌および慢性ウイルス感染を治療する改善された方法ならびに方法において使用するための治療用モノクローナル抗体などの医薬に対する必要性が存在する。このような改善された治療方法において使用するための医薬は、ＴＩＧＩＴと特異的に結合し、抗腫瘍もしくは抗ウイルス性免疫応答のＴＩＧＩＴ媒介性抑制を逆転させるかもしくは部分的に逆転させる抗体または抗体断片を含み得る。
本発明は、ｈｕＴＩＧＩＴと結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、癌および慢性ウイルス感染の治療の改善された医薬および方法を提供する。ｈｕＴＩＧＩＴと特異的に結合し、ｈｕＴＩＧＩＴとの高親和性の特異的な結合、サルＴＩＧＩＴ(例えば、カニクイザルＴＩＧＩＴ)との結合、ＴＩＧＩＴのＰＶＲおよび／またはネクチン−２との結合を遮断する能力、ＴＩＧＩＴのＤＮＡＭとの相互作用を遮断する能力またはこれらの特性の任意の組合せなどの望ましい機能的特性を有する、モノクローナル抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体などの単離された抗体が、本明細書において提供される。
本発明は、ＴＩＧＩＴ媒介性シグナル伝達が抗腫瘍免疫応答を抑制する癌、同時活性化受容体ＤＮＡＭ−１／ＣＤ２２６とのＴＩＧＩＴ相互作用が抗腫瘍免疫応答を抑制する腫瘍、ＴＩＧＩＴ発現性調節Ｔ細胞が抗腫瘍免疫応答を抑制する腫瘍またはＴＩＧＩＴが、そうでなければ抗腫瘍免疫応答を阻害する腫瘍を含めた、癌を治療する改善された方法および方法において使用するための治療用抗体をさらに提供する。本発明はまた、ＴＩＧＩＴが抗ウイルス性免疫応答を抑制する慢性ウイルス感染の治療において使用するための方法および治療用抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、ｈｕＴＩＧＩＴとの結合について本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する抗体と競合し、および／またはｈｕＴＩＧＩＴとの結合から本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗体を交差遮断する抗体に関する。
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、抗腫瘍免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強する。その他の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴ媒介性阻害シグナル伝達を遮断し、ＮＫ細胞のＰＶＲ／ＤＮＡＭ同時刺激を可能にして、ＮＫ媒介性抗腫瘍応答死滅を増大する。さらに別の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、そうでなければ抗腫瘍免疫応答を抑制するであろう、腫瘍内調節性Ｔ細胞の集団を枯渇させる。さらに別の実施形態では、ＩｇＧ１としてフォーマットされた本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＣＤ８＋疲弊Ｔ細胞およびＴｒｅｇを枯渇させ、新鮮な疲弊していないＣＤ８＋Ｔ細胞の流入を可能にする。その他の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、機序は必ずしも相互排他的ではないので、上記で言及した機序の１種または複数によって作用する。
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ＴＩＧＩＴ発現細胞の抗腫瘍活性を増強することに頼る実施形態において、活性化Ｆｃγ受容体(ＦｃγＲ)と結合しない。代替実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇなどのＴＩＧＩＴ発現細胞の死滅に頼る実施形態において、１種または複数の活性化ＦｃγＲと結合する。
本発明はまた、ｈｕＴＩＧＩＴと特異的に結合し、それぞれ、配列番号１４、１５および１６を含む重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む、単離されたモノクローナル抗体(１５Ａ６)またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、ｈｕＴＩＧＩＴと特異的に結合し、それぞれ、配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む単離されたモノクローナル抗体(２２Ｇ２)またはその抗原結合断片を提供する。
本発明は、ｈｕＴＩＧＩＴと特異的に結合し、それぞれ、配列番号２６、２７および２８を含む重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３ならびに／またはそれぞれ、配列番号２９、３０および３１を含む軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む、単離されたモノクローナル抗体(１１Ｇ１１)またはその抗原結合断片をさらに提供する。
本発明は、ｈｕＴＩＧＩＴと特異的に結合し、それぞれ、配列番号３２、３３および３４を含む重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号３５、３６および３７を含む軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む、単離されたモノクローナル抗体(１０Ｄ７)またはその抗原結合断片をなおさらに提供する。
本発明はまた、ｈｕＴＩＧＩＴと特異的に結合し、配列番号２(または３、４、５)および６、配列番号７(または８)および９、配列番号１０および１１ならびに配列番号１２および１３に開示される重鎖可変鎖および軽鎖可変鎖配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片も提供する。
本発明は、ｈｕＴＩＧＩＴと結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号２、３、４、５、７、８、１０および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ｈｕＴＩＧＩＴと結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片も提供し、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号６、９、１１および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、(ａ)１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１および／または１０Ｄ７と同一のｈｕＴＩＧＩＴ上のエピトープと結合し、ならびに／または(ｂ)例えば、ＦＡＣＳもしくはＥＬＩＳＡによって測定されるような、１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１および／または１０Ｄ７のｈｕＴＩＧＩＴとの結合を阻害する。
特定の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ｈｕＴＩＧＩＴ(配列番号１)の残基Ｅ６０、Ｉ１０９、Ｌ６５、Ｎ７０、Ｆ１０７、Ｔ１１７、Ｉ６８、Ｈ７６およびＮ５８(抗体２２Ｇ２)のうち１個もしくは複数を含むか、もしくはからなるエピトープと、残基Ｇ７４、Ｎ７０、Ｈ７６、Ｌ６５、Ｌ７３、Ｑ５６、Ｉ６８、Ｈ１１１およびＰ１１４(抗体１１Ｇ１１)のうち１個もしくは複数を含むか、もしくはからなるエピトープで、または残基Ｈ７６、Ｇ７４、Ｌ６５、Ｎ５８、Ｉ６８、Ｑ１３９、Ｇ１３５、Ｌ７３、Ｆ１０７、Ｎ７０、Ｅ６０、Ｈ１３４、Ａ１３２およびＩ１０９(抗体１５Ａ６)のうち１個もしくは複数を含むか、もしくはからなるエピトープで結合する。
あるいは、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ(配列番号３８)およびＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴ(配列番号３９)(抗体２２Ｇ２)からなる群から、またはＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ(配列番号４０)およびＨＴＹＰ(配列番号４１)(抗体１１Ｇ１１)からなる群から、またはＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ(配列番号３８)、ＦＣＩおよびＡＥＨＧＡＲＦＱ(配列番号４３)(抗体１５Ａ６)からなる群から選択される１種または複数の配列を含むか、またはからなるエピトープで結合する。
なおさらなる実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、残基Ｌ６５、Ｉ６８、Ｎ７０およびＨ７６のうち１種または複数を含むかまたはからなるｈｕＴＩＧＩＴ(配列番号１)上のコアエピトープと、および／またはＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ(配列番号４４)を含むかもしくはからなるエピトープで結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はまた、カニクイザルＴＩＧＩＴと結合する。
種々の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体またはその変異体である。それだけには限らないが、「疲弊した」腫瘍特異的Ｔ細胞においてＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断するかもしくはＮＫ細胞に対する阻害シグナルを遮断してＤＮＡＭ−１／ＰＶＲ媒介性同時刺激を可能にする方法またはＤＮＡＭ−１／ＣＤ２２６とのＴＩＧＩＴ相互作用を遮断して、ＤＮＡＭ−１ホモ二量体化を損なう方法を含めた特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、エフェクターレスまたはほとんどエフェクターレスのＦｃを含む。このようなＦｃ領域として、例えば、ヒトＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、または以下の突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ(ＥＵ番号付け)のうち１つもしくは複数を有するヒトＩｇＧ１のエフェクターレス変異体、例えば、列挙された突然変異のうち５つすべてを含むＩｇＧ１.１ｆ(配列番号４８)が挙げられる。
それだけには限らないが、ＴＩＧＩＴ＋調節Ｔ細胞を枯渇させる方法を含めた代替実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１などの活性化ＦｃγＲ(ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIａまたはＦｃγＲIIIａ)と選択的に結合するＦｃまたは野生型ＩｇＧ１ Ｆｃに対して増強された、活性化ＦｃγＲとの結合を有する配列変異体を含む。Ｔｒｅｇの枯渇を駆動する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体のＩｇＧ１型の使用を含む実施形態では、腫瘍微小環境への効果を局在化して、末梢組織における活性によって引き起こされる副作用の可能性を最小にするために、腫瘍内注射を適宜使用してもよい。
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体のＣＤＲ領域またはその抗原結合断片中のメチオニン残基(例えば、１０Ｄ７のＣＤＲＨ３中のＭ１１５、配列番号３４)が、酸化を受けないアミノ酸残基と置換される。
特定の実施形態では、１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１または１０Ｄ７と同一エピトープと結合について競合し、交差遮断するかまたは結合する抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトまたはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、米国特許出願公開第２００９／０２５８０１３号に記載される抗体ではないか、またはそれと同一のエピトープと結合しない、例えば、それらは、抗ｈｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂ １０Ａ７または１Ｆ４と同一のエピトープと結合しない。また、Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:1; Yu et al. (2009) Nat. Immunol. 10:48も参照のこと。
その他の実施形態では、抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、重鎖ＶドメインＶ４−３９、Ｖ４−６１またはＶ１−６９を含めた、本明細書に開示される抗体と同一のヒトＶドメイン生殖系列配列に由来する可変ドメインを含む。より具体的な実施形態では、抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、Ｖ４−３９／ＶＡ２７(１５Ａ６)、Ｖ４−６１／ＶＬ６(２２Ｇ２)、Ｖ４−３９／ＶＬ６(１１Ｇ１１)およびＶ１−６９／ＶＬ１５(１０Ｄ７)などの本明細書に開示される抗体と同一のヒト重鎖および軽鎖Ｖドメイン生殖系列配列に由来する重鎖および軽鎖可変ドメインを含む。
種々の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤでｈｕＴＩＧＩＴと結合する。その他の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、２ｎＭから１００ｐＭの間のＫＤでｈｕＴＩＧＩＴと結合する。
その他の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、ＣＤＲＨ１(配列番号１４、２０、２６および３２)、ＣＤＲＨ２(配列番号１５、２１、２７および３３)、ＣＤＲＨ３(配列番号１６、２２、２８および３４)、ＣＤＲＬ１(配列番号１７、２３、２９および３５)、ＣＤＲＬ２(配列番号１８、２４、３０および３６)およびＣＤＲＬ３(配列番号１９、２５、３１および３７)などの抗体１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１０Ｄ７のＣＤＲのいくつかの組合せから本質的になる、または含む。その他の実施形態では、抗体は、抗体１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１０Ｄ７のＣＤＲ配列の別個の特定の組合せから本質的になる、または含む。
さらなる実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、抗体１５Ａ６(配列番号２〜５および６)、２２Ｇ２(配列番号７〜８および９)、１１Ｇ１１(配列番号１０および１１)および１０Ｄ７(配列番号１２および１３)の重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメインまたはこれらの開示された配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％配列同一性を共有する配列から本質的になるかまたは含む。
なおさらなる実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、抗体１５Ａ６(配列番号２〜５および６)、２２Ｇ２(配列番号７〜８および９)、１１Ｇ１１(配列番号１０および１１)および１０Ｄ７(配列番号１２および１３)の可変ドメイン配列を含む重鎖および／もしくは軽鎖またはこれらの開示された配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％配列同一性を共有する配列から本質的になるかまたは含む。
その他の実施形態では、本発明の抗体の抗原結合ドメインは、それだけには限らないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４またはＬＡＧ３を含む、異なる免疫調節性受容体と特異的に結合する抗原結合ドメインをさらに含む二重特異性分子中に存在する。
本発明は、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、核酸分子を含む発現ベクター、発現ベクターで形質転換された細胞ならびに発現ベクターで形質転換された細胞を発現させることによって抗体を産生し、抗体を回収する方法をさらに提供する。
本発明はまた、検出可能な標識または細胞傷害性薬剤などの薬剤と連結している、本明細書に記載される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と、担体とを含む医薬組成物を提供する。また、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片および使用のための説明書を含むキットが本明細書に提供される。
別の態様では、本発明は、例えば、そうでなければ抗腫瘍応答を弱めるであろう阻害シグナルの低減によって、抗原特異的Ｔ細胞応答が増強されるように、Ｔ細胞を、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの腫瘍抗原特異的エフェクターＴ細胞であり、例えば、ＴＩＧＩＴ媒介性阻害効果の遮断による増強は、抗腫瘍活性の増大をもたらす。本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片はまた、ＮＫ細胞において阻害シグナルを低減し、ひいては、その抗腫瘍活性を増大し得る。理論によって制限されるつもりはないが、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのＰＶＲとの結合を遮断し、ひいては、そうでなければ細胞に送達されるであろう阻害シグナルを低減または排除することによってエフェクターＴ細胞またはＮＫ細胞機能を増大する。あるいは、またはさらに、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、そうでなければＤＮＡＭ−１媒介性免疫活性化を低減するであろう、ＴＩＧＩＴとＤＮＡＭ−１／ＣＤ２２６間の相互作用を阻害し得る。
本発明は、Ｔ細胞を有効量の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生ならびに／またはＴ細胞の増殖を増大する方法をさらに提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の有効量の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体を投与することを含む、それを必要にする対象における腫瘍においてＴｒｅｇを低減または枯渇させる方法であって、ここで、抗体は、腫瘍におけるＴｒｅｇ数を低減する、エフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有する、方法を提供する。
本発明は、対象における免疫応答が増強されるように、対象に本発明の有効量の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象において免疫応答を増強する方法を提供する。特定の実施形態では、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が増強される。別の実施形態では、対象は、ウイルス感染を有し、抗ウイルス性免疫応答が増強される。
本発明はまた、腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象において腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。
本発明は、それを必要とする対象に、例えば、医薬組成物として、治療上有効な量の本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を投与し、それによって、癌を治療することを含む、例えば、免疫療法によって癌を治療する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌、難治性癌または再発性癌である。
特定の実施形態では、免疫機能を調節する方法および本明細書に記載された治療の方法は、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体を、１種または複数のさらなる治療薬、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１３７ｍＡｂ、抗ＣＤ２７ｍＡｂ、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストと組み合わせて、またはこれとともに二重特異性試薬として投与することを含む。特定の実施形態では、抗ｈｕＴＩＧＩＴ治療は、抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１治療、例えば、ヒトＰＤ−１と結合する抗体もしくはその抗原結合断片またはヒトＰＤ−Ｌ１と結合する抗体もしくはその抗原結合断片を用いる治療と組み合わせる。
いくつかの実施形態では、患者から得たサンプル、例えば、バイオプシーを、抗ＴＩＧＩＴ治療に対して応答する可能性が最も高い患者を選択するために、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でのＤＮＡＭ−１の発現についてスクリーニングし、ここで、Ｔ細胞でのＤＮＡＭ−１の存在は、患者が抗ＴＩＧＩＴ治療、例えば、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体または断片を用いる治療の際に有益な抗腫瘍応答を有することを示唆し、ＤＮＡＭ−１の不在は、抗ＴＩＧＩＴ治療から恩恵を受ける可能性が低い患者を同定する。その他の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ治療に対して応答する可能性が最も高い患者を選択するために、患者から得たサンプルを、腫瘍細胞または腫瘍浸潤骨髄系細胞でのＰＶＲおよび／またはネクチン−２の発現についてスクリーニングし、ここで、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の存在は、患者が、抗ＴＩＧＩＴ治療、例えば、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体または断片を用いる治療の際に有益な抗腫瘍応答を有することを示唆し、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２／ＣＤ１１２の不在は、抗ＴＩＧＩＴ治療から恩恵を受ける可能性が低い患者を同定する。種々の実施形態では、ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の細胞表面発現は、ＦＡＣＳ、ＩＨＣまたはＬＣ−ＭＳによる。別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるようなＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の細胞表面発現を決定することおよび本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を、治療利益を提供する可能性が最も高いものへ選択的にまたは排他的に投与することを含む、それを必要とする対象の治療の方法を提供する。
一実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療について考慮されている対象において可溶性ＰＶＲおよび／または可溶性ネクチン−２(ｓＰＶＲ、ｓネクチン−２)のレベルを測定し、上昇した可溶性ＰＶＲおよび／またはネクチン−２を示す対象のみを、抗体を用いて治療する。いくつかの実施形態では、ｓＰＶＲおよび／またはｓネクチン−２は、ＥＬＩＳＡまたはＬＣ−ＭＳによって血清中で検出される。
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断とＴＩＧＩＴとの複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルを本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と接触させることおよび複合体の形成を検出することを含む、サンプル内の、サンプル内の細胞での(例えば、ＦＡＣＳ)、または細胞もしくは組織中の特定の位置における(例えば、ＩＨＣ)ＴＩＧＩＴの存在を検出する方法、またはその表面でのＴＩＧＩＴの有無に基づいて細胞を選別する方法(例えば、ＦＡＣＳ)も提供する。いくつかの実施形態では、検出のために使用される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、検出可能な標識とコンジュゲートされる。
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるが、これらは制限と解釈されてはならない。
図１は、本発明の種々の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体が、その他の抗体のｈｕＴＩＧＩＴとの結合を遮断する能力について対で試験される「ビニング」実験の模式図を示す。結果は、抗体が、制限された数のカテゴリーまたは「ビン」内に入ることを示す。実施例３を参照のこと。
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ｈｕＴＩＧＩＴ配列変異体のそれぞれ、抗体２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１５Ａ６との結合についての酵母ディスプレイデータを示す。成熟ｈｕＴＩＧＩＴ中の各アミノ酸残基の残基数が、横軸に沿って示されている。配列表は、図には含まれていないシグナルペプチドを含むので、残基数は、配列番号１の番号付けよりも２１少ない。実施例４に詳述されるように、ｈｕＴＩＧＩＴの配列変異体をディスプレイする酵母は、それがそれぞれの抗体(２２Ｇ２、１１Ｇ１１、１５Ａ６)と結合できないことに基づいて選択した。したがって、抗体結合にとって重要であるｈｕＴＩＧＩＴ配列に沿う位置は、非結合酵母クローンのプールにおいてその過剰提示のために高頻度で(すなわち、縦軸を上回って上がるバー／線として)現れる。各残基で変異体(非野生型)残基が現れる頻度は、縦軸で(対数目盛りで)表され、１つのバー(線)または各残基を有する。頻度データは、選択されていないライブラリー、すなわち、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体と結合できないことに基づく選択に付されていなかったライブラリーにおいて各位置で変異体残基が現れる頻度に対して正規化されている。実施例４を参照のこと。
図３は、ヒトＮＫ細胞による、ヒトＰＶＲを発現する細胞の特異的溶解パーセントとして表される溶解に対する抗ＴＩＧＩＴｍＡｂ ２２Ｇ２の効果を示す。実施例５を参照のこと。各抗体について、左のバーは野生型Ｐ８１５細胞であり、右のバーは、ヒトＰＶＲを発現するＰ８１５細胞である。
図４Ａは、抗原ペプチドのカクテル(ＣＥＴＦ＝ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザおよびテタヌス由来のペプチド)を用いる健常なヒトドナー血液の治療が、ＣＤ８＋Ｔ細胞でＰＤ−１およびＴＩＧＩＴの上方制御を誘導することを示す。「Ｎｏ Ｓｔｉｍ」サンプルは、ＣＥＦＴを用いて処理しなかったが、「Ｓｔｉｍ」サンプルは、処理した。図４Ｂは、ＣＥＴＦを用いて刺激された４人の健常なヒトドナー血液サンプルからのＩＦＮγ発現に対する抗ＴＩＧＩＴｍＡｂおよび／または抗ＰＤ−１ ｍＡｂの効果を示す。実施例６を参照のこと。
図５Ａおよび５Ｂは、マウスモデルにおける腫瘍成長に対する、単独での、またはその他の免疫調節性治療と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示す。図５Ａは、エフェクター機能が可能になったマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインを有する抗マウスＴＩＧＩＹ抗体(「ＴＩＧＩＴ Ｇ２ａ」)、エフェクター機能に欠陥があるＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ Ｆｃドメインを有する抗マウスＴＩＧＩＴ抗体(「ＴＩＧＩＴ Ｇ１ Ｄ２６５Ａ」)、エフェクター機能に欠陥のあるＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ Ｆｃドメインを有する抗マウスＰＤ−１抗体(「ＰＤ−１ Ｇ１ Ｄ２６５Ａ」)、それらの組合せまたは対照ＩｇＧ１抗体を用いて治療されたマウスについて、ＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおける腫瘍の幅の二乗に長さの半分を乗じることによって算出された腫瘍量(立方ミリメートル)を示す。図５Ｂは、抗ＴＩＧＩＴ単剤治療ならびに抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用療法の効果を示す。腫瘍量は、実験の最後での１０匹のマウスの各群中の腫瘍不含(ＴＦ)マウスの数とともに提供される。各線は、１匹のマウスを表す。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照は、腫瘍不含マウスを与えず、単剤治療としての抗ＴＩＧＩＴも同様であった。抗ＰＤ−１は、単剤治療として、１匹の腫瘍不含マウスを与え、抗ＴＩＧＩＴと組み合わせた場合には、５匹を与えた。抗ＣＴＬＡ−４は、単剤治療として、３匹の腫瘍不含マウスを与え、抗ＴＩＧＩＴと組み合わせた場合には、６匹を与えた。実施例７を参照のこと。
図６Ａおよび６Ｂは、癌組織における上昇したＰＶＲ発現を示す。図６Ａは、The Cancer Genome Atlas(ＴＣＧＡ)データセットにおいて検出されたような種々の腫瘍型におけるＰＶＲ ｍＲＮＡ発現を示す。データは、副腎皮質癌腫(ＡＣＣ)、嫌色素腎細胞癌(ＫＩＣＨ)、肝臓肝細胞癌腫(ＬＩＨＣ)、結腸および直腸腺癌(ＣＯＡＤ、ＲＥＡＤ)、膵管腺癌(ＰＡＡＤ)、褐色細胞腫＆傍神経節腫(ＰＣＰＧ)、乳頭状腎臓癌腫(ＫＩＲＰ)、肺腺癌(ＬＵＡＤ)、頭頸部扁平上皮癌(ＨＮＳＣ)、前立腺腺癌(ＰＲＡＤ)、子宮体子宮内膜癌(ＵＣＥＣ)、子宮頸癌(ＣＥＳＣ)、皮膚黒色腫(ＳＫＣＭ)、中皮腫(ＭＥＳＯ)、尿路上皮膀胱癌(ＢＬＣＡ)、明細胞腎臓癌腫(ＫＩＲＣ)、肺扁平上皮癌(ＬＵＳＣ)、子宮癌肉腫(ＵＣＳ)、肉腫(ＳＡＲＣ)、卵巣漿液性嚢胞腺癌(ＯＶ)、乳頭状甲状腺癌腫(ＴＨＣＡ)、神経膠芽腫多形(ＧＢＭ)、乳癌(ＢＲＣＡ)、ローグレード神経膠腫(ＬＧＧ)およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣ)について提供される。本明細書に開示される結果は、ＴＣＧＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋによって作製されたデータに基づいて全体または部分である。図６Ｂは、正常結腸上皮と比較した、結腸腺癌組織におけるヒトＰＶＲを示し、腺癌サンプル中に、上昇したＰＶＲ発現を示すより暗い領域を有する。実施例９を参照のこと。
図７は、ＩｇＧ１ｆ(配列番号４５)またはＩｇＧ１.１ｆ(配列番号４８)としてフォーマットされた抗ＴＩＧＩＴｍＡｂ ２２Ｇ２の、理論上の最大受容体結合値(Ｒｍａｘ)のパーセンテージとして表されるＦｃγ受容体結合を示す。データは、６種の異なるＦｃγ受容体について、示されるように１０μＭおよび１μｍで使用されるＩｇＧ１.１ｆ抗体の２種の異なるロットについて示されている。バーの各クラスター内で、Ｆｃγ受容体のデータは、左から右にｈＣＤ６４(ＦｃγＲＩ)；ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１(ＦｃγＲIIＡ−Ｈ１３１)；ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１(ＦｃγＲIIＡ−Ｒ１３１)；ｈＣＤ３２ｂ(ＦｃγＲIIＢ)；ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８(ＦｃγＲIIIＡ−Ｖ１５８)；およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２(ＦｃγＲIIIＢ−ＮＡ２、ここで、ＮＡ２はアロタイプ変異体を呼ぶ)の順に示されている。Ｆｃγ受容体の対は、同一バーによって表されるが、その同一性は、それらが示されている順から明らかである。カニクイザルＦｃγ受容体ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ１６との結合について同一の低下が観察された(示されていない)。
本発明は、ヒトＴＩＧＩＴ(「ｈｕＴＩＧＩＴ」)と特異的に結合し、ＰＶＲ／ＣＤ１５５との結合を遮断し、それによって、そうでなければＴＩＧＩＴ発現細胞において生じるであろう免疫抑制シグナルを低減または排除する、単離された抗体、特に、モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体を開示する。本発明はまた、ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合し、そうでなければＤＮＡＭ−１ホモ二量体化、したがって、ＤＮＡＭ−１媒介性同時刺激を妨げるであろう、ヒトＴＩＧＩＴのＤＮＡＭ−１／ＣＤ２２６との相互作用を遮断する、単離された抗体、特に、モノクローナル抗体、例えば、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を提供する。種々のヒト抗ｈｕＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の配列が提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、特に、重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来し、および／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。
このような抗体、このような抗体またはその抗原結合断片を含むイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子および抗体または断片を含有するよう製剤化された医薬組成物を作製する方法が、本明細書においてさらに提供される。また、抗体を、免疫応答増強のために、単独でまたはその他の免疫賦活剤(例えば、抗体)および／または癌もしくは抗感染薬治療と組み合わせて使用する方法も本明細書において提供される。したがって、本明細書に記載される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、例えば、腫瘍成長の阻害および慢性ウイルス性感染症の治療を含めた、さまざまな治療適用における治療において使用され得る。
定義
本明細書において説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示されている。
ＴＩＧＩＴとは、「ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体」、免疫グロブリンタンパク質のＰＶＲ(ポリオウイルス受容体)ファミリーのメンバーを指し、ＰＶＲ／ＣＤ１５５およびネクチン−２／ＣＤ１１２と結合する。ＴＩＧＩＴはまた、ＴＩＧＩＴ、ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３およびＶｓｉｇ９とも呼ばれる。特に断りのない限り、または文脈から明確ではない限り、本明細書においてＴＩＧＩＴへの言及は、ヒトＴＩＧＩＴ(「ｈｕＴＩＧＩＴ」)を指し、抗ＴＩＧＩＴ抗体とは、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を指す。ヒトＴＩＧＩＴは、ＧＥＮＥ ＩＤ番号：２０１６３３およびＭＩＭ(ヒトにおけるメンデル遺伝)：６１２８５９にさらに記載されている。２１個のアミノ酸のシグナル配列を含むヒトＴＩＧＩＴの配列(ＮＰ＿７７６１６０.２)が、配列番号１に提供されている。特に断りのない限り、または文脈から明確ではない限り、ＴＩＧＩＴの「阻害」とは、ＰＶＲ結合およびシグナル伝達の遮断を指す。本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の阻害、ＴＩＧＩＴ／ＤＮＡＭ−１相互作用の遮断および／または調節Ｔ細胞の枯渇の指示などのその他の機序によって作用し得る。
ＰＶＲ(ポリオウイルス受容体)は、ＴＩＧＩＴと相互作用して、免疫抑制シグナルを誘導する。ＰＶＲはまた、ＰＶＳ、ＨＶＥＤ、ＣＤ１５５、ＮＥＣＬ５、ＴＡＧＥ４、Ｎｅｃｌ−５とも呼ばれる。特に断りのない限り、または文脈から明確でない限り、本明細書においてＰＶＲ／ＣＤ１５５への言及は、ヒトＰＶＲ(「ｈｕＰＶＲ」)を指す。ヒトＰＶＲは、ＧＥＮＥ ＩＤ番号：５８１７およびＭＩＭ：１７３８５０にさらに記載されている。４種の既知ヒトＰＶＲ転写物変異体：α(ＮＰ＿００６４９６.４)、β(ＮＰ＿００１１２９２４０.１)、γ(ＮＰ＿００１１２９２４１.１)およびδ(ＮＰ＿００１１２９２４２.２)があり、それらの配列は、配列番号５０〜５３に提供されている。特に断りのない限り、ＰＶＲまたはヒトＰＶＲへの言及は、α転写物ポリペプチドと関連する。
特に断りのない限り、または文脈から明確でない限り、本明細書において用語「抗体」とは、全抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはその単一鎖を含み得る。「抗体」とは、一実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合断片を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書において、ＶＨと略される)および重鎖定常領域からなる。特定の天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体では、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。特定の天然に存在する抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書において、ＶＬと略される)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれ、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれるより保存されている領域と散在している超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク領域(ＦＲ)から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および伝統的な補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)との結合を媒介し得る。
抗体は、通常、そのコグネイト抗原と、１０−７〜１０−１Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)によって反映される高親和性で特異的に結合する。約１０−６Ｍより大きい任意のＫＤは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において、抗原と「特異的に結合する」抗体とは、抗原および実質的に同一の抗原と、１０−７Ｍ以下、好ましくは、１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは、５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは、１０−８Ｍから１０−１０Ｍ以下の間のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない抗体である。抗原は、所与の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合には、例えば、所与の抗原の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す場合に、所与の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合する抗体はまた、特定の非ヒト霊長類種(例えば、カニクイザル)に由来するＴＩＧＩＴと交差反応し得るが、その他の種に由来するＴＩＧＩＴと、またはＴＩＧＩＴ以外の抗原とは交差反応し得ない。
抗体は、Ｎおよび／またはＣ末端アミノ酸残基で修飾を示し得る。例えば、本発明の抗体は、例えば、重鎖でＣ末端リシン残基をコードするコンストラクトから産生され得るが、このようなＣ末端リシンは、販売または投与される治療用抗体では部分的にまたは完全に存在しないことがある。あるいは、抗体は、具体的に、Ｃ末端リシン残基をコードしないコンストラクトから産生され得るが、このようなリシンは、治療用抗体が導かれた親の抗体中には存在していた。別の例では、本発明の抗体中のＮ末端グルタミンまたはグルタミン酸残基は、販売され投与される治療用抗体では、ピログルタミン酸に部分的または完全に変換され得る。ピログルタミン酸を含めた、抗体鎖のＮ末端に存在するグルタミンまたはグルタミン酸の任意の形態は、本明細書において用語「グルタミン」内に包含される。したがって、Ｎ末端グルタミンまたはグルタミン酸残基を有する本明細書に提供される抗体鎖配列は、ピログルタミン酸形成のレベルに関わらず抗体鎖を包含する。
特に断りのない限り、免疫グロブリンは、それだけには限らないがＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含めた、よく知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分けられる：ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１は、多くても２、３個のアミノ酸で互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。特に断りのない限り、「抗体」は、例として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体および一本鎖抗体を含み得る。
本明細書において、用語、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」は、抗原(例えば、ヒトＴＩＧＩＴ)と特異的に結合する能力を保持する抗体の１種または複数の断片を指す。用語、抗体の「抗原結合部分／断片」内に包含される結合断片の例として、(ｉ)Ｆａｂ断片−ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、(ii)Ｆ(ａｂ’)２断片−ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結している２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片および(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)が挙げられる。単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)または合成リンカーによって接続された２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せは、抗原と結合できる場合には抗体の抗原結合ドメインを含み得る。
一本鎖抗体コンストラクトもまた、本発明中に含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域対が、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して接続され得る；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)を参照のこと。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分／断片」内に包含されるものとする。これらおよびその他の可能性あるコンストラクトは、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分／断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。
特に断りのない限り、語句「断片」は、特許請求の範囲などにおいて抗体に関連して使用される場合には、抗体の抗原結合断片を指し、その結果、「抗体または断片」は、「抗体またはその抗原結合断片」と同一の意味を有する。
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有し、異なる抗原に対して特異性を有する２つの抗原結合部位を生じさせる人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた種々の方法によって生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547を参照のこと。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体またはすべての抗体が特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物を指す。通常、このようなモノクローナル抗体は、抗体をコードする単一細胞または核酸に由来し、任意の配列変更を意図的に導入することなく増殖され得る。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および適宜定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは導入染色体非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス)から得られたＢ細胞を不死化された細胞と融合することによって得られたハイブリドーマによって産生される。
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体またはそれから調製されたハイブリドーマである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、(ｂ)抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(ｃ)組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含むが、その後の再編成および例えば、抗体成熟の間に起こる突然変異を含む。当技術分野で公知のように(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと)、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するよう再編成する種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。可変領域は、再配列に加えて、外来抗原に対する抗体の親和性を増大するよう、複数の単一アミノ酸変更(体細胞突然変異または高頻度突然変異とも呼ばれる)によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応じて変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。したがって、抗原に応じた、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再編成され、体細胞突然変異された核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではない場合があるが、代わりに、実質的に同一または同様となる(すなわち、少なくとも８０％の同一性を有する)。
「ヒト」抗体(ＨｕＭＡｂ)とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含み得る。しかし、本明細書において、用語「ヒト抗体」はマウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むよう意図されない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体のＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来するアミノ酸で置換されているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたはすべてのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入または置換または修飾は、抗体の特定の抗原と結合する能力を抑制しない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体のものと同様の抗原特異性を保持する。
「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。「ハイブリッド」抗体とは、マウス(親)重鎖およびヒト化軽鎖またはその逆などの異なる種の重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。
本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)を指す。
「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプ群内の天然に存在する変異体を指し、これらの変異体は、１個または２、３個のアミノ酸で異なっている。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと。
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
本明細書において「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指す(例えば、ＴＩＧＩＴと特異的に結合する単離された抗体は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、ヒトＴＩＧＩＴのエピトープと特異的に結合する単離された抗体は、異なる種に由来するその他のＴＩＧＩＴタンパク質と交差反応性を有し得る。
本明細書において、「ＰＶＲのＴＩＧＩＴとの結合を阻害する」抗体は、当技術分野で認識される方法において、例えば、ＦＡＣＳベースの細胞結合アッセイにおいて、約０.９μｇ／ｍＬ以下、約０.８５μｇ／ｍＬ以下、約０.８μｇ／ｍＬ以下、約０.７５μｇ／ｍＬ以下、約０.７μｇ／ｍＬ以下、約０.６５μｇ／ｍＬ以下、約０.６μｇ／ｍＬ以下、約０.５５μｇ／ｍＬ以下、約０.５μｇ／ｍＬ以下、約０.４５μｇ／ｍＬ以下、約０.４μｇ／ｍＬ以下、約０.３５μｇ／ｍＬ以下、約０.３μｇ／ｍＬ以下、約０.２５μｇ／ｍＬ以下、約０.２μｇ／ｍＬ以下、約０.１５μｇ／ｍＬ以下または約０.１μｇ／ｍＬ以下などの約１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、ヒトＰＶＲのヒトＴＩＧＩＴとの結合を阻害する抗体を指す。
抗体Ｆｃ領域の特定のＦｃ受容体との相互作用に由来する「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞媒介性食作用(ＡＤＣＰ)などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能および細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御を含むが、必ずしもそれらに制限されない。このようなエフェクター機能は、一般に、抗原結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わされるＦｃ領域を必要とする。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、対立遺伝子変異体およびこれらの受容体の別法としてスプライシングされた形態を含めたＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種の活性化(マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１種の阻害性(ＦｃγＲIIｂまたは同等にＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の特性は、表１に要約されている。先天性エフェクター細胞種の大部分は、１種または複数の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIｂを同時に発現するが、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、１種の活性化Ｆｃ受容体(マウスではＦｃγＲIIIおよびヒトではＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲIIｂを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体と結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に関してマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられる。
「Ｆｃ領域」(結晶化可能断片(fragment crystallizable)領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」とは、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)上に位置するＦｃ受容体とのまたは伝統的な補体系の第１の成分(Ｃ１ｑ)との結合を含めた、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)を含まない抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の各々中にＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む；ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖中に３つの重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについては、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１およびＣγ２の間にヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、普通、位置Ｃ２２６またはＰ２３０のアミノ酸残基(またはこれら２個のアミノ酸の間のアミノ酸)から重鎖のカルボキシ末端に伸びるよう規定され、ここで、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数に従う、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD；米国特許出願公開第２００８／０２４８０２８号の図３ｃ〜３ｆも参照のこと。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸３４０に広がるが、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する、すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸３４１〜約アミノ酸４４７(Ｃ末端リシンを含む)に広がる。本明細書において、Ｆｃ領域は、任意のアロタイプ変異体または変異体Ｆｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含めた天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた、単離において、または「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも呼ばれる、「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃを含むタンパク質ポリペプチドに関連して、この領域を指し得る。
特に断りのない限り、または文脈から明確ではない限り、抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸残基番号付けは、番号付けが必ずしも連続していない、配列表中の配列中の残基を具体的に指す場合を除いて、ＥＵ番号付けの慣習に従う。例えば、Ｆｃ領域におけるアミノ酸置換の効果に関する文献参照は、通常、ＥＵ番号付けを使用し、これによって、結合される可変ドメインの長さに関わらず、同一番号によって抗体のＦｃ領域中の任意の所与の残基の参照が可能になる。稀な場合には、正確なＦｃ残基が参照されていることを確認するために、参照されている文書を参照することが必要な場合もある。
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、ＴＩＧＩＴ)上の部位を指す。タンパク質抗原内のエピトープは、連続アミノ酸(普通、直鎖エピトープ)またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された非連続アミノ酸(普通、コンホメーションエピトープ)の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、必ずではないが、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次元フォールディングから形成されるエピトープは、通常、変性溶媒を用いる処理の際に失われる。エピトープは、通常、独特の空間コンホメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。
用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識に関与する抗原上の分子決定基の同定のプロセスを指す。所与の抗体によって結合されるエピトープを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、由来する(例えば、ＴＩＧＩＴに由来する)重複ペプチドまたは連続ペプチドが、所与の抗体(例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体)との反応性について試験される、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイ；Ｘ線結晶学；２次元核磁気共鳴；酵母ディスプレイ(本明細書中、実施例４を参照のこと)；およびＨＤＸ−ＭＳ(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと)が挙げられる。
２種以上の抗体に関して、用語「同一エピトープと結合する」は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基の同一セグメントと結合することを意味する。本明細書に記載される抗体を用いて、抗体が「ＴＩＧＩＴ上の同一エピトープ」と結合するか否かを調べる技術として、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析および水素／重水素交換質量分析(ＨＤＸ−ＭＳ)などのエピトープマッピング方法が挙げられる。アラニンスキャニング突然変異誘発(Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)または突然変異体標的配列変異体の酵母ディスプレイ(本明細書中、実施例４を参照のこと)などのその他の方法は、抗体の抗原断片(例えば、タンパク質分解断片)との、または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失が、エピトープ成分の指標と考えられることが多い。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。これらの方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。同一または密接に関連するＶＨおよびＶＬまたは同一のＣＤＲ配列を有する抗体は、同一エピトープと結合すると予想される。
「標的との結合について別の抗体と競合する」抗体とは、その他の抗体の標的との結合を阻害する(部分的にまたは完全に)抗体を指す。２種の抗体が、標的との結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、その他の抗体の標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するかは、公知の競合実験を使用して調べてもよい。特定の実施形態では、抗体は、別の抗体の標的との結合と、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合する、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」であるか(すなわち、標的とともに最初にインキュベートされるコールド抗体)に応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc.; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施できる。競合抗体は、同一エピトープと、重複エピトープとまたは隣接するエピトープ(例えば、立体障害によって証明されるような)と結合する。
その他の競合結合アッセイとして、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al. (1983) Methods in Enzymology 9:242を参照のこと)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614を参照のこと)；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照のこと)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7を参照のこと)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al. (1990) Virology 176:546)；および直接標識化ＲＩＡ(Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77)が挙げられる。
本明細書において、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープとの、その他の抗原とではない抗体結合を指す。通常、抗体は、(ｉ)例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組換えヒトＴＩＧＩＴおよびリガンドとして抗体を使用したＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００表面プラズモン共鳴機器における表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)技術または抗体の抗原陽性細胞との結合のスキャッチャード解析法によって決定される場合に、およそ１０−７Ｍ未満、例えば、およそ１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍまたはさらにそれより小さい平衡解離定数(ＫＤ)で結合し、(ii)所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)との結合に対するその親和性よりも、少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原と結合する。したがって、「ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより小さいＫＤで、可溶性または細胞結合型ヒトＴＩＧＩＴと結合する抗体を指す。「カニクイザルＴＩＧＩＴと交差反応する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより低いＫＤでカニクイザルＴＩＧＩＴと結合する抗体を指す。
本明細書において、用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」とは、特定の抗体抗原相互作用の会合速度定数を指すのに対し、本明細書において、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度定数を指す、用語「ＫＤ」は、本明細書において、平衡解離定数を指し、これはｋａに対するｋｄの割合(すなわち、ｋｄ／ｋａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法として、好ましくは、Fortebio Octet RED装置を使用するバイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴(例えば、実施例２を参照のこと)またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析法が挙げられる。
本明細書において、用語、ＩｇＧ抗体の「高親和性」とは、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは、１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、その他の抗体アイソタイプについては変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは、１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
用語、抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロまたはインビボアッセイに関連して「ＥＣ５０」とは、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの間の中間である応答を誘導する抗体またはその抗原結合断片の濃度を指す。
用語「固定化されたＴＩＧＩＴと結合する」とは、本明細書に記載された抗体の、例えば、細胞の表面に発現されたか、または固相支持体と結合しているＴＩＧＩＴと結合する能力を指す。
用語、本明細書において「交差反応する」とは、本明細書に記載された抗体の、異なる種に由来するＴＩＧＩＴと結合する能力を指す。例えば、ヒトＴＩＧＩＴと結合する本明細書に記載される抗体はまた、別の種に由来するＴＩＧＩＴ(例えば、カニクイザルＴＩＧＩＴ)と結合し得る。本明細書において、交差反応性は、結合アッセイ(例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ)において精製抗原との特異的反応性またはＴＩＧＩＴを生理学的に発現する細胞との結合もしくはそうでなければ、それとの機能的相互作用を検出することによって測定してもよい。交差反応性を調べるための方法として、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００ＳＰＲ機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析またはフローサイトメトリー技術による、本明細書に記載されるような標準結合アッセイが挙げられる。
用語、本明細書において対象に適用されるような「天然に存在する」とは、対象が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、実験室において人によって意図的に修飾されていない、自然界における供給源から単離され得る生物(ウイルスを含む)中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。
「ポリペプチド」とは、少なくとも２個の連続して連結しているアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１個または複数のアミノ酸残基は、それだけには限らないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの修飾を含有し得る。「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。
用語「核酸分子」とは、本明細書において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであり得る。
本明細書において提供される抗体配列への「保存的配列修飾」、すなわち、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるか、またはアミノ酸配列を含有する抗体の、抗原との結合を抑制しないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾も提供される。例えば、修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって導入され得る。保存的配列修飾として、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される保存的アミノ酸置換が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、抗ＴＩＧＩＴ抗体中の予想される非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換されることが好ましい。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Brummel et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997))を参照のこと。
あるいは、別の実施形態では、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって抗ＴＩＧＩＴ抗体コード配列のすべてかまたは一部に沿って無作為に導入され得、得られた修飾された抗ＴＩＧＩＴ抗体は、改善された結合活性についてスクリーニングされ得る。
核酸については、用語「実質的な相同性」は、２種の核酸またはその指定された配列は、最適にアラインされ、比較される場合に、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、普通、少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９.５％において適当なヌクレオチド挿入または欠失を用いて同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。
ポリペプチドについては、用語「実質的な相同性」は、２種のポリペプチドまたはその指定された配列が、最適にアラインされ、比較される場合に、アミノ酸の少なくとも約８０％、普通、少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、アミノ酸の少なくとも約９８％〜９９.５％において適当なアミノ酸挿入または欠失を用いて同一であることを示す。
２種の配列間の同一性パーセントは、配列が最適にアラインされる場合に配列によって共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００)、最適アラインメントは、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮して決定される。２種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の限定されない例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム(CABIOS, 4:11-17 (1989))を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定できる。さらに、２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を使用して実施され得る。本明細書に記載された核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施できる。本明細書に記載されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長(wordlength)＝３を用いて実施できる。比較目的でギャップ付きアラインメント得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)を使用できる。
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸(例えば、染色体のその他の部分)またはタンパク質から精製された場合に「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
本明細書において、用語「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すものとする。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などのその他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
用語「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、本明細書において、細胞中に天然に存在しない核酸を含み、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の後代も指すということは理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって後世において起こり得るので、このような後代は実際、親の細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
「免疫応答」とは、外来作用物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答が、これらの作用物質およびそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用によって媒介され、これは、進入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織との選択的標的化、結合、損傷、破壊および／またはそれらの脊椎動物の身体からの排除をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞の活性化もしくは阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害もしくは枯渇を含む。「Ｔエフェクター」(「Ｔｅｆｆ」)細胞とは、サイトカインを分泌し、その他の免疫細胞を活性化し、指示する、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞)ならびにＴヘルパー(Ｔｈ)細胞を指すが、調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)を含まない。
本明細書において、用語「Ｔ細胞媒介性応答」とは、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含めたＴ細胞によって媒介される応答を指す。Ｔ細胞媒介性応答は、例えば、Ｔ細胞細胞傷害性および増殖を含む。
本明細書において、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞によって誘導される免疫応答を指す。ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって主に媒介される。
「免疫調節物質(immunomodulator)」または「免疫制御物質(immunoregulator)」とは、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る作用物質、例えば、シグナル伝達経路の成分を指す。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」とは、免疫系の細胞における、またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性における任意の変更を指す。このような調節は、免疫系の刺激または抑制を含み、種々の細胞型の数の増大もしくは減少、これらの細胞の活性の増大もしくは減少または免疫系内で起こり得る任意のその他の変化によって示され得る。阻害的および刺激的免疫調節物質の両方とも同定されており、その一部は、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。好ましい実施形態では、免疫調節物質は、Ｔ細胞の表面に位置する。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、作用物質、部分、化合物または分子による結合に対して標的化される免疫調節物質であり、その活性は、物質、作用物質、部分、化合物または分子の結合によって変更される。免疫調節性標的は、例えば、細胞の表面の受容体(「免疫調節性受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節性リガンド」)を含む。
「免疫療法」とは、免疫応答を誘導、増強、抑制またはそうでなければ修飾することを含む方法によって、疾患の再発に苦しむまたは、それを起こすまたは患う危険にある対象の治療を指す。
「免疫賦活性(immunostimulating)療法」または「免疫賦活性(immunostimulatory)療法」とは、例えば、癌を治療するための、対象における免疫応答の増大(誘導または増強)をもたらす療法を指す。
「内因性免疫応答を増強する」とは、対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増大することを意味する。この有効性および効力の増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって達成され得る。
本明細書において、用語「連結している」とは、２つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合である場合も、非共有結合である場合もある。連結はまた、遺伝的であり(すなわち、組換えによって融合され)得る。このような連結は、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質生産などのさまざまな当技術分野において認識される技術を使用して達成され得る。
本明細書において、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して、治療薬を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸性に、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与することは、例えば、１回、複数回および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって実施され得る。
本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」(例えば、細胞上でのＰＶＲのＴＩＧＩＴとの結合の阻害／遮断を指す)は、同義的に使用され、例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の部分的および完全阻害／遮断の両方を包含する。
本明細書において、「癌」は、身体中での異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患の広い群を指す。未制御細胞分裂は、隣接する組織へ浸潤し、リンパ系または血流によって身体の遠隔部位へ転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
「血液悪性腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。例示的リンパ腫として、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられる。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫の限定されない例として、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫(慢性リンパ性白血病と重複する)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が挙げられる。Ｔ細胞リンパ腫の限定されない例として、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。血液悪性腫瘍としてまた、それだけには限らないが、続発性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病などの白血病も挙げられる。血液悪性腫瘍として、さらにそれだけには限らないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの骨髄腫も挙げられる。その他の血液系および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連癌が、用語血液悪性腫瘍によって包含される。
用語「治療する」、「治療すること」および「治療」とは、本明細書において、症状の進行、発生、重症度もしくは再発、合併症、疾病と関連している状態または生化学的兆候を逆転させ、軽減し、寛解し、阻害し、または減速することを目的とした、対象で実施される任意の種類の介入もしくはプロセスまたは対象へ活性薬剤を投与することを指す。予防とは、疾患が発生するのを防ぐため、またはそれが起こる場合にはその効果を最小化するための、疾患を有していない対象への投与を指す。
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止によって証明される疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の「予防的有効量」または「予防的有効投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて、疾患を発生するか、または疾患の再発を患うリスクにある対象に投与される場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬物の量である。治療薬または予防薬の疾患退縮を促進する能力または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、臨床治験の際にヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、インビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の種々の方法を使用して評価できる。
例として、抗癌剤は、対象において、癌進行を減速するか、または癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施形態では、治療上有効な量の薬物は、癌を排除するところまで癌退縮を促進する。「癌退縮を促進すること」とは、有効量の薬物を、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与することが、患者において、腫瘍成長または大きさの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１種の疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止またはそうでなければ疾患症状の寛解をもたらすことを意味する。薬理学的有効性とは、薬物の患者において癌退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、容認できるほど低レベルの毒性または細胞、臓器および／または生物レベルでのその他の有害な生理学的効果(有害効果)を指す。
腫瘍の治療の例として、薬物の治療上有効な量または投与量は、未治療の対象と比較して、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、一層より好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施形態では、薬物の治療上有効な量または投与量は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害し、すなわち好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を１００％阻害する。化合物の腫瘍成長を阻害する能力は、以下に記載されるアッセイを使用して評価できる。腫瘍成長の阻害は、治療後即時でない場合もあり、一定時間後または反復投与後にのみ起こる場合もある。あるいは、この組成物の特性は、化合物の細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定され得る。本明細書に記載されるその他の好ましい実施形態では、腫瘍退縮が観察され得、少なくとも約２０日、より好ましくは、少なくとも約４０日または一層より好ましくは、少なくとも約６０日の期間継続し得る。
「併用」療法とは、本明細書において、文脈から別に明確ではない限り、協調した様式での２種以上の治療薬の投与を包含することを意味し、それだけには限らないが、同時投薬を含む。具体的には、併用療法は、同時投与(例えば、合剤の投与または別個の治療用組成物の同時投与)および連続または逐次投与の両方を包含する、ただし、一方の治療薬の投与は、もう一方の治療薬の投与に対していくつかの方法で条件付けられる。例えば、一方の治療薬は、異なる治療薬が投与され、規定の期間作用させた後にのみ投与され得る。例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423を参照のこと。
用語「患者」および「対象」とは、予防的または治療的処置のいずれかを受ける任意のヒトまたは非ヒト動物を指す。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、癌を有する対象を治療するために使用され得る。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの哺乳動物および非哺乳動物、両生類、爬虫類などを含む。
本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
Ｉ. 抗ＴＩＧＩＴ抗体
本願は、癌などの疾患の治療において治療薬として使用するための所望の特性を有する、完全ヒト抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体を開示する。これらの特性として、ヒトＴＩＧＩＴと高親和性で結合する能力、カニクイザルＴＩＧＩＴと結合する能力、ＰＶＲ結合(したがって、シグナル伝達)を遮断する能力および抗体の化学安定性を低減し得る配列傾向がないこと、のうち１種または複数が挙げられる。
配列によって本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、実施例４に記載され、図２Ａ〜２Ｃにおいて示されるように決定されるヒトＴＩＧＩＴ上の特異的エピトープと結合する。エピトープが決定された３種の特異的抗体は、ヒトＴＩＧＩＴの同様の領域で結合するが、どの特異的アミノ酸残基が接触されるかが異なる。抗体は、高親和性でのヒトＴＩＧＩＴとの結合の特性を共有し、ＰＶＲ結合を遮断する能力を有する。したがって、同一または密接に関連するエピトープと結合するその他の抗体は、これらの望ましい特性を共有する可能性が高く、競合実験によって発見され得る。
さらに、抗体２２Ｇ２は、ヒトＴＩＧＩＴと結合するのと実質的に同一の親和性でカニクイザルＴＩＧＩＴと結合し、これは、ヒト治療薬として抗体を使用するために規制当局の承認を支持する毒性研究を実施するために必要である場合には好都合である。１５Ａ６および２２Ｇ２と同一または同様のエピトープと結合するその他の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ｃｙｎｏ ＴＩＧＩＴとの結合のこの有利な特性を共有する可能性が高い。同様のエピトープとの抗体結合は、競合実験を行うことによって、またはそのエピトープを直接的に調べることによって発見され得る。
本明細書において開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体と競合する抗ＴＩＧＩＴ抗体
１５Ａ６および２２Ｇ２などのｈｕＴＩＧＩＴとの結合について本発明の抗体と競合する抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書に記載されるもの(実施例１)と同様の免疫処置プロトコールを使用して作製され得る。本明細書に記載される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体との結合について競合する抗体はまた、ヒトＴＩＧＩＴもしくはその細胞外ドメイン(配列番号１の残基２２〜１４１；ＮＰ＿７７６１６０.２)を含むコンストラクトを用いてマウスを免疫処置することによって、または本明細書において開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体(例えば、１５Ａ６、２２Ｇ２および１１Ｇ１１)によって結合されるエピトープを含有するヒトＴＩＧＩＴの断片を用いて免疫処置することによって作製され得る。得られた抗体は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにおけるＴＩＧＩＴの細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインの融合タンパク質との結合の遮断、または例えば、ＦＡＣＳによる、その表面上にｈｕＴＩＧＩＴを発現する細胞と結合する能力の遮断によって、１５Ａ６または２２Ｇ２のヒトＴＩＧＩＴとの結合を遮断する能力についてスクリーニングされ得る。種々の実施形態では、試験抗体は、１５Ａ６または２２Ｇ２の添加に先立って、それと同時に、またはその後に、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質と(またはその表面上にｈｕＴＩＧＩＴを発現する細胞と)接触される。例えば、「ビニング」実験を実施して、抗体が抗体１５Ａ６または２２Ｇ２と同一「ビン」内に入るか否かを調べてもよく(実施例３)、この実験では、抗体１５Ａ６または２２Ｇ２は、「参照」抗体と呼ばれ、試験されるべき抗体は、「試験」抗体と呼ばれる。１５Ａ６および／または２２Ｇ２のＴＩＧＩＴ(Ｆｃ融合物としてかまたは細胞上のいずれか)との結合を、特に、およそ化学量論濃度で低減する抗体は、同一の、重複する、または隣接するエピトープと結合する可能性が高く、したがって、１５Ａ６および２２Ｇ２の.望ましい機能的特性を共有し得る。
競合抗体はまた、当技術分野で公知のその他の方法を使用しても同定できる。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用でき、これでは、組換えヒトＴＩＧＩＴタンパク質コンストラクトを、プレート上に固定化し、種々の濃度の非標識試験抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識された参照抗体を添加し、洗浄し、結合している標識の量を測定する。増大する濃度の非標識試験抗体が、標識された参照抗体の結合を阻害する場合には、試験抗体は、参照抗体のプレート上の標的との結合を阻害するといわれるか、または参照抗体の結合と競合するといわれる。さらに、またはあるいは、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析を実施して、抗体の競合する能力を評価してもよい。試験抗体の、本明細書に記載される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴとの結合を阻害する能力は、試験抗体がＴＩＧＩＴとの結合について参照抗体と競合し得ることを実証する。
したがって、例えば、以下の段落に記載されるアッセイを使用することなどによってＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって測定される場合、本明細書に記載される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の、細胞、例えば、活性化されたＴ細胞上のＴＩＧＩＴとの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害する、および／または細胞、例えば、活性化されたＴ細胞上のＴＩＧＩＴとのその結合が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害される抗ＴＩＧＩＴ抗体が、本明細書において提供される。
試験抗体が、参照抗体の結合を遮断する(すなわち「競合する」)か否かを調べるための例示的競合実験は、以下の通りに実施され得る：活性化ヒトＴ細胞を以下の通りに調製する：ヒト全血からフィコール勾配を使用して末梢血単核細胞(ＰＢＭＣｓ)を単離し、１０μｇ／ｍＬフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ−Ｌ)(ＵＳＢｉｏｌ番号Ｐ３３７０−３０)および２００ＩＵ／ｍＬ組換えＩＬ−２(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号２００−０２)を用いて３日間活性化する。活性化Ｔ細胞をＦＡＣＳバッファー(５％ウシ胎児血清を有するＰＢＳ)に再懸濁し、９６ウェルプレートにおいてサンプルウェルあたり１０５個細胞で播種する。プレートにコンジュゲートしていない試験抗体を、０〜５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で(５０μｇ／ｍＬの最高濃度から出発する３倍滴定)添加する。無関係のＩｇＧを試験抗体のアイソタイプ対照として使用し、同一濃度で(５０μｇ／ｍＬの最高濃度から出発する３倍滴定)添加してもよい。５０μｇ／ｍＬの非標識参照抗体とともにプレインキュベートしたサンプルを、競合遮断の陽性対照(１００％阻害)として含めてもよく、一次インキュベーションにおいて抗体を伴わないサンプルを、陰性対照(競合なし；０％阻害)として使用してもよい。３０分インキュベートした後、洗浄せずに、標識された、例えば、ビオチン化された参照抗体を、ウェルあたり２μｇ／ｍＬの濃度で添加する。サンプルをさらに３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファーを用いて細胞を洗浄することによって結合していない抗体を除去する。細胞が結合している標識された参照抗体を、標識、例えば、ビオチンを検出するための、ＰＥがコンジュゲートしているストレプトアビジン(Invitrogen、カタログ番号Ｓ２１３８８)を検出する薬剤を用いて検出する。サンプルをＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(BD, San Jose)で獲得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)を用いて分析する。結果は、阻害％として(すなわち、１００％から各濃度の標識の量を差し引き、遮断抗体を伴わずに得られた標識の量で除して)表され得る。
通常、次いで、同一実験を、逆で実施する、すなわち、試験抗体は、参照抗体であり、参照抗体は、試験抗体である。特定の実施形態では、抗体は、他の抗体の、標的、例えば、ヒトＴＩＧＩＴまたはその断片との結合を少なくとも部分的に(例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％)または完全に(１００％)遮断し、一方またはもう一方の抗体が試験抗体である場合に阻害が起こるか否かに関わらない。試験および参照抗体は、抗体が互いに双方向に、すなわち、試験抗体が最初に添加される競合実験において、および参照抗体が最初に添加される競合実験において競合する場合には、互いの標的との結合を「交差遮断」する。
抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、例えば、実施例３に記載されるもののような競合実験において、およそ等濃度で存在する場合に、１５Ａ６および／または２２Ｇ２のヒトＴＩＧＩＴとの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する場合に、本明細書に開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体と競合すると考えられる。別に示されない限り、抗体は、先行する２段落において概説されるような競合ＥＬＩＳＡ実験において測定される場合、選択された抗体とともにおよそ等モル濃度で使用した場合に、選択された抗体のヒトＴＩＧＩＴとの結合を少なくとも２０％低減する場合に、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体からなる群から選択される抗体と競合すると考えられる。
同一エピトープと結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体
本明細書に開示される抗体と同一または同様のエピトープと結合する抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書に記載されるもの(実施例１)と同様の免疫処置プロトコールを使用して作製され得る。得られた抗体は、ヒトＴＩＧＩＴとの高親和性結合についてスクリーニングされ得る(実施例２)。選択された抗体は、次いで、抗体によって結合される正確なエピトープを調べるために、ｈｕＴＩＧＩＴの配列変異体が酵母細胞の表面上に提示される酵母ディスプレイアッセイにおいて研究され得る(実施例４)。
エピトープ決定は、当技術分野で公知の任意の方法によって行われ得る。本明細書に開示されるエピトープは、実施例４に記載され、図２Ａ〜２Ｃで示される酵母ディスプレイによって決定した。種々の実施形態では、抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、１５Ａ６もしくは２２Ｇ２によって接触されるｈｕＴＩＧＩＴの少なくとも１つの領域内の１個または複数の同一残基と接触する場合に；１５Ａ６もしくは２２Ｇ２によって接触されるｈｕＴＩＧＩＴの少なくとも１つの領域内の大部分の残基と接触する場合に；１５Ａ６もしくは２２Ｇ２によって接触されるｈｕＴＩＧＩＴの各領域内の大部分の残基と接触する場合に；１５Ａ６もしくは２２Ｇ２によって接触されるｈｕＴＩＧＩＴの全長に沿う接触の大部分と接触する場合に；１５Ａ６もしくは２２Ｇ２によって接触されるヒトＴＩＧＩＴの別個の領域のすべて内で接触する場合に；１５Ａ６もしくは２２Ｇ２によって接触されるヒトＴＩＧＩＴ上の任意の１つの領域で同一残基のすべてと接触する場合に；または１５Ａ６または２２Ｇ２によって接触されるすべての領域ですべての残基と接触する場合に本明細書に開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、例えば、１５Ａ６および／または２２Ｇ２と同一エピトープと結合すると考えられる。エピトープ「領域」は、例えば、配列番号３８〜４４で提供されるような、抗体１５Ａ６または２２Ｇ２によって接触される一次配列に沿った残基のクラスターである。
本明細書に記載される抗体を用いて「ＴＩＧＩＴ上の同一エピトープ」と結合する抗体を調べる技術として、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析が挙げられ、これは、エピトープの原子分解を提供する。その他の方法は、抗体の抗原断片または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、エピトープ成分を示すと考えられる。方法はまた、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、または標的タンパク質のプロテアーゼ消化物から特異的な短いペプチド(天然の三次元形態または変性された形態のいずれか)を親和性単離する能力に頼る場合もある。そこで、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングのために、コンホメーション的に不連続なエピトープをマッピングするために示されてきた計算アルゴリズムも開発された。
エピトープまたはエピトープを含む領域はまた、ＴＩＧＩＴに広がる一連の重複するペプチドとの結合についてスクリーニングすることによって同定できる。あるいは、Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899の方法を使用して、同一エピトープを有する、したがって、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体に対して同様の特性を有する抗体の選択を導いてもよい。ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖を、(好ましくは、ヒト)軽鎖のレパートリーと対形成して、ＴＩＧＩＴ結合性抗体を選択し、次いで、新規軽鎖を(好ましくは、ヒト)重鎖のレパートリーと対形成して、本明細書に記載される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体と同一エピトープまたはエピトープ領域を有する(好ましくは、ヒト)ＴＩＧＩＴ結合性抗体を選択する。抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発によって、本明細書に記載される抗体の別法としての変異体を得ることができる。
Cunningham & Wells (1989) Science 244: 1081によって記載されるようなアラニンスキャニング突然変異誘発またはＴＩＧＩＴ中のアミノ酸残基の点突然変異誘発のいくつかのその他の形態(実施例４で提供される酵母ディスプレイ法など)を使用して、抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能的エピトープを調べてもよい。
特異的抗体によって結合されたエピトープまたはエピトープ領域(「エピトープ領域」は、エピトープを含むか、またはエピトープと重複する領域である)はまた、抗体の、ＴＩＧＩＴの断片を含むペプチドとの結合を評価することによって決定してもよい。ＴＩＧＩＴ(例えば、ヒトＴＩＧＩＴ)の配列を包含する一連の重複するペプチドは、合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ法(ペプチドが、抗体の、マイクロタイタープレートのウェルと結合しているＴＩＧＩＴとの結合を防ぐその能力について評価される)において、またはチップ上で結合についてスクリーニングしてもよい。このようなペプチドスクリーニング方法は、いくつかの不連続な機能的なエピトープ、すなわち、ＴＩＧＩＴポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出可能でない場合もある。
エピトープはまた、水素／重水素交換質量分析(ＨＤＸ−ＭＳ)およびタンパク質の迅速光化学酸化(Fast Photochemical Oxidation of Proteins)(ＦＰＯＰ)などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法によって同定してもよい。ＨＤＸ−ＭＳは、Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95でさらに記載されるように実施でき、その方法は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057に記載されるように実施でき、その方法は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
抗ＴＩＧＩＴ抗体によって結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３)、分子モデリングおよび遊離している場合および対象の抗体との複合体中に結合されている場合には、ＴＩＧＩＴ中の不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含めた核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法などの構造的方法によって決定してもよい(Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884)。
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ(例えば、Chayen (1997) Structure 5:1269)、懸滴蒸気拡散(例えば、McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300)、シーディングおよび透析を含めた当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して達成され得る(例えば、Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339;McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1)。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％(ｗ／ｖ)の範囲の濃度を有する、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００(ＰＥＧ；約１０００〜約２０,０００Ｄａの範囲の平均分子量)、好ましくは、約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは、約６０００Ｄａを含有する沈殿剤溶液中で最良に達成され得る。タンパク質分解防止剤、例えば、グリセロールを約０.５％〜約２０％の範囲の濃度で含むことが望ましいものであり得る。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適した塩はまた、好ましくは、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度の沈殿剤溶液中にあることが望ましいものであり得る。沈殿剤は、好ましくは、約３.０〜約５.０、好ましくは、約４.０のｐＨに緩衝される。沈殿剤溶液において有用な特定のバッファーは変わり得て、当技術分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用なバッファーの例として、それだけには限らないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸が挙げられる。結晶は２℃、４℃、８℃および２６℃を含めたさまざまな温度で成長させてもよい。
抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ−ＰＬＯＲ(Yale University、1992、Molecular Simulations、Inc.によって配布された;例えば、Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号を参照のこと)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.;Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)などのコンピュータソフトウェアを使用して洗練され得て、それらの開示内容は、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる。
高親和性で結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書に開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体のように、ｈｕＴＩＧＩＴと高親和性で結合し、有効な治療薬である可能性を高める。種々の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、ｈｕＴＩＧＩＴと１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭまたは６０ｐＭ未満のＫＤで結合する。その他の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、２ｎＭから６０ｐＭの間のＫＤでｈｕＴＩＧＩＴと結合する。抗体の、ｈｕＴＩＧＩＴに向けた結合能力を評価するための標準アッセイとして、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)およびＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析(実施例２を参照のこと)が挙げられる。
抗ＴＩＧＩＴ抗体配列変異体
本明細書に開示される抗体配列のいくつかの可変性は、許容され、抗体の望ましい特性を依然として維持し得る。ＣＤＲ領域は、カバットシステム(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を使用して描写される。したがって、本発明は、本明細書において開示される抗体(例えば、１５Ａ６、２２Ｇ２および１１Ｇ１１)のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣＤＲ配列を含む抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体をさらに提供する。本発明はまた、本明細書において開示される抗体(例えば、１５Ａ６、２２Ｇ２および１１Ｇ１１)の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体も提供する。
同一生殖系列に由来する抗ＴＩＧＩＴ抗体
抗原結合特異性は、主にＣＤＲによって決定されることを考えると、本明細書において開示される抗体(例えば、１５Ａ６、２２Ｇ２および１１Ｇ１１)とＣＤＲ配列を共有する抗体は、その望ましい特性を共有する可能性が高い。さらに、本明細書において開示される選択された抗体(１５Ａ６、２２Ｇ２および１１Ｇ１１)は、ｈｕＴＩＧＩＴの一次配列に沿って同様の領域と結合し、一部の重鎖および軽鎖は、同一の生殖系列配列に由来する。したがって、１５Ａ６、２２Ｇ２および１１Ｇ１１を有する抗体に由来するＣＤＲ領域を組み合わせる(混合するおよび対応させる)抗体もまた、ｈｕＴＩＧＩＴと結合し、その望ましい特性を保持すると予測され得る。本明細書において開示される特定の抗体と同等またはそれより優れた、結合親和性、生理活性 および／またはその他の特性を有する「混合および対応させた」抗体が、本発明の方法において使用するために選択され得る。
特定の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、特定のヒト生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および／または特定のヒト生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む。抗体１５Ａ６は、ヒト生殖系列Ｖ４−３９、Ｄ６−１９およびＪＨ４ｂに由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＡ２７およびＪＫ２に由来する軽鎖を有する。抗体２２Ｇ２は、ヒト生殖系列Ｖ４−６１、Ｄ３−１０およびＪＨ６ｂに由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＬ６およびＪＫ３に由来する軽鎖を有する。抗体１１Ｇ１１は、ヒト生殖系列Ｖ４−３９、Ｄ３−１０およびＪＨ４ｂに由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＬ６およびＪＫ２に由来する軽鎖を有する。抗体１０Ｄ７は、ヒト生殖系列Ｖ１−６９、Ｄ６−１３およびＪＨ６ｂに由来する重鎖ならびに生殖系列ＶＬ１５およびＪＫ５に由来する軽鎖を有する。ヒトＴＩＧＩＴと結合し、これらの生殖系列配列の一部またはすべてに由来するその他の抗体は、配列、特に、同一Ｖ領域遺伝子に由来するものにおいて密接に関連している可能性が高く、したがって、同一の望ましい特性を共有すると予測される。
抗体の可変領域が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られ、抗体配列が、所与の生殖系列に由来する可能性が任意のその他のものよりも高い生殖系列と十分に関連している場合には、本明細書において、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列に「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、対象の抗原を用いて免疫処置することまたは対象の抗原を用いてファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。抗体の配列が「由来する」ヒト生殖系列免疫グロブリン配列(単数または複数)は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することおよびヒト抗体の配列に対して配列が最も近い(すなわち、最大同一性パーセント)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に「由来する」ヒト抗体は、生殖系列配列と比較した場合に、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な誘導によるアミノ酸の相違を含有し得る。しかし、選択されたヒト抗体は、通常、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えば、Ｖ領域)によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、その他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較した場合に、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えば、Ｖ領域)によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。通常、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えば、Ｖ領域)によってコードされるアミノ酸配列から１０個以下のアミノ酸の相違を示す。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子(例えば、Ｖ領域)によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、またはさらに４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
II. 遺伝子操作された、および修飾された抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
修飾された抗体を遺伝子操作するために、出発材料として本明細書において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうち１種または複数を有する抗体を使用して調製され得る、遺伝子操作された、および修飾された抗体もまた提供され、この修飾された抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内の、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の、および／または１つまたは複数のフレームワーク領域内の１個または複数の残基を修飾することによって、遺伝子操作され得る。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するために、定常領域(単数または複数)内の残基を修飾することによって遺伝子操作され得る。
実施され得る１種の可変領域遺伝子操作として、ＣＤＲグラフティングがある。このようなグラフティングは、本明細書において開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体と結合について競合し、および／または本明細書において開示される抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体と同一エピトープと結合する非ヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体をヒト化において特に役立つ。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)中に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトされた特定の参照抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の参照抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033;Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと)。
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースに、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836に見い出すことができ、それらの各々の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
本明細書において記載される抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本明細書に記載される抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に同様であるものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域上にグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較した場合に最大２０個の好ましくは保存的なアミノ酸置換を含有するフレームワーク領域上にグラフトされ得る。例えば、特定の場合には、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることが有益であることがわかっている(例えば、Queen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと)。
本明細書に記載された遺伝子操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が行われているものを含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるよう行われることが多い。例えば、１つのアプローチとして、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することがある。より詳しくは、体細胞突然変異を起こしている抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列に対して比較することによって同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、体細胞突然変異を生殖系列配列に「復帰突然変異する」ことができる。このような「復帰突然変異された」抗体も包含されるものとする。
別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の免疫原性の可能性を低減するために、フレームワーク領域内の、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を突然変異することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Carr et alによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
別の種類の可変領域修飾は、対象の抗体の１種または複数の結合特性(例えば、親和性)を改善するためにＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を突然変異することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、抗体結合または対象のその他の機能的特性に対して突然変異(単数または複数)および効果を導入できる。保存的修飾が導入されることが好ましい。突然変異は、アミノ酸付加、欠失または好ましくは、置換であり得る。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基は、酸化され、その結果、化学的分解の可能性および結果としての抗体の効力の低減をもたらし得る。したがって、酸化分解を受けていないアミノ酸残基と置換された、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ中の１個または複数のメチオニン残基を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体も提供される。
同様に、抗ＴＩＧＩＴ抗体から、特に、ＣＤＲ中の脱アミド化部位も除去され得る。
抗原結合を干渉し得るグリコシル化を防ぐために、抗原結合ドメイン内の可能性あるグリコシル化部位が排除されることが好ましい。例えば、米国特許第５,７１４,３５０号を参照のこと。
標的化される抗原結合
種々の実施形態では、本発明の抗体は、抗原結合が有害である組織および環境において抗原結合を選択的に遮断するが、有益である抗原結合を可能にするよう修飾される。一実施形態では、抗体の抗原結合表面と特異的に結合し、抗原結合を干渉する遮断ペプチド「マスク」が生じ、このマスクは、ペプチダーゼ切断可能リンカーによって抗体の結合アームの各々と連結している。例えば、ＣｙｔｏｍＸの米国特許第８,５１８,４０４号を参照のこと。このようなコンストラクトは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、マスキング／遮断ペプチドの解離が可能となり、これが、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
あるいは、関連実施形態では、(二価)抗体の両方の抗原結合表面と結合し、抗原結合を干渉する、２つの抗原結合ドメインを含む二価結合化合物(「マスキングリガンド」)が開発され、これでは、２つの結合ドメインマスクは、切断可能なリンカー、例えば、ペプチダーゼによって切断可能なリンカーによって互いに(抗体ではなく)連結される。例えば、Tegopharm Corpの国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３を参照のこと。マスキングリガンドは、抗体が結合するよう意図される抗原を含み得るか、もしくはそれに由来し得るか、または独立に作製され得る。このようなマスキングリガンドは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、２つの結合ドメインの互いからの解離が可能となり、抗体の抗原結合表面の結合力を低下させる。結果として生じる、抗体からのマスキングリガンドの解離が、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
Ｆｃおよび修飾されたＦｃ
抗原結合ドメインの抗原との結合(例えば、アンタゴニスト抗体の場合には、同族リガンドもしくは受容体タンパク質またはアゴニスト抗体の場合には、誘導されるシグナル伝達の遮断)に起因する治療用抗体の活性に加えて、抗体のＦｃ部分は、複雑な方法で全体的に免疫系と相互作用して、任意の数の生物学的効果を誘発する。免疫グロブリンのＦｃ領域などのエフェクター機能は、抗原依存性細胞性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)および抗体依存性細胞媒介性食作用(ＡＤＣＰ)などの多数の重要な抗体機能に関与しており、異なる機序によってではあるが、標的細胞の死滅をもたらす。重鎖定常領域の５種の主要なクラスまたはアイソタイプ(ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ)があり、各々は、特徴的なエフェクター機能を有する。これらのアイソタイプは、サブクラスにさらに細分され得、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として知られる４つのサブクラスに分けられる。ＩｇＧ分子は、抗体のＩｇＧクラスに対して特異的な３つのクラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ)、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体との結合にとって重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン中に位置すると報告されている。抗体の血清半減期は、その抗体の新生児Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)と結合する能力によって影響を受ける。
本発明の抗体は、意図される使用のために抗体の生物活性(あるとすれば)に基づいて選択された、異なるＦｃ領域を含む定常ドメインと組み合わされた本発明の可変ドメインを含み得る。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。例えば、ヒトＩｇＧは、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類され得、これらの各々は、１種または複数のＦｃγ受容体(活性化受容体ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＣ(ＣＤ３２)；ＦｃγＲIIIＡおよびＦｃγＲIIIＢ(ＣＤ１６)ならびに阻害性受容体ＦｃγＲIIＢ)との結合について、ならびに補体の第１の成分(Ｃ１ｑ)について独特のプロフィールを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、すべてのＦｃγ受容体と結合し；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲIIＡＨ１３１と結合し、ＦｃγＲIIＡＲ１３１ ＦｃγＲIIIＡＶ１５８に対してより低い親和性を有し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ、ＦｃγＲIIＣおよびＦｃγＲIIIＡＶ１５８と結合し；阻害性受容体ＦｃγＲIIＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に対して、すべてのその他のＦｃγ受容体よりも低い親和性を有する。Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716。研究によって、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ２と結合せず、ＦｃγＲIIIＢは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４と結合しないことが示された。同著。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３>>ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２。結果として、例えば、ＡＤＣＣが望まれる薬物における使用のためには、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択され得；ＦｃγＲIIIＡ発現ＮＫ細胞、マクロファージの単球の活性化の場合には、ＩｇＧ３が選択され得；アレルギー患者を脱感作するために抗体が使用されるべきである場合にはＩｇＧ４が選択され得る。抗体がすべてのエフェクター機能を欠くことが望まれる場合にも、ＩｇＧ４が選択され得る。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃと連結され得(例えば、共有結合によって連結されるか、または融合される)、これは、例えば、ＩｇＧ１の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)であり得る。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1)を参照のこと。アロタイプの選択は、例えば、抗薬物抗体の形成を最小化するために、可能性ある免疫原性の懸念によって影響を受け得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ可変領域は、１種または複数の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、ＦｃγＲIIａ／ＣＤ３２またはＦｃγＲIIIａ／ＣＤ１６)と結合するＦｃと連結され、それによって、ＡＤＣＣを刺激し、Ｔ細胞枯渇を引き起こし得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ可変領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３ Ｆｃと連結され、すなわち、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、枯渇性抗体であり、特に、それらは、腫瘍微小環境において、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させ、Ｔｅｆｆ細胞を枯渇させない(それによって、抗腫瘍活性を増強する)が、腫瘍微小環境の外側、例えば、末梢では、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を大幅には枯渇させない。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、腫瘍部位でのＴｒｅｇ細胞枯渇または排除およびＴｅｆｆ細胞の同時活性化を刺激する、天然に存在するか、または天然に存在しない(例えば、突然変異(単数または複数)を含む)のいずれかのアイソタイプのものである。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、腫瘍部位でのＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比の上昇をもたらし、これは、強力な抗腫瘍活性を示し、好ましくは、腫瘍微小環境の外側、例えば、末梢では、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を大幅に枯渇しない。
その他の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を遮断する。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＦｃＲ結合が減少または排除された、例えば、活性化ＦｃＲとの結合が低減したＦｃを有する。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ可変領域は、例えば、腫瘍環境におけるＴｒｅｇ枯渇を増強するために、天然に存在しないＦｃ領域、例えば、エフェクターレスまたはほとんどエフェクターレスＦｃ(例えば、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４)、あるいは、１種または複数の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIａまたはＦｃγＲIIIａ)との結合が増強されたＦｃと連結され得る。
本明細書に記載される可変領域は、通常、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性などの、抗体の１種または複数の機能的特性を変更するために、１つまたは複数の修飾を含むＦｃと連結され得る。さらに、本明細書に記載される抗体は、化学的に修飾され得る(例えば、１種または複数の化学部分は、抗体と結合され得る)か、またはそのグリコシル化を変更するよう、抗体の１種または複数の機能的特性を変更するよう修飾され得る。これらの実施形態の各々は、以下に詳細に記載される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、カバットのＥＵ指数のものである。本明細書において開示される配列変異体は、残基番号と、それに続く、天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されるアミノ酸に関連して、任意選択で、その位置の天然に存在する残基が先行して提供される。所与の位置に複数のアミノ酸が存在し得る場合、例えば、配列が天然に存在するアイソタイプ間で異なる場合、または複数の突然変異がその位置で置換され得る場合には、それらは／によって分けられる(例えば、「Ｘ／Ｙ／Ｚ」)。
例えば、親のＦｃに対して、(ａ)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)が増大もしくは減少した、(ｂ)補体媒介性細胞傷害性(ＣＤＣ)が増大もしくは減少した、(ｃ)Ｃ１ｑに対する親和性が増大もしくは減少した、および／または(ｄ)Ｆｃ受容体に対する親和性が増大もしくは減少したＦｃ変異体を作製するために、Ｆｃ領域中に修飾を行ってもよい。このようなＦｃ領域変異体は、一般に、Ｆｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることは、特に望ましいと考えられる。例えば、変異体Ｆｃ領域は、中に、本明細書において同定される特定のＦｃ領域位置の２、３、４、５つなどの置換を含み得る。例示的Ｆｃ配列変異対は、本明細書において開示されており、また、米国特許第５,６２４,８２１号、同６,２７７,３７５号、同６,７３７,０５６号、同６,１９４,５５１号、同７,３１７,０９１号、同８,１０１,７２０号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０１／５８９５７、ＷＯ０４／０１６７５０、ＷＯ０４／０２９２０７、ＷＯ０４／０３５７５２、ＷＯ０４／０７４４５５、ＷＯ０４／０９９２４９、ＷＯ０４／０６３３５１、ＷＯ０５／０７０９６３、ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４で提供されている。
エフェクター機能を低減すること
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域を修飾することによって低減され得る。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体との結合に影響を及ぼす部位、好ましくは、サルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するよう修飾され得る。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野で公知である、例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9を参照のこと。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ変異体は、ＦｃγＲ結合を効率的に排除する。Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:4223およびChu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926。その他の実施形態では、ＦｃγＲとの結合が低減されているＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含んでいた。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
ＣＤＣ活性はまた、Ｆｃ領域を修飾することによって低減され得る。ＩｇＧ１位置での突然変異、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１、具体的には、アラニン突然変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、対応する抗体の、Ｃ１ｑと結合し、補体を活性化する能力を大幅に低減する。Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178；ＷＯ９９／５１６４２。ＩｇＧ１の位置３３１の修飾(例えば、Ｐ３３１Ｓ)は、補体結合を低減すると示されている。Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661およびCanfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。別の例では、アミノ酸位置２３１〜２３９内の１個または複数のアミノ酸残基が変更され、それによって、抗体の補体を固定する能力を低減する。ＷＯ９４／２９３５１。
いくつかの実施形態では、補体結合が低減したＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
エフェクター機能が完全に避けられるべき使用のために、例えば、所望の治療的利益を生じさせるのに抗原結合単独で十分である場合およびエフェクター機能が、望ましくない副作用につながる(そのリスクを増大する)だけである場合には、ＩｇＧ４抗体を使用してもよく、またはＦｃ領域もしくはそのかなりの部分を欠く抗体もしくは断片を考案することができ、またはＦｃを、グリコシル化を完全に排除するよう突然変異してもよい(例えば、Ｎ２９７Ａ)。あるいは、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲと結合する能力を欠き(ＩｇＧ２のように)、補体を活性化することができない(ＩｇＧ４のように)、ヒトＩｇＧ２のハイブリッドコンストラクト(ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域)およびヒトＩｇＧ４(ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン)が作製されてきた。Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441;Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479(エフェクター機能を全般的に低減するためのＦｃ修飾を論じる)も参照のこと。
その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のすべてのエフェクター機能を低減するよう、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することによって変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対して低減した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力は保持するよう、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換され得る。それに対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体(残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７)または補体のＣ１成分(残基２９７、３１８、３２０、３２２)であり得る。両方ともWinter et alによる米国特許第５,６２４,８２１号および同５,６４８,２６０号。
１つの早期の特許出願は、ＦｃγＲＩとの結合を低減して、ＡＤＣＣを低減するため(２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ)または補体成分Ｃ１ｑとの結合を遮断して、ＣＤＣを排除するために(Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ)、ＩｇＧ Ｆｃ領域中の修飾を提案した。ＷＯ８８／００７０８９。Duncan & Winter (1988) Nature 332:563;Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036;およびSondermann et al. (2000) Nature 406:267(ＦｃγＲIII結合に対するこれらの突然変異の効果を論じる)も参照のこと。
エフェクター機能を低減するＦｃ修飾はまた、位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５および３２８での置換、挿入および欠失、例えば、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒを含む。Ｆｃ変異体は、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減するためのその他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖを含む。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。ＩｇＧ１中、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、適宜、Ｇ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４中、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、適宜、Ｇ２３６Δ；およびＩｇＧ２中、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓなど、位置２３３〜２３６および３２７〜３３１のうち１つまたは複数でＩｇＧ残基を突然変異することによって、エフェクター機能(ＡＤＣＣおよび補体活性化の両方)は、新生児ＦｃＲ結合を維持しながら(半減期を維持しながら)低減され得る。Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613；ＷＯ９９／５８５７２を参照のこと。エフェクター機能を低減するその他の突然変異として、ＩｇＧ１中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537)；ＩｇＧ２中のＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613；米国特許第５,８３４,５９７号も参照のこと)；ならびにＩｇＧ４のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ(Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925)が挙げられる。ヒトＩｇＧ１においてエフェクター機能を低減するための突然変異の別の組合せとして、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓが挙げられる。Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。全般的に、Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479を参照のこと。Ｆｃ(ＩｇＧ１)融合タンパク質(アバタセプト)に関連してエフェクター機能を減少させるとわかっているさらなる突然変異として、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ(ＥＵ残基番号付け)がある。Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204。
ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを低減させたその他のＦｃ変異体は、Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287(ＩｇＧ４においてＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを減少させるためのＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ)；Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980(ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ)；An et al. (2009) MAbs 1:572および米国特許出願公開第２００７／０１４８１６７号(ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ)；McEarchern et al. (2007) Blood 109:1185(ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ)；Vafa et al. (2014) Methods 65:114(ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ)に開示されている。
特定の実施形態では、本質的にエフェクター機能を有さない、すなわち、ＦｃγＲとの結合が低減され、補体結合が低減されたＦｃが、選択される。エフェクターレスである例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃは、以下の５つの突然変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。これらの５つの置換は、同様にグリコシル化を排除するためのＮ２９７Ａと組み合わされ得る。
エフェクター機能を増強すること
あるいは、Ｆｃ領域を修飾することによって、ＡＤＣＣ活性は増大され得る。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３>>ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、そのため、ＡＤＣＣが望まれる薬物における使用のためには、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択され得る。あるいは、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９で１個または複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を増大するよう、および／またはＦｃγ受容体に対する親和性を増大するよう修飾され得る。ＷＯ２０１２／１４２５１５を参照のこと；ＷＯ００／４２０７２も参照のこと。例示的置換として、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的変異体として、２３９Ｄ−３３２Ｅ、２３６Ａ−３３２Ｅ、２３６Ａ−２３９Ｄ−３３２Ｅ、２６８Ｆ−３２４Ｔ、２６７Ｅ−２６８Ｆ、２６７Ｅ−３２４Ｔおよび２６７Ｅ−２６８Ｆ−３２４Ｔが挙げられる。例えば、任意選択で、Ｉ３３２Ｅと組み合わされ得る、Ｇ２３６Ａ変異体を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγＲIIＡ／ＦｃγＲIIＢ結合親和性比をおよそ１５倍増大するとわかった。Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強するためのその他の修飾として、それだけには限らないが、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌが挙げられる。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。具体的には、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方は、ＩｇＧ１の位置Ｅ３３３の変更、例えば、Ｅ３３３Ａによって増強され得る。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591。ＩｇＧ１においてエフェクター機能を増強するためのＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ突然変異の使用は、ＷＯ２００６／０２０１１４に開示されており、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／Ｖは、ＷＯ２００４／０７４４５５に開示されている。ヒトＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／ＷおよびＥ３３３Ａ／Ｓ変異体およびＩｇＧ２におけるＥ３３３Ｓは、エフェクター機能を増大するとわかっている。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。
具体的には、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604。組合せ突然変異体Ｔ２５６Ａ−Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ−Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ−Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ−Ｅ３３３Ａ−Ｋ３３４Ａ(ＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性が増強されている)を含めた、位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の突然変異は、ＦｃγＲIIIとの結合を改善すると示された。Ｓ２３９Ｄ−Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ−Ｉ３３２Ｅ−Ａ３３０Ｌ突然変異を有する変異体を含めた、ＦｃγＲIIIａとの結合が強力に増強されたその他のＩｇＧ１変異体が同定されており、これは、ＦｃγＲIIIａに対する親和性の最大の増大、ＦｃγＲIIｂ結合の減少およびカニクイザルにおける強力な細胞傷害性活性を示した。Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005;Awan et al. (2010) Blood 115:1204;Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。アレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)などの抗体中への三重突然変異の導入は、インビトロで大きく増強されたＡＤＣＣ活性に変換され、Ｓ２３９Ｄ−Ｉ３３２Ｅ変異体は、サルにおいてＢ細胞を枯渇させる増強された能力を示した。Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおいてヒトＦｃγＲIIIａを発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＦｃγＲIIIａとの増強された結合および同時に増強されたＡＤＣＣ活性を示した、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ突然変異を含有するＩｇＧ１突然変異体が同定された。Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882；米国特許第８,６５２,４６６号；Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。
種々のＩｇＧアイソタイプはまた、差次的ＣＤＣ活性を示す(ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４)。Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989。増強されたＣＤＣが望まれる使用のためには、Ｃ１ｑとの結合を増大する突然変異を導入することも可能である。補体(ＣＤＣ)を補充する能力は、Ｃ１ｑ、補体カスケードの第１の成分との結合を増大するための、ＩｇＧ２におけるＫ３２６および／またはＥ３３３での突然変異、例えば、Ｋ３２６Ｗ(ＡＤＣＣ活性を低減する)およびＥ３３３Ｓによって増強され得る。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。ヒトＩｇＧ１へのＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ(単独または任意の組合せの)導入は、Ｃ１ｑ結合を増強する。Moore et al. (2010) mAbs 2:181。Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863(その中の図１)のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体のＦｃ領域「１１３Ｆ」は、増強されたＣＤＣを与える。Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553およびRedpath et al. (1998) Immunology 93:595も参照のこと。
エフェクター機能を増大または減少し得るさらなる突然変異は、Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129に開示されている。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343;Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460も参照のこと。
本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴｍＡｂｓと必ずしも関連しないが、阻害性受容体ＦｃｙＲIIｂに対する親和性を増強するＦｃ変異体は、アポトーシス誘導またはアジュバント活性を増強し得る。Li & Ravetch (2011) Science 333:1030;Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:10966；米国特許出願公開第２０１４／００１０８１２号。このような変異体は、例えば、Ｂ細胞および単球を含めたＦｃｙＲIIｂ＋細胞と関連する免疫調節性活性を有する抗体を提供し得る。一実施形態では、Ｆｃ変異体は、１種または複数の活性化受容体と相対的に、ＦｃｙＲIIｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃｙＲIIｂに対する結合を変更するための修飾として、ＥＵ指数に従って、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１つまたは複数の修飾が挙げられる。ＦｃｙＲIIｂ親和性を増強するための例示的置換として、それだけには限らないが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的置換として、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙが挙げられる。ＦｃｙＲIIｂとの結合を増強するためのその他のＦｃ変異体として、２３５Ｙ−２６７Ｅ、２３６Ｄ−２６７Ｅ、２３９Ｄ−２６８Ｄ、２３９Ｄ−２６７Ｅ、２６７Ｅ−２６８Ｄ、２６７Ｅ−２６８Ｅおよび２６７Ｅ−３２８Ｆが挙げられる。具体的には、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ−Ｌ３２８Ｆ二重変異体を含めたＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅ変異体は、具体的には、阻害性ＦｃｙＲIIｂ受容体に対する親和性の増強において特に価値がある。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号；ＷＯ２０１２／０８７９２８。ＦｃγＲIIｂに対する増強された特異性(ＦｃγＲIIａＲ１３１とは区別されるような)は、Ｐ２３８Ｄ置換およびその他の突然変異(Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１)ならびにＶ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅ(Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723およびＷＯ２０１４／１８４５４５)を付加することによって得ることができる。
半減期延長
特定の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増大するよう修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増大することによって行うことができる。一実施形態では、抗体は、Presta et alによって米国特許第５,８６９,０４６号および同６,１２１,０２２号に記載されるようにＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとられるサルベージ受容体結合エピトープを含有するようＣＨ１またはＣＬ領域内で変更される。ＦｃＲｎとの結合を増大し、および／または薬物動態特性を改善するその他の例示的Ｆｃ変異体は、位置２５９、３０８および４３４での置換を含み、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍが挙げられる。ＦｃＲｎとのＦｃ結合を増大するその他の変異体として、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004、J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216、Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Dall'Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)が挙げられる。米国特許第８,３６７,８０５号を参照のこと。
Ｎ４３４Ａ変異体(Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)などの、ＩｇＧ Ｆｃ中の特定の保存された残基(Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４)の修飾は、ＦｃＲｎ親和性を増大し、したがって、循環における抗体の半減期を増大する方法として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組合せＦｃ変異体は、ＦｃＲｎ結合を増大し、血清半減期を最大５倍まで増大すると示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組合せＦｃ変異体もまた、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ−Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｓ変異体を含む組合せＦｃ変異体もまた、半減期を延長すると示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０。
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組合せＦｃ変異体は、半減期を４倍近く増大する。Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。増大したＦｃＲｎ親和性を提供するが、ｐＨ依存が低下した関連ＩｇＧ１修飾(Ｍ２５２Ｙ−Ｓ２５４Ｔ−Ｔ２５６Ｅ−Ｈ４３３Ｋ−Ｎ４３４Ｆ)を使用して、その他の抗体のＦｃＲｎとの結合を防ぎ、その結果、そのその他の抗体、内因性ＩｇＧ(例えば、自己免疫状況における)または別の外因性(治療用)ｍＡｂのいずれかのクリアランスの増大をもたらすための競合物質として使用するためのＩｇＧ１コンストラクト(「ＭＳＴ−ＨＮ Ａｂｄｅｇ」)を作製した。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４。
ＦｃＲｎ結合を増大するためのその他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；第６,２７７,３７５号；同６,８２１,５０５号；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
特定の実施形態では、ＦｃＲｎ結合を増大し、半減期を潜在的に増大するためにハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ１位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ３に由来するアミノ酸と置換することによって構築され得る。このようにして、１つまたは複数の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が、構築され得る。本明細書に記載されるその他の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ２位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ１に由来するアミノ酸と置換することによって、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体が構築され得る。このようにして、１つまたは複数の置換、例えば、以下のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(位置２３６でのグリシンの挿入を指す)および３２７Ａのうち１つまたは複数を含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が構築され得る。米国特許第８,６２９,１１３号を参照のこと。血清半減期に増大し、発現を改善するといわれているＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが作製された。米国特許第７,８６７,４９１号(その中の配列番号１８)。
本発明の抗体の血清半減期はまた、ペグ化によって増大され得る。抗体を、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を増大するようペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、通常、抗体またはその断片を、１つまたは複数のＰＥＧ基が、抗体または抗体断片と結合するようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)試薬と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(Ｃ１〜Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、その他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの任意の形態を包含するものとする。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、技術分野で公知であり、本明細書に記載される抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照のこと。
あるいは、いくつかの状況かでは、本発明の抗体の半減期を増大するのではなく、減少することが望ましい場合がある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ、Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)などの修飾は、医用画像のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を減少させ、ひいては、半減期を減少(クリアランスを増大)させ得る。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照のこと。クリアランスを増強するためのその他の手段として、本発明の抗原結合ドメインを、Ｆａｂ断片などのＦｃＲｎと結合する能力を欠く抗体断片としてフォーマットすることが挙げられる。このような修飾は、抗体の循環半減期を２、３週間から数時間に減少させ得る。次いで、抗体断片の選択的ペグ化を使用して、必要に応じて、抗体断片の半減期を微調整(増大)できる。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。半減期を増大するために、抗体断片をまた、ヒト血清アルブミンと融合して、例えば、融合タンパク質コンストラクトにしてもよい。Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)と結合する、本発明の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを用いて、二重特異性抗体を構築してもよい。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびその中で引用される特許参考文献を参照のこと。あるいは、半減期を増大するために、特殊化ポリペプチド配列、例えば、「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列を抗体断片に添加することができる。Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186;国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２。
さらなるＦｃ変異体
ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合には、普通、ＩｇＧ１中のヒンジ配列を模倣し、それによって、例えば、治療されている患者において、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４の間のＦａｂアーム交換を低減しながら、ＩｇＧ４分子を安定化する置換Ｓ２２８Ｐを含むことが好ましい。Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767;Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925。
ＩｇＧ１コンストラクトのヒンジ中の可能性あるプロテアーゼ切断部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾によって排除し、抗体の安定性を増大することができる。ＷＯ２０１４／０４３３４４。
Ｆｃ変異体のそのリガンド(Ｆｃ受容体)に対する親和性および結合特性は、それだけには限らないが、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)またはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ))または速度論(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析)および間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などのその他の方法を含めた、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)によって決定され得る。これらおよびその他の方法は、調べられている１種もしくは複数の成分上の標識を利用してもよく、および／またはそれだけには限らないが、クロマトグラフィー、蛍光、発光もしくは同位体標識を含めた種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論の詳細な説明は、抗体免疫原相互作用に焦点を当てる、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見い出すことができる。
さらにその他の実施形態では、抗体のグリコシル化は、エフェクター機能を増大または低減するよう修飾される。例えば、位置２９７の保存されたアスパラギン残基を突然変異し(例えば、Ｎ２９７Ａ)、ひいては、補体およびＦｃγＲＩ結合を消滅させることによって、すべてのエフェクター機能を欠く非グリコシル化抗体を作製できる。Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595(ＩｇＧ１中のＮ２９７Ｑを使用して、位置２９７でのグリコシル化を排除する)も参照のこと。
非グリコシル化抗体は、一般に、エフェクター機能を欠くが、その機能を回復させるよう、突然変異を導入することができる。非グリコシル化抗体、例えば、Ｎ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ突然変異に起因するものか、またはタンパク質をグリコシル化しない系(例えば、大腸菌)において産生されたものを、ＦｃγＲ結合を回復させるよう、さらに突然変異することができる、例えば、Ｓ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／もしくはＨ(ＷＯ２００９／０７９２４２)またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 107:604)。
さらに、グリコシル化を変更することによって、ＡＤＣＣが増強された抗体を製造できる。例えば、重鎖Ａｓｎ２９７が連結したオリゴ糖からのフコースの除去は、ＦｃγＲIIIａとの改善された結合に基づいてＡＤＣＣを増強すると示された。Shields et al. (2002) JBC 277:26733; Niwa et al. (2005) J. Immunol. Methods 306:151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res.15:3376 (MDX-1401);Cardarelli et al. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257(MDX-1342)。このような低フコース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ(ＦＵＴ８)を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において(Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614)、または非フコシル化抗体を生成するその他の細胞において産生され得る。例えば、Zhang et al. (2011) mAbs 3:289およびLi et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210(両方とも、糖鎖操作されたピキア・パストリス(Pichia pastoris)における抗体産生を説明する)；Mossner et al. (2010) Blood 115:4393;Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466;EP1176195B1を参照のこと。ＡＤＣＣはまた、フコースの、Ａｓｎ(２９７)が連結した炭化水素と結合する能力が低下した変異体ＣＨＯ細胞系統、Ｌｅｃ１３の使用を開示する、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５に記載されるように増強され得、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化をもたらした。Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと。あるいは、フコース類似体を、フコースが抗体上の炭水化物中に組み込まれることを阻害するために抗体産生の際に培養培地に添加してもよい。ＷＯ２００９／１３５１８１。
抗体が連結したオリゴ糖における二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大もまた、ＡＤＣＣを増強する。Umana et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾性グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するよう遺伝子操作された細胞系統を記載し、その結果、遺伝子操作された細胞系統において発現された抗体は、二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、これは、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと)。
ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰの増強を示すが、ＣＤＣを減少する、ガラクトース、シアル酸、フコースおよびキシロース残基(いわゆるＧＮＧＮグリコフォーム)を欠くさらなるグリコシル化変異体ならびにＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣの増強を示す、シアル酸、フコースおよびキシロース(いわゆるＧ１／Ｇ２グリコフォーム)を欠くその他のものが開発されている。米国特許出願公開第２０１３／０１４９３００号。これらのグリコシル化パターンを有する抗体は、任意選択で、内因性キシロシルおよびフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされている、遺伝子修飾されたベンサミアナタバコ(N. benthamiana)植物において産生される。
糖鎖操作はまた、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７で結合している炭水化物鎖のα２,６シアリル含量を変更することによって、ＩｇＧコンストラクトの抗炎症特性を修飾するために使用され得、これでは、α２,６シアリル化形態の割合の増加が、抗炎症効果の増強をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513を参照のこと。逆に、α２,６シアリル化炭化水素を有する抗体の割合の減少は、抗炎症特性が望まれない場合には有用であり得る。例えば、α２,６シアリル化形態の選択的精製によって、または酵素的修飾によって、抗体のα２,６シアリル化含量を修飾する方法は、米国特許出願公開第２００８／０２０６２４６号に提供されている。その他の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾を含めることによって、α２,６シアリル化の効果を模倣するよう修飾され得る。ＷＯ２０１３／０９５９６６。
III. 抗体物理的特性
本明細書に記載される抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増大または変更された抗原結合による抗体のｐＫの変更をもたらし得る(Marshall et al. (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702;Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94;Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7;Mimura et al. (2000) Mol. Immunol. 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こると知られている。いくつかの場合には、可変領域グリコシル化を含有しない抗ＴＩＧＩＴ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによってか、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによって達成され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、その結果、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を低減する(イソアスパラギン酸効果)イソアスパラギン酸残基を生成する。
各抗体は、独特の等電点(ｐＩ)を有し、これは、一般に、６から９.５の間のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、通常、７〜９.５のｐＨ範囲内に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、通常、６〜８のｐＨ範囲内に入る。正常範囲の外側のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下で幾分かのアンフォールディングおよび不安定性を有し得るという推測がある。したがって、正常範囲内に入るｐＩ値を含有する抗ＴＩＧＩＴ抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体を選択することによってか、または電荷を有する表面残基を突然変異させることによって達成され得る。
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボで全体的な安定性が大きいことを示す(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、ＴＭ１(最初のアンフォールディングの温度)は、６０℃超、好ましくは、６５℃超、さらにより好ましくは、７０℃超であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett. 68:47-52)または円偏光二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40:343-9)を使用して測定できる。
好ましい実施形態では、迅速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem. 67:3626-32)を使用して測定できる。
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択され、凝集効果は、不要な免疫応答および／または変更されたか、もしくは不都合な薬物動態特性の誘発につながり得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは、２０％以下、さらにより好ましくは、１５％以下、さらにより好ましくは、１０％以下およびさらにより好ましくは、５％以下の凝集を有しても許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含めた、いくつかの技術によって測定できる。
IV. 核酸分子
本明細書に記載される別の態様は、本明細書に記載される抗体をコードする核酸分子に関係する。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸(例えば、その他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界では単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製された場合に、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有する場合も、含有しない場合もある。特定の実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
本明細書に記載される核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ)によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから(例えば、ファージディスプレイ技術を使用して)から得られる抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するよう、標準組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と作動可能に連結している。この文脈において使用されるような、用語「作動可能に連結された」は、２種のＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるよう、２種のＤＮＡ断片が接続されることを意味するものとする。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと)、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと)、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得る(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照のこと)。
Ｖ. 抗体作製
本発明の種々の抗体、例えば、本明細書に開示される抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体と同一エピトープと競合するものまたはそれと結合するものは、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)によって記載される標準体細胞ハイブリダイゼーション技術などの種々の公知の技術を使用して産生できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は好ましいが、原理上、モノクローナル抗体を産生するためのその他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系として、マウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて十分に確立された手順である。免疫処置プロトコールおよび技術および融合のために免疫処置された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順も公知である。
本明細書に記載されるキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、対象のマウスハイブリドーマから得、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含有するよう遺伝子操作できる。例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許第４,８１６,５６７号を参照のこと)。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ領域を挿入できる(例えば、Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと)。
一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなＴＩＧＩＴに対して向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を保持する、トランスジェニックまたはトランスクロモソミック(transchromosomic)マウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミック(transchromosomic)マウスは、本明細書において、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、再編成されていないヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された突然変異とともに含有する(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照のこと)。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫処置に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖 導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al. (1994)、前掲; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説されている)。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスによって保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724;Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830;Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、それらの開示内容は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、すべてLonbergおよびKayの米国特許第５,５４５,８０６号；同５,５６９,８２５号；同５,６２５,１２６号；同５,６３３,４２５号；同５,７８９,６５０号；同５,８７７,３９７号；同５,６６１,０１６号；同５,８１４,３１８号；同５,８７４,２９９号；および同５,７７０,４２９号；Surani et al.の米国特許第５,５４５,８０７号；すべてLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、導入遺伝子および導入染色体(transchromosome)上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスを使用して作製される。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を作製するために使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix、Inc.)と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５,９３９,５９８号；同６,０７５,１８１号；同６,１１４,５９８号；同６、１５０,５８４号および同６,１６２,９６３号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスクロモソミック(transchromosomic)動物系は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を作製するために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体(transchromosome)およびヒト軽鎖導入染色体(transchromosome)の両方を保持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体(transchromosome)を保持するウシが、当技術分野で記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を作製するために使用できる。
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体を作製するための当技術分野において記載されるさらなるマウス系として、(ｉ)内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)が作製され、次いで、その後、標準組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)ならびに(ii)マウスが再編成されていないヒト重鎖可変領域、しかし単一の再変性されたヒト共通軽鎖可変領域を含有するＭｅＭｏ(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載されている。
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許第５,２２３,４０９号；同５,４０３,４８４号；および同５,５７１,６９８号；Dower et al.の米国特許第５,４２７,９０８号および同５,５８０,７１７号； McCafferty et al.の米国特許第５,９６９,１０８号および同６,１７２,１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５,８８５,７９３号；同６,５２１,４０４号；同６,５４４,７３１号；同６,５５５,３１３号；同６,５８２,９１５号および同６,５９３,０８１号を参照のこと。
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et alの米国特許第５,４７６,９９６号および同５,６９８,７６７号に記載されている。
免疫処置
ヒトＴＩＧＩＴに対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856−859;Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、ＴＩＧＩＴ抗原および／またはＴＩＧＩＴを発現する細胞の精製または濃縮された調製物を用いて免疫処置できる。あるいは、マウスをヒトＴＩＧＩＴをコードするＤＮＡを用いて免疫処置できる。好ましくは、マウスは、第１の注入の際に６〜１６週齢とする。例えば、ＨｕＭＡｂマウスを腹膜内に免疫処置するために、組換えＴＩＧＩＴ抗原の精製または濃縮された調製物(５〜５０μｇ)を使用できる。ＴＩＧＩＴ抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫処置が抗体をもたらさない事象では、ＴＩＧＩＴを発現する細胞、例えば、細胞系統を用いてマウスを免疫処置して、免疫応答を促進することもできる。例示的細胞系統として、ＴＩＧＩＴ過剰発現性安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞系統が挙げられる。
種々の抗原を用いる累積的経験は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる最初に腹膜内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)免疫処置と、それに続く、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる隔週でのＩＰ／ＳＣ免疫処置(最大合計１０)の際に最良に応答することを示した。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿サンプルを用いて、免疫処置プロトコールの過程にわたってモニタリングできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき(以下に記載されるように)、抗ＴＩＧＩＴヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫処置のために２〜３回の融合が実施されることが必要であり得ると予測される。各抗原について、６から２４匹の間のマウスが、通常免疫処置される。普通、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は両方とも、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)単一マウスに一緒に育種され得る。
ＴＩＧＩＴに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記載されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫処置されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、５０％ ＰＥＧを用いて、免疫処置マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１)と融合できる。細胞を、およそ２×１０５で平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」コンディショニング培地、５％オリゲン(origen)(ＩＧＥＮ)、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０.０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１Ｘ ＨＡＴ(Sigma)を含有する選択培地で２週間インキュベートする。およそ２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置換されている培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、１０〜１４日後に普通に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
モノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１.４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
VI. 抗体製造
ＴＩＧＩＴに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
配列が提供される特異的抗体およびその他の関連抗ＴＩＧＩＴ抗体の両方を含めた、本発明の抗体を、当技術分野で周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生できる(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術(例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング)によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすよう、抗体遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法(例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結)によって、発現ベクター(単数または複数)中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント(単数または複数)と作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結されるように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であり得る。
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得る当業者には明らかである。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列として、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲαプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製の起点)などのさらなる配列および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する(例えば、すべてAxel et al.による米国特許第４,３９９,２１６号、同４,６３４,６６５号および同５,１７９,０１７号を参照のこと)。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のための)が挙げられる。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター(単数または複数)を、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のためによく使用されるさまざまな技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記載される抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高効率の産生にとっては有効ではないと報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本発明の抗体はまた、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)の糖鎖操作された株においても産生できる。Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210。
本明細書に記載される組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の好ましい発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞中に導入され、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、よく観察される翻訳後修飾によって予測される配列とは異なることもある。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖から失われていることが多い。Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。N末端グルタミン残基およびより少ない程度であるが、グルタミン酸残基は、治療用抗体の軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換されることが頻繁にある。Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211。
本発明の種々のアゴニスト抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体のアミノ酸配列は、表５にまとめられている配列表に提供されている。上記の理由のために、Ｃ末端リシンは、重鎖または重鎖定常ドメインの配列表中の配列のいずれにも含まれない。しかし、代替実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の各重鎖および／またはこのような抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝子コンストラクトは、このさらなるリシン残基を重鎖(単数または複数)のＣ末端に含む。
VII. アッセイ
本明細書に記載される抗体は、ＴＩＧＩＴとの結合について、例えば、標準ＥＬＩＳＡによって試験できる。手短には、マイクロタイタープレートを精製されたＴＩＧＩＴを、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍＬで用いてコーティングし、次いで、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物(例えば、ＴＩＧＩＴ免疫処置マウスから得た血漿の希釈物)を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、例えば、ヒト抗体またはそうでなければヒト重鎖定常領域を有する抗体の二次試薬、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)とコンジュゲートしているヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄した後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc、product:ABTS-1000)を用いて発色させ、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計によって分析する。次いで、免疫処置されたマウスから得た血清を、ＴＩＧＩＴを発現しない対照細胞株とではなく、ヒトＴＩＧＩＴを発現する細胞株との結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。手短には、抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合を、ＴＩＧＩＴ発現性ＣＨＯ細胞を１：２０希釈の抗ＴＩＧＩＴ抗体とともにインキュベートすることによって評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用してフローサイトメトリー分析を実施する。最高の力価を発生するマウスが、融合に使用されることが好ましい。マウス抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体が検出されるべきである場合には、抗マウス検出抗体を使用して類似の実験を実施してもよい。
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、ひいては、ＴＩＧＩＴ免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングできる。好ましくは、高親和性でＴＩＧＩＴと結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。細胞バンクを作製するために、抗体精製のために、親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによって)各ハイブリドーマから１つのクローンを選択できる。
抗ＴＩＧＩＴ抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを成長させることができる。プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１.４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
選択された抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体が独特のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＴＩＧＩＴコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩コーティングできる。１％ ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
モノクローナル抗体の、ＴＩＧＩＴを発現する生存細胞との結合を調べるために、実施例に記載されるようにフローサイトメトリーを使用できる。手短には、膜結合性ＴＩＧＩＴを発現する細胞株(標準成長条件下で成長させた)を、０.１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフィコエリトリン(ＰＥ)標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析して、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ(に加えて、または代わりに)、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて減少した感受性を有し得る。
抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ウエスタンブロッティングによってＴＩＧＩＴ抗原との反応性についてさらに試験できる。手短には、ＴＩＧＩＴを発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランにトランスファーし、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いてプロービングする。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる(Sigma Chem.Co., St.Louis, MO)。
種々の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合親和性、交差反応性および結合速度論を解析する方法は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)分析およびＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００ＳＰＲ機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を含む。
一実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴの細胞外領域と特異的に結合する。抗体は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)と特異的に結合し得る。特定の実施形態では、抗体は、ＰＶＲが結合するＴＩＧＩＴ上の部位と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴの細胞外領域およびカニクイザルＴＩＧＩＴの細胞外領域と特異的に結合する。好ましくは、抗体は、高親和性でヒトＴＩＧＩＴと結合する。
VIII. 二重特異性分子
本明細書に記載される抗体は、二重特異性分子の形成のために使用され得る。抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、誘導体化されるか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、別の抗体または受容体のリガンド)と連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を生成し得る。本明細書に記載される抗体は、実際、誘導体化されるか、２種以上のその他の機能的分子と連結されて、２種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を生成し得；このような多重特異性分子もまた、本明細書において、用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本明細書に記載される二重特異性分子を作製するために、本明細書に記載される抗体を、二重特異性分子が結果として生じるような別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１種または複数のその他の結合分子と機能的に連結することができる(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による結合または別の方法で)。
したがって、少なくとも１つのＴＩＧＩＴに対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が本明細書において提供される。二重特異性分子が多重特異性である本明細書に記載される一実施形態では、分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖを含めたその抗体断片を含む。参照によりその開示内容が明確に組み込まれるLadner et al.米国特許第４,９４６,７７８号に記載されるように、抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体またはＦｖもしくは一本鎖コンストラクトなどのその任意の最小断片であり得る。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記載される二重特異性分子において使用され得るその他の抗体として、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体がある。
本明細書に記載される二重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して成分結合特異性をコンジュゲートすることによって調製できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を、別個に作製し、次いで、互いにコンジュゲートできる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合には、共有結合コンジュゲーションのために種々のカップリングまたは架橋剤を使用できる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシニミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)が挙げられる(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686;Liu、MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと)。その他の方法として、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されるものが挙げられる。好ましいコンジュゲート剤として、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣがあり、両方とも、Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合には、それらを、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートできる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションに先立って奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは、１を含有するよう修飾される。
あるいは、両結合特異性は、同一ベクター中にコードされ、同一宿主細胞において発現され、アセンブルされ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本明細書に記載される二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５,２６０,２０３号；同５,４５５,０３０号；同４,８８１,１７５号；同５,１３２,４０５号；同５,０９１,５１３号；同５,４７６,７８６号；同５,０１３,６５３号；同５,２５８,４９８号および同５,４８２,８５８号に記載されている。
二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、生物検定法(例えば、成長阻害)またはウエスタンブロットアッセイなどの当技術分野で認識される方法を使用して確認され得る。これらのアッセイは各々、一般に、対象の複合体に対して特異的な標識試薬(例えば、抗体)を使用することによって、特に対象とされるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
IX. 組成物
医薬上許容される担体と一緒に製剤化された、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片(単数または複数)を含有する組成物、例えば、医薬組成物がさらに提供される。このような組成物は、(例えば、２種以上の異なる)本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子のうち１種または組合せを含み得る。例えば、本明細書に記載される医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または補完的活性を有する抗体(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)の組合せを含み得る。
特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で、または１〜３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌで抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、その他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療薬の例は、本明細書に記載される抗体の使用に関する節において以下により詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される治療用組成物は、癌の治療のために使用されるその他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤として、例えば、所与の癌に対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が挙げられる。いくつかの場合には、治療用組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストのうち１種または複数を含み得る。
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適している。投与経路に応じて、化合物を、酸および化合物を不活性化し得るその他の天然条件作用から保護するために、材料において、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子をコーティングしてもよい。
本明細書に記載される医薬化合物は、１種または複数の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、何らかの望ましくない毒物学的影響を付与しない塩を指す(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと)。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などといった非毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などといった非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといったアルカリ土類金属に由来するものならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどといった非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として、(１)アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどといった水溶性抗酸化物質、(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどといった油溶性抗酸化物質および(３)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などといった金属キレート化剤が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどといった)およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌法手順、前掲によって、また種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が考慮される。補足活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含めることが好ましいであろう。組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射用組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込むことと、それに続く、滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法として、その前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)がある。
単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与様式に応じて変わる。単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生産する組成物の量となる。一般に、医薬上許容される担体との組合せにおいて、この量は、１００パーセントのうち、有効成分の約０.０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは、約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、有効成分の約１パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
投与計画は、最適の所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に低減または増大してもよい。投与の容易性および投与形の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療されている対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生産するよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記載される投与単位形の仕様は、(ａ)活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに(ｂ)個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。
抗体の投与のために、投与量は、約０.０００１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通常は、０.０１〜５ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０.３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的治療計画は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。好ましい実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、２週毎に投与される。本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体のその他の好ましい投与計画として、静脈内投与による１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇまたは５ｍｇ／体重１ｋｇが挙げられ、抗体は、以下の投与スケジュール：(ｉ)６投与形に対して４週間毎、次いで、３ヶ月毎、(ii)３週間毎、(iii)３ｍｇ／体重１ｋｇを１回と、それに続く１ｍｇ／体重１ｋｇを３週間毎のうち１種を使用して与えられる。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合には、投与される各抗体の投与量は、示される範囲内に入る。治療用抗体は、普通、複数の機会で投与される。単一投与量の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則である場合もある。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するよう調整される。
抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、治療が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時には必要である。その後、患者は、任意選択で、予防的投与計画を投与されることがあるが、多くの免疫−腫瘍学適応症では、継続治療は必要ではない。
本明細書に記載される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者とって毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るよう変えてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴および医薬の技術分野において周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に応じて変わる。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらす。癌に関連して、治療上有効な用量は、好ましくは、癌と関連する身体症状のさらなる増悪を防ぐ。癌の症状は、当技術分野で周知であり、例えば、普通ではない黒子の特徴、非対称、境界、色および／または直径を含めた黒子の外観の変化、新規に着色した皮膚領域、異常な黒子、爪の下の黒くなった領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、脱力感、過度の疲労、摂食障害、食欲の喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹膜腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。治療効力は、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂの最初の投与の直後に観察可能であるか、または一定期間および／または一連の用量の後にのみ観察され得る。このような遅延された有効性は、数ヶ月の治療、最大６、９または１２ヶ月後にのみ観察され得る。いくつかの免疫−腫瘍学薬剤によって示される遅延された有効性を考慮すると、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂが、治療上の有効性を欠くと早期に決定しないことが重要である。
疾患の早期または先行する徴候が存在する場合に望まれ得るような治療上有効な用量は、癌の発生を防ぐかまたは遅延し得る。癌の診断において使用される実験室試験は、化学(ＴＩＧＩＴレベルの測定を含む)、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のうちいずれかをモニタリングする任意の臨床または生化学アッセイを使用して、特定の治療が、癌を治療するための治療上有効な用量であるか否かを調べてもよい。当業者ならば、対象の大きさ、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択された投与経路のような因子に基づいてこのような量を決定できるであろう。
本明細書に記載される組成物は、当技術分野で公知の１種または複数の種々の方法を使用して、１種または複数の投与経路によって投与できる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸性、舌下にまたは局所になど、非経口ではない経路によって投与できる。
留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など、活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物は、米国特許第５,３９９,１６３号；同５,３８３,８５１号；同５,３１２,３３５号；同５,０６４,４１３号；同４,９４１,８８０号；同４,７９０,８２４号；または同４,５９６,５５６号に開示される装置などの注射針無し皮下注射装置を用いて投与できる。本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体とともに使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として、制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４,４８７,６０３号が挙げられる。；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する同４,４８６,１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する同４,４４７,２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋め込み可能注入器具を開示する同４,４４７,２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４３９,１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４７５,１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするよう製剤化できる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多数の高親水性化合物を排除する。本明細書に記載される治療用化合物が、ＢＢＢを通過することを確実にするために(必要に応じて)、それらを例えば、リポソーム中に製剤化できる。リポソームを作製する方法については、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号；同５,３７４,５４８号；および同５,３９９,３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送され、したがって、標的化された薬物送達を増強する１つまたは複数の部分を含み得る(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと)。例示的標的化部分として、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許第５,４１６,０１６号を参照のこと)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
Ｘ. 使用および方法
本明細書に記載される抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断することによる免疫応答の増強またはＴＩＧＩＴの検出に絡む多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、インビトロもしくはエキソビボで培養細胞に、または種々の疾患において免疫性を増強するために、例えば、インビボでヒト対象に投与できる。したがって、対象において免疫応答が増強され、刺激され、上方制御されるように、対象に、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象において免疫応答を修飾する方法が、本明細書において提供される。
好ましい対象として、免疫応答の増強が望ましいであろうヒト患者が挙げられる。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答)を増大することによって治療され得る障害を有するヒト患者を治療するために特に適している。特定の実施形態では、方法は、インビボでの癌の治療のために特に適している。免疫性の抗原特異的増強を達成するために、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を、対象の抗原と一緒に投与でき、または抗原が、治療されるべき対象においてすでに存在していてもよい(例えば、腫瘍を有するか、またはウイルスを有する対象)。ＴＩＧＩＴに対する抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合には、２種は、別個に投与することも、同時に投与することもできる。
また、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、抗体または断片とヒトＴＩＧＩＴとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＴＩＧＩＴ抗原の存在を検出するか、またはヒトＴＩＧＩＴ抗原の量を測定するための方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、これでは、対照サンプルと比較した、サンプル間の複合体形成の相違が、サンプルにおけるヒトＴＩＧＩＴ抗原の存在を示す。さらに、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＴＩＧＩＴを精製するために使用できる。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体の、Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答の阻害または同時阻害を遮断する能力を考えると、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御するために、本明細書に記載される抗体を使用するインビトロおよびインビボ法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＣＤ３刺激も提供され(例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との同時インキュベーションによって)、その刺激は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療と同時に、その前に、またはその後に提供され得る。例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答が例えばＴＩＧＩＴ媒介性阻害効果の除去によって増強されるように、前記Ｔ細胞を、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体と、および任意選択で、ＣＤ３と接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強する方法が本明細書において提供される。抗原特異的Ｔ細胞応答の任意の適した指標を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定できる。このような適した指標の限定されない例として、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増大および／または抗体の存在下でのサイトカイン生産の増大が挙げられる。好ましい実施形態では、インターロイキン−２および／または抗原特異的Ｔ細胞によるインターフェロン−γ生産が増強される。
対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が増強されるように、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を対象に投与することを含む、対象において免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を増強する方法がさらに包含される。好ましい実施形態では、対象は、腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が増強される。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。特定の実施形態では、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、非免疫原性である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性である。特定の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまた、ウイルスを有する対象であり得、ウイルスに対する免疫応答が増強される。
対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の成長を阻害するための方法がさらに提供される。また、対象において慢性ウイルス感染が治療されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を投与することを含む、対象において慢性ウイルス感染を治療する方法も提供される。
また、対象に、治療上有効な量の、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を投与することを含む、腫瘍、例えば、癌性腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境からＴｒｅｇ細胞を枯渇させる方法も本明細書に包含される。Ｆｃは、例えば、１種または複数の活性化Ｆｃ受容体との結合または増強された結合を有するなど、エフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有するＦｃであり得る。好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境においてＴｅｆｆの大幅な枯渇または阻害を伴わずに、また腫瘍微小環境の外側のＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞の大幅な枯渇または阻害を伴わずに起こる。特定の実施形態では、対象は、例えば、腫瘍微小環境においてＴｅｆｆ細胞よりもＴｒｅｇ細胞でより高レベルのＴＩＧＩＴを有する。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、腫瘍においてＴｒｅｇを、および／または腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)においてＴｒｅｇを枯渇させ得る。例えば、ＣＴ２６腫瘍モデルでは、マウスＩｇＧ２ａ(エフェクター機能を示す)としてフォーマットされた抗マウスＴＩＧＩＴ抗体は、ＴｒｅｇおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を部分的に枯渇させたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は枯渇させなかった。マウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａとしてフォーマットされた、エフェクターレス対応物抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔ細胞を枯渇させなかった。エフェクター機能を有するか、またはエフェクターレス抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用するか否かを考える場合には、抗腫瘍免疫応答を増強し得るＴｒｅｇの枯渇と、腫瘍細胞を実際に死滅させるのに必要とされる細胞の一部を排除するＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇の間の二律背反に、十分な考慮がなされなければならない。Ｔｒｅｇの枯渇は、抗腫瘍活性を増強すると予測され得るが、最近の研究によって、ＴＩＧＩＴ＋ＴｒｅｇでのＴＩＧＩＴの連結が、Ｔｅｆｆ細胞増殖のＴｒｅｇ細胞媒介性抑制を促進することが実証され(Joller et al. (2014) Immunity 40:569)、これは、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断(例えば、本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用する)がまた、抗腫瘍活性を増強し得ることを示唆する。したがって、ｉ)ＴｒｅｇにおいてＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断し、したがって、その免疫抑制活性を低減し、ii)ＴＩＧＩＴの阻害効果を遮断することによって抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、同時に、エフェクター機能媒介性枯渇を避け、iii)ＤＮＡＭが、そうでなければＴＩＧＩＴによって結合されたであろうＰＶＲと結合することを可能にすることによって(また直接ＴＩＧＩＴ−ＤＮＡＭ相互作用を低減することによって)、ＤＮＡＭ媒介性活性化を増強する(Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:923)、エフェクター機能を欠くアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用することは、最も有効であり得る。
特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、補助的療法として対象に与えられる。癌を有する対象の、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療は、現在の標準治療と比較して長期間耐久性のある応答、少なくとも１、２、３、４、５、１０年またはそれ以上の長期間の生存、少なくとも１、２、３、４、５または１０年またはそれ以上の再発のない生存につながり得る。特定の実施形態では、癌を有する対象の、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療は、癌の再発を防ぐか、または癌の再発を、例えば、１、２、３、４、５もしくは１０年もしくはそれ以上遅延する。抗ＴＩＧＩＴ治療は、第一次治療または第二次治療として使用できる。
本明細書に記載されるこれらおよびその他の方法は、以下にさらに詳述される。
癌
抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＴＩＧＩＴを介したＰＶＲ／ネクチン−２シグナル伝達の遮断は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。対象が治療される、例えば、その結果、癌性腫瘍の成長が阻害もしくは低減される、および／または腫瘍が退縮するように、対象に、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を投与することを含む、癌を有する対象を治療するための方法が、本明細書において提供される。抗ＴＩＧＩＴ抗体は、癌性腫瘍の成長を阻害するために単独で使用できる。あるいは、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、別の薬剤、例えば、以下に記載されるような、その他の免疫原、標準癌治療またはその他の抗体とともに使用できる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などのＰＤ−１の阻害剤との組合せも提供される。
したがって、対象に、治療上有効な量の本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１または１０Ｄ７またはその抗原結合断片を投与することを含む、例えば、対象において腫瘍細胞の成長を阻害することによって癌を治療する方法が、本明細書において提供される。抗体は、ヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体(本明細書に記載されるヒト抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体のいずれかなど)であり得るか、またはキメラもしくはヒト化非ヒト抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体、例えば、結合について、少なくとも１種の本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体と同一のエピトープと競合するか、またはそれと結合する、キメラもしくはヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体であり得る。
成長が本発明の抗体を使用して阻害され得る癌として、免疫療法に対して通常応答性の癌が挙げられる。治療のための癌の限定されない例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)およびＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎癌(例えば、明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、神経膠芽腫(神経膠芽腫多形)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌腫および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌(gastric cancer)、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、上皮小体腺の癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導性癌、ウイルス関連癌(例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)関連腫瘍)および２種の主要な血液細胞系統のいずれか、すなわち、骨髄系細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ球系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)に由来する血液悪性腫瘍、例えば、すべての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３変異体［Ｍ３Ｖ］)、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］)、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ球系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ １＋)大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる)およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも呼ばれる)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫を含めたその他の腫瘍、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；好ましくは、Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽球性亜種)；血管中心性(鼻腔の)Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記の癌の任意の組合せが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、転移性癌、難治性癌(例えば、遮断性ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体を用いる、例えば、これまでの免疫療法に対して難治性の癌)および再発性癌の治療のために使用してもよい。
抗ＴＩＧＩＴ抗体は、単剤治療として、または唯一の免疫賦活性療法として投与でき、または癌ワクチン戦略において、癌性細胞、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)もしくは免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞などの免疫原と組み合わせることができる(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。
腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62;Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302;Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738を参照のこと; DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition中のRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと)。これらの戦略の１つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であるとわかっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであるとわかっている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43)。
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合には、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示され得る。これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、ＴＩＧＩＴ阻害は、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物とともに使用できる。これらのタンパク質は、正常には、自己抗原として免疫系によって見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％超において、および限定された数の体細胞組織のみにおいて発現されるタンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変更するか、または２種の無関係の配列間の融合タンパク質(すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｃｒ−ａｂｌ)もしくはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプを作製する体細胞突然変異のために癌細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
その他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌に関わるウイルスに由来するタンパク質を含み得る。ＴＩＧＩＴ阻害とともに使用できる腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質(ＨＳＰ)がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達で高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588;Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答をプライムするために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載させることができる(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣはまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝的手段によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫処置を目的として腫瘍細胞と直接融合されている(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化する(制御を解く)よう、ＤＣ免疫処置を、ＴＩＧＩＴ遮断と効率的に組み合わせることができる。
ＴＩＧＩＴ阻害はまた、標準癌治療(例えば、手術、放射線照射および化学療法)と組み合わせることができる。ＴＩＧＩＴ阻害は、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、投与される化学療法試薬の用量を低減することが可能であり得る(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組合せの一例として、黒色腫の治療のためのデカルバジン(decarbazine)と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体がある。このような組合せの別の例として、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体がある。ＴＩＧＩＴ阻害および化学療法の組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死による、ＴＩＧＩＴ阻害との相乗作用をもたらし得るその他の併用治療として、放射線照射、手術およびホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、ＴＩＧＩＴ阻害と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体はまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現する、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用できる(例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同５,８３７,２４３号を参照のこと)。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性抗体が、腫瘍の部位に対するマクロファージを標的とするために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答を効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＴＩＧＩＴの阻害によって増強される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達され得る。
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現される免疫抑制タンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答に有利に働くよう、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせて使用できる。
宿主免疫応答性を活性化するその他の抗体を、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、効率的に、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＴＩＧＩＴ抗体とともに使用できる。ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169)、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することはまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供し得る。ＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４(例えば、米国特許第５,８１１,０９７号)の阻害剤もまた、抗ＴＩＧＩＴ抗体とともに使用してもよい。
造血起源の種々の腫瘍を治療するために、骨髄移植が現在使用されている。移植片対宿主病は、この治療の結果であるが、治療利益は、移植片対腫瘍応答から得られ得る。ＴＩＧＩＴ阻害は、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大できる。
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および増大ならびに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含む、いくつかの実験的治療プロトコールもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するために使用できる。抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下でのエキソビボ活性化は、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大し得る。
慢性ウイルス感染
別の態様では、本明細書に記載される本発明は、対象が感染性疾患について治療されるように、対象に抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象において感染性疾患を治療する方法を提供する。
上記で論じられるような腫瘍へのその適用と同様に、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を増強するために、抗体媒介性ＴＩＧＩＴ阻害を、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用できる。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例として、それだけには限らないが、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ状球菌(staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)が挙げられる。ＴＩＧＩＴ阻害は、感染の経過にわたって変更された抗原を示すＨＩＶなどの因子による確立された感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体投与の時点で外来性として認識され、したがって、強力なＴ細胞応答を引き起こす。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例として、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例として、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌が挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例として、カンジダ(Candida)(アルビカンス(albicans)、クルゼイ(krusei)、グラブラータ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis)など)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス(Aspergillus)(フミガツス(fumigatus)、ニガー(niger)など)、ケカビ目(Mucorales)の属(ケカビ属(mucor)、ユミケカビ属(absidia)、クモノスカビ属(rhizopus))、スポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix schenkii)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、南アメリカ分芽菌(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)およびヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)が挙げられる。
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例として、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、フォーラーネグレリア(Naegleriafowleri)、アカントアメーバ属(Acanthamoeba)の種、ランブル鞭毛虫(Giardia lambia)、クリプトスポリジウム属(Cryptosporidium)の種、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ネズミバベシア(Babesia microti)、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、ブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)が挙げられる。
上記の方法のすべてにおいて、ＴＩＧＩＴ阻害を、サイトカイン治療(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照)などのその他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。
ワクチンアジュバント
抗ＴＩＧＩＴ抗体の、対象の抗原(例えば、ワクチン)との同時投与によって、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用して抗原特異的免疫応答を増強できる。したがって、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に、(ｉ)抗原、(ii)抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法が、本明細書に提供される。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体に由来する抗原であり得る。このような抗原の限定されない例として、上記で論じられた腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記のウイルス、細菌もしくはその他の病原体に由来する抗原などの上記の節において論じられたものが挙げられる。
特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質が、抗ＴＩＧＩＴ抗体の代わりに、または抗ＴＩＧＩＴ抗体に加えて、ワクチンとして使用される。
インビボおよびインビトロで、本明細書に記載される、抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)を投与する適した経路は、当技術分野で周知であり、当業者ならば選択できる。例えば、抗体組成物は、注射(例えば、静脈内または皮下)によって投与できる。使用される分子の適した投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に応じて変わる。
これまでに記載したように、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、１種またはその他の複数の治療薬、例えば、細胞傷害性薬剤、放射性毒性薬剤(radiotoxic agent)または免疫抑制剤と同時投与できる。抗体は、薬剤と連結できる(免疫複合体として)か、または薬剤と別個に投与できる。後者の場合には(別個の投与)、抗体を、薬剤の前に、後にもしくは同時に投与できるか、またはその他の既知療法、例えば、抗癌療法、例えば、放射線照射と同時投与できる。このような治療薬として、中でも、それ自体では、患者とって毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗腫瘍、抗新生物薬剤が挙げられる。シスプラチンは、１００ｍｇ／ｍｌの用量で４週間に１回、静脈内に投与され、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量で２１日に１回静脈内に投与される。抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片の、化学療法薬との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害性効果をもたらすよう異なる機序によって作動する２種の抗癌剤を提供する。このような同時投与は、薬物に対する抵抗性の発生または抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決し得る。
また、本明細書に記載される範囲内に、本明細書に記載される抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子またはイムノコンジュゲート)および使用のための説明書を含むキットがある。キットは、少なくとも１種のさらなる試薬または１種もしくは複数のさらなる本明細書に記載されるヒト抗体(例えば、第１のヒト抗体とは別個のＴＩＧＩＴ抗原中のエピトープと結合する相補活性を有するヒト抗体)をさらに含有し得る。キットは、通常、キットの内容物の意図される使用を示す表示を含む。用語表示は、キット上にもしくはキットとともに供給された、またはそうでなければキットに添付されている任意の文書または記録材料を含む。
併用療法
上記で提供された併用療法に加えて、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体はまた、例えば、以下に記載されるように癌を治療するための併用療法において使用できる。
本発明は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を、１種または複数のさらなる薬剤、例えば、免疫応答の刺激において有効である抗体と同時投与し、それによって、対象において免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する併用療法の方法を提供する。実施例７に示され、図５Ａおよび５Ｂに示されるように、マウスへのアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体の投与は、腫瘍成長の阻害において増強された効果を有していた。
一般に、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、(ｉ)共刺激性受容体のアゴニストおよび／または(ii)Ｔ細胞での阻害シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができ、そのうちいずれかが、抗原特異的Ｔ細胞応答(免疫チェックポイント制御因子)の増幅をもたらす。共刺激および共抑制分子のほとんどは、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーであり、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とし、免疫応答を増大する薬剤とともに投与してもよい。共刺激または共抑制受容体と結合する膜結合リガンドの１つの重要なファミリーとして、Ｂ７ファミリーがあり、これは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含む。共刺激または共抑制受容体と結合する膜結合リガンドの別のファミリーとして、同族のＴＮＦ受容体ファミリーメンバーと結合する分子のＴＮＦファミリーがあり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1を参照のこと)。
Ｔ細胞活性化はまた、可溶性サイトカインによって制御される。したがって、抗ＴＩＧＩＴ抗体を、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤もしくは遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦまたはその他の免疫抑制サイトカイン)のアンタゴニストおよび／または(ii)免疫応答を刺激するための、例えば、癌などの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
一態様では、Ｔ細胞応答は、本発明の抗ＴＩＧＩＴｍＡｂと、(ｉ)ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、ＣＤ９６(ＷＯ２０１５／０２４０６０；Bernhardt et al. (2014) Nat. Immunol. 15:406)およびＴＩＭ−４などのＴ細胞活性化を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)のアンタゴニストならびに(ii)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨなどのＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニストのうち１種または複数の組合せによって刺激され得る。
上記のタンパク質のうち１種を調節し、アゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、癌を治療するために本明細書に記載されるものと組み合わせてもよい例示的薬剤として、ＹＥＲＶＯＹ(登録商標)／イピリムマブまたはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＯＰＤIVＯ(登録商標)／ニボルマブ／ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ピディリズマブ／ＣＴ−０１１(ＰＤ−１に対する)、ＫＥＹＴＲＵＤＡ(登録商標)／ペンブロリズマブ／ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２に対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する−ＷＯ１１／１０９４００)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ウレルマブ(urelumab)／ＢＭＳ−６６３５１３およびＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、ＭＥＤＩ−６３８３およびＭＥＤＩ−６４６９(ＯＸ４０に対する)、ＲＧ−７８８８(ＯＸ４０Ｌに対する−ＷＯ０６／０２９８７９)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(lucatumumab)(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)およびムロモナブＣＤ３(ＣＤ３に対する)が挙げられる。
癌の治療のためにアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせることができるその他の分子として、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、アンタゴニスト抗ＴＩＧＴ抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ(lirilumab))と組み合わせることができる。
併用療法のためのさらにその他の薬剤として、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤、それだけには限らないが、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９、ＷＯ１３１６９２６４、ＷＯ１４／０３６３５７)を含めたＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストが挙げられる。
一般に、本明細書に記載されるアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体は、１種または複数の、陽性共刺激性受容体をライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬ならびに１種または複数の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増大する薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路に克服する(例えば阻害性受容体の関与(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)を遮断しＴｒｅｇを枯渇または阻害し(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって)、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転させる／防ぐ)薬剤および先天性免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症の引き金を引く薬剤と一緒に使用できる。
例えば、腫瘍成長を阻害するよう、または抗ウイルス性応答を刺激するよう、対象において免疫応答が刺激されるように、対象に、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ分子、例えば、抗体ならびにＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／またはＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体などの１種または複数のさらなる免疫賦活性抗体を投与することを含む、対象において免疫応答を刺激するための方法が本明細書において提供される。一実施形態では、対象は、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体を投与される。一実施形態では、対象は、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与される。一実施形態では、対象は、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与される。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体(例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３)は、ヒト抗体である。あるいは、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体は、例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製された、例えば、キメラまたはヒト化抗体であり得る。
アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患(例えば、癌)を治療するための方法が本明細書において提供される。ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１は、黒色腫において同時発現され(Chauvin et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:2046)、また、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)および腎細胞癌(ＲＣＣ)患者に由来するＣＤ８＋ＴＩＬＳで比較的高レベルで同時発現される。表２を参照のこと(数人の患者から得たサンプルの総ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＩＬＳのパーセンテージとしてのＴＩＧＩＴ＋／ＰＤ−１＋細胞のパーセンテージを示す)。
特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ−１抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。また、抗ＴＩＧＩＴ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書において開示される抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などのヒト配列モノクローナル抗体である。
一実施形態では、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の高発現および高発現ＰＤ−Ｌ１を示す腫瘍を有する対象のみが、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＰＤ−１アンタゴニストを用いる併用治療のために選択される。別の実施形態では、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の高発現を示すが、低発現ＰＤ−Ｌ１を示す腫瘍を有する対象は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる単剤治療またはＰＤ−１アンタゴニスト以外の別の治療薬を用いる併用療法のために選択される。
その他の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストを用いる治療に続いて投与される併用療法を提供する。一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストを用いる治療が失敗し、不完全な治療応答をもたらすか、または腫瘍の再発もしくは再燃があった(本明細書において「ＰＤ−１失敗」と呼ばれる)後にだけ投与される。さらなる実施形態では、このようなＰＤ−１失敗における腫瘍は、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の発現についてスクリーニングされ、高レベル発現を有するもののみが抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いて治療される。
本明細書に記載される方法において使用するための適したＰＤ−１アンタゴニストとして、制限するものではないが、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体)および多価薬剤が挙げられる。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４などのＦｃ融合タンパク質である。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
例示的抗ＰＤ−１抗体として、ＯＰＤIVＯ(登録商標)／ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１種のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体がある。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＭＫ−３４７５(ＫＥＹＴＲＵＤＡ(登録商標)／ペンブロリズマブ／以前は、ランブロリズマブ)；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＡＭＰ−５１４／ＭＥＤＩ−０６８０；およびＣＴ−０１１(ピディリズマブ；これまでは、ＣＴ−ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ；例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409を参照のこと)である。さらに公知のＰＤ−１抗体およびその他のＰＤ−１阻害剤として、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号ならびに米国特許公開第２００９／０３１７３６８号に記載されるものが挙げられる。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ−１抗体のいずれかも使用してもよい。これらの抗体のうち１種と同様に、結合についてＰＤ−１上の同一エピトープと競合する、および／またはＰＤ−１上の同一エピトープと結合する抗ＰＤ−１抗体も、併用治療において使用してもよい。
アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患(例えば、癌)を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＴＩＧＩＴ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書において開示される抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体などのヒト配列モノクローナル抗体である。
一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号では１２Ａ４と呼ばれる)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(ＷＯ２０１３／７９１７４)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号に記載される３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６(また、抗Ｂ７−Ｈ１としても知られる)またはＭＰＤＬ３２８０Ａ(ＲＧ７４４６としても知られる)である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号および米国特許公開第２００９／１４５４９３号において開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれも使用してもよい。これらの抗体のいずれかのものと同一エピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も、併用治療において使用してもよい。
なおさらなる実施形態では、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、第３の免疫治療薬と組み合わせた、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−Ｌ１アンタゴニストなどのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達のアンタゴニストと組み合わされる。一実施形態では、第３の免疫治療薬は、本明細書において開示される抗ＧＩＴＲもしくは抗ＯＸ４０抗体などのＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ−４０アンタゴニストである。
別の態様では、免疫−腫瘍学薬剤は、アゴニストＧＩＴＲ抗体などのＧＩＴＲアゴニストである。適したＧＩＴＲ抗体として、例えば、ＢＭＳ−９８６１５３、ＢＭＳ−９８６１５６、ＴＲＸ−５１８(ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６)およびＭＫ−４１６６(ＷＯ１１／０２８６８３)が挙げられる。
別の態様では、免疫−腫瘍学薬剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。適したＩＤＯアンタゴニストとして、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２)、インドキシモド(indoximod)またはＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７)が挙げられる。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患(例えば、癌)を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＴＩＧＩＴ抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＹＥＲＶＯＹ(登録商標)(ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されるイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１)、トレメリムマブ(以前は、チシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)および以下の刊行物：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６,２０７,１５６；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071;Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145):Abstract No. 2505(antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304に記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれも、使用してよい。
抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患(例えば、癌)を治療するための方法が、本明細書において提供される。さらなる実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＬＡＧ−３抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＴＩＧＩＴ抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書において開示される抗体のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体などのヒト配列モノクローナル抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例として、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる、その他の当技術分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体として、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載されるＩＭＰ７３１が挙げられる。ＩＭＰ−３２１もまた使用してもよい。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＬＡＧ−３抗体も、併用治療において使用してもよい。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体およびアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の、ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの１種または複数の第２の標的抗原への投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。本開示の抗体を使用して成長が阻害され得る癌として、通常、免疫療法に応答性の癌が挙げられる。本開示の併用療法を用いる治療のための癌の代表例として、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる単剤治療の考察において上記で具体的に列挙された癌が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書において論じられる治療用抗体の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の各抗体を有する別個の組成物として同時に投与できる。別の実施形態では、治療用抗体の組合せを別個に投与できる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗ＣＴＬＡ−４抗体を最初に投与し、抗ＴＩＧＩＴ抗体を２番目に、または抗ＴＩＧＩＴ抗体を最初に投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を２番目に投与するなど、逐次投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−１抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗ＰＤ−１抗体を最初に投与し、抗ＴＩＧＩＴ抗体を２番目に投与するか、または抗ＴＩＧＩＴ抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−１抗体を２番目に投与するなど、逐次投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を最初に投与し、抗ＴＩＧＩＴ抗体を２番目に投与するか、または抗ＴＩＧＩＴ抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を２番目に投与するなど逐次投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体を、抗ＬＡＧ−３抗体を最初に投与し、抗ＴＩＧＩＴ抗体を２番目に投与するか、または抗ＴＩＧＩＴ抗体を最初に投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を２番目に投与するなど逐次投与できる。
さらに、２以上の用量の併用療法が逐次投与される場合には、逐次投与の順序は、各投与時点で逆転させることができ、同一順序で維持することができ、逐次投与は、同時投与またはその任意の組合せと組み合わせることができる。例えば、組合せ抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が第１および抗ＴＩＧＩＴ抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＴＩＧＩＴ抗体が第１および抗ＣＴＬＡ−４抗体が第２で逐次であり得る、など。さらにまたはあるいは、組合せ抗ＰＤ−１抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ−１抗体が第１および抗ＴＩＧＩＴ抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＴＩＧＩＴ抗体が第１で、抗ＰＤ−１抗体が第２で逐次であり得る、など。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第１および抗ＴＩＧＩＴ抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＴＩＧＩＴ抗体が第１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第２で逐次であり得るなど。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体の第１の投与は同時であり得、第２の投与は、−抗ＬＡＧ−３抗体が第１および抗ＴＩＧＩＴ抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＴＩＧＩＴ抗体が第１および抗ＬＡＧ−３抗体が第２で逐次であり得る。別の代表的な投薬スキームは、抗ＴＩＧＩＴが第１および抗ＣＴＬＡ−４抗体(および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)が第２で逐次である第１の投与を含み得、その後の投与は同時であってもよい。
適宜、唯一の免疫治療薬としての抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＴＩＧＩＴ抗体および１種または複数のさらなる免疫治療用抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断)の組合せを、癌性細胞などの免疫原、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激性サイトカイン(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)をコードする遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞とさらに組み合わせることができる。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる(以下にさらに論じられる)。ＴＩＧＩＴ阻害剤および１種または複数さらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)はまた、標準癌治療とさらに組み合わせることができる。例えば、ＴＩＧＩＴ阻害剤および１種または複数のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、本開示の組合せとともに投与されるその他の化学療法試薬の用量を低減することが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組合せの例として、黒色腫の治療のためのデカルバジン(decarbazine)とさらに組み合わせた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体などのさらなる抗体を伴うか、または伴わない、抗ＴＩＧＩＴアゴニスト抗体の組合せがある。別の例として、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２(ＩＬ−２)とさらに組み合わせた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体を伴うか、または伴わない、抗ＴＩＧＩＴ抗体の組合せがある。ＴＩＧＩＴ阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の、化学療法との組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死によるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うか、または伴わない、組み合わされたＴＩＧＩＴ阻害との相乗作用をもたらし得るその他の併用療法として、放射線照射、手術またはホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、組み合わされたＴＩＧＩＴ阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、宿主の抗原提示経路に供給される腫瘍抗原の供給源であり得る。
唯一の免疫治療薬としての抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体またはＴＩＧＩＴアンタゴニストおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組合せをまた、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体発現性エフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる(例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同５,８３７,２４３号)。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。これらの応答のＴ細胞アームは、組み合わされたＴＩＧＩＴ阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の使用によって増強される。
別の実施例では、唯一の免疫治療薬としての抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体または抗ＴＩＧＩＴ抗体およびさらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体の組合せを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ヘルセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼバリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ(登録商標)(エプルツズマブ(eprtuzumab))、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標)(エルロチニブ)などの抗腫瘍、抗新生物抗体とともに使用できる。例として、理論に捉われようとは思わないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートしている抗癌抗体を用いる治療は、癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)につながり得、これは、免疫賦活性薬剤、例えば、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体によって免疫応答媒介性を増強する。例示的実施形態では、過剰増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の治療は、抗癌剤、例えば、抗体を、同時にまたは逐次またはそれらの任意の組合せで、抗ＴＩＧＩＴおよび適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体と組み合わせて含み得、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による抗腫瘍免疫応答に有利に働くよう、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体を伴ってか、または伴わずに、抗ＴＩＧＩＴ抗体とさらに組み合わせることができる。
宿主免疫応答性を活性化するために使用できるその他の薬剤、例えば、抗体を、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体などを伴ってか、または伴わずに、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせてさらに使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体(Ridge et al., 前掲)は、抗ＴＩＧＩＴ抗体および適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体とともに使用できる。Ｔ細胞共刺激分子ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164:2160-2169)、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3:682-685 (1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397:262-266)に対するその他の活性化抗体はまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供する。
上記で論じたように、骨髄移植は現在、造血起源の種々の腫瘍を治療するために現在使用されている。抗ＴＩＧＩＴ免疫療法は、単独で、またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせて使用して、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大することができる。
いくつかの実験治療プロトコールは、抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および拡大および腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含む(Greenberg & Riddell、前掲)。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化するよう使用できる。抗ＴＩＧＩＴの存在下でのエキソビボ活性化は、さらなる免疫賦活性療法、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴ってか、または伴わずに、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大すると予測することができる。
抗ＴＩＧＩＴ抗体を、治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体を伴ってか、または伴わずに、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患(例えば、癌)の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。例えば、本明細書に記載される方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。本明細書に記載される一実施形態では、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。クローン病の治療のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)の通常の経口投与量は、６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)は、腸管において放出され、その後、腸粘膜において吸収され、保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)は、肝臓においてシトクロムＰ４５０系によって、無視できるほどのグルココルチコイド活性を有する代謝産物に広範に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、あまり広範ではない初回通過代謝を有するその他のグルココルチコイドと比較して改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身活性化コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含め、より少ない有害作用しかもたらさない。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)の慢性投与は、全身性高コルチコイド症(hypercorticism)および副腎抑制などの全身グルココルチコイド作用をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610を参照のこと。
さらなる実施形態では、非吸収性ステロイドとともに、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断(すなわち、免疫賦活性治療用抗体抗ＴＩＧＩＴおよび適宜、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)を伴うか、または伴わないＴＩＧＩＴ阻害を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸として、例えば、スルファサラジン(ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(ＤＩＰＥＮＴＵＭ(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(ＣＯＬＡＺＡＬ(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(ＡＳＡＣＯＬ(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ＰＥＮＴＡＳＡ(登録商標)、Shire US；ＣＡＮＡＳＡ(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ＲＯＷＡＳＡ(登録商標)、Solvay)などの５−ＡＳＡ薬剤が挙げられる。
本明細書に記載される方法に従って、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴うか、または伴わない、抗ＴＩＧＩＴと組み合わせて投与されるサリチル酸として、免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率の低減を目的とした、サリチル酸および非吸収性ステロイドの任意の重複または逐次投与を挙げることができる。したがって、例えば、本明細書に記載される免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率を低減するための方法は、サリチル酸および非吸収性を同時にまたは逐次投与すること(例えば、サリチル酸は、非吸収性ステロイドの６時間後に投与される)、またはその任意の組合せを包含する。さらに、サリチル酸および非吸収性ステロイドを、同一経路によって(例えば、両方を経口投与する)、または異なる経路によって(例えば、サリチル酸を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸に投与する)投与でき、これは、抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を投与するために使用される経路(単数または複数)とは異なり得る。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体および組合せ抗体療法を、治療されている適応症(例えば、癌)に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤(単数または複数)と逐次使用してもよい。
例えば、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体および組合せ抗体療法は、放射線照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘ ｃｏｍｂｏ)を使用する)、１種または複数のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１種または複数のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス(obatoclax))またはＭＣＬ−１(骨髄系白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質の阻害剤)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管新生阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤(例えば、アバスチン(登録商標))、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド(Lenalildomide)、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて(例えば、同時または別個に)使用できる。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体および組合せ抗体療法は、１種または複数の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
アルキル化剤(制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(商標))ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカププリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
当技術分野で公知のその他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体、制限するものではないが、タキサン、パクリタキセル(パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬＴＭとして市販されている)、ドセタキセル、ディスコデルモリド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシド(Peloruside)Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモリド(discoderomolide)、パツピロン(patupilone)(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモリド(discoderomolide))、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(タシドチン塩酸塩(tasidotin hydrochloride))、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩(Eribulin mesylate)(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ(ispinesib))、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７β−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモリドおよびクリプトチロン(cryptothilone)１と組み合わせるための適した抗増殖性薬剤。
本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療とともに、またはそれに先立って異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ＺＯＬＡＤＥＸＴＭなどのホルモンおよびステロイド(合成類似体を含む)も、患者に投与できる。本明細書に記載される方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
化学療法薬の安全および有効な投与のための方法は、当業者に公知である。さらに、その投与は標準的な文献に記載される。例えば、多数の化学療法薬の投与は、その開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Physicians' Desk Reference (PDR)、例えば、1996年版(Medical Economics Company、Montvale、N.J. 07645-1742、USA)に記載されている。
化学療法薬(単数または複数)および／または放射線療法を、当技術分野で周知の治療用プロトコールに従って投与できる。化学療法薬(単数または複数)および／または放射線療法の投与は、治療されている疾患およびその疾患に対する化学療法薬(単数または複数)および／または放射線療法の公知の効果に応じて変わり得るということは、当業者には明らかであろう。また、熟練した臨床医の知識に従って、患者に対する投与された治療薬の観察された効果を考慮して、また投与された治療薬に対する疾患の観察された応答を考慮して、治療プロトコール(例えば、投与の投与量および時間)を変えることができる。
患者選択
本発明の種々の実施形態では、患者は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いて治療される前に、抗ＴＩＧＩＴ療法に対して応答する可能性が高いか否かを調べるために試験され、治療的応答と関連する形質を示すもののみが治療される。ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ、ＰＶＲ、ネクチン−２、可溶性ＰＶＲ(ｓＰＶＲ)および可溶性ネクチン−２(ｓネクチン−２)またはそれらの組合せを含めた、ＴＩＧＩＴ経路と関連するタンパク質の発現を測定してもよい。ＰＶＲおよびネクチン−２ ｍＲＮＡは両方とも、ヒト腫瘍の大部分において高度に発現される。実施例９および図６Ａを参照のこと。一実施形態では、例えば、ＥＬＩＳＡによって、ヒト血清においてｓＰＶＲおよび／またはｓネクチン−２が検出され、これでは、ｓＰＶＲおよび／またはｓネクチン−２レベルの上昇が、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療に応答する可能性が高い癌を有する対象を示す。
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ療法に対して応答する可能性が最も高い患者を選択するために、患者から得たサンプルが、Ｔ細胞でのＤＮＡＭ−１の発現についてスクリーニングされ、これでは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でのＤＮＡＭ−１の存在が、患者が、抗ＴＩＧＩＴ療法、例えば、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体または断片を用いる治療の際に有益な抗腫瘍応答を有するであろうと示唆し、Ｔ細胞またはＮＫ細胞にＤＮＡＭ−１が存在しないことは、抗ＴＩＧＩＴ療法から恩恵を受ける可能性が低い患者を示す。その他の実施形態では、患者から得たサンプルは、抗ＴＩＧＩＴ療法に対して応答する可能性が最も高い患者を選択するために、腫瘍細胞または腫瘍浸潤骨髄系細胞でのＰＶＲおよび／またはネクチン−２／ＣＤ１１２の発現についてスクリーニングされ、これでは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤骨髄系細胞でのＰＶＲおよび／またはネクチン−２／ＣＤ１１２の存在は、患者が、抗ＴＩＧＩＴ療法、例えば、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体または断片を用いる治療の際に有益な抗腫瘍応答を有するであろうと示唆し、腫瘍細胞または腫瘍浸潤骨髄系細胞にＰＶＲおよび／またはネクチン−２／ＣＤ１１２が存在しないことは、抗ＴＩＧＩＴ療法から恩恵を受ける可能性が低い患者を同定する。
一実施形態では、可溶性ＰＶＲおよび／またはネクチン−２のレベルは、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療について考慮されている患者において測定され、可溶性ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の上昇を示す患者のみが、抗体を用いて治療される。例えば、高可溶性ＰＶＲおよび／またはネクチン−２を、患者選択バイオマーカーとして使用してもよい。
腫瘍の種類および個々の対象における腫瘍は、腫瘍細胞が、上昇したレベルのＰＶＲおよび／またはネクチン−２を発現する場合に、またこのような腫瘍が高レベルの浸潤ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を有する場合に、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療に対して応答する可能性が最も高い。
以下の実施例によって本開示をさらに例示するが、これは、さらなる制限と解釈されてはならない。本願を通じて引用された、すべての図およびすべての参考文献の内容、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６、ＷＯ０９／０５４８６３およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８および米国特許公開第２０１１／０１５０８９２号の開示内容は、参照により明確に組み込まれる。
実施例１
抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の作製
以下の通りに、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗ｈｕＴＩＧＩＴモノクローナル抗体を作製した。
抗原
ｈｕＴＩＧＩＴ可溶性組換えタンパク質を、免疫処置のための抗原として使用した。可溶性融合タンパク質は、４０.７ｋＤのＭＷを有し、そのＣ末端でマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃと連結しているｈｕＴＩＧＩＴの細胞外部分からなる。この融合タンパク質は、本明細書において、「ｈｕＴＩＧＩＴ−ｍｕＦｃ融合タンパク質」と呼ばれる。融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ法によって作製し、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞において発現させた、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、可溶性融合タンパク質を培養上清中に分泌した。トランスフェクションに使用されるＣＨＯ宿主細胞は、Invitrogen(カタログ番号１１６１９−０１２)から入手した。分泌された可溶性融合タンパク質を、免疫原として使用するために精製した。シグナル配列を含む全長ヒトＴＩＧＩＴの配列は、配列番号１に提供されている。
トランスジェニックマウス
ヒトＴＩＧＩＴに対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ＣＨＤ＊＊；ＣＫＤ２＊＊；ＣＭＤ＋＋；ＪＫＤ＋＋；ＫＣｏ５(９２７２)＋＾；ＳＣ２０＋遺伝型からマウスを使用して調製した(以下、ＫＭ(登録商標)マウスと呼ばれる)。個々の導入遺伝子指定は、括弧内にあり。それに無作為に組み込まれた導入遺伝子の系統番号が続く。記号＋＋および＋は、同形接合性またはヘミ接合性を示すが、マウスは、無作為に組み込まれたヒトＩｇ導入遺伝子について異型接合性および同型接合性間を区別することを可能にしないＰＣＲベースのアッセイを使用して日常的にスクリーニングされるので、＋指定は、これらの要素について実際に同形接合性であるマウスに与えられ得る。この株では、Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820に記載されるように、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、同型接合的に破壊されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、ＷＯ２００１／０９１８７の実施例１に記載されるように同型接合的に破壊されている。さらに、このマウス株は、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載されるようなヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５、ＷＯ２０００／０２６３７３に記載されるようなヒトκ軽鎖遺伝子座のほとんどを保持する酵母人工染色体(ＹＡＣ)を保持する。
マウスの免疫処置
ヒトＴＩＧＩＴに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ＫＭマウスを、精製されたｈｕＴＩＧＩＴ−ｍｕＦｃ融合タンパク質を用いて免疫処置した。一般的な免疫処置スキームは、Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859;Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４に記載されている。マウスは、抗原の第１の注入の際に、およそ４ヶ月齢であった。精製された組換えｈｕＴＩＧＩＴ−ｍｕＦｃ抗原調製物(融合タンパク質を発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞から精製された１０μｇ)またはヒトＴＩＧＩＴを用いてトランスフェクトされた３００−１９細胞のいずれかを使用して、マウスを腹膜内および皮下に免疫処置した。免疫原は、ＲＩＢＩアジュバント(Sigmaカタログ番号Ｍ６５３６)と１：１混合した。
マウスを５〜７日の間隔で５回免疫処置した。組換えタンパク質を用いて第１および第２の免疫処置を実施した。第３の免疫処置は、細胞を用い、第４の免疫処置は、タンパク質を用い、第５の免疫処置は、細胞を用いた。最後の免疫処置の１週間後にマウスを出血させて、抗原特異的力価を評価した。免疫応答を、後眼窩出血によってモニタリングした。トランスフェクトされた３００−１９細胞を使用するＦＡＣＳ分析によって血漿をスクリーニングし、抗ヒトＴＩＧＩＴヒトＩｇＧについて最高の力価を有するマウスを融合に使用した。マウスは、屠殺と脾臓採取前の２日前に可溶性抗原、および３日前にトランスフェクトされた細胞を静脈内(IV)および腹膜内(ＩＰ)注射することによって、最後のブーストを受けた。
ヒトＴＩＧＩＴに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
高力価ＫＭマウスから単離されたマウス脾細胞およびマウス骨髄腫融合パートナーを、Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を使用して電場ベースの電気融合を用いて融合した。免疫処置したマウスから得た脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、同数のＰ３Ｘ６３ Ａｇ８.６.５３(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０)非分泌性マウス骨髄腫細胞(融合数：２５４１)と融合した。得られた細胞を、β−メルカプトエタノール(１０００Ｘ、Gibco番号２１９８５−０２３)、７ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Cellgro 25-060-Cl)、追加の２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Cellgro 25-005-Cl)、ＨＡＴ(５０Ｘ、Sigma番号Ｈ−０２６２)、５％ハイブリドーマクローニング因子(BioVeris番号２１０００１)、１０％ Ｐ３８８ＤＩ(ATCC番号ＣＲＬ ＴＩＢ−６３)コンディショニング培地およびペニシリン−ストレプトマイシン(１００ｘ、Ｃｅｌｌｇｒｏ番号３０−００２−ＣＩ)を補給した、高グルコース(Cellgro番号１０−０１３−ＣＭ)および１０％ウシ胎児血清(Hyclone番号ＳＨ３００７１.０３)を含有する選択ＤＭＥＭ培地において、平底マイクロタイタープレート中に２.０×１０４個細胞／ウェルでプレーティングした。約７日後、ＨＡＴを含有する培地の一部を、ＨＴ(Cellgro番号２５−０４７−ＣＩ)を含有する培地と交換した。
１０〜１２日後、同種ＨＴＲＦアッセイを使用して、個々のウェルを、ヒトＩｇＧ／ヒトκ軽鎖抗体の存在についてスクリーニングした。このアッセイにおいて、９６ウェル融合プレートからの上清を、ユウロピウム−クリプテート標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃ断片特異的)、ビオチン化ヤギ抗ヒトκ軽鎖(Bethyl番号Ａ８０−１１５Ｂ)、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔと混合し、１時間インキュベートした。次いで、プレートをＲＵＢＹｓｔａｒリーダーで読み取った。
ヒトＩｇＧ／ヒトκ軽鎖またはヒトＩｇＧ／ヒトλ軽鎖抗体について陽性のウェルから得たハイブリドーマ細胞を、次いで、ヒトＴＩＧＩＴを用いてトランスフェクトされた３００−１９細胞および対照としての３００−１９非トランスフェクト細胞を使用してＦＡＣＳによってスクリーニングした。ＦＡＣＳ陽性の親株を２４ウェルプレートに移した。２、３日後、個々のウェルから得た細胞上清を、ＦＡＣＳによって再スクリーニングして、ヒトＴＩＧＩＴに対するＩｇＧ特異性を確認した。
ハイブリドーマを段階希釈によってクローニングし、ＦＡＣＳによって再スクリーニングした。３６抗体を拡大および精製のために選択した。４種の抗体(１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１、１０Ｄ７)を、配列決定およびさらなる分析のために続いて選択した。
実施例２
抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の可溶性ヒトＴＩＧＩＴとの結合
抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の可溶性ヒトＴＩＧＩＴとの結合をＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析によって調べた。抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体をヒトκでコーティングされたチップ(約５ＫＲＵ；Southernbiotechカタログ番号２０６０−０１)上に捕獲し、組換えヒトＴＩＧＩＴ(ｒｈＴＩＧＩＴ／Ｆｃ)を、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２ｎＭおよび３１ｎＭの濃度でチップ全体に流した。ｍＡｂ／容量の捕獲濃度は、２〜４０μｇ／ｍＬ(１０μＬ／分で５μＬ)であった。抗原会合時間は１５μＬ／分で５分とし、抗原解離時間は、６分とし、５０ｍＭ ＨＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨ(１００μＬ／分で各１２μＬ)を用いて再生を実施した。結果は、表３に示されている。
抗体１４Ｂ２、１９Ｈ２および２６Ｄ８の結合は、弱すぎて確実に測定されなかった。
表３に示される先行する結合定数決定を使用して、さらなる研究のために抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体を選択するのを補助した。次いで、サブクローニングされ、精製された抗体１５Ａ６および２２Ｇ２の結合定数を、全滴定曲線を使用して、それぞれ、１.５ｎＭおよび９０ｐＭであると決定した。
修飾されたフレームワーク残基および変更されたヒトＩｇＧ１定常領域を有する１５Ａ６および２２Ｇ２抗体を比較する、さらなるＳＰＲ実験を実施した。ヒトＩｇＧ１ｆ配列は、配列番号４５で提供され、配列番号４６で提供されアロタイプ変異体(配列番号４５と、Ｒ９７Ｋ、Ｅ２３９ＤおよびＭ２４１Ｌで異なる)を有する。ヒトＩｇＧ１.３は、配列番号４７で提供されている(配列番号４５と、Ｌ１１７Ａ、Ｌ１１８ＥおよびＧ１２０Ａで異なり、ＥＵ番号付け下のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａに対応する)。別のエフェクターレスヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ１.１ｆは、配列番号４８で提供される(配列番号４５と、Ｌ１１７Ａ、Ｌ１１８Ｅ、Ｇ１２０Ａ、Ａ２１３ＳおよびＰ２１４Ｓで異なり、ＥＵ番号付け下のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓに対応する)。図７は、ＩｇＧ１.１ｆコンストラクトにおけるＦｃγ受容体結合の劇的な低減を示す。ＴＩＧＩＴは、ＣＤ８＋ＴＩＬで高度に発現され、エフェクター機能を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体が、腫瘍を根絶させるのに必要とされる極めて抗腫瘍性のＣＤ８＋ＴＩＬおよび／またはＮＫ細胞を枯渇させ得るので、このような「不活性の」Ｆｃ領域の使用は、賢明であり得る。
フレームワーク変異体Ａ７２Ｓおよび／またはＮ１１２Ｔを有する１５Ａ６およびフレームワーク変異体Ｈ３Ｑを有する２２Ｇ２抗体を、その修飾されていない形態と比較するＳＰＲ実験によって、フレームワーク変更もアイソタイプも、ヒトＴＩＧＩＴとの結合に意味のある影響を及ぼさないということが実証された。結果は、表４に提供されている。
さらなるＳＰＲ実験によって、ｍＡｂ ２２Ｇ２は、ヒトＴＩＧＩＴと０.０６ ｎＭのＫＤで、カニクイザルＴＩＧＩＴと、０.０９ｎＭのＫＤで結合することがわかった。
配列表中のアミノ酸残基番号付けは、ＥＵ番号付けの使用および配列表中のＩｇＧ配列中に可変ドメインがないことのために、文献における番号付けよりも１１７小さい。ヒト抗体の遺伝子コンストラクト中に存在するＣ末端リシン(Ｋ)残基は、本発明の治療用抗体などの商業的に生産された抗体からは失われていることが多い。Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。したがって、このリシンは、配列番号４５〜４８のいずれにも含まれていないが、一実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、このさらなるリシン残基を重鎖(単数または複数)のＣ末端に含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えば、意図されないＣ末端クリッピングの結果として、Ｃ末端リシンを有する重鎖およびＣ末端リシンを欠く重鎖の混合物を含む調製物中にある。いくつかの実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体は、２種の重鎖および２種の軽鎖など、１種または複数の重鎖および１種または複数の軽鎖を含む。
実施例３
抗ＴＩＧＩＴ抗体は、複数の群へビニングする
どの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体が、ｈｕＴＩＧＩＴとの結合について、どのその他のものと競合し、したがって、同様のエピトープと結合するかを調べるために、抗体ビニング実験を実施した。抗体１４Ｂ２、１３Ｅ６、６Ｆ９、１１Ｇ１１、１０Ｃ９、１６Ｆ６、１１Ｃ９、２７Ａ９、１０Ｄ７、２０Ｇ６、２４Ｅ８、２４Ｇ１、２７Ｆ１、１５Ａ６、４Ｅ４、１３Ｄ１、９Ｂ１１、１０Ｂ８、２２Ｇ２、１９Ｈ２、８Ｃ８、１７Ｇ４、２５Ｅ７、２６Ｄ８および１６Ａ８を調べた。
抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体間の対競合は、以下のように決定し、これでは、第１の抗体は、センサーチップの表面と結合しており、第２の抗体は、混合物中でＴＩＧＩＴポリペプチドコンストラクトとともにプレインキュベートされており、プレインキュベートされた混合物をセンサーチップ上に流して、第２の抗体が、ＴＩＧＩＴポリペプチドコンストラクトのチップ表面上の第１の抗体との結合を干渉する程度を調べる。手短には、第１の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体を、センサーチップＣＭ５チップ(Series S, GE Healthcareカタログ番号ＢＲ−１００５−３０)表面上に固定化し、フローセル２、フローセル３＆フローセル４(５０００ＲＵ)およびフローセル１を陰性対照として使用した。第２の抗体を出発濃度で１２０μｇ／ｍＬ(２Ｘ)に希釈した。第２の抗体の一連の希釈は、滴定曲線を得るために、７種の異なる濃度および(０.０μｇ／ｍＬ)の対照サンプルを求めてバッファーを用いて抗体の濃度を１：３希釈することによって行った。各抗体濃度シリーズを、２つの半量に分けた。濃度シリーズの第１の半量では、４０ｎＭ(２Ｘ)ＴＩＧＩＴ抗原(ｒｈＴＩＧＩＴ／Ｆｃ)を加えて、最終濃度シリーズ(６０μｇ／ｍＬ〜０.０μｇ／ｍＬ)および各ウェルにおいて２０ｎＭの最終抗原濃度をとした。濃度のシリーズの第２の半量では、抗原の代わりに、同一濃度に希釈された抗体を有するようバッファーを加え、この半量をブランクとして処理した。第２の抗ＴＩＧＩＴ抗体およびｒｈＴＩＧＩＴ／Ｆｃの複合体を２時間インキュベートした。４０μＬの複合体を、抗体(第１)によってコーティングされた表面に３０μＬ／分の流速で注入した。ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)Ｔ２００表面プラズモン共鳴機器を使用し、ランニングバッファーは、ＨＢＥ−ＥＰ、GE Healthcareカタログ番号ＢＲ−１００１−８８、濾過され脱気された０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１５ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.００５％ 界面活性剤Ｐ２０とした。２５ｍＭ ＮａＯＨ(注文コード：ＢＲ−１００３−５８、GE Healthcare)を、１００μＬ／分で５秒間用いて表面を再生した。マイクロソフトエクセルを使用してデータを分析し、これでは、第２の抗体の濃度シリーズを、対応する応答単位に対してプロットして、滴定曲線を得た。
結果は、試験された抗体は、４つの群にビニングすることを示す。図１を参照のこと。ビン１中の抗体(１４Ｂ２、１３Ｅ６、６Ｆ９、１１Ｇ１１、１０Ｃ９、１６Ｆ６、１１Ｃ９、２７Ａ９、１０Ｄ７、２０Ｇ６、２４Ｅ８、２４Ｇ１、２７Ｆ１、１５Ａ６、４Ｅ４、１３Ｄ１、９Ｂ１１、１０Ｂ８)は、ビン１内のその他の抗体、ならびに２２Ｇ２、１９Ｈ２、８Ｃ８および１７Ｇ４の結合を遮断する。ビン２中の抗体(２５Ｅ７、２６Ｄ８、１６Ａ８)は、ビン２中のその他の抗体ならびに２２Ｇ２、１９Ｈ２および８Ｃ８結合を遮断する。抗体２２Ｇ２、１９Ｈ２および８Ｃ８(ビン３)は、ビン３中のその他の抗体ならびにビン１およびビン２両方の中の抗体の結合を遮断するが、１７Ｇ４(ビン４)を遮断しない。抗体１７Ｇ４は、ビン１内の抗体の結合を遮断するが、その他の抗体はいずれも遮断しない。
実施例４
酵母ディスプレイによるエピトープマッピング
本発明の選択された抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体(クローン２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１５Ａ６)のエピトープを、無作為に突然変異されたｈｕＴＩＧＩＴ細胞外領域変異体を酵母上にディスプレイし、これらの酵母を、それらが特定の抗体と結合できないことに基づいて選別することによって決定した。結合できなかった選択された酵母細胞を増幅し、それらが本発明の特定の抗体と結合できないことに基づく、さらなる選択ラウンドに付した。例えば、Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:539を参照のこと。得られた酵母についてｈｕＴＩＧＩＴ変異体の配列を決定し、抗体結合に対する各残基の効果について分析した。単一アミノ酸突然変異が本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体との結合を破壊するｈｕＴＩＧＩＴ配列内の遺伝子座として、本発明の抗体の結合エピトープを決定した。
手短には、エラープローンＰＣＲを使用して、ヒトＴＩＧＩＴをコードするＤＮＡを、ｈｕＴＩＧＩＴ変異体の、ｃ−ｍｙｃタグ配列および酵母細胞壁タンパク質Ａｇα１ｐをさらに含む融合タンパク質のアミノ末端部分としての発現を可能にするコンストラクト中にクローニングした。このようなコンストラクトは、酵母(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))中で発現されると、酵母細胞の表面に、Ａｇａ１ｐポリペプチドによって細胞表面に固定された変異体ｈｕＴＩＧＩＴポリペプチドをディスプレイする。ｃ−ｍｙｃタグは、所与の酵母細胞でのｈｕＴＩＧＩＴ−融合タンパク質のディスプレイの陽性対照として適宜使用できる。酵母細胞をＦＡＣＳによって選別し、適切にフォールディングされたｈｕＴＩＧＩＴ−融合タンパク質として発現される(アロフィコシアニン(ＡＰＣ)標識されたヤギ抗マウスＩｇＧによって二次的に検出される、対照マウス抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の結合によって決定されるように)が、本発明の抗体と結合しない(フィコエリトリン(ＰＥ)標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧを用いる二次的な検出によって決定されるように)ものをプールし、増幅し、その後の選択ラウンドにおいて使用した。数回の選択ラウンド後に残存する酵母から得たコンストラクトについてｈｕＴＩＧＩＴ配列を決定した。抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体選択を行わない対照実験によって、ｈｕＴＩＧＩＴ配列に沿った各位置で良好な突然変異体カバー度を確認し、選択されたライブラリーを用いて得られた結果を正規化するためのベースラインを提供した。
ｈｕＴＩＧＩＴ突然変異体分子の各抗体によって選択された集団について、何百万もの高品質配列リードを実施した。残基６０は、突然変異に対して構造的に寛容であるが、この位置での突然変異は、抗体２２Ｇ２と結合しないことがわかり、これは、Ｅ６０がエピトープに関与していることを示した。同様に、残基Ｉ１０９、Ｌ６５、Ｎ７０、Ｆ１０７、Ｔ１１７、Ｉ６８、Ｈ７６およびＮ５８もまた、抗体２２Ｇ２のエピトープにおいて重要な残基であるとわかった。２２Ｇ２のエピトープ残基は、残基５８〜７６(ＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ；配列番号３８)および残基１０７〜１１７(ＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴ；配列番号３９)を含む一次配列領域中に集まっている。図２Ａを参照のこと。このエピトープは、Ｘ線結晶構造によって調べられるようにＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ結合界面と重複する。Stengel et al. (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 109:5399。
抗体１１Ｇ１１を用いる類似実験によって、残基Ｇ７４、Ｎ７０、Ｈ７６、Ｌ６５、Ｌ７３、Ｑ５６、Ｉ６８、Ｈ１１１およびＰ１１４で重要な接触点が示された。１１Ｇ１１のエピトープ残基は、残基５６〜７６(ＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ；配列番号４０)および残基１１１〜１１４(ＨＴＹＰ；配列番号４１)を含む一次配列領域中に集まっており、残基１２０〜１３９(ＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱ；配列番号４２)においてその他の可能性ある接触を有する。図２Ｂを参照のこと。
抗体１５Ａ６を用いる類似実験によって、残基Ｈ７６、Ｇ７４、Ｌ６５、Ｎ５８、Ｉ６８、Ｑ１３９、Ｇ１３５、Ｌ７３、Ｆ１０７、Ｎ７０、Ｅ６０、Ｈ１３４、Ａ１３２およびＩ１０９で重要な接触点が示された。１５Ａ６のエピトープ残基は、残基５８〜７６(ＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ；配列番号３８)および残基１０７〜１０９(ＦＣＩ)を含む一次配列領域中に集まっており、残基１３２〜１３９(ＡＥＨＧＡＲＦＱ；配列番号４３)においてその他の可能性ある接触を有する。図２Ｃを参照のこと。
３種すべてのエピトープが、残基Ｌ６５、Ｉ６８、Ｎ７０およびＨ７６を含み、これは、これらの残基およびこの領域、すなわち、残基６５〜７６(ＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨ；配列番号４４)または１５Ａ６および２２Ｇ２のみを考慮すれば５８〜７６は、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体の結合の重要な領域(「コアエピトープ」)に相当するということを示唆する。
ｈｕＴＩＧＩＴのヒトＰＶＲ／ＣＤ１５５との結合に関する類似実験によって、残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｉ６８、Ｎ７０、Ｌ７３、Ｇ７４、Ｗ７５、Ｈ７６、Ｈ１１１、Ｔ１１２、Ｙ１１３、Ｐ１１４、Ｄ１１５およびＧ１１６で重要な接触点が示され、これらの接触は、抗体２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１５Ａ６によって結合されるエピトープ領域中に大部分は収まっている。
実施例５
抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いて処理されたＮＫ細胞によるＰＶＲ＋細胞の溶解の増強
インビトロでのＰＶＲ＋細胞のＮＫ細胞媒介性溶解に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体２２Ｇ２の効果を評価した。野生型およびヒトＰＶＲを発現するよう遺伝子操作されたＰ８１５細胞(マウスマスト細胞腫細胞株)の両方を、抗ｈｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ２２Ｇ２−ＩｇＧ１、２２Ｇ２−ＩｇＧ１.１またはアイソタイプ対照の存在下でヒトＮＫ細胞に曝露した。
手短には、ヒトＮＫ細胞、エフェクターを、全血から単離し、ＩＬ−２とともに一晩インキュベートした。ＮＫ細胞を、Ｐ８１５／ＰＶＲまたはＰ８１５［ｗｔ］いずれかの標的細胞とともに、１０：１または２０：１のＥ：Ｔ細胞比でプレーティングした。５μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに抗体を添加した。プレートを２〜４時間インキュベートし、細胞上清を、乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)の放出、死滅細胞または瀕死細胞の生成について評価した。
結果は図３に示されている。特異的溶解パーセント(％)を、［(試験シグナル−平均自然溶解)／(平均最大溶解−平均自然溶解)］×１００として算出した。抗ＴＩＧＩＴ抗体２２Ｇ２を使用するＴＩＧＩＴ遮断は、ＮＫ細胞での阻害シグナル伝達を低減し、これは、ＤＮＡＭ−１特異的に、ＰＶＲを発現する標的細胞の溶解の増大をもたらす。
実施例６
抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
単独のおよび抗ヒトＰＤ−１抗体と組み合わせた、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の、抗原ペプチドを用いて刺激されたヒトＴ細胞に対する効果を調べるために実験を実施した。予備的問題として、ＰＤ−１＋／ＴＩＧＩＴ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞が、抗原ペプチドのカクテル(ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザおよびテタヌスから)に曝露された健常なヒトドナーから得た血液中に、曝露されていない血液よりも広がっていることが観察された。図４Ａを参照のこと。ＣＥＦＴを用いて処理した血液において、ＩＦＮγ産生が測定された。図４Ｂを参照のこと。抗ＴＩＧＩＴｍＡｂ ２２Ｇ２は、単剤治療としては無効であるが、抗原ペプチドのカクテルに対して曝露されたヒトＴ細胞からのＩＦＮγ産生を刺激する抗ＰＤ−１の能力を増強した。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体１０Ｄ７の、ヒト腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の効果が、抗ｈｕＰＤ−１抗体の同時投与を伴うか、または伴わない、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドに対して曝露された黒色腫患者からの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)において決定されたChauvin et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:2046も参照のこと。
実施例７
マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍活性
抗マウスＴＩＧＩＴ抗体を、単独で、および抗マウスＰＤ−１抗体と組み合わせて、同一遺伝子ＣＴ２６結腸腺癌モデルにおいて抗腫瘍活性について試験した。これらの実験において使用される抗ｍｕＴＩＧＩＴ抗体は、本発明の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体のマウスサロゲートである。
手短には、抗ｍｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂ(クローン４Ｂ１)を、マウスＩｇＧ２ａまたはマウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ(エフェクター機能が低減した)Ｆｃ領域のいずれかを用いて、ならびに抗ｍｕＰＤ−１(クローン４Ｈ２)を、マウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ Ｆｃ領域を用いて調製した。これらの抗体およびその組み合わせを、マウスＩｇＧｌアイソタイプ対照と一緒にマウスに投与し、同一遺伝子ＣＴ２６結腸腺癌モデルにおいて抗腫瘍活性について調べた。研究のために使用されるＩｇＧ１対照抗体は、マウスＩｇＧｌアイソタイプを用いた組換えヒト抗ジフテリア毒素抗体である。
０日目に、群あたり１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス(合計で９０匹のマウス)に、１×１０６個のＣＴ２６腫瘍細胞を用いて皮下注射した。治療は、移植後７日目に開始した。腫瘍を測定し、同等の平均腫瘍量(４５〜５０ｍｍ３)を有するよう治療群に無作為化し、次いで、指定の抗体(２００μｇ／用量)を用いて腹膜内に(ＩＰ)治療し、１０および１４日目に再度治療した。各実験は、２００μｇ／用量の対照ＩｇＧ１抗体も同様に含んでおり、したがって、対照ＩｇＧ１実験自体は、４００μｇ／用量を含んでいた。腫瘍量は週に２回測定した。
結果は、図５Ａに示されており、これは、時間の関数として各実験の平均腫瘍量を示す。抗ＴＩＧＩＴ抗体(Ｇ１ Ｄ２６５Ａ)のエフェクター機能低減版は、腫瘍成長に影響を及ぼさず、いずれのマウスの腫瘍も取り除かなかったが、ＩｇＧ２ａは腫瘍成長を低減し、その結果、１５匹のうち３匹の３５日目に腫瘍がないマウスとなった。ＩｇＧ２ａ抗ＴＩＧＩＴ抗体の、抗ＰＤ−１抗体との組合せは、腫瘍成長の低減で高度に有効であり、１５匹のうち１０匹の腫瘍のないマウスにつながったが、抗ＴＩＧＩＴＧ１ Ｄ２６５Ａの、抗ＰＤ−１との組合せは、腫瘍成長の低減で幾分かあまり有効ではなく、その結果、１５匹のうち７匹の腫瘍のないマウスとなった。それにもかからず、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａ抗ＴＩＧＩＴ抗体は両方とも、抗ＰＤ−１抗体の活性を増大し、これは、単独で、１５匹のうち２匹のみの腫瘍のないマウスをもたらした。
同様の実験を実施して、単剤治療としての抗ＴＩＧＩＴを、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ−１および抗ＴＩＧＩＴ／抗ＣＴＬＡ−４併用療法と比較した。抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＤ−１抗体の両方とも、Ｆｃ不活性マウスＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａアイソタイプとして、抗ＣＴＬＡ−４はマウスＩｇＧ２ｂとしてフォーマットした。０日目に、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１×１０６個の腫瘍細胞を用いて移植し、１０、１４および１７日目に抗体を１０ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。結果は、図５Ｂに提供されている。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４を用いる治療への抗ＴＩＧＩＴの添加は、併用療法曲線から明らかであるように腫瘍成長阻害(ＴＧＩ)を大幅に増強し、それぞれ、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４を用いる単剤治療の７％、１８％および１３％ ＴＧＩと比較して、抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ−１の５６％ＴＧＩおよび抗ＴＩＧＩＴ／抗ＣＴＬＡ−４の４９％ＴＧＩであった。併用療法はまた、実験の最後での腫瘍のないマウスの数を、抗ＰＤ−１との組合せの１／１０から５／１０に、および抗ＣＴＬＡ−４との組合せの３／１０から６／１０に増大した。
実施例８
抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体１５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１０Ｄ７のその他の特性
種々のその他のインビトロアッセイを実施して、本発明の選択された抗体の特性を調べた。抗ｈｕＴＩＧＩＴ ｍＡｂ １５Ａ６、２２Ｇ２、１１Ｇ１１および１０Ｄ７は、ｈｕＴＩＧＩＴを発現するジャーカット細胞と結合するとわかった。ジャーカット／ｈＴＩＧＩＴ細胞の生物検定法は、抗体１５Ａ６、１１Ｇ１１および１０Ｄ７はすべて、ＰＶＲシグナル伝達を、およそ同等の有効性で遮断し、抗体２２Ｇ２は、約２倍良好である(ＩＣ５０＝０.２１ｎＭ)と実証した。抗体１５Ａ６および２２Ｇ２は、ＣＨＯ細胞上に発現された場合には、カニクイザル由来のＴＩＧＩＴとヒトＴＩＧＩＴと実質的に同一の親和性で結合すると示されるが、１１Ｇ１１および１０Ｄ７はそうではなかった。例えば、抗体２２Ｇ２ ＩｇＧ１.１ｆは、ヒトおよびサルＴＩＧＩＴと、それぞれ、０.０９ｎＭおよび０.０７ｎＭのＫＤで結合し、またＣＤ８＋Ｔ細胞との結合についてそれぞれ、０.５５ｎＭおよび０.２８〜０.５８ｎＭのＥＣ５０を有していたが、ラットまたはマウスＴＩＧＩＴと結合しなかった。しかし、初代細胞を用いるその後の実験は、１５Ａ６は、その関連ではｃｙｎｏ ＴＩＧＩＴとは十分に結合しないことを実証した。抗体２２Ｇ２および１５Ａ６は、ヒトリンパ球を染色したが、２２種のその他のヒト組織は、１０μｇ／ｍｌの濃度まで染色しなかった(大脳、小脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、扁桃腺、胸腺、結腸、小腸、胃、膵臓、皮膚、骨格筋、副腎、甲状腺、末梢神経、前立腺、胎盤、精巣および子宮)。抗体２２Ｇ２は、１０μｇ／ｍｌで２０時間インキュベートした場合に、８人のドナーから得たヒト全血に由来する７５種の異なるサイトカインおよびケモカイン(ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＰ−１０を含む)の発現を増大せず、サイトカイン放出症候群のリスクが低いことを示唆した。
別の実験では、抗ＴＩＧＩＴｍＡｂ ２２Ｇ２ ＩｇＧ１.１ｆは、それぞれ、ヒトＰＶＲおよびヒトネクチン−２を過剰発現するＰ８１５細胞とのＴＩＧＩＴ−ｍＦｃ結合の遮断について、各々がそのＥＣ９０濃度で存在する場合に(それぞれ、１４.１ｎＭおよび１２.８ｎＭ)、１５.４ｎＭおよび５.７２ｎＭのＩＣ５０を示した。
抗体２２Ｇ２ ＩｇＧ１.１ｆは、重鎖上のＮ３１０に単一Ｎ−グリコシル化部位を有し、ＣＨＯにおいて産生されたモノクローナル抗体に常のグリカンプロフィールを有するとわかった。
これらの結果は、抗体２２Ｇ２は、細胞の表面上に存在する場合にＴＩＧＩＴと結合する、ＰＶＲおよびネクチン−２シグナル伝達を阻害する、外来性ヒト組織と結合しないか、または不要なサイトカインもしくはケモカイン放出を誘導する、また、ｃｙｎｏ ＴＩＧＩＴと結合し、これは、規制当局の承認を支持する研究において使用するための毒性学研究を実施するのに役立つという点において、本発明の方法における治療的使用のための理想的な特性を有するということを示唆する。
実施例９
ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ、ＰＶＲおよびネクチン−２の発現に基づく患者選択
本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療を導くために、ＴＩＧＩＴ経路と関連するタンパク質(ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ／ＣＤ１５５、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＤＮＡＭ／ＣＤ２２６)の発現レベルを使用してもよい。ＰＶＲおよびネクチン−２の可溶性形態(ｓＰＶＲおよびｓネクチン−２)は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはその他の従来手段によって血清中で検出してもよい。ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ネクチン−２およびＤＮＡＭは、例えば、免疫組織化学(ＩＨＣ)、フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)または液体クロマトグラフィー質量分析(ＬＣ−ＭＳ)を含めた質量分析法によって、腫瘍細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、調節Ｔ細胞、ＮＫ細胞または腫瘍浸潤骨髄系細胞などの細胞の表面上で検出してもよい。
理論によって制限されるものではないが、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療は、相互作用細胞でのそのリガンド、例えば、ＰＶＲまたはネクチン−２とのＴＩＧＩＴ結合の遮断および／または同細胞でのＴＩＧＩＴのＤＮＡＭとの相互作用の防止に基づく。したがって、このような治療に対して応答する可能性が最も高い腫瘍または腫瘍の種類は、ＴＩＧＩＴ活性が、腫瘍進行にとって重要であり、その結果、このようなＴＩＧＩＴ活性の遮断が、腫瘍根絶を増強するものとなる。具体的には、ＴＩＧＩＴ＋ ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＩＧＩＴ＋ ＴｒｅｇまたはＴＩＧＩＴ＋ ＮＫ細胞などの高レベルのＴＩＧＩＴ＋ ＴＩＬは、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ治療に対して応答する可能性が高い腫瘍を示唆する。これらのＴＩＧＩＴ＋ ＴＩＬでのＤＮＡＭ発現は、腫瘍は抗ＴＩＧＩＴ治療に対して応答し得るということをさらに示唆する。同様に、腫瘍細胞自体で、または腫瘍浸潤骨髄系細胞のいずれかで、高レベルのＴＩＧＩＴ リガンドＰＶＲおよび／またはネクチン−２を発現する腫瘍もまた、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療の良好な候補となる。
ＴＩＧＩＴ経路のタンパク質の発現レベルのスクリーニングは、治療適応症選択のレベルで実施しても、個々の患者レベルで実施してもよい(「患者層別化」)。例えば、どの種類の癌が、タンパク質発現パターンを示すかを調べるために、いくつかの異なる癌の各々を有する多数の患者から得た組織サンプルにおいて発現レベルを調べてもよく、これは、特定の種類の癌が、本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴｍＡｂを用いる治療を受け入れられることを示唆する。統計上適切な数のサンプルについてこのような決定がなされると、抗ＴＩＧＩＴ療法に対して応答性であると予測される癌の種類を患っている任意の個々の患者に対して、抗ＴＩＧＩＴ療法を推奨することができる。あるいは、個々の患者について具体的に治療決定を導くのに役立つよう、代わりにその患者から得たサンプルを試験してもよい。
ＴＩＧＩＴ経路タンパク質の発現について試験されるべき関連細胞は、腫瘍および周囲の微小環境中のものであるので、このようなスクリーニングは、例えば、生検または摘出によって腫瘍のサンプルを得る必要がある可能性が高い。
したがって、本発明はまた、浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴｒｅｇまたはＮＫ細胞においてＴＩＧＩＴのレベルを測定することによって、および／または腫瘍細胞または腫瘍浸潤骨髄系細胞においてＰＶＲおよび／またはネクチン−２の発現を測定することによって、本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療の良好な候補である腫瘍の種類または特定の腫瘍を同定するための方法を提供する。
一実施例では、抗ＴＩＧＩＴ療法は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を用いる治療の代わりに、と同時に、またはそれに対して補足的に使用される。高ＰＶＲ／ネクチン−２発現および低ＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍を、単剤治療としての抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いて、またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト以外の別の免疫−腫瘍学薬剤について生物学的理論的根拠がある場合には、このような薬剤と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いて治療してもよい。本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、高ＰＶＲ／ネクチン−２発現およびまた高ＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍において、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体と実質的に同時に投与してもよい。あるいは、難治性患者、再燃患者または任意のその他の不完全なまたは不満足な応答を有するものでは、その腫瘍が、ＰＶＲおよび／またはネクチン−２の発現の上昇を示す場合には、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法の後に投与してもよい。
本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療を受け入れられる可能性が高い腫瘍の種類を同定するための実験では、ＴＣＧＡデータセットを使用して種々のヒト癌についてヒトＰＶＲ ｍＲＮＡの発現を調べた。結果は、図６Ａに示されている。結果は、降順で示されており、最高レベルのＰＶＲ ｍＲＮＡを有する、したがって、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療を受け入れられる可能性が最も高い腫瘍が最上部にある。
ＰＶＲはまた、ＩＨＣによって、結腸上皮対照サンプルにおいてよりも結腸腺癌サンプルにおいてかなり高レベルで検出された。図６Ｂを参照のこと。さらなるＩＨＣ実験は、肝細胞癌サンプルの１００％で(１０／１０)、結腸直腸癌サンプルの９０％で(９／１０)および卵巣癌サンプルの４４％で(４／９)上昇したＰＶＲ発現を示した。これらの結果は、これらの癌、特に、肝細胞および結腸直腸癌を有する患者は、本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いる治療の良好な候補であろうということを示唆する。
本発明はまた、腫瘍内細菌フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)の有無を調べることを含み、その存在が、腫瘍が、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の治療の良好な候補であり得ることを示唆する治療、例えば、結腸直腸癌の治療の方法を提供する。このような治療の方法はまた、適宜、抗生物質、例えば、メトロニダゾール、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、アモキシシリン／スルバクタム、アンピシリン／スルバクタム、エルツペネム(ertupenem)、イミペネム、メロペネム、クリンダマイシンまたはセフォキシチンを、腫瘍内細菌フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)を有する対象に投与することを含む。
抗体配列に関して、配列表は、重鎖および軽鎖の成熟可変領域の配列、すなわち、シグナルペプチドを含まない配列を提供する。
等価物：
当業者ならば、本明細書において開示される具体的な実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または単に慣例的な実験を使用すれば確かめることができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。

Claims (20)

  1. ｉ)配列番号２０の配列を含むＣＤＲＨ１、
    ii)配列番号２１の配列を含むＣＤＲＨ２および
    iii)配列番号２２の配列を含むＣＤＲＨ３
    を含むａ)重鎖可変ドメインと、
    ｉ)配列番号２３の配列を含むＣＤＲＬ１、
    ii)配列番号２４の配列を含むＣＤＲＬ２および
    iii)配列番号２５の配列を含むＣＤＲＬ３
    を含むｂ)軽鎖可変ドメインと
    を含む、ＴＩＧＩＴ(ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するヒトＴ細胞免疫受容体)と結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. １種または複数の重鎖および１種または複数の軽鎖を含み、ここで、
    ａ)重鎖が配列番号７の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、
    ｂ)軽鎖が配列番号９の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  3. １種または複数の重鎖および１種または複数の軽鎖を含み、ここで、
    ａ)重鎖が配列番号７の重鎖可変領域を含み、
    ｂ)軽鎖が配列番号９の軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  4. エフェクター機能が増大したヒトＩｇＧ１抗体またはその変異体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  5. エフェクター機能が低減または排除されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ変異体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  6. ＥＵ番号付けによる以下の突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ(配列番号４８)を含む、請求項５に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  7. 請求項１から６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
  9. （i）請求項８に記載の発現ベクター；または
    （ii）請求項１から６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする核酸を含む第一の発現ベクターおよび
    請求項１から６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする核酸を含む第二の発現ベクター
    で形質転換された宿主細胞。
  10. 抗体またはその抗原結合断片の産生を可能にする条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養することと、細胞から抗体を精製することとを含む、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
  11. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、対象において抗原特異的Ｔ細胞応答を増強するための医薬。
  12. 対象が腫瘍または慢性ウイルス感染を有し、腫瘍またはウイルス感染に対する免疫応答が増強される、請求項１１に記載の医薬。
  13. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、対象の腫瘍において調節Ｔ細胞を低減または枯渇させるための医薬。
  14. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、癌を治療するための医薬。
  15. 抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群から選択される１種または複数のさらなる治療薬と併用することを特徴とする、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の医薬。
  16. さらなる治療薬が抗ＰＤ−１抗体である、請求項１５に記載の医薬。
  17. さらなる治療薬が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１５に記載の医薬。
  18. 第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
    ａ)第１の抗原結合ドメインが、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ｈｕＴＩＧＩＴ抗体に由来し、
    ｂ)第２の抗原結合ドメインが、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群から選択される抗体に由来する、二重特異性抗体。
  19. 第２の結合ドメインが抗ＰＤ−１抗体に由来する、請求項１８に記載の二重特異性抗体。
  20. 第２の結合ドメインが抗ＰＤ−Ｌ１抗体に由来する、請求項１８に記載の二重特異性抗体。
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