MXPA04005538A - Procedimiento para la preparacion de una vacuna no toxica contra el antrax. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de una vacuna no toxica contra el antrax.Info
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Abstract
La toxina de antrax que comprende de antigeno protector (PA), factor letal (LF) y factor de edema (RF) es un factor principal virulento de B. anthracis; el antigeno protector PA es el principal componente de toas las vacunas contra el antrax; al eficacia protectora de PA es incrementada grandemente si se incorporan pequenas cantidades de LF o EF en las vacunas; una vacuna ideal contra el antrax debe contener PA, LE o EF en conjunto, pero esta combinacion puede ser toxica, por tanto, las preparaciones mutantes biologicamente inactivas de PA, LF y EF se pueden usar en conjunto para una inmunoproteccion mejor; la presente invencion describe el metodo para la generacion de una vacuna recombinante contra antrax, que comprende proteinas de toxina de antrax, mutantes, no toxicas; el procedimiento involucra mutagenesis dirigida al sitio de los genes nativo de las proteinas de toxina, la expresion y purificacion de las proteinas mutantes y finalmente la caracterizacion de estas proteinas.
Description
UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UNA VACUNA NO TOXICA DE ANTRAX
CAMPO DE LA INVENCION
Esta invención se refiere a una construcción de ADN recombinante y a un procedimiento para la preparación de una vacuna no tóxica de ántrax.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El ántrax, una enfermedad zoonótica se ocasiona por la esporulación de la bacteria gram positiva, Bacillus anthracis. Los humanos son hospederos accidentales a través de la comida de origen animal, productos animales y contaminación del ambiente con Bacillus anthracis (Brachman P. S., 1970, Annals. N. Y. Acad. Sci. 174, 577-582). El ántrax es una de las enfermedades bacterianas más antiguas conocidas y se presenta en la mayoría de las partes en el mundo incluyendo en la India. Los factores virulentos principales de B. anthracis incluyen la cápsula de ácido poli-D-glutámico y un complejo de tres componentes de la toxina de ántrax. La toxina de ántrax (Leppla S. H., 1991 , En Source Book of Bacterial protein toxins, pp 277- 309.), que consiste de un antígeno protector PA (83 kDa), un factor letal (LF-(90 kDa) y un factor de edema (EF-(89 kDa) es un factor virulento principal de B. anthracis. LF/EF, las porciones catalíticas de este complejo requieren PA para entrar al citosol de la célula. PA en combinación con LF (denominada la toxina letal), ocasiona la muerte en animales experimentales (Smith H. y Keppie J., 1954, Nature, 173, 869-870). PA en combinación con EF (denominada la toxina de edema) ocasiona el edema en la piel de los animales experimentales (Stanley J. L. y Smith H., 1961 , J. Gen Microbiol., 26, 49-66). PA es la porción para unión al receptor que facilita la translocación de las porciones catalíticas, LF y EF, dentro de las células blanco. Después de la translocación dentro de la célula, LF, una metaloproteasa ocasiona la escisión de ciertas proteína cinasa cinasas activadas por mitógeno (MAPKKs) que producen la inactivación de las rutas para la transducción de la señal (DuesberyN. S., et. al., 1998, Science, 280. 734-737). Por otra parte, EF, después de entrar a las células, se activa mediante calmodulina para ocasionar un incremento masivo en los niveles de AMPc intracelular (Leppla S. H., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 79, 3162-3166). El primer paso del proceso de intoxicación es la unión de PA a los receptores de la superficie celular (Bradley K. A., et al, 2001 , Nature, 414, 225-229). Después de unirse a los receptores sobre la superficie celular, PA se escinde por las proteasas de superficie celular para producir un fragmento de 63 kDa (Klimpel R. K., et. al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 89, 10277-10281 ), el cual se oligomeriza y se une a LF/EF (Milne J. C, et. al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 20607-20612). La unión de LF/EF es competitiva. El complejo completo lleva a cabo entonces endocitosis mediada por el receptor.
La acidificación del endosoma (Friedlander A. M., 1986, J. Biol. Chem. 261 , 7123-7126) produce la inserción del oligómero de PA dentro de la membrana endosomal para formar poros (Milne J. C. y Collier R. J., 1993, Mol. Microbiol., 10, 647-653) a través de los cuales LF/EF son translocados dentro del citosol de la célula. PA tiene cuatro dominios que están organizados principalmente en láminas beta antiparalelas con solamente unas pocas hélices cortas de menos de cuatro giros (Petosa C, et. al., 1997, Nature, 385, 833-838). El dominio 1 es responsable de la unión a LF/EF durante el proceso de intoxicación por ántrax. El dominio 2 está dominado por un barril beta y desempeña un papel en la inserción en la membrana y en la translocación. El dominio 3 es el dominio más pequeño y es importante para la oligomerización de PA y posiblemente también en la unión de PA a LF/EF. El dominio 4 es el dominio de unión al receptor. La estructura cristalina de LF, determinada recientemente, muestra que LF tiene 4 dominios (Pannifer A. D., et al, 2001 , Nature, 414, 229-233). El dominio 1 está implicado en la unión a PA. Este dominio, tiene homología significativa con los residuos N-terminales 1-250 de EF. De hecho, la mayoría de los residuos en esta región están absolutamente conservados. De todas las tres proteínas toxinas, PA es la más inmunogénica y es un componente esencial de la vacuna en contra del ántrax (Gladstone G. P., 1946, Br. J. Exp. Pathol, 27, 349-418). Se ha observado que la eficiencia protectora de PA se incrementa en gran medida si se incorporan cantidades pequeñas de LF o de EF dentro de la vacuna (Pezard et. al., 1995, Infecí. Immun., 63, 1369-1372). No obstante, también parece que ésta es la razón principal de la toxigenicidad y reactogenicidad de las vacunas. La toxina de ántrax (Leppla S. H., 1991 , En: Source Book of Bacterial protein toxins, pp 277-302), que consiste del antígeno protector (PA), el factor letal (LF) y el factor de edema (EF) es un factor virulento principal de B. anthracis. La vacuna del ántrax actualmente utilizada se deriva a partir de una cepa avirulenta no-encapsulada de la bacteria conocida como cepa de Sterne (Sterne M., 1939, J. Vet. Sci. Anim. Ind, 13, 307-312). En Rusia y en China, se utilizan las vacunas con esporas vivas basadas en la cepa de Sterne. En RU la vacuna es un filtrado del cultivo precipitado con alumbre de la cepa de Sterne mientras que la vacuna en E.U.A. consiste de filtrados de cultivo libres de células adsorbidos sobre un gel de alhidrogel de una cepa V770 derivada no-encapsulada, no proteolítica aislada a partir de ántrax de bovino (Turnbull P. C. B, 1991 , Vaccine, 9, 533-539). Todas estas vacunas de ántrax actualmente utilizadas, aparte de ser vacunas sin purificar tienen una composición no definida. Estas son reactogénicas y no proveen protección en contra de todas las cepas naturales de B. anthracis. La Patente de E.U.A. 2,017,606 describe la preparación del antígeno de ántrax mediante el crecimiento de los bacilos con un medio de cultivo adecuado, separando los bacilos a partir del medio de cultivo. La Patente de E.U.A. 2,151 ,364 describe un método para producir una vacuna de ántrax la cual comprende la preparación de la suspensión de esporas de ántrax, añadiendo a la suspensión una solución estéril que contiene alumbre. La patente de RU 2,115,433 describe el método de producción de una vacuna de ántrax, la cual comprende esporas vivas de una cepa no encapsulada de B. anthracis y el antígeno protector de B. anthracis. La Patente WO 0002522 describe un método para la producción de una vacuna de ántrax utilizando antígeno protector no tóxico a partir de B. anthracis para uso en la inducción de la respuesta inmune, la cual protege en contra del ántrax. Las desventajas en las patentes anteriormente mencionadas son que todas ellas utilizan cultivos/esporas de Bacillus anthracis. Bacillus anthracis es un organismo infeccioso y no puede ser manejado sin instalaciones para su contención. La vacuna preparada se contamina con otras proteínas tóxicas y no tóxicas a partir de Bacillus anthracis produciendo diversos efectos laterales y reactogenicidad. Estas vacunas también tienen un cierto grado de virulencia residual para ciertas especies de animales domesticados y de animales de laboratorio. La cepa de Sterne es toxigénica y patogénica a elevadas dosis. Como resultado se considera poco segura y no adecuada para uso en humanos. Esta vacuna puede ocasionar efectos laterales no deseables incluyendo necrosis en el sitio de la inoculación. Por lo tanto existe una necesidad para desarrollar una segunda generación de vacunas contra ántrax las cuales no tengan efectos laterales y tengan una composición bien definida. El objetivo de la presente invención es volver a la toxina de ántrax no tóxica sin afectar su inmunogenicidad, con el objeto de desarrollar una vacuna de ántrax segura y efectiva. Para lograr dicho objetivo, la presente invención provee una construcción de ADN recombinante que comprende un vector de expresión y un fragmento de ADN que incluye genes para el antígeno protector de tipo silvestre (PA) o el factor letal de tipo silvestre (LF) o el factor de edema de tipo silvestre (EF) La presente invención también provee una construcción de ADN recombinante que comprende: un vector de expresión y un fragmento de ADN que incluye los genes para el antígeno protector tipo muíante (PA) o el factor letal tipo muíante (LF) o el factor de edema tipo mutante (EF) Dicho vector es un vector procarionte, dicho vector es PQE 30 y dicho vector de expresión contiene un promotor T5 y una marca de 6X histidinas. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe202. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Leu203. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Pro205.
Dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Ile207. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en los residuos Pro205, Trp226 y Phe236. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe552. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Ile574. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe552 y Phe554. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Ile562 e Ile574. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Leu566 e Ile574. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe552 y Phe554, Ile562, Leu566 e Ile574. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe427. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con deleción del residuo Asp 425. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con deleción del residuo Phe 427.
El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Trp346. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Leu352. El fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Trp346, Met350 y Leu352. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Tyr148. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Tyr 149. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Ile151. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Lys 53. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Asp187. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Phe 190. El fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Asp187, Leu 188, Leu 189 y Phe190. El fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Tyr137. El fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Tyr138. El fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Ile 40. El fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Lys 142. La proteína codificada por dicho fragmento de ADN se expresa en un hospedero procarionte. Dicho hospedero procarionte es una cepa de E. col i. Una proteína expresada por un fragmento del gen de ADN es PA de tipo silvestre, LF de tipo silvestre, EF de tipo silvestre y sus variantes mutagenizadas. Esta invención describe adicionalmente un método para producir proteína toxina de ántrax mutagenizada que comprende: - Mutagenizar los genes PA, LF y EF utilizando diferentes iniciadores mutagénicos del tipo como se define en la presente invención para la reacción de PCR; - tratar a dicho producto de PCR muíante junto con el molde nativo con una enzima para escindir el molde nativo de dicho producto de PCR; - transformar dicho producto mutante en la cepa de E. coli; - aislar la construcción recombinante a partir de la cepa transformada de E. coli y confirmar la mutación deseada; - transformar la construcción mutante confirmada en una cepa apropiada para expresión de E. coli para expresar la proteína muíante y - purificar dicha proteína muíante expresada. La purificación se lleva a cabo uíilizando cromaíografía con Ni- NTA y/u oirás técnicas cromatográficas. Los genes se clonan dentro del vector de expresión PQE que contiene el promotor T5 y la marca de 6X histidinas. Las mutaciones se realizaron en el primer dominio de PA en los residuos 202, 203, 205. Las mutaciones se realizaron en el tercer dominio de PA en los residuos 552, 574 552+554, 562+574, 566+574, 559+554+562+566+574 produciendo proteínas mutantes que eran defectuosas en la oligomerización. Las mutaciones se realizaron en el segundo dominio de PA en los residuos 425 y 427 del asa 4 del dominio 2. Estas mutaciones deterioraron la capacidad de translocación de PA. Las mutaciones se realizaron en el segundo dominio de PA en los residuos 346, 352 y 346+350+352 en el asa 3 del dominio 2 de tal manera que PA se volvió biológicamente inactivo. Las mutaciones se realizaron en el primer dominio de LF en los residuos 148, 149, 151 , 153, 187, 190 y 187+188+189+190 deterioraron la unión de LP a PA. Las mutaciones se realizaron en los primeros 250 residuos de EF. Una vacuna de ántrax que comprende una proteína toxina de ántrax seleccionada a partir de PA de tipo silvestre o de LF de tipo silvestre o de EF de tipo silvestre.
Una vacuna de ántrax que comprende una proteína toxina de ántrax seleccionada a partir de PA de tipo muíante o LF de tipo mutante o EF de tipo mutante o una combinación de los mismos. Una vacuna de ántrax que comprende una proteína toxina de ántrax seleccionada es una combinación de cualesquiera seleccionadas a partir de PA de tipo silvestre o LF de tipo silvestre o EF de tipo silvestre con cualquiera una o más seleccionadas a partir del PA de tipo mutante o LF de tipo mutante o EF de tipo mutante. Una composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de una proteína toxina de ántrax como se reclama en la presente invención.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Una vacuna ideal en contra del ántrax debe contener PA, LF, EF juntos, pero al mismo tiempo debe ser no tóxica y segura. Las proteínas recombinantes purificadas con una composición definida pueden ser utilizadas en la vacuna para minimizar la reactogenicidad de la vacuna. Además, estas proteínas toxinas de ántrax se pueden volver no tóxicas mediante la introducción de mutaciones que afectan la actividad biológica de las proteínas sin afectar su estructura o inmunogenicidad. Estas proteínas mutantes de toxina de ántrax, no tóxicas, pueden ser utilizadas juntas para crear una vacuna recombinante segura, no reactogénica y efectiva en contra del ántrax. Por lo tanto, el principal objetivo de esta invención fue crear un procedimiento para elaborar una vacuna de segunda generación, segura y efectiva, en contra del ántrax que comprende proteínas de toxinas de ántrax no tóxicas que se han producido mediante mutagénesis sitio dirigida de los diferentes dominios funcionalmente importantes de las proteínas toxinas. Los inventores de esta solicitud han amplificado mediante PCR los genes para PA, LF y EF. Ellos han clonado estos genes dentro del vector de expresión pQE30 (Gupta P., et. al., 1998, Infect. Immun., 66, 862-865; Gupta P., et. al., 1999 Protein Expr. Purif. 16, 369-376; Kumar P., et. al. 2001 , Infect. Immun., 69, 6532-6536). El vector contiene el promotor T5 y una marca de 6x histidinas, la cual permite la purificación conveniente de las proteínas recombinantes (figura 1 ). Las condiciones para la sobre-expresión de dichos genes utilizando los plásmidos recombinantes anteriormente mencionados, a partir de las cepas de E. coli se han optimizado por los inventores (Chauhan V., et. al., 2001 , Biochem. Bíophys. Res. Commun., 283, 308-315). Utilizando el plásmido recombinante anteriormente mencionado, los inventores del presente procedimiento, introdujeron mutaciones en dichos genes para hacer a las proteínas recombinantes expresadas defectuosas en su función biológica, por lo tanto volviéndolas no tóxicas. La invención implica la expresión y purificación de dichas proteínas mutantes a partir de las cepas de E. coli. Esto implica adicionalmente la caracterización total de las proteínas mutantes purificadas para identificar con precisión el defecto que las vuelve no tóxicas.
Mutaciones introducidas en el antíqeno protector como parte de la invención
1. Mutaciones que hacen a PA defectuoso en la unión a LF/EF Los inventores introdujeron series de mutaciones en el primer dominio de PA. Entre las mutaciones introducidas, se encontró que las mutaciones en los residuos 202, 203, 205, 207 y 205+226+236 eran defectuosas en la unión a LF.
2. Mutaciones que hacen a PA defectuoso en la oligomerización Los autores de esta invención introdujeron mutaciones en el tercer dominio de PA. Las mutaciones en los residuos 552, 574, 552+554, 562+574 566+574, 552+554+562+566+574 produjeron proteínas mutantes que fueron defectuosas en la oligomerización.
3. Mutaciones que hacen a PA defectuoso en la translocación Los inventores introdujeron mutaciones en los residuos 425 y
427 del asa 4 del dominio 2. Estas mutaciones deterioraron la capacidad de translocación de PA.
4. Mutaciones que hacen a PA defectuoso en la inserción/translocación Los autores han descubierto que cuando se introducen mutaciones en los residuos 346, 352 y 346+350+352 en el asa 3 del dominio 2, PA se vuelve biológicamente inactivo. Las proteínas mutantes fueron capaces de unirse a los receptores de superficie celular, se activaron proteolíticamente para formar oligómeros y se unieron a LF. La inactividad biológica de estas proteínas mutantes puede relacionarse con un defecto en la inserción/translocación.
Mutaciones introducidas en el factor letal como parte de la invención
Mutaciones que hacen a LF defectuoso en la unión a PA Los inventores de este procedimiento han introducido mutaciones en el primer dominio de LF. Ellos encontraron que las mutaciones en los residuos 148, 149, 151 , 153, 187, 190 y +188+189+190 deterioraron la unión de LF a PA.
Mutaciones introducidas en el factor de edema como parte de la invención
Mutaciones que hacen a EF defectuoso en la unión a PA Los inventores de este procedimiento han introducido series de mutaciones en los primeros 250 residuos de EF. Se encontró que las mutaciones en los residuos 137, 138, 140 y 142 deterioraban drásticamente la unión de EF a PA. Después de la expresión y purificación de las proteínas mutantes, las proteínas fueron evaluadas para su actividad biológica. Los inventores han encontrado que los mutantes de PA anteriormente mencionados que fueron añadidos junto con el LF de tipo silvestre, no fueron tóxicos a las células J774A.1. De manera similar los mutantes de LF cuando se añadieron junto con el PA de tipo silvestre no fueron tóxicos a las células J774A.1 . De manera similar, los mutantes de EF cuando se añadieron junto con el PA de tipo silvestre fueron incapaces de producir toxicidad por AMPc en las células CHO (cuadro 2). La proteína muíante purificada se analizó para su actividad biológica mediante ensayo de la: -capacidad de PA para unirse a los receptores de superficie celular, -capacidad de PA para unirse a LF o a EF, -capacidad de PA para oligomerizar, -capacidad de inserción a la membrana del oligómero de PA, -capacidad de PA para translocar a LF o a EF al citosol, -capacidad de la toxina letal para eliminar a las líneas de células de macrófagos semejantes a RAW264.7 y J774A.1 -capacidad de la toxina del edema para elongar a las células
CHO.
Estudios de inmunización El antígeno protector, como el nombre sugiere es una proteína altamente inmunogénica. De hecho es un componente necesario para la vacuna en contra del ántrax. La inmunización con PA recombinante de tipo silvestre produce títulos elevados de anti-PA y provee protección en contra de la prueba letal del ántrax en conejillos de india. Se observó adicionalmente que el PA muíante era tan inmunogénico como el PA de tipo silvestre y se pudo sustituir fácilmente al PA de tipo silvestre en la vacuna (Singh et. al. 1998, Infect. Immun. 66, 3447-3448). Los estudios de inmunización también indican una contribución significativa de LF/EF a la inmunoprotección. Con base en estos resultados los inventores han desarrollado una vacuna recombinante en contra del ántrax, la cual comprende mutantes de los tres componentes de la toxina de ántrax. La vacuna recombinante basada en la toxina de ántrax desarrollada por los inventores inventors tiene las siguientes ventajas: 1. El procedimiento descrito en la presente invención no implica el manejo de cultivos de B. anthracis (en ninguna etapa). Por lo tanto este procedimiento es seguro, efectivo en costo y no requiere las instalaciones sofisticadas para la contención. 2. La vacuna desarrollada por los inventores tiene una composición bien definida y por lo tanto no tendrá ninguna variación de lote a lote. 3. La invención descrita en la presente invención utiliza proteína toxina de ántrax mutante purificada. Como consecuencia, esta vacuna de ántrax de segunda generación no será reactogénica y no ocasionará ningún efecto lateral a diferencia de la vacuna previa. 4. Adicionalmente, esta invención comprende proteínas mutantes no tóxicas, las cuales cuando se administran (ya sea solas o en combinación) no ocasionan ninguna toxigenicidad o patogenicidad asociada con el uso habitual de la vacuna. 5. Por lo tanto la invención descrita en la presente invención es segura y adecuada para uso animal/humano.
Detalles de los procedimientos experimentales
Mutaqénesis sitio dirigida de las proteínas de toxina de ántrax Para introducir las mutaciones deseadas en las proteínas de toxina de ántrax, se utilizaron iniciadores mutagénicos complementarios (referencia cuadro 1 ) para amplificar los genes de toxina de ántrax de tipo silvestre (para PA o LF o EF). Se utilizó la ADN polimerasa Pfu de alta fidelidad para la reacción de PCR. Se amplificaron las longitudes totales de ambas cadenas del ADN plasmídíco de manera lineal durante varias rondas de ciclo térmico, generando un plásmido mutante con cortes escalonados en las cadenas opuestas (figura 2). La amplificación se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa del producto de PCR. El producto de la amplificación se trató con Dpnl que escinde específicamente las secuencias ATC G completamente metiladas. La reacción de digestión se llevó a cabo en un volumen de reacción de 20 µ? con 100 ng del producto amplificado, 2 µ? del regulador de pH para reacción 10X Dpnl y 0.1 U de Dpnl. Después de la digestión con Dpnl, las moléculas resistentes a Dpnl que eran ricas en los mutantes deseados se recuperaron mediante la transformación del ADN dentro de la cepa apropiada de E. coli. Las mutaciones se confirmaron mediante la secuenciación de las construcciones anteriormente mencionadas utilizando un equipo de secuenciación de ciclo de ADN Perkin Elmer.
Expresión y purificación de las proteínas toxina de ántrax mutantes Las construcciones confirmadas se transformaron dentro de las cepas de expresión de E. coli que expresaban la ARN T5 polimerasa. Las células transformadas se crecieron en medio de caldo del Luria (LB) que contenía 100 µg/ml de ampicilina y 25 µg/ml de canamicina, a 37°C, a una OD600 de 0.8. Posteriormente se realizó la inducción con IPTG 0.5 mM y la incubación se continuó a 37°C por 3 a 4 horas. Luego las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 6000 rpm por 10 minutos. Posteriormente las células fueron lisadas. El perfil de la proteína se analizó mediante SDS-PAGE y western blot. Las proteínas PA mutantes se purificaron utilizando cromatografía de afinidad por Ni-NTA quelante de metal y otras técnicas cromatográficas (Kumar P., et. al. 2001 , Infect. Immun., 69, 6532-6536; Gupta P., et. al., 1998, Infect. Immun., 66, 862-865; Gupta P., et. al., 1999 Protein Expr. Purif. 16, 369-376). Las proteínas mutantes purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE y western blot y se estimaron utilizando el método de Bradford. Para el almacenamiento las proteínas purificadas fueron dializadas en contra de HEPES 50 mM y se almacenaron como alícuotas a -70°C.
Cultivo celular La línea de células semejantes a macrófagos J774A.1 se mantuvo en medio RPMI 1640 que contenía 10% de FCS inactivado mediante calor, HEPES 25mM, 100 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina en un ambiente humidificado con 5% de CO2 a 37°C. Las células CHO se mantuvieron en medio EMEM que contenía 10% de FCS inactivado mediante calor, HEPES 25 mM, 100 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina en un ambiente humidificado con 5% de C02 a 37°C. Para estudiar la actividad biológica del PA de tipo silvestre o sus proteínas mutantes, se añadieron concentraciones variables de esas proteínas junto con LF (1 µg/ml) a las células J774A.1 sembradas en placas de 96 pozos. La incubación se permitió por 3 horas a 37°C y luego se determinó la viabilidad celular (Bhatnagar et. al. 1989, Infect. Immun., 57, 2107-21 14) utilizando colorante de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-íl)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Bhatnagar R., et. al., 1999, Cell Signal., 1 1 , 1 1 1 -1 16). El MTT disuelto en RPMI se añadió a cada pozo a una concentración final de 0.5 mg/ml y se incubó por otros 45 minutos a 37°C para permitir la toma y oxidación del colorante por las células viables. El medio se reemplazó mediante 0.5% (p/p) de dodecil sulfato de sodio (SDS), HCI 25 mM en 90% de alcohol isopropílico y la placa se sometió a agitación. La absorción se leyó a 540 nm utilizando un lector de microplacas (BIORAD). De manera similar, para estudiar la actividad biológica del LF de tipo silvestre o sus proteínas mutantes, se añadieron concentraciones variables de estas proteínas junto con PA (1 g/ml) a las células J774A.1 sembradas en placas de 96 pozos. La incubación se permitió por 3 horas a 37°C y luego se determinó la viabilidad celular utilizando el colorante MTT, como se detalló anteriormente. Para estudiar la actividad biológica del EF de tipo silvestre o sus proteínas mutantes, se añadieron concentraciones variables de estas proteínas junto con PA (1 µg/ml) a las células CHO que estaban sembradas en placas de 96 pozos. La incubación se permitió por 3 horas a 37°C y luego las células se examinaron microscópicamente para su elongación. Se determinó la elevación de los niveles intracelulares de AMPc en las células después del tratamiento con la toxina (Kumar P., et. al., 2001 , Infect. Immun., 69, 6532-6536) con el equipo cAMP EIA de Amersham Pharmacia. Posteriormente se realizaron experimentos adicionales para entender como afectan las mutaciones a la actividad biológica de las proteínas mutantes de la toxina de ántrax.
Unión de PA a los receptores de superficie celular Las células J774A.1 se dejaron crecer hasta confluencia en placas de 24 pozos antes de incubar con 1 µ?/??? de PA de tipo silvestre o su proteína muíante a 4°C por 2 horas. Posteriormente las células se lavaron con 5 RPMI frío, se disolvieron en regulador del pH para lisis con SDS y se sometieron a SDS-PAGE para electroblot. El blot se desarrolló con anticuerpos anti-PA para estudiar la unión del PA de tipo silvestre o su proteína mutante con los receptores de superficie celular.
í o Escisión proteolítica de PA y proteínas mutantes en solución El PA de tipo silvestre y sus proteínas mutantes se evaluaron para susceptibilidad a escisión por tripsina. Las proteínas (1.0 mg/ml) se incubaron con 1 g/ml de tripsina por 30 minutos a temperatura ambiente en HEPES 25 mM, CaCI2 1 mM, EDTA 0.5 mM pH 7.5. La reacción de digestión
15 se detuvo mdiante la adición de PMSF a una concentración de 1 mM. Para SDS-PAGE, las muestras se hirvieron en regulador de pH para muestra con SDS por 5 minutos y se resolvieron sobre SDS-PAGE al 12 %.
Unión de PA a LF sobre la superficie de las células 0 Las células J774A.1 se lavaron dos veces con RPMI y luego se incubaron con 1 µg/ml de PA de tipo silvestre o su proteína mutante a 4°C por 3 horas. Posteriormente las células se lavaron con RPMI frío para remover la proteína no unida. Luego las células se incubaron con LF (1.0 µg/ml) por 3 horas y luego se lavaron con RPMI frío para remover el LF no unido. Las células se disolvieron en regulador de pH para lisis con SDS y se sometieron a SDS-PAGE por electroblot. El blot se desarrolló con anticuerpos anti-LF para estudiar la unión del PA de tipo silvestre o su proteína muíante a LF.
Oliqomerización en PA en solución PA después de la escisión proteolítica para formar heptámeros. Para estudiar la capacidad del PA de tipo silvestre y sus proteínas mutantes para formar oligómeros, las proteínas (1 mg/ml) se dirigieron con tripsina por 30 minutos a 25°C. Las muestras se llevaron a pH 5.0 mediante la adición de Tris 1 M pH 5.0 a una concentración final de 100 mM y se hirvieron por 5 minutos en regulador de pH para muestra con SDS (Tris-CI 0.0625 , 1.25% de SDS, 2.5% de ß-mercaptoetanol y 5% de glicerol, pH 6.8) antes de cargar sobre un gel con un gradiente de 3-12%. La tinción con plata se realizó para detectar la formación de oligómeros.
Unión de LF/EF al PA unido a la superficie celular. Las células J774A.1 se lavaron con RPMI frío y luego se incubaron con 1 µg/ml de PA de tipo silvestre a 4°C por 3 horas. Las células se lavaron de nuevo con RPMI frío para remover la proteína no unida. El LF/EF de tipo silvestre o las proteínas mutantes (1.0 µg/ml) se añadieron entonces y la incubación se continuó por 3 horas. Posteriormente las células se lavaron con RPMI frío para remover el LF/EF no unido. Posteriormente, las células se disolvieron en regulador de pH para lisis con SDS y se sometieron a SDS-PAGE para electroblot. El blot se desarrolló con anticuerpos anti-LF/EF para estudiar la unión de LF/EF a la unión a la superficie celular (cuadro 3).
CUADRO 1 Residuo Cambio Iniciadores Dominio Defecto mutantes PA: Phe202 a alanina 5'CTTTTCATGAATATTAG I Defectuoso AAATCCATGCTGAAAG en la unión al factor letal
Leu203 a alanina CTTTTCATGAATATTAGA I Defectuoso AATCCATGGTGAAGCAA en la unión AAGT al factor letal
Pro205 a alanina CTTTTCATGAATATTAGA I Defectuoso AATCCATGGTGAAAGAG en la unión CAGTTCT al factor letal
Ile207 a alanina TTTGGTTAACCCTTTCTT I Defectuoso TTCATGAATATTAGAAAT en la unión CCATGGTGAAAGAAAAG al factor TTCTTTTATTTTTGACATC letal AACCGTATATCCTTCTAC
CTCTAATGAATCAGCGAT
TCC Pro205 a alanina CTTTTCATGAATATTAGA I Defectuoso
+Trp226+ AATCCATGGTGAAAGAG en la unión
Phe236 CAGTTCT y al factor GGATTTCTAATATTCATG letal AAAAGAAAGGATTAACCA
AATATAAATCATCTCCTG
AAAAAGCGAGCACGGCT
TCTGATCCGTACAGTGAT
GCCGAAAAGGTT Phe552 a alanina CAAGGGAAAGATATCAC III Defectuoso CGAATTTGATGCTAATTT en CGATC oligomeriza ción Residuo Cambio Iniciadores Dominio Defecto
Ile574 a alanina GAATTAAACGCGTCTAAC III Defectuoso GCATATACTG en oligomeriza ción
Phe552 a alanina ATTTTGAGATGTTTGTTG III Defectuoso +Phe554 ATCGGCATTAGCATCAAA en TTC oligomeriza ción
Ile562 + a alanina CAGTATATGCGTTAGAC III Defectuoso I¡e574 GCG 1 1 1 AATTCCGCTTAA en CTGATTCTTGGCATTTTG oligomeriza AGATG ción
Leu566+ a alanina ATCAGGCAGCGGAATTA III Defectuoso Ile574 AACGCGTCTAACGCATAT en ACTG oligomeriza ción
Phe552 a alanina CAGTATATGCGTTAGAC III Defectuoso
+Phe554 GCGTTTAATTCCGCTGC en +Ile562+L CTGATTCTTGGCATTTTG oligomeriza eu566+ AGATG y ción
Ile574 ATTTTGAGATGTTTGTTG ATCGGCATTAGCATCAAA
TT Phe427 a alanina GTAATTGGAGTAGAACT II TranslocaGGCATCGTCTTGTGC ción defectuosa
Asp425 Residuo GTAATTGGAGTAGAACT II Translocadeletado GAAATCTTGTTCATTTAA ción TGCG defectuosa
Phe427 Residuo GCACAAGACGATAGTTC II Translocadeletado TACTCCAATTAC ción defectuosa
Trp 346 a alanina CGGTCGCAATTGATCATT II Inserción CACTATCTCTAGCAGGG en la GAAAGAA membrana/ CTGCGGCTGAAACAATG translocación defectuosa Residuo Cambio Iniciadores Dominio Defecto
Leu 352 a alanina CGGTCGCAATTGATCATT II Inserción en CACTATCTCTAGCAGGG la GAAAGAACTTCGGCTGA membrana/ AACAATGCGTGCAAATAC translocación CGCTGAT defectuosa
Trp 346, a alanina CGGTCGCAATTGATCATT II Inserción en Met 350 y CACTATCTCTAGCAGGG la Leu 352 GAAAGAACTGCGGCTGA membrana/ AACAGCGGGTGCAAATA translocación CCGCTGAT defectuosa
Mutantes LF: Tyr148 a alanina GTAGAAGGTACCGAAAA I Defectuoso GGCACTGAACGTTGCTT en unión al AT antígeno protector
Tyr149 a alanina GTAGAAGGTACCGAAAA Defectuoso GGCACTGAACGTTTATG en unión al CTGAA antígeno protector
Ile151 a alanina GTAGAAGGTACCGAAAA I Defectuoso GGCACTGAACGTTTATG en unión al AAGCAGGT antígeno protector
Lys153 a alanina GTACAAGGTACCGAAAA I Defectuoso GCCACTGAACGTTTATGA en unión al AATAGGTGCAATA antígeno protector
Asp 187 a alanina TGTG GG ATGTTCCTTAAG I Defectuoso CTGATTAGTAAATAAAAG en unión al AGCTTGT TCATCTGA antígeno protector
Mutantes LF: Phe 190 a alanina TGTGGGATGTTCCTTAAG I Defectuoso CTGATTAGTAGCTAAAAG en unión al ATCTTG antígeno protector
Asp 87, a alanina TGTGGGATGTTCCTTAAG I Defectuoso Leu 88, CTGATTAGTAGCTGCAG en unión al Leu189, CAGCTTGT TCATCTGA antígeno Phe190 protector
Mutantes EF: Tyr137 a alanina CCTTACTTATGATATCAA Defectuoso en unión GAGAAATCCCC TTT CC al antígeno protector AAT TTC AGC ATA TAC TTC TTT ACT TTG TTC AC Tyr138 a alanina CCTTACTTATGATATCAA Defectuoso en unión GAGAAATCCCC TTT CC al antígeno protector AAT TTC ATA AGCTAC TTC TTT ACT TTG TTC AC Ile140 a alanina CCTTACTTATGATATCAA Defectuoso en unión GAGAAATCCCCTTTCCA al antígeno protector GCTTC ATA ATATACTTCTTTACTTTG TTC AC Lys 142 a alanina CCTTACTTATGATATCAA Defectuoso en unión GAGAAATCCCC GCT CC al antígeno protector AAT TTC ATA ATATAC TTC I I I ACT TTG TTC AC
CUADRO 2
Características de mutantes
CUADRO 3
Claims (1)
- NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Una construcción de ADN recombinante que comprende: un vector de expresión, y un fragmento de ADN que incluye genes para el antígeno protector de tipo silvestre (PA) o el factor letal de tipo silvestre (LF) o el factor de edema de tipo silvestre (EF) 2 - Una construcción de ADN recombinante que comprende: un vector de expresión, y un fragmento de ADN que incluye genes para el antígeno protector de tipo muíante (PA) o el factor letal de tipo muíante (LF) o el factor de edema de tipo mutaníe (EF) 3. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque donde dicho vector es un vector procarionte. 4. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 3, caractenzada además porque dicho vector procarionte es PQE30. 5. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicho vector de expresión contiene el promotor T5 y la marca de 6X histidinas. 6. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen antígeno protector con sustitución de alanina el residuo Phe202. 7. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Leu203. 8. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Pro205. 9.- La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Ile207. 10. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en los Pro205, Trp226 y Phe236. 1 1. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe552. 12. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Ile574. 13. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe552 y Phe554. 14. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Ile562 y Ile574. 15. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Leu566 y Ile574. 16.- La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe552 y Phe554, Ile562, Leu566 e Ile574. 17. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Phe427. 18. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con deleción del residuo Asp425. 19. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con deleción del residuo Phe427. 20. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Trp346. 21 . - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Leu352. 22. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el antígeno protector con sustitución de alanina en el residuo Trp346, Met350 y Leu352. 23. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Tyr 48. 24. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Tyr149. 25. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Ile151. 26. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Lys153. 27. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Asp187. 28. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Phe190. 29. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor letal con sustitución de alanina en el residuo Asp187, Leu188, Leu189 y Phe190. 30. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Tyr137. 31 . - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Tyr138. 32. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Ile140. 33. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho fragmento de ADN es el gen para el factor de edema con sustitución de alanina en el residuo Lys142. 34. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque la proteína codificada por dicho fragmento de ADN se expresa en un hospedero procarionte. 35. - La construcción de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque dicho hospedero procarionte es una cepa de E. coli. 36. - Una proteína expresada por un fragmento de ADN del gen es PA de tipo silvestre, LF de tipo silvestre, EF de tipo silvestre y sus variantes mutagenizadas. 37. - Un método para producir proteína toxina de ántrax mutagenizada que comprende: mutagenizar genes de PA, LF y EF utilizando diferentes iniciadores mutagénicos complementarios para la reacción de PCR; tratar a dicho producto mutante de PCR junto con el molde nativo con una enzima para escindir el molde nativo de dicho producto de PCR; transformar dicho producto muíante en la cepa de E. coli; aislar la construcción recombinante a partir de la cepa recombinante de E. coli y confirmar la mutación deseada, transformar la construcción muíante confirmada en una cepa de expresión apropiada de E. coli para expresar la proteína muíante, purificar dicha proteína muíante expresada. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicha purificación se lleva a cabo ulilizando cromaíografía de Ni-NTA y/u oirás íécnicas cromatográficas. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicha enzima es la enzima Dpnl que escinde específicamente las secuencias ATC Gme6 completameníe meíiladas. 40. - El mélodo de conformidad con la reivindicación 37, caracíerizado además porque dichos genes se clonan en el vecíor de expresión PQE que coníiene los promotores T5 y la marca de 6X hislidinas. 41. - El método de conformidad con la reivindicación 38, caracíerizado además porque las muíaciones se realizan en el primer dominio de PA en los residuos 202, 203, 205. 42. - El mélodo de conformidad con la reivindicación 37, caracíerizado además porque las muíaciones se realizaron en el tercer dominio de PA en los residuos 552, 574 552+554, 562+574, 566+574, 552+554+562+566+574 produciendo proteínas mutaníes que fueron defectuosas en la oligomerización. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque las mutaciones se realizaron en el segundo dominio de PA en los residuos 425 y 427 del asa 4 del dominio 2; éstas mutaciones deterioraron la capacidad de translocación de PA. 44. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque las mutaciones se realizaron en el segundo dominio de PA en los residuos 346, 352 y 346+350+352 en el asa 3 del dominio 2 de tal manera que PA se vuelve biológicamente inactivo 45. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque las mutaciones se realizaron en el primer dominio de LF en los residuos 148, 149, 151 , 153, 187, 190 y 87+188+189+190 deterioraron la unión de LF a PA. 46. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque las mutaciones se realizaron en los primeros 250 residuos de EF. 47. - Una vacuna de ántrax que comprende una proteína toxina de ántrax seleccionada a partir de PA de tipo silvestre o LF de tipo silvestre o EF de tipo silvestre. 48. - Una vacuna de ántrax que comprende una proteína toxina de ántrax seleccionada a partir de PA de tipo mutante o LF de tipo mutante o EF de tipo mutante o una combinación de los mismos. 49. - Una vacuna de ántrax que comprende una proteína toxina de ántrax seleccionada es una combinación de cualquiera seleccionada a partir de PA de tipo silvestre o LF de tipo silvestre o EF de tipo silvestre con cualesquiera una o más seleccionada a partir de PA de tipo muíante o LF de tipo muíante o EF de tipo muíante. 50.- Una composición farmacéuíica que comprende una caníidad efectiva de una proteína toxina de ántrax como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 46-49.
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| GB0607462D0 (en) * | 2006-04-13 | 2006-05-24 | Avecia Ltd | Assay |
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| WO2008152654A1 (en) * | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Panacea Biotec Limited | Anthrax fusion proteins, compositions and uses thereof |
| WO2008152655A1 (en) * | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Panacea Biotec Limited Limited | Anthrax fusion proteins, compositions and uses thereof |
| RU2361921C1 (ru) * | 2007-11-23 | 2009-07-20 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ |
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| RU2410699C1 (ru) * | 2009-11-13 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для обнаружения антител к протективному антигену |
| CN101798565B (zh) * | 2010-02-26 | 2013-08-07 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 能在芽孢表面展示pa20蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用 |
| WO2012171329A1 (zh) * | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Du Quan | 一种核酸分离的方法及其应用 |
| CN102516394B (zh) * | 2011-12-14 | 2014-07-09 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN105797148B (zh) * | 2016-03-30 | 2020-01-14 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种无毒炭疽活疫苗及无毒炭疽菌株 |
| CN105749265B (zh) * | 2016-03-30 | 2020-03-27 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种二价炭疽疫苗 |
| WO2021151100A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | Aim Immunotech Inc. | Methods, compositions, and vaccines for treating a virus infection |
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| RU2115433C1 (ru) | 1992-08-28 | 1998-07-20 | Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ | Вакцина сибиреязвенная комбинированная |
| GB9618107D0 (en) * | 1996-08-30 | 1996-10-09 | Secr Defence | Vaccine production |
| WO2000002523A2 (en) * | 1998-07-10 | 2000-01-20 | U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Department Of The Army | Vaccine against staphylococcus intoxication |
| FR2798291B1 (fr) * | 1999-09-10 | 2005-01-14 | Pasteur Institut | Compositions acellulaires immunogenes et compositions acellulaires vaccinales contre bacillus anthracis |
| EP1244687A4 (en) * | 1999-12-22 | 2005-06-15 | Univ Ohio State Res Found | METHODS OF PROTECTION AGAINST LETHAL INFECTION BY BACILLUS ANTHRACIS / i |
| PL365453A1 (en) | 2000-05-04 | 2005-01-10 | President And Fellows Of Harvard College | Compounds and methods for the treatment and prevention of bacterial infection |
| US20040166120A1 (en) * | 2001-06-08 | 2004-08-26 | Thomas Lawrence J. | Vaccination against anthrax |
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