RU2361921C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2361921C1 RU2361921C1 RU2007143248/13A RU2007143248A RU2361921C1 RU 2361921 C1 RU2361921 C1 RU 2361921C1 RU 2007143248/13 A RU2007143248/13 A RU 2007143248/13A RU 2007143248 A RU2007143248 A RU 2007143248A RU 2361921 C1 RU2361921 C1 RU 2361921C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- anthrax
- recombinant
- lethal factor
- escherichia coli
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 title claims abstract description 46
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 title claims abstract description 45
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 24
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 7
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 title abstract 4
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 title 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 title 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 9
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 9
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 abstract description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 abstract 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150077375 LF gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WONRDHPFOHAWOG-UHFFFAOYSA-N 2-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C(Cl)C=CC2=C1 WONRDHPFOHAWOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000953488 Homo sapiens Inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol-pentakisphosphate kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037736 Inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol-pentakisphosphate kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical group [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 208000022338 anthrax infection Diseases 0.000 description 1
- 229960005447 anthrax vaccines Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- -1 β-cyanethyl-diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Способ предназначен для получения функционально активной формы LF, основного токсического белка, определяющего клеточные нарушения, приводящие к гибели организма при заражении бактерией сибирской язвы. Для осуществления способа сконструирована рекомбинантная плазмида pETHIS-LF (7816 п.н.), содержащая полноразмерный ген летального фактора (LF) сибирской язвы под контролем промотора бактериофага Т7 и детерминанту устойчивости к ампициллину. Плазмида обеспечивает эффективный синтез белка LF сибирской язвы, слитого с последовательностью шести гистидинов для очистки металл-хелатной хроматографией. Сконструирован штамм Escherichia coli BL-HISLF путем трансформации указанной плазмидной ДНК в штамм Е.coli BL21(DE3), синтезирующий активный белок LF. Целевой продукт выделяют способом, включающим очистку на металл-хелатном сорбенте с последующей дополнительной очисткой белка LF гель-фильтрацией. Изобретение позволяет получить активный рекомбинантный белок LF по упрощенной технологии и с высоким выходом синтезируемого белка летального фактора - не менее 10 мг на 1 г сырой биомассы без ферментации. 3 н.п. ф-лы, 3 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области генной инженерии, касается способа получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы LF, рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТНIS-LF, кодирующей активный белок летального фактора сибирской язвы LF, и штамма бактерий Escherichia coli, продуцирующего активный белок летального фактора сибирской язвы.
Летальный фактор сибирской язвы (LF), наряду с протективным антигеном (РА), представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инвазии. Основными областями применения активного белка LF являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств, в частности разработка диагностических китов для раннего определения и фармацевтических препаратов для терапии сибиреязвенной инфекции и вакцинации против сибирской язвы. Это может иметь важное значение как для борьбы с локальными вспышками заболевания, так и для быстрой нейтрализации последствий возможных биотеррористических актов с использованием бактерий или спор бактерий сибирской язвы.
Сибирская язва - это инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами грамположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютамовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn2+-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства киназ митогенакивируемых протеин киназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры.
Летальный фактор сибирской язвы является белком с молекулярной массой 90 кДа, структурно составленным из четырех доменов с преимущественно спиральной структурой. Домен 1 состоит из 12 спиральных участков, уравновешивающих четырехцепочечный слой. Этот домен связывается с протективным антигеном. Домен 2 сходен со вторым доменом токсина VIP2 Bacillus cereus, однако не обладает его каталитическими радикалами. Внутри последовательности домена 2 находится последовательность домена 3. Этот домен составлен из повторов, которые возникли в результате дупликапии последовательности, изначально принадлежавшей домену 2. Домен 4 - это каталитически активная протеаза. Бета-слой и шесть альфа-спиралей формируют структуру, сходную с той, которая существует у другой металлопротеазы, термолизина. Связывание субстратного белка семейства МАРКК происходит в углублении между доменами 3 и 4. Активный центр фермента составлен аминокислотным радикалом Glu687 за молекулой воды и атомом цинка, связанным с радикалами His686, His690, Туr728 и Glu735 (Pannifer AD, Wong TY, Schwarzenbacher R, Renatus M, Petosa C, Bienkowska J, Lacy DB, Collier RJ, Park S, Leppla SH, Hanna P, Liddington RC. (2001) Nature, 414, 229-233).
Известен способ выделения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы (Gupta P, Batra S, Chopra АР, Singh Y, Bhatnagar R. (1998) Infect Immun, 66(2), 862-865), в котором используют экспрессионную конструкцию на основе плазмиды pQE30, проэкспрессированную в штамме Е.coli SG 13009. Недостатком продукции белка с использованием этой конструкции является то, что более 40% белка находится в деградированном состоянии (видимо, в силу расщепления протеазами E.coli), что, безусловно, снижает выход белка при использовании данной конструкции. Большая исходная степень деградации белка приводит к тому, что требуется три стадии очистки белка для получения гомогенного продукта. В используемой экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.
Известен наиболее близкий к заявленному генно-инженерный способ получения мутантного белка LF с использованием конструкции на основе рЕТ30 под контролем промотора фага Т5 в экспрессионных штаммах E.coli (патент РФ №2287581, опубл. 20.11.2006). Полученный таким образом белок и его мутанты используют для разработки вакцин против сибирской язвы. Однако известно, что рекомбинантный белок LF, синтезируемый с применением использованной конструкции имеет до 40% деградации. В запатентованной экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.
Изобретение решает задачу создания продуцента и получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы с высоким выходом, низкой степенью деградации, легко детектируемого и по упрощенной технологии с использованием двух стадий хроматографической очистки вместо трех.
Поставленная задача решается за счет рекомбинантной плазмидной ДНК pETHIS-LF, обеспечивающей синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющей молекулярную массу 5,15 МДа, состоящей из BamHI-NdeI фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+); синтетической последовательности, кодирующей шесть гистидинов и пептид c-myc, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность полноразмерного летального фактора сибирской язвы, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pETHIS-LF клеток Escherichia coli к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: XhoII 657 пн, StuI 1572 пн, XhoI 1625 пн, BcoI 1625 пн.
Также за счет штамма Escherichia coli BL-LFHIS, продуцирующего гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, слитый с последовательностью шести гистидинов и пептидом с-myc.
А также за счет способа получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающего трансформацию клеток Escherichia coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона Х-100 в буферном растворе рН 7.4, содержащем протеазный ингибитор с последующей очисткой целевого продукта металл-хелатной хроматографией и гель-фильтрацией.
Техническим результатом изобретения является получение в очищенном виде и с высоким выходом (до 95% чистоты, до 100 мг с литра бактериальной культуры без ферментации) гомогенного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы по упрощенной технологии, предусматривающей две стадии хроматографии вместо трех.
Для повышения уровня продукции и снижения степени деградации белка LF в качестве базовой конструкции применяют плазмиду с промотором Т7 полимеразы, содержащую в своем составе последовательность, соответствующую пептиду с-myc для детекции продукта, и последовательность шести гистидинов для эффективной очистки синтезируемого белка. Для получения базовой векторной конструкции pETNHIS в плазмиду pET22b(+) (Novagen), не содержащую сайта BglII (последовательность сайта рестрикции нарушают обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции BglII с последующей достройкой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием достроенных концов) по сайтам рестрикции NdeI и BamHI вводят фрагмент ДНК, синтезированный полимеразной цепной реакцией, кодирующий последовательность шести гистидинов и пептид с-myc.
В полученную описанным способом плазмиду pETNHIS по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI клонируют полноразмерный ген летального фактора сибирской язвы, расщепленный по внесенным при амплификации фрагмента в составе праймеров концевым сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI (это возможно, поскольку при щеплении рестриктазы XhoI и SalI образуют совместимые липкие концы).
Полученную экспрессионную конструкцию pETHIS-LF трансформируют в штамм E.coli BL21(DE3) и экспрессируют в среде 2xYT. Выход рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы высокой степени чистоты (97%) после двух стадий хроматографической очистки достигает 15% относительно суммарного белка клетки.
Полученный продукт детектируют специфическими антителами к пептиду с-myc.
В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BLHIS-LF, содержащий плазмидную ДНК pETHIS-LF и являющийся суперпродуцентом рекомбинантного белка LF.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pETHIS-LF обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в них гена летального фактора сибирской язвы.
Ген летального фактора сибирской язвы получен полимеразной цепной реакцией с ДНК бактерии сибирской язвы в Государственном Научном Центре Прикладной микробиологии (ФГУН ГНЦПМБ).
Концевые участки гена, содержащие соответствующие применному вектору сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI, введены с помощью полимеразной цепной реакции с синтетическими олигонуклеотидными праймерами LFBamHI, LFSalI (фиг.1), а затем ген клонирован в векторной плазмиде pETNHIS.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL-HISLF характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, неспороносные, грамотрицательные.
Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на простых питательных средах. При выращивании на агаре образуют круглые, мутные желто-серые колонии со слегка неровным краем, диаметром до 3 мм. При росте на жидких средах (LB, 2xYT) образуют интенсивную муть.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме 37°С и оптимальных значениях рН от 7 до 7.5. В качестве источника углерода используют аминокислоты, углеводы, глицерин. В качестве источника азота могут использовать как органические соединения (аминокислоты, дрожжевой экстракт, триптон и др.), так и неорганические минеральные соли в аммонийной форме.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда (до 100 мкг/мл).
Штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток E.coli соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.
Штамм BL-HISLF является суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-галактозидом происходит эффективный синтез целевого белка LF, который накапливается в цитоплазме клеток в растворимом состоянии и составляет до 50% суммарного белка клетки.
Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pETHIS-LF, содержащую последовательность полноразмерного гена летального фактора сибирской язвы. Для этого полноразмерный ген летального фактора сибирской язвы получают полимеразной цепной реакцией с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (фиг.1). Праймеры содержат сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI (N-конец гена, праймер LFBamHI) и SalI (С-конец гена, праймер LFXhoI), полученную ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами рестрикции и затем лигируют с расщепленной по сайтам BamHI и XhoI векторной плазмидной ДНК pETNHIS. На фиг.2 представлена последовательность гена полноразмерного летального фактора сибирской язвы. На фиг.3 изображена последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETHIS-LF.
Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli DH12S или другие клетки, не содержащие DE3 лизогена и собственной устойчивости к антибиотикам пенициллинового ряда, и высевают на 2xYT-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют на наличие плазмиды, содержащей ген LF полимеразной цепной реакцией с праймеров LFBamHI и LFSalI. Из клонов, ПЦР которых приводит к образованию фрагмента нужной длины при анализе продуктов реакции агарозным гель-электрофорезом, выделяют плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Встраивание фрагмента подтверждают секвенированием плазмидной ДНК. Полученную рекомбинантную плазмидную ДНК трансформируют в компетентные клетки штамма E.coli BL21(DE3), полученные клоны анализируют на уровень экспрессии целевого белка и отбирают штамм-продуцент.
Штамм-продуцент E.coli BL-LFHIS выращивают на богатой среде (2×YT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С.
Клетки из экспрессионной культуры собирают центрифугированием при 5000 об/мин и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при 4°С в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCL рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl2 до концентрации 5 мМ и разрушают ДНК ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку. Первая стадия хроматографической очистки проводится на металл-хелатном сорбенте. Вторая стадия очистки осуществляется на гель-фильтрационной колонке в буфере, содержащем 30 мМ трис-НСl рН 7.4 и 70 мМ NaCl. Фракции, содержащие очищенный LF, определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и замораживают для хранения на -70°С.
Детекцию продукта осуществляют с помощью иммуноблота с антителами, специфичными к пептиду с-myc.
Активность полученного рекомбинантного летального фактора сибирской язвы измеряют с использованием специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы и содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия) по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре. Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С.
Изобретение иллюстрируют графические материалы:
фиг.1 - праймеры для амплификации гена летального фактора сибирской язвы;
фиг.2 - последовательность гена полноразмерного летального фактора сибирской язвы и его фрагмента без домена I;
фиг.3 - последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETHIS-LF.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pETNHIS-LF
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3' к 5' концу с помощью защищенных фосфамидитов (5'диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-О-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов), активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0.5-0.7 мкМ, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкМ/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК 3 мкг плазмиды pETNHIS обрабатывают в 20 мкл буфера для BamHI (фирма New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы рестрикции BamHI, а затем в 20 мкл буфера 2 (New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы XhoI (фирма New England Biolabs). Рестрикция проводится 1 час при 37°С. Векторный фрагмент длиной 6,09 т.п.о. после электрофореза в агарозном геле помещают в диализный мешочек с максмальной пропускной способностью пор 12-14 кДа и элюируют под действием тока в трис-боратном буфере для электрофореза, а затем обрабатывают смесью фенол-хлороформ (1:1) и осаждают ДНК из раствора этанолом.
Для приготовления фрагмента гена LF проводят ПЦР-амплификацию, используя в качестве матрицы бактериальную ДНК сибирской язвы 0.05 мкг в образце, а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А и В (по 20 рМ каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0.5 мМ и 1 ед. активности Pfu-полимеразы (фирма Promega). ПЦР проводят в режиме, предусматривающем 1 минуту денатурации при 95°С, отжиг 30 секунд при 57°С, элонгацию - 40 секунд при 72°С, 25 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют смесью фенол-хлороформ (1:2) и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл воды и расщепляют эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI (реакция с эндонуклеазой рестрикции SalI производства Fermentas проводится в буфере О Fermentas). Целевой фрагмент выделяют элюцией из агарозного геля.
0,5 мкг полученного синтетического фрагмента гена рекомбинантного летального фактора сибирской язвы прибавляют к раствору 0,2 мкг описанного выше векторного фрагмента и лигируют в 10 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7.6, 10 мМ MgCl2, 0.2 мМ АТР, 10 мМ дитиотрейтита и 10 ед. активности Т4-ДНК лигазы в течение 4 часов при 16°С.
Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации электропорацией (прибор ВТХ 600, режим 129 Ом, 2,5 кB) электрокомпетентных клеток E.coli DH12S. Трансформанты высевают на чашки с 2xYТ-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью ПЦР-амплификации в тех же условиях, что и получение фрагмента ДНК для клонирования, используя в качестве матрицы клетки единичной бактериальной колонии, содержащей плазмиду. Положительные клоны идентифицируются по наличию фрагмента длиной 2340 пн при анализе ПЦР-смеси электрофорезом в агарозном геле. Из отобранных клонов выделяют ДНК плазмиды pETNHIS-LF, используя метод щелочного лизиса.
Пример 2
Получение штамма-продуцента E.coli BL-LFHIS и определение его продуктивности
Штамм-продуцент E.coli BL-LFHIS получают трансформацией электрокомпетентных клеток E.coli BL21(DE3) плазмидой pETHIS-LF, как описано в примере 1. Единичные клоны BL21(DE3), несущие плазмиду pETHIS-LF, экспрессируют в аналитическом количестве (по 5 мл). Для этого E.coli BL-LFHIS выращивают на богатой среде (2xYT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С. Анализируют уровень экспрессии белка летального фактора сибирской язвы денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и иммуноблотом с антителами против пептида с-myc. Для проведения электрофореза равные аликвоты клеток разных клонов центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, обрабатывают 20 секунд ультразвуком, нагревают 3 минуты при 100°С и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Для постановки иммуноблота мембрану Hybond С+ и гель на 10 минут замачивают в буфере, содержащем 38.6 мМ глицина, 47.9 мМ трис-основание, 0,0385% додецилсульфата натрия, 20% метанола. Перенос ведут при силе тока 1 мА на см геля. Блокировка мембраны после переноса осуществляется 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS рН 7,4, содержащим 0.05% Tween. Блокированная мембрана инкубируется с антителами с-myc (клон CRL-1725, АТСС) при комнатной температуре в течение 2 часов в растворе PBS, содержащем 0.5% БСА, и после отмывки первичного антитела смесью PBS-0.05% Tween 20 мембрана инкубируется ночь с пероксидазным коньюгатом антитела к мышиным антителам. Отмытый блот проявляют с использованием субстрата пероксидазы хлоронафтола. Клоны, дающие наибольший выход белка, являются суперпродуцентами, их выращивают на богатой среде (2xYT) в течение ночи, добавляют глицерин до 15% и замораживают на -70°С для хранения.
Для препаративной экспрессии штаммы суперпродуцента E.coli BL-LFHIS выращивают в течение ночи при 37°С с добавлением 2% глюкозы, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина в течение, и выращивают при 37°С до оптической плотности 1 ОЕ. Выросшую культуру охлаждают до 25°С, добавляют ИПТГ до 1 мМ и проводят экспрессию 6 часов при 25°С. Далее клетки собрают центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и хранят в виде замороженных осадков при температуре -70°С.
Пример 3
Очистка белка летального фактора, полученного с использованием конструкции pETHIS-LF, и определение его активности
Клетки из экспрессионной культуры суспендируют в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCL рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при +4°С в течение 30 минут. Лизируют клетки добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl2 до концентрации 1 мМ и разрушают геномную ДНК E.coli ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку с металл-хелатным сорбентом с иммобилизованным ионом кобальта (Talon, Clontech) в буфере, содержащем 20 мМ Na2HPO4 рН 8.3 и 70 мМ NaCl. Колонку промывают 10 объемами того же буфера и элюируют белок раствором, содержащим 200 мМ имидазола в том же буфере. Вторая стадия очистки осуществляется на гель-фильтрационной колонке Superdex 200 в буфере, содержащем 30 мМ трис-НСl рН 7.4 и 70 мМ NaCl. Фракции, содержащие очищенный LF, определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано в примере 2, и замораживают для хранения на -70°С. Чистота перапарата составляет 95% по данным денситометрии. Выход рекомбинантного белка летального фактора составляет 30 мг с литра культуры после полной процедуры очистки.
Протеолитическая активность полученного препарата оценивается по расщеплению специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы, содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия), по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре (Тесап). Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С. Кинетические параметры щепления субстрата полученным летальным фактором сибирской язвы составляют kcat/КM=4.15±0.7 с-1 мкМ-1.
Claims (3)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETHIS-LF, обеспечивающая синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 5,15 МДа, состоящая из: BamHI-NdeI фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+); синтетической последовательности, кодирующей шесть гистидинов и пептид с-mус, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность полноразмерного летального фактора сибирской язвы, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pETHIS-LF клеток Escherichia coli к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эвдонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: XhoII 657 пн, StuI 1572 пн, XhoI 1625 пн, BcoI 1625 пн.
2. Штамм Escherichia coli BL-LFHIS, продуцирующий гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, слитый с последовательностью шести гистидинов и пептидом с-mус.
3. Способ получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающий трансформацию клеток Escherichia coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона Х-100 в буферном растворе рН 7,4, содержащем протеазный ингибитор, с последующей очисткой целевого продукта металл-хелатной хроматографией и гель-фильтрацией.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007143248/13A RU2361921C1 (ru) | 2007-11-23 | 2007-11-23 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007143248/13A RU2361921C1 (ru) | 2007-11-23 | 2007-11-23 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007143248A RU2007143248A (ru) | 2009-05-27 |
| RU2361921C1 true RU2361921C1 (ru) | 2009-07-20 |
Family
ID=41022898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007143248/13A RU2361921C1 (ru) | 2007-11-23 | 2007-11-23 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2361921C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6267966B1 (en) * | 1996-08-30 | 2001-07-31 | The Secretary Of State For Defence | Vaccine production of the Bacillus anthracis protective antigen |
| WO2001045639A3 (en) * | 1999-12-22 | 2002-01-10 | Univ Ohio State Res Found | Methods for protecting against lethal infection with bacillus anthracis |
| RU2180917C1 (ru) * | 2001-05-21 | 2002-03-27 | Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" | Штамм bacillus anthracis km90 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов |
| RU2287581C2 (ru) * | 2001-12-05 | 2006-11-20 | Ракеш БХАТНАГАР | Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины |
-
2007
- 2007-11-23 RU RU2007143248/13A patent/RU2361921C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6267966B1 (en) * | 1996-08-30 | 2001-07-31 | The Secretary Of State For Defence | Vaccine production of the Bacillus anthracis protective antigen |
| WO2001045639A3 (en) * | 1999-12-22 | 2002-01-10 | Univ Ohio State Res Found | Methods for protecting against lethal infection with bacillus anthracis |
| RU2180917C1 (ru) * | 2001-05-21 | 2002-03-27 | Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" | Штамм bacillus anthracis km90 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов |
| RU2287581C2 (ru) * | 2001-12-05 | 2006-11-20 | Ракеш БХАТНАГАР | Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007143248A (ru) | 2009-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abajy et al. | A type IV-secretion-like system is required for conjugative DNA transport of broad-host-range plasmid pIP501 in gram-positive bacteria | |
| JP5693848B2 (ja) | グラム陽性菌の増菌、分離、および検出のための方法および手段 | |
| Nugroho et al. | Characterization of a new sigma-K-dependent peptidoglycan hydrolase gene that plays a role in Bacillus subtilis mother cell lysis | |
| CN109825484B (zh) | 玉米赤霉烯酮水解酶zhd101突变体及利用该突变体水解玉米赤霉烯酮的方法 | |
| Schmelcher et al. | Staphylococcus haemolyticus prophage ΦSH2 endolysin relies on cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases activity for lysis ‘from without’ | |
| Van Staden et al. | Functional expression of GFP-fused class I lanthipeptides in Escherichia coli | |
| Maseko et al. | Purification and characterization of naturally occurring HIV-1 (South African subtype C) protease mutants from inclusion bodies | |
| US8241901B2 (en) | Method of secretory expression of lysostaphin in Escherichia coli at high level | |
| JP2008509682A (ja) | Ｙｅｂｆを利用するタンパク質の製造方法 | |
| Chen et al. | Construction of recombinant Escherichia coli for over-production of soluble heparinase I by fusion to maltose-binding protein | |
| CN106834252B (zh) | 一种高稳定型MazF突变体及其应用 | |
| RU2361921C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETHIS-LF, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL-HISLF, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ | |
| RU2355769C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (LF), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pETGST-LFmin, КОДИРУЮЩАЯ АКТИВНЫЙ БЕЛОК LF, И ШТАММ Escherichia coli BL-GSTLFmin, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ АКТИВНЫЙ БЕЛОК ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ | |
| JP2002503106A (ja) | 細菌フェロモンおよびその使用 | |
| Richet et al. | Two domains of MalT, the activator of the Escherichia coli maltose regulon, bear determinants essential for anti-activation by MalK | |
| US6696268B1 (en) | Production and use of antimicrobial agents | |
| JP5013375B2 (ja) | メッセンジャーｒｎａ干渉酵素が促進する生細胞における単一タンパク質産生 | |
| RU2416637C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPHOFus, КОДИРУЮЩАЯ СУБСТРАТ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, СЛИТЫЙ СО ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ Escherichia coli, И ШТАММ Escherichia coli BL-PHOFus, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ БЕЛОК - СУБСТРАТ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В СОСТАВЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli | |
| RU2156299C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая полную последовательность стафилокиназы, штамм escherichia coli sa 9325 - продуцент рекомбинантного белка | |
| RU2558295C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGST/ART/X, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТНЫЙ ХИМЕРНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST/ART/X ДЛЯ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ АПТАМЕРОВ К БЕЛКУ-МИШЕНИ X В СОСТАВЕ ПОЛИПЕПТИДА | |
| CN110592046A (zh) | 玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用 | |
| RU2347811C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET-KSI-Buf2, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД БУФОРИН-2, ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА БУФОРИНА-2 | |
| KR100408634B1 (ko) | 결핵균 알엠엘씨 단백질의 대량 제조방법 및 이에 의하여정제된 알엠엘씨 단백질 | |
| RU2728652C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-SAV, обеспечивающая синтез полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент растворимого полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii | |
| WO2018166237A1 (zh) | (s)-羰基还原酶异源聚合体及其在催化多苯环化合物的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20100416 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171124 |