MXPA06000508A - Agentes de union especifica al factor del crecimiento de los hepatocitos. - Google Patents
Agentes de union especifica al factor del crecimiento de los hepatocitos.Info
- Publication number
- MXPA06000508A MXPA06000508A MXPA06000508A MXPA06000508A MXPA06000508A MX PA06000508 A MXPA06000508 A MX PA06000508A MX PA06000508 A MXPA06000508 A MX PA06000508A MX PA06000508 A MXPA06000508 A MX PA06000508A MX PA06000508 A MXPA06000508 A MX PA06000508A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- amino acid
- serine
- tyrosine
- antibody
- hgf
- Prior art date
Links
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 140
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 140
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 title claims abstract description 115
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 title claims abstract description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 82
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 639
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 550
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 538
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 202
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 164
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 164
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 157
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 156
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 156
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 141
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 127
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 125
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 123
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 121
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 120
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 120
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Chemical group OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 120
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 119
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 115
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 115
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 110
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 106
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 88
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 73
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 72
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 69
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 63
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 61
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 61
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 61
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 57
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 57
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 55
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 55
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 55
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 53
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 53
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 53
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 claims description 50
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 50
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 49
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 47
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 47
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 claims description 47
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 46
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 45
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 43
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 40
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 39
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 39
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 37
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 37
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 36
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 33
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 32
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 31
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 31
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- -1 glycine; amino acid Chemical group 0.000 claims description 21
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 17
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 16
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 14
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 14
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 12
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 10
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 6
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 6
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 3
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims 4
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims 2
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims 2
- RZJQGNCSTQAWON-UHFFFAOYSA-N rofecoxib Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C1=C(C=2C=CC=CC=2)C(=O)OC1 RZJQGNCSTQAWON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 claims 1
- 101100534229 Caenorhabditis elegans src-2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100015729 Drosophila melanogaster drk gene Proteins 0.000 claims 1
- JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N Geldanamycin Natural products C1C(C)CC(OC)C(O)C(C)C=C(C)C(OC(N)=O)C(OC)CCC=C(C)C(=O)NC2=CC(=O)C(OC)=C1C2=O JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 claims 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 claims 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 claims 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 claims 1
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 claims 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 claims 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 claims 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 claims 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 claims 1
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 claims 1
- 229940111134 coxibs Drugs 0.000 claims 1
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 claims 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 claims 1
- QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N geldanamycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C/C=C\[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C/[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N 0.000 claims 1
- 101150098203 grb2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 claims 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 claims 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims 1
- 229960000371 rofecoxib Drugs 0.000 claims 1
- 229940087652 vioxx Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 23
- 241000894007 species Species 0.000 description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 16
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100230981 Mus musculus Hgf gene Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150046224 ABAT gene Proteins 0.000 description 2
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- HOURAEXAZWBEAW-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropane-1,1,3-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C(C(O)=O)(N)CCC(O)=O HOURAEXAZWBEAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNRLEMMIVRBKJE-UHFFFAOYSA-N 4,4'-Methylenebis(N,N-dimethylaniline) Chemical group C1=CC(N(C)C)=CC=C1CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 JNRLEMMIVRBKJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001156002 Anthonomus pomorum Species 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N Asn-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N Asp-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- QYKBTDOAMKORGL-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Asp Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N QYKBTDOAMKORGL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000027927 Hereditary papillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 241000283953 Lagomorpha Species 0.000 description 1
- 201000011062 Li-Fraumeni syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100004031 Mus musculus Aven gene Proteins 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151472 Neuroendocrine convertase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N Phe-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000255985 Trichoplusia Species 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N Val-Arg-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 238000000367 ab initio method Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-N dihydroxy-selanyl-selanylidene-lambda5-phosphane Chemical compound OP(O)([SeH])=[Se] PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001650 focal adhesion Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005282 malignant pleural mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 230000024799 morphogenesis of a branching structure Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010279 papillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124633 peptidic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical compound NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000455 protein structure prediction Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N temephos Chemical compound C1=CC(OP(=S)(OC)OC)=CC=C1SC1=CC=C(OP(=S)(OC)OC)C=C1 WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006032 tissue transformation Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
Se describen agentes de union especifica que interactuan con el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF). Se describen metodos de tratamiento del cancer mediante la administracion de una cantidad farmaceuticamente efectiva de un agente de union especifica al HGF. Se describen metodos de deteccion de la cantidad de HGF en una muestra usando un agente de union especifica al HGF.
Description
AGENTES DE UNION ESPECIFICA AL FACTOR DEL CRECIMIENTO DE LOS HEPATOCITOS
CAMPO DE LA INVENCION — -— -^La—-presente -intención.—se- relaciona con agentes de unión específica que se unen al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) . También se describen composiciones, métodos de producción de las composiciones, métodos para el tratamiento de varios trastornos, como ciertos tipos de cánceres, incluyendo, pero sin limitarse a, tumores sólidos y malignidades hematólógicas . ANTECEDENTES DE LA INVENCION El Factor de Crecimiento de los Hepatocitos (HGF) ha sido identificado como un mitógeno potente para los hepatocitos. El HGF fue también identificado como una proteína secretora de fibroblastos y músculo liso que induce la motilidad de células epiteliales. La HGF también es conocida en la literatura como Factor de Diseminación (SF, por sus siglas en inglés) . El HGF es un polipéptido heterodimérico multifuncional producido predominantemente por células mesenquimales, la cual actúa como un ligando para la tirosina cinasa receptora de et (Met) . El receptor de Met humano es también conocido como "c-met" . La señalización a través de la
Ref: 169239 vía de la tirosxna cinasa receptora del Met-HGF (Met-HGF) ha mostrado conducir a un arreglo de respuestas celulares, incluyendo, pero sin limitarse a la proliferación (mitosis) , propagación (motilidad) , estimulación del movimiento celular a través de una matriz (invasión) , y morfogénesis ramificante. In vivo, la vía de señalización Met-HGF (Met-HGF) juega un papel en, por ejemplo, la inducción neural, regeneración del hígado, cicatrización de heridas, angiogénesis, crecimiento, invasión, diferenciación morfológica y desarrollo embriónico normal. Además de esas funciones, el par Met-HGF también puede jugar un papel en cánceres humanos. La señalización Met-HGF aberrante ha mostrado estar implicada en la tumorigénesis, particularmente en el desarrollo de fenotipos invasivos y metastáticos . También se ha encontrado que ciertos patógenos, como los de la malaria, exploran a la señalización Met-HGF aberrante. Véase Carrolo et al., Nat Med. 2003 9 (11) -.1363-9 (Oct 12, 2003) , el contenido del cual se incorpora por lo tanto aquí como referencia para cualquier propósito. Además, algunos grupos han reportado que el HGF puede jugar un papel en la angiogénesis y en enfermedades mediadas por la angiogénesis, como la retinopatía diabética proliferativa, o degeneración macular. Véase, por ejemplo, Grant, D.S. et al., Proc . Nat. Acad. Sci . E.U.A. 90(5) 1937-41 (1993); Bussolino et al., J. Cell Biol . , 119 (3) : 629-641 (1992); Montesano et al., Cell, 67:901-908 (1991); Canon et al., Br. J. Ophtalmol. 84(7):732-5 (2000). El HGF también puede jugar un papel en la apoptosis o muerte celular programada. Los tumores pueden surgir cuando el mecanismo
---5... _regul_ado_r_ normal, deje de mantener un equilibrio entre la proliferación y la apoptosis, de modo que esas células se acumulen en números excesivos. El HGF puede efectuar la proliferación y apoptosis, dependiendo del contexto biológico. 10 Debido a que el HGF está implicado en muchos procesos fisiológicos, en ciertos casos, puede ser útil tener moléculas que puedan regular su actividad. Por ejemplo, en ciertos casos, esas moléculas pueden ser útiles para tratar una variedad de diferentes tipos de cáncer. 15 SUMARIO DE LA INVENCION En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende al menos una región determinante de la complementaridad (CDR, por sus siglas en inglés) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a . 20 cuando la CDRla comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g h i j k l m n o p q, cuando el aminoácido a es seleccionado de lisina, arginina o glutamina; el aminoácido b es seleccionado de serina o alananina; el aminoácido c es serina, el aminoácido d es glutamina; el
25 aminoácido e es seleccionado de serina, glicina, o ácido aspártico; el aminoácido f es seleccionado de valina o isoleucina o no está presente; el aminoácido g es seleccionado de leucina o fenilalanina o no está presente; el aminoácido h es seleccionado de fenilalanina o tirosina o no está presente; el aminoácido i es serina o no está presente; él aminoácido j es serina o no está presente; el aminoácido k es seleccionado de asparagina, treonina o no está presente; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, isoleucina o valina; el aminoácido m es seleccionado de lisina, arginina, asparagina o ácido aspártico; el aminoácido n es seleccionado de asparagina o serina; el aminoácido o es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, triptófano o asparagina; el aminoácido p es leucina; y el aminoácido q es seleccionado de alanina, glicina, o asparagina,- donde la CDR2a comprende una secuencia de aminoácido r s t u v w x, donde el aminoácido r es seleccionado de triptófano, alanina, valina, ácido glutámico, o glicina; el aminoácido s es alanina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es seleccionado de treonina, serina o ácido aspártico; el aminoácido v es seleccionado de arginina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de ácido glutámico, glutamina o alanina y el aminoácido x es seleccionao de serina, asparagina o treonina; donde la CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f' g' h', donde el aminoácido y es seleccionado de glutamina o leucina; el aminoácido z es seleccionado de glutamina, asparagina, o arginina; el aminoácido a' es seleccionado de tirosina, histidina, alanina o serina; el aminoácido b' es seleccionado de fenilalanina, tirgsina_,__ Jicido aspartico, asparagina o isoleucina; el aminoácido c' es seleccionado de serina, glicina o asparagina; el aminoácido d' es seleccionado de prolina, tirosina, treonina, fenilalanina, ácido aspártico, leucina, o triptófano; el aminoácido e' es prolina; el aminoácido f es prolina o no está presente; el aminoácido g' es triptófano, leucina, prolina, tirosina, o isoleucina; y el aminoácido h' es treonina o asparagina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena pesada de anticuerpo, es capaz de unirse al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) . En ciertas modalidades, la invención proporciona un péptido aislado que comprende al menos una región determinante de la complementaridad (CDR) seleccionada de CDRlb, CDR2b y CDR3b donde CRDlb comprende la secuencia de aminoácido a b c d e f g, donde el aminoácido a es serina o no está presente; el aminoácido b es seleccionado de ácido aspártico o glicina, o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de ácido aspártico, glicina, serina, valina, treonina o isoleucina; el aminoácido d es tirosina; el aminoácido e es seleccionado de tirosina o glicina,- el aminoácido f es seleccionado de isoleucina, metionina o triptófano; y el aminoácido g es seleccionado de histidina, asparagina o serina; donde la CDR2b comprende la secuencia de aminoácidos h i j k l m n o p q r s t u v w x, donde el aminoácido h es seleccionado de triptófano, tirosina, valina, asparagina, o ácido glutámico; el aminoácido i es seleccionado de isoleucina, fenilalanina, o valina; el aminoácido j es seleccionado de asparagina, serina, triptófano o tirosina; el aminoácido k es seleccionado de prolina, serina, tirosina, o histidina; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, serina ' o ácido aspártico; el aminoácido m es seleccionado de serina o glicina; el aminoácido n es seleccionao de glicina o serina, o no está presente; el ' aminoácido o es seleccionado de glicina, treonina, ácido aspártico, serina, isoleucina o asparagina; el aminoácido p es seleccionado de treonina, isoleucina o lisina; el aminoácido q es seleccionado de asparagina o tirosina; el aminoácido r es seleccionado de tirosina o histidina; el aminoácido s es seleccionado de alanina o asparagina; el aminoácido t es seleccionado de glutamina, ácido aspártico o prolina; el aminoácido u es seleccionado de lisina o serina; el aminoácido v es seleccionado de fenilalanina, valina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de glutamina o lisina, y el aminoácido x es seleccionado de glicina o serina; donde CDR3b comprende la secuencia de . aminoácidos y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' ' o' ' q' r' ,
_donde e.l_ „aminoácido._y_.es _seleccionado_de . ácido glutámico, ácido aspártico, serina o glicina o no está presente; el aminoácido z es seleccionado . de leucina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, prolina o glicina, o no está presente; el aminoácido a' es seleccionado de ácido glutámico, tirosina o leucina, o no está presente; el aminoácido b' es seleccionado de leucina, asparagina, glicina, histidina, tirosina o triptófano o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de arginina, serina, ácido glutámico, tirosina, glicina o fenilalanina, o no está presente; el aminoácido d' es glicina o no está presente; el aminoácido e' es seleccionado de triptófano o tirosina, o no está presente; el aminoácido f es ácido aspártico o no está presente; el aminoácido g' es seleccionado de serina o arginina, o no está presente; el aminoácido h' es serina o no está presente; el aminoácido i' es seleccionado de glicina o tirosina; o no está presente; el aminoácido j' es seleccionado de tirosina, ácido glutámico o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido k' es seleccionado de tirosina, fenilalanina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido 1' es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, histidina o triptófano o no está presente; el aminoácido m' es seleccionado de tirosina, glicina, ácido aspártico, prolina o serina o no está presente; el aminoácido n' es seleccionado de glicina, valina, tirosina o ácido aspártico, o no -está presente; el aminoácido o' es seleccionado de leucina, alanina, glicina, o tirosina, o no está presente; el aminoácido p' es seleccionado de metionina, fenilalanina, o tirosina; el aminoácido q' es ácido aspártico, y el aminoácido r' es seleccionado de valina, tirosina, isoleucina o prolina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena ligera de anticuerpo, es capaz de unirse al HGF. En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de unión específico aislado, donde el agente de unión específico comprende: (i) un primer polipéptido que comprende al menos, una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a cuando la CDRla comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g h i j k l tn n o p q, cuando el aminoácido a es seleccionado de lisina, arginina o glutamina; el aminoácido b es seleccionado de serina o alananina; el aminoácido c es serina, el aminoácido d es glutamina; el aminoácido e es seleccionado de serina, glicina, o ácido aspártico; el aminoácido f es seleccionado de valina o isoleucina o no está presente; el aminoácido g es seleccionado de leucina o fenilalanina o no está presente; el aminoácido h es seleccionado de fenilalanina o tirosina o no está presente; el aminoácido i es serina o no está presente;
_.__5 e.] aminoa.cii.do-j—es _sexina_o_ no _est_á_ pre_sente.;_ el_ aminoácido k es seleccionado de asparagina, treonina o no está presente ; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, isoleucina o valina; el aminoácido m es seleccionado de lisina, arginina, asparagina o ácido aspártico; el aminoácido n es seleccionado
10 de asparagina o serina; el aminoácido o es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, triptófano o asparagina; el aminoácido p es leucina; y el aminoácido q es seleccionado de alanina, glicina, o asparagina; donde la CDR2a comprende una secuencia de
15 aminoácido r s t u v w x, donde el. aminoácido r es seleccionado de triptófano, alanina, valina, ácido glutámico, o glicina; el aminoácido s es alanina, el aminoácido t es serina, el 'aminoácido u es seleccionado de treonina, serina o ácido aspártico; el aminoácido v es seleccionado de arginina
20 o leucina; el aminoácido w es seleccionado de ácido glutámico, glutamina o alanina; y el aminoácido x es seleccionao de serina, asparagina o treonina; donde la CDR3a comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f g' h' , donde el aminoácido
25 y es seleccionado de glutamina o leucina; el aminoácido z es seleccionado de glutamina, asparagina, o arginina; el aminoácido a' es seleccionado de tirosina, histidina, alanina o serina; el aminoácido b' es seleccionado de fenilalanina, tirosina, ácido aspártico, asparagina o isoleucina; el aminoácido c' es seleccionado de serina, glicina o asparagina; el aminoácido d' es seleccionado de prolina, tirosina, treonina, fenilalanina, ácido aspártico, leucina, o triptófano; el aminoácido e' es prolina; el aminoácido f es prolina o no está presente; el aminoácido g' es triptófano, leucina, prolina, tirosina, o isoleucina; y el aminoácido h' es treonina o asparagina; y donde el primer polipéptido, en asociación con una cadena pesada de anticuerpo, es capaz de unirse al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) ; y (ii) un segundo polipéptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRlb, CDR2b o CDR3b donde CRDlb comprende la secuencia de aminoácido a b c d e f g, conde el aminoácido a es serina o no está presente; el aminoácido b es seleccionado de ácido aspártico o glicina, o no está presente; « aminoácido c es seleccionado de ácido aspártico, glicina, serina, valina, treonina o isoleucina; el aminoácido d es tirosina; el aminoácido e es seleccionado de tirosina o glicina; el aminoácido f es seleccionado de isoleucina, metionina o triptófano; y el aminoácido g es seleccionado de histidina, asparagina o serina;
donde la CDR2b comprende la secuencia de aminoácidos h i j k l m n o p q r s t u v w x, donde el aminoácido h es seleccionado de triptófano, tirosina, valina, asparagina, o ácido glutámico ; el aminoácido i es seleccionado de isolj=ucinaj_ fenilalanina, o__yal_ina; el aminoácido j es seleccionado de asparagina, serina, triptófano, tirosina; el aminoácido k es seleccionado de prolina, serina, tirosina, o histidina; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, serina o ácido aspártico; el aminoácido m es seleccionado de serina o glicina; el aminoácido n es seleccionao de glicina o serina, o no está presente; el aminoácido o es seleccionado de glicina, treonina, ácido aspártico, serina, isoleucina o asparagina; el aminoácido p es seleccionado de treonina, isoleucina o lisina; el aminoácido q es seleccionado de asparagina o tirosina; el aminoácido r es seleccionado de tirosina o histidina; el aminoácido s es seleccionado de alanina o asparagina; el aminoácido t es seleccionado de glutamina, ácido aspártico o prolina; el aminoácido u es seleccionado de lisina o serina; el aminoácido v es seleccionado de fenilalanina, valina o leucina; el aminoácido es seleccionado de glutamina o lisina, y el aminoácido x es seleccionado de glicina o serina,- donde CDR3b comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' C d' e' f g' h' i' j ' k' 1' m' ' o' ' q' r' , donde el aminoácido y es seleccionado de ácido glutámico, ácido aspártico, serina o glicina o no está presente; el aminoácido z es seleccionado de leucina, ácido gl támico, ácido aspártico, histidina, prolina o glicina, o no está presente; el aminoácido a' es seleccionado de ácido
-glutámico, -tirosina o. leucina, ..._o_ no _ jsstá presente; el aminoácido b' es seleccionado de leucina, asparagina, glicina, histidina, tirosina o triptófano o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de arginina, serina, ácido glutámico, tirosina, glicina o fenilalanina, o no está presente; el aminoácido d' es glicina o no está presente; el aminoácido e' es seleccionado de triptófano o tirosina, o no está presente; el aminoácido f es ácido aspártico o no está presente; el aminoácido g' es seleccionado de serina o arginina, o no está presente; el aminoácido h' es serina o no está presente el aminoácido i' es seleccionado de glicina o tirosina; o no está presente; el aminoácido j' es seleccionado de tirosina, ácido glutámico o ácido aspártico, o no' está presente; el aminoácido k' es seleccionado de tirosina, fenilalanina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido 1' es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, histidina o triptófano o no está presente; el aminoácido m' es seleccionado de tirosina, glicina, ácido aspártico, prolina o serina o no está presente; el aminoácido n' es seleccionado de glicina, valina, tirosina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido o' es seleccionado de leucina, alanina, glicina, o tirosina, o no está presente; el aminoácido p' es seleccionado de metionina, fenilalanina, o tirosina; el aminoácido q' es ácido aspártico, y el aminoácido r' es seleccionado de valina, tirosina, isoleucina o prolina; y donde el segundo polipéptido, en asociación con una cadena ligera de anticuerpo, es capaz de unirse al HGF. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32,
34, 36, 38, 40 y 42. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33,
35, 37, 39, 41 y 43. En ciertas modalidades, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos una secuencia nucleotxdica seleccionada de la SEQ ID NO: 1,
3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En ciertas modalidades, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos una secuencia nucleotídica seleccionada de la SEQ ID NO: 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. En ciertas modalidades, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para un polipéptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a. donde la CDRla comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g h j k l m n o p q, donde el aminoácido a es seleccionado de^ aminoácido b es seleccionado de serina o alanina; el aminoácido c es serina, el aminoácido d es glutamina; el aminoácido e es seleccionado de serina, glicina, o ácido aspártico; el aminoácido f es seleccionado de valina o isoleucina o no está presente; el aminoácido g es seleccionado de leucina o fenilalanina o no está presente; el aminoácido h es seleccionado de fenilalanina o tirosina o no está presente; el aminoácido i es serina o no está presenté; el aminoácido j es serina o no está presente; el aminoácido k es seleccionado de asparagina, treonina, o no está presente; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, isoleucina, o valina; el aminoácido m es seleccionado de lisina, arginina, asparagina, o ácido aspártico; el aminoácido n es seleccionado de asparagina o serina; el aminoácido o es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, triptófano, o asparagina; el aminoácido p es leucina; y el aminoácido q es seleccionado de alanina, glicina, o asparagina; donde la CDR2a comprende la secuencia de aminoácidos r s t u v w x, donde el aminoácido r es seleccionado de triptófano, alanina, valina, ácido glutámico, o glicina; el aminoácido s es alanina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es seleccionado de treonina, serina, o ácido aspártico; el aminoácido v es seleccionado de arginina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de ácido glutámico, glutamina, o alanina; y el aminoácido x es seleccionado de serina, asparagina, o treonina; donde la CDR3a comprende la secuencia de aminoácido y z a' b' c' d' e' f g' h' , donde el aminoácido y es seleccionado de glutamina o leucina; el aminoácido z es seleccionado de glutamina, asparagina, o arginina; el aminoácido a1 es seleccionado de tirosina, histidina, alanina, o serina; el aminoácido b1 es seleccionado de fenilalanina, tirosina, ácido aspártico, asparagina, o isoleucina; el aminoácido c1 es seleccionado de serina, glicina, o asparagina; el aminoácido d' es seleccionado de prolina, tirosina, treonina, fenilalanina, ácido aspártico, leucina, o triptófano; el aminoácido e1 es prolina; el aminoácido f 1 es prolina o no está presente; el aminoácido g1 es triptófano, leucina, prolina, tirosina, o isoleucina; y el aminoácido h' es treonina o asparagina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena pesada de anticuerpos, es capaz de unirse al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) . En ciertas modalidades, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de CDRlb, CDR2b, y CDR3b Donde la CDRlb comprende la secuencia de aminoácidos - a— —c—d-e- -f—g,—donde_el aminoácido a es . serina o no está presente; el aminoácido b es seleccionado de ácido aspártico o glicina, o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de ácido aspártico, glicina, serina, valina, treonina, o isoleucina; el aminoácido d es tirosina; el aminoácido e es seleccionado de tirosina o glicina; el aminoácido f es seleccionado de isoleucina, metionina, o triptófano; y el aminoácido g es seleccionado de histidina, asparagina, o serina; Donde la CDR2b comprende la secuencia de aminoácidos h i j k l m n o p q r s t u v w x, donde el aminoácido h es seleccionado de triptófano, tirosina, valina, asparagina, o ácido glutámico; el aminoácido i es seleccionado de isoleucina, fenilalanina, o valina; el aminoácido j es seleccionado de asparagina, serina, triptófano, o tirosina; el aminoácido k es seleccionado de prolina, serina, tirosina, o histidina; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, serina, o ácido aspártico; el aminoácido m es seleccionado de serina o glicina; el •aminoácido n es seleccionado de glicina o serina, o no está presente; el aminoácido o es seleccionado de glicina, treonina, ácido aspártico, serina, isoleucina, o asparagina; el aminoácido p es seleccionado de treonina, isoleucina, o lisina; el aminoácido q es seleccionado de asparagina o tirosina; el aminoácido r es seleccionado de tirosina o ------ ~hi-stidi-na; - el -aminoácido - s -es seleccionado de alanina o asparagina; el aminoácido t es seleccionado de glutamina, ácido aspártico, o prolina; el aminoácido u es seleccionado de lisina o serina; el aminoácido v es seleccionado de fenilalanina, valina, o leucina; el aminoácido w es seleccionado de glutamina o lisina, y el aminoácido x es seleccionado de glicina o serina; Donde la CDR3b comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f g' h' i' jr k' I' m' n' o' p' q' r' , donde el aminoácido y es seleccionado de ácido glutámico, ácido aspártico, serina, o glicina, o no está presente; el aminoácido z es seleccionado de leucina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, prolina, o glicina, o no está presente; el aminoácido a' es seleccionado de ácido glutámico, tirosina, o leucina, o no está presente; el aminoácido b' es seleccionado de leucina, asparagina, glicina, histidina, tirosina, o triptófano, o no está presente; el aminoácido C es seleccionado de arginina, serina, ácido glutámico, tirosina, glicina, o fenilalanina, o no está presente; el aminoácido d' es glicina o no está presente; el aminoácido e' es seleccionado de triptófano o tirosina, o no está presente; el aminoácido f es ácido aspártico o no está presente; el aminoácido g' es seleccionado de serina o arginina, o no está presente; el aminoácido h' es serina o no está presente; el aminoácido i' es_seleccionado de glicina o tirosina, o no jestá presente; el aminoácido j ' es seleccionado de tirosina, ácido glutámico, o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido k' es seleccionado de tirosina, fenilalanina, o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido 1' es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, histidina, o triptófano, o no está presente; el aminoácido m' es seleccionado de tirosina, glicina, ácido aspártico, prolina, o serina, o no está presente; el aminoácido n' es seleccionado de glicina, valina, tirosina, o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido o' es seleccionado de leucina, alanina, glicina, o tirosina, o no está presente; el aminoácido p'es seleccionado de metionina, fenilalanina, o tirosina; el aminoácido q' es ácido aspártico, y el aminoácido r' es seleccionado de valina, tirosina, isoleucina, o prolina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena ligera de anticuerpo, es capaz de unirse al HGF. En ciertas modalidades, la invención proporciona una línea celular aislada que produce un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir la unión de la HGF a Mét que comprenden administrar un agente de unión específico al HGF. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido que consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. En ciertas modalidades, la invención proporciona un agente de unión específica que es capaz de unirse a al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. En ciertas modalidades, la invención proporciona un dominio de unión de anticuerpo o antígeno que es capaz de unirse a al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de unirse al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) que comprende administrar al menos un polipéptido seleccionado de la SEQ ID NO: 164 y 165 a un animal y obtener un anticuerpo capaz de unirse al HGF del animal . En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para hacer disminuir o prevenir la unión de un agente de unión específica al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) mediante la administración de un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para hacer disminuir o prevenir la unión de un agente de unión específica al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) mediante la administración de un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID NO: 164 y 165. Otras modalidades de esta invención serán fácilmente evidentes a partir de la descripción proporcionada con la presente. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1A muestra un dendrogra a de las cadenas ligeras kappa de ciertos anticuerpos para el HGF que muestran sus relaciones de la linea germinal . Las identificaciones del gen de la línea germinal están indicadas a la derecha de la designación del anticuerpo. La Figura IB muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera kappa de ciertos anticuerpos para HGF. Las identificaciones del gen de la línea terminal están indicadas a la izquierda. Las regiones CDR están indicadas como líneas más negras encima de las secuencias alineadas. La Figura 2A muestra un dendrograma de cadenas pesadas gamma de ciertos anticuerpos para HGF que muestran sus relaciones de línea germinal. Las identificaciones del gen de la línea germinal están indicadas a la derecha de la designación del anticuerpo. La Figura 2B muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena gamma de jsiertps anticuerpos para HGF. Las identificaciones del gen de la línea germinal están indicadas a la izquierda. Las identificaciones CDR están indicadas como líneas más negras encima de las secuencias alineadas . La Figura 3 muestra las secuencias de ADN que codifican para las regiones variables de ambas cadenas ligera y pesada de ciertos anticuerpos para HGF. El nombre del anticuerpo, la designación de la línea germinal y el ID de la secuencia están indicados para cada secuencia. La secuencia del péptido señal natural está subrayada. También se muestran las secuencias de ADN de las regiones constantes Kappa, IgGl, e IgG2 humanas . La Figura 4 muestra secuencias de aminoácidos de regiones variables de las cadenas ligera y pesada de ciertos anticuerpos para HGF. El nombre del anticuerpo, la designación de la línea germinal y el ID de la secuencia están indicados para cada secuencia. La secuencia del péptido señal natural está subrayada. También se muestran las secuencias de aminoácido de las regiones constantes Kappa, IgGl, e IgG2 humanas.
Las Figuras 5A-5B muestran secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementar!edad (CDR) de las cadenas ligera y pesada de ciertos anticuerpos para HGF. Esta indicados el nombre del anticuerpo y el ID de la secuencia para cada secuencia . La Figura _ 5A muestra secuencias de aminoácido de CDR de la cadena ligera de ciertos anticuerpos para HGF. La Figura 5B muestra - una secuencia de aminoácidos de CDR de la cadena pesada de ciertos anticuerpos para HGF. Las Figuras 6A-6B muestran los resultados de la determinación de Kd de ciertos anticuerpos para HGF, discutidos en el Ejemplo 8. La Figura 6A muestra datos de un método cinético. La Figura 6B muestra datos de un método de equilibrio/solución. La Figura 7 muestra autorradiogramas de análisis Western Blot discutidos en el Ejemplo 8 que prueban la capacidad de ciertos anticuerpos para unirse a un HGF y a un HGF de ratón. Los paneles a la izquierda (carriles 1-4) muestran autorradiogramas de experimentos efectuados bajo ciertas condiciones no reductoras. Los paneles a la derecha (carriles 5-8) muestran autorradiogramas de experimentos efectuados bajo condiciones reductoras. La Figura 8 muestra datos del clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) de experimentos discutidos en el Ejemplo 8, que evalúa la unión de ciertos anticuerpos a ciertos blancos . La parte superior de la Figura 8 muestra datos de FACS de muestras control que parecen de un agente de unión específica. Los paneles 1 y 2 (desde la izquierda) muestran datos de muestras control que carecen de blanco incubadas con FITC y PE, respectivamente. Los paneles 3 y 4 muestran datos de muestras control que comprenden HGF d5, marcado con FITC y PE, respectivamente, pero que carecen de un agente de unión específica. Los paneles debajo de la línea continua muestran datos de FACS de experimentos de prueba de cinco anticuerpos para HGF. Para cada anticuerpo, el primer panel (desde la izquierda) muestra datos de muestras de control que carecen de blanco, el segundo hasta cuarto paneles muestran datos de experimentos en los cuales el blanco fue: HGF humano, HGF de ratón, y HGF d5 humano, respectivamente . La Figura 9A muestra un esquema de un plásmido que codifica para avidina adyacente a un sitio de clonación múltiple que fue usado para generar proteínas de fusión que comprenden avidina y protelna blanco como se discute en el Ejemplo 8. La Figura 9B muestra la secuencia de avidina de pollo . Las Figuras 10A - 10D muestran representaciones esquemáticas de ciertas proteínas de fusión y los resultados de ensayos de unión, discutidos en los Ejemplos 8C y 8D, usando aquellas proteínas de fusión. La Figura 10C muestra una representación esquemática de ciertas proteínas de fusión que tienen mutaciones, inserciones o supresiones puntuales. La Figura 10D muestra las secuencias de aminoácidos de HGF de humano y ratón en la región de los aminoácidos 451-731 (SEQ ID NO. 120 y 121, respectivamente), con la secuencia de consenso correspondiente indicada (SEQ ID NO. 122) . Las Figuras 11A - 11C muestran análisis por CLAP de experimentos de protección de proteasa sobre HGF como se discute en el Ejemplo 8E. La Figura 11C muestra las secuencias de aminoácidos de péptidos protegidos contra la digestión proteolítica con unión al anticuerpo 2.12.1 en ese trabaj o . Las Figuras 12A-12D muestran resultados de ensayos de unión competitiva discutidos en el Ejemplo 8. La Figura 13 muestra los datos de CI50 de ensayos de neutralización discutidos en el Ejemplo 9. La Figura 14 muestra datos de ensayos de neutralización en células PC3 discutidos en el Ejemplo 10. La Figura 15 muestra datos de ensayos de inhibición en células U-87 discutidos en el Ejemplo 10. Las Figuras 16A-16F muestran los resultados de experimentos discutidos en el Ejemplo 11 que evalúan el efecto de ciertos anticuerpos para HGF sobre tumores de xenoinjerto U-87 MG en ratones. La Figura 16a muestra datos de dosis-respuesta para el anticuerpo 2.4.4 sobre el crecimiento del tumor de xenoinjerto U-87 MG en el modelo de enfermedad residual mínima. La Figura 16B muestra los datos de dosis-respuesta para el anticuerpo 2.4.4 sobre el crecimiento del tumor xenográfico U-87 en un modelo de —enfermedad establecida ._ Las .Figuras 16C, 16D, 16E, y 16F muestran datos de experimentos cabeza a cabeza que prueben anticuerpos para HGF en un modelo de enfermedad residual mínima U-87 (16C y 16D) o en un modelo de enfermedad establecida U-87 (16E y 16F) . DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Debe comprenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas únicamente y no restrictivas de la invención, como se reclama. En esta solicitud, el ' uso del singular incluye el plural a menos que se establezca otra cosa específicamente. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se establezca otra cosa. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, como "incluye", "incluido", no es limitante. También, -términos como "elemento" o "componente" abarca tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se establezca específicamente otra cosa. También el uso del término "porción" puede incluir parte de una porción o todo el anticuerpo.
Los encabezados de sección usados aquí son para propósitos Organizativos únicamente y no debe constituirse en limitantes de la materia objeto descrita. Todos los documentos, o porciones de documentos, citados en esta incluyendo pero _sin limitarte a patentes, solicitudes de patente, artículos, libros y tratados, se incorporan por lo tanto expresamente como referencia en su totalidad para cualquier propósito. Definiciones Pueden ser usadas técnicas estándar para el ADN recotnbinante, síntesis oligonucleotídica y cultivo y transformación tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden ser efectuadas de acuerdo" a las especificaciones del fabricante o como se efectúan comúnmente en la técnica o como se describe- aquí. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden ser efectuados generalmente de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidas a través de la presente especificación. Véase, por ejemplo, e. g., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ) , el cual se incorpora aquí como referencia para cualquier propósito. A menos que se proporcionen definiciones especificas, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas aquí son aquéllas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden ser usadas para síntesis química, análisis química, preparación farmacéutica, formulación y liberación, y tratamiento de pacientes. Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, deberá comprenderse que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados: El término "factor del crecimiento de los -hepatocitos" o "HGF" se refiere a un polipéptido expuesto en Nakamura et al., Nature 342: 440-443 (1989) o fragmentos de los mismos, así como polipéptidos relacionados, el cual incluye, pero no se limita a, variantes alélicas, variantes de empalme, variantes derivadas, variantes de sustitución, variantes de supresión y/o variantes de inserción, polipéptidos de fusión y de homólogos interespecies . En ciertas modalidades un polipéptido HGF incluye residuos terminales como, pero sin limitarse a residuos de secuencia líder, residuos directores, residuos de metionina terminal, residuos de lisina, residuos de marca y/o residuos de proteína de fusión.
El término "agente de unión específica" se refiere a una molécula natural o no natural que se une específicamente a un blanco. Los ejemplos de agentes de unión específica incluyen, pero no se limitan a ^proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y compuestos de molécula pequeñas. En ciertas modalidades, un agente de unión específica es un anticuerpo. En ciertas modalidades, un agente de unión específica es una región de unión de antígeno. El término agente de unión específica al HGF" se refiere aún agente de unión específica que se une específicamente a cualquier porción del HGF. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es un anticuerpo para HGF. En ciertas modalidades, un agente de unión específica es una región de unión de antígeno. El término "anticuerpo policlonal" se refiere a una mezcla heterogénea de anticuerpos que se unen a diferentes epítopes del mismo antígeno. El término "anticuerpos monoclonales" se refiere a una recolección de anticuerpos codificados por la misma molécula de ácido nucleico. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales son producidos por un solo hibridoma u otra línea celular, o por un mamífero transgénico. Los anticuerpos monoclonales típicamente reconocen el mismo epítope. El término "monoclonal" no se limita a ningún método particular para producir un anticuerpo. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una porción del anticuerpo es homologa a una secuencia de una especie particular o una clase de anticuerpo particular, mientras que la otra porción del anticuerpo es homologa a una secuencia de una especie o clase de anticuerpo diferente. Véase, por ejemplo la Patente Estadounidense No. 4,816, 567 y Morrison et al., Proc Nati Acad Sci (USA), 81: 6851-6855 (1985). El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a un anticuerpo en el cual la CDR de un anticuerpo se insertó en la estructura de otro anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo del cual se derivó la CDR y el anticuerpo del cual se derivó la estructura son de diferentes especies. En ciertas modalidades, el anticuerpo del cual se derivó la CDR y el anticuerpo del cual se derivó la estructura son de isotipos diferentes. El término "anticuerpo multiespecífico" se refiere a un anticuerpo donde dos o más regiones variables se unen a diferentes epítopes. Los epítopes pueden encontrarse sobre el mismo o diferentes plantas. En ciertas modalidades, un anticuerpo multiespecíf.ico es un "anticuerpo biespecífico" el cual reconoce dos epítopes diferentes sobre el mismo o diferentes antígenos.
El término "anticuerpo catalítico" se refiere a un anticuerpo en el cual está uñida una o más entidades catalíticas. En ciertas modalidades, un anticuerpo catalítico es un anticuerpo citotóxico, el cual comprende una entidad o porción-eitotóxica . - - - El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en el cual toda o parte de una región de la estructura del anticuerpo derivada de un humano, pero toda o parte de una o más regiones CD es derivada de otra especie, por ejemplo un ratón. El término "anticuerpo totalmente humano" se refiere a un anticuerpo en el cual ambos de la CDR y la estructura comprenden secuencias sustancialmente humanas . En ciertas modalidades, los anticuerpos completamente humanos son producidos en mamíferos no humanos, incluyendo, pero sin limitarse a ratones, ratas, y lagomorfos. En ciertas modalidades los anticuerpos totalmente humanos son producidos en células de hibridoma. En ciertas modalidades, los anticuerpos totalmente humanos son producidos de manera recombinante . El término "anticuerpo antiidiotipo" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a otro anticuerpo. El término "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un agente de unión específica para unirse a un blanco con afinidad mayor que con la que se une a una entidad no blanco. En ciertas modalidades, la unión específica se refiere a la unión eon un blanco con una afinidad que es al menos 10, 50, 100, 250, 500 ó 1000 veces mayor que la afinidad por una entidad no blanco. En ciertas modalidades, la afinidad es determinada por un ensayo de ELISA. En ciertas modalidades, la afinidad determinada por un ensayo de BIAcore. En ciertas modalidades, la afinidad es determinada por un método cinético. En ciertas modalidades, la afinidad es determinada por un método de equilibrio/solución. El término "epítope" se refiere a una porción de una molécula capaz de ser un ¦ agente de unión específica. En ciertas modalidades, los epltopes típicamente comprenden grupos o moléculas superficiales químicamente activas, como, por ejemplo, aminoácidos o cadenas laterales de carbohidratos, y tiene características tridimensionales estructurales específicas, así como características de carga específica. Los epítopes pueden estar contiguos o no. En ciertas modalidades los epítopes pueden ser miméticos dado que comprenden una estructura tridimensional que es similar a la de un epítope generado para producir el anticuerpo, no comprender o solo comprender algunos aminoácidos residuales encontrados en aquel epítope usado para generar el anticuerpo. El término "epítope inhibidor y/o neutralizante" se refiere a un epítope, el cual cuando es unido por un agente de unión específica da como resultado una disminución de la actividad biológica in vivo, in vitro, y/o in situ. En ciertas modalidades, un epítope neutralizante se localiza sobre o esta asociado con una región biológicamente activa de
-un- lanco.. - El término "epítope activante" se refiere a un epítope, el cual cuando es unido por un agente de unión específica da como resultado la activación o mantenimiento de una actividad biológica in vivo, in vitro, y/o in si tu. En ciertas modalidades, un epítope activante se localiza sobre o esta asociado con una región biológicamente activa de un blanco. El término "polinucleótido aislado" como se usa aquí significa un polinucleótido de origen genóraicó, ADNc, sintético o alguna combinación de los mismos, el cual en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con toda o una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta ligado a un polinucleótido con el cual no esta ligado en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "proteína aislada" referido aquí significa una proteína codificada por ADNc, ARN recombi ante, o de origen sintético o alguna combinación de las mismas, la cual (1) está libre de algunas proteínas con las cuales se encontrarían normalmente, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente u origen, por ejemplo, de las misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente , o (4) no se encuentra en la naturaleza. El_ término "polipéptido" se__ usa. aquí como un término genérico para referirse a proteínas nativas, o modificaciones de esas proteínas que tienen supresiones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. En ciertas modalidades, el polipéptido tiene supresiones, adiciones, y/o sustituciones de al menos uno pero no más de 50, 30, 20, 15, 10, 8, 5, ó 3 aminoácidos de la secuencia nativa. El término "que se encuentra en la naturaleza" como se usa aquí aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido con secuencia polinucleotídica está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente de la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otro modo se encuentra naturalmente . El término "ligado operativamente" como se usa aquí se refiere a componentes que están en una relación que les permite funcionar en su forma preferida. Por ejemplo una secuencia de control "ligado operativamente" a una secuencia codificadora esta ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora es lograda bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se usa aguí se refiere a secuencias polinucleotídicas que pueden efectuar _la expresión y procesamiento de las secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. La naturaleza de esas secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo anfitrión. De acuerdo a ciertas modalidades, las secuencias de control para procariotes pueden incluir el promotor, sitio de unión ribosomal y la secuencia de terminación de la transcripción. De acuerdo a ciertas modalidades, las "secuencias de control" para eucariotes pueden incluir promotores, uno o más mej oradores y la secuencia de terminación de la transcripción. En ciertas modalidades las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder y/o secuencias del par de fusión. El término "polinucleótido" referido aquí significa una forma polirnérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. En ciertas modalidades, las bases pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas del ADN de una sola o dos hebras. El término "oligonucleótido" referido aquí incluye nucleótidos naturales, y modificados ligados juntos por enlaces oligonucleotídicos naturales y/o no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto polinucleotídico que comprende, generalmente una longitud de 200 bases o menos. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son 10 a 60 bases de longitud. En ciertas modalidades los oligonucleótidos son de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 bases dé longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de una sola hebra o de dos hebras, por ejemplo para usarse en la construcción de un mutante genético. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. El término "nucleótidos naturales" incluyen desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" incluyen enlaces oligonucleo-tídicos como el fosforotioato, fosforoditioato, fosforo selenoato, fosforodiselenoato, fosoforoanilotioato, fosforo aniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, por ejemplo, La Planche et al. Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analoguees : A Practical Approach, pp. 87-108 (F.Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)): Stec et al. Patente Estadounidense No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, un oligonucleótido puede incluir una marca para su detección. La identidad y similitud de los polipéptidos relacionados pueden ser calculadas fácilmente por métodos conocidos. Esos métodos incluyen, pero ño se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics y Genome Projects, Smit , D.W., ed. , Academia Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press; New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, New York (1991); y Carrillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Ciertos métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor comparación entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad son descritos en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programa de computadora para determinar la identidad entre dos secuencias, incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG incluyendo GAP (Devereux et al.. Nucí . Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, I, BLASTP, BLAST , y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX se encuentra disponible al público del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul _ et al., supra (1990)). También puede ser usado el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad. Ciertos esquemas de alineación para dos secuencias dé aminoácidos pueden dar como resultado la comparación de solo una región corta de las dos secuencias, y. esta región alineada pequeña puede tener una identidad de secuencia muy alta aún cuando no exista una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, ciertas modalidades, el método de alineación seleccionado (programa GAP) dará como resultado una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido blanco. Por ejemplo, usando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) , dos polipéptidos para los cuales va a ser determinado el por ciento de identidad de las secuencias son alienados para la comparación óptima . de sus aminoácidos respectivos (el "tramo comparado" de acuerdo a lo determinado por el algoritmo) . En ciertas modalidades, se usa una penalidad de abertura de vacío (la cual se calcula como 3X la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que sea usada; la "diagonal" es el puntaje o número asignado a cada comparación de aminoácido perfecta por la matriz de comparación particular) y una penalidad de extensión de vacío (la cual es usualmente 1/10 veces la penalidad de abertura de vacío) , así como una matriz de comparación como la PAM 250 o BLOSUM 62 en conjunto con el algoritmo. En ciertas modalidades, también es usada una matriz de comparación estándar (véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc . Nati, Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) por el algoritmo. En ciertas modalidades, los parámetros para una comparación de secuencia polipeptídica incluyen los siguientes : Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al . , supra (1992) ; Penalidad de Separación: 12 Penalidad de Longitud de Separación; 4 Umbral de similitud: 0 El programa GAP puede ser útil con los parámetros anteriores. En ciertas modalidades, los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros predeterminados para comparaciones de polipéptidos (junto con la ausencia de penalidad para vacíos en el extremo) usando el algoritmo GAP. En ciertas modalidades, un agente de unión específico comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 y 43. En ciertas modalidades un agente de unión específica comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y 43. En ciertas modalidades, un agente de unión específica comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y 43. En ciertas modalidades, un agente de unión específica comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprendé una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, y 42. En ciertas modalidades, un agente de unión específica comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, y 42. En ciertas modalidades, un agente de unión específica comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, y 42. Como se usa aquí, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaciones siguen el uso convencional. Véase Immunology- -A Synt esis (2da Edición, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), el cual se incorpora aquí como referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, los D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales como aminoácidos a-, a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formil metionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metil arginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación polipeptídica usada aquí, la dirección a la izquierda es una dirección amino terminal y la dirección a la derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso y convención estándar. De manera similar, a menos que se especifique otra cosa, el extremo izquierdo de secuencias polinucleotídicas de una sola hebra es el extremo 5' ; la dirección hacia la izquierda de las secuencias polinucleotídicas de doble hebra es referida como la dirección 5' . La dirección de adición 5' o 3' de transcriptos de ARN incipientes es referida como la dirección de transcripción; las regiones de la secuencia sobre la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y las cuales son 5' al extremo 5' del transcripto de ARN son referidas como "secuencias corriente arriba" ; las regiones de las secuencias sobre la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están 3' al extremo 3' del transcripto de ARN son referidas como "secuencias corriente abaj o" . Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar aminoácidos residuales no naturales, los cuales son incorporados típicamente por síntesis peptídica química en lugar de la síntesis en sistemas biológicos. Esos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de porciones de aminoácidos. Los residuos naturales pueden ser divididos en clases basadas en las propiedades de la cadena lateral común: 1) hidrofóbicos : norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácidos: Asp, Glu; . 4) básicos.: His, Lys,_ Arg; 5) residuos que tienen influencia sobre la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Por ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de esas clases por un miembro de otra clase. Esos residuos sustituidos pueden ser introducidos en regiones del anticuerpo humano que so homólogas con anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula. Al hacer esos cambios, de acuerdo a ciertas modalidades, puede ser considerado el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga. Ellos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5) ; glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).
La importancia del índice hidropático del aminoácido para conferirle función biológica interactiva sobre una proteína es comprendida en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol . , 157: 105-131 (1982) . Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntaje hidropático similar y aún retener una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el índice hidropático, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de + 2 está incluida. En ciertas modalidades, aquéllos que están dentro de ± 1 están incluidos, y en ciertas modalidades, aquéllos dentro de ± 0.5 están incluidos . - También se comprende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido biológicamente funcional creada por tal razón se pretende sea de uso en modalidades inmunológicas , como en el presente caso. En ciertas modalidades, la hidrofilicidad promedio local mayor de una proteína, de acuerdo a lo gobernado por la hidrof ilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su imunogenicidad y ant igenicidad, es decir, con una propiedad biológica. de la proteína. Los siguientes valores de hidrof ilicidad han sido asignados a esos aminoácidos residuales: arginin'a (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); gl tamato (+3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina {-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). Haciendo cambios sobre la base de valores de hidrof ilicidad similares, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de + 2 está incluida, en ciertas modalidades, aquéllos que están dentro de ±1 están incluidos, y en ciertas modalidades, aquéllos dentro de +0.5 están incluidos. También pueden identificarse epítopes de secuencias de aminoácidos primarios sobre la base de la hidrofilicidad. Esas regiones también son referidas como "regiones del núcleo epitópico" . Las sustituciones de aminoácidos ejemplares se exponen en la Tabla I .
Tabla I Sustituciones de Aminoácidos
Residuos Sustituciones Sustituciones originales ej emplares preferidas
Ala Val, Leu, lie Val
Arg Lys, Gln, Asn Lys
Asn Gln Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser, Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro, Ala Ala
His Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie, Leu Val, Met, Ala, Leu Phe, Norleucina Leu Norleucina, lie, lie Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, Acido 1,4 Arg Diamino-butirico, Gln, Asn et Leu, Phe, lie Leu Tabla I (continuación) Sustituciones de Aminoácidos
Un experto en la técnica será capaz de determinar las variantes adecuadas de los polipéptidos como se expone aquí usando técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, el experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad por regiones directoras que se cree no son de importancia para la actividad. En ciertas modalidades, pueden identificarse residuos y porciones de la molécula que estén conservadas entre polipéptidos similares. En ciertas modalidades, aún las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden ser sometidas a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la -actividad biológica o . s_in afectar de , manera _ adversa la estructura del polipéptido. Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios sobre la estructura-función identificando residuos en polipéptidos similares que sean importantes para la actividad o estructura. En vista de esa comparación, puede predecirse la importancia de los aminoácidos residuales en una proteína que correspondan a aminoácidos residuales que sean importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para esos aminoácidos residuales de importancia predicha. . Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de esa información, el experto en la técnica puede predecir la alineación de los aminoácidos residuales de un anticuerpo con respecto a su estructura dimensional . En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede elegir hacer cambios radicales a los aminoácidos residuales predichos sobre la superficie de la proteína, puesto que esos residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una sola sustitución de aminoácido en cada aminoácido residual deseado. Las variantes pueden entonces ser separadas o seleccionadas usando ensayos de actividad conocidos por aquellos expertos en la técnica. Esas variantes podrían ser usadas para recabar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se describe que un cambio a un aminoácido . residual particular da como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, pueden ser evitadas las variantes con ese cambio. En otras palabras, sobre la base de la información recabada de esos experimentos de . rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deberán ser evitadas sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones. Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura .secundaria. Véase Moült J. , Curr. Op. in Biotech. , 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., Al: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem. , 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Además, actualmente están disponibles programas de computadora para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelaje de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de -seeuenc-i-a—-mayor del 30% -o- una similitud mayor del 40%, con frecuencia tiene topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de las bases estructurales de proteínas (PDB) ha proporcionado mayor capacidad de predicción de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al., Nucí. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que ha sido resuelto el número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá dramáticamente más exacta. Los métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen "el enhebrado" (Jones, D. , Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bo ie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym. , 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355-4358 (1987)), y "enlace evolutivo" (véase Holm, supra (1999) , and Brenner, supra (1997) ) .
En ciertas modalidades, las variantes del agente de unión específica incluyen variantes de glicosilacion donde el número y/o tipo de sitios de glicosilacion ha sido alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipépt-ido ..original En ciertas ..modalidades,,.. las. variantes de la proteína comprenden un mayor o menor número de sitios de glicosilacion ligados a N que en la proteína nativa. Un sitio de glicosilacion ligado a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde el aminoácido residual designado como X puede ser cualquier aminoácido residual excepto prolina. La sustitución de aminoácidos residuales para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato ligada a N. De manera alternativa, las sustituciones que eliminan esta secuencia removerán una cadena de carbohidrato ligada a N existente. También se proporciona un rearreglo de cadenas de carbohidrato ligadas a M donde uno o más de los sitios de glicosilacion ligados a N (típicamente aquéllos presentes en la naturaleza) son eliminados y son creados uno o más nuevos sitios ligados a N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína donde uno o más residuos de cisteína son suprimidos de o sustituidos por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos original . Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deban ser replegados en una conformación biológicamente activa como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos residuos de cisteína que la proteína nativa.,___y_ típicamente _.tienen__un número, _par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no apareadas . De acuerdo a ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son aquellas las cuales: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales sobre esos polipéptidos . De acuerdo a ciertas modalidades, pueden ser producidas sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (en ciertas modalidades, sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia natural (en ciertas modalidades, en la porción del polipéptido fuera de los contactos intermoleculares formadores de dominio) . En ciertas modalidades, una sustitución conservativa de aminoácidos puede o no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no tendería a romper una hélice que ocurra en la secuencia original, o perturbar otros tipos de estructuras secundarias que caractericen a la secuencia original. Los ejemplos de estructuras secundaria y terciaria de polipéptidos reconocidos en la técnica son descritos en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton,
___E¿L_, W. , H. Fjr_eejn.an___and_ jCompany, .New . York (1984));
Introduc ion to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354: 105 (1991), los cuales se incorporan aquí como referencia. El término "derivado" se refiere a una molécula que incluye una modificación química diferente a una inserción, supresión o sustitución de aminoácidos. En ciertas modalidades, los derivados comprenden modificaciones covalentes, incluyendo, pero sin limitarse a, unión química con polímeros, lípidos, u otras porciones orgánicas o inorgánicas. En ciertas modalidades, un agente de unión específica modificado químicamente puede tener una vida media en circulación mayor que un agente de unión específica que no sea modificado químicamente. En ciertas modalidades, un agente de unión específica modificado químicamente puede tener una mejor capacidad para ser blanco en células, tejidos y/u órganos deseados. En ciertas modalidades, un agente de unión específica derivado es modificado covalentemente para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua, incluyendo, pero sin limitarse a, polietilen glicol, polioxietilen glicol o polipropilen glicol. Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 y 4,179,337. En ciertas modalidades, un agente de unión específica derivado comprende uno o más polímeros, incluyendo, pero sin limitarse a, monometoxi-polietilen glicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli (N-vinil pirrolidona) -polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxie ilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de esos polímeros. En ciertas modalidades, un derivado es modificado covalentemente con subunidades de polietilen glicol (PEG) . En ciertas modalidades, es unido uno o más polímeros solubles en agua en una o más posiciones específicas, por ejemplo en el amino terminal, de un derivado. En ciertas modalidades, es unido aleatoreamente uno o más polímeros solubles en agua a una o más cadenas laterales de un derivado. En ciertas modalidades, se usa PEG para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión específica. En ciertas modalidades, el PEG es usado para mejorar la capacidad terapéutica de un anticuerpo humanizado. Ciertos de esos métodos son discutidos, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 6,133,426, la cual se incorpora por lo tanto aquí como referencia para cualquier propósito.
El término "fragmento de polipéptido" como se usa aquí se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino terminal y/o carboxi terminal. En ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5 a 478 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o 450 aminoácidos de longitud. Los análogos peptidicos son usados comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptidicos con propiedades análogas a las de aquellos del . péptido molde o patrón. Esos tipos de compuestos no peptidicos son llamados "miméticos peptidicos" o "peptidomiméticos" . Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30: 122? (1987), las cuales se incorporan aquí como referencia para cualquier propósito. Esos compuestos son con frecuencia desarrollados con la ayuda de modelaje molecular computarizado . Los miméticos. peptidicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden ser usados para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) como anticuerpo humano, pero tiene uno o . más enlaces peptidicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado de: --CH2NH--, --CH2S--, -~CH2-CH2--, --CH=CH-(cis y trans) , --COCH2--, - -CH (OH) CH2- - , y --CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede ser usada en ciertas modalidades para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden ser generados por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), incorporado aquí como referencia para cualquier propósito).; por ejemplo, agregando residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares los cuales ciclizan el péptido. Los términos "anticuerpo" o "péptidos de anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. En ciertas modalidades, los fragmentos de unión son producidos por técnicas de ADN recombinante . En ciertas modalidades, los fragmentos de unión son producidos por la escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, y anticuerpos de una sola cadena.
El término "cadena pesada" incluye cualquier polipeptido que tenga una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad por un blanco. El término cadena ligera" incluye cualquier polipéptido que tenga una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad por un blanco. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, Csl, C½2, y CH3. El dominio VH está en el amino terminal del polipeptido, y el dominio ¾3 está en el carboxi terminal. El término "cadena pesada", como se usa aquí, abarca una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. Al igual que la cadena pesada, el dominio de la región variable, de la cadena ligera está e el amino terminal del polipéptido. El término "cadena ligera", como se usa aquí, abarca una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma. Un fragmento Fab está comprendido de una cadena ligera de CH1 y regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab puede no formar un enlace disulfuro con otra molécula de la cadena pesada. Un fragmento Fab' contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, de modo que puede ser formado un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')2. La región Fv comprende las regiones variables de ambas cadenas pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes. Los anticuerpos de una sola cadena son moléculas Fv en las cuales las -reglones .variables _de__.la_ cadena_pesada y ligera han sido conectadas por un enlazante flexible para formar una cadena de un solo polipéptido que: forma una región de unión de antígeno. Los anticuerpos de una sola cadena son discutidos con detalle por ejemplo, en la WO 88/01649 y las Patentes Estadounidenses Nos. 4,946,778 y 5,260,203. El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo, que típicamente incluye aproximadamente de 120 a 130 aminoácidos amino terminales en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos aminoterminales en la cadena ligera. En ciertas modalidades, las regiones variables de los diferentes anticuerpos difieren extensamente en la secuencia de aminoácidos aún entre anticuerpos de la misma especie. La región variable de un anticuerpo determina típicamente la especificidad de un anticuerpo particular por su blanco. El término "fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional" se refiere a un fragmento de polipéptido que comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmuno-globulina . En ciertas modalidades, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional es capaz de unirse a un ligando, prevenir la unión del ligando a su receptor, e interrumpir por lo tanto una respuesta biológica resultante de la unión del ligando al receptor. En ciertas modalidades, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional es capaz de unirse a un receptor, prevenir la unión del ligando a su receptor, y por lo tanto interrumpir una respuesta biológica resultante de la unión del ligando al receptor. En ciertas modalidades, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamen e funcional es capaz de unirse a un receptor y activar o inactivar ese receptor. Típicamente se comprende que un anticuerpo bivalente es diferente a un anticuerpo
"mult iespecíf ico" o "multifuncional" , en ciertas modalidades, tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos . Un agente de unión específica inhibe sustancialmente la adhesión de un ligando a un receptor cuando un exceso del agente de unión específica reduce la cantidad de receptor unido a un contrarreceptor en al menos 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, o más (de acuerdo a lo medido en un ensayo de unión competitiva in vitro) .
El término "blanco" se refiere a una molécula o a una porción de una molécula capaz de ser unida por un agente de unión especifica. En ciertas modalidades, un blanco puede tener uno o más epítopes . En ciertas modalidades, un blanco es—un—ant geno „ El término "epítope" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de célula T. En ciertas modalidades, los determinantes epitópicos incluyen agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específica. Un epítope' es una región de un antígeno que es unida por un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno blanco en una mezcla compleja de proteína y/o macromoléculas . En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es _< 1 µ?, en ciertas modalidades, cuando la constante de disociación es < 100 n , y en ciertas modalidades, cuando la constante de disociación es < 10 nM. El término "agente" se usa aquí para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto producido a partir de materiales biológicos. Como se usan aguí, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido marcado radioactivamente o unido a un polipéptido de porciones de biotina que pueden ser detectadas por avidina marcada (por ejemplo estreptavidina que contenga un marcador fluorescente o actividad enzimática que pueda ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos) . En ciertas modalidades, la marca o marcador también puede ser terapéutica. Varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas son conocidos en la técnica y pueden ser usados. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90 Y, 99 Te, 111 ln, 125 I, 131 I), marcas fluorescentes (por ejemplo FITC, rodamina, lantánidos fosforosos) , marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos quimioluminiscentes, biotinilados , epitopes polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias del par de la cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, marcas epitópicas) . En ciertas modalidades, las marcas son unidas por brazos separadores de varias longitudes para reducir el potencial de impedimento histérico . El término "muestra biológica", como se usa aquí, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de sustancia de una ente, o ente anteriormente viviente. Esos entes vivientes incluyen, pero no se limitan a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Esas sustancias incluyen, pero no se limitan a sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, huesos, médula ósea, nodos linfáticos y piel . El término "cáncer" incluye, pero no se limita a tumores sólidos y enfermedades malignas hematológicas . Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer colorrectal, carcinoma gástrico, glioma, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma renal papilar hereditario y esporádico, leucemia, linfoma, síndrome de Li-Fraumeni, mesotelioma pleural maligno, melanoma, mieloma múltiple, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer pulmonar de células pequeñas, sarcoma sinovial, carcinoma tiroide y carcinoma de células transitorias de la vejiga urinaria. El término "actividad de HGF" incluye cualquier efecto biológico del HGF. En ciertas modalidades, la actividad de la HGF es la actividad de Met-HGF. En ciertas modalidades, la actividad de HGF es la actividad de HGF independiente de Met. El término "señalización de Met-HGF" incluye la interacción del HGF con un receptor de Met. El término _"actividad de Met-HGF" incluye cualquiera actividad biológica resultante de la señalización de Met-HGF. Las actividades ejemplares incluyen, pero no se limitan a, inducción neural, regeneración hepática, cicatrización de heridas, crecimiento, invasión, diferenciación morfológica, desarrollo embriológico, propagación, proliferación, apoptosis, motilidad celular, metástasis, migración, adhesión celular, agrupamiento de integrina, fosforilación de paxilina, formación de adhesiones focales, y cáncer resultante de señalización de Met-HGF aberrante . El término "señalización de Met-HGF aberrante" incluye cualquier - circunstancia en la cual la señalización de Met-HGF no estimule ninguna actividad de Met-HGF cuando la señalización normalmente daría como resultado esa actividad. La señalización de Met-HGF aberrante también incluye cualquier circunstancia en la cual la señalización de Met-HGF dé como resultado una menor actividad de Met-HGF que la que ocurriría con la señalización normal. La actividad aberrante también incluye cualquier circunstancia en la cual la señalización de Met-HGF dé como resultado una mayor actividad de et-HGF que la que ocurriría con la señalización normal. La señalización de Met-HGF aberrante puede dar como resultado, por ejemplo, ciertos cánceres. El término "actividad del HGF independiente de Met" se refiere a cualquier actividad biológica afectada por el HGF que no dependa de la unión de HGF al receptor de Met . Esa actividad incluye, pero no se limita a, actividad biológica afectada por la interacción del HGF con otros receptores y actividad biológica afectada por el HGF a través de otras vías, por ejemplo heterodímeros Ron o met/ron. El término "actividad aberrante del HGF" se refiere a cualquier circunstancia en la cual la actividad del HGF sea mayor o menor de lo que debiera. En ciertas circunstancias, la actividad aberrante del HGF resulta de la señalización aberrante del _HGF. En ciertas circunstancias, la actividad aberrante del HGF resulta de una concentración de HGF que es mayor de lo que debiera ser. En ciertas modalidades, la actividad aberrante del HGF resulta de una concentración de HGF que es menor de lo que debiera ser. El término ^agente o fármaco farmacéutico" como se usa aquí se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administre apropiadamente a un paciente. El término "modulador", como se usa aquí, es un compuesto que cambia o altera la actividad o función de una molécula. Por ejemplo, un modulador puede producir un incremento o disminución en la magnitud de cierta actividad o función de una molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En ciertas modalidades, un_ modulador es un_ inhibidor, el cual hace disminuir la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Ciertas actividades y funciones ejemplares de una molécula incluyen, pero no se limitan a, afinidad de unión, actividad enzimática y transducción de señales. Ciertos inhibidores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, peptidocuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los peptidocuerpos son descritos en, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,660,843 (correspondiente a la Solicitud PCT No. WO01/83525) . Como se usa aquí, "sustancialmente pura" significa una especie objetivo que es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualesquier otras * especies individuales en la composición) . En ciertas modalidades, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde las especies objetivo comprenden al menos aproximadamente 50% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas modalidades, .una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% de todas las especies macromolares presentes en la composición. En ciertas modalidades, las especies objetivo son purificadas esencialmente hasta su homogeneidad (no pueden ser detectadas especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular. El término paciente incluye sujetos humanos y animales . Ciertos Agentes de Unión Específica Ejemplares En ciertos casos, el HGF se une a un receptor de Met para inducir la fosforilación de Met. En ciertos casos, la fosforilación de Met inducida por el HGF normal regula una variedad de procesos celulares. En ciertos casos, una actividad de Met-HGF aberrante se correlaciona con un número de estado de enfermedades humanas. Por ejemplo, en ciertos casos, demasiada actividad del HGF se relaciona con ciertos cánceres. Por lo tanto, en ciertos casos, la modulación de la actividad del HGF puede ser terapéuticamente útil. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica al HGF son usados para hacer disminuir la cantidad de actividad del HGF de un nivel normalmente alto. En ciertas modalidades, la disminución de la actividad del HGF de un nivel anormalmente alto disminuye la actividad tumorigénica y reduce la severidad del cáncer. De acuerdo a ciertas modalidades, los agentes de unión específica al HGF son usados para tratar el cáncer. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica al HGF son usados para evitar el cáncer. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es usado para tratar cánceres en los cuales la actividad del HGF es normal. En esos cánceres, por ejemplo, la reducción de la actividad del HGF por debajo de lo normal puede proporcionar un efecto terapéutico. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es usado para modular al menos una actividad del Met-HGF. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es usada para modular al menos una actividad de HGF independiente de Met. En ciertas modalidades, es usado más de un agente de unión específica al HGF para modular la actividad del HGF. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica al HGF son anticuerpos monoclonales completamente humanos. En ciertas modalidades, se proporcionan secuencias nucleotídicas que codifican para, y secuencias de aminoácidos que comprenden, moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias correspondientes a las regiones variables. En ciertas modalidades, se proporcionan secuencias que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , específicamente de la CDR1 hasta la CDR3. De acuerdo a ciertas modalidades, se proporciona una línea celular de hibridoma que expresa esa molécula de inmunoglobulina . De acuerdo a ciertas modalidades, se proporciona una línea celular de hibridoma que expresa ese anticuerpo monoclonal . En ciertas modalidades se selecciona una. línea celular de hibridoma de al menos una de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 y 3.10.1. En ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo monoclonal purificado humano para el HGF humano. La capacidad para clonar y reconstruir sitios humanos del orden de megabases en cromosomas artificiales de levadura (YAC, por sus siglas en inglés) e introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un método para producir los componentes funcionales de sitios muy grandes o trazados en curvo así como generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, la utilización de esa tecnología para la sustitución de los sitios de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar agudeza en la expresión y regulación de los productos genéticos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progreso de enfermedades. Una aplicación práctica importante de esa estrategia es la "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de sitios de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los cuales los genes de Ig endógenos han sido inactá¾sdos ofrecen la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y montar anticuerpos así como su papel en el desarrollo de las células B. Además, esa estrategia puede proporcionar una fuente de proyección de anticuerpos monoclonales (AcM) completamente humanos. En ciertas modalidades, se espera que los anticuerpos completamente humanos se minimicen en las respuestas inmunogénica y alérgica intrínsecas a los AcM de ratón o derivados de ratón, y de este modo, en ciertas modalidades, incremente la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. En ciertas modalidades, los anticuerpos completamente humanos pueden ser usados en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas o recurrentes, como el cáncer, malaria o retinopatía diabética proliferativa, las cuales pueden implicar administraciones repetidas de anticuerpo. Pueden diseñarse cepas de ratón deficientes en producción de anticuerpo de ratón con fragmentos grandes del sitio de Ig humana de manera anticipada de modo que esos ratones produzcan anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos de Ig humana grandes pueden preservar la diversidad del gen variable grande así como la regulación apropiada de la producción y expresión del anticuerpo. Explotando la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos en la ausencia de tolerancia inmunológica a proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos producidos en esas cepas de ratón puede producir anticuerpos completamente humanos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología del hibridoma, pueden ser producidos y seleccionados AcM humanos específicos del antígeno con la especificidad deseada. Ciertos métodos ejemplares son descritos en la WO 98/24893, Patente Estadounidense No. 5,545,807, la EP 546073B1, y la EP 546073A1. En ciertas modalidades, pueden usarse regiones constantes de especies diferentes a humanos junto con las regiones variables humanas . Estructura del Anticuerpo Natural Las unidades estructurales del anticuerpo natural típicamente comprende un tetrámero. Cada uno de esos tetrámeros típicamente está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas , teniendo cada par una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas modalidades, de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" de longitud completa (en ciertas modalidades, de aproximadamente 50-70 kDa) . La porción aminoterminal de cada cadena típicamente incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 ó más aminoácidos que típicamente responden al reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define típicamente una región constante que puede ser responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas son clasificadas típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas típicamente como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el isotipp del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero sin limitarse a, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. La IgM tiene subclases incluyendo, pero sin limitarse a IgMl e IgM2. La IgA está igualmente subdividida en subclases incluyendo, pero sin limitarse a, IgAl e IgA2. Dentro de las cadenas ligera y pesada de longitud completa, típicamente, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada incluyendo también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W. , ed., 2da ed. aven Press, N.Y. (1989)) (incorporada aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos) .. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada típicamente forma el sitio de unión del antígeno. Las regiones variables exhiben típicamente la misma estructura general de regiones estructurales (FR, por sus siglas en inglés) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables , también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están típicamente alineadas por las regiones estructurales, las cuales pueden permitir la unión a un epítope específico. Del N-terminal al C-terminal, ambas regiones variables de cadena ligera y pesada típicamente comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3 , CDR3 y _ER4^—La- -asignación -de .aminoácidos . a cada dominio es, típicamente, de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Proteína de abat de Interés Inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987); Chotia et al. Nature 342:878-883 (1989). En ciertas modalidades, una cadena pesada de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena ligera de anticuerpo. En ciertas modalidades, una cadena ligera de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena pesada de anticuerpo. En ciertas modalidades, una región de unión de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena ligera de anticuerpo. En ciertas modalidades, una región de unión de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de cadena pesada de anticuerpo. En ciertas modalidades, una región variable individual se une específicamente a un antígeno en ausencia de otras regiones variables . En ciertas modalidades, la desalineación definitiva de una CDR y la identificación de los residuos que comprenden el sitio de unión de un anticuerpo es lograda resolviendo la estructura del anticuerpo y/o resolviendo la estructura del complejo anticuerpo-1igando . En ciertas modalidades, que pueden ser logradas por cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica, como La cristalografía de rayos X. En ciertas modalidades, pueden ser empleados varios métodos de análisis para identificar o aproximarse a las regiones CDR. Los ejemplos de esos métodos incluyen, pero no se limitan a, la definición de abat, la definición de Chot ia, la definición del AcM y la definición de contacto. La definición de Kabat es un estándar para numerar los residuos en un anticuerpo y se usa típicamente para identificar regiones CDR. Véase, Johnson and Wu, Nucleíc Acids Res, 28:214-8 (2000). La definición de Chothia es similar a la definición de Kabat, pero la definición de Chothia toma en cuenta las posiciones de ciertas regiones de espiras estructurales. Véase, por ejemplo, Chothia et al . , J" Mol Biol, 196:901-17 (1986); Chothia et al., Naüure, 342:877-83 (1989) . La definición del AcM usa un con unto integrado de programas de computadora producidos por el Grupo Molecular de Oxford que modela la estructura del anticuerpo. Véase, por ejemplo, Martin et al., Proc Nati Acad Sci (USA) 86:9268-9272 (1989) ; AbM®, un programa de computadora para modelar regiones variables de anticuerpos, Oxford, UK; Oxford Molecular, Lfed-. La definición del AcM modela la estructura terciaria de un anticuerpo a partir de la secuencia primaria usando una combinación de bases de datos conocidas y métodos ab initio, como aquellos descritos en Samudrala et al., Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach, PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl . 3:194-198 (1999). La definición de contacto se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas disponibles. Véase, por ejemplo MacCallum et al., J Mol Biol, 5:732-45 (1996) . Por convención, las regiones CDR en la cadena pesada son referidas típicamente como Hl, H2, y H3 y son numeradas secuencialmente en dirección del amino terminal al carboxi terminal. Las regiones CDR en la cadena ligera son referidas típicamente como Ll, L2, y L3 y son numeradas secuencialmente en la dirección del amino terminal al carboxi terminal . Anticuerpos Biespecíficos o Bifuncionales - Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es típicamente un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos por una variedad de métodos incluyendo, pero sin limitarse, a, fusión de hibridomas, o enlace de fragmentos Fab' . Véase, por ejemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol . 79:315-321 (1990); Kostelny etal . , J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).
Preparación de Anticuerpos De acuerdo a ciertas modalidades, ciertos anticuerpos que se unen específicamente al HGF son abarcados por la invención. En ciertas modalidades, los anticuerpos son producidos por- -inmunización con un antígeno. El término "antígeno" se refiere a una molécula usada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a ese antígeno y/u otro objetivo. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser producidos por inmunización con HGF de longitud completa, una forma soluble de HGF, una forma variante de empalme del HGF, o un fragmento del mismo. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, y/o pueden ser anticuerpos recombinantes . En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanos preparados, por ejemplo, por inmunización de animales transgénicos capaces de producir anticuerpos humanos. Véase, por ejemplo, la Solicitud PCT Publicada . o . WO 93/12227) . En ciertas modalidades, pueden ser empleadas ciertas estrategias para manipular propiedades inherentes de un anticuerpo, como la afinidad de un anticuerpo por su blanco. Esas estrategias incluyen, pero no se limitan al uso de mutagénesis específica del sitio o aleatoria de la molécula polinucleotídica que codifica para un anticuerpo para generar una variante del anticuerpo. En ciertas modalidades, esa generación es seguida separando variantes del anticuerpo que exhiban el cambio deseado, por ejemplo, mayor o menor afinidad. En ciertas modalidades, los aminoácidos residuales dirigidos en las estrategias mutagénicas son aquellos en las CDR. En ciertas modalidades, los aminoácidos en las regiones estructurales de los dominios variables son dirigidos. En ciertas modalidades, esas regiones . estructurales han mostrado contribuir a las propiedades de unión del blanco de ciertos anticuerpos. Véase, por ejemplo, Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402 (1999) y referencias citadas allí. En ciertas modalidades, las bibliotecas de variantes de anticuerpos seleccionadas o separadas más efectivamente y más pequeñas son producidas por mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, restrictiva, a sitios de hipermutación en la CDR, los cuales son sitios que corresponden a área propensas a mutación durante el proceso de mutación de afinidad somática. Véase, por ejemplo, Chowdhury and Pastan, IVature Biotech, 17: 568-572 (1999) y referencias en ella. En ciertas modalidades, pueden ser usados ciertos tipos de elementos de ADN para identificar sitios de hipermutación incluyen, pero sin limitarse a, ciertas repeticiones directas e invertidas, ciertas secuencias de consenso, ciertas estructuras secundarias y ciertos palíndromas. Por ejemplo, aquellos elementos de ADN que pueden ser usados para identificar sitios de hipermutación incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de tetrabases que comprenda una purina (A o G) , seguida por una guanina (G) , seguida por una pirimidina (C o T) , seguida por adenosina o__tir_osina JA o T) Jes decir^A/G-G-C/T-A/T) . Otro ejemplo de un elemento de ADN que puede ser usado para identificar los sitios de hipermutación es en el codón de la serina; A-G-C/T. En ciertas modalidades, los anticuerpos son humanizados. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado es sustancialmente no inmunogénico en humanos. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado tiene sustancialmente la misma afinidad por un blanco que un anticuerpo de otra especie la cual se derivó el anticuerpo inmunizado. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense 5,530,101, Patente Estadounidense 5,693,761; Patente Estadounidense 5,693,762; Patente Estadounidense 5,585,089. En ciertas modalidades, son identificados los aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo sin disminuir la afinidad nativa del dominio de unión del antígeno reduciendo a la vez su inmunogenicidad. Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,766,886 y 5,869, 619. En ciertas modalidades, la modificación de un anticuerpo por métodos conocidos en la técnica es diseñada típicamente para lograr un incremento en la afinidad de unión por un blanco y/o para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo en el receptor. En ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados son modificados para eliminar los sitios de glicosilación para incrementar la afinidad de anticuerpo por su antígeno cognato. Véase, por ejemplo, Co et al., Mol Immunol 30:1361-1367(1993). En ciertas modalidades, son usadas técnicas como la "reformación" ,
"hiperquimerización" , o "revestimiento/recubrimiento" para producir anticuerpos humanizados. Véase, por ejemplo, Vaswami et al., Annals of Allergy, Astlma, & Immunol 81:105(1998); Roguska et al., Prot Engineer 9:895-904 (1996); y la Patente Estadounidense No. 6,072,035. En ciertas de esas modalidades, esas técnicas reducen típicamente la inmunogenicidad del anticuerpo reduciendo el número de residuos externos, pero no evitan las respuestas antiidiotxpica y antialotípica después de la administración repetida de los anticuerpos. Ciertos otros métodos para reducir la inmunogenicidad son descritos, por ejemplo, en Gilliland et al., J Immunol .62 (6): 3663-71 (1999). En ciertos casos, los anticuerpos humanizados dan como resultado una pérdida de la capacidad de unión del antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados son "nuevamente sometidos a mutación" . En ciertas modalidades, el anticuerpo humanizado es sometido a mutación para incluir uno o más de los aminoácidos residuales encontrados en el anticuerpo donador. Véase, por ejemplo, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19(1999). En ciertas modalidades las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo para el HGF pueden ser insertadas a las regiones estructurales (FR) de la misma u otras especies. En ciertas modalidades, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo para HGF pueden ser injertadas a FR humanas de consenso. Para crear FR humanas de consenso, en ciertas modalidades, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena ligera o cadena pesada humanas son alineadas para ^identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. En ciertas modalidades, las FR de un anticuerpo para la cadena pesada o cadena ligera del HGF son reemplazadas con las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En ciertas modalidades, no son reemplazados aminoácidos raros en las FR de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo para HGF, mientras que el resto de los aminoácidos de la FR son reemplazados. Los aminoácidos raros son aminoácidos específicos que están en posiciones en las cuales no se encuentran usualmente en las FR. En ciertas modalidades, las regiones variables injertadas de un anticuerpo para HGF pueden ser usadas con una región constante que sea diferente de la región constante de un anticuerpo para HGF. En ciertas modalidades, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de una sola cadena. El injerto de CDR es descrito, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,180,370, 6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089, y 5,530,101, y en Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts 430: 92-94 (1998) , las cuales se incorporan aquí como referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, es usada una técnica de presentación de fago para generar anticuerpos monoclonales . En ciertas modalidades, esas técnicas producen anticuerpos monoclonales completamente humanos. En ciertas modalidades un polinucleótido que codifica para un solo fragmento de anticuerpo Fab o Fv es expresado sobre la superficie de una partícula de fago. Véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., J Mol Biol 227:381 (1991);- Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991); Patente Estadounidense No. 5,885,793. En ciertas modalidades, los fagos son "separados" para identificar aquellos fragmentos de anticuerpo que tienen afinidad por el blanco. De este modo, ciertos de esos procesos imitan la selección inmune a través de la presentación de repertorios de fragmento de anticuerpo sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos, y la selección posterior del fago por su unión al blanco. En ciertos de esos procedimientos, se aislan fragmentos de anticuerpo agonísticos funcionales de alta afinidad. En ciertas de esas modalidades, se crea un repertorio completo dé genes de anticuerpos humanos clonando enes _V .de humanos rearreglados de manera natural a partir de linfocitos sanguíneos periféricos. Véase, por ejemplo, Mullinax et al., Proc Nati Acad Sci (USA) 87:8095-8099 (1990). De acuerdo a ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son preparados a través del uso de un ratón transgénico. que tiene una porción sustancial del genoma productor de anticuerpos humanos insertado pero que se volvió deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Esos ratones entonces, son capaces de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr este resultado son descritas en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la especificación, aquí. En ciertas modalidades, pueden emplearse métodos como aquéllos descritos en la Solicitud PCT Publicada No. WO 98/24893 o en Méndez et al, Nature Genetics 15: 146-156 (1997), las cuales se incorporan por lo tanto aquí como referencia para cualquier propósito. De acuerdo a ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales completamente humanos específicos para HGF son producidos como sigue. Los ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana son inmunizados con el antígeno de interés, por ejemplo, HGF, células linfáticas (como células B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Esas células recuperadas son fusionadas con una línea celular tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y esas líneas celulares de hibridoma son separadas y seleccionadas para identificar las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En ciertas modalidades, se proporciona la producción de una línea celular de hibridoma que produce anticuerpos específicos para HGF. En ciertas modalidades, los anticuerpos completamente humanos son producidos por la expresión de ADN recombinante en células anfitrionas o por la expresión de células de hibridoma. En ciertas modalidades, los anticuerpos son producidos usando la técnica de presentación de fago descrita anteriormente. En ciertas modalidades, los anticuerpos completamente humanos son producidos exponiendo los esplenocitos humanos (células B o T) a un antígeno in vitro, reconstituyendo entonces las células expuestas en un ratón inmunocomprometido, por ejemplo SCID o nod/SCID. Véase, por ejemplo en Brams et al.., J. Iwmnol, 160:2051-2058 (1998); Carballido et al., Nat Med, 6:103-106 (2000). En ciertos de esos métodos, el injerto de tejido humano fetal en los ratones SCID (SCID-hu) da como resultado una hematopoyesis y desarrollo de células T humanas. Véase, por ejemplo McCune et al., Science 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem Imm nol 8:243-248 (1996). En ciertos casos, la respuesta i.nmune___humo_ral en esos ratones quiméricos depende del codesarrollo de células T humanas en los animales. Véase, por ejemplo, Martensson et al., Jmmunol 83:1271-179 (1994). En ciertos métodos son transplantados linfocitos de sangre periférica humana en ratones SCID. Véase por ejemplo Mosier et al .Nature 335:256-259 (1988) . En ciertas de esas modalidades, cuando esas células transplantadas son tratadas con un agente cebador, como la Enterotoxina Estafilocóccica A (SEA) , o con anticuerpos monoclonales CD40 antihumano, se detectan mayores niveles de producción de células B. Véase, por ejemplo, Martensson et al., Immunol 84:224-230 (1995); Murphy et al., Blood 86:1946-1953 (1995) En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son producidos por al menos uno de los siguientes hibridomas: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 y 3.10.1. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica se unen al HGF con una KD de 10"8, 10"9, o 10"10M. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica se unen a la HGF con una constante de disociación (KD) de entre aproximadamente 0.099 y 0.79 nM de acuerdo a lo medido por el método cinético (Figura 6A) . En ciertas modalidades, los agentes de unión específica se unen al HGF con una KD de menos de 10 pM hasta aproximadamente 54 M, de acuerdo a lo medido por el método de equilibrio/solución (Figura 6B) . En ciertas, modalidades, los agentes de unión específica comprenden una molécula de inmunoglobulina de al menos uno de los isotipos IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgE, IgA, IgD, y IgM. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica comprenden una cadena ligera kappa y/o una cadena pesada humana. En ciertas modalidades, la cadena pesada es uno de ios isotipos IgGl, IgG2, lgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, o IgM. En ciertas modalidades específicas, los agentes de unión específica han sido clonados para su expresión en células de mamífero. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica comprenden una región constante diferente a cualquiera de las regiones constantes de los isotipos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, o IgM. En ciertas modalidades, los agentes de. unión específica comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgGl humana. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG2 humana. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG3 , IgG4, IgE, IgA, IgD o IgM humana. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica comprenden regiones variables de anticuerpos ligadas a una región constante que no es la región constante para el isotipo IgGl, y en la región constante para el isotipo IgG2. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica han__ sido clonados para la expresión en células de mamífero. En ciertas modalidades, las modificaciones conservativas a las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de al menos una de las líneas de hibridoma: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1 (y correspondientes a las modificaciones a los nucleótidos codificantes) producirá anticuerpos para HGF que tienen características químicas y funcionales similares a aquellas de los anticuerpos de las líneas de hibridomas: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1. En contraste, en ciertas modalidades, pueden ser logradas modificaciones sustanciales y las características funcionales y/o químicas de anticuerpos para HGF seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácido sobre las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente de su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal (b) de la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco, o (c) el volumen de la cadena lateral.
Por ejemplo una "sustitución conservativa de aminoácidos" puede implicar una sustitución de un aminoácido residual nativo con un residuo no nativo puesto que existe poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del aminoácido re_sidual en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede ser sustituido con alanina, como ha sido descrito anteriormente para la ¦"mutagénesis de exploración de alanina" . Las sustituciones de aminoácido deseadas (ya sea conservativas o no) pueden ser determinadas por aquellos expertos en la técnica en el momento que se deseen esas sustituciones. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido pueden ser usadas para identificar residuos importantes de anticuerpos para HGF, o para incrementa o hacer disminuir la. afinidad de los anticuerpos HGF descritos aquí . En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden ser expresados en lineas celulares diferentes a las líneas celulares de hibridoma. En ciertas modalidades, las secuencias que codifican para anticuerpos particulares pueden ser usadas para la transformación de una célula anfitriona de mamífero adecuada. De acuerdo a ciertas modalidades, la transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona> incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleó ido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula anfitriona con el virus (o vector) o por procedimientos de transíección conocidos en la técnica, como los ejemplificados por las patentes Estadounidenses Nos. {las cuales son incorporadas aquí como referencia para cualquier propósito) . En ciertas modalidades, el procedimiento de transformación usado puede depender del anfitrión a ser transformado. Los métodos para la introducción de polinucleótidos eterológos en las células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Las líneas celulares de mamífero disponibles como anfitrionas para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de Hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , y un número de otras líneas celulares. En ciertas modalidades, las líneas celulares pueden ser seleccionadas a través de la determinación de cuales líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión de HGF constitutivas. Los vectores de expresión apropiados para las células anfitrionas de mamífero son bien conocidos. En ciertas modalidades, los agentes de unión específica comprenden uno o más polipéptidos . En ciertas modalidades, puede ser utilizada cualquiera de una variedad de sistemas de vectores/anfitriones de expresión para expresar las moléculas polinucleotídicas que codifican para polipéptidos. Esos sistemas incluyen, pero no limitan a microorganismos, como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, plasmidos, o vectores de expresión de ADN cosmídico; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células- de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) sistemas de células de plantas tranfectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacteriano (por ejemplo, Ti o plásmido pBR.322) ; o sistemas de células de animales . En ciertas modalidades, un polipéptido es expresado de manera recombinante en levadura. Ciertas de esas modalidades usan sistemas de expresión comercialmente disponibles, por ejemplo, el Sistema de Expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. En ciertas modalidades, ese sistema depende de la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción. En ciertas modalidades,_las transcripción del inserto es dirigida por el promotor de alcohol oxidasa (A0X1) para la inducción por metanol.. - En ciertas modalidades, un polipéptido secretado es purificado del medio de crecimiento.de levaduras. En ciertas modalidades, los métodos utilizados para purificar un polipéptido del medio de crecimiento de levadura es el mismo que aquel usado para purificar el polipéptido de sobrenadantes de células bacterianas y de mamífero. En ciertas modalidades, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido es clonado en un vector de expresión de baculovirus, como el pVL1393 (PharMingen, San Diego CA) . En ciertas modalidades, ese vector puede ser usado de acuerdo a las instrucciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio libre de proteína sF9. y para producir polipéptido recombinante. En ciertas modalidades, un polipéptido es concentrado y purificado de ese medio usando una columna de heparina-Sepharosa (Pharmacia) . En ciertas modalidades, un polipéptido es expresado en un sistema de insecto. Ciertos sistemas de insecto para la expresión de polipéptidos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En uno de esos sistemas, se usa el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes externos en c_élulas _de Spodgptera_ frugiperda o_en larvas de Trichoplusia. En ciertas modalidades, puede ser insertada una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido o en un gen no esencial del virus, por ejemplo, dentro del gen de la poliedrina, y colocado bajo el control del promotor para ese gen. En ciertas modalidades, la inserción exitosa de una molécula de ácido nucleico volverá al gen no esencial inactivo. En ciertas modalidades, esa inactivación da como resultado una característica detectable. Por ejemplo, l inactivación del gen de la poliedrina da como resultado la producción de un virus que. carece de proteína de recubrimiento. En ciertas modalidades, pueden ser usados virus recombinantes- para infectar células de S. Frugiperda o larvas de Trichoplusia. Véase por ejemplo, Smith- et al J". Virol 46:584 (1983); Engelhard et al., Proc Nat Acad Sci (USA) 91:3224-7 (1994) . En ciertas modalidades, los polipéptidos producidos en células bacterianas son producidos como cuerpos de inclusión insoluble en las bacterias. En ciertas modalidades, las células anfitrionas que comprenden esos cuerpos de inclusión son recolectadas por centrifugación; lavadas en NaCl 0.15 M, Tris 10 mM, pH 8.1, EDTA 1 mM; y tratadas con 0.1 mg/ml de lisozima (Sigma, S . Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente. En ciertas modalidades, el lisado es clarificado por sonicación, y los restos celulares sedimentados por centrifugación durante 10 minutos a 12,000 X g. En ciertas modalidades, el sedimento que contiene el polipéptido es resuspendido en Tris 50 mM, pH 8, y EDTA 10 mM; colocadas sobre glicerol al 50%; y centrifugadas durante 30 minutos a 6000 X g. En ciertas modalidades, ese sedimento puede ser resuspendido en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) libre de Mg++ y Ca++. En ciertas modalidades, el polipéptido es purificado adicionalmente fraccionando el sedimento resuspendido en un gel de poliacrilamida SDS desnaturalizado (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra) . En ciertas modalidades, ese gel puede ser sumergido en KCl 0.4 M para visualizar la proteína, la cual puede ser escindida y electroeluida en amortiguador que corra en el gel y que carezca de SDS. De acuerdo a ciertas modalidades, es producida una proteína de fusión Glutation-S-Transferasa (GST) en bacterias como una proteína soluble. En ciertas modalidades, esa proteína de fusión GST es purificada usando un Módulo de Purificación GST (Pharmacia) . En ciertas modalidades, es deseable "replegar" ciertos polipéptidos . En ciertas modalidades, esos polipéptidos son producidos usando ciertos sistemas recombinantes discutidos aquí. En ciertas modalidades, los polipéptidos son "replegados" y/o oxidados para formar la estructura terciaría deseada y/o generar enlaces disulfuro. En ciertas modalidades, esa estructura _y/o enlaces están relacionados con cierta actividad biológica del polipéptido. En ciertas modalidades, el repliegue es logrado usando cualquiera de un número de procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a la exposición del agente polipeptídico solübilizado a un pH típicamente superior a 7 en presencia de un agente caotropico. Un agente caotropico ejemplar es la guanidina. En ciertas modalidades, la solución de repliegue/oxidación también contiene Un agente reductor y la forma oxidada de ese agente reductor. En ciertas modalidades, el agente reductor y su forma oxidada están presentes en una relación que generará un potencial redox particular que permite que ocurra el entremezclado de puentes disulfuro. En ciertas modalidades, ese entremezclado permite la formación de puentes de cisteína. Los pares redox ejemplar, incluyen pero no se limitan a ' cisteína/cistamina, glutation/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (b E) /ditio-bME . En ciertas modalidades, es usado un cosolvente para incrementar la eficiencia del repliegue. Los cosolventes ejemplares, incluyen pero no se limitan a glicerol, polietileno, glicol de varios pesos moleculares y arginina.
En ciertas modalidades, se purifica sustancialmente un polipéptido. Ciertas técnicas de purificación de proteína son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. En ciertas modalidades, la purificación de proteína implica la fraccionación en crudo de fracciones de _pqlipéptido de fracciones no polipeptídicas . En ciertas modalidades, los polipéptidos son purificados usando técnicas cromatográficas y/o electroforéticas. Los métodos de purificación ejemplares incluyen pero no se limitan a precipitación son sulfato de amonio; precipitación con PEG; inmunoprecipitación; desnaturalización por calor seguida por centrifugación; cromatografía, incluyendo, pero sin limitarse a cromatografía de afinidad (por ejemplo Proteína-A-Sefarosa) , cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión y cromatografía en fase inversa; filtración en gel; cromatografía con hidroxiapatita; enfoque isoeléctrico; electroforesis sobre gel de poliacrilamida; y "combinaciones de esas y otras técnicas. En ciertas modalidades, un polipéptido es purificado por cromatografía de líquidos de proteína rápida o por cromatografía de líquidos de alta presión (CLAP) . En ciertas modalidades, los pasos de purificación pueden ser cambiados o ciertos pasos pueden ser omitidos y aún dar como resultado un método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado. En ciertas modalidades, se cuantifica el grado de purificación de una preparación polipeptídica. Ciertos métodos para cuantificar el grado de purificación son conocidos por aquellos expertos' en la técnica. Ciertos métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, determinación de la activación de unión específica de la preparación evaluación^ de la cantidad de un polipéptido dentro de una preparación por análisis con SDS/PAGE. Ciertos métodos ejemplares para evaluar la cantidad de purificación de una preparación polipeptidica comprende calcular la actividad de unión de una preparación y comparar esta con la actividad de unión de un extracto inicial. En ciertas modalidades, los resultados de ese cálculo son expresados como "la purificación doble" . Las unidades usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependen del ensayo particular efectuado. En ciertas modalidades, un polipéptido es parcialmente purificado. En ciertas modalidades, puede ser efectuada una purificación parcial usando menos pasos de purificación o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una cromatografía en columna de intercambio catiónico efectuada usando un aparato de CLAP generalmente dará como resultado una "purificación doble" que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. En ciertas modalidades, los métodos que dan como resultado un menor grado de purificación pueden tener ventajas en la recuperación total del polipéptido, o en el mantenimiento de la actividad de unión de un polipéptido . En ciertos casos, la migración electroforét ica de un polipéptido puede variar, algunas veces de manera significativa, con diferentes condiciones de SDS/PAGE. Véase, por ejemplo, Capaldi et al., Biochem Biophys/Res Comía, 76:425(1977). Se apreciará que bajo diferentes condiciones de electroforesis, el peso molecular aparente del polipéptido purificado o parcialmente purificado puede ser diferente. Ciertos Epítopes Ejemplares En ciertas modalidades, se proporcionan epítopes a los cuales se unen anticuerpos' anti-HGF (véase por ejemplo, el Ejemplo 8, Figuras 10 y 11, y las SEQ ID NO. 164 y 165) . En ciertas modalidades, puede ser utilizado un epítope de HGF para evitar la unión de un anticuerpo anti-HGF o el agente de unión específica al HGF. En ciertas modalidades puede ser utilizado un epítope de- HGF para hacer disminuir la unión de un anticuerpo anti-HGF o el agente de unión específica al HGF. En ciertas modalidades, puede ser utilizado un epítope de HGF para inhibir sustancialmente la unión de un anticuerpo anti-HGF o el agente de unión específica al HGF. Un epítope inhibe sustancialmente la unión de un anticuerpo anti-HGF o el agente de unión específica al HGF cuando un exceso de epítope reduce la cantidad de un anticuerpo anti-HGF o el agente de unión específica unido al HGF en al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, o más. En ciertas modalidades puede ser utilizado un epítope de HGF para unirse a__un _anticuerpo anti-HGF o agente de unión específica. En ciertas modalidades, puede ser utilizado un epítope de HGF para identificar anticuerpos o agentes de' unión específica que se unan al HGF. En ciertas modalidades, .puede ser utilizado un epítope de HGF para aislar anticuerpos o agentes de unión específica que se unen al HGF. En ciertas modalidades, puede ser utilizado un epítope de HGF para generar anticuerpos o agentes de unión específica que se unan al HGF. En ciertas modalidades, puede ser utilizado un epítope de HGF como inmunógeno para generar anticuerpos o agentes de unión específica que se unan al HGF. En ciertas modalidades, puede ser administrado un epítope de HGF a un animal, los anticuerpos que se unen al HGF pueden ser obtenidos posteriormente del animal. En ciertas modalidades puede ser utilizado un epítope de HGF para interferir con la señalización normal de HGF-Met. Ciertos Usos Terapéuticos En. ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar un cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión específica al HGF. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión específica al HGF y otro agente terapéutico. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la malaria que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión específica al HGF. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la malaria que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión específica al HGF y otro agente terapéutico . En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la retinopatía diabética proliferativa que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión específica al HGF. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la retinopatía diabética proliferativa que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de unión específica al HGF y otro agente terapéutico. En ciertas modalidades, uh agente de unión específica al HGF es administrado solo. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es administrado antes de la administración de al menos otro agente terapéutico. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es administrado concurrentemente con la administración de al menos otro agente terapéutico. En ciertas modalidades, un agente de unión especifica al HGF es administrado después de la administración de al menos otro agente terapéutico. Los. agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, al menos otro agente para la terapia del cáncer. Los agentes para la terapia del cáncer incluyen, pero no se limitan a, terapias de radiación y quimioterapias. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas en una terapia combinada, es decir, combinadas con otros agentes. En ciertas modalidades, la terapia combinada comprende un agente de unión específica capaz de unirse al HGF, en combinación con al menos un agente an iangiogénico . Los agentes incluyen, pero no se limitan a, composiciones químicas preparadas sintéticamente in vitro, anticuerpos, regiones de unión de antígeno, radionúclidos y combinaciones y conjugados de los mismos. En ciertas modalidades, el agente puede actuar como un agonista, antagonista y modulador alostérico o toxina. En ciertas modalidades, el agente puede actuar para inhibir o estimular a su blanco (por ejemplo, activación o inhibición del receptor o enzima) y por lo tanto promover la muerte celular o contrarrestar el crecimiento celular.
Los tratamientos con quimioterapia incluyen, pero no se limitan a agentes antineoplásicos incluyendo pero sin limitarse a, agentes alquilantes incluyendo: mostazas nitrogenadas, como la mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan _ cloranbucilo; nitrqsoureas, como la carmustina (BCNU) , lomustina (CCÑU) , y semustina (metil-CCNU) ; Temodal"11 (temozolamida) , etileniminas/metilmelamina como la trietilenmelamina (TEM) , trietileno, tiofosforamida (tiotepa) , hexametilmelamina (HMM, altreta ina) ; sulfonatos de alquilo como el busulfan; triacinas como la dacarbacina (DTIC) ; antimetabolitos incluyendo los análogos del ácido fólico como él metotrexato y trimetrexato, análogos de pirimidina como el 5-fluorouracilo (5FU) , fluorodesoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinósido (AraC, citarabina) , 5-azacitidina, 2 , 2J -difluorodesoxicitidina, análogos de purina como la 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2 ' -desoxicoformicina (pentostatina) , eritrohidroxinoniladenina (EH A) , fosfato de fludarabina, y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA) ; productos naturales incluyendo fármacos antimitóticos como el paclitaxel, alcaloides de vinca incluyendo la vinblastina (VLB) , vincristina, y vinorelbina, taxotero, estramustina, y fosfato de estramustina; pipodofilotoxinas como el etopósido y tenipósido; antibióticos como la actimomicina D, daunomicina (rubidomicina) , doxorrubicana, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) , mitomicina C, y actinomicina; enzimas como la L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica como el interferón alpha, IL-2, G-CSF y GM-CSF; agentes misceláneos incluyendo complejos de coordinación de platino como el cisplatino y carboplatino, antracendionas como la mitoxantrona, urea sustituida como la hidroxiurea, derivados de metilhidracina incluyendo la N-metilhidracina (MIH) y procarbacina, supresores adrenocorticales como el mitotano (?,?'-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas incluyendo antagonistas adrenocorticosteroideos como la prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; Gemzarm (gemcitabina) , progestina como el caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol ; estrógenos como el dietilestilbestrol y equivalentes del etinil estradiol; antiestrógenos como el tamoxifeno; andrógenos incluyendo el propionato de testosterona y fluoxitnesterona/equivalentes ; antiandrógenos como la flutamida, análogo de la hormona liberadora de la gonadotropina y leuprolida; y antiandrógenos no esteroideos, como la flutamida. Las terapias para el cáncer, las cuales pueden ser administradas con un agente de unión específica al HGF, también incluyen, pero no se limitan a, terapias dirigidas. Los ejemplos de terapias dirigidas incluyen, pero no se limitan a, uso de anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos terápéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de ratón, quiméricos de ratón-humano, injertados con CDR, humanizados y completamente humanos, y anticuerpos sintéticos, incluyendo pero sin limitarse a aquéllos seleccionados por la separación de bibliotecas de anticuerpos. Los anticuerpos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquéllos los cuales se unen a proteínas de la superficie celular Her2 , CDC20, CDC33, glicoproteína similar a la mucina y receptor del factor del crecimiento epidérnrico (EGFR) presente sobre células tumorales, y opcionalmente inducen un efecto citostático y/o citotóxico sobre células tumorales que presentan esas proteínas. Los anticuerpos ejemplares también incluyen al HERCEPTIN14 (trastuzumab) , los cuales pueden ser usados para tratar el cáncer de mama- y otras formas de cáncer, y el RITUXA *111 (rituximab) , ZEVALIN14* (ibritumomab tiuxetan) , GLEEVECMR, y LYMPHOCIDE"11
(epratuzumab) , los cuales pueden ser usados para tratar linfornas no Hodgkin . y otras formas de- cáncer. Ciertos anticuerpos ejemplares también incluyen ERBITUX1^ (I C-C225) ; ertinolib (Iressa) ; BEXXAR" (yodo 131 tositumomab) ; inhibidores de DR (receptor del dominio de cinasa) ; anticuerpos anti VEGF y antagonistas (por ejemplo, Avastin™ y VEGAF-TRAP) ; anticuerpos receptor de anti VEGF y regiones de unión de antígeno; anticuerpos anti-Ang-1 y Ang-2 y regiones de unión de antígeno; anticuerpos para Tie-2 y otros receptores Ang-1 y Ang-2; ligandos de Tie-2; anticuerpos contra inhibidores de cinasa de Tie-2; y Campath!9 (Aleratuzumab) . En ciertas modalidades, los agentes para la terapia del cáncer son polipéptidos los cuales inducen selectivamente apoptosis en células tumorales, incluyendo, pero sin limitarse a, el polipéptido relacionado con el TNF TRAIL. En ciertas modalidades, los agentes para la terapia del cáncer son agentes antiangiogénicos los cuales hacen disminuir la angiogénesis . Ciertos de esos agentes incluyen, pero no se limitan a, IL-8; Campath, B-FGF; antagonistas de FGF; antagonistas de Tek (Cerretti et al., Publicación Estadounidense No. 2003/0162712; Cerretti et al., Patente Estadounidense No. 6,413, 932, y Cerretti et al., Patente Estadounidense No. 6,521, 424, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia para cualquier propósito) ; agentes anti-TWEAK (los cuales incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y regiones de unión de antígeno) ; antagonistas del receptor de TWEAK soluble (Wiley, Patente Estadounidense No. 6,727, 225); y dominio de desintegrina de ' ADAM para antagonizar la unión de la integrina a sus ligandos (Fanslow et al., Publicación Estadounidense No. 2002/0042368); receptor anti-eph y anticuerpos anti-efrina; regiones de unión de antígeno, o antagonistas (Patentes Estadounidenses Nos. 5,981,245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447;
6,057,124 y miembros de la familia de patentes de las mismas) ; agentes anti-VEGF (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión de antigeno que se unen específicamente al VEGF, o receptores de VEGF solubles o una región de unión del ligando de los mismos) como Avastinm o VEGF-TRAP™* y agentes anti-receptor de VEGF (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión de antígeno que se. unen específicamente a estos) , agentes inhibidores de EGFR (por ejemplo,- anticuerpos o regiones de unión de antígeno que se unen específicamente a estos) como panitumumab, IRESSA™* (gefitinib) , TARCEVA"11 (erlotinib) , agentes anti-Ang-1 y anti-Ang-2 (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión de antígeno que se unen específicamente a estos o a sus receptores, por ejemplo, Tie-2/TE ) , y agentes inhibidores de anti-cinasa de Tie-2 (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión de antígeno que se unen específicamente e inhiben la actividad de los factores del crecimiento, como antagonistas del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF, también conocido como Factor de Propagación) , y anticuerpos o regiones de unión de antígeno que se unen específicamente a su receptor "c-met"; antagonistas anti-PDGF-BB; anticuerpos y regiones de unión de antígeno para ligandos de PDGF-BB; e inhibidores de cinasa de PDGFR. En ciertas modalidades, los agentes para la terapia del cáncer son inhibidores de la angiogénesis . Ciertos de esos inhibidores incluyen, pero no se limitan a, SD-7784 (Pfizer, USA) ; cilengitide (Merck KGaA, Alemania, EPO 770622) ; pegaptanib octasódico, (Gilead Sciences, EUA) ; Alfastatina, (BioActa, RU) ; M-PGA, (Celgene, EUA, US 5712291) ; ilomastat, (Arriva, EUA, US 5892112) ; semaxanib,
(Pfizer,_ EUA, US 5792783); vatalanib, (Novartis, Suiza); 2-metoxiestradiol, (EntreMed, EUA); TLC ELL-12, (Elan, Irlanda) ; acetato de anecortave, (Alcon, EUA) ; AcM alfa-D148,
(Amgen, EUA); CEP-7055, (Cephalon, EUA); AcM anti-Vn,
(Crucell, Holanda) DAC : antiangiogénico, (ConjuChem, Canadá) ; Angiocidina, (InKine Pharmaceutical , EUA) ; KM- 2550, (Kyo a Hakko, Japón); SU-0879, (Pfizer, EUA); CGP-79787, (Novartis, Suiza, EP 970070) ; tecnología de ARGEN , (Ariad, EUA) ; YIGSR-Stealth, (Johnson & Johnson, EUA) ; fragmento de fibrinógeno E, (BioActa, RU) ; inhibidor de la angiogénesis, (Trigen, RU) ; TBC-1635, (Encysive Pharmaceuticals, EUA) ; SC-236, (Pfizer, EUA); ABT-567, (Abbott, EUA); Metastatina, (EntreMed, EUA); inhibidor de la angiogénesis, (Tripep, Suecia) ; maspina,
(Sosei, Japón) ; 2-metoxiestradiol, (Oncology Sciences Corporation, EUA); ER-68203-00, (IVAX, EUA); Benefina, (Lañe Labs, EUA); Tz-93, (Tsumura, Japón); TAN-1120, (Takeda, Japón); FR-111142, (Fujisawa, Japón, JP 02233610); factor plaquetario 4, (RepliGen, EUA, EP 407122); antagonista del factor del crecimiento endotelial vascular, (Borean, Dinamarca) ; terapia del cáncer, (University of South Carolina, EUA); bevacizumab (pINN) , (Genentech, EUA);
inhibidores de la angiogénesis, (SUGEN, EUA); XL 784, (Exelixis, EUA); XL 647, (Exelixis, EUA); AcM, alfa5beta3 integrina, segunda generación, (Applied Molecular Evolution, EUA y Medimmune, EUA) ; terapia genética, retinopatía, (Oxford BioMedica,_ RU) ; clorhidrato de enzastaurina (USAN) , (Lilly, EUA); CEP 7055, (Cephalon, EUA y Sanofi-Synthelabo, Francia); BC 1, (Genoa Institute of Cáncer Research, Italia) ; inhibidor de la angiogénesis, (Alchemia, Australia); antagonista de VEGF, (Regeneron, EUA) ; rBPI 21 y BPI derivado antiangiogénico, (XOMA, EUA); PI 88, (Progen, Australia); cilengitide (pINN) , (Merck KGaA, Alemania; Munich Technical University, Alemania, Scripps Clinic and Research Foundation, EUA); cetuximab (INN) , (Aventis, Francia); AVE 8062, (Ajinomoto, Japón) ; AS 1404, (Cáncer Research Laboratory, Nueva Zelanda); SG 292, (Telios, EUA); Endostatina, (Boston Children Hospital, EUA); ATN 161, (Attenuon, EUA) ; ANGIOSTATIN, (Boston Children Hospital, EUA); 2-metoxiestradiol , (Boston Children Hospital, EUA) ; ZD 6474, (AstraZeneca, RU) ; ZD 6126, (Angiogene Pharmaceuticals, RU) ; PPI 2458, (Praecis, EUA); AZD 9935, (AstraZeneca, RU) ; AZD 2171, (AstraZeneca, RU) ; vatalanib (pINN) , (Novartis, Suiza and Schering AG, Alemania) ; inhibidores de la vía del factor tisular, (EntreMed, EUA) ; pegaptanib (Pinn) , (Gilead Sciences, EUA) ; xantorrizol, (Yonsei University, Corea del Sur); vacuna, basadas en genes , VEGF-2, (Scripps Clinic and Research Foundation, EUA) ; SPV5.2, (Supratek, Canadá); SDX
103, (University of California at San Diego, EUA) ; PX 478, (ProIX, EUA); METASTATIN, (EntreMed, EUA); troponina I, (Harvard University, EUA); SU 6668, (SUGEN, EUA); OXI 4503, (OXiGENE, EUA) ; o-guanidinas, (Dimensional Pharmaceuticals,
EUA) ; motuporamina C, (British Columbia University, Canadá) ;
CDP 791, (Celltech Group, RU) ; atiprimod (pINN) , (GlaxoSmith line, RU) ; E 7820, (Eisai, Japón); CYC 381, (Harvard University, EUA) ; AE 941, (Aeterna, Canadá) ; vacuna, angiogénesis , (EntreMed, EUA) ; inhibidor del activador de plasminógeno de urocinasa, (Dendreon, EUA) ; oglufanida (pINN) , (Melraotte, EUA) ; inhibidores de HIF-lalfa, (Xenova,
RU) ; CEP 5214, (Cephalon, EUA); BAY RES 2622, (Bayer,
Alemania) ; Angiocidin, (InKine, EUA) ; A6, (Angstrom, EUA) ; KR 31372, (Korea Research Institute of Chemical Technology,
Corea del Sur); GW 2286, (GlaxoSmithKline, RU) ; EHT 0101, (ExonHit, Francia); CP 868596, (Pfizer, EUA); CP 564959, (OSI, EUA); CP 547632, (Pfizer, EUA); 786034, (GlaxoSmithKline, RU) ; KR 633, (Kirin Brewery, Japón) ; sistema de liberación de fármacos, intraocular, 2-metoxiestradiol , (EntreMed, EUA) ; anginex, (Maastricht
University, Holanda, y Minnesota University, EUA) ; ABT 510, (Abbott, EUA); AAL 993, (Novartis, Suiza); VEGI, (ProteomTech, EUA) ; inhibidores del factor alfa de la necrosis tumoral, (National Institute on Aging, EUA); SU 11248, (Pfizer, EUA y SUGEN EUA) ; ABT 518, (Abbott, EUA) ; YH16, (Yantai Rongchang, China) ; S-3APG, (Boston Children Hospital, EUA y EntreMed, EUA); AcM, KDR, (ImClone Systems, EUA) ; AcM, alfaSbetal, (Protein Design, EUA) ; inhibidor de KDR cinasa, (Celltech Group, . RU, y Johnson & Johnson, EUA) ; GFB 116, (South Florida University, EUA y Yale University, EUA); CS 706, (Sankyo, Japón); profármaco combretastatina A4, (Arizona State University, EUA) ; condroitinasa AC, (IBEX, Canadá); BAY RES 2690, (Bayer, Alemania); AGM 1470, (Harvard University, EUA, Takeda, Japón, y TAP, EUA) ; AG 13925, (Agouron, EUA) ; Tetratiomolibdato, (University of Michigan, EUA) ; GCS 100, (Wayne State University, EUA) CV 247, (Ivy Medical, RU) ; CKD 732, (Chong Kun Dang, Corea del Sur); AcM, factor del crecimiento del endotelio vascular, (Xenova, RU) ; irsogladina (INN) , (Nippon Shinyaku, Japón); RG 13577, (Aventis, Francia) ; WX 360, (Wilex, Alemania) ; esqualamina (pINN) , (Genaera, EUA) ; RPI 4610, (Sima, EUA); terapia del cáncer, (Marinova, Australia) ; inhibidores de heparanasa, (InSight, Israel); KL 3106, (Kolon, Corea del Sur); Honokiol, (Emory University, EUA) ; ZK CDK, (Schering AG, Alemania) ; ZK Angio, (Schering AG, Alemania) ; ZK 229561, (Novartis, Suiza, y Schering AG, Alemania); XMP 300, (XOMA, EUA); VGA 1102, (Taisho, Japón) ; moduladores del receptor de VEGF, (Pharmacopeia, EUA); antagonistas de VE-caderina-2 , (ImClone Systems, EUA).; Vasostatina, (National Institutes of Health, EUA) ; vacuna, Plk-1, (ImClone Systems, EUA) ; Z 93, (Tsumura, Japón); TumStatin, (Beth Israel Hospital, EUA) ; FLT 1 soluble truncado (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1), (Merck & Co, EUA); ligandos de Tie-2, (Regeneron, EUA) ; inhibidor de trombospondina 1, (Allegheny Health, Education and Research Foundation, EUA) ; 2-bencensulfonamida, 4- (5- (4-clorofenil) -3- (trifluorometil) -1 H-pirazol-l-il) - ; Arriva; y C-Met. AVE 8062 (monoclorhidrato de (2S) -2-amino-3-hidroxi-N- [2-metoxi-5- [ (1Z) -2- (3,4,5-trimetoxifenil) etenilj henil]propanamida) ; metelimumab (pINN) (immunoglobulina G4, anti- (factor del crecimiento de transformación humano, beta.l (CAT 192 monoclonal humano, gamma. 4-cadenas)), disulfuro con CAT 192 monoclonal humano, kappa. -cadena dimérica) ; ligando de Flt3; ligando de CD40; interleucina-2 ; interleucina-12 ; ligando de 4-1 BB; anticuerpos anti-4-1 BB; antagonistas de TNF y antagonistas del receptor de TNF incluyendo TNFR/Fc, antagonistas de TWEAK y antagonistas de TWEAK-R incluyendo TWEAK-R/Fe; TRAIL; antagonistas de VEGF incluyendo anticuerpos anti-VEGF; antagonistas de receptor de VEGF (incluyendo VEGF-R1 y VEGF-R2, también conocidos como Fltl y Flkl o KDR) ; CD148 (también referido como DEP-1, ECRTP, y PTPRJ, véase Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2135-45 (1999), incorporadas por lo tanto aquí como referencia para cualquier propósito) agonistas; inhibidor de thrombospondina 1, e inhibidores de uno o ambos de Tie-2 o ligandos de Tie-2 (como el Ang-2) . Un número de inhibidores de Ang-2 son conocidos en la técnica, incluyendo los anticuerpos anti-Ang-2 descritos en la solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 20030124129 (correspondiente a la Solicitud PCT No. W003/030833) , y la Patente Estadounidense No. 6,156,185, el contenido de las cuales se incorpora por lo tanto aquí como referencia en su totalidad. Adicionalmente, también son conocidos en la técnica péptidocuerpos de Ang-2, y pueden encontrarse, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 20030229023 (correspondiente a la Solicitud PCT No. W003/057134) , y la Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 20030236193, el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Ciertos agentes para la terapia de cáncer incluyen, pero no se limitan a: talidomida y análogos de talidomida (N- (2, 6-dioxo-3-piperidil) ftalimida) ; tecogalan sódico (peptido glican de polisacárido sulfatado) ; TAN 1120 (8-acetil-7,8,9, 10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-l-metoxi-10- [ [octahidro -5-hidroxi-2- (2-hidroxipropil) -4, 10-dimetilpirano [3,4-d] -1, 3 , 6-dioxazocin-8-il] oxi] -5 , 12-naftacendiona) ; suradista (sal tetrasódica del ácido 7 , 7 ' - [carbonilbis [imino (1-metil-lH-pirrol-4 , 2-diil) carbonilimino (1-metil-lH-pirrol-4 , 2-diil) carbonilimino] ] bis-1, 3-naftalendisulfónico) ; SU 302; SU 301; SU 1498 ( (E) -2-ciano-3- [4-hidroxi-3 , 5-bis (1-metiletil) fenil] -N-(3-fenilpropil) -2 -propenamida) ; SU 1433 (4- (6 , 7-dimetil-2-quinoxalinil) -1, 2 -bencendiol) ; ST 1514;· SR 25989; Tie-2 soluble; derivados de SERM, Pharmos; semaxanib (pI ) (3-[ (3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-il) metilen] -1, 3-dihidro-2H-indol-2-one); S JB36; RG 8803^ RESTIN; _R 440 (3- (l-metil-lH-indol-3-il) -4- (l-metil-6-nitro-lH-indol-3-il) -lH-pirrol-2, 5-diona) ; R 123942 (1- [6- (1 , 2 , 4-tiadiazol-5-il) -3-piridacinil] -N- [3- (trifluorometil) fenil] -4 -piperidinamina) ; inhibidor de la prolilhidroxilasa; genes de progresión elevada; prinomastat (INN) (ácido (S) -2,2-dimetil-4- [ tp- (4-piridiloxi) fenil] sulfonil] -3-tiomorfolincarbohidroxámico) ; NV 1030; M 3 (ácido 8-hidroxi-6-metoxi-alfa-metil-l-oxo-lH-2 -benzopiran-3 -acético); NF 681; NF 050; 1G; MET 2; MET 1; manasantina B (alfa- [1- [4- [5- [4- [2- (3 , 4-dimetoxifenil) 2-hidroxi-l-metileto-xi] -3-metoxifenil] tetrahidro-3 ,4-dimetil-2-furanil] -2-metoxi fenoxi] etil] -1, 3-benzodioxol-5-raetanol) anticuerpo monoclonal KDR; anticuerpo monoclonal de alfa5beta3 integrina; LY 290293 (2-amino-4- (3 -piridinil) -4H-nafto [1 , 2-b]piran-3-carbonitrilo) ; KP 0201448; KM 2550; péptidos específicos de integrina; INGN 401; GYKI 66475; GYKI 66462; greenstatina (plasminógeno 101-354 (humano)); terapia génica para la artritis reumatoide, cáncer de próstata, cáncer de ovario, glioma, endostatina, cáncer colorrectal, ATFBTPI, genes antiangio-génesis, inhibidor de la angiogénesis, o angiogénesis ; inhibidor de gelatinasa, FR 111142 5-metoxi-4- [2-metil-3- (3-metil-2-butenil) oxiranil] -1-oxaespiro [2.5] oct-6-il éster del ácido 4 , 5~dihidroxi-2-hexenoico; forfenimex (pINN) ácido (S) -alfa-amino-3-hidroxi-4 (hidroximetil) bencenacetico) antagonista de fibronectina (l-acetil-L-prolil-L-histidil-L-seril-L-cisteinil-L-aspartamida) ; inhibidor del receptor de factor del crecimiento de los fibroblastos; antagonista del factor del crecimiento de los fibroblastos; FCE 27164 (sal hexasódica del ácido 7, 7 '- [carbonilbis limino (1-metil-lH-pirrol-4, 2-diil) carbonilimino (l-metil-lH-pirrol-4, 2-diil) car bonilimino] ] bis-1 , 3 , 5-naftalentrisulfónico) ; FCE 26752 ácido (8,8'- [carbonilbis [imino (l-metil-lH-pirrol- , 2-diil) carbonil imino (l-metil-lH-pirrol-4 , 2-diil) carbonilimino] ] bis-1, 3 , 6-naftalentrisulfónico) ; polipéptido activador de los monocitos endoteliales II; oligonucleótido antisentido de VEGFR; factores antiangiogénico y trófico; agente angioiestático ANCHOR; endostatina; proteína angiogénica Del-1; CT 3577; contortrostatina; CM 101; condroitinasa AC; CDP 845; CanStatina; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1000; ARRESTIN; apomigren (colágeno 1304-1388-tipo XV (precursor de la cadena alfal de gen humano COL15A1) ) ; angioinhibina; aaATIII; A 36; acetato de 9 alfa-fluoromedroxiprogesterona ( (6-alfa) -17- (acetiloxi) -9-fluoro-6-metil-pregn-4-en-3 , 20-diona) ; ácido 2-metil-2-f alimidino-glutárico (2- (1, 3-dihidro -l~oxo-2H-isoindol-2-il) -2-metilpentandioico) anticuerpo mono clonal marcado con Yttrium 90 BC-1; Semaxanib (3- (4, 5-Dimetilpirrol-2-ilmetilen) indolin-2-ona) (C15 H14 N20) ,· PI 88 (sulfato de fosfomanopentaosa) ; Alvocidifa (4H-l-Benzopiran-4-ona, 2- (2-clorofenil) -5, 7-dihidroxi-8- (3-hidroxi-l-metil-4-piperidinil) -cis- (-) -) (C21 H20 Cl N 05); E 7820,· SU 11248 ácido 15- [3-Fluoro-2-oxo-l , 2 -dihidroindol- (3Z) -ilidenmetil] -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico (2 -dietilaminoetil) amida) (C22 H27 F N4 02); Escualamina (Colestan-7 , 24-diol , 3- [ [3- [ (4-aminobutil) arainopropil] amino] - , 24- (sulfato de hidrógeno), (3.beta., 5. alfa., 7.alfa.)-) (C34 H65 N3 05 S) ; Eriochrome Black T; AGM 1470 (ácido carbámico, (cloroacetil) - , 5-metoxi-4- [2-metil-3- (3-metil-2-butenil) oxiranil] -l-oxaespiro [2,5] oct-6-il éster, [3R- [3alfa, 4alfa (2R, 3R) , 5beta, 6beta]]) (C19 H28 Cl N 06); A2D 9935; BIBF 1000; AZD 2171; ABT 828; KS-interleucina-2; Uteroglobina; A 6; NSC 639366 fumarato de (1- [3- (Dietilamino) -2-hidroxipropilamino] -4- (oxiran-2-ilmetilamino) antraquinona) (C24 H29 N3 04. C4 H4 04); ISV 616; proteínas de fusión anti-ED-B; HUI 77; Troponina I; anticuerpo monoclonal BC-1; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 ácido (3- (3,4, 5-Trimetoxifenil) -2 (E) -propenoico (3R, 4S, 5S, 6R) -4- [2 (R) -metil-3 (R) -3 (R) - (3-metil-2-butenil) oxiran-2 - 1] -5-metoxi-l-oxaespiro [2. 5] oct-6-il éster) (C28 H38 08); I C-1C11; aaATIII; SC 7; CM 101; Angiocol; Kringle 5; CKD 732 ácido (3- [4- [2- (Dimetilamino) etoxi] fenil] -2 (E) -propenoico) (C29 H41 N 06); U 995; Canstatina; SQ 885; CT 2584 (1- [11- (Dodecilamino) -10-hidroxiundecil] -3 , 7-dimetilxantina) (C30 H55 N5 03); Salmosina; E AP II; TX 1920 (1- (4-Metilpiperacino) -2- (2-nitro-lH-l-imidazoil) -1-etanona) (CIO H15 N5 03); inhibidor Alfa-v Beta-x; CHIR 11509 (N- (1 -Propinil) glicil- [N- (2 -naftil) ] glicil- [N- (carbamoilmetil) ]glicin bis (4-metoxifenil) metilami-da)—(T3-6-?37 N5 06) -;- -BST 2002-;—BST- 2001; B .0829; FR 111142; (3R, 4S, 5S, 6R)-4-[l (R) , 2 (R) -epoxi-1, 5-dimetil-4-hexenil] -5-metoxi-l-oxaespiro [2.5] octan-6-il ester del ácido 4,5-dihidroxi-2 (E) -hexenoico (C22 H34 07) ; e inhibidores de cinasa incluyendo, pero sin limitarse a, N- (4-clorofenil) -4- (4-piridinilmetil) -1-ftalacinamina; 4- [4- [ [ [ [4-cloro-3- (tri fluorometil) fenil] amino] carbonil] mino] fenoxi] -metil-2-piri-dincarboxamida; N- [2- (dietilamino) etil] -5- [ (5-fluoro-l,2-di-hidro-2-oxo-3H-indol-3-iliden) metil] -2, -dimetil-lH-pirrol-3-carboxamida; 3- t (4-bromo-2 , 6-difluorofenil) metoxi] -5- [ [ [ [4- (1-pirrolidinil) butil] amino] carbonil] amino] -4-isotiazolcarbo-xamida; N- (4-bromo-2-fluorofenil) -6-metoxi-7- [ (l-metil-4-piperidinil) metoxi] -4-quinazolinamina; 3- [5, 6 , 7 , 13 -tetrahidro -9- [ (1-metiletoxi) metil] -5-oxo-12H-indeno [2 , 1-a] pirrólo [3 , 4c] carbazol-12-il] propil éster ?,?-dimetil-glicina; N-[5-[[[5- (1, 1-dimetiletil) -2-oxazolil] metil] tio] -2-tiazolil] -4-piperi-dincarboxamida; N- [3-cloro-4- [ (3-fluorofenil) metoxi] fenil] -6- [5- [ [ [2- (metilsulfonil) etil] amino] metil] -2-furanil] -4-quinazo linamina; 4- [ (4-Metil-l-piperacinil) metil] -N- [4-metil-3- t [4- (3-piridinil) -2-pirimidinil] amino] fenil] benzamida; N- (3-cloro -4- luorofenil) -7-metoxi-6- [3- (4-morfolinil) propoxi] -4-quina-zolinamina; N- (3 -etinilf nil) -6, 7-bis (2-metoxietoxi) -4-quina-zolinaraina; N- (3- ( ( ( (2R) -l-metil-2-pirrolidinil) metil) oxi) -5-(trifl orometil) fenil) -2- ( (3- (1, 3-oxazol-5-il) fenil) amino) -3-piridincarboxamida; 2- ( ( (4-fl orofenil) metil) amino) -N- (3-( ( ( (2R) -1-metil- -pirrolidinil) metil) oxi) -5- (trifluorometil) fenil) -3-piridincarboxamida; M- [3- (Acetidin-3-ilmetoxi) -5-trifluorometil-fenil] -2- (4-fluoro-bencilamino) -nicotinamida; 6-fluoro-N- (4- (1-metiletil) fenil) -2- ( (4-piridinilmetil) amino) -3-piridincarboxamida; 2- ( (4-piridinilmetil) amino) -N(3- ( ( (2S) -2-pirrolidinilmetil) oxi) -5- (trifluorometil) fenil) -3-piridin carboxamida; N- (3- (1, 1-dimetiletil) -lH-pirazol-5-il) -2- ( (4-piridinilmetil) amino) -3-pirid ncarboxamida; N- (3 , 3 -dimetil-2 , 3-dihidro-l-benzofuran -6-il) -2 - ( (4-piridinilmetil) amino) -3-piridincarboxamida; N- (3- ( ( ( (2S) -l-metil-2-pirrolidinil) metil ) oxi) -5- (trifluorometil) fenil) -2- ( (4-piridinilmetil) amino) -3-piridincarboxamida; 2- ( (4-piridinilmetil) amino) -N- (3- ( (2- (1-pirrolidinil) etil) oxi) -4- (trifluorometil) fenil) -3-piridincarboxamida; N- (3 , 3-dimetil-2, 3-dihidro-lH-indol-6-il) -2- ( (4-piridinilmetil) amino) -3-piridincarboxamida; N- (4- (pentafluoro etil) -3- .( ( (2S) -2-pirrolidinilmetil) oxi) fenil) -2- ( (4-piridinil metil) amino) -3-piridincarboxamida; N- (3- ( (3-acetidinilmetil) oxi) -5- (trifluorometil) fenil) -2- ( (4-piridinilmetil) amino) -3-piridincarboxamida N- (3- (4-piperidiniloxi) -5- (trifluorometil) fenil) -2- ( (2- (3-piridinil) etil) amino) -3-piridincarboxamida; N - (4,4-dimetil-l,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-7-il)2- (lH-inda-zol-6-ilamino) -nicotinamida; 2-(l H-indazol-6-ilamino) -N- [3-(l-metilpirrolidin-2-ilraetoxi) -5-trifluorometil-fenil] -nicotinamida; N- [1- (2-dimetilaraino-acetil) -3, 3-dimetil-2 , 3-dihi-dro-lH-indol-6-il] -2- (lH-indazol-6-ilamino) -nicotinamida; 2-(-l-a=A-nda-zol-6^il-amino--JSr^-[^- p-i roli.din-2 -iJ etoxi) -5-tri£luo rometi1-fen 1] -nico inamid ; N (1- ceti1-3 , 3-dimetil-2,3 -dihi-dro-lH-indol-6-il) -2- (lH-indazol-6-ilamino) -nicotinamida; N-(4 , 4-dimetil-l-oxo-l , 2,3, -tetrahidro-isoquinolin-7-il) -2- (1H -indazol-6-ilamino) -nicotinamida; N- [4- (ter-butil) -3- (3-pipe-ridilpropil) fenil] [2- (lH-indazol-6-ilamino) (3-piridil) ] carbo-xamida; N~ [5- (ter-butil) isoxazol-3-il] [2- (lH-indazol-6-ilami-no) (3-piridil) ] carboxamida; y N- [4- (ter-butil) fenil] [2- (1H-indazol-6-ilamino) (3-piridil) ] carboxamida, e inhibidores de cinasa descritos en las Patentes Estadounidenses Nos . 6,258,812; 6,235,764; 6,630,500; 6,515,004; 6,713,485;
5,521,184; .5,770,599; 5,747,498; 5,990,141; Publicación Estadounidense No. US20030105091; y publicación del Tratado dé Cooperación en Materia de Patentes nos. W001/37820; W001/32651; W002/68406; W002/66470; W002/55501; W004/05279; W004/07481; 004/07458; W004/09784; WO02/59110; W099/45009;
W098/35958; WO00/59509; 099/61422; WOOO/12089; y WOOO/02871, publicaciones cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, puede ser administrado un agente de unión específica al HGF antes de, concurrentemente con, y después del tratamiento con agentes para el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades/ un agente de unión específica al HGF puede ser administrado profilácticamente para prevenir o mitigar la aparición de pérdida ósea por cáncer metastásico. En ciertas modalidades, puede ser administrado un agente de unión específica al HGF para el tratamiento de una condición existente de pérdida ósea debida a la metástasis. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer colorrectal, carcinoma gástrico, glioma, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, carcinoma renal papilar hereditario y esporádico, leucemia, linfoma, síndrome de Li-Fraumeni, mesotelioma pleural maligno, melanoma, mieloma múltiple, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer pulmonar de células pequeñas, sarcoma sinovial, carcinoma tiroideo y carcinoma de células transitorias de la vej iga urinaria . En ciertas modalidades, puede ser usado un agente de unión específica al HGF solo o con al menos un agente terapéutico adicional para el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es usado en conjunto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico adicional. Los agentes terapéuticos ejemplares que pueden ser administrados con un agente de unión específica al HGF incluyen, pero no se limitan a, un miembro de la familia de la geldanamicina de antibióticos de anisamicina; una Pro-HGF; N 2; un inhibidor del péptido c-Met; un antagonista de Grb2 Src homología 2; un modulador Gabl; Src negativo dominante; inhibidor de von-Hippel-Landau, incluyendo, pero sin limitarse a, wortmanina; inhibidores de cinasa P13, otras terapias antirreceptor, anti EGFR, un inhibidor de COX-2, Celebrex" , Vioxx* ; factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) , un modulador de VEGF, un factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF) , un modulador de FGF, un factor del crecimiento epidérmico (EGF); un modulador de EGF; un factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF) , una molécula relacionada con - GF, un modulador de KGF; un modulador de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) . En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF . es usado con agentes terapéuticos particulares para tratar varios cánceres . En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es usado con agentes terapéuticos particulares para tratar o. prevenir la malaria. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF es usado con agentes terapéuticos particulares para tratar o prevenir la retinopatía diabética proliferativa. E ciertas modalidades, en vista de la condició y el nivel de tratamiento deseado, pueden ser administrados dos, tres o más agentes. En ciertas modalidades, esos agentes pueden ser proporcionados juntos mediante la inclusión en la misma formulación. En ciertas modalidades, esos , agentes y agentes de unión especifica al HGF pueden ser proporcionados juntos mediante la inclusión en la misma formulación. En ciertas modalidades, esos- agentes pueden ser formulados por separado y proporcionados juntos mediante la inclusión en un equipo de tratamiento. En ciertas modalidades, esos agentes y agentes de unión específica al HGF pueden ser formulados separados y proporcionados juntos mediante la inclusión en un equipo de tratamiento. En ciertas modalidades esos agentes pueden ser proporcionados separados. En ciertas modalidades, cuando se administren por terapia genética, los genes que codifican para agentes proteínicos y/o un agente de unión específica al HGF pueden ser incluidos en el mismo vector. En ciertas modalidades, los genes que codifican para agentes proteínicos y/o un agente de unión específica al HGF pueden estar bajo el control de la misma región promotora. En ciertas modalidades, los genes que codifican para agentes proteínicos y/o un agente de unión específica al HGF pueden estar en vectores separados . En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión específica al HGF junto con un diluente, portador, solubilizante, emulsificante, preservativo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión específica al HGF y una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, junto con un diluente, portador, solubilizante, emulsificante, preservativo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, la presente invención está dirigida a terapias que comprenden un agente de unión específica al HGF y al menos un inhibidor de serína proteasa, y métodos de tratamiento usando esas terapias. En ciertas modalidades, una terapia comprende un agente de unión especifica al HGF y un inhibidor de la serina proteasa y al menos una molécula adicional descrita aquí . En ciertos casos, una cancelación del equilibrio inhibidor de la proteasa/proteasa puede conducir a destrucción tisular mediada con proteasa, incluyendo, pero sin limitarse a, . invasión tumoral de tejido normal conduciéndose a metástasis. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF puede ser usado con al menos un agente terapéutico para la inflamación. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF puede ser usado con al menos un agente terapéutico para un trastorno inmune. Los agentes terapéuticos ejemplares para los trastornos inflamatorios e inmunes, incluyen, pero no se limitan a moduladores de molécula pequeña de inhibidores de ciclooxigenasa tipo 1 (COX-1) y ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2) de proteína cinasa activada por mitógeno 38 kDa (p38-MAPK) ; los moduladores de molécula pequeña de moléculas intracelulares implicadas en las vías de inflamación, donde esas moléculas intracelulares incluyen, pero no se limitan a, jnk, IKK, NP-KB/ ZAP70 y lck. Ciertos agentes terapéuticos ejemplares para la inflamación son descritos, por ejemplo, en C.A. Dinarello y L.L. Moldawer Proinflammatory y Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Artritis: A Primer for Clinicians Third Edition (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluirán más de un agente de unión específica al HGF diferente. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluirán más de un agente de unión específica al HGF donde los agentes de unión específica al HGF se unen a más de un epítope. En ciertas modalidades, los materiales de formulación aceptables preferiblemente no son tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar y mantener o preservar, por ejemplo, pH, omolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En ciertas modalidades, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobianos, antioxidantes (como el ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) ; amortiguadores (como el borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes (como el mannitol o glicina) ; agentes quélantes (como el ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) ) ; agentes complej antes (como la cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-cielodextrina) ; cargas; monosacáridos, disacáridos; y otros carbohidratos (como la glucosa, mañosa o dextrinas) ; proteínas (como la albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas) ; agentes colorantes, saborizantes, diluyentes; agentes emulsificantes ; polímeros hidrofílicos (como la polivinilpirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (como el sodio) ; preservativos (como el cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) ; solventes ( como la glicerina, propilen glicol o polietilen glicol) ,· alcohol azucarado (como el manitol o sorbitol) ;
agentes suspensores; tensoactivos o agentes humectantes (como plurónicos, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos , como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tyloxapal) ; agentes mejoradores de la estabilidad (como la sucrosa o sorbitol) ; agentes mejoradores de la tonicidad (como haluros de metal alcalino, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol) ; vehículos de liberación; diluentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (.ReiTungton's Pharmaceutical Sciences, 18 Edición, A. . Gennaro, ed., Mack Eublishing Company (1990) . En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF y/o una molécula terapéutica es enlazado a un vehículo que extiende la vida media conocido en la técnica. Esos vehículos incluyen pero no se limitan a, polietilen glicol y dextrano. Esos vehículos son descritos, por ejemplo en la solicitud Estadounidense No. de Serie 09/428,082 y solicitud de PCT publicada No. WO 99/25044, las cuales por lo tanto se incorporan aquí como referencia para cualquier propósito. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración pretendida, el formato de liberación y dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. En ciertas modalidades, esas composiciones pueden tener influencia sobre el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo o velocidad de eliminación in vivo de los anticuerpos de la invención. En ciertas modalidades, el vehículo o excipiente primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un vehículo o excipiente adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebro espinal artificial, posiblemente implementado con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral . En ciertas modalidades, se mezcla solución salina amortiguada neutra o solución salina con seroalbúmina como vehículos ejemplares adicionales. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden amortiguador Tris de un pH de aproximadamente 7.0-8.5, o un amortiguador de acetato de pH 4.0-5.5, el cual puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En ciertas modalidades, una composición que comprende un agente de unión específica al HGF, con ó sin al menos un agente terapéutico adicional, puede ser preparado para almacenarse mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcional (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas modalidades, una composición que comprende un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede ser formulada como un liofilizado usando los excipientes adecuados como la sucrosa. En _ ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser seleccionadas para la liberació parenteral . En ciertas modalidades, las composiciones pueden ser seleccionadas para inhalación o ser liberadas a través del tracto digestivo, como oralmente. La preparación de esas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de las destrezas de la técnica. En ciertas modalidades, los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En ciertas modalidades, se usan amortiguadores para mantener la composición a un pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, típicamente un pH de un intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8. En ciertas modalidades, cuando se ha contemplado la administración parenteral, una composición terapéutica puede esta en forma de solución acuosa libre de pirógenos, párenteralmente aceptable, que comprenda un agente de unión específica al HGF deseado, con o sin agentes terapéuticos adicionales en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, un vehículo para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual se formuló un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, como una solución estéril, isotónica, preservada apropiadamente. En ciertas modalidades, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (como el ácido poliláctico o ácido poliglicolíco) , perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto, las cuales pueden entonces ser liberadas vía una inyección de depósito. En ciertas modalidades, también puede ser usado ácido hialurónico y puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, pueden ser usados dispositivos de liberación de fármacos implantables para introducir la molécula deseada. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica puede ser formulada para su inhalación. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede ser formulado como polvo seco para inhalación. En ciertas modalidades, una solución de inhalación que comprende un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un " agente terapéutico adicional, puede ser formulado con un propelente para su liberación en aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones pueden ser nebulizadas, La administración pulmonar es descrita en la solicitud del PCT no. PCT/US94/001875 , la cual describe la liberación pulmonar de proteínas modificadas químicamente. En ciertas modalidades, se contempló que las formulaciones pueden ser administradas oralmente. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, que sea administrado de esta forma puede ser formulado con o sin aquellos excipientes usados de manera acostumbrada en la composición de dosificación sólida, como tabletas y cápsulas. En ciertas modalidades, una cápsula puede ser diseñada para liberar la porción activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad sea maximizada y la degradación presistémica sea minimizada. En ciertas modalidades, puede ser incluido al menos un agente adicional para facilitar la absorción de un agente de unión específica al HGF y/o cualquier agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, también pueden ser empleados, diluentes, saborizantes , ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes suspensores, agentes desintegrantes de tabletas y aglutinantes. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede implicar una cantidad efectiva de un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una mezcla con excipientes no tóxicos que sean adecuados para la elaboración de tabletas . En ciertas modalidades, disolviendo las tabletas en agua estéril, o en otro vehículo apropiado, pueden ser preparadas soluciones en formas de dosis unitarias. En ciertas modalidades, los excipientes adecuados, incluyen, pero no se limitan a, diluentes inertes, como el carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, como el almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes como el estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que impliquen agentes de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en formulaciones de liberación sostenida o controlada. En ciertas modalidades, la técnicas para formular una variedad de otros medios de . liberación sostenida o controlada, como portadores de liposoma, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, la Solicitud PCT No. PCT/US93/00829 la cual describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la liberación de composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S. 3,773,919 y EP 058,481), copolímeros de L-ácido glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al, J. Biomed Mater Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem, Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etilen vinilo (Langer et al., supra) o ácido poli-D (-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988). En ciertas modalidades, las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas los cuales pueden ser preparados por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949. La composición farmacéutica a ser usada para la composición in vivo típicamente es estéril. En ciertas modalidades, esto puede ser logrado por filtración a través de membranas de filtración estériles. En ciertas modalidades, donde la composición es liofilizada, la esterilización usando este método puede ser conducida antes o después de la liofilización y reconstitución. En ciertas modalidades, la composición para administración parenteral puede ser almacenada en forma liofilizada o en una solución. En ciertas modalidades, las composiciones parenterales generalmente son colocadas en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. En ciertas modalidades, una vez que ha sido formulada la composición farmacéutica, esta puede ser almacenada en frascos estériles, como solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o un polvo deshidratado o liofilizado. En ciertas modalidades, esas formulaciones pueden ser almacenadas en una forma lista para usarse en una forma (por ejemplo, liofilizada) que sea reconstituida antes de la administración. En ciertas modalidades, la presente invención esta dirigida a equipos para producir una administración de unidad de una sola dosis. En ciertas modalidades, los equipos pueden contener cada uno un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tenga una formulación acuosa. En ciertas modalidades de esta invención, están incluidos los equipos que contienen jeringas prellenadas de una o múltiples cámaras, (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas) . En ciertas modalidades, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un agente de unión específica al HGF, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, a ser empleada terapéuticamente dependerán, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosis apropiados para el tratamiento, de acuerdo a ciertas modalidades, variaran de este modo dependiendo en parte, de la molécula liberada, la indicación para- la--cual - el- -agente, de unión^.específica al HGF con o sin al menos un agente terapéutico adicional, sea usada la ruta de administración y la talla, peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el clínico puede titular la dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En ciertas modalidades, una dosis típica puede fluctuar de aproximadamente 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En ciertas modalidades, la dosis puede fluctuar de 0.1 g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 |-ig/kg hasta 100 mg/kg; ó 5 g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. En ciertas modalidades, la frecuencia de dosificación tomará en cuenta parámetros farmacocinéticos de un agente de unión específica al HGF y/o cualquier agente terapéutico adicional en la formulación usada. En ciertas modalidades, un clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. En ciertas modalidades, la composición puede por lo tanto ser administrada como una sola dosis, o como dos o más dosis, (las cuales pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) con el tiempo, o con una infusión continua vía un dispositivo de implantación o catéter. El refinamiento adicional de la dosis apropiada es hecho de manera rutinaria por aquellos expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas efectuadas comúnmente por ellos . En ciertas modalidades, las dosis apropiadas pueden ser determinadas a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados. En ciertas modalidades, la ruta de administración de la composición farmacéutica es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección, por las rutas intravenosa, intraperitoneal , intracerebral (intraparenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, o intralesión; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En ciertas modalidades, las composiciones pueden ser administradas por la inyección de bolo o continuamente por infusión, o por un dispositivo de implantación. En ciertas modalidades, la composición puede ser administrada localmente vía implantación de una membrana, una esponja u otro material apropiado sobre el cual haya sido absorbida o encapsulada la molécula deseada. En ciertas modalidades, donde es usado un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u órgano adecuado y la liberación de la molécula deseada puede ser vía difusión, bolo liberado de manera sincronizada, o administración continua. En ciertas modalidades, puede ser deseable usar una composición farmacéutica que comprende un agente de unión específica al HGF con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una forma ex vivo. En esos casos las células, tejidos y/u órganos que hayan sido removidos del paciente son expuestos a una composición farmacéutica que comprenda un agente de unión específica al HGF, - con o sin al menos un agente terapéutico adicional, después de lo cual las células, tejidos y/u órganos son implantados posteriormente de nuevo al paciente. En ciertas modalidades, un agente de unión específica al HGF y/o cualquier agente terapéutico adicional puede ser proporcionado implantando ciertas células que hayan sido modificadas genéticamente, usando métodos como aquellos descritos aquí, para expresar y secretar los polipéptidos . En ciertas modalidades, esas células pueden ser células de animal o humano, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogeneicas . En ciertas modalidades, las células pueden ser inmortalizadas. En ciertas modalidades, para hacer disminuir la probabilidad de una respuesta inmunológica , las células pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de tejido circundante. En ciertas modalidades, los materiales de encapsulación son típicamente jrecintos o membranas poliméricas biocompatibles , semipermeables que permiten la liberación de los productos proteínicos que evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores de los tejidos circundantes. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los resultados logrados, se proporcionan para propósitos ilustrativos únicamente y no deben constituirse en limitantes de la presente invención . Ejemplo 1 Generación de Hibridomas Anti-HGF Los anticuerpos para HGF fueron producidos en ratones XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) , los cuales son ratones que contienen genes de inmunoglobul ina humana. Se usaron tres grupos de ratón XenoMouse® , grupos la, Ib, y 2, para producir anticuerpos para HGF y se resumen en la tabla 1. El grupo la consistió de ratones de la cepa XenoMouse® XMG2 , la cual produce anticuerpos IgG2K, completamente humanos. Los ratones del grupo la fueron inmunizados con HGF. El HGF fue preparado usando una técnica recombinante estándar usando la secuencia en Nakamura et al . , líature 342: 440-443 (1989) . El grupo Ib también consistió de ratones XenoMouse® cepa XMG2 , pero los ratones del grupo Ib fueron inmunizados con HGF que había sido conjugado químicamente a un epítope de célula T (TCE) que tiene la secuencia Gln Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Leu Lys Lys Cys (SEQ ID NO. 47). El TCE fue conjugado al HGF por reticulación a través de cisteína C-terminal de TCE a N-terminal del HGF usando Sulpho-SMCC (Pierce, cat#; 22322) y ditiotreiotol (Fisher Scientific) . El TCE-HGF conjugado resultante fue separado de péptido no conjugado usando una columna Centricon® (Amicon) . El grupo 2 consistió de ratones XenoMouse® cepa XMG1 , la cual produce anticuerpos IgGlK completamente humanos . Los ratones del grupo 2 fueron inmunizados con el TCE-HGF descrito anteriormente. Los ratones de los tres grupos fueron inyectados con antígeno (ya sea HGF o TCE-HGF) ocho veces, de acuerdo al programa de la Tabla 1. En las inmunizaciones iniciales cada ratón fue inyectado con un total de 10 µ? de antigeno en la pata trasera (5 µg por pata). Aquellas inyecciones contenían el adyuvante TiterMax® Gold (Sigma, Cat # T2684). En las inyecciones 2 hasta 7, cada ratón fue inyectado con un -total de 5 µg de antígeno en gel de aluminio adyuvante (adyuvante de gel de fosfato de aluminio; Superfos Biosector a/s, distribuido por E. M. Sargent Pulp and Chemical Co . , Clifton NJ, cat#; 1452-250). La inyección final tuvo un total de 10 µg de antígeno por ratón y no tuvo adyuvante.
Tabla 1. Inmunización de los Ratones Grupo la Grupo Ib Grupo 2 Cepa XMG2 XMG2 X G1 # de ratones 8 8 10 Antígeno H'GF HGF-TCE HGF-TCE
Ira inyección 10 µg/ratón en 10 ratón en 10 µ / atón en (día 1) TiterMax Gold TiterMax Gold TiterMax Gold
2do refuerzo 5 g/ratón en 5 µg/ratón en 5 µg atón en (día 7) Gel de Alum Gel de Alum Gel de Alum
3er refuerzo 5 µg/ atón en 5 µg/ratón en 5 g ratón en (día 9) Gel de Alum Gel de Alum Gel de Alum
4to refuerzo 5 µg/ratón en 5 µg/ratón en 5 µg/ratón en (día 13) Gel de Al ra Gel de Alum Gel de Alum Tabla 1. Inmunización de los ratones (continuación)
Cada ratón fue sangrado dos días después de la sexta inyección. Las muestras de sangre de aquellos sangrados fueron ensayadas por ELISA para determinar el titulo de anticuerpos para HGF. En aquellos ensayos de ELISA, se recubrieron placas de 96 pozos (Fisher Scientific cat. # 12-565-136) con HGF en amortiguador de carbonato 0.1 (pH 9.6). Las muestras de sangre fueron agregadas y las placas fueron incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas fueron lavadas tres veces con solución de lavado (T een 20 al 0.05% en PBS) y se agregaron 100 µ?/???? de anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario fue anticuerpo anti-IgGFc humana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (Southern Biotech cat. # 9060-05) . Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas y se agrégaron. 100 µ?/???? de solución reveladora de TMB (BioFX Lab Cat. # TMSK-0100-01) . Después de 10 minutos, se agregaron 50 µ?/???? de solución interruptora de TMB (BioFX Lab Cat. # STPR-0100-01) . Las placas fueron leídas sobre un lector de placas de ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Cuatro días después de la inyección final, los ratones fueron sacrificados y sus nodos linfáticos drenados fueron cosechados y recuperados los linfocitos . Los linfocitos de los ratones de Cada uno de los tres grupos fueron reunidos por separado. Para enriquecer las muestras de linfocitos en células B, se agotaron las células T agregando perlas magnéticas anti-CD90 (Miltenyi Biotech cat, # 491-01) y haciendo pasar entonces los linfocitos a través de una columna LS+ (Miltenyi Biotech cat. # 424-01). Cada una de las tres muestras de linfocitos enriquecidos en células B fueron entonces fusionadas con células de mielorna P3 usando un dispositivo de fusión electrocelular (Genetronic, Inc. , Model ECM 2001) para crear hibridomas. Los tres grupos de líneas de hibridoma fusionadas fueron entonces cultivados en placas de 96 pozos a una densidad de 1 x 10e linfocitos ricos en células B alimentados por pozo en medios de hibridoma (para los componentes véase la Tabla 2) que contenían hipoxantinina-azaserina (Sigma) . Las líneas de hibridoma fueron cultivadas durante 14 días a 37°C, C02 al 15%.
14 días después, los sobrenadantes de cultivos fueron ensayados por ELISA para detectar la presencia de anticuerpos IgG para el HGF usando el mismo protocolo que se usó para ensayar las muestras de sangre, descrito anteriormente. Los sobrenadantes de cultivo que probaron ser positivos en ese ELISA fueron tratados por la presencia de cadena kappa humana en un segundo ELISA. En ese segundo ELISA, las condiciones fueron idénticas a las del primer ELISA, excepto que el anticuerpo secundario fue un anticuerpo anti-cadena kappa humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano. Los hibridomas que probaron ser positivos en ambos ensayos de ELISA fueron expandidos adicionalmente para producir 5 mi de sobrenadante para la prueba funcional in vitro, la cual se discute en los Ejemplos 8 y 9. Los sobrenadantes de 82 clones correspondientes a los ratones del grupo la, 42 clones correspondientes a los ratones del grupo Ib y 176 clones correspondientes a los ratones, del grupo 2 fueron probados . Sobre la base de los resultados de aquellos ensayos funcionales, fueron identificadas varias líneas de hibridoma como productoras de anticuerpos para HGF. Se usó una dilución limitante para aislar de tres a seis clones de cada línea. Las clones fueron designados por el número de la línea de hibridoma (por ejemplo 1.24) y el número de clon (por ejemplo 1.24.1). No ha sido detectada diferencia de los diferentes clones de una linea particular por los ensayos funcionales discutidos en los Ejemplos 8 y 9. Aquellos clones aislados fueron expandidos cada uno en 50-100 mi de medios de hibridoma y se dejaron crecer hasta su agotamiento, (es decir, una viabilidad celular menor de aproximadamente 10%) . La concentración y potencia de los anticuerpos para HGF en los sobrenadantes de aquellos cultivos fueron determinadas por ELISA y por prueba funcional in vitro, como se discute en los Ejemplos 8 y 9. Los diez hibridomas con el titulo más amplio de anticuerpos para HGF fueron identificados. Aquellos hibridomas fueron designados como 1.24. 1,1. 29.1, 1.60.1, 1. 61.3, 1.74.3, 1. 75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1.
Tabla 2. Composición de los Medios Medios de Hibridoma Componente Fuente D E Gibco Suero bovino fetal al 15% Hyclone, cat # SH 30070.03 L-glutamina 200mM al 1% Sigma, cat # G2150 Aminoácidos no Sigma cat # M 7145 esenciales 100X al 1% 100X pen/estrep al 1% Sigma Cat # P 7539 (10,000 U/ml de penicilina/lOmg/ml de estreptomicina) 10 U/ml de IL-6 Boehringer Mannheim, cat. # 1299972 Tabla 2. Composición de los Medios (continuación)
Ejemplo 2 Producción de Anticuerpos a partir de los Hibridomas Los anticuerpos fueron preparados a partir de los diez hibridomas discutidos en el Ejemplo 1 usando uno de los sistemas diferentes: matraces Integra y centrifugas de roció.
Matraces Integra Se hicieron crecer por separado siete líneas de hibridoma 2.12.1, 1.24.2, 1.29.1, 1.74.1, 1.75.1, 1.60.2, y 2.40.1, en matraces T75 en 20 mi de medios HSFM (véase la Tabla 2 para los componentes de los medios) . Cuando los hibridomas estaban cerca de la confluencia en los matraces T75, fueron transferidos a matraces Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat # 90 005) . El matraz Integra es un matraz de cultivo celular que está dividido por una membrana en dos cámaras, una cámara pequeña y una cámara grande. Se colocó un volumen de 20-30 mi de células de hibridoma a una densidad celular mínima de 1 x 106 células por mi de cada una de las siete líneas de hibridoma en la cámara pequeña de siete matraces Integra en medios Integra (véase la Tabla 2 para los componentes de los medios Integra) . Se colocaron medios Integra (1L) solos en las cámaras grandes de los matraces Integra. La membrana que separa las dos cámaras es permeable a nutrientes de bajo peso molecular pero es impermeable a las células de hibridoma y a los anticuerpos producidos por aquellas células. De este modo, las células de hibridoma y los anticuerpos producidos por aquellas células de hibridoma fueron retenidos en la cámara pequeña. Después de una semana, los medios fueron removidos de ambas cámaras de cada uno de los siete matraces Integra y fueron reemplazados con medios Integra frescos . Los medios recolectados de las siete cámaras pequeñas fueron retenidos por separado. Después de una segunda semana de crecimiento, los medios de las cámaras pequeñas fueron recolectados nuevamente. Los medios recolectados de la semana 1 de cada línea de hibridoma fueron combinados con los medios recolectados de la semana 2 de la misma línea de hibridomas. Las sietes muestras de medios recolectada resultantes de las siete líneas de hibridoma fueron centrifugadas para remover células y restos (15 minutos a 3000 rpm) y los sobrenadantes resultantes fueron filtrados (0.22 µp?) . Matraces Agitadores con Barboteó (3L) Se hicieron crecer por separado tres líneas de hibridoma 3.10.1, 2.4.4, y 2.12.1 en matraces T75 en 20 ral de medio HSFM. Cuando los hibridomas alcanzaron una densidad celular suficiente, fueron transferidos a matraces T175. De igual modo, cuando los hibridomas alcanzaron una densidad celular suficiente en los matraces T175, fueron transferidos a matraces agitadores de 100 mi y entonces a matraces agitadores de 500 mi, y entonces a matraces de agitación de 1 L. Cuando las células alcanzaron una densidad, celular suficiente en los matraces agitadores de 1 L, fueron transferidas a matraces agitadores con barboteo (Bélico Biotechnology, cat # 1965-300, con aditamento del brazo lateral # 1965-30003) .
El matraz agitador con barboteo de 3L es un recipiente de vidrio donde son mezclados cultivos con un impelente controlado por una plataforma magnética. El agitador es conectado a una linea de gas para proporcionar 5% de CO2 y aire. Hibridoma 3.10.1 Fueron sembrados dos matraces agitadores con barboteo de 3 L con células de hibridoma de la linea de hibridoma 3.10.1 en medios HSFM con las adiciones anotadas en la Tabla 3,. la cual resume las condiciones de crecimiento de aquellos dos matraces con barboteo.
Tabla 3. Condiciones para el Crecimiento del Hibridoma 3.10.1.
7 fueron cosechados cuando la viabilidad era inferior al 20%, de acuerdo a lo determinado por exclusión de azul de tripan. La cosecha consistió de la centrifugación durante 15 minutos a 7000 rpm y filtración posterior del sobrenadante resultante a través de un filtro de 0.22 µt?. La productividad fue determinada eluyendo la cantidad de proteina presente en las muestras cosechadas finales por una CLAP de proteína A y se reportaron en la Tabla 3.
Hibridoma 2.4.4 Cinco matraces agitadores con barboteo de 3L fueron sembrados con células de hibridoma de la línea de hibridoma 2.4.4 en medios HSFM con las adiciones anotadas e la Tabla 4, la cual resume las condiciones de crecimiento para aquellos cinco matraces con barboteo.
Tabla 4. Condiciones del Crecimiento del Hibridoma
Condiciones Agitador Agitador Agitador Agitador Agitador 1 2 3 4 5 Densidad de 0.3 0.3 0.18 0.18 0.4 sembrado (10E6 células/mi) HSFM (Gibco cat X X X X X # 12045-076) Tabla 4. Condiciones del Crecimiento del Hibridoma (Continuación)
Los cultivos se hicieron crecer durante 7, 8, o 10 dias de acuerdo a lo indicado en la Tabla 4, y se cosecharon cuando la viabilidad celular fue inferior al 20%, como se describió anteriormente . Hibridoma 2.12.1 Se sembraron seis matraces agitadores con barboteo de 3L con células de hibridoma de la línea de hibridoma 2.12.1 en medios HSFM con las adiciones anotadas en la Tabla 5, la cual resume las condiciones de crecimiento para esos matraces agitadores con barbot
Tabla 5. Condiciones para el Crecimiento del Hibridoma 2,12.1
Condiciones Agitador Agitador 2 Agitador 3 Agitador 4 Agitador 5 Agitador 6 1 Densidad de 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 sembrado (10E6 células/mi) HSFM (Gibco X X X X X X cat # 12045- 076) Suero 5% 5% 5% 5% 5% 5% ultrabajo en IgG (Gibco cat t 16250- 078) L glutamina 2 mmol/L 8 mmol/L 4 mmol/L 4 mmol/L ' 4 mmol/L 4 mmol/L (JRH cat # 59202-500M) P/S (Gemini 1% 1% 1% 1% 1% 1% cat# 400-109) ????. (JRH 1% 1% 1% 1% 1% 1% cat# 58572- 77P) Peptona 1 g/L 1 g/L 1 g/L 1 g/L 1 g/L i g/L
Glucosa 2M 2 g/L 8 g/L 4 g/L 4 g/L 4 g/L 4 g/L
Antiespumante 2 ml/L 2 ml/L 2 ml/L 2 ml/L 2 ml/L 2 ml/L C Tabla 5. Condiciones para el Crecimiento del Hibridoma 2.12.1 (Continuación)
Los cultivos se hicieron crecer durante 7 u 11 dias, de acuerdo a lo indicado en la Tabla 5, y fueron cosechados cuando la viabilidad era inferior al 20%, como se describió anteriormente. Ejemplo 3 Clonación y Análisis de Secuencia de las Cadenas Pesada y Ligera del Anticuerpo A. Clonación de las Cadenas Ligeras Fueron identificados diez hibridomas (1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1) como los que expresan anticuerpos monoclonales para HGF, como se discute en el Ejemplo 1. Fue - aislado el ARN total de cada uno de esos diez hibridomas usando reactivo TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los extremos . 5' de -esas diez preparaciones de ARN total fueron adaptados a la amplificación rápida 5' de los extremos de ADNc (RACE) usando el equipo GeneRacer® (Invitrogen) . Aquellas preparaciones de ARN modificado en 5' fueron entonces usadas en reacciones RACE separadas, cada una usando un cebador aleatorio con un adaptador de extensión (5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-31 ) (SEQ ID NO: 48) , para generar diez moléculas de ADNc. Las diez moléculas . de ADNc fueron entonces amplificadas en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) separada para generar diez secuencias de cadena ligera kappa amplificadas. Por cada una de aquellas reacciones, el cebador de avance o directo fue el cebador anidado GeneRacer1^ de avance o directo (5'-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3 ' ) (SEQ ID NO: 49). El cebador inverso (5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-31 ) (SEQ ID NO: 50) fue diseñado para unirse a la secuencia complementaria a la cadena ligera kappa. Cada una de las diez secuencias de la cadena ligera kappa amplificadas fue entonces ligada por separado en plásmidos pCR4-TOPO (Invitrogen) separados. Los diez plásmidos resultantes, cada uno de los cuales contiene una de las diez secuencias de cadena ligera, kappa, fueron entonces amplificados por separado en bacterias y se secuenciaron varias clones de cada una. Aquellas secuencias fueron mostradas para diseñar cebadores de PCR para amplificar las diez secuencias del marco de lectura abierta de cadena ligera kappa de los plásmidos clonados como sigue.
Los conjuntos de cebadores para cada una de las diez PCR comprendieron un cebador 5' y un cebador 3'. Cada cebador 5' comprendió una porción complementari a la secuencia del amino terminal de la secuencia de la cadena ligera kappa particular, una secuencia de Kozak optimizada, y uno o más sitios de restricción. Por . ejemplo, la secuencia del cebador 5' usado en la reacción con el plásmido finalmente derivado del hibridoma 3.10.1 fue: 5 ' - ACA ACA AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA AGC CCC AGC
TCA Xbal Kozak GCT TCT CTT - 3' (SEQ ID NO: 51)
El cebador 3 ' para cada una de las PCR comprendió una porción complementaria al carboxilo terminal de la secuencia de la secuencia de la cadena ligera kappa particular, incluyendo el cod n de terminación y un sitio de restricción. Por ejemplo, la secuencia del cebador 3' usado en la reacción con el plásmido finalmente derivado del hibridoma 3.10.1 fue :
CTT GCT GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA
GCT Salí C -3' (SEQ ID NO: 52) Se usaron conjuntos de cebadores separados en reacciones PC separadas con los plásmidos clonados correspondientes para amplificar diez secuencias de la región codificadora de la cadena ligera kappa . Los diez productos de la amplificación de aquellas reacciones fueron aislados en gel por separados y purificados usando un equipo de extracción en gel QIAquick® (Catalogo No. 28704, Qiagen, Valencia, CA) . Aquellos productos purificados fueron entonces cada uno cortados con las enzimas de restricción apropiadas para obtener las secuencias de la región que codifica para la cadena ligera kappa libre de plásmido. Por ejemplo, el producto purificado correspondiente al hibridoma 3.10.1 fue cortado con Xbal y Salí, sitios los cuales fueron introducidos por el cebador durante la amplificación por PCR de ese plásmido clonado, como se discutió anteriormente. Las secuencias de la región que codifica para la cadena ligera kappa digeridas por restricción resultantes fueron aisladas en gel por separado nuevamente y purificadas usando un equipo de extracción en gel QIAquick® (Catalogo No. 28704, Qiagen, Valencia, CA) . Aquellas diez secuencias de la región que codifica para la cadena ligera kappa digeridas por restricción, purificadas,"fueron entonces ligadas cada uno por separado en un vector de expresión de mamífero, pDSRa20 (WO 90/14363) , para crear diez vectores de expresión de la cadena ligera kappa separados correspondientes a los diez hibridomas originales. Los diez insertos de vector de expresión de la cadena ligera kappa fueron entonces secuenciados . Finalmente se confirmó que el vector de expresión pDSRa20 que contiene la región que codifica para la cadena ligera kappa finalmente derivada del hibridoma 3.10.1 (pDSRa20: 3.10.1) comprende 5473 pares de bases incluyendo un fragmento de PCR de 719 pares de bases, el cual codificó para los 235 aminoácidos residuales (incluyendo la secuencia señal de la cadena kappa de 20 aminoácidos) de la cadena ligera kappa 3.10.1. Ese vector de expresión comprendió siete regiones funcionales, como se describe en la Tabla 6. Tabla 6. Expresión del Vector pDSRa20 : 3.10.1 kappa Número de Par de Base Plasmídica : Una señal de terminación de la transcripción/ poli adenilacion de la subunidad a de la homona de gli- coproteína pituitaria bovina (a-FSH) (Goodwin, et al, 1983, Nucleic Aclds Res. 11:6873-82; Número de Acceso del Genbank X00004)
Tabla 6. Expresión del Vector pDSRa.20 : 3.10.1 kappa (continuación) Número de Par de Base Plasmídica:
882 a Un minigen de dihidrofo ato reductasa de ratón 2027 (DHFR) que contiene el promotor de DHFR de ratón endógeno, las secuencias codificadoras de ADN, y las señales de terminación de la transcripción/ poliadenilación de DHFR (Gasser et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 79:6522-6; Nunberg et al, 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al, 1982, J. Biol Che . 257:5143-7; Me Grogan et al, 1985, J. Biol Chem. 260:23.07-14) 2031 a Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador 3947 de resistencia a la ampicilina o el origen para la replicación de plásmido en E. coli (Número de Acceso del Genbank J01749) 3949 a Promotor inicial, mej orador y origen de replica4292 ción de SV40 (Takebe et al, 1988, MoL Cell Biol 8: 466-72, Número de Acceso del Genbank J02400) 4299 a Un elemento mejorador translacional del dominio 4565 LTR de HTLV-1 LTR (Seiki et al, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U..S.A. 80:3618-22, Número de Acceso del Genbank J02029)
Tabla 6. Expresión del Vector pDSRa20 : 3.10.1 kappa
(continuación) Número de Par de Base Plasmí
B . Clonación de las Cadenas Pesadas La región variable de las cadenas pesadas de los anticuerpos para HGF de los hibridomas fueron clonadas usando los mismos métodos que aquellos usados para las cadenas ligeras discutidas anteriormente en el Ejemplo 3A. El ARN total de cada uno de los diez hibridomas fue aislado, modificado en 5' por RACE, y usado para generar moléculas de ADNc como se describió anteriormente en el Ejemplo 3A. Aquellas diez moléculas de ADNc fueron amplificadas en reacciones PCR separadas como se discutió para las cadenas ligeras en el Ejemplo 3A, excepto que el cebador inverso (5'-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3 * (SEQ ID NO: 53)) fue diseñado para unirse a la secuencia complementaria de la región variable de la cadena pesada. El cebador de avance directo fue nuevamente el cebador directo anidado GeneRaceMR (5'GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3') (SEQ ID NO: 49) . Cada una de las diez secuencias de la región variable de la cadena pesada amplificadas fueron ligadas por separado en plásmidos pCR4-T0P0 separados. Los diez plásmidos resultantes, cada uno de los cuales contienen una de las diez secuencias de la región variable de la cadena pesada, fueron entonces amplificados por separado en bacterias y se secuencia-ron varias clones de cada uno como se describió anteriormente para las cadenas ligeras en el Ejemplo 3A. Aquellas secuencias fueron usadas para diseñar cebadores de PCR para amplificar cada una de las regiones variables de la cadena pesada de los plásmidos clonados como sigue. Los conjuntos de cebadores para cada una de las diez PCR fueron diseñados usando la misma estrategia que. se usó para las cadenas ligeras, discutidas anteriormente en el Ejemplo 3A. Cada cebador 5' comprendió una porción complementaria a la secuencia del amino terminal de la secuencia en la región variable de la cadena pesada particular, una secuencia de Kozak optimizada, y uno o más sitios de restricción. Por ejemplo, la secuencia del cebador 5' usada para la amplificación de la región variable de la cadena pesada finalmente derivada del hibridoma 3.10.1 fue: 5 ' - AGC AGA AGC TTC TAG ACC ACC ATG AAA CAC CTG TGG TC Xbal Kozak TTC CTC CTC - 3' (SEQ ID NO: 54)
El cebador 3' para cada una de las PC comprendió una porción complementaria al carboxilo terminal de la secuencia de consenso de la secuencia de la región variable de la cadena pesada particular, incluyendo un codón de terminación y un sitio de restricción. Por ejemplo, la secuencia del cebador 3' usado para amplificar la región variable de la cadena pesada finalmente derivada del hibridoma 3.10.1 fue:
5'- GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC-3' BsmBI (SEQ ID NO: 55) Se usaron conjuntos de cebadores separados en reacciones PCR separadas con los plásmidos clonados correspondientes para amplificar las diez secuencias de la región variable de la cadena pesada. Los diez productos amplificados de aquellas reacciones fueron aislados en gel por separado y purificados usando un equipo de Extracción en Gel QUIAquick y cortados con las enzimas de restricción apropiadas cerno se describió para las cadenas ligeras en el Ejemplo 3A. Las secuencias de la región variable de la cadena pesada "digeridas por restricción resultantes fueron nuevamente aisladas en gel por separado y purificadas usando un equipo de Extracción en Gel QüIAquick como se describe en el Ejemplo 3A. Tres de aquellas diez secuencias de la región variable de la cadena pesada digeridas por restricción purificadas, aquellas finalmente derivadas del hibridoma 3.10.1, 1.24.1, y 2.4.4, fueron entonces ligadas por separado en el vector de expresión de mamífero pDSRa20 : hIgGCH para crear tres vectores de expresión IgGl de cadena pesada. El vector de expresión pDSRa20 :hIgGCH es el mismo que el pDSRa20 excepto que también contiene la secuencia de la región constante de IgGl. El vector de expresión pDSRa20: hIgGCH se resume en la Tabla 7.
Tabla 7. Vector de Expresión pDSRa20 : IgGCH Número de Par de Base Plasmídica: Una señal de terminación de la transcripción/ poli adenilación de la subunidad a de la homona de gli- coproteína pituitaria bovina (ot-FSH) (Goodwin, et al, 1983, Nucleic Acíds Res. 11:6873-82; Número de Acceso del Genbank X00004) Tabla 7. Vector de Expresión pDS a20 :hIgGCj (continuación) Número de Par de Base Plasmídica :
882 a Un minigen de dihidrofolato reductasa de ratón 2027 (DHFR) que contiene el promotor de DHFR de ratón endógeno, las secuencias codificadoras de ADN, y las señales de terminación de la transcripción/ poliadenilación de DHFR (Gasser et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 79:6522-6; Nunberg et al, 1980, Cell 19:355-64; Setzer et al, 1982, J. Biol Chem. 257:5143-7; Me Grogan et al, 1985, J. Biol Chem. 260:2307-14) 2031 a Secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador 3947 de resistencia a la ampicilina o el origen para la replicación de plásmido en E. coli (Número de Acceso del Genbank J01749) 3949 a Promotor inicial, mejorador y origen de replica4292 ción de SV40 (Takebe et al, 1988, MoL Cell Biol 8: 466-72, Número de Acceso del Genbank J02 00) 4299 a Un elemento me orador translacional del dominio 4565 LTR de HTLV-1 LTR (Seiki et al, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. ¡30:3618-22, Número de Acceso del Genbank J02029) 4574 a Un intrón de las señales donadora/receptora de 4730 empalme 16S, 19S de SV40 (Okayama and Berg, 1983. Mol Cell Biol 3: 280-9, Número de Acceso del Genbank J02400) Tabla Vector de Expresión pDSR 20 :hIgGCH (con inuación) Número de Par de Base Plasmídi
4755 a El ADNc de cadena pesada pI/hCHl entre los sitios Xbal y Salí. Las secuencias del cual es el siguiente 5791 Xbal BsmBI TCTAGACCACCGCCATGGGTGAAAATTGAATCGTCTCTA
GTGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTGGGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA CCTACATCTG CAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG AAAGTTGAGC
CCAAATCTTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA CTCCTGGGGG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG CTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ATAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG
CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA Salí AATGATAAGT CGAC (SEQ ID NO: 56) Se secuenciaron las regiones variables de la cadena pesada de los tres insertos del vector de expresión de IgGl. El vector de expresión pDSRa20 : hIgGCH que contiene la región variable de cadena pesada finalmente derivada del hibridoma 3.10.1 (pDSRa20^h!gGCH:__3.10_.1) se resume en la Tabla 8.
Tabla 8. Vector de expresión. pDSRoc20 :hlgGCH: 3.10.01
Número de Par de Base Plasmídica: 2 a 881 Una señal de la terminación de la transcripción/poliadenilación de la subunidad a de la hormona de la glicoproteina pituitaria bovina ( -FSH) (Goodwin, et al., 1983 Nucleic Acids Res 11:6873-82; Número de Acceso Genbank X00004) 882 a 2027 Un minigen de dihidrofolato reductasa de ratón (DHFR) que contiene el promotor de DHFR de ratón endógeno, las secuencias . codificadoras de ADNc, y la señal de la terminación de la transcripción/poliadenilación de DHFR (Gassr et al., 1982, Proc. Nati, Acad. Sel. U.S.A.. 79:6522-6; Nunberg ET Al., 1980, CelJ 19:355- 64; Setter et al., 1982, J, Biol. Chem 257:51143-7; McGrogan et ai., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14)
Tabla 8. Vector de expresión pDSRoc20 :hlgGCH: 3.10.01
(continuación) Número de Par de Base Plasmídica :
caaa una de las diez secuencias ae región variaDle de cadena pesada purificada fue ligada por separado en un vector de expresión de mamífero pDSRa20 junto con las secuencias que codifican para la región constante de IgG2 para crear diez vectores de expresión de IgG2. Cada uno de los diez vectores de expresión de IgG2 resultantes (designados como pDSRa20:hlgG:hibridoma #) comprendiendo secuencias que codifican para la región constante de la IgG2 y una de las diez secuencias de región variable de la cadena pesada. Los diez insertos de la secuencia de la región variable de cadena pesada fueron secuenciados para confirmar que comprendían las mismas secuencias de la región variable de cadena pesada que fueron identificadas en los plásmidos clonados de los clones pCR4-T0P0. El vector de expresión pDSRot20 : hlgG2 que contiene la región variable de cadena pesada finalmente derivado del hibridoma 2.12.1 (pDSRcc20:hlgG2:2.12.2) se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9. Vector de Expresión pDSRa20 : IgG2 : 2.12.1
Número de Par de Base Plasmídica: 2 a 881 Una señal de la terminación _ de la transcripción/poliadenilación de la subunidad ce de la hormona de la glicoproteina pituitaria bovina (a-FSH) (Goodwin, et al., 1983 Nucleic Acids Res 11:6873-82; Número de Acceso Genbank X00004)
882 a 2027 Un minigen de dihidrofolato reductasa de ratón (DHFR) que contiene el promotor de DHFR de ratón endógeno, las secuencias - codificadoras de ADNc, y la señal de la terminación de la trasncripción/poliadenilación de DHFR (Gassr et al., 1982, Proc. Nati, Acad. Sci. U.S.A. 79:6522-6; Nunberg ET Al., 1980, €ell 19:355-64; Setter et al., 19€2, J, Biol. Chem 257:51143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) Tabla 9. Vector de Expresión pDSRa20 : IgG2 : 2.12.1 (continuación)
Las secuencias de ADNc para las regiones variables de cadena ligera kappa (SEQ ID NOs. : 1,3, 5,7, 9, 11, 13,15, 17, y 19) , la región constante de cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 21) , las regiones variables de cadena pesada (SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, and 20), y las regiones constantes de cadena pesada IgGl y IgG2 (SEQ ID NOs: 22 y 23) se muestran en la Figura 3.
Se determinaron las secuencias polipeptídicas predichas de cada una de las secuencias de ADNc. Las secuencias polipeptídicas predichas para las regiones variables de cadena ligera kappa (SEQ ID NOs : . 24, 26, 28,30, 32, 34, 36, 38, 40, and 42), la región constante de cadena ligera kappa (SEQ ID NO 44) , las regiones variables de cadena pesada (SEQ. ID NOs. 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, and 43) , y las regiones constantes de cadena pesada de IgGl y IgG2 (SEQ ID NOs : 45 and 46) se muestran en la 4. Sobre la base de los datos de secuencia, se determinaron los genes de la línea germinal de los cuales cada región variable de cadena pesada o cadena ligera fue derivada. Las identidades de los genes de la línea germinal se indican después de la línea de hibridoma correspondiente en la Figuras 1, 2, 3 y 4. El análisis adicional de la relación de las secuencias (Figuras IB y 2B) condujo a los dendrogramas representados en la Fig. 1A (regiones variables de cadena ligera kappa) y la Figura 2A (las regiones variables de cadena pesada) . Ejemplo 4 Expresión Transitoria en Células 293T En diez contransfecciones separadas, se contransfectaron células 293T con un vector de expresión pDSRa20 que comprende una secuencia de cadena ligera kappa que se explica en el ejemplo 3A (vector de cadena ligera) y un vector de expresión pDSR<x20 que comprende una secuencia de cadena pesada descrita en el Ejemplo 3B (vector de cadena pesada) . En aquellas diez cotransfecciones separadas, la células 293T fueron cotransfectadas con ambos del vector de cadena ligera del vector de cadena pesada finalmente derivados de uno de los hibridomas discutidos en el Ejemplo 1. Específicamente, para la cotransfección del vector finalmente derivado del hibridoma 3.10.1, se uso la IgGl que comprende el vector de cadena pesada (pDSRcc20 :hIgGCH: 3.10.1) . Para los cotransfecciones de los vectores finalmente derivados de los otros nueve hibridomas, se usó la IgG2 que comprenden la cadena pesada (pDSRoc20 :hIgG2 :hibridoma #) : Las cotransfecciones fueron efectuadas usando cualquiera de Fugene 6 o X-TremeGene RO-1539 (ambos de Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las cotransfecciones fueron conducidas primero usando células 293T adherentes en botellas giratorias estándar. Las botellas giratorias fueron sembradas con 4x107 a 5x107 células por botella giratoria de DMEM con un contenido del 5% de de Suero Bovino Fetal (FBS) (Hyclone, cat#; SH 30070.03), y IX de aminoácidos no esenciales (Sigma, cat #; M 7145) , y IX de penicilina/estreptomicina (Sigma, cat #; P7539 (10,000 U/ml penicilina/estreptomicina)), y IX piruvato de sodio (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Cuando las células alcanzaron una confluencia de 60-70%, el vector de la cadena pesada y vector de la cadena ligera derivados finalmente de hibridoma particular fueron cotransfectados en las células durante 24 horas, después de los cual los medios cambiaron a los mismos medios que carecen de suero. Los medios libres de suero fueron recolectados y reemplazados con medio libres de sueros frescos dos veces, a las 48 y 96 horas después de la transfección, produciendo un volumen total de 1.25L de medios libres de suero recolectado. Se repitieron diez cotransfecciones separadas usando células 293T adaptadas libres de suero y suspensión en los mismos medios discutidos anteriormente que carecen de suero. Los vectores de cadena pesada y los vectores de cadena ligera correspondientes a un hibridoma particular fueron cotransfectadas en las células en un volumen de cultivo de 500 mL. Las células transfectadas fueron incubadas , durante 7 días, después de los cual el medio acondicionado libre de suero fue recolectado. Ejemplo 5 Expresión del Anticuerpo y Clonación de las Células CHO Se usaron células de ovario de hámster chino DHFR(CHOd-) para generar la expresión estable de anticuerpos recombinantes para HGF. En diez cotransfecciones separadas, fueron cotransfectadas células CHOd- con ambos del vector de cadena pesada y los vectores de cadena ligera, finalmente derivados de uno de los hibridomas discutidos en el Ejemplo 1, como se discute en el Ejemplo 4. Las cotransfecciones se lograron usando un método con fosfato de calcio estándar. Las células transíectadas de cada una de las diez cotransfecciones se hicieron crecer por separado en medios de selección que contenían DMEM alto en glucosa que carecían de hipoxant ina - timidina (Gibco/BRL,
Carlsbad, CA Cat # ; 11965) con 5% suero bovino fetal dializado. Esos medios que carecen de hipoxantina-timidina seleccionan el crecimiento de células que expresan a la enzima de DHFR recombinante . Los medios de cada uno de los transí ectantes del crecimiento fueron separados usando ensayos de ELISA estándar para detectar la presencia de los anticuerpos humanos . Ejemplo 6 Expresión de Anticuerpos para HGF en Clones CHOd- Seis muestras de cada uno de diez clones CHOd-estables diferentes descritos en el ejemplo 5, cada clon diferente expresando uno de los diez anticuerpos diferentes para HGF, se hicieron crecer por separado en medio de crecimiento . Los medios de crecimiento fueron de DMEM con un alto contenido de glucosa (Gibco/BRL, Carlsbad, CA Cat # 11965) , suplementados con FBS al 5% dializado, aminoácidos no esenciales y L-glutamina (Life Technologies, Carlsbad, CA) . Las células se hicieron crecer a 37°C bajo 5% de C02.
Cuando los clones CHOd- alcanzaron la etapa de crecimiento de seis pozos se agregó metotrexato 10 nM a los medios de crecimiento para amplificar la expresión de los anticuerpos. Después de que las células se volvieron confluentes, fueron movidas a 100 discos de mm. La concentración de metotrexato se aumentó gradualmente de 10 nM a 20 nM, a 50 nM, a 100 nM, a 250nm, a 500nM, a 1 µ?, a 2 µ?, a 4 µ?, y finalmente hasta 10 µ?. Las células fueron mantenidas a cada concentración durante un mínimo de una semana y hasta que se adaptaron lo suficiente a una concentración de metotrexato, de acuerdo a lo determinado visualmente . Los medios acondicionados de cada uno de los clones fueron ensayados a cada concentración de metotrexato para determinar el nivel de expresión de cada anticuerpo al HGF, Los medios fueron ensayados por ELISA estándar y ensayos intercalados de fluorescencia (TRF) para medir semicuantit tivamente la unión de los anticuerpos a HGF a placas recubiertas con HGF humano. Los clones amplificados con metotrexato con niveles de expresión de anticuerpos más alto fueron adaptados para crecer en medio de producción libre de suero como sigue. Los clones fueron tripsinizados del recipiente de cultivo, centrifugados, y resuspendidos en 50 mi de medio de producción libre de suero a 4xl05 células/ml en un matraz de agitación de capa sólida 250 mi. Los cultivos fueron incubados en una sala tibia a 37°C y agitados a aproximadamente 125 RPM. Cada 3-4 días las células fueron centrifugadas y diluidas hasta 4x1O5 células/ml con medios de producción libre de suero fresco. El medio de producción libre de suero fresco fue agregado aproximadamente diez veces por cada uno de los cultivos para completar esta fase de adaptación. Ejemplo 7 Purificación del Anticuerpo de Medios Acondicionados de Células Recombinantes Los medios fueron recolectados de los hibridomas descritos en el Ejemplo 1, de las células T 293 de expresión transitoria descritas en el Ejemplo 4, de las transfectantes estables descritas en el Ejemplo 5, y de los clones amplificados con metotrexato descritos en el Ejemplo 6. Los medios de cada una de aquellas fuentes fueron concentradas por separado aproximadamente 10 veces usando un cartucho de enrollado en espiral YM30 (Milipore, Bedford, MA Cat# S10Y30) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. La concentración del anticuerpo presente en cada muestra de medios concentrados fue estimado por Cromatografía de Líquidos de Alto Desempeño (CLAD) . Los anticuerpos fueron purificados de las muestras de medios concentrados por purificación con resina de afinidad usando Proteína A Sefarosa recombinante (rProA) (Amersham, Piscataway, NJ, Cat # 17-1279-03) . La rProA fue lavada primero cuatro veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Después del último lavado, se produjo una suspensión de rProA lavada en PBS mezclando un volumen igual de rProA y PBS . Esa suspensión de rProA fue agregada a cada muestra de medios concentrados a una cantidad de aproximadamente 1 µ? de suspensión de rProA por cada 5 µg de anticuerpo en la muestra de medios, pero no menos de 50 µ? de suspensión de rProA para cualquier muestra de medios . Las muestras de medios/suspensión resultantes fueron incubadas durante la noche a 4°C con agitación. Las - muestras de medios/suspensión fueron entonces centrifugadas para sedimentar la rProA. Las fracciones sobrenadantes que contenían proteína no unida fueron desechadas. Los sedimentos de rProA fueron resuspendidos por separado en 0.5 mi de PBS cada uno. Las muestras de rProA resuspendidos fueron entonces transferidas a tubos Spin-X de 0.45 µp? (CoStar, Corning Y, Cat # 8162) y centrifugadas para remover el PBS. La rProA en los tubos Spin-X fue entonces lavada tres veces con 0.5 mi de PBS por lavado. Las fracciones de anticuerpo fueron eluidas de la rProA en los tubos Spin-X agregando 1.5 volúmenes de glicina 0.1 M, pH 2.7, e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente . Los tubos Spin-X fueron entonces centrifugados y los eluatos de cada tubo Spin-X fueron recolectados por separado. La elución se repitió y dos eluatos de cada tubo Spin-X fueron reunidos. El pH de los eluatos reunidos fue neutralizado con un l/25to del volumen de Tris 1.0 M Tris, pH 9.2. Cada muestra fue entonces filtrada a través de un tubo Spin-X para remover partículas . La concentración de proteína de las preparaciones finales fue determinada por ensayo de Bradford usando IgG humano como estándar. Para evaluar la pureza, las muestras de cada una de las preparaciones finales fueron ensayadas por separado en carriles separados de un gel de SDS-PAGE, teñidas con coomassie y se inspeccionaron visualmente. Ejemplo 8 Caracterización de la Unión de Anticuerpos a HGF A. Mediciones de Afinidad Usando un análisis de afinidad BIAcore®3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) se efectuó el análisis de seis de los anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6 (aquellos finalmente derivados de los hibridomas 3.10.1, 2.4.4, 2.12.1, 1.29.1, 1.75.1, y 1.74.3) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El amortiguador de ensayo para aquellos análisis fue PBS en -0.005% de tensoactivo P20 (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) . La Proteína Recombinante G (Pierce, Rockford, IL) fue inmovilizada a un microcircuito integrado sensor CM5 grado investigación (Biacore, Inc.
Piscata ay, NJ) vía los grupos amina primaria usando el equipo de acoplamiento de amina (Biacore, Inc. Piscataway, NJ) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En sei's muestras separadas, se unieron por separado aproximadamente 200 unidades de resonancia (RU) de cada uno de los seis anticuerpos para HGF a proteína G inmovilizada siguiendo las instrucciones del fabricante. Muestras que comprenden varias concentraciones {0-100 nM) de HGF humano fueron inyectadas sobre la superficie del anticuerpo medido a una velocidad de flujo de 50 µ?/min durante 3 minutos. Los parámetros cinéticos de unión del anticuerpo incluyendo la ka (constante de velocidad de asociación) , kd (constante de velocidad de disociación) , y Ko (constante de equilibrio de disociación) fueron determinados usando el programa de computadora de evaluación 3.1 BIA (BlAcore, Inc. Piscataway, NJ) . Constantes de equilibrio de disociación más bajas indican una mayor afinidad del anticuerpo por HGF. Los datos se presentan en la Figura 6A. Los valores KD de cada uno de los cuatro anticuerpos para HGF (aquellos finalmente derivados de los hibridomas 2.4.4, 1.29.1, 1.74.2, y 2.12.1) fueron también medidos usando un' método de unión en equilibrio. Ese método fue efectuado con un BIAcore® 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) usando PBS con 0.005% de tensoactivo P20
(BIAcore, Inc. Piscataway, NJ) como amortiguador de ensayo. Los cuatro anticuerpos para HGF fueron inmovilizados por separado a microcircuitos integrados sensores C 5 grado investigación (Biacore, Inc. Piscataway, NJ) vía los grupos amino primario usando un Equipo de Acoplamiento de Amina
(Biacore, Inc. Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. En ensayos por separado, cada uno de los cuatro anticuerpos para HGF, sobre un intervalo de concentraciones (de 0.01 nM a 50 nM) fueron incubados por separado en cada una de dos concentraciones diferentes (0.05 nM y 1 nM) de HGF humano en PBS con 0.005% de P-20 y 0.1 mg/mL de BSA a temperatura ambiente durante al menos seis horas. Cada una de aquellas, muestras fue entonces inyectada sobre una superficie de un microcircuito integrado sensor CM5 sobre el cual había sido inmovilizado el mismo anticuerpo para HGF. La señal de unión obtenida fue proporcional al HGF libre en solución. La constante del equilibrio de disociación (KD) fue obtenida del análisis de regresión no lineal de curvas de competencia usando un modelo de unión homogéneo de un sitio de doble curva (KinExA software, Sapidyne Instruments Inc., Boise ID). Aquellos valores de la constante del equilibrio de disociación son representados en la Figura 6B.
B. Especificidad de la Unión de los Anticuerpos a
HGF El HGF humano fue expresado en células CHO o comprado de R & D Systems (R & D Systems, Minneapolis M , Cat # 294-HG-005) . El HGF de ratón recombinante fue preparado usando la secuencia en Liu et al.. Molecular cloning and characterization of cDNA encoding mouse hepatocyte growth factor, Biochim Biophys Acta. 16:1216 (2):299-300 (1993). El HGF de ratón recombinante fue obtenido por la expresión en células de insecto usando un vector de baculovirus, o por la expresión en células 293T. En cualquier caso, el HGF de ratón fue purificado por cromatografía de afinidad con sulfato de heparina . Cada una de las preparaciones del HGF de humano o ratón mostró ser biológicamente activo. El HGF humano indujo una fosforilación de Met humano dependiente de la dosis en células PC3 humanas (ATCC Manassas, VA # CRL 1435) y en células 4T1 de ratón (ATCC Manassas, VA # CRL 2531). El HGF de ratón indujo la fosforilación de Met en células 4T1 de ratón, pero no en células PC3 humanas. El HGF humano y el HGF de ratón fueron ensayados sobre carriles separados de geles de SDS PAGE. El HGF humano y el HGF de ratón fueron ensayados cada uno por separado a 100 ng/carril y a 10ng/carril. Algunos geles fueron ensayados bajo condiciones no reductoras y otros gel s separados fueron ensayados bajo condiciones reductoras usando beta-mercaptoetanol . El HGF humano y el HGF de ratón en los geles SDS PAGE fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa. Aquellas membranas fueron incubadas por separado con uno de los diez anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6. Cada uno de los diez anticuerpos para HGF fue incubado por separado con membranas de nitrocelulosa de geles que contienen HGF humano y HGF de ratón bajo reducción y con membranas de nitrocelulosa de geles que contienen HGF humano y HGF de ratón bajo condiciones no reductoras. Las membranas fueron entonces incubadas con anticuerpo anti-IgG humana de cabra ligado a HRP· (Pierce, Rockford, IL, Cat . # 31412) . LA señal de ese anticuerpo anti-IgG humana de cabra ligado a HRP fue detectado por electroquimioluminescencia (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Cat. # RPN2106) siguiendo las instrucciones del fabricante. La Figura 7 muestra imágenes de geles que prueban cada uno de los diez anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6. Los paneles a la izquierda muestran los geles que prueban cada anticuerpo contra 100 ng de HGF humano (carril 1) , 10 ng de HGF humano (carril 2) , 100 ng HGF de ratón, y 10 ng de HGF de ratón (carril 4) bajo condiciones no reductoras. Los paneles de la derecha muestran geles que prueban cada anticuerpo contra 100 ng de HGF humano (carril 5) , 10 ng de HGF humano (carril 6) , 100 ng de HGF de ratón (carril 7) , y 10 ng de HGF de ratón (carril 8) bajo condiciones reductoras. Cada uno de los anticuerpos . para HGF probados se unió a HGF bajo condiciones no reductoras (carriles 1 y 2) . Ninguno de los anticuerpos para HGF probó unirse significativamente a HGF de ratón bajo condiciones no reductoras (carriles 3 y 4) , o a HGF humano (carriles 5 y 6) o a HGF de ratón (carriles 7 y 8) bajo condiciones reductoras. C. Trazo de Epítope usando Proteínas de Fusión Se construyó un vector de expresión de mamífero que comprende una secuencia de ADNc que codifica para avidina de pollo adyacente al sitio de clonación múltiple del vector pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# V044-50) usando técnicas moleculares estándar (Figura 9A) . El vector incluyó la secuencia señal de avidina de pollo (Figura 9B) para permitir la secreción de proteína de fusión expresadas posteriormente. Los vectores de expresión se construyeron insertando la secuencia que codifica para una proteína blanco particular en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión de la proteína de fusión. Los plásmidos recombinantes o constructos de fusión resultantes codificaron cada uno para una proteína avidina en el N-terminal de una proteína blanco. Usando esta técnica, se prepararon proteínas de fusión que comprenden avidina fusionada a las siguientes proteínas blanco: HGF humana de longitud completa; d5 HGF, la cual es una variante de empalme natural del HGF humano (Rubin, J. et al. PNAS 88: 415-419 (1991)); HGF de ratón de longitud completa; quimera # 1 que comprende una porción terminal del HGF humano (aminoácidos 32-505) y una porción G-terminal de HGF de _yatón...(aminoácidos 508-728); quimera #2 que comprende una porción N- terminal de HGF de ratón (aminoácidos 33-506) y una porción C-terminal de HGF humano (aminoácidos 506-728) ; y quimera #3 que comprende una porción N-terminal de HGF humano (aminoácidos 32-582) y una porción C-terminal de HGF de ratón (aminoácidos 583-728) . Una representación esquemática de las proteínas de fusión se muestra en la Figura 10. El dominio N-terminal del HGF contiene cuatro dominios de kringle, representados por las casillas marcadas K1-K4. El dominio C-terminal del HGF comparte homología con las serina proteasas. Ese dominio es representado por barras. Las casillas abiertas y las barras sólidas indican las secuencias de HGF humano. Las casillas sombreadas y las barras usadas indican secuencias de ratón. Las proteínas de fusión individuales fueron expresadas transitoriamente en células 293T transfectando por separado células con uno de los vectores de expresión de proteína de fusión individuales usando Lipofectamina (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Cat # 18324) siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 48 horas después de la transfección , fueron recolectados y ensayados los medios acondicionados .T En muestras separadas, 5 de los 10 anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6 (aquellos finalmente derivados de los hibridomas 2.4.4, 1.74.1, 1.75.1, 3.10.1, y 2.12.1) fueron incubados por separado con proteínas de fusión que comprenden cada una de las siguientes proteínas blanco: HGF humano de longitud completa, d5 HGF, y HGF de ratón. Después de la incubación, las proteínas de fusión en cada muestra fueron capturadas por separado usando perlas recubiertas con biotina (Spherotech Inc., Libertyville, IL, Cat # TP-60-5) . Los complejos perla-proteína resultantes fueron marcados agregando anticuerpo anti-avidina marcado con FITC {Vector Lab, Burlingame, CA, Cat. # SP-2040) . La presencia de los anticuerpos para HGF fue determinada agregando anticuerpo anti-F(ab')2 humano de cabra marcado con" ficoeritrina (PE) (Southern Biotech Associates, Inc, Birmingham, AL, Cat # 2043-09) . Aquellas muestras fueron entonces sometidas a análisis por el Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS) . Los complejos de perlas marcados con FITC (el cual indicó la presencia de avidina) y/o PE (el cual indicó la presencia de anticuerpo para HGF) fueron detectados en un Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ) . Las gráficas del explorador FACS para los cinco anticuerpos para HGF son presentadas en la Figura 8. En muestras separadas, dos de los diez anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6 (aquellos finalmente derivados de los hibridomas 2.12.1 y 2.4.4) fue on incubados por separado con proteínas de fusión que comprendían cada una de las siguientes proteínas blanco en: HGF humano de longitud completa, d5 HGF, y HGF de ratón, quimera #1, quimera #2, y —quimera—#3. Aquel-las muestras fueron sometidas a análisis por FACS como se describió anteriormente . Los resultados de aquellos experimentos de unión se resumen en la figura 10A, a la derecha del diagrama esquemático. Ni el anticuerpo 2.12.1, ni el 2.4.4 se unieron a la quimera #1. Ambos anticueros 2.12.1 y el anticuerpo 2.4.4 se unieron a la quimera #2. El anticuerpo 2.4.4 se unió a la quimera #3. El anticuerpo 2.12.1 no se unió a la quimera #3. D. Trazo del Epítope Adicional usando Proteínas de
Fusión Para proporcionar información adicional acerca de los epítopes del HGF a los cuales los anticuerpos 2.4.4 y 2.12.1 se unen, se construyeron quimeras de humano/ratón adicionales y se ensayaron como se describió anteriormente en el Ejemplo 8C (Figura 10B) . Los cebadores usados para generar las quimeras se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10 Oligonucleótidos Usados para Generar Quimeras de HGF de Humano/Ratón en Mutaciones , Inserciones y Supresiones Puntuales . SEQ ID Oligo # Secuencia n Plásmido Puntos de NO: Recombinante r<xtpimiento o mutación
124 3210-76 ATG CGT CTC CCT TGA TGA 33 pt . mutante hHGFR647Q TGC TGG CTG CAT TTC 125 3201-75 ¦ ATG CGT CTC TCA AGG GAA 33 pt . mutante · hHGFR647Q GGT GAC TCT GAA TGA 126 3201-72 ' ATG CGT CTC TAA CTA GGT 36 pt . mutante hHGFN601S AAA TCA ATC GTA CTA ACA 127 3201-71 ATG CGT CTC TAG TIA TGG 35 pt. mutante hHGFN601S ATG CAC AAT TCC TGA AA 128 3201-70 ATG CGT CTC AAT TAT CCA 32 pt . mutante hHGFD592N GGA CAG CAG GCC TG 129 3201-69 ATG CGT CTC ATA ATT TTG 37 pt . mutante hHGFD592N TTA GTA CGA TTG ATT TAC 130 3201-68 ATG CGT CTC GCG ?G? CTC 32 pt . mutante hHGFC56IR ATC TCC TCT TCC GT 131 3201-67 ATG CGT CTC AAA CGC AAA 34 pt. mutante hHGFC56IR CAG GTT CTC AAT GTT T 132 3201-66 ATG CGT CTC CTT TCG TGG 34 pt. mutante hHGFG555E ACA TCA TGA ATT CCA A 133 3201-65 ATG CGT CTC CGA AAG AGG 34 pt. mutante hHGFG555E AGA TGA GAA ATG CAA A
Tabla 10 Oligonucleótidos Usados para Generar Quimeras de HGF de Humano/Ratón en Mutaciones, Inserciones y Supresiones Puntuales (Continuación)
SEQ ID Oligo # Secuencia n Plásmido Puntos de NO: Recombinante rompimiento o mutación
134 3201-64 GAG CAG CTG CTA GCA AGC 24 sitio de HHGF n- TG CTA restricción terminal+Notl
135 3167-41 ATG CGT CTC AGA GAC TTG 35 supresión supresión de AAA GAC TAT GAA GCT TG itiHGF DK
136 3167-42 ATG CGT CTC GTC TCT GGC 34 supresión supresión de TGG AAA ACA TTG TCT T mHGF DK
137 3167-44 ATG CGT CTC AAC AAA GAC 38 inserción inserción TTG AAA GAT TAT GAA GCT de hHGF DK TG 138 3167-43 ATG CGT CTC TTT GTT TCG 36 Inserción inserción AGA AGG GAA ACA CTG TCG de hHGF DK
139 3167-37 ATG CGT CTC AAG CTT GCC 29 quimera 9 hHGF AGG CCT GCT GT aa586-3'
140 3167-50 ATG CGT CTC AAG CTT CAG 33 quimera 9 mHGF 5'- TAA AAC CAA GTC TGA aa585
141 3167-38 ATG CGT CTC AAG CTT GCT 30 quimera 8 mHGF CGA CCT GCA ATC aa586-3'
142 3167-39 ATG CGT CTC AAG CTT CAI • 33 quimera 8 hHGF 5'- ITAA AAC CAG ATC TGA aa585
143 3167-37 ATG CGT CTC AAG CTT GCC 29 quimera 7 hHGF AGG CCT GCT GT aa586-3'
144 3167-40 ATG CGT CTC AAG CTT CAG 33 quimera 7 mHGF 5'- ' TAA AAC CAA GTC TGA aa585
145 3167-38 ATG CGT CTC AAG CTT GCT 30 quimera 3 mHGF CGA CCT GCA ATC aa586-3' Tabla 10 Oligonucleótidos Usados para Generar Quimeras de H6F de Humano/Ratón en Mutaciones, Inserciones y Supresiones Puntuales (Continuación)
SEQ ID Oligo # Secuencia n Plásmido Puntos de NO: Reco binante rcnpimiento o mutación
146 3167-39 ATG CGT CTC AAG CTT CAT 33 quimera 3 hHGF 5'- TAA AAC CAG ATC TGA aa585
147 3167-35 ATG CGT CTC TAG GAT GGA 33 quimera 2 hHGF TGG ??? GTT TGA GAT aa507-3'
148 3167-36 ATG CGT CTC ATC CIA CTG 34 quimera 2 mHGF 5'- TTG TTT GTG TTG GAA T aa506
149 3144-31 ATG CGT CTC TAG GAT GGA 34 quimera 1 mHGF TGG TTA GTT TGA AAT A aa507-3'
150 3080-16 ATG CGT CTC ATC CTA TGT 31 quimera 1 hHGF 5'- · TTG TTC GTG TTG G aa506
151 3080-04 ATG CGT CTC ATG CAT CCA 32 quimera 6 hHGF AGG TCA AGG AGA AG aa307-3'
152 3144-28 ATG CGT CTC ATG CAT TCA 32 quimera 6 - mHGF 5'- GTT GTT TCC ATA GG aa306
153 3079-84 ATG CGT CTC ATG CAT GAC 31 quimera 5 hHGF CTG CAA TGG GGA G aa213-3'
154 3144-27 ATG CGT CTC ATG CAT TCA 33 quimera 5 mHGF 5'- ACT TCT GAA CAC TGA aa212
¦ 155 3079-77 ATG CGT CTC ATG CAT CAT 31 quimera 4 hHGF TGG TAA AGG ACG C aal-29-3'
156 3079-78 ATG CGT CTC ATG CAG TTT 38 quimera 4 mHGF 5'- CTA ATA TAG TCT TTG TTT aal28 TC
Tabla 10 Oligonucleótidos Usados para Generar Quimeras de HGF de Humano/Ratón en Mutaciones , Inserciones y Supresiones Puntuales (Continuación)
La Figura 10B muestra dibujos esquemáticos de las moléculas quiméricas de HGF de ratón y humano creadas para el estudio, con el comportamiento de unión de los anticuerpos 2.12.1 y 2.4.4 a cada quimera indicada al lado derecho de la Figura. Los quimeras # 1-3 en este estudio fueron idénticas a las quimeras # 1-3 descritas en el Ejemplo 8C y la Figura 107A. Las quimeras # 4-6 incorporaron cantidades crecientes de la N-terminal del HGF de ratón en una molécula de HGF en otras circunstancias enteramente humana. La quimera #7 utilizó los aminoácidos 507-585 de HGF de ratón y una molécula de HGF en otras circunstancias humana, y la quimera #8 utilizó los aminoácidos 507-585 del HGF humano en una molécula de HGF en otras circunstancias de ratón. La quimera #9 fue construida a partir de los aminoácidos 1-585 de HGF de ratón y los aminoácidos 586-731 de HGF humano. La unión de los anticuerpos 2.4.4 y 2.12.1 a las proteínas quiméricas fue ensayada como se describe en el Ejemplo 8C. Después de la incubación de cualquiera del anticuerpo 2.4.4 o el anticuerpo 2.12.1 con una de las proteínas de fusión, las proteínas de fusión en cada muestra fueron capturadas por separado usando perlas recubiertas con biotina (Spherotech Inc.,. Libertyville, IL, Cat # TP-60-5) . Los complejos de perla-proteína resultantes fueron marcados agregando anticuerpo anti-avidina marcado con FITC (Vector Lab, Burlingame, CA, Cat. # SP-2040) . La presencia de anticuerpos para HGF fue determinada agregando anticuerpo anti-F(ab')2 humano marcado con ficoeritrina (PE) (Southern Biotech Associates, Inc, Birmingham, AL, Cat # 2043-09) . Aquellas muestras fueron entonces sometidas a análisis por el Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS) . Los complejos de perlas marcados con FITC (la cual indicó la presencia de avidina) y/o PE (la cual indicó la presencia de anticuerpo para HGF) fueron detectados en un Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ) . En algunos casos, después de la normalización de la expresión usando FITC, se efectuó el análisis FACS de un solo color siguiendo la unión del anticuerpo por la marca de PE. Este marca incrementó la sensibilidad del ensayo y ayudó a la método edición de la unión los constructos o plásmidos recombinantes que no fueron expresados a niveles muy altos . Como se muestra en la Figura 10B, ambos anticuerpos 2.4.4 y 2.12.1 se unieron a la quimera #8 (Figura 10B) , la cual contiene los aminoácidos 507-585 del HGF humano. Aquellos resultados sugirieron que aquella región contiene residuos implicados directa o indirectamente en la unión del anticuerpo 2.4.4 y 2.12.1 al HGF. Las quimeras que contenían la secuencia de ratón en esta misma región 507-585 (quimeras 7 y 9) no se unieron a los anticuerpos 2.12.1 o 2.4.4. La quimera 3 no se unió al anticuerpo 2.12.1 pero se unió al anticuerpo 2.4.4, a pesar de la presencia de los aminoácidos 507-585 del HGF humano. Para obtener información adicional acerca de los aminoácidos 507-585 del HGF humano
(GWMVSLRYRN HICGGSLIKESWVLTARQCFPS -- DLKDYEAWLGIHDAHGRGDEKCKQVL VSQLVYGPEGSDLVL (SEQ ID NO : 123) (véase la Figura 10D) ) , se creó HGF mutante que ¦ contenía mutaciones puntuales específicas cambiando el residuo humano a residuo de ratón dentro la. región de los aminoácidos 507-585 (Figura 10C) , usando los conjuntos de cebadores expuestos en la Tabla 10. Se construyeron proteínas de fusión de HGF humano-avidina que contienen cinco cambios simples de aminoácido no conservativos de la secuencia del HGF humano a la secuencia de HGF de ratón (No. de Acceso del Genbank NM_ 000601 y N _010427, respectivamente) . También fueron creados los constructor o plásmidos recombinantes adicionales, uno que contenía la inserción de dos aminoácidos en la secuencia del HGF humano, y el otro que contenía una supresión de dos aminoácidos de la secuencia de ratón (Figura 10C) . Esos constructor o plásmidos recombinantes fueron expresados y sometidos a análisis de unión de acuerdo a lo descrito en los Ejemplos 8C y 8D. Después de la incubación de cualquiera del anticuerpo 2.4.4 o el anticuerpo 2.12.1 con una de las proteínas mutantes, las proteínas mutantes en cada muestra fueron capturadas por separado usando perlas recubiertas con biotina (Spherotech Inc., Libertyville, IL, Cat # TP-60-5) . Los complejos de perla-proteína resultantes fueron marcados agregando anticuerpo anti-avidina marcado con FITC (Vector Lab, Burlingame, CA, Cat. 3 SP-2040) . La presencia de los anticuerpos para HGF fue determinada agregando anticuerpo anti-F(ab')2 marcado con humano con ficoeritrina (PE) (Southern Biotech Associates, Inc, Birmingham, AL, Cat # 2043-09) . Aquellas muestras fueron entonces sometidas a análisis con el Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS) . Los complejos de perlas marcados con FITC (la cual indica la presencia de avidina) y/o PE (la cual indica la presencia de anticuerpo para HGF) fueron detectados en un Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ) . En algunos casos, después de la normalización de la expresión usando FITC, se efectuó un
—análisis- FACS—de—-un solo- color siguiendo la unión del anticuerpo por la marca de PE. Este método incrementó la sensibilidad del ensayo y ayudó a la medición de la unión con constructos o plásmidos recombinantes que no fueron expresados a niveles muy altos . Se encontró que las mutaciones en el aminoácido 561, pero no en los aminoácidos 592, 601 o 647, perturbaron la unión entre el HGF humanó mutante y el anticuerpo 2.12.1 así como entre el HGF humano mutante y el anticuerpo 2.4.4. La mutación en el aminoácido 555 perturbó la unión del anticuerpo 2.12.1, pero no la interferencia con la unión del anticuerpo 2.4.4. La inserción de los dos aminoácidos de ratón 5 0N y 5 1K, no presentes en la secuencia human (véase la Figura 10D) , perturbó la unión de cualquier anticuerpo. La supresión de aquellos dos aminoácidos de la secuencia de HGF de ratón, no dio como resultado la unión de cualquier, anticuerpo al HGF de ratón. E. Trazo del Epítope por Ensayos de Protección de
Proteasa Los ensayos de protección de proteasa clásicos complementarios fueron también efectuados para identificar los epítopes de HGF unidos por el anticuerpo 2.12.1. Véase Yi and Skalka, Mapping Epitopes of Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Integrase with Limited Proteolysis and Matrix-Assisted Laser Desorption lonization Time-of-Flight Mass Spectrometry, Biopolymers- (Peptide Science) 55: 308- 318 (2000). El HGF humano __3_0 µ/10µ1) fue mezclado con anticuerpo 2.12.1
(40 µ9/ µ1) en 200 µ? de amortiguador Tris 0.1 M, pH 7.5 e incubado sobre hielo durante .30 minutos. La digestión con tripsina (^g) se llevó a cabo a 37°C durante 1 hora. El material digerido fue sometido a CLAD en fase inversa para la separación del péptido. Se llevó a cabo en paralelo una digestión con tripsina similar a la del HGF humano solo, sin anticuerpo 2.12.1. La columna de CLAD (Vydac C18, 2.1 x 150 mm, Vydac Inc., Hesperia CA) fue trabajado en ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% con un gradiente de elusión de 2-35% de acetonitrilo en TFA al 0.1%. El trazo de UV de los péptidos eluyentes fue registrado por un dispositivo de CLAD 1090 (Hewlett Packard, Palo Alto) . Los dos mapas de CLAD fueron comparados para investigar los péptidos que fueron protegidos por la unión al anticuerpo 2.12.1 (Figura 11A) . Posteriormente se efectuaron el secuenciamiento N-terminal y la espectrometría de masas para identificar los péptidos protegidos específicamente. El secuenciamiento del péptido N-terminal se efectuó por degradación de Edman en un secuenciador de proteínas ABI-Procise (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Los aminoácidos en cada ciclo fueron identificados por el tiempo de retención sobre un dispositivo de CLM) acoplado comparando con estándares de aminoácidos . La espectrometría de masas de los fragmentos protegidos fue efectuada en un espectrómetro de masas Perceptive Voyager (Applied Biosystems, Framingham, MA) . La ionización por deserción con láeer auxiliada con matriz (MALDI) fue efectuando usando la matriz, ácido 4-hidroxicianocinámico (HCCA) o ácido sinápico. Los pesos moleculares fueron determinados por calibración en relación con estándares conocidos (cadena beta de insulina oxidada y citocromo c) . La subunidad alfa del HGF humano abarca los aminoácidos 32-494, y la subunidad beta abarca los aminoácidos 495-728 (véase la entrada P14210 de Swiss-Prot para el HGF). La unión del anticuerpo 2.12.1 al HGF humano protegió dos picos, T33 y T38.6. (Figura 11A) . El pico T38.6 contenía dos peptidos, ambos correspondientes a secuencias en o cerca del inicio de la subunidad beta del HGF maduro (véase la Figura 10b) , secuencia que comienza en el texto en negrillas, subrayado (W GIPTRTN (SEQ ID NO: 172) ) y la Figura 11C) . T33 se derivó de la subunidad alfa (Figura 11 C) . Sobre la base de la espectrometría de masas, las masas observadas medidas de los dos peptidos en el pico T38.6 fueron de 7165 y 6840 Daltons, respectivamente. Sobre la base de los posibles sitios de escisión de tripsina presentes en la secuencia de HGF (véase, por ejemplo, el residuo de arginina subrayado y en negrillas en el aminoácido 559 del HGF humano en la Figura 10D) , se predijo que el residuo de arginina número 559 define el C-terminal de los péptidos protegidos. También se diseñó otro experimento complementario para investigar los péptidos de unión de anticuerpo. La mezcla de HGF y anticuerpo 2.12. 1, como se describió anteriormente, fue digerida con tripsina durante una hora y entonces fue sometida a filtración por Microcone* 10 (Millipore Corp., Bedford, MA) para remover los péptidos no unidos . Se esperaba que los péptidos unidos fuesen capturados por la membrana junto con el anticuerpo 2.12.1. Se agregó HGF humano Intacto (15 µg) a la mezcla de péptido-anticuerpo 2.12. Para eluir los péptidos unidos del complejo. Las muestras fueron incubadas durante la noche a 4°C y fueron sometidas nuevamente a filtración por Microcon® 10 para separar los péptidos eluidos del HGF del anticuerpo y HGF intacto. Ambas muestras (péptidos unidos y no unidos) fueron analizadas por CLAD en fase inversa (Figura 11 B) . Los péptidos unidos fueron aislados por CLAD y sometidos a secuenciamiento N-terminal y espectrometría de masas como se describió anteriormente . Cuando se usó HGF para eluir los péptidos unidos, se observó que eluía un pico de péptido grande (T48 en la Figura 11 B) del complejo anticuerpo-HGF y se identificó por secuenciamiento del péptido N-terminal que contenía las mismas dos secuencias de la subunidad beta encontradas en T38.6, anteriormente. El tamaño del péptido del pico T48 fue heterogéneo sobre la base de la espectrometría de masas y por lo tanto no pudo ser predicho un C terminal preciso de estos datos . _ Otros tres__picos (marcados #; en la Figura 11 B) no contenían péptido o un péptido de origen desconocido, no relacionado con el HGF. Juntos, esos dos experimentos indicaron que la región N- erminal de la subunidad beta del HGF es parte del epítope del anticuerpo 2.12.1. éstos datos complementan los datos en el Ejemplo 8D, donde se encontró qué los epítopes implicados en la unión se localizaban dentro de los aminoácidos 507-585 del HGF humano. El análisis mutacional y las masas moleculares de los péptidos protegidos mostraron que el epítope de unión de anticuerpo del HGF se localiza dentro de los aminoácidos 495-556 del HGF humano. F. Unión Competitiva de los Anticuerpos Los anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6 derivados simultáneamente del hibridoma 2.4.4 (anticuerpo 2.4.4) y los anticuerpos para HGF derivados finalmente del hibridoma 2.12.1 (anticuerpo 2.12. 1) fueron marcados con FITC para usarse en ensayos de competencia como sigue. Los anticuerpos 2.4.4 y 2.12.1 fueron dializados por separado en PBS pH 8.5. Se agregaron marcas de FITC (isómeros mezclados de ácido {6-fluorescein-5- (y-6) -carboxamido] hexanoico, succinimidil éster (5(6)-SFX]) (Molecular
Probes. Cat # F-2181) a cada uno de los dos anticuerpos dializados a una relación molar de 5:1 (marca : anticuerpo) de una solución patrón de marca de FITC y 5mg/ml en DMSO. Aquellas mezclas fuero __incubadas a temperatura ambiente (20-22°C) durante la noche en la oscuridad. Las mezclas fueron entonces cada una ensayada por separado a través de columnas Pharmacia PD-10 (Amersham, Piscataway, NJ) las cuales habían sido equilibradas con PBS . Las preparaciones resultantes fueron leídas en un espectrofotómetro a 280 n y 495 nM. Las concentraciones de anticuerpo de aquellas preparaciones fueron capturadas usando absorbancia a 280 nm. La relación de anticuerpo marcado a anticuerpo no marcado fue calculada usando la siguiente fórmula: Ax X PM del anticuerpo = moles de anticuerpo marcado E mg de anticuerpo/ml moles de anticuerpo no marcado
donde Ax= absorbancia de la marca a 495 nm, y E= coeficiente de extinción de la marca = 77500. Típicamente, el anticuerpo fue marcado a aproximadamente 3:1 (anticuerpo marcado con FTIC : anticuerpo no marcado) . Se evaluó la capacidad de cada uno de los dos anticuerpos marcados para competir por la unión con cada uno de los otros nueve anticuerpos para el HGF. Cada uno de los dos anticuerpos marcados para HGF fue incubado por separado con HGF y cada uno de los dos anticuerpos marcados para HGF fue también incubado por separado con HGF en presencia de un exceso molar de 50 veces de uno de los otros nueve anticuerpos para HGF que no habían sido marcados . De este modo , en nueve muestras separadas , el anticuerpo 2 . 4 . 4 fue incubado por separado con HGF j unto con cada uno de los otros nueve anticuerpos para HGF que no habían sido marcados, de igual modo, en nueve muestras separadas, el anticuerpo marcado 2.12.1 fue incubado por separado con HGF junto con cada uno de los otros nueve anticuerpos para HGF que no habían sido marcados. Cada una de esas -combinaciones también se repitió usando la variable de empalme d5 del HGF en lugar del HGF de longitud completa. El control de competencia positivo para esos ensayos de competencia fue para incubar cada anticuerpo marcado con un exceso molar de 50 veces del mismo anticuerpo que no fue marcado. De este modo el anticuerpo 2.12.1 marcado con FITC fue incubado en presencia de, y por separado en ausencia de, un exceso molar de 50 veces el anticuerpo de 2 . 12 . 1 no marcado . De igual modo el anticuerpo 2 .4 . 4 marcado con FICT fue incubado de , y en ausencia de , un exceso molar de 50 veces el anticuerpo marcado de 2 .4 .4 . Como se esperaba , las señales de fluorescencia de las muestras en presencia de un exceso molar de 50 veces de los anticuerpos no marcados fueron significativamente menores que las señales de fluorescencia de las muestras en las cuales no se agregaron anticuerpos no marcados .
Los perfiles de unión se proporcionan en la Figura 12. Las Figuras' 12A y 12B muestran experimentos usando anticuerpos 2.12.1 marcados. Claves para las curvas en todos los paneles de 12A y 12B: A: control negativo (anticuerpo 2.12.1 marcado con FICT sin HGF) ; B: __control positivo
(anticuerpo 2.12.1 marcado con FITC con HGF); C: anticuerpo 1.74.1; D: anticuerpo 1.75.1; E: anticuerpo 1.29.1; F: anticuerpo 3.10.1; G: anticuerpo 1.61.3; H: anticuerpo 1.24.1; I: anticuerpo 1.60.1; J: anticuerpo 2.40.1; · K: anticuerpo 2.12.1; L: anticuerpo 2.4.4. La Figura 12A muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva usando anticuerpo 2.12.1 fluorescente con la proteina blanco variante de empalme HGF d5. La Figura 12B muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva de un anticuerpo 2.12.1 fluorescente con proteína blanco de HGF de longitud completa. Las Figuras 12C y 12D muestran un experimento usando anticuerpo 2.4.4. marcado. Claves para las curvas en todos los paneles de 12C y 12D: A: control negativo (anticuerpo 2.4.4 marcado con FICT sin HGF); B: control positivo (anticuerpo 2.4.4 marcado con FITC con HGF); C: anticuerpo 1.74.1; D: anticuerpo 1.75.1; E: anticuerpo 1.29.1; F: anticuerpo 3.10.1; G: anticuerpo 1.61.3; H: anticuerpo 1.24.1; I: anticuerpo 1.60.1; J: anticuerpo 2.40.1; K: anticuerpo 2.12.1; L: anticuerpo 2.4.4. La Figura 12C muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva usando anticuerpo 2.4.4 fluorescente con la proteína blanco variante de empalme de HGP. La Figura 12D muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva usando anticuerpo 2.4.4 fluorescente con proteína blanco con HGF de
—longitud—completa Los datos indican que cada uno de los diez anticuerpos para HGF compiten por cada uno de los dos anticuerpos mercados por la unión al HGF completa o d5. Algunos de los anticuerpo se exhibieron con competencia completa con el anticuerpo marcado (por ejemplo, los anticuerpos 2.12.1, 1.24.1 y 2.4.4 compiten completamente con el anticuerpo 2.12.1 marcado con FICT, Figura 12A y 12B, picos H, K y L, respectivamente) . Otros anticuerpo solo compitieron parcialmente por la unión (por ejemplo, los anticuerpos 2.12.1, 2.40.1 y 1.61.3 compiten parcialmente con 2.4.4 marcado con FITC, Figura 12C y 12D, picos K, J y G, respectivamente) . E emplo 9 Ensayos de Elisa Neutralizante Se desarrollo un ensayo de ELISA neutralizante para evaluar si los anticuerpos discutidos en el Ejemplo 6 podrían interrumpir la unión Met-HGF. Placas de 96 pozos Delphia (Cat# AA D-0001, Wallac Inc., Gaithersburg, MD) fueron recubiertas con HGF agregando 100 µ? de HGF a 6.25 g/ml por pozo. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 1 hora o a 4°C durante la noche. Las placas fueron entonces bloqueadas con BSA al ,5% (Cat#; 50-61-00, KPL, Gaithersburg, MD) en PBS que contenía 0.1% de Tween 20 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. — Las mezclas . de prueba fueron preparadas mezclando por separado Met soluble (2nM, 0.256 g/ml) con diferentes concentraciones de un anticuerpo particular para HGF siendo probado. Las concentraciones probadas fueron: 667 nM, 223 n , 74.1 nM, 24.7 nM, 8.2 nM, 2.7 nM, 0.91 nM, 0.30 nM, 0.10 nM, y 0.034 nM. Se agrego un volumen de 100 µ? de una muestra de prueba de cada una de las placas Las placas fueron entonces incubadas a 4°C durante la noche y entonces lavadas 4 veces con PBS que contenia 0.1 % de Tween 20. A continuación se agregaron 100 µ? por pozo de anticuerpo anti-cMetR Biotinilado anticuerpo (Cat#: BAF358, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) a 2 µ9/t?1. Ese anticuerpo se une a los complejos Met-HGF sobre la placa, pero no se une al anticuerpo anti-HGF unido al HGF sobre la placa. Las placas fueron entonces incubadas durante 2 horas con agitación, fueron lavadas 4 veces con PBS que contenía 0.1% de Tween 20. Se agrego Eu-estreptavidina (1:1000 dilución en amortiguador de ensayo) (Cat#; 1244-360, Wallac Inc., Gaithersburg, MD) y las placas fueron agitadas a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas fueron entonces lavadas 4 veces con PBS que contenía 0.1% de Tween 20. A continuación se agregaron 100 µ? de amortiguador mejorador (Wallacinc, Cat.# 1244-105, Gaithersburg, MD) Después de al menos 5, las placas fueron leídas usando el método de Europio sobre Victor 2 (1420 Multilabel Counter, Wallacinc, Gaithersburg, MD) . _ Se_calculó el por ciento de ' inhibición de la unión de Met al HGF (es decir, la neutralización) y se determinaron los valores de CI50 usando la ecuación de ajuste de 4 parámetros Excelfit, Versión 2.0.6, (Microsoft Inc, Seattle, WA) . En presencia de los anticuerpos HGF discutidos en el Ejemplo 6, se neutralizo la unión de Met al HGF. Los datos para dos experimentos se muestran en la Figura 13. Ejemplo 10 Neutralización en las Células A. fosforilación de Met El HGF induce la fosforilación de Met en células PC-3 (ATCC, Manassas, VA # CRL 1435) . Las células PC-3 se hicieron crecer en placas de cultivo tisular Falcon de 96 pozos (VWR, San Diego, CA, Cat.# 62740-081) agregando lxlO4 células PC-3 por pozo en 100 µ? de RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat.# 11875- 093) con un contenido del 5% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT, Cat.# SH 30070.03) y lx de penicilina, estreptomicina, glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat.# 10378-016) . Después de 24 horas de crecimiento a 37°C bajo 5% de C02, las células fueron enjuagadas una vez con DMEM bajo en glucosa (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat.# 11885-084) con un contenido de 0.1% de albúmina sérica bovina (Sigma, Louis, MO, Cat.# A-3156) y se incubo durante 18 a 20 horas con 100 µ? de DMEM bajos en glucosa con un contenido del 0.1% de albúmina sérica bovina jSigma, Louis, MO, Cat.# A-3156) . _ _ Se prepararon ocho diluciones diferentes de cada uno de los diez anticuerpos para HGF del Ejemplo 6 por dilución en serie (DMEM bajo en glucosa con 0.1% de albúmina sérica bovina) que contenía 200 µg/ l de HGF. Las concentraciones de los anticuerpos para HGF en diluciones separadas fueron de: 200 nM, d7 M, 22 nM, 7 nM, 2.5 M, 1 nM, 0.3 nM, y 0.1 nM de un anticuerpo particular para HGF. Aquellas diluciones de anticuerpo /HGF fueron incubadas durante 30 minutos a 37°C. Las células PC-3 fueron enjuagadas una vez con 100 µ? de DMEM bajo en glucosa con un contenido de 0.· 1% de albúmina sérica bovina. Se agregaron entonces por separado 100 µ? de cada una de las diluciones de anticuerpo/HGF a pozos separados de células PC-3. Después de la incubación a 37°C bajo 5% de C02, las diluciones de anticuerpo/HGF que fueron aspiradas de los pozos, las placas fueron colocadas sobre hielo durante 1-2 minutos. Las células fueron enjuagadas una vez con 100 µ? de PBS enfriada en hielo que contenía ortovanadato de sodio 0.3 (Sigma, Louis, MO, Cat.# S-6508) . Las células lavadas fueron incubadas durante 15-30 minutos sobre hielo en 60 µ? en amortiguador de lisis con un contenido del 1% de Tritón X-100 (Pierce, Rockford,IL, Cat.# 28314), Tris pH8 , NaCI 100 mM, ortovanadato de sodio 0.3 mM, (Sigma, Louis, MO, Cat.# S-6508) y 1 X de cocktail inhibidor de proteasa (Sigma Cat.# P-8340) . Se prepararon perlas recubiertas con anticuerpo Anti-Met incubando, Dynabeads M-280 Streptavidin (IGEN International, Gaithersburgh, MD, Cat.# 110029) con 4 µg ml anti-Met-biotina de cabra (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, Cat.# BAF 358) durante 30 minutos a temperatura ambiente en PBS con un contenido de 1% de albúmina sérica bovina (Sigma, St. Louis, MO, Cat.# A-7888) , 0.1% de Tween 20 (Biorad, Hercules, CA, Cat.# 170-6531) . Se colocó un volumen de 25 µ? de perlas recubiertas con anticuerpo anti-Met en placas de ensayo Costar de 96 pozos (Corning, NY, Cat.#3365). Se agrego por separado un volumen de 25 µ? a cada uno de los diferentes lisados de células PC-3 a cada pozo que contenia perlas recubiertas con anticuerpo anti-Met. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se agregó un volumen de 122.5 µ? de PBS que contenia 1% de albúmina sérica bovina (Sigma, Louis, MO, Cat.# A-7888), 0.1% de Tween 20 (Biorad, Hercules, CA, Cat.# 170-6531) y 0.04 µg del anticuerpo anti-Fosfotirosina con 4G10 · (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, Cat.# 05-321) y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se agregó un volumen de 12.5 µ? de PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina, 0.1% de T een 20 y 8 µg/ml anti-marca ORI-TAG de ratón (IGEN International, Gaithersburgh, MD, Cat. # 110087) y las placas fueron - incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. La señal (expresada en conteos IGEN) fue determinada en el lector IGEN M8 (IGEN International, Gaithersburgh, MD) . Los valores de CI50 fueron calculados usando la ecuación de ajuste de 4 parámetros y el paquete de programas y sistemas de programación o software Excelfit, versión 2.0. 6, (Microsoft Inc., Seattle WA.) . Los datos para los dos experimentos usando el formato de IGEN se muestran en la Figura 14. Para cada uno de los diez anticuerpos para HGF, los valores de . CISo estuvieron en el intervalo de la nanomolar a la subnanomolar . B. Neutralización del crecimiento/sobrevivencia de U-87 MG Las células U-87 MG (ATCC # HTB-14) son una linea de glioblastoma humano que expresa tanto Met como HGF. El crecimiento/sobrevivencia de las células en cultivo no es mejorado por el HGF exógeno. El Met endógeno, sin embrago parece ser activado por el HGF endógeno bajo las condiciones de crecimiento. La perturbación de la unión del HGF endógeno al no endógeno da como resultado la disminución del crecimiento y/o sobrevivencia. Las células U-87 MG se hicieron crecer a placas de ensayo Costar de 96 pozos (Corning, NY, Cat. # 3365) agregando 800 células por pozo en medios IMEM (Gibco BRL, Rockville, MD, Catálogo # 11125-028) con un contenido del 5% de FBS . Después de aproximadamente 24 horas , cada una de once concentraciones diferentes de ' cada uno de los diez anticuerpos para HGF del Ejemplo 6 se agregaron a pozos separados de células U-87 MG. Las concentraciones de los anticuerpos para HGF en las diluciones separadas fueron: 100 g/ml, 33.3 µg/mlf 11.1 µg/ml/ 3.7 µg/mlí 1.2 µ9/t?1, 0.4 µ9/t?1, 0.14 µ9/t?1, 0.05 µg/ml/ 0.015 µg/ml , 5.1 µ9/p?1, y 1.7 µ /?t?1 de un anticuerpo particular para HGF. Siete días después de la adición de los anticuerpos para HGF, los medios fueron removidos de las placas y las células fueron fijadas con 100 µ? de ácido tricloroacético al 10% (Sigma Inc., St Louis, MO Cat# T-9159) por pozo e incubadas a 4°C durante 1-2 horas. Los pozos fueron enjuagados 5 veces con agua corriente. Las células fijadas fueron teñidas con 100 µ? de sulforrodamina B al 0.4% (Sigma, St Louis, MO Cat#: S^9012) en ácido acético al 1% (Fisher, Pittsburgh, PA Cat#: UN2789) durante una incubación de diez minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células fueron lavadas 5 veces con ácido acético al 1% y secadas con aire. La densidad óptica de las placas fue leída a 540 nm en un lector de placas microtituladoras (SpectraMax PLUS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . La densidad óptica es proporcional a la cantidad total de proteína presente en la raonocapa celular, y de este modo es una medida de la sobrevivencia/proliferación celular durante el periodo de ensayo de 7 días. Para calcular los valores de CI50, se calculó el por ciénto de inhibición comparando las células
_incubadas c n_ un, anticuerpo control _isotipp_, p sin anticuerpo. Los valores de CI50 fueron calculados usando la ecuación de ajuste de cuatro parámetros y el paquete de programas y sistemas de programación Excelfit, versión 2.0. 6, (Microsoft Inc., Seattle WA) . Los datos para los dos experimentos se muestran en la Figura 15. Los diez anticuerpos para HGF descritos en el Ejemplo 6 exhiben el crecimiento/sobrevivencia de las células U-87 MG. Los valores de CIS0 de cada uno de los anticuerpos fueron típicamente menores de 100 nM. Ejemplo 11 Neutralización en Tumores Xenoinjertados A. Modelo de Enfermedad Residual Mínima de Xenoinjerto de U-87 MG Se hicieron crecer células U-87 MG casi hasta la confluencia y entonces se suspendieron en medio libre de suero a una concentración de 25xl06 células/ml. Visualmente se evaluó que las células eran >98.5% viables, de acuerdo a lo determinado por exclusión de azul de tripán. Para probar un solo anticuerpo para HGF, se inyectaron subcutáneamente 5x10s células U-87 MG. En medios libres de suero en el flanco derecho de cincuenta ratones hembra sin pelo (CD1 Nu/Nu, Charles Ri er Laboratories, Wilmington, Mass.). Los cincuenta ratones fueron colocados en cinco grupos de diez ratones cada uno. Cada ratón dentro de un grupo particular de diez ratones fue tratado con inyección intraperitoneal con la misma dosis y el mismo anticuerpo para HGF discutido en el Ejemplo 7, o con la región constante de IgGl (isotipo control) . Las dosis de anticuerpo probadas fueron de: 1 µg, 3 µg, 10 µg, y 30 µg por inyección. Las inyecciones de anticuerpo fueron efectuadas dos veces por semana : durante cuatro semanas, comenzando el dia 2 después de la inyección de las células U-87 MG. Las mediciones del tumor y pesos corporales fueron registradas dos veces por semana durante 30 días y los volúmenes del tumor fueron calculados usando la fórmula : longitud x ancho x altura . Los resultados f eron analizados con el programa estadístico StatView® (SAS Institute, Inc., Cary, N. C.) usando ANOVA de mediciones repetidas, seguidas por la prueba post hoc de Scheffe. En experimentos separados, cada uno de los diez anticuerpos para HGF discutidos en el Ejemplo 6 fueron probados en este modelo. Un experimento dosis-respuesta para el anticuerpo: 2.4.4 se muestra en la Figura 16A. Las flechas indican el tiempo de dosificación, y las dosis se muestran en la leyenda. El número de animales a cada dosis (de 10) sin tumor medible es indicado entre paréntesis. Para las dos dosis, más altas probadas, 10 iq administrados dos veces por semana en 30 µg administrado dos veces por semana, la inhibición del crecimiento del tumor fue estadísticamente significativa cuando se comparó con los animales control que recibieron el isotipo control a 30 g dos veces por semana (IgG2 human #PK16.3.1, Abgenix Inc. Fremont, CA) . Se observó que una ligera inhibición del crecimiento, pero no estadísticamente significativa con las dosis más bajas (1 a 3 µg dos veces por semana) de 2.4.4. Los datos son presentados como la media + error estándar; n=10 animales por grupo y una p<0.05 considerada estadísticamente significativa. Los experimentos de prueba para los otros nueve anticuerpos para HGF del Ejemplo 6 mostraron una inhibición completa similar del crecimiento del tumor a las dosis más altas . B. Modelo de Enfermedad Establecida con Xenoinjerfco de ü-87 MG. Se inyectaron células U-87 MG de medios libres de suero en ratones sin pelo, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el Ejemplo 11A. Los tumores se dejaron crecer durante aproximadamente dos semanas hasta que alcanzaron un volumen de ~200 mm3 antes de que comenzara la dosificación intraperitoneal con anticuerpos para HGF. Los ratones fueron tratados dos veces por semana 2.4.4 a 200 µg, 100 µg o 30 µg dos veces por semana, comenzando el día 16, de acuerdo a lo indicado por las flechas en la Figura 16B. El volumen del tumor fue medido y evaluado como se describió anteriormente. El número de animales (de 10) sin tumor medible el día 30 se indica entre paréntesis. Se observó inhibición completa del crecimiento del tumor U-87 MG a todas las dosis. Se logró una regresión estadísticamente significativa de los tumores establecidos al día 29. En experimentos separados, cada uno de los diez anticuerpos para HGF discutidos en el Ejemplo 6 fue probado en este modelo y se observó una inhibición completa a las dosis más altas de cada anticuerpo. C. Anticuerpos de Clasificación en un modelo de enfermedad residual mínima con U-87 MG Para determinar la frecuencia relativa de los diez anticuerpos para HGF discutidos en el Ejemplo 6 en el modelo de tumor U-87 MG discutido en el Ejemplo 11A, se eligió una dosis baja que únicamente inhibió parcialmente el crecimiento del tumor en el modelo de enfermedad residual mínima. Estudios dosis-respuesta preliminares (Figura 16A) sugirieron que 5 µg dos veces por semana darían una inhibición parcial por los anticuerpos para HGF. Se condujo una serie de experimentos cabeza a cabeza comparando hasta cinco anticuerpos diferentes para HGF. Los resultados de dos de esos experimentos se muestran en las Figuras 16C y 16D. Los dos ** indican aquellos anticuerpos para HGF que inhibieron significativamente el crecimiento del tumor en comparación con PBS y anticuerpo IgG2 isotipo control (p < 0.0001) . Se efectuaron experimentos de orden de clasificación usando- el modelo de enfermedad U-87 establecida en el Ejemplo 11B. En aquellos experimentos, se usó una dosis de 10 µg, 2X semana. Los resultados de dos de esos experimentos se muestran en la Figura 16E y 16F. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (3)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a en donde la CDRla comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g h i j k l m n o q, donde el aminoácido a es seleccionado de lisina, arginina o glutamina; el aminoácido b es seleccionado de serina o alananina; el aminoácido c es serina, el aminoácido d es glutamina; el aminoácido e es seleccionado de serina, glicina, o ácido aspártico; el aminoácido f es seleccionado de valina o isoleucina o no está presente; el aminoácido g es seleccionado de leucina o fenilalanina o no está presente; el aminoácido h es seleccionado de fenilalanina o tirosina o no está presente; el aminoácido i es serina o no está presente; el aminoácido j es serina o no está presente; el aminoácido k es seleccionado de asparagina, treonina o no está presente; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, isoleucina o valina; el aminoácido m es seleccionado de lisina, arginina, asparagina o ácido aspártico; el aminoácido n es seleccionado de asparagina o serina; el aminoácido o es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, triptófano o asparagina; el aminoácido p es leucina; y el aminoácido q es seleccionado de alaniña, glicina, o asparagina,- donde la CDR2a comprende una secuencia de _aminoácido . r—s _u.___v. _w_...x,_ donde . _el . aminoácido r es seleccionado de triptófano, alanina, valina, ácido glutámico, o glicina; el aminoácido s es alanina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es seleccionado de treonina, serina o ácido aspártico; el aminoácido v es seleccionado de arginina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de ácido glutámico, glutamina o alanina; y el aminoácido x es seleccionado de serina, asparagina o treonina; donde la CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f g' h' , donde el aminoácido y es seleccionado de glutamina o leucina; el aminoácido z es seleccionado de glutamina, asparagina, o arginina; el aminoácido a' es seleccionado de tirosina, histidina, alanina o serina; el aminoácido b' -es seleccionado de fenilalanina, tirosina, ácido aspártico, asparagina o isoleucina; el aminoácido C es seleccionado de serina, glicina o asparagina; el aminoácido d' es seleccionado de prolina, tirosina, treonina, fenilalanina, ácido aspártico, leucina, o triptófano; el aminoácido e' es prolina; el aminoácido f es prolina o no está presente; el aminoácido g' es triptófano, leucina, prolina, tirosina, o isoleucina; y el aminoácido h' es treonina o asparagina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena pesada de anticuerpo, es capaz de unirse al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) . 2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, y 42. 3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, y 69. 4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, y 79. 5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, y 89. 6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido es un agente de unión específica. 7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo. 8. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende al menos una región determinante de la complementar!edad (CDR) seleccionada de CDRlb, CDR2b y CDR3b donde la CRDlb comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g, donde el aminoácido a es serina o no está presente; el aminoácido b es seleccionado de ácido aspártico o glicina, o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de ácido aspártico, glicina, serina, valina, treonina o isoleucina; el aminoácido d es tirosina; el aminoácido e es seleccionado de tirosina o glicina; el aminoácido f es seleccionado de isoleucina, metionina o triptóf no; y el aminoácido g es seleccionado de histidina, asparagina o serina; donde la CDR2b comprende la secuencia de aminoácidos h i j k l m n o p q r s t u v w x, donde el aminoácido h es seleccionado de triptófano, tirosina, valina, asparagina, o ácido glutámico; el aminoácido i es seleccionado de isoleucina, fenilalanina, o valina; el aminoácido j es seleccionado de asparagina, serina, triptófano o tirosina; el aminoácido k es seleccionado de prolina, serina, tirosina, o histidina; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, serina o ácido aspártico; el aminoácido m es seleccionado de serina o glicina; el aminoácido n es seleccionado de glicina o serina, o no está presente; el aminoácido o es seleccionado de glicina, treonina, ácido aspártico, serina, isoleucina o asparagina; el aminoácido p es seleccionado de treonina, isoleucina o lisina; el aminoácido q es seleccionado de asparagina o tirosina; el aminoácido r es seleccionado de tirosina o histidina; el aminoácido s es seleccionado de alanina o asparagina; el aminoácido t es seleccionado de glutamina, ácido aspártico o prolina; el aminoácido u es seleccionado de lisina o serina; el aminoácido v es seleccionado de fenilalanina, valina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de glutamina o lisina, y el aminoácido x es seleccionado de glicina o serina; donde la CDR3b comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j ' k' 1' m' n' o' p' q' r' , donde el aminoácido y es seleccionado de ácido glutámico, ácido aspártico, serina o glicina o no está presente; el aminoácido z es seleccionado de leucina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, prolina o glicina, o no está presente; el aminoácido a' es seleccionado de ácido glutámico, tirosina o leucina, o no está presente; el aminoácido b' es seleccionado de leucina, asparagina, glicina, histidina, tirosina o triptófano o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de arginina, serina, ácido glutámico, tirosina, glicina o fenilalanina, o no está presente; el aminoácido d' es glicina o no está presente; el aminoácido e' es seleccionado de triptófano o tirosina, o no está presente; el aminoácido f es ácido aspártico o no está presente; el aminoácido g' es seleccionado de serina o arginina, o no está presente; el aminoácido h' es serina o no está presente; el aminoácido i' es seleccionado de glicina o tirosina; o no está presente; el aminoácido j' es seleccionado de tirosina, ácido glutámico o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido k' es seleccionado de tirosina, fenilalanina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido 1' es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, histidina o triptófano o no está presente; el aminoácido m' es seleccionado de tirosina, glicina, ácido aspártico, prolina o serina o no está presente; el aminoácido n' es seleccionado de glicina, valina, tirosina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido- o' es seleccionado de leucina, alanina, glicina, o tirosina, o no está presente; el aminoácido p' es seleccionado de metionina, fenilalanina, o tirosina; el aminoácido q' es ácido aspártico, y el aminoácido r' es seleccionado de valina, tirosina, isoleucina o prolina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena ligera de anticuerpo, es capaz de unirse al HGF. 9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y 43. 10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, y 99. 11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, y 109. 12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, y 119. 13. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-12, caracterizado porque el polipéptido es un agente de unión específica. 14. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-12, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo. 15. Un agente de unión específica aislado, caracterizado porque el agente de unión específica comprende: (i) un primer polipéptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a donde la CDRla comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g h i j k l m n o p q, cuando el aminoácido a es seleccionado de lisina, arginina o glutamina; el aminoácido b es seleccionado de serina o alananina; el aminoácido c es serina, el aminoácido d es glutamina; el aminoácido e es seleccionado de serina, glicina, o ácido aspártico; el aminoácido _f es_ seleccionado de valina o isoleucina o no está presente; el aminoácido g es seleccionado de leucina o fenilalanina o no está presente; el aminoácido h es seleccionado de fenilalanina o tirosina o no está presente; el aminoácido i es serina o no está presente; el ' aminoácido j es serina o no está presente; el aminoácido k es seleccionado de asparagina, treonina o no está presente; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, isoleucina o valina; el aminoácido m es seleccionado de lisina, arginina, asparagina o ácido aspártico; el aminoácido n es seleccionado de asparagina o serina; el aminoácido o es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, triptófano o asparagina; el aminoácido p es leucina; y el aminoácido q es seleccionado de alanina, glicina, o asparagina; donde la CDR2a comprende una secuencia de aminoácido r s t u v w x, donde el aminoácido r es seleccionado de triptófano, alanina, valina, ácido glutámico, o glicina; el aminoácido s es alanina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es seleccionado de treonina, serina o ácido aspártico; el aminoácido v es seleccionado de arginina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de ácido glutámico, glutamina o alanina; y el aminoácido x es seleccionado de serina, asparagina o treonina; donde la CDR3a comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f' g' h' , donde el aminoácido y es seleccionado de glutamina o leucina; el aminoácido z es seleccionado de glutamina, asparagina, o arginina; el aminoácido a' es seleccionado de tirosina, histidina, alanina o serina; el aminoácido b' es seleccionado de fenilalanina, tirosina, ácido aspártico, asparagina o isoleucina; el aminoácido c' es seleccionado de serina, glicina o asparagina; el aminoácido d' es seleccionado de prolina, tirosina, treonina, fenilalanina, ácido aspártico, leucina, o triptófano; el aminoácido e' es prolina; el aminoácido f es prolina o no está presente; el aminoácido g' es triptófano> leucina, prolina, tirosina, o. isoleucina; y el aminoácido h' es treonina o asparagina; y donde el primer polipéptido, en asociación con una cadena pesada de anticuerpo, es capaz de unirse al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) ; y (ii) un segundo polipéptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRlb, CDR2b o CDR3b donde la CRDlb comprende la secuencia de aminoácido a b c d e f g, donde el aminoácido a es serina o no está presente; el aminoácido b es seleccionado de ácido aspártico o glicina, o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de ácido aspártico, glicina, serina, valina, treonina o isoleucina; el aminoácido d es tirosina; el aminoácido e es seleccionado de tirosina o glicina; el aminoácido f es seleccionado de isoleucina, metionina o triptófano; y el aminoácido g es seleccionado de histidina, asparagina o serina; donde la CDR2b comprende la secuencia de aminoácidos h i j k l m n o p q r s t u v w , donde el aminoácido h es seleccionado de triptófano, tirosina, valina, asparagina, o ácido glutámico; el aminoácido i es seleccionado de isoleucina, fenilalanina, o valina; el aminoácido j es seleccionado de asparagina, serina, triptófano, tirosina; el aminoácido k es seleccionado de prolina, serina, tirosina, o histidina; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, serina o ácido aspártico; el aminoácido m es seleccionado de serina o glicina; el aminoácido n es seleccionado de glicina o serina, o no está presente; el aminoácido o es seleccionado de glicina, treonina, ácido aspártico, serina, isoleucina o asparagina; el aminoácido p es seleccionado de treonina, isoleucina o lisina; el aminoácido q es seleccionado de asparagina o tirosina; el aminoácido r es seleccionado de tirosina o histidina el aminoácido s es seleccionado de alanina o asparagina; el aminoácido t es seleccionado de glutamina, ácido aspártico o prolina; el aminoácido u es seleccionado de lisina o serina; el aminoácido v es seleccionado de fenilalanina, valina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de glutamina o lisina, y el aminoácido x es seleccionado de glicina o serina; donde la CDR3b comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n' o' p' q' r' , donde el aminoácido y es seleccionado de ácido glutámico, ácido aspártico, serina o glicina o no está presente; el aminoácido z es seleccionado de leucina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, prolina o glicina, o no está presente; el aminoácido a' es seleccionado de ácido glutámico, tirosina o leucina, o no está presente; el aminoácido b' es seleccionado de leucina, asparagina, glicina, histidina, tirosina o triptófano o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de arginina, serina, ácido glutámico, tirosina, glicina o fenilalanina, o no está presente; el aminoácido d' es glicina o no está presente; el aminoácido e' es seleccionado de triptófano o tirosina, o no está presente; el aminoácido f es ácido aspártico o no está presente; el aminoácido g' es seleccionado de serina o arginina, o no está presente; el aminoácido h' es serina o no está presente; el aminoácido i' es seleccionado de glicina o tirosina; o no está presente; el aminoácido j' es seleccionado de tirosina, ácido glutámico o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido k' es seleccionado de tirosiíia, fenilalartina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido 1' es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, stidina o triptófano o no está presente; el aminoácido m' es seleccionado de tirosina, glicina, ácido aspártico, prolina o serina o no está presente; el aminoácido n' es seleccionado de glicina, valina, tirosina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido o' es seleccionado de leucina, alanina, glicina, o tirosina, o no está presente; el aminoácido p' es seleccionado de metionina, fenilalanina, o tirosina; el aminoácido q' es ácido aspártico, y el aminoácido r' es seleccionado de valina, tirosina, isoleucina o prolina; y donde el segundo polipéptido, en asociación con una cadena ligera de anticuerpo, es capaz de unirse al HGF. 16. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, '40 y 42. 17. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 y 43. 18. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 24 y 25. 19· El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 26 y 27. 20. El agente de unión específica de conformidad _con_l_a. reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de l SEQ ID NO. 28 y 29. 21. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 30 y 31. 22. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 32 y 33. 23. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 34 y 35. 24. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15,. caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 36 y 37. 25. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 38 y 39. 26. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 40 y 41. 27. El agente de unión especifica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 42 y 43. 28. El agente de unión específica de conformidad -con -la— eiv_indi.cación__15 r. caracterizado .porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, y 69. 29. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, y 79. 30. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, y 89. 31. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, y 99. 32. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, y 109. 33. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, y 119. 34. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende: — - una—cadena jp_es_ada.-.que_comp e.nde__u^a-_prjjnera región variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y 43; y una cadena ligera que comprende una segunda región variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, y 42. 35. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agente de unión específica tiene al menos una propiedad seleccionada de: a) compite por unión al HGF con al menos un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 y 3.10.1; b) se une al mismo epítope del HGF como al menos un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1; y c) se une al mismo antígeno que se une al menos a un anticuerpo seleccionado de 1.24..1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1. 36. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende: una cadena pesada que comprende una primera región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y 43; y una cadena ligera que comprende una segunda región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 95% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, y 42. 37. El agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el agente de unión específica tiene al menos una propiedad seleccionada de : a) compite por la unión al HGF con al menos un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1; b) se une al mismo epítope del HGF como al menos un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1; y c) se une al mismo antígeno que se une al menos a un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1. 38. El agente de unión específica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-37, caracterizado porque el agente de unión específica es un anticuerpo. 39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la cadena pesada y la cadena ligera están conectadas por un enlazante. 40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porqué es un anticuerpo de un solo Fv. 41. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un fragmento de inmunoglobulina inmuno lógicamente funcional . 42. El anticuerpo. de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un anticuerpo Fab. 43. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un anticuerpo Fab' . 44. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un anticuerpo (Fab')2. 45. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un anticuerpo completamente humano. 46. ' El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado. 47. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico . 48. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la unión del HGF a un receptor de c-Met. 49. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 y 42. 50. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 y 43. 51. Una molécula de acido nucleico aislada, caracterizada jpprque comprende al menos una secuencia nucleotidica seleccionada de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. 52. Un molécula de acido nucleico aislada, caracterizada porque comprende al menos una secuencia nucleotidica seleccionada de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. 53. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica para un polipéptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a donde la CDRla comprende la secuencia de aminoácidos a b c d e f g h i j k l m n o p q, cuando el aminoácido a es seleccionado de lisina, arginina o glutamina; el aminoácido b es seleccionado de serina o alananina; el aminoácido c es serina, el aminoácido d es glutamina; el aminoácido e es seleccionado de serina, glicina, o ácido aspártico; el aminoácido f es seleccionado de valina o isoleucina o no está presente; el aminoácido g es seleccionado de leucina o fenilalanina o no está presente; el aminoácido h es seleccionado de fenilalanina o tirosina o no está presente; el aminoácido i es serina o no está presente; el aminoácido j es serina o no está presente; el aminoácido k es seleccionado de asparagina, treonina o no está presente; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, isoleuc na o valina; el ^mlnoácid jri_es_sjBlecciona_do_ de lisina, arginina, asparagina o ácido aspártico; el aminoácido n es seleccionado de asparagina o serina; el aminoácido o es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, triptófano o asparagina; el aminoácido p es leucina; y el aminoácido q es seleccionado de alanina, glicina, o asparagina; donde la · CDR2a comprende una secuencia de aminoácido r s t u v w x, donde el aminoácido r es seleccionado de triptófano, alanina, valina, ácido glutámico, o glicina; el aminoácido s es alanina, el aminoácido t es serina, el aminoácido u es seleccionado de treonina, serina o ácido aspártico; el aminoácido v es seleccionado de arginina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de ácido glutámico, glutamina o alanina; y el aminoácido x es seleccionado de serina, asparagina o treonina; donde la CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos y z a' b' c' d' e' f ' g' h' , donde el aminoácido y es seleccionado de glutamina o leucina; el aminoácido z es seleccionado de glutamina, asparagina, o arginina; el aminoácido a' es seleccionado de tirosina, histidina, alanina o serina; el aminoácido b' es seleccionado de fenilalanina, tirosina, ácido aspártico, asparagina o isoleucina; el aminoácido c' es seleccionado de serina, glicina o asparagina; el aminoácido d' es seleccionado de prolina, tirosina, treonina, fenilalanina, ácido aspártico, leucina, o t iptófano; el aminoácido e' es prolina; el aminoácido f es prolina o no está presente; el aminoácido g' es triptóf no, leucina, prolina, tirosina, o isoleucina; y el aminoácido ' es treonina o asparagina; y donde el polipéptido, e asociación con una cadena pesada de anticuerpo, es capaz de unirse al factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) . 5 . La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 53 , caracterizada porque comprende una secuencia nucleotidica seleccionada de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, y 19. 55. Una molécula aislada de ácido nucleico caracterizada porque codifica para un polipéptido caracterizado que comprende al menos "una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada de CDRla, CDR2a y CDR3a donde la CRDlb comprende la secuencia de aminoácido a b c d e f g, donde el aminoácido a es serina o no está presente; el aminoácido b es seleccionado de ácido aspártico o glicina, o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de ácido aspártico, glicina, serina, valina, treonina o isoleucina; el aminoácido d es tirosina; el aminoácido e es seleccionado de tirosina o glicina; el aminoácido f es seleccionado de isoleucina, metionina o triptofano; y el aminoácido g es seleccionado de histidina, a_sparagina_ o_serína,· donde la CDR2b comprende la secuencia de aminoácidos h i j k l m n o p q r s t u v w x, donde el aminoácido h es seleccionado de triptofano, tirosina, valina, asparagina, o ácido glutámico; el aminoácido i es seleccionado de isoleucina, fenilalanina, o valina; el aminoácido j es seleccionado de asparagina, serina, triptofano o tirosina; el aminoácido k es seleccionado de prolina, serina, tirosina, o histidina; el aminoácido 1 es seleccionado de asparagina, serina o ácido aspártico; el aminoácido m es seleccionado de serina o glicina; el aminoácido n es seleccionado de glicina o serina, o no está presente; el aminoácido o es seleccionado de glicina, treonina, ácido aspártico, serina, isoleucina o asparagina; el aminoácido p es seleccionado de treonina, isoleucina o lisina; el aminoácido g es seleccionado de asparagina o tirosina; el aminoácido r es seleccionado de tirosina o histidina; el aminoácido s es seleccionado de alanina o asparagina; el aminoácido t es seleccionado de glutamina, ácido aspártico o prolina; el aminoácido u es seleccionado de lisina o serina; el aminoácido v es seleccionado de fenilalanina, valina o leucina; el aminoácido w es seleccionado de glutamina o lisina, y el aminoácido x es seleccionado de glicina o serina; donde la CDR3b comprende la secuencia- de aminoácidos y z a' b' C d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n' o' p' g' r' , donde el aminoácido y es seleccionado de ácido glutámico, ácido aspártico, serina o glicina o no está presente; el aminoácido z es seleccionado ele leucina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, prolina o glicina, o no está presente; el aminoácido a' es seleccionado de ácido glutámico, tirosina o leucina, o no está presente; el aminoácido b' es seleccionado de leucina, asparagina, glicina, histidina, tirosina o triptofano o no está presente; el aminoácido c es seleccionado de arginina, serina, ácido glutámico, tirosina, glicina o fenilalanina, o no está presente; el aminoácido d' es glicina o no está presente; el aminoácido e' es seleccionado de triptofano o tirosina, o no está presente; el aminoácido f es ácido aspártico o no está presente; el aminoácido g' es seleccionado de serina o arginina, o no está presente; el aminoácido h' es serina o no está presente; el aminoácido i' es seleccionado de glicina o tirosina; o no está presente; el aminoácido j' es seleccionado de tirosina, ácido glutámico o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido k' es seleccionado de tirosina, fenilalanina o ácido aspártico, o no está presente; el aminoácido 1' es seleccionado de tirosina, ácido aspártico, histidina o triptófano o no está presente; el aminoácido m' es seleccionado de tirosina, glicina, ácido aspártico, prolina o serina o no está presente; el aminoácido n' es seleccionado de glicina, valina, tirosina o ácido -aspártico, o no está presente; el aminoácido o' es seleccionado de leucina, alanina, glicina, o tirosina, o no está presente; el aminoácido p' es seleccionado de metionina, fenilalanina, o tirosina; el aminoácido q' es ácido aspártico, y el aminoácido r' es seleccionado de valina, tirosina, isoleucina o prolina; y donde el polipéptido, en asociación con una cadena ligera de anticuerpo, es capaz de unirse al HGF. 56. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16," 18, y 20. 57.. Una célula anfitriona, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 53. 58. Una célula anfitriona, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 55. 59. Una línea celular aislada, caracterizada porque produce el agente de unión específica de conformidad con las reivindicaciones 34 ó 36. 60. La línea celular aislada de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el agente de unión especifica es un anticuerpo. 61. Una línea celular aislada, caracterizada porgue_ produce un anticuerpo seleccionado de 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1, y 3.10.1. 62. Una composición caracterizada porque comprende un agente de unión específica . de conformidad con la reivindicación 34 ó 36 y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. 63. La composición de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque el agente de unión específico es un anticuerpo. 64. Una composición, caracterizada porque comprende un agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 34 ó 36 y al menos un agente seleccionado de: un miembro de la familia de la geldanamicina de antibióticos de anisamicina; un antagonista de homología de Grb2 Src 2; un modulador de Gabl; Src negativo dominante; inhibidor de von-Hippel-Landau, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID) ; un inhibidor de COX-2, CelebrexR (celecobix) , Vioxx" (rofecoxib) ; un factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) , un modulador de VEGF, un modulador del factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF) , un factor del crecimiento epidérmico (EGF) ; un factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF) , una molécula relacionada con KGF, un modulador de KGF; un modulador de la metaloproteinasa de la matriz (M P) ; IL-2; Proluecina; Herceptina; Rituxan; Zevalina; Erbitux epratuzumab; un anticuerpo para OPGL; un inhibidor para_Ang-2¿ un_anticuerpo para VEGF-2; avastina; un agente antimioplásico; un agente antimicótico ; un antimetabolito; y un sulfonato de alquilo. 65. La composición de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque el agente de unión específico es un anticuerpo. 66. Un método para tratar el cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 62. 67. Un método para tratar el cáncer' en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 63. 68. Un método para tratar el cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 64. 69. Un método para tratar el cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 65. 70. -Un método para tratar un tumor sólido en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 62. 71. Un método para tratar tumor sólido en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 63. 72. Un método para tratar tumor sólido en un _5-, paciente.,,.. caracterizado porque___cpmprende___ administrar la composición de conformidad con la reivindicación 6 . 73. Un método para tratar tumor sólido en un paciente, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 65. 10 74. Un método para tratar el cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar un agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 34 ó 36 y al menos un tratamiento de quimioterapia. 15 75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el agente de unión específica es administrado antes de la administración del tratamiento de quimioterapia. 76. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el agente de unión específica es 20 administrado concurrentemente con la administración del tratamiento de quimioterapia. 77. El método de conformidad con la reivindicación 74 , caracterizado porque el agente de unión específica es administrado después de la administración del tratamiento de 25 quimioterapia. 78. Un método para tratar el cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar un agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 34 ó 36 y terapia de radiación. __79_. El_méto_do _de conformidad cqn la. reivindicación 78 , caracterizado porque el agente de unión específica es administrado antes de la administración de la terapia de radiación. 80. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el agente de unión específica es administrado concurrentemente con la administración de la terapia de radiación. 81. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el agente de unión específica es administrado después de la administración de la terapia de radiación. 82. Un método para detectar los niveles de factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con el agente de unión específica de conformidad con la reivindicación 34 ó 36. 83. El método de conformidad con lá reivindicación 82, caracterizado porque el agente de unión específica es un anticuerpo . 84. Un método para inhibir la unión del HGF a Met, caracterizado porque comprende administrar un agente de unión específica al HGF. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el agente de unión específica es un anticuerpo. 86. El método de conformidad con. la reivindicación 84, caracterizado porque el agente de unión específica comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y 43. 87. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el agente de unión específica comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, y 42. 88. Un polipéptido, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 89. Un polipéptido, caracterizado porque consiste esencialmente de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 90. Un agente de unión específica, caracterizado porque es capaz de unirse a al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 91. Un anticuerpo o dominio de unión de antígeno, caracterizado porque es capaz de unirse a al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 92. Un método para obtener un anticuerpo capaz de unirse al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) , caracterizado porque comprende administrar al menos un polipéptido seleccionado de la SEQ ID NO: 164 y 165 a un animal y obtener un anticuerpo capaz de unirse al HGF del animal. 93. Un método, caracterizado porque hace disminuir o previene la unión de cualquiera de uno de los agentes de unión específica de conformidad con las reivindicaciones 18-27 al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) administrando un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 94. Un método, caracterizado porque hace disminuir o previene la unión de cualquiera de los péptidos de conformidad con las reivindicaciones 18-27 al factor del crecimiento de los hepatocitos (HGF) administrando - un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 95. Un método, caracterizado porque hace disminuir o previene la unión de un agente de unión específica del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF) >6; S = 54=VI;UH-HOFF GOMEZ VEGA ;S2oee3ST 234 administrando un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 164 y 165. 96. Un método, caracterizado porque hace disminuir o previene la unión de un agente de unión específica del factor de crecimiento de los hepatocitos ¡HGP) administrando un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ IDt NO : 16 y 165.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48868103P | 2003-07-18 | 2003-07-18 | |
| PCT/US2004/018936 WO2005017107A2 (en) | 2003-07-18 | 2004-07-16 | Specific binding agents to hepatocyte growth factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA06000508A true MXPA06000508A (es) | 2006-04-05 |
Family
ID=34193077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MXPA06000508A MXPA06000508A (es) | 2003-07-18 | 2004-07-16 | Agentes de union especifica al factor del crecimiento de los hepatocitos. |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8609090B2 (es) |
| EP (2) | EP1648998B1 (es) |
| JP (4) | JP5105874B2 (es) |
| KR (2) | KR20110129988A (es) |
| CN (3) | CN103880955A (es) |
| AR (3) | AR042955A1 (es) |
| AU (1) | AU2004265595B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0412885A (es) |
| CA (1) | CA2532027C (es) |
| DK (1) | DK1648998T3 (es) |
| EA (1) | EA015363B1 (es) |
| ES (1) | ES2523837T3 (es) |
| HK (1) | HK1199266A1 (es) |
| IL (1) | IL172906A0 (es) |
| ME (1) | MEP31408A (es) |
| MX (1) | MXPA06000508A (es) |
| NO (1) | NO20060600L (es) |
| NZ (1) | NZ544797A (es) |
| PL (1) | PL1648998T3 (es) |
| PT (1) | PT1648998E (es) |
| RS (1) | RS53476B (es) |
| SG (1) | SG131943A1 (es) |
| SI (1) | SI1648998T1 (es) |
| TW (3) | TWI395756B (es) |
| WO (1) | WO2005017107A2 (es) |
| ZA (2) | ZA200601353B (es) |
Families Citing this family (196)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7220410B2 (en) | 2003-04-18 | 2007-05-22 | Galaxy Biotech, Llc | Monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor |
| US20040208876A1 (en) | 2003-04-18 | 2004-10-21 | Kim Kyung Jin | Monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor |
| RS53476B (sr) * | 2003-07-18 | 2014-12-31 | Amgen Fremont Inc. | Sredstva za specifično vezivanje faktora rasta hepatocita |
| HN2004000285A (es) | 2003-08-04 | 2006-04-27 | Pfizer Prod Inc | ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET |
| US7046714B2 (en) * | 2003-09-10 | 2006-05-16 | Intel Corporation | Method and apparatus for Raman ring resonator based laser/wavelength converter |
| PL1766017T3 (pl) * | 2004-06-10 | 2015-08-31 | Viventia Bio Inc | Przeciwciało specyficzne wobec nowotworu |
| EP2949328B1 (en) | 2005-03-29 | 2022-07-20 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Minoxidil for generating new hair follicles and treating baldness |
| US7737115B2 (en) | 2005-04-15 | 2010-06-15 | Genetech, Inc. | HGF beta chain variants |
| JP2008545753A (ja) * | 2005-06-02 | 2008-12-18 | ギャラクシー バイオテック， エルエルシー | 抗体で脳腫瘍を処置する方法 |
| WO2007019620A1 (en) * | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Arana Therapeutics Limited | Engineered antibodies with new world primate framework regions |
| JP2009519983A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-21 | アラーナ・テラピューティクス・リミテッド | 部分的な新世界ザル結合領域を有するキメラ抗体 |
| EA017417B1 (ru) * | 2006-02-01 | 2012-12-28 | Сефалон Астралия Пти Лтд. | КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ |
| AR059922A1 (es) | 2006-04-01 | 2008-05-07 | Galaxy Biotech Llc | Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos |
| AU2007254853B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-11-17 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Hepatocyte growth factor (HGF) binding proteins |
| AU2007254942B2 (en) * | 2006-06-02 | 2011-10-27 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Hepatocyte growth factor (HGF) binding proteins |
| CL2007002225A1 (es) * | 2006-08-03 | 2008-04-18 | Astrazeneca Ab | Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un |
| CL2007002567A1 (es) | 2006-09-08 | 2008-02-01 | Amgen Inc | Proteinas aisladas de enlace a activina a humana. |
| JP2010504974A (ja) | 2006-09-28 | 2010-02-18 | フォリカ，インコーポレーテッド | 新しい毛嚢を生成させ毛髪を成長させる方法、キット、及び組成物 |
| US20080139790A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-12 | Jennings Philip A | Chimeric antibodies |
| CA2692165A1 (en) * | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Amgen Inc. | Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor |
| MX2010002249A (es) * | 2007-08-31 | 2010-03-17 | Amgen Inc | Formulacion de proteina de estado solido. |
| US7982016B2 (en) | 2007-09-10 | 2011-07-19 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin |
| EP2197911A2 (en) | 2007-09-14 | 2010-06-23 | Amgen Inc. | Homogeneous antibody populations |
| CA2701032C (en) | 2007-09-27 | 2021-01-26 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
| EP3381445B1 (en) | 2007-11-15 | 2023-10-25 | Amgen Inc. | Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration |
| TW200948380A (en) * | 2008-04-11 | 2009-12-01 | Galaxy Biotech Llc | Combination of HGF inhibitor and PTEN agonist to treat cancer |
| TW201002346A (en) * | 2008-04-11 | 2010-01-16 | Galaxy Biotech Llc | Combination of HGF inhibitor and EGF inhibitor to treat cancer |
| CN102076355B (zh) | 2008-04-29 | 2014-05-07 | Abbvie公司 | 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
| US8101725B2 (en) | 2008-05-29 | 2012-01-24 | Galaxy Biotech, Llc | Monoclonal antibodies to basic fibroblast growth factor |
| SG191639A1 (en) | 2008-06-03 | 2013-07-31 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| AU2009256246B2 (en) | 2008-06-03 | 2013-07-18 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| AU2009268585C1 (en) * | 2008-07-08 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | Prostaglandin E2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| AU2013202400B2 (en) * | 2008-07-16 | 2014-10-09 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| UA112050C2 (uk) * | 2008-08-04 | 2016-07-25 | БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі | Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi) |
| WO2010039248A1 (en) * | 2008-10-01 | 2010-04-08 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for the treatment of cancer |
| DK2842573T3 (en) | 2008-11-07 | 2017-10-30 | Galaxy Biotech Llc | Monoclonal antibodies to fibroblast growth factor receptor 2 |
| CA2743775A1 (en) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | Schering Corporation | .beta.gi-igg intron for enhanced anti-igf1r expression |
| WO2010119991A2 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Novel method of treating cancer |
| JP2012525441A (ja) * | 2009-05-01 | 2012-10-22 | アボット・ラボラトリーズ | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこの使用 |
| TW201109438A (en) * | 2009-07-29 | 2011-03-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| TW201119673A (en) | 2009-09-01 | 2011-06-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| CA2774199C (en) * | 2009-09-16 | 2018-11-13 | Mipsalus Aps | Improved purification of multi-specific receptors |
| UY32948A (es) | 2009-10-15 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
| AU2010310457B2 (en) | 2009-10-23 | 2015-07-02 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
| SG183443A1 (en) | 2010-03-01 | 2012-09-27 | Bayer Healthcare Llc | Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| KR102513760B1 (ko) | 2010-06-07 | 2023-03-27 | 암젠 인크 | 약물 전달 장치 |
| US8834883B2 (en) | 2010-06-14 | 2014-09-16 | Vaccinex, Inc. | Anti-VEGF antibodies and uses thereof |
| US20130315895A1 (en) | 2010-07-01 | 2013-11-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | COMBINATION OF A cMET INHIBITOR AND AN ANTIBODY TO HGF AND/OR cMET |
| TW201206473A (en) | 2010-08-03 | 2012-02-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| CA2807552A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| CN103260639A (zh) | 2010-08-26 | 2013-08-21 | Abbvie公司 | 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
| CN103391773A (zh) | 2010-09-27 | 2013-11-13 | 埃克塞里艾克西斯公司 | 用于治疗去势抵抗性前列腺癌和成骨性骨转移的met和vegf的双重抑制剂 |
| EP3431485B2 (en) | 2010-10-01 | 2024-09-04 | ModernaTX, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| CN103459422A (zh) | 2010-11-24 | 2013-12-18 | 葛兰素集团有限公司 | 靶向hgf的多特异性抗原结合蛋白 |
| EP3178465A1 (en) | 2010-12-06 | 2017-06-14 | Follica, Inc. | Methods for treating baldness and promoting hair growth |
| SI2500036T1 (sl) * | 2011-03-18 | 2014-09-30 | Metheresis Translational Research Sa | Met inhibitorji za izboljĺ anje uäśinkovitosti obsevanja |
| EP2691065B1 (en) | 2011-03-31 | 2017-03-01 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| WO2012135805A2 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | modeRNA Therapeutics | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| CA2833748C (en) | 2011-04-20 | 2019-07-16 | Amgen Inc. | Autoinjector apparatus |
| WO2013006486A2 (en) * | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases |
| EP2753357A1 (en) | 2011-09-09 | 2014-07-16 | Amgen Inc. | Use of c-met protein for predicting the efficacy of anti-hepatocyte growth factor ("hgf") antibodies in esophageal and gastric cancer patients |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP2763701B1 (en) | 2011-10-03 | 2018-12-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
| EP3335747B1 (en) | 2011-10-14 | 2021-04-07 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
| KR20140102759A (ko) | 2011-12-16 | 2014-08-22 | 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물 |
| WO2013102042A2 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17 |
| US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
| DE18200782T1 (de) | 2012-04-02 | 2021-10-21 | Modernatx, Inc. | Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| WO2013152252A1 (en) | 2012-04-06 | 2013-10-10 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Combination anti-cancer therapy |
| US9441039B2 (en) | 2012-05-07 | 2016-09-13 | Amgen Inc. | Anti-erythropoietin antibodies |
| WO2014004549A2 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Amgen Inc. | Anti-mesothelin binding proteins |
| SG11201502816YA (en) | 2012-10-12 | 2015-05-28 | Agency Science Tech & Res | Optimised heavy chain and light chain signal peptides for the production of recombinant antibody therapeutics |
| HK1212359A1 (en) | 2012-11-01 | 2016-06-10 | Abbvie Inc. | Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| US9695228B2 (en) * | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
| PL2922872T3 (pl) | 2012-11-21 | 2019-03-29 | Janssen Biotech, Inc. | Bispecyficzne przeciwciała przeciwko egfr/c-met |
| EP3072548B1 (en) | 2012-11-21 | 2019-03-06 | Amgen, Inc | Drug delivery device |
| US20170275367A1 (en) | 2012-11-21 | 2017-09-28 | Janssen Biotech, Inc. | Bispecific EGFR/C-Met Antibodies |
| CA2892529C (en) | 2012-11-26 | 2023-04-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Terminally modified rna |
| US9290557B2 (en) | 2012-11-28 | 2016-03-22 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides |
| ES2828505T3 (es) | 2012-11-28 | 2021-05-26 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos y enfermedades metabólicos |
| US9273107B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| SG10202100667SA (en) | 2012-12-27 | 2021-02-25 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| WO2014108854A1 (en) | 2013-01-09 | 2014-07-17 | Fusimab Ltd. | Monospecific anti-hgf and anti-ang2 antibodies and bispecific anti-hgf/anti-ang2 antibodies |
| AU2014249458A1 (en) | 2013-03-11 | 2015-09-24 | Amgen Inc. | Protein formulations |
| US9481725B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-01 | Alderbio Holdings, Llc | Antibodies to HGF and compositions containing |
| CN105246915A (zh) * | 2013-03-14 | 2016-01-13 | 奥尔德生物制药公司 | Hgf抗体及含有其的组合物 |
| JP6336564B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-06-06 | アムゲン・インコーポレーテッド | 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム |
| JP2016522793A (ja) | 2013-03-15 | 2016-08-04 | アッヴィ・インコーポレイテッド | ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質 |
| US10492990B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-03 | Amgen Inc. | Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system |
| CN111617347B (zh) | 2013-03-15 | 2023-09-29 | 安进公司 | 身体轮廓可调适的自动注射器装置 |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| EP2976117B1 (en) | 2013-03-22 | 2020-12-30 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
| KR102060540B1 (ko) | 2013-04-03 | 2019-12-31 | 삼성전자주식회사 | 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물 |
| WO2015031578A1 (en) * | 2013-08-28 | 2015-03-05 | Abbvie Inc. | Hgf assay |
| US10023626B2 (en) | 2013-09-30 | 2018-07-17 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| EA201690675A1 (ru) | 2013-10-03 | 2016-08-31 | Модерна Терапьютикс, Инк. | Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности |
| SG11201602876WA (en) | 2013-10-24 | 2016-05-30 | Amgen Inc | Injector and method of assembly |
| WO2015061389A1 (en) | 2013-10-24 | 2015-04-30 | Amgen Inc. | Drug delivery system with temperature-sensitive control |
| US10994112B2 (en) | 2014-02-05 | 2021-05-04 | Amgen Inc. | Drug delivery system with electromagnetic field generator |
| EP3122900A1 (en) | 2014-03-24 | 2017-02-01 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression |
| SG10201811702TA (en) | 2014-05-07 | 2019-01-30 | Amgen Inc | Autoinjector with shock reducing elements |
| US10398758B2 (en) | 2014-05-28 | 2019-09-03 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions |
| MX387194B (es) | 2014-06-03 | 2025-03-18 | Amgen Inc | Sistemas y metodos para procesar de manera remota datos recolectados por un dispositivo de suministro de farmaco. |
| US10456449B2 (en) | 2014-06-16 | 2019-10-29 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| EP3943135B1 (en) | 2014-10-14 | 2025-09-24 | Amgen Inc. | Drug injection device with visual and audible indicators |
| CN107108711B (zh) | 2014-10-23 | 2021-11-23 | 恩格姆生物制药公司 | 包含肽变异体的药物组合物及其使用方法 |
| WO2016073855A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders |
| WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
| EP3689394A1 (en) | 2014-12-19 | 2020-08-05 | Amgen Inc. | Drug delivery device with live button or user interface field |
| US10799630B2 (en) | 2014-12-19 | 2020-10-13 | Amgen Inc. | Drug delivery device with proximity sensor |
| ES2748750T3 (es) | 2015-02-17 | 2020-03-17 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármacos con sujeción asistida por vacío y/o realimentación |
| US11806509B2 (en) | 2015-02-27 | 2023-11-07 | Amgen Inc. | Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement |
| JP6510075B2 (ja) | 2015-05-18 | 2019-05-08 | トレロ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | バイオアベイラビリティが高いアルボシジブプロドラッグ |
| TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白 |
| EP3331510A4 (en) | 2015-08-03 | 2019-04-03 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | COMBINATION THERAPIES FOR THE TREATMENT OF CANCER |
| WO2017039786A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Amgen Inc. | Syringe assembly adapter for a syringe |
| US10358497B2 (en) | 2015-09-29 | 2019-07-23 | Amgen Inc. | Methods of treating cardiovascular disease with an ASGR inhibitor |
| CN106589128B (zh) * | 2015-10-20 | 2020-03-03 | 天津医科大学 | 肝癌标志物单克隆抗体的制备及其应用 |
| WO2017075484A2 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Galaxy Biotech, Llc | Highly potent antibodies binding to death receptor 4 and death receptor 5 |
| WO2017083276A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders |
| CN106674350B (zh) * | 2015-11-09 | 2020-03-03 | 天津医科大学 | 肝癌标志物单链抗体的制备及其应用 |
| US11351308B2 (en) | 2015-12-09 | 2022-06-07 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling cap |
| US11154661B2 (en) | 2016-01-06 | 2021-10-26 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling electronics |
| EP3429663B1 (en) | 2016-03-15 | 2020-07-15 | Amgen Inc. | Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices |
| US11541168B2 (en) | 2016-04-29 | 2023-01-03 | Amgen Inc. | Drug delivery device with messaging label |
| US11389588B2 (en) | 2016-05-02 | 2022-07-19 | Amgen Inc. | Syringe adapter and guide for filling an on-body injector |
| JP7309363B2 (ja) | 2016-05-13 | 2023-07-18 | アムジエン・インコーポレーテツド | バイアル・スリーブ組立体 |
| US11238150B2 (en) | 2016-05-16 | 2022-02-01 | Amgen Inc. | Data encryption in medical devices with limited computational capability |
| AU2017273857B2 (en) | 2016-06-01 | 2021-08-19 | Athira Pharma, Inc. | Compounds |
| WO2017209899A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Amgen Inc. | Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices |
| EP3478342B1 (en) | 2016-07-01 | 2025-03-12 | Amgen Inc. | Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events |
| WO2018034784A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement detection |
| EP3503882A4 (en) | 2016-08-26 | 2020-07-29 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS |
| US20200261643A1 (en) | 2016-10-25 | 2020-08-20 | Amgen Inc. | On-body injector |
| US11279694B2 (en) | 2016-11-18 | 2022-03-22 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors |
| MX2019008432A (es) | 2017-01-17 | 2019-11-18 | Amgen Inc | Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje. |
| MX2019009755A (es) | 2017-02-17 | 2019-10-07 | Amgen Inc | Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos. |
| US11752258B2 (en) | 2017-02-17 | 2023-09-12 | Amgen Inc. | Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly |
| WO2018165143A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-13 | Amgen Inc. | Drug delivery device with activation prevention feature |
| WO2018164829A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Amgen Inc. | Needle insertion by overpressure |
| IL268386B2 (en) | 2017-03-09 | 2023-11-01 | Amgen Inc | Insertion mechanism for a drug delivery device |
| PL3600491T3 (pl) | 2017-03-28 | 2024-03-04 | Amgen Inc. | Układ i sposób montażu trzonu tłoka i strzykawki |
| BR112019019813A2 (pt) | 2017-03-30 | 2020-04-22 | Univ Queensland | moléculas quiméricas e usos das mesmas |
| EP3634546A1 (en) | 2017-06-08 | 2020-04-15 | Amgen Inc. | Torque driven drug delivery device |
| WO2018226515A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Amgen Inc. | Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly |
| WO2018236619A1 (en) | 2017-06-22 | 2018-12-27 | Amgen Inc. | Device activation impact/shock reduction |
| JP7475860B2 (ja) | 2017-06-23 | 2024-04-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス |
| EP3651832B1 (en) | 2017-07-14 | 2023-12-13 | Amgen Inc. | Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system |
| US11672733B2 (en) | 2017-07-21 | 2023-06-13 | Amgen Inc. | Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly |
| JP2020528296A (ja) | 2017-07-25 | 2020-09-24 | アムジエン・インコーポレーテツド | ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法 |
| JP7242562B2 (ja) | 2017-07-25 | 2023-03-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法 |
| US12318593B2 (en) | 2017-08-09 | 2025-06-03 | Amgen Inc. | Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system |
| EP3668567A1 (en) | 2017-08-18 | 2020-06-24 | Amgen Inc. | Wearable injector with sterile adhesive patch |
| US11103636B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-08-31 | Amgen Inc. | Needle insertion mechanism for drug delivery device |
| WO2019055579A1 (en) | 2017-09-12 | 2019-03-21 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR |
| US11759565B2 (en) | 2017-10-04 | 2023-09-19 | Amgen Inc. | Flow adapter for drug delivery device |
| EP3691716B1 (en) | 2017-10-06 | 2023-11-29 | Amgen Inc. | Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly |
| IL273323B2 (en) | 2017-10-09 | 2024-10-01 | Amgen Inc | Drug delivery device with drive assembly and related assembly method |
| US11826480B2 (en) | 2017-11-03 | 2023-11-28 | Amgen Inc. | Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device |
| MA50569A (fr) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Amgen Inc | Ensembles de remplissage-finition et procédés associés |
| MA50553A (fr) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Amgen Inc | Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit |
| SG11202002966QA (en) | 2017-11-10 | 2020-05-28 | Amgen Inc | Plungers for drug delivery devices |
| JP7747438B2 (ja) | 2017-11-16 | 2025-10-01 | アムジエン・インコーポレーテツド | 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ |
| AU2018368340B2 (en) | 2017-11-16 | 2024-03-07 | Amgen Inc. | Door latch mechanism for drug delivery device |
| US10835685B2 (en) | 2018-05-30 | 2020-11-17 | Amgen Inc. | Thermal spring release mechanism for a drug delivery device |
| US11083840B2 (en) | 2018-06-01 | 2021-08-10 | Amgen Inc. | Modular fluid path assemblies for drug delivery devices |
| MX2021000749A (es) | 2018-07-24 | 2021-03-29 | Amgen Inc | Dispositivos de suministro para administrar farmacos. |
| WO2020023336A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with grip portion |
| EP3826701A1 (en) | 2018-07-24 | 2021-06-02 | Amgen Inc. | Delivery devices for administering drugs |
| WO2020023220A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation |
| WO2020028009A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Amgen Inc. | Fluid path assembly for a drug delivery device |
| JP2022500095A (ja) | 2018-09-24 | 2022-01-04 | アムジエン・インコーポレーテツド | インターベンション投薬システム及び方法 |
| IL281469B2 (en) | 2018-09-28 | 2024-08-01 | Amgen Inc | Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device |
| EP3860685A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Amgen Inc. | Injection systems for drug delivery with internal force transmission |
| US12151089B2 (en) | 2018-10-05 | 2024-11-26 | Amgen Inc. | Drug delivery device having dose indicator |
| MA53912A (fr) | 2018-10-15 | 2022-01-19 | Amgen Inc | Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement |
| SG11202101824VA (en) | 2018-10-15 | 2021-03-30 | Amgen Inc | Platform assembly process for drug delivery device |
| TWI831847B (zh) | 2018-11-01 | 2024-02-11 | 美商安進公司 | 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法 |
| AU2019370159B2 (en) | 2018-11-01 | 2025-05-29 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
| EP3873566B1 (en) | 2018-11-01 | 2024-11-27 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
| US11034710B2 (en) | 2018-12-04 | 2021-06-15 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer |
| US11793802B2 (en) | 2019-03-20 | 2023-10-24 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure |
| US20220160972A1 (en) | 2019-04-24 | 2022-05-26 | Amgen Inc. | Syringe sterilization verification assemblies and methods |
| MX2021014931A (es) | 2019-06-07 | 2022-01-24 | Amgen Inc | Construcciones de union biespecificas con enlazadores selectivamente escindibles. |
| EP3772518A1 (en) * | 2019-08-07 | 2021-02-10 | Merus N.V. | Modified human variable domains |
| EP4013869A1 (en) | 2019-08-12 | 2022-06-22 | InteRNA Technologies B.V. | New treatments involving mirna-193a |
| JP7608439B2 (ja) | 2019-08-23 | 2025-01-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法 |
| CN115461461A (zh) | 2020-02-28 | 2022-12-09 | 因特尔纳技术有限公司 | 用于促进免疫原性细胞死亡的miRNA-193a |
| US20230203198A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-06-29 | Amgen Inc. | Bispecific binding constructs |
| CA3203468A1 (en) | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Amgen Inc. | Immunoglobuline constructs with multiple binding domains |
| US20240327503A1 (en) * | 2021-03-12 | 2024-10-03 | Jimmy Dale GOLLIHAR | Sars-cov-2 neutralizing antibodies and uses thereof |
| US20240208680A1 (en) | 2021-05-21 | 2024-06-27 | Amgen Inc. | Method of optimizing a filling recipe for a drug container |
| WO2024258870A2 (en) | 2023-06-12 | 2024-12-19 | Amgen Inc. | Lymphotoxin beta receptor agonist binding proteins |
Family Cites Families (140)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
| JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
| US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
| US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
| DE3374837D1 (en) | 1982-02-17 | 1988-01-21 | Ciba Geigy Ag | Lipids in the aqueous phase |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| HUT35524A (en) | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
| EP0143949B1 (en) | 1983-11-01 | 1988-10-12 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | Pharmaceutical composition containing urokinase |
| US4740461A (en) | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| EP0206448B1 (en) | 1985-06-19 | 1990-11-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide) |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| US4959455A (en) | 1986-07-14 | 1990-09-25 | Genetics Institute, Inc. | Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions |
| US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| DE3785186T2 (de) | 1986-09-02 | 1993-07-15 | Enzon Lab Inc | Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette. |
| US4912040A (en) | 1986-11-14 | 1990-03-27 | Genetics Institute, Inc. | Eucaryotic expression system |
| JPS6427491A (en) | 1987-07-14 | 1989-01-30 | Yasushi Daikuhara | Monoclonal antibody |
| US5520914A (en) | 1987-08-06 | 1996-05-28 | President And Fellows Of Harvard College | Antibodies to angiogenin: immunotherapeutic agents |
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| JP3030312B2 (ja) * | 1988-12-12 | 2000-04-10 | 敏一 中村 | 成熟肝実質細胞増殖因子（ｉ） |
| IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5086164A (en) | 1989-01-10 | 1992-02-04 | Repligen Corporation | Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| JP2762522B2 (ja) | 1989-03-06 | 1998-06-04 | 藤沢薬品工業株式会社 | 血管新生阻害剤 |
| JPH02240100A (ja) * | 1989-03-15 | 1990-09-25 | Takara Shuzo Co Ltd | 新規ポリペプチド |
| JP2877509B2 (ja) | 1989-05-19 | 1999-03-31 | アムジエン・インコーポレーテツド | メタロプロテイナーゼ阻害剤 |
| US5112946A (en) | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
| GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| US5362716A (en) | 1989-12-27 | 1994-11-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for stimulating hematopoietic progenitors using hepatocyte growth factor and lymphokines |
| US5871959A (en) | 1989-12-27 | 1999-02-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines |
| GB9003621D0 (en) | 1990-02-16 | 1990-04-11 | Imp Cancer Res Tech | Protein factor |
| US5151510A (en) | 1990-04-20 | 1992-09-29 | Applied Biosystems, Inc. | Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs |
| GB9009548D0 (en) | 1990-04-27 | 1990-06-20 | Celltech Ltd | Chimeric antibody and method |
| EP0461560B1 (en) | 1990-06-11 | 1998-11-18 | Toshikazu Nakamura | Recombinant human hepatocyte growth factor and method for production thereof |
| KR100272077B1 (ko) | 1990-08-29 | 2000-11-15 | 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 | 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물 |
| US5821223A (en) | 1990-09-14 | 1998-10-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of stimulating cell growth with a novel broad spectrum human lung fibroblast-derived mitogen |
| EP1069137A1 (en) | 1990-09-24 | 2001-01-17 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Peptides having thrombospondin-like activity and their therapeutic use |
| US5268384A (en) | 1990-11-21 | 1993-12-07 | Galardy Richard E | Inhibition of angiogenesis by synthetic matrix metalloprotease inhibitors |
| US5892112A (en) | 1990-11-21 | 1999-04-06 | Glycomed Incorporated | Process for preparing synthetic matrix metalloprotease inhibitors |
| WO1992010210A1 (en) | 1990-12-14 | 1992-06-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Inhibition of angiogenesis by il-1 |
| WO1994004679A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
| EP0590058B1 (en) | 1991-06-14 | 2003-11-26 | Genentech, Inc. | HUMANIZED Heregulin ANTIBODy |
| US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
| ATE408012T1 (de) | 1991-12-02 | 2008-09-15 | Medical Res Council | Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken |
| US5869619A (en) | 1991-12-13 | 1999-02-09 | Xoma Corporation | Modified antibody variable domains |
| DE69233204T2 (de) | 1991-12-13 | 2004-07-15 | Xoma Corp., Berkeley | Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung |
| CA2124967C (en) | 1991-12-17 | 2008-04-08 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5521184A (en) | 1992-04-03 | 1996-05-28 | Ciba-Geigy Corporation | Pyrimidine derivatives and processes for the preparation thereof |
| US5763584A (en) | 1992-05-18 | 1998-06-09 | Genentech, Inc. | Receptor activation with hepatocyte growth factor agonists |
| WO1994006909A2 (en) | 1992-09-18 | 1994-03-31 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A method of preventing tumor metastasis |
| US6066718A (en) | 1992-09-25 | 2000-05-23 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
| DE69334100T2 (de) | 1992-11-13 | 2007-07-19 | Immunex Corp., Seattle | Elk ligand, ein cytokin |
| US5629327A (en) | 1993-03-01 | 1997-05-13 | Childrens Hospital Medical Center Corp. | Methods and compositions for inhibition of angiogenesis |
| US5807711A (en) | 1993-03-23 | 1998-09-15 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Parenchymal hepatocyte growth factors |
| US5516658A (en) | 1993-08-20 | 1996-05-14 | Immunex Corporation | DNA encoding cytokines that bind the cell surface receptor hek |
| US5837676A (en) | 1993-10-18 | 1998-11-17 | Long Island Jewish Medical Center | Use of scatter factor to enhance angiogenesis |
| US6498144B1 (en) | 1993-10-18 | 2002-12-24 | North Shore - Long Island Jewish Research Institute | Use of scatter factor to enhance angiogenesis |
| US5700823A (en) | 1994-01-07 | 1997-12-23 | Sugen, Inc. | Treatment of platelet derived growth factor related disorders such as cancers |
| US5429746A (en) | 1994-02-22 | 1995-07-04 | Smith Kline Beecham Corporation | Antibody purification |
| CA2189028A1 (en) | 1994-04-15 | 1995-10-26 | Gary M. Fox | Hek5, hek7, hek8, hek11, new eph-like receptor protein tyrosine kinases |
| US5707624A (en) | 1994-06-03 | 1998-01-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor |
| US6303769B1 (en) | 1994-07-08 | 2001-10-16 | Immunex Corporation | Lerk-5 dna |
| US5919905A (en) | 1994-10-05 | 1999-07-06 | Immunex Corporation | Cytokine designated LERK-6 |
| US5814464A (en) | 1994-10-07 | 1998-09-29 | Regeneron Pharma | Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2 |
| US6057124A (en) | 1995-01-27 | 2000-05-02 | Amgen Inc. | Nucleic acids encoding ligands for HEK4 receptors |
| GB9508538D0 (en) | 1995-04-27 | 1995-06-14 | Zeneca Ltd | Quinazoline derivatives |
| JP4312259B2 (ja) * | 1995-04-27 | 2009-08-12 | アムジェン フレモント インク． | 免疫したゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）に由来するヒト抗体 |
| US5686292A (en) | 1995-06-02 | 1997-11-11 | Genentech, Inc. | Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof |
| US6214344B1 (en) | 1995-06-02 | 2001-04-10 | Genetech, Inc. | Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof |
| US5747498A (en) | 1996-05-28 | 1998-05-05 | Pfizer Inc. | Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines |
| US5880141A (en) | 1995-06-07 | 1999-03-09 | Sugen, Inc. | Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease |
| US6127977A (en) | 1996-11-08 | 2000-10-03 | Cohen; Nathan | Microstrip patch antenna with fractal structure |
| DE19534177A1 (de) | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
| US6090382A (en) | 1996-02-09 | 2000-07-18 | Basf Aktiengesellschaft | Human antibodies that bind human TNFα |
| US5783186A (en) | 1995-12-05 | 1998-07-21 | Amgen Inc. | Antibody-induced apoptosis |
| US5827673A (en) | 1996-08-13 | 1998-10-27 | Akira Matsumori | Method of detecting myocardial infarction |
| EP0941111A4 (en) | 1996-11-05 | 2000-09-27 | Smithkline Beecham Corp | HEPATOCYTE GROWTH FACTOR ANTAGONISTS |
| DE69738539T2 (de) | 1996-12-03 | 2009-03-26 | Amgen Fremont Inc. | Vollkommen humane Antikörper die EGFR binden |
| CO4950519A1 (es) | 1997-02-13 | 2000-09-01 | Novartis Ag | Ftalazinas, preparaciones farmaceuticas que las comprenden y proceso para su preparacion |
| US6133426A (en) | 1997-02-21 | 2000-10-17 | Genentech, Inc. | Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies |
| US20020032315A1 (en) * | 1997-08-06 | 2002-03-14 | Manuel Baca | Anti-vegf antibodies |
| CA2205096C (en) * | 1997-05-09 | 2001-10-09 | Ibm Canada Limited-Ibm Canada Limitee | A system for remote debugging of client/server applications |
| US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
| WO2000012089A1 (en) | 1998-08-31 | 2000-03-09 | Merck & Co., Inc. | Novel angiogenesis inhibitors |
| US6232456B1 (en) | 1997-10-06 | 2001-05-15 | Abbott Laboratories | Serine protease reagents and methods useful for detecting and treating diseases of the prostate |
| GB9800569D0 (en) | 1998-01-12 | 1998-03-11 | Glaxo Group Ltd | Heterocyclic compounds |
| WO1999045009A1 (en) | 1998-03-04 | 1999-09-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Heterocyclo-substituted imidazopyrazine protein tyrosine kinase inhibitors |
| WO1999046291A1 (en) | 1998-03-12 | 1999-09-16 | Shanghai Second Medical University | A human glia maturation factor (gmf) beta homolog gene (cbfboe11) |
| CA2326053A1 (en) | 1998-03-26 | 1999-09-30 | Long Island Jewish Medical Center | Use of scatter factor to enhance angiogenesis |
| ATE321066T1 (de) | 1998-05-06 | 2006-04-15 | Genentech Inc | Anti-her2 antikörperzusammensetzung |
| CA2314156C (en) | 1998-05-29 | 2010-05-25 | Sugen, Inc. | Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors |
| UA60365C2 (uk) | 1998-06-04 | 2003-10-15 | Пфайзер Продактс Інк. | Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця |
| JP2002520324A (ja) | 1998-07-10 | 2002-07-09 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | 新規な血管形成インヒビター |
| WO2000012560A1 (en) | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Dendreon Corporation | Selective apoptosis of neoplastic cells by an hla-dr specific monoclonal antibody |
| US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| ATE538794T1 (de) | 1999-01-13 | 2012-01-15 | Bayer Healthcare Llc | Gamma carboxyarylsubstituierte diphenylharnstoffverbindungen als p38 kinasehemmer |
| EP1165085B1 (en) | 1999-03-30 | 2006-06-14 | Novartis AG | Phthalazine derivatives for treating inflammatory diseases |
| US6521424B2 (en) | 1999-06-07 | 2003-02-18 | Immunex Corporation | Recombinant expression of Tek antagonists |
| ES2262518T5 (es) | 1999-06-07 | 2009-05-08 | Immunex Corporation | Antagonistas de tek. |
| EE05330B1 (et) | 1999-11-05 | 2010-08-16 | Astrazeneca Ab | Kinasoliini derivaadid kui VEGF-i inhibiitorid |
| US7459536B1 (en) | 1999-11-09 | 2008-12-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HGF-SF monoclonal antibody combinations |
| ATE514676T1 (de) | 1999-11-24 | 2011-07-15 | Sugen Inc | Ionisierbare indolinon derivate und deren verwendung als ptk liganden |
| US6515004B1 (en) | 1999-12-15 | 2003-02-04 | Bristol-Myers Squibb Company | N-[5-[[[5-alkyl-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-carboxamide inhibitors of cyclin dependent kinases |
| US6727225B2 (en) | 1999-12-20 | 2004-04-27 | Immunex Corporation | TWEAK receptor |
| WO2001059100A2 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Genentech, Inc. | Inhibitor of hepatocyte growth factor activator for use in modulation of angiogenesis and cardiovascularization |
| US7074408B2 (en) | 2000-02-25 | 2006-07-11 | Immunex Corporation | Use of integrin antagonists to inhibit angiogenesis |
| WO2001068707A1 (en) | 2000-03-13 | 2001-09-20 | Eli Lilly And Company | Human hepatocyte growth factor activator inhibitor homologue |
| GB0006398D0 (en) * | 2000-03-16 | 2000-05-03 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US6749847B2 (en) * | 2000-03-30 | 2004-06-15 | The University Of Connecticut | Hybrid cytokine of IL-7 and β-chain of hepatocyte growth factor |
| AU2001259432B2 (en) | 2000-05-03 | 2005-04-21 | Amgen Inc. | Modified peptides, comprising an FC domain, as therapeutic agents |
| JP3597140B2 (ja) | 2000-05-18 | 2004-12-02 | 日本たばこ産業株式会社 | 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
| EP1355921A2 (en) | 2000-06-29 | 2003-10-29 | North Shore-Long Island Jewish Health System | Modulators of cellular proliferation and angiogenesis, methods for use and identification thereof |
| US6902734B2 (en) * | 2000-08-07 | 2005-06-07 | Centocor, Inc. | Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof |
| US6630500B2 (en) | 2000-08-25 | 2003-10-07 | Cephalon, Inc. | Selected fused pyrrolocarbazoles |
| EP1343782B1 (en) | 2000-12-21 | 2009-05-06 | SmithKline Beecham Corporation | Pyrimidineamines as angiogenesis modulators |
| US6995162B2 (en) | 2001-01-12 | 2006-02-07 | Amgen Inc. | Substituted alkylamine derivatives and methods of use |
| US7102009B2 (en) | 2001-01-12 | 2006-09-05 | Amgen Inc. | Substituted amine derivatives and methods of use |
| US6878714B2 (en) | 2001-01-12 | 2005-04-12 | Amgen Inc. | Substituted alkylamine derivatives and methods of use |
| US20020147198A1 (en) | 2001-01-12 | 2002-10-10 | Guoqing Chen | Substituted arylamine derivatives and methods of use |
| US7105682B2 (en) | 2001-01-12 | 2006-09-12 | Amgen Inc. | Substituted amine derivatives and methods of use |
| US7205275B2 (en) | 2001-10-11 | 2007-04-17 | Amgen Inc. | Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2 |
| US7521053B2 (en) | 2001-10-11 | 2009-04-21 | Amgen Inc. | Angiopoietin-2 specific binding agents |
| US7138370B2 (en) | 2001-10-11 | 2006-11-21 | Amgen Inc. | Specific binding agents of human angiopoietin-2 |
| CA2472383A1 (en) | 2001-12-27 | 2003-07-17 | Van Andel Research Institute | Monoclonal antibody imaging and therapy of tumors that express met and bind hepatocyte growth factor |
| CN1376923A (zh) * | 2002-04-08 | 2002-10-30 | 刘友华 | 肝细胞生长因子的测定方法 |
| US7307088B2 (en) | 2002-07-09 | 2007-12-11 | Amgen Inc. | Substituted anthranilic amide derivatives and methods of use |
| TWI329112B (en) | 2002-07-19 | 2010-08-21 | Bristol Myers Squibb Co | Novel inhibitors of kinases |
| US20040208876A1 (en) | 2003-04-18 | 2004-10-21 | Kim Kyung Jin | Monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor |
| US7220410B2 (en) | 2003-04-18 | 2007-05-22 | Galaxy Biotech, Llc | Monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor |
| EP2367008A3 (en) | 2003-06-06 | 2014-12-24 | Genentech, Inc. | Modulating the interaction between HGF beta chain and C-Met |
| RS53476B (sr) | 2003-07-18 | 2014-12-31 | Amgen Fremont Inc. | Sredstva za specifično vezivanje faktora rasta hepatocita |
| AR059922A1 (es) | 2006-04-01 | 2008-05-07 | Galaxy Biotech Llc | Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos |
| AU2007254942B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-10-27 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Hepatocyte growth factor (HGF) binding proteins |
| US9300829B2 (en) | 2014-04-04 | 2016-03-29 | Canon Kabushiki Kaisha | Image reading apparatus and correction method thereof |
-
2004
- 2004-07-16 RS YU20050975A patent/RS53476B/sr unknown
- 2004-07-16 CN CN201310572240.4A patent/CN103880955A/zh active Pending
- 2004-07-16 ME MEP-314/08A patent/MEP31408A/xx unknown
- 2004-07-16 EP EP04776560.7A patent/EP1648998B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-16 TW TW093121407A patent/TWI395756B/zh not_active IP Right Cessation
- 2004-07-16 ES ES04776560.7T patent/ES2523837T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-16 SG SG200702945-7A patent/SG131943A1/en unknown
- 2004-07-16 CN CN2004800262988A patent/CN101124240B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-16 WO PCT/US2004/018936 patent/WO2005017107A2/en not_active Ceased
- 2004-07-16 TW TW102101625A patent/TWI476206B/zh not_active IP Right Cessation
- 2004-07-16 PL PL04776560T patent/PL1648998T3/pl unknown
- 2004-07-16 AR ARP040102530A patent/AR042955A1/es active IP Right Grant
- 2004-07-16 AU AU2004265595A patent/AU2004265595B2/en not_active Expired
- 2004-07-16 EP EP20100016059 patent/EP2341067A1/en not_active Withdrawn
- 2004-07-16 KR KR1020117027450A patent/KR20110129988A/ko not_active Ceased
- 2004-07-16 MX MXPA06000508A patent/MXPA06000508A/es active IP Right Grant
- 2004-07-16 JP JP2006520171A patent/JP5105874B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-16 US US10/893,576 patent/US8609090B2/en active Active
- 2004-07-16 KR KR1020067001157A patent/KR101254371B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-16 PT PT47765607T patent/PT1648998E/pt unknown
- 2004-07-16 EA EA200600233A patent/EA015363B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-07-16 CA CA2532027A patent/CA2532027C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-16 BR BRPI0412885-0A patent/BRPI0412885A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-07-16 SI SI200432202T patent/SI1648998T1/sl unknown
- 2004-07-16 CN CN201310572326.7A patent/CN103755807A/zh active Pending
- 2004-07-16 NZ NZ544797A patent/NZ544797A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-16 DK DK04776560.7T patent/DK1648998T3/en active
- 2004-07-16 TW TW102101626A patent/TW201319088A/zh unknown
-
2005
- 2005-12-29 IL IL172906A patent/IL172906A0/en unknown
-
2006
- 2006-02-07 NO NO20060600A patent/NO20060600L/no unknown
- 2006-02-15 ZA ZA200601353A patent/ZA200601353B/xx unknown
-
2008
- 2008-02-15 ZA ZA200803050A patent/ZA200803050B/xx unknown
-
2010
- 2010-10-27 JP JP2010241562A patent/JP5543315B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-09-29 JP JP2011215589A patent/JP5750021B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-05-21 AR ARP120101798A patent/AR086510A2/es unknown
- 2012-05-21 AR ARP120101799A patent/AR086511A2/es unknown
- 2012-07-04 JP JP2012150185A patent/JP2012235783A/ja active Pending
-
2013
- 2013-11-21 US US14/086,864 patent/US20140154243A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-12-22 HK HK14112761.6A patent/HK1199266A1/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8609090B2 (en) | Specific binding agents to hepatocyte growth factor | |
| CA2620470C (en) | Trail receptor 2 polypeptides and antibodies | |
| CA2696761C (en) | Human c-fms antigen binding proteins | |
| AU2011250879A1 (en) | Specific binding agents to hepatocyte growth factor | |
| HK1087437B (en) | Specific binding agents to hepatocyte growth factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC | Change of company name or juridical status | ||
| FG | Grant or registration |