MXPA02002037A

MXPA02002037A - Dosificaciones para el tratamiento con anticuerpos anti-erb2.

Info

Publication number: MXPA02002037A
Application number: MXPA02002037A
Authority: MX
Inventors: Shak Steven
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2002-10-31
Also published as: US20190055317A1; US20130149299A1; KR20110008112A; US20140079692A1; KR20090024308A; CY1109421T1; HK1048260A1; JP2013209389A; US7371379B2; AU2006200146B2; EP1210115A1; AU2006200146A1; JP2017081944A; AU2009201871A1; JP2020063266A; KR101261749B1; NZ517150A; PL353750A1; CN100443118C; KR20020027587A

Abstract

La presente invencion se refiere al tratamiento de alteraciones, caracterizado por la sobre expresion de ErbB2. Mas especificamente, la invencion se refiere al tratamiento de pacientes humanos susceptibles a o diagnosticados con cancer que sobre expresan ErbB2 con el anticuerpo anti-ErbB2.

Description

DOSIFICACIONES SARA EL TRATAMIENTO CON ANTICUERPOS ANTI-ErbB2 Campo de la Invención La presente invención se refiere al tratamiento de alteraciones, caracterizado por la sobre expresión de ErbB2 o alteraciones que expresan el receptor del factor eje Crecimiento epidérmico (RFCE) , que comprende administrar a un humano o animal que presenta las alteraciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza a ErbB2. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento de pacientes humanos susceptibles a o diagnosticados con cáncer que sobre expresan ErbB2 o que sobre expresan el RFCE, en donde el tratamiento es con un anticuerpo anti-ErbB2 administrado por carga delantera de la dosis de anticuerpo durante el tratamiento por administración intravenosa y/o subcutánea. La invención opcionalmente incluye el tratamiento del cáncer en üa paciente humano con una combinación de un anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico, tal como, pero no limitado, a un taxoide. El taxoide puede ser, pero ao se limita a paclitaxel o docetaxel. La invención además incluye REF. : 136306 * «- el tratamiento de cáncer en un paciente humano con una combinación de anticuerpo anti-ErbB2 y un agente /qui ioterapéutico tal como, pero no limitado a, un derivado de antraciclina. Opcionalmente, el tratamiento con una combinación de anti-ErbB2 y un derivado de antraciclina incluye tratamiento con una cantidad efectiva de un cardioprotector. La presente invención además se refiere a la dosificación infrecuente de anticuerpos ant?-ErbB2.

Antecedentes de la Invención Los pro-oncogenes que codifican los factores de crecimiento y receptores del factor de crecimiento, se han identificado por jugar papeles importantes en la patogénesis de varias malignidades humanas, incluyendo cáncer de mama. Se ha encontrado que el gen humano ErbB2 (erb2, también conocido como her2, o c-erbB-2), el cual codifica a un receptor de la glicoproteina de la transmembrana de 185 kd (pl85 HER2, relacionado con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) , está sobre expresado en aproximadamente 25% hasta 30% del cáncer de mama humano (Slamon et al . , Science 235:177-182

[1987]; Slamon et al . , Science 244 : 707-712

[1989] ) . ' ^.««ißlß Varias lineas de evidencia soportan un papel directo para el ErbB2 en la patogénesis y agresividad clínica de los tumores que sobre expresan ErbB2. La introducción de ErbB2 en células no neoplásticas se ha 5 mostrado por causar su transformación maligna (Hudziak et* al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA 84 : 7159-7163

[1987] ; DiFiore r et al . , Science 237 : 78-182 (

[1987] ) . Se encontró que ratones transgénicos que expresan HER2 desarrollan tumores mamarios {Guy et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA 89:10578-10582' 10

[1992]). Se han descrito los anticuerpos dirigidos contra los productos de la proteína humana erbB2 y proteínas codificadas por el equivalente de rata del gen erbB2 (neu) . Debrin et al . , Cell 41:695-706 (1985) se refiere a uh 15 anticuerpo monoclonal IgG2a, el cual se dirige contra el producto del gen neu de rata. Este anticuerpo llamado 7.16.4 causa modulación descendente de la expresión de pl85 de la "superficie celular en las células B104-1-1 (células NIH-3T3 transfectadas con el proto-oncogen neu) e inhibe la 20 formación de colonias de estas células. En Debrin et al . PNAS (USA) 83:9129-9133 (1986), el anticuerpo 7.16.4 mostró inhibir el crecimiento tumorigénico de células NIH-3T3 neu- , transformadas así como también las células de neuroblastoma de rata (a partir de las cuales el oncogen neu se aisló inicialmente)/ implantadas en ratones desnudos. Debrin et al . en Oncogene 2:387-394 (1988) discute la producción de un panel de anticuerpos contra el producto del gen de rata neu. Se encontró que todos los anticuerpos ejercen un efecto citostático en el crecimiento de células neu-transformadas 'Suspendidas en agar suave. Los anticuerpos de los isotipog IgM, IgG2a e IgG2b, son capaces de mediar la lisis in vi tro significante de las células neu-transformadas en la presencia del complemento, mientras ninguno de los •anticuerpos fue capaz de mediar niveles altos de "citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de las células neu-transformadas. Debrin et al . Oncogene 2:273- 277 (1988) reporta que las mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas en la molécula pl85 resultan en los efectos anti-tu or sinergístico en células NIH-3T3 neu- transformadas implantadas en ratones desnudos. Los efectos biológicos de los anticuerpos anti-neu son revisados en Myers et al . , Meth . Enzym. 198:277-290 (1991). También véase W094/22478 publicada el 13 de Octubre de 1994. Hudziak et al . , Mol . Cell . Biol . 9 (3) : 1165-1172 (1989) describe la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 el cual se caracteriza usando la línea celular de tumor de mama humano SKBR3. La proliferación celular telativa de células SKBR3 después de la exposición a los anticuerpos, se determinó por el teñido con violeta de cristal de las monocapas después de 72 horas. Usando este ensayo, se obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo llamado 4D5, el cual inhibió la proliferación celular por 56%. Otros anticuerpos en el panel, incluyendo 7C2 y 7F3, reducen la proliferación celular a una extensión menor en este ensayo. Hudziak et al . , concluye que el efecto del anticuerpo 4D5 en las células SKBR3 fue más citostático que citotóxico, puesto que las células SKBR3 resumidas crecieron a una velocidad cercana a la normal después de la remoción del anticuerpo a partir del medio. El anticuerpo 4D5 además se encontró sensibilizar el pl85eroB2 que sobre expresa las líneas celulares de tumor de mama con los efectos citotóxicos del TNF-a. Véase también WO 89/06692 publicada el 27 de Julio de 1989. Los anticuerpos anti-ErbB2 discutidos en Hudziak et al . , son además caracterizados en Fendly e£ al . Cáncer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al . In Vi tro 26(3) :59A (1990); Sarup et al . Growth Regula tion 1:72-82 (1991); Shepard et al . J. Clin . Immunol . 11 (3) : 117-127 (1991); Kumar et al . Mol . Cell . Biol . 11 (2) : 979-986 (1991); Le is et al . Cáncer Immunol f£z*'t Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al . Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vietta et al . Cáncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al . J. Biol . Chem. 269 (20) : 14661-14665 (1994); Scott et al . J. Biol . Chem. 266:14300-5 (1991); y D'souza et al . Proc. Natl . Acad. Sci . 91:7202-7206 (1994) . Tagliabue et al . Int . J. Cáncer 47:933-937 (1991) describe dos anticuerpos los cuales se seleccionan por su reactividad en la línea celular de adenocarcinoma de pulmón (Calu-3) , la cual sobre expresa ErbB2. Uno de los anticuerpos, llamado MGR3, encontrado por internalizarse, induce fosforilación de ErbB2, e inhibe el crecimiento de las células tumorales in vi tro . McKenzie et al . Oncogene 4:543-548 (1989) generó un panel de anticuerpos anti-ant?-ErbB2 con especificidades de epítopes variantes, que incluyen el anticuerpo designado TAI . Este anticuerpo TAI se encontró que induce la endocitosis acelerada de ErbB2 (véase Maier et al . Cáncer Res . 51:5361-5369

[1991]). Bacus et al . Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990) reportó que el anticuerpo anticuerpo TAI induce maduración de las líneas de células de cáncer de mama AU-565 (las cuales sobre expresan el gen erbB2) y MCF-7 (la cual no) . La inhibición del crecimiento y " adquisición de un fenotipo maduro en estas células se encontró estar asociado con los niveles reducidos del receptor ErbB2 en la superficie celular y niveles «incrementados temporales en el citoplasma. 5 Stancovski et al . PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991), generó un panel de anticuerpos anti-ErbB2, inyectados i.p. en ratones desnudos y evaluados sus efectos en el Crecimiento tumoral de fibroblastos de murina transformados por la sobre expresión del gen erbB2. Varios niveles de 0 inhibición del tumor se detectaron por cuatro de los anticuerpos, pero uno de los anticuerpos (N28 inconsistentemente estimuló el crecimiento del tumor. El anticuerpo Monoclonal N28 induce fosforilación significante •»«. del receptor ErB2, mientras los otro cuatro anticuerpos 5 generalmente presentan baja o ninguna actividad que induce fosforilación. El efecto de los anticuerpos anti-ErbB2 en la proliferación de las células SKBR3 también se valoró. En este ensayo de proliferación de células SKBR3, dos de los anticuerpos (N12 y N29) causaron una reducción en la 0» proliferación celular relativa al control. La habilidad de los varios anticuerpos para inducir la lisis celular in vi tro vía citotoxicidad dependiente complemento (CDC) y citotoxicidad dependiente de la célula mediada por el »* i?A i anticuerpo (CDCA) se valoraron, con los autores de este documento concluyendo que la función inhibitoria de los anticuerpos no se atribuyó significantemente a CDC o CDCA. Bacus et al . Cáncer Research 52:2580-2589 (19*92), S además caracterizó los anticuerpos descritos en Bacus et al . (1990) y Stancovski et al. de los párrafos precedentes. Extendiendo los estudios i.p. de Stancovski et al . , .se valoró el efecto de los anticuerpos después de la inyección i.v. en los ratones desnudos que albergan fibroblastos de 10 ratones que sobre expresan el ErbB2 humano. Como se observa en su trabajo más reciente, el N28 acelera el crecimiento del tumor, mientras N12 y N29 inhiben significantemente el crecimiento de las células que expresan ErbB2. La inhibición . parcial del tumor también se observó con el anticuerpo N24. 15 Bacus et al. también sometió a prueba la habilidad de los . - anticuerpos para promover un fenotipo maduro en las líneas de células de cáncer de mama humano AU-565 y MDA-MB453 (las cuáles sobre expresaron ErbB2), así como también MCF-7 (que contiene niveles bajos del receptor) . Bacus et al . dice una 20 correlación entre la inhibición del tumor in vivo y la - . diferenciación celular; el anticuerpo estimulador del tumor N28 no tiene efecto en la diferenciación, y la acción inhibitoria del tumor de los anticuerpos N12, N29 y N24 correlacionadas con la extensión de la diferenciación que ellos inducen. Xu et al . Int . J. Cáncer 53:401-408 (1993) evaluó un panel de anticuerpos anti-ErbB2 por sus especificidades que se enlazan a los epítopes, así como también su habilidad para inhibir el crecimiento dependiente del anclaje e independiente del anclaje de las células SKBR3 (por anticuerpos individuales y en combinación) , modular el ErbB2 de la superficie celular e inhibir el crecimiento independiente del anclaje estimulado por el ligando. Véase también WO94/00136 publicado el 6 de Enero de 1994, y Kasprzyk et al . Cáncer Research 52:2771-2776 (1992) concerniente a las combinaciones anticuerpo anti-ErbB2. Otros anticuerpo anti-ErbB2 son discutidos en Hancock et al . Cáncer Res . 51:4575-4580 (1991); Shawver et al . Cáncer Res . 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al . Cáncer Res . 54:3758-3765 (1994); y Har erth et al . J. Biol . Chem. 267:15160-15167 (1992) . Un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 humanizado recombínante (una versión humanizada del anticuerpo 4D5 anti-ErbB2 de murina, referida como rhuMAb HER2, HERCEPTIN®, o anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®) ha sido clínicamente activa en pacientes con cánceres metastáticos de mama que sobre expresan ErbB2, que han recibido terapia anti-cancer previa extensiva (Balsega et al . , J. Clin- Oncol . 14:737-744

[1996]). La dosis de carga inicial recomendada para HERCEPTIN® es 4 mg/kg administrada como una infusión a 90 minutos. La dosis de mantenimiento semanal recomendada es 2 mg/kg y puede ser administrada como una infusión de 30 minutos si la dosificación de carga inicial es bien tolerada. La sobre expresión de ErbB2 es comúnmente considerada como un mecanismo de predicción de una prognosis escasa, especialmente en pacientes con padecimientos primarios que involucran nudos linfáticos axilares (Slamon et al . ,

[1987] y

[1989], supra ; Ravdin y Chamness, Gene 159:19-27

[1995]; y Hynes y Stern, Biochim. Biophys Acta 1198:165-184

[1994]), y ha sido ligado a la sensibilidad y/o resistencia a la terapia de la hormona y regímenes qui ioterapéuticos, incluyendo CMF (ciclofosfamida, metotrexato, y fluoracilo) y antraciclmas (Balsega et al . Oncology 11 (3 Supp 1): 43-48

[1997] ) . Sin embargo, debido a la asociación de la sobre expresión de ErbB2 con escasa diagnosis, las desigualdades de pacientes positivos a HER2 que responden clínicamente al tratamiento con taxanos, fueron mayores de tres veces que aquellos pacientes negativos a HER2 (ibid) . El rhuMAb HER2 mostró mejorar la actividad del paclitaxel (TAXOL®) y doxorubicina contra los xenógrafos de cáncer de mama en ratones desnudos inyectados con células de adenocarcinoma de mama humano BT-474, las cuales expresan niveles altos de HER2 (Baselga et al . Breast Cáncer, Proceedings o f ASCO, Vol. 13, Resumen 53

[1994]).

Sumario de la Invención La presente invención se refiere al descubrimiento de que una realización temprana de una concentración de suero máxima objetivo eficaz, proporcionando una dosis inicial o dosificaciones de anticuerpos anti-ErbB2 seguida por las dosis subsecuentes de cantidades iguales o más pequeñas de anticuerpos (carga delantera mayor) es más eficaz que los tratamientos convencionales. La concentración máxima de suero objetivo eficaz, se alcanza en 4 semanas o menos, preferiblemente 3 semanas o menos, más preferiblemente 2 semanas o menos, y mayormente preferible 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos. La concentración de suero objetivo es posteriormente mantenida por la administración de dosis de mantenimiento de cantidades iguales o menores para el resto del régimen de tratamiento o *i m hasta que se logra la supresión de los síntomas del padecimiento. La invención además se refiere a un método para el tratamiento de un paciente humano susceptible a o diagnosticado con una alteración, caracterizado por la sobre expresión del receptor ErbB2 que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-ErbB2 subcutáneamente. Preferiblemente, la dosis inicial (o las dosis), así como también la dosis o dosis de mantenimiento subsecuentes se administran subcutáneamente. Opcionalmente, en donde la tolerancia del paciente al anticuerpo anti-ErbB2 se desconoce, la dosis inicial se administra por infusión intravenosa, seguida por la administración subcutánea de las dosis de mantenimiento si la tolerancia del paciente para el anticuerpo es aceptable. De conformidad con la invención, el método de tratamiento involucra la administración de una dosis inicial de anticuerpo anti-ErbB2 de más de aproximadamente 4 mg/kg, preferiblemente más de aproximadamente 5 mg/kg. La dosis máxima inicial o una dosis subsecuente, no excede 50 mg/kg, preferiblemente no excede 40 mg/kg, y más preferiblemente no excede 30 mg/kg. La administración es por administración intravenosa o subcutánea, preferiblemente infusión intravenosa o inyección del bolo o más preferiblemente inyección del bolo subcutáneo. La dosis inicial puede ser de una o más administraciones del fármaco suficiente para alcanzar la concentración máxima del suero objetivo, en 4 semanas o menos, preferiblemente 3 semanas o menos, más preferiblemente 2 semanas o menos, y mayormente preferible 1 semana o menos, incluyendo un día o menos. De conformidad con la invención, la dosis inicial o dosis es/son seguidas por las dosis subsecuentes de cantidades iguales o más pequeñas de anticuerpo a intervalos suficientemente cerca para mantener la concentración máxima de suero de anticuerpo a o arriba de un nivel objetivo eficaz. Preferiblemente, una dosis inicial o dosis subsecuentes no exceden 50 mg/kg, y cada dosis subsecuente es al menos 0.01 mg/kg. Preferiblemente la cantidad de fármaco administrado es suficiente para mantener la concentración máxima del suero objetivo, de manera que el intervalo entre ciclos de administración sea al menos de una semana. Preferiblemente la concentración máxima de suero no excede 2500 µl/ml y no cae por debajo de 0.01 µg/ml durante el tratamiento. El método de tratamiento de fármaco de carga delantera de la invención, tiene la ventaja de eficacia incrementada alcanzando una concentración temprana de fármaco de suero objetivo en el tratamiento. El suministro subcutáneo de dosis de mantenimiento de conformidad con la invención, tiene la ventaja de ser conveniente para el paciente y los cuidados de salud profesionales, reduce el tiempo y costos para el tratamiento del fármaco. Preferiblemente, la dosis inicial (o al menos la dosis dentro de una serie de dosis iniciales), se separa en tiempo a partir de la primera dosis subsecuente por 4 semanas o menos, preferiblemente 3 semanas o menos, más preferiblemente 3 semanas o menos, más preferiblemente 1 semana o menos. En una modalidad de la invención, la dosis inicial del anti-ErbB2 es 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg suministrada por administración intravenosa o subcutánea, tal como infusión intravenosa o inyección de bolo subcutáneo. Las dosis de mantenimiento subsecuente son 2 mg/kg suministrada una vez por semana por infusión intravenosa, inyección de bolo intravenoso, infusión subcutánea, o inyección de bolo subcutáneo. La selección del método de suministro para las dosis inicial y de mantenimiento se hace de conformidad con la habilidad del paciente humano o animal para tolerar la introducción del anticuerpo en el cuerpo. En donde el anticuerpo es bien tolerado, el tiempo de infusión puede ser reducido. La selección del método de suministro como se describe para esta modalidad, aplica a todos los regímenes de suministro de fármaco contemplados de conformidad con la invención. En otra modalidad, la invención incluye una dosis inicial de 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por dosis de mantenimiento subsecuente de 6 mg/kg una vez por 3 semanas. En todavía otra modalidad, la invención incluye una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por 6 mg/kg una vez por 3 semanas. En aún otra modalidad, la invención incluye una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por dosis de mantenimiento subsecuente de 8 mg/kg una vez cada 2 a 3 semanas. En otra modalidad, la invención incluye dosis iniciales de al menos 1 mg/kg, preferiblemente 4 mg/kg, de anticuerpo anti-ErbB2 en cada uno de los días 1, 2 y 3, seguidos por las dosis de mantenimiento subsecuente de 6 mg/kg una vez por 3 semanas. En otra modalidad, la invención incluye una dosis inicial de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguida por dosis de mantenimiento subsecuente de 2 mg/kg dos veces por j g¡| g g¡jj||||Í^ g^|g^ semana, en donde la dosis de mantenimiento se separa por 3 días. En todavía otra modalidad, la invención incluye un ciclo de dosificación en el cual, el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 es 2-3 veces por semana por 3 semanas. En una modalidad de la invención, cada dosis es de aproximadamente 25 kg/mg o menos para un paciente humano, preferiblemente aproximadamente 10 mg/kg o menos. Este ciclo de 3 semanas es preferiblemente repetido como sea necesario para lograr la supresión de los síntomas del padecimiento. En otra modalidad, la invención incluye un ciclo de dosificación en el cual el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 es diariamente por 5 días. De conformidad con la invención, el ciclo es preferiblemente repetido como sea necesario para lograr la supresión de los síntomas del padecimiento. La alteración preferiblemente es un tumor benigno o maligno caracterizado por la sobre expresión del receptor ErbB2, por ejemplo, un cáncer, tal como cáncer de mama, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer tiroidal, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cuello y cabeza. El método de la invención puede además comprender administración de un agente quimioterapéutico preferentemente una antraciclina, por ejemplo, doxorubicina o epirubicina. El agente quimioterapéutico preferiblemente es un taxoide, tal como TAXOL® (paclitaxel) o un derivado de TAXOL®. Los anticuerpos anti-ErbB2 preferidos se enlazan al dominio extracelular del receptor ErbB2, y preferiblemente se enlazan al epítope 4D5 o 3H4 dentro de la secuencia del dominio extracelular ErbB2. Más preferiblemente, el anticuerpo es el anticuerpo 4D5, más preferiblemente es una forma humanizada. Otros anticuerpos ErbB2 enlazantes preferidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos 7C2, 7F3 y 2C4, preferiblemente en una forma humanizada. El método de la presente invención es particularmente adecuado para el tratamiento de cáncer de mama o de ovario, caracterizado por la sobre expresión del receptor ErbB2. La presente solicitud también proporciona un método de terapia que involucra la dosificación infrecuente de un anticuerpo anti-ErbB2. En particular, la invención proporciona un método para el tratamiento del cáncer (por ejemplo, cáncer caracterizado por la sobre expresión del receptor ErbB2) en un paciente humano, que comprende administrar al paciente una primera dosis de un anticuerpo anti-ErbB2, seguida por al menos una dosis subsecuente del anticuerpo, en donde la primera dosis y la dosis subsecuente se separan entre sí en tiempo por al menos aproximadamente dos semanas {por ejemplo, desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente dos meses) , y opcionalmente al menos aproximadamente tres semanas (por ejemplo, desde aproximadamente tres semanas hasta aproximadamente seis semanas) . Por ejemplo, el anticuerpo puede ser administrado aproximadamente cada tres semanas, aproximadamente dos a aproximadamente 20 veces, por ejemplo, aproximadamente seis veces. La primera dosis y la dosis subsecuente pueden cada una ser de aproximadamente 2 mg/kg hasta aproximadamente 16 mg/kg; por ejemplo, desde aproximadamente 4 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg; y opcionalmente desde aproximadamente 6 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. De manera general, dos o más dosis subsecuentes (por ejemplo, desde aproximadamente dos hasta aproximadamente diez dosis subsecuentes) del anticuerpo son administradas al paciente, y aquellas dosis subsecuentes son preferiblemente separadas entre sí en tiempo por al menos aproximadamente dos semanas (por ejemplo, desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente dos meses) , y opcionalmente al menos aproximadamente tres semanas (por ejemplo, desde aproximadamente tres semanas hasta aproximadamente seis semanas) . Las dos o más dosis subsecuentes pueden cada una ser desde aproximadamente 2 mg/kg hasta aproximadamente 16 mg/kg; o desde aproximadamente 4 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg; o desde aproximadamente 6 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. La invención adicionalmente proporciona un artículo de manufactura, que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2, y un inserto de envase que contiene instrucciones para administrar el anticuerpo de conformidad con tales métodos. Los protocolos de dosificación actualmente descritos, pueden ser aplicados a otros anticuerpos anti- ErbB2, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , anticuerpos anti-ErB3 y anti-ErbB4. Así, la invención proporciona un método para el tratamiento de cáncer en un paciente humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-ErbB2 al paciente humano, el método comprende administrar al paciente una dosis inicial de al menos aproximadamente 5 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2; y administrar al paciente una pluralidad de dosis subsecuentes del anticuerpo en una cantidad que es aproximadamente la misma o menos que la dosis inicial. Alternativamente o adicionalmente, la invención pertenece a un método para el tratamiento del cáncer en un paciente humano que comprende administrar al paciente una primera dosis de un anticuerpo anti-ErbB2, seguida por al menos una dosis subsecuente del anticuerpo, en donde la primera dosis y la dosis subsecuente son separadas entre sí en tiempo por al menos aproximadamente dos semanas. La invención adicionalmente proporciona un artículo de manufactura que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende el anticuerpo anti-ErbB2, y un inserto de envase que comprende instrucciones para administrar el anticuerpo de conformidad con tales métodos. En otro aspecto, la invención se refiere a un artículo de manufactura, que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2, opcionalmente una etiqueta en o 1^^^^^^^^^^ asociada con el contenedor, que indica que la composición puede ser usada para tratar una condición caracterizada por la sobre expresión del receptor ErbB2, y un inserto de envase que contiene las instrucciones para evitar el uso de quimioterapéuticos del tipo antraciclina en combinación con la composición. De conformidad con la invención, el inserto de envase además incluye instrucciones para administrar el anticuerpo anti-ErbB2 a una dosis inicial de 5 mg/kg, seguida por la misma dosis o dosis más pequeñas subsecuentes. En otra modalidad de la invención, el inserto de envase además incluye instrucciones para administrar el anticuerpo anti-ErbB2 subcutáneamente por al menos una de las dosis, preferiblemente para todas las dosis subsecuentes después de la dosis inicial, más preferiblemente para todas las dosis. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de tratamiento de un cáncer que expresa ErbB2 en un paciente humano que comprende, administrar al paciente, cantidades efectivas de un anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico. En una modalidad de la invención, el agente quimioterapéutico es un taxoide que incluye pero no se limita a, paclitaxel y docetaxel. En otra modalidad, el agente quimioterapéutico es un derivado de antraciclina que [j^iü^^ incluye, pero no se limita a, doxorubicina o epirubicina. En todavía otra modalidad de la invención, el tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB2 y un derivado de antraciclina además incluye la administración de un cardioprotector al paciente. En todavía otra modalidad, un derivado de antraciclina no es administrado al paciente con el anticuerpo anti-ErbB2. Uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales pueden también ser administrados al paciente. El cáncer está preferiblemente caracterizado por la sobre expresión de ErbB2. La invención además proporciona un artículo de manufactura que comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2 y un inserto de envase que instruye al usuario de la composición a administrar la composición de anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico a un paciente. En otra modalidad, el agente quimioterapéutico es preferentemente una antraciclina, y es preferiblemente un taxoide, tal como T.AXOL®. En todavía otra modalidad, el agente quimioterapéutico es una antraciclina, incluyendo pero no limitado a, doxorubicina o epirubicina. En aún otra modalidad, el agente quimioterapéutico es una antraciclina y el inserto de envase además instruye al usuario a -¡ ± 4 Éjfcja * ********.*.****% ** ** .^Jf—rf f*- administrar un cardioprotector. Los métodos y composiciones de la invención comprenden un anticuerpo ant?-ErbB2 e incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 humanizado. Así, la invención además pertenece a una composición que comprende un anticuerpo que se enlaza a ErbB2 y el uso del anticuerpo para el tratamiento del cáncer que expresa ErbB2, por ejemplo, cáncer que sobre expresa ErbB2, en un humano. La invención además pertenece al uso del anticuerpo para el tratamiento del cáncer que expresa RFCE. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, 4D5 humanizado (y preferiblemente huMAb4D5-8 (anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®) ; o anticuerpo monoclonal 2C4, por ejemplo, 2C4 humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo IgGi intacto) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, F(ab)2, diacuerpo, y los similares) . Las regiones de cadena ligera variable y cadena pesada variable de anticuerpos 2C4 anti-ErbB4 humanizados, se muestran en las Figuras 5A y 5B.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra formación de mapas epítopes del dominio extracelular de ErbB2 como se determina por el análisis mutante de truncación y mutagénesis dirigida al sitio (Nakamura et al . , J. of Virology 67 (10) : 6179-6191 [Oct 1993]; Renz et al . J. Cell . Biol . 125 (6) : 1395-1406 [Jun 1994]). El 4D5 Mabs anti-proliferativo y 3H4 se enlazan adyacentes al dominio de la transmembrana. Las varias truncaciones ErbB2-ECD o mutaciones de punto, se prepararon a partir de ADNc usando la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa. Los mutantes ErbB2 se expresaron como proteínas de fusión gD en un plásmido de expresión de mamífero. Este plásmido de expresión usa el promotor/mejorador de citomegalovirus con terminación SV40 y señales de poliadenilación ubicadas corriente abajo del ADNc insertado. El plásmido ADN se transfectó en 293S células. Un día después de la transfección, las células se etiquetaron metabólicamente durante la noche en metionina y libres de cisteína, el DMEM bajo en glucosa que contiene suero bovino fetal dializado al 1% y 25 µCi cada uno de metionina 35S y cisteína 35S. Los sobrenadantes se cosecharon ya sea el MAbs ErbB2 o los anticuerpo de control se agregaron al sobrenadante y se incubaron 2-4 horas a 4°C. Los complejos se precipitaron, aplicaron a gel de gradiente SDS de Tricina al 10-20% y se sometieron a electrofóresis a 100 V. El gel se electro manchó en una membrana y se analizó por autoradiografía. Las SEC IDE Nos: 8 y 9, muestran los epítopes 3H4 y 4D5, respectivamente. La Figura 2 demuestra con subrayado la secuencia de aminoácido del Dominio 1 de ErbB2 (SEC ID N0:1). Los aminoácidos en negritas indican la ubicación del epítope reconocido por Mabs 7C2 y 7F3 determinado por supresión de formación de mapas, es decir, el "epítope 7C2/7F3" (SEC ID NO: 2) . La Figura 3 es una gráfica de la concentración máxima de suero anticuerpo anti-ErbB2 (HERCEPTIN®) (µg/ml, media + SE, círculos obscuros) por semana, a partir de la semana 2 hasta la semana 36 para pacientes que sobre expresan ErbB2 tratados con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® a dosis inicial de 4 mg/kg, seguida por 2 mg/kg semanalmente. El número de pacientes a cada punto de tiempo está representado por "n" (cuadrados blancos) . La Figura 4A es un trazo lineal de cambios de volumen del tumor con el tiempo en ratones tratados con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®. La Figura 4B es un trazo semi-logarítmico de los mismos datos como en la Figura 4A, de manera tal que la variación en el volumen del tumor para los animales tratados se observa más fácilmente. Las Figuras 5A y 5B muestran alineaciones de las secuencias de aminoácido de los dominios ligero variable (VL) (Fig. 5A) y pesado variable (VH) (Fig. 5B) del anticuerpo 2C4 monoclonal de murina (SEC ID Nos: 10 y 11, respectivamente); dominios VL y VH de la versión 574 Fab humanizada (SEC ID 5 Nos: 12 y 13, respectivamente), y estructuras consenso humanas VL y VH (humana kl, subgrupo kappa I; hu III, subgrupo pesado III) (SEC ID Nos. 14 y 15, respectivamente. Los asteriscos identifican diferencias entre la versión 574 Fab humanizada y el anticuerpo 2C4 monoclonal de murina o 10 entre la versión 574 Fab humanizada y la estructura humana. Las Regiones de Determinación de Complementariedad (RDC) están en corchetes. La versión 574 Fab humanizada, con los cambios ArgH71Val, AspH73Arg y IleH69Leu, parecen tener enlaces restaurados a aquellos del fragmento Fab 2C4 15 quimérico original. Los residuos FR y/o RDC adicionales, tales como L2, L54, L55, L56, H35 y/o H48, pueden ser modificados (por ejemplo, substituidos como sigue IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; y ValH48Ile) para además retinar o mejorar el enlace del 20 anticuerpo humanizado. Alternativamente, o adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede ser de afinidad maduro para mejorar además o refinar su afinidad y/o otras actividades biológicas . -14* Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I. Definiciones Un "receptor ErbB" es una proteína receptora tirosina cinasa la cual pertenece a la familia del receptor ErbB e incluye receptores EGFR, HER2, ErbB3 y ErbB4, así como también TEGFR (Patente Estadounidense No. 5,708,156) y otros miembros de esta familia para ser identificados en el futuro. El receptor ErbB generalmente comprenderá un dominio extracelular, el cuál puede estar enlazado a un ligando ErbB; un dominio de la transmembrana lípofílica; un dominio de la tirosina cinasa intracelular conservada; y un dominio de señalización carboxil-terminal que alberga varios residuos de tirosina los cuales pueden ser fosforilados. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB de secuencia nativa o una variante de secuencia de aminoácido de la misma. Preferiblemente, el receptor ErbB es un receptor ErbB humano de secuencia nativa. Los términos "ErbBl", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR", son usados intercangeablemente ahí y se refieren a un EGFR de secuencia nativa como se describe por ejemplo, en Carpenter et al .

-^^^^^M^ ^ A ** Ann. .Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), que incluye variantes de la misma (por ejemplo un EGFR mutante de supresión como en Humphrey et al . , PNAS (USA) 87:4027-4211 (1990)). ErbBl se refiere al gen que codifica al producto de la proteína EGFR. Los ejemplos de anticuerpos los cuales se enlazan a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8507), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase Patente Estadounidense No. 4,943,533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225) y 225 humano reformado (H225) (véase WO 96/40210, Imclone Systems Inc.). "ErbB3" y "HER3" se refiere al polipéptido receptor como se describe por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,183,884 y 5,480,968 así como también Kraus et al . PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989), incluyendo variantes de las mismas. Los ejemplos de anticuerpos los cuales se enlazan a HERB3, se describen en la Patente Estadounidense No. 5,968,511 (Akita y Sliwko ski) , por ejemplo, el anticuerpo 8B8 (ATCC HB 12070) o una variantes humanizada de la misma. Los términos "ErbB4" y "HER4" aquí, se refieren al polipéptido receptor como se describe por ejemplo, en Solicitud de Patente EP No. 599,274; Plowman et al . , Proc.

Natl . Acad. Sci . USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al . Nature, 366:473-475 (1993), que incluyen variantes de las mismas tales como las isoformas HER4 descritas en WO 99/19488. Los términos "HER2", "ErbB" "c-Erb-B2" son usados intercambiablemente. A menos que se indique de otro modo, los términos "ErbB2", "c-ErbB2" y "HER2" cuando se usan aquí, se refieren a la proteína humana, y n erbB2" , "c-erb-B2", y "her" se refiere al gen humano. El gen er£>B2 humano y la proteína ErbB2 son, por ejemplo, descritos en Semba et al . , PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al . Nature 319:230-234 (1986) (Número de acceso de GeneBank X03363) . ErbB2 comprende cuatro dominio (Dominios 1-4) . El "epítope 4D5" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la cual el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) se enlaza. Este epítope se cierra en la región de la transmembrana de ErbB2. Para seleccionar los anticuerpos a los cuales se enlaza el epítope 4D5, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como aquel descrito en Antibodies . A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David lañe (1988) . Alternativamente, la formación de mapas epítopes se puede realizar (véase Fig. 1) para valorar si el anticuerpo se enlaza al epítope 4D5 de **? rt* t » ErbB2 (es decir, uno cualquiera o más residuos en la región desde aproximadamente 529 residuos, por ejemplo, aproximadamente 561 hasta aproximadamente 625 residuos inclusive) . El "epítope 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 al cual el anticuerpo 3H4 se enlaza. Este epítope se muestra en la Figura 1, e incluye residuos desde aproximadamente 541 hasta aproximadamente 599, inclusive, en la secuencia de aminoácido del dominio extracelular ErbB2. El "epítope 7C2/F3" es la región en el N-término del dominio extracelular de ErbB2 al cual los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositados con el ATCC, véase abajo) , se enlaza. Para seleccionar anticuerpos a los cuales se enlaza el epítope 7C2/7F3, un ensayo de bloqueo de cruzas de rutina, tal como aquél descrito en Antibodies . A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), pueden ser realizados. Alternativamente, la formación de mapas epítopes puede realizarse para establecer si el anticuerpo se enlaza al epítope 7C2/7F3 en ErbB3 (es decir, uno cualquiera o más residuos en la región desde aproximadamente 22 hasta aproximadamente el residuo 53 de ErbB2; SEC ID NO: 2) .

El término "induce muerte celular" o "capaz de inducir muerte celular", se refiere a la habilidad del anticuerpo a hacer una célula viable que llegue a ser no viable. La "célula" aquí, es una la cual expresa el receptor ErbB2, especialmente en donde la célula sobre expresa el receptor ErbB2. Una célula la cual "sobre expresa" ErbB2, tiene niveles ErbB2 significantemente superiores que los normales, comparados con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Preferiblemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colón, tiroides, pancreática o de vejiga. In vi tro, la célula puede ser una célula SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vi tro puede ser determinada en la ausencia de células efectoras inmunes^ y complementos para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) o citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) . Así, el ensayo para la muerte celular puede ser realizado usando suero inactivado por calor (es decir, en la ausencia de complemento) y en la ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de integridad de la membrana como se evaluó por la captación de yoduro de propidio (Pl), azul de triptano (véase Moore et al . Cytotechnology 17:1-11

[1995]) o 7.AAD, pueden ser sometidos a ensayos, con relación a las células no tratadas. Los anticuerpos preferidos que inducen muerte celular son aquellos los cuales inducen captación de Pl en el "ensayo de captación de Pl en células BT474". La frase "induce apoptosis" o "capaz de inducir apoptosis", se refiere a la habilidad del anticuerpo para inducir muerte celular programada como se determinó por el enlace de anexina V, fragmentación de .ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo enodplasmático, fragmentación celular, y/o formación de las vesículas de la membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . La célula es una la cuál sobre expresa el receptor ErbB2. Preferiblemente, la "célula" es una célula de tumor, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroide, pancreática o de vejiga. In vi tro, la célula puede ser una células SKBR3, BT474, célula Calu 3, célula MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKV03. Varios métodos están disponibles para la evaluación de los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (FS) puede ser medida por enlace de anexina; la fragmentación de .ADN puede ser evaluada a través de la escalerilla de ADN como se describe en el ejemplo aquí; y condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de .ADN, pueden ser evaluadas por cualquier incremento en las células hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo el cual induce apoptosis, es uno el cual resulta en aproximadamente 2 hasta 50 partes, preferiblemente 5 hasta 50 partes, y más preferiblemente alrededor de 10 hasta 50 partes, de inducción de enlace de anexina con relación a las células no tratadas en un "ensayo de enlace a anexina que usa células BT474" (véase abajo". Algunas veces el anticuerpo pro-apoptótico será uno el cual bloquea el enlace/activación HRG del complejo ErbB2/ErbB3 (por ejemplo, anticuerpo 7F3) . En otras situaciones, el anticuerpo es uno el cual no bloquea significantemente la activación del complejo receptor ErbB2/ErbB3 por HRG (por ejemplo, 7C2) . Además, el anticuerpo puede ser uno como 7C2, el cual mientras induce apoptosis, no induce una reducción grande en el porcentaje de células en la fase S (por ejemplo, uno el cual solamente induce aproximadamente 0-10% de reducción en el por ciento de estas células con relación al control) .

El anticuerpo de interés puede ser uno como 7C2, el cual se enlaza específicamente al ErbB2 humano y no reacciona significante contrario con otras proteínas tales como aquellas codificadas por los genes errBl, eri)B3 y/o erbB . Algunas veces, el anticuerpo no reacciona significantemente contrario con la proteína neu de rata, por ejemplo, como se describe en Schecter et al . Nature 312:513 (1984) y Drebin et al . Nature 312:545-548 (1984). En tales modalidades, la extensión del enlace del anticuerpo a estas proteínas (por ejemplo, enlazantes de la superficie celular al receptor endógeno) , serán menos de aproximadamente 10% como se determinó por el análisis de clasificación de células activadas fluorescentes (CCAF) o radioinmunoprecipitación (RÍA) . "Heregulina" (HRG) cuando se usa aquí, se refiere a un polipéptido el cual activa el ErbB2-ErbB3 y los complejos de la proteína ErbB2-ErbB4 (es decir, induce fosforilación de los residuos tirosina en el complejo después del enlace al mismo) . Varios polipéptidos heregulina abarcados por este término están descritos en Holmens et al . Science, 256:1205- 1210 (1992); WO 92/20798; Wen et al . , Mol . Cell . Biol . 14 (3) : 1909-1919 (1994); y Marchionni et al . , Nature, 362:312-318 (1993), por ejemplo. El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido HRG que se origina naturalmente, tal como un fragmento de dominio como EGF del mismo (por ejemplo, HRGßll77-244 ) • El "complejo de proteína ErbB2-ErbB3" y "complejo de proteína ErbB2-ErbB4", son oligómeros asociados no covalentemente del receptor ErbB2 y el receptor ErbB3 o receptor ErbB4, respectivamente. Los complejos de forman cuando una células que expresa ambos de estos receptores/ se expone a HRG y puede ser aislada por inmunoprecipitación y analizada por SDS-PAGE como se describe en Sliwkowski et al . , J. Biol . Chem . , 269 (20) : 14661-14665 (1994). ".Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs" son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras los anticuerpos exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico, las inmunoglobulmas incluyen ambos anticuerpos y otras moléculas como anticuerpos, las cuales carecen de especificidad al antígeno. Los polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producidos a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles incrementados por mielomas. ¿fáli ii ^il^^ Los "anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativas" son glicoproteínas comúnmente heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace covalente de disulfuro, en tanto que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también ha espaciado en forma regular los puentes de disulfuro de intracadenas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un campo variable (VH) seguido por un número de campos constantes. Cada cadena ligera tiene un campo variable en un extremo (Vi) y un campo constante en su otro extremo; el campo constante de la cadena ligera se alinea con el primer campo constante de la cadena pesada, y el campo variable de cadena ligera se alinea con el campo variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los campos variables de cadena ligera y pesada. El término "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los campos variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los campos variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes complementarias (por sus siglas en inglés, CDRs) o regiones hipervariables tanto en los campos de variables de cadena ligera y cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de campos variables son llamadas la región de estructura (por sus siglas en inglés, FR) . Los campos variables de cadenas ligeras y pesadas naturales comprenden cada una cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración de hoja ß, conectadas por tres CDRs, las cuales forman circuitos que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja ß. Los CDRs en cada cadena se mantienen juntos en proximidad estrecha por los FRs y, con los CDRs de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígenos de anticuerpos (véase Kabat et al . , NIH Publ . No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669

[1991]). Los campos constantes no se involucran directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo.

La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígenos idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de enlace de antígenos sencillo, y un fragmento "Fc" residual, cuyos nombres reflejan su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con papaína produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y es todavía capaz de reticular antígenos. "Fv" es el fragmento de anticuerpos mínimo el cual contiene un sitio de enlace y reconocimiento de antígenos completo. Esta región consiste de un dímero de un campo variable de cadena pesada y de cadena ligera en asociación no covalente hermética. El mismo es en esta configuración que los tres CDRs de cada campo variable interactúan para definir un sitio de unión de antígenos en la superficie del dímero VH-VL. De manera general, los seis CDRs confieren especificidad de enlace de antígenos al anticuerpo. Sin embargo, incluso un campo variable único (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígenos, aunque a una baja afinidad que el sitio de enlace completo. El fragmento Fab también contiene el campo constante de la cadena ligera y el primero campo constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren ,de los fragmentos Fab por la adición de pocos residuos en la terminal carboxi del campo CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región articulada de anticuerpos. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en el cual el (los) residuo (s) de cisteína de los campos constantes lleva un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se producen como pares de fragmentos Fab' los cuales tienen cisteínas articuladas entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos también son conocidos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cada especie vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) y lambda (?) , basada en las secuencias de aminoácidos de sus campos constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del campo constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Estas son cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los campos constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamadas a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos {por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos mientras que las mismas exhiben la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o de unión de antígenos del cuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2/ y Fv: diacuerpos: anticuerpos lineales (Zapata et al . , Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062

[1995]); moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para la posible mutación que está presente en forma natural que puede estar presente en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un sitio antigénico sencillo. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales las cuales típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante sencillo en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos, porque los mismos se sintetizan por el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos substancialmente homogénea, y no se construye cuando re requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención, se pueden hacer por el método del hibridoma descrito primero por Kohler et al . , Nature, 256:495 (1975), o se puede hacer por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de las genotecas de anticuerpos del fago usando las técnicas descritas en Clackson et al . , Nature . 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particulares, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de tales anticuerpos, mientras que los mismos exhiben la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; Morrison et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855

[1984] ) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadena de inmunoglobulinas o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión de antígenos) las cuales contienen una mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del recipiente se remplazan por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se remplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprenden residuos los cuales no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o secuencias de estructura. Estas modificaciones se hacen para mejorar y maximizar adicionalmente el funcionamiento de anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos una, y típicamente dos, campos variables, en los cuales todo o substancialmente todo de los CDRs corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todo o substancialmente todo de los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente todo comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al . , Nature. 321:522-525 (1986); Reichmann et al . , Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, C?rr. Op. Struct . Biol . , 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED™ en donde la región de unión de antígenos del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido por la inmunización de monos macacos con el antígeno de interés. Los fragmentos de anticuerpos de "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los campos VH y VL de anticuerpos, en donde estos campos están presentes en una cadena de polipéptido sencilla. Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador polipéptido entre los campos VH y VL los cuales permiten que el sFv forme la estructura deseada por la unión de antígenos. Para una revisión de sFv véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión de antígenos, estos fragmentos comprenden un campo variable de cadena pesada (VH) conectada a un campo variable de cadena ligera (V) en la misma cadena de polipéptido (VH - VL) . Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir formar pares entre los dos campos en la misma cadena, los * -j* , *S? '** ¥ * &&$&£^' ** gSCÍÍj? campos se fuerzan para hacer pares con los campos complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígenos. Los diacuerpos se describen en forma más completa en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161: y Hollinger et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA. 90:6444-6448 (1993). Un anticuerpo "aislado" es uno el cual se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales interfieren con usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y en forma más preferida más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácido interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS- PAGE bajo condiciones de reducción o sin reducción usando tinta azul Coomassie o, preferiblemente, tinta plateada. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de las células recombinantes puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación. Cuando de usa aquí, el término "epítope de unión del receptor de recuperación" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgC (por ejemplo, IgCi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar el promedio de vida del suero in vivo de la molécula IgG. El "tratamiento" se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el desorden así como también aquellos en los cuales el desorden va a ser prevenido. El "mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deportes, mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano. Un "desorden" es cualquier condición que podría beneficiarse a partir del tratamiento con el anticuerpo anti- ErbB2. Esto incluye desórdenes o enfermedades crónicas o agudas que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. Los ejemplos no limitativos de desórdenes a ser tratados aquí, incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y malignidades del linfoide; desórdenes neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros desórdenes de glándulas, de macrófagos, epiteliales, estromales y blastocoéticos; y desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos . El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se usa para referir una cantidad que tiene efecto antiproliferativo. Preferiblemente, la cantidad terapéuticamente efectiva tiene actividad apoptótica, o es capaz de inducir a la muerte celular, y preferiblemente a la muerte de células tumorígenas benignas o malignas. La eficacia se puede medir en formas convencionales, dependiendo de la condición a ser tratada. Para la terapia del cáncer, la eficacia se puede medir, por ejemplo, valorando el tiempo de progreso de la enfermedad (TTP) , o determinando las velocidades de respuesta (RR) (véase, Ejemplo 1, posteriormente) . La cantidad terapéuticamente efectiva también se refiere a una concentración de suero de blanco, tal como una concentración de suero máxima, que se ha mostrado que es efectivo en la inhibición de síntomas de la enfermedad cuando se mantiene por un periodo de tiempo. ^^,t^..i,^^ M^<^^^^,-^i^ Los términos "cáncer" y "canceroso" se refiere o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento de células no reguladas. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin estar limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, Cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de senos, cáncer de colón, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glándulas salivarías, cáncer del riñon, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. El término "agente citotóxico" como se usa aquí se refiere a una substancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células. El término está propuesto para incluir los isótopos radioactivos (por ejemplo I131, I125, Y90 y Re186) , agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, o fragmentos de los mismos .

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXANMR) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamisa, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticas tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, Carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorubiciña, idarubicina, marcelomiecina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina: anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprima, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilistano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; alfornitina; acetato de aliptinio; etoglucida; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; Ionidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2' , 2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C") , ciclofosfamida; tiotepa; taxanoz, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (T.AXOTERE®, Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los mencionados anteriormente. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores tales como antiestrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifen, raloxifeno, 4 (5) -imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelin; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualesquiera de los mencionados anteriormente.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que sobreexpresa ErbB2 ya sea in vi tro o in vivo. Por consiguiente, el agente inhibidor del crecimiento es uno el cual reduce significativamente el porcentaje de células de sobreexpresión de ErbB2 en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , tal como agentes que inducen la detención de Gl y la detención de fase M. Los bloquadores de fase M clásicos incluyen los vincas (vincristina y vinblastina) . Los inhibidores TAXOL®, y topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se extienden sobre la detención de la fase S, por ejemplo, agentes de alquilación de .ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Además la información se puede encontrar en Tiie Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al . , (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. El anticuerpo 4D5 (y los equivalentes funcionales de los mismos) también se puede emplear para este propósito. La "doxorubicina" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de doxorubicina es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3, 6-tridesoxi-a-L-lixo- hexopiranosil) oxi] -7, 8, 9, 10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5, 12-naftacendiona. El término "citosina" es un término genérico para proteína liberadas por una población de células la cual actúa en otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citosinas son linfocinas, monocinas, y hormonas de polipéptidos tradicionales. Se incluyen entre las citosinas la hormona del crecimiento tal como hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano de N-metionilo, y hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína tales como la hormona de estimulación del folículo (FSH), hormona para la estimulación de las tiroides (TSH), y hormona de luteinización (LH) ; factor de crecimiento heptáico; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor a y ß de necrosis de tumor; substancia inhibidora de mulerian; péptido asociado a gonadotropina del ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) tal como TGF-a y TGF-ß; factor I y II de crecimiento semejante a la insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferonas tales como interferona a, ß, y ?; factores de estimulación de colonias (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis del tumor tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores de polipéptido que incluyen LIF y conjunto de ligandos (KL) . Como se usa aquí, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia nativa. El término "profármaco" cuando se usa en esta solicitud se refiere a una forma de precursor o derivado de una substancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a células de tumores comparadas con el fármaco base y es capaz de ser activado o convertido enzimáticamente en la forma base más activa. Véase, por ejemplo, Wil an, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society ffiM i^^ Transactions. 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al . , "Prodrugs: A Chemical Approach to Targ ted Drug Delivery", Directed Drug Delivery; Borchardt et al . , (ed.). pp. 247-267. Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero sin estar limitados a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido. Los profármacos modificados con aminoácido D, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente substituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente substituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina los cuales se pueden convertir en los fármacos libres citotóxicos más activos. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar en una forma de profármaco para uso en esta invención incluyen, pero sin estar limitados a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual los anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención se pueden adherir. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas aquí, incluyen aquellas formadas parcialmente o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio poroso *i?£Ífe ^.^^^¿^^^^ ^M^M i controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender la cavidad de una placa de ensayo; en otros es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad) . Así, el término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la Patente Norteamericana No, 4,275,149. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos, y/o tensioactivo el cual es útil para suministrar un fármaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB2 descritos aquí y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma están arreglados comúnmente en una formación de dos capas, similar al arreglo de lípido de membranas biológicas. El término "inserto de empaque" se usa para referir a instrucciones habitualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o peligros que se refieren al uso de tales productos terapéuticos.

El término "concentración de suero", "concentración de fármaco de suero", o concentración de anticuerpos anti-ErbB2 HERCEPTIN® del suero" se refiere a la concentración de un fármaco, tal como anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, en el suero sanguíneo de un paciente animal o humano que es tratado con el fármaco. La concentración de suero del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, por ejemplo, se determina preferiblemente por el inmunoensayo. Preferiblemente, el inmunoensayo es un ELISA de acuerdo con el procedimiento descrito aquí. El término "concentración del suero pico" se refiere a la máxima concentración de fármaco de suero poco tiempo después del suministro del fármaco en el paciente animal o humano, después de que el fármaco se haya distribuido en todo el sistema sanguíneo, pero antes de que haya ocurrido la distribución del tejido significante, metabolismo o excreción del fármaco por el cuerpo. El término "concentración de suero máxima" se refiere a la concentración de fármaco del suero en un periodo después del suministro de una dosis previa e inmediatamente previo al suministro de la siguiente dosis subsecuente del fármaco en una serie de dosis. Generalmente, la concentración de suero máxima es una concentración de fármaco eficaz, mantenida mínima, en las series de administraciones de fármacos. También, la concentración de suero máxima frecuentemente es tomada como blanco como una concentración de suero mínima para la eficacia, a causa de que representa la concentración de suero a la cual otra dosis de fármaco se va administrar como parte del régimen de tratamiento. Si el suministro de fármaco es por administración intravenosa, la concentración de suero máxima se logra en forma más preferible dentro de 1 día de un suministro de fármaco inicial de carga frontal. Si el suministro de fármaco es por administración subcutánea, la concentración de suero pico es preferiblemente alcanzada en 3 días o menos. De acuerdo con la invención, la concentración de suero máxima se alcanza de manera preferible en 4 semanas o menos, preferiblemente 3 semanas o menos, en forma más preferible 2 semanas o menos, de manera más preferida en 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos usando cualquiera de los métodos de suministro de fármacos descritos aquí. El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un fármaco en la vena de un paciente animal o humano durante un periodo de tiempo mayor que aproximadamente 5 minutos, preferiblemente entre aproximadamente 30 a 90 minutos, aunque, de acuerdo con la invención, la infusión intravenosa se administra alternativamente por 10 horas menos . El término "bolus intravenoso" o "empuje intravenoso" se refiere a una administración de fármaco en una vena de un animal o humano de modo que el cuerpo reciba el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, preferiblemente 5 minutos o menos. El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, preferiblemente dentro de una bolsa entre la piel y debajo del tejido, por suministro mantenido, relativamente lento, de un receptáculo de fármaco. La bolsa se puede crear al apretar o estirar la piel hasta y lejos del tejido subyacente. El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, preferiblemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, por suministro mantenido, relativamente lento desde un receptáculo del fármaco por un periodo de tiempo que incluye, pero sin estar limitado a, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión se puede hacer por implante subcutáneo de una bomba de suministro de fármaco implantada bajo la piel del paciente animal o humano, en donde la bomba suministra una cantidad predeterminada de fármaco por un periodo de tiempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos, o un periodo de tiempo que transcurre la duración del régimen de 5 tratamiento. El término "bolus subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco debajo de la piel de un paciente animal o humano, donde el suministro de fármaco de bolus preferiblemente es menor que aproximadamente 15 minutos, en 10 forma más preferible menor que 5 minutos, y en forma más preferible menor que 60 segundos. La administración está preferiblemente dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, en donde la bolsa es creada, por ejemplo, apretando o estirando la piel hasta y lejos el tejido 15 subyacente. El término "carga frontal" cuando se refiere a la administración del fármaco se entiende que describe una dosis inicialmente superior seguida por la misma dosis o dosis inferior a intervalos. La dosis o las dosis superiores 20 iniciales se entiende para incrementar más rápidamente la concentración de fármaco de suero del paciente animal o humano a una concentración de suero de blanco eficaz. De acuerdo con la presente invención, se logra la carga frontal por una dosis o varias dosis iniciales suministradas por tres semanas o menos que causa que la concentración de suero del animal o paciente alcance una concentración pasante de suero de blanco. Preferiblemente, la dosis o serie de dosis de carga frontal inicial se administran en dos semanas o menos, en forma más preferible en 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos. En forma más preferida, en donde la dosis inicial es una dosis única y no se sigue por una dosis de mantenimiento subsecuente por al menos 1 semana, la dosis inicial se administra en 1 día o menos. Donde la dosis inicial es una serie de dosis, cada dosis se separa por al menos 3 horas, pero no más de 3 semanas o menos, preferiblemente 2 semanas o menos, en forma más preferible 1 semana o menos, de manera más preferida 1 día o menos. Para evitar la reacción inmune adversa a un fármaco de anticuerpos tal como anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®) en un animal o paciente quien no ha sido tratado previamente con el anticuerpo, puede ser preferible suministrar dosis iniciales del anticuerpo por infusión intravenosa. La presente invención incluye suministro de fármaco de carga frontal de dosis inicial y de mantenimiento por administración de infusión o bolus, intravenosa y subcutáneamente.

La información publicada relacionada con los anticuerpos anti-ErbB2, incluye las siguientes patentes expedidas y aplicaciones publicadas: PCT/US89/00051, publicada el 5 de Enero de 1989; PCT/US90/02697, publicada el 18 de Marzo de 1990; EU 0474727 expedida el 23 de Julio de 1997; DE 69031120.6, expedida el 23 de Julio de 1997; PCT/US97/18385, publicada el 9 de Octubre de 1997; SA 97/9185, expedida el 14 de Octubre de 1997; US 5677171, expedida el 14 de Octubre de 1997; US 5720937, expedida el 24 de Febrero de 1998; US 5720954, expedida el 24 de Febrero de 1998; US 5725856, expedida el 10 de Marzo de 1998; US 5770195, expedida el 23 de Junio de 1998; US 5772997, expedida el 30 de Junio de 1998; PCT/US98/2626, publicada el 10 de Diciembre de 1998; y PCT/US99/06673, publicada el 26 de Marzo de 1999, cada uno de las patentes y publicaciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

II. Producción de Anticuerpos anti-ErbB2 Una descripción sigue como para técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención. El antígeno ErbB2 a ser usado para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del campo extracelular de ErbB2 o una porción de los mismos, que contiene el epítope deseado. Alternativamente, las células que expresan ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo, células NIH-3T3 transformadas ErbB2 sobreexpresadas; o una línea de células de carcinoma tal como células SKBR3, véase Stancovski et al . , PNAS (USA) 88:8691-8695

[1991]) se puede usar para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpo será evidente para aquellos expertos en la técnica. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales preferiblemente se presentan en animales por las múltiples inyecciones mtraperitoneal (ip) o subcutánea (sec) del antígeno relevante y un adyuvante. Pueden ser útiles para conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica a ser inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidores de tripsina de soya usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados por combinación, por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde los animales se inyectan de refuerzo con la 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en sitios múltiples. Siete a 14 días más tarde los animales se combinan y el suero se somete a ensayos para la titulación de anticuerpos. Los animales se inyectan de refuerzo hasta que se nivele la titulación. Preferiblemente, el animal de inyecta de refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden elaborar en cultivo de célula recombinante como fusiones de proteína. Además, los agentes de agregación tal como alumbre se usan adecuadamente para mejorar la respuesta inmune. (n) Anti cuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una colonia de organismos de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la colonia de organismo son idénticos excepto por las mutaciones posibles que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en menores cantidades. Por consiguiente, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo cuando no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et a l . , Na ture, 256:495 (1975), o se pueden elaborar por métodos de ADN recombinante (Patente Norteamericana No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describió antes para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente enlazarán a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro . Los linfocitos que se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Pra ctíce, pp.59-103 [Academic Press. 1986]).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más substancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parenterales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parenteral carecen de la enzima hipoxantma guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o PRET) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , las substancias previenen el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, soportan la producción de alto nivel estable de anticuerpos por las células que producen el anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma son líneas d mieloma de murina, tal como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponible de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de Amerivan Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas celulares de heteromieloma humana y de ratón y mieloma humana también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); ^i ftt^aÉ aaasfci^Jtafl¿>iM Brodeur et al . , Monoclonal An tibody Production Techmques and Applica tions, pp. 51-63 [Marcel Dekker, Inc., New York, 1987] ) . El medio de cultivo en el cual las células de hibpdoma están creciendo se somete a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. Preferiblemente, la especificidad del enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por la inmunoprecipitacion o por un ensayo de enlace ?n vi tro, tal como radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo inmunoabsorbente que enlaza a la enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada por el análisis de Scatchard de Munson et al . , Anal . Biochem . , 107:220 (1980). Después de que las células de hibpdoma se identifica que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones se pueden subcolnar limitando los procedimientos de dilución y el crecimiento por métodos estándar (Goding, Monoclona l An tibodi es : Principies and Practice , pp . 59-103 [Academic Press, 1986] ) . Los medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio D- EM o RPMI-1640.

Además , las células de hibridoma pueden crecen ín vivo como tumores de ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis , o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tal como, por ej emplo, A-Sefarosa de proteína, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis de gel , diálisis , o cromatografía de afinidad . La codificación de ADN de los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se clasifica usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando probetas de oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de murina) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión, los cuales son entonces transfectados en las células hospederas tal como células E. coli, células Cos de simio, Células de Ovarios de Hámster Chino (CHO) , o células de miel na que no producen de otra forma proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas reco binantes . Los artículos revisados en la expresión recombinante en bacteria de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs. , 130: 151-188 (1992) .

En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de genotecas de bacteriófagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al . , Nature, 348:552-554 (1990). Clackon et al . , Nat?re, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describe el aislamiento de anticuerpos humanos y de murina, respectivamente, usando genotecas de bacteriófagos. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos (rango nM) de alta afinidad entremezclando la cadena (Marks et al . , Bio/Technology, 10:779-783

[1992]), así como también la infección combinatoria y recorabinación in vivo como una estrategia para la construcción de genotecas de bacteriófagos muy grandes (Waterhouse et al . , Nuc. Acids. Res. , 21:2265-2266

[1993]). Por consiguiente, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal de aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN también se puede modificar, por ejemplo, substituyendo la secuencia de codificación para los dominios de constante de cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias de murina análogas (Patente Norteamericana No. 4,816,567; Morrison, et al . , Proc. Natl Acad. Sci . USA, 81:6851

[1984]), o por la unión covalentemente de toda la secuencia de codificación de inmunoglobulina o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina. -^s^^ ,s * Típicamente, tales polipéptidos no inmunoglobulinas son substituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables del sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. 10 (iii) Anticuerpos humanos y humanizados Los métodos para anticuerpos no humanos humanizantes son bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más 15 residuos de aminoácido introducidos en él a partir de una fuente la cual es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son a menudo referidos como residuos "de importación", los cuales son típicamente tomados de un dominio variable "de importación". La humanización puede ser 20 realizada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al . , Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Na ture, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al . , Science, 239-1534-1536

[1988]), substituyendo secuencias RDC o RDCs de roedores para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Estadounidense No. 4,816,567), en donde se ha substituido substancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente a partir de unas especies no humanas. En práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos RDC y posiblemente algunos residuos FR, son substituidos por residuos a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La selección de los dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, para ser usados en la elaboración de los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenicidad. De conformidad con el método así llamado "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la biblioteca entera de las secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana la cual es la más cercana a aquella del roedor es entonces aceptada como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol . Biol . , 196:901

[1987]). Otro método usa una región de estructura particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. La misma estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . , Proc . Na tl . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J. Immunol . , 151:2623

[1993]). Es además importante, que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de conformidad con un método preferido, los anticuerpos humanizados son preparados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Los programas de computadora son disponibles, los cuales ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos .l.^^iliM.^ a^ que influencia la habilidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antígeno. En esta forma, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados a partir del recipiente y las secuencias importadas, de manera que las características de anticuerpos deseadas, tales como afinidad incrementada para el (los) antígenos objetivos se logran. En general, los residuos RDC están directamente y más substancialmente, involucrados en la influencia de enlace al antígeno. Alternativamente, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones), que sean capaces después de la inmunización, de producir un completo repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada al anticuerpo (JH) en los ratones mutantes de la línea germinal y quimérica, resulta en la inhibición completa de la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo de gen de inmunoglobulma de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos después del cambio del antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovi ts et al . , Proc . Na tl . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Na ture, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . , Year in Immuno . , 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos pueden también ser derivados de bibliotecas que presentan fagos (Hoogenboom et al . , J. Mol . Biol . , 277:381 (1991); Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597

[1991]). (iv) Fragmen tos de an ti cuerpo Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan vía digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (véase por ejemplo, Morimoto et al . , Journal of Biochemical and Biophysícal Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al . , Science , 229:81 (

[1985]). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente por células hospederas recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidos anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser directamente recuperados de E. coli y químicamente acoplados para formar los fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167

[1992]). De conformidad con otro procedimiento, los fragmentos F(ab')2 .* ?We pueden ser aislados directamente a partir del cultivo de células hospederas recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena única (scFv) . Véase WO 93/16185. (v) Anticuerpos biespecí fieos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace por al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden enlazarse a dos diferentes epítopes de la proteína ErbB2. Por ejemplo, un brazo puede enlazarse a un epítope en el Dominio 1 de ErbB2 tal como el epítope 7C2/7F3, el otro puede enlazarse a un epítope ErbB2 diferente, por ejemplo, el epítope 4D5. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace ErbB2 con sitio (s) de enlace para EGFR, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, un brazo ant?-ErbB2 puede ser combinado con un brazo el cual se enlaza a una molécula disparadora en un leucocito, tal como una molécula del receptor de las células T (por ejemplo, CD2 o CD3) , o receptores Fc para IgG (Fc?R), tal como Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CD16) , de manera que los mecanismos de defensa celular se enfocan a la célula que expresa ErbB2. Los anticuerpos biespecíficos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a las células, las cuales expresan ErbB2. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace ErbB2 y un brazo el cual se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferon-a, alcaloide vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno de isótopos radioactivos) . Los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2. Los métodos para la elaboración de anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulina de cadena ligera y cadena pesada, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al . , Na ture, 305:537-539

[1983]). Debido a la clasificación aleatoria de inmunoglobulinas de cadenas ligera y pesada, estos hibridomas (cuadromas), producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales una tienen la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta la cual se hace usualmente por pasos de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los productos proporcionados son bajos. Los procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). De conformidad con un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo- antígeno) , son fusionados a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulmas . La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos, parte de la articulación, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contienen el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados y son co-transfectadas en un organismo hospedero adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las modalidades cuando relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes para dos o todas las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales resulta en rendimientos superiores o cuando las relaciones son de significancia no particular . En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos específicos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encuentra que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseada, como la presencia de una inmunoglobulina de cadena ligera en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este procedimiento se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase por ejemplo, Suresh et al . , Methods in Enzymology, Me* k^IÉ^.^.^ 121:210 (1986). De conformidad con otro procedimiento descrito en WO96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales son recuperados de un cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas menores laterales de aminoácido a partir de la interfase de la primer molécula de anticuerpo, son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la(s) cadena (s) laterales grandes, son creadas en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo, reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales no deseados tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido por t» ij.4 ejemplo, propuestos a células del sistema inmune objetivo a células indeseadas (Patente Estadounidense No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados usando cualquiera de los métodos de reticulación convenientes. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente Estadounidense No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de los fragmentos de anticuerpos han sido también descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados usando enlace químico. Brennan et al . , Science, 229:81 (1985), describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son proteolíticamente desdoblados para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en la presencia de arsenita de sodio del agente formador de complejos ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intramolecular. Los fragmentos Fab' generados son entonces convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB es después reconvertido al Fab' -tiol por reducción con la mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, el cual puede ser químicamente acoplado para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp . Med. , 175:217-225 (1992), describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada uno de los fragmentos Fab' se secretó separadamente a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Este anticuerpo biespecífico así formado, fue capaz de enlazarse a las células que sobre expresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como también provocan la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos del tumor de mama humano. Varias técnicas para elaboración y aislamiento de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivos de células recombinantes han sido también descritas. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos han sido producidos usando cierres de leucina. Kostelny et al . , J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cierre de leucina a partir de las proteínas Fos y Jun se enlazan a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por la fusión del gen. Los homodímeros de anticuerpos son reducidos a la región de articulación para formar monómeros y después re-oxidados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de los homodímeros de anticuerpos. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al . , Proc . Na tl . Acad. Scí . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaboración de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador, el cual es también corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento, son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, con ello, se forman dos sitios de enlace al antígeno. Otra estrategia para la elaboración de fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de los dímeros Fv (sFv) de cadena única también se ha reportado. Véase Gruber et al . , J.

Immunol . , 152:5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias están contemplados. Por ejemplo, los anticuerpos triespecíficos pueden ser preparados. Tutt et al . , J. Immunol . 147:60 (1991) . (vi) Selección para anticuerpos con las propiedades deseadas Las técnicas para la generación de anticuerpos se han descrito anteriormente. Se seleccionaron aquellos anticuerpos que tienen las características descritas aquí. Para seleccionar los anticuerpos los cuales inducen muerte celular, pérdida de la integridad de la membrana como se indica por ejemplo por Pl, azul tripano o captación de 7AAD se valoraron con relación al control. El ensayo preferido es el "ensayo de captación Pl que usa células BT474". De conformidad con este ensayo, las células BT474 (las cuales pueden ser obtenidas a partir de la Colección de Cultivos Tipo Americano [Rockville, MD] ) . Son cultivadas en Medio de Águila Modificado Dulbecco (D-MEM) : Ham' s F-12 (50:50) suplementado con FBS inactivado por calor al 10% (Hyclone) y 2 mM de L-glutamina. (Así, el ensayo se realiza en la ausencia de células efectoras inmunes y complementarías) . Las células BT474 se siembran a una densidad de 3 x 106 por caja en cajas de 100 x 20 mm y se dejan fijar durante la noche. El medio es entonces removido y colocado nuevamente con medio fresco solo o con medio que contiene 10 µg/ml del MAb apropiado. Las células son incubadas por un periodo de tiempo de 3 días. Después de cada tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se separan por tripsinización. Las células son entonces centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a 4°C, la pelotilla resuspendida en 3 ml de amortiguador de enlace Ca2+ enfriado en hielo (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) y sometida a alícuota en tubos de 12 x 75 tapados forzados de 35 mm ( 1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la remoción de los grupos celulares. Los tubos entonces reciben Pl (10 µg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y software CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson) . Los anticuerpos los cuales inducen niveles estadísticamente significantes de muerte celular como se determinó por la captación de Pl se seleccionaron. Para seleccionar anticuerpos los cuales inducen apoptosis, está disponible un "ensayo de enlace de anexina que usa células BT474". Las células BT474 son cultivadas y sembradas en cajas de petri como se discute en el párrafo precedente. El medio es entonces removido y colocado nuevamente con medio fresco solo o medio que contiene 10 µg/ml del MAb. Siguiendo un periodo de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se retiran por tppsinización. Las células son entonces centrifugadas, resuspendidas en amortiguador de enlace Ca2+ y sometidas a alícuotas en tubos como se discute anteriormente para el ensayo de muerte celular. Los tubos después reciben anexina etiquetada (por ejemplo, anexina V-FTIC) (1 µg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y software CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos los cuales inducen niveles estadísticamente significantes de enlace de anexina con relación al control, son seleccionados como anticuerpos que inducen apoptosis. Además del ensayo de enlace de anexina, un "ensayo de teñido de ADN que usa células BT474" es disponible. Para realizar este ensayo, las células B474 las cuales han sido tratadas con el anticuerpo de interés, como describe en los dos párrafos precedentes, se incuban con 9 µg/ml de HOECHSST 33342™ por dos horas a 37 °C, después se analizan en un citómetro de flujo EPICS ÉLITE™ (Coulter Corporation) usando ?*t'í' > »-< «^#rt»# software MODIFT LT™ (Verity Software House) . Los anticuerpos los cuales inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas las cuales son 2 veces o mayores (y preferiblemente 3 veces o mayores) que las células no tratadas (hasta 100% de células apoptóticas) pueden ser seleccionados como anticuerpos pro-apoptóticos usando este ensayo. Para seleccionar anticuerpos los cuales se enlazan a un epítope en ErbB2 enlazado por un anticuerpo de interés, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquél descrito en An tibodies , A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) . Alternativamente, la formación de mapas epítopes puede ser realizada por los métodos conocidos en la técnica. Para identificar anticuerpos anti-ErbB2, los cuales inhiben el crecimiento de células SKBR3 en el cultivo celular por 50-100%, el ensayo SKBR3 descrito en WO 89/06692 puede ser realizado. De conformidad con este ensayo, las células SKBR3 se hacen crecer en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, glutamina y penicilinaestreptomicina. Las células SKBR3 son colocadas en placas a 20,000 células en una caja de cultivo celular de 35 mm (2 mls/35 mm caja) . 2.5 µg/ml del anticuerpo anti-ErbB2 se agrega por caja. Después de seis días, el número de células, comparado con las células no tratadas, se cuenta usando un contador celular electrónico COULTER™. Aquellos anticuerpos los cuales inhiben el crecimiento de las células SKBR3 por 50-100% se seleccionan para combinación con los anticuerpos apoptóticos como se desee. (viii) Diseño genético de función efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para así mejorar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, el (los) residuo(s) de cisteína pueden ser introducidos en la región Fc, con ello, se permite la formación de enlaces de disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado, puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte celular incrementada mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (CCDA) . Véase Carón et al . , J. Exp . Med. 176:1191-1195 (1992), y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada, pueden también ser preparados usando enlazadores contrarios heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado genéticamente, el cual tenga regiones Fc duales y pueda con ello, tener lisis de complemento mejorado y capacidades ADCC. Véase Stevenson et al . An ti -Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). (viii) Inmunoconj ugados La invención también pertenece a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito aquí, conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, o fragmentos de los mismos) , o un isótopo radioactivo (es decir, radioconjugado) . Los agentes quimioterapéuticos empleados en la generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de los mismos los cuales pueden ser usados, incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazantes de difteria toxina, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurí tes fordii , proteínas diantinas, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de la carantia momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionúcidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados anti-ErbB2. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxíco son elaborados usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidiilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tal como bis (p-diazoniobenzoil) -etilendimina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisoc?anato de tolueno) y compuestos de fluoro bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, -dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al . Science 238:1098 (1987). El ácido triaminpentaacético de 1- isotiocianatobencil-3-metildietileno (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14, es un agente de quelación ejemplar para la conjugación de radionúclidos al anticuerpo. Véase WO 94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo puede estar conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en el tumor pre-objetivo en donde el conjugado de anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción del conjugado no enlazado a partir de la circulación usando un agente de depuración y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina), la cual se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido) . (ix) Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-ErbB2 descritos aquí, pueden también ser formulados como inmunoliposomas. Las liposomas que contienen el anticuerpo son preparadas por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al . , Proc . Na tl . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang et al . , Proc . Na tl . Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980); y Patentes Estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Las líposomas con tiempo de circulación incrementado se describen en la Patente Estadounidense No. 5,013,556. Las liposomas particularmente empleadas pueden ser generadas por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE) . Las liposomas son sometidas a extrusión a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención, pueden ser conjugados a las liposomas como se describe en Martin et al . , J. Biol . Chem . 257:286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro de la liposoma. Véase Gabizon et al . , J. Na tional Cáncer Inst . 81(19)1484(1989). (x) Terapia de Profárma co Mediada por la Enzima Dependien te del Anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser usados en ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima de activación por profármaco, la cual convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, véase WO 81/01145) a un fármaco anti-cancerígeno activo. Véase por ejemplo, WO 88/07378 y Patente ^á ,*^?* S**á** Estadounidense No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado empleado para ADEPT, incluye cualquier enzima capaz d© actuar a un profármaco de una manera tal para convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son empleadas en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a fosfatasa alcalina empleada para convertir los profármacos que contienen fosfato, en fármacos libres; arilsulfato empleados para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; desaminasa citosina empleada para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cancerígeno, 5-fluoroacilo; proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina, subtilisina, carbopeptidasas y catepsinas (tal como catepsinas B y L) , que son empleadas para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxípeptidasas, empleadas para convertir profármacos que contienen substituyentes de D-aminoácidos; enzimas que desdoblan carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa empleadas para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa empleada para convertir fármacos derivatizados con ß-lactamas en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tales como amidasa penicilina V o amidasa penicilina G, empleadas para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", pueden ser usados para convertir los profármacos de la invención en los fármacos activos libres (véase por ejemplo, Massey, Na ture 328; 57-458

[1987] ) . Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden ser preparados como se describe aquí para suministrar la abzima a una población de células del tumor. Las enzimas de esta invención pueden estar covalentemente unidas a los anticuerpos anti-ErbB2 por técnicas bien conocidas en el arte, tal como el uso de agentes de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos una región de enlace de antígeno de un anticuerpo de la invención ligadas a al menos, una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, pueden ser construidas usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el arte (véase por ejemplo, Neuberger et al . , Na ture, 312:604-608

[1984]). (xi) Fusiones de epí topes de enlace al receptor salvaje de anticuerpo En ciertas modalidades de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, preferentemente un anticuerpo intacto, para incrementar la penetración del tumor, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para incrementar la penetración del tumor, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para incrementar su vida media del suero. Esto se puede lograr por ejemplo, por la incorporación de un epítope de enlace al receptor salvaje en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o por incorporación del epítope en un extremo péptido que es entonces fusionado al fragmento de anticuerpo ' a ya sea el extremo o en la mitad, por ejemplo, por ADN o síntesis peptídica) . Un método sistemático para preparar tal variante de anticuerpo que tiene una vida media in vivo incrementada, comprende varios pasos. El primero involucra identificar la secuencia y conformación de un epítope de enlace receptor salvaje de una región Fc de una molécula IgG. Una vez que este epítope es identificado, la secuencia del anticuerpo de ?M ÜÉ - tidií»"-;!" ..•' «a interés es modificada para incluir la secuencia y conformación del epítope de enlace identificado. Después que la secuencia es mutada, la variante de anticuerpo se somete a prueba para ver si tiene una vida media in vivo más larga que aquella del anticuerpo original. Si la variante de anticuerpo no tiene una vida media in vivo más larga después de someterse a prueba, su secuencia es además alterada para incluir la secuencia y conformación del epítope de enlace identificado. El anticuerpo alterado es sometido a prueba por su vida media in vivo más larga, y este proceso se continua hasta que se obtiene una molécula que presenta una vida media ín vivo más larga. El epítope de enlace al receptor salvaje es así incorporado en el anticuerpo de interés es cualquier adecuado, tal epítope como se define anteriormente, y su naturaleza dependerá por ejemplo, en el tipo de anticuerpo a ser modificado. La transferencia se hace de manera tal que el anticuerpo de interés poseerá actividades biológicas descritas aquí. El epítope preferiblemente constituye una región en donde uno cualquiera o más residuos de aminoácidos a partir de uno o dos lazos de un dominio Fc son transferidos a una posición análoga del fragmente de anticuerpo. Aún más preferiblemente, tres o más residuos a partir de uno o dos lazos del dominio Fc se transfieren. Todavía más preferido, el epítope se toma a partir del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de un IgG) , y se transfieren a la región CH1, CH2 o VH, O más de una de las regiones al anticuerpo. Alternativamente, el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o VL o ambas, del fragmento de anticuerpo. En una modalidad más preferida, el epítope de enlace receptor salvaje, comprende la secuencia (5' a 3'): PKNSSMISNTP (SEC ID NO: 3), y opcionalmente además comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de HQSLGTQ (SEC ID NO.4), HQNLSDGK (SEC ID NO. 5), HQNISDGK (SEC ID NO.6), o VISSHLGQ (SEC ID NO.7), particularmente en donde el fragmento de anticuerpo es Fab o F(ab')2. En otra modalidad más preferida, el epítope de enlace al receptor salvaje, es un polipéptido que contiene la(s) secuencia (s) (5' hasta 3'): HQNLSDGK (SEC ID NO:5), HQNISDGK (SEC ID NO:6), o VISSHLGQ (SEC ID NO: 7), y la secuencia : PKNSSMISNTP (SEC ID NO.:3). (xii) Purificación de anticuerpo anti-ErbB2 Cuando se usan técnicas recombinantes, el Hl jJyl ^ U l -í f? t «**"- -'— — — anticuerpo puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, el desecho particulado, ya sea célula hospedera o fragmentos sometidos a lisis se remueven por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al . , Bio/Technology 10:163-167 (1992), describe un procedimiento para aislamiento de anticuerpos los cuales son secretados en el espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, la pasta celular es cebada en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5) EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) sobre aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser removidos por centrifugación. En donde el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes a partir de tales sistemas de expresión son preferiblemente primero concentrados usando filtros de concentración de proteínas comercialmente disponibles, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Milipore Pellicon. Un inhibidor de la proteasa tal como PMSF, puede ser incluido en cualquiera de los pasos mencionados anteriormente para inhibir la proteólisis y los antibióticos pueden ser incluidos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo preparada a partir de las células, puede ser usada purificando por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, con cromatografía de afinidad siendo la técnica de purificación preferida. La adecuabilidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser usada para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas ?l, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al . , J. Immunol . Meth . 62:1-13

[1983]). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para el ?3 humano (Guss et al . , EMBO J. 5:15671-1575

[1986]). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une, es más frecuentemente agarosa, pero otras matrices son disponibles. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno, permitido para velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden ser logradas con la agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Barker, Phillipsburg, NJ) es usada para purificación. Otras técnicas para la purificación de la proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio, son también disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado. Después de cualquier paso de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes, puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo usando un amortiguador de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferiblemente realizado a concentraciones bajas de sal (por ejemplo, desde aproximadamente sal de 0-0.25M) .

III. Determinación de la concentración de anticuerpo anti-ErbB2 en suero El ensayo no limitante siguiente es empleado para determinar la presencia de y para cuantificar la cantidad de HER2 rhuMAb específico (anticuerpo monoclonal anti-pl85HER2 humanizado, incluyendo anticuerpo ant?-ErbB2 HERCEPTIN®) en un fluido corporal de un mamífero que incluye pero no se limita a, suero, fluido amniótico, leche, suero de cordón umbilical, líquidos vitreos y acuosos oculares y gel vitreo ocular.

Ensayo de Actividad Enlazante en Placa para HER2 rhuMAb (Anticuerpo Monoclonal Ant?-pl85HER2 Humanizado) El método de ensayo de HER2 rhuMAb descrito aquí, es sugerido como un ejemplo de tal método y no significa ser limitante. Una preparación estandarizada de HER2 rhuMAb (Genetech, Inc., South San Francisco, CA) , controles, y muestras de suero, se diluyó con Diluyente de Ensayo (PBS/BSA al 0.5%/Pol?sorbato 20 al 0.5%/T?merosal al 0.01%). Las diluciones de HER rhuMAb estandarizadas se prepararon para medir un rango de concentraciones empleadas para una curva estándar. Las muestras se diluyeron para caer dentro de la curva estándar. Una alícuota de Antigeno de Revestimiento en Amortiguador de Revestimiento (pl85HER2 recombmante (Genetech, Inc.) en 0.05M de amortiguador de carbonato de sodio) , se agrego a cada pozo de una placa microtituladora y se incubo a 2-8 °C por 12-72°. La solución de revestimiento se remueve y cada pozo se lava seis veces con agua, después se mancha para remover el exceso de agua, Una alícuota del Diluyente de Ensayo, se agregó a cada pozo e incubó por 1-2 horas a temperatura ambiente con agitación. Los pozos se lavaron como en el paso previo. Alícuotas de soluciones de muestra y control, estándares diluidas, se agregaron a los pozos y se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora con agitación para permitir el enlace del anticuerpo al antígeno de revestimiento. Los pozos se lavaron nuevamente con agua como en los pasos previos. Conjugado de peroxidasa de rábano picante (conjugado HRP, Fc IgG anti-humano de cabra conjuga a peroxidasa de rábano picante: Organon Teknika catalog #55253 o equivalente) , se diluyó con Diluyente de Ensayo para proporcionar un rango de densidad óptica entre los estándares más altos y los más bajos. Una alícuota de la solución de conjugado HRP se agregó a cada pozo e incubó a temperatura ambiente por 1 hora con agitación. Los pozos se lavaron con agua como en los pasos previos. Una alícuota de la Solución de Substrato (o-fenilendia ina (OFD) tableta de 5 mg (Sigma P9612 o equivalente) en 12.5 ml 4 mM H202 en PBS), se agregó a cada pozo e incubó por un periodo de tiempo suficiente (aproximadamente 8-10 minutos) en la oscuridad a temperatura ambiente para permitir el desarrollo del color. La reacción se detuvo con una alícuota de ácido sulfúrico 4.5 N. La densidad óptica se leyó a 490-492 nm para detección de absorbencia y 405 nm para referencia de absorbencia. Los datos de la curva estándar se trazaron y los resultados para los controles y las muestras se determinaron de la curva estándar.

IV. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos usados de conformidad con la presente invención, se preparan por almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores opcionales farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores {Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th. Edición, Osol, A. Ed.

[1980]), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores aceptables, excipientes o estabilizadores son no tóxicos a recipientes a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol fenol, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propilparaben; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes queiantes tales como EDTA; azúcares tal como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; iones contadores formadores de sal, tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™, o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpos anti-ErbB2 liofilizadas preferidas, se describen en WO 97/04801, expresamente incorporadas aquí por referencia. La formulación aquí puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular a ser tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable además, proporcionar anticuerpos los cuales se enlazan a EGFR, ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo el cual se enlaza a un epítope diferente en ErbB2), ErbB3, ErbB4, o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una formulación. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citosina o agente inhibidor de crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los ingredientes activos pueden también ser atrapados en microcápsulas preparados por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas poli (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son descritas en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edición, Osol, A. Ed. (1980) . Las formulaciones para ser usadas para administración in vi vo, deben ser estériles. Esto es fácilmente acompañado por la filtración a través de membranas de filtración estériles. Las preparaciones de liberación sostenida se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, en el cuál las matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidrox?etil- metacplato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilátidos (Patente Estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L- glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™, (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido-ácido glicólico y acetato de leuprolido) , y ácido poli-D- (-) -3- hidroxibutírico. Mientras los polímeros tales como etileno- acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación de moléculas sobre 100 días, ciertas proteínas de liberación de hidrogeles para periodos de tiempo m s cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permaneces en el cuerpo por un tiempo largo, pueden ser desnaturalizados o agregados como un resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden ser divisadas para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre por ser formación de enlace S-S intramolecular a través del intercambio tio- disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

V. Tratamiento con los .Anticuerpos Anti-ErbB2 Se contempla que, de conformidad con la presente invención, los anticuerpos anti-ErbB2 pueden ser usados para tratar varias condiciones caracterizadas por la sobre expresión y/o activación del receptor ErbB2. Las condiciones ejemplares o alteraciones incluyen tumores benignos o malignos (por ejemplo, tumores renales, hígado, riñon, vejiga, mama, gástrico, ovario, colorectal, próstata, pancreático, pulmón, vulva, tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello) ; leucemias y malignidades linfoides; otras alteraciones tales como alteraciones neuronales, guales, astrocitales, hipotalámicas y otras glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicas; y alteraciones inflamatorias, angiogénicas e inmunogénicas. Los anticuerpos de la invención son administrados a un paciente humano, de conformidad con los métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. Se prefiere la administración subcutánea del anticuerpo. El tratamiento de la presente invención involucra la administración del anticuerpo anti-ErbB2 a un paciente humano o animal, seguido por intervalos por dosis subsecuentes de dosis iguales o más pequeñas, de manera tal que se logre una concentración de suero objetiva y se mantenga durante el tratamiento. Preferiblemente, las dosis de mantenimiento se suministran por suministro de bolo, preferiblemente por administración subcutánea del bolo, haciendo al tratamiento conveniente y efectivo en costo para el paciente y los profesionales del cuidado de la salud. En donde la administración combinada de un agente quimioterapéutico (preferentemente una antraciclina se desee) , la administración combinada incluye coadministración, usando formulación separada o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) los ingredientes activos simultáneamente ejercen sus actividades biológicas. La preparación y programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos puede ser usada de conformidad con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el practicante especialista. Los programas de preparación y dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico puede preceder o siguiendo la administración del anticuerpo o puede ser dado simultáneamente con éste. El anticuerpo puede ser combinado con un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifeno o una anti-progesterona tal como onapristona (véase, EP 616 812) en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Puede ser deseable también, administrar anticuerpos contra otros antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos los cuales se enlazan al EGFR, ErbB3, ErbB4, o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Alternativamente, o adicionalmente, dos o más anticuerpos anti-ErbB2 pueden ser co-administrados al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también administrar una o más citosinas al paciente. El anticuerpo ErbB2 puede ser co- administrado con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser administrado primero, seguido por el anticuerpo ErbB2. Sin embargo, las administraciones simultáneas, o administración del anticuerpo ErbB2 primero, están también contempladas. Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas actualmente usadas y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y anticuerpo ant?-ErbB2. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a remoción quirúrgica de las células cancerígenas y/o terapia de radiación. Para la prevención o tratamiento del padecimiento, la dosificación apropiada del anticuerpo anti-ErbB2 dependerá del tipo de padecimiento a ser tratado, como se define anteriormente, la severidad y curso del padecimiento, si el anticuerpo es administrado para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción de la atención del especialista. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente a un tiempo o sobre una serie de tratamientos. En donde el tratamiento involucra una serie de tratamientos, la dosis inicial o dosis iniciales son seguidas a intervalos diariamente o semanalmente por dosis 5 de mantenimiento. Cada dosis de mantenimiento proporciona la misma o menor cantidad de anticuerpo, comparado con la cantidad de anticuerpo administrado en la dosis las dosis iniciales . Dependiendo del tipo y severidad del padecimiento, 10 aproximadamente 1 µg/kg hasta 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) del anticuerpo, está una dosificación candidata inicial para administración al paciente, si por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podrá variar desde 15 aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg7kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas sobre varios días o más largos, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas del 20 padecimiento. El progreso de esta terapia es fácilmente monitoreado por técnicas y ensayos convencionales. De conformidad con la invención, los regímenes de dosificación puede incluir una dosis inicial de un anti- ErbB2 de 6 mg/kg, 8 mg/kg o 12 mg/kg suministrado por infusión intravenosa o subcutánea, seguida por dosis de mantenimiento semanales subsecuentes de 2 mg/kg por infusión intravenosa, inyección intravenosa del bolo, infusión subcutánea o inyección subcutánea del bolo. En donde el anticuerpo es bien tolerado por el paciente, el tiempo de infusión puede reducirse. Alternativamente, la invención incluye una dosis inicial de 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguido por las dosis de mantenimiento subsecuentes de 6 mg/kg una ves por 3 semanas. Otros regímenes de dosificación involucran una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguido por 6 mg/kg una vez por 3 semanas. Todavía otro régimen de dosificación involucra una dosis inicial de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguido por dosis de mantenimiento subsecuentes de 8 mg/kg una vez por semana o 8 mg/kg una vez cada 2 a 3 semanas. Como un régimen alternativo, las dosis iniciales de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, pueden ser administradas en cada uno de los días 1, 2 y 3, seguida por dosis de mantenimiento subsecuente de 6 mg/kg una vez por 3 semanas.

A &A* S2Í ***^l ¡****ié* ?*ÍL Un régimen adicional involucra una dosis inicial de 4 mg7kg de anticuerpo anti-ErbB2, seguido por dosis de mantenimiento subsecuente de 2 mg/kg dos veces por semana, en donde las dosis de mantenimiento son separadas por 3 días . Alternativamente, la invención puede incluir un ciclo de dosificación en el cual, el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 es 2-3 veces por semana por 3 semanas. El ciclo de 3 semanas es preferiblemente repetido como sea necesario, para lograr la supresión de los síntomas del padecimiento. La invención además incluye un régimen de dosificación cíclica en el cual, el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 es diariamente por 5 días. De conformidad con la invención, el ciclo es preferiblemente repetido como sea necesario para lograr la supresión de los síntomas del padecimiento. La información además acerca de dosificaciones adecuadas se proporciona en los Ejemplos abajo.

VI. Artículos de Manufactura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene los materiales empleados para el tratamiento de los desordenes descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un contenedor, una etiqueta y un inserto de envase. Los contenedores adecuados incluyen por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene una composición la cual es efectiva para tratar la condición y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-ErbB2. La etiqueta en, o asociada con el contenedor, indica que la composición se usa para tratar la condición de elección. El artículo de manufactura puede además comprender un segundo contenedor que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como salina amortiguada de fosfato, solución Ringer y solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables a partir de un punto de permanencia comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Además, el artículo de manufactura puede comprender insertos de envase con instrucciones para usarse, incluyendo por ejemplo, una advertencia de que la n*. composición no se puede usar en combinación con el agente quimioterapéutico del tipo antraciclina, por ejemplo, doxorubicina o epirubicina.

Depósito de Materiales Las siguientes líneas celulares de hibridoma han sido depositadas con la Colección de Cultivos Tipo .Americano 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) : Designación de ATCC No. Fecha del Depósito anticuerpo 7C2 ATCC HB-12215 Octubre 17, 1996 7F3 ATCC HB-12216 Octubre 17, 1996 4D5 ATCC CRL 10463 Mayo 24, 1990 2C4 ATCC HB-12697 Abril 8, 1999 Los detalles adicionales de la invención serán ilustrados por los siguientes Ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación y Eficacia del Anticuerpo Anti-ErbB2 HERCEPTIN® Materiales y Métodos Anticuerpo monoclonal Anti -ErbB2. El anticuerpo monoclonal de murina 4D5 Igdk anti-ErbB2, específico para el dominio extracelular de ErbB2, se produjo como se describe en Fendly et al . , Cáncer Research 5o: 1550-1558 (1990) y WO 89/06692. Brevemente, las células NIH 3T3/HER2-3400 (que expresan aproximadamente 1 x 105 moléculas/células ErbB2) producidas como se describe en Hudziak et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . (USA) 84:7159 (1987), se cosecharon con salina amortiguada de fosfato (PBS) que contiene 25 mM de EDTA y se usaron para inmunizar ratones BALB/c. A los ratones se les dieron inyecciones i.p de células 107 en 0.5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisuero que inmunoprecipitaron ErbB2 32P-etiquetados, se les dio inyecciones i.p. de un extracto de membrana ErbB2 purificado de Sefarosa de aglutinina de germen de trigo (AGT) en las semanas 9 y 13. Esto se siguió por una inyección i.v. de 0.1 ml de la preparación de ErbB2 y los esplenocitos se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes del hibridoma se seleccionaron para el enlace ErbB2 por ELISA y radioinmunoprecipitación. El MOPC-21 (IgGl), (Cappell, Durham, NC) , se usó como un control igualado de isotipo) . El tratamiento se realizó con una versión humanizada del anticuerpo 4D5 de murina (anticuerpo anti- ErbB2 HERCEPTIN®) . El anticuerpo humanizado se diseñó genéticamente insertando las regiones de determinación de complementariedad del anticuerpo 4D5 murina en la estructura de una inmunoglobulina humana consenso IgGi (IgGi) (Cárter et al . , Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:4285-4289

[1992]). El anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 humanizado resultante tiene alta afinidad para pl85HER2 (constante de Dilohiación [Kd]=0.1 nmol/L) , marcadamente inhibe los xenógrafos in vi tro y en humanos, el crecimiento de las células de cáncer de mama que contienen altos niveles de pl85HER2, induce citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) , y se han encontrado clínicamente activas, como un agente único, en pacientes con cánceres de mama metastáticos que sobre expresan ErbB2 que han recibido terapia previa extensiva. El anticuerpo anti- ErbB2 HERCEPTIN® se produce por una línea de células de Ovario de Hámster Chino diseñadas genéticamente (CHO) , que crecen en gran escala, que secretan el anticuerpo en el medio de cultivo. El anticuerpo es purificado a partir del medio de cultivo CHO usando métodos de filtración y cromatográficos estándares. Cada lote de anticuerpo usado en este estudió, se sometió a ensayo para verificar la identidad, pureza y potencia, así como también para sugerir los requerimientos de Administración de Alimentos y Fármacos para esterilidad y seguridad.

Cri terio de Elegibilidad. Los pacientes tienen que cubrir completamente todos los siguientes criterios para ser elegibles para la admisión al estudio: -Cáncer de mama metastásico -Sobre expresión del oncogen ErbB2 (HER2) (2+ hasta 3+ como se determina por inmunohistoquímica o hibridación in si tu fluorescente (FISH) . [La expresión del tumor de ErbB2 puede ser determinada por análisis inmunohistoquímico como se describe previamente (Slamon et al . ,

[1987] y

[1989], supra), de una serie de secciones delgadas preparadas de los bloques de tumores logrados por la parafina del paciente. El anticuerpo detectante primario usado es murina 4D5 MAb, el cual tiene el mismo CDR como el anticuerpo humanizado usado para el tratamiento. Los tumores son considerados por sobre expresar el ErbB2 si al menos 25% de las células de tumores presentan características de teñido de membrana para pl85HER2] . -Padecimiento bidimensionalmente medible (que incluye lesiones óseas líticas) por medios radiográficos, examinación física o fotografías. -Los padecimientos medibles se definen como cualquier masa reproduciblemente medible en dos diámetros perpendiculares por examinación física, rayos X (películas plantas), tomografía computarizada (CT) , formación de imágenes de resonancia magnética (IRM), ultrasonido o fotografías. Los metastasos osteoblásticos, efusiones pleurales o ascitos, no son considerados como medibles. Las lesiones medibles deben ser al menos 1 cm en la dimensión más grande. La enumeración de sitios evaluables de padecimiento metastático y número de lesiones en un sitio evaluable (por ejemplo, pulmón) , no se han registrado en la Forma de Reporte de Casos apropiada (FRC) . Si un gran número de lesiones pulmonares y hepáticas se presentan, las seis lesiones más grandes por sitio se siguen. -La habilidad para entender y de buena gana firmar una forma de consentimiento informada escrita -Mujeres > 18 años -Candidatos adecuados para recibir quimioterapia citotóxica concomitante como se evidencia por las valoraciones de laboratorio de selección para funciones hematológicas, renales, hepáticas y metabólicas.

Cri terio de Excl usión . Pacientes con cualquiera de los siguientes se excluyeron de la entrada al estudio: -Quimioterapia citotóxica previa para cáncer de mama metastático -Pacientes pueden haber recibido terapia hormonal previa (por ejemplo, tamoxifen) para padecimiento metastático o terapia citotóxica en la colocación del adyuvante . -La malignidad concomitante no se ha tratado curativamente -Un estado de realización de <60% en la escala Karnofsky -Mujeres embarazadas o nodrizas; mujeres de potencial de maternidad, a menos que usen anticonceptivos efectivos como se determinó por el investigador -Cáncer de mama bilateral (ya sea tanto tumores primarios deben tener sobre expresión HER2 2+ o 3+, o el sitio metastático debe tener sobre expresión HER2 2+ o 3+, o el sitio metastático debe tener sobre expresión HER2 2+ o 3+) -Uso de agentes investigacionales o sin licencia dentro de 30 días previo a la entrada del estudio -Metástasis no tratada o clínicamente inestable en el cerebro (por ejemplo, que requieren terapia por radiación) .

Basados en el criterio expuesto anteriormente, se seleccionaron 469 pacientes y se enrollaron en el estudio.

La mitad de pacientes (estratificados por quimioterapia) se aleatorizaron para recibir adicionalmente el anticuerpo anti-ErbB2 ERCEPTIN® (véase abajo) .

Administración y Dosificación Anticuerpo Anti-ErbB2 Al día 0, una dosis de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 humanizado (HERCEPTIN®, H) , se administró intravenosamente, durante un periodo de 90 minutos. Comenzando en el día 7, pacientes recibieron semanalmente administración de 2 mg/kg del anticuerpo (i.v) durante un periodo de 90 minutos.

Quimioterapia Los pacientes recibieron uno de los dos regímenes de quimioterapia por un mínimo de seis ciclos, proporcionado su padecimiento sin progresión: a) ciclofosfamida y doxorubicina o epirubicina (AC) , si los pacientes no han recibido terapia con antraciclina en la colocación del adyuvante, o b) paclitaxel (T, TAXOL®), si los pacientes han recibido cualquier terapia de antraciclina en la colocación del adyuvante. La dosis inicial del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® precede el primer ciclo de ya sea el régimen de quimioterapia por 24 horas. Las dosis subsecuentes del anticuerpo se dieron inmediatamente antes de la administración de la quimioterapia, si la dosis inicial del anticuerpo fue bien tolerada. Si la primera dosis del anticuerpo no fue bien tolerada, las infusiones subsecuentes continuaron preceder la administración de quimioterapia por 24 horas. A los pacientes se les permitió continuar recibiendo quimioterapia más allá de seis ciclos si, en la opción del especialista que lo trata, fueron continuando recibiendo tratamiento benéfico. Se dio ciclofosfamida (600 mg/m2) ya sea por empuje iv sobre un periodo mínimo de 3 minutos o por infusión durante un periodo máximo de 2 horas. La doxorubicina (60 mg/m2) o epirubicina (75 mg/cm2) se dio ya sea por empuje iv lento durante un periodo mínimo de 3-5 minutos o por infusión durante un periodo máximo de 2 horas, de conformidad con el protocolo institucional .

*•»•**. El paclitaxel (TAXOL®) se dio a una dosis de 175 mg/m2 durante 3 horas por administración intravenosa. Todos los pacientes que recibieron paclitaxel se premedicaron con dexametasona (o su equivalente) 20 mg x 2, administrado 5 oralmente 12 y 6 horas previo al paclitaxel; difenhidramina (o su equivalente) 50 mg, iv, administrado 30 minutos previo al paclitaexl, y dimetidina (u otro bloqueador H2) , 300 mg iv, administrado 30 minutos previo al paclitaxel. 10 Cri terio de Respuesta Padecimiento Progresivo. Evidencia objetiva de un incremento del 25% o más en cualquier lesión medible. El padecimiento progresivo también incluye aquellos ejemplos cuando las nuevas lesiones han aparecido. Para lesiones 15 óseas, el progreso se definió como un incremento del 25% en medición objetiva por película plana, CT, MRI; nuevas lesiones sintomáticos, no debido a rupturas; o requerimiento de radioterapia paliativa. 20 Respuesta Compleca. La desaparición de todos los tumores radiográficamente y/o visualmente aparentes por un mínimo de 4 semanas. Las respuestas completas de la pared de la piel y el pecho se han confirmado por biopsia.

V<f Respuesta Parcial. Una reducción de al menos 50% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones medibles por un periodo mínimo de 4 semanas. No pueden haber aparecido nuevas lesiones, ni pueden muchas lesiones haber progresado en tamaño.

Respuesta Menor. Una reducción de 25% hasta 49% en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones medióles. No pueden haber aparecido nuevas lesiones, ni puede cualquier lesión haber progresado en tamaño .

Padecimiento Estable. Sin cambio de más de 25% en el tamaño de las lesiones medibles. No pueden haber aparecido lesiones. El tiempo para la progresión del padecimiento se calculó (TPP) a partir del comienzo de la terapia a la progresión. Los límites de confidencia para las velocidades de respuesta se calcularon usando el método exacto para una proporción única. (Fleiss, JL, Sta tistical Methods for Rates and Proportions (ed. 2), New York, NY, Wiley, 1981, pp 13-17) .

Resultados A una mediana siguiendo de los 10.5 meses, las valoraciones de tiempo para la progresión del padecimiento (TTP en meses) y las velocidades de respuesta (RR) , mostraron un aumento significante del efecto quimioterapéutico por anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, sin incremento en los eventos adversos severos totales (AE) : Tabla 1: Eficacia del Anticuerpo Anti-ErbB2 HERCEPTIN® Enrollaido TTP (meses) RR(%) AE(%) CRx 234 5.5 36.2 66 CRx +H 235 8.6* 62.00** 69 AC 145 6.5 42.1 71 AC+H 146 9.0 64.9 68 T 89 4.2 25.0 59 T+H 89 7.1 57.3 70 *p<0.001 por prueba de arreglo log; ** p <0.01 por prueba X2; CRx: quimioterapia; AC: tratamiento de antraciclina/ciclofosfamida; H: anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®; T: TAXOL®.

Un síndrome de la disfunción miocardial similar a aquél observado con antraciclinas se reportó más comúnmente con un tratamiento combinado de AC+H (18% Grado H) que con AC solo (3%), T(0%), o T+H (2%). Estos datos indican que la combinación de tratamiento de anticuerpo anti-ErbB2 con quimioterapia, incrementa marcadamente el beneficio clínico, como se valoró por las velocidades de respuesta y la evaluación del progreso del padecimiento. Sin embargo, debido a los efectos 10 laterales cardiacos incrementados de doxorubicina o epirubicina, el uso combinado de antraciclinas con terapia anticuerpo anti-ErbB2 está contraindicado. Los resultados, tomando en cuenta el tratamiento a favor, riesgo y beneficio con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® y paclitaxel (T.AXOL®) , 15 en donde se desea un régimen de tratamiento combinado.

Ejemplo 2: Propiedades Farmacocinéticas y Farmacodiná icas del Anticuerpo Anti-ErbB2 (HERCEPTIN®) El anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, se administró 20 por infusión intravenosa a pacientes humanos, seleccionados de conformidad con el criterio proporcionado en el Ejemplo 1. Una dosis inicial de 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se suministró por infusión intravenosa, seguido *tí¿ *Íi * *> . por infusiones i.v subsecuentes de 2 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® semanalmente por varias semanas. Doscientos trece pacientes comenzaron este régimen de tratamiento y se obtuvo la concentración del fármaco de suero más allá de 8 semanas para menos de 90 pacientes como discontinuación selectiva de pacientes con padecimiento rápidamente progresivo ocurrido. De los 213 pacientes quienes comenzaron el tratamiento, los datos de concentración máxima de suero fueron disponibles para 80 pacientes a la Semana 12, para 77 pacientes a la Semana 16 y para 44 pacientes a la Semana 20, para 51 pacientes a la semana 24, para 25 pacientes a la Semana 28, para 23 pacientes a la Semana 32 y para 37 pacientes a la Semana 36.

Concentraciones máximas de suero del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® para las Semanas 0-36 Las concentraciones máximas de suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® (µg/ml, media + SE), de la Semana 2 hasta la Semana 36, se trazaron en la Figura 3 (círculos obscuros) . El número de pacientes fue justamente constante debido a los datos de pacientes descontinuados del programa debido al rápido progreso del padecimiento, se excluyeron de este análisis. Las concentraciones máximas del suero tienden a incrementarse a través de la Semana 12 y tienden a nivelarse después de tal tiempo.

Concentraciones pico y máximas del suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® por las Semanas 1-8 Algunos datos de concentración de suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, fueron disponibles por 212 de los 213 pacientes originales. Los datos de concentración máxima y pico del suero que reflejan las infusiones de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, fueron disponibles por 195 de los 212 pacientes. Para la séptima infusión, los datos de concentración máxima de suero fueron disponibles para 137/212 pacientes y los datos de la concentración pico del suero fueron disponibles para 114/212 pacientes. La Tabla 2 presenta un resumen de estadísticas a partir de las concentraciones pico y máximas de suero de las primeras 8 semanas de tratamiento. Las muestras de pico fueron cortamente dirigidas después del final de la administración del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®; las muestras máximas fueron dirigidas previo a la dosis subsecuente (es decir, 1 semana después) . Las concentraciones del suero del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se determinaron como se describe aquí.

Tabla 2 Concentraciones de Suero Máximas y Pico de Anticuerpo Anti- ErbB2 HERCEPTIN® por las Primeras 8 Semanas de Tratamiento (µg/ml) Los datos en la tabla 2 sugieren que hubo un incremento en la concentración máxima de suero sobre el tiempo. De muchos pacientes estudiados, hubo 18 pacientes de quiénes las concentraciones máximas no excedieron 20 µg/ml desde la Semana 2 hasta la Semana 8. Una concentración máxima de suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® de 20 µg/ml se dirigió nominalmente para estos estudios basados en los estudios farmacológicos previos en animales y análisis exploratorios en ensayos clínicos. El estatus de respuesta del paciente se evaluó relativo a la concentración de suero del anticuerpo anti- ErbB2 HERCEPTIN®. Para este propósito, la concentración de suero media (un promedio de máximos y picos), se calculó por varias veces y el estatus de respuesta del paciente (en donde el estatus de respuesta del paciente se determinó por un Comité de Evaluación de Respuesta independiente) . El incremento en la concentración del suero entre las Semanas 2 y 8 pareció ser mayor en respondedores que en no respondedores, sugiriendo que hay una relación entre el estatus de respuesta y la concentración de suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®. Un análisis estadístico (análisis de varianza) de los valores de concentración máxima de sueros a la Semana 2 y un promedio de Semanas 7 y 8 en relación al estatus de respuesta, indicó una relación significantemente alta entre estatus de respuesta y promedio máximo de Semanas 7 y 8 (p < 0.001). Los resultados indican que hubo una diferencia significante entre la concentración máxima de suero (promedios máximos de Semanas 7 y 8) en los respondedores y no respondedores: las concentraciones máximas fueron de 60 + 20 µg/ml en los respondedores contra 44 + 25 µg/1 en los no respondedores (media + SD) . El nivel de sobre expresión de HER2 y el tipo de sitios etastátícos fueron asociados con diferencias significantes en las concentraciones máximas de sueros. A la semana 2, pacientes con sobre expresión 2+ HER2 tuvieron concentraciones de suero significantemente máximas superiores (n =40, media -28.8 µg/ml, SD = 10.4), comparados con pacientes con sobre expresión de 3+ HER2 (n = 155, media = 24.1 µg/ml, SD=13.1). Esta diferencia en las concentraciones máxima de sueros promedio para las Semanas 7 y 8 no fue más grande estadísticamente significante. Además, a la Semana 2, pacientes con padecimientos superficiales tuvieron concentraciones máximas de suero significantemente superiores (n=12, media 34.1 µg/ml, SD=12.0), comparado con pacientes con padecimientos viscerales (n= 183, media = 24.4 µg/ml, SD=12-ß) . Esta diferencia en las concentraciones máximas de sueros promedio para las Semanas 7 y 8 fue significante. Estos datos indican que la elevación en las concentraciones máximas de sueros entre las Semanas 2 y 7/8 ocurre para pacientes humanos con varios perfiles de padecimientos .

En un estudio subsecuente, similarmente diseñado, los pacientes con cáncer de mama humano se trataron con una dosis de carga de 8 mg/kg seguida por dosis de mantenimiento de 4 mg/kg semanalmente. Los resultados de este estudio humano preliminar indican que un régimen de mantenimiento semanal de 8 mg/kg carga: 4 mg/kg fue eficaz en la reducción del volumen del tumor en los pacientes. Los datos descritos en este Ejemplo indican que la carga delantera anticuerpo, de manera que se logra una concentración de suero objetivo más fácilmente, puede estar asociada con los resultados mejorados.

Ejemplo 3: I.V. El Suministro de Bolo e Infusión Subcutánea de Anticuerpo Anti-ErBb2 HERCEPTIN®, Efectivamente Disminuye el Volumen del Tumor en el Ratón Se examinó la eficacia de la infusión o el suministro de bolo de anticuerpos anti-ErbB2 humanizados (HERCEPTIN®, véase Ejemplo 1 para la preparación) , ya sea por inyección intravenosa o inyección subcutánea. El propósito del estudio fue preguntar si el suministro subcutáneo fue factible y si el suministro del bolo subcutáneo conveniente fue útil en el tratamiento del cáncer metastático en animales inoculados con una línea celular que sobre expresa el gen HER2. Los resultados, detallados abajo, muestran que el i.v. y la infusión s.c. y el suministro del bolo son metodologías de tratamiento factibles. Un estudio en un modelo de xenógrafo de ratones desnudos, el cual incorpora una línea celular de cáncer de mama humano que naturalmente sobre expresa el gen HER2 (BT-474MI, derivado de células BT-474, número de Acceso ATCC HRB-20) , que compara el volumen del tumor como una función de bolo i.v. contra infusión s.c., se realizó como sigue. En el primer estudio, se obtuvieron ratones hembra de 7-9 semanas de edad u nu desnudos atímicos, de Taconic Inc (Ger antown, NY) . Para iniciar el desarrollo del tumor, cada ratón se inoculó subcutáneamente con células BT474MI 3 x 106 suspendidas en Matrigel™. Cuando los nodulos del tumor alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm3, los animales se aleatorizaron a 4 grupos de tratamiento. Los grupos se trataron de conformidad con la Tabla 3.

Tabla 3 Grupos de Animales y Dosis para Comparación del Bolo I.V. e Infusión S.C.

Conc. de suero = concentración en suero. DC = dosis de carga. DM - dosis de mantenimiento La concentración de lo Infusado se calculó para lograr la concentración de suero de objetivo usando minibombas osmóticas Alzet® (Alza Corp., Palo Alto, CA) .

Los animales se expusieron a estrógeno por pelotillas de estrógeno de liberación sostenida subcutánea 9 días antes del inicio de la dosificación para promover el crecimiento de las células tumorales injertadas. Los animales se inocularon con las células BT474MI 8 días antes del comienzo del tratamiento y los tumores se dejaron crecer. Los animales entonces se trataron con anticuerpo E25 no relevante (no específico para el receptor HER, pero un miembro de la clase IgG monoclonal) o anticuerpo de prueba anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® como se indica en la Tabla 3. Los niveles de dosificación se seleccionaron para lograr las concentraciones de suero objetivo de HERCEPTIN®, ya sea 1 µg/ml o 20 µg/ml, por infusión de bomba subcutánea o por suministro de bolo i.v. Los grupos de estudio se trataron hasta el día 35. La concentración de suero del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se midió semanalmente (justo antes de la dosificación por Grupo 4) usando 3 ratones/grupo/punto de tiempo. La concentración de anticuerpo anti-ErbB2 se determinó de conformidad con el método descrito aquí que involucra técnicas estándares. Los volúmenes de tumor se midieron dos días antes del comienzo de la dosificación y dos veces por semana a partir del día 6 hasta el día 35 en el estudio para el cual los datos se tabularon abajo. Los tumores se midieron en tres dimensiones y los volúmenes se expresaron en mm3. La eficacia se determinó por comparación estadística (ANOVA) de los volúmenes del tumor de animales de prueba con relación a los animales de control no tratados . Como se muestra en la Tabla 4 abajo, el tratamiento de ratones que albergan el tumor BT474MI con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® por los métodos de dosificación indicados, significantemente inhiben el crecimiento de los tumores. Todos los grupos tratados con HERCEPTIN® mostraron inhibición similar del crecimiento del tumor con relación al grupo de control. No se observó respuesta de dosis.

Tabla 4 Comparación de Infusión S.C. y Suministro de Bolo I.V. s.c = suministro subcutáneo; i.v.= suministro intravenoso. *4.0 mg/kg Dosis de Carga y dosis de Mantenimiento 2.0 mg/kg/semana ** a predosis (concentración máxima de suero inmediatamente antes de una dosis de mantenimiento) .

Los resultados tabulados anteriormente indican que el mantenimiento de la concentración de suero de aproximadamente 2 µg/ml fue tan efectivo como la concentración de 20 µg/ml en este estudio. Los resultados indican que la dosificación por infusión subcutánea fue tan efectivo como la dosificación de bolo intravenoso y logró similares concentraciones máximas de suero. Los resultados también indican que los niveles de dosis estudiados están en la parte superior de la curva de respuesta de dosis en este modelo y que la dosificación subcutánea es efectiva en el tratamiento de los tumores de cáncer de mama. Así, la administración subcutánea de las dosis de mantenimiento es factible como parte de un régimen de tratamiento de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®.

Ejemplo 4: Los Suministros de Bolo y Bolo Subcutáneo de Anticuerpo Anti-ErbB2 HERCEPTIN®, Efectivamente Disminuyen el Volumen del Tumor en el Ratón El suministro del bolo subcutáneo es conveniente y efectivo en costo para el paciente y los profesionales del cuidado de la salud. Los resultados del estudio descrito en este ejemplo, indican que el suministro del bolo subcutáneo fue tan efectivo como el suministro del bolo intravenoso en la reducción del tamaño del tumor de la célula de mama en un ratón. Este estudio se fijó como se describe aquí en el Ejemplo 3 para la comparación del suministro de bolo intravenoso e infusión subcutánea. Un implante de estrógeno de liberación sostenida se insertó subcutáneamente un día antes de la inoculación de la célula del tumor, como se describe en el Ejemplo 3. Seis días después de la inoculación de la célula del tumor, se realizó la medición inicial del tumor. Siete días después de la inoculación de la célula del tumor, la primera dosis del anticuerpo de control o anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se suministró. Los grupos de animales, tipo de suministro, dosis de carga y dosis de mantenimiento, se proporcionan en la Tabla 4. Los animales se dosificaron una vez semanalmente por 4 semanas.

Tabla 5 Grupos de Animales y Dosis para Comparación del Suministro del Bolo I.V. y Bolo Subcutáneo IV = intravenoso; SC= subcutáneo; n= número de animales por grupo.

Los ratones se trataron de conformidad con la información en la Tabla 4 y usando las técnicas descritas en el Ejemplo 3. La concentración de suero del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® se midió semanalmente antes de cada dosis de mantenimiento i.v. semanalmente de conformidad con el procedimiento descrito aquí y usando técnicas estándares. La concentración de suero de anticuerpo E25 de control, se determinó de conformidad con las técnicas de inmunoensayo estándares. La tabla 6 muestra el incremento en las concentraciones del suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® con el tiempo.

Tabla 6 Suministro de Bolo IV contra SC; Concentración de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® del suero, Concentración de suero, µg/ml n-10 por puntos de tiempo Días 0, 7 y 14. N = 9 para el día 21. La Tabla 7 muestra la eficacia relativa del suministro del bolo intravenoso y el suministro del bolo subcutáneo para los Grupos 1-5 que han logrado las concentraciones de anticuerpo de suero presentadas en la Tabla 6. Para este estudio, la eficacia se midió como una disminución en el volumen del tumor. El volumen del tumor se midió dos veces semanalmente.

Tabla 7 Eficacia del Anticuerpo Anti-ErbB2 HERCEPTIN® Medido como un Cambio en el Volumen del Tumor Comparando Suministros de Bolo Intravenoso y Bolo subcutáneo, Media (SD) N=10 para cada punto de datos. TM= medición del tumor. IV= intravenoso. SC= subcutáneo, MD=dosis de mantenimiento. Vol. Tumor = volumen de tumor, mm3. *Día 17 excluido debido al error de medición. Velocidad de crecimiento del tumor al Día 21-Día 31 Log(TM+l). Área bajo la curva es el área por debajo de un trazo del volumen del tumor contra tiempo.

Las Figuras 4A y 4B son trazos gráficos de cambios en el volumen del tumor con el tiempo, algunos de los datos se encuentran en la Tabla 7. La Figura 4A es un trazo lineal del volumen del tumor contra el tiempo. La Figura 4B es un trazo semilogarítmico de los mismos datos, permitiendo a los puntos de prueba, ser revisados más claramente. Los datos en la Tabla 7 y las Figuras 4A y 4B indican que, aunque no se observó la respuesta relacionada con la dosis entre los grupos tratados con HERCEPTIN, dosificando por bolo subcutáneo tan efectivo como la dosificación del bolo intravenoso y alcanzando concentraciones máximas de suero similares.

Ejemplo 5: Regímenes para el Suministro Intravenoso y Subcutáneo de Anticuerpo Anti-ErbB2 De conformidad con la invención, el suministro de anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, HERCEPTIN®) , comprende carga delantera mayor del fármaco para lograr una concentración de suero objetivo en aproximadamente 4 semanas o menos, preferiblemente 3 semanas o menos, más preferiblemente 2 semanas o menos, y mayormente preferido 1 semana o menos, incluyendo un día o menos. De conformidad con la invención, esta dosificación inicial se sigue por la dosificación que mantiene la concentración de suero objetivo por dosis subsecuentes de cantidades iguales o más pequeñas. Una ventaja de los métodos de la invención es que la dosificación de mantenimiento puede ser menos frecuente y/o suministrada por inyección subcutánea, haciendo a los regímenes de tratamiento de la invención, convenientes y efectivos en costo para el paciente y profesionales médicos, administrando el anticuerpo. Además, un régimen de dosis de mantenimiento subcutáneo puede ser interrumpido por la dosificación intravenosa (tal como infusión) , cuando la quimioterapia del paciente requiere suministro de otros fármacos por inyección intravenosa. Para probar los regímenes de dosificación «siguientes, los sujetos humanos se seleccionan de conformidad con el criterio descrito en el Ejemplo 1, anteriormente. El número de dosis iniciales es uno o más dosis suficientes para lograr la concentración de suero objetiva eficaz en aproximadamente 4 semanas o menos, preferiblemente 3 semanas o menos, más preferiblemente 2 semanas o menos, y mayormente preferido 1 semana o menos, incluyendo 1 día o menos. El número de dosis de mantenimiento puede ser uno o más dosis suficientes para lograr supresión de los síntomas del padecimiento, tal como una disminución en el volumen del tumor. Las dosis de mantenimiento son iguales o menores que la dosis o las dosis iniciales, consistentes con un objeto de la invención del anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® por regímenes proporcionando carga delantera mayor. Los regímenes de suministro específicos del fármaco descritos aquí, son representativos de la invención y no están sugeridos para ser limitantes. En un ensayo, una dosis inicial de 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, se suministra a pacientes humanos por inyección intravenosa o subcutánea. Las dosis iniciales (dosis de carga) son suministrados por infusión intravenosa o por inyección del * i ***•*•* + 'SI bolo o preferiblemente inyección de bolo subcutáneo. Preferiblemente, se logra una concentración máxima de suero objetivo de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, de aproximadamente 10-20 µg/ml, (promediado para todos los pacientes en el grupo de tratamiento) , y se mantiene por dosis subsecuentes de anticuerpo anti-ErbB2 que son iguales a o más pequeñas que la dosis inicial. En un método, una concentración máxima de suero objetivo se logra y se mantiene por una vez por semana suministros de 2 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® por inyección intravenosa o subcutáneo por al menos ocho semanas. Alternativamente, para este o cualquier régimen de dosificación descrito aquí, la infusión continua subcutánea por bomba subcutánea es usado para suministrar dosis de mantenimiento subsecuentes. En otro método, una dosis inicial (carga delantera) de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, es suministrado por inyección intravenosa (infusión o inyección del bolo), o por inyección del bolo subcutáneo. Esto es seguido por las inyecciones intravenosas del bolo, infusiones intravenosas, infusión subcutánea, o inyección subcutánea del bolo de 6 mg/kg a intervalos de 3 semanas para mantener la concentración máxima del suero de aproximadamente 10-20 µg/ml, promediada por un grupo de tratamiento completo. En otro método, una dosis inicial (carga delantera) de 12 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, es suministrada por inyección intravenosa (infusión o inyección del bolo), o por inyección del bolo subcutáneo. Esto es seguido por las inyecciones intravenosas del bolo, infusiones intravenosas, infusión subcutánea, o inyección subcutánea del bolo de 6 mg/kg a intervalos de 3 semanas para mantener la concentración máxima del suero de aproximadamente 10-20 µg/ml. En aún otro método, una dosis inicial (carga delantera) de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, es suministrada por infusión intravenosa o inyección del bolo, o preferiblemente, por inyección subcutánea del bolo o infusión. Esto es seguido por administración de 8 mg/kg por semana u 8 mg/kg por 2-3 semanas para mantener una concentración máxima de suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® de aproximadamente 10-20 µg/ml. Las dosis de mantenimiento son suministradas por infusión intravenosa o inyección del bolo, o preferiblemente por infusión subcutánea o inyección del bolo. En otro método, la dosis inicial de carga delantera es una serie de inyecciones intravenosas o subcutáneas, por ejemplo, una en cada uno de los días 1, 2 y 3 de al menos 1 mg/kg para cada inyección (en donde la cantidad del anticuerpo anti-ErbB2 suministrado por la suma de las inyecciones iniciales es más de 4 mg/kg) , seguido por las dosis de mantenimiento de 6 mg/kg una vez cada intervalo de 3 semanas para mantener una concentración máxima de suero (por ejemplo, aproximadamente 10-20 µg/ml) de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®. Las dosis de mantenimiento son suministradas por infusión intravenosa o inyección del bolo o por infusión subcutánea o inyección subcutánea del bolo. En aún otro método, la carga delantera es por infusión intravenosa de al menos 1 mg/kg, preferiblemente 4 mg/kg en cada uno de los cinco días consecutivos, seguido por repeticiones de este ciclo de un número suficiente de veces para lograr la supresión de los síntomas del padecimiento. Siguiendo la dosis o las dosis iniciales, las dosis subsecuentes pueden ser suministradas por infusión subcutánea o por inyección del bolo si se tolera por el paciente. Tal suministro subcutáneo es conveniente y efectivo en costo para el paciente y profesionales que administran el cuidado de la salud. En todavía otro método, el anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, es suministrado inicialmente como al menos, 2 infusiones intravenosas por semana por tres semanas, seguido por repeticiones de este ciclo para mantener una concentración máxima eficaz del suero de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®. La dosis es al menos, 4 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2, preferiblemente al menos 5 mg/kg. Los suministros de fármacos de mantenimiento pueden ser intravenosos o subcutáneos. En donde el animal o el paciente tolera el anticuerpo durante una dosis inicial, el suministro de las dosis subsecuentes puede ser subcutáneo, con ello, se proporciona mayor conveniencia y efectividad en costo para el paciente y los profesionales del cuidado de la salud. En estudios animales, una dosis inicial de más de 4mg/kg, preferiblemente más de 5 mg/kg suministrada por inyección intravenosa o subcutánea, se sigue por inyecciones subcutáneas del bolo de 2 mg/kg dos veces por semana (separados por 3 días) , para mantener una concentración máxima del suero de aproximadamente 10-20 µg/ml. Además, en donde el animal o paciente se conoce por tolerar el anticuerpo, una dosis inicial de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® es opcional y preferiblemente suministrable por inyección subcutánea del bolo, seguida por inyecciones subcutáneas de mantenimiento.

Mientras se describen aquí concentraciones de suero objetivo para el propósito de comparar estudios animales y ensayos humanos, las concentraciones de suero objetivo en usos clínicos, pueden diferir. La descripción proporciona aquí guía al usuario en la selección de un régimen de suministro de fármaco de carga delantera, que proporcionar una concentración máxima de suero objetivo eficaz. Los métodos de la invención descritos aquí, opcionalmente incluyen el anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, en combinación con un agente quimioterapéutico (preferentemente un derivado antraciclina) , para lograr la supresión de los síntomas del padecimiento. El agente quimioterapéutico puede ser suministrado con anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, o separadamente y de conformidad con un programa de dosificación diferente. Por ejemplo, el suministro subcutáneo de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® con TaAXOL®, está incluid en la invención. Además, las inyecciones intravenosas o subcutáneas de 8 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN®, seguidos por inyección intravenosa o subcutánea de 6 mg/kg de anticuerpo anti-ErbB2 HERCEPTIN® cada 3 semanas, es administrado en combinación con un agente quimioterapéutico, tal como un taxoide (por ejemplo, paclitaxel 175 mg/m2 cada 3 semanas) o un derivado de antraciclina (por ejemplo, doxorubicina 60 mg/m2 o epirubicina 75 mg/m2 cada 3 semanas) . Opcionalmente, en donde un derivado de antraciclina es administrado, un cardioprotector (por ejemplo, 600 mg/m2 de ciclofosfamida cada 3 semanas), es administrado. En otra terapia de combinación, un anticuerpo anti-ErbB2 es administrado en una dosis de carga de más de 4 mg/kg, preferiblemente más de 5 mg/kg, y más preferiblemente al menos 8 mg/kg. La dosis de carga es seguida por dosis de mantenimiento de al menos 2 mg/kg semanalmente, preferiblemente 6 mg/kg cada 3 semanas. La terapia de combinación incluye administración de un taxoide durante el tratamiento con anticuerpo anti-ErbB2. De conformidad con una modalidad de la invención, el taxoide es paclitaxel y se administra a una dosis de 70-100 mg/m2/semana. De conformidad con otra modalidad de la invención, el taxoide es docetaxel y se administra a una dosis de 30-70 mg/m2/semana.

Ejemplo 6: HERCEPTIN® Administrado Intravenosamente Cada Tres Semanas en Combinación con Paclitaxel Actualmente, la dosis recomendada de HERCEPTIN® es 2mg/kg una vez diariamente. Los pacientes serán , actaiinistrados con HERCEPTIN® cada tres semanas en lugar de semanalmente, junto con paclitaxel (175 mg/m2 cada tres semanas) . La simulación del régimen de tratamiento prepuesto sugiere que las concentraciones máximas del suero serán 17 cmg/ml, en el rango (10-20 mcg/ml) de las concentraciones máximas de suero objetivo de ensayos clínicos IV de HERCEPTIN® previos. Después de los primeros 12 pacientes, los parámetros PK serán valorados, si la exposición se siente inadecuada, entonces las dosis incrementarán a 8 mg/kg cada tres semanas por el resto de los 12 pacientes.

Criterios de Inclusión 1) Hembras > 18 años de edad 2) Cáncer de mama metastático que sobre expresa ErbB2 histológicamente confirmado 3) Pacientes quienes han sido recientemente diagnosticados con padecimientos metastáticos 4) Tienen un estatus de resolución Karnofsky de > 70%. 5) Dan consentimiento informado escrito para cualquier procedimiento de selección específico del estudio con el entendimiento de que el paciente tiene el derecho a retirarse del estudio en cualquier tiempo, sin perjuicio.

Criterio de Exclusión 1) Mujeres embarazadas o lactantes 2) Mujeres de potencial materno a menos que (1) sean estériles quirúrgicamente o (2) usen mediciones adecuadas de anticoncepción tales como anticonceptivos orales, dispositivos intra-uterinos o método de barrera de anticoncepción en conjunto con geles espermicidas. 3) Evidencia clínica o radiológica de metástasis CNS 4) Historia de cualquier padecimiento cardiaco significante 5) LVEF < 50% 6) Sin terapia de taxano previa en cualquier colocación de tratamiento. 7) Cualquiera de los siguientes valores hematológicos de línea base anormales -Hb menos de 9 g/dl -WBC menos de 3.0 x 109/1 -Granulocitos menos de 1.5 x 109/1 -Plaquetas menos de 100 x 109/1 8) cualquiera de las siguientes pruebas de función del hígado de línea base anormal: -bilirubina de suero mayor de 1.5 x ULN (límite normal superior) -ALT y/o AST mayor de 2.5 x ULN (mayor de 4.0 x ULN si es metástasis ósea o de hígado) -fosfatasa alcalina mayor de 2.5 x ULN (mayor de 4.0 x ULN si es metástasis ósea o de hígado) 9) Las pruebas de función renal de línea base anormal siguientes: -creatinina de suero mayor de 1.5 x ULN 10) Historia de otras condiciones médicas serias que podrán evitar la participación del paciente en un estudio investigacional .

Dosis de Carga de HERCEPTIN® y programa: 8 mg/kg para la primera dosis. Dosis de mantenimiento y programa: 6 mg/kg cada 3 semanas. Paclitaxel . 175 mg/m2 IV cada 3 semanas por 6 ciclos como una infusión de 3 horas.

NOTA: En el primer ciclo de tratamiento, el paclitaxel será dosificado 8 horas previo al HERCEPTIN® para determinar el PK del paclitaxel solo. El HERCEPTIN® será administrado 8 horas post-paclitaxel por el 1er. ciclo solamente. En ciclos de tratamiento subsecuentes, el HERCEPTIN® será administrado previo al paclitaxel. La duración total de este estudio es de 18 semanas. Los sujetos estudiados recibirán hasta 6 dosis totales de HERCEPTIN®. Después el último sujeto ha recibido el último ciclo de paclitaxel, la colección de datos para seguridad y análisis de farmacocinéticos serán detenidos, y el estudio cerrará el protocolo de tratamiento específico. Los sujetos de estudio pueden continuar recibiendo HERCEPTIN® +/- paclitaxel a la discreción del investigador. Se cree que el régimen de tratamiento anterior será efectivo en el tratamiento de cáncer de mama metastático, debido a la infrecuencia con la cual es administrado el HERCEPTIN® al paciente. Mientras los aspectos particulares y modalidades de la invención como aquí se muestran y describen en detalle, es completamente capaz de obtener los objetos y proporcionar las ventajas aquí antes declaradas, es por lo tanto entendido que es meramente ilustrativo de algunas de - - ¡ „*• - las modalidades actualmente preferidas de la invención y que no se proponen limitaciones a los detalles de los métodos y artículos de manufactura mostrados preferentemente como se describe en las reivindicaciones adjuntas. Las descripciones de todas las citaciones en la especificación, están expresamente incorporadas aquí por referencia.

Listado de Secuencia <110> Genentech, Inc. <120> Dosificaciones para el tratamiento con anticuerpos anti-erbB2 <130> P1775R1PCT <141> 2000-08-25 <150> DS 60/151,018 <X51> 1999-08-27 <150> OS 60/213,822 <151> 2000-06-23 <160> 15 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Thr His Leu Asp Hee Leu Ar?r His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val 20 25 30 Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Leu Gln Asp lie Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu 50 55 60 He Ala HÍS Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg 65 70 75 He Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala 80 85 90 Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr 95 100 105 Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Glr. Leu Arg Ser Leu 110 115 120 Thr Glu He Leu Lys Gly Gly Val Leu He Gln Arg Asn Pro Gln 125 130 135 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr He Leu Trp Lys Asp He Phe His Lys 140 145 150 Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu He Asp Thr Asn Arg Ser Arg 155 160 165 Ala <210> 2 <21I> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro 1 5 10 15 Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln 20 25 30 Gly Cys <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <221> artificial <222> 1-11 <223> <40O> 3 Pro Lys Asn Ser Ser Met He Ser Asn Thr Pro 1 5 IO <210> 4 •211> 7 <212> PRT •c213> artificial <220> <221> artificial <222> 1-7 <223> <400> 4 His Gln Ser Leu Gly Thr Gin 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <221> artificial <222> 1-8 <223> <400> 5 His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <221> artificial <222> 1-B <223> -^ ^^^^^^ <400> 6 Has Gln Asn He Ser Asp Gly Lys 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <221> artificial <222> 1-8 <223> <400> 7 Val He Ser Ser His Leu Gly Gln 1 5 <210> 8 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val 1 5 10 15 Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln 20 25 30 Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val 35 40 45 Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg 50 55 <210> 9 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Glp Asn Gly Ser Val Thr 1 5 10 15 Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr 20 25 30 Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys 35 40 45 Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro He Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu 50 55 60 Gly Ala Cys Gln Pro 65 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 10 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys He Met Ser Thr Ser Val 10 15 Gly Asp Arg Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 He Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gin Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys 35 40 45 Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He 65 70 75 Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gxn Gln 80 85 90 Tyr Tyr He Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 He Lye <210> 11 <211> 119 ^212> PRT <213> Mus m?sculus <400> 11 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser H s Gly Lys Ser Leu 35 40 45 Glu Trp He Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser He Tyr 50 55 60 Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser 65 70 75 Ser Arg He Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp 80 85 90 Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr 95 100 105 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Tnr Thr Leu Thr val Ser Ser 110 115 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <400> 12 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 He Gly Val Ala Trp Tyr Glp Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 - 45 Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Tyr He Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 He Lys <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <221> artificial <222> 1-119 <223> -Fab 574 VH <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser He Tyr 50 55 60 Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Tnr Leu Ser al Asp Arg Ser 65 70 75 Lys Asr. Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr 95 100 105 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <400> 14 A=p He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser He Ser 20 25 30 fc i— ?A ^* -. ?Jz* **-?A¿*a**~& ?? *l Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 • 45 Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 He Lys <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Val He Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg -Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 60 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu 95 100 105 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para el tratamiento de un paciente humano susceptible o diagnosticado con una alteración caracterizado por la sobre expresión del receptor ErbB2, que comprende la administración en una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-ErbB2 al paciente humano, el método comprende: administrar al paciente una dosis inicial de aproximadamente al menos 5 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2; y admini strar al paciente una pluralidad de dosis subsecuentes del anticuerpo en una cantidad que es aproximadamente la misma o menor que la dosis inicial. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 6 mg/kg. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 8 mg/kg. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 12 mg/kg. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan entre sí en tiempo por al menos una semana. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan entre sí por al menos dos semanas. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan entre sí por al menos tres semanas. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis inicial es administrada por inyección intravenosa, y en donde al menos una dosis subsecuente es administrada por inyección subcutánea. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis inicial es administrada por inyección intravenosa, en donde al menos dos dosis subsecuentes son administradas, y donde cada dosis subsecuente es administrada por un método seleccionado del grupo que consiste esencialmente de inyección intravenosa e inyección subcutánea. 10. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque la dosis inicial y al menos una dosis subsecuente se administran por inyección subcutánea. 11. El método de conformidad con la reivindicación 5 1, caracterizado porque la dosis inicial se selecciona del grupo que consiste esencialmente de aproximadamente 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg, en donde la pluralidad de dosis subsecuentes son al menos aproximadamente 2 mg/kg, y en donde las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí 10 por al menos una semana. 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque la pluralidad de dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas. 13. El método de la reivindicación 12, 15 caracterizado porque la pluralidad de dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos tres semanas. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es 20 aproximadamente 6 mg/kg. 15. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 12 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 6 mg/kg. 16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 8 mg/kg. 17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, en donde al menos una dosis subsecuente es 8 mg/kg, y en donde la administración de la dosis inicial y las dosis subsecuentes se separan en tiempo por al menos 2 semanas. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la dosis inicial y las dosis subsecuentes se separan en tiempo por al menos 3 semanas. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales son de aproximadamente al menos 1 mg/kg y son administradas en al menos 2 días consecutivos, en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 2 mg/kg, y en donde la administración de la última dosis inicial y la primera dosis subsecuente y adicionales se separan en tiempo por al menos una semana. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales es aproximadamente al menos 1 mg/kg y se administran en al menos 3 días consecutivos, en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente al menos 6 mg/kg, y en donde la administración de la última dosis inicial y la primera dosis subsecuente y adicional se separan en tiempo por al menos 3 semanas. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales es aproximadamente al menos 1 mg/kg y se administran al menos dos veces por semana por 3 semanas como un primer ciclo de dosificación, en donde el ciclo de dosificación es repetido, y en donde las dosis de cada ciclo se separan en tiempo por al menos 1 día, y en donde los ciclos de dosificación se separan en tiempo por al menos 1 semana . 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la alteración es un tumor benigno o maligno. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la alteración es un cáncer. tiSt.i?* ..^?*»^ *Í&*? Ü****mS^^ 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, leucemia, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastroinstestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma en la glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cuello y cabeza. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el cáncer es carcinoma de mama metastático. 27. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al dominio extracelular del receptor ErbB2. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al epítope 4D5 dentro del dominio de la secuencia extracelular de ErbB2 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-ErbB2 4D5 humanizado. 30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método además comprende administrar una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico . 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el taxoide es paclitaxel o docetaxel. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cantidad efectiva del anticuerpo anti-ErbB2 y la cantidad efectiva del agente quimioterapéutico como una combinación son más bajas que la suma de las cantidades efectivas del anticuerpo anti-ErbB2 y el agente quimioterapéutico, cuando se administran individualmente, como agentes solos. 3 . El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un derivado de antraciclina. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el derivado de antraciclina es doxorubicina o epirubicina. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el método además comprende la administración de un cardioprotector. 37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la eficacia es medida por la determinación del tiempo de la progresión del padecimiento o la velocidad de la respuesta. 38. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2, y un inserto de envase que contiene instrucciones para administrar una dosis inicial del anticuerpo anti-ErbB2 de al menos 5 mg/kg, y al menos una dosis subsecuente que es la misma cantidad o menos que la dosis inicial. 39. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las instrucciones son para la administración de una dosis inicial por inyección intravenosa y al menos una dosis subsecuente por inyección subcutánea. ¿¿UJ^^Ü 40. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 6 mg/kg. 41. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 8 mg/kg. 42. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 12 mg/kg. 43. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos una semana . 44. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas . 45. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos tres semanas . 46. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la dosis inicial tr*? .al..f * - í ? y al menos una dosis subsecuente se administran por inyección subcutánea. 47. El artículo de manufactura de la reivindicación 38, caracterizado porque la dosis inicial se selecciona del grupo que consiste esencialmente de aproximadamente 6 mg/kg, 8 mg/kg, o 12 mg/kg, en donde la pluralidad de dosis subsecuentes son de al menos aproximadamente 2 mg/kg, y en donde las dosis subsecuentes se separa en tiempo entre sí por al menos una semana. 48. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la pluralidad de dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas. 49. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la pluralidad de dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos tres semanas. 50. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 6 mg/kg. 51. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 12 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 6 mg/kg. 52. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, y en donde al menos una dosis inicial subsecuente es aproximadamente 8 mg/kg. 53. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, en donde al menos una dosis subsecuente es 8 mg/kg, y en donde la administración de la dosis inicial y las dosis subsecuentes se separan en tiempo por al menos 2 semanas. 54. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la dosis inicial y dosis subsecuentes se paran en tiempo por al menos 3 semanas . 55. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales son aproximadamente al menos 1 mg/kg y se administran en al menos 2 días consecutivos, en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente al menos 2 mg/kg, y en donde la administración de la última dosis inicial y la primera dosis subsecuente y adicional se separan en tiempo por al menos una semana. 56. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales es aproximadamente al menos 1 mg/kg y se administran en al menos 3 días consecutivos, en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente al menos 6 mg/kg, y en donde la administración de la última dosis inicial y la primera dosis subsecuente y adicional se separan en tiempo por al menos 3 semanas . 57. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales son aproximadamente al menos 1 mg/kg y se administran al menos dos veces por semana por 3 semanas como un primer ciclo de dosificación, en donde el ciclo de dosificación se repite, y en donde las dosis de cada ciclo se separan en tiempo por al menos 1 día, y en donde los ciclos de dosificación se separan en tiempo por al menos 1 semana. 58. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las instrucciones son para la administración de una dosis inicial por inyección subcutánea y al menos una dosis subsecuente por inyección subcutánea. 59. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 6 mg/kg. 60. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 8 mg/kg. 61. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente al menos 12 mg/kg. 62. El artículo de manufactura de conformidad con al reivindicación 58, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos una semana. 63. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas . 64. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos tres-semanas . 65. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la dosis inicial se selecciona del grupo que esencialmente consiste de aproximadamente 6 mg/kg, 8mg/kg, o 12 mg/kg, en donde la pluralidad de dosis subsecuentes son de aproximadamente al menos 2 mg/kg, y en donde las dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos una semana. 66. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la pluralidad de dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas. 67. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la pluralidad de dosis subsecuentes se separa en tiempo entre sí por al menos tres semanas. 68. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 6 mg/kg. 69. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 12 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 6 mg/kg. 70. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, y en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente 8 mg/kg. 71. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la dosis inicial es aproximadamente 8 mg/kg, en donde al menos una dosis subsecuente es 8 mg/kg, y en donde la administración de la dosis inicial y dosis subsecuentes se separan en tiempo por al menos 2 semanas. 72. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la dosis inicial y las dosis subsecuentes se separan en tiempo por al menos 3 semanas . 73. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las . dosis iniciales son al menos aproximadamente 1 mg/kg y se administran en al menos 2 días consecutivos, en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente al menos 2 mg/kg, y en donde la administración de la última dosis inicial y la primera dosis subsecuente y adicional se separan en tiempo por al menos una semana. 74. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales son aproximadamente al menos 1 mg/kg y se administran en al menos 3 días consecutivos, en donde al menos una dosis subsecuente es aproximadamente al menos 6 mg/kg, y en donde la administración de la última dosis inicial y la primera dosis subsecuente y adicional se separan en tiempo por al menos 3 semanas. 75. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la dosis inicial es una pluralidad de dosis, en donde cada una de la pluralidad de las dosis iniciales son al menos aproximadamente 1 mg/kg y se administran al menos dos veces por semana por 3 semanas como un primer ciclo de dosificación, en donde el ciclo de dosificación se repite, y en donde las dosis de cada ciclo se separan en tiempo por al menos 1 día, y en donde los ciclos de dosificación s© separan en tiempo por al menos 1 semana. 76. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las instrucciones además incluyen la administración de un agente quimioterapéutico . 77. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide. 78. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el taxoide es paclitaxel o docetaxel. 79. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un derivado de antraciclina. 80. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque las instrucciones además incluyen la administración de un cardioprotector. 81. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende una etiqueta en o asociada con el contenedor que indica que la composición puede ser usada para tratar una condición caracterizada por la sobre expresión del receptor ErbB2. 82. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque la etiqueta indica que la composición puede ser usada para el tratamiento de cáncer de mama. 83. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el anticuerpo anti-ErbB2 se enlaza al dominio extracelular del receptor. 84. El artículo de manufactura de la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo anti-ErbB2 se enlaza al epítope 4D5 dentro de la secuencia de dominio extracelular. 85. El artículo de manufactura de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo ant?-ErbB2 4D5 humanizado. 86. Un método para el tratamiento de cáncer en un paciente humano, caracterizado porque comprende la administración al paciente de una primera dosis de un anticuerpo ant?-ErbB2 seguido por al menos una dosis subsecuente del anticuerpo, en donde la primera dosis y la dosis subsecuente se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas. 87. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la primera dosis y la dosis subsecuente se separan en tiempo entre sí por al menos tres semanas . 88. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la primera dosis y la segunda dosis son cada una de alrededor de 2 mg/kg hasta alrededor de 16 mg/kg. 89. El método de la reivindicación 88, caracterizado porque la primera dosis y la dosis subsecuente cada una alrededor de 4 mg/kg hasta alrededor de 12 mg/kg. 90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la primera dosis y la dosis subsecuente son cada una de alrededor de 6 mg/kg hasta alrededor de 12 mg/kg. 91. El método de la reivindicación 86, caracterizado porque dos o más dosis subsecuentes del anticuerpo se administran al paciente. 92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque alrededor de dos hasta alrededor de diez dosis subsecuentes del anticuerpo se administran al paciente, 93. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dos o más dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas. 94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque dos o más dosis subsecuentes se separan en tiempo entre sí por al menos tres semanas. 95. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dos o más dosis subsecuentes son cada una de alrededor de 2 mg/kg hasta alrededor de 16 mg/kg. 96. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque dos o más dosis subsecuentes son cada una de alrededor de 4 mg/kg hasta alrededor de 12 mg/kg. 97. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado dos o más de las dosis subsecuentes son cada una de alrededor de 6 mg/kg hasta alrededor de 12 mg/kg. 98. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el método además comprende administrar una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico al paciente. 99. El método de la reivindicación 98, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es un taxoide. í * 100. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB2, y un inserto de envase que contiene instrucciones para la dosis del anticuerpo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 86 a 99. 101. Un método para el tratamiento de cáncer en un paciente humano, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-ErbB al paciente humano, el método comprende: administrar al paciente una dosis inicial de aproximadamente al menos 5 mg/kg de un anticuerpo anti-ErbB; y administrar al paciente una pluralidad de dosis subsecuentes del anticuerpo en una cantidad que es aproximadamente la misma o menor que la dosis inicial. 102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque en anticuerpo anti-ErbB se selecciona del grupo que consiste del receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR) , anti-ErbB3 y anti-ErbB4. 103. Un método para el tratamiento de cáncer en un paciente humano, caracterizado porque comprende administrar al paciente una primera dosis de un anticuerpo anti-ErbB seguido por al menos una dosis subsecuente del anticuerpo, en donde la primera dosis y la dosis subsecuente se separan en tiempo entre sí por al menos dos semanas. 104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo anti-ErbB se selecciona del grupo que consiste del receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR) , anti-ErbB3 y anti-ErbB4. 105. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende un contenedor, una composición dentro del contenedor que comprende un anticuerpo anti-ErbB, y un inserto de empaque que contiene instrucciones para la dosis del anticuerpo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 101 a 104. 106. Uso de un anticuerpo anti-ErbB2 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una alteración caracterizada por la sobre expresión del receptor ErbB2, en el cuál el tratamiento es por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37. 107. Uso de un anticuerpo anti-ErbB2 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento del cáncer por el método de uno cualquiera de las reivindicaciones 86 a 99. 108. Uso de un anticuerpo anti-ErbB2 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer por el método de la reivindicación 101 o reivindicación 102. 109. Uso de un anticuerpo anti-ErbB2 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o cáncer por el método de la reivindicación 103 o reivindicación 104.