MX2007005777A - Peptidos novedosos que se unen al receptor de eritropoietina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos peptidicos que son agonistas del receptor de eritropoyetina (EPO-R); la invencion se refiere ademas a metodos terapeuticos que utilizan tales compuestos peptidicos para tratar trastornos asociados con produccion insuficiente o defectuosa de globulos rojos; tambien se proveen composiciones farmaceuticas, las cuales comprenden los compuestos peptidicos de la invencion.

Description

PEPTIDOS NOVEDOSOS QUE SE UNEN AL RECEPTOR DE ERITROPOIETINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos peptídicos que son agonistas del receptor de eritropoietina (EPO-R). La invención se refiere adicionalmente a métodos terapéuticos utilizando dichos compuestos peptídicos para tratar trastornos asociados con producción insuficiente o defectuosa de célula roja sanguínea. También se proveen las composiciones farmacéuticas, que comprenden los compuestos peptídicos de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La eritropoietina (EPO) es una hormona glicoproteína de 165 aminoácidos, con un peso molecular de aproximadamente 34 kilodaltones (kD) y sitios de glicosilación preferidos en las posiciones de aminoácidos 24, 38, 83, y 126. Esta se produce inicialmente como una proteína precursora con un péptido señal de 23 aminoácidos. EPO se puede presentar en tres formas: , ß, y asialo. Las formas y ß difieren ligeramente en sus componentes de carbohidrato, pero tienen la misma potencia, actividad biológica, y peso molecular. La forma asialo es una forma a o ß con el carbohidrato terminal (ácido siálico) removido. Las secuencias de ADN que codifican EPO se han reportado [Patente de E.U.A. No. 4,703,008 a Lin]. EPO estimula la división mitótica y la diferenciación de las células precursoras del eritrocito, y por lo tanto asegura la producción de eritrocitos. Se produce en el riñon cuando prevalecen condiciones hipóxicas. Durante la diferenciación inducida por EPO de las células precursoras del eritrocito, se induce la síntesis de globina; se estimula la síntesis del complejo hemo; y se incrementa el número de receptores de ferritina. Estos cambios permiten que las células tomen más hierro y sintetice hemoglobina funcional, la cual une el oxígeno en eritrocitos maduros. Por lo tanto, los eritrocitos y su hemoglobina desempeñan un papel clave en el abastecimiento del cuerpo con oxígeno. Estos cambios se inician por la interacción de EPO con un receptor apropiado en la superficie de las células precursoras del eritrocito [Véase, por ejemplo, Graber y Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29: 51-66]. EPO está presente en concentraciones muy bajas en el plasma cuando el cuerpo se encuentra en un estado sano, en el cual los tejidos reciben suficiente oxigenación a partir del número existente de eritrocitos. Esta concentración normal baja de EPO es adecuada para estimular el reemplazo de células rojas sanguíneas que normalmente se pierden durante el envejecimiento. La cantidad de EPO en circulación se incrementa bajo condiciones de hipoxia cuando se reduce el transporte de oxígeno por las células sanguíneas en circulación. La hipoxia se puede ocasionar, por ejemplo, mediante una pérdida sustancial de sangre a través de la hemorragia, destrucción de células rojas sanguíneas mediante la sobre-exposición a la radiación, reducción en la toma de oxígeno debido a la altitud elevada o inconciencia prolongada, o diversas formas de anemia. En respuesta a dicha tensión hipóxica, los niveles elevados de EPO incrementan la producción de células rojas sanguíneas mediante la estimulación de la proliferación de células progenitoras del eritrocito. Cuando el número de células rojas sanguíneas en circulación es mayor que es necesario para normalizar los requerimientos de oxígeno en el tejido, los niveles de EPO en circulación disminuyen. Debido a que EPO es esencial en el proceso de formación de célula roja sanguínea, esta hormona tiene aplicaciones potencialmente útiles tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de los trastornos sanguíneos caracterizados por una baja producción o una producción defectuosa de célula roja sanguínea. Los estudios recientes han provisto una base para la proyección de la eficiencia terapéutica de la EPO para una variedad de estados de enfermedad, trastornos, y estados de irregularidad hematológica, incluyendo: beta-talasemia [Véase Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71 : 211-213]; fibrosis quística [Véase Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105: 15-21]; trastornos de la preñez y trastornos menstruales [Véase Cotes, et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90: 304-311]; anemia temprana de premadurez [Véase Haga, et al (1983) Acta Pediatr. Scand. 72: 827-831]; lesión de médula espinal [Véase Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65: 370- 374]; vuelo espacial [Véase Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52: 178-182]; pérdida aguda de sangre [véase, Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52: 545-590]; envejecimiento [Véase Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103: 574-580 y 581-588 y Lipschitz, et al. (1983) Blood 63: 502-509]; diversos estados de enfermedad neoplástica acompañados por eritropoiesis anormal [Véase Dainiak, et al. (1983) Cáncer 5: 1101-1106 y Schwartz, et al. (1983) Otolaryngol. 109: 269-272]; e insuficiencia renal [Véase Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316: 73-78]. La EPO purificada, homogénea, ha sido caracterizada [Patente de E.U.A. No. 4,677,195 a Hewick]. Una secuencia de ADN que codifica EPO se purificó, se clonó, y se expresó para producir polipéptidos recombinantes con las mismas propiedades bioquímicas e inmunológicas que la EPO natural. También se ha producido una molécula EPO recombinante con oligosacáridos idénticos a aquellos en la EPO natural [Véase Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059-12076]. El efecto biológico de EPO parece ser mediado, en parte, por la interacción con un receptor unido a la membrana celular. Los estudios iniciales utilizando células eritroides inmaduras aisladas a partir de bazo de ratón sugieren que las proteínas de superficie celular unidas a EPO comprenden dos polipéptidos que tienen pesos moleculares aproximados de 85,000 daltones y 100,000 daltones, respectivamente [Sawyer, et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 3690-3694]. El número de sitios de unión a EPO se calculó a un promedio de 800 a 1000 por superficie celular. De estos sitios de unión, aproximadamente 300, se unen a EPO con un valor Kd de aproximadamente 90 picomolar (pM), mientras que los sitios remanentes se unen a EPO con una afinidad reducida de aproximadamente 570 pM [Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 5554-5562]. Un estudio independiente sugiere que los eritroblastos esplénicos que responden a EPO preparados a partir de ratones inyectados con la cepa anémica (FVA) del virus de la leucemia de Friend poseen un total de aproximadamente 400 sitios de unión a EPO de alta y baja afinidad con valores de Kd de aproximadamente 100 pM y 800 pM, respectivamente [Landschulz, et al. (1989) Blood 73: 1476-1486]. El trabajo subsecuente indicó que las dos formas del receptor de EPO (EPO-R) se codifican por un gen particular. Este gen ha sido clonado [Véase, por ejemplo, Jones, et al. (1990) Blood 76: 31-35; Noguchi, et al. (1991) Blood 78: 2548-2556; Maouche, et al. (1991) Blood 78: 2557-2563]. Por ejemplo, las secuencias de ADN y secuencias peptídicas codificadas para proteínas EPO-R de murino y de humano se describen en Publicación PCT No. WO 90/08822 a D'Andrea, et al. Los modelos actuales sugieren que la unión de EPO a EPO- R resulta en la dimerización y activación de dos moléculas EPO-R, lo cual resulta en pasos subsecuentes de la transducción de la señal [Véase, por ejemplo, Watowich, et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 2140- 2144]. La disponibilidad de los genes clonados para EPO-R facilita la búsqueda de agonista y antagonistas de este receptor importante. La disponibilidad de la proteína receptora recombinante permite el estudio de la interacción del receptor-ligando en una variedad de sistemas de generación de diversidad de péptido al azar y semi-al azar. Estos sistemas incluyen el sistema "péptidos en plásmidos" [descrito en la Patente de E.U.A. No. 6,270,170]; el sistema "péptidos en fago" [descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,432,018 y Cwirla, et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382]; el sistema de "librería sintética codificada" (ESL) [descrito en la solicitud de patente de E.U.A. No. de serie 946,239, descrita el 16 de septiembre de 1992]; y el sistema de "síntesis a muy gran escala de polímero inmovilizado" [descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,143,854; Publicación PCT No. 90/15070; Fodor, et al. (1991) Science 251 : 767-773; Dower y Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-180; y Patente de E.U.A. No. 5,424,186]. Se han identificado los péptidos que interactúan en al menos cierto grado con EPO-R y se describen, por ejemplo, en Wrighton et al (1996) Science 273: 458-463, Johnson et al, (1998) Biochemistry 37: 3699-3710, y Wrighton et al (1997) Nat. Biotechnol. 15: 1261-1265, véase también las Patentes de E.U.A. Nos. 5,773,569, 5,830,851 , 5,986,047, y 5,767,078; WO 96/40749; WO 96/40772; WO 01/38342; y WO 01/91780. En particular, se ha identificado un grupo de péptidos que contienen un motivo peptídico, miembros de los cuales se une a EPO-R y estimulan la proliferación de la célula dependiente de EPO. Incluso, los péptidos identificados hasta la fecha que contienen el motivo estimulan la proliferación de la célula dependiente de EPO in vitro con valores ECdO entre aproximadamente 20 nanomolar (nM) y 250 nM. Por lo tanto, las concentraciones peptídicas de 20 nM a 250 nM se requieren para estimular 50% de la proliferación celular máxima estimulada por EPO. Dado el inmenso potencial de los agonistas de EPO-R, tanto para estudios de actividades biológicas importantes mediadas por este receptor como para el tratamiento de la enfermedad, permanece una necesidad para la identificación de agonistas peptídicos de EPO-R con potencia y actividad mejorada. La presente invención provee dichos compuestos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee péptidos monoméricos agonistas de EPO-R con potencia y actividad dramáticamente mejoradas y agonistas peptídicos diméricos que comprenden dos monómeros peptídicos. La potencia de estos agonistas peptídicos novedosos se puede mejorar adicionalmente mediante una o más modificaciones, incluyendo: acetilación, formación de enlace disulfuro intramolecular, unión covalente de una o más porciones de polietilenglicol (PEG), y otras como se lista en los cuadros 1 - 42 y a través de esta solicitud. La invención también provee péptidos con grupos protectores y/o grupos hidrófobos. Los grupos protectores y/o grupos hidrófobos asociados con los péptidos se pueden utilizar para prolongar las vidas medias de los péptidos en circulación, y facilitar la toma por las células y el transporte a través de las membranas celulares. La invención provee adicionalmente composiciones farmacéuticas comprendidas de dichos agonistas peptídicos, y métodos para el tratamiento de diversas condiciones médicas utilizando dichos agonistas peptídicos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los cuadros 1 - 42 muestran péptidos, incluyendo secuencias peptídicas de la presente invención. Se proveen la secuencias peptídicas utilizando el código de aminoácidos de una sola letra. Se indican los aminoácidos modificados y los aminoácidos que no se presentan de manera natural utilizando las abreviaturas definidas, a continuación, en esta especificación. Por conveniencia, cada péptica individual se refiere con referencia a su número único de identificación de secuencia (SEQ ID NO) dado en la columna más hacia la izquierda. La dimerización de los péptidos individuales por enlaces sulfhidrilo ("enlaces SS") se indica en rosa en los residuos individuales de cisteína, mientras que la dimerización a través de los grupos carboxílicos o grupos amina (formando un enlace de amida) del péptido se indican en azul y amarillo, respectivamente, sobre los residuos implicados. Las porciones enlazadoras de los péptidos individuales, cuando están presentes, se especifican en la columna marcada con "enlazador". La columna marcada con "enlazador-R" indica la porción química presente como el grupo R, si está presente, en el enlazador.

CUADRO 1 CUADRO 2 CUADRO 3 CUADRO 4 CUADRO 5 CUADRO 6 CUADRO 8 CUADRO 9 CUADRO 10 CUADRO 11 > CUADRO 12 CUADRO 13 CUADRO 14 CUADRO 15 CUADRO 16 CUADRO 17 CUADRO 18 CUADRO 19 t ^1 CUADRO 20 CUADRO 21 CUADRO 22 CUADRO 23 CUADRO 24 CUADRO 25 CUADRO 26 CUADRO 27 Ln CUADRO 28 OJ CUADRO 29 CUADRO 30 CUADRO 31 CUADRO 32 CUADRO 33 CUADRO 34 CUADRO 35 CUADRO 36 CUADRO 37 n CUADRO 38 CUADRO 39 CUADRO 40 OO CUADRO 42 Ln O Definiciones: Los aminoácidos no convencionales en los péptidos se abrevian como sigue: 1-naftilalanina es 1-na1 o Np; 2-naftilalanina es 2-nal; N-metilglicina (también conocida como sarcosina) es MeG, Se o Sar; homoserina metiléter es Hsm; y glicina acetilada (N-acetilglicina) es AcG.

Otras abreviaturas se proveen en los cuadros a continuación. Como se utiliza en la presente invención, el término "polipéptido" o "proteína" se refiere a un polímero de monómeros de aminoácidos que son aminoácidos alfa unidos a través de enlaces de amida. Por lo tanto los polipéptidos son de al menos dos residuos de aminoácidos en longitud, y usualmente son más largos. Generalmente, el término "péptido" se refiere a un polipéptido que solamente tiene unos pocos residuos de aminoácidos en longitud. Los péptidos EPO-R novedosos de la presente invención preferiblemente no tienen más de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos en longitud. Estos tienen más preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 45 residuos de aminoácidos en longitud. Por polipéptido, en contraste con un péptido, puede comprender cualquier número de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, el término polipéptido incluye péptidos así como secuencias más largas de aminoácidos. Como se utiliza en la presente invención, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que "generalmente se consideran como seguras", por ejemplo, que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o reacción similar desfavorable, tales como malestar gástrico, vértigo y las similares, cuando se administran a un humano. Preferiblemente, como se utiliza en la presente invención, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un gobierno estatal o listado en la farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en manos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adjuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de frijol de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y los similares. El agua o las soluciones salinas en solución acuosa y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol preferiblemente se emplean como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Como se utiliza en la presente invención el término "agonista" se refiere a un ligando biológicamente activo el cual se une a su receptor complementario biológicamente activo y activa a éste último ya sea al ocasionar una respuesta biológica en el receptor, o al mejorar la actividad biológica preexistente del receptor. Las abreviaturas utilizadas en la presente invención se definen en el cuadro continuación y a lo largo de la especificación.

Adicionalmente, las siguientes son más abreviaturas y sus estructuras químicas asociadas.

Péptidos novedosos que son agonistas de EPO-R La presente invención se refiere a péptidos que son agonistas del EPO-R y muestran potencia y actividad dramáticamente mejorada. Estos agonistas peptídicos son preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 45 aminoácidos en longitud.

Los péptidos de esta invención pueden ser monómeros, homo- o hetero-dímeros, u otros homo- o hetero-multímeros. El término "homo" significa que comprende monómeros idénticos; por lo tanto, por ejemplo, un homodímero de la presente invención es un péptido que comprende dos monómeros idénticos. El término "hetero" significa que comprende monómeros diferentes; por lo tanto, por ejemplo, un heterodímero de la presente invención es un péptido que comprende dos monómeros no idénticos. Los multímeros peptídicos de la invención pueden ser trímeros, tetrámeros, pentámeros, u otras estructuras de un orden superior. Además, dichos dímeros y otros multímeros pueden ser heterodímeros o heteromultímeros. Los monómeros peptídicos de la presente invención pueden ser productos de degradación (por ejemplo, productos de oxidación de metionina o glutamina deaminada, arganina, y amida C-terminl). Dichos productos de degradación se pueden utilizar en y por lo tanto se consideran parte de la presente invención. En modalidades preferidas, los heteromultímeros de la invención comprenden múltiples péptidos que son todos péptidos agonistas de EPO-R. En modalidades altamente preferidas, los multímeros de la invención son homomultímeros: por ejemplo, comprenden múltiples péptidos agonistas de EPO-R de la misma secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, la presente Invención también se refiere a homo- o hetero-agonistas peptídicos diméricos de EPO-R, que muestran potencia y actividad dramáticamente mejoradas. En modalidades preferidas, los dímeros de la invención comprenden dos péptidos que son ambos péptidos agonistas de EPO-R. Estos agonistas peptídicos diméricos preferidos comprenden dos monómeros peptídicos, en donde cada monómero peptídico es de aproximadamente 14 a aproximadamente 45 aminoácidos en longitud. En modalidades particularmente preferidas, los dímeros de la invención comprenden dos péptidos agonistas de EPO-R de la misma secuencia de aminoácidos. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a, a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales pueden ser componentes adecuados para compuestos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales Incluyen, pero no se limitan a: ß-alanina, 3-piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfoserina, N-metilglicina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, nor-leucina, y otros aminoácidos similares e imino ácidos. Otras modificaciones también son posibles, incluyendo la modificación del aminoácido, modificación del carboxi terminal, remplazo de uno o más de los aminoácidos genéticamente codificados que se presentan de manera natural con un aminoácido no convencional, modificación de la cadena lateral de uno o más residuos de aminoácidos, fosforilación del péptido, y los similares. Una modificación amino terminal preferida es la acetilación (por ejemplo, con ácido acético o un ácido acético sustituido por halógeno). En modalidades preferidas una glicina N-terminal se acetila hacia N-acetilglicina (AcG). En modalidades preferidas, la glicina C-terminal es N-metílglicina (MeG, también conocida como sarcosina). En modalidades preferidas, los monómeros peptídicos de la invención contienen un enlace disulfuro intramolecular entre los dos residuos de cisteína de la secuencia núcleo. La presente invención también provee conjugados de estos monómeros peptídicos. Por lo tanto, de conformidad con una modalidad preferida, los péptidos monoméricos de la presente invención se dimerizan u oligomerizan, mejorando así la actividad del agonista de EPO-R. En una modalidad, los monómeros peptídicos de la invención se pueden oligomerizar utilizando el sistema de biotina/estreptavidina. Los análogos biotinilados de los monómeros peptídicos se pueden sintetizar mediante técnicas estándares. Por ejemplo, los monómeros peptídicos pueden estar C-terminalmente biotinilados. Estos monómeros biotinilados se ollgomerizan entonces mediante incubación con estreptavidina [por ejemplo, a una relación molar de 4:1 a temperatura ambiente en solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) o medio RPMI con pH regulado con HEPES (Invitrogen) por 1 hora]. En una variación de esta modalidad, los monómeros peptídicos biotinilados se pueden oligomerizar mediante incubación con cualquiera de numerosos anticuerpos anti-biotina comercialmente disponibles [por ejemplo, IgG anti-biotina de cabra a partir de Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC)].

En modalidades preferidas, los monómeros peptídicos de la invención se dimerizan mediante unión covalente a al menos una porción enlazadora. La porción enlazadora (L«) es preferiblemente, aunque no necesariamente, una porción enlazadora C?_?2 opcionalmente terminada con uno o dos enlaces -NH- y opcionalmente sustituida en uno o más átomos de carbono disponibles con un sustituyente del alquilo inferior. Preferiblemente el enlazador L? comprende -NH-R-NH- en donde R es un alquileno inferior (C1-6) sustituido con un grupo funcional tal como un grupo carboxilo o un grupo amino que permite la unión a otra porción molecular (por ejemplo, como puede estar presente en la superficie de un soporte sólido). Más preferiblemente el enlazador es un residuo de lisina o una lisina amida (un residuo de lisina en donde el grupo carboxilo se ha convertido a una porción amida - CONH ). En modalidades preferidas, el enlazador se une a los C-terminales de dos monómeros peptídicos, mediante la unión simultánea al aminoácido C-terminal de cada monómero. Por ejemplo, cuando el enlazador C-terminal L? es una lisina amida, el dímero se puede ilustrar estructuralmente como se muestra en la fórmula I, y se resumen como se muestra en la fórmula 11: Fórmula i Fórmula iE Monómero Monómero 2 En la formula I y en la formula II, N2 representa el átomo de nitrógeno del grupo e-amino de la lisina y N1 representa el átomo de nitrógeno del grupo a-amino de la lisina. La estructura dimérica se puede escribir como [péptido]2Lys-amida para denotar un péptido unido tanto a los grupos amino a como e de la lisina, o [Ac-péptido]2Lys-amida para denotar un péptido N-terminalmente acetilado unido tanto a los grupos amino a como e de la lisina, o [Ac-péptido, disulfuro]2Lys-amida para denotar un péptido N-terminalmente acetilado unido tanto a los grupos amino a como e de la lisina con cada péptido conteniendo un asa disulfuro intramolecular, o [Ac-péptido, disulfuro]2Lys-espaciador-PEG para denotar un péptido N-terminalmente acetllado unido a ambos grupos amino a y e de la lisina con cada péptido conteniendo un asa disulfuro intramolecular y una molécula espaciadora formando un enlace covalente entre el C-terminal de la lisina y una porción PEG, o [Ac-péptido-Lys*-NH2]2-lminodiacético-N-(Boc-ßAla) para denotar un homodímero de un péptido N-terminalmente acetilado que contiene un residuo C-terminal de lisinamida en donde la e amine de la lisina se une a cada uno de los grupos carboxllo del ácido iminodiacético y en donde la Boc-beta-alanina está covalentemente unida al átomo de nitrógeno del ácido iminodiacético vía un enlace de amida. En una modalidad adicional, el polietilenglicol (PEG) puede servir como el enlazador LK que dimeriza dos monómeros peptídicos: por ejemplo, una porción PEG particular puede estar simultáneamente unida a los N-terminales de ambas cadenas peptídicas del péptido dimérico. En incluso otra modalidad adicional, la porción enlazadora (LK) es preferiblemente, pero no necesariamente, una molécula que contiene dos ácidos carboxílicos y opcionalmente sustituidos en uno o más átomo disponibles con un grupo funcional adicional tal como una amina capaz de ser unido a una o más moléculas PEG. Dicha molécula se puede ilustrar como: -CO-(CH2)n-X-(CH2)m-CO- en donde n es un entero de 0 a 10, m es un entero de 1 a 10, X se selecciona a partir de O, S, N(CH2)pNR-,, NCOÍCH^PNRT, y CHNR^ Ri se selecciona a partir de H, Boc, Cbz, etc., y p es un entero de 1 a 10. En modalidades preferidas, un grupo amino de cada uno de los péptidos forman un enlace amida con el enlazador L . En modalidades particularmente preferidas, el grupo amino del péptido unido al enlazador LK en la épsilon amina de un residuo de lisina o la alfa amina del residuo N-termlnal, o un grupo amino de la molécula espaciadora opcional. En modalidades particularmente preferidas, tanto n como m son uno, X es NCO(CH2)pNR-?, p es dos, y Ri es Boc. Una péptido EPO dimérico que contiene dicho enlazador preferido puede ser estructuralmente ilustrado como se muestra en la fórmula lll. Monómero 1 Formula lll Monómero 2 Opcionalmente, el grupo Boc se puede remover para liberar un grupo amina reactiva capaz de formar un enlace covalente con una especie polimérica soluble en agua adecuadamente activada, por ejemplo, una especie PEG tal como mPEG-para-nitrofenilcarbonato (mPEG-NPC), rnPEG- succinimidil propionato (mPEG-SPA), y N-hidroxisuccinimida-PEG (NHS-PEG) (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,672,662). Un péptido EPO dimérico que contiene dicho enlazador preferido se puede ilustrar estructuralmente como se muestra en la fórmula IV.

Monómero 1 Fórmula IV Monómero 2 Generalmente, aunque no necesariamente, los dímeros peptídicos también contendrán uno o más enlaces disulfuro intramoleculares entre los residuos de cisteína de los monómeros peptídicos. Preferiblemente, los dos monómeros contienen al menos un enlace disulfuro intramolecular. Más preferiblemente, ambos monómeros de un dímero peptídico contienen un enlace disulfuro intramolecular, de tal manera que cada monómero contiene un grupo cíclico. Un monómero o dímero peptídico puede comprender adicionalmente una o más porciones espaciadoras. Dichas porciones espaciadoras se pueden unir a un monómero peptídico o a un dímero peptídico. Preferiblemente, dichas porciones espaciadoras se unen a la porción enlazadora L? que conecta los monómeros del dímero peptídico. Por ejemplo, dichas porciones espaciadoras se pueden unir al dímero peptídico vía el carbono del carbonilo de un enlazador de lisina, o vía el átomo de nitrógeno de un enlazador de ácido iminodiacético. Por ejemplo, dicho espaciador puede conectar el enlazador del dímero peptídico a una porción polimérica unida soluble en agua o un grupo protector. En otro ejemplo, dicho espaciador puede conectar un monómero peptídico a una porción polimérica unida soluble en agua. En una modalidad, la porción espaciadora es una porción de unión a C?-12 opcionalmente terminada con enlaces - NH- o grupos carboxilo (-COOH), y opcionalmente sustituida en uno o más átomo de carbono disponibles con un sustituyente de alquilo Inferior. En una modalidad, el espaciador es R-COOH en donde R es un alquileno inferior de (C1-6) opcionalmente sustituido con un grupo funcional tal como un grupo carboxilo o un grupo amino que permite la unión a otra porción molecular. Por ejemplo, el espaciador puede ser un residuo de glicina (G), o un ácido amino hexanóico. En modalidades preferidas el ácido amino hexanóico es ácido 6-amino hexanóico (Ahx). Por ejemplo, en donde el espaciador ácido 6-amino hexanóico (Ahx) se une al N-terminal de un péptido, el grupo peptídico amina terminal se puede enlazar con el grupo carboxilo de Ahx vía un acoplamiento estándar por amida. En otro ejemplo, en donde Ahx se une al C-terminal de un péptido, la amina de Ahx se puede enlazar al grupo carboxilo del enlazador vía un acoplamiento estándar por amida. La estructura de dicho péptido se puede ilustrar como se muestra en la fórmula V, y se resume como se muestra en la fórmula VI.

Formula V Fórmula VI Monómero 1 Monómero 2 .

En otras modalidades, el espaciador es -NH-R-NH- en donde R es un alquileno inferior de (C-?-6) sustituido con un grupo funcional tal como un grupo carboxilo o un grupo amino que permite la unión a otra porción molecular. Por ejemplo, el espaciador puede ser un residuo de lisina (K) o una lisina amida (K-NH2, un residuo de lisina en donde el grupo carboxilo se ha convertido hacia una porción amida - CONH2).

En modalidades preferidas, la porción espaciadora tiene la siguiente estructura: -NH-(CH2)a-[O-(CH2)ß]?-Od-(CH2)e-Y- en donde a, ß, ?, d, y e son cada uno de enteros cuyos valores se seleccionan independientemente. En modalidades preferidas, a, ß, y e son cada uno enteros cuyos valores se seleccionan independientemente a partir de uno a aproximadamente seis, d es cero a uno, ? es un entero seleccionado a partir de cero a aproximadamente diez, excepto que cuando ? es mayor de uno, ß es dos, e Y se selecciona a partir de NH o CO. En modalidades particularmente preferidas a, ß, y e es cada una igual a dos, tanto ? como d son iguales a 1 , e Y es NH. Por ejemplo, un dímero peptídico que contiene dicho espaciador se ilustra esquemáticamente en la fórmula Vil, en donde el enlazador es una lisina y el espaciador une el enlazador a un grupo protector Boc. Fórmula Vil En otra modalidad particularmente preferida ? y d son cero, a y e juntos son iguales a cinco, e Y es CO.

En modalidades particularmente preferidas, el enlazador más la porción espaciadora tiene la estructura mostrada en la fórmula VIII o en la fórmula IX. Fórmula VIH Fórmula IX Los monómeros peptídicos, dímeros, o multímeros de la invención pueden comprender adicionalmente una o más porciones poliméricas solubles en agua. Preferiblemente, estos polímeros están covalentemente unidos a los compuestos peptídicos de la invención.

Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación del producto terminal, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones tales como si el conjugado de polímero-péptido será utilizado terapéuticamente, y si lo es, la dosis deseada, tiempo de circulación, resistencia a la proteolisis, y otras consideraciones. El polímero soluble en agua puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrán, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1 ,3-dioxolano, poli-1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maléico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros al azar), poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, y polioles polioxietilados. Un polímero soluble en agua preferido es PEG. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Un PEG preferido para uso en la presente invención comprende PEg no ramificado, lineal que tiene un peso molecular que es mayor de 10 kilodaltones (kD) y más preferiblemente es entre aproximadamente 20 y 60 kD en peso molecular. Incluso más preferiblemente, la porción PEG no ramificada, lineal debe tener un peso molecular de entre aproximadamente 20 y 40 kD, con un PEG 20 kD siendo particularmente preferido. Se entiende que en una preparación dada de PEG, los pesos moleculares típicamente variarán entre moléculas individuales. Algunas moléculas pesarán más, y algunas pesarán menos, que el peso molecular establecido. Dicha variación generalmente se refleja por el uso de la palabra "aproximadamente" para describir los pesos moleculares de las moléculas de PEG. El número de las moléculas poliméricas unidas puede variar; por ejemplo, uno, dos, tres, o más polímeros solubles en agua se pueden unir a un péptido agonista de EPO-R de la invención. Los múltiples polímeros unidos pueden ser las mismas porciones químicas o pueden ser diferentes porciones químicas (por ejemplo, PEGs de diferente peso molecular). Por lo tanto, en una modalidad preferida la invención contempla péptidos agonistas de EPO-R que tienen dos o más porciones PEG unidas a éstos. Preferiblemente, ambas porciones de PEG son PEG no ramificado, lineal, cada uno preferiblemente teniendo un peso molecular de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 kD. Más preferiblemente, cada porción PEG no ramificada, lineal, tiene un peso molecular que es entre aproximadamente 20 y 40 kD, e ¡ncluso más preferiblemente entre aproximadamente 20 y 30 kD con un peso molecular de aproximadamente 20 kD para cada porción PEG lineal siendo particularmente preferido. Sin embargo, también se contemplan otros pesos moleculares para PEG en dichas modalidades. Por ejemplo, la invención contempla y abarca péptidos agonistas de EPO-R que tienen dos o más porciones PEG no ramificadas, lineales, unidas a éstos, al menos uno o ambos tienen un peso molecular de entre aproximadamente 20 y 40 kD o entre aproximadamente 20 y 30 kD. En otras modalidades la invención contempla y abarca péptidos agonistas de EPO-R que tienen dos o más porciones PEG no ramificadas, lineales, unidas a éstos, al menos una de las cuales tiene un peso molecular de entre aproximadamente 40 y 60 kD. En una modalidad, PEG puede servir como un enlazador que dimeriza dos monómeros peptídicos. En una modalidad, PEG se une a al menos un extremo terminal (N-terminal o C-terminal) de un monómero peptídico o dímero. En otra modalidad, PEG se une a una porción espaciadora de un monómero peptídico o dímero. En una modalidad preferida PEG se une a la porción enlazadora del dímero peptídico. En una modalidad altamente preferida, PEG se une a una porción espaciadora, en donde dicha porción espaciadora se une a la porción espaciadora L? que conecta los monómeros del dímero peptídico. En modalidades particularmente preferidas, PEG se une a una porción espaciadora, en donde dicha porción espaciadora se une al dímero peptídico vía el carbono del carbonilo de un enlazador de lisina, o el nitrógeno de la amida de un enlazador de lisina amida. Los péptidos y las secuencias peptídicas comprendidas por la presente invención, incluyendo monómeros peptídicos y dímeros, se muestran en los cuadros 1 - 42. Por conveniencia, los péptidos individuales y secuencias peptídicas ilustradas en esos cuadros se describen en la presente invención como referencia a los número de identificación de secuencia (SEQ ID NOs.) provistos en la columna a mano izquierda de los cuadros 1 - 42. Las secuencias peptídicas de la presente invención se puede presentar solas o en conjunción con extensiones N-terminales y/o C-terminales de la cadena peptídicas. Dichas extensiones pueden ser secuencias peptídicas codificadas naturalmente opcionalmente con o sustancialmente sin secuencias que no se presentan de manera natural; las extensiones pueden incluir cualesquiera adiciones, deleciones, mutaciones puntuales, o otras modificaciones o combinaciones de las secuencias como se describe por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo y sin limitación, las secuencias que se presentan de manera natural pueden ser de longitud total o de longitud parcial y pueden incluir sustituciones de aminoácidos para proveer un sitio para unión del carbohidrato, PEG, otro polímero, o los similares vía conjugación a la cadena lateral. En una variación, la sustitución de aminoácidos resulta en la humanización de una secuencia para hacerla compatible con el sistema inmune de humano. Se proveen las proteínas de fusión de todos los tipos, incluyendo secuencias de inmunoglobulina adyacentes a o en proximidad cercana a las secuencias activadoras EPO-R de la presente invención con o sin una secuencia espaciadora no inmunoglobulina. Un tipo de modalidad es la cadena de inmunoglobulina que tiene la secuencia activadora de EPO-R en lugar de la región variable (V) de la cadena pesada y/o ligera.

Preparación de los compuestos peptidicos de la invención: Síntesis del péptido Los péptidos de la invención se pueden preparar mediante métodos clásicos conocidos en la técnica. Estos métodos estándares incluyen síntesis exclusiva en fase sólida, métodos de síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos, síntesis de solución clásica, y tecnología de ADN recombinante [Véase, por ejemplo, Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85: 2149]. En una modalidad, los monómeros peptídicos del dímero peptídico se sintetizan individualmente y se dimerizan de manera subsecuente a la síntesis. En modalidades preferidas los monómeros peptídicos de un dímero tienen la misma secuencia de aminoácidos. En modalidades particularmente preferidas, los monómeros peptídicos de un dímero se enlazan vía sus C-terminales mediante una porción enlazadora L? que tiene dos grupos funcionales capaces de servir como sitios de inicio para la síntesis peptídica y un tercer grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilo o un grupo amino) que permite la unión a otra porción molecular (por ejemplo, como puede estar presente en la superficie de un soporte sólido). En este caso, los todos monómeros peptídicos se pueden sintetizar directamente sobre dos grupos reactivos de nitrógeno de la porción espaciadora L? en una variación de la técnica de síntesis en fase sólida. Dichas síntesis puede ser secuencial o simultánea. Cuando se lleva a cabo la síntesis secuencial de las cadenas peptídicas de un dímero sobre un enlazador, dos grupos funcionales de amina sobre la molécula enlazadora se protegen con dos grupos protectores de amina diferentes ortogonalmente removibles. En modalidades preferidas, la dlamina protegida es una Usina protegida. El enlazador protegido se acopla a un soporte sólido vía el tercer grupo funcional del enlazador. El primer grupo protector de la amina se remueve, y el primer péptido del dímero se sintetiza sobre la primera porción de amina desprotegida. Luego el segundo grupo protector de amina se remueve, y el segundo péptido del dímero se sintetiza sobre la segunda porción de amina desprotegida. Por ejemplo, la primera porción amino del enlazador se puede proteger con Alloc, y la segunda con Fmoc. En este caso, el grupo Fmoc (pero no el grupo Alloc) se puede remover mediante tratamiento con una base suave [por ejemplo, 20% de piperidina en dimetil formamida (DMF)], y la primera cadena peptídica sintetizada. Posteriormente el grupo Alloc se puede remover con un reactivo adecuado [por ejemplo, Pd(PPh3)/4-metil morfolina y cloroformo], y la segunda cadena peptídica sintetizada. Esta técnica se puede utilizar para generar dímeros en donde las secuencias de las dos cadenas peptídicas son idénticas o diferentes. Nótese que cuando se van a utilizar diferentes grupos protectores de tiol para la cisteína, para controlar la formación de enlace disulfuro (como se discute a continuación) esta técnica se debe utilizar incluso cuando las secuencias finales de aminoácidos de las cadenas peptídicas de un dímero son idénticas. En donde se lleva a cabo la síntesis simultánea de las cadenas peptídicas de un dímero sobre un enlazador, se protegen dos grupos funcionales de amina de la molécula enlazadora con el mismo grupo protector de amina removible. En modalidades preferidas, la diamina protegida es una lisina protegida. El enlazador protegido se acopla a un soporte sólido vía el tercer grupo funcional del enlazador. En este caso los dos grupos funcionales protegidos de la molécula enlazadora se desprotegen simultáneamente, y las dos cadenas peptídicas se sintetizan simultáneamente en las aminas desprotegidas. Nótese que con el uso de esta técnica, las secuencias de las cadenas peptídicas del dímero serán idénticas, y todos los grupos protectores de tiol para los residuos de cisteína son los mismos. Un método preferido para la síntesis peptídica es la síntesis en fase sólida. Los procedimientos de síntesis peptídica en fase sólida se conocen bien en la técnica [véase, por ejemplo, Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 General Catalog from Novabiochem Corp, San Diego, EUA; Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002]. En la síntesis en fase sólida, la síntesis típicamente comienza a partir del extremo C-terminal del péptido utilizando una resina protegida en a-amino. Se puede preparar una materia prima adecuada, por ejemplo, mediante la unión del a-aminoácido requerido hacia una resina clorometilada, una resina de hidroximetilo, una resina de poliestireno, una resina de benzhidrilamina, o las similares. Una de dichas resinas clorometiladas se vende bajo el nombre registrado de B1O-BEADS SX-1 por Bio Rad Laboratories (Richmond, CA). Se ha descrito la preparación de la resina de hidroximetilo [Bodonszky, et al. (1966) Chem. Ind. Londres 38: 1597]. Se ha descrito la resina de benzhidrilamina (BHA) [Pietta y Marshall (1970) Chem. Commun. 650], y la forma de clorhidrato está disponible comercialmente a partir del Beckman Instruments, Inc. (Palo Alto, CA). Por ejemplo, un aminoácido protegido en a-amino se puede acoplar a una resina clorometilada con la ayuda de un catalizador de bicarbonato de cesio, de conformidad con el método descrito por Gisin (1973) Helv. Chim. Acta 56: 1467. Después del acoplamiento inicial, el grupo protector de a-amino se remueve, por ejemplo, utilizando soluciones de ácido trifluoroacético (TFA) o ácido clorhídrico (HCl) en solventes orgánicos a temperatura ambiente. Posteriormente, los aminoácidos protegidos en a-amino se acoplan sucesivamente a una cadena peptídica en crecimiento unida al soporte. Los grupos protectores de a-amino son aquellos que se sabe que son útiles en la técnica de síntesis de péptidos paso a paso, incluyendo: grupos protectores tipo acilo (por ejemplo, formilo, trifluoroacetilo, acetilo), grupos protectores tipo uretano aromático [por ejemplo, benciloxicarbonilo (Cbz) y Cbz sustituido], grupos protectores de uretano alifático [por ejemplo, t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo], y grupos protectores tipo alquilo (por ejemplo, bencilo, trifenilmetilo), fluorenílmetil oxicarbonilo (Fmoc), aliloxicarbonilo (Alloc), y 1-(4,4-dimetil-2,6-d¡oxociclohex-1-iliden)et¡lo (Dde). Los grupos protectores de cadena lateral (típicamente éteres, esteres, tritilo, PMC (2,2,5,7,8- pentametil-croman-6-sulfonilo), y los similares) permanecen intactos durante el acoplamiento y no se dividen durante la desprotección del grupo protector de amino terminal o durante el acoplamiento. El grupo protector de cadena lateral debe ser removible después del término de la síntesis del péptido final y bajo condiciones de reacción que no alterarán al péptido blanco. Los grupos protectores de cadena lateral para Tyr incluyen tetrahidropiranilo, ter-butilo, tritilo, bencilo, Cbz, Z-Br-Cbz, y 2,5-diclorobencilo. Los grupos protectores de cadena lateral para Asp incluyen bencilo, 2,6-diclorobencilo, metilo, etilo, y ciciohexilo. Los grupos protectores de cadena lateral para Thr y Ser incluyen acetilo, benzoilo, tritilo, tetrahidropiranilo, bencilo, 2,6-diclorobencilo, y Cbz. Los grupos protectores de cadena lateral para Arg incluyen nitro, Tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonilo mesitoilsulfonilo (Mts), 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf), 4-metoxi-2,3,6-trimetil-bencensulfonilo (Mtr), o Boc. Los grupos protectores de cadena lateral para Lys incluyen Cbz, 2-clorobenciloxicarbonilo (2-CI-Cbz), 2-bromobenciloxicarbonilo (2-Br-Cbz), Tos, o Boc.

Después de la remoción del grupo protector de a-amino, los aminoácidos protegidos remanentes se acoplan paso a paso en el orden deseado. Cada aminoácidos protegidos generalmente se hace reaccionar en aproximadamente un exceso de 3 veces utilizando un grupo activador de carboxilo apropiado tales como hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1 ,1 ,3,3 tetrametiluronio (HBTU) o diciclohexilcarbodimida (DCC) en solución, por ejemplo, en cloruro de metileno (CH2Cl2), N-metil pirrolidona, dimetil formamida (DMF), o mezclas de los mismos. Después de que se ha completado la secuencia de aminoácidos deseada, el péptido deseado se desacopla a partir del soporte de resina mediante el tratamiento con un reactivo, tal como ácido trifluoroacético (TFA) o fluoruro ácido (HF), el cual no solamente escinde al péptido a partir de la resina, sino que también escinde todos los grupos protectores de la cadena lateral remanentes. Cuando se utiliza una resina clorometilada, el tratamiento con fluoruro ácido resulta en la formación de los ácidos peptídicos libres. Cuando se utiliza la resina benzhidrilamina, el tratamiento con fluoruro ácido resulta directamente en la amida peptídica libre. Alternativamente, cuando se emplea resina clorometilada, la cadena lateral protegida del péptido se puede desacoplar mediante el tratamiento de la resina peptídica con amoniaco para producir la cadena lateral deseada protegida con amida o con una alquilamina para producir una cadena lateral protegida con alquilamida o dialquilamida. Luego se remueve la protección de cadena lateral de la manera usual mediante tratamiento con fluoruro ácido para producir las amidas libres, alquilamidas, o dialquilamidas. Durante una preparación de los esteres de la invención, se emplean las resinas utilizadas para preparar los ácidos peptídicos, y la cadena lateral protegida con el péptido se escinde con una base y el alcohol apropiado (por ejemplo, metanol). Los grupos protectores de la cadena lateral se remueven entonces de la manera usual mediante tratamiento con fluoruro ácido para obtener el éster deseado. Estos procedimientos también se pueden utilizar para sintetizar péptidos en los cuales los aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural, los aminoácidos genéticamente codificados se sustituyen en una, dos, o más posiciones de cualesquiera de los compuestos de la invención. Los aminoácidos sintéticos que se pueden sustituir dentro de los péptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, N-metilo, L-hidroxipropilo, L-3,4-dihidroxifenilalanilo, d aminoácidos tales como L-d-hidroxilisilo y D-d-metilalanilo, L-a-metilalanilo, ß aminoácidos, e isoquinolilo. Los D-aminoácidos y aminoácidos sintéticos que no se presentan de manera natural también se pueden incorporar dentro de los péptidos de la presente invención.

Modificaciones peptídicas Uno también puede modificar los extremos amino y/o carboxi de los compuestos peptídicos de la invención para producir otros compuestos de la invención. Las modificaciones al amino terminal incluyen metilación (por ejemplo, -NHCH3 o -N(CH3)2), acetilación (por ejemplo, con ácido acético o un derivado halógenoado del mismo tal como ácido a-cloroacético, ácido a-bromoacético, o ácido a-iodoacético), añadiendo un grupo benciloxicarbonilo (Cbz), o bloqueando el amino terminal con cualquier grupo bloqueador que contiene una funcionalidad carboxilato definida por RCOO- o una funcionalidad sulfonilo definida por R-S02 --, en donde R se selecciona a partir de alquilo, arilo, heteroarilo, alquil arilo, y los similares, y grupos similares. Uno también puede incorporar un desamino ácido en el N-terminal (de manera que no existe un grupo amino N-terminal) para disminuir la susceptibilidad a las proteasas o para restringir la conformación del compuesto peptídico. En modalidades preferidas, el N-terminal es acetilado. En modalidades particularmente preferidas una glicina N-terminal es acetllada para producir N-acetilglicina (AcG). Las modificaciones carboxi terminal incluyen reemplazo del ácido libre con un grupo carboxamida o la formación de un lactamo cíclico en el carboxi terminal para introducir restricciones estructurales. Uno también puede formar en ciclo los péptidos de la invención, o incorporar un residuo desamino o descarboxi en los extremos del péptido, de manera que no existe un grupo amino o carboxilo terminal, para disminuir la susceptibilidad a las proteasas o para restringir la conformación del péptido. Los grupos funcionales C-terminales de los compuestos de la presente invención incluyen amida, amida alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, y carboxi, y los derivados esteres inferiores de los mismos, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Uno puede reemplazar la cadena lateral que se presente de manera natural de los 20 aminoácidos genéticamente codificados (o los D aminoácidos estereoisoméricos ) con otras cadenas laterales, por ejemplo con grupos tales como alquilo, alquilo inferior, alquilo cíclico de 4-, 5-, 6-, a 7-miembros, amida, amida alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, carboxi y los derivados éster inferior de los mismos, y con heterocíclico de 4-, 5-, 6-, a 7-miembros. En particular, se pueden emplear los análogos de prolina en los cuales el tamaño del anillo del residuo de prolina se cambia de 5 miembros a 4, 6, o 7 miembros. Los grupos cíclicos pueden ser saturados o insaturados, y si son insaturados, pueden ser aromáticos o no aromáticos. Los grupos heterocíclicos preferiblemente contienen uno o más heteroátomos de nitrógeno, oxígeno, y/o azufre. Los ejemplos de dichos grupos incluyen el furazanilo, furilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, ¡sotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (por ejemplo morfolino), oxazolilo, piperazinilo (por ejemplo, 1 -piperazinilo), piperidilo (por ejemplo, 1 -piperidilo, piperidino), piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridil, pirimidinilo, pirrolidinilo (por ejemplo, 1 -pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por ejemplo, tiomorfolino), y triazolilo. Estos grupos heterocíclicos pueden estar sustituidos o no sustituidos. Cuando un grupo está sustituido, el sustituyente puede ser alquilo, alcoxi, halógeno, oxígeno, o fenílo sustituido o no sustituido.

Uno también puede modificar fácilmente a los péptidos mediante fosforilación, y otros métodos [por ejemplo, como se describe en Hruby, et al. (1990) Biochem J. 268: 249-262]. Los compuestos peptídicos de la invención también sirven como modelos estructurales para compuestos no peptídicos con actividad biológica similar. Aquellos expertos en la técnica reconocen que está disponible una variedad de técnicas para la construcción de compuestos con la misma actividad biológica deseada o con una actividad biológica similar como el compuesto peptídico guía, pero con una actividad más favorable que el guía con respecto a la solubilidad, estabilidad, y susceptibilidad a la hidrólisis y a la proteólisis [Véase, Morgan y Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252]. Estas técnicas incluyen reemplazo de la estructura base peptídica con una estructura base compuesta de fosfonatos, amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundarias, y N-metilamínoácidos.

Formación de enlaces disulfuro Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más puentes disulfuro intramoleculares. En una modalidad, un monómero peptídico o dímero comprende al menos un enlace disulfuro intramolecular. En modalidades preferidas, el dímero peptídico comprende dos enlaces disulfuro intramoleculares. Dichos enlaces disulfuro se pueden formar mediante la oxidación de los residuos de cisteína de la secuencia peptídica núcleo. En una modalidad el control de la formación del enlace de cisteína se ejercita mediante la elección de un agente oxidante del tipo y concentración efectiva para optimizar la formación del isómero deseado. Por ejemplo, la oxidación del dímero peptídico para formar dos enlaces disulfuro intramoleculares (uno en cada cadena peptídica) preferiblemente se logra (sobre la formación de los enlaces disulfuro intermoleculares) cuando el agente oxidante es DMSO. En modalidades preferidas, la formación de los enlaces de cisteína se controla mediante el uso selectivo de grupos protectores de tiol durante la síntesis peptídica. Por ejemplo, en donde se desea un dímero con dos enlaces disulfuro intramoleculares, la primera cadena peptídica monomérica se sintetiza con los dos residuos de cisteína de la secuencia núcleo protegida con un primer grupo protector tiol [por ejemplo, tritilo (Trt), aliloxicarbonilo (Alloc), y 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iIiden)etilo (Dde) o los similares], luego el segundo péptido monomérico se sintetiza con los dos residuos de cisteína de la secuencia núcleo protegida con un segundo grupo protector tiol diferente del primer grupo protector tiol [por ejemplo, acetamidometilo (Acm), t-butilo (tBu), o los similares]. Posteriormente, los primeros grupos protectores tiol se remueven afectando la formación en ciclo del bisulfuro del primer monómero, y luego los segundos grupos protectores tiol se remueven afectando la formación en ciclo del bisulfuro del segundo monómero. Otras modalidades de esta invención se proveen para análogos de estos derivados disulfuro en los cuales uno de los azufres ha sido reemplazado por un grupo CH2 u otro isótero por azufre. Estos análogos se pueden preparar a partir de los compuestos de la presente invención, en donde cada secuencia núcleo contiene al menos un C o un residuo de homocisteína y un ácido a-amino-?-butírico en lugar del segundo residuo C, vía un desplazamiento intramolecular o intermolecular, utilizando métodos conocidos en la técnica [Véase, por ejemplo, Barker, et al. (1992) J. Med. Chem. 35: 2040-2048 y Or, et al. (1991 ) J. Org. Chem. 56: 3146-3149]. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que este desplazamiento también se puede presentar utilizando otros homólogos del ácido a-amino-?-butírico y homocisteína. Además de las estrategias de formación en ciclo precedentes, se pueden emplear otras estrategias de formación en ciclo del péptido no disulfuro. Dichas estrategias alternativas de formación en ciclo incluyen, por ejemplo, estrategias de formación en ciclo de la amida así como aquellas que implican la formación de enlaces tio-éter. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden existir en una forma en ciclo con cualquier enlace amida intramolecular o un enlace tio-éter intramolecular. Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido en donde una cisteína de la secuencia núcleo se reemplaza con lisina y la segunda cisteína se reemplaza con ácido glutámico. Posteriormente se puede formar un monómero cíclico a través de un enlace de amida entre las cadenas laterales de estos dos residuos. Alternativamente, se puede sintetizar un péptido en donde una cisteína de la secuencia núcleo se reemplaza con lisina. Luego se puede formar un monómero cíclico a través de un enlace tio-éter entre las cadenas laterales del residuo de lisina y el segundo residuo de cisteína de la secuencia núcleo. Como tal, además de las estrategias de formación en ciclo con disulfuro, se pueden utilizar fácilmente las estrategias de formación en ciclo con amida y las estrategias de formación en ciclo con tio-éter para formar en ciclo los compuestos de la presente invención. Alternativamente, el amino-terminal del péptido se puede modificar en un extremo con un ácido acético sustituido con a, en donde el sustituyente a es un grupo residual, tal como un ácido a-haloacético, por ejemplo, ácido a-cloroacético, ácido a-bromoacético, o ácido a-iodoacético.

Adición de enlazadores En modalidades en donde el dímero peptídico se dimeriza mediante una porción enlazadora L , dicho enlazador se puede incorporar dentro del péptido durante la síntesis peptídica. Por ejemplo, en donde una porción enlazadora LK contiene dos grupos funcionales capaces de servir como sitios de inicio para la síntesis peptídica y un tercer grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilo o un grupo amino) que permite la unión a otra porción molecular, el enlazador se puede conjugar a un soporte sólido. Posteriormente, dos monómeros peptídicos se pueden sintetizar directamente sobre los dos grupos de nitrógeno reactivos de la porción espaciadora LK en una variación de la técnica de síntesis en fase sólida. En modalidades alternativas en donde el dímero peptídico se dimeriza mediante una porción enlazadora LK, dicho enlazador se puede conjugar a los dos monómeros peptídicos del dímero peptídico después de la síntesis peptídica. Dichas conjugación se puede lograr mediante métodos bien establecidos en la técnica. En una modalidad, el enlazador contiene al menos dos grupos funcionales adecuados para unión a los grupos funcionales blanco de los monómeros peptídicos sintetizados. Por ejemplo, un enlazador con dos grupos amina libres se puede hacer reaccionar con los grupos carboxilo C-terminales de cada uno de dos monómeros peptídicos. En otro ejemplo, los enlazadores que contienen dos grupos carboxilo, ya sea preactivados o en la presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado, se pueden hacer reaccionar con los grupos amina N-terminal o con los grupos amina de cadena lateral, o con las lisina amidas C-terminales, de cada uno de los dos monómeros peptídicos.

Adición de espaciadores En modalidades en donde los compuestos peptídicos contienen una porción espaciadora, dicho espaciador se puede incorporar dentro del péptido durante la síntesis peptídica. Por ejemplo, en donde un espaciador contiene un grupo amino libre y un segundo grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilo o un grupo amino) que permite la unión a otra porción molecular, el espaciador se puede conjugar al soporte sólido. Posteriormente, el péptido se puede sintetizar directamente sobre el grupo amino libre del espaciador mediante técnicas estándares en fase sólida.

En una modalidad preferida, un espaciador que contiene dos grupos funcionales se acopla inicialmente al soporte sólido vía un primer grupo funcional. A continuación una porción enlazadora LK que tiene dos grupos funcionales capaces de servir como sitios de inicio para la síntesis peptídica y un tercer grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilo o un grupo amino) que permite la unión a otra porción molecular se conjuga al espaciador vía el segundo grupo funcional del espaciador y el tercer grupo funcional del enlazador. Posteriormente, se pueden sintetizar dos monómeros peptídicos directamente sobre los dos grupos de nitrógeno reactivos de la porción espaciadora LK en una variación de la técnica de síntesis en fase sólida. Por ejemplo, un espaciador acoplado a un soporte sólido con un grupo amina libres se puede hacer reaccionar con un enlazador de lisina vía el grupo carboxilo libre del enlazador. En modalidades alternativas en donde los compuestos peptídicos contienen una porción espaciadora, dicho espaciador se puede conjugar al péptido después de la síntesis peptídica. Dicha conjugación se puede lograr mediante métodos bien establecidos en la técnica. En una modalidad, el enlazador contiene al menos un grupo funcional adecuado para unión al grupo funcional blanco del péptido sintetizado. Por ejemplo, un espaciador con un grupo amina libre se puede hacer reaccionar con un grupo carboxilo C-terminal del péptido. En otro ejemplo, se puede hacer reaccionar un enlazador con un grupo carboxilo libre con el grupo amina libre del N-termlnal de un péptido o de un residuo de lisina. En incluso otro ejemplo, un espaciador que contiene un grupo sulfhidrilo libre se puede conjugar a un residuo de cisteína de un péptido mediante oxidación para formar un enlace disulfuro.

Unión de polímeros solubles en agua Incluida con la descripción a continuación, la Solicitud de Patente de E.U.A. Número de Serie 10/844,933 y la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/U804/14887, presentada el 12 de mayo del 2004, se incorporan como referencia en la presente invención en su totalidad. En años recientes, los polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol (PEG), se han utilizado para la modificación covalente de péptidos de importancia terapéutica y en diagnóstico. La unión de dichos polímeros es a través de una actividad biológica mejorada, tiempo de circulación en sangre prolongado, inmunidad reducida, solubilidad acuosa incrementada, y resistencia mejorada a la digestión por proteasa. Por ejemplo, la unión covalente de PEG a los polipéptidos terapéuticos tales como interieucinas [Knauf, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263; 15064; Tsutsumi, et al. (1995) J. Controlled Reléase 33: 447), interferones (Kita, et al. (1990) Drug Des. Delivery 6: 157), catalasa (Abuchowski, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252: 582), superóxido dismutasa (Beauchamp, et al. (1983) Anal. Biochem. 131 : 25), y adenosina deaminasa (Chen, et al. (1981 ) Biochim. Biophy. Acta 660: 293), se han reportado para extender su vida media in vivo, y/o reducir su inmunogenicidad y antigenicidad.

Los compuestos peptídicos de la invención pueden comprender adicionalmente una o más porciones poliméricas solubles en agua. Preferiblemente, estos polímeros están covalentemente unidos a los compuestos peptídicos. El polímero soluble en agua puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrán, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1 ,3-dioxolano, poli-1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maléico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros al azar), poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, propropilenglicol homopolímeros, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, y polioles polioxietilados. Un polímero soluble en agua preferido es PEG. Los péptidos, dimeros peptídicos y otras moléculas basadas en péptido de la invención se pueden unir a péptidos solubles en agua (por ejemplo, PEG) utilizando cualesquiera de una variedad de químicas para asociar el polímero(s) soluble en agua a ia porción de unión al receptor de la molécula (por ejemplo, péptído + espaciador). Una modalidad típica emplea una unión particular de unión para la unión covalente del polímero(s) soluble en agua a la porción de unión al receptor, sin embargo en modalidades alternativas se pueden utilizar múltiples uniones para unión, incluyendo variaciones adicionales en donde diferentes especies de polímeros solubles en agua se unen a la porción de unión al receptor en uniones para unión distintas, las cuales pueden incluir unión(es) para unión covalente del espaciador y/o a una o ambas cadenas peptídicas. En algunas modalidades, el dímero o multímero de orden mayor comprenderá distintas especies de cadenas peptídicas (por ejemplo, un heterodímero u otro heteromultímero). A manera de ejemplo y no de limitación, un dímero puede comprender una primera cadena peptídica que tiene una unión para unión al PEG y la segunda cadena peptídica puede carecer ya sea de una unión para unión al PEG o puede utilizar diferentes químicas de unión que la primera cadena peptídica y en algunas variaciones el espaciador puede contener o carecer de una unión para unión al PEG y dicho espaciador, si se encuentra PEGilado, puede utilizar una química de unión diferente a aquella utilizada por la primera y/o segunda cadena peptídica. Una modalidad alternativa emplea un PEG unido a la porción espaciadora de la porción para unión al receptor y un polímero soluble en agua diferente (por ejemplo, un carbohidrato) conjugado a una cadena lateral de uno de los aminoácidos de la porción peptídica de la molécula. Se puede utilizar una amplia variedad de especies de polietilenglicol (PEG) para PEGilación de la porción para unión al receptor (péptidos + espaciador). Sustancialmente se puede utilizar cualquier reactivo PEG reactivo adecuado. En modalidades preferidas, el reactivo PEG reactivo resultará en la formación de un carbamato o enlace de amida después de la conjugación a la porción para unión al receptor. Las especies PEG reactivas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellos que están disponibles para venta en el catálogo de Drug Delivery Systems (2003) de NOF Corporation (Yebisu Garden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-ku, Tokyo 150- 6019) y el catálogo de Molecular Engineering (2003) de Nektar Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806). Por ejemplo y sin limitación, los siguientes reactivos PEG frecuentemente se prefieren en varias modalidades: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, PEG multi-Brazo, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-tiopesteres, mPEG-ésteres dobles, mPEG-BTC, mPEG-ButirALD, mPEG-ACET, PEGs heterofuncionales (NH2-PEG-COOH, Boc- PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), PEG acrilatos (ACRL-PEG-NHS), PEG-fosfolípidos (por ejemplo, mPEG-DSPE), PEGs multibrazo de la serie SUNBRITE incluyendo la serie GL de PEGs basados en glicerina activados por una química elegida por aquellos expertos en la técnica, cualesquiera de los PEGs activados de SUNBRITE (incluyendo pero no limitados a carboxilo-PEGs, p-NP-PEGs, Tresil-PEGs, aldehido PEGs, acetal-PEGs, amino-PEGs, tiol-PEGs, maleimido-PEGs, hidroxil-PEG-amina, amino-PEG-COOH, hidroxil-PEG-aldehído, PEG tipo anhídrido carboxílico, PEG-fosfolípido funcionalizado, y otros PEGs similares y/o reactivos adecuados como se selecciona por aquellos expertos en la técnica para la aplicación y uso particular. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. Un PEG preferido para uso en la presente invención comprende PEG no ramificado, lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kilodaltones (kD o kDa) a aproximadamente 40 kD (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de PEG, algunas moléculas pesarán más, algunas pesarán menos, que el peso molecular establecido). Más preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kD a aproximadamente 40 kD. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, duración de la liberación sostenida deseada; efectos, si se presentan, sobre la actividad biológica; facilidad en el manejo; grado o ausencia de antigenicidad; y otros efectos conocidos de PEG sobre un péptido terapéutico). El número de moléculas poliméricas unidas puede variar; por ejemplo, uno, dos, tres, o más polímeros solubles en agua pueden estar unidos a un péptido agonista de EPO-R de la invención. Los múltiples polímeros unidos pueden ser los mismos o pueden ser porciones químicas diferentes (por ejemplo, PEGs de diferente peso molecular). En algunos casos, el grado de unión del polímero (el número de porciones poliméricas unidas a un péptido y/o el número total de péptidos al cual se une un polímero) puede estar influenciado por la proporción de moléculas poliméricas contra moléculas peptídicas en una reacción de unión, así como mediante la concentración total de cada una en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima del polímero contra el péptido (en términos de la eficiencia de la reacción para no proveer un exceso de péptidos que no han reaccionado y/o porciones poliméricas) será determinada por factores tales como el grado deseado de unión al polímero (por ejemplo, mono, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, ya sea que el polímero se encuentra ramificado o no ramificado, y las condiciones de reacción para un método de unión particular.

En modalidades preferidas, el polímero soluble en agua covalentemente unido es PEG. Para propósitos ilustrativos, los ejemplos de métodos para la unión covalente de PEG (PEGilación) se describen a continuación. No se pretende que estas descripciones ilustrativas sean limitantes. Un experto en la técnica apreciará que una variedad de métodos para unión covalente de un amplio intervalo de polímeros solubles en agua está bien establecida en la técnica. Como tal, los compuestos peptídicos a los cuales se une cualquier número de polímeros solubles en agua conocidos en la técnica mediante cualquier número de métodos de unión conocidos en la técnica se comprenden por la presente invención. En una modalidad, PEG puede servir como un enlazador que dimeriza dos monómeros peptídicos. En una modalidad, PEG se une a al menos un extremo terminal (N-terminal o C-terminal) de un monómero peptídico o dímero. En otra modalidad, el PEG se une a una porción espaciadora de un monómero peptídico o dímero. En una modalidad preferida el PEG se une a la porción enlazadora del dímero peptídico. En una modalidad altamente preferida, el PEG se une a una porción espaciadora, en donde dicha porción espaciadora se une a la porción enlazadora LK que conecta los monómeros del dímero peptídico. Más preferiblemente, PEG se une a una porción espaciadora, en donde dicha porción espaciadora se une al dímero peptídico vía el carbono del carbonilo de un enlazador de lisina, o el nitrógeno de la amida de un enlazador de lisina amida.

Existen numerosos métodos para unión al PEG disponibles a aquellos expertos en la técnica [véase, por ejemplo, Goodson, et al. (1990) Bio/Technology 8: 343 (PEGylation of interleukin-2 at its glycosilación site after site-directed mutagenesis); EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF); Malik, et al, (1992) Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (PEGylation of G -CSF using tresyl chloride); Publicación PCT No. WO 90/12874 (PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introduced cystein residue using a cystein-specifc mPEG derivative); Patente de E.U.A. No. 5,757,078 (PEGylation of EPO peptides); y Patente de E.U.A. No. 6,077,939 (PEGylation of an N-terminal a-carbon of a peptide)]. Por ejemplo, PEG se puede unir covalentemente a los residuos de aminoácidos vía un grupo reactivo. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales una molécula PEG activada se puede unir (por ejemplo, un grupo amino o carboxilo libre). Por ejemplo, residuos de aminoácido N-terminal y residuos de lisina (K) tienen un grupo amino libre; y los residuos de aminoácido C-terminal tienen un grupo carboxilo libre. Los grupos sulfhidrilo (por ejemplo, como se encuentra en los residuos de cisteína) también se pueden utilizar como un grupo reactivo para la unión a PEG. Además, se han descrito los métodos asistidos por enzima para la introducción de grupos activados (por ejemplo, hidrazida, aldehido, y grupos amino aromáticos) específicamente en el C-terminal de un polipéptido [Schwarz, et al. (1990) Methods Enzymol. 184: 160; Rose, et al. (1991 ) Bioconjugate Chem. 2: 154; Gaertner, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 7224].

Por ejemplo, las moléculas de PEG se pueden unir a grupos amino peptídicos utilizando PEG metoxilado ("mPEG") que tiene diferentes porciones reactivas. Dichos polímeros incluyen mPEG-succinimidil succinato, mPEG-succinimidil carbonato, mPEG-imidato, mPEG-4-nitrofenil carbonato, y mPEG-cloruro cianúrico. De manera similar, las moléculas PEG se pueden unir a grupos carboxilo peptídicos utilizando PEG metoxilado con un grupo amina libre (mPEG-NH2). En donde la unión del PEG no es específica y se desea un péptido que contiene una unión PEG específica, el compuesto PEGilado deseado se puede purificar a partir de la mezcla de compuestos PEGilados. Por ejemplo, si se desea un péptido N-terminalmente PEGilado, la forma N-terminalmente PEGilada se puede purificar a partir de una población de péptidos PEGilados al azar (por ejemplo, separando esta porción a partir de otras porciones monoPEGiladas). En modalidades preferidas, el PEG se une de manera sitio específica a un péptido. La PEGilación sitio específica en el N-terminal, cadena terminal, y C-terminal de un análogo potente del factor liberador de la hormona de crecimiento se ha llevado a cabo a través de la síntesis en fase sólida [Félix, et al. (1995) Int. J. Peptide Protein Res. 46: 253]. Otro método sitio específico implica la unión de un péptido a los extremos de las cadenas de PEG insertado en la superficie liposomal de manera sitio específica a través de un grupo aldehido reactivo en el N-terminal generado mediante oxidación con peryodato de sodio de la treonina N-terminal [Zalipsky, et al. (1995) Bioconj. Chem. 6: 705]. Sin embargo, este método se limita a los polipéptidos con residuos de serina o treonina N-terminal. Otro método sitio específico para la PEGilación N-terminal de un péptido vía una hidrazona, hidrazona reducida, oxima, o enlace de oxima reducida se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,077,939 a Wei, et al. En un método, la PEGilación selectiva N-terminal se puede lograr mediante la alquilación reductiva la cual explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina contra el N-terminal) disponible para la derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, un grupo carbonilo que contiene PEG se une selectivamente al N-terminal de un péptido. Por ejemplo, uno puede PEGilr selectivamente de manera N-terminal a la proteína al llevar acabo la reacción a un pH que explota las diferencias de pKa entre los grupos e-amino de un residuo de lisina y el grupo a-amino del residuo N-terminal del péptido. Mediante dicha unión selectiva, la PEGilación toma lugar predominantemente en el N-terminal de la proteína, sin modificación significativa de otros grupos reactivos (por ejemplo, grupos amino de cadena lateral de la lisina). Utilizando la alquilación reductiva, el PEG debe tener un aldehido reactivo particular para el acoplamiento a la proteína (por ejemplo, se puede utilizar el PEG proprionaldehído). La mutagénesis sitio específica es un método adicional que se puede utilizar para preparar péptidos para unión sitio específica al polímero. Mediante este método, la secuencia de aminoácidos de un péptido se diseña para que incorpore un grupo reactivo apropiado en la posición deseada dentro del péptido. Por ejemplo, WO 90/12874 describe la PEGilación sitio dirigida de proteínas modificadas por la inserción de residuos de cisteína o la sustitución de otros residuos por residuos de cisteína. Esta publicación también describe la preparación de mPEG- eritropoietina ("mPEG-EPO") mediante la reacción de un mPEG derivado específico de cisteína con un residuo de cisteína recombinantemente introducido en EPO. Cuando PEG se une a un espaciador o porción enlazadora, se pueden utilizar métodos de unión similares. En este caso, el enlazador o espaciador contiene un grupo reactivo y una molécula PEG activada que contiene el grupo reactivo complementario apropiado se utiliza para llevar a cabo la unión covalente. En modalidades preferidas el enlazador o grupo reactivo espaciador contiene un grupo amino terminal (por ejemplo, ubicado en el terminal del enlazador o espaciador) que se hace reaccionar con una molécula de PEG activada de manera adecuada para hacer un enlace covalente estable tal como una amida o un carbamato. Las especies PEG adecuadas activadas incluyen, pero no se limitan a, mPEG-para-nitrofenilcarbonato (mPEG-NPC), mPEG-succinimidil carbonato (mPEG-SC), y mPEG-succinimidil propionato (mPEG-SPA). En otras modalidades preferidas, el enlazador o grupo reactivo espaciador contiene un grupo carboxilo capaz de ser activado para formar un enlace covalente con una molécula PEG que contiene una amina bajo condiciones de reacción adecuadas. Las moléculas PEG adecuadas incluyen mPEG-NH2 y las condiciones de reacción adecuadas incluyen la formación de amida mediada por carbodiimida o los similares.

Ensayos de actividad del agonista del EPO-R: La actividad biológica de los diversos compuestos peptídicos de esta invención (por ejemplo, como agonista de EPO-R) se puede ensayar mediante cualesquiera de una variedad de métodos que se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, en la Solicitud de Patentes Internacional No. PCT/US04/14886, presenta del 12 de mayo de 2004. Los ejemplos no limitantes de ciertos ensayos preferidos también se describen en la presente invención.

Ensayos funcionales in vitro Los ensayos de unión competitiva in vitro cuantifican la capacidad de un compuesto prueba para competir con EPO para la unión a EPO-R. Por ejemplo (véase, por ejemplo, como se describe en la Patente de E.U.A. 5,773,569), el dominio extracelular del EPO-R de humano (proteína de unión a EPO, EBP) se puede producir de manera recombinante en E. coli y la proteína recombinante se acopla a un soporte sólido, tal como un plato para microtitulación o un lecho sintético [por ejemplo, lechos de Sulfolink a partir de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)]. La EBP inmovilizada se incuba entonces con EPO recombinante marcado, o con EPO recombinante marcado y un péptido prueba. Se emplean diluciones seriales del péptido prueba para dichos experimentos. Los puntos de ensayos sin péptido prueba añadido definen las uniones EPO totales a EBP. Para las reacciones que contienen el péptido prueba, la cantidad de EPO unido se cuantifica y se expresa como un porcentaje de la unión control (total=100%). Estos valores se grafican contra la concentración del péptido. El valor IC50 se define como la concentración del péptido prueba que reduce la unión de EPO a EBP en un 50% (por ejemplo, inhibición del 50% en la unión de EPO). Un ensayo de unión competitivo in vitro diferente mide la señal luminosa generada como una función de la proximidad de los dos lechos: un lecho conjugado a EPO y un lecho conjugado a EPO-R. La proximidad del los lechos se genera por la unión de EPO a EPO-R. Un péptido prueba que compite con EPO para la unión a EPO-R prevendrá esta unión, ocasionando una disminución en la emisión de luz. La concentración del péptido prueba que resulta en una disminución del 50% en la emisión de luz se define como el valor IC50. La actividad biológica y potencia de péptidos monoméricos y diméricos de los agonistas de EPO-R de la invención, que se unen específicamente al receptor EPO, se pueden medir utilizando ensayos funcionales basados en célula in vitro. Un ensayo se basa en una línea celular pre-B de murino que expresa EPO-R de humano y adicionalmente transfectada con una construcción del reportero de luciferasa dirigida por el promotor fos. Después de la exposición a EPO o de otro agonista de EPO-R, de tal manera que las células responden mediante la síntesis de luciferasa. La luciferasa ocasiona la emisión de luz después de la adición del sustrato luciferina. Por lo tanto, el nivel de activación de EPO-R en dichas células se puede cuantificar vía la medición de la actividad de luciferasa. La actividad de un péptido prueba se mide mediante la adición de diluciones seriales del péptido prueba a las células, las cuales se incuban entonces por 4 horas. Después de la incubación, el sustrato de luciferiná se añade a las células, y se mide la emisión de luz. La concentración del péptido prueba que resulta en una emisión de la mitad de la emisión máxima de luz se registra como la ECdO. Se puede llevar a cabo otro ensayo utilizando células FDC- P1/ER [Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med. 152: 1036-1047], una línea celular derivada de médula ósea de murino no transformada bien caracterizada dentro de la cual se ha transfectado de manera estable EPO-R. Estas células exhiben proliferación dependiente de EPO. En uno de dichos ensayos, las células se dejan crecer hasta la mitad de una densidad estacional en la presencia de los factores de crecimiento necesarios (véase, por ejemplo, como se describe en la Patente de E.U.A. 5,773,569). Luego las células se lavan en PBS y se dejan en ayuno por 16-24 horas en medio completo sin los factores de crecimiento. Después de determinar la viabilidad de las células (por ejemplo, mediante tinción con azul tripán), se realizaron soluciones para almacenamiento (en medio completo sin los factores de crecimiento) para producir aproximadamente 105 células por 50 uL. Las diluciones seriales de los compuestos agonistas del péptido EPO-R (típicamente el péptido en fase de solución, libre, en oposición a un péptido unido al fago u otro péptido unido o inmovilizado) a ser evaluadas se realizan en placas para cultivo de tejidos de 96 pozos para un volumen final de 50 uL por pozo. Las células (50 uL) se añaden a cada pozo y las células se incuban por 24-48 horas, tiempo en el cual los controles negativos deben morir o deben permanecer quiescentes. La proliferación celular se mide entonces mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como ensayo de MTT ei cual mide la incorporación de H3-timidina como una indicación de la proliferación celular [véase, Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65: 55-63]. Los péptidos se evaluaron tanto en la línea celular que expresa EPO-R como en una línea celular parental que no expresa ese elemento. La concentración del péptido prueba necesaria para producir una mitad de la proliferación celular máxima se registra como la EC50. En otro ensayo, las células se crecen hasta una fase estacionaria en medio suplementado con EPO, se recolectaron, y luego se cultivaron por 18 horas adicionales en medio sin EPO. Las células se dividieron en tres grupos de igual densidad celular: un grupo sin factor añadido (control negativo), un grupo con EPO (control positivo), y un grupo experimental con el péptido prueba. Las células cultivadas se recolectaron entonces a diversos puntos de tiempo, se fijaron, y se tiñeron con un colorante fluorescente para unión al ADN (por ejemplo, yoduro de propidio o colorante de Hoechst, ambos disponibles a partir de Sigma). Luego se midió la fluorescencia, por ejemplo, utilizando un citómetro de flujo para registro FACS.

El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se puede determinar entonces, por ejemplo, utilizando el modelo SOBR de CelIFIT software (Becton Dickinson). Las células tratadas con EPO o con un péptido activo mostrarán una porción mayor de células en fase S (como se determina por la fluorescencia incrementada como un indicador del contenido incrementado de ADN) en relación con el grupo control negativo. Se pueden llevar a cabo ensayos similares utilizando las líneas celulares FDCP-1 [véase, por ejemplo, Dexter et al. (1980) J. Exp. Med. 152: 1036-1047] o TF-1 [Kitamura, et al. (1989) Blood 73: 375-380]. FDCP-1 es una línea celular de progenitor hematopoiético multi-potencial de murino dependiente del factor de crecimiento que puede proliferar, pero no puede diferenciarse, cuando su suplementado con medio condicionado con WEHI-3 (medio que contiene IL-3, ATCC número TIB-68). Para dichos experimentos, la línea celular FDCP-1 se transfecta con el EPO-R de humano o murino para producir las líneas celulares FDCP-1-hEPO-R o FDCP-1-mEPO-R, respectivamente, que pueden proliferar, pero no se pueden diferenciar, en la presencia de EPO. TF-1 , una línea celular dependiente de EPO, también se puede utilizar para medir los efectos de los agonistas peptídicos de EPO-R sobre la proliferación celular. En incluso otro ensayo, el procedimiento establecido en Krystal (1983) Exp. Hematol 11 : 649-660 para un microensayo basado en incorporación de H3-timidina dentro de células del bazo se puede emplear para evaluar la capacidad de los compuestos de la presente invención para servir como agonistas de EPO. En breve, los ratones B6C3F-] son inyectados diariamente por dos días con fenilhidrazina (60 mg/kg). Al tercer día, las células de bazo se remueven y se evalúa su capacidad para proliferar durante un periodo de 24 horas utilizando un ensayo MTT. La unión de EPO a EPO-R en una línea celular que responde a eritropoietina induce la fosforilación de la tirosina tanto del receptor como de numerosas proteínas intracelulares, incluyendo She, vav y JAK2 cinasa. Por lo tanto, otro ensayo in vitro mide la capacidad de los péptidos de la invención para inducir la fosforilación de la tirosina de EPO-R y de las proteínas transductoras de la señal intracelular cascada abajo. Los péptidos activos, como se identifican mediante los ensayos de unión y proliferación anteriormente descritos, inducen un patrón de fosforilación casi idéntico a aquel de EPO en las células que responden a eritropoietina. Para este ensayo, las células FDC-P1/ER [Dexter, et al. (1980) J Exp Med 152: 1036-47] se mantienen en medio suplementado con EPO y se dejan crecer hasta una fase estacionaria. Estas células se cultivan entonces en medio sin EPO por 24 horas. Un número definido de dichas células se incuba entonces con un péptido prueba por aproximadamente 10 minutos a 37°C. Una muestra control de las células con EPO también se procesa con cada ensayo. Las células tratadas se recolectan entonces mediante centrifugación, se resuspenden en regulador de pH para lisis con SDS, y se someten a electroforesis en gel de SDS poliacrilamida. Las proteínas sometidas a electroforesis en el gel se transfieren a nitrocelulosa, y las proteínas que contienen fosfotirosina en el blot se visualizaron mediante técnicas inmunológicas estándares. Por ejemplo, el blot se puede ensayar con un anticuerpo anti-fosfotirosina (por ejemplo, IgG anti-fosfotirosina de ratón a partir de Upstate Biotechnology, Inc.), se lava, y luego se ensaya con un anticuerpo secundario [por ejemplo, IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa a partir de Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC)]. Posteriormente, las proteínas que contienen fosfotirosina se pueden visualizar mediante técnicas estándares incluyendo ensayos colorimétricos, quimioluminiscentes, o fluorescentes. Por ejemplo, un ensayo quimioluminiscente se puede llevar a cabo utilizando el sistema de Western Blot ECL a partir de Amersham. Otro ensayo in vitro basado en célula que se puede utilizar para evaluar la actividad de los péptidos de la presente invención comprende un ensayo de colonia, utilizando células de médula ósea de murino o células de sangre periférica de humano. La médula ósea de murino se puede obtener a partir de los fémures de los ratones, mientras que una muestra de sangre periférica de humano se puede obtener a partir de un donante sano. En el caso de la sangre periférica, las células mononucleares se aislan primero a partir de la sangre, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente Ficoll-Hypaque [Stem Cell Technologies, Inc. (Vancouver, Canadá)]. Para este ensayo se lleva a cabo un conteo de células nucleadas para establecer el número y concentración de células nucleadas en la muestra original. Se siembra un número definido de células sobre metil celulosa de conformidad con las instrucciones del fabricante [Stem Cell Technologies, Inc.

(Vancouver, Canadá)]. Un grupo experimental se trata con un péptido prueba, un grupo control positivo se trata con EPO, y un grupo control negativo no recibe tratamiento. El número de colonias en crecimiento para cada grupo se evalúa entonces después de períodos de incubación definidos, generalmente 10 días y 18 días. Un péptido activo promoverá la formación de la colonia. Otros ensayos biológicos in vitro que se pueden utilizar para demostrar la actividad de los compuestos de la presente invención se describen en Greenberger, et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2931-2935 (línea celular de progenitor hematopoiético dependiente de EPO); Quelle y Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266: 609-614 (fosforilación de la tirosina de la proteína en células B6SULEP); Dusanter-Fourt, et al. (1992) J. Biol. Chem. 287: 10670-10678 (fosforilación de tirosina del receptor de EPO en células de humano que responden a EPO); Quelle, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17055-17060 (fosforilación de tirosina de una proteína citosólica, pp 100, en células FDC-ER); Worthington, et al. (1987) Exp. Hematol. 15: 85-92 (ensayo colorimétrico para hemoglobina); Kaiho y Miuno (1985) Anal. Biochem. 149: 117-120 (detección de hemoglobina con 2,7-diaminofluoreno); Patel, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 21300- 21302 (expresión de c-myb); Witthuhn, et al. (1993) Cell 74: 227-236 (asociación y fosforilación de tirosina de JAK2); Leonard, et al. (1993) Blood 82: 1071-1079 (expresión de factores los de transcripción GATA); y Ando, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 9571-9575 (regulación de la transición de G-i mediante el ciclo D2 y D3).

Se ha reportado que un aparato diseñado por Molecular Devices Corp., conocido como un microfisiómetro, se utiliza de manera exitosa para la medición de los efectos de los agonistas y los antagonistas en diversos receptores. La base de este aparato es la medición de las alteraciones en la velocidad de acidificación del medio extracelular en respuesta a la activación del receptor.

Ensayos funcionales in vivo Un ensayo funcional in vivo que se puede utilizar para evaluar la potencia de un péptido prueba es el bioensayo de ratón exhipóxico policitémico. Para este ensayo, los ratones se someten a un ciclo de acondicionamiento alternativo por varios días. En este ciclo, los ratones se alternan entre períodos de condiciones hipobáricas y condiciones de presión ambiental. Por lo tanto, los ratones se mantienen a presión ambiental por 2-3 días antes de la administración de las muestras prueba. Las muestras del péptido prueba, o EPO estándar en el caso de los ratones control positivos, se inyectan simultáneamente dentro de los ratones condicionados. Se administra hierro radiomarcado (por ejemplo, Fe59) 2 días después, y las muestras de sangre se toman dos días después de la administración del hierro radiomarcado. Las mediciones de hematocrito y radioactividad se determinan entonces para cada muestra de sangre mediante técnicas estándares. Las muestras de sangre a partir de los ratones inyectados con los péptidos prueba activos mostrarán una mayor radiactividad (debido a la unión de Fe59 por hemoglobina del eritrocito) en comparación con los ratones que no recibieron los péptidos prueba o EPO. Otro ensayo funcional in vivo que se puede utilizar para evaluar la potencia de un péptido prueba es en ensayo en reticulocito. Para este ensayo, los ratones no tratados normales se inyectan subcutáneamente en tres días consecutivos ya sea con EPO o con el péptido prueba. En el tercer día, los ratones también se inyectan intraperitonealmente con hierro dextrán. Al día cinco, las muestras de sangre se recolectan a partir de los ratones. Se determinan el porcentaje (%) de reticulocitos en la sangre mediante tinción con naranja tiazol y análisis de citometría del flujo (programa retic-count). Además, los hematocritos se determinan anualmente. El porcentaje de reticulocito corregidos se determina utilizando la siguiente fórmula: ^ RETICcorregido = RETIC0bservado X (HematocritOindi iduai/HematocritOnor ai) Los compuestos prueba activos mostrarán un nivel incrementado en el % RETICcorregido en relación con los ratones que no recibieron los péptidos prueba o EPO.

Uso de los agonistas peptídicos de EPO-R de la invención Los compuestos peptídicos de la invención son útiles in vitro como herramientas para entender el papel biológico de EPO, incluyendo la evaluación de muchos factores a través de la influencia, y se pueden influencia por, la producción de EPO y la unión de EPO al EPO-R (por ejemplo, el mecanismo de transducción de la señal/ activación de la señal de EPO/EPO-R). Los presentes péptidos también son útiles en el desarrollo de otros compuestos que se unen al EPO-R, debido a que los presentes compuestos proveen información importante de la relación estructura-actividad que facilita ese desarrollo. Además, basándose en su capacidad para unirse a EPO-R, los péptidos de la presente invención se pueden utilizar como reactivos para detectar EPO-R en células vivas; células fijadas; en fluidos biológicos; el homogenizados de tejido; en materiales biológicos naturales, purificados; etc. Por ejemplo, mediante el marcado de dichos péptidos, uno puede identificar células que tienen EPO-R en sus superficies. Además, basándose en su capacidad para unirse a EPO- R, los péptidos de la presente invención se pueden utilizar en la tinción in situ, análisis FACS (clasificación celular activada por fluorescencia), Western blot, ELISA (ensayo inmunosorbente asociado a enzima), etc. Además, basándose en su capacidad para unirse EPO-R, los péptidos de la presente invención se pueden utilizar en la purificación del receptor, o en la purificación de células que expresan EPO-R en la superficie celular (o dentro de células permeabilizadas). Los péptidos de la invención también se pueden utilizar como reactivos comerciales para diversos propósitos de investigación médica y diagnóstico. Dichos usos pueden incluir pero no se limitan a: (1) el uso de un estándar de calibración para la cuantificación de las actividades de los agonistas de EPO-R candidatos en una variedad de ensayos funcionales; (2) el uso como reactivos para bloqueo en la selección de péptidos al azar, por ejemplo, en la búsqueda de nuevas familias de ligandos peptídicos de EPO-R, los péptidos se pueden utilizar para bloquear la recuperación de péptidos EPO de la presente invención; (3) el uso en co-cristalización con EPO-R, por ejemplo, se pueden formar cristales de los péptidos de la presente invención unidos al EPO-R, que permiten la determinación de la estructura del receptor/péptido mediante cristalografía de rayos X; (4) el uso para medir la capacidad de las células precursoras del eritrocito para inducir la síntesis de globina y la síntesis del complejo heme, y para incrementar el número de receptores de ferritina, mediante el inicio de la diferenciación; (5) el uso para mantener la proliferación y crecimiento de las líneas celulares dependientes de EPO, tales como las líneas celulares FDCP-1 -mEPO-R y las líneas celulares TF-1 ; y (6) otras aplicaciones en investigación y diagnóstico en donde el EPO-R preferiblemente está activado o dicha activación se calibra convenientemente en contra de una cantidad conocida de un agonista de EPO-R, y los similares. En incluso otro aspecto de la presente invención, se proveen los métodos de tratamiento y elaboración de un medicamento. Los compuestos peptídicos de la invención se pueden administrar a animales de sangre caliente, incluyendo humanos, para estimular la unión de EPO al EPO-R in vivo. Por lo tanto, la presente Invención abarca los métodos para el tratamiento terapéutico de trastornos asociados con una deficiencia de EPO, dichos métodos comprenden la administración de un péptido de la invención en cantidades adecuadas para estimular el EPO-R y por lo tanto, aliviar los síntomas asociados con una deficiencia de EPO in vivo. Por ejemplo, los péptidos de esta invención encontrarán uso en el tratamiento de insuficiencia renal y/o insuficiencia renal en etapa terminal/diálisis; anemia asociada con el SIDA; anemia asociada con enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, artritis reumatoide e inflamación crónica de intestino) y enfermedad autoinmune; y para refuerzo del conteo de células rojas de la sangre de un paciente antes de la cirugía. Otros estados de enfermedad, trastornos, y estados de irregularidad hematológica que se pueden tratar mediante la administración de los péptidos de esta invención incluyen: beta-talasemia; fibrosis quística; trastornos de la preñez y trastornos menstruales; anemia temprana de premadurez; lesión de médula espinal; vuelo espacial; pérdida aguda de sangre; envejecimiento; y diversos estados de enfermedad neoplástica acompañados por eritropoiesis anormal. En otras modalidades, los compuestos peptídicos de la invención se pueden utilizar para el tratamiento de trastornos que no se caracterizan por una baja o deficiencia en las células rojas de la sangre, por ejemplo como un pretratamiento antes de las transfusiones. Además, la administración de los compuestos de esta invención puede resultar en una disminución en el tiempo desangrado y por lo tanto, encontrará uso en la administración a pacientes antes de la cirugía o para indicaciones en donde se espera que ocurra sangrado. Además, los compuestos de esta invención encontrarán uso en la activación de los megacariocitos.

Puesto que se ha mostrado que EPO tiene un efecto mitogénico y quimiotáctico sobre la células endoteliales vasculares así como un efecto sobre las neuronas colinérgicas centrales [véase, por ejemplo, Amagnostou, et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 5978-5982 y Konishi, et al. (1993) Brain Res. 609: 29-35], los compuestos de esta invención también encontrarán uso para el tratamiento de una variedad de trastornos vasculares, tales como: promoción de la cicatrización de heridas; promoción del crecimiento de vasos sanguíneos coronarios colaterales (tales como aquellos que se pueden presentar después de infarto del miocardio); tratamiento de trauma; y tratamiento de injerto post-vascular. Los compuestos de esta invención también encontrarán uso para el tratamiento de una variedad de trastornos neurológicos, generalmente caracterizados por niveles absolutos bajos de acetil colina o niveles relativamente bajos de acetil colina en comparación con otras sustancias neuroactivas por ejemplo, neurotransmisores.

Composiciones farmacéuticas En incluso otro aspecto de la presente invención, se proveen las composiciones farmacéuticas de los compuestos peptídicos agonistas de EPO-R anteriormente mencionados. Las condiciones aliviadas o moduladas mediante la administración de dichas composiciones incluyen aquéllas anteriormente indicadas. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante rutas de administración orales, parenterales (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), transdermal (ya sea pasivamente o utilizando iontoforesis o electroporación), transmucosal (nasal, vaginal, rectal, o sublingual) o utilizando insertos que se erosionan por procesos biológicos y se podrán formular en formas de dosis adecuadas para cada ruta de administración. En general, comprendidas por la invención se encuentran las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de un péptido agonista de EPO-R, o productos derivados, de la invención junto con diluyentes farmacéuticamente aceptables, conservadores, solubilizantes, emulslficantes, adyuvantes y/o vehículos. Dichas composiciones incluyen diluyentes con diversos contenidos de regulador de pH (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Polisorbato 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ha sido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores (por ejemplo, Thimersol, bencil alcohol) y sustancias formadoras de masa (por ejemplo, lactosa, manitol); incorporación del material dentro de preparaciones particulares de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o dentro de liposomas. El ácido hilaurónico también se puede utilizar. Dichas composiciones pueden influir el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de eliminación in vivo de las presentes proteínas y derivados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorpora en la presente invención como referencia. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida, o se pueden secar en forma en polvo (por ejemplo, liofilizada).

Administración oral Contempladas para uso en la presente invención se encuentran las formas de dosis orales sólidas, las cuales se describen generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) en el capítulo 89, que se incorpora en la presente invención como referencia. Las formas de dosis sólidas incluyen tabletas, cápsulas, pildoras, trociscos o tabletas, sellos, concentrados, polvos, o granulos. También, la encapsulación liposomal o proteinoide se puede utilizar para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, microesferas de proteinoide reportadas en la Patente de E.U.A. No. 4,925,673). Se puede utilizar la encapsulación liposomal y los liposomas se pueden derivar con diversos polímeros (por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,013,556). Una descripción de las formas de dosis sólidas posibles para terapéutica se proporciona por Marshall, K. En: Modern Pharmaceutics editado por G.S. Banker and CT. Rhodes capítulo 10, 1979, incorporado en la presente invención como referencia. En general, la formulación incluirá los péptidos agonistas de EPO-R (o formas químicamente modificadas de los mismos) e ingredientes activos que permitirán la protección en contra del ambiente estomacal, y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

También se contemplan para uso en la presente invención las formas de dosis líquidas para administración orales, incluyendo emulsiones farmacéuticamente aceptable, soluciones, suspensiones, y jarabes, que pueden contener otros componentes incluyendo diluyentes inertes; adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes para suspensión; y agentes edulcorantes, saborizantes, y perfumantes. Los péptidos se pueden modificar químicamente de manera que la administración oral del derivado sea eficiente. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos una porción a la molécula componente misma, en donde dicha porción permite (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la toma en el torrente sanguíneo a partir de estómago o del intestino. También se desea el incremento en la estabilidad general del componente o componentes y el incremento en el tiempo en circulación en el cuerpo. Como se discutió anteriormente, la PEGilación es una modificación química preferida para el uso farmacéutico. Otras porciones que se pueden utilizar incluyen: propilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetil celulosa, dextrán, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poliprolina, poli-1 ,3-dioxolano y poli-1 ,3,6-tioxocano [véase, por ejemplo, Abuchowsld y Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," en Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-lnterscience: New York, NY) pp. 367-383; y Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4: 185-189].

Para formulaciones orales, la ubicación de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno, o el íleo), o el intestino grueso. Un experto en la técnica tiene formulaciones disponibles las cuales no se disolverán en el estómago, pero aun así liberarán el material en el duodeno o en otro lugar en el intestino. Preferiblemente, la liberación evitará los efectos deletéreos del ambiente estomacal, ya sea mediante la protección del péptido (o derivado) o mediante la liberación del péptido (o derivado) más allá del ambiente estomacal, tal como en el intestino. Para asegurar la resistencia gástrica total es esencial un revestimiento impermeable a al menos un pH 5.0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como revestimientos entéricos son celulosa acetato trimelitato (CAT), hidroxipropilmetilcelulosa ftalato (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinil acetato ftalato (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, celulosa acetato ftalato (CAP), Eudragit L, Eudragit S, y Shellac. Estos revestimientos se pueden utilizar como películas mezcladas. Un revestimiento o mezcla de revestimientos también se puede utilizar sobre las tabletas, las cuales no se pretenden para protección en contra del estómago. Estas pueden incluir revestimientos de azúcar, o revestimientos que hacen a la tableta más fácil de tragar. Las cápsulas pueden consistir de una cubierta dura (tal como gelatina) para la administración de un elemento terapéutico seco (por ejemplo en polvo), para formar líquidas se fue utilizar una cubierta de gelatina suave. El material de cubierta de los sellos puede ser un almidón grueso u otro papel comestible. Para las pildoras, tabletas, tabletas moldeadas o triturados de tableta, se pueden utilizar técnicas de formación de masa con humedad. El péptido (o derivado) se puede incluir en la formulación como multipartículas finas en la forma de granulos o concentrados de un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para administración de cápsulas podría ser como un polvo, elementos ligeramente comprimidos, o incluso, tabletas. Estos elementos terapéuticos se podrían preparar mediante compresión. También se pueden incluir colorantes y/o agentes saborizantes.

Por ejemplo, el péptido (o derivado) se puede formular (tal como mediante encapsulación en liposoma o en microesfera) y luego se puede contener adicionalmente dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene agentes colorantes y agentes saborizantes. Uno puede diluir o incrementar el volumen del péptido (o derivado) con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-Iactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. Ciertas sales inorgánicas también se pueden utilizar como llenadores incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell. Los desintegrantes se pueden incluir en la formulación del elemento terapéutico dentro de una forma de dosis sólida. Los materiales utilizados como desintegrantes incluyen pero no se limitan a almidón, incluyendo el desintegrante comercial basado en almidón, Explotab. Se pueden utilizar glicolato de almidón sódico, Amberlita, carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cascara de naranja, carboximetil celulosa acida, esponja natural y bentonita. Los desintegrantes también pueden ser resinas insolubles de intercambio catiónico. Las gomas en polvo se pueden utilizar como desintegrantes y como aglutinantes, y pueden incluir gomas en polvo tales como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio también son útiles como desintegrantes. Los aglutinantes también se pueden utilizar para mantener el agente peptídico (o derivado) junto para formar una tableta dura e incluyen materiales a partir de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metil celulosa (MC), etil celulosa (EC) y carboximetil celulosa (CMC). Se puede utilizar tanto la polivinil pirrolidona (PVP) como la hidroxipropilmetil celulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el péptido (o derivado). Un agente antifricción se puede incluir en la formulación del péptido (o derivado) para prevenir la adhesión durante el proceso de formulación. Los lubricantes se pueden utilizar como una capa entre el péptido (o derivado) y la pared del troquel, y estos pueden incluir pero no se limitan a; ácido esteárico incluyendo sus sales de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites y ceras vegetales. Los lubricantes solubles también se pueden utilizar tales como lauril sulfato de sodio, lauril sulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000. Se pueden añadirlos deslizantes que pueden mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación y ayudar al rearreglo durante la compresión. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénico y silicoaluminato hidratado. Para ayudar a la disolución del péptido (o derivado) dentro del ambiente acuoso se puede añadir un agente tensioactivo como un agente humectante. Los agentes tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como lauril sulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil sódico y sulfonato de dioctil sódico. Los detergentes catiónico se pueden utilizar y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían ser incluidos en la formulación como agentes tensioactivos son lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, aceite de ricino polioxietileno hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearateglicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metil celulosa y carboximetil celulosa. Estos agentes tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de la proteína o derivado ya sea solos o como una mezcla en diferentes proporciones. Los aditivos que mejoran potencialmente la toma del péptido (o derivado) son por ejemplo los ácidos grasos de ácido oléico, ácido linoléico y ácido linolénico.

Las formulaciones orales de liberación controlada pueden ser deseables. El péptido (o derivado) se podría incorporar dentro de una matriz inerte que permite de liberación ya sea mediante difusión o mediante mecanismos de lixiviación, por ejemplo, gomas. Las matrices de degeneración lenta también se pueden incorporar dentro de la formulación. Algunos revestimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retrasada. Otra forma de liberación controlada es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), por ejemplo el fármaco se encierra en una membrana semipermeable que permite que el agua entre y empuja el fármaco fuera a través de una abertura pequeña particular debido a los efectos osmóticos. Otros revestimientos se pueden utilizar para la formulación. Estos incluyen una variedad de azúcares que podrían ser aplicados en un recipiente para revestimiento. El péptido (o derivado) también se podría proporcionar en una tableta revestida con película y los materiales utilizados en este caso se dividen en 2 grupos. El primero son los materiales no entéricos e incluyen metil celulosa, etil celulosa, hidroxietil celulosa, metilhidroxi-etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil-metil celulosa, carboxi-metil celulosa sódica, providona y los polietilenglicoles. El segundo grupo consiste de los materiales entéricos que comúnmente son esteres del ácido ftálico. Se puede utilizar una mezcla de materiales para proveer el revestimiento de película óptimo. El revestimiento de película se puede llevar acabo en un revestidor o en una cama fluida o mediante revestimiento por compresión.

Administración parenteral Las preparaciones de conformidad con esta invención para administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, o emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos o vehículos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Dichas formas de dosis también paren contener adyuvantes tales como agentes conservadores, humectantes, emulsificantes, y dispersantes. Esto se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro que retiene las bacterias, mediante incorporación de agentes esterilizantes dentro de las composiciones, mediante irradiación de las composiciones, o mediante calentamiento de las composiciones. Estas también se pueden elaborar utilizando agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril, inmediatamente antes de su uso.

Administración rectal o vaginal Las composiciones para administración rectal o vaginal preferiblemente son supositorios que pueden contener, además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de cocoa o una cera para supositorio. Las composiciones para administración nasal o sublingual también se preparan con excipientes estándares bien conocidos en la técnica.

Administración pulmonar También se contempla en la presente invención la administración pulmonar de los péptidos agonistas de EPO-R (o derivados de los mismos). El péptido (o derivado) se administra a los pulmones de un mamífero mientras se inhala y atraviesa a través del revestimiento epitelial del pulmón hacia el torrente sanguíneo [véase, por ejemplo, Adjei, et al. (1990) Pharmaceutical Research 7: 565-569; Adjei, et al. (1990) Int. J. Pharmaceutics 63: 135-144 (acetato de leuprolida); Braquet, et al. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13(sup5): 143-146 (endotelina-1); Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. lll, pp. 206-212 (a1 -antitripsina); Smith, et al. (1989) J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (a-1 -proteinasa); Oswein, et al. (1990) "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (hormona de crecimiento recombinante de humano); Debs, et al. (1988) J. Immunol. 140: 3482-3488 (interferón-? y factor de necrosis tumoral a); y Patente de E.U.A. No. 5,284,656 a Platz, et al. (factor estimulante de la colonia del granulocito). Un método y composición para la administración pulmonar de fármacos para el efecto sistémico se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,451 ,569 a Wong, et al. Contemplado para uso en la práctica de esta invención se encuentra un amplio intervalo de dispositivos mecánicos diseñados para administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores en polvo, todos los cuales son familiares para aquellos expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); el nebulizador Acom II (Marquest Medical Products, Englewood, CO); el inhalador de dosis medida Ventolín (Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC); y el inhalador en polvo Spinhaler (Fisons Corp., Bedford, MA). Todos esos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispersión del péptido (o derivado). Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede emplear el uso de un material propelente apropiado, además de los diluyentes usuales, adyuvantes y/o vehículos útiles en terapia. También, se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, u otros tipos de vehículos. Los péptidos químicamente modificados también se pueden preparar en diferentes formulaciones dependiendo del tipo de modificación química o del tipo de dispositivo empleado. Las formulaciones adecuadas para uso con un nebulizador, ya sea a chorro o ultrasónico, típicamente comprenderán péptido (o derivado) disuelto en agua a una concentración de aproximadamente OJ a 25 mg de la proteína biológicamente activa per mL de solución. La formulación también puede incluir un regulador de pH y un azúcar simple (por ejemplo, para estabilización de la proteína y regulación de la presión osmótica). La formulación en nebulizador también puede contener un agente tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie del péptido (o derivado) ocasionada por la atomización de la solución durante la formación del aerosol. Las formulaciones para uso con un dispositivo inhalador de dosis medida generalmente comprenderán un polvo finamente dividido que contiene el péptido (o derivado) suspendido en un propelente con la ayuda de un agente tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tales como un clorofluorocarbono, un hldroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarbono, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, y 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitano y lecitina de soya. El ácido oléico también puede ser útil como un agente tensioactivo. Las formulaciones para dispersión a partir de un dispositivo inhalador en polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el péptido (o derivado) y también pueden incluir un agente para formación de masa, tales como lactosa, sorbitol, sacarosa, o manitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo a partir del dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en peso de la formulación. El péptido (o derivado) se debe preparar de manera más ventajosa en forma de partícula con un tamaño promedio de partícula de menos de 10 mm (o mieras), más preferiblemente de 0.5 a 5 mm, para una administración más efectiva al pulmón distal.

Administración nasal La administración nasal de los péptidos agonistas de EPO-R (o derivados) también se contempla. La administración nasal permite el paso del péptido al torrente sanguíneo directamente después de la administración del producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad de una depositación del producto en el pulmón. Las formulaciones para administración nasal incluyen aquellas con dextrán o ciclodextrán. Otros potenciadores de la penetración utilizados para facilitar la administración nasal también se contemplan para uso con los péptidos de la presente invención (tal como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2004056314, presentada el 17 de diciembre de 2003, incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad).

Dosis Para todos los compuestos peptídicos, como los estudios adicionales han llevado a cabo, la información surgirá con respecto a los niveles de dosis apropiados para el tratamiento de diversas condiciones en diversos pacientes, y el trabajador experto en la técnica, considerando el contexto terapéutico, edad, y salud general del recipiente, será capaz de averiguar una dosificación adecuada. La dosis seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la ruta de administración, y de la duración deseada del tratamiento. Generalmente los niveles de dosis de 0.001 a 10 mg/kg de peso corporal diariamente se administran a los mamíferos. Generalmente, para inyección intravenosa o para dosis por infusión ésta puede ser menor. El programa de dosificación puede variar, dependiendo de la vida media en circulación, y de la formulación utilizada. Los péptidos de la presente invención (o sus derivados) se pueden administrar en conjunción con uno o más ingredientes activos adicionales o composiciones farmacéuticas.

EJEMPLOS La presente invención se describe a continuación por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de estos y otros ejemplos en cualquier lugar en la especificación solamente es ilustrativa, y no se pretende que limite el alcance y significado de la invención o de cualquier forma ejemplificar. De manera similar, la invención no se limita a cualesquiera modalidades preferidas particulares descritas en la presente invención. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invención pueden ser evidentes a aquellos expertos en la técnica después de la lectura de esta especificación, y se puedan realizar sin apartarse de su espíritu y alcance. Por lo tanto la invención se limita solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance total de los equivalentes con respecto a los cuales se titulan las reivindicaciones. Los ejemplos listados describen experimentos por medio de los cuales un experto en la técnica puede averiguar la actividad biológica de los péptidos de la presente invención.

EJEMPLO 1 Síntesis de los péptidos agonistas de EPO-R Este ejemplo describe las modalidades preferidas, no limitantes de métodos por medio de los cuales los péptidos abarcados por la presente invención se pueden sintetizar. Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos, los cuales han sido previamente descritos para la síntesis de las porciones del péptido de EPO (véase, por ejemplo, en PCT/US04/14886, presentada el 12 de mayo de 2004) para preparar los compuestos de esta invención. Se proveen las técnicas en fase sólida para la síntesis tanto de monómeros peptídicos como de dímeros peptídicos de la invención. También se describen las técnicas ejemplares para la unión del enlazador y de las porciones PEG a un compuesto peptídico de esta invención, así como métodos para la oxidación de los compuestos peptídicos, por ejemplo, formando enlaces disulfuro intramoleculares. Finalmente, este ejemplo también provee una técnica para purificar los compuestos peptídicos de que se sintetizan de conformidad con estos métodos. 1. Síntesis del monómero peptídico Varios monómeros peptídicos de la invención se pueden sintetizar, como se describe en la presente invención, utilizando la técnica de síntesis en fase sólida de Merrifield [véase, Stewart y Young. Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edición (Pierce Chemical, Rockford, IL) 1984] en un aparato automatizado Applied Biosystems 433 A. La resina PAL (Milligen/Biosearch) se utilizan, la cual es poliestireno entrecruzado con ácido 5-(4'-Fmoc-aminomet¡l-3,5'-d¡metox¡fenox¡)valérico. El uso de la resina PAL resulta en un grupo funcional de amida carboxilo terminal después de la escisión del péptido a partir de la resina. La protección de la amina primaria en los aminoácidos se logra con Fmoc, y los grupos de protección a la cadena lateral son t-butilo para hidroxilos de serina, treonina, y tirosina; tritilo para amidas de glutamina y asparagina; Trt o Acm para cisteína; y PMC (2,2,5,7,8-pentametilcroman sulfonato) para el grupo de arginina guanidino. Cada acoplamiento se lleva a cabo ya sea por 1 hora o 2 horas con BOP (hexafluorofosfato de benzotriazolil N-oxtrisdimetilaminofosfonio) y HOBt (1-hidroxibenzotriazol). Para la síntesis de los péptidos con un carboxi terminal amidado, el péptido completamente ensamblado se escinde con una mezcla de 90% de ácido trifluoroacético, 5% de etanoditiol, y 5% de agua, inicialmente a 4°C y gradualmente incrementando a temperatura ambiente por 1.5 horas. El producto desprotegido se filtra a partir de la resina y se precipita con dietil éter. Después de un secado extensivo el producto se purifica mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa C18 con un gradiente de acetonitrilo/agua en OJ % de ácido trifluoroacético. 2. Síntesis del dímero peptídico Diversos dímeros peptídicos de la invención se sintetizan directamente sobre un enlazador de lisina en una variación de la técnica en fase sólida. Para la síntesis simultánea de las dos cadenas peptídicas, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH se acopla a una resina PAL (Milligen/Biosearch), proveyendo así un residuo inicial de lisina para servir como el enlazador entre las dos cadenas a ser sintetizadas. Los grupos protectores Fmoc se remueven con una base suave (20% de piperidina en DMF), y las cadenas peptídicas se sintetizan utilizando los grupos amino libres resultantes como puntos de inicio. La síntesis de la cadena peptídica se lleva a cabo utilizando la técnica de síntesis en fase sólida anteriormente descrita. Trt se utiliza para proteger todos los residuos de cisteína. Después de la desprotección del dímero, la escisión a partir de la resina, y la purificación, se lleva a cabo la oxidación de los residuos de cisteína mediante la incubación del dímero desprotegido en 100% de DMSO por 2-3 días de 5°C a 25°C. Esta reacción de oxidación puede producir predominantemente (>75%) dímeros con dos enlaces disulfuro intramoleculares. Para la síntesis secuencial de las dos cadenas peptídicas, Fmoc-Lys(Alloc)-OH se acopla a una resina PAL (Milligen/Biosearch), proveyendo así un residuo inicial de lisina para servir como el enlazador entre las dos cadenas a ser sintetizadas. El grupo protector Fmoc se remueve con una base suave (20% de piperidina en DMF). La primera cadena peptídica se sintetiza entonces utilizando el grupo amino libre resultante como un punto de inicio. La síntesis peptídicas se lleva a cabo utilizando la técnica en fase sólida anteriormente descrita. Los dos residuos de cisteína de la primera cadena se protegen con Trt. Después de la síntesis de la primera cadena peptídica, el grupo Alloc se remueve a partir del enlazador de lisina unido al soporte con Pd[P(C6H5)3] , 4-metil morfolina, y cloroformo. La segunda cadena peptídica se sintetiza entonces en este segundo grupo amino libre. Los dos residuos de cisteína de la segunda cadena se protegen con Acm. Se forma un enlace disulfuro intramolecular en la primera cadena peptídica mediante la remoción de los grupos protectores Trt utilizando ácido trifluoroacético, seguido por oxidación mediante agitación en 20% de DMSO durante toda la noche. Un enlace disulfuro intramolecular se forma entonces en la segunda cadena peptídica mediante la remoción simultánea de los grupos protectores Acm y la oxidación de los residuos de cisteína desprotegidos utilizando yodo, metanol, y trifluoroacetato de talio. 3. Unión de los espaciadores En donde el espaciador es un aminoácido (por ejemplo, glicina o lisina), el espaciador se incorpora dentro del péptido durante la sínfisis del péptido en fase sólida. En este caso, el aminoácido espaciador se acopla a la resina PAL, y su grupo amino libre o de servir como la base para la unión de otro aminoácido espaciador, o del enlazador de lisina. Después de la unión del enlazador de lisina, los dímeros peptídicos se sintetizan como se describió anteriormente. 4. Oxidación de los péptidos para formar enlaces disulfuro intramoleculares El dímero peptídico se disolvió en 20% de DMSO/agua (1 mg de péptido en peso seco/mL) y se dejó reposar a temperatura ambiente por 36 horas. El péptido se purificó mediante la carga de la mezcla de reacción sobre una columna CLAR C18 (Waters Delta-Pak C18, tamaño de partícula 15 mieras, tamaño de poro de 300 angstroms, 40 mm x 200 mm de longitud), seguido por un gradiente lineal de ACN/agua/0.01 % de TFA a partir de 5 a 95% de ACN durante 40 minutos. La liofilización de las fracciones que contenían el péptido deseado produjo el producto como un sólido blanco esponjoso. 5. PEGilación de péptidos La PEGilación de los péptidos de la invención se puede llevar a cabo utilizando varias técnicas diferentes. PEGilación de un grupo -NH? terminal: El dímero peptídico se mezcló con 1.5 equivalentes (base molar) de especies PEG activadas (mPEG-NPC a partir de NOF Corp. Japón) en DMF seco para producir una solución clara. Después de 5 minutos se añadieron 4 equivalentes de DIEA a la solución anteriormente mencionada. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 14 horas, seguido por purificación con CLAR en fase reversa C18. La estructura del péptido PEGilado se confirmó mediante análisis de masa MALDI. El péptido purificado también se sometió a una purificación vía cromatografía de intercambio de iones catiónicos como se describe a continuación. DiPEGilación de los N-terminales de un dímero peptídico: El dímero peptídico se mezcló con 2.5 equivalentes (base molar) de especies PEG activadas (mPEG-NPC a partir de NOF Corp. Japón) en DMF seco para obtener una solución clara. Después de 5 minutos se añadieron 4 equivalentes de DIEA a la solución anteriormente mencionada. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 14 horas, seguido por purificación con CLAR en fase reversa C18. El péptido purificado también se sometió a purificación vía cromatografía de intercambio de iones catiónicos como se describe a continuación.

Dimerización peptídica vía PEGilación de los N-terminales: El péptido (2.5 equivalentes) y PEG-(SPA-NHS)2 (1 equivalente a partir de Shearwater Corp, EUA.) se disolvió en DMF seco a 0.25 M para obtener una solución clara. Después de 5 minutos se añadieron 10 equivalentes de DIEA a la solución anteriormente mencionada. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por purificación con CLAR en fase reversa C19. El péptido purificado también se sometió purificación vía cromatografía de intercambio de iones catiónicos como se describe a continuación. Dimerización peptídica vía PEGilación de los C-terminales: El péptido (2.5 equivalentes) y PEG-(SPA-NHS)2 (1 equivalente a partir de Shearwater Corp, EUA.) se disolvió en DMF seco a 0.25 M para obtener una solución clara. Después de 5 minutos se añadieron 10 equivalentes de DIEA a la solución anteriormente mencionada. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por purificación con CLAR en fase reversa C18. El péptido purificado también se sometió a purificación vía cromatografía de intercambio de iones catiónicos como se describe a continuación. 6. Purificación de péptidos por intercambio iónico. Varios soportes para intercambio se pueden examinar por su capacidad para separar el conjugado anteriormente mencionado del péptido- PEG a partir de PEG no reaccionado (o hidrolizado), además de su capacidad para retener a los dímeros peptídicos iniciales. La resina de intercambio iónico (2-3 g) se carga sobre una columna 1 cm, seguido por conversión a la forma sódica (0.2 N de NaOH cargado sobre una columna hasta que el eluyente fue de pH 14, casi 5 volúmenes de columna), y luego hacia la forma de hidrógeno (eluida ya sea con OJ N de HCl o OJ M de HOAc hasta que el pH de la carga coincidió con el eluido, casi 5 volúmenes de columna), seguido por lavado con 25% de ACN/agua hasta pH 6. Ya sea el péptido antes de la conjugación o el conjugado de péptido-PEG se disuelve en 25% de ACN/agua (10 mg/mL) y el pH se ajusta a <3 con TFA, luego se carga en la columna. Después del lavado con 2-3 volúmenes de columna de 25% de ACN/agua y la recolección de fracciones de 5 mL, el péptido se liberó a partir de la columna mediante la elución con OJ M de NH OAc en 25% de ACN/agua, de nuevo se recolectaron fracciones de 5 mL. El análisis vía CLAR puede revelar cuáles fracciones contienen el péptido deseado. El análisis con un detector por dispersión de luz evaporativa (ELSD -por sus siglas en inglés) puede indicar que cuando el péptido se retiene en la columna y se eluye con la solución de NH4OAc (generalmente entre las fracciones 4 y 10), no se observa ningún PEG no conjugado como un contaminante. Cuando el péptido eluye en el regulador de pH para lavado inicial (generalmente las primeras 2 fracciones), no se observa la separación del PEG-conjugado deseado y exceso de PEG. Las siguientes columnas pueden retener posiblemente de manera exitosa tanto al péptido como al conjugado de péptido-PEG, y purificar sucesivamente el conjugado de péptido-PEG a partir del péptido no conjugado: Resinas de intercambio iónico EJEMPLO 2 Ensayos de actividad in vitro Este ejemplo describe ciertos ensayos in vitro que son útiles para la evaluación de la actividad y potencia de péptidos abarcados por esta invención, por ejemplo, como agonistas de EPO-R. En particular, los resultados obtenidos a partir de los ensayos tales como aquellos descritos en la presente invención describen si un compuesto peptídico se une a EPO-R y activa la señalización de EPO-R. Los ensayos también se pueden utilizar para comparar la eficiencia de unión y actividad biológica de un compuesto, por ejemplo, con respecto a otro, compuestos miméticos a EPO conocidos. Los monómeros peptídicos agonistas de EPO-R y dímeros evaluados en estos ensayos típicamente se preparan de conformidad con los métodos tales como aquellos descritos en el ejemplo 1. La potencia de estos monómeros peptídicos y dímeros se evalúa entonces utilizando una serie de ensayos de actividad in vitro, incluyendo: un ensayo con reportero, un ensayo de proliferación, un ensayo de unión competitiva, y un ensayo con C/BFU-e. Estos cuatro ensayos se describen con mayor detalle a continuación. 1. Ensavo con reportero Este ensayo se basa en una célula reportera derivada de la línea celular pre-B de murino, Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux. Esta línea celular reportera expresa un receptor quimérico que comprende la porción extraceiular del receptor EPO de humano con respecto a la porción intracelular del receptor GCSF de humano. Esta línea celular se transfecta adicionalmente con una construcción de un gen reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La activación de este receptor quimérico a través de la adición del agente eritropoiético resulta en la expresión del gen reportero de luciferasa, y por lo tanto la producción de luz después de la adición del sustrato de la luciferasa luciferina. Por lo tanto, el nivel de activación de EPO-R en dichas células se puede cuantificar vía la medición de la actividad de la luciferasa. Las células Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux se cultivan en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS; Hyclone), 10% de sobrenadante de WEHI-3 (el sobrenadante a partir de un cultivo de células WEHI-3, ATCC # TIB-68), y penicilina/estreptomicina. Aproximadamente 18 horas antes del ensayo, las células se sometieron a ayuno mediante la transferencia de éstas hacia medio DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS y 0.1 % de sobrenadante de WEHI-3. Al día del ensayo, las células se lavaron una vez con medio DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS (sin sobrenadante de WEHI-3), luego 1 X 106 células/mL se cultivaron en la presencia de una concentración conocida dei péptido prueba, o con EPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como un control positivo, en medio DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS (sin sobrenadante de WEHI-3). Las diluciones seriales del péptido prueba se probaron concurrentemente en este ensayo. Los platos de ensayo se incubaron por 4 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de C02, después de lo cual se añadió luciferina (Steady-Glo; Promega, Madison, Wl) a cada pozo. Después de una incubación de 5 minutos, se midió la emisión de luz en un luminómetro de mesa Packard (Packard Instrument Co., Downers Grove, 111.). Las cuentas de luz se graficaron en relación con la concentración del péptido prueba y se analizaron utilizando el software Graph Pad. La concentración del péptido prueba que resulta en una emisión de luz media máxima se registró como la EC50. 2. Ensavo de proliferación Este ensayo se basa en una línea celular pre-B de murino, Baf3, transfectada para expresar el EPO-R de humano. La proliferación de la línea celular resultante, BaF3/Ga14/Elk/EPOR, es dependiente de la activación de EPO-R. El grado de proliferación celular se cuantifica utilizando MTT, en donde la señal en el ensayo con MTT es proporcional al número de células viables. Las células BaF3/Ga14/EIk/EPOR se cultivan en botellas para agitación en medio DMEM/F12 (Gibco) suplementado con 10% de FBS (Hyclone) y 2% de sobrenadante de WEHI-3 (ATCC # TB-68). Las células cultivadas se dejaron en ayuno durante toda la noche, en una botella para agitación a una densidad celular de1x106 células/ml, en medio DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS y 0.1 % de sobrenadante de WEHI-3. Las células mantenidas en ayuno se lavaron entonces dos meses con PBS de Dulbecco (Gibco), y se resuspendieron a una densidad de 1x106 células/ml en DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS (sin sobrenadante de WEHI-3). Luego se sembraron alícuotas de 50 uL (~50,000 células) de la suspensión celular, por triplicado, en platos de ensayo de 96 pozos. Se añadieron alícuotas de 50 uL de las diluciones en serie de los péptidos prueba miméticos de EPO, o 50 uL de EPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) o Aranesp™ (darbepoeitin alfa, un agonista de ERO-R comercialmente disponible partir de Amgen) en medio DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS (sin sobrenadante I de WEHI-3) a los platos para ensayo de 96 pozos (volumen final del pozo de 100 uL). Por ejemplo, 12 diferentes diluciones se pueden evaluar en donde la concentración final del péptido prueba (o péptido EPO control) tiene un intervalo de 810 pM a 0.0045 pM. Las células sembradas cultivaron entonces por 48 horas a 37°C. A continuación, se añadieron 10 uL de MTT (Roche Diagnostics) a cada pozo del plato de cultivo, y luego se dejaron incubar por 4 horas. La reacción se detuvo entonces mediante la adición de 10% de SDS + 0.01 N de HCl. Los platos se incubaron entonces durante toda la noche 37°C. Se midió la absorbancia de cada pozo a una longitud de onda de 595 nm mediante espectrofotometría. Las gráficas de las lecturas de absorbancia contra la concentración del péptido prueba se construyeron y la ECdO se calculó utilizando el software Graph Pad. La concentración del péptido prueba que resulta en una absorbancia media máxima se registró como la ECdO. 3. Ensavo de unión competitiva Los cálculos de unión competitiva se realizaron utilizando un ensayo en el cual se generó una señal luminosa como una función de la proximidad de los dos lechos: un lecho donante de estreptavidina que contiene un péptido trazador de unión a EPO-R y un lecho aceptor al cual se une EPO-R. La luz se genera mediante la transferencia de energía no radiactiva, durante el cual se libera un singulete de oxígeno a partir de un primer lecho después de la iluminación, y el contacto con el singulete de oxígeno liberado ocasiona que el segundo lecho emita luz. Estas series de lechos están comercialmente disponibles (Packard). La proximidad del lecho se genera mediante la unión del péptido trazador de unión a EPO-R con respecto a EPO-R. Un péptido prueba que compite con el péptido trazador de unión a EPO-R para la unión a EPO-R prevendrá esta unión, ocasionando una disminución en la emisión de la luz.

Con más detalle el método es como sigue: Se añaden 4 uL de diluciones seriales del péptido agonista prueba EPO-R, o de los controles positivos o negativos, a los pozos de una placa de 384 pozos. Posteriormente, se añaden 2 uL/pozo del cóctel de receptor/lecho. El cóctel de receptor lecho consiste de: 15 uL de 5 mg/ml de lechos donantes de estreptavidina (Packard), 15 uL de d mg/ml de anticuerpo monoclonal ab179 (este anticuerpo reconoce la porción de la proteína fosfatasa alcalina de placenta de humano contenida en el EPO-R recombinante), lechos aceptores revestidos con proteínaA (la proteína A se unirá al anticuerpo ab179; Packard), 112.5 uL de una dilución 1 :6.6 de EPO-R recombinante (producido en células de ovario de hámster chino como una proteína difusión a una porción de la proteína fosfatasa alcalina de placenta de humano que contiene el epítope blanco de ab179) y 607.5 uL de regulador de pH Alphaquest (40 mM de HEPES, pH 7.4; 1 mM de MgCI2; 0.1% de BSA, 0.05% de Tween 20). Cubrir para mezclar. Añadir 2 uL/pozo de un péptido trazador de unión a EPO-R biotinilado. Centrifugar 1 minuto para mezclar. Sellar la placa con Packard Top Seal y envolver en papel aluminio. Incubar durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de 18 horas leer la emisión de luz utilizando un lector AlphaQuest (Packard). Graficar la emisión de luz vs la concentración del péptido y analizar con Graph Pad o Excel. La concentración del péptido prueba que resulta en una disminución del 50% en la emisión de luz, en relación con aquello observada sin el péptido prueba, se registra como la IC50. 4. Ensayo con C/BFU-e La señalización de EPO-R estimula la diferenciación de las células madre de médula ósea hacia precursores de célula roja de la sangre en proliferación. Este ensayo mide la capacidad de los péptidos prueba para estimular la proliferación y diferenciación de los precursores de célula roja de las sangre a partir de células madre primarias pluripotenciales de la médula ósea de humano. Para este ensayo, se realizaron diluciones seriales del péptido prueba en medio IMDM (Gibco) suplementado con 10% de FBS (Hyclone). Estas diluciones seriales, o péptido EPO control positivo, se añadieron entonces a la metilcelulosa para producir un volumen final de 1.5 mL. La mezcla de metilcelulosa y péptido se sometió a vórtex de manera extensiva. Las alícuotas (100,000 células/mL) de células CD34+ derivadas de médula ósea de humano (Poietics/Cambrex) se descongelaron. Las células descongeladas se añadieron lentamente a 0J mL de 1 mg/ml de DNAsa (células madre) en un tubo de 50 mL. A continuación, se añadieron 40-50 mL de medio MDM suavemente a las células: el medio se añadió gota a gota a lo largo del lado del tubo de 50 mL por los primeros 10 mL, y luego el volumen remanente del medio se dispensó lentamente a lo largo del lado del tubo. Las células se centrifugaron a 900 rpm por 20 minutos, y el medio se removió cuidadosamente mediante aspiración suave. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio IMDM y la densidad celular por mL se contó en un portaobjetos hemocitómetro (alícuota de 10 uL de la suspensión celular en el portaobjetos, y la densidad celular es el promedio del conteo X 10,000 células/ml). Las células se diluyeron entonces el medio IMDM hasta una densidad de 1 d,000 células/mL. A 100 uL de células diluidas se les añadió entonces 1.5 mL de la muestra de metil celulosa más el péptido (la concentración final de células en el medio de ensayo es de 1000 células/ mL), y la mezcla se sometió a vórtex. Se permitió que las burbujas en la mezcla desaparecieran, y luego se aspiró 1 mL utilizando una aguja de punta roma. Se añadieron 0.25 mL de la mezcla aspirada para cada muestra en cada uno de los 4 pozos de una placa de 24 pozos (marca Falcon). Se incubaron las mezclas sembradas a 37°C bajo 5% de C02 en una incubadora húmeda por 14 días. La evaluación para la presencia de colonias eritroides utilizando un microscopio de fases (objetivo dX-10X, amplificación final de 100X). La concentración del péptido prueba a la cual el número de colonias formadas es 90% con respecto al máximo, en relación con aquella observada para el control positivo de EPO, se registra como la EC90. d. Ensavo de unión competitiva por radioliqando Un ensayo alternativo de unión competitiva por radioligando también se puede utilizar para medir los valores ICdO para péptidos de la presente invención. Este ensayo mide la unión de 125l-EPO a EPOr. El ensayo se puede llevar a cabo de conformidad con el siguiente protocolo ejemplar: A. Materiales B. Determinación de la concentración apropiada del receptor. Un vial de dO ug del dominio extracelular de EPOR recombinante liofilizado fusionado a la porción Fc de la lgG1 de humano se reconstituyó en 1 mL de regulador de pH para ensayo. Para determinar la cantidad correcta del receptor para utilizar en el ensayo, se combinaron 100 uL de las diluciones seriales de esta preparación del receptor con aproximadamente 20,000 cpm en 200 uL de eritropoietina recombinante de humano iodinada ( 25l-EPO) en tubos prueba de polipropileno de 12 x 7d mm. Los tubos se taparon y se mezclaron suavemente a 4°C durante toda la noche en un agitador rotatorio LabQuake. Al siguiente día, se añadieron dO uL de una pasta aguada al d0% de Proteína-G Sepharose a cada tubo. Luego los tubos se incubaron por 2 horas a 4°C, se mezclaron suavemente. Luego los tubos se centrifugaron por 1 d minutos a 4000 RPM (3297 x G) para concentrar la proteína-G sepharose. Los sobrenadante se removieron cuidadosamente y se desecharon. Después de lavado por 3 veces con 1 mL de regulador de pH para ensayo a 4°C, los concentrados se contaron en un contador gamma Wallac Wizard. Los resultados se analizaron entonces y se calculó la dilución requerida para alcanzar 60% del valor máximo de unión.

C. Determinación de la ICdO para el péptido Para determinar la ICdO de un péptido de la presente invención, se combinaron 100 uL de las diluciones seriales del péptido con 100 uL del receptor de eritropoietina recombinante (100 pg/tubo) en tubos prueba de polipropileno de 12 x 7d mm. Luego se añadieron 100 uL de eritropoietina recombinante de humano iodinada (125l-EPO) a cada tubo y los tubos se taparon y se mezclaron suavemente a 4°C durante toda la noche.

El siguiente día, se cuantificó la unión de 125l-EPO como se describió anteriormente. Los resultados se analizaron y se calculó el valor ICdO utilizando Graphpad Prism versión 4.0, a partir del software GraphPad , Inc. (San Diego, CA) el ensayo se repitió preferiblemente 2 o más veces para cada péptido cuyo valor ICdO se midió por este procedimiento, para un total de 3 réplicas de las determinaciones de ICdO.

EJEMPLO 3 Ensayos de actividad in vivo Este ejemplo describe ciertos ensayos in vivo que son útiles para evaluar la actividad y potencia de los péptidos abarcados por esta invención, por ejemplo, como agonistas de EPO-R. En particular, los resultados obtenidos a partir de los ensayos tales como aquellos descritos en la presente invención demuestran si un compuesto peptídico se une a EPO-R y activa la señalización de EPO-R. Estos ensayos también se pueden utilizar para comparar la eficiencia de unión y actividad biológica de un compuesto, por ejemplo, con respecto a otro, compuestos miméticos de EPO conocidos. Este ejemplo describe diversos ensayos in vivo que son útiles en la evaluación de la actividad y potencia de los péptidos agonistas de EPO-R de la invención. Los monómeros peptídicos agonistas de EPO-R y dímeros evaluados en estos ensayos típicamente se preparan de conformidad con los métodos descritos en el ejemplo 1. La actividad ¡n vivo de estos monómeros peptídicos y dímeros se evaluó entonces utilizando una serie de ensayos, incluyendo un bioensayo de ratón exhipóxico policitémico y un ensayo de reticulocito. Estos dos ensayos se describen con mayor detalle a continuación. 1. Bioensayo de ratón exhipóxico policitémico Los péptidos prueba se ensayaron para actividad in vivo en el bioensayo de ratón exhipóxico policitémico adaptado para el método descrito por Cotes y Bangham (1961), Nature 191 : 106d-1067. Este ensayo examina la capacidad de un péptido prueba para funcionar como un mimético de EPO: por ejemplo, para activar a EPO-R e inducir la síntesis de nuevas células rojas de la sangre. La síntesis de células rojas de la sangre se cuantifica basándose en la incorporación de hierro radiomarcado dentro de la hemoglobina de las células rojas de la sangre sintetizadas. Los ratones BDF1 se dejaron aclimatar a condiciones ambientales por 7-10 días. Los pesos corporales se determinaron para todos los animales, y no se utilizaron los animales con bajo peso (<1d gramos). Los ratones se sometieron a ciclos de acondicionamiento sucesivos en una cámara hipobárica por un total de 14 días. Cada ciclo de 24 horas consiste de 18 horas a 0.40±0.02% de presión atmosférica y 6 horas a presión ambiental. Después del acondicionamiento los ratones se mantuvieron a presión ambiental por 72 horas adicionales antes de la dosificación. Los péptidos prueba, o EPO estándares recombinantes de humano, se diluyeron en PBS + 0.1 % de BSA como vehículo (PBS/BSA). Las soluciones de almacenamiento del monómero peptídico se solubilizaron inicialmente en dimetil sulfóxido (DMSO). Los grupos de control negativo incluyen un grupo de ratones inyectados con con PBS/BSA solo, y un grupo inyectado con 1 % de DMSO. Cada grupo de dosis contenía 10 ratones. Los ratones se inyectaron subcutáneamente (por la nuca) con O.d mL de la muestra apropiada. Cuarenta y ocho horas después de la inyección de la muestra, a los ratones se les administró una inyección intraperitoneal de 0.2 mi de Fe59 (Dupont, NEN), para una dosis de aproximadamente 0.7d uCuri es/ratón. Los pesos corporales de los ratones se determinaron 24 horasr después de la administración de Fe59, y los ratones se sacrificaron 48 horas después de la administración de Fe59. La sangre se recolectó a partir de cada animal mediante punción cardiaca y se determinaron los hematocritos (la heparina se utilizó como el anticoagulante). Cada muestra de sangre (0.2 ml) se analizó para incorporación de Fe59 utilizando un contador gamma Packard. Los ratones que no respondieron (por ejemplo, aquellos ratones con incorporación radioactiva menor que el grupo control negativo) se eliminaron de la serie de datos apropiados. Los ratones que tuvieron valores de hematocrito menores de 63% en comparación con el grupo control negativo también fueron eliminados. Los resultados se derivan a partir de series de 10 animales para cada dosis experimental. Se calculó la cantidad promedio de radiactividad incorporada [cuentas por minuto (CPM)] en las muestras de sangre a partir de cada grupo. 2. Ensavo de reticulocito Los ratones BDFI normales se dosificaron (O.d mL, inyectada subcutáneamente) en tres días consecutivos ya sea con EPO control o el péptido prueba. Al día tres, los ratones también se dosificaron (OJ mL, inyectada intraperitonealmente) con hierro dextrán (100 mg/ml). Al día cinco, los ratones se anestesiaron con C02 y se sangraron mediante punción cardiaca. El porcentaje (%) de reticulocitos para cada muestra de sangre se determinó mediante la tinción con tiazol naranja y mediante análisis de citometría de flujo (programa retic-count). Los hematocritos se determinaron manualmente. El porcentaje corregido de reticulocito se determinó utilizando la siguiente fórmula: % RETICcorregido = % RETIC0bservado X (HematocritOindividuai/HematocritOnormai) 3. Ensavo hematológico Los ratones CDI normales se dosificaron con inyecciones intravenosas en bolo cuatro veces a la semana ya sea del EPO control positivo, compuesto prueba, o vehículo. Se evaluó un intervalo de dosis del control positivo y del péptido prueba, expresadas como mg/kg, al variar la concentración del compuesto activo en la formulación. Los volúmenes inyectados fueron de d ml/kg. El grupo control vehículo comprendía doce animales, mientras que 8 animales se encontraban en cada uno de los grupos de dosificación remanentes. Se registraron la viabilidad diaria y los pesos corporales semanalmente. Los ratones dosificados son ratones que se sometieron a ayuno y luego se anestesiaron con isoflurano inhalado y se recolectaron las muestras de sangre terminal vía punción cardiaca o punción de la aorta abdominal al día 1 (para los ratones control vehículo) y a los días 1d y 29 (4 ratones/grupo/día). La sangre se transfirió a tubos marca Vacutainer®. El anticoagulante preferido es ácido etilendiaminatetraacético (EDTA). Las muestras de sangre se evaluaron para los puntos terminales midiendo la síntesis de células rojas de la sangre y la fisiología tal como el hematocrito (Het), hemoglobina (Hgb) y conteo total de eritrocitos (RBC) utilizando analizadores clínicos automatizados bien conocidos en la técnica (por ejemplo, aquellos elaborados por Coulter, Inc.). La presente invención no se limita en el alcance por las modalidades específicas descritas en la presente invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente invención se volverán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y el(los) cuadro(s) anexo(s). Se pretende que dichas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Se entiende adicionalmente que todos los valores son aproximados, y se proveen para descripción. Numerosas referencias, incluyendo patentes, solicitudes de patente, y diversas publicaciones se citan y discuten a lo largo de la especificación. La cita y/o discusión de dichas referencias se proveen meramente para aclarar la descripción de la presente invención y no es una admisión de que cualquiera de dichas referencias sea una "técnica previa" a la presente invención. Todas las referencias citadas y discutidas en esta especificación se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad y hasta el mismo grado como si cada referencia se incorporara individualmente como referencia.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un péptido, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOS: 1-668. 2.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el N-terminal de dicho péptido está acetilado. 3.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido es un monómero. 4.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido es un dímero. 5.- El péptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el péptido es un homodímero. 6.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente uno o más polímeros solubles en agua covalentemente unidos al péptido. 7.- El péptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol-(PEG). 8.- El péptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho PEG comprende una molécula no ramificada lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 60,000 daltones. 9.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 20,000 daltones. 10.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 60,000 daltones. 11.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000 daltones. 12.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dos porciones PEG están covalentemente unidas al péptido, cada uno de dichos PEG comprende una molécula no ramificada lineal. 13.- El péptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque cada uno de dichos PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 30,000 daltones. 14.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho péptido se une a y activa el receptor de eritropoietina (EPO-R). 15.- Un péptido dimérico, que comprende: (a) una primera cadena peptídica; (b) una segunda cadena peptídica; y (c) una porción enlazadora que conecta a dicha primera y dicha segunda cadenas peptídicas, en donde al menos una de dicha primera cadena peptídica y dicha segunda cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOS: 1-668 y en donde dicho péptido se une a y activa el receptor de eritropoietina (EPO-R). 16.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la porción enlazadora comprende la fórmula: -NH-R3-NH-en donde R3 es un alquileno inferior de (C-^). 17.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la porción enlazadora es un residuo de lisina. 18.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la porción enlazadora comprende la fórmula: -CO-(CH2)n-X-(CH2)m-CO-en donde n es un entero de 0 a 10, m es un entero de 1 a 10, X se selecciona a partir de O, S, N(CH2)PNR?, NCO(CH2)PNR?, y CHNRT, R se selecciona a partir de H, Boc, y Cbz, y p es un entero de 1 a 10. 19.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque n y m son cada uno 1 , X es NCO(CH2)pNR-?, p es 2, y R-, es H. 20.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende adicionalmente un polímero soluble en agua. 21.- El péptldo dimérico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el polímero soluble en agua está covalentemente unido a la porción enlazadora. 22.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende adicionalmente una porción espaciadora. 23.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la porción espaciadora comprende la fórmula: -NH-(CH2)a-[0-(CH2)ß]?-Od-(CH2)e-Y-en donde a, ß, y e son cada uno enteros cuyos valores se seleccionan independientemente a partir de 1 a 6, d es 0 o 1 , ? es un entero seleccionado a partir de 0 a 10, e Y se selecciona a partir de MH o CO, con la condición de que ß es 2 cuando ? es mayor de 1. 24.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 23 caracterizado además porque cada uno de a, ß, y e es 2, cada uno de ? y d es 1 , e Y es NH. 25.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende adicionalmente uno o más polímeros solubles en agua. 26.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 2d, caracterizado además porque el polímero soluble en agua está covalentemente unido a la porción espaciada. 27.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 20 ó 25, caracterizado además porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG). 28.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el PEG es un PEG no ramificado lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 60,000 daltones. 29.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a menos de aproximadamente 20,000 daltones. 30.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a 60,000 daltones. 31.- El péptido dimérico de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000 daltones. 32.- El péptido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dos porciones PEG están covalentemente unidas al péptido, cada uno de dichos PEG comprende una molécula no ramificada lineal. 33.- El péptido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque cada uno de dichos PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 30,000 daltones. 34.- El uso de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOS: 1-668, para preparar un medicamento útil para el tratamiento de un paciente que tiene un trastorno caracterizado por una deficiencia de eritropoietina o una población baja o defectuosa de célula roja sanguínea. 3d.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 34, en donde el trastorno se selecciona a partir de: insuficiencia renal en etapa terminal o diálisis; anemia asociada con el SIDA, enfermedad autoinmune o una malignidad; beta-talasemia; fibrosis quística; anemia temprana de premadurez; anemia asociada con enfermedad inflamatoria crónica; lesión de médula espinal; pérdida aguda de sangre; envejecimiento; y estados de enfermedad neoplástica acompañada por eritropoiesis anormal. 36.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 34, en donde el péptido es un monómero. 37.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 34, en donde el péptido es un dímero. 38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el péptido es un homodímero. 39.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 34, en donde uno o más polímeros solubles en agua están covalentemente unidos al péptido. 40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG). 41.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde el PEG es un PEG no ramificado lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente dOO a aproximadamente 60,000 daltones. 42.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente dOO a menos de aproximadamente 20,000 daltones. 43.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a 60,000 daltones. 44.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 43, en donde el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000 daltones. 4d.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde dos porciones PEG están covalentemente unidas al péptido, cada uno de dichos PEG comprende una molécula no ramificada lineal. 46.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 4d, en donde cada uno de dichos PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 30,000 daltones. 47.- Una composición farmacéutica que comprende: (i) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOS: 1-668; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. 48.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque el péptido es un monómero. 49.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque el péptido es un dímero. dO.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque el péptido es un homodímero. 51.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque uno o más polímeros solubles en agua están covalentemente unidos al péptido. 52.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizada además porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG). 53.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque el PEG es un PEG no ramificado lineal que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 60,000 daltones. 54.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente dOO a menos de aproximadamente 20,000 daltones. dd.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 60,000 daltones. 66.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación dd, caracterizada además porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000 daltones. 67.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada además porque dos porciones PEG están covalentemente unidas al péptido, cada uno de dichos PEG comprende una molécula no ramificada lineal. 68.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque cada uno de dichos PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a 30,000 daltones.