PROTEÍNA DE FUSIÓN QUE TIENE MEJORADA ACTIVIDAD IN VIVO DE ERITROPOYETINA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una proteina de fusión que tiene mejorada actividad in vivo de eritropoyetina (EPO, posteriormente) que es una nueva medicina para el tratamiento de la anemia. . Específicamente, la presente invención se refiere a una proteina de fusión que tiene vida media y actividad in vivo altamente mejorada de eritropoyetina por fusión de la molécula EPO con un cierto péptido que tiene actividad de extensión de la vida media y se deriva a partir del cuerpo humano. EPO/ un glicoproteina que tiene el peso molecular de 30,000 a 34,000, es un factor que estimula la producción y diferenciación de los glóbulos rojos. Esta proteina actúa enlazándose a receptores sobre las células precursoras de eritrocito que resulta en el aumento de la concentración de ion calcio en una célula, aumento de la biosintesis de ADN, y estimulación de la formación de hemoglobina y similares. Esta EPO puede usarse para el tratamiento de la anemia a partir de insuficiencia renal, anemia de un bebé prematuro, anemia a partir de hipotiroidismo, anemia a partir de desnutrición, etc. El uso clínico de EPO humano recombinante está en aumento. Sin embargo, tal uso puede ocasionar alguna inconveniencia y altos costos debido a que debe administrarse en promedio tres veces a la semana debido a su vida media corta. Asi, si la actividad in vivo de EPO se mantiene durante un largo tiempo, la frecuencia de administración de EPO puede disminuirse en gran medida. La eficacia de EPO es proporcional a la vida media in vivo de la misma. Se conoce que la vida media in vivo de EPO se correlaciona con el contenido de ácido siálico que se ubica en el término de las cadenas de carbohidratos de EPO. Por lo tanto, la eficacia de EPO es altamente dependiente de la presencia de cadenas y carbohidratos. Puesto que la forma de los carbohidratos aparecen diferentemente dependiendo del tipo de células en donde EPO se expresa, las mismas glicoproteinas pueden tener diferente estructura de carbohidratos si se expresan en células diferentes. Aunque se ha demostrado recientemente que algunas bacterias pueden unir las cadenas de carbohidratos, las bacterias típicas, por ejemplo E. coli, se sabe que no lo hace. Las proteínas expresadas en E. coli no contienen las cadenas de carbohidratos, y así, EPO derivada de E. coli que no contiene las cadenas de carbohidratos, presenta actividad in vitro positiva pero no actividad in vivo. Se debe a que EPO deglicosilada se elimina rápidamente a partir del cuerpo humano y tiene vida media extremadamente corta. En conclusión, las cadenas de carbohidratos juegan un papel muy importante en la actividad de EPO.
Se han hecho muchos estudios para mejorar la actividad de EPO. La propuesta principal son sustituciones de algunos aminoácidos de EPO por mutagenesis en el gen de EPO. Por ejemplo, PCT/US94/09257, presentada por Amgen y titulada "Análogos de eritropoyetina", describe un método para aumentar la vida media in vivo de EPO aumentando el contenido de carbohidratos a través de mutagénesis. También, se hizo un intento para aumentar la vida media in vivo de EPO por la formación del dimero EPO. Véase, A. J. Sytkowski et al., J.B.C. vol. 274, No. 35, pp24773-24778. Además, otro método conocido es mejorar la actividad in vivo de EPO fusionando nuevos aminoácidos, péptidos, o fragmentos de proteina con la molécula de EPO en la forma de ingenieria genética y aumentando el contenido de carbohidratos, es decir, su contenido de ácido siálico de EPO. Sin embargo, no todos los aminoácidos, péptidos, o fragmentos de proteína heterogéneos pueden usarse para este propósito. En la mayoría de los casos, tales modificaciones pueden resultar en la disminución o pérdida de actividad inherente de la proteína y puede ocasionar un problema de antigenicidad cuando se usa in vivo. Aunque no se refiere a EPO, las proteínas de fusión o proteínas quiméricas, se han estudiado, por ejemplo, para la hormona que estimula el folículo, que es un tipo de hormona sexual. Véase, Furuhashi et al., 1995, Mol. Endocxinol . Sin embargo, los métodos no se han aplicado a la industria puesto que las modificaciones de proteina que usan un método de ingeniería genética tienen muchos riesgos. Esto es, en la mayoría de los casos, la proteína objetivo no puede obtenerse fácilmente sin habilidades profesionales, y por el contrario, la actividad inherente de la proteína puede disminuirse o puede perderse por la adición o sustitución de nuevos aminoácidos. Se han estudiado extensamente nuevos métodos para mejorar la actividad in vivo de EPO fusionando nuevos aminoácidos, péptidos, o fragmentos de proteina con la molécula de EPO, y aumentando así el contenido de carbohidratos de la misma. Como resultado, se ha descubierto que una proteína de fusión de EPO obtenido fusionando un péptido de término carboxi (CTP, posteriormente) de trombopoyetina (TPO, posteriormente) , una proteína que ya existe en el cuerpo humano, con el término carboxi de EPO tienen altamente mejorada vida media in vivo debido a una porción de aminoácidos que aumentan el sitio de glicosilación sin pérdida de la actividad inherente de EPO, y no ocasiona ninguna antigenicidad cuando se aplica al cuerpo humano. Entonces, se han completado la presente invención. Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de fusión que tiene mejorada actividad in vivo de EPO humano y que contiene CTP de TPO fusionada con EPO humano en el término carboxi de la misma.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un ácido nucleico que codifica la proteina de fusión, un vector recombinante que contiene el ácido nucleico, y una linea de células huésped transformada con el vector recombinante. Objeto adicional de la presente invención es proporcionar un proceso para la preparación de la proteina de fusión que tiene mejorada actividad in vivo de EPO humano cultivando la linea de células transformada. Primero, la presente invención se refiere a una proteina de fusión que tiene mejorada actividad in vivo de EPO humano y que contiene CTP de TPO fusionadas con EPO humano en el término carboxi de la misma. El CTP comprende preferiblemente la secuencia de aminoácido de la SEC. DE IDENT. NO. 1 que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 176 a 353 (LTP, posteriormente) o partes de la misma, particularmente la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. 2 que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 337 a 353 (STP, posteriormente) . Particularmente, la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO. 3 ó 4. Segundo, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión, un vector recombinante que contiene el ácido nucleico, y una línea de células huésped, preferentemente la célula CHO (ovario de hámster chino), transformada con el vector recombinante. Tercero/ la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de la proteina de fusión que tiene mejorada actividad in vivo de EPO humano cultivando la linea de células transformada. Posteriormente, la presente invención se explicará en mayor detalle. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras la y Ib muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los péptidos de término carboxi (LTP, STP) de TPO; las Figuras 2aa y 2ab muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ELTP que es una proteina de fusión de EPO y el péptido LTP, y la Figura 2b muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácido de ESTP que es una proteina de fusión de EPO y el péptido STP; las Figuras 3a y 3b son esquemas que muestran los procedimientos para preparar los vectores de expresión, pcDNA-ESTP y pcDNA-ELTP; la Figura 4 es una fotografía de electroforesis de ELTP y ESTP expresado; y la Figura 5 es una gráfica que muestra los resultados de farmacocinética de EPO, ELTP, y ESTP. La presente invención comprende los pasos de preparación y clonación de un gen de la proteina de fusión deseada, la construcción de un vector de expresión que contiene el gen deseado, la transformación de una célula animal, expresión, purificación, y prueba biológica. (1) preparación del gen Puede obtenerse ADNc de EPO realizando la técnica de PCR convencional (PCR PreMix Kit of Bioneer Co.) usando t los cebadores complementarios de los términos de ADNc de EPO (EP1 y EP2) a partir de la biblioteca ADNc de higado fetal deri ado de humano (Invitrogen Co . ) . El ADNc de TPO puede obtenerse usando los cebadores complementarios de los términos de ADNc de TPO (TI y T2) de acuerdo con la misma forma. EP1: ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG (SEC. DE IDENT. NO. 5) EP2: GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT (SEC. DE IDENT. NO.6) TI: ATGGATCTGACTGAATTGCTCCTC (SEC. DE IDENT. NO.7) T2: TTACCCTTCCTGAGACAGATTCTGGGA (SEC. DE IDENT. NO.8) El ADNc de EPO y el ADNc de TPO obtenidos por PCR se clonan con pGEM-T (Promega Co) , un vector de clonación, respectivamente. El pGEM-EPO y pGEM-TPO se llevaron a secuencia después, y se usan como una plantilla para los siguientes procedimientos. LTP, un gen de CTP de TPO usado en la presente invención, puede obtenerse realizando PCR usando pGEM-TPO como una plantilla y los cebadores ELI y T2.
EL1: GAGGCCTGCAGGACAGGGGACGCCCCACCCACCACAGCTGTCC (SEC. DE IDENT. NO. 9) El cebador ELI contiene un t gen ampliado a la posición de la enzima de restricción Stul que se ubica cerca del término 3' de EPO, y una parte del término 5' del gen LTP (aminoácidos de las posiciones 176 a 353 de TPO) al mismo tiempo. Por otro lado, se realiza PC usando pGEM-EPO como una plantilla y los cebadores EPl y EP2 para dar el gen EPO solamente. Los genes EPO y LTP así obtenidos se tratan con la enzima de restricción Stul, respectivamente. Después, los fragmentos de los genes EPO y LTP se ligan y el producto de ligadura se usa como una plantilla en el procedimiento PCR usando los cebadores EP11 y L2 para dar un fragmento de gen ELTP que tiene aproximadamente 1113 bps. EP11: TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT (SEC. DE IDEMT. NO. 10) L2: TGGATTCTTACCCTTCCTGAGACAGATTC (SEC. DE IDENT. NO. 11) Este gen se clona a un vector de clonación de pGEM-T y se levan a secuencia después (pGEM-ELTP, Figura 3a) . Adicionalmente, el gen STP usado en la presente invención puede obtenerse por el procedimiento PCR de sintesis de autocebado. Los fragmentos del gen sintetizados son los siguientes ESI, S2, S3 y el anterior L2. ES1: AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACCCTCTTCTAA (SEC. DE IDENT. NO. 12) S2: GTGGGTGTAGGATGTGTTTAGAAGAGG (SEC. DE IDENT. NO. 13) S3: TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTC (SEC. DE IDENT. NO. 14) Se toman 1 D(50 pmol/D) de cada 4 fragmentos de gen y se realiza PCR usando el sistema de Taq de alta fidelidad de BM Co. El fragmento del gen de aproximadamente 50 bps (gen STP) se identifica en gel de agarosa al 1%. Este gen codifica los 17 aminoácidos (aminoácidos de las posiciones 337 a 353) del término carboxi de TPO (Figura 1) . Se realiza PCR usando pGEM-EPO como una plantilla y los cebadores EP11 y EP2 para dar el gen EPO solamente. Este gen EPO y el gen STP se usan como plantillas al mismo tiempo y los cebadores EP11 y L2 se usan en una PCR que usa el sistema Taq de BM Co. de alta fidelidad de para dar el gen de fusión deseado, gen ESTP, de aproximadamente 630 bps. Este gen se clona a pGEM-T, un vector de clonación, y se lleva a secuencia después (pGEM-ESTP, Figura 3b) . (2) Construcción del vector de expresión El vector pcDNA3.1 de Invitrogen Co. se usa como un vector de expresión. El vector pcDNA3.1 se trata con las enzimas de restricción HindlII y BamHI para elaborar un vector lineal, y pGEM-ELTP y pGEM-ESTP se tratan también con las mismas enzimas de restricción HindlII y BamHI, respectivamente. Los genes ELTP y ESTP y pcDNA3.1 digeridos se aislan usando el equipo de extracción Qiagen sobre gel de agarosa. Después de cada ligadura de los genes, el producto de ligadura se introduce dentro de E. coli N 522. Los plásmidos se aislan a partir de las colonias que se han formado a partir del cultivo de la E. coli transformada en la placa de LB-ampicilina durante la noche, y se tratan con las enzimas de restricción, HindlII y BamHI. Las colonias que tienen el gen ELTP o ESTP se seleccionan después por electroforesis en gel de agarosa al 1%; Estos plásmidos se designan como pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP, respectivamente (Figura 3a y 3b) . (3) Transformación de la célula de CHO y expresión Las células de CHO (DG ) se cultivan a una confluencia de 40-80% (lD4x 105 células/cajas de 60mm) en una caja de cultivo de células de 60mm. 3D del reactivo de superfección (BM Co.) y 97D de medio de cultivo de célula (a-MEM con medio, sin suero, sin antibiótico) se mezclan bien y pcDNA-ELTP (=0.lQ/D, aproximadamente 20) y el vector pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0.2D) que tiene el gen dhfr se agregan a la misma. La mezcla se hace reaccionar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente y después se agrega a las células como se prepararon anteriormente. Después de un dia, el medio se renueva con un medio que contiene G418 en una cantidad de 500D/D (a-ME sin medio, 10% de FBS) . El medio se renueva después con el medio G418 que contiene 500D/D de G418 durante 7~10 dias durante lo cual las células sin el gen de resistencia G418 y las células de control negativo se destruyen completamente. Las células seleccionadas en el medio G418 se cultivan suficientemente y una proteína ELTP expresada se identifica usando el equipo EPO ELISA de BM Co. El mismo proceso se aplica al vector de expresión ESTP y después una proteína de fusión ESTP expresada se identifica también en la misma forma. (4) Purificación de ELTP y ESTP expresados La resina de afinidad para aislamiento y purificación se prepara usando el anticuerpo monoclonal anti-EPO (R&D Co.) como sigue: Se dilatan 0.3g de Sefarosa 4B activada con CNBr durante 20 minutos en lmM de HC1, y la resina se mueve en una columna y se lava con lmM de HC1. La resina se lava con 4ml de regulador de acoplamiento (0.1M de NaHC03/ 0.5M de NaCl, pH 8.3), se mezcla inmediatamente con anticuerpo monoclonal anti-EPO (500 g/frasco) contenido en 4ml de regulador de acoplamiento y se hace reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente agitando el tubo. Renovada con regulador de bloqueo (0.2M de glicina, pH 8.0], la resina se hace reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas agitando el tubo. Después, la resina se lava con 6.5ml con regulador de acoplamiento, 6.5ml de regulador de acetato (0.1M de ácido acético, 0.5M de NaCl, pH 4), y 6.5ml de regulador de acoplamiento en ese orden. Se prepara una columna usando tal resina obtenida y la purificación se lleva a cabo como se describe posteriormente.
Las células se cultivan en un medio libre de suero durante un día, y el medio se concentra a aproximadamente 5 veces usando Centriprep (Millipore MWCO 10,000). Este concentrado se carga en una columna equilibrada anticipadamente con PBS a una velocidad de flujo de 20ml/hr, y lavada de nuevo con PBS. El regulador de elución (0.1M de glicina, pH 2.8) se aplica a la columna y el eluyente se titula inmediatamente con 1M de Tris a pH7.5. La pureza es al menos 97% cuando se analiza por SDS-PAGE y tinción de plata (Figura 4) . (5) Medición dé actividad por el método de bioensayo En la prueba de bioensayo usando células de bazo de ratón tratadas con fenilhidrazina, los ELTP y ESTP, que se expresan y purifican apropiadamente muestran mayor actividad que EPO. Demuestra que los términos carboxi fusionados en los ELTP y ESTP puede no inhibir la actividad de EPO en si misma. (§) Experimentos de farmacocinética. Se realizan experimentos farmacocinéticos en ratones para determinar los ELTP y ESTP preparados han prolongado actualmente la vida media in vivo. La sustancia candidato se administra intravenosamente a cuatro ratones en una cantidad de 20 unidades/ratón. Para identificar la concentración en la sangre en el intervalo de tiempo, se toma la sangre de los ratones a un intervalo de 30 minutos y las concentraciones se miden usando el equipo EIA de Boehringer Mannheim Co. En los experimentos farmacocinéticos con ratones, las sustancias candidato, ELTP y ESTP, muestran una vida media mucho más larga que el control EPO (Figura 5) . La presente invención se explicará más específicamente en los ejemplos siguientes. Sin embargo, debe entenderse "que los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar la presente invención pero no es para limitar el alcance de la presente invención en ninguna forma. Ejemplo 1: Preparación del gen Se obtuvo ADNc de EPO realizando la PCR convencional (Equipo de PCR PreMix de Bioneer Co.) usando los cebadores EPl y EP2 que son complementarios a los términos de ADNc de EPO, en una cantidad de 50 pmoles, respectivamente, a partir de la biblioteca ADNc de hígado fetal derivado de humano (Invitrogen Co.). El ADNc de TPO se obtuvo usando los cebadores TI y T2 complementarios con los términos de ADNc de TPO, de acuerdo con la misma forma. Se realizaron 30 ciclos totales de PCR usando el sistema Taq de alta fidelidad de BM Co. bajo la condición de 52°C durante 40 segundos para templar, 72°C durante 55 segundos, y 94°C durante 20 segundos para dar ADNc de EPO y ADNc de TPO. Se clonaron a pGEM-T (Promega Co) , un vector de clonación, respectivamente. Esto es, los productos PCR se midieron a partir de 1% de gel de agarosa y se ligaron dentro de pGEM-T el cual se introdujo después dentro de E. coli NM522. La E. coli transformada se cultivó durante la noche en placa de LB-ampicilina que contiene X-gal/IPTG. Los plásmidos se purificaron a partir de las colonias blancas y se trataron con enzimas de restricción, SacO y SacD, para seleccionar las colonias que contienen los ADNc respectivos. Los vectores obtenidos en esta etapa se designaron como pGEM-EPO y pGEM-TPO los cuales se llevaron a secuencia después y se usaron como plantillas para los siguientes procedimientos. El gen LTP, CTP de TPO usado en la presente invención se obtuvo realizando 30 ciclos totales de PC usando el sistema Taq de alta fidelidad de BM Co. y usando pGEM-TPO como una plantilla y los cebadores, ELI y T2 (50 pmoles) , bajo las condiciones de 50°C durante 40 segundos para templar, 72°C durante 45 segundos, y 94°C durante 20 segundos. El cebador ELI contiene un gen a partir de la posición de enzima de restricción Stul que se ubica cerca del término 3' de EPO, con el término 3', y una parte del término 51 del gen LTP al mismo tiempo. Se identificó un fragmento de gen de aproximadamente 534 bps en gel de agarosa al 1% (gen LTP) . Este gen codifica los 178 aminoácidos del término carboxi de TPO (aminoácidos de las posiciones 176 a 353) (Figura 1) . Por otro lado, se realizó PCR usando pGEM-EPO como una plantilla y los cebadores EP1 y EP2 para dar el gen EPO solamente. Los genes EPO y LTP obtenidos asi se trataron con la enzima de restricción Stul, respectivamente. Después, los fragmentos de los genes EPO y LTP se purificaron por el equipo de extracción Qiagen y se ligaron con una ligasa. El producto de ligadura de los genes EPO y LTP se usaron como una plantilla en 30 ciclos totales del procedimiento de PCR usando los cebadores EP11 y L2 (50 pmoles) y usando el sistema Taq de alta fidelidad de B Co. bajo la condición de 55°C durante 40 segundos para templar, 72°C durante 60 segundos, y 94°C durante 20 segundos para dar el gen de fusión deseado de ELTP que tiene aproximadamente 1113 bps. Este gen se clonó con un vector de clonación de pGEM-T en la misma forma que anteriormente se llevó a secuencia después (pGEM-ELTP, Figura 3a) . El gen de STP se obtuvo por el procedimiento PCR de sintesis de auto-cebado. Los fragmentos.de ADN sintetizados fueron ESI, S2, S3 y L2. Se tomó ID (50 pmoles/?) de cada uno de los 4 fragmentos de ADN y se realizaron 15 ciclos totales de PCR usando el sistema Taq de alta fidelidad de BM Co. bajo la condición de 55°C durante 40 segundos para templar, 72°C durante 40 segundos, y 94°C durante 20 segundos. Se identificó un fragmento de gen de aproximadamente 50 bps en gel de agarosa al 1% (gen STP) . Este gen codifica los 17 aminoácidos del término carboxi de TPO (aminoácidos de las posiciones 337 a 353) (Figura 1) . Se realizó PCR usando pGEM-EPO como una plantilla y los cebadores EPll y EP2 en la misma forma como anteriormente para dar el gen EPO solamente. Este gen EPO y el gen STP se usaron como plantillas al mismo tiempo y los cebadores EPll se usaron L2 en 30 ciclos totales de PCR usando el sistema Taq de alta fidelidad de BM Co. bajo la condición de 58°C durante 40 segundos para templar, 72°C durante 50 segundos, y 94°C durante 20 segundos para dar el gen de fusión deseado, el gen ESTP, de aproximadamente 630 bps. Este gen se clonó a pGEM-T, un vector de clonación, y se llevó a secuencia después (pGEM-ESTP, Figura 3b) . Ejemplo 2: Construcción de los vectores de expresión pcDA-ELTP y pcDNA-ESTP Se usó el vector pcDNA3.1 de Invitrogen Co. como un vector de expresión. Los genes ELTP y ESTP que se clonan al vector pGEM-T contienen sitios de reconocimiento HindlII y BamHI en los términos, respectivamente. Se trataron pcDNA3.1, pGEM-ELTP y pGEM-ESTP con las enzimas de restricción, HindlII y BamHI, respectivamente. Los genes pcDNA3.1, ELTP, y ESTP linearizados se aislaron usando el equipo de extracción Qiagen en gel de agarosa. Después de la ligadura de pcDNA3.1 con ELTP o ESTP, el producto de ligadura se introdujo dentro de E. coli NM522. Los plásmidos se aislaron a partir de las colonias que se hablan formado a partir del cultivo de la E.
coli transformada en la placa de LB-ampicilina durante la noche, y se trataron con las enzimas de restricción HindlII y BamHI. Las colonias que tienen el gen ELTP o ESTP se seleccionaron después por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Estos plásmidos se designaron como pcDNA-ELTP y pcDNA-ESTP, respectivamente (Figura 3) . Ejemplo 3: Transformación de la célula de CHO y expresión Las células de CHO (DG44) se cultivaron a una confluencia de 40~80% (1D4X103 células/caja de 60mm) en una caja o cultivo de células de 60mm. 30 de reactivo de superfección (BM Co.) y 97D de medio de cultivo de células (a-MEM con medio, sin suero, sin antibióticos) se mezclaron bien, y el plásmido pcDNA-ELTP (=0.1 ?/?, aproximadamente 2D) y el vector pLTRdhfr26 (ATCC37295, 0.2D) que tiene el gen dhfr se agregaron a la misma. La mezcla se hizo reaccionar durante 5~10 minutos a temperatura ambiente y después se agregó a las células como se prepararon anteriormente. Después de un día, el medio se renovó con un medio que contiene G418 conteniendo en una cantidad de 500D/D (a-MEM sin medio, 10% de FBS) . El medio se renovó después con el medio G418 que contiene 500D/D de G418 durante 7~10 dias, durante los cuales las células sin el gen de resistencia G418 y las células control negativas se destruyeron completamente. Las células seleccionadas en medio de G418 se cultivaron suficientemente y se identificó una proteina ELTP expresada usando el equipo EPO ELISA de BM Co. El mismo proceso se aplicó a pcDNA-ESTP. Ejemplo 4: Purificación de las proteínas de fusión expresadas Se preparó resina de afinidad para aislamiento y purificación usando anticuerpo monoclonal anti-EPO (R&D Systems Co.) como sigue: Se dilataron 0.3g de sefarosa 4B activada con CNBr durante 20 minutos en lmM de HC1 y la resina se movió a una columna y se lavó con lmM de HC1. La resina se lavó con 4ml de regulador de acoplamiento (0.1M de NaHC03/ 0.5M de NaCl, pH 8.3), se mezcló inmediatamente con anticuerpo monoclonal anti-EPO (500 g frasco) contenido en 4 mi de regulador de acoplamiento en un tubo, y se hizo reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente agitando el tubo. Renovada con regulador de bloqueo (0.2M de glicina, pH 8.0), la resina se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas agitando el tubo. Después, la resina se lavó con 6.5ml de regulador de acoplamiento, 6.5ml de regulador de acetato (0.1 M de ácido acético, 0.5M de NaCl, pH 4) , y 6.5ml de regulador de acoplamiento en ese orden. Se preparó una columna usando tal resina obtenida y la purificación se llevó a cabo como se describe posteriormente. Las células se cultivaron en un medio libre de suero durante un día, y el medio se concentró a aproximadamente 5 veces usando Centriprep (Millipore, MWCO 10,000). Este concentrado se cargó a una columna equilibrada anticipadamente con PBS a una velocidad de flujo de 20ml/hr, y se lavó de nuevo con PBS. Se aplicó regulador de elución (0.1M de glicina, pH 2.8) a la columna y el eluyente se tituló inmediatamente con 1M de Tris a pH 7.5. Los resultados de SDS-PAGE del ELTP y ESTP purificado se muestran en la Figura 4. La pureza fue al menos 97% cuando se analizó por SDS-PAGE y tinción de plata. Ejemplo 5: Medición de la actividad por el método de bioensayo Se inyectó fenilhidrazina a un ratón una vez al dia durante 2 días a una dosis de 60mg/kg. Después de 3 días, se separó el bazo agrandado y se molió con un homogenizador para obtener células de bazo. Las células de bazo se diluyeron a 6X106 células/ml y se introdujeron ???µ? de la solución de células dentro de cada pozo de una placa de 96 pozos. Se agregó 0~500 mU/ml de EPO auténtico y 100 mU/ml de la proteína de fusión expresada a cada pozo, y la placa se dejó permanecer a 37°C durante 22 horas en un incubador de CO2. Se agregó 50µ1 de dimetil 3 [H] -timidina (20µ(?/p?1) a cada pozo, se hizo reaccionar adicionalmente durante 2 horas en el mismo incubador, y la solución de reacción se absorbió después sobre un filtro de vidrio (Nunc 1-73164) por cada pozo. Los filtros se lavaron con solución salida fisiológica 3 veces y la cantidad de radioactividad de cada filtro se midió usando un contador ß. Las actividades de las proteínas de fusión, ELTP y ESTP mostraron ser comparables a, o mayores que las de EPO auténticas, la cual demostró que los términos carboxi fusionados dentro de EPO no presentaron actividad de EPO en si misma. Ejemplo 6: Experimentos farmacocinéticos Se realizaron experimentos farmacocinéticos con ratones para determinar si la sustancia candidato preparada ha prolongado actualmente la vida media in vivo. La proteina de fusión purificada de acuerdo con el. proceso del Ejemplo 5 se administró intravenosamente a 4 ratones en una cantidad de 20 unidades/ratón. Para identificar la concentración de sangre en el intervalo de tiempo, se tomó sangre de los ratones a un intervalo de 30 minutos y las concentraciones se midieron usando el equipo EIA de Boehringer Mannheim Co. Los resultados se muestran en la Figura 5. Como puede verse de la Figura 5, ELTP y ESTP muestran aproximadamente tres veces vida media más larga que el control, EPO, respectivamente (la vida media de EPO fue 22 minutos, la de ELTP fue 60 minutos, y la de ESTP fue 57 minutos) . Las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención tienen vida media de EPO altamenté aumentada in vivo debido a la presencia de aminoácidos que aumentan las cadenas de carbohidratos sin influenciar la actividad inherente de EPO. Adicionalmente, las proteínas de fusión no ocasionan ningún problema de antigenicidad cuando se aplican al cuerpo humano puesto que el péptido fusionado, LTP o STP, es un péptido que ya existe en el cuerpo.