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MX2014009908A - Acido nucleico que comprende o codifica para un asa troncal de histona y una secuencia poly (a) o una señal de poliadenilacion para aumentar la expresion de un antigeno patogenico codificado. - Google Patents

Acido nucleico que comprende o codifica para un asa troncal de histona y una secuencia poly (a) o una señal de poliadenilacion para aumentar la expresion de un antigeno patogenico codificado.

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MX2014009908A
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Andreas Thess
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Curevac Gmbh
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Abstract

La presente invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico, que comprende o codifica para una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína que comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo, al menos un asa troncal de histona y una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación. Además, la presente invención proporciona el uso del ácido nucleico para aumentar la expresión del péptido o proteína codificado. También describe su uso para la preparación de una composición farmacéutica, en especial una vacuna, por ejemplo, para utilizarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas. La presente invención además describe un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína que comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo, utilizando el ácido nucleico que comprende o codifica para un asa troncal de histona y una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación.

Description

ÁCIDO NUCLEICO QUE COMPRENDE O CODIFICA PARA UN ASA TRONCAL DE HISTONA Y UNA SECUENCIA POLY (A) O UNA SEÑAL DE POLIADE ILACION PARA AUMENTAR LA EXPRESIÓN DE UN ANTÍGENO PATOGÉNICO CODIFICADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico, que comprende o codifica para una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo, al menos un asa troncal de histona y una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación . Además, la presente invención proporciona el uso del ácido nucleico para aumentar la expresión del péptido o proteina codificado. También se describe su uso para la preparación de una composición farmacéutica, en especial una vacuna, por ejemplo, para utilizarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas. La presente invención describe además un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variánte o derivado del mismo, utilizando el ácido nucleico que comprende o codifica para un asa troncal de histona y una secuencia poly (A) o una señal de poliadenilación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El aumento de una inmunidad adaptativa mediante vacunación se dirige a estimular las respuestas efectivas contra antígenos específicos presentes en patógenos ín vivo. Los métodos tradicionales de vacunación, utilizando patógenos atenuados vivos o exterminados por calor, han sido exitosos para prevención y tratar enfermedades infecciosas tales como viruela, polio y difteria, aunque existen mayores enfermedades donde no está disponible una vacuna efectiva (por ejemplo, malaria y VIH) , o la vacuna disponible sólo proporciona una protección transitoria o parcial (por ejemplo, cólera y gripe) . Las estrategias más modernas se dirigen a antígenos seleccionados blanco para subconjuntos de células presentadoras de antígenos y que dirigen el sistema inmune hacia las respuestas inmunes de tipo Thl y/o Th2 asociadas con la protección contra el patógeno específico. Estas estrategias dirigidas minuciosamente también pueden conducir al desarrollo de vacunas terapéuticas capaces de superar algunas de las deficiencias inmunitarias inducidas por patógenos para una evasión inmune (Gamvrellis, A., D. Leong et al. (2004), Immunology and Cell Biology 82, 506-516.). Una de estas estrategias novedosas es la vacunación genética .
La terapia génica y la vacunación genética son métodos de la medicina molecular, que ya se han probado en la terapia y prevención de enfermedades y en general exhiben un efecto considerable sobre la práctica médica diaria, en particular con respecto al tratamiento de enfermedades como se mencionó anteriormente. Ambos métodos, la terapia génica y la vacunación genética, se basan en la introducción de ácidos nucleicos en las células o tejido del paciente y el procesamiento posterior de la información codificada por el ácido nucleico que se haya introducido en las células o tejido, es decir, la expresión (proteinica) de los polipéptidos deseados.
En los procedimientos de terapia génica, se utiliza típicamente ADN incluso aunque también se conoce el ARN en desarrollos recientes. De manera importante, en los tres procedimientos de terapia génica el ARNm funciona como mensajero para información de la secuencia de la proteína codificada, sin tomar en consideración si se utiliza ADN, ARN o ARNm viral.
En general se considera al ARN una molécula inestable: las RNasas son omnipresentes y notoriamente difíciles de inactivar. Además, el ARN también es químicamente más lábil que el ADN. De esta forma, quizás es sorprendente que el "estado predeterminado" de un ARNm en una célula eucariota esté caracterizado por una estabilidad relativa y se requieren señales especificas para acelerar la descomposición de los ARNm individuales. La razón principal de este hallazgo parece ser que el ARNm descompuesto dentro de las células se catalizada casi exclusivamente por exonucleasas . Sin embargo, los extremos de los ARNm eucariotas se protegen contra estas enzimas mediante estructuras terminales especificas y sus proteínas asociadas: un m7GpppN CAP en el extremo 5' y típicamente una secuencia poly(A) en el extremo 3' . La eliminación de estas dos modificaciones terminales de esta forma se considera limitante de velocidad para la descomposición del ARNm. Aunque se ha caracterizado un elemento estabilizante en el 3' UTR del ARNm de alfa-globina , las secuencias de ARN que afectan el recambio metabólico de los ARNm eucariotas típicamente actúan como un promotor de la descomposición por lo general al acelerar la desadenilación (revisado en Meyer, S., C. Temme, et al. (2004) , Crit Rev Biochem Mol Biol 39(4): 197-216. ) .
Como se mencionó anteriormente, los extremos 5' de los ARNm eucariotas típicamente se modifican pos-transcripcionalmente para portar una estructura CAP metilada, por ejemplo m7GpppN. Además de las funciones de empalme, estabilización y transporte del ARN, la estructura CAP mejora significativamente el reclutamiento de la subunidad ribosómica 40S para el extremo 5' del ARNm durante el inicio de la traducción. La última función requiere el reconocimiento de la estructura CAP por el complejo factor de iniciación eucariota elF4F. La secuencia poly(A) adicionalmente estimula la traducción vía el reclutamiento aumentado de la subunidad 4 OS para los ARNm, un efecto que requiere la intervención de la proteina de unión con poly(A) (PABP) . La PABP, a su vez, recientemente demostró que interactuar físicamente con elF4G, que forma parte del complejo elF4F unido a CAP. De esta forma, se postuló un modelo de asa cerrada del inicio de la traducción en los ARNm poliadenilados , rematados (Michel, Y. M., D. Poncet, et al. (2000), J Biol Chem 275(41): 32268-76.).
Casi todos los ARNm eucariotas terminan con esta secuencia poly(A) que se agrega a su extremo 3' mediante el mecanismo de segmentación/poliadenilación omnipresente. La presencia de una secuencia poly(A) en el extremo 3' es una de las características más reconocibles de los ARNm eucariotas. Después de la segmentación, la mayoría de los pre-ARNm, con la excepción de las transcripciones de histona dependientes de la replicación obtienen una prolongación poliadenilada. En este contexto, el procesamiento del extremo 3' es un proceso co-transcripcional nuclear que estimula el transporte de los ARNm desde el núcleo hacia el citoplasma y afecta la estabilidad y la traducción de los ARNm. La formación de este extremo 3' se presenta en una reacción en dos pasos dirigida por el mecanismo segmentación/poliadenilación y depende de la presencia de dos elementos de la secuencia en los precursores del ARNm (pre-ARNm) ; un hexanucleótido bastante conservado AAUAAA (señal de poliadenilación) y una secuencia rica en G/U en la dirección 3' . En un primer paso, los pre-ARNm están segmentados entre estos dos elementos. En un segundo paso acoplado estrechamente con el primer paso, el extremo 3' recién formado se extiende mediante la adición de una secuencia poly (A) que consiste de 200-250 adenilatos lo cual afecta posteriormente todos los aspectos del metabolismo del ARNm, incluyendo la exportación, estabilidad y traducción del ARNm, (Dominski, Z. and W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2): 373-90. ) .
La única excepción conocida a esta regla son los ARNm de histonas dependientes de la replicacion que terminan con un asa troncal de histona en lugar de una secuencia poly (A). Las secuencias del asa troncal de histona ilustrativas se describen en López et al. (Dávila López, M. , & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi: 10.1261/rna.782308. ) .
Las asas troncales en los pre-ARNm de histona típicamente están seguidas por una secuencia rica en purina conocida como el elemento en la dirección 3' de la histona (HDE) . Estos pre-ARNm se procesan en el núcleo mediante una segmentación endonucleolitica individual de aproximadamente 5 nucleótidos en la dirección 3' de asa troncal, catalizada por el U7 RNPsn a través de apareamiento de bases del U7 ARNsn con el HDE. La secuencia 3'-UTR que comprende la estructura de asa troncal de histona y el elemento en la dirección 3' de la histona (HDE) (el sitio de unión del U7 snRNP) donde por lo general se denomina como la señal de procesamiento 3' de la histona (Véase, por ejemplo, Chodchoy, N., N. B. Pandey, et al. (1991). Mol Cell Biol 11(1): 497-509.).
Debido al requerimiento de empacar un ADN recién sintetizado en cromatina, la síntesis de histonas se regula de acuerdo con el ciclo celular. Una síntesis aumentada de proteínas de histona durante la fase S se alcanza mediante la activación transcripcional de los genes de histona, así como la regulación pos-transcripcional de los niveles de ARNm de la histona. Se podría mostrar que el asa troncal de la histona es esencial para todos los pasos pos-transcripcionales de la regulación de la expresión de histonas. Para un procesamiento eficiente es necesaria la exportación del ARNm en el citoplasma, la carga sobre polirribosomas , y la regulación de la estabilidad del ARNm.
En el contexto anterior, se identificó una proteína de 32 kDa, que está asociada con el asa troncal de histona en el extremo 3' de los mensajes de la histona tanto en el núcleo como en el citoplasma. El nivel de expresión de esta proteina de unión con el asa troncal (SLBP) se regula por el ciclo celular y es mayor durante la fase S cuando se aumentan los niveles del ARNm de la histona. La SLBP es necesaria para un procesamiento eficiente en el extremo 3' del pre-ARNm de la histona mediante el U7 snRNP. Después de terminar el procesamiento, la SLBP permanece asociada con el asa troncal en el extremo de los ARNm de la histona madura y estimula su traducción en las proteínas de histona en el citoplasma. (Dominski, Z. and W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2): 373-90) . De manera interesante, el dominio de unión del ARN de la SLBP se conserva en todos los metazoarios y protozoarios (Dávila López, M . , & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) y se podría mostrar que su unión a la secuencia de asa troncal de histona depende de la estructura del asa troncal y que el sitio de unión mínima contiene al menos 3 nucleótidos 5' y 2, 3' del asa troncal (Pandey, N. B., et al. (1994), Molecular and Cellular Biology, 14(3), 1709-1720 and Williams, A. S., & Marzluff, W. F. , (1995), Nucleic Acids Research, 23{A), 654-662. ) .
Incluso aunque se han identificado en casos muy raros, los genes de histona en general se clasifican como ya sea "dependiente de la replicación", dando lugar a la terminación del ARNm en un asa troncal de histona, o "tipo de reemplazamiento", dando lugar a un ARNm que porta una prolongación de poly(A) en lugar de, los ARNm de origen natural que contienen tanto un asa troncal de histona como y poly(A) u oligo(A) 3' de los mismos. Sánchez et al. examinaron el efecto de las prolongaciones oligo(A) de origen natural 3' anexadas del asa troncal del ARNm de la histona durante la ovogénesis Xenopus utilizando luciferasa como una proteina reportera y encontraron que la prolongación oligo (A) es una parte activa del mecanismo para represión de traducción que lentifica el ARNm de la histona durante la ovogénesis y su eliminación forma parte del mecanismo que activa la traducción de los ARNm de la histona (Sánchez, R. and W. F. Marzluff (2004), Mol Cell Biol 24(6): 2513-25).
Además, se han investigado los requerimientos para la regulación de las histonas dependientes de la replicación al nivel del procesamiento de pre-ARNm y la estabilidad del ARNm utilizando estructuras artificiales que codifican para la proteina marcadora alfa-globina, aprovechando el hecho de que el gen de globinas contiene intrones en oposición a los genes de histona con menos intrones. Para este fin se generaron estructuras en las cuales las secuencias codificantes de alfa globina se siguió mediante una señal de asa troncal de histona (el asa troncal de histona seguida por el elemento en dirección 3' de la histona) y una señal de poliadenilación (Whitelaw, E., et al. (1986). Nucleic Acids Research, 14(17), 7059-7070.; Pandey, N. B., & Marzluff, W. F. (1987). Molecular and Cellular Biology, 7(12), 4557-4559.; Pandey, N. B., et al. (1990). Nucleic Acids Research, 18(11), 3161-3170) .
En otro procedimiento Liischer et al. investigaron la regulación dependiente del ciclo celular de un gen H4 de la histona recombinante . Las estructuras fueron generadas en las cuales se siguió la secuencia de codificación H4 seguida por una señal de asa troncal de histona y una señal de poliadenilación, las dos señales de procesamiento separadas incidentalmente por una secuencia codificante de galactoquinasa (Lüscher, B. et al., (1985). Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82(13), 4389-4393).
Adicionalmente, Stauber et al., identificaron la secuencia mínima requerida para conferir una regulación de ciclo celular sobre los niveles del ARNm H4 de la histona. Para estas investigaciones, se utilizaron estructuras, que comprende una secuencia codificante para la selección del marcador xantina: Guanina fosforibosilo transferasa (GPT) que precede a una señal de asa troncal de histona seguida por una señal de poliadenilación (Stauber, C. et al., (1986). E BO J, 5 (12) , 3297-3303) .
En el examen procesamiento del pre-ARNm de la histona Wagner et al., identificaron los factores requeridos para la segmentación de los pre-ARNm de la histona utilizando una estructura reportera colocando la EGFP entre una señal de asa troncal de histona y una señal de poliadenilación, de tal forma que la EGFP se exprese únicamente en caso de que se interrumpa el procesamiento del pre-ARNm de la histona (Wagner, E . J. et al., (2007). Mol Cell 28(4), 692-9).
Cabe señalar, que la traducción del ARNm poliadenilado por lo general requiere la secuencia 3' poly(A) que se pondrá en proximidad del 5' CAP. Esto se realiza a través de la interacción proteina-proteina entre la proteina de unión con poly(A) y el factor de inicio eucariota elF4G. Con respecto a los ARNm de la histona dependiente de la replicación, queda sin cubrir un mecanismo análogo. En este contexto, Gallie et al., muestran que el asa troncal de histona es funcionalmente similar a una secuencia poly(A) ya que mejora la eficiencia traduccional y es co-dependiente de un 5' -CAP para establecer un nivel de traducción eficiente. Mostraron que el asa troncal de histona es suficiente y necesaria para aumentar la traducción de un ARNm reportero en células de ovario de hámster chino transíectadas aunque se debe colocar en el extremo 3' para que funcione óptimamente. Por lo tanto, similar a la prolongación poly(A) en otros ARNm, el extremo 3' de estos ARNm de histona parece ser esencial para la traducción in vivo y es funcionalmente análogo con una prolongación poly(A) (Gallie, D. R., Lewis, N. J., & Marzluff, W. F. (1996), Nucleic Acids Research, 24(10), 1954-1962) .
Adicionalmente, se podría mostrar que la SLBP está unida al ARNm de la histona citoplásmica y se requiere para su traducción. Incluso aunque la SLBP no interactúe directamente con elF4G, el dominio requerido para la traducción del ARNm de histonas interactúa con la proteína SLIP1 recientemente identificada. En un aspecto adicional, la SLIP1 interactúa con elF4G y permite circularizar el ARNm de la histona y soportar una traducción eficiente del ARNm de la histona mediante un mecanismo similar a la traducción de los ARNm poliadenilados .
Como se mencionó anteriormente, los procedimientos de terapia génica normalmente utilizan ADN para transferir la información de codificación en la célula que luego se transcribe en el ARNm, portando los elementos de origen natural de un ARNm, en particular la estructura 5' -CAP y la secuencia 3' poly(A) para asegurar la expresión de la proteína terapéutica o antigénica codificada.
Sin embargo, en muchos casos, los sistemas de expresión se basan en la introducción de estos ácidos nucleicos al interior de las células o tejido del paciente y la expresión posterior de los polipéptidos deseados codificados por estos ácidos nucleicos no exhiben el nivel de expresión deseado, o incluso requerido que puede permitir una terapia eficiente, sin importar que se utilice ADN o ARN .
En la técnica anterior, hasta ahora se han realizado diferentes intentos para aumentar el rendimiento de la expresión de una proteina codificada, en particular, mediante el uso de sistemas mejorados de expresión, tanto in vitro y/o in vivo. Los métodos para aumentar la expresión descrita en general en la técnica anterior se basan convencionalmente en el uso de vectores de expresión o casetes que contengan promotores específicos y elementos de regulación correspondientes. Ya que estos vectores de expresión o casetes típicamente se limitan a sistemas células particulares, estos sistemas de expresión se deben adaptar para utilizarse en diferentes sistemas celulares. Estos vectores de expresión o casetes adaptados luego por lo general se transfectan en las células y se tratan típicamente en dependencia de la línea celular específica. Por lo tanto, se da preferencia principalmente a aquellas moléculas de ácido nucleico que sean capaces de expresar las proteínas codificadas en una célula blanco mediante los sistemas inherentes en la célula, independiente de los promotores y elementos de regulación que son específicos para los tipos celulares particulares. En este contexto, puede haber distinción entre los elementos estabilizantes del ARNm y los elementos que aumentan la eficacia de traducción del ARNm.
Los ARNm que se optimizan en su secuencia codificante y que en general son adecuados para este fin se describen en la solicitud O 02/098443 (CureVac GmbH) . Por ejemplo, la WO 02/098443 describe los ARNm que están estabilizados en forma general y optimizados para traducción en sus regiones codificantes. La WO 02/098443 describe además un método para determinar las modificaciones de secuencia. La WO 02/098443 describe adicionalmente las posibilidades para sustituir los nucleótidos de adenina y uracilo en las secuencias de ARNm para aumentar el contenido de guanina/citosina (G/C) de las secuencias. De acuerdo con la WO 02/098443, estas sustituciones y adaptaciones para aumentar el contenido de G/C se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas génicas, aunque también para vacunas genéticas en el tratamiento del cáncer o enfermedades infecciosas. En este contexto, la WO 02/098443 en general menciona las secuencias como una secuencia base para estas modificaciones, en las cuales los códigos modificados del ARNm para al menos un péptidc o polipéptido biológicamente activo, que se traduce en el paciente que será tratado, por ejemplo, ya sea no en todo o inadecuadamente o con defectos. Alternativamente, la WO 02/098443 propone los ARNm que codifican para antigenos, por ejemplo, antigenos patogénicos o antigenos virales como una secuencia base para estas modificaciones .
En un procedimiento adicional para aumentar la expresión de una proteina codificada, la solicitud WO 2007/036366 describe el efecto positivo de las secuencias poly(A) largas (en particular, más largas que 120 pb) y la combinación de al menos dos regiones sin traducir 3' del gen beta-globina sobre la estabilidad del ARNm y la actividad traduccional .
Sin embargo, incluso aunque todos estos últimos documentos de la técnica anterior ya probaron proporcionar herramientas muy eficientes para los procedimientos de terapia génica y adicionalmente una estabilidad y actividad traduccional mejoradas del ARNm, siguen existiendo los problemas de una estabilidad en general menor de las aplicaciones a base de ARN contra las vacunas de ADN y los procedimientos terapéuticos génicos a base de ADN. Por consiguiente, todavía existe una necesidad en la técnica por proporcionar herramientas mejoradas para los procedimientos de terapia génica y vacunación genética o como una terapia suplementaria para los tratamientos convencionales como se analizó anteriormente, que permiten una mejor provisión de proteínas codificadas in vivo, ' por ejemplo, vía una estabilidad y/o actividad traduccional mejoradas del ARNm, de preferencia para una terapia génica y una vacunación genética .
Además, a pesar de todo el progreso en la técnica, la expresión eficiente de un péptido codificado o proteína en los sistemas libres de células, células u organismos (expresión recombinante ) sigue siendo un problema desafiante.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, el objetivo fundamental de la presente invención es proporcionar métodos adicionales y/o alternativos para aumentar la expresión de una proteína codificada, de preferencia vía una estabilización adicional del ARNm y/o un aumento de la eficacia traduccional de este ARNm con respecto a los ácidos nucleicos conocidos de la técnica anterior para utilizarse en vacunación genética en el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades infecciosas .
Este objetivo se resuelve por la materia de las reivindicaciones anexas. En particular, el objetivo fundamental de la presente invención se resuelve de acuerdo con un primer aspecto mediante una secuencia de ácido nucleico inventivo que comprende o que codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivados del mismo; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación, de preferencia para aumentar la expresión del péptido o proteina codificado.
Alternativamente, se puede emplear por la presente invención en todos sus aspectos y modalidades cualquier secuencia del asa troncal adecuada distinta a una secuencia de asa troncal de histona (derivada de los genes de histonas, en particular, los genes de histonas de las familias Hl, H2A, H2B, H3 y H4) .
En este contexto, se prefiere particularmente que el ácido nucleico inventivo, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, se produzca al menos parcialmente mediante la síntesis de ADN o ARN, de preferencia como se describe en la presente o es un ácido nucleico aislado.
La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de los inventores de la presente, que la combinación de una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación y al menos un asa troncal de histona, incuso aunque ambas presentan mecanismos alternativos por naturaleza, actúa sinérgicamente a medida que aumenta la expresión proteinica múltiple por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. El efecto sinérgico de la combinación de poly(A) y al menos un asa troncal de histona es visto con independencia del orden de la poly(A) y el asa troncal de histona y con independencia de la longitud de la secuencia poly(A).
Por lo tanto, se prefiere particularmente que la secuencia de ácido nucleico inventiva comprenda o codifique para a) una región codificante, que codifica al menos para un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una secuencia de poliadenilación; de preferencia para aumentar el nivel de expresión del péptido o proteína codificado, en donde la proteína codificada de preferencia no es una proteína de histona, en particular, ninguna proteína de histona de las familias de histonas H4, H3, H2A y/o H2B o un fragmento, derivado o variante de las mismas que conserve una (función de histonas ( -similares )) , a saber, que forma un nucleosoma. También, la proteína codificada típicamente no corresponde a una proteína ligadora de histona de la familia de histonas Hl. La molécula de ácido nucleico inventivo típicamente no contiene ninguna de las señales reguladoras (5' y/o, en particular, 3' de un gen de histonas de ratón, en particular, no un gen de histonas de ratón H2A y, además, de mayor preferencia no el gen de histonas de ratón H2A614. En particular, no contiene un asa troncal de histona y/o una señal para procesamiento de asa troncal de histona proveniente de gen de histonas de ratón, en particular, no un gen de histonas de ratón H2A y de mayor preferencia no un gen de histonas de ratón H2A614.
También, típicamente el ácido nucleico de la invención no proporciona una proteína reportera (por ejemplo, luciferasa, GFP, EGFP, ß-galactosidasa, en particular EGFP) , galactoquinasa (galK) y/o una proteína marcadora o de selección (por ejemplo, alfa-globina, galactoquinasa y xantina: Guanina fosforribosiltransferasa (GPT) ) o una proteína reportera bacteriana, por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) u otras proteínas de resistencia a antibióticos bacterianos, por ejemplo, derivadas del neo gen bacteriano en su elemento (a) .
Típicamente se entiende que una proteína reportera, marcadora o de selección no será una proteína antigénica de acuerdo con la invención. Una proteína reportera, marcadora o de selección o su gen fundamental se utiliza como una herramienta de búsqueda en bacterias, cultivos celulares, animales o plantas. Los mismos confieren sobre los organismos (de preferencia heterólogamente ) que los que expresan una propiedad fácilmente identificable, que se puede medir o que permite la selección. Específicamente, las proteínas marcadoras o de selección exhiben una función seleccionable . Típicamente, en esta selección, las proteínas marcadoras o reporteras no son de origen natural en humanos u otros mamíferos, pero se derivan de otros organismos, en particular a partir de bacterias o plantas. Por consiguiente, las proteínas con una función de selección, marcadora o reportera que se originan de especies inferiores (por ejemplo, bacterias) de preferencia se excluyen de ser entendidas como una "proteína antigénica" de acuerdo con la presente invención. Con respecto a esto, se debe entender que una proteína antigénica corresponde a una proteína, que desencadena una reacción inmunológica que permite proteger inmunológicamente el sujeto contra una infección mediante un organismo o virus que ejerce una reacción patológica en el sujeto dando por resultado en un estado de enfermedad. En particular, una proteína de selección, marcadora o reportera permite identificar células transformadas mediante ensayos in vitro con base, por ejemplo, en técnicas de fluorescencia u otras espectroscópicas y proporcionar resistencia hacia los antibióticos. Los genes de selección, reporteros o con marcador que otorgan estas propiedades a las células transformadas por lo tanto, típicamente no se entiende que sean una proteína antigénica patogénica de acuerdo con la invención .
En cualquier caso, las proteínas reporteras, o marcadores de selección por lo general no ejercen ningún efecto antigénico como resultado de la respuesta inmunológica (del sujeto que será tratado) hacia el antígeno patogénico. Si cualquier proteína reportera individual, marcadora o de selección, no obstante lo haga (además de su función reportera de selección o de función marcadora) , esta proteína reportera, marcadora o de selección de preferencia no se entiende que sea un "antígeno patogénico" dentro del significado de la presente invención.
Por el contrario, un antígeno patogénico (incluyendo sus fragmentos, variantes y derivados), en particular, excluyendo los genes de histona de las familias Hl, ?2?, H2B, H3 y H4, de acuerdo con la presente invención típicamente no exhibe una función de selección, marcadora o reportera. No obstante si cualquier "antígeno patogénico", individual deba hacerlo (además de su función antigénica) , este antígeno patogénico de preferencia no se entiende que sea una "proteína de selección, marcadora o reportera" dentro del significado de la presente invención.
De mayor preferencia se entiende que un antígeno patogénico, de acuerdo con la invención, se deriva de organismos patogénicos, de preferencia, bacterias o virus, que ejerzan una función inmunológica . Típicamente, estos antígenos no califican como una proteína de selección, marcadora o reportera.
Por consiguiente, se prefiere que la región codificante (a) que codifica al menos para un péptido o proteína sea heteróloga para al menos (b) al menos un asa troncal de histona, o más ampliamente, para cualquier asa troncal adecuada. En otras palabras, "heterólogo" en el contexto de la presente invención significa que al menos una secuencia de asa troncal no es de origen natural como una secuencia (reguladora) (por ejemplo, en el 3' UTR) del gen específico, que codifica para la proteína antigénica (patogénica) o el péptido del elemento (A) del ácido nucleico inventivo. Por consiguiente, el asa troncal (de histona) del ácido nucleico inventivo de preferencia se deriva del 3' UTR de un gen distinto al que comprende la región codificante del elemento (a) del ácido nucleico inventivo. Por ejemplo, la región codificante del elemento (a) no codificará para una proteína de histona o un fragmento, variante o derivado de la misma (que conserva la función de una proteina de histona) , si el acido nucleico inventivo es heterólogo, aunque codificará para cualquier otro péptido o secuencia (de la misma u otra especie) que ejerza una función biológica, de preferencia una función antigénica distinta de la función de histona- (similar) , por ejemplo, codificará para una proteina antigénica (que ejerza una función antigénica, por ejemplo, al desencadenar la reacción del sistema inmune del sujeto, por ejemplo, mediante una reacción del anticuerpo, permitiendo con esto que el ácido nucleico inventivo actúe como una vacuna, por ejemplo, en mamíferos, en particular en seres humanos.
En este contexto, se prefiere particularmente que el ácido nucleico de la invención comprenda o codifique en la dirección 5'- o 3'-: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antígeno patogénico o fragmento, variante o derivado del mismo; b) al menos un asa troncal de histona, opcionalmente sin un elemento en la dirección 3' de la histona (HDE) 3' para el asa troncal de histona; c) una secuencia poly(A) de una señal de poliadenilación .
El término "elemento en la dirección 3' de histona (HDE) se refiere a un tramo de polinucleótido rico en purina de aproximadamente 5 hasta 20 nucleótidos 3' de las asas troncales de histona, lo que representa el sitio de unión para el U7 ARNsn implicado en el procesamiento del pre-ARNm de histona en el ARNm de histona maduro. Por ejemplo, en los erizos de mar el HDE es CAAGAAAGA (Dominski, Z. and W. F . Marzluff (2007), Gene 396(2): 373-90).
Además, se prefiere que el ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención no comprenda un intrón.
En otra modalidad preferida particular, la secuencia del ácido nucleico inventivo, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención comprende o codifica para 5' a 3' : a) una región codificante, que de preferencia codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo; c) una secuencia poly(A); y b) al menos un asa troncal de histona.
La secuencia de ácido nucleico inventivo de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención comprende cualquier ácido nucleico adecuado, seleccionado, por ejemplo de cualquier ADN (de cadena individual o doble cadena) de preferencia sin estar limitada a las mismas, por ejemplo, un ADN genómico, un ADN de plásmido, moléculas de ADN de cadena individual, moléculas de ADN de doble cadena, o se puede seleccionar de cualquier PNA (ácido nucleico peptidico) o se puede seleccionar por ejemplo de cualquier ARN (de cadena individual o de doble cadena), de preferencia un ARN mensajero (ARNm) ; etc. La secuencia de ácido nucleico inventivo también puede comprender un ARN viral (ARNv) . Sin embargo, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede no ser un ARN viral o puede no contener una ARN viral. Más específicamente, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede no contener elementos de secuencias virales, por ejemplo, intensificadores virales o promotores virales (por ejemplo, sin un promotor viral inactivado o elementos de secuencia, más específicamente no activados por estrategias de reemplazo) , u otros elementos de secuencias virales, o secuencias de ácidos nucleico viral o retroviral. Más específicamente, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede no ser un vector retroviral o viral o un vector retroviral o viral modificado.
En cualquier caso, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede o no contener una secuencia intensificadora y/o promotora, que se pueda modificar o no, o que se pueda activar o no. El intensificador y/o promotor puede ser una planta expresable o no expresable, y/o en eucariotas expresables o no expresables y/o en procariotas expresables o no expresables. La secuencia de ácido nucleico inventivo puede contener una secuencia que codifica para un ribosoma (de auto-empalme) o no.
En modalidades especificas, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede ser o puede comprender un ARN de auto-replicación (replicón) .
De preferencia, la secuencia de ácido nucleico inventivo es un ADN de plásmido, o un ARN, en particular un ARNm.
En modalidades particulares del primer aspecto de la presente invención, el ácido nucleico inventivo es una secuencia de ácido nucleico que consta de un ácido nucleico adecuado para transcripción in vitro, en particular en un vector de transcripción in vitro adecuado (por ejemplo, un plásmido o una secuencia de ácido nucleico lineal que comprende promotores específicos para una transcripción in vitro, tales como los promotores T3, T7 o SP6) .
En modalidades preferidas particulares adicionales del primer aspecto de la presente invención, el ácido nucleico inventivo consta de un ácido nucleico adecuado para transcripción y/o traducción en un sistema de expresión (por ejemplo, en un vector de expresión o plásmido), en particular un sistema de expresión procariota (por ejemplo, bacterias similares a E. coli) o eucariotas (células de mamíferos, similares a células CHO, células de levadura o células de insecto u organismos enteros similares a plantas o animales) .
El término "sistema de expresión" significa un sistema (cultivo celular u organismos enteros) que sea adecuado para la producción de péptidos, proteínas o ARN en particular ARNm (expresión recombinante) .
La secuencia de ácido nucleico inventivo, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, comprende o codifica para al menos un asa troncal de histona. En el contexto de la presente invención, esta asa troncal de histona típicamente se deriva de genes de histona y comprende un apareamiento de bases intramoleculares de dos secuencias complementarias totalmente en vecindad o parcialmente inversas, formando con esto un asa troncal. Un asa troncal en general es independiente de que sea un asa troncal de histonas o no, se puede presentar en un ADN de cadena individual o, más comúnmente, en un ARN. Esta estructura también se conoce como una horquilla o asa de horquilla y por lo general consiste de un tronco y un asa (terminal) dentro de una secuencia consecutiva, en donde el tronco está formado por dos secuencias complementarias totalmente en vecindad o parcialmente inversas separadas por una secuencia corta como una especie de separador, que constituye el asa de la estructura de asa troncal. Las dos secuencias complementarias totalmente en vecindad o parcialmente inversas se pueden definir como por ejemplo los elementos de asa troncal tronco 1 y tronco 2. El asa troncal se forma cuando dos secuencias complementarias en vecindad o parcialmente inversas, por ejemplo, los elementos de asa troncal, tronco 1 y tronco 2, forman pares de bases entre si, conduciendo a un tramo de la secuencia de ácido nucleico de doble cadena que comprende un asa no apareada en su extremo terminal formado por la secuencia corta ubicada entre los elementos de asa troncal tronco 1 y tronco 2 en la secuencia consecutiva. El asa no apareada típicamente con esto representa una región del ácido nucleico que no es capaz de formar pares de bases con cualquiera de estos elementos de asa troncal. La estructura con forma de paleta resultante es un bloque de construcción clave en muchas estructuras secundarias de ARN. La formación de una estructura de asa troncal de esta forma depende de la estabilidad del tronco resultante y las regiones de asa, en donde el primer pre-requisito típicamente es la presencia de una secuencia que se puede plegar en si misma para formar una doble cadena apareada. La estabilidad de los elementos de asa troncal apareado se determina por la longitud, el número de mal-apareamientos o protuberancias que contienen (un pequeño número de mal-apareamientos típicamente tolerable, en especial en un tramo largo de doble cadena) , y la composición de base de la región apareada. En el contexto de la presente invención, es imaginable una longitud del asa de 3 hasta 15 bases, mientras que una longitud del asa óptima más preferida es de 3-10 bases, de mayor preferencia de 3 hasta 8, de 3 hasta 7, de 3 hasta 6 o incluso de mayor preferencia de 4 hasta 5 bases, y con la máxima preferencia 4 bases. La secuencia troncal que forma la estructura de doble cadena típicamente tiene una longitud entre 5 hasta 10 bases, de mayor preferencia entre 5 hasta 8 bases.
En el contexto de la presente invención, un asa troncal de histona típicamente se deriva de los genes de histona (por ejemplo, los genes de las familias de histonas Hl, H2A, H2B, H3, H4) y comprende un apareamiento de bases intramoleculares de dos secuencias complementarias totalmente en vecindad o parcialmente inversas, formando con esto un asa troncal. Típicamente, un asa troncal 3' UTR de histona es un elemento de ARN implicado en el transporte nucleocitoplásmico de los ARNm de histona, y en la regulación de la estabilidad y la eficiencia de traducción en el citoplasma. Los ARNm de los genes de histonas en metazoarios carecen de poliadenilación y una prolongación poly-A, en lugar de que el procesamiento en el extremo 3' se presente en un sitio entre esta asa troncal conservada y una región rica en purina alrededor de 20 nucleótidos en la dirección 3' (el elemento en la dirección 3' de histona, o HDE) . El asa troncal de histona está unida por una proteína de unión del asa troncal de 31 kDa (SLBP - también denominada la proteína de unión de horquilla con histonas, o HBP) . Estas estructuras de asa troncal de histona de preferencia se emplean por la presente invención en combinación con otros elementos de secuencia y estructuras, que no son de origen natural (lo que significa que están sin transformar en organismos vivientes/células) en los genes de histona, pero que están combinados -de acuerdo con la- para proporcionar un ácido nucleico artificial, heterólogo. Por consiguiente, la presente invención se basa particularmente en el hallazgo de que una combinación artificial (no natural) de una estructura de asa troncal de histona con otros elementos de secuencias heterologas, que no se presentan en los genes de histona o los genes de histona de metazoarios y están aislados de las regiones operacionales y/o reguladoras de la secuencia (lo que influye en la transcripción y/o traducción) de los genes que codifican para proteínas distintas a histonas, proporcionan efectos ventajosos. Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona la combinación de una estructura de asa troncal de histona con una secuencia poly(A) o una secuencia presentadora de una señal de poliadenilacion (3' terminal de una región codificante) , que no se presenta en los genes de histonas de metazoarios. De acuerdo con otro aspecto preferido de la invención, se proporciona con el mismo una combinación de una estructura de asa troncal de histona con una región codificante que codifica para un antigeno patogénico, el cual, de preferencia no se presenta en los genes de histonas de metazoarios (la región codificante y la secuencia de asa troncal de histonas son heterólogas) . Se prefiere, si estos antigenos patogénicos no se presentan en metazoarios en absoluto, pero se derivan de organismos unicelulares, por ejemplo, bacterias, o de virus. En una modalidad todavía preferida adicional, todos los elementos (a) , (b) y (c) del ácido nucleico inventivo son heterólogos entre sí y se combinan artificialmente a partir de tres fuentes diferentes, por ejemplo, la región codificante de antígenos proveniente de bacterias o virus, el asa troncal de histona proveniente de un gen de histona de metazoarios y la secuencia poly (A) o la señal de poliadenilacion proveniente por ejemplo de un gen de metazoarios distinto a un gen de histona .
Por lo tanto, un asa troncal de histonas es, una estructura de asa troncal como se describe en la presente, la cual, si de preferencia se define funcionalmente exhibe/conserva la propiedad de unión a su pareja de unión natural, la protelna de unión de asa troncal (SLBP - también denominada la proteina de unión de horquilla con histona, o HBP) .
De acuerdo con la presente invención, la secuencia de asa troncal de histona de acuerdo con el componente (b) de la reivindicación 1 puede no estar derivada de una proteina de histonas de ratón. Más específicamente, la secuencia de asa troncal de histona puede no estar derivada de un gen de histonas de ratón H2A614. También, el ácido nucleico de la invención puede ser que no contenga una secuencia de asa troncal de histonas de ratón ni contenga un gen de histonas de ratón H2A614. Además, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede no contener una señal de procesamiento del asa troncal, más específicamente, una señal de procesamiento de histonas de ratón y, más específicamente, puede no contener una señal de procesamiento de asa troncal de ratón H2kA614, incluso si la secuencia de ácido nucleico inventivo puede contener al menos un gen de histona de mamífero. Sin embargo, al menos un gen de histona de mamífero puede no ser la SEC ID NO: 7 de la WO 01/12824.
De acuerdo con una modalidad preferida del primer aspecto inventivo, la secuencia de ácido nucleico inventivo comprende o codifica para al menos una secuencia de asa troncal de istona, de preferencia de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas (I) o (II) : fórmula (I) (secuencia de asa troncal sin elementos contiguos troncales) : [No.2GN3.s] V» fNWUmN [N3-5CN0 2¡ J V» tronco 1 asa tronco2 fórmula (II) (secuencia de asa troncal con elementos contiguos troncales) : elemento tioncol tronco 2 elemento contigua del tronco 1 contiguo del tronco2 en donde: los elementos es una secuencia consecutiva de 1 hasta contiguos del 6, de preferencia 2 hasta 6, de mayor tronco 1 o preferencia 2 hasta 5, incluso de mayor tronco 2 ??-6 preferencia 3 hasta 5, con la máxima preferencia de 4 hasta 5 o 5N en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleotido del mismo; tronco 1 es complementario inverso o [N0-2GN3- 5 ] complementario parcialmente inverso con el elemento de tronco 2, y es una secuencia consecutiva entre 5 hasta 7 nucleótidos ; en donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 hasta 2, de preferencia 0 hasta 1, de mayor preferencia 1 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; en donde N3- 5 es una secuencia consecutiva de 3 hasta 5, de preferencia 5 hasta 5, de mayor preferencia 4 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, u, T, G y C, 0 un análogo de nucleótido del mismo; y en donde G es guanosina 0 un análogo de la misma y se puede remplazar opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, con la condición de que la citidina de nucleótido complementaria en el tronco 2 se remplace por guanosina; está ubicada entre los elementos del tronco 1 y tronco 2, y es una secuencia consecutiva de 3 hasta 5 nucleótidos, de mayor preferencia de 4 nucleótidos; en donde cada No-4 es independientemente de otra secuencia consecutiva de 0 hasta 4, de preferencia de 1 hasta 3, de mayor preferencia 1 hasta 2 N, en donde cada N es independientemente de otra seleccionada de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde U/T representa uridina u opcionalmente timidina; es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa con el elemento de tronco 1, y es una secuencia consecutiva entre 5 hasta 7 nucleótidos ; en donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 hasta 5, de preferencia 4 hasta 5, de mayor preferencia 4 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; en donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 hasta 2, de preferencia 0 hasta 1, de mayor preferencia 1 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, ü, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde C es citidina o un análogo de la misma y se puede remplazar opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma, con la condición de que su guanosina de nucleótido complementario en el tronco 1 se remplace por citidina; en donde el tronco 1 y tronco 2 son capaces de realizar un apareamiento de bases entre si formando una secuencia complementaria inversa, en donde el apareamiento de bases se puede presentar entre el tronco 1 y el tronco 2, por ejemplo, mediante un apareamiento de bases Watson-Crick de los nucleótidos A y U/T o G y C, o mediante un apareamiento de bases que no Watson-Crick por ejemplo un apareamiento de bases de balanceo, un apareamiento de bases Watson-Crick inverso, un apareamiento de bases Hoogsteen, un apareamiento de bases Hoogsteen inverso o tenga la capacidad para formar un apareamiento de bases entre si formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, en donde se puede presentar un apareamiento de bases incompleto entre el tronco 1 y el tronco 2, con base entre una o más bases en el único tronco no tenga una base complementaria en la secuencia complementaria inversa del otro tronco.
En el contexto anterior, un apareamiento de bases de balanceo típicamente es un apareamiento de bases que no sea de Watson-Crick entre los nucleótidos. Los cuatro pares de bases de balanceo principales en el presente contexto, que se pueden utilizar, son guanosina-uridina, inosina-uridina , inosina-adenosina, inosina-citidina (G-U/T, I-U/T, I-A e I-C) y adenosina-citidina (A-C) .
Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, una base de balanceo es una base, que forma un par de bases de balanceo con una base adicional como se describió anteriormente, Por lo tanto, un apareamiento de bases que no sea Watson-Crick, por ejemplo, un apareamiento de bases de balanceo, se puede presentar en el tronco de la estructura de asa troncal de histona de acuerdo con la presente invención.
En el contexto anterior, una secuencia complementaria parcialmente inversa comprende como máximo 2, de preferencia sólo un mal apareamiento en la estructura troncal de la secuencia de asa troncal formada por el apareamiento de bases del tronco 1 y el tronco 2. En otras palabras, el tronco 1 y el tronco 2 de preferencia son capaces de formar apareamiento de bases (totales) entre si a todo lo largo de la secuencia completa del tronco 1 y el tronco 2 (100% de posibles apareamientos de bases correctos Watson-Crick o que no sean Watson-Crick) , formando con esto una secuencia complementaria inversa, en donde cada base tiene su base colgante Watson-Crick o que no sea de Watson-Crick como una pareja de unión complementaria. Alternativamente, el tronco 1 y el tronco 2 de preferencia tienen la capacidad para formar pares de bases parciales entre si a todo largo de la secuencia del tronco 1 y el tronco 2, en donde al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% del 100% de apareamientos de bases correctos posibles de Watson-Crick o que no sea Watson-Crick están ocupados con los apareamientos de bases correctos Watson-Crick o que no sean Watson-Crick y como máximo aproximadamente el 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, ó 5% de las bases restantes están sin aparear.
De acuerdo con una modalidad preferida del primer aspecto inventivo, al menos una secuencia de asa troncal de histona (con los elementos contiguos troncales) de la secuencia de ácido nucleico inventivo como se define en la presente comprende una longitud entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 45 nucleótidos, de preferencia una longitud entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 40 nucleótidos, de preferencia una longitud entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35 nucleótidos, incluso de mayor preferencia una longitud entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de mayor preferencia una longitud entre aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 y con la máxima preferencia una longitud entre aproximadamente 24 hasta aproximadamente 28 nucleótidos .
De acuerdo con una modalidad preferida adicional del primer aspecto inventivo, al menos una secuencia de asa troncal de histona (sin los elementos contiguos troncales) de la secuencia de ácido nucleico inventivo como se define en la presente comprende una longitud entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 nucleótidos, de preferencia una longitud entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, de preferencia una longitud entre aproximadamente 12 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, de preferencia una longitud entre aproximadamente 14 hasta aproximadamente 20 nucleótidos incluso de mayor preferencia una longitud entre aproximadamente 16 hasta aproximadamente 1 7 y con la máxima preferencia una longitud de aproximadamente 16 nucleótidos.
De acuerdo con una modalidad preferida adicional del primer aspecto inventivo, la secuencia de ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención puede comprender o codificar para al menos una secuencia de asa troncal de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas especificas (la) o (lia): fórmula (la) (secuencia de asa troncal sin elementos contiguos troncales) : [N^GNj.,] [N (U/nNH] [N3 5CNfrl] 'X v >· troncal asa tronco2 fórmula (Ha) (secuencia de asa troncal con elementos contiguos troncales) : elemento tronco 1 asa tronco 2 elemento contiguo del tronco 1 contiguo deltronco2 en donde: N, C, G, T y U son como se definió anteriormente .
De acuerdo con una modalidad adicional particularmente más preferida del primer aspecto, la secuencia de ácido nucleico inventivo puede comprender o codificar para al menos una secuencia de asa troncal de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas especificas (Ib) o (Ilb): fórmula (Ib) (secuencia de asa troncal sin elementos contiguos troncales) : tr ncol asa tronco2 fórmula (Ilb) (secuencia de asa troncal elementos contiguos troncales) : contiguo del troncol contiguo del tronco2 en donde: N, C, G, T y U son como se definió anteriormente .
De acuerdo todavía con una modalidad más preferida del primer aspecto inventivo, la secuencia de ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención puede comprender o codifica para al menos una secuencia de asa troncal de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas especificas (Ic) hasta (Ih) o (lie) hasta (Ilh) , mostradas alternativamente en su estructura de asa troncal y como una secuencia lineal que representa las secuencias del asa troncal de histona según se generan de acuerdo con Ejemplo 1: Fórmula (Ic): (secuencia consensuada de asa troncal de histona de protozoarios sin elementos contiguos troncales) : N U N N N-N N-N N-N N-N G-C N-N (estructura de asa troncal) NGNNNNNNUNNNNNCN (secuencia lineal) (SEC ID NO: 1) Fórmula (lie): (secuencia consensuada de asa troncal de histona de metazoarios y protozoarios con elementos contiguos troncales) : N U N N N-N N-N N-N N-N G-C N*N*NNNN-NNNN*N*N* {estructura de asa troncal) N*N*NNNNGNNNNNNUNNNNNCNNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEC ID NO: 2) Fórmula (Id) : (sin elementos contiguos del tronco) N U N N N-N N-N N-N N-N C-C N-N (estructura de asa troncal) NCNNNNNNUNNNNNGN (secuencia lineal) (SEC ID NO: 3) Fórmula (lid): (con elementos contiguos del tronco) : N U N N N-N N-N N-N N-N C-G N*N*NNNN-NNNN*N*N* (estructura de asa troncal) N*N*NNNNCNNNNNNUNNNNNGNNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEC ID NO: 4) Fórmula (le): (secuencia consensuada de asa troncal de histona de protozoarios sin elementos contiguos troncales) : N U N N N-N N-N N-N N-N G-C D-H (estructura de asa troncal) DGNNNNNNUNNNNNCH (secuencia lineal) (SEC ID NO: 5) Fórmula (lie): (secuencia consensuada de asa troncal de histona de protozoarios con elementos contiguos troncales ) : N U N N N-N N-N N-N N-N G-C N*N*NNND-HNNN*N*N* (estructura de asa troncal) N*N*NNNDGNNNNNNUNNNNNCHNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEC ID NO: 6) Fórmula (lf ) : (secuencia consensuada de asa Lroncal de histona de metazoarios sin elementos contiguos troncales ) : N U N N Y-V Y-N B-D N-N G-C N-N (estructura de asa troncal) NGNBYYNNUNVNDNCN (secuencia lineal) (SEC ID NO: 7) Fórmula (Ilf): (secuencia consensuada de asa troncal de histona de metazoarios con elementos contiguos troncales ) : N U N N Y-V Y-N B-D N-N G-C N*N*NNNN-NNNN*N*N* (estructura de asa troncal) N*N*NNNNGNBYYNNUNVNDNCNNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEC ID NO: 8) Fórmula (Ig): (secuencia consensuada de asa troncal de histona de vertebrados sin elementos contiguos troncales ) : N U D H Y-A Y-B Y-R H-D G-C N-N (estructura de asa troncal) NGHYYYDNUHABRDCN (secuencia lineal) (SEC ID NO: 9) Fórmula (Ilg) : (secuencia consensuada de asa troncal de histona de vertebrados con elementos contiguos troncales) : N U D H Y-A Y-B Y-R H-D N*N*HNNN-NNNN*N*H* (estructura de asa troncal) N*N*HNNNGHYYYDNUHABRDCNNNN*N*H* (secuencia lineal) (SEC ID NO: 10) Fórmula (Ih): (secuencia consensuada de as troncal de histonas de humano (Homo sapiens) sin elemento contiguos troncales) : Y u D H U-A c-s Y-R H-R G-C D-C (estructura de asa troncal) DCH YCU DYU H ASRRCC (secuencia lineal) (SEC ID NO: 11) Fórmula (IIH) : (secuencia de la histona humana as troncal consenso (Homo sapiens) con elementos contiguo troncales ) : Y U D H U-A C-S Y-R H-R G-C N*H*AAHD-CVHB*N*H* (estructura de asa troncal) N * H * AAH DG H YCU D YU H ASRRCC VH B * N * H * (secuencia lineal) (SEC ID NO: 12) en donde cada una de las fórmulas anteriores (Ic) hasta (Ih) o (lie) hasta (Ilh) : N, C, G, A, T y U son como se definió anteriormente; cada U se puede remplazar por T; cada G o C (bastante) conservada en los elementos de tronco 1 y tronco 2 se puede reemplazar por su base complementaria de nucleótidos C o G, con la condición de que su nucleótido complementario en el tronco correspondiente se remplace por su nucleótido complementario en paralelo; y/o G, A, T, U, C, R, Y, H, K, S, W, H, B, V, D y N son bases de nucleótidos como se define en la siguiente Tabla: En este contexto, se prefiere particularmente que la secuencia de asa troncal de histona de acurdo con al menos una de las fórmulas (I) o (la) hasta (Ih) o (II) o (Ha) hasta (Ilh) de la presente invención se seleccione de una secuencia de asa troncal de histona de origen natural, en particular se prefiere en mayor medida que sea a partir de secuencias del asa troncal de histonas de protozoarios o metazoarios, e incluso más preferido particularmente a partir de vertebrados y con la máxima preferencia a partir de secuencias del asa troncal de histonas de mamífero en especial provenientes de secuencias del asa troncal de histonas humanas.
De acuerdo con una modalidad particularmente preferida del primer aspecto, la secuencia del asa troncal de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas especificas (I) o (la) hasta (Ih) o (II) o (Ha) hasta (Ilh) de la presente invención es una secuencia de asa troncal de histona que comprende en cada posición de nucleótidos el nucleótido que se presenta con mayor frecuencia, o cualquiera del nucleótido que se presenta con mayor frecuencia o el segundo con mayor frecuencia de las secuencias del asa troncal de histonas de origen natural en metazoarios y protozoarios (figura 1), protozoarios (figura 2), metazoarios (figura 3), vertebrados (figura 4) y humanos (figura 5) como se muestra en las figuras 1, 2, 3, 4, y 5. En este contexto, se prefiere particularmente que al menos el 80%, de preferencia al menos el 85%, o de mayor preferencia al menos el 90% de todos los nucleótidos correspondan al nucleótido que se presenta con mayor frecuencia de las secuencias del asa troncal de histona de origen natural.
En una modalidad particular adicional del primer aspecto, la secuencia de asa troncal de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas especificas (I) o (la) hasta (Ih) de la presente invención se selecciona de las siguientes secuencias del asa troncal de histona (sin elementos contiguos troncales) que representan las secuencias del asa troncal de histona según se generan de acuerdo con el Ejemplo 1: VGYYYYHHTHRVVRCB (SEC ID NO: 13 de acuerdo con la fórmula (Ic) ) SGYYYTTYTMARRRCS (SEC ID NO: 14 de acuerdo con la fórmula SGYYCTTTTMAGRRCS (SEC ID NO: 15 de acuerdo con la fórmula DGNNNBNNTHVNNNCH (SEC ID NO: 16 de acuerdo con la fórmula RGNNNYHBTHRDNNCY (SEC ID NO: 17 de acuerdo con la fórmula RGNDBYHYTHRDHNCY (SEC ID NO: 18 de acuerdo con la fórmula VGYYYTYHTHRVRRCB (SEC ID NO: 19 de acuerdo con la fórmula SGYYCTTYTMAGRRCS (SEC ID NO: 20 de acuerdo con la fórmula SGYYCTTTTMAGRRCS (SEC ID NO: 21 de acuerdo con la fórmula GGYYCTTYTHAGRRCC (SEC ID NO: 22 de acuerdo con la fórmula GGCYCTTYTMAGRGCC (SEC ID NO: 23 de acuerdo con la fórmula GGCTCTTTTMAGRGCC (SEC ID NO: 24 de acuerdo con la fórmula DGHYCTDYTHASRRCC (SEC ID NO: 25 de acuerdo con la fórmula (Ih) GGCYCTTTTHAGRGCC (SEC ID NO: 26 de acuerdo con la fórmula (Ih) GGCYCTTTTMAGRGCC (SEC ID NO: 27 de acuerdo con la fórmula (Ih) Además, en este contexto, siguiendo las secuencias del asa troncal de histona (con elementos contiguos troncales) según se generan de acuerdo con el Ejemplo 1 de acuerdo con una de las fórmulas especificas (II) o (Ha) hasta (Ilh) en particular se prefieren: H*H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N* (SEC ID NO: 28 de acuerdo con la fórmula (lie) ) M*H*MHMSGYYYTTYTMARRRCS CH*H*H* (SEC ID NO: 29 de acuerdo con la fórmula (lie) ) M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H* (SEC ID NO: 30 de acuerdo con la fórmula (lie) ) N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N* (SEC ID NO: 31 de acuerdo con la fórmula (He) ) N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N* (SEC ID NO: 32 de acuerdo con la fórmula (He)) N*H*HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H*H* (SEC ID NO: 33 de acuerdo con la fórmula (He)) H*H*MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N* (SEC ID NO: 34 de acuerdo con la fórmula (Ilf)) M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H*H* (SEC ID NO: 35 de acuerdo con la fórmula (Ilf)) M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H* (SEC ID NO: 36 de acuerdo con la fórmula (Ilf)) H*H*MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M* (SEC ID NO: 37 de acuerdo con la fórmula (Ilg)) H*H*AA GGCYCTTYTMAGRGCCVCH*H*M* (SEC ID NO: 38 de acuerdo con la fórmula (Ilg) ) M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY* *M* (SEC ID NO: 39 de acuerdo con la fórmula (Ilg)) N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCHBV*N*H* (SEC ID NO: 40 de acuerdo con la fórmula (Ilh)) H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M* (SEC ID NO: 41 de acuerdo con la fórmula (Ilh) ) H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H*M* (SEC ID NO: 42 de acuerdo con la fórmula (Ilh) ) De acuerdo con una modalidad preferida adicional del primer aspecto inventivo, la secuencia del ácido nucleico inventivo comprende o codifica para al menos una secuencia de asa troncal de histona que muestra al menos aproximadamente el 80%, de preferencia al menos aproximadamente 85%, de mayor preferencia al menos aproximadamente 90%, o incluso de mayor preferencia al menos aproximadamente 95%, de identidad de secuencia con los nucleótidos conservados que no están al 100% en las secuencias del asa troncal de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas especificas (I) o (la) hasta (Ih) o (II) o (Ha) hasta (Ilh) o con una secuencia de asa troncal de histona de origen natural.
En una modalidad preferida, la secuencia de asa troncal de histona no contiene la secuencia de asa 5'-UUUC-3' . Más específicamente, el asa troncal de histonas no contiene la secuencia de tronco 1 5'-GGCUCU-3' y/o la secuencia de tronco 2 5' -AGAGCC-3' , respectivamente. En otra modalidad preferida, la secuencia de asa troncal no contiene la secuencia de asa 5 ' -CCUGCCC-3 ' o la secuencia de asa 5' -UGAAU-3' . Más específicamente, el asa troncal no contiene la secuencia de tronco 1 5' -CCUGAGC-3' o no contiene la secuencia de tronco 1 5' -ACCUUUCUCCA-3' y/o la secuencia de tronco 2 5' -GCUCAGG-3' o 5 ' -UGGAGAAAGGU-3 ' , respectivamente. También, en lo posible, la invención no se limita a las secuencias del asa troncal de histonas específicamente, las secuencias del asa de preferencia no se derivan de una región 3'- no traducida del receptor de insulina de mamífero. También, de preferencia, el ácido nucleico inventivo puede no contener las señales para procesamiento de asas troncales de histona, en particular, no aquellas derivadas del gen de histonas de ratón, el gen H2A614 (H2kA614).
La secuencia de ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención opcionalmente puede comprender o codificar para una secuencia poly(A) . Cuando está presente, esta secuencia poly(A) comprende una secuencia entre aproximadamente 30 o, de mayor preferencia, entre aproximadamente 25 hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, de preferencia una secuencia entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, de mayor preferencia una secuencia entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 300 nucleótidos de adenosina, incluso de mayor preferencia una secuencia entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina, de mayor preferencia una secuencia entre aproximadamente 60 hasta aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina. En este contexto, el término "aproximadamente" se refiere a una desviación de ± 10% del valor (valores) que se alcanza. Por consiguiente, la secuencia poly(A) contiene al menos 25 o más de 25, de mayor preferencia, al menos 30, de mayor preferencia al menos 50 nucleótidos de adenosina. Por lo tanto, esta secuencia poly (A) no contiene típicamente menos de 20 nucleótidos de adenosina. De manera más particular, no contiene 10 y/o menos de 10 nucleótidos de adenosina .
De preferencia, el ácido nucleico de acuerdo de la presente invención no contiene uno o dos o al menos uno o la totalidad pero uno o la totalidad de los componentes del grupo que consiste de: una secuencia que codifica para una ribozima (de preferencia una ribozima de auto-empalme) , una secuencia de ácido nucleico viral, una señal para procesamiento del asa troncal de histona, en particular una secuencia para procesamiento del asa troncal de histona derivadas del gen H2A614 de ratón histona, un gen neo, una secuencia promotora inactivada y una secuencia intensificadora inactivada. Incluso de mayor preferencia, el ácido nucleico de acuerdo con la invención no contiene una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, y una del grupo que consiste de: un gen neo, una secuencia de promotora inactivada, una secuencia intensificadora inactivada, una señal para procesamiento del asa troncal de histona, en particular una secuencia para procesamiento del asa troncal de histona privada del gen H2A614 de histonas de ratón. Por consiguiente, el ácido nucleico puede en un modo preferido no contiene una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, ni un gen neo o, alternativamente, ni una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, ni cualquier gen de resistencia (por ejemplo, usualmente aplicado para selección) . En otro modo preferido, el ácido nucleico de la invención puede no contener una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme ni una señal para procesamiento del asa troncal de histona, en particular una secuencia para procesamiento del asa troncal de histona derivada del gen H2A614 de histonas de ratón.
Alternativamente, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico inventivo comprende opcionalmente una señal de poliadenilación que se define en el presente como una señal que transporta la poliadenilación hacia un ARNm (transcrito) mediante factores de proteínas específicas (por ejemplo, un factor de especificidad para segmentación y poliadenilación (CPSF) , un factor para estimulación de segmentación (CstF) , los factores de segmentación I y II (CF I y CF II) , la polimerasa poly(A) (PAP)) . En este contexto se prefiere una señal poliadenilacion consensuada que comprenda la secuencia de consensuada N (U/T) ANA. En un aspecto preferido particular, la señal de poliadenilacion comprende una de las siguientes secuencias: AA (U/T ) AAA o A (U/T) (U/T) AA (en donde esta presente usualmente uridina en el ARN y está presente usualmente timidina en el ADN) . En algunas modalidades, la señal de poliadenilacion utilizada en el ácido nucleico inventivo no corresponde al U3 ARNsn, U5, la señal para procesamiento de poliadenilacion proveniente del gen humano G-CSF, o las secuencias de la señal de poliadenilacion SV40. En particular, las señales de poliadenilacion anteriores no están combinadas con ningún gen de resistencia a antibióticos (o cualquier otro gen reportero, marcador o de selección) , en particular, no con el gen neo de resistencia (neomicina fosfotransferasa) <como el gen de la región codificante de acuerdo con elemento (a) del ácido nucleico inventivo. Y cualquiera de las señales de poliadenilacion anteriores (que típicamente no se presentan en el ácido nucleico inventivo) de preferencia no están combinadas con el asa troncal de histona o la señal para procesamiento del asa troncal de histona proveniente del gen de histonas de ratón H2A614 en un ácido nucleico inventivo.
La secuencia del ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención además puede codificar para una proteina o un péptido, que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo. Estos antigenos patogénicos se derivan de organismos patogénicos, en particular organismos patogénicos bacterianos, virales o protozoológicos (multicelulares), que evocan una reacción inmunológica por el sujeto, en particular, un sujeto mamífero, más particularmente un ser humano. Más específicamente, los antígenos patogénicos de preferencia son antígenos superficiales, por ejemplo, proteínas (o fragmentos de proteínas, por ejemplo, la porción exterior de un antígeno superficial) ubicada en la superficie del virus o el organismo bacteriano o protozoológico .
Los antígenos patogénicos son antígenos peptídicos o proteínicos derivados de preferencia de un patogénico asociado con una enfermedad infecciosa que de preferencia se selecciona de antígenos derivados de los patógenos, Acinetobacter baumannii, Anaplasma genus, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides , Aspergillus genus, Astroviridae , Babesia genus, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, BK virus, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis , Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia genus, Borrelia spp, Brucella genus, Brugia malayi, Bunyaviridae family, Burkholderia capacia y otras especies Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudoraallei , familia Caliciviridae, Campylobacter genus, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, CJD prion, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, coronaviruses , Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, virus de fiebre hemorrágica de Crimean-Congo, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium genus, Citomegalovirus (CMV) , virus del dengue (DEN-1, DEN-2 , DEN-3 y DEN-4), Dientamoeba fragilis, Ebolavirus (EBOV) , Echinococcus genus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia genus, Entamoeba histolytica, Enterococcus genus, Enterovirus genus, Enteroviruses, principalmente un virus Coxsackie A y Enterovirus 71 (EV71) , Epidermophyton spp, Epstein-Barr Virus (EBV) , Escherichia coli 0157:H7, 0111 y O104:H4, Fasciola hepática y Fasciola gigantica, FFI prion, Filarioidea superfamily, Flaviviruses , Francisella tularensis, Fusobacterium genus, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, GSS prion, Guanarito virus, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Henipavirus (Hendra virus Nipah virus) , virus de Hepatitis A, virus de Hepatitis B (HBV) , virus de Hepatitis C (HCV) , virus de Hepatitis D, virus de Hepatitis E, virus de Herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), Histoplasma capsulatum, VIH (virus de inmunodeficiencia humana) , Hortaea werneckii, Human bocavirus (HBoV) , virus de herpes humana 6 (HHV-6) y virus de herpes humana 7 (HHV-7), Human metapneumovirus (hMPV) , virus de papiloma humana (HPV) , virus de parainfluenza humana (HPIV) , virus encefalitis japonesa, virus JC, virus Junin, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis , Kuru prion, virus Lassa, Legionella pneumophila, Leishmania genus, Leptospira genus, Listeria monocytogenes, virus Lymphocytic choriomeningitis (LC V) , virus Machupo, alassezia spp, virus arburg, virus Measles, Metagonimus yokaga ai, Microsporidia phylum, virus Molluscum contagiosum (MCV) , virus Mumps, Mycobacterium leprae y Mycobacterium lepromatosis , tuberculosis Mycobacterium, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis , Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, Orthomyxoviridae family (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis , Paragonimus spp, Paragonimus westermani, Parvovirus B19, Pasteurella genus, Plasmodium genus, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, virus de la rabia, virus sincitial respiratorio (RSV) , Rhinovirus, rhinoviruses , Rickettsia akari, Rickettsia genus, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, Rift Valley fever virus, Rotavirus, Rubella virus, Sabia virus, Salmonella genus, Sarcoptes scabiei, SARS coronavirus, Schistosoma genus, Shigella genus, Sin Nombre virus, Hantavirus, Sporothrix schenckii, Staphylococcus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Taenia genus, Taenia solium, virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV) , Toxocara canis or Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, virus de varicela zoster (VZV) , virus de varicela zoster (VZV) , Viruela elevada o viruela mínima, vCJD prion, virus de encefalitis equina Venezolana, Vibrio cholerae, virus de Nilo Occidental, virus de encefalitis equina Occidental, Wuchereria bancrofti, virus de fiebre amarilla, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, y Yersinia pseudotuberculosis.
En este contexto en particular se prefieren los antígenos provenientes de los patógenos seleccionados del virus de influenza, el virus sincitial respiratorio (RSV) , Virus de herpes simplex (HSV) , virus de papiloma humano (HPV) , Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, Cytomegalovirus (CMV) , virus de Hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y el Virus de fiebre amarilla.
Además, el antigeno patogénico (antigeno derivado de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa) de preferencia se puede seleccionar de los siguientes antigenos: la proteina de membrana externa OmpA, la biopelicula asociada con la proteina Bap, la proteina de transporte Muck (infecciones por Acinetobacter baumannii, Acinetobacter) ) ; la glucoproteina VSG superficial variable, la proteínas MAPP15 microtubular asociada, trans-sialidasa TSA (Trypanosoma brucei, enfermedad del sueño africano (African trypanosomiasis ) ) ; Antígeno p24 del VIH, las proteínas con envoltura del VIH (gpl20, gp41, gpl60), la poliproteína GAG, la proteína del factor negativo Nef, el trans-activador Tat de transcripción (virus de la inmunodeficiencia humana VIH) , SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) ) ; la proteína de adherencia de galactosa-inhibitable GIAP, antígeno Eh29 de 29 kDa, lectina Gal/GalNAc, proteína CRT, antígeno inmunodominante de 125 kDa, proteína M17, adhesina ADH112, proteína STIRP (Entamoeba histolytica, Amoebiasis) ; proteínas superficiales mayores 1-5 (MSPla, MSPlb, MSP2, MSP3 , MSP4, MSP5) , las proteínas del sistema de secreción tipo IV (VirB2, VirB7, VirBll, VirD4) (Anaplasma genus, anaplasmosis) ; antígeno protector ??, factor de edema EF, factor letal LF, proteínas de homología con capa S SLH (Bacillus anthracis, ántrax) ; acranolisina, fosfolipasa D, proteína de unión a colágeno CbpA (infección por Arcanobacterium haemolyticum, Arcanobacterium haemolyticum) ; proteína nucleocápside P, precursor de glucoproteína GPC, glucoproteína GPl, glucoproteína GP2 (virus Junin, fiebre hemorrágica argentina) ; proteínas con capa de proteína-quitina, antígeno superficial de 14 kDa A14, proteína principal de esperma MSP, proteína organizadora de polimerización MSP MPOP, proteína de fibra MSP 2 MFP2, quinasa para activación de polimerización MSP MPAK, proteína similar a ABA-1 ALB, proteína ABA-1 , cuticulina CUT-1 (Ascaris lumbricoides , ascariasis); alérgeno de 41 kDa Asp vl3, alérgeno Asp f3, la proteína de barra cilindrica A de superficie conideal principal, proteasa peplp, proteína anclada a GPI Gellp, proteína anclada a GPI Crflp (Aspergillus genus, Aspergillosis ) ; proteína de la familia VP26, proteína VP29 (infección por Astroviridae, Astrovirus) ; proteína roptri-asociada 1 PAR-1, los antígenos superficiales del merozoitos MSA-1, MSA-2 (al, a2, b, c) , 12D3, 11C5, 21B4, P29, antígeno superficial de eritrocitos variantes VESA1, antígeno de membrana apical 1 AMA-1 (género Babesia, babesiosis ) ; hemolisina, enterotoxina C, pX01-51, glicolato oxidasa, transportador ABC, proteina de unión a penicilina, preoteina de la familia transportadora de zinc, pseudouridina sintasa Rsu, proteina para replicación de plásmidos RepX, oligoendopeptidasa F, proteina de membrana profgo, proteina HemK, antigeno flagelar H, antigeno de superficie celular 28.5-kDa (infección por Bacillus cereus, Bacillus cereus) ; antigeno T largo LT, antigeno T pequeño, proteina con cápside protein VPl, proteina cápside VP2 (virus BK, infección por el virus BK) ; proteina de 29 kDa, antigenos similares a caspasa-3, las glucoproteinas (infección por Blastocystis hominis, Blastocystis hominis) ; adhesina con superficie de levadura WI-1 (Blastomyces dermatitidis , Blastomycosis ) ; nucleoproteina N, polimerasa L, proteina matriz Z, glucoproteina GP (Machupo virus, fiebre hemorrágica Boliviana) ; proteina de superficie externa A OspA, proteina de superficie externa OspB, proteina de superficie externa OspC, proteina de unión a decorina A DbpA, proteina de unión a decorina B DbpB, proteina Fia con núcleo de 41 kDa de filamentos flagelares, proteina de membrana básica A precursora BmpA (Antigeno inmunodominante P39) , precursor de lipoproteina 22 kDa de superficie externa (antigeno IPLA7) , lipoproteina vlsE de superficie variable (infección por Borrelia genus, Borrelia) ; Botulinum neurotoxins BoNT/Al, BONT/A2, ????/?3, ????/?, BoNT/C, BoNT/D, ????/?, BoNT/F, BoNT/G, toxina botulinum recombinante F dominio He FHc (Clostridium botulinum, Botulism (y botulismo infantil) ) ; nucleocápside, precursor de glucoproteinas (virus Sabia, fiebre hemorrágica Brasileña) ; superóxido dismutasa de cobre/Zinc SodC, bacterioferritina Bfr, proteina robosómica 50S RplL, proteina que contiene un dominio transmembrana similar a OmpA 0mp31, proteina M5 P39 de 39-kDa inmunogénica, proteina de unión a zinc znuA periplásmica trasportadora de ABC y zinc, proteina immunogénica periplásmica Bp26, proteina ribosómica 30S S12 RpsL, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa Gap, precursor de la proteina inmunogénica de membrana exterior de 25 kDa Omp25, proteina B de invasión lalB, factor desencadenador Tig, chaperona molecular DnaK, peptidil-prolil cis-transisomerasa putativa SurA, lipoproteina 0mpl9, proteina de membrana externa MotY Ompl6, proteina de membrana externa conservada D15, malato deshidrogenasa Mdh, componente del sistema de secreción Tipo IV (T4SS) VirJ, lipoproteina de función desconocida BAB1_0187 (Brucella genus, Brucellosis) ; miembros de la familia de transportadores ABC (LolC, OppA, y PotF) , proteina transmembrana del sistema para liberación de lipoproteina putativa LolC/E, flagelina FliC, motilidad intracelular Burkholderia A BimA, factor de alargamiento bacteriano-Tu EF- Tu, proteina similar a OmpA de 17 kDa, proteina codificante boaA, proteina codificante boaB (Burkholderia cepacia y otras especies de Burkholderia, infección por Burkholderia) ; micolil-transferasa Ag85A, proteina de choque térmico Hsp65, proteina TB10.4, antigeno de 19 kDa, proteina PstS3, proteina de choque térmico Hsp70 (Mycobacterium ulcerans, Buruli ulcer) ; proteínas cápside virales VP1 y VP2 mayores y menores de norovirus, poliproteína genómica, proteína con cápside de Sapoviurus VP1, proteína Vp3, poliproteína grenómica (familia de Caliciviridae, infección por Calicivirus (Norovirus y Sapovirus) ) ; proteína de membrana externa principal PorA, flagelina FlaA, antígeno superficial CjaA, proteína de unión a fibronectina CadF, proteína transportadora de ABC PeblA de unión a aspartato/glutamato, proteína FspAl, proteína FspA2 (Campylobacter genus, Campylobacteriosis ) ; enzima glucolítica enolasa, proteinasas aspartilo secretadas SAP1-10, proteína de pared celular enlazada a glucofosfatidilinositol (GPI) , proteína Hyrl, proteína relacionada con el receptor 3 complementario CR3-RP, adhesina Als3p, proteína de choque térmico hsp90 de 90 kDa, proteína de hidrofobicidad de superficie celular CSH (por lo general Candida albicans y otras especies de Candida, Candidiasis) ; antígeno de 17-kDa, proteína P26, adhesinas autotransportadoras triméricas ???, adhesina A de Bartonella BadA, proteínas Vomps de membrana externa expresada variablemente, proteína Pap3, proteina HbpA, protease HtrA envoltura-asociada, proteína OMP89, proteína GroEL, proteína LalB, proteína OMP43, dihirolipoamida suciniltransferasa SucB (Bartonella henselae, enfermedad de araña-gato) ; proteína-2 con superficie amastigote, proteína SSP4 con superficie amastigote-específica, cruzipaina, trans-sialidasa TS, glucoproteína de superficie tripomastigote TSA-1, proteína reguladora complementaria CRP-10, proteína G4, proteína G2, proteína de bastón paraxonemal PAR2, componente4 de bastón paraflagelar Parí, Proteínas superficiales mucina-asociadas MPSP (Trypanosoma cruzi, enfermedad de Chagas (American trypanosomiasis ) ) ; glucoproteínas con envoltura (gB, gC, gE, gH, gl, gK, gL) (virus de varicela zoster (VZV) , Chickenpox) ; proteína de membrana externa principal MOMP, proteína de membrana externa probable PMPC, proteína compleja de membrana externa B OmcB, proteínas de choque térmico Hsp60 HSP10, proteína IncA, proteínas provenientes del sistema de secreción tipo III, proteína de cadena pequeña de reductasa y ribonucleótido NrdB, proteína plasmídica Pgp3, proteína externa declamida N CopN, antígeno CT521, antígeno CT425, antígeno CT043, antígeno TC0052, antígeno TC0189, antígeno TC0582, antígeno TC0660, antígeno TC0726, antígeno TC0816, antígeno TC0828 (Chlamydia trachomatis, Chlamydia) ; proteína de respuesta a calcio bajo E LCrE, proteina externa de clamidia N CopN, proteína quinasa de serina/treonina PknD, proteina portadora de acilo-S-maloniltransferasa FabD, proteina de unión a ADN de cadena individual de Ssb, proteína de membrana externa principal OMP, proteína de membrana externa 2 0mp2, familia de proteínas de membrana polimórfica (Pmpl, Pmp2, Pmp3, Pmp4, Pmp5, Pmp6, Pmp7 , Pmp8, Pmp9, PmplO, Pmpll, Pmpl2, Pmpl3, Pmpl4, Pmpl5, Pmpl6, Pmpl7, Pmpl8, Pmpl9, Pmp20, Pmp21) (infección por Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae) ; toxina B del cólera CTB, pilin corregulado de toxina A TcpA, pilin corregulado de toxina TcpF, proteína para biosíntesis de pilus co-regulado de toxina F TcpF, subunidad A de enterotoxina del cólera, la subunidad B de enterotoxina del cólera, enterotoxina ST estable al calor, hemaglutinina sensible de mañosa MSHA, proteína de membrana externa U Porin ompU, proteína Poring B, proteína de membrana polimórfica D (Vibrio cholerae, Cholera) ; propionil-CoA carboxilasa PCC, proteína 14-3-3, prohibitina, proteasa de cisteina, transferasas de glutatión, gelsolina, cathepsina L proteinasa CatL, proteína Tegumental 20.8 kDa TP20.8, proteína tegumental 31.8 kDa TP31.8, fosfatasa de ácido lisofosfatídico LPAP, (Clonorchis sinensis, Clonorchiasis ) ; proteínas de capa superficial SLP, antígeno de glutamato deshidrogenasa GDH, toxina A, toxina B, cisteina proteasa Cwp84, cisteína proteasa Cwpl3, cisteina proteasa Cwpl9, proteína de pared celular CwpV, proteína flagelar FliC, proteína flagelar FliD (infección por Clostridium difficile, Clostridium difficile) ; rinovirus: proteínas cápside VP1, VP2, VP3, VP4; coronavirus: proteínas sprike S, proteínas con envoltura E, proteínas de membrana M, proteínas nucleocápside N (por lo general rinovirus y coronavirus, resfriado común (rinofaringitis viral aguda; Acute coryza) ) ; proteína prion Prp (prion CJD, enfermedad de Creut zfeldt-Jakob (CJD) ) ; proteína con envoltura Ge, proteína con envoltura Gn, proteínas nucleocápside (virus de fiebre hemorrágica Crimean-Congo, fiebre hemorrágica Crimean-Congo (CCHF) ) ; helicase con ARN de cuadro DEAD virulencia-asociado VAD1, proteína de galactoxilomanano GalXM, glucuronoxilomanano GXM, manoproteína MP (Cryptococcus neoformans, Cryptococcosis) ; proteína ribosómica ácida P2 CpP2, antígenos de mucina Mucl, Muc2, Muc3 Muc4, Muc5, Muc6, Muc7, proteína de adherencia superficial CP20, proteína de adherencia superficial CP23, proteína superficial CP12, proteína superficial CP21, proteína superficial CP40, proteína superficial CP60, proteína superficial CP15, glucopéptidos superficie-asociados gp40, glucopéptidos superficie-asociados gpl5, proteína de pared de oocitos AB, profilina PRF, apirasa (Cryptosporidium genus, Cryptosporidiosis ) ; proteína-1 de unión a ácido graso y retinol FAR-1, inhibidor de tejidos de metaloproteinasa TIMP (TMP) , cisterna proteinasa ACEY-1, cisteína proteinasa ACCP-1, antígeno superficial Ac-16, proteína 2 secretada ASP-2, metaloproteasa 1 MTP-1, inhibidor de aspartilproteasa API-1, antígeno superficie-asociado SAA-1, factor secretado adulto-específico Xa anticoagulante del inhibidor de proteasa de serina AP, proteasa aspártica similar a catepsina D ARR-1 (usualmente Ancylostoma braziliense; otros múltiples parásitos, Cutaneous larva migrans (CLM) ) ; proteasas similares a catepsina L, antígeno 53/25-kDa, miembros de la familia de 8kDa, proteína del cisticercos con una actividad similar a tripsina marginal TsAg5, proteína oncosfere TS0L18, proteína oncosfere TSOL45-1A, lactato deshidrogenasa A LDHA, lactato deshidrogenasa B LDHB (Taenia solium, Cysticercosis ) ; antígeno ??ß5, proteína de membrana ppl5, proteína tegumental cápside-proximal ppl50, proteína M45, ADN polimerasa UL54, helicasa UL105, glucoproteína gM, glucoproteína gN, glucoproteína H, glucoproteína B gB, proteína UL83, proteína UL94, proteína UL99 (Citomegalovirus (CMV) , infección por Citomegalovirus ) ; proteína cápside C, proteína premembrana prM, proteína membrana M, proteína con envoltura E (dominio I, dominio II, dominio II), proteína NS1, proteína NS2A, proteína NS2B, proteína NS3, proteína NS4A, proteína 2K, proteína NS4B, proteina NS5 (Virus del dengue (DEN-1, DEN-2 , DEN-3 y DEN-4 ) -Flavivirus , fiebre de Dengue); proteína de 39kDa (Dientamoeba fragilis, Dientamoebiasis ) ; precursor de la toxina de difteria Tox, toxina de difteria DT, sortasa pilin-específica SrtA, proteína pilin de eje SpaA, proteína pilin punta SpaC, proteína pilin menor SpaB, proteína superficie-asociado DIP1281 (Corynebacterium diphtheriae, Diphtheria) ; glucoproteína GP, nucleoproteína NP, proteína matriz menor VP24, proteína matriz mayor VP40, activador de transcripción VP30, cofactor de polimerasa VP35, polimerasa L de ARN (Ebolavirus (EBOV) , fiebre hemorrágica de Ebola) ; proteína prion (prion vCJD, enfermedad variante de Creutzfeldt-Jakob (vCJD, nvCJD) ) ; proteína del sistema UvrABC B, proteína Flpl, proteína Flp2, proteína Flp3, proteína TadA, receptor de hemoglobina HgbA, proteína de membrana externa TdhA, proteína CpsRA, regulator CpxR, proteína SapA, antígeno de 18 kDa, proteína de membrana externa NcaA, proteína LspA, proteína LspAl, proteína LspA2, proteína LspB, componente de membrana externa DsrA, lectina DltA, lipoproteína Hlp, proteína de membrana externa principal OMP, proteína de membrana externa OmpA2 (Haemophilus ducreyi, Chancroid) ; aspartilproteasa 1 Pepl, fosfolipasa B PLB, alfa-manosidasa 1 AMN1, glucanosiltransferasa GEL1, ureasa URE, proteína de matriz peroxisomal Pmpl, antígeno rico en prolina Pra, proLeína reactiva de linfocitos T humanos TcrP (Coccidioides immitis y Coccidioides posadasii, Coccidioidomycosis) ; alérgeno Tri r2, proteina de choque térmico 60 Hsp60, actina fungal Act, antigeno Tri r2, antigeno Tri r4, antigeno Tri ti, proteina IV, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa Gpdl, osmodetector HwSholA, osmodetector HwSholB, histidina quinasa HwHhk7B, alérgeno Mala s 1, alérgeno Mala s 11, tioredoxina Trx Mala s 13, alérgeno Mala f, alérgeno Mala s (usualmente Trichophyton spp, Epidermophyton spp., Malassezia spp., Hortaea werneckii, Dermatophytosis ) ; proteina EG95, proteina EG10, proteina EG18, proteina EgA31, proteina EM18, antigeno EPCl, antigeno B, antigeno 5, proteina P29, proteina 14-3-3, 8-kDa proteina, miofilina, proteina de choque térmico 20 HSP20, glucoproteina GP-89, ácido graso proteina de unión FAPB (Echinococcus genus, Echinococcosis) ; proteina 2 de superficial principal MSP2, proteina 4 de superficie principal MSP4, variante MSP SGV1, variante MSP SGV2, proteina de membrana externa OMP, proteina de membrana externa 19 OMP-19, proteina antigénica principal MAPI, proteina antigénica principal MAP1-2, proteina antigénica principal MAP1B, proteina antigénica principal MAP1-3, proteina codificante de Erum2510, proteina GroEL, proteina GroES, proteínas de membrana externa principal de 30-kDA, proteína GE de 100-kDa, proteína GE de 130-kDa, proteina GE de 160-kDa (Ehrlichia genus, Ehrlichiosis ) ; antigeno secretado SagA, proteínas similares a sagA, SalA y SalB, colágeno adhesina Scm, proteínas superficiales Fmsl (EbpA(fm), Fms5 (EbpB(fm), Fms9 (EpbC(fm) y FmslO, proteína EbpC(fm), glucoproteína inmunoprotectora Gl de 96 kDa (Enterococcus genus, infección por Enterococcus) ; poliproteína de genoma, polimerasa 3D, proteína con cápside viral VP1, proteína con cápside viral VP2, proteína con cápside viral VP3, proteína con cápside viral VP4, proteasa 2A, proteasa 3C (Enterovirus genus, infección por Enterovirus ) ; proteínas de membrana externa OM, proteína de membrana externa de 60 kDa, antígeno de superficie celular OmpA, antígeno de superficie celular OmpB (sca5), proteína de membrana externa de 134 kDa, proteína de membrana externa de 31 kDa, proteína de membrana externa de 29.5 kDa, proteína de superficie celular SCA4, proteína de superficie celular Adrl (RP827), proteína de superficie celular Adr2 (RP828), proteína de superficie celular SCA1, proteína de invasión invA, proteína de división celular fts, proteínas de secreción sec Ofamily, proteínas de virulencia virB, tlyA, tlyC, proteína similar a parvulina Plp, translocasa preproteínica SecA, antígeno de proteína superficial SPA de 120-kDa, antígeno complejo de 138 kD, proteína principal de 100-kD (proteína I) , proteína intracitoplásmica D, antígeno de la proteína superficial protectora SPA (Rickettsia prowazekii, tifus Epidémico) ; antígenos nucleares Epstein-Barr (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-proteína líder (EBNA-LP) ) , proteínas de membrana latente (LMP-1, LMP-2A, LMP-2B) , anteriormente el antígeno EBV-EA, antígeno de membrana EBV-MA, antígeno cápside viral EBV-VCA, nucleasa alcalina EBV-AN, glucoproteína H, glucoproteína gp350, glucoproteína gpllO, glucoproteína gp42, glucoproteína gHgL, glucoproteína gB (virus Epstein-Barr (EBV) , Mononucleosis infecciosa del virus Epstein-Barr) ; proteína con cápside VP2, proteína con cápside VPl, proteína principal NS1 (Parvovírus B19, Erythema infectiosum (quinta enfermedad) ) ; antígeno pp65, glucoproteína 105, proteína con cápside principal, glucoproteína con envoltura H, proteína U51 (herpesvirus humano 6 (HHV-6) y herpesvirus humano 7 (HHV-7), Exanthem subitum) ; tioredoxin-glutatión reductasa TGR, catepsinsa Ll y L2, proteína tipo Kunitz KTM, leucina aminopeptidasa LAP, cisterna proteinasa Fas2, proteína-2 similar a saposin SAP-2, tioredoxinperoxidasa TPx, Prx-1, Prx-2, cisteína proteinasa de catepsina 1 CL3, proteasa de catepsina L CL1, fosfoglicerato quinasa PGK, proteína secretora de 27-kDa, proteína de 60 kDa HSP35alpha, glutatión transferasa GST, antígeno tegumental de 28.5 kDa 28.5 kDa TA, proteasa de catepsina B3 CatB3, cistatin stefin-1 Tipo I , catepsina L5, catepsina Llg y catepsina B, proteina de unión con ácido graso FABP, leucina aminopeptidasas LAP (Fasciola hepática y Fasciola gigantica, Fasciolosis ) ; proteina prion (prion FFI, insomnio familiar fatal (FFI)); proteina similar al homólogo alérgeno de veneno VAL-1, transcripción larval abundante ALT-1, transcripción larval abundante ALT-2, tioredoxin peroxidasa PX, homologue alérgeno de avispa VAH, thiordoxina peroxidasa 2 TPX-2, proteina antigénica SXP (péptidos N, NI, N2, y N3) , proteina-1 asociada con la activación ASP-1, Tioredoxina TRX, transglutaminasa BmTGA, glutatión-S-transferasas GST, miosina, homólogo del alérgeno de avispa VAH, colagenasa de 175 kDa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa GAPDH, colágeno cuticular Col-4, proteínas ácidas larvales secretadas SLAP, quitinasa CHI-1, proteína de unión a maltosa BP, enzima glucolítica fructuosa-1 , 6-bisfosfato aldolasa Fba, tropomiosina TMY-1, producto génico nematodo específico OvB20, oncocistatina CPI-2, Cox-2 ( superfamilia de Filarioidea, Filariasis); fosfolipasa C PLC, enterotoxina termo-lábil B, componente de la toxina Iota Ib, proteína CPE1281, piruvato ferredoxinoxidoreductasa, factor de alargamiento G EF-G, perfringolisina 0 Pfo, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa GapC, Fructosa-bisfosfato aldolasa Alf2, enterotoxina de clostridium perfringens CPE, toxina alfa AT, toxoide alfa ATd, toxoide epsilón ETd, proteina HP, citotoxina larga TpeL, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa Naglu, fosfogluceromutasa Pgm (Clostridium perfringens, envenenamiento de alimentos por Clostridium perfringens) ; leucotoxina lktA, adhesión FadA, proteina de membrana externa RadD, proteina de unión a arginina de alto molecular (género Fusobacterium, infección por Fusobacterium) ; fosfolipasa C PLC, enterotoxina termo-lábil B, componente de toxina Iota Ib, proteina CPE1281, piruvato ferredoxinoxidoreductasa, factor de alargamiento G EF-G, perfringolisina O Pfo, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa GapC, fructosa-bisfosfato aldolasa Alf2, enterotoxina clostridium perfringens CPE, toxina alfa AT, toxoide alfa ATd, toxoide epsilón ETd, proteina HP, citotoxina larga TpeL, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa Naglu, fosfogliceromutasa Pgm (usualmente Clostridium perfringens; otra especie de Clostridium, Gas gangrene (Clostridial myonecrosis)'); lipasa A, lipasa B, peroxidasa Decl (Geotrichum candidum, Geotrichosis ) ; proteina prion (prion GSS, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) ) ; proteina de pares quistica CWP1, CWP2, CWP3, proteina superficial variante VSP, VSP1, VSP2 , VSP3, VSP4, VSP5, VSP6, antigeno de 56 kDa, piruvato ferredoxinoxidoreductasa PFOR, alcohol deshidrogenasa E ADHE, alfa-giardin, alfa-8-giardin, alfa-1- guiardin, beta-giardin, cisteína proteasas, glutatión-S-transferasa GST, arginina deiminasa ADI, fructosa-1, 6-bisfosfato aldolasa FBA, antígenos de Giardia trophozoite GTA (GTAl, GTA2), ornitincarboxiltransferasa OCT, proteina similar a asseblin de fibra estriada SALP, proteina similar a uridinfosforilo UPL, alfa-tubulina, beta-tubulina (Giardia intestinalis , Giardiasis ) ; miembros de la familia de transportadores de ABC (LolC, OppA, y PotF) , proteina transmembrana del sistema para liberación de lipoproteinas putativas LolC/E, flagelina FliC, motilidad intracelular de Burkholderia A BimA, factor de alargamiento bacteriano-Tu EF-Tu, proteína similar a OmpA de 17 kDa, proteina codificante boaA (Burkholderia mallei, Glanders) ; ciclofilina CyP, proteína de larva en tercera etapa de 24 kDa GS24, productos de excreción-secreción ESPs (40, 80, 120 y 208 kDa) (Gnathostoma spinigerum y Gnathostoma hispidum, Gnathostomiasis ) ; proteínas pilin, subunidad pilin asociada menor pilC, subunidad pilin mayor y variantes pilE, pilS, proteína de variación de fase porA, Porin B PorB, proteína TraD, antígeno de membrana externa Neisserial H.8, antígeno de 70kDa, proteína de membrana externa principal PI, proteínas de membrana externa PIA y PIB, antígeno W, proteína superficial A NspA, proteína de unión a transferrina TbpA, proteína de unión a transferrina TbpB, PBP2, proteína codificante mtrR, proteina codificante ponA, permeasa de membrana FbpBC, sistema de proteina FbpABC, proteínas LbpAB, proteina de membrana externa Opa, transportador de membrana externa FetA, regulador de hierro represado (Neisseria gonorrhoeae, Gonorrhea) ; proteina de membrana externa A OmpA, proteina de membrana externa C OmpC, proteina de membrana externa K17 0mpK17 (Klebsiella granulomatis , Granuloma inguinale (Donovanosis) ) ; proteína de unión a fibronectina Sfb, proteína de unión fibronectina/fibrinógeno FBP54, proteína de unión a fibronectina FbaA, proteína M tipo 1 Emml, proteína tM ipo 6 Emm6, proteína de unión a immunoglobulin 35 Sib35, Proteína superficial R28 Spr28, superóxido dismutasa SOD, peptidasa C5a ScpA, antígeno I/II Agl/II, adhesina AspA, proteína de unión a macroglobulina alfa2 de G-GRAB relacionada, proteína fibrilar superficial M5 (infección por Streptococcus pyogenes, Grupo A streptococcal ) ; antígeno ß de proteína C, proteínas de arginina desiminasa, adhesina BibA, proteína de 105 kDA BPS, antígenos superficiales c, antígenos superficiales R, antígenos superficiales X, proteína resistente a tripsina Rl, proteína resistente a tripsina R3, proteína resistente a tripsina R4, proteína inmunogénica superficial Sip, proteína superficial Rib, proteína de repeticiones ricas en Leucina LrrG, proteína de repetición rica en serina Srr-2, antígeno alfa de proteína C Bca, antígeno Beta Bag, antígeno superficial Epsilon, proteína similar a alfa ALP1, proteína similar a alfa ALP5 antígeno delta superficial, proteína similar a alfa ALP2, proteína similar a alfa ALP3, proteína similar a alfa ALP4, proteína Cbeta Bac ( Streptococcus agalactiae, infección por estreptococos Grupo B) ; proteína de unión a transferrina 2 Tbp2, fosfatasa P4, proteína de membrana externa P6, lipoproteína Pal peptidoglicano-asociada, proteína D, proteína E, proteína de adherencia y penetración Hap, proteína de membrana externa 26 Omp26, proteína de membrana externa P5 (Fimbrin), proteína de membrana externa D15, proteína de membrana externa 0mpP2, 5'-nucleotidasa NucA, proteína de membrana externa Pl, proteína de membrana externa P2 , lipoproteína de membrana externa Pcp, Lipoproteína E, proteína de membrana externa P4, fuculoquinasa FucK, [Cu, Zn] -superóxido dismutasa SodC, proteasa HtrA, proteína 0145, alfa-galactosilceramida (Haemofilus influenzae, infección por Haemofilus influenzae) ; polimerasa 3D, proteína con cápside viral VP1, proteína con cápside viral VP2, proteína con cápside viral VP3, proteína con cápside viral VP4, proteasa 2A, proteasa 3C (Enteroviruses, principalmente virus de Coxsackie A y Enterovirus 71 (EV71) , enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) ) ; ARN polimerasa L, proteína L, glucoproteína Gn, glucoproteina Ge, nucleoproteina con cápside S, glucoproteina con envoltura Gl, nucleoproteina NP, proteina N, poliproteina M (virus sin nombre, Hantavirus, síndrome pulmonar por hantavirus (HPS) ) ; proteína de choque térmico HspA, proteína de choque térmico HspB, citrato sintasa GltA, proteína UreB, proteína de choque térmico Hsp60, proteína activadora de neutrófilos NAP, catalasa KatA, citotoxina vacuolante VacA, ureasa alfa UreA, ureasa beta Ureb, proteína CpnlO, proteína groES, proteína de choque térmico HsplO, proteína MopB, proteína de citotoxicidad asociada de 10 kDa CAG, antígeno de 36 kDa, beta-lactamasa HcpA, Beta-lactamasa HcpB (Helicobacter pylori, infección por Helicobacter pylori) ; proteínas de membrana integral, proteínas propensas a agregación, O-antígeno, antígenos toxínico Stx2B, antígeno toxínico StxlB, fragmento de antígeno de adhesión Int28, proteína EspA, proteína EspB, Intimina, proteína Tir, proteína IntC300, proteína Eae (Escherichia coli 0157 :H7, 0111 y O104:H4, síndrome hemolítico-urémico (HUS) ) ; ARN polimerasa L, proteína L, glucoproteina Gn, glucoproteina Ge, nucleoproteina con cápside S, glucoproteina con envoltura Gl, nucleoproteina NP, proteína N, poliproteina (familia Bunyaviridae, Fiebre femorrágica con síndrome renal (HFRS) ) ; glucoproteina G, proteína matriz M, nucleoproteina N, proteína de fusión F, polimerasa L, proteína W, proteína C, fosfoproteina P, proteina no estructural V (virus Henipavirus (Hendra virus Nipah) , infecciones Henipavirus) ; poliproteina, glucoproteina Gp2, antigeno superficial de hepatitis A HBAg, proteína 2A, proteína viral VP1, proteína viral VP2, proteína viral VP3, proteína viral VP4, proteína P1B, proteína P2A, proteína P3AB, proteína P3D (Virus de Hepatitis A, Hepatitis A) ; antígeno superficial hepatitis B HBsAg, antígeno núcleo de Hepatitis B HbcAg, polimerasa, proteína Hbx, proteína superficial media preS2, proteína superficial L, proteína larga S, proteína viral VP1, proteína viral VP2, proteína viral VP3, proteína viral VP4 (Virus de Hepatitis B (HBV) , Hepatitis B) ; glucoproteina de envoltura El gp32 gp35 , glucoproteina con envoltura E2 NS1 gp68 gp70, proteína con cápside C , proteína núcleo Core, poliproteina, proteína viral VP1, proteína viral VP2, proteína viral VP3, proteína viral VP4, antígeno G, proteína NS3, proteína NS5A, (Virus de Hepatitis C, Hepatitis C) ; proteína viral VP1, proteína viral VP2, proteína viral VP3, proteína viral VP4, antígeno delta largo de hepaptitis, antígeno delta pequeño de hepaptitis (virus de Hepatitis D, Hepatitis D) ; proteína viral VP1, proteína viral VP2, proteína viral VP3, proteína viral VP4, proteína con cápside E2 (virus de Hepatitis E, Hepatitis E) ; glucoproteina L UL1, uracil-ADN glucosilasa UL2, proteína UL3, proteína UL4, proteína ADN de replicación UL5, proteína portal UL6, proteína para maduración de viriones UL7, ADN helicasa UL8, proteína de unión al origen de replicación UL9, glucoproteína M UL10, proteína UL11, exonucleasa alcalina UL12, proteína quinasa de serina-treonina UL13, proteína tegumentaria UL14, terminasa UL15, proteína tegumentaria UL16, proteína UL17, proteína con cápside VP23 UL18, proteína con cápside principal VP5 UL19, proteína con membrana UL20, proteína tegumentaria UL21, Glucoproteína H (UL22), Timidina quinasa UL23, proteína UL24, proteína UL25, proteína con cápside P40 (UL26, VP24, VP22A) , glucoproteína B (UL27) , proteína ICP18.5 (UL28), proteína principal de unión a ADN ICP8 (UL29) , ADN polimerasa UL30, proteína de matriz nuclear UL31, glucoproteína con envoltura UL32, proteína UL33, proteína con membrana nuclear interna UL34, proteína con cápside VP26 (UL35) , proteína tegumentaria larga UL36, proteína de ensamble cápside UL37, proteína VP19C (UL38), ribonucleótido reductasa (subunidad Largo) UL39, ribonucleótido reductasa (subunidad pequeña) UL40, proteína tegumentaria/proteína VHS para interrupción en el hospedero de viriones (UL41), factor de procesamiento de ADN polimerasa UL42, proteína con membrana UL43, glucoproteína C (UL44), proteína con membrana UL45, proteína tegumentarias VP11/12 (UL46) , proteína tegumentaria VP13/14 (UL47), proteína para maduración de viriones VP16 (UL48, Alfa-TIF) , proteína con envoltura UL49, dUTP difosfatasa UL50, proteína tegumentaria UL51, proteína compleja de ADN helicasa/primasa UL52, glucoproteína K (UL53) , proteína para regulación transcripcional IE63 (ICP27, UL54), proteína UL55, proteína UL56, proteína de replicación viral ICP22 (IE68, US1) , proteína US2, proteína quinasa de serina/treonina US3, glucoproteína G (US4), glucoproteína J (US5) , glucoproteína D (US6) , glucoproteína I (US7), glucoproteína E (US8), proteina tegumentaria US9, proteína con cápside/tegumentaria US10, proteína Vmw21 (US11), proteína ICP47 (IE12, US12), activador transcriptional principal ICP4 (IE175, RS1) , E3 ubiquitina ligasa ICPO (IE110) , proteina 1 latencia-relacionada LRP1, proteína 2 latencia-relacionada LRP2, factor de neurovirulencia RLl (ICP34.5), transcripción LAT latencia-asociada (Virus de herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) , Herpes simplex); proteina de choque térmico Hsp60, proteina de superficie celular H1C, dipeptidilpeptidasa tipo IV DppIV, antígeno M, proteína de 70 kDa, proteína similar a histona de 17 kDa (Histoplasma capsulatum, Histoplasmosis ) ; proteina-1 de unión a ácido graso y retinol FAR-1, inhibidor de tejidos de metaloproteinasa TIMP (TMP) , cisterna proteinasa ACEY-1, cisterna proteinasa ACCP-1, antígeno superficial Ac-16, proteína secretada 2 ASP-2, metaloproteasa 1 MTP-1, inhibidor de aspartilproteasa API-1, antígeno superficial-asociado SAA- 1, antigeno superficial-asociado SAA-2, factor secretado adulto-especifico Xa, anticoagulante inhibidor de serina proteasa AP, proteasa aspártica similar a catepsina D ARR-1, glutatión S-transferasa GST, proteasa aspártica APR-1, acetilcolinesterasa AChE (infección por Ancylostoma duodenale y Necator americanus, Hookworm) ; proteina NS1, proteina NP1, proteina VP1, proteina VP2, proteina VP3 (infección por bocavirus Humano (HBoV) , bocavirus Humano) ; proteina superficial principal 2 MSP2, proteina superficial principal 4 MSP4, variante MSP SGV1, variante MSP SGV2, proteina de membrana externa OMP, proteina de membrana externa 19 OMP-19, proteina antigénica principal MAPI, proteina antigénica principal MAP1-2, proteina antigénica principal MAP1B, proteina antigénica principal MAPl-3, proteina codificante Erum2510, proteina GroEL, proteina GroES, proteínas de membrana externa principal de 30-kDA, proteína GE de 100-kDa, proteína GE de 130-kDa, proteína GE de 160-kDa (Ehrlichia ewingii, Human ewingii ehrlichiosis ) ; proteína principal superficiales 1-5 (MSPla, MSPlb, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5) , proteínas del sistema de secreción tipo IV VirB2, VirB7, VirBll, VirD4 (Anaplasma phagocytofilum, anaplasmosis granulocítica Humano (HGA) ) ; proteína NS1, proteína hidrofóbica pequeña NS2, proteína SH, proteína de fusión F, glucoproteína G, proteína de matriz M, proteína de matriz M2- 1, proteína de matriz M2-2, fosfoproteína P, nucleoproteína N, polimerasa L (metapneumovirus Humano (hMPV) , infección por metapneumovirus Humano) ; proteína superficial principal 2 MSP2, proteína superficial principal 4 MSP4, variante MSP SGV1, variante MSP SGV2, proteína de membrana externa OMP, proteína de membrana externa 19 OMP-19, proteína antigénica principal MAPI, proteína antigénica principal MAP1-2, proteína antigénica principal MAP1B, proteína antigénica principal MAP1-3, proteína codificante Erum2510, proteína GroEL, proteína GroES, proteínas de membrana externa principal de 30-kDA, proteína GE de 100-kDa, proteína GE de 130-kDa, proteína GE de 160-kDa (Ehrlichia chaffeensis, Human monocytic ehrlichiosis ) ; proteína de replicación El, proteína reguladora E2, proteína E3, proteína E4, proteína E5, proteína E6, proteína E7, proteína E8, proteína con cápside mayor Ll, proteína con cápside menor L2 (papilomavirus humano (HPV) , infección por papilomavirus humano (HPV) ) ; proteína de fusión F, hemaglutinin-neuramidasa HN, glucoproteína G, proteína matriz M, fosfoproteína P, nucleoproteína N, polimerasa L (virus de parainfluenza humana (HPIV) , infección por virus de parainfluenza humana) ; Hemaglutinina (HA) , Neuraminidasa (NA) , Nucleoproteína (NP) , proteína MI, proteína M2, proteína NS1, proteína NS2 (proteína NEP: proteína de exportación nuclear) , proteína PA, proteína PB1 (proteína de polimerasa básica 1) , proteína PB1-F2 y proteína PB2 (familia Ortomixoviridae, virus de Influenza (gripe)); poliproteína genómica, proteína E, proteína M, proteína con cápside C (virus de encefalitis Japonesa, encefalitis Japonesa) ; toxina RTX, pili tipo IV, pilus mayor subunidad PilA, factores de transcripción reguladora PilS y PilR, proteína sigma54, proteínas de membrana externa (Kingella kingae, infección por Kingella kingae) ; proteína prion (Kuru prion, Kuru) ; nucleoproteína N, polimerasa L, proteína de matriz Z, glucoproteína GP (Lassa virus, fiebre de Lassa) ; lipoproteína peptidoglican-asociada PAL, chaperonina de 60 kDa Cpn60 (groEL, HspB) , pilin PilE tipo IV, proteína de membrana externa MIP, proteína de membrana externa mayor MompS, metaloproteinasa de zinc MSP (Legionella pneumofila, Legionellosis (enfermedad del Legionario, fiebre Pontiac) ) ; nucleasa P4, proteína WD, reductasa ribonucleótido M2, superficie de membrana glucoproteína Pg46, cisteína proteinasa CP, proteína glucosa-regulada 78 GRP-78, proteína similar al antígeno S en etapa específica A2, ATPasa Fl, beta-tubulina, proteína de choque térmico 70 Hsp70, KMP-11, glucoproteína GP63, proteína BT1, nucleósido hidrolasa NH, proteína de superficie celular Bl, proteína Pl similar a la proteína ribosóimica Pl, esterol 24-c-metiltransferasa SMT, proteína LACK, histona Hl, proteína SPB1, antioxidante tiol- específico TSA, antígeno proteínico ST11, señal de peptidasa SP, histona H2B, antígeno superficial PSA-2, cisteína proteinasa b Cpb (género Leishmania, Leishmaniasis ) ; proteína con membrana mayor I, antígeno rico en serina de 45 kDa, caperonina de 10 kDa GroES, antígeno HSP kDa, amino-oxononanoato sintasa AONS, recombinasa proteínica A RecA, Acetil-/propionil-coenzima A carboxilasa alfa, alanina racemasa, chaperonina 2 de 60 kDa, proteína EcxB similar ESAT-6 (L-ESAT-6) , proteína Lsr2, proteína ML0276, hemaglutinina de unión a heparina HBHA, proteína de choque térmico 65 Hsp65, proteína codificante de mycPl o ML0041, proteína codificante htrA2 o ML0176, proteína codificante de htrA4 o ML2659, proteína codificante de gcp o ML0379, proteína codificante de clpC o ML0235 (Mycobacterium leprae y Mycobacterium lepromatosis , Leprosy) ; proteína de membrana externa LipL32, proteína con membrana LIC10258, proteína con membrana LP30, proteína con membrana LIC12238, proteína similar Ompa Lsa66, proteína superficial LigA, proteína superficial LigB, proteína de membrana externa mayor OmpLl, proteína de membrana externa LipL41, proteína LigAni, proteína superficial LcpA, proteína de adhesión LipL53, proteína de membrana externa UpL32, proteína superficial Lsa63, flagelina FlaBl, lipoproteína de membrana LipL21, proteína con membrana pL40, adhesina superficial leptospiral Lsa27, proteína de membrana externa OmpL36, proteína de membrana externa OmpL37, proteína de membrana externa OmpL47, proteína de membrana externa OmpL54, aciltransferasa LpxA (género Leptospira, Leptospirosis) ; precursor Hly de listeriolisina 0 (LLO) , proteína Iap asociada con invasión (P60), proteína reguladora de Listeriolisina PrfA, metaloproteinasa de zinc Mpl, fosfolipasa fosfatidilinositol-específica C PLC (PlcA, PlcB) , O-acetiltransferasa Oat, permeasa transportadora de ABC Im.G_1771, proteína de adhesión LAP, receptor LAP Hsp60, adhesina LapB, hemolisina listeriolisina 0 LLO, proteína ActA, Internalina A InlA, proteína lnlB (Listeria monocytogenes , Listeriosis) ; proteína de superficie externa A OspA, proteína de superficie externa OspB, proteína de superficie externa OspC, proteína de unión a decorina A DbpA, proteína de unión a decorina B DbpB, proteína núcleo Fia de 41 kDa de filamentos flagelares, proteína de membrana básica A BmpA (antígeno inmunodominante P39), precursor de lipoproteína de 22 kDa de superficie externa (antígeno IPLA7), lipoproteína de superficie variable vlsE (usualmente Borrelia burgdorferi y otras especie de Borrelia, enfermedad de Lyme (Lyme borreliosis) ) ; proteína VAL-1 similar al homólogo alergénico de veneno, transcripción ALT-1 larval abundante, transcriptasa ALT-2 larval abundante, tioredoxina peroxidasa PX, homólogo VAH del alérgeno de avispa, tiordoxina peroxidasa 2 TPX-2, proteina antigénica SXP (peptidos N, NI, N2, y N3) , proteina-1 asociada con activación ASP-1, tioredoxina TRX, transglutaminasa BmTGA, glutatión-S-transferasas GST, miosina, homólogo VAH del alérgeno de avispa, colagenasa de 175 kDa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GAPDH, colágeno cuticular Col-4, proteínas ácidas larvales secretadas SLAP, quitinasa CHI-1, proteína de unión a maltosa MBP, fructosa-1 , 6-bisfosfato aldolasa Fba de enzimas glucolíticas, tropomiosina TMY-1, producto génico nematodo-específico OvB20, oncocistatina CPI-2, proteína Cox-2 (Wuchereria bancrofti y Brugia malayi, filariasis linfática (Elephantiasis) ) ; glucoproteína GP, proteína de matriz Z, polimerasa L, nucleoproteína N (virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV) , Lymphocytic choriomeningitis ) ; proteína TRAP anónima relacionada con trombospondina, proteína superficial de SSP2 Sporozoite 2, antígeno de membrana apical 1 AMAl, antígeno de membrana rhoptry R Al, antígeno de repetición básica ácida ABRA, proteína transversal celular PF, proteína Pvs25, proteína superficial de merozoito 1 MSP-1, proteína superficial de merozoito 2 MSP-2, antígeno superficial de eritrocitos anillo-infectados antígeno de etapa RESALiver 3 LSA-3, proteína Eba-175, antígeno 5 para repetición de serina SERA-5, proteína de circumsporozoitos CS, proteína 3 superficial de merozoito MSP3, proteina superficial 8 de merozoitos MSP8, enolasa PF10, proteina de hepatocitos-eritrocitos de 17 kDa HEP17, proteina con membrana 1 de eritrocitos EMP1, proteina superficial 4/5 de la proteina Kbetamerozoitos MSP 4/5, proteina de choque térmico Hsp90, proteina rica en glutamato GLURP, proteina superficial 4 de merozoitos MSP-4, proteina STARP, precursor antigénico relacionado con la proteina de circumsporozoitos CRA (Plasmodium genus, Malaria); nucleoproteina N, proteina de VP24 membrana-asociada, nucleoproteina menor VP30, cofactor de polimerasa VP35, polimerasa L, proteina matriz VP40, glucoproteina con envoltura GP (virus Marburg, fiebre hemorrágica Marburg (MHF) ) ; proteina C, proteina matriz M, fosfoproteina P, proteina no estructural V, glucoproteina de hemaglutinina H, polimerasa L, nucleoproteina N, proteina de fusión F (virus de sarampión, Sarampión) ; miembros de la familia de transportadores de ABC ¦' (LolC, OppA, y PotF) , proteina transmembrana LolC/E del sistema para liberación de lipoproteina putativa, flagelina FliC, motilidad intracelular de Burkholderia A BimA, factor de alargamiento bacteriano-Tu EF-Tu, proteina similar a OmpA de 17 kDa, proteina codificante boaA, proteina codificante boaB (Burkholderia pseudomallei , Melioidosis (enfermedad de Whitmore) ) ; proteínas pilin, subunida pilC pilin-asociada menor, subunidad pilin mayor y variantes pilE, pilS, proteina porA de variación de fase, Porin B PorB, proteina TraD, antigeno de membrana externa Neisserial H.8, antigeno de 70kDa, proteina PI de membrana externa mayor, proteínas PIA y P1B de membrana externa, antigeno , proteina superficial A NspA, proteina de unión a transferrina TbpA, proteína de unión a transferrina TbpB, PBP2, proteína codificante mtrR, proteína codificante ponA, permeaza con membrana FbpBC, sistema proteínico FbpABC, proteínas LbpAB, proteína de membrana externa Opa, transportador de membrana externa FetA, regulador hierro-reprimido MpeR, proteína de unión al factor H fHbp, adhesina NadA, proteína NhbA, represor FarR (Neisseria meningitidis , enfermedad Meningococcal) ; proteína de 66 kDa, proteína de 22 kDa (usualmente Metagonimus yokagawai, Metagonimiasis ) ; proteínas de tubo polar (34, 75, y 170 kDa en Glugea, 35, 55 y 150kDa en Encephalitozoon) , proteína quinesina-relacionada, subunidad mayor de ARN polimerasa II, proteína con membrana similar o integral YIPA, proteína 1 anti-lentificación, factor de transcrición de choque térmico HSF, proteína quinasa, timidina quinasa, proteína nucleolar similar a NOP-2 (Microsporidia phylum, Microsporidiosis) ; regulador de apoptosis similar a CASP8 y FADD, Glutatión peroxidasa GPX1, ARN helicasa NPH-II NPH2 , subunidad catalílita de Poly (A) polimerasa PAPL, proteína con envoltura mayor P43K, subunidad VETFS de 70 kDa con factor de transcrición temprano, subunidad VETFL de 82 kDa con factor de transcripción temprano, metaloendopeptidasa tipo Gl, nucleósido trifosfatasa I NPH1, proteína de replicación similar a A28 MC134L, subunidad RP07 de 7 kDa de ARN polimeasa (virus Molluscum contagiosum (MCV) , Molluscum contagiosum (MC) ) ; proteína matriz M, fosfoproteína P/V, proteína hidrofóbica pequeña SH, nucleoproteína N, proteína V, glucoproteína de fusión F, hemaglutinina-neuraminidasa HN, ARN polimerasa L (virus Mumps, Mumps) ; proteínas de membrana externa OM, antígeno de superficie celular OmpA, antígeno de superficie celular OmpB (sca5), proteína de superficie celular SCA , proteína de superficie celular SCA1, proteína intracitoplásmica D, proteína de capa superficial cristalina SLP, antígeno de proteína superficial protectora SPA (Rickettsia tyfi, Murine typhus (Endemic typhus) ) ; adhesina Pl, adhesión P30, proteína pll6, proteína P40, proteína citoesquelética HMW1, proteína citoesquelética HMW2, proteína citoesquelética HMW3, proteína codificante MPN152, proteína codificante MPN426, proteína codificante MPN456, proteína codificante MPN-500 (Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma pneumonía) ; NocA, proteína reguladora dependiente de hierro, VapA, VapD, VapF, VapG, proteasa caseinolítica, proteína de 43-kDa punta asociada con filamentos, proteína P24, proteína P61, proteína de 15-kDa, proteina de 56-kDa (usualmente Nocardia asteroides y otras especies de Nocardia, Nocardiosis ) ; proteína similar al homólogo alérgeno de veneno VAL-1, transcripción larval abundante ALT-1, transcripción larval abundante ALT-2, tioredoxina peroxidasa TPX, homólogo VAH alérgeno de avispa, tiordoxina peroxidasa 2 TPX-2, proteína antigénica SXP (péptidos N, NI, N2, y N3), proteína-1 asociada con la activación ASP-1, Tioredoxina TRX, transglutaminasa BmTGA, glutatión-S-transferasas GST, miosina, homólogo VAH de alérgeno de avispa, collagenase de 175 kDa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa GAPDH, colágeno cuticular Col-4, proteínas ácidas larvales secretadas SLAP, quitinasa CHI-1, proteína de unión a maltosa MBP, enzima glucolítica fructosa-1 , 6-bisfosfato aldolasa Fba, tropomiosina T Y-l, producto génico nematodo-específico OvB20, oncocistatina CPI-2, Cox-2 (Onchocerca volvulus, Onchocerciasis (River blindness) ) ; glucoproteína secretada de 43 kDa, glucoproteína gpO, glucoproteína gp75, antígeno Pb27, antígeno Pb40, proteína de choque térmico Hsp65, proteína de choque térmico Hsp70, proteína de choque térmico Hsp90, proteína PIO, triosefosfato isomerasa TPI, lectina paracoccin de unión a N-acetil-glucosamina, proteína de 28 kDa Pb28 ( Paracoccidioides brasiliensis , Paracoccidioidomycosis (Blastomicosis de sudamérica) ) ; cisteína proteasa similar a cruzipaina de 28-kDa Pw28CCP (usualmente Paragonimus westermani y otras especies de Paragonimus, Paragonimiasis) ; proteina de membrana externa OmpH, proteína de membrana externa Omp28, proteína PM1539, proteína PM0355, proteína PM1417, proteína de reparación MutL, proteína BcbC, proteína PM0305, formiato deshidrogenasa-N, proteína PM0698, proteína P 1422, girasa ADN, lipoproteína PlpE, proteína adhesiva Cp39, receptor HasR del sistema para hemo-adquisición, proteína capsular de 39 kDa, OMP hierro-regulada IROMP, proteína de membrana externa OmpA87, proteína fimbrial Ptf, proteína de subunidad fimbrial PtfA, proteína de unión a transferrina Tbpl, enzima esterasa MesA, toxina de Pasteurella multocida PMT, proteína adhesiva Cp39 (género Pasteurella, Pasteurellosis ) ; hemaglutinina filamentosa FhaB, adenilato ciclasa CyaA, precursor PtxD de la subunidad 4 de la toxina pertussis, precursor de pertactina Prn, subunidad 1 de toxinas PtxA, proteína Cpn60, proteína brkA, precursor PtxB de la subunidad 2 de la toxina pertussis, precursor PtxC de la subunidad 3 de la toxina pertussis, precursor PtxE de la subunidad 5 de la toxina pertussis, pertactina Prn, proteína Fim2, proteina Fim3; (Bordetella pertussis, Pertussis (Whooping cough) ) ; antígeno capsular Fl, antígeno virulenta-associado V, proteína efectora secretada LcrV, antígeno V, proteasa Pía de membrana externa, proteína efectora secretada YopD, proteína-tirosina fosfatasa YopH secretada putativa, subunidad mayor YscF de complejo de aguja, proteína quinasa YopO, proteína autotransportadora putativa YapF, membrana interna transportador YbtQ de ABC (Irp7), proteína de unión a azúcar putativa YPO0612, proteína de choque térmico 90 HtpG, proteína de sulfatasa putativa YdeN, proteína LolA portadora de lipoproteína de membrana externa, chaperona de secreción YerA, lipoproteína putativa YPO0420, proteína activadora de hemolisina HpmB, receptor de membrana externa para pesticina/yersiniabactina Psn, proteína YopE efectora secretada, proteína YopF efectora secretada, proteína YopK efectora secretada, proteína de membrana externa YopN, proteína de membrana externa YopM, precursor de coagulasa/fibrinolisina Pía; (Yersinia pestis, peste); proteína PhpA, adhesina superficial PsaA, neumolisina Ply, proteasa Clp dependiente de ATP, lipoato-proteína ligasa LplA, proteína anclada a la superficie de la pared celular psrP, sortasa SrtA, glutamil-ARNt sintetasa GltX, proteína de unión A colina CbpA, proteína de superficie A neumocótica PspA, proteína de superficial C pneumococal PspC, 6-fosfogluconato deshidrogenasa Gnd, proteína de unión a hierro PiaA, urein hidrolasa LytB, proteon LytC, proteasa Al ( Streptococcus pneumoniae, infección Pneumococcal) ; proteína superficial mayor B, proteasa similar a quexinaKEXl, proteína A12, antigeno de 55 kDa P55, glucoproteína de superficie mayor Msg ( Pneumocystis jirovecii, Pneumocystis pneumonía (PCP) ) ; poliproteina genómica, polimerasa 3D, proteína con cápside viral VP1, proteína con cápside viral VP2, proteína con cápside viral VP3, proteína con cápside viral VP4, proteasa 2A, proteasa 3C (Poliovirus, Poliomyelitis) ; proteína Nfal, exendin-3, lipasa secretora, proteasa similar a catepsina B, cisteína proteasa, catepsina, peroxiredoxina, proteína CrylAc (usualmente Naegleria fowleri, meningoencefalitis amoebica primaria (PAM)); agnoproteína, antígeno T largo, antígeno T pequeño, proteína con cápside mayor VP1, proteína con cápside menor Vp2 (virus JC, leucoencefalopatía multifocal progresiva); proteína con respuesta de calcio bajo E LCrE, proteína externa de clamidia N CopN, serina/treonina-proteína quinasa PknD, proteína acilo-portadora-S-maloniltransferasa FabD, proteína de unión a ADN de cadena individual-Ssb, proteína de membrana externa mayor MOMP, proteína de membrana externa 2 0mp2, familia de proteína con membrana polimórfica (Pmpl, Pmp2, Pmp3, Pmp4, Pmp5, Pmp6, Pmp7, Pmp8, Pmp9, PmplO, Pmpll, Pmpl2, Pmpl3, Pmpl4, Pmpl5, Pmpl6, Pmpl7, Pmpl8, Pmpl9, Pmp20, Pmp21) (Chlamydofila psittaci, Psittacosis) ; proteína de membrana externa Pl, proteína de choque térmico B HspB, transportador peptídico ABC, proteína de unión con GTP, proteína IcmB, ribonucleasa R, fosfatasas SixA, proteina DsbD, proteina de membrana externa TolC, proteina de unión con DNA PhoB, ATPasa DotB, proteina de choque térmico B HspB, proteina con membrana Comí, proteina de 28 kDa, ADN-3-metiladenina glucosidasa I, proteina de membrana externa OmpH, proteina de membrana externa AdaA, proteina T del sistema de segmentación de glicina (Coxiella burnetii, fiebre Q) ; nucleoproteina N, proteina estructural grande L, fosfoproteina P, proteina de matriz M, glucoproteina G (Virus de la rabia, Rabias) ; proteina de fusión F, nucleoproteina N, proteina de matriz M, proteina de matriz M2-1, proteina de matriz M2-2, fosfoproteina P, proteina hidrofóbica pequeña SH, glucoproteina G de superficie mayor, poliiaerasa L, proteina 1 no estructural NS1, proteina 2 no estructural NS2 (Virus sincitial respiratorio (RSV) , infección por virus sincitial respiratorio) ; poliproteina genómica, polimerasa 3D, proteina con cápside viral VP1, proteina con cápside viral VP2, proteina con cápside viral VP3, proteina con cápside viral VP4, proteasa 2A, proteasa 3C (Rhinovirus, infección por Rhinovirus) ; proteínas de membrana externa OM, antígeno OmpA de superficie celular, antígeno OmpB de superficie celular (sca5), proteína de superficie celular SCA4, proteína de superficie celular SCA1, proteína PS120, proteína D intracitoplásmica, antígeno SPA de proteína superficial protectora (género Rickettsia, infección por Rickettsial) ; proteínas OM de membrana externa, antígeno OmpA de superficie celular, antígeno OmpB de superficie celular (sca5), proteína SCA4 de superficie celular, proteína SCA1 de superficie celular, proteína D intracitoplásmica (Rickettsia akari, Rickettsialpox) ; glucoproteína GP con envoltura, polimerasa L, nucleoproteína N, proteína NSS no estructural (virus de fiebre Rift Valley, fiebre de Rift Valley (RVF) ) ; proteínas OM de membrana externa, antígeno OmpA de superficie celular, antígeno OmpB de superficie celular (sca5), proteína SCA4 de superficie celular, proteína SCA1 de superficie celular, proteína D intracitoplásmica (Rickettsia rickettsii, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (RMSF) ); proteína 6 no estructural NS6, proteína 2 no estructural NS2, proteína VP6 con cápside intermedia, proteína VP2 con cápside interna, proteína 3 no estructural NS3, polimerasa L de ARN-ARN-dirigida, proteína VP3, proteína 1 no estructural NS1, proteína 5 no estructural NS5, glucoproteína VP7 con cápside extrna, glucoproteína 4 no estructural NS4, proteína VP4 con cápside externa (Rotavirus, infección por Rotavirus) ; poliproteína P200, glucoproteína El, glucoproteína E2, proteína NS2, proteína C con cápside (virus de rubéola, rubéola) ; chaperonina GroEL (MopA) , inositol fosfato fosfatasa SopB, proteína de chogue térmico HslU, proteína chaperona DnaJ, proteína TviB, proteína IroN, flagelina FliC, proteína de invasión SípC, glucoproteína gp43, proteína de membrana externa LamB, proteína de membrana externa PagC, proteína de membrana externa TolC, proteína de membrana externa NmpC, proteína de membrana externa FadL, proteína de transporte SadA, transferasa WgaP, proteínas efectoras SifA, SteC, SseL, SseJ y SseF (Salmonella genus, Salmonelosis) ; proteína 14, proteína NS7b no estructural, proteína NS8a no estructural, proteína 9b, proteína 3a, nucleoproteína N, proteína NS3b no estructural, proteína NS6 no estructural, proteína 7a, proteína NS8b no estructural, proteína con membrana M, proteína EsM con membrana pequeña con envoltura, poliproteína la de replicasa, glucoproteína de espira S, replicase poliproteína lab; (SARS coronavirus, SARS (Síndrome respiratorio agudo severo) ) ; serin proteasa, Antígeno 1 ASA1 de sarcoptes atípico, glutatión S-transferasas GST, cisteína proteasa, serina proteasa, apolipoproteína (Sarcoptes scabiei, Scabies) ; glutatión S-transferasas GST, paramiosina, hemoglobinasa SM32, antígeno de huevo mayor, proteína Sml4 de unión con ácido graso de 14 kDa, antígeno P37 de superfie larval mayor, antígeno tegumental de 22.6 kDa, calpaina CANP, trifosfato isomerasa Tim, proteína superficial 9B, proteína VP2 con cápside externa, proteína Sm23 con membrana integral de 23 kDa, Cu/Zn-superóxido dismutasa, glucoproteína Gp, miosina (género Schistosoma, Schistosomiasis (Bilharziosis) ) ; chaperonina de 60 kDa, antígeno tipo específico de 56 kDa, piruvato fosfatodiquinasa, 4-hidroxibenzoato octapreniltransferasa (Orientia tsutsugamushi, Scrub typhus) ; deshidrogenasa GuaB, proteina de invasión Spa32, invasina IpaA, invasina IpaB, invasina IpaC, invasina IpaD, invasina IpaH, invasina IpaJ (Shigella genus, Shigellosis (disenteria Bacillary) ) ; proteína P53, homólogo US10 de proteína viriónica, regulador transcripcional IE63, transactivador transcripcional IE62, proteasa P33, proteína de 74 kDa del factor de alfa trans-inducción, desoxiuridina 5' -trifosfato nucleotidohidrolasa, transactivador transcripcional IE4, homólogo UL43 de proteína con membrana, homólogo UL3 de fosfoproteína nuclear, homólogo UL4 de proteína nuclear, proteína de unión con origen de replicación, proteína con membrana 2, fosfoproteína 32, proteína 57, factor de procesibilidad de polimerasa con ADN, proteína portal 54, ADN primasa, homólogo UL14 de proteína tegumentaria, homólogo UL21 de proteína tegumentaria, homólogo UL55 de proteína tegumentaria, homólogo UL33 de la subunidad de terminasa tripartita, homólogo de UL15 de la subunidad de terminasa tripartita, proteína 44 de unión con cápside, proteína 43 de empaque viriónico (virus de varicela zoster (VZV) , Shingles (Herpes zoster) ) ; homólogo de esferoide deshidrogenasa de 3- beta hidroxi-5-eno truncado, proteína A13 de membrana viriónica, proteina A19, proteina A31, homólogo A35 de proteina truncada, homólogo A37.5 de proteina, proteína A47, proteina A49, proteína A51, proteína A43 similar a semaforina, inhibidor 1 de serina proteinasa, inhibidor 2 de serina proteinasa, inhibidor 3 de serina proteinasa, proteína A6, proteína B15, proteína Cl, proteína C5, proteína C6, proteína F7 , proteína F8, proteína F9, proteína Fll, proteína F14, proteína F15, proteína F16 (Varióla mayor o Varióla menor, Smallpox (Varióla) ) ; adhesina/glucoproteína gp70, proteasas (Sporothrix schenckii, Sporotrichosis ) ; proteína IsdB de unión hemo-hierro, colágeno adhesina Cna, factor A de aterronamiento ClfA, proteína MecA, proteína de unión A fibronectina FnbA, enterotoxina tipo A EntA, enterotoxina tipo B EntB, enterotoxina tipo C EntCl, enterotoxina tipo C EntC2, enterotoxina tipo D EntD, enterotoxina tipo E EntE, toxina-1 de síndrome de choque tóxico TSST-1, Stafiloquinasa, proteína 2a de unión penicilina PBP2a (MecA) , antígeno secretor SssA ( Staphylococcus genus, envenenamieto Staphylococcal por alimentos) ; proteína IsdB de unión a hemo-hierro, colágeno adhesina Cna, factor A de aterronamiento ClfA, proteína MecA, proteína A de unión fibronectina FnbA, tipo A EntA de enterotoxina, tipo B EntB de enterotoxina, tipo C EntCl de enterotoxina, tipo C EntC2 de enterotoxina, tipo D EntD de enterotoxina, tipo E EntE de enterotoxina, toxina 1 de síndrome de choque tóxico TSST-1, Staphyloquinasa, proteína 2a de unión a penicilina PBP2a (MecA) , antígeno secretorio SssA (Staphylococcus genus por ejemplo, infección por aureus, Staphylococcal ) ; antígeno Ss-IR, antígeno NIE, estrongilastacina, Na+-K+ ATPasa Sseat-6, tropomisina SsTmy-1, proteína LEC-5, antígeno de 41 kDa P5, proteínalarval de 41-kDa, proteína larval de 31-kDa, proteína larval de 28-kDa ( Strongyloides stercoralis, Strongyloidiasis) ; glicerofosfodiéster fosfodiesterasa GlpQ (Gpd) , proteína TmpB de membrana externa, proteína Tp92, antígeno TpFl, proteína de repetición Tpr, proteína de repetición F TprF, proteína de repetición G TprG, proteína de repetición I Tprl, proteína de repetición J TprJ, proteína de repetición K TprK, proteína A con membrana treponémica TmpA, lipoproteína, Tppl5 de 15 kDa, antígeno de membrana de 47 kDa, miniferritina TpFl, adhesina Tp0751, lipoproteína TP0136, proteína TpNl7, proteína TpN47, proteína de membrana externa TP0136, proteína de membrana externa TP0155, proteína de membrana externa TP0326, proteína de membrana externa TP0483, proteína de membrana externa TP0956 (Treponema pallidum, Sífilis); proteasas similares a catepsina L, antígeno de 53/25-kDa, miembros de la familia de 8kDa, proteína de cisticercos con una actividad TsAg5 similar a tripsina marginal, proteina TS0L18 oncosfera, proteina TSOL45-1A oncosfera, lactato deshidrogenasa A LDHA, lactato deshidrogenase B LDHB (género Taenia, Taeniasis); toxina tetánica TetX, toxina tetánica C TTC, proteina con capa de 140 kDa S, subunidad CT3 de flavoproteína beta, fosfolipasa ( lecithinasa) , proteína fosfoportadora HPr (Clostridium tetani, Tetanus (Lockjaw) ) ; poliproteína genómica, proteína E, proteína M, proteína C con cápside (virus de encefalitis portada por garrapatas (TBEV) , encefalitis portada por garrapatas) ; antígeno de 58-kDa, antígenos de 68-kDa, antígeno TES excretor-secretor de larva toxocara, glucoproteína de 32-kDa, glucoproteína TES-70, glucoproteína GP31, antígeno TcES-57 excretor-secretor, antígeno Pe de fluido perientérico, antígenos Ex de extracto soluble, antigens ES de larva excretor/secretor, antígeno TES-120, alérgeno de poliproteína TBA-1, cisterna proteasa c-cpl-1 similar a catepsina L, proteína de 26-kDa (Toxocara canis o Toxocara cati, Toxocariasis (Larva Migrans Ocular (OLM) y Larva Migrans Visceral (VLM) ) ) ; proteínas micronémicas (MIC1, MIC2, MIC3, MIC4, MIC5, MIC6, MIC7, MIC8), proteína rhoptry Rop2, proteínas rhoptry (Ropl, Rop2 , Rop3, Rop4, Rop5, Rop6, Rop7, Ropl6, Rjopl7), proteína SR1, antígeno superficial P22, antígeno mayor p24, antígeno superficial mayor p30, proteínas de gránulo denso (GRA1, GRA2 , GRA3, GRA4, GRA5, GRA6, GRA7 , GRA8, GRA9, GRA10), antígeno de 28 kDa, antígeno superficial SAG1, antigeno relacionado con SAG2, nucleósidos-trifosfatasa 1, nucleósido-trifosfatasa 2, proteina Stt3, proteina que contiene un dominio similar a HesB, proteasa 5 similar a romboides, toxomepsin 1 (Toxoplasma gondii, Toxoplasmosis) ; glucoproteina secretada de 43 kDa, glucoproteina secretada de 53 kDa, paramiosina, antigeno Ts21, antigeno Ts87, antigeno p46000, antigenos TSL-1, caveolin-1 CAV-1, antigeno de larva recién nacida de 49 kDa, homólogo de prosaposina, serina proteasa, inhibidor de serina proteinasa, glucoproteina Gp45 de 45 kDa (Trichinella spiralis, Trichinellosis) ; factores transcripcionales similares a Myb (Mybl, Myb2, Myb3) , proteina de adhesión AP23, proteina de adhesión AP33, proteina adhesina AP33-3, adhesins AP51, adhesina AP65, proteina de adhesión AP65-1, alfa-actinina, proteina asociada con cinesina, teneurina, proteinasa de 62 kDa, serine proteasa SUBI similar a subtilisina, gen 3 CP3 de cisteina proteinasa, alfa-enolasa Enol, cisteina proteinasa CP30, proteina de choque térmicos (Hsp70, Hsp60) , proteina inmunogénica P270, (Trichomonas vaginalis, Trichomoniasis ) ; beta-tubulina, proteina de 47-kDa, proteinasa-1 similar a leucocito secretor SLP-1, proteina TT50 de 50-kDa, antigeno de 17 kDa, proteina de 43/47 kDa (Trichuris trichiura, Trichuriasis (infección por Whipworm) ) ; proteina ESAT-6 (EsxA) , antigeno filtrado EsxB de 10 kDa, antígeno secretado 85-B FBPB, proteina A de unión a fibronectina FbpA (Ag85A) , serina proteasa PepA, proteina PPE18 de la familia PPE, proteina D de unión a fibronectina FbpD, proteina inmunogénica MPT64, proteina secretada MPT51, catalasa-peroxidasa-peroxinitritasa T ATG, lipoproteina PSTS3 de unión a fosfato peripl'ásmico (PBP-3, Phos-1) , hemaglutinina Hbha de unión a heparina hierro-regulada, proteina PPE14 de la familia PPE, proteina PPE68 de la familia PPE, proteina Mtb72F, proteina Apa, proteina inmunogénica MPT63, lipoproteina PSTS1 de unión a fosfato periplásmico (PBP-1), chaperona molecular DnaK, lipoproteina Mpt83 de superficie celular, lipoproteina P23, proteina permeasa pstA del sistema de transporte de fosfato, antigeno de 14 kDa, proteina C de unión a fibronectina FbpCl, alanina deshidrogenasa TB43, glutamina sintetasa 1, proteina ESX-1, proteina CFP10, proteina TB10.4, proteina MPT83, proteina MTB12, proteina TB8, proteínas similares a Rpf, proteína MTB32, proteína MTB39, cristalina, proteína de choque térmico HSP65, proteína PST-S (usualmente tuberculosis Mycobacterium, Tuberculosis) proteína FobA de membrana externa, proteína FobB de membrana externa, locus lglCl de crecimiento intracelular , locus IglC2 de crecimiento intracelular, aminotransferasa Wbtl, chaperonina GroEL, proteína TUL4 con membrana mayor de 17 kDa, lipoproteina LpnA, proteína de la familia de quitinasa 18, isocitrato deshidrogenasa, proteína de la familia Nif3, proteína de glucosilación pili tipo IV, proteína tolC de membrana externa, proteína de la familia de unión con FAD, proteína de membrana externa multimérica pilin tipo IV, proteína KdpD con sensor de dos componentes, proteína chaperona DnaK, proteína TolQ (Francisella tularensis, Tularemia) ; MB antígeno, ureasa, proteína GyrA, proteína GyrB, proteína ParC, proteína ParE, proteínas LAMP de membrana asocidada con lípidos, timidina quinasa K, fosfolipasa PL-A1, fosfolipasa PL-A2, fosfolipasa PL-C, antígeno de 96-kDa superficie expresado; (Ureaplasma urealyticum, infección por Ureaplasma urealyticum) ; poliproteína no estructural, poliproteína estructural, proteína CP con cápside, proteína El, proteína E2, proteína E3, proteasa Pl, proteasa P2, proteasa P3 (virus de encefalitis equina Venezolana, encefalitis equina Venezolana) ; glucoproteína GP, proteína matriz Z, polimerasa L, nucleoproteína N (virus Guanarito, fiebre hemorrágica Venezolana) ; poliproteína, proteína E, proteína M, proteína C con cápside, proteasa NS3, proteína NS1, proteína NS2A, proteína AS2B, broteína NS4A, proteína NS4B, proteína NS5 (virus del nilo Occidental, fiebre del Nilo Occidental) ; proteína CP con cápside, proteína El, proteína E2, proteína E3, proteasa P2 (virus de encefalitis equina Occidental, encefalitis equina Occidental) ; poliproteina genómica, proteina E, proteina M, proteína C con cápside, proteasa NS3, proteína NS1, proteína NS2A, proteína AS2B, proteína NS4A, proteína NS4B, proteína NS5 (virus de fiebre amarilla, Fiebre amarilla) ; proteína YobB blanco Yop putativa, proteína efectora YopD, proteína efectora YopE, proteína YopH, proteína efectora YopJ, proteína de translocación proteínica YopK, proteína efectora YopT, proteína YpkA, proteína FlhA de biosíntesis flagelar, peptidasa M48, system de flujo de potasio KefA, regulatoer transcripcional RovA, adhesina Ifp, proteína translocadora LcrV, proteína PcrV, invasina Inv, purina similar a OmpF de proteína con membrana externa, adhesina YadA, proteína quinasa C, fosfolipase Cl, proteína PsaA, proteína WbyK similar manosiltransferasa, proteína YscU, antígeno YPMa (Yersinia pseudotuberculosis, infección por Yersinia pseudotuberculosis); proteína efectora YopB, chaperonina de 60 kDa, proteína WbcP, tirosina-proteína fosfatasa YopH, proteína YopQ, enterotoxina, Galactosido permeasa, reductasa NrdE, proteína YasN, Invasina Inv, adhesina YadA, porina F de membrana externa OmpF, proteína UspAl, proteína EibA, proteína Hia, proteína Ail de superficie celular, chaperona SycD, proteína LcrD, proteína LcrG, proteína LcrV, proteína SycE, proteína YopE, proteína TyeA reguladora, proteína YopM, proteína YopN, proteína YopO, proteína YopT, proteína YopD, proteasa ClpP, proteína MyfA, proteína FilA, y proteína PsaA (Yersinia enterocolitica, Yersiniosis) .
(Entre paréntesis se encuentra el patógeno particular de la familia de patógenos de los cuales se deriva o se derivan el antígeno o antígenos y la enfermedad infecciosa con la cual está asocia el patógeno) La región codificante del ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención se puede presentar como un ácido nucleico mono-, di-cistrónico o incluso multi-cistrónico, es decir, un ácido nucleico que porta las secuencias codificantes de una, dos o más proteínas o péptidos. Estas secuencias codificantes en ácidos di- o incluso multi-cistrónicos pueden estar separados por al menos una secuencia con sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), por ejemplo, como se describe en el presente o mediante péptidos señal que inducen la segmentación del polipéptido resultante que comprende diversas proteínas o péptidos .
De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico inventivo comprende una región codificante, que codifica para un péptido o proteína que comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo. De preferencia, el antigeno patogénico codificado no es la proteina de histona. En el contexto de la presente invención esta proteina de histona típicamente es una proteína bastante alcalina encontrada en núcleos celulares eucariotas, que empaca y ordena el ADN en unidades estructurales denominadas nucleosomas. Las proteínas de histonas son los componentes proteínicos líderes de la cromatina, actúan como bobinas alrededor de las cuales se enrolla el ADN, y desempeñan una función en la regulación génica. Sin las histonas, el ADN no enrollado en los cromosomas podría ser muy largo (una proporción de longitud a anchura de más de 10 millones a uno en el ADN humano) . Por ejemplo, cada célula humana tiene hasta aproximadamente 1.8 metros de ADN, aunque enrollado en las histonas tiene aproximadamente 90 milímetros de cromatina, las cuales, cuando se duplican y condensan durante la mitosis, dan por resultado en aproximadamente 120 micrómetros de cromosomas. De mayor preferencia, en el contexto de la presente invención, esta proteína de histona típicamente se define como una proteína bastante conservada seleccionada de una de las siguientes cinco clases principales de histonas: H1/H5, H2A, H2B, H3, y H4, de preferencia, seleccionadas de histonas de mamífero, de mayor preferencia de histonas humanas o proteínas de histonas. Estas histonas o proteínas de histonas típicamente están organizadas en dos superclases definidas como histonas núcleo, que comprenden las histonas H2A, H2B, H3 y H4, e histonas ligadoras, que comprenden las histonas Hl y H5.
En este contexto, las histonas ligadoras, de preferencia excluidas del alcance de la protección de la invención pendiente, de preferencia las histonas ligadoras de mamíferos, de mayor preferencia las histonas ligadoras humanas, típicamente se seleccionan de Hl incluyendo H1F, en particular incluyendo H1F0, H1FNT, H1F00, H1FX, y H1H1, en particular incluyendo HIST1H1A, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H1T; y Además, las histonas núcleo, de preferencia excluidas del alcance de la protección de la invención pendiente, de preferencia, las histonas núcleo de mamífero, de mayor preferencia las histonas núcleo de humanos, típicamente se seleccionan de H2A, incluyendo H2AF, en particular incluyendo H2AFB1, H2AFB2 , H2AFB3, H2AFJ, H2AFV, H2AFX, H2AFY, H2AFY2 , H2AFZ, y H2A1, en particular incluyendo HIST1H2AA, HIST1H2AB, HIST1H2AC, HIST1H2AD, HIST1H2AE, HIST1H2AG, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AK, HIST1H2AL, HIST1H2A , y H2A2, en particular incluyendo HIST2H2AA3, HIST2H2AC; H2B, incluyendo H2BF, en particular incluyendo H2BFM, H2BFO, H2BFS, H2BFWT H2B1, en particular incluyendo HIST1H2BA, HIST1H2BB, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BE, HIST1H2BF, HIST1H2BG, HIST1H2BH, HIST1H2BI , HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2B , HIST1H2B , HIST1H2B0, y ?2?2, en particular incluyendo HIST2H2BE; H3, incluyendo H3A1, en particular incluyendo HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, y H3A2, en particular incluyendo HIST2H3C, y H3A3, en particular incluyendo HIST3H3; H4, incluyendo H41, en particular incluyendo HIST1H4A, HIST1H4B, HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4G, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1H4 J, HIST1H4K, HIST1H4L, y H44, en particular incluyendo HIST4H , y H5.
De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, la secuencia del ácido nucleico inventivo comprende una región codificante, que codifica para un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo. De preferencia, el antigeno patogénico codificado no es una proteina reportera (por ejemplo, luciferasa, proteina fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente verde intensificada (EGFP) , ß-galactosidasa) y no es una proteina marcadora o de selección (por ejemplo, alfa-globina, galactoquinasa y xantina : guanina fosforribosiltransferasa (GPT) ) . De preferencia, la secuencia de ácido nucleico de la invención no contiene un gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo, una secuencia Neogénica (bacteriana) (gen de resistencia a neomicina) o una secuencia génica CAT (que codifica para cloranfenicol acetiltransferasa; un gen de resistencia a cloranfenicol ) .
El ácido nucleico inventivo como se definió anteriormente, comprende o codifica para a) una región codificante, que codifica para un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; de preferencia para aumentar la expresión del péptido o proteina codificado, en donde el péptido o proteina codificado de preferencia no es una proteína de histona, ni una proteína reportera y/o tampoco una proteína marcadora o de selección, como se definió anteriormente. Los elementos b) hasta c) del ácido nucleico inventivo se pueden presentar en el ácido nucleico inventivo en cualquier orden, es decir, los elementos a) , b) y c) se pueden presentar en el orden a) , b) y e) o a) , c) y b) desde la dirección 5' hasta 3' en la secuencia del ácido nucleico inventivo, en donde se describen en la presente elementos adicionales, también pueden estar acompañadas, tal como una estructura 5' -CAP, una secuencia poly(C), secuencias de estabilización, secuencias IRES, etc. Cada uno de los elementos a) hasta c) del ácido nucleico inventivo, en particular a) en las estructuras di-cistrónicas o multi-cistrónicas y/o cada uno de los elementos b) y e), de mayor preferencia el elemento b) también se puede repetir al menos una vez, de preferencia dos o más veces en el ácido nucleico inventivo. Como un ejemplo, el ácido nucleico inventivo puede mostrar sus elementos de secuencia a) , b) y opcionalmente c) en, por ejemplo el siguiente orden: 5' - región codificante - asa troncal de histona secuencia poly(A) - 3'; o 5' - región codificante - asa troncal de la histona - señal de poliadenilación - 3' ; o 5' - región codificante - secuencia poly(A) - asa troncal de histona - 3' ; o 5' - región codificante - señal de poliadenilación - asa troncal de histona - 3' ; o 5' - región codificante - región codificante - asa troncal de la histona - señal de poliadenilación - 3'; o 5' - región codificante - asa troncal de la histona - asa troncal de histona - secuencia poly(A) - 3'; o 5' - región codificante - asa troncal de la histona - asa troncal de la histona - señal de poliadenilación 3'; etc.
En este contexto, se prefiere particularmente que la secuencia del ácido nucleico inventivo comprenda o codifique para a) una región codificante, que codifica para un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o fragmento, variante o derivado del mismo; b) al menos un asa troncal de histona, y c) un secuencia poly(A) de poliadenilación secuencia; de preferencia para aumentar el nivel de expresión del péptido o proteina codificado, en donde la proteina codificada de preferencia no es una proteina de histona, ni una proteina reportera (por ejemplo, luciferasa, GFP, EGFP, ß-galactosidasa, en particular EGFP) y/o no es una proteina marcadora de selección (por ejemplo, alfa-globina, galactoquinasa y xantina : guanina fosforibosiltransferasa (GPT) ) .
En una modalidad preferida adicional del primer aspecto de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, también se puede presentar en la forma de un ácido nucleico modificado.
En este contexto, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, se puede modificar para proporcionar un "ácido nucleico estabilizado", de preferencia un ARN estabilizado, de mayor preferencia un ARN que sea esencialmente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante una exo- o endo-nucleasa) . Un ácido nucleico estabilizado por ejemplo se puede obtener mediante la modificación del contenido de G/C de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, mediante la introducción de análogos de nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos con modificaciones estructurales, modificaciones de azúcar o modificaciones de base) o mediante la introducción de secuencias de estabilización de la región sin traducir 3'- y/o 5'- de la secuencia de ácido nucleico inventivo .
Como se mencionó anteriormente, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente puede contener análogos de nucleótidos/modificaciones, por ejemplo, modificaciones estructurales, modificaciones de azúcar o modificaciones de base. Una modificación estructural, junto con la presente invención es una modificación en la cual se modifican químicamente los fosfatos de la estructura de los nucleótidos contenidos en la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente. Una modificación del azúcar, junto con la presente invención es una modificación química del azúcar de los nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente. Además, una modificación de bases junto con la presente invención es una modificación química de la porción de la base de los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico inventivo. En este contexto, los análogos de nucleótidos o modificaciones de preferencia se seleccionan de análogos de nucleótidos que sean aplicables para transcripción y/o traducción.
En una modalidad particularmente preferida del primer aspecto de la presente invención, los análogos/modificaciones de nucleótidos definidos en la presente se seleccionan a partir de modificaciones de bases que aumentan adicionalmente la expresión de la proteina codificada y que de preferencia se seleccionan de 2-amino-6-cloropurinribosida-5 ' -trifosfato, 2-aminoadenosin-5' -trifosfato, 2-tiocitidin-5 ' -trifosfato, 2-tiouridin-5' -trifosfato, 4-tiouridin-5' -trifosfato, 5-aminoalilcitidin-5' -trifosfato, 5-aminoaliluridin-5' -trifosfato, 5-bromocitidin-5' -trifosfato, 5-bromouridin-5' -trifosfato, 5-iodocitidin-5' -trifosfato, 5-iodouridin-5' -trifosfato, 5-metilcitidin-5' -trifosfato, 5-metiluridin-5 ' -trifosfato, 6-azacitidin-5' -trifosfato, 6-azauridin-5' -trifosfato, 6-cloropurinribosida-5' -trifosfato, 7-deazaadenosino-5' -trifosfato, 7-deazaguanosino-5' -trifosfato, 8-azaadenosino-5' -trifosfato, 8-azidoadenosino-5' -trifosfato, benzimidazol-ribosida-5 ' -trifosfato, Nl-metiladenosino-5' -trifosfato, Nl-metilguanosina-5' -trifosfato, N6-metiladenosina-5' -trifosfato, 06-metilguanosina-5' -trifosfato, pseudouridin-5' -trifosfato, o puromicin-5' -trifosfato, xantosina-5' -trifosfato. Se proporciona una preferencia particular a los nucleótidos para las modificaciones de bases seleccionadas del grupo de nucleótidos base-modificados que consisten de 5-metilcitidin-5' -trifosfato, 7-deazaguanosin-5' -trifosfato, 5-bromocitidin-5' -trifosfato, y pseudouridin-5' -trifosfato.
De acuerdo con una modalidad adicional, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, puede contener una modificación de lipidos. Este ácido nucleico lipido-modificado típicamente comprende un ácido nucleico, como se define en la presente. Esta molécula de ácido nucleicolípido-modificado de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente típicamente comprende además al menos un ligador que se enlaza covalentemente con esa molécula de ácido nucleico, y al menos un lípido enlazado covalentemente con el ligador respectivo. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico lípido-modifícado comprende al menos una molécula de ácido nucleico, como se define en la presente y al menos un lípido (bifuncional ) enlazado covalentemente (sin un ligador) con esa molécula de ácido nucleico. De acuerdo con una tercera alternativa, la molécula de ácido nucleico lípido-modificado comprende una molécula de ácido nucleico, como se define en la presente, al menos un ligador enlazado covalentemente con esa molécula de ácido nucleico, y al menos un lípido enlazado covalentemente con el ligador respectivo, y al menos un lipido (bifuncional ) enlazado covalentemente (sin un ligador) con esa molécula de ácido nucleico. En este contexto, en particular se prefiere que la modificación de lipidos esté presente en los extremos terminales de una secuencia lineal del ácido nucleico inventivo.
De acuerdo con otra modalidad preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, en particular si se proporciona como un ARN (m) , por lo tanto, se puede estabilizar contra la degradación mediante RNasas mediante la adición de la denominada estructura "5' CAP".
De acuerdo con una modalidad preferida adicional del primer aspecto de la invención, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente se puede modificar mediante una secuencia de al menos 10 citidinas, de preferencia al menos 20 citidinas, de mayor preferencia al menos 30 citidinas (denominada "secuencia poly(C)"). En particular, la secuencia de ácido nucleico inventivo, puede contener o codificar para una secuencia poly(C) o típicamente aproximadamente 10 hasta 200 nucleótidos de citidina, de preferencia de aproximadamente 10 hasta 100 nucleótidos de citidina, de mayor preferencia aproximadamente 10 hasta 70 nucleótidos de citidina o incluso de mayor preferencia aproximadamente 20 hasta 50 o incluso 20 hasta 30 nucleótidos de citidina. Esta secuencia poly(C) de preferencia se ubica en la dirección 3' de la región codificante comprendida en el ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el contenido de G/C de la región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, se modifica, en particular se aumenta, en comparación con el contenido de G/C de su región codificante tipo salvaje particular, es decir, la región codificante no modificada. La secuencia de aminoácidos codificados de la región codificante de preferencia no se modifica en comparación con la secuencia de aminoácidos codificados de la región codificante tipo silvestre particular.
La modificación del contenido de G/C de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente se basa en el hecho de que la secuencia de cualquier región de ARNm que se traducirá es importante para una traducción eficiente del ARNm. De esta forma, son importantes la composición y la secuencia de diversos nucleótidos. En particular, las secuencias de ARNm que tienen un contenido aumentado de G (guanosina) /C (citosina) son más estables que las secuencias de ARNm que tienen un contenido aumentado de A (adenosina ) /U (uracilo) . De acuerdo con la invención, por lo tanto los codones de la región codificante son variados en comparación con su región codificante tipo silvestre, mientras que conservan la secuencia traducida de aminoácidos, de tal forma que incluyan una cantidad aumentada de nucleótidos G/C. con respecto al hecho de que diversos codones codifican para uno y el mismo aminoácido (denominado degeneración del código genético) , se pueden determinar los codones más favorables para la estabilidad (denominado uso de codones alternativos) .
Dependiendo del aminoácido que será codificado por la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, existen diversas posibilidades para la modificación de la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, la región codificante, en comparación con su región codificante tipo silvestre. En caso de que los aminoácidos que están codificados por codones que contienen exclusivamente nucleótidos G o C, no es necesaria ninguna modificación del codón. De esta forma, los codones para Pro (CCC o CCG) , Arg (CGC o CGG) , Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren modificación, ya que no esta presente A o U.
Por el contrario, los codones que contienen nucleótidos A y/o U se pueden modificar mediante la sustitución de otros codones que codifican para los mismos aminoácidos pero no contengan A y/o U. los ejemplos de éstos son : los codones para Pro se pueden modificar a partir de CCU o CCA a CCC o CCG; los codones para Arg se pueden modificar a partir de CGU o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG; los codones para Ala se pueden modificar a partir de GCU o GCA a GCC o GCG los codones para Gly se pueden modificar a partir de GGU o GGA a GGC o GGG.
En otros casos, aunque los nucleótidos A o U no se pueden eliminar de los codones, sin embargo es posible disminuir el contenido de A y U al utilizar codones que contengan un contenido menor de nucleótidos A y/o U. Los ejemplos de éstos son: los codones para Phe se pueden modificar a partir de UUU a UUC; los codones para Leu se pueden modificar a partir de UUA, UUG, CUU o CUA a CUC o CUG; los codones para Ser se pueden modificar a partir de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC; el codón para Tyr se pueden modificar a partir de UAU a UAC; el codón para Cys se pueden modificar a partir de UGU a UGC; el codón para His se pueden modificar a partir de CAU a CAC; el codón para Gln se pueden modificar a partir de CAA a CAG; los codones para lie se pueden modificar a partir de AUU o AUA a AUC; los codones para Thr se pueden modificar a partir de ACU o ACA a ACC o ACG; el codón para Asn se pueden modificar a partir de AAU a AAC; el codón para Lys se pueden modificar a partir de AAA a AAG; los codones para Val se pueden modificar a partir de GUU o GUA a GUC o GUG; el codón para Asp se pueden modificar a partir de GAU a GAC; el codón para Glu se pueden modificar a partir de GAA a GAG; el codón de terminación UAA se puede modificar para UAG o UGA.
En el caso de los codones para Met (AUG) y Trp (UGG) , por otro lado, no existe la posibilidad de modificación de secuencias.
Las sustituciones listadas anteriormente se pueden utilizar ya sea individualmente o en todas las combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, en comparación con su región codificante tipo silvestre particular (es decir, la secuencia original) . De esta forma, por ejemplo, todos los codones para Thr que se presentan en la secuencia tipo silvestre se pueden modificar a ACC (o ACG) .
En el contexto anterior, se muestran los codones presentes en el ARNm. Por ejemplo, la uridina presente en un ARNm también puede estar presente como timidina en el ADN respectivo que codifica para el ARNm particular.
De preferencia, el contenido de G/C de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente se aumenta en al menos 7%, de mayor preferencia en al menos 15%, en particular de preferencia en al menos 20%, en comparación con el contenido de G/C de la región codificante tipo silvestre. De acuerdo con una modalidad especifica, al menos, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de mayor preferencia al menos 70%, incluso de mayor preferencia al menos 80% y con la máxima preferencia al menos 90%, 95% o incluso el 100% de los codones que se pueden sustituir en la región codificante que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo se sustituyen, aumentando con esto el contenido de G/C de la región codificante .
En este contexto, en particular se preferible aumentar el contenido de G/C de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, al máxima (es decir, 100% de los codones que se pueden sustituir) , en comparación con la región codificante tipo silvestre.
De acuerdo con la invención, una modificación preferida adicional de la región codificante que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, se basa en el hallazgo de que la eficacia de traducción también se determina mediante una frecuencia diferente en la presencia de los ARNt en células. De esta forma, los denominados "codones raros" están presentes en la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, a un grado aumento, la secuencia de ácido nucleico modificado correspondiente se traduce a un grado significativamente más eficiente que en el caso en donde están presentes codones que codifican para los ARNt relativamente "frecuentes".
En este contexto, la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo de preferencia se modifica en comparación con la región codificante tipo silvestre correspondiente de tal forma que al menos un codón de la secuencia de tipo silvestre que codifica para un ARNt que es relativamente raro en la célula se intercambia por un codón que codifica para un ARNt que relativamente es frecuente en la célula y porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Mediante esta modificación, la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, se modifica de tal forma que los codones para los cuales los ARNt se presentan frecuentemente están disponibles e insertados. En otras palabras, de acuerdo con la invención, mediante esta modificación, todos los codones de la región codificante tipo silvestre que codifican para un ARNt que es relativamente rara en la célula pueden en cada caso ser intercambiados para un codón que codifica para un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y el cual, en cada caso, porta el mismo aminoácido como el ARNt relativamente raro.
Se conoce por un experto en la técnica cuáles ARNt se presentan con relativa frecuencia en la célula y cuáles, por el contrario, se presentan con relativa rareza; véase, por ejemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet . Prog. 2001, 11(6): 660-666. En particular se prefieren los codones que utilizan para el aminoácido particular, el ARNt que se presenta con mayor frecuencia, por ejemplo, el codón Gly, que utiliza el ARNt que se presenta de manera más frecuente en la célula (humana) .
De acuerdo con la invención, en particular se prefiere ligar el contenido de G/C secuencial que se aumenta, en particular se aumentan al máximo, en la región codificante de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, con los codones "frecuentes" sin modificar la secuencia aminoácido del péptido o proteina codificado por la región codificante de la secuencia de ácido nucleico. Esta modalidad preferida permite la provisión de una secuencia de ácido nucleico inventivo traducida y estabilizada (modificada) eficientemente, como se describe en la presente.
De acuerdo con otra modalidad preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, de preferencia adicionalmente tiene al menos una secuencia de estabilización 5' y/o 3' . Estas secuencias de estabilización en las regiones no traducidas 5' y/o 3' tienen el efecto de aumentar la vida media del ácido nucleico, en particular del ARNm en el citosol . Estas secuencias de estabilización pueden tener un 100% de identidad de secuencia con las secuencias de origen natural que se presentan en virus, bacterias y eucariotas, aunque también pueden ser parcial o totalmente sintéticas. Las secuencias no traducidas (UTR) del gen (alfa-) globina, por ejemplo proveniente de Homo sapiens o Xenopus laevis se pueden mencionar como un ejemplo de secuencias de estabilización que se pueden utilizar en la presente invención para un ácido nucleico estabilizado. Otro ejemplo de una secuencia de estabilización tiene la fórmula general (C/U) CCANXCCC (U/A) PyxUC (C/U) CC (SEC ID NO: 55), que está contenida en los 3' -UTR de los ARN muy estables que codifican para (alfa-) globina, colágeno tipo (I), 15-lipoxigenasa o para tirosina hidroxilasa (véase Holcik et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414). Estas secuencias de estabilización por supuesto se pueden utilizar individualmente o en combinación con otras y también en combinación con otras secuencias estabilización conocidas para un experto en la técnica. En este contexto, en particular se prefiere que la secuencia 3' UTR del gen alfa-globina esté ubicado en la dirección 3' de la región codificante que codifica para al menos un péptido o proteina que comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo comprendido en la secuencia de ácido nucleico inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
Las sustituciones, adiciones o eliminaciones de bases de preferencia se llevan a cabo con la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, utilizando una matriz de ADN para la preparación de la secuencia de ácido nucleico mediante técnicas de la mutagénesis sitio dirigida bien conocida o con una estrategia de ligación de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001) . Se pueden aplicar cualquiera de las modificaciones anteriores a la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente y además a cualquier ácido nucleico según se utiliza en el contexto de la presente invención y si es adecuado o necesario, se pueden combinar entre si en cualquier combinación, con la condición de que, estas combinaciones o modificaciones no interfieran entre si en el ácido nucleico respectivo. Alguien con experiencia en la técnica tendrá la capacidad para tomar esta decisión por consiguiente .
Las secuencias de ácido nucleico utilizadas de acuerdo con la presente invención como se define en la presente se pueden preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos sintéticos, tales como por ejemplo, síntesis en fase de sólidos, así como métodos in vitro, tales como reacciones de transcripción in vitro o en reacciones in vivo, tales como propagación in vivo de plásmidos de ADN en bacterias.
En este proceso, para la preparación de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, en especial si el ácido nucleico está en la forma de un ARNm, una molécula de ADN correspondiente se puede transcribir in vitro. Esta matriz de ADN de preferencia comprende un promotor adecuado, por ejemplo, un promotor T7 o SP6, para la transcripción in vitro, que está seguida por la secuencia de nucleótidos deseada para la molécula de ácido nucleico, por ejemplo ARNm, que será preparado y una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN, que forma la matriz de al menos un ARN de interés, se puede preparar mediante proliferación fermentativa y aislamiento posterior como parte de un plásmido que se puede replicar en bacterias. Los plásmidos que se pueden mencionar adecuados para la presente invención son, por ejemplo, los plásmidos pT7T (número de acceso GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 hasta 2360), la serie pGEM®, por ejemplo, pGEM®-l (número de acceso GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (número de acceso GenBank X65327); véase también Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed. ) , PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Ratón, FL, 2001.
La secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, asi como las proteínas o péptidos según se codifican por esta secuencia de ácido nucleico puede comprender fragmentos o variantes de estas secuencias. Estos fragmentos o variantes típicamente pueden comprender una secuencia que tenga una identidad de secuencia con uno de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente, o con una de las proteínas o péptidos o secuencias, si se codifican por la secuencia de ácido nucleico inventivo, de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de preferencia al menos 70%, de mayor preferencia al menos 80%, igualmente de mayor preferencia al menos 85%, incluso de mayor preferencia al menos 90% y con la máxima preferencia al menos 95% o incluso 97%, 98% ó 99%, con la secuencia tipo silvestre total, ya sea a nivel de ácido nucleico o a nivel de aminoácidos .
Los "fragmentos" de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención (por ejemplo, según se codifican por la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente) pueden comprender una secuencia de una proteina o péptido como se define en la presente, el cual, con respecto a su secuencia de aminoácido (o su molécula de ácido nucleico codificado) , se compara N-terminal, C-terminal y/o intra-secuencialmente truncado/acortado con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (natural) (o su molécula de ácido nucleico codificado) . Este truncamiento de esta forma se puede presentar ya sea al nivel de aminoácidos o correspondientemente al nivel de ácido nucleico. Una identidad de secuencia con respecto a este fragmento, como se define en la presente por lo tanto de preferencia puede hacer referencia a la proteina o péptido total, como se define en la presente o a la molécula de ácido nucleico total (codificante) de esta proteína o péptido. Asimismo, las "fragmentos" de ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención, pueden comprender una secuencia de un ácido nucleico como se define en la presente, el cual, con respecto a su molécula de ácido nucleico se compara truncado/acortado 5'-, 3'- y/o intra-secuencialmente con la molécula de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico original (natural) . Una identidad de secuencia con respecto a este fragmento como se define en la presente por lo tanto de preferencia puede hacer referencia al ácido nucleico total, como se define en la presente y el nivel de identidad de secuencia preferido como se indica en el presente. Los fragmentos tienen la misma función biológica o actividad especifica o al menos conservan una actividad de la proteina de longitud total natural de al menos 50%, de mayor preferencia al menos 70%, incluso de mayor preferencia al menos el 90% (según se mide en un ensayo funcional adecuado, por ejemplo, mediante la cuantificación de la respuesta a linfocitos B del organismo) en comparación con el péptido o proteina natural de longitud total, por ejemplo su propiedad antigénica especifica. Por consiguiente, en una modalidad preferida, el "fragmento" es una porción de la proteina antigénica de longitud completa, que ejerce propiedades antigénicas sobre el sistema inmunitario como se describe en la presente.
Los fragmentos de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención (por ejemplo, según se codifican por la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente) además pueden comprender una secuencia de una proteína o péptido como se define en la presente, que tenga una longitud entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo, los fragmentos según se procesan y presentan mediante las moléculas clase I de HC, de preferencia que tengan una longitud entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo, 8, 9, ó 10, (o incluso 6, 7, 11, ó 12 aminoácidos), o fragmentos según se procesan y presentan mediante las moléculas clase II de MHC, que tengan de preferencia una longitud entre aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, en donde se pueden seleccionar estos fragmentos a partir de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos típicamente están reconocidos por linfocitos T en la forma de un complejo que consiste del fragmento peptídico y una molécula de MHC, es decir, los fragmentos típicamente no son reconocidos en su forma natural. Los fragmentos de proteínas o péptidos, según se define en la presente, pueden comprender al menos un epítope de aquellas proteínas o péptidos. Además también se puede entender que los dominios de una proteína, similares al dominio extracelular , el dominio intracelular o el dominio transmembrana y las versiones acortadas o truncadas de una proteína comprenden un fragmento de una proteína.
Los fragmentos de proteínas o péptidos, como se definen en la presente (por ejemplo, según se codifican por la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente) también pueden comprender epítopes de estas proteínas o péptidos. Los epítopes de linfocitos T o partes de proteínas, en el contexto de la presente invención, pueden comprender fragmentos que de preferencia tienen una longitud entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo, los fragmentos según se procesan y presentan por las moléculas clase I de MHC, de preferencia que tengan una longitud entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo, 8, 9, ó 10, (o incluso 6, 7, 11, ó 12 aminoácidos), o fragmentos según se procesan y presentan por las moléculas clase II de MHC, de preferencia que tengan una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, en donde estos fragmentos se pueden seleccionar de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos típicamente se reconocen por los linfocitos T en la forma de un complejo que consiste del fragmento peptídico y una molécula de MHC, es decir, los fragmentos típicamente no se reconocen en su forma natural .
Los epítopes de linfocitos B típicamente son fragmentos ubicados en la superficie externa de una proteína (natural) o antígenos peptídicos, como se define en la presente, de preferencia que tengan 5 hasta 15 aminoácidos, de mayor preferencia que tengan 5 hasta 12 aminoácidos, incluso de mayor preferencia que tengan 6 hasta 9 aminoácidos, que se puedan reconocer por anticuerpos, es decir, en su forma natural.
Estos epítopes de proteínas o péptidos además se pueden seleccionar de cualquiera de las variantes mencionadas en la presente de estas proteínas o péptidos. En este contexto los determinantes antigénicos pueden ser epítopes conformacionales o discontinuos que están compuestos de segmentos de las proteínas o péptidos como se define en la presente, que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos como se define en la presente, pero están reunidos en la estructura tridimensional o continuos o los epítopes lineales que están compuestos de una cadena individual de polipéptidos .
Las "variantes" de proteínas o péptidos, como se definen en el contexto de la presente invención pueden estar codificados por la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente. Con esto, se puede generar una proteína o péptido, que tenga una secuencia de aminoácidos que difiera de la secuencia original en una o más mutaciones (2, 3, 4, 5, 6, 7, o más), tal como uno o más aminoácido sustituidos, insertados y/o suprimidos. El nivel preferido de la identidad de secuencia de las "variantes" en vista de la secuencia de proteínas de longitud total, típicamente es como se indica en la presente. De preferencia, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad especifica o al menos conservan una actividad de la proteina de longitud total y natural de al menos 50%, de mayor preferencia al menos 70%, incluso de mayor preferencia al menos 90% (según se mide en un ensayo funcional adecuado, por ejemplo, mediante la cuantificación de la respuesta inmune a linfocitos B del organismo) en comparación con el péptido o proteina natural de longitud total, por ejemplo su propiedad antigénica especifica. Por consiguiente, en una modalidad preferida, la "variante" es una variante de la proteina antigénica de longitud total, que ejerce propiedades antigénicas sobre el sistema inmune al grado como se describe en la presente.
Las "variantes" de proteínas o péptidos como se define en el contexto de la presente invención (por ejemplo, según se codifican por un ácido nucleico como se define en la presente) pueden comprender sustitución de aminoácidos conservadores en comparación con su secuencia fisiológica natural, es decir, no mutada. Aquellas secuencias de aminoácidos, así como sus secuencias de nucleótidos codificantes, en particular, quedan bajo el término de variantes, como se define en la presente. Las sustituciones en las cuales los aminoácidos, que se originan de la misma clase, se intercambian entre sí, se denominan sustituciones conservadoras. En particular, estos son aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos, las cadenas laterales de las cuales pueden ingresar en puentes de hidrógeno, por ejemplo, cadenas laterales que tengan una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido que tenga una cadena lateral polar se reemplaza por otro aminoácido que tenga asimismo una cadena lateral polar, o, por ejemplo, un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrofóbica está sustituido por otro aminoácido que tenga asimismo una cadena lateral hidrofóbica (por ejemplo, serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles inserciones y sustituciones, en particular, en esas posiciones de las secuencias que no provocan modificación a la estructura tridimensional o no afectan la región de unión. Las modificaciones a la estructura tridimensional mediante inserciones o supresiones se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, utilizando espectros CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam) .
Además, las variantes de proteínas o péptidos, como se definen en la presente, que se pueden codificar por la secuencia de ácido nucleico inventivo," como se define en la presente, también pueden comprender aquellas secuencias, en donde los nucleótidos del ácido nucleico se intercambian de acuerdo con la degeneración del código genético, sin conducir a una alteración de la secuencia de aminoácidos respectiva de la proteina o péptido, es decir, la secuencia de aminoácidos o al menos parte de la misma puede no ser diferente de la secuencia original en una o más mutaciones dentro del significado anterior.
Para determinar el porcentaje al cual son idénticas las dos secuencias, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico o las secuencias de aminoácidos como se define en la presente, de preferencia las secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o las secuencias de aminoácidos por si mismas, las secuencias pueden estar alineadas para que se comparen posteriormente entre si. Por lo tanto, por ejemplo, una posición de la primera secuencia se puede comparar con la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo componente, como es el caso en una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esta posición. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esta posición. Si las inserciones se presentan en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar separaciones en la primera secuencia para permitir un alineamiento adicional. Si se presentan supresiones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar separaciones en la segunda secuencia para permitir un alineamiento adicional. El porcentaje al cual las dos secuencias son idénticas luego es una función del número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones incluyendo aquellas posiciones que estén ocupadas únicamente en una secuencia. El porcentaje al cual las dos secuencias son idénticas se puede determinar utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, aunque no limitante, de un algoritmo matemático que se puede utilizar es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 o Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Este algoritmo está integrado en el programa BLAST . Las secuencias que son idénticas a las secuencias de la presente invención a cierto grado se pueden identificar mediante este programa .
La secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente puede codificar para los derivados de un péptido o proteina. Este derivado o péptido o proteína es una molécula que se deriva de otra molécula, tal como el péptido o proteina. Un "derivado" típicamente contiene la secuencia de longitud total del péptido o proteína natural y las características adicionales de la secuencia, por ejemplo en el término N o en el término C, que pueden exhibir una función adicional para el péptido/proteina de longitud total natural. Nuevamente estos derivados tienen la misma función biológica o actividad específica o al menos conservan una actividad de la proteína de longitud total natural de al menos el 50%, de mayor preferencia al menos 70%, incluso de mayor preferencia al menos 90% (según se mide en un ensayo funcional adecuado) , por ejemplo, su propiedad antigénica específica. Mediante esto, un "derivado" también abarca proteínas/péptidos de fusión (quiméricos) que comprenden un péptido o proteína utilizado en la presente invención o una proteína de longitud total natural (o una variante o fragmento de la misma) fusionada a un péptido/proteina distinto otorgando, por ejemplo, dos o más funciones biológicas al péptido/proteina de fusión. Por ejemplo, la fusión comprende una etiqueta, tal como, por ejemplo, un epitope, por ejemplo, un epitope FLAG o un epitope V5 o un epitope HA. Por ejemplo, el epitope es un epitope FLAG. Esta marca es útil para, por ejemplo, purificar la proteína de fusión .
En este contexto, una "variante" de una proteína o péptido puede tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de aminoácidos con respecto a un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 aminoácidos de esta proteína o péptido. Análogamente, una "variante", o particularmente, un "fragmento" de una secuencia de ácido nucleico pueden tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de nucleótidos con respecto a un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 ó 100 nucleótidos de esta secuencia de ácido nucleico; sin embargo, típicamente haciendo referencia a las secuencias de longitud total de origen natural. En el caso de los "fragmentos" típicamente, la identidad de secuencia se determina para el fragmento sobre la longitud (del fragmento) en la porción de la proteína de longitud total (reflejando la misma longitud que el fragmento) , que exhibe el mayor nivel de identidad de secuencia.
En una modalidad preferida adicional del primer aspecto de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico inventivo está asociada con un vehículo, agente de transfección o complejación para aumentar la eficiencia de transfección y/o las propiedades inmunoestimuladoras de la secuencia de ácido nucleico inventivo. Los agentes particularmente preferidos en este contexto adecuados para aumentar la eficiencia de transfección, son compuestos catiónicos o policatiónicos, que incluyen protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros péptidos o proteínas catiónicos, tales como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, polipéptidos básicos, péptidos para penetración celular (CPP) , que incluyen péptidos de unión a VIH, VIH-1 Tat (VIH) , péptidos derivados de Tat, Penetratin, péptidos derivados o análogos de VP22 (Herpes simplex) , MAP, KALA o dominios para transduccion proteínica (PTD) , PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, MPG-péptidos , Pep-1, L-oligómeros , péptidos de calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia (en particular de Drosophila antennapedia) , pAntp, plsl, FGF, Lactoferrin, Transportan, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(l), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, o histonas. Adicionalmente, las proteínas o péptidos catiónicos o policatiónicos preferidos se pueden seleccionar de las siguientes proteínas o péptidos que tengan la siguiente fórmula total: (Arg) x; (Lys)m; (His) n; (Orn) D; (Xaa) x, en donde 1 + m + n +o + x = 8-15, y 1, m, n u o independientemente entre si puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, con la condición de que el contenido general de Arg, Lys, His y Orn represente al menos el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos naturales (= de origen natural) o no naturales de Arg, Lys, His o Orn; y x puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3 ó 4, con la condición de que el contenido general de Xaa no excede el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido . Los péptidos catiónicos particularmente preferidos en este contexto son por ejemplo, Arg7, Arg8, Arg9, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, ( RKH ) , Y(RKH)2R, etc., los compuestos catiónicos o policatiónicos preferidos adicionales, que se pueden utilizar como un agente de transfección pueden incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo, quitosán, polibreno, polímeros catiónicos, por ejemplo, polietilenimina (PEI), lipidos catiónicos, por ejemplo, DOT A: cloruro de [1- (2 , 3-sioleiloxi ) propil ) ]-N, , N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS : Dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI : bromuro de dimiristo-oxipropildimetilhidroxietilamonio, DOTAP: dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) propaneo DC-6-14: cloruro de 0,0-ditetradecanoil-N- ( -trimetilamonioacetil) dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-[ (2, 3-dioctadeciloxipropil) (2-hidroxietil) ]-dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi ) etil]trimetilamonio, CLIP9 : rac-[2 (2 , 3-dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxi ) etil]-trimet lamonio, oligofectamina, o polímeros catiónicos o policatiónicos, por ejemplo, poliaminoácidos modificados, tales como polímeros de ß-aminoácídos o poliamidas inversas, etc., polietilenos modificados, tales como PVP (bromuro de poli (N-etil-4-vinilpiridinio) ) , etc., acrilatos modificados, tales como pDMAEMA (metilacrilato de poli (dimetilaminoetilo) ) , etc., amidoaminas modificadas tales como pAMAM (poli (amidoamina) ) , etc., polibeta-aminoéster modificado (PBAE), tal como polímeros de 1/4-butandioldiacrilato-co-5-amino-l-pentanol modificados en el extremo de diamina etc., dendrímeros, tales como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros a base de pAMAM, etc., poliiminas, tales como PEI: poli (etilenimina) , poli (propilenimina) , etc., polialilamina, polímeros a base de una estructura de azúcar, tales como polímeros a base de ciclodextrina, polímeros a base de dextrano, quitosán, etc., polímeros a base de una estructura de silano, tales como copolímeros de PMOXA-PD S, etc., polímeros en bloque que consisten de una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ejemplo, seleccionados de un polímero catiónico, como se mencionó anteriormente) y uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (por ejemplo, polietilenglicol ) / etc.
En este contexto, en particular se prefiere que el ácido nucleico inventivo esté complejado al menos parcialmente con un compuesto catiónico o policatiónico, de preferencia proteínas o péptidos catiónicos. Parcialmente significa que sólo una parte del ácido nucleico inventivo esté complejado con un compuesto catiónico o policatiónico y que el resto del ácido nucleico inventivo esté en forma no complejada ("libre"). De preferencia, la proporción de ácido nucleico complejado a: ácido nucleico libre se selecciona de una variación, de aproximadamente 5:1 (p/p) hasta aproximadamente de 1:10 (p/p), de mayor preferencia de una variación entre aproximadamente 4:01 (p/p) hasta aproximadamente 1: 8 (p/p), incluso de mayor preferencia de una variación entre aproximadamente 3:01 (p/p) hasta aproximadamente 1: 5 (p/p) o 1:3 (p/p) , y con la máxima preferencia la proporción de ácido nucleico complejado a ácido nucleico libre se selecciona de una proporción de aproximadamente 1:1 (p/p).
Se prefiere que la secuencia de ácido nucleico de la invención se proporcione, en forma ya sea pura o complejada, por ejemplo, mediante compuestos policatiónicos de cualquier estructura química, de preferencia (poli ) péptidos policatiónicos o compuestos policatiónicos sintéticos. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico no se proporciona junto con una célula de empaquetamiento.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición o un kit o un kit de partes que comprende una pluralidad o más de una, de preferencia 2 hasta 10, de mayor preferencia 2 hasta 5, con la máxima preferencia 2 hasta 4 de las secuencias de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente. Estas composiciones inventivas comprenden más de una de las secuencia de ácido nucleico inventivo, de preferencia que codifican para diferentes péptidos o proteínas que comprenden de preferencia diferentes antígenos patogénicos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos .
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención también proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado que comprende los pasos de, por ejemplo, a) proporcionar la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, b) aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente a un sistema de expresión, por ejemplo, a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ejemplo, una célula hospedera para expresión o una célula somática) , un tejido o un organismo. El método se puede aplicar para laboratorio, para investigación, para diagnóstico, para producción comercial de péptidos o proteínas y/o para fines terapéuticos. En este contexto, típicamente después de preparar la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, típicamente se aplica o administra a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ejemplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo, por ejemplo, en forma pura o complejada o como una composición farmacéutica o vacuna como se describe en la presente, de preferencia vía transfección o al utilizar cualquiera de los modos de administración descritos en la presente. El método se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. El método además se puede llevar a cabo en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, en particular en el tratamiento de enfermedades infecciosas, de preferencia como se define en la presente.
En este contexto, in vitro se define en la presente como la transfección o transducción del ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de las secuencias de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente en células en cultivo fuera de un organismo; in vivo se define en la presente como la transfección o transducción del ácido nucleico inventivo o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de las secuencias de ácido nucleico inventivo en células mediante la aplicación del ácido nucleico inventivo o de la composición inventiva al organismo entero o individuo y ex vivo se define en la presente como la transfección o transducción del ácido nucleico inventivo o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo en células fuera de un organismo o individuo y la posterior aplicación de las células transfectadas al organismo o individuo.
Asimismo, de acuerdo con otro aspecto, la presente invención también proporciona el uso de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de las secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, de preferencia para fines de diagnóstico o terapéuticos, para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado, por ejemplo, al aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de las secuencias de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, por ejemplo, a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ejemplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática) , un tejido o un organismo. El uso se puede aplicar para laboratorio, para investigación, para diagnóstico para producción comercial de péptidos o proteínas y/o para fines terapéuticos. En este contexto, típicamente después de preparar la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de las secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, típicamente se aplica o administra a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ejemplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática) , un tejido o un organismo, de preferencia en forma pura o complejada, o como una composición farmacéutica o vacuna como se describe en la presente, de preferencia vía transfección o al utilizar cualquiera de los modos de administración como se describe en la presente. El uso se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. El uso además se puede llevar a cabo en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, en particular en el tratamiento de enfermedades infecciosas, de preferencia como se define en la presente.
Todavía en otro aspecto, la presente invención también se relaciona con un sistema de expresión inventivo que comprende una secuencia de ácido nucleico inventivo o un vector o plásmido de expresión de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. En este contexto, el sistema de expresión puede ser un sistema de expresión libre de células (por ejemplo, un sistema de transcripción/traducción in vitro) , un sistema de expresión celular (por ejemplo, células CHO similares a células mamíferas, células de insectos, células de levadura, células bacterianas similares a E. coli) u organismos utilizados para la expresión de péptidos o proteínas (por ejemplo, plantas o animales, similares a vacas) .
Adicionalmente, de acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se relaciona con el uso del ácido nucleico inventivo como se define en la presente o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo (lo cual significa típicamente más de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más de 10 ácidos nucleicos, por ejemplo, 2 hasta 10, de preferencia de 2 hasta 5 ácidos nucleicos) como se define en la presente para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado, por ejemplo, para tratar una enfermedad infecciosa, de preferencia, como se define en la presente, por ejemplo, al aplicar o administrar el ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente a una célula (por ejemplo, una célula huésped de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo, de preferencia en forma pura o complejada o como una composición farmacéutica o vacuna como se describe en la presente, de mayor preferencia utilizando cualquiera de los modos de administración como se describe en la presente.
Por consiguiente, en un aspecto preferido particular, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica, que comprende un ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, o una composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente y, opcionalmente, un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable .
Como un primer ingrediente, la composición farmacéutica de la invención comprende al menos un ácido nucleico inventivo, como se define en la presente.
Como un segundo ingrediente de la composición farmacéutica de la invención opcionalmente puede comprender al menos un componente farmacéuticamente activo adicional. Un componente farmacéuticamente activo en este contexto es un compuesto que tiene un efecto terapéutico para sanar, disminuir o evitar una infección o enfermedad particular, como se menciona en la presente, de preferencia enfermedades infecciosas. Estos compuestos incluyen, sin implicar ninguna limitación, péptidos o proteínas, de preferencia como se definen en la presente, ácidos nucleicos, de preferencia tal como se definen en la presente, compuestos orgánicos o inorgánicos de bajo peso molecular (terapéuticamente activo) (peso molecular menor de 5000, de preferencia menor de 1000) , azúcares, antígenos o anticuerpos, de preferencia, como se define en la presente, agentes terapéuticos ya conocidos en la técnica anterior, células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares; componentes de pared celular (por ejemplo, polisacáridos) , patógenos modificados, atenuados o desactivados (por ejemplo, químicamente o mediante irradiación) (virus, bacterias, etc. ) , adyuvantes, de preferencia como se define en la presente, etc.
Además, la composición farmacéutica inventiva puede comprender un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. En el contexto de la presente invención, un portador farmacéuticamente aceptable típicamente incluye la base liquida o no liquida de la composición farmacéutica inventiva. Si la composición farmacéutica inventiva se proporciona en forma liquida, el portador típicamente será agua libre de pirógenos; solución salina isotónica o soluciones amortiguadas (acuosas) , por ejemplo, fosfato, citrato, etc., soluciones amortiguadas. El tampón de inyección puede ser hipertónico, isotónico o hipotónico con referencia al medio de referencia específico, es decir, el tampón puede tener1 un mayor, idéntico o menor contenido de sal con referencia al medio de referencia específico, en donde de preferencia estas concentraciones de las sales mencionadas anteriormente se pueden utilizar, pero sin conducir al daño de las células debido a osmosis u otros efectos de concentración. Los medios de referencia son, por ejemplo líquidos que se presentan en métodos "in vivo" tales como, sangre, linfas, líquidos citosólicas, u otros líquidos corporales, o por ejemplo, líquidos, que se puedan utilizar como medios de referencia en métodos "in vitro" tales como tampones o líquidos comunes. Estos tampones o líquidos comunes se conocen por un experto. En particular se prefiere como una base líquida la solución de Ringer-Lactato.
Sin embargo, se pueden utilizar uno o más materiales de relleno o diluyentes sólidos o líquidos compatibles o compuestos encapsulantes para la composición farmacéutica inventiva, que sean adecuados para administración a un paciente que será tratado. El término "compatible", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa que estos constituyentes de la composición farmacéutica inventiva son capaces de ser mezclados con el ácido nucleico inventivo, como se define en la presente de tal forma que no se presente ninguna interacción que pudiera reducir sustancialmente la efectividad farmacéutica de la composición farmacéutica inventiva bajo condiciones típicas de uso.
De acuerdo con una modalidad específica, la composición farmacéutica inventiva puede comprender un adyuvante. En este contexto, se puede entender como un adyuvante cualquier compuesto, que sea adecuado para iniciar o aumentar una respuesta inmune del sistema inmune innato, es decir, una respuesta inmune no específica. En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica inventiva de preferencia produce una respuesta inmune innata debido al adyuvante, opcionalmente contenida en la misma. De preferencia, este adyuvante se puede seleccionar de un adyuvante conocido por un experto y que sea adecuado para el caso presente, es decir, que soporte la inducción de una respuesta inmune innata en un mamífero, por ejemplo, una proteína adyuvante, como se definió anteriormente o un adyuvante como se define en los siguiente.
Los compuestos catiónicos o policatiónicos se prefieren particularmente como adyuvantes adecuados para el depósito y suministro, como se describió anteriormente para la secuencia de ácido nucleico inventivo como un vehículo, agente de transfección o de complej ación .
La composición farmacéutica inventiva adicionalmente puede contener una o más sustancias auxiliares para aumentar su inmunogenicidad o capacidad inmunoestimuladora, si se desea. De preferencia mediante esto se alcanza una acción sinérgica de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente y de una sustancia auxiliar, que puede estar contenida opcionalmente en la composición farmacéutica inventiva. Dependiendo de los diversos tipos de sustancias auxiliares, con respecto a esto entran en consideración diversos mecanismos. Por ejemplo, los compuestos que permitan la maduración de células dendríticas (DC) , por ejemplo lipopolisacáridos , ligandos TNF-alfa o CD40, forman una primera clase de sustancias auxiliares adecuadas. En general, es posible utilizar como sustancia auxiliar cualquier agente que influye en el sistema inmune en la forma de una "señal de peligro" (LPS, gp96, etc.) o citoquinas, tales como GM-CFS, que permitan que una respuesta inmune se mejore y/o esté influida en una forma dirigida. Las sustancias auxiliares particularmente preferidas son citoquinas, tales como, monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimiocinas, que estimulan adicionalmente la respuesta inmune innata, tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta o TNF-alfa, factores de crecimiento, tales como hGH.
Los aditivos adicionales que pueden estar incluidos en la composición farmacéutica inventiva son emulsionantes, tales como, por ejemplo, Tween® ; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes para impartir sabor, portadores farmacéuticos; agentes formadores de tabletas; estabilizantes; antioxidantes; conservadores.
La composición farmacéutica inventiva también puede contener adicionalmente cualquier compuesto adicional, que se conoce que será inmunoestimulador debido a su afinidad de unión (como ligandos) para receptores similares a Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, o debido a su afinidad de unión (como ligandos) para receptores similaresa Toll-murino TLR1, TLR2 , TLR3, TLR4 , TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 , TLR9, TLR10, TLR1 1, TLR12 o TLR13.
La composición farmacéutica inventiva se puede administrar oral, parenteral, mediante aerosol para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginalmente o vía un depósito implantado. El término parenteral, en el sentido en el que se utiliza en la presente, incluye técnicas de inyección o infusión subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intra-articulares, intra-sinoviales, intraesternales, intratecales, intrahepáticas , intralesionales , intracraneales, transdérmicas , intradérmicas , intrapulmonales , intraperitoneales , intracardiacas, intra-arteriales , y sublinguales.
De preferencia, la composición farmacéutica inventiva se puede administrar mediante inyección parenteral, de mayor preferencia mediante inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonal , intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial , y sublingual o via técnicas de infusión. En particular se prefiere la inyección intradérmica e intramuscular. Las formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en este campo utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión.
La composición farmacéutica inventiva como se define en la presente, también se puede administrar oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, de manera enunciativa, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas.
La composición farmacéutica inventiva también se puede administrar tópicamente, en especial cuando el blanco de trabamiento incluya áreas u órganos a los que tenga fácil acceso mediante una aplicación tópica, por ejemplo, incluyendo las enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica inventiva se puede formular en un ungüento adecuado, que contenga el ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, suspendido o disuelto en uno o más portadores .
La composición farmacéutica inventiva comprende típicamente una "cantidad segura y efectiva" de los componentes de la composición farmacéutica inventiva, en particular de las secuencias de ácido nucleico inventivo, tal como se define en la presente. En el sentido en el que se utiliza en la presente, una "cantidad segura y efectiva" significa una cantidad de las secuencias de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, de tal forma que sea suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno, como se define en la presente. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y efectiva" es tan peque_ña que evite efectos secundarios graves y permita una relación sensible entre ventaja y riesgo. La determinación de estos limites típicamente queda dentro del alcance del juicio médico sensible .
La composición farmacéutica inventiva se puede utilizar para un ser humano y también para fines médicos veterinarios, de preferencia para fines médicos humanos, como una composición farmacéutica, en general, o como una vacuna.
De acuerdo con otro aspecto particularmente preferido, la composición farmacéutica inventiva (o la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o la composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente) se puede proporcionar o utilizar como una vacuna. Típicamente, esta vacuna es como se definió anteriormente para las composiciones farmacéuticas. Adicionalmente, esta vacuna típicamente contiene el ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o la composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente .
La vacuna inventiva también puede comprender un portador, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptables, como se define en la presente para la composición farmacéutica inventiva. En el contexto específico de la vacuna inventiva, la elección de un portador farmacéuticamente aceptable se determina, en principio, por la forma en la cual la vacuna administre. La vacuna inventiva se puede administrar, por ejemplo, sistémica o localmente. Las rutas para administración sistémica, en general, incluyen, por ejemplo, rutas transdérmicas , orales, parenterales , incluyendo subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarteriales , intradérmicas e inyecciones intraperitoneales y/o rutas de administración intranasal. Las rutas para administración local en general incluyen, por ejemplo, rutas de administración tópica, aunque también intradérmica, transdérmica, subcutánea, o inyecciones intramusculares o inyecciones intralesionales , intracraneales, intrapulmonales, intracárdicas y sublinguales. De mayor preferencia, las vacunas se pueden administrar mediante una ruta intradérmica, subcutánea, o intramuscular. Por lo tanto, las vacunas inventivas de preferencia se formulan en forma liquida (o, algunas veces en forma sólida) .
La vacuna inventiva adicionalmente puede contener una o más sustancias auxiliares para aumentar su inmunogenicidad o capacidad inmunoestimuladora, si se desea. En particular se prefieren los adyuvantes como sustancias auxiliares o aditivos como se define para la composición farmacéutica .
La presente invención proporciona, además, diversas aplicaciones y usos de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, de la composición farmacéutica inventiva, de la vacuna inventiva, comprendiendo toda la secuencia de ácido nucleico inventivo como se define en la presente o los kits que comprenden las mismas .
De acuerdo con un aspecto especifico, la presente invención se dirige al primera uso médico de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente como un medicamento, de preferencia como una vacuna particularmente en el tratamiento de enfermedades infecciosas .
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se dirige al segundo uso médico de la secuencia de ácido nucleico inventivo como se define en la presente o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, para el tratamiento de enfermedades infecciosas como se define en la presente, de preferencia para el uso de la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, de una composición farmacéutica o vacuna que comprende la misma o de los kits que comprenden la misma para la preparación de un medicamento para la profilaxis, tratamiento y/o mejora de enfermedades infecciosas, como se definen en la presente. De preferencia, la composición farmacéutica o una vacuna se utiliza o se administra a un paciente que necesite de la misma para este fin.
De preferencia, las enfermedades infecciosas como se menciona en la presente de preferencia se seleccionan de enfermedades infecciosas virales, bacterianas, protozoológico y priónicas. Estas enfermedades infecciosas típicamente se seleccionan de la lista que consiste de infecciones por Acinetobacter , enfermedad africana del sueño (tripanosomiasis africana) , SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) , Amoebiasis, Anaplasmosis, Anthrax, Appendicitis , infecciones por Arcanobacterium haemolyticum, fiebre hemorragia Argentina, Ascariasis, Aspergillosis , infecciones por Astrovirus, pie de atleta, Babesiosis, infecciones por Bacillus cereus, meningitis bacteriana, pneumonía bacteriana, vaginosis bacteriana (BV) , infecciones Bacteroides, Balantidiasis , infecciones por Baylisascaris, Bilharziosis , infecciones por virus BK, piedra negra, infecciones por Blastocystis hominis, Blastomycosis , fibre hemorrágica boliviana, infecciones por Borrelia (Borreliosis ) , Botulismo (y botulismo infantil) , cestodo bovino, fiebre hemorrágica brasileña, Brucellosis, infecciones por Burkholderia, úlcera de Buruli, infecciones por Calicivirus (Norovirus y Sapovirus) , Campylobacteriosis , Candidiasis (Candidosis) , infecciones por cestodo canino, enfermedad por arañazo de gato, enfermedad de Chagas (tripanosomiasis Americana) , Chancroide, varicela, infecciones por clamida, infecciones por Chlamydia trachomatis, infecciones por Chlamydophila pneumoniae, Cólera, Chromoblastomycosis, bubón climático, Clonorquiasis , infecciones por Clostridium difficile, Coccidioidomycosis , catarro, fiebre por garrapatas de Colorado (CTF) , resfriado común (rinofaringitis viral aguda; coryza agudo) , Condyloma acuminata, Conj unctivitis , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , fiebre hemorrágica de Crimean-Congo (CCHF) , Cryptococcosis , Cryptosporidiosis, larva migran cutánea (CLM) , Leishmaniosis cutánea, Ciclosporiasis , Cisticercosis , infecciones por citomegalovirus, fiebre del dengue, dermatofitosis, Dientamoebiasis, Difteria, Difilobotriasis, Donavanosis, Dracunculiasis , meningoencephalitis de verano temprano (FSME), fiebre hemorrágica por Ebola, Echinococcosis , Ehrlichiosis , Enterobiasis (infecciones por Pinworm) , infecciones por Enterococcus, infecciones por Enterovirus, tifus epidémica, Epiglotitis, Mononucleosis infecciosa por el virus de Epstein-Barr, Eritema infeccioso (guinta enfermedad) , Exanthem subitum, Fasciolopsiasis , Fasciolosis, insomnia familiar fatal (FFI) , quinta enfermedad, Filariasis, envenenamiento por pescado (Ciguatera) , cestodo de pescado, gripe, envenenamiento de alimentos por Clostridium perfringens, cestodo de zorro, infecciones amebianas de crecimiento libre, infecciones por Fusobacterium, gangrena gaseosa, Geotricosis, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) , Giardiasis, Glanders, Gnathostomiasis , Gonorrhea, Granuloma inguinal (Donovanosis) , infecciones por estreptococos del Grupo A, infecciones por estreptococos Grupo B, infecciones por Haemophilus influenzae, enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) , síndrome pulmonar por Hantavirus (HPS) , infecciones por Helicobacter pylori, síndrome hemolítico-urémico (HUS) , Fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS) , infecciones por Henipavirus, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Herpes simplex, Herpes simplex tipo I, Herpes simplex tupo II, Herpes zoster, Histoplasmosis, verrugas huecas, infecciones por anquilostoma, infecciones por bocavirus humano, erliquiosis ewingii humana, anaplasmosis granulocítica humana (HGA) , infecciones por metapneumovirus humano, erliquiosis monocítico humano, infecciones por papilomavirus Humano (HPV) , infecciones por virus de parainfluenza humana, Hymenolepiasis , Influenza, Isosporiasis , encefalitis Japanesa, enfermedad de Kawasaki, Keratitis, infecciones por Kingella kingae, Kuru, Lambliasis (Giardiasis) , fiebre de Lassa, Legionellosis (enfermedad del Legionario, fiebre Pontiac) , Leishmaniasis , Lepra, Leptospirosis, piojo, Listeriosis, Lyme borreliosis, enfermedad de Lyme, filariasis Linfática (Elefantiasis) , coriomeningitis linfocítica, Malaria, fiebre hemorrágica por Marburg (MHF) , virus de Marburg, Sarampión, Melioidosis (enfermedad de Whitmore) , Meningitis, enfermedad Meningococal, Metagonimiasis , Microsporidiosis, cestodo miniatura, aborto (inflamación de la próstata), Molluscum contagiosum (MC) , Mononucleosis , paperas, tifus murino (tifus endémico) , Mycetoma, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumonía, Myiasis, dermatitis por pañal desechable/pañal de tela, conj unctivitis neonatal (Ophthalmia neonatorum) , sepsis neonatal (Chorioamnionitis ) , Nocardiosis, Noma, infecciones por el virus Norwalk, Oncocercosis (ceguera de los rios) , Osteomielitis, Otitis media, Paracoccidioidomycosis (blastomicosis de Sudamérica) , Paragonimiasis , Paratyphus, Pasteurellosis , Pediculosis capitis (Head lice) , Pediculosis corporis (piojos del cuerpo) , Pediculosis pubis (piojo púbico, liendre) , enfermedad inflamatoria pélvica ( PID) , Pertussis (tosferina) , fiebre glandular de Pfeiffer, plaga, infecciones por pneumococus, Pneumocystis pneumonía (PCP), Pneumonía, Polio (cojera infantil), Poliomielitis, cestodo porcino, infecciones por Prevotela, meningoencefalitis amebiana primaria (PAM), leucoencefalopatía multifocal progresiva, Pseudo-croup, Psittacosis, fiebre Q, fiebre de conejo, Rabia, fiebre por mordida de rata, síndrome de Reiter, infección por virus sincitial respiratorio (RSV) , Rhinosporidiosis , infecciones por Rinovirus, infecciones por Rickettsial , Rickettsialpox, fiebre amarilla (RVF) , fiebre manchada de las montañas rocosas (RMSF) , infecciones por Rotavirus, Rubéola, Salmonella paratyphus, Salmonella typhus, Salmonellosis , SARS (Síndrome Respiratorio Agudo Grave) sarna, escarlatina, Esquistosomiasis (Bilharziosis ) , Scrub typhus, Sepsis, Shigellosis (disintiera basilar) , Shingles, Smallpox (Viruela) , chancro suave, Sporotricosis, envenenamiento de alimentos por estafilococos, infecciones por estafilococos, Strongyloidiasis, sífilis, Taeniasis, Tétanos, fiebre de los tres días, encephalitis portada por garrpatas, Tinea barbae (picazón de Barber) , Tiña del cuero cabelludo (Tiña del cuerpo) , Tiña corporis (tiña del cuerpo) , Tiña cruris (picazón Jock) , Tiña de la mano (Tiña de la mano) , Tiña nigra, Tiña pedís (pie de atleta) , Tiña unguium (Onicomicosis ) , Tiña versicolor (Pityriasis versicolor), Toxocariasis (Larva Migrans Ocular (OLM) y Larva Migrans Visceral (VLM) ) , Toxoplasmosis, Triquinelosis , Tricomoniasis , Tricuriasis (infecciones del intestino grueso), Tripper, Trypanosomiasis (enfermedad del sueño) , enfermedad Tsutsugamushi, Tuberculosis, Tularemia, Tifo, fiebre por tipfo, infecciones por Ureaplasma urealyticum, Vaginitis (Colpitis) , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante (vCJD, nvCJD) , encefalitis equina Venezolana, fiebre hemorrágica Venezolana, neumonía viral, Leishmaniosis visceral, verrugas, Fiebre del Nilo occidental, encefalitis equina occidental, piedra blanca (Tiña blanca) , tosferina, puntos por hongos de levadura, fiebre amarilla, infecciones por Yersinia pseudotuberculosis , Yersiniosis, y Zygomycosis.
En un aspecto preferido adicional, la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, se puede utilizar para la preparación de una composición farmacéutica o una vacuna, de preferencia para los fines como se define en la presente.
La composición farmacéutica inventiva o vacuna, además, se pueden utilizar para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, de preferencia para enfermedades infecciosas, como se definen en el presente.
De acuerdo con un aspecto final, la presente invención también proporciona kits, en particular kits de partes. Estos kits, en particular kits de partes, típicamente comprenden como componentes solos o en combinación con componentes adicionales, tal como se define en la presente al menos una secuencia de ácido nucleico inventivo como se define en la presente, la composición farmacéutica inventiva o vacuna que comprende la secuencia de ácido nucleico inventivo. Al menos una secuencia un ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, es, por ejemplo, opcionalmente en combinación con componentes adicionales, tal como se define en la presente, con lo cual al menos un ácido nucleico de la invención se proporciona por separado (primera parte del kit) de al menos otra parte del kit que comprende uno o más de otros componentes. La composición farmacéutica inventiva y/o la vacuna inventiva por ejemplo se pueden presentar en uno o diferentes kit de partes. Como un ejemplo, por ejemplo, al menos un kit de partes puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, y al menos una parte adicional del kit al menos otro componente, como se define en la presente, por ejemplo, al menos otra parte del kit puede comprender al menos una composición farmacéutica o vacuna o una parte de la misma, por ejemplo, al menos una parte del kit puede comprender la secuencia de ácido nucleico inventivo, como se define en la presente, al menos una parte adicional del kit al menos otro componente, como se define en la presente, al menos una parte adicional del kit, al menos un componente de la composición farmacéutica inventiva o vacuna o la composición farmacéutica inventiva o vacuna como un todo, y al menos una parte adicional del kit por ejemplo, al menos un portador o vehículo farmacéutico, etc. En caso de que el kit o partes kit comprendan una pluralidad de secuencias de ácido nucleico inventivo (lo que significa típicamente más de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más de 10 ácidos nucleicos, por ejemplo, 2 hasta 10, de preferencia 2 hasta 5 ácidos nucleicos), un componente del kit puede comprender sólo una, diversas o todas las secuencias de ácido nucleico inventivo comprendidas en el kit. En una modalidad alternativa, cada secuencia de ácido nucleico inventivo puede estar comprendida en un componente diferente/separado del kit de tal forma que cada componente forme una parte del kit. También, más de un ácido nucleico puede estar comprendido en un primer componente como parte del kit, mientras que uno o más de otros (segundo, tercero, etc.) componentes (que proporcionan uno o más kit de partes) ya sea pueden contener uno o más de los ácidos nucleicos inventivos, que pueden ser idénticos o parcialmente idénticos o diferentes del primer componente. El kit o el kit de partes además pueden contener las instrucciones técnicas con la información sobre la administración y dosificación de la secuencia de ácido nucleico inventivo, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna inventiva o de cualquiera de sus componentes o partes, por ejemplo, si el kit se prepara como una kit de partes.
Tomada conjuntamente, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly (A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociado con una enfermedad infecciones que sea una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácido nucleico. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado que comprende los pasos de proporcionar una secuencia de ácido nucleico o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa gue es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , una infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de hepatitis B (HBV) , tuberculosis ycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprenden además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo .
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antigeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la Hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, incluso de mayor preferencia el antigeno se selecciona del antigeno p24 del VIH, proteínas con envoltura del VIH (Gpl20 , gp41, Gpl 60), poliproteína GAG, proteína Nef de factor negativo, trans-activador de transcripción Tat si la enfermedad infecciosa es VIH, de preferencia una infección con el virus de la inmunodeficiencia humana. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar una secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, incluso de mayor preferencia el antigeno se selecciona de la proteina OMP de membrana externa mayor, la proteina de membrana externa PMPC probable, proteina compleja de membrana externa B OmcB, proteínas de choque térmico Hsp60 HSP10, proteína IncA, proteínas provenientes del sistema de secreción tipo III, proteína de cadena pequeña de reductasa y ribonucleótido NrdB, proteína plasmídica Pgp3, proteína externa de clamida N CopN, antígeno CT521, antígeno CT425, antígeno CT043, antígeno TC0052, antígeno TC0189, antígeno TC0582, antígeno TC0660, antígeno TC0726, antígeno TC0816, antígeno TC0828 si la enfermedad infecciosa es una infección con Chlamydia trachomatis. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo .
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly (A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (SV), virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis ycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, incluso de mayor preferencia el antigeno se selecciona del antigeno pp65, proteina de membrana ppl5, proteina tegumental cápside-proximal ppl50, proteina M45, ADN polimerasa UL54, helicasa UL105, glucoproteina gM, glucoproteina gN, glucoproteina H, glucoproteina B gB, proteina UL83, proteina UL94, proteina ÜL99 si la enfermedad infecciosa es una infección por Citomegalovirus, de preferencia una infección con citomegalovirus (CMV) . La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociado con una enfermedad que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección protozoaria, una infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , Virus de herpes simplex (HSV) , virus de papiloma humano (HPV) , Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis , Cytomegalovirus (CMV) , virus de Hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y el Virus de fiebre amarilla, incluso de mayor preferencia el antigeno se selecciona de la proteina C con cápside, proteina premembrana prM, proteína membrana M, proteina con envoltura E (dominio I, dominio II, dominio II), proteína NS1, proteína NS2A, proteína NS2B, proteína NS3, proteína NS4A, proteína 2K, proteína NS4B, proteína NS5 de preferencia una infección con los virus de dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 ) -Flavivirus . La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo .
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociado con una enfermedad que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección protozoaria, una infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , Virus de herpes simplex (HSV) , virus de papiloma humano (HPV) , Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, Cytomegalovirus (CMV) , virus de Hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y el Virus de fiebre amarilla, incluso de mayor preferencia el antigeno se selecciona del antigeno superficial hepatitis B HBsAg, antigeno núcleo de Hepatitis B HbcAg, polimerasa, proteina Hbx, proteina superficial media preS2, proteina superficial L, proteina larga S, proteina viral VP1, proteina viral VP2, proteina viral VP3, proteina viral VP4 si la enfermedad infecciosa es la Hepatitis B, de preferencia una infección con virus de hepatitis B (HBV) . La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo .
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , Virus de herpes simplex (HSV) , virus de papiloma humano (HPV) , Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, Cytomegalovirus (CMV) , virus de Hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y el Virus de fiebre amarilla, incluso de mayor preferencia el antígeno se selecciona de la proteína de replicación de El, proteína reguladora E2, proteína E3, proteína E4, proteína E5, proteina ?ß, proteina E7, proteína E8, proteína con cápside mayor Ll, proteína con cápside menor L2 si la enfermedad infecciosa es infección por papilomavirus humano (HPV) ; de preferencia una infección con papilomavirus humano (HPV) . La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenqa esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, el antígeno se selecciona incluso de mayor preferencia de proteína de fusión F, hemaglutinin-neuramidasa HN, glucoproteína G, proteína matriz M, fosfoproteína P, nucleoproteína N, polimerasa L, si la enfermedad infecciosa es la infección por el virus de la parainfluenza humana, de preferencia una infección con los virus de parainfluenza Humanos (HPIV) . La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo .
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una- secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteina comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antigeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antigeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, el antigeno se selecciona incluso de mayor preferencia de hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , nucleoproteina (NP) , proteina MI, proteina M2, proteina NS1, proteina NS2 (proteina NEP: proteina de exportación nuclear), proteina PA, proteina PB1 (proteina de polimerasa básica 1), proteina PB1-F2 y proteina PB2 (familia Ortomixoviridae, virus de Influenza (gripe) ) ; nucleoproteina N, proteina estructural grande L, fosfoproteina P, proteina de matriz M, glucoproteina G si la enfermedad infecciosa es la rabia, de preferencia una infección con el virus de la rabia; de mayor preferencia el antigeno se deriva de un virus de la Orthomyxoviridae, de mayor preferencia de un virus de influenza, lo de mayor preferencia de hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , nucleoproteina (NP) , uno o ambos de los matrixproteinas (MI) y (M2), las proteínas de la polimerasa (PB1), (PB2), y las proteínas NS1 y NS2. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) Una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios, un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antígeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis , citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, el antigeno se selecciona incluso de mayor preferencia proteína de fusión F, nucleoproteína N, proteína de matriz M, proteína de matriz M2-1, proteína de matriz M2-2, fosfoproteína P, proteína hidrofóbica pequeña SH, glucoproteína G de superficie mayor, polimerasa L, proteína 1 no estructural NS1, proteína 2 no estructural NS2 si la enfermedad infecciosa es la infección del virus sincitial respiratorio, de preferencia una infección con virus sincitial respiratorio (RSV) .
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteina comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antigeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antigeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, el antigeno incluso de mayor preferencia el antigeno se selecciona de antigeno secretorio SssA ( Staphylococcus genus; envenenamiento de alimentos estafilococal ) antigeno secretorio SssA (Staphylococcus genus; por ejemplo, infección por aureus, Staphylococcal ) ; chaperona molecular DnaK, lipoproteina Mpt83 de superficie celular, lipoproteina P23, proteina permeasa pstA del sistema de transporte de fosfato, antigeno de 14 kDa, proteina C de unión a fibronectina FbpCl, alanina deshidrogenasa TB43, glutamina sintetasa 1, proteina ESX-1, proteina CFP10, proteina TB10.4, proteina MPT83, proteina MTB12, proteina MTB8, proteínas similares a Rpf, proteína MTB32, proteína MTB39, cristalina, proteína de choque térmico HSP65, proteína PST-S si la enfermedad infecciosa es tuberculosis, de preferencia una infección con tuberculosis Mycobacterium. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para: a) una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteina; b) al menos un asa troncal de histona, y c) Una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteina comprende un antigeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antigeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa, de preferencia asociada con una enfermedad infecciosa que es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios , un infección por hongos o lo semejante, de mayor preferencia en donde el antigeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, el virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) ,. tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla, el antigeno se selecciona incluso de mayor preferencia de poliproteina genómica, proteina E, proteina M, proteina C con cápside, proteasa NS3, proteina NS1, proteina NS2A, proteina AS2B, proteina NS4A, proteina NS4B, proteina NS5, si la enfermedad infecciosa es la fiebre amarilla, de preferencia una infección con el virus de fiebre amarilla. La invención proporciona además una composición o kit o un kit de partes que comprende al menos una de estas secuencias de ácidos nucleicos. Además, la invención proporciona el uso de esta secuencia de ácido nucleico tales como un medicamento, de preferencia para el tratamiento de enfermedades infecciosas, de mayor preferencia en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para aumentar la expresión de un péptido o proteina codificado que comprende los pasos de proporcionar esta secuencia de ácido nucleico, o una composición que contenga esta secuencia de ácido nucleico y aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
En la presente invención, si no se indica de otra manera, las diferentes características de las alternativas y modalidades se pueden combinar entre sí. Además, el término "que comprende" no se debe interpretar con el significado de "que consiste de", si no se menciona específicamente. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, el término "que comprende" se puede sustituir con el término "que consiste de", cuando sea adecuado.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras se destinan para ilustrar la invención adicionalmente y no se deben interpretar como limitantes de la presente invención.
La figura 1: muestra la secuencia consensuada del asa troncal de histona generada a partir de secuencias del asa troncal de metazoarios y protozoarios (según se reporta por Dávila López, M . , & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi: 10.1261/rna.782308) . Se alinearon 4001 secuencias del asa troncal de histona provenientes de metazoarios y protozoarios y la cantidad de los nucleótidos que se presentan se indica para cada posición en la secuencia del asa troncal. La secuencia consensuada generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se proporciona utilizando el código de nucleótidos de una sola letra. Además de la secuencia consensuada, se muestran las secuencias que representan al menos el 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas .
La figura 2: muestra la secuencia consensuada del asa troncal de histona generada a partir de las secuencias del asa troncal de protozoarios (según se reporta por Dávila López, M . , & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi: 10.1261/rna.782308) . Se alinearon 131 secuencias del asa troncal de histonas provenientes de protozoarios y la cantidad de nucleótidos que se presentan se indica para cada posición en la secuencia del asa troncal. La secuencia consensuada generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se proporciona utilizando el código de nucleótidos de una sola letra. Además de la secuencia consensuada, se muestran las secuencias que representan al menos el 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 3: muestra la secuencia consensuada del asa troncal de histona generada a partir de las secuencias del asa troncal metazoarios (según se reporta por Dávila López, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi: 10.1261/rna.782308) . Se alinearon 3870 secuencias del asa troncal de histona de metazoarios y la cantidad de nucleotidos que se presentan se indica para cada posición en la secuencia del asa troncal. La secuencia consensuada generada que representa todos los nucleotidos presentes en las secuencias analizadas se proporciona utilizando el código de nucleotidos de una sola letra. Además de la secuencia consensuada, se muestran las secuencias que representan al menos el 99%, 95% y 90% de los nucleotidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 4: muestra la secuencia consensuada del asa troncal de histona generada a partir de las secuencias del asa troncal de vertebrados (según se reporta por Dávila López, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi: 10.1261/rna.782308) . Se alinearon 1333 secuencias del asa troncal de histona de vertebrados y la cantidad de nucleotidos que se presentan se indica para cada posición en la secuencia del asa troncal. La secuencia consensuada generada que representa todos los nucleotidos presentes en las secuencias analizadas se proporciona utilizando el código de nucleotidos de una sola letra. Además de la secuencia consensuada, se muestran las secuencias que representan al menos el 99%, 95% y 90% de los nucleotidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 5: muestra la secuencia consensuada del asa troncal de histona generado a partir las secuencias del asa troncal humana (Homo sapiens) (como se informa por Dávila López, M . , & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) . Se alinearon 84 secuencias del asa troncal de histona en seres humanos y la cantidad de nucleótidos que se presentan se indica para cada posición en la secuencia del asa troncal. La secuencia consensuada generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se proporcionan utilizando el código de nucleótidos de una sola letra. Además de la secuencia consensuada, se muestran las secuencias que representan al menos el 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
Las figuras 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19: muestran los ARNm provenientes de la transcripción in vitro.
Se proporcionan la designación y la secuencia de los ARNm obtenidos mediante transcripción in vitro. Se utilizan las siguientes abreviaturas: ppLuc (GC) : secuencia de ARNm enriquecido con GC que codifica para Photinus pyralís luciferasa ag: región no traducida (UTR) 3' del gen alfa-globina A64: secuencia poly(A) con 64 adenilatos A120: secuencia poly(A) 120 adenilatos histonaSL: asa troncal de histona aCPSL: asa troncal que se ha seleccionado a partir de las biblioteca para su unión especifica de la proteina aCP-2KL PolioCL: hoja de trébol 5' proveniente de ARN genómico del virus de polio G30 secuencia poly(G) con 30 guanilatos U30 secuencia poly(U) con 30 uridilatos SL asa troncal no especifica/artificial N32 secuencia no especifica de 32 nucleótidos dentro de las secuencias, se resaltan los siguientes elementos: región codificante (ORF) (letras mayúsculas), ag (negrillas), histonaSL (subrayado), secuencias distintas adicionales probadas (cursivas) .
La figura 6: muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC) - ag (SEC ID NO: 43) .
Mediante la linearización del vector original en el sitio de restricción inmediatamente después del 3' -UTR de alfa-globina (ag) , se obtiene el ARNm que carece de una secuencia poly(A).
La figura 7: muestra la secuencia de ARNm de ppLuc (GC) - ag - A64 (SEC ID NO: 44) .
Mediante la linearización del vector original en el sitio de restricción inmediatamente después de la secuencia poly(A) A64, Se obtiene el ARNm que termina con una secuencia poyi(A) A64.
La figura 8: muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC) - ag - histonaSL (SEC ID NO: 45).
La secuencia poly(A) A64 se reemplazó por una histonaSL. La secuencia del asa troncal de histona utilizado en los ejemplos se obtuvo a partir de Cakmakci et al. (2008). Molecular and Cellular Biology, 28(3), 1182-1194.
La figura 9: muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - histonaSL (SEC ID NO: 46) .
La histonaSL se agregó 3' de la poly(A) A6 .
La figura 10: muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC) - ag - A120 (SEC ID NO: 47).
La secuencia poly(A) A64 se reemplazó por una secuencia poly(A) A120.
La figura 11: muestra la secuencia ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - ag (SEC ID NO: 48). Una segunda 3' -UTR de alfa-globina se agregó 3' de una poly(A) A64.
La figura 12: muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - aCPSL (SEC ID NO: 49) . Se agregó un asa troncal 3' de la poly (A) A64. El asa troncal se habla seleccionado de una biblioteca para su unión especifica de la proteina aCP-2KL (Thisted et al., (2001), The Journal of Biological Chemistry, 276(20), 17484-17496) ccCP-2KL es una isoforma de ccCP-2, la proteína aCP expresada con mayor fuerza (proteina de unión poly(C) de ARNm de alfa-globina) (Makeyev et al., (2000), Genomics, 67(3), 301-316), un grupo de proteínas de unión a ARN, que se unen a la 3'-UTR de alfa-globina (Chkheidze et al., (1999), Molecular and Cellular Biology, 19(7), 4572-4581).
La figura 13: muestra la secuencia ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - PolioCL (SEC ID NO: 50) .
La hoja de trébol 5' proveniente del ARN genómico del virus de Polio se agregó 3' de poly(A) A64.
La figura 14 muestra la secuencia ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - G30 (SEC ID NO: 51).
Se agregó un tramo de 30 guanilatos 3' de la poly(A) A64.
La figura 15: muestra la secuencia ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - U30 (SEC ID NO: 52).
Se anexó un tramo de 30 uridilatos 3' de la poly(A) A64.
La figura 16: muestra la secuencia ARNm de ppLuc(GC) - ag - A64 - SL (SEC ID NO: 53) .
Se anexó un asa troncal 3' de poly(A) A64. La parte superior del tronco y el asa se tomaron de (Babendure et al., (2006), RNA (New York, N.Y.), 12(5), 851-861). El asa troncal consiste de 17 pares de bases largas, un tronco rico en CG y un asa larga de 6 bases.
La figura 17: muestra ppLuc (GC) - ag - A64 - N32 (SEC ID NO: 54) .
Mediante la linearización del vector original en un sitio de restricción alternativo, Se obtuvo un ARNm con 32 nucleótidos adicionales después de la poly (A) .
La figura 18: muestra la secuencia ARNm de HA (H1N1/PR8) (GC) - ag - A64 -C30 (SEC ID NO: 55) .
La figura 19: muestra la secuencia ARNm de HA (H1N1/PR8) (GC) - ag - A64 -C30 - histonaSL (SEC ID NO: 56) .
La figura 20: muestra la combinación de poly (A) y los aumentos de histonaSL de la expresión proteinica a partir de un ARNm de una forma sinérgica.
Se examinó el efecto de la secuencia poly (A) , histonaSL, y la combinación de la poly (A) y la histonaSL sobre la expresión de luciferasa a partir del ARNm. Por lo tanto en células HeLa se sometieron a electroporación diferentes ARNm. Los niveles de luciferasa se midieron a las 6, 24 y 48 horas después de la transfeccion. Se expresa poca luciferasa proveniente del ARNm que no tiene ni una secuencia poly (A) ni una histonaSL. Tanto la secuencia poly (A) como la histonaSL aumentan el nivel de luciferasa. Sin embargo, extraordinariamente, la combinación de la poly (A) y la histonaSL aumenta además fuertemente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando asi sinérgicamente . Los datos se grafican como la media RLU + SD (unidades de luz relativas + desviación estándar) para transfecciones por triplicado. En el ejemplo 11.2 se resumen los RLU específicos .
La figura 21: muestra que la combinación de poly (A) y la histonaSL aumenta la expresión proteínica a partir del ARNm independientemente de su orden.
Se examinó el efecto de la secuencia poly (A), la histonaSL, la combinación de poly (A) y la histonaSL, y su orden por la expresión de luciferasa a partir del ARNm. Por lo tanto, se lipofectaron diferentes ARNm en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a las 6, 24 y 48 horas después del inicio de la transfección. Tanto una secuencia pol (A) A64 o la histonaSL dieron lugar a niveles comparables de luciferasa. Aumentar la longitud de la secuencia poly (A) de A64 hasta A120 o hasta A300 aumenta el nivel de luciferasa moderadamente. Por el contrario, la combinación de poly (A) y la histonaSL aumenta el nivel de luciferasa mucho más que el alargamiento de la secuencia poly (A). La combinación de poly (A) y la histonaSL actúa sinérgicamente, ya que aumenta el nivel de luciferasa muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. Se observa el nivel sinérgico de la combinación de poly(A) y la histonaSL independientemente del orden de la poly(A) y la histonaSL e independientemente de la longitud de la poly(A) con el ARNm de A64-histonaSL o histonaSL-A250. Los datos se grafican como la media RLU + SD para transfecciones por triplicado. En el ejemplo 11.3 se resumen los RLU específicos .
La figura 22: muestra que el aumento en la expresión proteínica mediante la combinación de poly (A) y la histonaSL es específico.
Se examinó el efecto de combinar la poly (A) y la histonaSL o la poly (A) y las secuencias alternativas sobre la expresión de luciferasa a partir de un ARNm. Por lo tanto, se sometieron a electroporación diferentes ARNm en células HeLa. Se midieron los niveles de luciferasa a las 6, 24, y 48 horas después de la transfección. Tanto una secuencia poly (A) o la histonaSL dieron lugar a niveles comparables de luciferasa. La combinación de poly (A) y la histonaSL aumenta en gran medida el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando así sinérgicamente . Por el contrario, combinar la poly (A) con cualquiera de las otras secuencias no tiene efecto sobre el nivel de luciferasa en comparación con el ARNm que contiene sólo una secuencia poly(A). De esta forma, la combinación de la poly (A) y la histonaSL actúa específica sinérgicamente . Los datos se grafican como la media RLU ± SD para transfecciones por triplicado. En el ejemplo 11.4 se resumen los RLU específicos.
La figura 23: muestra que la combinación de la poly (A) y la histonaSL aumenta la expresión proteínica a partir del ARNm de una manera sinérgíca in vivo.
Se examinó el efecto de la secuencia poly (A), la histonaSL, y la combinación de la poly (A) y la histonaSL sobre la expresión de luciferasa a partir del ARNm in vivo. Por lo tanto, se inyectaron intradérmicamente diferentes ARNm en ratones. Los ratones se sacrificaron de 16 horas después de la inyección y se midieron los niveles de luciferasa en los sitios de inyección. La luciferasa se expresa a partir de un ARNm que tiene ya sea una histonaSL o una secuencia poly (A) . Sin embargo, asombrosamente la combinación de la poly (A) y la histonaSL aumenta fuertemente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando de esta forma sinérgicamente. Los datos se grafican como la medía RLU ± SEM (unidades de luz relativa ± error estándar de la media). En el ejemplo 11.5 se resumen los RLU específicos.
La figura 24: muestra que la combinación de la poly(A) y la histonaSL aumenta el nivel de anticuerpos producidos por la vacunación con un ARNm.
Se examinó el efecto de la secuencia poly(A) y la combinación de la poly(A) y la histonaSL sobre la inducción de anticuerpos anti-HA producidos por la vacunación con un ARNm. Por lo tanto, ratones Balb/c se vacunaron intradérmicamente con diferentes ARNm. El nivel de anticuerpos HA-especificos en ratones vacunados y de control se analizó mediante ELISA con diluciones en serie de sueros. El IgGl anti-HA se indujo mediante ARNm que tiene sólo una secuencia poly(A). Sin embargo, sorprendentemente, la combinación de la poly(A) y la histonaSL aumenta fuertemente el nivel de IgGl anti-HA, por encima del nivel observado con sólo una secuencia poly(A).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplos : Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren adicionalmente la invención y no se deben interpretar como limitantes de la presente invención. 1. Generación de secuencias consensuadas del asa troncal de histonas Antes de los experimentos, se determinaron las secuencias consensuadas del asa troncal de histonas sobre la base de secuencias del asa troncal de histonas de metazoarios y protozoarios . Las secuencias se tomaron del suplemento proporcionado por López et al. (Dávila López, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi : 10.1261/rna .782308 ) , quienes identificaron un gran número de secuencias del asa troncal de histonas naturales mediante la búsqueda de secuencias genómicas y las marcas de secuencias expresadas. En primer lugar, todas las secuencias provenientes de metazoarios y protozoarios (4001 secuencias) , o todas las secuencias provenientes de protozoarios (131 secuencias) o, alternativamente, de metazoarios (3870 secuencias), o de vertebrados (1333 secuencias) o de humanos (84 secuencias) se agruparon y alinearon. Después, se determinó la cantidad de los nucleótidos presentes para cada posición. Con base en las tablas asi obtenidas, se generaron secuencias consensuadas para los 5 diferentes grupos de secuencias representando todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas. Además, también se obtuvieron secuencias consensuadas restrictivas, enfatizando cada vez más los nucleótidos conservados. 2. Preparación de moldes de ADN Se construyó un vector para transcripción in vitro que contuvo un promotor T7 seguido por una secuencia enriquecida con GC que codifica para Photinus pyralis luciferasa (ppLuc (GQ) , la parte central de la región no traducida 3' (UTR) de alfa-globina (AG) , y una secuencia poly(A) . La secuencia de poly (A) fue seguida inmediatamente por un sitio de restricción utilizado para la linearización del vector antes de la transcripción in vitro para obtener el ARNm que termina en una secuencia poly (A) A64. El ARNm obtenido de esta vector por consiguiente mediante transcripción in vitro se designó como "ppLuc(GC) - ag -A64".
La linearización de este vector en los sitios de restricción alternativas antes de la transcripción in vitro permitió tener un ARNm ya sea extendido mediante nucleótidos adicionales 3' de A64 o que carecen de A64. Además, el vector original se modificó para incluir secuencias alternativas. En resumen, se obtuvieron los siguientes ARNm a partir de estos vectores mediante transcripción in vitro (en las figuras 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17, se proporcionan las secuencias de ARNm) : ppLuc (GC) - ag (SEC ID NO: 43) ppLuc (GC) - ag - A64 (SEC ID NO: 44) ppLuc (GC) - ag - histonaSL (SEC ID NO: 45) ppLuc (GC) - ag - A64 - histonaSL (SEC ID NO: 46) ppLuc (GC) - ag - A120 (SEC ID NO: 47) ppLuc (GC) - ag - A64 - ag (SEC ID NO: 48) ppLuc (GC) - ag - A64 - aCPSL (SEC ID NO: 49) ppLuc (GC) - ag - A64 - PolioCL (SEC ID NO: 50) ppLuc (GC) - ag - A64 - G30 (SEC ID NO: 51) ppLuc (GC) - ag - A64 - U30 (SEC ID NO: 52) ppLuc (GC) - ag - A64 - SL (SEC ID NO: 53) ppLuc (GC) - ag - A64 - N32 (SEC ID NO: 54) Además, se prepararon de acuerdo como se describió anteriormente las secuencias del plásmido de ADN que codifican para el antigeno patogénico HA (Hl N1/PR8) .
En resumen, se obtuvieron los siguientes ARNm proveniente de estos vectores mediante transcripción in vitro (en las figuras 18 y 19 se proporciona las secuencias de ARN) : HA (H1N1/PR8) (GC) - ag - A64 -C30 (SEC ID NO: 55) HA (H1N1/PR8) (GC) - ag - A64 -C30 - histonaSL (SEC ID NO: 56) 3. Transcripción in vitro El molde de ADN de acuerdo con el Ejemplo 2 se linearizó y se transcribió in vitro utilizando T7 polimerasa. El molde de ADN luego se digirió mediante tratamiento con ADNasa. Todas las transcripciones de ARNm contuvieron una estructura 5' -CAP obtenida mediante la adición de un exceso de N7-metil-guanosina-5' -trifosfato-5' -guanosina a la reacción de transcripción. El ARNm asi obtenido se purificó y se volvió a suspender en agua. 4. Adenilación enzimática del ARNm Dos ARNm se sometieron a adenilación enzimáticamente : ppLuc(GC) - ag - A64 y ppLuc(GC) - ag - histonaSL.
Para este fin, el ARN se incubó con E. coli poly (A) -polimerasa y ATP (Poly(A) Polymerase Tailing Kit, Epicentre, Madison, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm con la secuencia poly (A) extendida se purificó y se volvió a suspender en agua. La longitud de la secuencia poly (A) se determinó vía electroforesis en gel de agarosa. Los ARNm de partida se extendieron en aproximadamente 250 adenilatos, los ARNm obtenidos se designaron como: ppLuc(GC) - ag - A300 y ppLuc (GC) - ag - histonaSL - A250, respectivamente . 5. Expresión de luciferasa mediante electroporación de ARNm Se trataron con tripsina células HeLa y se lavaron en opti-MEM. 1 x 105 células en 200 µ? de opti-MEM cada una se sometieron a electroporación con 0.5 g de ARNm que codifica para ppLuc. Como un control, se sometió a electroporación por separado un ARNm no codificante para ppLuc. Las células sometidas a electroporación se sembraron en placas de 24 pocilios en 1 mi de medio RPMI 1640. 6, 24 ó 48 horas después de la transfeccion, el medio se aspiró y las células se Usaron en 200 µ? de tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7.5 (HC1), EDTA 2 mM, 10% de glicerol, 1% de Tritón X-100, DTT 2 mM, PMSF 1 mM) . Los Usados se almacenaron a -20°C hasta que se midió la actividad de ppLuc. 6. Expresión de luciferasa mediante lipofeccion de ARNm Células HeLa se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 2 x 104 células por pocilio. Al siguiente dia, las células se lavaron en Opti-MEM y luego se transfectaron con 0.25 µg de ARNm que codifican para ppLuc-complejados con lipofectina en 150 µ? de Opti-MEM. Como un control, se sometió a lipofeccion por separado un ARNm no codificante para ppLuc. En algunos pocilios, el Opti-MEM se aspiró y las células se Usaron en 200 µ? de tampón de lisis 6 horas después del inicio de la transíección. En los pocilios restantes, el Opti-MEM se intercambió por medio RPMI 1640 en ese momento. En estos pocilios, el medio se aspiró y las células se Usaron en 200 µ? de tampón de lisis 24 ó 48 horas después del inicio de la transfección . Los lisados se almacenaron a -20 °C hasta que se midió la actividad de ppLuc. 7. Medición de luciferasa La actividad ppLuc se midió como unidades de luz relativa (RLU) en un lector de placas BioTek SynergyHT a un tiempo de medición de 5 segundos utilizando 50 µ? del lisado y 200 µ? de tampón de luciferina (Glicilglicina 25 mM, pH 7.8 (NaOH) , MgS04 15 mM, ATP 2 mM, luciferina 75 µ?) . Se calcularon los RLU específicos al restar el RLU del ARN control del RLU totales. 8. Expresión de luciferasa mediante inyección de ARNm intradérmico (expresión de luciferasa in vivo) Se anestesiaron ratones con una mezcla Rompun y Ketavet. Cada ARNm que codifica para ppLuc se inyectó intradérmicamente (0.5 iq de ARNm en 50 µ? por inyección). Como un control, se inyectó por separado ARNm no codificante para ppLuc. 16 horas después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tejidos. Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente en nitrógenos líquidos y se Usaron en un lisador de tejido (Qiagen) en 800 µ? de tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7.5 (HC1) , EDTA 2 mM, glicerol al 10%, Tritón X-100 al 1%, DTT 2 mM, PMSF 1 mM) . Posteriormente las muestras se sometieron a centrifugación a 13500 rpm a 4°C durante 10 minutos. Los lisados se almacenaron a -80 °C hasta que se midió la actividad de ppLuc (véase 7. medición de luciferasa) . 9. Detección de una respuesta inmune a linfoc os B antigeno-especifica (anticuerpos) Ratones BALB/c (8 ratones por grupo) se vacunaron dos veces en un término de 7 dias intradérmicamente con la vacuna que comprendió 10 µg de ARNm que codifica para HA (hemaglutinina de A/Puerto Rico/8/34, de acuerdo con la SEC ID NO: 55 y 56) . Para control negativo, los ratones se trataron un tampón.
La detección de una respuesta inmune antígeno-específica se llevó al detectar los anticuerpos proteína-específicos HA. Por lo tanto, se extrajeron muestras sanguíneas de ratones vacunados cuatro semanas después de la última vacunación y los sueros se prepararon. Placas MaxiSorp® (Nalgene Nunc International) se recubrieron con proteína HA (Charles River Laboratories). Después de bloquear con lxPBS que contuvo 0.05% de Tween-20 y 1% de BSA, las placas se incubaron con suero diluido de ratón (1:50). Posteriormente se agregó un anticuerpo secundario acoplado con biotina (anti-mouse-IgG Dianova, cat . #115035003). Después de lavar, la placa se incubó con peroxidasa estreptavidina de rábano picante y posteriormente, se midió la conversión del sustrato ABTS (ácido 2 , 2 ' -azino-bis ( 3-etil-benztiazolin-6-sulfónico) . En la figura 24, se muestran los resultados de este experimento. 10. Detección de una respuesta inmune celular antigeno- especifica (respuesta inmune a linfocitos T) mediante ELISPOT : Ratones C57BL/6 se vacunaron intradérmicamente con ARNm que codifica para HA (hemaglutinina de A/Puerto Rico/8/34, de acuerdo con la SEC ID NO: 55 y 56) complejada con protamina (2 veces en 7 dias) . Los ratones control se trataron con tampón. 1 semana después de la vacunación los ratones se sacrificaron, se retiraron los bazos y se aislaron los esplenocitos . Los esplenocitos se volvieron a estimular durante 7 dias en presencia de los péptidos provenientes del antigeno anterior (biblioteca de péptidos) o se co-incubaron con células dendriticas generadas a partir de células de médula ósea de ratones singénicos naturales, que se sometieron a electroporación con un ARNm que codifica para el antigeno. Para determinar una respuesta inmune celular antigeno-especifica se midió la secreción INFgamma después de la re-estimulación. Para la detección de INFgamma, una placa de multi-selección recubierta (Millipore) se incubó durante la noche con tampón de recubrimiento de carbonato-bicarbonato 0.1 M, pH 9.6, 10.59 g/1 de Na2C03, 8.4 g/1 de NaHC03) que comprende el anticuerpo contra Infy (BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania) . Se incubaron estimuladores y células efectoras conjuntamente en la placa en la proporción de 1:20 durante 24 h. La placa se lavó con 1 x PBS y se incubó con un anticuerpo secundario acoplado con biotina. Después del lavado con 1 x PBS/0.05% de Tween-20 al sustrato (5-Bromo-4-Cloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium Liquid Substrate System from Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se agregó a la placa y se podría detectar visualmente la conversión del sustrato.
RESULTADOS 11.1 Secuencias del asa troncal de histonas : Para caracterizar las secuencias del asa troncal de histonas, se agruparon y alinearon las secuencias provenientes de metazoarios y protozoarios (4001 secuencias), o de protozoarios (131 secuencias) o alternativamente de metazoarios (3870 secuencias), o de vertebrados (1333 secuencias) o de humanos (84 secuencias). Luego, la cantidad de nucleotidos presentes se determinó para cada posición. Con base de las tablas asi obtenidas, se generaron las secuencias consensuadas para los 5 diferentes grupos de secuencias representando todos los nucleotidos presentes en las secuencias analizadas. Dentro de la secuencia consensuada de metazoarios y protozoarios combinados, se conservaron 3 nucleotidos, uno T/U en el asa y un G y un C en el tronco, formando un par de bases.
Estructuralmente, típicamente se formó un tronco de 6 pares de bases y un asa de 4 nucleotidos. Sin embargo, son comunes estructuras de desviación: de 84 asas troncales de histonas humanas, dos contuvieron un tronco de sólo 5 nucleotidos que comprende 4 pares de bases y un mal apareamiento. Otra asa troncal de histonas humanas contuvo un tronco de sólo 5 pares de bases. Cuatro más asas troncales de histonas humanas contuvo un tronco de 6 nucleotidos de largo, aunque incluyó un mal apareamiento en tres posiciones diferentes, respectivamente. Además, cuatro asas troncales de histonas humanas contuvieron un par de bases inestables en dos posiciones diferentes, respectivamente. Con relación al asa, una longitud de 4 nucleotidos parece no ser requerida estrictamente, ya que un asa de 5 nucleotidos se ha identificado en D. discoideum.
Además de las secuencias consensuadas que representan todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas, también se obtuvieron más secuencias consensuadas restrictivas, enfatizando cada vez más los nucleótidos conservados. En resumen, se obtuvieron las siguientes secuencias : (Cons) : representa todos los nucleótidos presentes (99%): representa al menos el 99% de todos los nucleótidos presentes (95%): representa al menos el 95% de todos los nucleótidos presentes (90%): representa al menos el 90% de todos los nucleótidos presentes Los resultados de análisis de las secuencias del asa troncal de histona se resumen en las siguientes Tablas 1 a 5 (véanse también la figura 1, 2, 3, 4 y 5) : Tabla 1 : Secuencia consensuada del asa troncal de histonas de metazoarios y protozoarios : (con base en una alineación de 4001 secuencias del asa troncal de histonas de metazoarios y preotozoarios) (véase también la figura 1) Secuencia consensuada del asa troncal de histonas de protozoarios: (con base en una alineación de 131 secuencias del asa troncal de histonas de preotozoarios) (véase también la figura 2) Tabla 3: Secuencia consensuada del asa troncal de histonas de metazoarios: (con base en una alineación de 3870 (incluyendo 1333 secuencias de vertebrados) secuencias del asa troncal de histonas de metazoarios) (véase también la figura 3) Tabla 4: Secuencia consensuada del asa troncal de histonas de histonas de vertebrados: (con base en una alineación 1333 secuencias del asa troncal de histonas vertebrados) (véase también la figura 4) Tabla 5: Secuencia consensuada del asa troncal de histonas de Homo sapiens: (con base en una alineación de 84 secuencias del asa troncal de histonas humana) (véase también la figura 5) en donde las abreviaturas utilizadas se definen como sigue: R G o A Purina Y T/U o C Pirimidina M A o C Amino K G o T/U Queto S G o c Fuerte (enlaces 3H) W A o T/U Débil (enlaces 2H) H A o C o T/U Sin G B G o T/U o C Sin A V G o C o A Sin T/U D G o A o T/U Sin C N G o C o T/U o A Cualquier base La base puede estár * Presents o no presente o no 11.2 La combinación de la poly(A) y la histonaSL alimenta la expresión proteinica proveniente de un ARNm de una forma sinérgica Para investigar el efecto de la combinación de la poly(A) y la histonaSL sobre la expresión proteinica a partir de un ARNm, se sintetizaron los ARNm con diferentes secuencias 3' de la 3'-UTR de alfa-globina : los ARNm ya sea terminal justo en 3' del 3'-UTR, de esta forma carecen tanto de la secuencia poly(A) como de la histonaSL, o contuvieron ya sea una secuencia poly(A) A64 o una histonaSL en su lugar, o tanto la poly (A) A64 como la histonaSL 3' de la 3'-UTR. Los ARNm que codifican para luciferasa o el ARNm control se sometieron a electroporacion en células HeLa. Se midieron los niveles de luciferasa a las 6, 24, y 48 horas después de la transfección (véase la siguiente Tabla 6 y la figura 20).
Tabla 6: Se expresó poca luciferasa a partir de un ARNm que no tiene ni una secuencia poly (A) ni una histonaSL. Tanto una secuencia poly (A) o la histonaSL aumentaron el nivel de luciferasa a un grado similar. Cualquier ARNm dio lugar a un nivel de lucifesa mucho mayor de lo que lo hizo el ARNm que carece tanto de la poly (A) como de la histonaSL. Sin embargo, sorprendentemente, la combinación de la poly (A) y la histonaSL aumentaron fuerte y adicionalmente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. La magnitud del aumento en el nivel de luciferasa debido a la combinación de la poly (A) y la histonaSL en el mismo ARNm demuestra que están actuando sinérgicamente.
La sinergia entre la poly (A) y la histonaSL se cuantificó al dividir la señal proveniente del ARNm de poly (A) -histonaSL (+/+) entre las sumas de las señales provenientes del ARNm de la histonaSL (-/+) más el ARNm poly(A) (+/-) (véase la siguiente Tabla 7).
Tabla 7: El factor aquí calculado especifica cuán mucho mayor es el nivel de luciferasa proveniente de la combinación del ARNm de la poly(A) y la histonaSL de lo que se podría esperar si los efectos de la poly(A) y la histonaSL fueron puramente aditivos. El nivel de luciferasa a partir del ARNm que combina la poly(A) y la histonaSL fue hasta 16.6 veces mayor que si sus efectos hubieran sido puramente aditivos. Este resultado confirma que la combinación de la poly(A) y la histonaSL provoca un aumento marcadamente sinérgico en la expresión de proteínas. 11.3 La combinación de la poly(A) y la histonaSL alimenta la expresión proteinica a partir de ARNm independientemente de su orden El efecto de la combinación de la poly(A) y la histonaSL podría depender de la longitud de la secuencia poly(A) y el orden de la poly(A) y la histonaSL. De esta forma, se sintetizaron los ARNm con una longitud de secuencia poly(A) cada vez mayor y un el ARNm con la poly(A) y la histonaSL en orden inverso: los dos ARNm contuvieron 3' de la 3'-UTR una secuencia poly(A) ya sea A120 o una A300. Un ARNm adicional contuvo 3' de la 3'-UTR en primer lugar una histonaSL seguida por una secuencia poly(A) A250. Los ARNm que codifican para luciferasa o el ARNm control se sometieron a lipofección en células HeLa. Se midieron los niveles de luciferasa a las 6, 24, y 48 horas después del inicio de la transfección (véase la siguiente Tabla 8 y la figura 21) .
Tabla 8: Tanto una secuencia poly(A) A64 o la histonaSL dieron lugar a niveles comparables de luciferasa. De acuerdo con el experimento anterior, la combinación de A64 y la histonaSL aumentó fuertemente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. La magnitud del aumento en el nivel de luciferasa debido a la combinación de la poly (A) y la histonaSL en el mismo ARNm demuestra que están actuando sinérgicamente . La sinergia entre la A64 y la histonaSL se cuantificó como antes con base de los niveles de luciferasa del ARNm del A64 -histonaSL, A64 y la histonaSL (véase la siguiente Tabla 9) . El nivel de luciferasa a partir de la combinación del ARNm A64 y la histonaSL fue hasta 61.7 veces mayor que si los efectos de la poly (A) y la histonaSL fueran puramente aditivos.
Tabla 9: Por el contrario, aumentar la longitud de la secuencia poly (A) de A64 hasta A120 o hasta A300 aumenta el nivel de luciferasa sólo moderadamente (véase la Tabla 8 y la figura 19). El ARNm con la secuencia poly(A) más larga, A300, también se comparó con el ARNm en el cual se combinó una secuencia poly (A) de longitud similar con la histonaSL, la histonaSL-A250. Además de tener una secuencia poly (A) larga, el orden de la histonaSL y la poly(A) se invierte en este ARNm con relación al ARNm de la A64-histonaSL . La combinación de A250 y la histonaSL aumenta fuertemente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con ya sea la histonaSL o A300. Nuevamente, se cuantificó la sinergia entre A250 y la histonaSL como antes en comparación con el RLU proveniente del ARNm de la histonaSL-A250 al RLU proveniente del ARNm A300 más el ARNm de la histonaSL (véase la siguiente Tabla 10) . El nivel de luciferasa a partir del ARNm que combina A250 y la histonaSL fue hasta 17.0 veces mayor que si los efectos de la poly(A) y la histonaSL fueran puramente aditivos.
Tabla 10: En resumen, se ha demostrado un efecto bastante sinérgico de la combinación de la histonaSL y la poly(A) sobre la expresión proteinica a partir del ARNm para longitudes sustancialmente diferentes de la poly (A) e independientemente del orden de la poly (A) y la histonaSL. 11.4 El aumento en la expresión proteinica mediante la combinación de la poly(A) y la histonaSL es especif co Para investigar si el efecto de la combinación de la poly(A) y la histonaSL sobre la expresión proteinica a partir del ARNm es especifico, se sintetizaron los ARNm con secuencias alternativas en combinación con la poly (A) : estos ARNm contuvieron 3' de A64 una de siete secuencias distintas, respectivamente. Los ARNm que codifican para luciferasa o el ARNm control se sometieron a electroporacion en células HeLa. Se midieron los niveles de luciferasa a las 6, 24, y 48 horas después de la transfeccion (véase la siguiente Tabla 11 y la figura 22) .
Tabla 11: Tanto una secuencia poly(A) o la histonaSL dieron lugar a niveles comparables de luciferasa. Nuevamente, la combinación de la poly(A) y la histonaSL aumentó fuertemente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando asi sinérgicamente . Por el contrario, combinar la poly(A) con cualquiera de las secuencias alternativas no tuvo efecto sobre el nivel de luciferasa en comparación con el ARNm que contuvo sólo una secuencia poly(A) . De esta forma, la combinación de la poly(A) y la histonaSL aumenta la expresión proteínica a partir del ARNm de una forma sinérgica, y este efecto es especifico.
La combinación de la poly(A) y la histonaSL aumenta la expresión proteinica a partir del ARNm de una forma sinérgica in vivo.
Para investigar el efecto de la combinación de la poly(A) y la histonaSL sobre la expresión proteinica a partir del ARNm in vivo, los ARNm que codifican para luciferasa con diferentes secuencias 3' de la 3'-UTR alfa-globina o del ARNm control se inyectaron intradérmicamente en ratones: los ARNm contuvieron ya sea una secuencia poly(A) A64 o una histonaSL en su lugar, o tanto una poly(A) A64 como una histonaSL 3' de la 3'-UTR. Se midieron los niveles de luciferasa a las 16 horas después de la inyección (véase la siguiente Tabla 12 y figura 23) .
Tabla 12: La luciferasa se expresó a partir del ARNm que tiene ya sea una histonaSL o una secuencia poly(A) . Sin embargo, sorprendentemente la combinación de la poly (A) y la histonaSL aumentó en gran medida adicionalmente el nivel de luciferasa, muchas veces por encima del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. La magnitud del aumento en el nivel de luciferasa debido a la combinación de la poly (A) y la histonaSL en el mismo ARNm demuestra que están actuando sinérgicamente .
La sinergia entre la poly (A) y la histonaSL se cuantificó al dividir la señal proveniente del ARNm de poly (A) - histonaSL (+/+) entre la suma de las señales provenientes del ARNm de la histonaSL (-/+ ) más el ARNm de poly(A) (+/-) (véase la siguiente tabla 13) .
Tabla 13: El factor asi calculado especifica cuán mucho mayor es el nivel de luciferasa proveniente del ARNm que combina la poly(A) y la histonaSL es de lo que se podría esperar si los efectos de la poly(A) y la histonaSL fueran puramente aditivos. El nivel de luciferasa proveniente del ARNm al combinar la poly(A) y la histonaSL fue 8 veces mayor que si sus efectos fueran puramente aditivos. Este resultado confirma que la combinación de la poly(A) y la histonaSL provoca un aumento marcadamente sinérgico en la expresión proteínica in vivo.
La combinación de la poly(A) y la histonaSL aumenta el nivel de anticuerpos producidos por la vacunación con un ARNm.
Para investigar el efecto de la combinación de la poly(A) y la histonaSL sobre la inducción de anticuerpos producidos por la vacunación con un ARNm, se vacunaron intradérmicamente ratones Balb/c con, los ARNm que codifican para HA con diferentes secuencias 3' de la 3'-UTR de alfa- globina mutada. Los ARNm contuvieron ya sea una secuencia poly (A) A64 o tanto una poly (A) A64 como la histonaSL 3' de la 3'-UTR. Mediante ELISA se analizó el nivel de los anticuerpos HA-específicos en ratones vacunados y de control con diluciones en serie de suero (véase la figura 24) .
Se indujo IgGl anti-HA mediante un ARNm que tiene sólo una secuencia poly (A) . Sin embargo, sorprendentemente la combinación de la poly (A) y la histonaSL aumentó fuertemente el nivel IgGl anti-IIA, por encima del nivel observado con sólo una secuencia poly (A) .

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :
1. Una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque comprende o codifica: a), una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína; b) al menos un asa troncal de histona, y c) una secuencia poly(A) o una señal de poliadenilación; en donde el péptido o proteína comprende un antígeno patogénico o un fragmento, variante o derivado del mismo en particular un antígeno proveniente de un patógeno asociado con una enfermedad infecciosa.
2. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la enfermedad infecciosa es una infección bacteriana, una infección viral, una infección por protozoarios, una infección por hongos o lo semej ante .
3. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el antígeno patogénico se puede derivar de un patógeno seleccionado de la primera lista de: Acinetobacter baumannii, Anaplasma genus, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, Aspergillus genus, Astroviridae, Babesia genus, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, BK virus, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia genus, Borrelia spp, Brucella genus, Brugia malayi, Bunyaviridae family, Burkholderia capacia y otras especies Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, familia Caliciviridae, Campylobacter genus, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, CJD prion, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, coronaviruses, Corynebacterium diphtheriae, Cox6iella burnetii, virus de fiebre hemorrágica de Crimean-Congo, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium genus, Citomegalovirus (CMV) , virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4), Dientamoeba fragilis, Ebolavirus (EBOV) , Echinococcus genus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia e ingii, Ehrlichia genus, Entamoeba histolytica, Enterococcus genus, Enterovirus genus, Enteroviruses , principalmente un virus Coxsackie A y Enterovirus 71 (EV71) , Epidermophyton spp, Epstein-Barr Virus (EBV) , Escherichia coli 0157:H7, 0111 y O104:H4, Fasciola hepática y Fasciola gigantica, FFI prion, Filarioidea superfamily, Flaviviruses, Francisella tularensis, Fusobacterium genus, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis , Gnathostoma spp, GSS prion, Guanarito virus, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Henipavirus (Hendra virus Nipah virus) , virus de Hepatitis A, virus de Hepatitis B (HBV) , virus de Hepatitis C (HCV) , virus de Hepatitis D, virus de Hepatitis E, virus de Herpes simplex 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) , Histoplasma capsulatum, VIH (virus de inmunodeficiencia humana) , Hortaea werneckii, Human bocavirus (HBoV) , virus de herpes humana 6 (HHV-6) y virus de herpes humana 7 (HHV-7), Human metapneumovirus (hMPV) , virus de papiloma humana (HPV) , virus de parainfluenza humana (HPIV) , virus encefalitis japonesa, virus JC, virus Junin, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis , Kuru prion, virus Lassa, Legionella pneumophila, Leishmania genus, Leptospira genus, Listeria monocytogenes , virus Lymphocytic choriomeningitis (LCMV) , virus Machupo, Malassezia spp, virus Marburg, virus Measles, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, virus Molluscum contagiosum (MCV) , virus Mumps, Mycobacterium leprae y Mycobacterium lepromatosis , tuberculosis Mycobacterium, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis , Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi , Orthomyxoviridae family (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, Parvovirus B19, Pasteurella genus, Plasmodium genus, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, virus de la rabia, virus sincitial respiratorio (RSV) , Rhinovirus, rhinoviruses , Rickettsia akari, Rickettsia genus, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, Rift Valley fever virus, Rotavirus, Rubella virus, Sabia virus, Salmonella genus, Sarcoptes scabiei, SARS coronavirus, Schistosoma genus, Shigella genus, Sin Nombre virus, Hantavirus, Sporothrix schenckii, Staphylococcus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Taenia genus, Taenia solium, virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV) , Toxocara canis or Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, virus de varicela zoster (VZV) , virus de varicela zoster (VZV) , Viruela elevada o viruela mínima, vCJD prion, virus de encefalitis equina Venezolana, Vibrio cholerae, virus de Nilo Occidental, virus de encefalitis equina Occidental, Wuchereria bancrofti, virus de fiebre amarilla, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, y Yersinia pseudotuberculosis .
4. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el antigeno patogénico se puede derivar de patógenos seleccionados del virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus del herpes simplex (HSV) , virus del papiloma humano (VPH) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del Dengue, Chlamydia trachomatis, citomegalovirus (CMV) , virus de la hepatitis B (HBV) , tuberculosis Mycobacterium, virus de la rabia, y virus de la fiebre amarilla.
5. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el antigeno patogénico se selecciona de: • antigeno p24 del VIH, proteínas con envoltura del VIH (Gpl20, gp41, gpl60), poliproteína GAG, proteína Nef de factor negativo, trans-activador Tat de transcripción si la enfermedad infecciosa es VIH, de preferencia una infección con el virus de la inmunodeficiencia humana, • proteína MOMP de membrana externa mayor, proteína PMPC de membrana externa probable, proteína compleja B de membrana externa OmcB, proteínas de choque térmico Hsp60 HSP10, proteína de IncA, proteínas provenientes del sistema de secreción tipo III, proteína nrdB de cadena pequeña de ribonucleótido reductasa, proteína plasmídica pgp3, proteína N CopN externa de clamidia, antígeno CT521, antígeno CT425, antígeno CT043, antígeno TC0052, antígeno TC0189, antígeno TC0582, antígeno TC0660, antígeno TC0726, antígeno TC0816, antígeno TC0828 si la enfermedad infecciosa es una infección con Chlamydia trachomatis, • antígeno pp65, proteína de membrana ppl5, proteína tegumental cápside-proximal ppl50, proteína M45, ADN polimerasa UL54, helicasa UL105, glucoproteína gM, glucoproteína gN, glucoproteína H, glucoproteína B gB, proteína UL83, proteína UL94, proteína UL99 si la enfermedad infecciosa es infección por citomegalovirus , de preferencia una infección con citomegalovirus (CMV) ; proteína cápside C, proteína premembrana prM, proteína membrana M, proteína con envoltura E (dominio I, dominio II, dominio II), proteína NS1, proteína NS2A, proteína NS2B, proteína NS3, proteína NS4A, proteína 2K, proteína NS4B, proteína NS5, si la enfermedad infecciosa es fiebre por dengue, de preferencia una infección del virus por dengue ( DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4 ) -Flavivirus ; • antígeno superficial hepatitis B HBsAg, antígeno núcleo de Hepatitis B HbcAg, polimerasa, proteína Hbx, proteína superficial media preS2f proteína superficial L, proteína larga S, proteína viral VP1, proteína viral VP2, proteína viral VP3, proteína viral VP4 si la enfermedad infecciosa es Hepatitis B, de preferencia una infección con virus de hepatitis B (HBV) ; • proteína de replicación El, proteína reguladora E2, proteína E3, proteína E4, proteína E5, proteína E6, proteína E7, proteína E8, proteína con cápside mayor Ll, proteína con cápside menor L2 si la enfermedad infecciosa es infección de papilomavirus humano (HPV) , de preferencia una infección con papilomavirus humano (HPV) ; • proteína de fusión F, hemaglutinin-neuramidasa HN, glucoproteína G, proteína matriz M, fosfoproteína P, nucleoproteína N, polimerasa L si la enfermedad infecciosa es infección por virus de parainfluenza humana de preferencia una infección con virus de parainfluenza humana (HPIV) ; • hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , nucleoproteína (NP) , proteína MI, proteína M2, proteína NS1, proteina NS2 (proteína NEP: proteína de exportación nuclear) , proteína PA, proteína PB1 (proteína de polimerasa básica 1), proteina PB1-F2 y proteína PB2 (familia Ortomixoviridae , virus de Influenza (gripe) ) ; nucleoproteína N, proteína estructural grande L, fosfoproteína P, proteína de matriz. M, glucoproteína G si la enfermedad infecciosa es la rabia, de preferencia una infección con el virus de la rabia; • proteina de fusión F, nucleoproteina N, proteina de matriz M, proteina de matriz M2-1, proteina de matriz M2-2, fosfoproteina P, proteina hidrofóbica pequeña SH, glucoproteina G de superficie mayor, polimerasa L, proteina 1 no estructural NS1, proteina 2 no estructural NS2 si la enfermedad infecciosa es infección por virus sincitial respiratorio, de preferencia una infección con virus sincitial respiratorio (RSV) ; • antigeno secretorio SssA ( Staphylococcus genus; envenenamiento de alimentos estafilococal ) antigeno secretorio SssA (Staphylococcus genus; por ejemplo, infección por aureus, Staphylococcal) ; chaperona molecular DnaK, lipoproteina Mpt83 de superficie celular, lipoproteina P23, proteina permeasa pstA del sistema de transporte de fosfato, antigeno de 14 kDa, proteina C de unión a fibronectina FbpCl, alanina deshidrogenasa TB43, glutamina sintetasa 1, proteina ESX-1, proteina CFP10, proteina TB10.4, proteina MPT83, proteina MTB12, proteina MTB8, proteínas similares a Rpf, proteína MTB32, proteína MTB39, cristalina, proteína de choque térmico HSP65, proteína PST-S si la enfermedad infecciosa es tuberculosis, de preferencia una infección con tuberculosis Mycobacterium; • poliproteína genómica, proteína E, proteína M, proteina C con cápside, proteasa NS3, proteína NS1, proteína NS2A, proteína AS2B, proteína NS4A, proteína NS4B, proteína NS5, si la enfermedad infecciosa es la fiebre amarilla, de preferencia una infección con el virus de fiebre amarilla.
6. El ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque al menos un asa troncal de histona es heteróloga con la región codificante que codifica para al menos un péptido o proteína, de preferencia, en donde la región codificante no codifica para una proteína de histona o un fragmento, derivado o variante de la misma que tenga una histona o una función similar a histonas .
7. El ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el péptido o proteína codificado por la región codificante comprende una proteína antigénica o un fragmento, variante o derivado de la misma, el fragmento, variante o derivado de la proteína antigénica o un péptido que conserva al menos 50% de la actividad biológica de la proteína o péptido antigénico de longitud total de origen natural.
8. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque su región codificante no codifica para una proteína reportera o una proteína marcadora o de selección.
9. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 8, caracterizada porque el ácido nucleico es un ARN, de preferencia un ARNm.
10 La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque al menos un asa troncal de histonas se selecciona de las siguientes fórmulas (I) o (II) : fórmula (I) (secuencia de asa troncal sin elementos contiguos troncales) : tronco 1 asa tronco2 fórmula (II) (secuencia de asa troncal elementos contiguos troncales) : elemento troncol asa tronco 2 elemento contiguo del tronco 1 contiguo del tronco2 en donde: los elementos es una secuencia consecutiva de 1 hasta contiguos del 6, de preferencia 2 hasta 6, de mayor tronco 1 o preferencia 2 hasta 5, incluso de mayor tronco 2 Ni-g preferencia 3 hasta 5, con la máxima preferencia de 4 hasta 5 o 5N en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; tronco 1 es complementario inverso o [N0-2GN3-5 ] complementario parcialmente inverso con el elemento de tronco 2, y es una secuencia consecutiva entre 5 hasta 7 nucleótidos ; en donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 hasta 2, de preferencia 0 hasta 1, de mayor preferencia 1 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; en donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 hasta 5, de preferencia 5 hasta 5, de mayor preferencia 4 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde G es guanosina o un análogo de la misma y se puede remplazar opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, con la condición de que la citidina de nucleótido complementaria en el tronco 2 se remplace por guanosina; está ubicada entre los elementos del tronco 1 y tronco 2, y es una secuencia consecutiva de 3 hasta 5 nucleótidos, de mayor preferencia de 4 nucleótidos; en donde cada N0-4 es independientemente de otra secuencia consecutiva de 0 hasta 4, de preferencia de 1 hasta 3, de mayor preferencia 1 hasta 2 N, en donde cada N es independientemente de otra seleccionada de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde U/T representa uridina u opcionalmente timidina; es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa con el elemento de tronco 1, y es una secuencia consecutiva entre 5 hasta 7 nucleótidos ; en donde 3-5 es una secuencia consecutiva de 3 hasta 5 , de preferencia 4 hasta 5, de mayor preferencia 4 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; en donde No-2 es una secuencia consecutiva de 0 hasta 2 , de preferencia 0 hasta 1, de mayor preferencia 1 N, en donde cada N se selecciona independientemente de otra a partir de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde C es citidina o un análogo de la misma y se puede remplazar opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma, con la condición de que su nucleótido complementario de guanosina en el tronco 1 se remplace por citidina; en donde tronco 1 y tronco 2 tienen capacidad para apareamiento de bases entre sí formando una secuencia complementaria inversa, en donde el apareamiento de bases se puede presentar entre el tronco 1 y el tronco 2, o formar una secuencia complementaria parcialmente inversa, en donde se puede presentar entre el tronco 1 y el tronco 2 un apareamiento incompleto de bases.
11. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque al menos un asa troncal de histona se selecciona de al menos una de las siguientes fórmulas (la) o (lia): [NMGNM] IN^U/ONeJ [Nj.sClsU * v V y v , tronco 1 asa tronco2 fórmula (la) (secuencia de asa troncal sin elementos contiguos troncales) elemento troncol asa tronco 2 elemento contiguo del troncol contiguo del tronco2 fórmula (lia) (secuencia de asa troncal con elementos contiguos troncales)
12. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la secuencia poly(A) comprende una secuencia entre aproximadamente 25 hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, de preferencia una secuencia entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 400 nucleotidos de adenosina, de mayor preferencia una secuencia entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 300 nucleotidos de adenosina, incluso de mayor preferencia una secuencia entre aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 nucleotidos de adenosina, con la máxima preferencia una secuencia entre aproximadamente 60 hasta aproximadamente 250 nucleotidos de adenosina.
13. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque la señal de poliadenilación comprende la secuencia consensuada NN (U/T ) ANA, de preferencia AA (U/T ) AAA o A(U/T) (U/T) AAA.
14. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico es un ácido nucleico modificado, en particular un ácido nucleico estabilizado.
15. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el contenido de G/C de la región codificante que codifica para al menos un péptido o proteina del ácido nucleico modificado se aumenta en comparación con el contenido de G/C de la región codificante del ácido nucleico tipo silvestre, la secuencia de aminoácidos codificados del ácido nucleico modificado de preferencia no se modificará en comparación con la secuencia de aminoácidos codificados del ácido nucleico tipo silvestre.
16. Una composición o kit o un kit de partes caracterizado porque comprende una pluralidad de más de una de las secuencias de ácido nucleico cada una de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. La secuencia de ácido nucleico como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la composición o kit o un kit de partes como se define de conformidad con la reivindicación 16, para utilizarse como un medicamento .
18. La secuencia de ácido nucleico como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 0 la composición o kit o un kit de partes como se define de conformidad con la reivindicación 16, para utilizarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
19. La composición farmacéutica caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o una composición como se define de conformidad con la reivindicación 16, y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
20. El uso de una secuencia de ácido nucleico como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición o kit o un kit de partes como se define de conformidad con reivindicación 16, para aumentar la expresión del péptido o proteína codificado.
21. El uso de una secuencia de ácido nucleico como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la composición o kit o un kit de partes como se define de conformidad con la reivindicación 16, para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
22. Un método para aumentar la expresión de un péptido o proteína codificado, caracterizado porque comprende los pasos: a) proporcionar la secuencia de ácido nucleico como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la composición como se define de conformidad con la reivindicación 16; b) aplicar o administrar la secuencia de ácido nucleico o la composición a un sistema de expresión libre de células, una célula, un tejido o un organismo.
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