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MX2013002332A - Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina. - Google Patents

Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina.

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MX2013002332A
MX2013002332A MX2013002332A MX2013002332A MX2013002332A MX 2013002332 A MX2013002332 A MX 2013002332A MX 2013002332 A MX2013002332 A MX 2013002332A MX 2013002332 A MX2013002332 A MX 2013002332A MX 2013002332 A MX2013002332 A MX 2013002332A
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liposome
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MX2013002332A
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Andrew Geall
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Novartis Ag
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Abstract

Se describe un ARN que es encapsulado dentro de un liposoma para suministro in vivo. El ARN codifica un polipéptido de interés, tal como un inmunógeno para propósitos de inmunización. El liposoma incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) y la fórmula (XI).

Description

LIPIDOS APROPIADOS PARA SUMINISTRO LIPOSOMAL DEL ARN QUE CODIFICA A LA PROTEINA Campo de la Invención Esta invención está en el campo de entre no viral de ARN a los animales .
Antecedentes de la Invención El suministro de ácidos nucleicos para la expresión in vivo de proteínas codificadas es útil tanto para la terapia de gen como para la inmunización. Se han probado varios enfoques para el suministro exitoso, incluyendo el uso de ARN o ADN, de vehículos de entrega viral o no viral (o incluso sin vehículo de entrega, en una vacuna "desnuda"), de vectores de replicación o sin replicación, o de vectores virales o no virales.
Se mantiene la necesidad de de formas adicionales y mejoradas de entrega de ácidos nucleicos para animales en la expresión in vivo vivo de sus proteínas codificadas.
Breve Descripción de la Invención De acuerdo a la invención,- el ARN se suministra encapsulado en dentro de un liposoma. El ARN codifica un polipéptido de interés. El liposoma incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) y la fórmula (XI) . Estos liposomas pueden entregar eficientemente ARN para expresión in vivo. La Ref . :.239468 invención es particularmente útil para la inmunización, en la cual el polipeptido codificado es un inmunógeno.
De este modo la invención proporciona un liposoma dentro del cual el ARN codifica a un polipéptido de interés que está encapsulado, en done el liposoma incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos de la fórmula (I) y la fórmula (XI) .
La fórmula (I) es: en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3.2o/ heterocicloalquenilo C3-2o, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C3-2o opcionalmente sustituido; a está ausente alquinelo Ci-4 opcionalmente sustituido; b está ausente es alquinelo Ci-4 opcionalmente sustituido; c está ausente es alquinelo Ci-4 opcionalmente sustituido; X1 es 0 o S; X2 es O o S; Y1 es alquenilo C1 0 - 30 / alquinilo C10-30, heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-3o; L está ausente o es - (La) d- (Lb) e- (L°) f- , en donde La es alquileno C1-15, alquenileno Ci-i5/ alquinileno Ci-is, heteroalquileno Ci-i5, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno C1-15 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-i3 opcionalmente sustituido; Le es alquileno C1-15, alquenileno C1-15, alquinileno Ci-is, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno C1-15 opcionalmente sustituido ,- d es 0 o 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
La fórmula (XI) es : Ra- (AA)Z-R en donde Ra es un alquilamida de terminal N; z es un entero de 2 a 10; cada AA es un aminoácido, siempre y cuando esté presente al menos una histidina y al menos un aminoácido catiónico; Rb es -H o -NH2.
La invención también proporciona un proceso para preparar un liposoma que contiene AR , que comprende la etapa de mezclar ARN con un compuesto seleccionado del grupo que consiste de los compuestos de la fórmula (I) y la fórmula (XI) , bajo condiciones de manera que los compuestos formen un liposoma en el cual el ARN está encapsulado . El ARN y el compuesto pueden mezclarse en la presencia de otros compuestos que también se incorporan en el liposoma por ejemplo lípidos adicionales.
El liposoma La invención utiliza liposomas dentro de los cuales el ARN que codifica el inmunógeno se encapsula. Así el ARN (como en un virus natural) se separa de cualquier medio externo. La encapsulación dentro del liposoma se ha encontrado que protege el ARN de la digestión RNasa. Los liposomas pueden incluir algunos ARN externos (por ejemplo, en su superficie) , pero al menos la mitad del ARN (e idealmente todo de esto) se encapsula en el núcleo del liposoma. La encapsulación dentro de los liposomas es distinta de, por ejemplo, los complejos de lípido/ARN descritos en la referencia 1, donde el ARN se mezcla con liposomas pre-formados .
Diversos lípidos amfifílicos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo principal hidrofílico aniónico, catiónico o zwitteriónico . La formación de liposomas de fosfolípidos aniónicos se remonta a la década de los 60s, y los lípidos que forman liposoma catiónico se han estudiado desde la década de los 90s. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras que otros son zwitteriónicos y otros son catiónicos. Las clases adecuadas de fosfolípido incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas , fosfatidilcolinas , fosfatidilserinas, y fosfatidil-gliceroles , y algunos fosfolipidos adecuados se enlistan en la Tabla 1. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP) , 1 , 2 -diesteariloxi-N, N-dimetil-3 -aminopropano (DSDMA) , 1, 2-dioleiloxi-N,Ndimetil-3-aminopropano (DODMA) , 1, 2-di-0-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) , 1,2-dilinoleiloxi-N, -dimetil-3 -aminopropano (DLinDMA) , 1,2-dilinoleniloxi-N, -dimetil- 3 -aminopropano (DLenDMA) . Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos zwitteriónicos de acilo y lípidos zwitteriónicos de éter. Los ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son DPPC, DOPC, DSPC, dodecilfosfocolina, 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE) , y 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPyPE) . Los lípidos pueden ser saturados o no saturados. Se prefiere el uso de al menos un lípido no saturado para preparar liposomas . Si un lípido no saturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser no saturadas, o pueden tener una cola saturada y una cola no saturada. Un lípido puede incluir un grupo esteroide en una cola por ejemplo, como en RV05.
Los liposomas de la invención se pueden formar de un lípido o, más usualmente, sencillo o de una mezcla de lipidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lipidos aniónicos (ii) una mezcla de lipidos catiónicos (iii) una mezcla de lipidos zwitteriónicos (iv) una mezcla de lipidos aniónicos y lipidos catiónicos (v) una mezcla de lipidos aniónicos y lipidos zwitteriónicos (vi) una mezcla de lipidos zwitteriónicos y lipidos catiónicos o (vii) una mezcla de lipidos aniónicos, lipidos catiónicos y lipidos zwitteriónicos. Similarmente, una mezcla puede comprender ambos lipidos saturados y no saturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwitteriónicos, saturados) , DlinDMA (catiónicos, no saturados) , y/o DMG (aniónicos, saturados) . Donde se usa una mezcla de lipidos, no todos de los lipidos del componente en la mezcla necesitan ser amfifilicos por ejemplo, uno o más lipidos amfifílicos se pueden mezclar con colesterol.
Los liposomas de la invención comprenden al menos un compuesto de la fórmula (I) y/o al menos un compuesto de la fórmula (XI) . Los liposomas preferidos de la invención incluyen un lipido catiónico de la fórmula (I) . Como se muestra en los ejemplos, tales liposomas son particularmente útiles para entrega in vivo de ARN para proteína de expresión. Otros liposomas preferidos de la invención incluyen un lipopéptido de la fórmula (XI) .
Un liposoma puede incluir tanto un liposoma de la fórmula (I) como un lipopéptido de la fórmula (XI) , pero usualmente sólo incluye una de esas dos clases de compuesto catiónico.
Donde se forma un liposoma de la invención de una mezcla de lípidos, se prefiere que la proporción de aquellos lípidos que es catiónica deba estar entre 20-80% de la cantidad total de lípidos por ejemplo, entre 30-70%, o entre 40-60%. El resto se puede hacer de por ejemplo, colesterol (por ejemplo, 35-50% de colesterol) y/o DMG (opcionalmente PEGylated) y/o DSPC. Tales mezclas se usan a continuación. Estos valores porcentuales son porcentajes en moles.
Un liposoma puede incluir un lípido anfifílico cuya porción hidrofílica es PEGilada (esto es, modificada por enlace covalente de un polietilen glicol) . Esta modificación puede incrementar la estabilidad y evitar adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos se pueden conjugar con PEG usando técnicas tales como aquellas descritas en la referencia 2 y 3. PEG proporciona los liposomas con una capa que puede conferir características farmacocinéticas favorables. Diversas longitudes de PEG se pueden usar por ejemplo, entre 0.5-8kDa.
Las mezclas útiles de lípidos, para formar los liposomas de la invención, comprenden: un lípido catiónico de la fórmula (I) ; colesterol; y un lípido PEGilado, tal como PEG-DMG es decir PEG-conjugado 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (glicol polietileno) . Esta mezcla también puede incluir un lípido zwitteriónico neutral, tal como DSPC (1, 2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) o DPyPE. Estas (y otras) mezclas se usan en los ejemplos a continuación.
Los liposomas usualmente se dividen en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV, por sus siglas en inglés) ; vesículas multilaminares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) ; y vesículas multilaminares grandes (LUV, por sus siglas en inglés) . MLVs tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando formando muchos compartimentos acuosos separados. Las SUVs y LUVs tienen una bicapa sencilla encapsulando un núcleo acuoso; las SUVs generalemente tienen un diámetro <50nm, y las LUVs tiene un diámetro >50nm. Los liposomas de la invención son idealmente LUVs con un diámetro en el intervalo de 60-180nm, y preferiblemente en el intervalo de 80-160nm. un liposoma de la invención puede ser parte de una composición que comprenda una pluralidad de liposomas, y los liposomas dentro de la pluralidad pueden tener un intervalo de diámetros. Para una composición que comprende una población de liposomas con diferentes diámetros: (i) al menos 80% por número de los liposomas deben tener diámetros en el intervalo de 60-180nm, y preferiblemente en el intervalo de 80-160nm, y/o (ii) el diámetro promedio (por intensidad por ejemplo promedio Z) de la población está idealmente en el intervalo de 60- 180nm, y preferiblemente en el intervalo de 80- 160nm. Los diámetros dentro de la pluralidad deben idealmente tener un índice de polidispercidad <0.2. Los complejos de ARN de liposoma de la referencia 1 se espera que tenga un diámetro en el intervalo de 600-800nm y que tengan una polidispersidad alta. Los diámetros en la población pueden medirse usando dispersión ligera dinámica.
Las técnicas para preparar liposomas adecuados son bien conocidas en el campo por ejemplo, ver referencias 4 hasta 6. Un método útil se describe en la referencia 7 e implica mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos (ü) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) solución amortiguadora, seguido por mezclado, equilibrio, dilución y purificación. Los liposomas preferidos de la invención son obtenibles por este proceso de mezclado. Para obtener liposomas con los diámetros deseados, el mezclado se puede realizar usando un proceso en el cual dos corrientes de alimentación de solución ARN acuosa se combinan en una zona de mezclado único con una corriente de una solución de lípido etanólico, todas en la misma velocidad de flujo por ejemplo, en un canal microf luídico como se describe a continuación.
Fórmula (I) Los lípidos catiónicos de la fórmula (I) son como siguen a continuación: en donde: R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalqüilo C3-2o, heterocicloalquenilo C3,2o , heterocicloalquinilo C3.2o o heteroarilo C5 - 2o opcionalmente sustituido; a está ausente o es alquinelo Ci- 4 opcionalmente sustituido; b está ausente o es alquinelo Ci- 4 opcionalmente sustituido; c está ausente o es alquinelo Ci- 4 opcionalmente sustituido; X1 es O o S; X2 es O o S; Y1 es Cio-3o alquenilo, C10-30 alquinilo, C10-30 heteroalquenilo o Ci0-3o heteroalquinilo; L está ausente o es - (La) d- (Lb) e- (Lc) f-en donde La es alquileno Ci_15 , alquenileno C1- 15 , alquinileno Ci. ?5, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno Ci-15 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-13 opcionalmente sustituido; Lc es alquileno C1-15, alquenileno C1-15, alquinileno Ci. 15, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno Ci-15 opcionalmente sustituido; d es 0 o 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
De este modo R1 y R2, junto con elátomo de nitrógeno al cula están adjuntos, forman un "grupo principal" cíclico con una amina terciaria. Estos compuestos se describen a más detalle en la referencia 8, los contenidos completos que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (II) : en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o, heterocicloalquenilo C3.2o heterocicloalquinilo C3.2o o heteroarilo C5 - 2o opcionalmente sustituido; a está ausente o es alquinelo Ci-4 opcionalmente sustituido; b está ausente o es alquinelo Ci-4 opcionalmente sustituido; c está ausente o es alquinelo Ci-4 opcionalmente sustituido; X1 es 0 o S; X2 es 0 o S; Y1 es alquenilo Ci0-30 , alquinilo Ci0 - 3o , heteroalquenilo Cio- 30 o heteroalquinilo C10-3o; L es -(La)d- (Lb)e- (Lc)f-en donde La es alquileno Ci-is , alquenileno C1-15, alquinileno Ci. 15, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno Ci- 15 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C3-i4 o heteroarileno C5 -i3 opcionalmente sustituido; L° es alquileno C1-15, alquenileno C1-15, alquinileno Ci-15, heteroalquileno C1 - 15 , heteroalquenileno Ci.15 o heteroalquinileno Ci-i5 opcionalmente sustituido; d es 0 o 1 ; e es 0 o l ; y f es 0 o 1 ; siempre y cuando L comprenda uno o más heteroátomos, y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (III) : en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o, heterocicloalquenilo C3-2o, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es 0 o S; X2 es O o S; Y1 es alquenilo Ci0-30 alquinilo C10-30, heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-30; L es -(La)d- (Lb)e- (Lc)f-en donde La es alquileno Ci-i5, alquenileno CÍ-ÍS, alquinileno Ci-15, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno Ci-15 o heteroalquinileno C1-15 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-i3 opcionalmente sustituido; Lc es alquileno C1-15, alquenileno Ci-i5, alquinileno Cx_ 15, heteroalquileno Ci-i5í heteroalquenileno Ci-15 o heteroalquinileno Ci-i5 opcionalmente sustituido; d es 0 o 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (IV) : en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo . C3-2o/ heterocicloalquenilo C3-2o/ heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es O o S; X2 es O O S; Y1 es alquenilo Ci0-30 alquinilo C10-3o/ heteroalquenilo io-30 o heteroalquinilo C10-30; L es -(La)d- (Lb)e- (Lc)f-en donde La es alquileno C1-15, alquenileno Ci-i5( alquinileno Ci-i5, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno i.is opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-i3 opcionalmente sustituido; Lc es alquileno Ci-i5, alquenileno Ci-i5, alquinileno Ci-15, heteroalquileno Í-IS, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno Ci_i5 opcionalmente sustituido; d es 0 o 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; siempre y cuando L comprenda uno o más heteroátomos , y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tiene la fórmula (V) : en donde: R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3.2o heterocicloalquenilo C3-2o, heterocicloalquinilo C3-20 o heteroarilo C5.2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es 0 o S,· X2 es 0 o S; Y1 es alquenilo Ci0-3o, alquinilo Ci0-3o# heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-30; L es -(La)d- (Lb)e- (Lc)f-en donde La es alquileno Ci-i5, alquenileno Ci-i5, alquinileno Ci_ 15, heteroalquileno i-i5, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno x-15 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-i3 opcionalmente sustituido; L° es alquileno Ci-15, alquenileno Ci-i5, alquinileno ??. i5, heteroalquileno Ci-i5, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno C1-15 opcionalmente sustituido; d es 0.0 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; siempre y cuando L comprenda uno o más heteroatomos Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (VI) : en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o/ heterocicloalquenilo C3-20, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es 0 o S; X2 es 0 o S; Y1 es alquenilo Ci0-3o# alquinilo C10-30, heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-3o; L es -Le-, en donde Le heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno Ci_iS opcionalmente sustituido; y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (VII) : en donde: R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o/ heterocicloalquenilo C3-2o/ heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es O o S; X2 es O o S; Y1 es alquenilo Ci0-3o, alquinilo C10-30, heteroalquenilo Cio-3o o heteroalquinilo Ci0-3o; L es -Le-, en donde Le heteroalquileno Ci-i5, heteroalquenileno C1-:L5 o heteroalquinileno Ci-i5 opcionalmente sustituido; y Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (VIII) : en donde: R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-20, heterocicloalquenilo 03-20, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno ,- c está ausente; X1 es O o S; X2 es O o S; Y1 es alquenilo C10-30, alquinilo C3.0-30/ heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-30; L es -Le-, en donde Le heteroalquileno Ci-15 heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno C1-15 opcionalmente sustituido; y Y2 es colesterol conectado a través del grupo hidroxi en la posición 3 del anillo de esteroide A, el átomo de hidrógeno de dicho grupo hidroxi estando ausente.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula (I) tienen la fórmula (IX) : (IX) en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3.2o, heterocicloalquenilo C3-20/ heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-20 opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es O o S; X2 es O o S; Y1 es alquenilo i0-30 alquinilo C10-30, heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-30; L es -(La)d- (Lb)e- (Lc)f-en donde La es alquileno Ci-i5, alquenileno C1-15, alquinileno Ci. 15, heteroalquileno C1-:L5í heteroalquenileno Ci-15 o heteroalquinileno Ci-i5 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-i3 opcionalmente sustituido; Lc es alquileno C1-15, alquenileno C1.15, alquinileno Ci. 15, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno Ci-i5 opcionalmente sustituido; d es 0 o 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; siempre y cuando L comprenda uno o más heteroatomos, Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido; y el pKa del compuesto es de aproximadamente 5.9 alrededor de 7.
En algunas modalidades los compuestos de la fórmula tienen la fórmula (X) : en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o, heterocicloalquenilo C3-2o, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido; a es metileno; b es metileno; c está ausente; X1 es 0 o S; X2 es O o S; Y1 es alquenilo C10-30, alquinilo C10-30/ heteroalquenilo Cio-30 heteroalquinilo C10-30; L es -(La)d- (Lb)e- (Lc)f-en donde La es alquileno C1-15, alquenileno C1-15, alquinileno Ci-15, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno Ci-i5 o heteroalquinileno Ci-i5 opcionalmente sustituido; Lb es arileno C6-i4 o heteroarileno C5-i3 opcionalmente sustituido; Lc es alquileno Ci-i5, alquenileno Ci-15, alquinileno Ci-i5, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno Ci- 5 opcionalmente sustituido; d es 0 o 1 ; e es 0 o 1 ; y f es 0 o 1 ; siempre y cuando L comprenda uno o más heteroátomos, Y2 es un esteroide opcionalmente sustituido; y el pKa del compuesto es de aproximadamente 4.5 alrededor de 6.2. a,b y c En una modalidad, a es un alquileno Ci-2 opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, a es alquileno Ci opcionalmente sustituido.
En una modalidad, b es alquileno C0-2 opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, b es alquileno Ci opcionalmente sustituido.
En una modalidad, c está ausente o es alquileno Ci opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, c está ausente.
En una modalidad, a, b y c son, si están presentes, no sustituidos.
El grupo principal En una modalidad, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o, heterocicloalquenilo C3.20, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5-2o- En una modalidad, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3_2o, heterocicloalquenilo C3-20, heterocicloalquinilo C3.20 o heteroarilo C5.2o opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o opcionalmente sustituido.
En una modalidad, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo C5-iS. En una modalidad adicional, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo C5-12 opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo Cs, grupo C6 o grupo C7. En una modalidad adicional, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman un grupo C5 o grupo C6 opcionalmente sustituido.
En una de las modalidades preferidas de esta invención, R1 y R2, junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos forman una especie que comprende al menos un átomo de hidrógeno.
En una modalidad, R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cuál están adjuntos se seleccionan de H1 a H48 como se proporciona en la Tabla 1.
- Porciones nombradas H1 a H' X1 y X2 En una modalidad, X1 es O. En otra modalidad, X2 es O. En una modalidad adicional, tanto X1 como X2 son O.
Ligador En una modalidad preferida, L comprende al menos un heteroatomo. Esto significa que la cadena que proporciona una liga directa entre X2 y Y2 tenga al menos un heteroatomo o, en otras palabras, que cualquier heteroatomo en un sustituyente en L no cuente para estos propósitos. En una modalidad adicional, L comprende al menos un átomo O.
En una modalidad, L comprende al menos dos heteroatomos. En una modalidad adicional, L comprende al menos dos O átomos .
En una modalidad, Lc es alquileno C1-15 o heteroalquileno Ci-15 opcionalmente sustituido. En una modalidad, Lc es alquileno Ci-i5 o heteroalquileno Cx-i5 opcionalmente sustituido y d y e son ambos 0.
En una modalidad, L° se selecciona de una de las fórmulas LC_I a L0-**1111. En una modalidad, L° se selecciona de una de las fórmulas L0"1 a L0"**1111 y d y ambos se seleccionan de 0.
-(CH^CKCH^- Le -(CH2)4- Lc-iii -CO(CH2).CO- -CO- LC"Y -COC¾OCH2CO- Lc -(CH2)20(CH2)2NHCO- Lc -(CH2)30(CH2)3- -(CH^- -(CHi CHCHjhC CHi^OiCHa)!- -(CHiJiOiCI-hhOCCH:):- -{C¾)iO{CH2)20CH(CH3)- L -< -(CH2)20{CH2)20C(=0)(CH2)2CO- -(CH2)iOC(=0)(CH2)2CO- ^c-»viii -(CH2)20(CH2)20CO-Lc- « -(CH2)2NHC(=0)CH20CH2C(=0)- -(CH2)2NHC(=0)(CH2)2C(=0)- Lc-«i -(CH2)2NHC(=0)- -(CH2)2NHC(=0)CH2NHC(=0)- -(CH¿)2NHC(=0)CH (cadena-lateral NHC(=0)-, en donde la cadena-lateral representa el grupo la linea punteada representando el enlace al resto de la molécula.
Ya que los grupos en los cuales L comprende al menos un heteroátomo se prefieren, Lc es preferiblmente seleccionado de Lc_i Lc"v a Lc"vli y Lc"ix a j_¡c'XJíiii .
En una modalidad, Lc es C1-15 heteroalquileno opcionalmente sustituido.
En una modalidad, Lc es un grupo Ci-n opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, L es un grupo Ci-9 opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, Lc es un grupo C3-a opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, en donde Lc es un grupo C4-7 opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, L es un grupo C5, Cs o C7 opcionalmente sustituido.
En una modalidad preferida, d es 0; e es 0, y f es 1. En una modalidad preferida, d es 0; e es 0, y f es 1 y Lc es, dentro de las longitudes de cadena establecidas anteriormente, heteroalquileno. i En una modalidad, Y1 es un grupo Ci2-28- En una modalidad adicional Y1 es un grupo Ci4-2s. En una modalidad adicional, Y1 es un grupo Ci5.24. En una modalidad adicional, Y1 es un grupo Ci6-22- En una modalidad adicional, la cadena Y1 es 18, 19, 20 o 21 átomos de largo.
Dentro de los intervalos de carbono establecidos arriba, Y1 es preferiblemente alquenilo o heteroalquenilo.
En una modalidad, Y1 tiene al menos un grupo alqueno. En una modalidad adicional, Y1 tiene 1, 2 o 3 grupos alqueno.
En una modalidad, Y1 tiene un grupo alqueno en la posición omega 3. En otra modalidad, Y1 tiene un grupo alqueno en al posición omega 6. En otra modalidad, Y1 tiene un grupo alqueno en la posición omega 9. En una modalidad adicional, Y1 tiene un grupo alqueno en dos o tres de las posiciones omega 3 , omega 6 y omega 9. En una modalidad, Y1 está no saturado en las posiciones omega 6 y omega 9. En otra modalidad, Y1 estáno saturado en las posiciones omega 3, omega 6 y omega 9. En una modalidad, Y1 está no saturado en la posición omega 9.
En una modalidad, Y1 tiene al menos un grupo no saturado cis. En una modalidad adicional, Y1 tiene al menos dos grupos alqueno no saturados cis. En una modalidad adicional, Y1 tiene al menos tres grupos alqueno no saturados cis. El al menos un grupo alqueno no saturado cis puede estar en una, dos o tres de las posiciones omega 3, omega 6 y omega 9. La no saturación en las cadenas de lípidos se discute en MacLachlan et al, Journal of Controlled Reléase 107 (2005) 276-287.
En una modalidad Y1 se selecciona de Y1"1 a ?1_?? como se proporciona en la Tabla 2.
?? En una modalidad, Y2 está ligado a L por medio de un átomo de oxígeno en el esteroide opcionalmente sustituido. En una modalidad adicional, Y2 está ligado a L por medio de un átomo de oxígeno en la posición 3 del anillo del esteroide A. En una modalidad adicional Y2 es un esterol en el cual el átomo de hidrógeno del grupo hidroxi en la posición 3 del anillo de esteroide A ha sido removido (y la conexión a L es a través del átomo de oxígeno de dicho grupo epoxi) .
En una modalidad dicho esterol se selecciona del grupo que consiste de: annasterol; avenasterol; beta-si tosterol; brasicasterol ; calciferol; campesterol ; calinosterol ; chinasterol ; colestanol; colesterol; coprostanol; cicloartenol ,· dehidrocolesterol desmosterol; dihydrocalciferol ; dihidrocolesterol ; dihidroergosterol ; dinosterol; epicolesterol ; ergosterol; fucosterol; hexahidrolumisterol ; hexaol; hidroxicolesterol ; lanosterol; lumisterol; parkeol; poriferasterol ; saringosterol ; sitostanol; sitosterol; estigmastanol ; estigmasterol ; weinbersterol ; zimosterol; ácidos biliares de esteróles (tales como ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido desoxicólico y ácido litocólico) ; y sales de los mismos.
En una modalidad adicional, el esterol es colesterol. pKa El pKa de un lípido es el pH en el cual 50% de los lípidos se cargan, yaciendo a la mitad entre el punto donde los lípidos se cargan completamente y el punto donde los lípidos están completamente no cargados. Puede medirse de varias maneras, pero se mide preferiblemente usando el método descrito a continuación. El pKa generalmente debe de medirse para el lípido solo más que para el lípido de contexto de una mezcla que también incluye otros lípidos por ejemplo no como se realiza en la referencia 2, que ve el pKa de un SNALP más que de los lípidos individuales) .
El pKa de un lípido se mide en agua en la temperatura y presión usando la siguiente técnica: • 2mM de solución de lípido en etanol se prepara pesando el lípido y disolviendo en etanol. 0.3mM de solución de ácido nitrosulfónico de tolueno de sonda fluorescente (TNS) en etanol ¡metanol 9:1 se prepara primero haciendo la solución de 3mM de TNS en metanol y después diluyendo a 0.3mM con etanol.
• Se prepara una solución amortiguadora que contiene fosfato de sodio, acetato de sodio de citrato de sodio y cloruro de sodio, en las concentraciones 20mM, 25mM, 20mM y 150 mM, respectivamente. La solución amortiguadora se rompe en ocho partes y el pH ajustado ya sea con 12N HCl o 6N NaOH a 4.44-4.52, 5.27, 6.15-6.21, 6.57, 7.10-7.20, 7.72-7.80, 8.27-8.33 y 10.47-1 1.12. 400uL de 2mM de solución de lípido y 800uL de O .3mM de solución TNS se mezclan. • 1.5\i , de mezcla sonda/lípido se agregan a 242. SiL, de solución amortiguadora en 1 mL de placa de 96 pozos. Esto se hace con las ocho soluciones amortiguadoras. Después de mezclar, lOOuL de cada mezcla de sonda/ lípido/solución amortiguadora se transfiere a 250uL black con placa de 96 pozos de fondo claro (por ejemplo model COSTAR 3904, Corning) .
•La fluorescencia de cada mezcla de sonda/lípido/solución amortiguadora se mide (por ejemplo con un espectrofotómetro SpectraMax M5 y software SoftMax pro 5.2) con 322nm de excitación, 431nm de emisión (autocierre en 20nm) .
• Después de la medición, el valor de fluorescencia de soporte de un pozo vacío en la placa de 96 pozos se sustrae de cada mezcla de sonda/lípido/solución amortiguadora. Los valores de intensidad de fluorescencia entonces se normalizan al valor del pH más bajo. La intensidad de fluorescencia normalizada se traza contra el pH y se proporciona una línea de mejor ajuste.
• Se encuentra el punto en la línea de mejor ajuste en el cual la intensidad de fluorescencia normalizada es igual a 0.5. Se encuentra el pH correspondiente a la intensidad de fluorescencia normalizada es igual a 0.5 y se considera el pKa del lípido.
Los mejores resultados inmunológicos se ven con los lípidos que tienen un pKa en el intervalo de 5.0 a 7.6. Dentro de este intervalo de pKa, los lípidos preferidos tienen un pKa de 5.5 a 6.7 por ejemplo entre 5.6 y 6.8, entre 5.6 y 6.3, entre 5.6 y 6.0, entre 5.5 y 6.2, o entre 5.7 y 5.9.
Compuestos específicos de la fórmula (I) Los compuestos específicos de la fórmula (I) que son útiles con la invención se describen en la referencia 8. Por ejemplo, el compuesto puede ser E0024, E0014, E0052, E0118, E0083, E0011, E0008, E0025, E0026, E0069, E0076, E0077, E0078, E0085 o E0088. El compuesto puede ser los lípidos mostrados a continuación que se usaron en los liposomas "RV03" to "RV12", o en los liposomas "RV15" . Los compuestos preferidos son E0026, E0069 y E0078. Los compuestos preferidos son los lípidos mostrados a continuación que se usaron en los liposomas "RV05", "RV08" y "RV09" .
En una modalidad alternativa, más que el uso de un compuesto de la fórmula (I) , un liposoma de la invención usa el compuesto "RV02" (estructura mostrada a continuación) . Excepto para esta sustitución, todos los otros aspectos de estos liposomas que contienen RV02 como se describen en cualquier otra parte de la presente.
Fórmula (XI) Los compuestos de la fórmula (XI) son lipopéptidos catiónicos que comprenden un alquilamida con término N y de 2 a 10 aminoácidos. La fórmula (XI) es: Ra- (AA) Z-Rb en donde Ra es n alquilamida de término N z es un entero de 2 a 10; cada AA es un aminoácido, siempre y cuando estén presentes al menos una histidina y al menos un aminoácido catiónico; Rb es -H, -OH o -NH2.
La porción Ra tiene la fórmula Rc-C(0)-NRd- donde Rc es un alquilo C2 a C24 y Rd es -H o C, para el alquilo C4. Los grupos Rc apropiados incluyen laurilo ('Lau' Ci2) y palmitoil ( - Pal1 ; Ci6) .
La amida de la porción Ra se adjunta a una cadena de oligopéptido desde 2 a 10 aminoácidos por ejemplo de 3-8 aminoácidos. Esta cadena incluye al menos una (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5) histidina. También incluye al menos un aminoácido catiónico por ejemplo al menos un residuo de arginina, lisina u ornitina. La inclusión de al menos una lisina es preferida, e idealmente 2 o 3 Usinas. La histidina se incluye ya que su cadena lateral es débilmente básica y predominantemente no ionizada en el pH fisiológico, pero está más latamente protonatada en el débilmente entorno acídico del endosoma. Un aminoácido catiónico, tal como lisina o arginina, proporciona una unidad de carga positiva en el lipopéptido en el pH neutral. Los oligopéptidos útiles tienen secuencia de aminoácidos -C-Ki-Hj- donde: i es 1, 2 o 3 ; y j es 1, 2, 3 , 4 o 5.
La C- terminal de la cadena de oligopéptido puede quedar como -COOH o en su lugar puede formar una amida.
Los compuestos de la fórmula (XI) pueden describirse en los términos de su cadena de alquilos, su secuencia de aminoácidos, y su grupo de C-terminal. Por ejemplo, el lipopéptido "Lau- ( C-K-H-H) -NH2" tiene una cadena de laurilo de término N, después una cisteína, después una lisina, después dos histidinas, y una amina de C-terminal . Los lipopéptidos idóneos de la fórmula (XI) de este modo incluyen, pero no se limitan a: Lau- (C-K-K-H) -NH2í Pal- (C-K-H-H) -NH2, Pal - ( C-K-K-H-H) -NH2 , Pal - (C-K-K-H-H-H)-NH2, Pal- (C-K-K-H-H-H-H) -NH2, Pal - ( C-K-K-H-H-H-H-H) -NH2, Pal- (C-K-K-K-H-H) -NH2 Y Pal - (C-K-K-K-H-H-H) -NH2. Estos y otros compuestos se describen en la referencia 9, e incluyen: El ARN Los liposomas de la invención incluyen una molécula de ARN que (a diferencia de siARN) codifica un inmunógeno. Después de la administración in vivo de las partículas, el ARN sé libera de las partículas y se traduce dentro de una célula para proporcionar el inmunógeno in situ.
El ARN es de hebra positiva, y de esta manera se puede traducir por células sin necesidad de ninguna de las etapas de replicación de intervención tal como transcripción inversa. También se puede, enlazar a receptores TLR7 expresados por células inmunitarias , iniciando de este modo un efecto adyuvante que es útil ppara propósitos de inmunización.
Los ARNs de hebra positiva preferidos son auto-replicantes. Una molécula de ARN auto-replicante (replicón) puede, cuando se suministra a una célula de vertebrado aún sin ninguna de las proteínas, llevar a la producción de múltiples ARNs hijos por la transcripción de sí mismos (por medio de una copia antisentido que se genera a partir de sí mismo) . Una molécula de ARN auto-replicante es así típicamente una molécula de hebra positiva que se puede traducir directamente después del suministro a una célula, y esta traducción proporciona una polimerasa de ARN dependiente de ARN que luego produce ambos transcriptos antisentido y sentido del ARN suministrado. Así el ARN suministrado lleva a la producción de múltiples ARNs hijos. Estos ARNs hijos, así como transcriptos subgenómicos colineales, se pueden traducir ellos mismos para proporcionar expresión in situ de un inmunógeno codificado, o se puede transcribir para proporcionar transcriptos adicionales con el mismo sentido como el ARN suministrado que se traducen para proporcionar expresión in situ del inmunógeno. El resultado general de esta secuencia de transcripciones es una amplificación enorme en el número de los ARNs de replicón introducidos y entonces el inmunógeno codificado se convierte en un producto de importante de las células.
Un sistema adecuado para lograr la auto-replicación es para usar un replicón ARN basado en alfavirus. Estos replicones de hebra positiva se traducen después de suministrar a una célula para dar de una replicasa (o replicasa-transcriptasa) . La replicasa se traduce como una poliproteína que se auto escinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de hebra negativa genómicas del ARN suministrado de hebra positiva. Estos transcriptos de hebra negativa pueden ellos mismos transcribirse para dar copias además del ARN precursor de hebra positiva y también para dar un transcripto transgénico que codifica el inmunógeno. La traducción del transcripto transgénico así lleva a expresión in situ del inmunógeno por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque Semliki, un virus de encefalitis equina del este, un virus de encefalitis equina de Venezuela, etc. Las secuencias de virus mutante o de tipo natural se pueden usar por ejemplo, el mutante TC83 atenuado de VEEV se ha usado en replicones [10] .
Una molécula de ARN auto-replicante preferida codifica de esta manera (i) una polimerasa de ARN dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN auto-replicante y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus por ejemplo, que comprende una o más de proteínas de alfavirus nsPl, nsP2, nsP3 y nsP4.
Aunque los genomas de alfavirus naturales codifican las proteínas de virión estructurales además de la poliproteína de replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN auto-replicante de la invención no codifique las proteínas estructurales de alfavirus. Así un ARN auto replicante preferido puede llevar a la producción de copias de ARN genómico de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo natural, la molécula de ARN auto-replicante no puede perpetuarse en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para perpetuación en virus de tipo natural están ausentes de ARN auto replicantes de la invención y su lugar se toma por genes que codifican el inmunógeno de interés, de tal manera que el transcripto transgénico codifica el inmunógeno antes que las proteínas de virión de alfavirus estructurales .
Así una molécula de ARN auto-replicante útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto (5') codifica una replicasa; El segundo marco de lectura abierto (3') codifica un inmunógeno. En algunas modalidades el ARN puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo, dirección descendente) por ejemplo, para codificar inmunógenos adicionales (ver abajo) o para codificar polipéptidos accesorios .
Una molécula de ARN auto-replicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
Las moléculas de ARN auto-replicante pueden tener diversas longitudes pero son típicamente 5000-25000 nucleótidos largos por ejemplo, 8000-15000 nucleótidos, o 9000-12000 nucleótidos. Así el ARN es mayor que lo visto en el suministro de siARN. una molécula de ARN útil con la invención puede tener una tapa 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina) . Esta tapa puede mejorar la traducción in vivo del ARN.
El nucleótido 51 de una molécula de ARN útil con la invención puede tener un grupo de trifosfato 5'. En un ARN sellado este se puede ligar a un 7-metilguanosina por medio de un puente 5' a 5' . Un trifosfato 5' puede mejorar RIG-I enlazada y así promueve efectos adyuvantes .
Una molécula de ARN puede tener una cola poli-A 31. Esto también puede incluir una secuencia de reconocimiento de polimerasa poli-A (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3 ' .
Una molécula de ARN útil con la invención típicamente será de cadena sencilla. Los ARNs de cadena sencilla pueden iniciar generalmente un efecto adyuvante al enlazar a TLR7, TLR8, helicasas de ARN y/o PKR. El ARN suministrado en forma de hebra doble (dsARN) puede enlazar a TLR3 , y su receptor también se puede activar por dsARN que se forma ya sea durante la replicación de un ARN de hebra sencilla o dentro de la estructura secundaria de un ARN de hebra sencilla. una molécula de ARN útil con la invención se puede preparar convenientemente por transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) . La IVT puede usar un cebador (cADN) creado y propagado en forma de plásmido en bacteria, o sintéticamente creado (por ejemplo por síntesis de gen y/o métodos fabricados por ingeniería de reacción de cadena de polimerasa) . Por ejemplo, una polimerasa de ARN dependiente de ADN (tal como el bacteriófago T7 , polimerasas de ARN T3 o SP6) se puede usar para transcribir el ARN de un cebador de ADN. El tapado y las reacciones de adición poli A apropiados se pueden usar como se requiera (aunque el poli-A del replicón se codifica usualmente dentro del cebador de ADN) . Estas polimerasas de ARN pueden tener requisitos estrictos para los nucleótidos 5' transcritos y en algunas modalidades estos requisitos deben corresponder con los requisitos de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN transcrito IVT puede funcionar eficientemente como un substrato para su replicasa auto-codificada.
Como se discutió en la referencia 11, el ARN auto-replicante puede incluir (además de cualquier estructura de tapa 5') uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada. Así el ARN puede comprender m5C (5-metilcitidina) , m5U (5-metiluridina) , m6A (N6-metiladenosina) , s2U (2 -thiouridina) , Um (2 ' -O-metiluridina) , mlA (1-metiladenosina) ; m2A (2-metiladenosina) ; Am (2'-0-metiladenosina) ; ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina) ; i6A (N6-isopenteniladenosina) ; ms2i6A (2 -metiltio- N6isopenteniladenosina) ; io6A (N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; ms2io6A (2-metiltio-N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina) ; t6A (N6-treonil carbamoiladenosina) ; ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina) ; m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina) ; hn6A (N6. -hidroxinorvalilcarbamoil adenosina) ; ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2 ' -O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina) ; mll (1-metilinosina) ; m'Im (l,2'-0-dimetilinosina) ; m3C ( 3 -metilcitidina) ; Cm (2T-0-metilcitidina) ; s2C (2-tiocitidina) ; ac4C (N4-acetilcitidina) ; f5C (5-fonnilcitidina) ; m5Cm (5,2-0-dimetilcitidina) ; ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina) ; k2C (lisidina) ; mlG ( 1-metilguanosina) ; m2G (N2-metilguanosina) ; m7G (7-metilguanosina) ,· Gm (2 ' -O-metilguanosina) ; m22G (N2 , 2-dimetilguanosina) ; m2Gm (N2 , 21 -O-dimetilguanosina) ; m22Gm (N2 , N2 , 21 -0-trimetilguanosina) ; Gr(p) (2'-0-ribosilguanosina (fosfato)); y (wibutosina) ; o2yW (peroxiwibutosina) ; OHyW (hidroxiwibutosina) ; OHyW* (hidroxiwibutosina sub-modificada) ; imG (wiosina) ; mimG (metilguanosina) ; Q (queuosina) ; oQ (epoxiqueuosina) ; galQ (galtactosil-queuosina) ; manQ (manosil-queuosina) ; preQo (7-ciano-7-deazaguanosina) ; preQi (7-aminometil-7-deazaguanosina) ; G* (arqueosina) ; D (dihidrouridina) ; m5Um (5 , 2 ' -O-dimetiluridina) ; s4U (4 -tiouridina) ; m5s2U (5-metil-2-tiouridina) ; s2Um (2-tio-21 -O-metiluridina) ; acp3U (3- (3-amino-3-carboxipropil) uridina) ; ho5U ( 5 -hidroxiuridina) ; mo5U (5-metoxiuridina) ; cmo5U (ácido 5-oxiacético de uridina) ; mcmo5U (éster de metilo del ácido 5-oxiacético de uridina) ; chm5U (5- (carboxihidroximetil) uridina) ) ; mchm5U (éster de metilo 5- (carboxihidroximetil) uridina) ; mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina) ; mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-0-metiluridina) ; mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina) ; nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina) ; mnm5U (5-metilaminometiluridina) ; mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina) ; mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina) ; ncm5U (5-carbamoilmetil uridina) ; ncm5Um (5-carbamoilmetil-21 -O-metiluridina) ; cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina) ; cnmm5Um (5 -carboximetilaminometil-2 -L-Ometiluridina) ; cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina) ; m62A (N6 , 6-dimetiladenosina) ; Tm (2 ' -O-metilinosina) ; m4C (N4-metilcitidina) ; m4Cm (N4 , 2 -O-dimetilcitidina) ; hm5C (5-hidroximetilcitidina) ; m3U (3 -metiluridina) ; cm5U (5-carboximetiluridina) ; m6Am (N6 , -O-dimetiladenosina) ; rn62Am (N6 , N6 , 0-2-trimetiladenosina) ; m2 ' 7G (N2 , 7-dimetilguanosina) ; m212 ' 7G (N2,N2, 7-trimetilguanosina) ; m3Um (3,2T-0-dimetiluridina) ; m5D (5-metildihidrouridina) ; f5Cm (5-formil-21 -O-metilcitidina) ; mlGm (1 , 21 -O-dimetilguanosina) m'Am ( 1 , 2 -0-dimetil adenosina) irinometiluridina) ; tm5s2U (S-taurinometil-2 -tiouridina) ) ; imG-14 (4-demetil guanosina) ; imG2 (isoguanosina) ; o ac6A (N6-acetiladenosina) , hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados 7-substituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2 -tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5- (C1-C6) -alquiluracilo, 5-metiluracilo, 5- (C2-C6) -alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5- (hidroximetil) uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5 -hidroxicitosina, 5- (C1-C6) -alquilcitosina, 5 -metilcitosina, 5- (C2-C6) -alquenilcitosina, 5- (C2-C6) -alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromoci osina, N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, 7-deaza-7-guanina substituida, 7-deaza-7- (C2-C6) alquinilguanina, 7-deaza-8-guanina substituida, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2 , 4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina substituida, 7-deaza-7-purina substituida, 7-deaza-8-purina substituida, o un nucleótido básico. Por ejemplo, un ARN auto-replicante puede incluir una o más nucleobases de pirimidina modificada, tales como pseudouridina y/o residuos de 5-metilcitosina. En algunas modalidades, sin embargo, el ARN incluye nucleobases no modificadas, y puede incluir nucleótidos no modificados esto es, todos de los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos A, C, G y U estándares (excepto para cualquier estructura de tapa 5', que puede incluir una 7'-metilguanosina) . En otras, modalidades, el ARN puede incluir una tapa 51 que comprende una 71 -metilguanosina, y los primeros 1, 2 ó 3 5' ribonucleótidos se pueden metilar en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención idealmente incluye únicamente ligaduras de fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas modalidades esto puede contener ligaduras de fosforamidato, fosforotioato, y/o metilfosfonato .
Idealmente, un liposoma incluye menos que 10 diferentes especies de ARN por ejemplo, 5, 4, 3, ó 2 diferentes especies; más preferiblemente, un liposoma incluye una especie de ARN simple esto es, todas las moléculas de ARN en el liposoma tienen la misma secuencia y misma longitud.
La cantidad de ARN por liposoma puede variar. El número de moléculas de ARN auto-replicante individuales por liposoma es típicamente <50 por ejemplo, <20, <10, <5, o 1-4 por liposoma .
El polipeptido codificado de interés Las moléculas de ARN usadas con la invención codifican un polipéptido de interés. Después de la administración de los liposomas de ARN se trasladan in vivo y la proteína resultante puede ejercer su efecto deseado por ejemplo puede provocar una respuesta inmunitaria en el recipiente, o puede proporcionar una función de interés, tal como una actividad enzimática.
La molécula de ARN puede codificar un polipéptido sencillo de interés o polipéptidos múltiples. Los polipéptidos múltiples pueden presentarse como un polipéptido sencillo (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados . Si los polipéptidos se expresan como polipéptidos separados de un replicón entonces uno o más de estos pueden proporcionarse con un IRES corriente arriba o un elemento promotor viral adicional. Alternativamente, pueden expresarse polipéptidos múltiples de una poliproteína que codifiquen el polipéptido individual fusionado a una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo enfermedad de pies y manos de la proteína 2A del virus), o como inteínas.
A diferencia de las referencias 1 y 12, el ARN codifica un polipéptido con una función in vivo útil. Para evitara la duda, la invención no abarca el ARN que codifica una luciferasa luciérnaga luciferasa o que codifica una proteína de fusión de E.coli ß-galactosidasa o que codifica una proteína de fluorescencia verde (GFP, por sus siglas en inglés) . Tales polipéptidos pueden ser útiles como marcadores pero a la invención le preocupa la entrega de ARN para expresión in vivo de un polipéptido que puede proporcionar un uso terapéutico o respuesta inmunológica . También, el ARN no es ARN de timus de ratón total.
El in unógeno En algunas modalidades el ARN codifica un inmunógeno de polipéptido. Después de la administración de los liposomas el ARN se traduce in vivo y el inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria en el recipiente. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito (o, en algunas modalidades, contra un alérgeno; y en otras modalidades, contra un antígeno del tumor) . La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta de anticuerpo (usualmente que incluye IgG) y/o una respuesta inmunitaria mediada por la célula. El inmunógeno de polipéptido típicamente provocará una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido fúngico o de parásito (o alérgeno o de tumor) , viral, bacteriano correspondiente, pero en algunas modalidades el polipéptido puede actuar como un mimótopo para provocar una respuesta inmunitaria que reconoce un sacárido bacteriano, viral, fúngico o de parásito. El inmunógeno típicamente será un polipéptido de superficie por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glicoproteína de envoltura, una glicoproteína de pico, etc.
En algunas modalidades el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra una de estas bacterias : Neisseria meningitidis los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas de membrana tales como adhesinas, autotransportadores , toxinas, proteínas de adquisición de hierro, y proteína de enlace de factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles se describe en la referencia 13.
Streptococcus pneumoniae: los inmunógenos de polipéptido útiles se describen en referencia 12. Estos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad pilus RrgB, el precursor beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057) , spr0096, Proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216) , serina/treonina quinasa StkP (SP1732) , y adhesina PsaA de superficie neumocócica.
Streptococcus pyogenes: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 15 y 16.
Moraxella catarrhalis .
Bordetella pertussis: Los inmunógenos de tosferina útiles incluyen, pero no se limitan a, toxoide o toxina de tosferina (PT) , hemaglutinina filamentosa (FHA) , pertactina, y aglutinógenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 17, tales como una hemolisina, esxA, esxB, proteína que enlaza ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína staOll.
Clostridium tetani el inmunógeno típico es toxoide tetánico .
Corynebacterium diphtheriae: el inmunógeno típico es toxoide de difteria.
Haemophilus influenzae: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 18 y 19.
Pseudomonas aeruginosa .
Streptococcus agalactiae: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 15.
Chlamydia trachomatis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA y MurG (por ejemplo, como se describen en la referencia 18. LcrE [21] y HtrA [22] son dos inmunógenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 23.
Helicobacter pylori: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, CagA, VacA, NAP, y/o ureasa [24] .
Escherichia coli: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, inmunógenos derivados de enterotoxigénica E. coli (ETEC) , entero agregado E. coli (EAggEC) , adherido difusamente E. coli (DAEC) , enteropatogénico E. coli (EPEC) , patogénico extraintestinal E. coli (ExPEC) y/o enterohemorrágico E. coli (EHEC) . Las cepas ExPEC incluyen uropatogénico E. coli (UPEC) y meningitis/E. coli asociada con sepsis (MNEC) . Los inmunógenos de polipéptido UPEC útiles se describen en las referencias 25 y 25. Los inmunógenos MNEC útiles se describen en la referencia 27. Un inmunógeno útil para diversos tipos de E.coli es AcfD [28] .
Bacillus anthracis .
Yersinia pestis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las referencias 29 y 30.
Staphylococcus epidermis.
Clostridium perfringens o Clostridium botulinums .
Legionella pneumophila.
Coxiella burnetii Brucella, tal como B.abortus, B.canis, B.melitensis, B.neoto ae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.
Francisella, tal como F. novicida, F.philomiragia, F. tularensis .
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Haemophilus ducreyi Enterococcus faecalis o Enterococcus faeciu Staphylococcus saprophyticus Yersinia enterocolitica Mycobacterium tuberculosis Rickettsia Listeria monocytogenes Vibrio cholerae Salmonella typhi Borrelia burgdorferi Porphyromonas gingivalis Klebsiella En algunas modalidades el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra uno de estos virus: Orthomyxovirus : Los inmunogenos útiles pueden ser de un virus . de influenza A, B o C, tales como las proteínas hemaglutinina, neuraminidasa o matriz M2. Donde el inmunógeno es un virus de hemaglutinina de influenza A este puede ser de cualquier subtipo por ejemplo, Hl, H2 , H3 , H4 , H5 , H6 , H7 , H8, H9, H10, Hll, H12, H13 , H14 , H15 o H16.
Paramyxoviridae viruses: Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Pneumoviruses (por ejemplo, virus sincitial respiratorio, RSV) , Rubulaviruses (por ejemplo, virus de paperas) , Paramyxoviruses (por ejemplo, virus de parainfluenza) , Metapneumoviruses y Morbilliviruses (por ejemplo, virus de sarampión) .
Poxviridae: Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Orthopoxvirus tal como Varióla vera, que incluye pero no se limita a, Varióla major y Varióla minor.
Picornavirus: Los inmunogenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Picornaviruses, tales como Enteroviruses, Rhinoviruses, Heparnavirus, Cardioviruses y Aphthoviruses . En una modalidad, el enterovirus es un virus de polio por ejemplo, un virus de polio tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra modalidad, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra modalidad, el enterovirus es un virus de coxsackie A o B.
Bunyavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Orthobunyavirus, tal como virus de encefalitis de California, un Phlebovirus, tal como virus de Fiebre del Valle de Rift, o un Nairovirus, tal como virus de fiebre hemorrágica de Crimean-Congo.
Heparnavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Heparnavirus, tal como virus de hepatitis A (HAV, por sus siglas en inglés) .
Filovirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un filovirus, tal como un virus Ebola (que incluye un virus del ébola de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudán) o un virus Marburg.
Togavirus Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Togavirus, tales como un Rubivirus, un Alphavirus, o un Arterivirus . Este incluye virus de rubéola.
Flavivirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Flavivirus, tal como virus de encefalitis transmitido por Garrapatas (TBE) , virus del Dengue (tipos 1, 2, 3 o 4) , virus de Fiebre Amarilla, virus de · encefalitis Japonesa, Virus del Bosque Kyasanur, virus de encefalitis del Nilo Occidental, virus de encefalitis de San Luis, Virus de encefalitis de primavera-verano Ruso, Virus de encefalitis de Powassan.
Pestivirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Pestivirus, tal como Diarrea viral bovina (BVDV, por sus siglas en inglés) , Peste porcina clásica (CSFV, por sus siglas en inglés) o Enfermedad de la frontera (BDV, por sus siglas en inglés) .
Hepadnavirus : Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Hepadnavirus, tal como virus de Hepatitis B. Una composición puede incluir antígeno de superficie de virus de la hepatitis B (HBsAg) .
Otros virus de la hepatitis: Una composición puede incluir un inmunógeno de un virus de la hepatitis C, virus de hepatitis delta, virus de la hepatitis E, o virus de la hepatitis G.
Rhabdovirus-, Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Rhabdovirus, tal como un Lyssavirus (por ejemplo, un virus de Rabia) y Vesiculovirus (VSV) .
Caliciviridae-. Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Calciviridae, tal como virus de NorwAlq (Norovirus) , y Virus tipo NorwAlq, tales como Virus de Hawái y Virus de la Montaña Nevada.
Coronavirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un coronavirus SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV, por sus siglas en inglés) , Virus de hepatitis de ratón (MHV, por sus siglas en inglés) , y Virus de gastroenteritis transmisible porcina (TGEV, por sus siglas en inglés) . El inmunógeno coronavirus puede ser un polipéptido de pico.
Retrovirus : Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) o un Spumavirus.
Reovirus Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Orthoreovirus , un Rotavirus, un Orbivirus, o un Coltivirus.
Parvovirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Parvovirus B19.
Herpesvirus: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un virus del herpes humano, tal como, a modo de ejemplo únicamente, Virus del Herpes Simple (HSV, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, HSV tipos 1 y 2) , Virus de varicela zoster (VZV, por sus siglas en inglés) , virus de Epstein-Barr (EBV) , Citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) , virus del Herpes humano 6 (HHV6) , virus del Herpes humano 7 (HHV7) , y virus del Herpes humano 8 (HHV8) .
Papovaviruses: Los inmunógenos virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de virus de Papiloma y virus de Polioma. El virus de papiloma (humano) puede ser de serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65 por ejemplo, de uno o más de serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: Los inmunógenos virales incluyen aquellos derivados de adenovirus serotipo 36 (Ad-36) .
En algunas modalidades, el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta a peces, tales como: virus de anemia de salmón infecciosa (ISAV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad pancreática de salmón (SPDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis pancreática infecciosa (IPNV, por sus siglas en inglés) , virus de bagre de canal (CCV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad de linfocitis de pez (FLDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV, por sus siglas en inglés) , virus del herpes del koi, virus tipo picorna del salmón (también conocido como virus tipo picorna de salmón del atlántico) , virus de salmón de río (LSV, por sus siglas en inglés) , rotavirus de salmón del atlántico (ASR, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad de fresa de trucha (TSD, por sus siglas en inglés) , virus de tumor de salmón coho (CSTV, por sus siglas en inglés) , o virus de septicemia hemorrágica viral (VHSV, por sus siglas en inglés) .
Los inmunógenos fúngicos pueden ser derivados de Dermatofitos , que incluyen: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporu · distortum, Microsporum equinu , Microsporum gypsu , Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini , Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. álbum, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi , Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blasto yces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp. , Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; las menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneu ocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporu ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii , Trichosporon beigelii , Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp. , Fonsecaea spp. , Wangiella spp. , Sporothrix spp. , Basidiobolus spp. , Conidiobolus spp. , Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusariu spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, RhizocLonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
En algunas modalidades el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito del género Plas odium, tales como P. falciparu , P.vivax, P.malariae o P. ovale. Asi la invención se puede usar para inmunizar contra la malaria. En algunas modalidades el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellos de los géneros Lepeophtheirus y Caligus por ejemplo, piojos de mar tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi .
En algunas modalidades el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra: alérgenos polínicos (alérgenos polínicos de árbol, hierba, maleza, y pasto) ; alérgenos de insecto o de arácnidos (alérgenos inhalantes, de saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y mosquitos, alérgenos de veneno de himenopteros) ; alérgenos de cabello y caspa de animal (de por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de alimentos (por ejemplo, una gliadina) . Los alérgenos polínicos importantes de árboles, pastos y hierbas son de este tipo procedentes de las ordenes taxonómicas de Fágales, Oléales, Piñales y platanáceas que incluyen, pero no se limitan a, abedul (Betula) , aliso (Alnus) , avellano (Corylus) , carpe (Carpinus) y olivo (Olea) , cedro (Cryptomeria y Juniperus) , árbol de plátano (Platanus) , el orden de Poales que incluye pastos de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale, y Sorghum, las órdenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia, y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de ácaros de polvo doméstico del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaro de almacenamiento por ejemplo, Lepiperrolyphys, Glycyphagus y Tyrophagus , aquellos de cucarachas, mosquitos y pulgas por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y aquellos de los mamíferos tales como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno que incluyen tales procedentes de picaduras o mordidas de insectos tales como aquellos del orden taxonómico de himenóptero que incluye abejas (Apidae) , avispas (Vespidea) , y hormigas (Formicoidae) .
En algunas modalidades el inmunogeno es un antígeno del tumor seleccionado de: (a) antígenos de cáncer de testículo tales como polipéptidos de la familia NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1 , MAGE-2 , MAGE-3 , MAGE-4 , MAGE-5 , MAGE- 6 , y MAGE-12 (que se pueden usar, por ejemplo, para dirigir tumores de melanoma, pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, de mama, gastrointestinal, y de vejiga; (b) antígenos imitados, por ejemplo, p53 (asociados con diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorectal, de pulmón, de cabeza y de cuello) , p2l/Ras (asociado con, por ejemplo, cáncer por melanoma, cáncer pacreático y cáncer colorectal) , CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma) , MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma) , caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello) , CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga) , HLA-A2 -R1701 , beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma de no Hodgkins de célula T) , BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica) , isomerasa de triosefosfato, KIA 0205, CDC-27, y LDLR-FUT; (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociado con, por ejemplo, cáncer colorectal) , Galectina 9 (asociado con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin) , proteinasa 3 (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica) , T 1 (asociado con, por ejemplo, diversas leucemias) , anhidrasa carbónica (asociado con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociado con, por ejemplo, cáncer de pulmón) , PRAME (asociado con, por ejemplo, melanoma) , HER-2/neu (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, de pulmón y de ovario) , mamaglobina, alfa-fetoproteína (asociado con, por ejemplo, hepatoma) , KSA (asociado con, por ejemplo, cáncer colorectal) , gastrina (asociado con, por ejemplo, cáncer pancreático y gástrico) , proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y ovario) , G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de célula renal) , p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, y de colon) , y antígeno carcinoembriónico (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, y cánceres del tracto gastrointestinal tal como cáncer colorectal) ; (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocito tales como MART-l/Melan A, gplOO, MC1R, receptor de hormona de estimulación de melanocito, tirosinasa, tirosinasa relacionada con proteína-1/TRP1 y tirosinasa relacionada con proteína-2/TRP2 (asociado con, por ejemplo, melanoma); (e) antígenos asociados con -la próstata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociado Con por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociado con mieloma y linfornas de célula B, por ejemplo) . En ciertas modalidades, los inmunógenos de tumor incluyen, pero no se limitan a, pl5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos de virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos de virus de papiloma humano (HPV) , que incluye E6 y E7, antígenos de virus de hepatitis B y C, antígenos de virus linfotrópico de célula T, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7 , 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM) , HTgp-175, M344, MA-50, MG7 -Ag, M0V18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Proteína de enlace Mac-2/proteína asociada C ciclofilina) , TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y similares.
Terapia de gen En algunas modalidades el ARN codifica un polipéptido que es útil en un contexto de terapia de gen. Esta proteína codificada se proporciona en adición a cualquiera de los polipéptidos que se codifican para la habilidad de ARN para auto replicarse. De este modo el ARN puede codificar una enzima (por ejemplo, una enzima que no enlace a ARN) , una citoquina, un receptor de transmembrana, un canal de ion, una hormona, una proteína de sangre, o un anticuerpo. El ARN preferiblemente codifica un polipéptido humano en estas categorías .
Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a : alfa polimerasa ADN, delta polimerasa de ADN, Las citoquinas de interés incluyen, pero no se limitan a: interleucina 1; interleucina 2; interleucina 4; interleucina 6; interleucina 7; interleucina 12; interleucina 17; GM-CSF; G-CSF; TNF-alfa; alfa interferon; beta interferon; gamma interferon; y secretoneurina .
Los receptores de interés incluyen, pero no se limitan a: el receptor leptina; el receptor de lipoproteína de baja densidad; el receptor del tipo 2 de proteína morfogenética de hueso; el receptor TNF; el receptor de hormona de liberación de gonadotropina; el receptor de dopamina; el receptor de somatostatina; el receptor de vitamina D; el receptor activador de plasminógeno uroquinasa; el receptor de tranferrina; etc.
Los canales de ion de interés incluyen, pero no se limitan a: HCN2; HCN4 ; CFTR; la subunidad a del canal Maxi-K; KCNQ2; KCNQ3; y Kvl .5.
Las hormonas de interés incluyen, pero no se limitan a: gonadotropina coriónica; corticotropina; eritropoyetina; glucagón; IGF-1; oxitocina; derivado de plaquetas factor de crecimiento; calcitonina; hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante; hormona estimulante del tiroides; insulina; hormona liberadora de gonadotropina; vasopresina; somatostatina; prolactina; adrenocorticotrópica hormona, hormona antidiurética; hormona liberadora de tirotropina; octreotida; hormona de crecimiento humana; relaxina; crecimiento hormona liberadora de hormona, hormona paratiroidea; calcitrol; calciferol ; -péptido natriurético atrial; gastrina; secretina; colecistoquinina; leptina; Y neuropéptido; grelina; angiotensinogen; dopamina; y trombopoietin. Donde una hormona requiere subunidades de polipéptido múltiple para actividad, el AR puede codificar una o más de las subunidades por ejemplo el ARN puede codificar la subunidad alfa y/o la subunidad beta de la hormona de estimulación de folículo.
Las proteínas de sangre de interés incluyen, pero no se limitan a: haemoglobina; fibrinógeno; factor VII; factor Vila; factor VIII; factor IX; fibrinogen; trombin; factor von illebrand.
Composiciones farmacéuticas Los liposomas de la invención son útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra diversas enfermedades. Estas composiciones típicamente incluirán un portador farmacéuticamente aceptable además de los liposomas . Una discusión completa de portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 31. una composición farmacéutica de la invención puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista TLR2 (por ejemplo, Pam3CSK4) , un agonista TLR4 (por ejemplo, un aminoalquil glucosaminida fosfato, tal como E6020) , un agonista TLR7 (por ejemplo, imiquimod) , un agonista TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista TLR9 (por ejemplo, IC31) . Cualquier agonista tal idealmente tiene un peso molecular de <2000Da. En algunas modalidades tales agonistas también se encapsulan con los liposomas dentro del AR , pero en otras modalidades están sin encapsular.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir los liposomas en agua corriente (por ejemplo, w.f.i.) o en una solución amortiguadora por ejemplo, una solución amortiguadora de fosfato, una solución amortiguadora Tris, una solución amortiguadora de borato, una solución amortiguadora de succinato, una solución amortiguadora de histidina, o una solución amortiguadora de citrato. Las sales de solución amortiguadora típicamente se incluirán en el intervalo 5-20mM.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener un pH entre 5.0 y 9.5 por ejemplo, entre 6.0 y 8.0.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml NaCl es típica por ejemplo, alrededor de 9 mg/ml.
Las composiciones de la invención pueden incluir queladores de ion de metal. Estos pueden prolongar la estabilidad de ARN al remover iones que pueden acelerar la hidrólisis de fosfodiéster . Así una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc. Tales queladores típicamente se presentan entre 10-500µ? por ejemplo, O.lmM. Una sal de citrato, tal como citrato de sodio, también puede actuar como un quelador, mientras que también ventajosamente proporciona actividad amortiguadora.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservadores, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol . Las composiciones libres de mercurio se prefieren, y las vacunas libres de conservador se pueden preparar .
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferiblemente estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferiblemente no pirogénicas por ejemplo, que contienen <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferiblemente <0.1 EU por dosis.
Las composiciones farmacéuticas de la invención están preferiblemente libres de gluten.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en forma de dosis unitaria. En algunas modalidades una dosis de unidad puede tener un volumen de entre 0.1-1. Oml por ejemplo, alrededor de 0.5ml .
Las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición se puede preparar para administración pulmonar por ejemplo, por un inhalador, usando un atomizador fino. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular por ejemplo, como rocío o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son típicos.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de liposomas, así como cualquiera de otros componentes, según sea necesario. Por ? cantidad inmunológicamente efectiva' , se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es efectivo para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratarse, edad, el grupo taxonómico del individuo a tratarse (por ejemplo, primate de humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo a sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. El liposoma y contenido de AR de las composiciones de la invención generalmente se expresará en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene ARN =l00pg (por ejemplo, desde 10- lOOpg, tal como alrededor de 10 g, 25µg, 50pg, 75pg o lOO g) , pero la expresión se puede ver en niveles mucho mayores por ejemplo, =^g/dosis, =100ng/dosis , =10ng/dosis, =lng/dosis, etc .
La invención también proporciona un dispositivo de suministro (por ejemplo, jeringa, nebulizador, rociador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo se puede usar para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
LOS liposomas de la invención no contienen ribosomas.
Métodos de tratamiento y usos médicos En contraste con las partículas descritas en la referencia 12, los liposomas y composiciones farmacéuticas de la invención son para uso in vivo para obtener una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno de interés, o para una terapia de gen.
La - invención proporciona un método para elevar una respuesta inmunitaria en un vertebrado que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de un liposoma o composición farmacéutica de la invención. La respuesta inmunitaria es preferiblemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos e/o inmunidad mediada por célula. El método puede elevar una respuesta amplificadora.
La invención también proporciona un liposoma o composición farmacéuitica de la invención para unos en un método para elevar una respuesta inmunitaria en un vertebrado .
La invención también proporciona el uso de un liposoma de la invención en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta en un vertebrado .
La invención también proporciona el uso de un liposoma de la invención en la fabricación de un medicamento para elevar una respuesta inmunitaria en un vertebrado.
Al elevar una respuesta inmunitaria en el vertebrado por estos usos y métodos, el vertebrado se puede proteger contra diversas enfermedades y/o infecciones por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o virales como se discute arriba. Los liposomas y composiciones son inmunogénicos , y son más preferiblemente composiciones de vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser ya sea profilácticas (esto es, para prevenir la infección) o terapéuticas (esto es, para tratar la infección) , pero típicamente serán profilácticas .
El vertebrado es preferiblemente un mamífero, tal como un humano o un mamífero veterinario grande (por ejemplo, caballos, vacas, ciervos, cabras, cerdos) . Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o bebe) o un adolescente; donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferiblemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada para niños también se puede administrar a adultos por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención se pueden usar para tratar tanto a niños como adultos. Así un paciente humano puede ser menor de 1 año de edad, menor de 5 años de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, =50 años de edad, =60 años de edad, y preferiblemente =65 años) , los jóvenes (por ejemplo, =5 años de edad) , pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, personal militar y de servicio armado, mujeres embarazadas, los enfermos crónicos, o pacientes inmunodeficientes . Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar más generalmente en una población.
Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. El suministro directo se puede realizar por inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, de forma intraperitoneal, intravenosamente, intramuscularmente , intradermalmente , o al espacio intersticial de un tejido a diferencia de la referencia 1, la inyección intraglosal no se usa típicamente con la presente invención) . Las vías de suministro alternativas incluyen administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, rocío) , bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdermal o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosal . La administración intradermal e intramuscular son dos vías preferidas. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero la inyección libre de aguja alternativamente se puede usar. Una dosis intramuscular típica es 0.5 mi.
La invención se puede usar para provocar inmunidad sistémica y/o de mucosa, preferiblemente para provocar una inmunidad sistémica y/o de mucosa mejorada.
La dosificación puede ser por un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Las dosificaciones múltiples se pueden usar en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples las diversas dosificaciones se pueden dar por la misma o diferentes vías por ejemplo, un refuerzo principal parenteral y de mucosa, un refuerzo principal de mucosa y parenteral, etc. Las dosificaciones múltiples típicamente se administrarán al menos 1 semana aparte (por ejemplo, alrededor de 2 semanas, alrededor de 3 semanas, alrededor de 4 semanas, alrededor de 6 semanas, alrededor de 8 semanas, alrededor de 10 semanas, alrededor de 12 semanas, alrededor de 16 semanas, etc.). En una modalidad, las dosificaciones múltiples se pueden administrar aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo, en una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se usa frecuentemente en el Programa Ampliado de la Organización Mundial de la Salud en Inmunización ("EPI", por sus siglas en inglés). En una modalidad alternativa, dos dosificaciones primarias se administran alrededor de dos meses de diferencia, por ejemplo, alrededor de 7, 8 o 9 semanas de diferencia, seguido por una o más dosificaciones de refuerzo alrededor de 6 meses hasta 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo, alrededor de 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una modalidad adicional, tres dosificaciones primarias se administran alrededor de dos meses de diferencia, por ejemplo, alrededor de 7, 8 o 9 semanas de diferencia, seguido por una o más dosificaciones de refuerzo alrededor de 6 meses hasta 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo, alrededor de 6, 8, 10, o 12 meses después de la tercera dosis primaria.
Términos y definiciones químicas Halo El término "halógeno" (o "halo") incluye flúor, cloro, bromina y yodo.
Alquilo, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo etc .
Los términos "alquilo" , "alquinelo" , "alquenilo" y "alquinilo" se usan en la presente para referirse tanto a las formas acíclicas de cadena ramificada como de recta. Los análogos cíclicos de las mismas se refiren a cicloalquilo, etc .
El término "alquilo" incluye grupos hidrocarbil acíclicos monovalentes, saturados, rectos o ramificados. En una modalidad alquilo es alquilo Ci-io, en otra modalidad alquilo Ci-6 en otra modalidad alquilo Ci-4, tal como grupos metilo, etilo, n-propilo, i-propilo o t-butilo.
El término "cicloalquilo" incluye grupos hidrocarbil cíclico monovalentes, saturados, grupos hidrocarbil cíclicos, en una modalidad cicloalquilo es cicloalquilo Ci-i0, en otra modalidad cicloalquilo C3_s tal como ciclopentilo y ciclohexilo .
El término "alcoxi" se refiere a alquilo-0- .
El término "alquenilo" incluye grupos hidrocarbilo acíclico monovalente, no saturado, recto o ramificado, que tienen al menos un enlace doble carbono-carbono y, en una modalidad, sin enlace triple carbono-carbono . En una modalidad alquenilo es cicloalquenilo C2-io, en otra modalidad alquenilo C2-s/ en otra modalidad alquenilo C2-4.
El término "cicloalquenilo" incluye grupos hidrocarbilo cíclicos monovalentes, parcialmente no saturados, que tienen al menos un enlace doble carbono-carbono y, en una modalidad, sin enlaces triples carbono-carbono . En una modalidad cicloalquenilo es cicloalquenilo C3_10, en otra modalidad cicloalquenilo C5-10, por ejemplo ciclohexenilo o benzociclohexilo .
El término "alquinilo" incluye grupos hidrocarbilo acíclico monovalente, no saturado, rectos o ramificados, que tiene al menos un enlace triple carbono-carbono y, en una modalidad, sin enlaces dobles carbono-carbono . En una modalidad, alquinilo es alquinilo C2-io, en otra modalidad alquinil C2-6, en otra modalidad alquinilo C2-4.
El término "cicloalquinilo" incluye grupos hidrocarbilo cíclicos, monovalentes, parcialmente no saturados, que tienen al menos un enlace triple carbono-carbono y, en una modalidad, sin enlaces dobles carbono-carbono . En una modalidad cicloalquinilo es cicloalquenilo C3-i0, en otra modalidad cicloalquinilo C5-i0.
El término "alquileno" incluye grupos hidrocarbilo acíclico divalentes, rectos o ramificados, saturados. En una modalidad alquileno es alquileno C^-io, en otra modalidad alquileno Ci-6, en otra modalidad alquileno Ci-4, tal como grupos metileno, etileno, n-propileno, i-propileno o t-butileno.
El término "alquenileno" incluye grupos hidrocarbilo acíclicos divalentes, rectos o ramificados, no saturados, que tiene al menos un enlace doble carbono-carbono y, en una modalidad, sin enlaces triples carbono-carbono . En una modalidad alquenileno es alquenileno C2-i0, en otra modalidad alquenileno C2-6, en otra modalidad alquenileno C2-4.
El término "alquinileno" incluye grupos hidrocarbilo acíclicos divalentes, rectos o ramificados, no saturados, que tienen al menos un enlace triple carbono-carbono triple y, en una modalidad, sin enlaces dobles de carbono-carbono . En una modalidad alquinileno es alquinileno C2-io, en otra modalidad alquinileno C2-6, en otra modalidad alquinileno C2-4.
Heteroalquilo etc.
El término "heteroalquilo" incluye grupos alquilo en los que hay hasta seis átomos de carbono, en una modalidad hasta cinco átomos de carbono, en otra modalidad hasta cuatro átomos de carbono, en otra modalidad hasta tres átomos de carbono, en otra modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada una se remplaza independientemente por O, S(0)q, N, P(0)r o Si (y preferiblemente 0, S(0)q o N) , siempre y cuando se mantenga al menos uno de los átomos de carbono alquilo. El grupo heteroalquilo puede estra ligado a C o hetero ligado, es decir puede estar ligado a un resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de 0, S(0)q, N, P(0)r o Si.
El término "heterocicloalquílo" incluye grupos cicloalquilo en los cuales hay hasta seis átomos de carbono, en una modalidad hasta cinco átomos de carbono, en otra modalidad hasta cuatro átomos de carbono, en otra modalidad hasta tres tomos de carbono, en otra modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno se remplaza independientemente de 0, S(0)q o N, proporcionando al menos uno de los átomos de átomo cicloalquilo restantes. Los ejemplos de grupos heterocicloalquilo incluyen oxiranilo, tiaranil, aziridinilo, oxetanilo, tiatanil, azetidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidinilo, 1, 4-dioxanilo, 1,4-oxatianilo, morfolinilo, 1 , 4 -ditianilo, piperazinilo, 1,4-azatianilo, oxepanilo, tiepanilo, azepanilo, 1, 4-dioxépanilo, 1, 4-oxatiepanilo, 1 , 4-oxaazepanilo, 1, 4-ditiepanilo, 1,4-tieazepanilo y 1,4-diazepanilo. El grupo heterocicloalquilo puede estar ligado a C o ligado a N, es decir puede estar ligado al resto de una molécula a través de un átomo de carbono o a través de un átomo de nitrógeno.
El término "heteroalquenilo" incluye grupos alquenilo en los cuales hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno se remplaza independientemente por O, S(0)q o N, con la condición de que al menos uno de los átomos de carbono alquenilo retantes. El grupo heteroalquenilo puede estar ligado a C o hetero ligado, es decir puede estar ligado al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de O, S(0)q o N.
El término "heterocicloalquenilo" incluye grupos cicloalquenilo en los cuales hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno es remplazado independientemente por O, S(0)q o N, proporcionando al menso uno de los átomos de carbono cicloalquenilo restantes. Los ejemplos de los grupos heterocicloalquenilo incluyen 3,4-dihidro-2H-piranilo, 5-6-dihidro-2H-piranilo, 2H-piranilo, 1, 2 , 3 , 4 -tetrahidropiridinilo y 1 , 2 , 5 , 6 -tetrahidropiridinilo . El grupo heterocicloalquenilo puede estar ligado a C o ligado a N, es decir puede estra ligado al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de un átomo de nitrógeno .
El término "heteroalquinilo" incluye grupos alquinilo en los cuales hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno remplazado independientemente por 0, S(0)q o N, proporcionando al menos uno de los átomos de carbono alquinil restantes. El grupo heteroalquinilo puede estar ligado a C o heteroligado, es decir puede estar ligado al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de 0, S(0)q o N.
El término "heterocicloalquinilo" incluye grupos cicloalquinilo en los cuales hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno remplazado independientemente por O, S(0)q o N, proporcionando al menos uno de los átomos de carbono cicloalquinilo restantes . El grupo heterocicloalquenilo puede estar ligado a C p ligado a N, es decir puede estar ligado al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o a través de un átomo de nitrógeno .
El término "heteroalquileno" incluye grupos alquileno en donde hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno remplazado independientemente por O, S(0)q o N, con la condición de que al menos uno de los átomos de carbono alquileno se mantenga.
El término "heteroalquenileno" incluye grupos alquenileno en donde hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno remplazado independientemente por O, S(0)q or N, con la condición de que al menos uno de los átomos de carbono alquenileno se mantenga.
El término "heteroalquinileno" incluye grupos alquinileno en los cuales hay hasta tres átomos de carbono, en una modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno remplazado independientemente por 0, S(0)q o N, con la condición de que al menos uno de los átmos de carbono alquinileno se mantenga.
Arilo El término "arilo" incluye grupos hidrocarbil cíclicos monovalentes, aromáticos, tal como fenilo o naftilo (por ejemplo 1-naftilo o 2-naftilo) . En general, los grupos arilo pueden ser monocíclicos o policíclicos fusionados a grupos aromáticos del anillo. Los arilos preferidos son arilo C6-Ci4.
Otros ejemplos de grupos arilo son derivados monovalentes de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, as-indaceno, indeno, naftaleno, ovaleno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno y rubiceno .
El término "arilalquilo" se refiere a alquilo sustituido con un grupo arilo, por ejemplo bencilo.
El término "arileno" incluye grupos hidrocarbilo cíclicos aromáticos, tales como fenileno. En general, los grupos arileno pueden ser monocíclicos o policíclicos fusionados de grupos aromáticos del anillo. Los arilenos preferidos son arileno C6-Ci . Otros ejemplos de grupos arileno son derivados divalentes de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, as-indaceno, indeno, naftaleno, ovaleno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadene, pireno, pirantreno y rubiceno.
Heteroarilo El término "heteroarilo" incluye grupos hidrocarbilo cíclico monovalentes, heteroaromáticos que contienen adicionalmente uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de 0, S, N y NRN, donde RN se define a continuación (y en una modalidad es H o alquilo (por ejemplo alquilo d-6) ) .
En general, los grupos heteroarilo pueden ser monocíclicos o poliscíclicos (por ejemplo bicíclicos) fusionados a grupos heteroaromáticos del anillo. En una modalidad, los grupos heteroarilo contienen 5-13 miembros de anillo (preferiblemente 5-10 miembros) y 1, 2, 3 o 4 heteroátomos de anillo independientemente seleccionados de 0, S, N y NRN. En una modalidad, un grupo heteroarilo puede ser de 5, 6, 9 o 10 miembros, por ejemplo monocíclico de 5 miembros, monocíclico de 6 miembros, bicíclico fusionado de anillo de 9 miembros o bicíclico fusionado de anillo de 10 miembros .
Los grupos heteroaromáticos monocíclicos incluyen grupos heteroaromáticos que contienen 5-6 miembros de anillo y 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados de O, S, o NRN.
En una modalidad, los grupos heteroarilo monocíclico de 5 miembros contienen 1 miembro de anillo que es un grupo -NRN-, un átomo -0- o un átomo -S- y, opcionalmente , 1 -3 miembros de anillo (por ejemplo 1 o 2 miembros de aro) que son átomos =N- (donde el resto de los 5 miembros del anillo son átomos de carbono) .
Los ejemplos de grupos heteroarilo monocíclico de 5 miembros son pirrolilo, furanilo, tiofenilo, pirazolilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, tiazolilo, 1,2,3 triazolilo, 1,2,4 triazolilo, 1,2,3 oxadiazolilo, 1,2,4 oxadiazolilo, 1,2,5 oxadiazolilo, 1,3,4 oxadiazolilo, 1,3,4 tiadiazolilo, piridilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, 1,3,5 triazinilo, 1,2,4 triazinilo, 1,2,3 triazinilo y tetrazolilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo monocíclico de 6 miembros son piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo y pirazinilo.
En una modalidad, los grupos heteroarilo monocíclico de 6 miembros contienen 1 o 2 miembros de anillo que son átomos =N- (donde el resto de los 6 miembros de anillo son átomos de carbono) .
Los grupos heteroaromáticos bicíclicos incluyen grupos heteroaromáticos de anillo fusionado que contienen 9-13 miembros de anillo y 1, 2, 3, 4 o más heteroátomos seleccionados de O, S, N o NRN.
En una modalidad, los grupos heteroarilo bicíclico de 9 miembros contienen 1 miembro de anillo que es un grupo -NRN-, un átomo -0- o un átomo -S- y, opcionalmente, 1-3 miembros de anillo (por ejemplo 1 o 2 miembros de aro) que son átomos =N-(donde el resto de los 9 miembros de anillo son átomos de carbono) .
Los ejemplos de grupos heteroarilo bicíclico de anillo fusionado de 9 miembros son benzofuranilo, benzotiofenilo, indolilo, benzimidazolilo, indazolilo, benzotriazolilo , pirrólo [2 , 3 -b] piridinilo, pirrólo [2 , 3-c] piridinilo, pirrólo [3 , 2-c] piridinilo, pirrólo [3 , 2-b] piridinilo, imidazo [4 , 5-b] piridinilo, imidazo [4 , 5-c] iridinilo, pirazolo [4, 3 -d] iridinilo, pirazolo [4, 3-c] piridinilo, pirazolo [3 , 4-c] piridinilo, pirazolo [3 , 4-b] piridinilo, isoindolilo, indazolilo, purinilo, indolininilo, imidazo [1,2-a] iridinilo, imidazo [1, 5-alpiridinilo, pirazolo [1 , 2 -a] piridinilo, pirrólo [1 , 2-b] piridazinilo y imidazo [1,2-c] pirimidinilo .
En una modalidad, los grupos heteroarilo bicíclico de 10 miembros contienen 1-3 miembros de anillo que son átomos =N-(donde el resto de los 10 miembros de anillo son átomos de carbono) .
Los ejemplos de grupos heteroarilo bicíclico de anillo fusionado de 10 miembros son quinolinilo, isoquinolinilo, cinnolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, ftalazinilo, 1,6-naftiridinilo, 1 , 7-naftiridinilo, 1, 8-naftiridinilo, 1,5-naftiridinilo, 2, 6-naftiridinilo, 2, 7-naftiridinilo, pirido [3 , 2-d] pirimidinilo, pirido [4 , 3-d] pirimidinilo, pirido [3 , 4-d] pirimidinilo, pirido [2 , 3 -d] irimidinilo, pirido [2 , 3-b] pirazinilo, pirido [3 , 4-b] irazinilo, pirimido[5,4-d]pirimidinilo, pirazino [2 , 3 -b] irazinilo y pirimido [4 , 5 -d] irimidinilo .
El término "heteroariloalquilo" se refiere a alquilo sustituido con un grupo heteroarilo.
El término "heteroarileno" incluye grupos hidrocarbilo cíclico heteroaromáticos divalentes que contienen adicionalmente uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de 0, S, N y NRN, donde RN se define a continuación (y en una modalidad es H o alquilo (por ejemplo alquilo C1-6) ) . En general, los grupos heteroarileno pueden ser grupos heteroaromáticos de anillo fusionado monocíclicos o policíclicos (por ejemplo bicíclicos) . En una modalidad, los grupos heteroarileno contienen 5-13 miembros de anillo (preferiblemente 5-10 miembros) y 1, 2, 3 o 4 heteroátomos de anillo independientemente seleccionados de O, S, N y RN. En una modalidad, un grupo heteroarileno puede ser de 5, 6, 9 o 10 miembros, por ejemplo monocíclico de 5 miembros, monocíclico de 6 miembros, bicíclico de anillo fusionado de 9 miembros o bicíclico de anillo fusionado de 10 miembros. El término "heteroarileno" incluye derivados divalentes de cada uno de los grupos heteroarilo discutidos anteriormente.
Los términos "arilo" , "aromático", "heteroarilo" y "heteroaromático" también incluyen grupos que son parcialmente reducidos. De este modo, por ejemplo, "heteroarilo" incluye especies fusionadas en las cuales uno de los aros ha sido reducido a un anillo saturado (por ejemplo 1 , 2 , 3 , 4- tetrahidro-1 , 8-nafthiridin-2-ilo) .
Grupos ausentes Cuando un grupo a, b o c en la fórmula (I) está "ausente", lo que significa es que en su lugar un enlace sencillo está presente, es decir que los dos grupos ya sea del lado del grupo a, b o c estén directamente enlazados el uno al otro.
General A menos que se indique explícitamente de otro modo, donde las combinaciones de grupos se refieren a la presente como una porción, por ejemplo arilalquilo, el último grupo mencionado consiste del átomo por el cual la porción se adjunta al resto de la molécula.
Donde se hace referencia a un átomo de carbono de un grupo alquilo o de otro grupo siendo remplazado por 0, S(0)q, N o P(0)r/ lo que se pretende es que: (en donde E no es H) ; -CH= es remplazado por -N= o -P(0)r=; =C-H es remplazado por =N o =P(0)r; o -CH2- es remplazado por -0-, -S(0)q- -NRN- o -P(0)rRN-donde RN es H o alquilo Ci-6, heteroalquilo Ci-6, cicloalquilo C3-6, heterocicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, heteroalquenilo C2-6/ cicloalquenilo C3-6, heterocicloalquenilo C3-6, fenilo, o heteroarilo opcionalmente sustituido que contiene 5 o 6 miembros del anillo. RN es preferiblemente H, Ci-6alquilo o C3- gcicloalquilo . q es independientemente 0, 1 o 2. En una modalidad, q es 0. r es independientemente 0 o 1. En una modalidad, r es 0. Donde se hace referencia a un átomo de carbono siendo remplazado por Si, lo que se pretende es que el átomo de carbono se intercambie por un átomo de sílice pero que los enlaces de otro modo se mantengan igual. De este modo, por ejemplo, -CH2- es remplazado por -SiH2-; -CH= es remplazado por -SiH=; y =C-H remplazado por =Si-H.
A modo de aclaración, en relación al heteroátomo arriba mencionado que contiene grupos (tal como heteroalquilo etc.) , donde se da un numérico de átomos de carbono, por ejemplo heteroalquilo C3-6, lo que se pretende es que un grupo se base en alquilo C3-6 en el cual uno o más de los 3-6 átomos de carbono de cadena es remplazado por O, S(0)q o N. De acuerdo a esto, un grupo C3-6heteroalquilo contendría, por ejemplo, menos que 3-6 átomos de carbono de cadenas. Como otro ejemplo, un grupo piridil sería clasificado como un grupo heteroarilo CG aunque contenga 5 átomos de carbono.
Sustitución Los grupos de los compuestos de la invención (por ejemplo grupos alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, heteroalquilo, heterocicloalquilo, heteroalquenilo, heterocicloalquenilo, heteroalquinilo, heteroalquileno, heteroalquenileno arilo, arilalquilo, arilheteroalquilo, heteroarilo, heteroariloalquilo o heteroariloheteroalquilo etc.) pueden sustituirse o no sustituirse, en una modalidad no son sustituidos. Generalmente, la sustitución implica el remplazo hipotético de un átomo de hidrógeno con un grupo sustituto, o dos átomos de hidrógeno en el caso de sustitución por =0.
Donde se sustituye, habrá generalmente 1 hasta 5 sustituyentes en cada grupo, en una modalidad 1 hasta 3 sustituyentes , en una modalidad 1 o 2 sustituyentes, en una modalidad 1 sustituyente . Una modalidad incluye más de un sustituyente en el mismo átomo, por ejemplo un grupo acetal.
En una modalidad, los sustituyentes son independientemente Sub1 o Sub2 (en una modalidad Sub2) en donde : Sub1 es independientemente halógeno, trihalometilo, trihaloetilo, -N02, -CN, -N+(Rs)20~, -C02H, -C02Rs, -S03H, -SOR3, -S02RS, -S03Rs, -OC( =0)ORS, -C(=0)H, -C(=0)Rs, -0C(=0)R3, =0, -NRS2, -C(=0)NH2 -C(=0)NRs2, -N (Rs) C (=0) 0RS, N(RS)C(=0)NRS2, -OC(=0)NRs2/ -N (Rs) C (=0) Rs, -C(=S)NRS2, NRSC(=S)RS, -S02NRs2; -NRsS02R3, -N (Rs) C (=S) NRS2 , -N (Rs) S02NRs2 , -Rs o -ZSRS, en donde; Zs es independientemente 0, S o NRS; Rs es independientemente H o alquilo Ci-6, heteroalquilo Ci-6, - (Alqa) f-cicloalquilo C3-6, - (Alqa) f-heterocicloalquilo C3- 6, alquenilo G2-6, heteroalquenilo C2-6, - (Alqa) f-cicloalquenilo C3-6, - (Alqa) f-heterocicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, heteroalquinilo C2-e, - (Alqa) f-arilo C6-i4, - (Alqa) f-arilo C6-14 o - (Alqa) f-heteroarilo (donde heteroarilo contiene anillo de 5-13 miembros) , donde f es 0 o 1; f es 0 o 1; Alqa es alquileno Ci-6 o heteroalquileno Ci-6; y Rs se sustituye opcionalmente por sí mismo (en una modalidad no sustituida) por 1 hasta 3 sustituyentes Sub2; Sub2 es independientemente halógeno, trihalometilo, trihaloetilo, -N02, -CN, -N+ (alquilo C1-6)20~f -C02H, C02alquilo Ci-6, -S03H, -SOalquilo Ci-6, -S02alquilo Ci_6, S03alquilo Ci-e, -0C ( =0) Oalquilo C1-6, -C(=0)H, -C ( =0) alquilo C1-6, -0C(=0) alquilo C1-6, =0, -N(alquilo C1-6)2, -C(=0)NH2/ -C(=0)N (alquilo Ci-6)2, -N(alquilo Ci-?) C (=0) O (alquilo Ci_6) , -N(alquilo Ci-6)C(=0)N (alquilo C1-6)2; -0C (=0) N (alquilo C1-6)2/ -N(alquilo Ci-6) C (=0) alquilo Ci-e, -C (=S) N (alquilo C1-s)2, N(alquilo Ci-6) C (=S) alquilo C1-6, -S02N (alquilo Ci-6)2, N(alquilo Ci-6) S02alquilo C1-6, -N(alquilo d-6) C (=S) (alquilo Ci-e , -N (alquilo Ci-S) S02 (alquilo C1.6)2, -alquilo Ci-6/ heteroalquilo Ci-6, -cicloalquilo C3-6, -heterocicloalquilo C3- 6, -alquenilo C2- 6 / -heteroalquenilo C2-s, -cicloalquenilo C3-6/ -heterocicloalquenilo C3-6, -alquinilo C2-6, -heteroalquinilo C2 - 6 -arilo C6-i4, -heteroarilo C5-i3, -Z1-alquilo Ci-6, -Z1-cicloalquilo C3-6, -Z1-alquenilo C2-6, -Z1-cicloalquenilo C3-6, o -Z1-alquinilo C2-6; y Z1 es independientemente 0, S, NH o N (alquilo Ci-6) .
Aunque Rs en Sub1 puede sustituirse opcionalmente por 1 hasta 3 sustituyentes Sub2, Sub2 no se sustituye. Sin embargo, en una modalidad, Rs no se sustituye.
En una modalidad, Rs es H o alquilo Ci-6, opcionalmente sustituido por 1 hasta 3 sustituyentes Sub2.
En una modalidad, Sub2 es independientemente halógeno, trihalometilo, trihaloetilo, -N02, -CN, -N+ (alquilo Ci-6)20", -C02H, -S03H, -SOalquilo Ci_6, -S02alquilo d-ß, -C(=0)H, C(=0)alquilo C1-6, =0, -N(alquilo Ci-6)2, -C(=0)NH2, -alquilo Ci-s, -cicloalquilo C3.6, -heterocicloalquilo C3-6, -Z1-alquilo Ci- 6 o -Z^cicloalquilo C3-6.
En una modalidad, donde el grupo sustituido es acíclico (por ejemplo alquilo, heteroalquilo, alquenilo etc.), Sub1 no es -Rs y Sub2 no es -alquilo Ci-6, -heteroalquilo C1-6, alquenilo C2.6, -heteroalquenilo C2-6, -alquinilo C2-6 o heteroalquinilo C2-6.
Donde un grupo diferente de Sub2 tiene al menos 2 posiciones que pueden sustituirse, el grupo puede sustituirse por ambos extremos de una cadena de alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno (en una modalidad que contiene 1 hasta 6 átomos, en una modalidad adicional 3 hasta 6 átomos, y en una modalidad adicional 3 o 4 átomos) para formar una porción cíclica. Tal cadena está opcionalmente sustituida por 1 hasta 3 sustituyentes Sub2. En una modalidad tal cadena no está sustituida. De este modo, los términos opcionalmente sustituidos "cicloalquilo", "cicloalquenilo" , "cicloalquinilo" , "heterocicloalquilo" , "heterocicloalquenilo" , "heterocicloalquinilo" , "arilo" y "heteroarilo" incluyen especies fusionadas. Por ejemplo "cicloalquilo opcionalmente sustituido" incluye una especie en la cual dos anillos cicloalquilo se fusionan, y "heteroarilo opcionalmente sustituido" incluye una especie en la cual un anillo heterocicloalquilo se fusiona al anillo aromático (por ejemplo 5, 6, 7, 8-tetrahidro-l, 8-naftiridin-2-ilo) .
Donde un grupo diferente de Sub2 tiene un átomo que puede sustituirse dos veces, tal átomo puede sustituirse por ambos extremos de una cadena de alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno (en una modalidad que contiene 2 hasta 8 átomos, en una modalidad adicional 3 hasta 6 átomos, y en una modalidad adicional 4 o 5 átomos) para formar una porción cíclica. Tal cadena es opcxonalmente sustituida por 1 hasta 3 sustituyentes Sub2. En una modalidad tal cadena no está susitituida. De este modo, los términos opcionalmente sustituidos "cicloalquilo" , "cicloalquenilo" , "cicloalquinilo" , "heterocicloalquilo" , "heterocicloalquenilo" , "heterocicloalquinilo" , "arilo" y "heteroarilo" incluyen especies espiro.
A manera de aclaración, cuando un grupo tiene un heteroátomo, un sustituyente puede enlazarse al heteroátomo. De este modo, por ejemplo, "heteroalquilo opcionalmente sustituido" incluye -CH2-N (Sub1) -CH2- , -CH (Sub1) -NH-CH2- y -CHtSub1) -NCSub1) -CH2- etc.
Términos modificadores Cuando una lista se precede por un modificador, se pretende que el modificador es para entenderse ya que aplica a cada uno de los artículos en la lista. Por ejemplo, la frase "grupo -heterocicloalquilo C3-20, heterocicloalquenilo C3-20, -heterocicloalquinilo C3-20 o -heteroarilo C5-2o opcionalmente sustituido" significa que cada uno de los cuatro artículos en la lista, particularmente el grupo -heterocicloalquilo C3-20, el grupo -heterocicloalquenilo C3-20, el grupo heterocicloalquinilo C3-20 y el grupo -heteroarilo C6-20, puede opcionalmente sustituirse.
Cuando un grupo se caracteriza por un primer modificador y luego, más tarde, el mismo grupo se caracteriza por un modificador porsterior, lo que se entiende es que el grupo se caracteriza por ambos modificadores simultáneamente. Por ejemplo, si un grupo se describe como un grupo "-heterocicloalquinilo C3-2o" (el primer modificador) y luego después el mismo grupo se describe como un grupo "C5_16" (el modificador posterior) , lo que se entiende es un grupo heterocicloalquinilo C5_16. Esteroides Como se usa en la presente, el término "esteroide" se refiere a cualquier grupo que comprende la siguiente estructura (cuya estructura se refiere en la presente como el "esqueleto de esteroide" ) .
Puramente para los propósitos de ilustración, el esqueleto de esteroide se ha ibujado arriba como completamente saturado. El término esteroide, sin embargo, también se pretende para cubrir casos donde existe insaturacion en el esqueleto de esteroide. Por ejemplo, el término esteroide cubre un grupo que comprende el esqueleto básico completamente insaturado (mancude) , 15H-ciclopenta [a] fenantreno : El término esteroide también cubre un grupo que comprende un esqueleto de esteroide parcialmente no saturado.
El término esteroide también cubre derivados "seco" del esqueleto de esteroide, es decir grupos en los cuales el desdoblamiento de anillo se ha efectuado; los derivados "ñor" y "homo" del esqueleto de esteroide que involucran expansión y contracción del anillo, respectivamente (ver Systemic Nomenclature of Organic Chemistry, por D. Hellwinkel, published by Springer, 2001, ISBN: 3-540-41138-0, página 203 para "seco" y página 204 para "ñor" y "homo") . En una modalidad, sin embargo, tales derivados seco no se abarcan por el término "esteroide" . En otra modalidad, tales derivador ñor no se abarcan por el término "esteroide" . En otra modalidad, tales derivados homo no se abarcan por el término "esteroide" . De este modo en una modalidad, tales derivados secos, ñor y homo no se abarcan por el término "esteroide" .
El término esteroide también cubre casos donde uno o más de los átomos de carbono en el esqueleto de esteroide etiquetado estructura son remplazados por un heteroátomo. En tal modalidad, hasta seis átomos de carbono, en una modalidad hasta cinco átomos de carbono, en otra modalidad hasta cuatro átomos de carbono, en otra modalidad hasta tres átomos de carbono, en otra modalidad hasta dos átomos de carbono, en otra modalidad un átomo de carbono, cada uno remplazado independientemente por 0, S(0)q, N, P(0)r o Si (y preferiblemente 0, S(0)q o N) . En una modalidad, sin embargo, el término "esteroide" comprende especies en las cuales el "esqueleto básico de esteroide" no contiene heteroátomos .
Un sistema de anillo de esteroide se enumera de acuerdo con la convención establecida a continuación.
El término esteroide abarca esteróles, hormonas de esteroide, ácidos biliares y sales de ácidos biliares. Un esterol es cualquier esteroide con un grupo hidroxilo en la posición 3 del anillo A.
Insaturación De acuerdo con el uso estándar, la posición omega 3 se refiere al tercer enlace de la terminal (metilo) de la cadena; la posición omega 6 se refiere al sexto enlace de la terminal (metilo) de la cadena y la posición omega 9 se refiere al noveno enlace de la terminal (metilo) de la cadena .
General La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro del experto en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, las referencias 32-38, etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo, X + Y.
El término "alrededor de" en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que es "sustancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. En caso necesario, la palabra "sustancialmente" se puede omitir de la definición de la invención.
Las referencias para cargar, a cationes, a aniones, a zwitteriones , etc., se toman en pH 7.
TLR3 es el receptor 3 tipo Toll. Esto es un receptor que abarca membrana simple que juega un papel importante en el sistema inmunitario innato. Los antagonistas TLR3 conocidos incluyen poly(I:C). El "TLR3" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC: 11849. La secuencia RefSeq para el gen TLR3 humano es GI:2459625.
TLR7 es el receptor 7 tipo Toll. Este es un receptor que abarca membrana simple que juega un papel importante en el sistema inmunitario innato. Los agonistas TLR7 conocidos incluyen por ejemplo, imiquimod. El "TLR7" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC: 15631. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI: 67944638.
TLR8 es el receptor 8 tipo Toll. Este es un receptor que abarca membrana simple que juega un papel importante en el sistema inmunitario innato. Los agonistas TLR8 conocidos incluyen por ejemplo, resiquimod. El "TLR8" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC: 15632. La secuencia RefSeq para el gen TLR8 humano es GI: 20302165.
La familia del receptor tipo RIG-I ("RLR", por sus siglas en inglés) incluye diversas Helicasas de ARN que juegan papeles importantes en el sistema inmunitario innato [37] . El RLR-1 (también conocido como RIG-I o gen I inducible de ácido retinoico) tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su Terminal N. El nombre HGNC aprobado por el gen que codifica la helicasa RLR-1 es "DDX58" (para polipéptido 58 de caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) ) y el HGNC ID único es HGNC: 19102. La secuencia RefSeq para el gen RLR-1 humano es GI:77732514. El RLR 2 (también conocido como MDA5 o gen 5 asociado con diferenciación de melanoma) también tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su Terminal N. El nombre HGNC aprobado por el gen que codifica la helicasa RLR-2 es "IFIH1" (para interferón inducido con dominio 1 de helicasa C) y el HGNC ID único es HGNC: 18873. La secuencia RefSeq para el gen humano RLR-2 es GI : 27886567. El RLR-3 (también conocido como LGP2 o laboratorio de genéticos y fisiología 2) no tiene dominios de reclutamiento de caspasa. El nombre HGNC aprobado por el gen que codifica la helicasa RLR-3 es "DHX58" (para polipéptido 58 de caja DEXH (Asp-Glu-X-His) ) y el HGNC ID único es HGNC: 29517. La secuencia RefSeq para el gen humano RLR-3 es GI : 149408121.
PKR es una quinasa de proteína dependiente de ARN de hebra doble. Esta juega un papel importante en el sistema inmunitario innato. El "EIF2AK2" (para quinasa 2 de 2 -alfa de factor de iniciación eucariótica) es el nombre HGNC aprobado por el gen que codifica esta enzima, y su HGNC ID único es HGNC: 9437. La secuencia RefSeq para el gen humano PKR es GI:208431825.
Breve Descripción de las Figuras La FIG. 1 muestra un gel con ARN manchado. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón después del tratamiento de RNasa (4) replicón encapsulado en liposoma (5) liposoma después del tratamiento de RNasa (6) liposoma tratada con RNasa luego sometida a extracción de fenol/cloroformo.
La FIG. 2 es un micrográfo de electrón de liposomas.
La FIG. 3 muestra la expresión de proteína (como unidades ligeras relativas, RLU) en el día 6 después del suministro de ARN en liposomas con varios lipidos catiónicos.
La FIG.4 muestra un gel con ARN manchado. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón encapsulado en liposoma (4) liposoma tratado con RNasa luego sometido a extracción de fenol/cloroformo.
La FIG. 5 muestra expresión de proteína en los días 1, 3 y 6 después del suministro de ARN como un replicón empaquetado con virión (cuadrados) , como ARN desnudo (diamantes), o en liposomas (+ = O.lpg, x = l g) .
La FIG. 6 muestra expresión de proteína en los días 1, 3 y 6 después del suministro de cuatro diferentes dosis de ARN encapsulado con liposoma.
La FIG. 7 muestra titulaciones de IgG anti-F en animales que reciben replicón empaquetado con virión (VRP o VSRP) , l g de ARN desnudo, y l g de ARN encapsulado con liposoma.
La FIG. 8 muestra títulos IgG anti-F en animales que reciben VRP, lpg de ARN desnudo, y 0. lg o l g de ARN encapsulado con liposoma.
La FIG. 9 muestra titulaciones de anticuerpo neutralizante en animales que reciben VRP o ya sea 0.1 g o 1 pg de ARN encapsulado con liposoma.
La FIG. 10 muestra niveles de expresión después del suministro de un replicón como ARN desnudo (círculos) , ARN encapsulado con liposoma (triangulo y cuadrado) , o como un lipoplex (triangulo invertido) .
La FIG. 11 muestra titulaciones de IgG específicos de F (2 semanas después de la segunda dosis) después del suministro de un replicón como ARN desnudo (0.01-lpg), ARN encapsulado con liposoma (0.01-10pg), o empaquetado como un virión (VRP, 106 unidades infecciosas o IU) .
La FIG. 12 muestra titulaciones de IgG específicos de F (círculos) y títulos PRNT (cuadrados) después del suministro de un replicón como ARN desnudo (l g) / ARN encapsulado con liposoma (0.1 o lpg) , o empaquetado como un virión (VRP, 106 IU) . Las titulaciones en ratones sin tratamiento también se muestran. Las líneas sólidas muestran medios geométricos.
La FIG. 13 muestra producción de citoquina intracelular después de la re-estimulación con péptidos sintéticos que representan los epítopos principales en la proteína F, 4 semanas después de una segunda dosis. El eje y muestra el % citoquina+ de CD8+CD4-.
La FIG. 14 muestra titulaciones IgG específicas de F (titulaciones log10 media ± desviación estándar) durante 63 días después de la inmunización de vaces en los días 0 y 21.
Modos para llevar a cabo la invención Replicones ARN Se usan a continuación diversos replicones . En general estos se basan en un genoma de alfavirus híbrido con proteínas no estructurales de virus de encefalitis equina de venezolana (VEEV, por sus siglas en inglés) , una señal de empaquetamiento de VEEV, y un UTR 3 ' de virus Sindbis o un mutante VEEV. El replicón es alrededor de lOkb de largo y tiene una cola poli A.
El ADN plásmido que codifica replicones de alfavirus (nombrado: pT7-mVEEV-FL . RSVF o A317; pT7 -mVEEV-SEAP o A306; pSP6-VCR-GFP o A50) sirvió como un cebador para la síntesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de alfavirus requeridos para la replicación de ARN pero carecen de aquellos que codifican productos de gen necesarios para montaje de partículas; las proteínas estructurales se reemplazan en lugar de una proteína de interés (ya sea un reportero, tal como SEAP o GFP, o un inmunógeno, tal como proteína RSV F de longitud completa) y entonces los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor de bacteriófago (T7 o SP6) dirección ascendente del cADN alfavirus facilita la síntesis del ARN de replicón in vitro y una ribozima de virus delta de hepatitis (HDV) dirección descendente inmediatamente de la cola poli (A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad auto-escindible .
Después de la linealización del ADN plásmido dirección descendente de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, las transcripciones de salida se sintetizaron in vitro usando bacteriófago T7 o SP6 derivado de Polimerasa de ARN dependiente de ADN. Las transcripciones se realizaron por 2 horas a 37°C en la presencia de 7.5 mM (polimerasa ARN T7) o 5 mM (polimerasa ARN SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion) . Después de la transcripción el ADN de cebador se digirió con DNasa TURBO (Ambion) . El ARN de replicón se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua libre de nucleasa. El ARN sin tapa se tapó post- transcripcionalmente con Enzima de tapado de Vacuna (VCE, por sus siglas en inglés) usando el Sistema de tapado m7G ScriptCap (Epicentre Biotechnologies ) como se resume en el manual del usuario; replicones tapados de esta forma se les da el prefijo "V" por ejemplo, VA317 es el replicón A317 tapado por VCE. El ARN tapado post - transcripcionalmente se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua libre de nucleasa. La concentración de las muestras de ARN se determinó al medir OD260nm. La Integridad de los transcriptos in vitro se confirmó por electroforesis de gel de agarosa desnaturalizante.
Eneapsulación en liposomas basadas en DlinDMA El ARN se encapsuló en liposomas hechos esencialmente por el método de las referencias 7 y 40. Los liposomas se hicieron de 10% de DSPC (zwitteriónico) , 40% de DlinDMA (catiónico) , 48% de colesterol y 2% de DMG conjugado con PEG (2kDa PEG) . Estas proporciones se refieren al % de moles en el liposoma total.
DlinDMA (1, 2 -dilinoleiloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano) se sintetizó usando el procedimiento de la referencia 2. DSPC (1, 2-Diaestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) se adquirió de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich. El DMG conjugado con PEG (1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (polietilen glicol) , sal de amonio), DOTAP (1, 2 -dioleoil-3 -trimetilamonio-propano , sal de cloruro) y DC-chol (clorohidrato de 3ß- [N- (?' ,?' -dimetilaminoetano) -carbamoil] colesterol) fueron de Avanti Polar Lipids .
Brevemente, los lípidos se disolvieron en etanol (2 mi) , un replicón de ARN se disolvió en solución amortiguadora (2 mi, lOOmM citrato de sodio, pH 6) y estos se mezclaron con 2ml de solución amortiguadora seguido por 1 hora de equilibrio. La mezcla se diluyó con solución amortiguadora 6ml luego se filtró. El producto resultante contiene liposomas, con ~95% de eficiencia de encapsulación. La FIG. 2 muestra un micrográfo de electrón de ejemplo de liposomas preparados por estos métodos. Estos liposomas contienen ADN encapsulado que codifica antígeno RSV F de longitud completa. La dispersión de luz dinámica de un lote mostró un diámetro promedio de 141nm (por intensidad) o 78nm (por número) .
En un método de encapsulación particular, las soluciones de reserva de lípido fresco se prepararon en etanol . 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG-DMG se pesaron y disolvieron en 7.55 mL de etanol. La solución de reserva de lipido preparado recientemente se sacudió suavemente a 37 °C por alrededor de 15 min para formar una mezcla homogénea. Entonces, 755 L de la reserva se agregó a 1.245 mL de etanol para hacer una solución de reserva de trabajo de 2 mL. Esta cantidad de lípidos se usó para formar liposomas con 250 g de ARN. Una solución de trabajo 2 mL de ARN también se preparó de una solución de reserva de ~l g/ L en solución amortiguadora de citrato 100 mM (pH 6) . Tres viales de vidrio 20 mL (con barras de agitación) se enjuagaron con solución RNasa Away (Molecular BioProducts) y lavaron con suficiente agua MilliQ antes de usar para descontaminar los viales de RNasas . Uno de los viales se usó por la solución de trabajo dé ARN y los otros para colectar el lípido y mezclas de ARN (como se describe más adelante) . El lípido de trabajo y soluciones de ARN se calentaron a 37°C por 10 min antes de que se cargara en jeringas de 3cc de cierre luer. La solución amortiguadora de citrato 2 mL (pH 6) se cargó en otra jeringa 3 ce. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (PEEK™ 500 µp? unión ID, Idex Health Science) usando tubería FEP (etileno-propileno fluorado; toda la tubería FEP usada tenía un diámetro interno de 2mm y un diámetro externo de 3mm; obtenido de Idex Health Science) . La salida desde el mezclador T también fue tubería FEP. La tercera jeringa que contiene la solución amortiguadora de citrato se conectó a una pieza separada de la tubería. Todas las jeringas se condujeron luego en una velocidad de flujo de 7 mL/min usando una bomba de jeringa. Las salidas del tubo se colocaron para colectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mL (mientras la agitación) . La barra de agitación se quitó y la solución de etanol/acuosa se permitió equilibrar a temperatura ambiente por 1 hora. Se cargó 4 mi de la mezcla en una jeringa 5 ce, que se conectó a una pieza de tubería FEP y en otra jeringa 5 ce conectada a una longitud igual de la tubería FEP, se cargó una cantidad igual de solución amortiguadora de citratolOO m (pH 6) . Las dos jeringas se condujeron en velocidad de flujo 7mL/min usando la bomba de jeringa y la mezcla final colectada en un vial de vidrio de 20 mL (mientras la agitación) . A continuación, la mezcla colectada de la segunda etapa de mezclado (liposomas) se pasó a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio de anión que enlaza y remueve moléculas aniónicas, obtenidas de Pall Corporation) . Antes de usar esta membrana por los liposomas, 4 mL de NaOH 1 M, 4 mL de NaCl 1 M y 10 mL de solución amortiguadora de citrato 100 mM (pH 6) se pasaron sucesivamente a través de esto. Los liposomas se entibiaron por 10 min a 37°C antes de pasar a través de la membrana. A continuación, los liposomas se concentraron a 2 mL y dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando por filtración de flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y membranas de filtración de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs (Rancho Domínguez) y se usaron de acuerdo con las directrices del fabricante. Las membranas de filtración de fibra hueca Polisulfona con un corte de tamaño de poro 100 kD y área de superficie 8 cm2 se usaron. Para formulaciones de experimentos in vitro e in vivo se diluyeron a la concentración de ARN requerido con IX PBS.
El porcentaje de ADN encapsulado y concentración de ARN se determinaron por kit de reactivo de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN ribosomal estándar proporcionado en el kit se usó para generar una curva estándar. Los liposomas se diluyeron lOx o lOOx en solución amortiguadora IX TE (del kit) antes de la adición del colorante. De forma separada, los liposomas se diluyeron lOx o lOOx en solución amortiguadora IX TE que contiene Tritón X 0.5% antes de la adición del colorante (para interrumpir los liposomas y así a ARN total de ensayo) . Después de eso una cantidad igual de colorante se agregó a cada solución y luego -180 pL de cada solución después de la adición de colorante se cargó en duplicado en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplaca. Todas las formulaciones de liposoma se dosificaron in vivo basado en la cantidad encapsulada de ARN.
Para obtener liposomas más pequeños el método de jeringa/tubo se reemplazó por un método en el cual el lípido y soluciones de ARN se mezclan en canales en un chip de microfluidos . Se prepararon soluciones madre de lípido fresco en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG-DMG y disolvieron en 7.55 mL de etanol. La solución madre de lípido frescamente preparado se movió suavemente a 37°C durante alrededor de 15 min para formar una mezcla homogénea. Luego, 226.7 yL -de la solución madre se agregó a 1.773 mL de etanol para hacer una solución madre de lípido de trabajo de 2 mL. Una solución de trabajo de 4 mL de ARN también se preparó de una solución madre de -l g/ L en solución amortiguadora de citrato de 100 mM (pH 6) . Cuatro viales de vidrio de 20 mL (con barras de agitación) se enjuagaron con solución RNase Away y lavaron con bastante de agua MilliQ antes del uso para descontaminar los viales de ARNsas . Dos de los viales se usaron para la solución de trabajo de AR (2 mL en cada vial) y los otros para recolectar el lípido y mezclas de ARN. Las soluciones de ARN y lípido de trabajo se calentaron a 37°C durante 10' min antes de que se carguen en jeringas de seguro luer 3cc. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectaron a un Chipo de unión Mitos Droplet (un dispositivo de microfluido de vidrio obtenido de Syrris, Parte no. 3000158) usando tubería PTFE de 0.0762 cm (0.03 pulgadas) ID x 0.025 era (1/16 pulgada) OD, (Syrris) usando un conector final de 4 vías. Dos corrientes de ARN y una corriente de lípido se condujeron por bombas de jeringa y la mezcla del etanol y la fase acuosa se hizo en la unión X (100 µp? x 105 µp?) del chip. La tasa de flujo de las tres corrientes se mantuvo a 1.5 mL/min, por lo tanto la relación de la tasa de flujo acuosa a etanólica total fue 2:1. La salida del tubo se posicionó para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mL (mientras se agita) . La barra de agitación se tomó y el etanol/solución acuosa se permitió equilibrar a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego la mezcla se cargó en una jeringa 5 ce que se fijó a una pieza de tubería PTFE de 0.0762 (0.03 pulgadas) ID x (0.025 cm) (1/16 pulgadas) OD y en otra jeringa 5 ce con longitud igual de tubería PTFE, se cargó un volumen igual de solución amortiguadora de citrato 100 mM (pH 6) . Las dos jeringas se condujeron en 3mL/min de tasa de flujo usando una bomba de jeringa y la mezcla final recolectada en un vial de vidrio 20 mL (mientras se agita) . Después, los liposomas se concentraron hasta 2 mL y dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando el sistema TFF antes de recuperar el producto final. Se usaron membranas de filtración de fibra huecas con un recorte de tamaño de poro de 100 kDa y área de superficie de 20cm2. Para experimentos in vitro en vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración de ARN requerida con IX PBS. Mientras que los liposomas preparados usando el método de jeringa/tubo con 75 g de ARN tienen un diámetro promedio Z de 148nm y un índice de polidispersidad de 0.122, la mezcla del chip da liposomas 'con un diámetro promedio Z de 97nm y un índice de polidispersidad de 0.086. La proporción de ARN encapsulado disminuye ligeramente desde 90% hasta 87%.
La encapsulación en liposomas se mostró para proteger ARN de la digestión RNasa . Los experimentos usados 3.8mAU de RNasa A por microgramo de ARN, incubado por 30 minutos a temperatura ambiente. RNasa se inactivo con Proteinasa K a 55°C por 10 minutos. Una mezcla 1:1 v/v de muestra a 25:24:1 v/v/v, fenol : cloroformo : alcohol de isoamilo se agregó luego para extraer el ARN de los lípidos en la fase acuosa. Las muestras se mezclaron por agitación en vórtice durante algunos segundos y luego colocaron en una centrífuga por 15 minutos a 12k RPM. La fase acuosa (que contiene el ARN) se removió y usó para analizar el ARN. Antes de cargar (400 ng ARN por pozo) todas las muestras se incubaron con colorante de carga formaldehido, desnaturalizado durante 10 minutos a 65 °C y enfriaron a temperatura ambiente. Los marcadores Ambion Millennium se usaron para aproximar el peso molecular del constructo de ARN. El gel se corrió a 90 V. El gel se tiñó usando 0.1% oro SYBR de acuerdo con las directrices del fabricante en agua al agitar a temperatura ambiente por 1 hora. La FIG. 1 muestra que RNasa completamente digiere ARN en la ausencia de encapsulacion (carril 3) . El ARN es indetectable después de la encapsulacion (carril 4) , y ningún cambio se ve en estos liposomas se tratan con RNasa (carril 4) . Después de que los liposomas tratados con RNasa se someten a extracción de fenol, se ve ARN no digerido (carril 6) . Aún después de 1 semana a 4°C el ARN podría verse sin ninguna fragmentación (FIG. 4, flecha). La expresión de proteína in vivo se mantuvo sin cambios después de 6 semanas a 4°C y un ciclo de congelación-descongelación. Así ARN encapsulado con liposoma es estable.
Para evaluar la expresión in vivo del ARN una enzima de reportero (SEAP fosfatasa alcalina secretada) se codificó en el replicón, antes que un inmunógeno . Los niveles de expresión se midieron en sueros diluidos 1:4 en solución amortiguadora de dilución de Fosfa-Luz IX usando un substrato de fosfato alcalino quimioluminiscente . Los ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) se inyectaron intramuscularmente en el día 0, 50µ1 por pata con 0. lpg o dosis de ARN lpg. El mismo vector también se administró sin los liposomas (en RNasa libre IX PBS) a lpg. Replicones empaquetados con virión también se probaron. Los replicones empaquetados con virión usados en la presente (referidos como "VRPs") se obtuvieron por los métodos de referencia 39, donde el replicón de alfavirus se deriva del VEEV mutante o una quimera derivada del genoma de VEEV fabricado por ingeniería para contener el UTR 3 ' de virus Sindbis y una señal de empaquetamiento (PS) de virus Sindbis, empaquetado por co-electroporación en células BHK con ARNs auxiliares defectuosos que codifican el cápside de virus Sindbis y genes de glicoproteína .
Como se muestra en la FIG. 5, la encapsulación incrementa los niveles de SEAP por alrededor de ¾ log en la dosis lpg, y en la expresión el día 6 de niveles emparejados de dosis encapsulada 0. lpg visto con dosis no encapsulada l g. Por niveles de expresión el día 3 superaron aquellos alcanzados con VRPs (cuadrados) . Así expresado aumentado cuando el ARN se formuló en los liposomas relativos al control de ARN desnudo, aún en una dosis inferior 10x. La expresión también fue mayor con relación al control VRP, pero los cinéticos de expresión fueron muy diferentes (ver FIG. 5) . El suministro del ARN con electroporacion resulta en expresión incrementada relativa al control de ARN desnudo, pero estos niveles fueron inferiores con liposomas.
Para evaluar si el efecto visto en los grupos de liposoma fue debido simplemente a los componentes de liposoma, o se ligó a la encapsulación, el replicón se administró en forma encapsulada (con dos diferentes protocolos de purificación, ARN O.l g), o mezclada con los liposomas después de su formación (un "lipoplex" no encapsulado, ARN O.l g), o como ARN desnudo (1 pg) . La FIG. 10 muestra que el lipoplex dio los niveles más bajos de expresión, mostrando que la encapsulación mostrada es esencial para expresión potente.
Los experimentos SEAP adicionales mostraron una respuesta de dosis clara in vivo, con expresión vista después del suministro de tan poco como ARN lng (FIG. 6) . Los experimentos adicionales que comparan la expresión de replicones encapsulados y desnudos indicaron que ADN encapsulado 0.0 l g fue equivalente a lpg de ARN desnudo. En una dosis de ARN 0.5 g el material encapsulado dio una expresión 12 veces mayor en el día 6; en niveles de dosis 0. l\xq fueron 24 veces mayor en el día 6.
En lugar de buscar en niveles promedio en el grupo, los animales individuales también se estudiaron. Aunque diversos animales no respondieron a replicones desnudos, la encapsulación elimina a los que no responden.
Los experimentos adicionales remplazan DlinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas DOTAP dieron mejor expresión que replicón desnudo, fueron inferiores a los liposomas DlinDMA (2 hasta 3 veces diferentes en el día 1) .
Para evaluar la inmunogenicidad in vivo un replicón se construyó para expresar proteína F de longitud completa de virus sincitial respiratorio (RSV) . Esto se suministro desnudo (lpg) , encapsulado en liposomas (0.1 o lpg) , o empaquetado en viriones (106 IU; "VRP") en los días 0 y 21. La FIG. 7 muestra titulaciones IgG anti-F 2 semanas después de la segunda dosis, y los liposomas claramente aumentan la inmunogenicidad. La FIG. 8 muestra titulaciones 2 semanas más tarde, por lo que en el punto no hubo diferencia estadística entre el ADN encapsulado en O.lpg, el ADN encapsulado en lpg, o el grupo VRP . Las titulaciones de neutralización (medidos como 60% reducción de placa, "PRNT60") no fueron significativamente diferentes en estos tres grupos 2 semanas después de la segunda dosis (FIG. 9) . La FIG. 12 muestra ambos títulos IgG como PRNT 4 semanas después de la segunda dosis.
La FIG. 13 confirma que el ARN provoca una respuesta de célula T CD8 robusta.
Los experimentos adicionales comparan titulaciones IgG específicos de F en ratones que reciben VRP, 0. l g de ARN encapsulado con liposoma, o lpg de ARN encapsulado con liposoma. Las relaciones (VRP: liposoma) en diversos momentos después de la segunda dosis fueron como sigue: Así el ARN encapsulado con liposoma induce esencialmente la misma magnitud de respuesta inmunitaria como se ve con suministro de virión.
Los experimentos adicionales mostraron respuestas IgG específicas de F superiores con una dosis 10pg, las respuestas equivalentes para lpg y dosis O.lpg, y una respuesta inferior con una dosis O.Olpg. La FIG. 11 muestra títulos IgG en ratones que reciben el replicón en forma desnuda en 3 diferentes dosis, en liposomas en 4 diferentes dosis, o como VRP (106 IU) . La respuesta observada con lpg de ARN encapsulado con liposoma fue estadísticamente insignificante (ANOVA) cuando se compara con VRP, pero la respuesta superior observada con lOpg de ARN encapsulado con liposoma fue estadísticamente significativa (p<0.05) cuando se compara con ambos de estos grupos.
Un estudio adicional confirma que el 0. lpg de ARN encapsulado con liposoma dio mucho mayores respuestas IgG anti-F (15 días posterior a la segunda dosis) que 0. l g de ADN suministrado, y aún fue más inmunogénico que 20 g de ADN plásmido que codifica el antígeno F, suministrado por electroporación (Elgen™ DNA Delivery System, Inovio) .
Un estudio adicional se realizó en ratas de algodón (Sigmodon hispidis) en lugar de ratones. En una encapsulación de liposoma de dosis lpg aumenta las titulaciones de IgG específicas de F por 8.3 veces comparado con ARN desnudo y aumenta las titulaciones PRNT por 9.5 veces. La magnitud de la respuesta de anticuerpo fue equivalente a esa inducida por 5xl06 IU VRP . Tanto el ARN desnudo como encapsulado con liposoma fueron capaces para proteger a las ratas de algodón de la estimulación con RSV (lxlO5 placa que forma unidades) , reduciendo la carga viral del pulmón por al menos 3.5 logs . La encapsulación aumenta la reducción por alrededor de 2 veces .
Se realizó un estudio de animal grande en ganado. Las vacas se inmunizaron con 66µg de proteína RSV F de longitud completa que codifica replicón en los días 0 y 21, formulado dentro de los liposomas. Se usó solo PBS como un control negativo, y una vacuna autorizada se usó como un control positivo ("Triángulo 4" de Fort Dodge, que contiene virus exterminado) . La FIG. 14 muestra titulaciones IgG específicas F durante un periodo de 63 días partiendo de la primera inmunización. El replicón de ARN fue inmunogénico en las vacas, aunque da titulaciones inferiores que la vacuna autorizada. Todas las vacas vacunadas muestran anticuerpos específicos F después de la segunda dosis, y las titulaciones fueron muy estables durante el periodo de 2 hasta 6 semans después de la segunda dosis (y fueron particularmente estables para la vacuna de ARN) .
Encapsulación en liposomas usando lípidos catiónicos alternativos Como una alternativa para usar DlinDMA, se usan lípidos catiónicos de la referencia 8. Estos lípidos pueden sintetizarse como se describe en la referencia 8.
Los liposomas formados arriba usando DlinDMA se refieren de aquí en adelante como la serie "RV01" . El DlinDMA se reemplazó con varios lípidos catiónicos en la serie "RV02" para "RV12" como se describe a continuación. Dos diferentes tipos de cada liposoma se formaron, usando PEG2000-DMG al 2% con ya sea (01) 40% del lípido catiónico, DSPC al 10%, y colesterol al 48%, o (02) 60% del lípido catiónico y colesterol al 38%. De este modo una comparación de los liposomas (01) y (02) muestra el efecto del lípido zwitterionico neutro.
Se hicieron liposomas RV02 usando el siguiente ípido catiónico: Se hicieron liposomas RV04 usando el siguiente lípido catiónico: Se hicieron liposomas RV05 usando el siguiente lípido catiónico : Se hicieron liposomas RV08 usando el siguiente lipido catiónico : Se hicieron liposomas RV09 usando el siguiente lipido catiónico: Se hicieron liposomas RV10 usando el siguiente lipido catiónico : Se hicieron liposomas RV11 usando el siguiente lipido catiónico : Se hicieron liposotnas RV12 usando el siguiente lípido catiónico : Se hicieron liposotnas RV13 usando el siguiente lípido catiónico (DOTAP, para propósitos comparativos) : Se hicieron liposomas RV14 usando el siguiente lípido catiónico (DC-colesterol, para comparación) : Estos liposomas se probaron con el reportero SEAP descrito arriba. La siguiente tabla muestra el tamaño de los liposomas (promedio Z e índice de polidispersidad) , el % de encapsulación de AR en cada liposoma, junto con la actividad SEAP detectada en los días 1 y 6 después de la inyección. La actividad SEAP es relativa a los liposomas "RV01(02)" hechos de DlinDMA, colesterol y PEG-DMG: La FIG. 3 ilustra los niveles de expresión SEAP observados en el día 6. Los mejores resultados se observaron con RV04, RV05, RV07, RV08, RV09, y RV11.
Varios de estos liposomas también se usaron para suministrar una proteína RSV F de longitud completa que codifica replicón. Un estudio, compara RV01, RV05 y RV13 ; las titulaciones IgG de suero específico F más altas se observaron con RV01 y las más bajas con RV13. Otro estudio compara RV01, RV02, RV04 y RV07; los mejores resultados fueron de nuevo observados con RV01, con RV07 pobremente realizado. Otro estudio compara RV01, RV03, RV08, RV09 y RV14 los mejores resultados fueron de nuevo observados con RV01, con RV03 y RV14 pobremente realizados. Otro estudio compara RV01, RV10, RV11 y RV15 los mejores resultados fueron de nuevo observados con RV01. En general, los mejores resultados se observaron con RV01, RV05, RV08 y RV09, mientras que RV13 (DOTAP) y RV 14 (DC-colesterol) · fueron pobres .
De este modo no todas de las liposomas fueron efectivas para producir respuestas inmunitarias. En general, aunque, se observó que la mejor eficacia inmunológica se observó cuando el lípido catiónico en los liposomas tiene un pKa en el intervalo de 5.0 hasta 7.6, y particularmente en el intervalo de 5.5 hasta 6.7, entre 5.6 y 6.3, entre 5.6 y 6.0, o entre 5.7 y 5.9.
Expresión BHK Las liposomas con diferentes lípidos se incubaron con células BHK durante la noche y evaluaron para potencia de expresión de proteína. De una línea base con lípido RV05, la expresión puede incrementarse 18x al agregar 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina al 10% (DPyPE) para el liposoma o lOx al agregar 18:2 (cis) fosfatidilcolina al 10%. En general, los estudios in vivo muestran que las cruces de lípidos no saturadas tienden a aumentar las titulaciones IgG elevadas contra antígeno codificados .
Inmunogenicídad RSV El replicón auto-replicante vA317 que codifica proteína RSV F se administró a ratones BALB/c, 4 o 8 animales por grupo, por vacunaciones intramusculares bilaterales (50 L por pata) en los días 0 y 21 con el replicón (lpg) solo o formulado como liposomas con DlinDMA ("RV01") o DOTAP ("RV13") o el lípido muestra en las FIGS. 16A hasta 16M ("RV05"). Los liposomas RV01 tenían 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG, pero con cantidades' diferentes de AR . Los liposomas RV05 tenían ya sea 40% de RV05, 10% de DSPC, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG o 60% de RV05, 38% de colesterol y 2% de PEG-DMG. Los liposomas RV13 tenían 40% de DOTAP, 10% de DOPE, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG. Para comparación, el ADN de plásmido desnudo (20 ]xg) que expresa el mismo antígeno RSV-F se suministró ya sea usando electroporación o con liposomas RV01(10) (ADN ?.?µ?). Cuatro ratones se usaron como un grupo control sin tratamiento.
El diámetro de partícula promedio Z e índice de polidispersidad fueron: El suero se colectó para análisis de anticuerpo en los días 14, 36 y 49. Los bazos se recogieron de ratones en el día 49 para análisis de célula T.
Las titulaciones IgG de suero específica de F (GMT) fueron como sigue: La proporción de células T que son positivas de citoquina y específicas para péptido RSV F51-66 son como sigue, mostrando únicamente figuras que son estadísticamente de forma significativa por arriba de cero: Así las formulaciones de liposoma de forma significativa aumentan la inmunogenicidad relativa a los controles de ARN desnudo, como se determina al incrementar titulaciones IgG específicas de F y frecuencias de célula T. El ADN plásmido formulado con liposomas, o suministrado desnudo usando electroporación, fue de forma significativa menos inmunogénico que ARN auto-replicante formulado con liposoma.
Inunogenicidad RSV en diferentes cepas de ratones El replicón "vA142" codifica la glicoproteína (F) de fusión de superficie de tipo natural de longitud completa de RSV pero con el péptido de fusión eliminado, y el extremo 3' se forma por insición meditada de ribozima. Se probó en tres diferentes cepas de ratones.
Los ratones BALB/c se les dieron vacunación intramuscular bilateral (50 L- por pata) en los días 0 y 22. Los animales se dividieron en 8 grupos de prueba (5 animales por grupo) y un control sin experimentar (2 animales) : Al grupo 1 se le dio replicón desnudo (1 pg) .
Al grupo 2 se le dio lpg de replicón suministrado en liposomas "RV01(37)" com 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Choi, 2% PEG-conjugado DMG.
Al grupo 3 se le dio lo mismo que al grupo 2, pero en 0.1 g AR .
Al grupo 4 se le dio l g de replicón en liposomas "RV05 (11)" (40% RV05 lípido, 30% 18:2 PE (DLoPE, 28% colesterol, 2% PEG-DMG) .
Al grupo 5 se le dio 5]iq subunidad RSV-F de proteína adyuvada con hidróxido de aluminio .
Al grupo 6 fueron un control sin experimentar (2 animales) Se recolectaron los sueros para análisis de anticuerpo en los días 14, 35 y 49. GMTs IgG de suero específico P fueron: En el día las titulaciones IgGl específicas de F e IgG2a (GMT) fueron como se presentan a continuación: Las titulaciones de neutraliación de suero RSV en los días 35 y 49 fueron como se presentan a continuación (los datos son 60% de titulaciones de neutralización de reducción de placa de las agrupaciones de 2-5 ratones, 1 agrupación por grupo) : 12.6 Se extrajeron los bazos el día 49 para análisis de células T. Las frecuencias promedio de células T positivas de citoquina específicas de F brutas (CD4+ o CD8+) fueron como se presentan a continuación, mostrando sólo las figuras las cuales fueron estadísticamente importantes arriba de cero (específico para los péptidos RSV F51-66, F164-178, F309-323 para CD4+, o para los péptidos F85-93 y F249-258 para CD8+) : Los ratones C57BL/6 se inmunizaron del mismo modo, pero un 7o grupo recibió VRPs (lxlO6 IU) expresando la glicoproteína de fusión de superficie de longitud completa de RSV (eliminación del péptido de fusión) .
Los sueros se recolectaron para análisis de anticuerpo los días 14, 35 y 49. Las titulaciones IgG específicos de F (GMT) fueron: En el día 35 las titulaciones IgGl específicas de F e IgG2a (GMT) fueron como se presentan a continuación: Las titulaciones de anticuerpo de neutralización de suero RSV en los días 35 y 49 fueron como se presentan a continuación (los datos son 60% titulaciones de neutralización de reducción de placa de agrupaciones de 2-5 ratones, 1 agrupación por grupo) : Los bazos se extrajeron el día 49 para análisis de células T. Las frecuencias promedio de células T positivas de citoquina de específico de F netas (CD8+) fueron como se presentan a continuación, mostrando sólo las figuras las cuales fueron estadísticamente importantes arriba de cero (específico para péptidos RSV F85-93 y F249-258) : Nueve grupos de ratones C3H/HeN se inmunizaron del mismo modo. Las titulaciones IGg específicos de F (GMT) fueron: El día 35 las titulaciones IgGl específico de F y IgG2a (GMT) fueron como se presentan a continuación: Las titulaciones de anticuerpo de neutralización de suero RSV los días 35 y 49 fueron como se presentan a continuación : De este modo los diferentes lípidos (RV01 y RV05; pKa 5.8 y 5.85) se probaron en tres diferentes cepas de ratón innato. Para las cepas BALB/c y C3H RV05 fue menos efectivo que RV01, pero fue más efectivo en la cepa B6. En todos los casos, sin embargo, los liposomas fueron más efectivos que dos nanoemulsiones catiónicas que se probaron en paralelo.
Ratas de algodón El replicón vA142 también se probó en ratas de algodón usando liposomas formados de: (a) 40% DlinDMA, 10% DPSC, 48% colesterol y 2% PEG DMG 2000. (b) 40% RV05, 30% DLoPE (18:2 PE), 28% colesterol y 2% PEG DMG 2000.
A las ratas de algodón, 4-8 animales por grupo, se les dio vacunación intramuscular (100 \iL en una pata) los días 0 y 21 con: Grupo 1 ARN de auto-replicación (vA142, 0.1 yg, RSV-F) formulado en liposomas (a) Grupo 2 ARN de auto-replicación (vA142, 0.1 pg, RSV-F) formulado en liposomas (b) Grupo 3 ARN de auto-replicación (vA142, 1 pg, RSV-F) formulado en liposomas (a) Grupo 4 ARN de auto-replicación (vA142, 1 pg, RSV-F) formulado en liposomas (b) Grupo 5 VRPs (1x106 IU) expresando la glicoproteína F de superficie de tipo natural de longitud completa de RSV Grupo 6 vacuna de proteína de subunidad RSV-F (5 pg) adyuvada con hidróxido de aluminio Grupo 7 un conterol sin experimentar (3 animales) Todas las ratas de algodón (excepto grupo 7) se vacunaron con 5 pg subunidad F + hidróxido de aluminio el día 49 (cuatro semanas después de la segunda vacunación) .
El suerto se recolectó para análisis de anticuerpos los días 0, 21, 35, 49, 64.
Las titulaciones IgG de suero específico de F (GMT) fueron como se presentan a continuación: Las titulaciones de anticuerpos de neutralización de suero RSV fueron como se presentan a continuación: De este modo las ratas de algodón se vacunaron con replicón vA142 formulado con RV01 o RV05, y el replicón se dio en dos dosis (1.0 y 0.1 . Después de la primera vacunación de replicón las titulaciones IgG de suero específico de F fueron más altos que RV01 y RV05, pero las titulaciones de neutralización fueron aproximadamente iguales. Las titulaciones en todos los grupos fueron impulsados por una segunda vacunación homologa dada el día 21. Después de la segunda vacunación de replicón, las titulaciones IgG de suero específico de F de nuevo fueron más altas con RV01 que con RV05, y las titulaciones de neutralización RSV generalmente siguieron esta tendencia.
La vacunación de proteína el día 49 no impulsó las titulaciones de anticuerpo en ratas de algodón previamente vacunadas con proteína, pero proporcionaron un impulso grande a las titulaciones en ratas de algodón previamente vacunadas con AR . Las titulaciones (IgG total y neutrlización) fueron más altas el día 64 usando RV05 que cuando se usa RV01.
Diferentes lípidos catiónicos con replicón vA317 RSV Los experimentos adicionales compararon cuatro diferentes lípidos catiónicos (DlinDMA, RV02, RV04 y RV07) . Todos los liposomas contienen 2% de PEG-DMG 2000 pero las composiciones de lípido restantes varían. Las composiciones y características físicas fueron como sigue: Para comparación de inmunogenicidad, los liposomas HT, SUV y MLV también se hicieron con RV01, usando los mismos componentes en las mismas proporciones, pero con métodos de fabricación que no son escalábales (pero son más rápidos) . Brevemente, se creó una solución madre de etanol que contiene 37mg/ml DLinDMA, 12mg/ml DSPC, 28mg/ml colesterol, y 8 mg/ml de PEG DMG 2000. 100 L de la solución madre se diluyeron en un total de lml de etanol . Los liposomas se prepararon evaporando la solución de etanol usando un evaporador rotativo en 150 milliTorr, presión por 30 minutos a 50°C. La evaporación de etanol residual se aseguró colocando las muestras durante toda la noche bajo vacio en un secador en frío. La película de lípido se hidrató y se dispersó agregando 1.0 mL de agua deionizada filtrada y colocada a 50°C para asegurar la suspensión total de los lípidos en MLVs.
Una alícuota se removió de los MLVs y se sónico con un sonicadorde sonda con un pulso de 1 segundo por 5 minutos a 100% de energía para formar SUVs. Ambas soluciones resultantes fueron complejas en ARN de replicón. Los liposomas HT se hicieron usando una solución madre de etanol que contiene 37mg/ml DLinDMA, 12mg/ml DSPC, 28mg/ml colesterol, y 8 mg/ml de PEG DMG 2000. ???µ?? de la solución madre se diluyeron a 400µ]_. con etanol. La solución de etanol resultante se agregó gota a gota a 600µL de lOmM de solución amortiguadora de citrato a pH 6.5 que contiene 4µg de ARN bajo agitación constante. La solución resultante se dializó toda la noche contra 4L de solución amortiguadora PBS usando una membrana de diálisis 10,000 MWCO.
Los ratones BALB/c, 8 por grupo, se les dio vacunaciones intramusculares bilaterales (50 L por pata) en los días 0 y 21 con replicón desnudo (Ipg) o O.lpg ADN encapsulado. Las titulaciones IgG de suero específico de F (GMT) 2 semanas después de estas dos inyecciones fueron como sigue: Para RV07 la ausencia de DSPC causa una disminución grande en la inmunogenicidad .
Los lípidos adicionales (RV03, RV08, RV09, RV14) se probaron de la misma forma: El liposoma N (con DC-colesterol) se desempeñó pobremente, incluso debajo del control de ARN desnudo. En contraste, los lípidos catiónicos restantes dieron resultados útiles. El liposoma O se preparó por medio de un método de mezcla diferente (chip microfluídico) del liposoma G y este liposoma más pequeño dio mejores resultados con aproximadamente la misma encapsulación.
Los lípidos adicionales (RV01, RV10, RV11, RV15) se probaron de la misma forma: Excepto para liposoma Q cada uno de estos liposomas funcionó mejor que el control. El lípido RV10 en liposoma Q tiene un pKa de 7.86 qüe parece demasiado alta para ser útil in vivo. Aún dentro del intervalo pKa útil de 5.0 hasta 7.6, sin embargo, aunque los resultados fueron buenos, ninguno de los lípidos con una cola de alquilo y una cola que contiene esteroide dio resultados tan buenos como RV01.
Los liposomas adicionales se hicieron con RV05. Los liposomas todos tenían RV05 40% y lípido PEGilado 2%, pero los componentes restantes variaron (aunque el colesterol siempre se incluyó) . Las características físicas fueron: aGC = a-galactosilceramida Los ratones BALB/c se probaron como antes : Para un lípido catiónico con colas de lípido asimétrico (alquilo + colesterol) , que cambia el lípido neutral de DSPC (cola de lípido C18 saturado) hasta 18:2 o 18:3 PC (con 2 y 3 enlaces dobles no saturados por cola) aumentan las titulaciones IgG totales. Los resultados comparables se observaron al reemplazar DSPC con DPyPE.
En el experimento final con el lípido RV05 se hizo con 40% RV05, 10% 18:2 PC, 40% DPyPE, 8% colesterol y 2% PEG DMG 2000. Estos liposomas tuvieron un diámetro Zav de 124.7nm, un pdl de 0.17 y una encapsulación de ARN de 61.5%. Se usaron para vacunar ratones BALB/c como antes (O.lpg dosis ARN) , en comparación con el ARN desnudo (l g) o con liposomas basados en RV01 (40% DlinDMA, 10% DPSC, 48% colesterol, 2% PEG DMG 2000) . Titulaciones (GTM) IgG de suero específico de F fueron como se presentan a continuación: De este modo los liposomas RV05 fueron más inmunogénicos que el ARN desnudo, pero menos inmunogénicos que los liposomas RV01.
Los bazos se extrajeron el día 49 para el análisis de células T. Las frecuencias promedio de células T positivas de citoquina específicas de F brutas (CD4+ or CD8+) fueron como se presentan a continuación, mostrando sólo las figuras las cuales fueron estadísticamente importantes arriba de cero (específico para péptidos RSV F51-66, F164-178, F309-323 para CD4+, o para péptidos F85-93 y F249-258 para CD8+) : En términos de respuestas de las células T, por lo tanto, RV05 dio mejores resultados que RV01.
Se entenderá que la invención se ha descrito a modo de ejemplo únicamente y las modificaciones se pueden hacer mientras sigan estando dentro del alcance y espíritu de la invención.
Tabla 1: fosfolípidos adecuados DDPC 1 , 2-Didecanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DEPA 1, 2-Dierucoil-sn-Glicero-3-Fosfato DEPC 1, 2-Erucoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DEPE 1, 2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1,2 -Dierucoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1 ¡rol... ) DLOPC 1,2 -Linoleoil-sn-•Glicero-3 -fosfatidilcolina DLPA 1,2 -Dilauroil-sn-•Glicero-3-Fosfato DLPC 1,2 -Dilauroil-sn-¦Glicero- 3 -fosfatidilcolina DLPE 1,2 -Dilauroil-sn-¦Glicero- 3-fosfatidiletanolamina DLPG 1, 2-Dilauroil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- icerol ..
DLPS 1, 2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DMG 1, 2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DMPA 1, 2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfato DMPC 1, 2-Dimiristoil-sn-Glicero-3- fosfatidilcolina DMPE 1, 2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DMPG 1, 2-Miristoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DMPS 1, 2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DOPA 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato DOPC 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DOPE 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DOPG 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DOPS 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DPPA 1, 2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato DPPC 1, 2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DPPE 1, 2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DPPG 1, 2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DPPS 1, 2-Dipaltnitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DPyPE 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DSPA 1, 2-Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfato DSPC 1, 2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DSPE 1, 2-Diostearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DSPG 1, 2-Distearoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1-glicerol ... ) DSPS 1, 2 -Distearoil-sn-Glicero-3 -fosfatidilserina EPC PC de huevo HEPC PC de huevo Hidrogenado HSPC PC de soja hidrogenado de Alta pureza HSPC PC de soja hidrogenado LYSOPC MYRISTIC l-Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina LYSOPC PALMITIC l-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina LYSOPC STEARIC l-Estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina Leche Esfingomielina MPPC 1-Miristoilo, 2-palmitoil-sn-Glicero 3 -fosfatidilcolina MSPC 1-Miristoilo, 2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina PMPC 1-Palmitoilo, 2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina POPC 1-Palmitoilo, 2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina POPE l-Palmitoil-2 -oleoil-sn-Glicero-3 -fosfatidiletanolamina POPG 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1-glicerol) ... ] PSPC 1-Palmitoilo, 2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SMPC 1-Estearoilo, 2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SOPC 1-Estearoilo, 2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SPPC 1-Estearoilo, 2-palmitoil-sn-Glicero-3 -fosfatidilcolina REFERENCIAS [I] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23: 1495-1501. [2] Heyes et al. (2005) J Controlled Reléase 107:276-87. [3] WO2005/121348. [4] Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers : Methods and Protocols, (ed. eissig) . Humana Press, 2009. ISBN 160327359X. [5] Liposome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis) . Informa Healthcare, 2006. [6] Functional Polymer Colloids and Microparticles volumen 4 (Microspheres , microcapsules & liposomes), (eds. Arshady & Guyot) . Citus Books, 2002. [7] Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3) :362-372. [8] WO2011/076807. [9] Tarwadi et al. (2008) Bioconjugate Chem. 19:940-950. [10] WO2005/113782.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un liposoma dentro del cual el ARN que codifica un polipéptido de interés es encapsulado, caracterizado porque incluye al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de los compuestos de la fórmula (I) y la fórmula (XI) , donde La fórmula (I) es: en donde : R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al cual están adjuntos forman un grupo heterocicloalquilo C3-2o, heterocicloalquenilo C3-2o, heterocicloalquinilo C3-2o o heteroarilo C5.2o opcionalmente sustituido; a está ausente o alquileno Ci-4 opcionalmente sustituido; b está ausente o alquileno Ci-4 opcionalmente sustituido; c está ausente o alquileno Ci-4 opcionalmente sustituido; X1 es O u S; X2 es 0 o S; Y1 es alquenilo C10-30/ alquinilo C10-30, heteroalquenilo Cio-30 o heteroalquinilo C10-3o opcionalmente sustituido; L está ausente o es - (La) d- (Lb) e- (Lc) f- , en donde La es alquileno Ci_i5, alquenileno C1-15, alquinileno C1-:L5, heteroalquileno C1-15, heteroalquenileno Ci-iS o heteroalquinileno C1-15 opcionalmente sustituido; Lb es arileno CS-i4 o C5-13heteroarileno opcionalmente sustituido; Lc es alquileno Ci-15, alquenileno C1-15, alquinileno C1-15, heteroalquileno Ci-15, heteroalquenileno C1-15 o heteroalquinileno CX-1S opcionalmente sustituido; d es 0 o 1; e es 0 o 1; y f es 0 o 1; y y2 es un esteroide opcionalmente sustituido. La fórmula. (XI) es: Ra- (AA)Z-R en donde Ra es un alquilamida de terminal N; z es un entero de 2 a 10; cada AA es un aminoácido, siempre y cuando esté presente al menos una histidina y al menos un aminoácido catiónico esté presente; Rb es -H o -NH2.
2. El liposoma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el liposoma tiene un diámetro en el intervalo de 80-160nm.
3. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARN es un ARN auto-replicante.
4. El liposoma de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la molécula de ARN auto-replicante codifica (i) una polimerasa ARN dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de auto-replicación de ARN y (ii) el polipéptido de interés.
5. El liposoma de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la molécula de ARN tiene dos marcos de lectura abiertos, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y el segundo del cual codifica el polipéptido de interés.
6. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la molécula de ARN es de 9000-12000 nucleótidos de largo.
7. El liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polipéptido de interés es un inmunógeno.
8. El liposoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el inmunógeno puede eludir una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
9. El liposoma de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el inmunógeno puede eludir una respuesta inmunitaria in vivo contra la glicoproteína F de virus sincitial respiratorio.
10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un liposoma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. Un método para producir una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al vertebrado una cantidad efectiva del liposoma de conformidad con las reivindicaciones 1-9, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10.
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