MXPA04007811A - Proceso para producir hidrolizado de almidon. - Google Patents
Proceso para producir hidrolizado de almidon.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a un proceso para la hidrolisis enzimatica de almidon granular en un hidrolizado de almidon soluble a una temperatura abajo de la temperatura de gelatinizacion inicial del almidon granular.
Description
PROCESO PARA PRODUCIR HIDROLIZADO DE ALMIDON
Campo de la Invención La presente invención se refiere a un proceso de una etapa para la hidrólisis del almidón granular en un hidrolizado de almidón soluble a una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón granular. Antecedentes de la Invención Se ha descrito un gran número de procesos para convertir el almidón a hidrolizados de almidón, tales como jarabes de maltosa, glucosa o de especialidad, ya sea para su uso como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como la fructosa. La glucosa también puede ser fermentada a etanol u otros productos de fermentación. El almidón es un polímero de peso molecular elevado que consiste de cadenas de unidades de glucosa. El mismo consiste usualmente de aproximadamente 80% de amilopectina y 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el cual las cadenas lineales de residuos de alfa- 1,4 D-glucosa están unidas por enlaces alfa-1 , 6-glucosídicos . La amilosa es un polisacárido lineal construido de unidades de D-glucopiranosa enlazadas conjuntamente por enlaces alfa-1, 4 glucosídicos . En el caso de la conversión del almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado . El proceso de despolimerización
Ref.: 157343 convencional consiste de una etapa de gelatinización y dos etapas de proceso consecutivas, especialmente un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación. El almidón granular consiste de gránulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando una suspensión acuosa de almidón es calentada, los gránulos se hinchan y eventualmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización", existe un incremento notable en la viscosidad. Cuando el nivel de los sólidos es del 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser adelgazado o "licuado" de modo, que el mismo pueda ser manipulado. Esta reducción en la viscosidad es obtenida en su mayoría hoy en día por degradación enzimática. Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades lineales y ramificadas más pequeñas (maltodextrinas) por una alfa-amilasa . El proceso de licuefacción es llevado a cabo típicamente a aproximadamente 105-110 °C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por aproximadamente 1-2 horas a aproximadamente 95 °C. La temperatura es reducida entonces a 60 °C, se agrega una glucoamilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desrramificante , tal como una isoamilasa o una pululanasa, y el proceso de sacarificación procede durante aproximadamente 24 hasta 72 horas.
Será evidente de la descripción anterior que el proceso de conversión de almidón convencional consume mucha energía debido a los diferentes requerimientos en términos de la temperatura durante las diversas etapas. Por consiguiente es deseable ser capaz de seleccionar las enzimas utilizadas en el proceso de modo que el proceso total pueda ser efectuado sin gelatinizar el almidón, Tales procesos son el objeto de las patentes US4591560, US4727026 y US4009074 y EP0171218. La presente invención se refiere a un proceso de una etapa para convertir el almidón granular en un hidrolizado de almidón soluble a una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón. Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto la invención proporciona un proceso de una etapa para producir un hidrolizado de almidón soluble, el proceso comprende someter una suspensión de almidón granular acuoso a una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón granular a la acción simultánea de las siguientes actividades enzimáticas, una primera enzima la cual es un miembro de la Familia 13 de la Glucósido Hidrolasa, tiene la actividad de hidrólisis alfa- 1.4 -glucosídica y comprende un Módulo de Aglutinación de los Carbohidratos de la Familia 20, y una segunda enzima la cual es una alfa-amilasa fungosa (EC 3.'2.1.1) , una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2) , o una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3) . En un segundo aspecto la invención proporciona un proceso para la producción de jarabe a base de almidón con contenido elevado de fructosa (HFSS) (por sus siglas en inglés) , el proceso comprende producir un hidrol izado de almidón soluble por el proceso del primer aspecto de la invención, y comprende además una etapa para la conversión del hidrol izado de almidón soluble en un jarabe a base de almidón con contenido elevado de fructosa (HFSS) . En un tercer aspecto la invención proporciona un proceso para la producción de etanol combustible o potable; que comprende producir un hidrol izado de almidón soluble por el proceso del primer aspecto de la invención, y además comprende una etapa para la fermentación del hidrolizado de almidón soluble en etanol, en donde la etapa de fermentación es llevada a cabo simultáneamente o de manera separada/secuencial con respecto a la hidrólisis del almidón granular . Descripción Detallada de la Invención Definiciones El término "almidón granular" se entiende como almidón no cocido sin refinar, es decir almidón que no ha sido sometido a una gelatinización. El almidón es formado en plantas como gránulos diminutos insolubles en agua. Estos gránulos son preservados en almidones a temperaturas abajo de la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se colocan en agua fría, los granos pueden absorber una cantidad pequeña del líquido. Hasta el intervalo de 50 °C hasta 70 °C la hinchazón es reversible, el grado de reversibilidad depende del almidón particular. Con temperaturas más elevadas empieza una hinchazón irreversible llamada gelatinización. El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización del almidón. El almidón empieza a gelatinizarse en el intervalo de entre 60 °C y 70 °C, la temperatura exacta depende del almidón específico. La temperatura de gelatinización inicial depende de la fuente de almidón que va a ser procesada. La temperatura de gelatinización inicial para el almidón de trigo es de aproximadamente 52 °C, para el almidón de papa de aproximadamente 56 °C, y para el almidón de maíz de aproximadamente 62 °C. Sin embargo, la calidad de almidón inicial puede variar de acuerdo con la variedad particular de especies de la planta así como con las condiciones de crecimiento y por lo tanto la temperatura de gelatinización inicial debe ser determinada para cada conjunto de almidón individual . El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles del proceso de la invención y puede comprender mono-, di-, y oligosacáridos , tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas , ciclodextrinas y cualquier mezcla de estas. Preferentemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ó 98% de los sólidos secos del almidón granular son convertidos en un hidrolizado de almidón soluble . El término "Jarabes de Especialidad", es un término reconocido en el arte y está caracterizado de acuerdo con DE y el espectro del carbohidrato (Véase el artículo "New Speciality Glucose Syrups", p.. 50+, en el libro de texto "Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate " , Editado por G.G. Birch y L.F. Green, Applied Science Publishers LTD., Londres). Típicamente, los Jarabes de Especialidad tienen una DE en el intervalo desde 35 hasta 45. La "Familia 13 de Glucósido Hidrolasa" está definida en el contexto de esta invención como el grupo de hidrolasas que comprenden un dominio catalítico que tiene una estructura de barril de TIM o de (beta/alfa) 8 y que actúa sobre el almidón y los substratos relacionados a través de un mecanismo de reacción de retención alfa (Koshland, 1953, Biol. Rev. Camp. Philos. Soc 28, 416-436). Las enzimas que tienen la "actividad de hidrólisis alfa-1. -glucosídica" están definidas en el contexto de esta invención comprendiendo el grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis y/o la síntesis de los enlaces alfa-1,4-glucosídicos como se definió por Takata (Takata et al, 1992, J. Biol. Chem. 267, 18447-18452) y por Koshland (Koshland, 1953, Biol. Rev.Camp.Philos. Soc 28, 416-436). El "Módulo de Aglutinación de los Carbohidratos de la Familia 20" o un módulo CBM-20 está definido en el contexto de esta invención como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos que tiene al menos 45% de homología con respecto al Módulo de Aglutinación de los Carbohidratos (CBM) (por sus siglas en inglés) del polipéptido descrito en la Figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol . Lett . 19:1027-1031. El CBM comprende los últimos 102 aminoácidos del polipéptido, es decir la subsecuencia desde el aminoácido 582 hasta el aminoácido 683. Las enzimas que; (a) son miembros de la Familia 13 de la Glucósido Hidrolasa; (b) tienen actividad de hidrólisis alfa-1.4-glucosídica y (c) comprenden un Módulo de Aglutinación de los Carbohidratos de la Familia 20, y son contemplados específicamente para esta invención comprenden las enzimas clasificadas como EC 2.4.1.19, las ciclodextrinas glucanotransferasas, y EC 3.2.1.133, las alfa-amilasas maltogénicas, y los números seleccionados de 3.2.1.1 de las alfa-amilasas, y 3.2.1.60, las amilosas formadoras de maltotetraosa . La "actividad de hidrólisis" de las CGTasas y las alfa-amilasas maltogénicas es determinada por la medición del incremento en el poder reductor durante la incubación con el almidón de acuerdo con Wind, R.D. et al en Appl . Environ. Microbiol. 61:1257-1265. La reducción de las concentraciones del azúcar es medida con el método de ácido dinitrosalicílico de acuerdo con Bernfield (Bernfield, P. 1955. Amylases alpha and beta. Methods Enzymol . 1:149-158), con pocas modificaciones. La enzima diluida es incubada durante un período de tiempo apropiado con 1% (p/v) . de almidón soluble (almidón Paselli SA2 de Avebe, Países Bajos o alternativamente almidón soluble de Merck) en un amortiguador de citrato de sodio 10 mM (pH 5.9) a 60 °C. Una unidad de la actividad de hidrólisis está definida como la cantidad de enzima que produce 1 micro mol de maltosa por minuto bajo condiciones estándares. La "homología" del polipéptido referida en esta descripción se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede ser determinada adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en el arte tales como GAP provisto en el paquete de programa GCG (Manual de Programa para el Paquete isconsin, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos son utilizadas: penalidad de creación de GAP de 3.0 y penalidad por extensión de GAP de 0.1. Ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasas) Una enzima particular que va a ser utilizada como una primera enzima en los procesos de la invención puede ser una ciclomaltodextrina glucanotransferasa (E.C. 2.4.1.19). La ciclomaltodextrina glucanotransferasa , también designada como ciclodextrina glucanotransferasa o ciclodextrina glicosiltransferasa, en la siguiente CGTasa denominada, cataliza la conversión del almidón y substratos semejantes en ciclomaltodextrinas por medio de una reacción de transglicosilación intramolecular, por lo cual se forman ciclomaltodextrinas de varios tamaños. La mayoría de CGTasas tienen tanto actividad de transglucosilación como actividad degradante del almidón. Las CGTasas contempladas son preferentemente de origen microbiano, y más preferentemente de origen bacteriano. Las CGTasas contempladas específicamente incluyen las CTGasas que tienen 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia mostrada como los aminoácidos 1 a 679 de la SEC ID NO:2 en WO02/06508, las CGTasas tienen 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido descrito en Joergensen et al, 1997 en la Figura 1 en Biotechnol. Lett . 19:1027-1031, y las CGTasas descritas en US5278059 y US5545587. Preferentemente la CGTasa que va a ser aplicada como una primera enzima del proceso tiene una actividad de hidrólisis de al menos 3.5, preferentemente de al menos 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o más preferentemente al menos 23 micro moles por min/mg. Las CGTasas pueden ser agregadas en cantidades de 0.01-100.0 NU/g DS, preferentemente desde 0.2-50.0 NU/g DS, preferentemente 10.0-20.0 NU/g DS . Alfa-amilasa maltogénica Otra enzima particular que va a ser utilizada como una primera enzima en los procesos de la invención es una alfa-amilasa maltogénica (E.C. 3.2.1.133). Las alfa-amilasas maltogénicas (glucan 1 , 4-alfa-maltohidrolasa) son capaces de hidrolizar la amilosa y la amilopectina a la maltosa en la configuración alfa. Además, una alfa-amilasa maltogénica es capaz de hidrolizar la maltotriosa así como las ciclodextrinas . Las alfa-amilasas maltogénicas contempladas específicamente pueden ser derivadas de Bacillus sp., preferentemente de Bacillus stearothermophilus, más preferentemente de Bacillus stearothermophilus C599 tal como una descrita en EP120.693. Esta alfa-amilasa maltogénica particular tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1-686 de la SEC ID NO:l en US6162628. Una alfa-amilasa maltogénica preferida tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con respecto a los aminoácidos 1-686 de la SEC ID NO : 1 en US6162628, preferentemente al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o particularmente al menos 99%. Las variantes más preferidas de la alfa-amilasa maltogénica comprenden las variantes descritas en W099/43794. La alfa-amilasa maltogénica que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 1-686 de la SEC ID N0:1 en US6162628 tiene una actividad de hidrólisis de 714. Preferentemente la alfa-amilasa maltogénica va a ser aplicada como una primera enzima del proceso tiene una actividad de hidrólisis de al menos 3.5, preferentemente de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o más preferentemente al menos 700 micro mol por min/mg. Las alfa-amilasas maltogénicas pueden ser agregadas en cantidades de 0.01-40.0 MANU/g DS, preferentemente desde 0.02-10 MANU/g DS, preferentemente 0.05-5.0 MANU/g DS . Alfa-amilasa fungosa Una enzima particular que va a ser utilizada como una segunda enzima en los procesos de la invención es una alfa-amilasa fungosa (EC 3.2.1.1), tal como una alfa-amilasa semejante al fungamilo. En la presente descripción, el término "alfa-amilasa semejante al fungamilo" indica una alfa-amilasa la cual exhibe una homología elevada, es decir de más del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 10 en W096/23874. Las alfa-amilasas fungosas pueden ser agregadas en una cantidad de 0.001-1.0 AFAU/g DS, preferentemente desde 0.002-0.5 AFAU/g DS , preferentemente 0.02-0.1 AFAU/g DS . Beta-amilasa Otra enzima particular que va a ser utilizada como una segunda enzima en los procesos de la invención puede ser una beta-amilasa (E.C 3.2.1.2). La beta-amilasa es el nombre dado tradicionalmente a las amilasas maltogénicas de activación exo, las cuales catalizan la hidrólisis de los enlaces 1 , 4 -alfa-glucosídicos en la amilosa, amilopectina y polímeros de glucosa relacionados. Las beta-amilasas han sido aisladas de varias plantas y microorganismos (W. M. Fogarty y C.T. Kelly, Progress in Industrial Microbiology, vol . 15, pp . 112-115, 1979) . Estas beta-amilasas están caracterizadas porque tienen temperaturas óptimas en el intervalo desde 40 °C hasta 65 °C y un pH óptimo en el intervalo desde 4.5 hasta 7.0. La beta-amilasa contemplada incluye la beta-amilasa de cebada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA y Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA de Genencor int así como Novozym™ WBA de' Novozymes A/S. Glucoamilasa Una enzima particular adicional que va a ser utilizada como una segunda enzima en los procesos de la invención también puede ser una glucoamilasa (E.C. 3.2.1.3) derivada de un microorganismo o una planta. Se prefieren las glucoamilasas de origen fungoso o bacteriano seleccionadas del grupo que consiste de glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasa' Gl o G2 de A. Niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), o las variantes de las mismas, tal como se describe en WO92/00381 y O00/04136; la glucoamilasa de A. awamori (WO84/02921) , A. oryzae (Agrie. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o las variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus contempladas incluyen variantes para mejorar la estabilidad térmica; G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); enlaces de disulfuro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; y la introducción de los residuos Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204. Además Clark Ford presentó un artículo el 17 de octubre de 1997, ENZYME ENGINEERING 14, Beij ing/China 12-17 de octubre de 1997, libro del Resumen p.0-61. El resumen sugiere mutaciones en las posiciones G137A, N20C/A27C, y S30P en una glucoamilasa de Aspergillus awamori para mejorar la estabilidad térmica. Otras glucoamilasas contempladas incluyen glucoamilasas de Talaromyces, derivadas en particular de Talaromyces emersonii (W099/28448) , Talaromyces leycettanus (patente US No. Re. 32,153), Talaromyces dupontii, Talaromyces thermophilus (patente US No. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen las glucoamilasas del género Clostridiu.71 , en particular C. Thermoamylolyticum (EP135, 138) , y C. T ermohydrosulfuricuín (WO86/01831) . Las glucoamilasas preferidas incluyen las glucoamilasas derivadas de Aspergillus orizae, tales como la glucoamilasa que tiene 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2 en WO00/04136. También están contemplados los productos comerciales AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER y A G™ E (de Novozymes) ; OPTIDEX™ 300 (de Genencor Int.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM) ; G-ZYME™ G900 (de Enzyme Bio-Systems) ; G-ZYME™ G990 ZR (glucoamilasa de A. niger y contenido bajo de proteasa) . Las glucoamilasas pueden ser agregadas en una cantidad de 0.02-2.0 AGU/g DS, preferentemente 0.1-1.0 AGU/g DS, tal como 0.2 AGU/g DS. Enzimas adicionales Los procesos de la invención también pueden ser llevados a cabo en la presencia de una tercera enzima. Una tercera enzima particular puede ser una alfa-amilasa de Bacillus (referidas frecuentemente como alfa-amilasas semejantes a Termamilo") . Las alfa-amilasas semejantes al Termamilo bien conocidas, incluyen alfa-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis (disponible comercialmente como Termamilo) , B. Amyloliquefaciens, y alfa-amilasa de B. Stearothermophilus . Otras alfa-amilasas semejantes al Termamilo incluyen la alfa-amilasa derivada de una cepa del Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, la totalidad de las cuales son descritas con detalle en 095/26397, y la alfa-amilasa descrita por Tsukamoto et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988) , pp. 25-31. En el contexto de la presente invención una alfa-amilasa semejante al Termamilo es una alfa-amilasa como se definió en W099/19467 en la página 3, línea 18 hasta la página 6, línea 27. Las variantes e híbridos contemplados se describen en W096/23874, W097/41213, y W099/19467. Esta contemplada específicamente una variante de alfa-amilasa de B. stearothermophilus con las mutaciones: 1181* + G182* + N193F. Las alfa-amilasas de Bacillus pueden ser agregadas en cantidades efectivas bien conocidas por la persona experta en el arte. Otra tercera enzima particular del proceso puede ser una enzima de desrramificación, tal como una isoamilasa (E.C. 3.2.1.68) o pululanasas (E.C. 3.2.1.41) . La isoamilasa hiroliza los enlaces de la ramificación alfa-l,S-D-glucosídica en amilopectina y dextrinas de límite beta y pueden ser distinguidas de las pululanasas por la incapacidad de la isoamilasa para atacar el pululano, y por la acción limitada sobre las dextrinas del límite alfa. La enzima de desrramificación puede ser agregada en cantidades efectivas bien conocidas por la persona experta en el arte. Modalidades de la invención La suspensión de almidón que va a ser sometida a los procesos de la invención puede tener almidón granular al 20-55% de sólidos secos, preferentemente almidón granular al 25-40 % de sólidos secos, más preferentemente almidón granular al 30-35% de sólidos secos. Después de ser sometido al proceso del primer aspecto de la invención, al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o preferentemente 99% de los sólidos secos del almidón granular es convertido en un hidrolizado de almidón soluble. De acuerdo con la invención los procesos del primer y segundo aspectos son llevados a cabo a una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización inicial. Preferentemente, la temperatura a la cual los procesos son llevados a cabo es de al menos 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C, 41 °C, 42 °C, 43 °C, 44 °C, 45 °C, 46 °C, 47 °C, 48 °C, 49 °C, 50 °C, 51 °C, 52 °C, 53 °C, 54 °C, 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, o preferentemente al menos 60 °C.
El pH al cual el proceso del primer aspecto de la invención es llevado a cabo puede estar en el intervalo de 3.0 hasta 7.0, preferentemente desde 3.5 hasta 6.0, o más preferentemente desde 4.0-5.0. La composición exacta de los productos del proceso del primer aspecto de la invención, el hidrolizado de almidón soluble, depende de la combinación de enzimas aplicada así como del tipo de almidón granular procesado. Preferentemente, el hidrolizado soluble es maltosa con una pureza de al menos 85%, 90%, 95.0%; 95.5%, 96.0%, 96.5%, 97.0%, 97.5%, 98.0%, 98.5%, 99.0% ó 99.5%. Aún más preferentemente, el hidrolizado de almidón soluble es glucosa, y todavía más preferentemente el hidrolizado de almidón tiene una DX (por ciento de glucosa de los sólidos secos solubilizados totales) de al menos 94.5%, 95.0%; 95.5%, 96.0%, 96.5%, 97.0%, 97.5%, 98.0%, 98.5%, 99.0% ó 99.5%. Sin embargo, está contemplado igualmente el proceso en donde el producto del proceso de la invención, el hidrolizado de almidón soluble, es un jarabe de especialidad, tal como un jarabe de especialidad que contiene una mezcla de glucosa, maltosa, DP3 y DPn para su uso en la fabricación de helados, pasteles, dulces, fruta envasada. El almidón granular que va a ser procesado en los procesos de la invención puede ser obtenido en particular de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o el grano completo. Más específicamente, el almidón granular puede ser obtenidos de maíces, mazorcas de maíz, trigo, cebada, centeno, milo (especie de sorgo) , sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, arvejas, frijol, banana o patatas. Se contemplan especialmente los tipos tanto cerosos como no cerosos del maíz y la cebada. El almidón granular que va a ser procesado puede ser de una calidad de almidón altamente refinado, preferentemente mayor que 90%, 95%, 97% ó 99.5% de pureza o puede ser un almidón más crudo que contiene material que comprende el grano completo molido que incluye fracciones sin almidón tales como residuos de germen y fibras . La materia prima, tal como el grano completo, es molido para abrir la estructura y permitir el procesamiento adicional . Dos procesos de molienda son preferidos de acuerdo con la invención; molienda en húmedo o en seco. En la molienda en seco el grano completo es molido y utilizado. El molido en húmedo proporciona una buena separación del germen y la harina (gránulos de almidón y proteína) y con pocas excepciones es aplicado en lugares en donde el hidrolizado de almidón es utilizado en la producción de jarabes. La molienda tanto en seco como en húmedo es bien conocida en el arte del procesamiento del almidón y son contempladas igualmente para los procesos de la invención. El proceso del primer aspecto de la invención puede ser llevado a cabo en un sistema de ultrafiltración en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, el almidón crudo y agua y en donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. Esta contemplado igualmente el proceso llevado a cabo en un reactor de membrana continua con membranas de ultrafiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, el almidón crudo y el agua y en donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. También está contemplado el proceso llevado a cabo en un reactor de membrana continua con membranas de ultrafiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la • presencia de enzimas, el almidón crudo y el agua y en donde el material permeado es el hidrolizado del almidón soluble. En el proceso del segundo aspecto de la invención ¦ el hidrolizado del almidón soluble del proceso del primer aspecto de la invención es sometido a conversión en jarabe a base de almidón con contenido elevado de fructosa (HFSS, por sus siglas en inglés) , tal como jarabe de maíz con contenido elevado de fructosa (HFCS, por sus siglas en inglés) . Esta conversión es lograda preferentemente utilizando una glucosa isomerasa, y más preferentemente por una glucosa isomerasa inmovilizada soportada sobre un soporte sólido. Las isomerasas contempladas comprenden los productos comerciales Sweetzy e™ IT de Novozymes A/S, G-zyme™ IMGI y G-zyme™ G993, Ketomax™ y G-zyme™ G993 de Rhodia, G-zyme™ G993 líquida y GenSweet™ IGI de Genemcor Int .
En el proceso del tercer aspecto de la invención el hidrolizado de almidón soluble del proceso del primer aspecto de la invención es utilizado para la producción de etanol combustible o potable. En el proceso del tercer aspecto la fermentación puede ser llevada a cabo simultáneamente o de manera separada/secuencial con respecto a la hidrólisis de la suspensión del almidón granular. Cuando la fermentación es efectuada de manera simultánea con la hidrólisis, la temperatura está preferentemente entre 30 °C y 35 °C, y más preferentemente entre 31 °C y 34 °C. El proceso del tercer aspecto de la invención puede ser llevado a cabo en un sistema de ultrafiltración en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, almidón crudo, levadura, nutrientes de la levadura y agua y en donde el material permeado es un líquido que contiene etanol. Está contemplado igualmente el proceso llevado a cabo en un reactor de membrana continua con membranas de ultrafiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, almidón crudo, levadura, nutrientes de la levadura y agua y en donde el material permeado es un líquido que contiene etanol. Materiales y Métodos Actividad de la alfa-amilasa (KNU) La actividad amilolítica puede ser determinada utilizando almidón de patata como el substrato. Este método está basado en el desdoblamiento del almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción es seguida mezclando muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul -negruzco, pero durante el desdoblamiento del almidón el color azul empieza a perder intensidad y gradualmente se convierte en café-rojizo, el cual es comparado con un estándar de vidrio coloreado. Una unidad de alfa amilasa de Kilo Novo (KNU) (por sus siglas en inglés) está definida como la cantidad de enzima la cual, bajo las condiciones estándares (es decir a 37 °C +/- 0.05; 0.0003 M Ca2+; y pH 5.6) dextriniza 5.26 g de substancia seca de almidón Merck Amylum solubile. Una carpeta AF 9/6 que describe este método analítico con mayor detalle está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, tal carpeta es incluida por el presente para referencia. Actividad de CGTasa (KNU) La actividad de alfa-amilasa de CGTasa es determinada por un método que emplea tabletas de Phadebas® como el substrato. Las tabletas de Phadebas (Phadebas® Amylase Test, suministradas por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón de color azul insoluble, reticulado, el cual ha sido mezclado con albúmina del suero de bovino y una substancia amortiguadora. Para cada medición única, una tableta es suspendida en un tubo que contiene 5 mi de amortiguador Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, CaCl2 0.1 mM, el pH ajustado al valor de interés con NaOH) . La prueba es efectuada en un baño de agua a la temperatura de interés. La alfa-amilasa que va a ser probada es diluida en x mi de amortiguador de Britton-Robinson 50 mM. 1 mi de esta solución de alfa-amilasa es agregada a los 5 mi de amortiguador de Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la alfa-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de. la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de la alfa-amilasa. Es importante que la absorbancia de 620 nm medida después de 10 ó 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en el intervalo de 0.2 hasta 2.0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este intervalo de absorbancia existe linealidad entre la actividad y la absorbencia (ley de Lambert-Beer) . La dilución de la enzima debe ser ajustada por lo tanto adaptarse a este criterio. Bajo un conjunto especificado de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones del amortiguador) , 1 mg de una alfa-amilasa dada hidrolizará una cierta cantidad del substrato y un color azul será producido. La intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de la proteína de alfa-amilasa) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones.
Una carpeta EAL-SM-0351 que describe este método analítico con mayor detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, tal carpeta es incluida por el presente para referencia. Actividad de alfa-amilasa maltogénica ( ANU) Una Unidad Novo de Amilasa Maltogénica (MANU) (por sus siglas en inglés) , está definida como la cantidad de enzima la cual bajo el estándar segmentará un micro mol de maltotriosa por minuto. Las condiciones estándares son 10 mg/ml de maltotriosa, 37 °C, pH 5.0, y 30 minutos de tiempo de reacción. La glucosa formada es convertida por la glucosa deshidrogenasa (GlucDH, Merck) a gluconolactona bajo la formación de NADH, la cual es determinada espectrofotométricamente a 340 nm. Una carpeta (EAL-SM-0203.01) que describe este método analítico con mayor detalle está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, tal carpeta es incluida por el presente para referencia. Actividad de glucoamilasa (AGU) La Unidad de Glucoamilasa de Novo (AGU) (por sus siglas en inglés) está definida como la cantidad de enzima, la cual hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 37 °C y pH 4.3. La actividad es determinada por AGU/ml por un método modificado después (AEL-SM-0131 , disponible a petición de Novozymes) de utilizar el kit Glucosa GOD-Perid de Boehringer Mannheim, 124036. Estándar: AMG-estándar , lote 7-1195, 195 AGU/ml . 375 microlitros del substrato (maltosa al 1% en acetato de sodio 50 mM, pH 4.3) son incubados 5 minutos a 37 °C. Se agregan 25 microlitros de enzima diluidos en acetato de sodio. La reacción es detenida después de 10 minutos agregando 100 microlitros de NaOH 0.25 M. Se transfieren 20 microlitros a una placa de microtitulacion de 96 cavidades y 200 microlitros de la solución de GOD-Perid (124036, Boehringer Mannheim) son agregados. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la absorbancia es medida a 650 nm y la actividad calculada en AGU/ml a partir del estándar de AMG. Una carpeta (AEL-SM- 0131 ) que describe este método analítico con mayor detalle está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, tal carpeta es incluida por el presente para referencia. Actividad de la alfa-amilasa fungosa (FAU) La actividad de alfa-amilasa es medida en FAU (por sus siglas en inglés) (Unidades de Alfa-Amilasa Fungosas) . Una (1) FAU es la cantidad de enzima que bajo condiciones estándares (es decir a 37 °C y pH 4.7) desdobla 5260 mg de almidón sólido (Amylum solubile, Merck) por hora. Una carpeta AF 9.1/3, que describe este ensayo de FAU con mayores detalles, está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, tal carpeta es incluida por el presente para referencia.
Actividad de alfa-amilasa ácida (AFAU) La actividad de alfa-amilasa ácida es medida en AFAU (por sus siglas en inglés) (Unidades de Alfa-amilasa Fungosas Acidas) , las cuales son determinadas con relación a un estándar de enzima. El estándar utilizado es AMG 300 L (de Novozymes A/S, glucoamilasa del tipo silvestre de Aspergillus niger Gl, también descrita en Boel et al. (1984) , E BO J. 3 (5) , p. 1097-1102 y en WO92/00381) . La alfa-amilasa neutral en este AMG cae después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 3 semanas desde aproximadamente 1 FAU/ml hasta abajo de 0.05 FAU/ml. La actividad de alfa-amilasa ácida en este AMG estándar es determinada de acuerdo con la siguiente descripción. En este método 1 la AFAU está definida como la cantidad de enzima, la cual degrada 5.26 mg de sólidos secos de almidón por hora bajo condiciones estándares. El yodo forma un complejo azul con el almidón pero no con sus productos de degradación. La intensidad del color por lo tanto es directamente proporcional a la concentración del almidón. La actividad de amilasa es determinada utilizando colorimetría inversa como una reducción en la concentración del almidón bajo condiciones analíticas específicas.
Alfa-amilasa Almidón + yodo > Dextrinas + oligosacáridos 40 °C, H 2.5 Azul/violeta t = 23 seg. Decoloración
Condiciones estándares/condiciones de reacción: (por minuto)
Substrato: almidón, aprox. 0.17 g/1 Amortiguador: Citrato, aprox. 0.03 M Yodo (12) : 0.03 g/1 CaCl2: 1.85 mM pH: 2.50 - 0.05 Temperatura de incubación: 40 °C Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: lambda = 590 nm Concentración de la enzima: 0.025 AFAU/ml Intervalo de trabajo de la enzima: 0.01-0.04 AFAU/ml . Si se prefieren detalles adicionales estos pueden ser encontrados en EB-SM-0259.02/01 disponible a petición de
Novozymes A/S, e incorporado para referencia. Actividad de beta-amilasa (DP°) La actividad de SPEZYME® BBA 1500 es expresada en grados de Potencia Diastática (DP°) . Esta es la cantidad de enzima contenida en 0.1 mi de una solución al 5% de la preparación de la enzima de la muestra que producirá azúcares reductores suficientes para reducir 5 mi de solución de Fehling cuando la muestra es incubada con 100 mi del substrato durante 1 hora a 20 °C. Actividad de pululanasa (Nueva Unidad de Pululanasa Novo) (NPUN) ) La actividad de pululanasa puede ser determinada con relación a un substrato de pululano. El pululano es un polímero de D-glucosa lineal que consiste esencialmente de unidades de maltotriosilo unidas por enlaces 1,6-alfa. Las endo-pululanasas hidrolizan los enlaces 1,6-alfa al azar, liberando maltotriosa, 63-alfa-maltotriosil-maltotriosa, 63-alfa- (63-alfa-maltotriosil-maltotriosil) -maltotriosa. Una Nueva Unidad de Pululanasa Novo (NPUN) es una unidad de actividad de endo-pululanasa y es medida con relación a un estándar de Promozyme D de Novozymes A/S. Las condiciones estándares son un tiempo de reacción de 30 minutos a 40 °C y pH 4.5; y con 0.7% de pululano como el substrato. La cantidad del producto de degradación del substrato rojo es medida espectrofotométricamente a 510 nm y es proporcional a la actividad de endo-pululanasa en la muestra. Una carpeta (EB-SM.0420.02/01) que describe este método analítico con mayor detalle está disponible a petición de Novozymes A/S, Dinamarca, tal carpeta es incluida por el presente para referencia. Bajo las condiciones estándares una NPUN es aproximadamente igual a la cantidad de enzima que libera carbohidratos reductores con un poder reductor equivalente a 2.86 micromol de glucosa por minuto. Determinación de la actividad de hidrólisis de CGTasa La actividad de hidrólisis de CGTasa fue determinada midiendo el incremento en el poder reductor durante la incubación con almidón Paselli SA2 (de Avebe, Países Bajos), como se describe por Wind et al. 1995 en Appl . Environ. Microbiol . 61: 1257-1265. Determinación del perfil de azúcar y sólidos secos solubilizados La composición de azúcar de los hidrolizados de almidón se determinó por CLAR y el rendimiento de glucosa se calculó subsiguientemente como DX. °BRIX, los sólidos secos solubilizados (solubles) de los hidrolizados de almidón fueron determinados por la medición del índice de refracción. Materiales Se utilizaron las siguientes actividades de enzima. Una alfa-amilasa maltogénica con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:l en W09/943794. Una glucoamilasa derivada de Aspergillus oryzae que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en WOOO/04136 como la SEC ID NO: 2 o una de las variantes descritas. Una alfa-amilasa fungosa ácida derivada de Aspergillus niger. Una alfa-amilasa de Bacillus la cual es una variante de B. stearothe.rmop.hi2us recombinante con mutaciones: 1181* + G182* + N193F. Una alfa-amilasa fungosa derivada de Aspergillus oryzáe. Una CGTasa N con la secuencia mostrada aquí como la SEC ID N0:1. Una CGTasa 0 con la secuencia mostrada aquí como la SEC ID NO: 2. Una CGTasa T con la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 1 en Joergensen et al (1997) en Biotechnol . Lett. 19:1027-1031 y mostrada aquí como la SEC ID NO:3. Una CGTasa A que tiene la secuencia mostrada aquí como la SEC ID NO: 4. El almidón de maíz común (C x PHAR 03406) fue obtenido de Cerestar. Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra la conversión del almidón granular en glucosa utilizando la CGTasa T y una glucoamilasa y una amilasa fungosa ácida. Una suspensión con almidón granular al 33% de sólidos secos (DS) fue preparada agregando 247.5 g de almidón de maíz común bajo agitación a 502.5 mi de agua. El pH fue ajustado con HCl a 4.5 La suspensión de almidón granular fue distribuida a recipientes de tapa azul de 100 mi con 75 g en cada recipiente. Los recipientes fueron incubados con agitación magnética en un baño de agua a 60 °C. A las cero horas las actividades de la enzima provistas en la tabla 1 fueron dosificadas a los recipientes. Las muestras fueron retiradas después de 24, 48, 72, y 96 horas.
Tabla 1. Los niveles de actividad de la enzima utilizados fueron :
Los sólidos secos totales del almidón fueron determinados utilizando el siguiente método. El almidón fue hidrolizado completamente agregando una cantidad en exceso de alfa-amilasa (300 KNU/Kg de sólidos secos) y subsiguientemente colocando la muestra en un baño de aceite a 95 CC durante 45 minutos. Después de filtración a través de un filtro de 0.22 microM los sólidos secos fueron medidos por una medición del índice de refracción. Los sólidos secos solubles en el hidrolizado de almidón fueron determinados sobre las muestras después de filtración a través de un filtro de 0.22 microM. Los sólidos secos solubles fueron determinados por la medición del índice de refracción y el perfil del azúcar fue determinado por CLAR. La cantidad de glucosa fue calculada como DX. Los resultados son mostrados en las tablas 2 y 3.
Tabla 2. Los sólidos secos solubles como porcentaje de la substancia seca total a los tres niveles de actividad de CGTasa.
Tabla 3. La DX del hidrolizado soluble a los tres niveles actividad de la CGTasa.
Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra la conversión del almidón granular en glucosa utilizando CGTasa T, una glucoamilasa, una alfa-amilasa fungosa ácida y una alfa-amilasa de Bacillus. Los recipientes con almidón granular de 33% de DS fueron preparados e incubados como se describió en el ejemplo 1 . A las cero horas las actividades de las enzimas proporcionadas en la ¦ tabla 4 fueron dosificadas al recipiente.
Tabla 4. Los niveles de actividad de la enzima utilizados fueron :
Las muestras fueron retiradas después de 24, 48, 72, y 96 horas y se analizaron como se describió en el ejemplo 1. Los resultados son mostrados en las tablas 4 y 5. Tabla 5. Sólidos secos solubles como porcentaje de la substancia seca total.
Tabla 6. La DX del hidrolizado soluble.
Ejemplo 3 Este ejemplo ilustra la conversión del almidón granular en glucosa utilizando una alfa-amilasa maltogénica, una glucoamilasa y una alfa-amilasa fungosa. Los recipientes con almidón granular al 33 % de DS fueron preparados e incubados como se describió en el ejemplo 1. A las cero horas las actividades de la enzima dadas en la tabla 6 fueron dosificadas a los recipientes. Tabla 6. Los niveles de actividad de la enzima utilizados fueron :
Las muestran fueron retiradas después de 24, 48, 72, y 96 horas y se analizaron como se describió en el Ejemplo 1. Los resultados son mostrados en la tabla 7 y 8. Tabla 7. Sólidos secos solubles como porcentaje de la substancia seca total a los dos niveles de actividad de alfa-amilasa maltogénica.
Tabla 8. La DX del hidrolizado soluble a los dos niveles de actividad de alfa-amilasa maltogénica.
Ejemplo 4 Este ejemplo ilustra la única conversión parcial del almidón granular en glucosa utilizando una glucoamilasa y una alfa-amilasa fungosa ácida. Los recipientes con almidón granular al 33% de DS fueron preparados e incubados como se describió en el ejemplo 1. A las cero horas las actividades de la enzima dadas en la tabla 9 fueron dosificadas a los recipientes. Las muestras fueron retiradas después de 24, 48, 72, y 96 horas. Las muestras fueron analizadas como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados son mostrados en las tablas 10 y 11. Tabla 9. Los niveles de actividad de la enzima utilizados fueron:
Tabla 10. Sólidos secos solubles como porcentaje de la substancia seca total.
Tabla 11. DX del hidrolizado soluble.
24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 27.7 34.9 39.2 42.2 Ejemplo 5 Este ejemplo ilustra la correlación entre la actividad de la hidrólisis de cuatro diferentes CGTasas (CGTasa A, CGTasa N, CGTasa 0 y CGTasa T) contra el rendimiento durante la conversión del almidón granular en jarabe de glucosa utilizando una CGTasa y una glucoamilasa medida como sólidos secos solubles y el desarrollo en DX. Los recipientes con almidón granular al 33% de DS fueron preparados y se incubaron como se describió en el ejemplo 1. En la hora cero las CGTasas todas fueron dosificadas a 100 NU/kg DS en combinación con glucoamilasa a 200 AGU/kg DS . Las muestras fueron retiradas a las 48 horas y se analizaron como se describe en el ejemplo 1. Los resultados son presentados en la Tabla 12.
Tabla 12. Actividad de hidrólisis (micro mol por min/mg proteina) , y sólidos secos solubles (DS) y DX después de 48 horas
CGTasa Actividad de Hidrólisis DS solubles DX CGTasa N 0.27 37.4 35.1 CGTasa A 0.38 49.9 46.7 CGTasa O 1.62 60.9 57.1 CGTasa T 4.59 97.9 91.2 Ejemplo 6 Este ejemplo ilustra el proceso llevado a cabo en un sistema de ultrafiltración en donde el material retenido fue mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, el almidón crudo y el agua y en donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. Una suspensión que comprende 100 kg de almidón de maíz granular suspendidos en 233 litros de agua del grifo de la ciudad y CGTasa T (12.5 KNU/kg almidón) , alfa-amilasa de Bacillus (300 KNU/kg almidón) y glucoamilasa (200 AGU/kg de almidón) fue procesada en un sistema de ultrafiltración por lotes (tipo PCI) con un módulo de membrana tubular (tipo PU 120) . La suspensión se agitó a 100 rpm, el pH se ajustó a 4.5 utilizando 170 mi de HCl al 30 %, y la temperatura de reacción fue fijada a 57 °C. Las muestras del material permeado y retenido fueron analizadas para verificar el contenido de los sólidos secos y la composición del azúcar. El. factor de corrección para el material no soluble es: q = (100-S%) / (100-°BRIX) . El índice de centrifugación para el azúcar es: ciS% = °BRIX/S% (sin corrección). El rendimiento teórico del azúcar (glucosa) Srendiraiento ciS%*q*100/lll*100 %. Una corrección se ha hecho así para 100 kg de materia seca de almidón dando casi 111 kg de materia seca de glucosa como un resultado de la reacción de hidrólisis.
Se hizo un ensayo en un sistema por lotes, simple, de utilizar el mismo sistema de enzima para el ensayo de membrana. Como comparación en las tablas 15 a y b se muestra que el sistema de membrana alcanzó la solubilización máxima del almidón más temprano. Tabla 13. Contenido de sólidos secos y composición de azúcar del material retenido y permeado
Tabla 14. Distribución de sólidos secos en el material retenido a 3, 28, 53 y 77 horas.
3 horas 28 horas 53 horas 77 horas .
DS solubles 16 28 31 39 DS totales 38 37 42 45 Tabla 15 a. Rendimiento teórico de glucosa contra el tiempo para el sistema de membrana
Tabla 15 b. Rendimiento teórico de glucosa contra el tiempo para el sistema de reactor por lotes
La conclusión fue que cuando la saturación del substrato fue mantenida durante la sacarificación en un sistema de membrana, el grado de solubilización fue mejorado cuando se compara con un sistema de reactor por lotes, simple, para la sacarificación en frío del almidón crudo. Ejemplo 7 Este ejemplo ilustra una licuefacción en frío simultánea y el proceso de sacarificación de la invención llevado a cabo en un reactor de membrana de microfiltración de trabajo continuo utilizando un módulo de cerámica. Un tanque mezclador de alimentación de 200 litros fue conectado por una bomba de alimentación del reactor a un tanque del reactor de 200 litros con control de la temperatura. Utilizando una bomba con una capacidad de 0-20 1/h, la mezcla del reactor fue reciclada a través de un módulo de microfiltración de cerámica APV para la separación de la glucosa. El tamaño de poro fue de 0.2 micro m y el área de la membrana fue de 0.2 m2. El reactor trabajó durante aproximadamente 200 horas utilizando una dosificación de 100 KNU/kg DS CGT-asa T y 300 AGU/kg DS de glucoamilasa . Con un tiempo de retención promedio en el reactor de 35-45 horas, el sistema operó en estado permanente para el período completo produciendo un jarabe de glucosa de DPI = 93 % a un rendimiento de cerca del 100 %. El tanque del reactor fue cargado con 60 kg del almidón de maíz tipo Cerestar C x PHARM 03406 suspendido en 140 litros de agua del grifo de la ciudad de 58 °C bajo agitación. Utilizando un mantel calentado con vapor la temperatura se ajustó a 60 °C. Utilizando HC1 al 30% el pH se redujo desde 6.1 hasta 4.5. El pH se volvió a verificar (pH = 4.5) después de 15 minutos. A las cero horas, inmediatamente antes de agregar las enzimas, la CGTasa . T (100 K U/kg almidón) y la glucoamilasa (300 AGU/kg almidón) , las muestras fueron tomadas para la determinación del % en volumen del lodo después de la centrifugación a 3000 rpm durante 3 minutos en una centrífuga de mesa. Además, el °BRIX del sobrenadante fue medido utilizando un refractómetro . El curso de la reacción fue seguido regularmente por las mediciones de los volúmenes de lodo y °BRIX de los sobrenadantes como se describió anteriormente. El tanque mezclador de alimentación fue cargado con 186 1 de agua del grifo fría de la ciudad y 80 kg del almidón de maíz tipo Cerestar C x PHARM 03406. El mezclador de alimentación fue mantenido agitado suavemente y el pH fue ajustado a 4.5 utilizando 30 % de HC1. La temperatura fue mantenida a 7-8 °C utilizando agua de enfriamiento y las enzimas CGTasa T (100 KNU/kg de almidón) y glucoamilasa (300 AGU/kg de almidón) fueron agregadas. La temperatura baja aseguró que ninguna reacción se llevara a cabo. El funcionamiento del reactor fue continuado hasta que el valor de °Brix después de 30 horas se ha estabilizado alrededor de 27. Luego se inició la microfiltración utilizando una caída de presión de 0.15 Bar y el flujo máximo del material retenido para asegurar esta presión. El material filtrado fue reciclado al tanque del reactor las primeras 5.7 horas. Después de esto, el material filtrado fue colectado en un tanque separado, y el volumen fue medido como una función del tiempo. En este punto del tiempo la bomba de alimentación del reactor fue iniciada y se ajustó a una velocidad de flujo equivalente al flujo del material filtrado (1/min.). Haciéndolo así, el volumen en el tanque del reactor fue mantenido constante. La alimentación de la suspensión del almidón fue continuada mientras que las muestras fueron tomadas como se describió anteriormente. Además se tomaron muestras de los materiales filtrados. Cualquier reducción en el flujo del material filtrado fue compensada incrementando el flujo del material retenido por lo cual la torta del filtro sobre la membrana fue rota. Por esto, la caída de presión también fue incrementada. Las muestras fueron tomadas como una función del tiempo del material filtrado para CLAR y °BRIX así como el volumen colectado fue medido. Las muestras fueron tomadas simultáneamente del reactor para la medición de DS total, lodo, °Brix y CLAR para la composición de azúcar. El ensayo duró 220 horas. En este instante del tiempo la caída de presión fue incrementada hasta aproximadamente 0.4 Bar.
La determinación de los valores del flujo del filtrado (basado en determinaciones únicas) y del flujo del filtrado promedio (integrado) como una función del tiémpo de proceso mostró que el sistema de enzima que consiste de una CGTasa y una glucoamilasa sola, mantuvo y aseguró un flujo estable durante un tiempo de procesamiento prolongado. Esto subraya las ventajas potenciales industriales de este sistema estable . Los resultados y un balance de masa son presentados en las tablas 16-18. Tabla 16. Análisis de los materiales filtrados colectados.
*inicio de alimentación continua al reactor Tabla 17. Composición del jarabe producido
Tabla 18. Balance de masa para el ensayo del ejemplo 7.
*consumo del substrato base a producción continua.
Comparado con un ensayo por lotes llevado a cabo en un tanque simple con agitación, una reducción significativa del tiempo de reacción fue obtenida utilizando el arreglo para la hidrólisis del almidón granular descrito anteriormente. Como no se encontraron problemas de viscosidad con DS al 30% se considera factible incrementar DS al 40%, o aún tan elevado como 45% y todavía mantener una operación suave.
Ejemplo 8 Este ejemplo compara un proceso de la invención y un proceso convencional para la producción de etanol combustible o alcohol potable a partir del almidón crudo en la forma de maíz molido seco, Amarillo Dental No. 2. Una suspensión de 30% de DS de maíz molido seco fue preparada en agua del grifo en recipientes de tapa azul de 250 mi y el almidón del maíz crudo expuesto a licuefacción fría simultánea y pre-sacarificación por un proceso de la invención. La suspensión fue calentada a 60 °C en un baño de agua bajo agitación magnética, el pH se ajustó a 4.5 utilizando 30% de HCl y se agregó CGTasa T (75 KNÜ/kg DS) y glucoamilasa (500 AGU/kg DS) . Después de 48 horas el recipiente fue enfriado en el baño de agua a 32 °C. Una suspensión de maíz molido seco al 30 % de DS fue pre-licuado en un proceso continuo convencional que consiste de un recipiente de pre-licuefacción, un horno de cocción con surtidor, un recipiente de licuefacción instantánea, y uno de licuefacción posterior. La alfa-amilasa de Bacillus fue agregada durante la pre-licuefacción a 70-90 °C (10 KNU/kg de DS) y nuevamente durante la postlicuefacción a casi 85-90 °C (20 KNU/kg DS) . La cocción en el horno de cocción con surtidor fue llevada a cabo a 115-120 °C. La pre-sacarificación fue efectuada bajo agitación magnética por calentamiento de la masa pulposa en recipientes de tapa azul a 60 °C en un baño de agua. Después del ajuste del pH a 4.5 utilizando HCl al 30%, se agregó glucoamilasa en una dosificación equivalente a 500 AGU/kg DS . Después de 48 horas el recipiente fue enfriado en el baño de agua a 32 °C. Las fermentaciones se hicieron directamente en los recipientes de tapa azul equipados con obturadores de levadura rellenos con aceite de soya. La levadura de los panaderos {Saccharomyces cerevisiae) fue agregada en una cantidad equivalente a 10 millones/ml de células de levadura viables y la nutrición de levadura en la forma de 0.25% de urea fue agregada a cada recipiente. Cada tratamiento fue efectuado en 3 duplicados. La fermentación fue verificada por la pérdida de C02 como se determinó pesando los recipientes a intervalos regulares. Luego se calculó la materia seca de L. EtOH/100 kg de grano (DS) utilizando la siguiente fórmula: Materia seca de L. EtOH/100 kg de masa pulposa = Pérdida de peso (g) x 1.045 x 100 0.79 (g/ml) x 250 x 30% materia seca La masa pulposa contuvo 30% p/p de materia seca del grano. 0.79 g/ml es la densidad del etanol. Las tablas 19 y 20 muestran los resultados obtenidos de la fermentación para los duplicados incluyendo los resultados del cálculo estadístico de dos tipos de materias primas pre-tratadas (los resultados faltantes estimados por interpolación) . Tabla 19. Resultado de fermentación para el proceso de la invención utilizando CGTasa T (75 KNU/kg DS) y glucoamilasa (500 AGU/kg DS)
*Valor estimado
Tabla 20. Resultado de la fermentación para un convencional utilizando la alfa-amilasa de Bacillus KNU/kg DS) y glucoamilasa (500 AGU/kg DS)
*Valor estimado
Usando un tiempo de fermentación industrial simulado en el intervalo de aproximadamente 48-70 horas, se obtuvo un rendimiento de alcohol equivalente o más elevado de la masa pulposa producida por el proceso de la invención que el que podría ser obtenido de una masa pulposa producida por el proceso de cocción en un horno con surtidor y pre-licuefacción de la suspensión caliente, de dos etapas, que consume más energía. Ejemplo 9 Este ejemplo ilustra la conversión de almidón de maíz común y trigo granular en glucosa utilizando una CGTasa, una glucoamilasa y una alfa-amilasa fungosa ácida a 60 °C. Los recipientes con ya sea almidón granular de trigo o de maíz común, al 33 % de DS, fueron preparados e incubados como se describió en el ejemplo 1. A las cero horas las actividades de enzima dadas en la tabla 20 fueron dosificadas a los recipientes. Las muestras fueron retiradas después de 24, 48, 72 y 96 horas y analizadas como se describió en el ejemplo 1. Los resultados son mostrados en la tabla 21 y la tabla 22. Tabla 20. Los niveles de la actividad de la enzima utilizados fueron:
CGTasa Glucoamilasa Alfa-amilasa NU/g DS AGU/g DS fungosa ácida AFAU/g DS 100.0 0.2 0.05 Tabla 21. Sólidos secos solubles como porcentaje de la substancia seca total utilizando dos tipos de almidón diferentes .
Tabla 22. La DX del hidrolizado soluble utilizando los dos diferentes tipos de almidón.
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un proceso de una etapa para producir un hidrolizado de almidón soluble, caracterizado porque comprende someter una suspensión de almidón granular acuosa a una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón granular a la acción simultánea de: una primera enzima la cual : (a) es un miembro de la Familia 13 de la Glucósido Hidrolasa, (b) tiene una actividad en la hidrólisis 1.4-glucosídica, y; (c) comprende un Módulo de Aglutinación del Carbohidrato de la Familia 20, y al menos una segunda enzima la cual es, una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), o una glucoamilasa (E.C. 3.2.1.3). 2. El proceso de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque la suspensión de almidón tiene un almidón granular de 20-55% de sólidos secos, preferentemente un almidón granular de 25-40% de sólidos secos, más preferentemente un almidón granular de 30-35% de sólidos secos, especialmente alrededor de 33% de sólidos secos. 3. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99% de los sólidos secos del almidón granular es convertido en un hidrolizado de almidón soluble. 4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es de origen microbiano, y preferentemente de origen bacteriano. 5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es una CGTasa (E.C. 2.4.1.19). 6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es una CGTasa que tiene una actividad en la hidrólisis de al menos 3.5, preferentemente de al menos 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o más preferentemente al menos 23 micro mol por min/mg . 7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es una CGTasa que tiene 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 en Joergensen et al, 1997, Biotechnol . Lett . 19:1027-1031. 8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es una alfa-amilasa maltogenica (E.C. 3.2.1.133) . 9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la alfa-amilasa maltogenica es derivada de Bacillus, preferentemente de B . stearothermophilus . 10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es una alfa-amilasa maltogenica que tiene 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:l en 09943794. 11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera enzima es la alfa-amilasa maltogenica que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO : 1 en 09943794 o una variante de la secuencia de aminoácidos descrita en dicha patente. 12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado . porque la primera enzima es una alfa-amilasa maltogénica que tiene una actividad en la hidrólisis de al menos 3.5, preferentemente de al menos 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o más preferentemente al menos 700 micro mol por min/mg. 13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la segunda enzima es una beta-amilasa de cebada (E.C. 2.4.1.2), tal como Spezyme® BBA 1500 o Spezyme® DBA de Genencor in . 1 . El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la segunda enzima es una glucoamilasa . 15. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la segunda enzima es una glucoamilasa derivada de Aspergillus oryzae, tal como una glucoamilasa que tiene 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o aún 90% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 en WO00/04136. 16. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una tercera enzima está presente, la tercera enzima es una alfa-amilasa derivada de un Bacillus sp., tal como las enzimas, las variantes y los híbridos descritos en 099/19467 , W096/23874 , WQ97/41213, y W099/19467. 17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una tercera enzima está presente, la enzima es una isoamilasa o una pululanasa. 18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la temperatura es de al menos 58 °C, 59 °C, o más preferentemente de al menos 60 °C. 19. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el pH está en el intervalo desde 3.0 hasta 7.0, preferentemente desde 3.5 hasta 6.0, o más preferentemente desde 4.0-5.0. 20. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el hidrolizado de almidón soluble tiene una DX de al menos 94.5%, 95.0%; 95.5%, 96.0%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98.0%, 98.5%, 99.0% ó al menos 99.5%. . 21. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sacárido dominante en el hidrolizado de almidón soluble es la glucosa o maltosa. 22. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el almidón granular es obtenido de tubérculos, raíces, tallos, o el grano completo. 23. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el almidón granular es obtenido de los cereales. 2 . El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el almidón granular es obtenido del maíz, mazorcas de maíz, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz o patatas . 25. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el almidón granular es obtenido de la molienda en seco del grano entero o de la molienda en húmedo del grano entero. 26. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un sistema de ultrafiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, almidón crudo y agua y en donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. 27. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un reactor de membrana continua con membranas de ultrafiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, almidón crudo y agua y en donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. 28. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un reactor de membrana continua con membranas de microfiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, almidón crudo y agua y en donde el material permeado es el hidrolizado de almidón soluble. 29. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende someter el hidrolizado de almidón soluble a conversión en un jarabe a base de almidón con contenido elevado de fructosa (HFSS) , tal como el jarabe de maíz con contenido elevado de fructosa (HFCS) . 30. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende someter el hidrolizado de almidón soluble a fermentación en etanol . 31. El proceso de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la etapa de fermentación es llevada a cabo simultáneamente o de manera separada/secuencial con la hidrólisis del almidón granular. 32. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-31, caracterizado porque el proceso es llevado a cabo en un sistema de ultrafiltración en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presencia de enzimas, almidón crudo, levadura, nutrientes de levadura y agua y en donde el material permeado es un líquido que contiene etanol. 33. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-32, caracterizado porque es llevado a cabo en un reactor de membrana continua con membranas de ultrafiltración y en donde el material retenido es mantenido bajo recirculación en la presenci a de enzimas, almidón crudo, levadura, nutrientes de la levadura y agua y en donde el material permeado es un líquido que contiene etanol.
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