MX2012008018A

MX2012008018A - Métodos y recubrimientos para tratar biopeliculas.

Info

Publication number: MX2012008018A
Application number: MX2012008018A
Authority: MX
Inventors: Richard Losick; Jon Clardy; Roberto Kolter; Illana Kolodkin-Gal; Diego Romero; Shugeng Cao
Original assignee: Harvard College
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2012-10-03
Also published as: WO2011085326A9; WO2011109119A1; KR20120115375A; BR112012016869A2; WO2011085326A1; CN102791262A; KR20120113259A; EP2521542A1; AU2011221564A1; CN103025158A; BR112012016749A2; EP2521448A1; AU2011203862A1; US20130071439A1; US20130059096A1; JP2013516297A; JP2013516492A; MX2012008017A

Abstract

Un método para tratar, reducir o inhibir formación de biopelículas por bacterias, el método comprende: poner en contacto un artículo con una composición que comprende una cantidad efectiva de D-amino ácido, dicha composición esencialmente libre del L-amino ácido correspondiente, tratando, reduciendo o inhibiendo así la formación de la biopelícula, en donde el D-amino ácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptofano, D-tirosina y una combinación de las mismas.

Description

MÉTODOS Y RECUBRIMIENTOS PARA TRATAR BIOPELÍCULAS PRIORIDAD La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional estadounidense No. 61/293,414, presentada el 8 de enero de 2010 y la solicitud provisional estadounidense No. 61/329,930, presentada el 30 de abril de 2010, pendientes.

La solicitud se refiere a la solicitud internacional de patente pendiente presentada en la misma fecha que la presente y titulada "Método y composición para tratar biopelículas".

Los contenidos de dichas solicitudes se incorporan mediante esta referencia.

DECLARACIÓN DE DERECHOS GUBERNAMENTALES La presente invención fue realizada con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos conforme a los premios del Instituto Nacional de la Salud CA24487, GM058213, GM082137, GM086258 y GM18568. El gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos sobre la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las biopelículas son comunidades de células que se asientan y proliferan sobre las superficies y están recubiertas por una matriz exopolimérica. Presentan un crecimiento lento y muchas se encuentran en la fase de crecimiento estacionaria. Pueden estar formadas por la mayoría de, si no todos, los patógenos. De acuerdo con los CDC [Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades según sus sigla en inglés], el 65% de todas las infecciones en los Estados Unidos son causadas por biopelículas que pueden estar formadas por patógenos comunes. Las biopelículas también se encuentran en contextos industriales, tales como en sistemas de distribución de agua potable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los aspectos de la invención presentan métodos para tratar, reducir o inhibir la formación de biopelículas por parte de las bacterias. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto una superficie con una composición que comprende una cantidad eficaz de un D-aminoácido, que de este modo, tratan, reducen o inhiben la formación de la biopelícula. En algunas modalidades, las bacterias son bacterias Gram negativas o Gram positivas. En modalidades particulares, 'las bacterias son bacterias Bacillus, Staphylococcus, E. coli o Pseudomonas.

En una o más otras modalidades, la superficie comprende equipamiento industrial, sistemas de cañerías, masas de agua, superficies de la casa, textiles y papel.

En otros aspectos, la invención presenta composiciones, tales como composiciones industriales, terapéuticas o farmacéuticas, que comprenden uno o más D-aminoácidos. En determinadas modalidades, la composición comprende D-tirosina, D-leucina, D-metionina, D-triptófano o una combinación de estos. En algunas modalidades, la composición comprende D-tirosina, D-fenilalanina, D-prolina o una combinación de estos. En modalidades adicionales, la composición comprende dos o más de D-tirosina, D-leucina, D-fenilalanina, D-metionina, D-prolina y D-triptófano, y en otras modalidades adicionales, esta última composición básicamente no contiene detergente y/o L-aminoácidos. En otras modalidades, la composición se usa para tratar una biopelícula industrial descrita en la presente, tal como en sistemas de tratamiento de agua o cañerías.

Un aspecto de la presente descripción se refiere a métodos para tratar, reducir o inhibir la formación de biopelículas por parte de una bacteria que forma biopelículas, el método comprende poner en contacto un artículo con una composición que comprende una cantidad eficaz de un D-aminoácido o una combinación de D-aminoácidos, que de este manera, tratan, reducen o inhiben la formación de la biopelícula, donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D- prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina y una combinación de estos, o donde la combinación de D-aminoácidos es una combinación sinergística de dos o más D-aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparag¡na, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano y D-tirosina.

En algunas modalidades, la composición básicamente no contiene el/los L-aminoácido/s correspondiente/s con respecto a los D-aminoácidos o combinación de D-aminoácidos.

En algunas modalidades, el artículo es uno o más que se selecciona del grupo que consiste en un equipamiento industrial, sistemas de cañerías, masas de agua, superficies de la casa, textiles y papel. En modalidades adicionales, el artículo es uno o más componentes que participan en la recolección de agua condensada, recirculación del agua, transporte del agua de alcantarilla, proceso y fabricación de la pulpa de papel, y procesamiento y transporte del agua. En aun otras modalidades, el artículo es un desagüe, bañera, electrodoméstico para la cocina, mesada, cortina de baño, lechada de relleno (grout), baño, instalación de producción industrial de bebidas o alimentos, piso, barco, muelle, plataforma petrolera, puerto de captación de agua, tamiz, tubería de agua, sistema de refrigeración o central eléctrica.

En algunas modalidades, el artículo se fabrica con un material que se selecciona del grupo que consiste en metal, aleación metálica, polímero sintético, polímero natural, cerámica, madera, vidrio, cuero, papel, tela, inorgánicos no metálicos, materiales compuestos y combinaciones de estos.

En otras modalidades, el contacto comprende aplicar un recubrimiento al artículo, dicho recubrimiento comprende una cantidad eficaz del D-aminoácido. En modalidades adicionales, el recubrimiento comprende adicionalmente un aglutinante. En algunas modalidades, el recubrimiento se logra mediante absorción, rociado, sumersión, recubrimiento giratorio, laminación, pintura, exposición, extrusión o reducción de la composición de recubrimiento en la superficie. En otras modalidades, el contacto comprende introducir un D-aminoácido en un material precursor y procesar el material precursor en el artículo impregnado con D-aminoácido. En modalidades adicionales, el contacto comprende introducir un D-aminoácido en una composición líquida.

En algunas modalidades de los métodos que anteceden, la composición comprende D-tirosina. En otras modalidades, la composición comprende adicionalmente uno o más de D-prolina y D-fenilalanina. En aun otras modalidades, la composición comprende adicionalmente uno o más de D-leucina, D-triptófano y D-metionina. En modalidades aun adicionales, la composición comprende adicionalmente uno o más de D-alanina, D-císteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D- arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina [sic], D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina y D-triptófano.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos precedentes, los métodos adicionalmente comprenden poner en contacto la superficie con un biocida. En algunas modalidades, la composición comprende polihexametileno biguanida, clorhexidina, xilitol, triclosán o dióxido de cloro.

En otras modalidades de cualquiera de los métodos precedentes, la composición contiene menos de 1 % de L-aminoácidos.

En modalidades adicionales de cualquiera de los métodos precedentes, la composición básicamente no contiene detergente.

Aun otro aspecto de esta descripción se dirige a artículos recubiertos resistentes a la formación de biopelículas, que comprende un artículo que comprende un recubrimiento en al menos una superficie expuesta, dicho recubrimiento comprende una cantidad eficaz de un D-aminoácido o una combinación de D-aminoácidos, que por lo tanto tratan, reducen o inhiben la formación de biopelícula, donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lísina, D-leucína, D-asparagina, D-prolina, D-glutamína, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina y una combinación de estos, o donde la combinación de D-aminoácidos es una combinación sinergística de dos o más D-aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano y D-tirosina.

En algunas modalidades, el recubrimiento básicamente no contiene el/los L-aminoácido/s correspondiente/s con respecto a los D-aminoácidos o combinación de D-aminoácidos.

En algunas modalidades, el artículo es uno o más que se selecciona del grupo que consiste en un equipamiento industrial, sistemas de cañerías, masas de agua, superficies de la casa, textiles y papel. En modalidades adicionales, el artículo es uno o más componentes que participan en la recolección de agua condensada, recirculación del agua, transporte del agua de alcantarilla, proceso y fabricación de la pulpa de papel y procesamiento y transporte del agua. En aun otras modalidades, el artículo es un desagüe, banadera, electrodoméstico para la cocina, mesada, cortina de baño, lechada de relleno (grout), baño, instalación de producción de bebidas o alimentos industriales, piso, barco, muelle, plataforma petrolera, puerto de captación de agua, tamiz, tubería de agua, sistema de refrigeración o central eléctrica.

En algunas modalidades, el artículo se fabrica con un material que se selecciona del grupo que consiste en metal, aleación metálica, polímero sintético, polímero natural, cerámica, madera, vidrio, cuero, papel, tela, inorgánicos no metálicos, materiales compuestos y combinaciones de estos. En modalidades adicionales, el recubrimiento comprende adicionalmente un aglutinante. En otras modalidades, el recubrimiento comprende adicionalmente un polímero y el D-aminoácido está distribuido en el polímero.

En algunas modalidades, el recubrimiento de D-aminoácido se formula como una formulación de liberación lenta.

En algunas modalidades, la composición comprende D-tirosina. En modalidades adicionales, la composición adicionalmente comprende uno o más de D-prolina y D-fenilalanina. En aun otras modalidades adicionales, la composición adicionalmente comprende uno o más de D-leucina, D-triptófano y D-metionina. En aun otras modalidades, la composición adicionalmente comprende uno o más D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina [sic], D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina y D-triptófano.

En algunas modalidades, la composición adicionalmente comprende un biocída. En modalidades adicionales, el biocida comprende polihexametileno biguanida, clorhexidina, xilitol, triclosán o dióxido de cloro.

En algunas modalidades, cualquiera de los artículos recubiertos o composiciones precedentes contienen menos de 1 % de L-aminoácidos. En modalidades adicionales, el artículo recubierto o composición básicamente no contienen detergente.

Otro aspecto de la presente descripción se refiere a composiciones resistentes a la formación de biopelículas, que comprenden una base fluida; y una cantidad eficaz de un D-aminoácido o una combinación de D-aminoácidos distribuidos en la base, que de este modo tratan, reducen o inhiben la formación de la biopelícula, donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina y una combinación de estos, y donde la combinación de D-aminoácidos es una combinación sinergística de dos o más D-aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano y D-tirosina.

En algunas modalidades, la base fluida se selecciona de un líquido, gel, pasta.

En algunas modalidades, la composición se selecciona del grupo que consiste en agua, formulaciones para lavar, formulaciones desinfectantes, pinturas y formulaciones de recubrimiento.

Aun otro aspecto de esta descripción se dirige a composiciones de recubrimiento que comprenden dos o más D-aminoácidos, donde al menos un D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-tirosina, D-leucina, D-metionina y D-triptófano, y al menos un D-aminoácido es un D-aminoácido diferente que se selecciona del grupo que consiste en D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano y D-tirosina y un aglutinante polimérico.

En algunas modalidades, la composición básicamente no contiene el L-aminoácido correspondiente con respecto al D-aminoácido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras se presentan solamente a efectos ilustrativos y no pretenden limitar la descripción.

Las figuras 1A y 1 B muestran células de B. subtilis cepa NCIB3610 que se cultivaron a 22°C en placas de 12 pocilios en medio líquido que produce biopelícula durante 3 días (figura 1A) o durante 8 días (figura 1 B).

Las figuras 1 C y 1 D muestran células cultivadas durante 3 días en un medio al que se le agregó un eluato de metanol seco y resuspendido (1 :100 v/v) de una columna C18 Sep Pak a la que se le cargó un medio acondicionado de un cultivo de 6-8 días (figura 1C) o un cultivo de 3 días (figura 1D). La concentración final del factor concentrado agregado a los pocilios representó un dilución 1 :4 en una base de volumen del medio acondicionado original.

La figura 1 E es la misma que la figura 1 C salvo que el factor se purificó adicionalmente en la columna C-18 mediante la elución por etapas con metanol. Se muestra el resultado de agregar 3 µ? del eluato de metanol al 40%.

La figura 1 F es la misma que la figura 1 C salvo que, antes de la adición al medio fresco, el eluato de metanol al 40% se incubó con microesferas de proteinasa K durante 2 horas seguido de centrifugación para retirar las microesferas.

La figura 2A muestra los efectos de agregar D-tirosina (3 µ?), D-leucina (8.5 mM), L-tirosina (7 mM) o L-leucina (8.5 mM) a cultivos recién inoculados en medio que produce biopelícula luego de la incubación durante 3 días sobre la formación de una capa.

La figura 2B muestra la mínima concentración inhibitoria de biopelícula (MBIC) de D-aminoácidos necesarios para la inhibición completa de la formación de una capa.

La figura 2C muestra cultivos de 3 días a los que se les agregó D-tirosina (3 µ?), una mezcla de D-tirosina, D-triptófano, D-metionina y D-leucina (2.5 nM cada uno), o no se les agregaron aminoácidos (sin tratar), a lo que le siguió una incubación adicional durante 8 horas.

La figura 2D muestra el efecto del eluato de columna Sep Pak C-18 concentrado del medio acondicionado de un cultivo de 8 días del tipo salvaje o de una cepa (IKG55) doblemente mutante para ylmE y racX.

La figura 2E muestra S. aureus (cepa SC01 ) que fue cultivada en placas de poliestireno de 12 pocilios durante 24 horas a 37°C en medio de TSB que contiene glucosa (0.5%) y NaCI (3%). De manera adicional, se agregó D-tirosina (50 µ?) o la mezcla de D-aminoácidos (15 nM cada uno) o no se agregaron aminoácidos (sin tratar) a los pocilios. Se visualizaron las células unidas al poliestireno retirando las células no unidas y luego tiñiéndolas con cristal violeta.

La figura 3A muestra la incorporación de D-tirosina radiactiva en la pared celular. Las células se cultivaron en medio que produce biopelícula y se incubaron con 14C-D-tirosina o con 1 C-L-prolina (10 pCi/ml) durante 2 h a 37°C. Los resultados se presentan como un porcentaje de la incorporación total en las células (360,000 cpm/ml para L-prolina y 46,000 cpm/ml para D-tirosina).

La figura 3B muestra la fluorescencia total de las células (DR-30 (Romero et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2010, en prensa)) que contiene una fusión de traducción de tasA-mCherry funcional. Las células se cultivaron en fase estacionaria agitando en medio que produce biopelícula en presencia o ausencia de D-tirosina (6 µ?).

La figura 3C muestra la asociación de las células de TasA-mCherry mediante microscopía fluorescente. Las células de tipo salvaje y las células mutantes yqxM6 (IKG51 ) que contienen la fusión de tasA-mCherry se cultivaron en fase estacionaria (DO=1.5) agitando en medio que produce biopelícula en presencia o ausencia (sin tratar) de D-tirosina (6 µ?) tal como se indicó, lavada en PBS, y se visualizaron mediante microscopía fluorescente.

La figura 3D muestra la asociación celular de las fibras TasA mediante microscopía electrónica. Se incubaron cultivos de 24 horas sin (imágenes 1 y 2) o con (imágenes 3-6) D-tirosina (0.1 mM) durante 12 horas adicionales. Se tiñeron fibras TasA medíante etiquetado inmunooro usando anticuerpos anti-TasA, y se visualizaron mediante microscopía electrónica de transmisión, tal como se describe en los Ejemplos. Las células eran mutantes con respecto al operón eps {Aeps) ya que la ausencia de exopolisacárido mejora significativamente la imagenología de fibras TasA. Las flechas llenas indican grupos de fibras; las flechas abiertas indican fibras individuales. La barra de escala es de 500 nm. La barra de escala en las ampliaciones de las imágenes 2, 4 y 6 es 100 nm. Las imágenes 1 y 2 muestran grupos de fibras ligados a las células, las imágenes 3, 4 y 6 muestran fibras individuales y grupos separados de las células y las imágenes 3-5 muestran células con poco o nada de material de fibras.

La figura 4A muestra células cultivadas durante 3 días en medio que produce biopelícula sólido (imágenes superiores) o líquido (imágenes inferiores) que contenía o no contenía D-tirosina.

La figura 4B muestra una secuencia de aminoácidos abreviada para YqxM. Los residuos especificados por los codones en donde las mutaciones del marco de lectura de yqxM2 e yqxM6 dieron como resultado los cambios indicados en las secuencias se encuentran subrayados.

La figura 5 muestra pocilios que contienen medio de MSgg complementado con D-triptófano (0.5 mM), D-metionina (2 mM), L-triptófano (5 mM) o L-metionina (5 mM) que fueron inoculados con la cepa NCIB3610 e incubados durante 3 días.

La figura 6 muestra placas que contienen medio de MSgg sólido complementado con D-tirosina (3 µ?) o D-leucina (8.5 mM) que fueron inoculados con la cepa NCIB3610 e incubados durante 4 días.

La figura 7 muestra NCIB3610 (tipo salvaje) y un mutante doblemente eliminado para ylmE y racX (IKG155) que fueron cultivados en placas de 12 pocilios e incubados durante 5 días.

La Figura 8 muestra el efecto de los D-aminoácidos en el crecimiento celular. Las células se cultivaron en medio de MSgg que contiene D-tirosina (3 µ?), D-leucina (8.5 mM) o la mezcla de cuatro D-aminoácidos (2.5 nM cada uno) agitando.

La figura 9A muestra la expresión de PyqxM-lacZ mediante la cepa FC122 (que transporta PyqxM-lacZ) y la figura 9B muestra la expresión de PepSA-lacZ mediante la cepa FC5 (que transporta PepsA-lacZ) que se cultivaron en medio de MSgg que contiene D-tirosina (3 µ?), D-leucina (8.5 mM) o la mezcla de cuatro D-aminoácidos (2.5 nM cada uno) agitando.

La figura 10 muestra la inhibición de la formación de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa mediante los D-aminoácidos. La cepa P014 de P. aeruginosa se cultivó en placas de poliestireno de 12 pocilios durante 48 horas a 30°C en medio de M63 que contiene glicerol (0.2%) y ácidos casamino (20 pg/ml). De manera adicional, se agregó D-tirosina o la mezcla de D-aminoácidos o no se agregaron aminoácidos (sin tratar). Se visualizaron las células unidas al poliestireno retirando las células no unidas y luego tiñiéndolas con cristal violeta. Los pocilios se tiñeron con 500 µ? de tinte de cristal violeta al 1 .0%, se lavaron dos veces con 2 mi de agua destilada dos veces y se secaron por completo.

La figura 1 1 muestra la tinción con cristal violeta de biopelículas de Staphylococcus aureus cultivadas con D-aminoácidos individuales o con la mezcla cuádruple en medio de TSB durante 24 horas.

La figura 12 muestra la tinción con cristal violeta de Pseudomonas aeruginosa cultivadas con D-aminoácidos individuales o la mezcla cuádruple en medio de M63 durante 48 horas.

La figura 13 muestra la tinción con cristal violeta de biopelículas de Staphylococcus aureus cultivadas con D-aminoácidos individuales o con la mezcla cuádruple en medio de TSB durante 24 horas.

La figura 14 muestra la tinción con cristal violeta de biopelículas de Staphylococcus aureus cultivadas en medio de TSB con L-aminoácidos durante 24 horas.

La figura 15 es una imagen representativa de las biopelículas de Staphylococcus aureus formadas en el medio de TSB aplicado con D- aminoácidos luego de retirar las bacterias planctónicas.

La figura 16 es una imagen representativa de las biopelículas de Staphylococcus aureus formadas en el medio de TSB aplicado con L-aminoácidos luego de retirar las bacterias planctónicas.

La figura 17 es una cuantificación de las células dentro de las biopelículas de Staphylococcus aureus formadas en el medio de TSB luego de retirar las bacterias planctónicas. Las células se volvieron a suspender en PBS.

La figura 18 muestra el efecto de una mezcla de D-aminoácidos (1 mM) en la formación de biopelícula de Staphylococcus aureus sobre las superficies. Las superficies epoxi se empaparon en una mezcla de D/L aminoácidos y luego se incubaron con bacterias durante 24 horas.

La figura 19 muestra el efecto de una mezcla de D-aminoácidos (1 mM) en la formación de biopelícula de Staphylococcus aureus sobre las superficies. Las superficies epoxi se empaparon en una mezcla de D/L aminoácidos y luego se incubaron con bacterias durante 24 horas.

La figura 20 muestra el efecto de D-aminoácidos en la formación de biopelículas sobre el medio sólido de M63 en Pseudomonas aeruginosa. Las colonias se cultivaron a temperatura ambiente durante 4 días.

La figura 21 muestra la tinción con Sytox de células unidas individuales en el fondo de una placa de 6 pocilios de Pseudomonas aeruginosa en condiciones que producen biopelícula.

La figura 22 muestra la tinción con cristal violeta de Proteus mirabilis cultivadas con una mezcla de D-aminoácidos (100 µ?) o L-aminoácidos ( 00 µ?) en medio de LB durante 48 horas.

La figura 23 muestra la tinción con cristal violeta de Streptococcus mutans cultivados con D- o L- aminoácidos (1 mM) en medio de BHI aplicado con medio de sucrosa (0.5%) durante 72 horas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Si bien en la práctica o en el análisis de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan mediante esta referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" se refieren en la presente a la inhibición del desarrollo o inicio de una biopelícula o la prevención de la reaparición, inicio o desarrollo de uno o más indicios o síntomas de una biopelícula, sobre una superficie o en un sujeto, resultante de la administración de una composición descrita en la presente (por ej., una composición profiláctica o terapéutica), o la administración de una combinación de terapias (por ej., una combinación de composiciones profilácticas o terapéuticas).

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones detalladas a continuación. Como será evidente para el experto en la técnica, las características y modalidades específicas descritas en la presente se pueden combinar con cualquier otra característica o modalidad.

La invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de que los D-aminoácidos presentes en un medio acondicionado de biopelículas maduras previenen la formación de biopelículas y provocan la desintegración de las biopelículas existentes. Los aminoácidos estándar pueden existir en cualquiera de los dos isómeros ópticos, denominados L- o D-aminoácidos, que son imágenes en espejo de sí mismos. Mientras que los L-aminoácidos representan la gran mayoría de los aminoácidos que se encuentran en las proteínas, los D-aminoácidos son componentes de la pared celular de peptidoglicano de las bacterias. Los D-aminoácidos descritos en la presente pueden penetrar las biopelículas en las superficies vivas y no vivas, prevenir la adhesión de bacterias a las superficies y cualquier acumulación de biopelícula, separar dicha biopelícula y/o inhibir el crecimiento adicional de los microorganismos que forman biopelículas en la matriz biológica o eliminar dichos microorganismos.

Los D-aminoácidos son conocidos en la técnica y se pueden preparar usando técnicas conocidas. Los ejemplos de métodos incluyen, por ej., los descritos en la publicación estadounidense No. 20090203091. Los D-aminoácidos también están comercialmente disponibles (por ej., en Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.).

Se puede usar cualquier D-aminoácido en los métodos descritos en la presente, incluyendo de modo no taxativo, D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano o D-tirosina. Se puede usar un D-aminoácido solo o combinado con otros D-aminoácidos. En métodos de ejemplo, se usan 2, 3, 4, 5, 6 o más D-aminoácidos combinados. Preferentemente, en los métodos descritos en la presente se usan D-tirosina, D-leucina, D-metionina o D-triptófano, ya sea solos o combinados. En otras modalidades preferidas, en los métodos descritos en la presente se usan D-tirosina, D-prolina y D-fenilalanina, ya sea solos o combinados.

Un D-aminoácido puede utilizarse a una concentración de alrededor de 0.1 nM a alrededor de 100 µ?, por ejemplo, de alrededor de 1 nM a alrededor de 10 µ?, de alrededor de 5 nM a alrededor de 5 µ?, o de alrededor de 10 nM a alrededor de 1 µ?, por ejemplo, a una concentración de 0.1 nM a 100 µ?, 1 nM a 10 µ?, 5 nM a 5 µ? o 10 nM a 1 µ?.

Un ejemplo de una composición, recubrimiento o solución de D-aminoácidos que se descubrió que era particularmente eficaz para inhibir o tratar la formación de biopelículas incluye D-tirosina. En algunas modalidades, se usa D-tirosina sola y se puede usar, por ejemplo, como concentraciones inferiores a 1 mM, o inferiores a 100 µ? o inferiores a 10 µ?, o en una concentración de 0.1 nM a 100 µ?, por ej., 1 nM a 10 µ?, 5 nM a 5 µ? o 10 nM a 1 µ?.

En otras modalidades, se usa D-tirosina combinada con uno o más de D-prolina y D-fenilalanina. En algunas modalidades, se usa D-tirosina combinada con uno o más de D-leucina, D-triptófano y D-metionina.Las combinaciones de D-tirosina con uno o más de D-prolina, D-fenilalanina, D-leucina, D-triptófano y D-metionina pueden ser sinergísticas y pueden ser eficaces para inhibir o tratar la formación de biopelículas en concentraciones totales de D-aminoácidos de 10 µ? o menos, por ej., alrededor de 1 nM a alrededor de 10 µ?, alrededor de 5 nM a alrededor de 5 µ?, o alrededor de 10 nM a alrededor de 1 µ?, o en una concentración de 0.1 nM a 100 µ?, por ej., 1 nM a 10 µ?, 5 nM a 5 µ? o 10 nM a 1 µ?.

En algunas modalidades, las combinaciones de D-aminoácidos son equimolares. En otras modalidades, las combinaciones de D-aminoácidos no se encuentran en cantidades equimolares.

En algunas modalidades, la composición básicamente no contiene L-aminoácidos. Por ejemplo, la composición comprende menos de alrededor de 30%, menos de alrededor de 20%, menos de alrededor de 10%, menos de alrededor de 5%, menos de alrededor de 1 %, menos de alrededor de 0.5%, menos de alrededor de 0.25%, menos de alrededor de 0.1 %, menos de alrededor de 0.05%, menos de alrededor de 0.025%, menos de alrededor de 0.01 %, menos de alrededor de 0.005%, menos de alrededor de 0.0025%, menos de alrededor de 0.001 % o menos de L-aminoácidos. En otras modalidades, la composición comprende menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 1 %, menos de 0.5%, menos de 0.25%, menos de 0.1 %, menos de 0.05%, menos de 0.025%, menos de 0.01 %, menos de 0.005%, menos de 0.0025%, menos de 0.001 % de L-aminoácidos. En modalidades preferidas, el porcentaje de L-aminoácido está en relación con el D-aminoácido correspondiente. A modo de ejemplo, una mezcla racémica de L-aminoácido y D-aminoácido contiene 50% de L-aminoácido.

En algunas modalidades, la composición básicamente no contiene detergente. Por ejemplo, la composición comprende menos de alrededor de 30% en peso, menos de alrededor de 20% en peso, menos de alrededor de 10% en peso, menos de alrededor de 5% en peso, menos de alrededor de 1 % en peso, menos de alrededor de 0.5% en peso, menos de alrededor de 0.25% en peso, menos de alrededor de 0.1% en peso, menos de alrededor de 0.05% en peso, menos de alrededor de 0.025% en peso, menos de alrededor de 0.01 % en peso, menos de alrededor de 0.005% en peso, menos de alrededor de 0.0025% en peso, menos de alrededor de 0.001 % en peso o menos de un detergente. En otras modalidades, la composición comprende, con relación a la composición total, menos de alrededor de 30% en peso, menos de alrededor de 20% en peso, menos de alrededor de 10% en peso, menos de alrededor de 5% en peso, menos de alrededor de 1 % en peso, menos de alrededor de 0.5% en peso, menos de alrededor de 0.25% en peso, menos de alrededor de 0.1 % en peso, menos de alrededor de 0.05% en peso, menos de alrededor de 0.025% en peso, menos de alrededor de 0.01 % en peso, menos de alrededor de 0.005% en peso, menos de alrededor de 0.0025% en peso, menos de alrededor de 0.001 % en peso de un detergente. Muchas veces en las formulaciones que contienen detergentes, por ej., tensioactivos, el tensioactivo interactuará con el agente activo, antes del D-aminoácido, que podrían afectar bastante la eficacia del agente. En algunas modalidades, podría ser necesario analizar la eficacia de los agentes con relación a los tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos y tensioactivos zwiteriónicos como análisis para determinar si la presencia del tipo de tensioactivo altera la eficacia. Reducir o eliminar los detergentes puede aumentar la eficacia de las composiciones y/o reducir las complicaciones de formulación.

Biopelículas La mayoría de las bacterias pueden formar comunidades multicelulares complejas que contienen matriz, conocidas como biopelículas (O'Toole et ál., Annu. Rev. Microbio!. 54:49 (2000); López et ál., FEMS Microbiol. Rev. 33:152 (2009); Karatan et ál., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73:310 (2009)). Las bacterias relacionadas con las biopelículas se protegen de las agresiones ambientales, tales como antibióticos (Bryers, Biotechnol. Bioeng.100:1 (2008)). Sin embargo, a medida que envejecen las biopelículas, los nutrientes se vuelven restrictivos, los productos residuales se acumulan y es ventajoso que las bacterias relacionadas con las biopelículas vuelvan a una existencia planctónica (Karatan et ál., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73:310 (2009)). Por lo tanto, las biopelículas tienen una duración limitada, caracterizada por una posible desintegración.

En términos muy generales, las biopelículas son consideradas conjuntos de microorganismos vivos o muertos, especialmente bacterias, que se adhieren a las superficies vivas o inertes, junto con sus metabolitos en forma de sustancias poliméricas extracelulares (matriz de SPE), por ejemplo, polisacáridos. La actividad de las sustancias antibiopelícula que normalmente exhiben una marcada actividad letal o de inhibición del crecimiento, con respecto a las células planctónicas se puede reducir mucho con respecto a los microorganismos que están organizados en las biopelículas, por ejemplo, debido a la inadecuada penetración de las sustancia activa en la matriz biológica.

Las bacterias gram negativas y las bacterias gram positivas, además de otros organismos unicelulares, pueden producir biopelículas. Las biopelículas bacterianas son comunidades unidas a la superficie de las células que están encerradas dentro de una matriz extracelular de polisacáridos producida por las células colonizadoras. El desarrollo de la biopelícula se produce mediante una serie de pasos programados, que incluyen la unión inicial a la superficie, la formación de microcolonias tridimensionales y el desarrollo posterior de una biopelícula madura. Cuanto más profunda esté ubicada una célula dentro de una biopelícula (tal como, cuanto más cerca esté la célula a la superficie sólida a la que está unida la biopelícula, estando así más protegida por el volumen de la matriz de la biopelícula), más metabólicamente inactivas serán las células. Las consecuencias de esta variación y gradiente fisiológicos crean un conjunto de comunidades bacterianas donde hay un sistema eficiente establecido mediante el cual los microorganismos presentan distintos rasgos funcionales. Una biopelícula también está compuesta por varios y distintos componentes no celulares y pueden incluir, de modo no taxativo, carbohidratos (simples y complejos), lípidos, proteínas (incluyendo polipéptidos) y complejos lípidos de azúcares y proteínas (lipopolisacáridos y lipoproteínas).

La biopelícula puede permitir que las bacterias existan en estado inactivo durante determinada cantidad de tiempo hasta que surjan las condiciones de crecimiento adecuadas ofreciendo, de este modo, al microorganismo una ventaja selectiva para asegurar su supervivencia. Sin embargo, esta selección puede representar serias amenazas para la salud humana ya que se ha observado que las biopelículas están implicadas en alrededor del 65% de las infecciones bacterianas humanas (Smith, Adv. Drug Deliv. Rev. 57:1539-1550 (2005); Hall-Stoodley et ál., Nat. Rev. Microbiol. 2:95-108 (2004)).

Las biopelículas también pueden afectar a una gran variedad de operaciones biológicas, médicas, comerciales, industriales y de procesamiento, tal como se describe en la presente. En contextos industriales, las biopelículas pueden adherirse a superficies tales como caños y filtros. Las biopelículas son problemáticas en contextos industriales porque causan corrosión e incrustación biológicas en sistemas industriales, tales como intercambiadores de calor, oleoductos, sistemas de agua, filtros y similares (Coetser et al., (2005) Crit. Rev. Micro. 31 : 212-32). Por lo tanto, las biopelículas pueden inhibir el flujo de fluidos por los caños, obstruir sistemas de agua y de otros fluidos, así como también oficiar de depósitos para bacterias, protozoos y hongos patogénicos. Como tales, las biopelículas industriales son una causa importante de la ineficiencia económica en los sistemas de procesamiento industrial. Asimismo, pueden coexistir diferentes especies de bacterias que producen la biopelícula dentro de dicho sistema. Por lo tanto, existe la posibilidad de formación de biopelícula en dichos sistemas debido a múltiples especies.

Los métodos y materiales descritos en la presente pueden prevenir o reducir la formación de biopelícula asociada a una amplia variedad de operaciones comerciales, industriales y de procesamiento, tales como las que se encuentran en las industrias de manejo/procesamiento de agua. En algunos casos, se puede aplicar un D-aminoácido a la biopelícula encontrada en dichas superficies. En otros casos, se puede utilizar un D-aminoácido para prevenir que las bacterias que forman biopelículas se adhieran a la superficie. Por ejemplo, la superficie puede ser una superficie de un equipamiento industrial (tal como el equipamiento ubicado en las instalaciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP), plantas de procesamiento de alimentos, lugares de procesamiento de fotografías y similares), las superficies de los sistemas de cañerías o las superficies de masas de agua (tal como lagos, piscinas, océanos y similares).

Las superficies pueden estar recubiertas, rociadas o impregnadas con un D-aminoácído antes de su uso para prevenir la formación de biopelículas bacterianas. Ejemplos específicos no limitantes de dichas superficies incluyen cañerías, tubos y componentes de soporte que participan en la recolección de agua condensada, descargas del agua de alcantarilla, operaciones de pulpa de papel, sistemas de recirculación del agua (tales como sistemas de aire acondicionado, torres de refrigeración y similares) y en sistemas de almacenamiento, manejo, procesamiento y recolección de agua. Mediante la adición de un D-aminoácido se puede tratar, prevenir o reducir la formación de biopelículas en la superficie del agua o en la superficie de los tubos o cañerías de los sistemas de manejo de agua u otras superficies que participan en los sistemas de recolección/operación que se ponen en contacto con el agua.

Bacterias que forman biopelículas Los métodos descritos en la presente se pueden usar para prevenir o retrasar la formación de biopelículas y/o para tratarlas. En los ejemplos de métodos, las biopelículas se forman por bacterias que forman biopelículas. Las bacterias pueden ser especies bacterianas gram negativas o especies bacterianas gram positivas. Los ejemplos no taxativos de dichas bacterias incluyen un miembro del género Actinobacillus (tal como Actinobacillus actinomycetemcomitans), un miembro del género Acinetobacter (tal como Acinetobacter baumannii), un miembro del género Aeromonas, un miembro del género Bordetella (tales como Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica o Bordetella parapertussis), un miembro del género Brevibacillus, un miembro del género Brucella, un miembro del género Bacteroides (tal como Bacteroides fragilis), un miembro del género Burkholderia (tales como Burkholderia cepacia o Burkholderia pseudomallei), un miembro del género Borelia (tal como Borelia burgdoríeri), un miembro del género Bacillus (tales como Bacillus anthracis o Bacillus subtilis), un miembro del género Campyiobacter (tal como Campyiobacter jejuni), un miembro del género Capnocytophaga, un miembro del género Cardiobacterium (tal como Cardiobacterium hominis), un miembro del género Citrobacter, un miembro del género Clostridium (tales como Clostridium tetani o Clostridium diffícile), un miembro del género Chlamydia (tales como Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae o Chlamydia psiffaci), un miembro del género Eikenella (tal como Eikenella corrodens), un miembro del género Enterobacter, un miembro del género Escherichia (tal como Escherichia coli), un miembro del género Francisella (tal como Francisella tularensis), un miembro del género Fusobacterium, un miembro del género Flavobacterium, un miembro del género Haemophilus (tales como Haemophilus ducreyi o Haemophilus influenzae), un miembro del género Helicobacter (tal como Helicobacter pylori), un miembro del género Kingella (tal como Kingella kingae), un miembro del género Klebsiella (tal como Klebsiella pneumoniae), un miembro del género Legionella (tal como Legionella pneumophila), un miembro del género Listeria (tal como Listeria monocytogenes), un miembro del género Leptospirae, un miembro del género Moraxella (tal como Moraxella catarrhalis), un miembro del género Morganella, un miembro del género Mycoplasma (tales como Mycoplasma hominis o Mycoplasma pneumoniae), un miembro del género Mycobacterium (tales como Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium leprae), un miembro del género Neisseria (tales como Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis), un miembro del género Pasteurella (tal como Pasteurella multocida), un miembro del género Proteus (tales como Proteus vulgaris o Proteus mirablis), un miembro del género Prevotella, un miembro del género Plesiomonas (tal como Plesiomonas shigelloides), un miembro del género Pseudomonas (tal como Pseudomonas aeruginosa), un miembro del género Providencia, un miembro del género Rickettsia (tales como Rickettsia rickettsii o Rickettsia typhi), un miembro del género Stenotrophomonas (tal como Stenotrophomonas maltophila), un miembro del género Staphylococcus (tales como Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis), un miembro del género Streptococcus (tales como Streptococcus viridans, Streptococcus pyogenes (grupo A), Streptococcus agalactiae (grupo B), Streptococcus bovis o Streptococcus pneumoniae), un miembro del género Streptomyces (tal como Streptomyces hygroscopicus), un miembro del género Salmonella (tales como Salmonella enteriditis, Salmonella typhi o Salmonella typhimurium), un miembro del género Serratia (tal como Serratia marcescens), un miembro del género Shigella, un miembro del género Spirillum (tal como Spirillum minus), un miembro del género Treponema (tal como Treponema pallidum), un miembro del género Veillonella, un miembro del género Vibrio (tales como Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus o Vibrio vulnificus), un miembro del género Yersinia (tales como Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis o Yersinia pseudotuberculosis), y un miembro del género Xanthomonas (tal como Xanthomonas maltophilia).

Específicamente, Bacillus subtilis forma comunidades arquitecturalmente complejas sobre superficies semisólidas y partículas gruesas en la interfaz aire/líquido de los cultivos en reposo (López et ál., FEMS Microbiol. Rev. 33:152 (2009); Aguilar et ál., Curr. Opin. Microbiol. 10:638 (2007); Vlamakis et ál., Genes Dev. 22:945 (2008); Branda et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:11621 (2001)). Las biopelículas de B. subtilis consisten en cadenas largas de células unidas por una matriz extracelular que consiste en fibras de exopolisacáridos y amiloides compuestas de la proteína TasA (Branda et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:1 1621 (2001); Branda et ál., Mol. Microbiol.59:1229 (2006); Romero et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2010, en prensa)). El exopolisacárido se produce mediante enzimas codificadas por el operón epsA-0 ("operón eps") y la proteína TasA está codificada por el gen promotor distal del operón yqxM-sipW-tasA ("operón yqxM") (Chu et ál., Mol. Microbiol. 59:1216 (2006)).

Las bacterias que producen biopelículas, por ej., una especie descrita en la presente, se pueden encontrar en un sujeto vivo, in vitro o sobre una superficie, tal como se describe en la presente.

Aplicaciones/Formulaciones Las composiciones con D-aminoácidos pueden utilizarse para reducir o prevenir la formación de biopelícula en superficies no biológicas semisólidas o sólidas. Dicha superficie puede ser cualquier superficie que sea propensa a la formación de biopelícula y a la adhesión de bacterias. Ejemplos no limitantes de superficies incluyen superficies duras fabricadas con uno o más de los siguientes materiales: metal, plástico, goma, cartón, vidrio, madera, papel, concreto, piedra, mármol, materiales de yeso y cerámica, tales como porcelana, que están opcionalmente recubiertos, por ejemplo, con pintura o esmalte.

En determinadas modalidades, la superficie es una superficie que se pone en contacto con agua o, en particular, con agua estancada. Por ejemplo, la superficie puede ser una superficie de un sistema de cañerías, equipamiento industrial, recolectores de agua condensada, equipamiento usado para transportar agua de alcantarilla, recirculación del agua, proceso de pulpa de papel, y procesamiento y transporte de agua. Ejemplos no limitantes incluyen las superficies de los desagües, bañeras, electrodomésticos para la cocina, mesadas, cortinas de baño, lechada de relleno (grout), baños, instalaciones de producción industrial de bebidas o alimentos, y revestimiento de pisos. Otras superficies incluyen estructuras marítimas, tales como barcos, muelles, puertos de captación de agua, tamices y puertos de observación.

Se puede aplicar un D-aminoácido a una superficie mediante cualquier método conocido, tales como mediante cobertura, recubrimiento, contacto, asociación, relleno o carga de la superficie con una cantidad eficaz de un D-aminoácido. El D-aminoácido puede aplicarse a la superficie con un portador adecuado, por ejemplo, un portador fluido, que se remueve, por ejemplo, mediante evaporación, para dejar un recubrimiento de D-aminoácido. En ejemplos específicos, un D-aminoácido se fija directamente a la superficie ya sea rociando la superficie, por ejemplo con una película polimérica/de D-aminoácidos, sumergiendo la superficie en o mediante recubrimiento giratorio de la superficie, por ejemplo con solución polimérica/de D-aminoácidos o mediante otros medios covalentes o no covalentes. En otros casos, la superficie se recubre con una sustancia absorbente (tal como hidrogel) que absorbe el D-aminoácido.

Los D-aminoácidos son adecuados para tratar superficies en un hospital o contexto médico. La aplicación de los D-aminoácidos y las composiciones descritas en la presente pueden inhibir o reducir la formación de biopelícula cuando se aplica como recubrimiento, lubricante, solución para lavado o limpieza, etc.

Los D-aminoácidos descritos en la presente también son adecuados para tratar, especialmente para conservar materiales de fibra textil. Dichos materiales son materiales de fibra teñidos o sin teñir, impresos, por ejemplo, de seda, lana, poliamida o poliuretanos, y especialmente materiales de fibra de celulosa de todo tipo. Dichos materiales de fibra son, por ejemplo, fibras naturales de celulosa, tales como algodón, lino, yute y cáñamo, así como también celulosa y celulosa regenerada. También se le puede proporcionar propiedades antibiopelícula al papel, por ejemplo, al papel usado para fines higiénicos, utilizando uno o más D-aminoácido descrito en la presente. También es posible proporcionarle propiedades antibiopelícula a las telas no tejidas, por ejemplo, pañales, toallitas femeninas, protectores diarios y paños para higiene y usos domésticos.

Los D-aminoácidos descritos en la presente son adecuados también para tratar, especialmente para conferir propiedades antibiopelícula a o para conservar formulaciones industriales tales como recubrimientos, lubricantes, etc.

Los D-aminoácidos descritos en la presente también pueden utilizarse en formulaciones para lavado y limpieza, por ejemplo en agentes o suavizantes de limpieza líquidos o en polvo. Los D-aminoácidos descritos en la presente también pueden utilizarse en limpiadores de uso doméstico o general para limpiar y desinfectar superficies duras. Un ejemplo de preparación de limpieza tiene, por ejemplo, la siguiente composición: 0.01 a 5% en peso de uno o más D-aminoácidos, 3.0% en peso de octil alcohol 4EO, 1.3% en peso de alcohol graso C8-Ci0 poliglucósido, 3.0% en peso de isopropanol y agua al 100%.

Los D-aminoácidos descritos en la presente también pueden utilizarse para el tratamiento antibiopelícula de la madera y para el tratamiento antibiopelícula del cuero, la conservación del cuero y para conferirle al cuero las propiedades antibiopelícula. Los D-aminoácidos descritos en la presente también pueden utilizarse para proteger productos cosméticos y productos domésticos del daño microbiano.

Los D-aminoácidos descritos en la presente son útiles para prevenir la incrustación biológica, o para eliminar o controlar la acumulación de microbios en las superficies, ya sea mediante la incorporación de uno o más D-aminoácidos descritos en la presente en el artículo o superficie del artículo en cuestión o mediante la aplicación del antibiopelícula a estas superficies como parte de un recubrimiento o película. Dichas superficies incluyen superficies que están en contacto con ambientes marítimos (incluyendo ambientes de agua fresca, agua salobre y agua salada), por ejemplo, los cascos de los barcos, las superficies de muelles o el interior de las cañerías de los sistemas de agua en circulación o de paso. Otras superficies son susceptibles a incrustación biológica similar, por ejemplo, paredes expuestas al agua de lluvia, paredes de duchas, techos, canaletas, áreas de piscina, saunas, pisos y paredes expuestas a ambientes húmedos, tales como sótanos o garages y hasta las estructuras para almacenar herramientas y muebles de exteriores. La patente estadounidense 7,618,697, la cual se incorpora en su totalidad a la presente como referencia, describe compuestos útiles para recubrimientos o películas para proteger superficies contra la incrustación biológica.

Cuando se aplica como parte de una película o recubrimiento, uno o más D-aminoácidos descritos en la presente pueden ser parte de una composición que también comprende un aglutinante. El aglutinante puede ser cualquier polímero u oligómero compatible con los antibiopelículas de la presente. El aglutinante puede encontrarse en forma de un polímero u oligómero antes de la preparación de la composición antiincrustación, o puede formarse mediante polimerización durante o después de la preparación, incluyendo después de la aplicación al sustrato. En determinadas aplicaciones, tal como en determinadas aplicaciones de recubrimiento, sería deseable reticular el oligómero o polímero de la composición antiincrustación después de la aplicación. El término "aglutinante", tal como se usa en la presente, también incluye materiales como glicoles, aceites, ceras y tensioactivos usados comercialmente en el cuidado de la madera, plástico, vidrio y otras superficies. Los ejemplos incluyen materiales impermeabilizantes para madera, protectores de vinilo, ceras protectoras y similares.

La composición puede ser un recubrimiento o una película.

Cuando la composición es una película termoplástica que se aplica a una superficie, por ejemplo, mediante el uso de un adhesivo o mediante aplicaciones de fusión que incluyen calandrado y coextrusión, el aglutinante es la matriz polimérica termoplástica utilizada para preparar la película. Cuando la composición es un recubrimiento, se puede aplicar como una solución o suspensión líquida, una pasta, gel, aceite o la composición de recubrimiento puede ser un sólido, por ejemplo, un recubrimiento en polvo que posteriormente se cura con calor, luz UV u otro método.

Como la composición de la invención puede ser un recubrimiento o una película, el aglutinante puede estar compuesto por cualquier polímero utilizado en las formulaciones de recubrimiento o en la preparación de la película. Por ejemplo, el aglutinante es un polímero termoestable, termoplástico, elastomérico, intrínsecamente reticulado o reticulado. Los polímeros termoestables, termoplástícos, elastoméricos, intrínsecamente reticulados o reticulados incluyen poliolefina, poliamida, poliuretano, poliacrilato, poliacrilamida, policarbonato, poliestireno, polivinil acetatos, polivinil alcoholes, poliéster, polímeros de vinilo halogenados, tal como, PVC, gomas naturales y sintéticas, resinas de alquido, resinas de epoxi, poliésteres insaturados, poliamidas insaturadas, poliimidas, polímeros que contienen silicio y de carbamato, polímeros fluorinados, resinas acrílicas reticulables derivadas de ésteres acrílicos sustituidos, por ej., de acrilatos de epoxi, acrilatos de uretano o acrilato de poliéster. Los polímeros también pueden ser mezclas y copolímeros de los químicos que anteceden.

Los polímeros de recubrimiento biocompatibles, tales como, poliésteres de poli[-alcoxialcanoato-co-3-hidroxialquenoato] (PHAE), Geiger et. ál. Polymer Bulletin 52, 65-70 (2004), también pueden ser útiles como aglutinantes en la presente invención. Las resinas de alquido, poliésteres, poliuretanos, resinas de epoxi, polímeros que contienen silicona, poliacrilatos, poliacrilamidas, polímeros fluorinados y polímeros de vinil acetato, vinil alcohol y vinil amina son ejemplos no taxativos de aglutinantes de recubrimiento comunes útiles en la presente invención. Otros aglutinantes de recubrimiento conocidos son parte de la presente descripción.

Los recubrimientos se pueden reticular con, por ejemplo, resinas de melamina, resinas de urea, isocianatos, isocianuratos, poliisocianatos, resinas de epoxi, anhídridos, poliácidos y aminas, con o sin aceleradores. Las composiciones descritas en la presente pueden ser, por ejemplo, un recubrimiento aplicado a una superficie que está expuesta a condiciones favorables para la bioacumulación. La presencia de uno o más D-aminoácidos descritos en la presente en dicho recubrimiento puede prevenir la adherencia de organismos a la superficie.

Los D-aminoácidos descritos en la presente pueden formar parte de una formulación completa de recubrimiento o pintura, tal como una película gelificada para uso marítimo, goma laca, barniz, laca o pintura, o la composición anti incrustante puede comprender solamente un polímetro de la presente invención y un aglutinante, o un polímero de la presente invención, un aglutinante y una sustancia portadora. Otros aditivos conocidos en la técnica para dichas formulaciones o aplicaciones son también adecuados.

El recubrimiento puede ser a base de solvente o acuoso. En general, se considera que los recubrimientos acuosos son más ecológicos. En algunos ejemplos, el recubrimiento puede ser una dispersión acuosa de uno o más D-aminoácidos descritos en la presente y un aglutinante o un recubrimiento o pintura a base de agua. Por ejemplo, el recubrimiento puede comprender una dispersión acuosa de uno o más D-aminoácidos y polímeros o copolímeros acrílicos, metacrílicos o de acrilamida o un poliéster de poli[-alcoxialcanoato-co -3-hidroxialquenoato].

El recubrimiento puede aplicarse a una superficie que ya ha sido recubierta, tal como un recubrimiento protector, un recubrimiento transparente o una cera protectora aplicada sobre un artículo previamente recubierto. Los sistemas de recubrimiento incluyen recubrimientos para uso marítimo, recubrimientos para madera, otros recubrimientos para metales y recubrimientos para plásticos y cerámicas. Los ejemplos de recubrimientos para uso marítimo son las películas gelificadas que comprenden un poliéster no saturado, un estireno y un catalizador. En algunos ejemplos, el recubrimiento es una pintura para el hogar u otra pintura decorativa o protectora. Puede ser una pintura u otro recubrimiento que se aplica a cemento, concreto u otro artículo de mampostería. El recubrimiento puede ser impermeabilizante en el caso de sótanos o de cimientos.

En algunos casos, la composición de recubrimiento se puede aplicar a una superficie mediante cualquier medio convencional incluyendo recubrimiento giratorio, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por pulverización, reducción o mediante un cepillo, rodillo u otro aplicador. Se puede realizar un período de secado o cura.

El espesor del recubrimiento o la película puede variar dependiendo de la aplicación y el experto en la técnica puede determinarlo fácilmente luego de un período de prueba limitado.

En algunos casos, una composición descrita en la presente puede encontrarse en forma de una película laminada protectora. Dicha película puede comprender polímeros termoestables, termoplásticos, elastoméricos o reticulados. Los ejemplos de dichos polímeros incluyen, de modo no taxativo, poliolefina, poliamida, poliuretano, poliacrílato, poliacrilamida, policarbonato, poliestireno, poíivinil acetatos, polivinil alcoholes, poliéster, polímeros de vinilo halogenados, tal como, PVC, gomas naturales y sintéticas, resinas de alquido, resinas de epoxi, poliésteres insaturados, poliamidas insaturadas, poliimidas, polímeros fluorinados, polímeros que contienen silicio y de carbamato. Los polímeros también pueden ser mezclas y copolímeros de los químicos que anteceden.

Cuando una composición descrita en la presente es una película preformada, se puede aplicar a una superficie mediante, por ejemplo, el uso de un adhesivo o se puede coextrudir sobre la superficie. También se puede adherir de forma mecánica mediante sujetadores, lo que puede requerir el uso de un sellador o masilla, donde también se pueden emplear ventajosamente los ésteres de la presente invención. Una película plástica también se puede aplicar con calor, incluyendo aplicaciones de calandrado, fusión y mediante embalaje termoplástico.

En otros casos, una composición como se describe en la presente, puede ser parte de un lustre, tal como un lustre para muebles, o una formulación dispersante o tensioactiva tal como una dispersión de glicol o aceite mineral u otra formulación que se utilice en, por ejemplo, la protección de la madera. Los ejemplos de tensioactivos útiles incluyen, de modo no taxativo, sustancias tensioactivas basadas en polioxietileno, incluidos tetraoleato de polioxietilen sorbitán (PST), hexaoleato de polioxietilen sorbitol (PSH), tridecil éter de polioxietileno 6, tridecil éter de polioxietileno 12, tridecil éter de polioxietileno 18, tensioactivos TWEEN®, tensioactivos TRITON® y copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno tal como la línea de productos PLURONIC® y POLOXAMER® (de BASF). Otros componentes que forman matrices incluyen dextranos, moléculas PEG lineales (peso molecular de 500 a 5,000,000), moléculas PEG con forma de estrella, moléculas PEG hiperramificadas, en forma de peine y dendriméricas, así como los polímeros análogos de poliamina lineal, en forma de estrella y dendrimérica, y varios tensioactivos carbonados, perfluorados (por ejemplo, fluorotensioactivos DUPONT ZONYL®) y tensioactivos siliconados (por ejemplo, copolímeros de bloque de óxido dimetilsiloxano-etileno).

Dado el amplio conjunto de aplicaciones para los D-aminoácidos descritos en la presente, una composición que contiene D-aminoácidos puede incluir otros aditivos, tales como antioxidantes, absorbentes UV, aminas impedidas, fosfitos o fosfonitas, benzofuran-2-onas, tiosinergistas, estabilizadores de poliamida, estearatos metálicos, agentes cristalizadores, rellenos, agentes de refuerzo, lubricantes, emulsificantes, tintes, pigmentos, dispersantes, otros abrillantadores ópticos, retardantes de llama, agentes antiestáticos, agentes de soplado y similares, tales como los materiales enumerados a continuación o mezclas de estos.

El sustrato a ser tratado puede ser un sustrato inorgánico u orgánico, por ejemplo, un metal o una aleación metálica; un polímero termoplástico, elastomérico, intrínsecamente reticulado o reticulado, como se describe anteriormente; un polímetro natural, tal como madera o goma; un material cerámico; vidrio; cuero u otro tejido. El sustrato puede ser, por ejemplo, superficies inorgánicas no metálicas, tal como sílice, dióxido de silicio, óxidos de titanio, óxidos de aluminio, óxidos de hierro, carbono, sílice, varios silcatos y sol-geles, materiales de mampostería y materiales compuestos tales como fibra de vidrio y madera plástica (una mezcla de polímeros y virutas de madera, harina de madera u otras partículas de madera).

El sustrato puede ser un artículo de capas múltiples que comprende el mismo o diferentes componentes en cada capa. La superficie recubierta o laminada puede ser la superficie expuesta de un recubrimiento o laminado anterior.

El sustrato inorgánico u orgánico a ser recubierto o laminado puede estar en cualquier forma sólida.

Por ejemplo, los sustratos de polímeros pueden ser plásticos en forma de películas, artículos moldeados por inyección, productos eximidos, fibras, fieltros y telas tejidas. Por ejemplo, los artículos poliméricos moldeados o extruidos utilizados en la construcción y fabricación de bienes duraderos, tal como vías, letreros y buzones, pueden beneficiarse de la incorporación de los D-aminoácidos de la presente invención. En algunas situaciones, uno o más D-aminoácidos pueden incorporarse al artículo polimérico durante su formación, por ejemplo, proceso de moldeado.

Los plásticos que pueden beneficiarse por el método de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, plásticos utilizados para la fabricación de bienes duraderos o partes de maquinaria, incluidos muebles de exteriores, barcos, vías, techos, vidriados, películas protectoras, calcomanías, selladores, compuestos como madera plástica y compuestos reforzados de fibra de vidrio, películas funcionales, incluidas las utilizadas en pantallas así como artículos construidos a partir de fibras sintéticas, tales como toldos, telas tales como las utilizadas en lienzos o velas de barcos y artículos de goma, tales como esteras para exteriores, coberturas para pisos, recubrimientos plásticos, contenedores de plástico y materiales para empaque; utensilios de cocina y para el baño (por ejemplo, cepillos, cortinas de baño, esponjas, alfombras para el baño), látex, materiales de filtro (filtros de aire y agua), artículos de plástico utilizados en el área de la medicina, por ej., materiales de vendaje, jeringas, catéteres, etc., denominados "dispositivos médicos", guantes y colchones. Los ejemplos de dichos plásticos son polipropileno, polietileno, PVC, POM, polisulfonas, polietersulfonas, poliestirénicos, poliamidas, poliuretanos, poliésteres, policarbonato, poliacrilicos y metacrílicos, polibutadienos, poliolefinas termoplásticas, ionómeros, poliésteres insaturados y mezclas de resinas poliméricas incluyendo ABS, SAN y PC/ABS.

En algunas situaciones, tal como la incorporación de uno o más D-aminoácidos descritos en la presente en agua para refrigeración en recirculación, unas pocas partes por millón de los D-aminoácidos son eficaces para prevenir la acumulación de biopelícula en las paredes de caños y de otros aparatos mecánicos. Sin embargo, alguna pérdida debido a filtración, alguna pérdida debido a reacciones en las que los aminoácidos están involucrados y alguna pérdida por reacciones de degradación, etc., significa que en la práctica se pueden preparar formulaciones que tienen concentraciones que serán eficaces durante el período de tiempo previsto para la aplicación y teniendo en cuenta el esfuerzo ambiental al cual los D-aminoácidos estarán expuestos.

Por ejemplo, en aplicaciones industriales de agua, de alrededor de 0.001 % a alrededor de 10% en peso o, por ejemplo, de 0.001 % a 10% en peso de uno o más D-aminoácidos respecto al agua en tratamiento, puede ser utilizado, comúnmente, un límite superior de menos de alrededor de 10% puede ser utilizado, por ejemplo, alrededor de 5%, alrededor de 3%, alrededor de 2% o incluso alrededor de 1 % o menos puede ser eficaz en muchas circunstancias, por ejemplo, pueden utilizarse niveles de carga de alrededor de 0.01 % a alrededor de 5% o de alrededor de 0.01 % a alrededor de 2% de uno o más D-aminoácidos. En otras modalidades, un nivel superior de menos de 10%, 5%, 3%, 2%, 1 % puede ser utilizado, tal como de 0.01 % a 5% o de alrededor de 0.01 % a 2% en peso de uno o más D-aminoácidos puede ser utilizado. Dada la gran actividad de los D-aminoácidos de la presente invención, cantidades muy pequeñas son eficaces en muchas circunstancias y concentraciones de alrededor de 0.000001 % a alrededor de de 0.5%, por ejemplo, de alrededor de 0.000001% a alrededor de 0.1 %, o de alrededor de 0.000001 % a alrededor de 0.01 %, pueden utilizarse en aplicaciones industriales de agua. En otras modalidades, concentraciones de 0.000001 % a 0.5%, por ejemplo, 0.000001 % a 0.1 % o 0.000001 % a 0.01 % pueden utilizarse en aplicaciones industriales de agua.

Los D-aminoácidos, especialmente en bajas concentraciones, se pueden usar de forma segura incluso en aplicaciones donde es posible la ingestión, tales como botellas de agua reutilizables o bebederos donde se puede desarrollar una biopelícula. Las superficies de dichos dispositivos de transporte de agua se pueden enjuagar con una formulación que contiene uno o más D-aminoácidos descritos en la presente, o se pueden introducir niveles bajos de uno o más D-aminoácidos en el agua que pasa a través de los recipientes de los conductos. Por ejemplo, se puede introducir alrededor de 0.0001 % o menos o hasta alrededor de 1 %, en general menos de alrededor de 0.1 % en peso de uno o más D-aminoácidos en dicha agua. En otros ejemplos, de 0.0001 % o menos o hasta 1 %, típicamente menos de 0.1 % en peso de uno o más D-aminoácidos pueden introducirse en dicha agua. Dada la gran actividad de los D-aminoácidos de la presente, se pueden usar en dichas aplicaciones muy pequeñas cantidades son eficaces en muchas circunstancias y concentraciones de alrededor de 0.000001 % a alrededor de 0.1 %, por ejemplo, alrededor de 0.000001 % a alrededor de 0.01 %, o alrededor de 0.000001 % a alrededor de 0.001 %. En otros ejemplos, se pueden utilizar concentraciones de 0.000001% a 0.1%, 0.000001 % a 0.01 %, o 0.000001 % a 0.001 %.

En algunos casos, las formulaciones líquidas se preparan con una concentración de alrededor de 0.0005 µ? de D-aminoácido a alrededor de 50 µ? de D-aminoácido, por ejemplo, de alrededor de 0.001 µ? de D-aminoácido a alrededor de 25 µ de D-aminoácido, de alrededor de 0.002 µ? D-aminoácido a alrededor de 10 µ? de D-aminoácido, de alrededor de 0.003 µ? de D-aminoácido a alrededor de 5 µ? de D-aminoácido, de alrededor de 0.004 µ? de D-aminoácido a alrededor de 1 µ? de D-aminoácido, de alrededor de 0.005 µ? de D-aminoácido a alrededor de 0.5 µ? de D-aminoácido, de alrededor de 0.01 µ? de D-aminoácido a alrededor de 0.1 µ? de D-aminoácido, o de alrededor de 0.02 µ? de D-aminoácido a alrededor de 0.1 µ? de D-aminoácido. En otras modalidades, las formulaciones líquidas se preparan con una concentración de 0.0005 µ? de D-aminoácido a 50 µ? de D-aminoácido, de 0.001 µ? de D-aminoácido a 25 µ? de D-aminoácido, de 0.002 µ? de D-aminoácido a 10 µ? de D-aminoácido, de 0.003 µ? de D-aminoácido a 5 µ? de D-aminoácido, de 0.004 µ? de D-aminoácido a 1 µ? de D-aminoácido, de 0.005 µ? de D-aminoácido a 0.5 µ? de D-aminoácido, de 0.01 µ? de D-aminoácido a 0.1 µ? de D-aminoácido, o de 0.02 µ? de D-aminoácido a 0.1 µ? de D-aminoácido. Preferentemente, la composición de D-aminoácidos tiene concentraciones nanomolares, por ejemplo, alrededor de 5 nM, alrededor de 10 nM, alrededor de 15 nM, alrededor de 20 nM, alrededor de 25 nM, alrededor de 30 nM, alrededor de 50 nM o mayores. En otras modalidades, la composición de D-aminoácidos tiene una concentración de alrededor de 5 nM, de 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, o 50 nM.

Cuando se usan en un recubrimiento o película, las pequeñas cantidades de uno o más D-aminoácidos pueden estar presentes para su uso a corto plazo, por ejemplo, un uso, artículos temporales o desechables, etc. En general, se puede usar alrededor de 0.001 % o menos, hasta alrededor de 5%, por ejemplo, hasta alrededor de 3% o alrededor de 2% en dichos recubrimientos o películas. En otras modalidades puede utilizarse 0.001 % a 5%, o hasta 3% o 2% en peso de uno o más D-aminoácidos. Dada la gran actividad de los D-aminoácidos de la presente, muy pequeñas cantidades son eficaces en muchas circunstancias y concentraciones de alrededor de 0.0001 % a alrededor de 1 %, por ejemplo, se puede usar alrededor de 0.0001 % a alrededor de 0.5%, o alrededor de 0.0001 % a alrededor de 0.01 %. En otras modalidades pueden utilizarse concentraciones de 0.0001 % a 1 %, 0.0001 % a 0.5%, o 0.0001 % a 0.01 % en peso de uno o más D-aminoácídos en las aplicaciones de recubrimiento.

Para usos más resistentes, por ejemplo, recubrimiento para materiales marítimos, para piscinas, para duchas o de construcción, niveles más altos de uno o más D-aminoácidos pueden ser utilizados. Por ejemplo, puede utilizarse de alrededor de 0.01 % a alrededor de 30%, basado en la formulación de recubrimiento o película; en muchos usos, de alrededor de 0.01 % a alrededor de 15% o a alrededor de 10% será eficaz, y comúnmente puede utilizarse de alrededor de 0.01 % a alrededor de 5% o de alrededor de 0.01 % a alrededor de 1 % o incluso alrededor de 0.1 % o menos de D-aminoácidos. En otras modalidades, de 0.01 % a 15%, o de 0.01 % a 10% será efectivo, y comúnmente puede utilizarse de 0.01 % a 5%, o 0.01 % a 1 %, o incluso 0.1 % de uno o más D-aminoácidos.

Para la incorporación en un artículo de plástico moldeado, se puede usar alrededor de 0.00001 % a alrededor de 10% de uno o más D-aminoácidos, por ejemplo, alrededor de 0.0001 % a alrededor de 3%, por ejemplo, se puede usar alrededor de 0.001 % hasta alrededor de 1 % de uno o más D-aminoácidos. En algunas modalidades se puede usar 0.00001 % a 10% de uno o más D-aminoácidos, o de 0.0001% a 3% o de 0.001 % a 1 % de uno o más D-aminoácidos. En las situaciones en las que los D-aminoácidos se impregnan en la superficie de una fibra o artículo moldeado previamente preparado, la cantidad real de un D-aminoácido presente en la superficie puede depender del material de sustrato, la formulación de la composición impregnada, y del tiempo y temperatura usados durante el paso de impregnación. Dada la gran actividad de los D-aminoácidos de la presente, muy pequeñas cantidades son eficaces en muchas circunstancias y concentraciones de alrededor de 0.0001 % a alrededor de 1 %, por ejemplo, se puede usar alrededor de 0.0001 % a alrededor de 0.1 %, o alrededor de 0.0001 % a alrededor de 0.01 % en plásticos. En otras modalidades se puede usar 0.0001 % a 1 %, o 0.0001 % a 0.1 %, o 0.0001 % a 0.01 % en peso de uno o más D-aminoácidos en plásticos.

La inhibición o reducción en una biopelícula mediante el tratamiento con un D-aminoácido se puede medir usando técnicas consolidadas en la técnica. Estas técnicas permiten evaluar la unión bacteriana midiendo la tinción de la biomasa adherente, visualizar los microbios in vivo usando métodos de microscopía o controlar la muerte celular en la biopelícula como respuesta a los agentes tóxicos. Luego del tratamiento, la biopelícula se puede reducir con respecto al área de superficie cubierta por la biopelícula, espesor y consistencia (por ejemplo, la integridad de la biopelícula). Los ejemplos no taxativos de los ensayos de biopelícula incluyen ensayos de biopelícula de placa de microtitulación, ensayos fluorescentes de biopelícula, ensayos estáticos de biopelícula de acuerdo con Walker et ál., Infect. Immun. 73:3693-3701 (2005), ensayos de interfaz aire-líquido, ensayos de biopelícula de colonias y ensayos de cuentagotas de biopelícula Kadouri (Merritt et ál., (2005) Current Protocols in Microbiology 1. B.1.1-1. B.1.17). Dichos ensayos se pueden usar para medir la actividad de un D-aminoácido en la desintegración o inhibición de la formación de una biopelícula (Lew et ál., (2000) Curr. Med. Chem. 7(6):663-72; Werner et ál., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1 ):32-6).

En algunos casos, se puede usar un D-aminoácido junto con un segundo agente, por ej., un biocida, un antibiótico, para tratar una biopelícula o para prevenir la formación de una biopelícula. Se puede combinar un antibiótico con el D-aminoácido ya sea secuencial o simultáneamente. Por ejemplo, cualquiera de las composiciones descritas en la presente se pueden formular para incluir uno o más D-aminoácidos y uno o más segundos agentes.

El antibiótico puede ser cualquier compuesto conocido por un experto en la técnica que puede inhibir el crecimiento de las bacterias o eliminarlas. Los ejemplos útiles no taxativos de antibióticos incluyen lincosamidas (clindomicina); cloranfenicoles; tetraciclinas (tal como, tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, metaciclina, doxiciclina, minociclina); aminoglicósidos (tal como, gentamicina, tobramicina, netilmicina, amikacina, kanamicina, streptomicina, neomicina); beta-lactamas (tal como, penicilinas, cefalosporinas, imipenem, aztreonam); antibióticos glucopéptidos (tal como, vancomicina); antibióticos polipéptidos (tal como, bacitracina); macrólidos (eritromicinas), anfotericinas; sulfonamidas (tal como, sulfanilamida, sulfametoxazol, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfisoxazol, sulfacitina, sulfadoxina, mafenida, ácido p-aminobenzoico, trimetoprim-sulfametoxazol); metenamina; nitrofurantoína; fenazopiridina; trimetoprim; rifampicinas; metronidazoles; cefazolinas; lincomicina; espectinomicina; mupirocinas; quinolonas (tales como, ácido nalidíxico, cinoxacina, norfloxacina, ciprofloxacina, perfloxacina, ofloxacina, enoxacina, fleroxacina, levofloxacina); novobiocinas; polimixinas; gramicidinas y antipseudomonales (tales como, carbenicilina, carbenicilina indanilo, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina) o cualquier sal o variante de estos. Dichos antibióticos están comercialmente disponibles, por ej., en Daiichi Sankyo, Inc. (Parsipanny, NJ), Merck (Whitehouse Station, NJ), Pfizer (Nueva York, NY), Glaxo Smith Kline (Research Triangle Park, NC), Johnson & Johnson (New Brunswick, NJ), AstraZeneca (Wilmington, DE), Novartis (East Hanover, NJ) y Sanofi-Aventis (Bridgewater, NJ). El antibiótico utilizado dependerá del tipo de infección bacteriana.

Los biocidas conocidos adicionales incluyen triclosán, dióxido de cloro, biguanida, clorhexidina, xilitol y similares.

Los ejemplos útiles de agentes antimicrobianos incluyen, de modo no taxativo, piritiones, especialmente el complejo de zinc (ZPT); Octopirox®; dimetildimetilol hidantoína (Glydant®); metilcloroisotiazolinona/ metilisotiazolinona (Kathon CG®); sulfito de sodio; bisulfito de sodio; imidazolidinil urea (Germall 1 15®, diazolidinil urea (Germaill II®); alcohol bencílico; 2-bromo-2-nitropropano-1 ,3-diol (Bronopol®); Formalin (formaldehído); yodopropenil butilcarbamato (Polyphase P100®); cloroacetamida; metanamina; metildibromonitrilo glutaronitrilo (1 ,2-dibromo-2,4-dicianobutano o Tektamer®); glutaraldehído; 5-bromo-5-nitro-1 ,3-dioxano (Bronidox®); alcohol fenetílico; o-fenilfenol/sodio o-fenilfenol; hidroximetilglicinato de sodio (Suttocide A®); oxazolidina bicíclica de polimetoxi (Nuosept C®); dimetoxano; timersal; alcohol diclorobencílico; captan; clorfenenesina; diclorofeno; clorbutanol; laurato de glicerilo; éteres de difenilo halogenados; 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxi-difenil éter (Triclosán®. o TCS); 2,2'-dihidroxi-5,5'-d¡bromo-difenil éter; compuestos fenólicos; fenol; 2-metil fenol; 3-metil fenol; 4-metil fenol; 4-etil fenol; 2,4-dimetil fenol; 2,5-dimetil fenol; 3,4-dimetil fenol; 2,6-dimetil fenol; 4-n-propil fenol; 4-n-butil fenol; 4-n-amil fenol; 4-terc-amil fenol; 4-n-hexil fenol; 4-n-heptil fenol; mono- y poli-alquilo y halofenoles aromáticos; p-clorofenol; metil p-clorofenol; etil p-clorofenol; n-propil p-clorofenol; n-butil p-clorofenol; n-amil p-clorofenol; sec-amil p- clorofenol; ciclohexil p-clorofenol; n-heptil p-clorofenol; n-octil p-clorofenol; o-clorofenol; metil o-clorofenol; etil o-clorofenol; n-propil o-clorofenol; n-butil o-clorofenol; n-amil o-clorofenol; terc-amil o-clorofenol; n-hexil o-clorofenol; n-heptil o-clorofenol; o-bencil p-clorofenol; o-bencil-m-metil p-clorofenol; o-bencil-m; m-dimetil p-clorofenol; o-feniletil p-clorofenol; o-feniletil-m-metil p-clorofenol; 3-metil p-clorofenol; 3,5-dimetil p-clorofenol; 6-etil-3-metil p-clorofenol; 6-n-propil-3-met¡l p-clorofenol; 6-iso-propil-3-metil p-clorofenol; 2-etil-3,5-dimetil p-clorofenol; 6-sec-butil-3-metil p-clorofenol; 2-iso-propil-3,5-dimetil p-clorofenol; 6-dietilmetil-3-metil p-clorofenol; 6-iso-propil-2-etil-3-metil p-clorofenol; 2-sec-amil-3,5-dimetil p-clorofenol; 2-dietilmetil-3,5-dimetil p-clorofenol; 6-sec-octil-3-metil p-clorofenol; p-cloro-m-crespl; p-bromofenol; metil p-bromofenol; etil p-bromofenol; n-propil p-bromofenol; n-butil p-bromofenol; n-amil p-bromofenol; sec-amil p-bromofenol; n-hexil p-bromofenol; ciclohexil p-bromofenol; o-bromofenol; terc-amil o-bromofenol; n-hexil o-bromofenol; n-propil-m,m-dimetil o-bromofenol; 2-fenil fenol; 4-cloro-2-metil fenol; 4-cloro-3-metil fenol; 4-cloro-3,5-d¡metil fenol; 2,4-dicloro-3,5-dimetilfenol; 3,4,5,6-terabromo-2-metilfenol; 5-metil-2-pentilfenol; 4-isopropil-3-metilfenol; para-cloro-meta-xilenol (PCMX); clorotimol; fenoxietanol; fenoxüsopropanol; 5-cloro-2-h¡droxid¡fenilmetano; resorcinol y sus derivados; resorcinol; resorcinol de metilo; resorcinol de etilo; resorcinol de n-propilo; resorcinol de n-butilo; resorcinol de n-amilo; resorcinol de n-hexilo; Resorcinol de n-heptilo; resorcinol de n-octilo; resorcinol de n-nonilo; resorcinol de fenilo; resorcinol de bencilo; resorcinol de feniletilo; resorcinol de fenilpropilo; resorcinol de p-clorobencilo; 5-cloro 2,4-dihidroxidifenil metano; 4'-cloro 2,4-dihidroxidifenil metano; 5-bromo 2,4-dihidroxidifenil metano; 4'-bromo 2,4-dihidroxidifenil metano; compuestos bisfenólicos; 2,2'-metileno bis-(4-clorofenol), 2,2'-metileno bis-(3,4,6-triclorofenol); 2,2'-metileno bis (4-cloro-6-bromofenol); bis(2-hidroxi-3,5-diclorofenil)sulfuro; bis(2-hidroxi-5-clorobencil)sulfuro; ésteres benzoicos (parabenos); metilparabeno; propilparabeno; butilparabeno; etilparabeno; isopropilparabeno; isobutilparabeno; bencilparabeno; metilparabeno de sodio; propilparabeno de sodio; carbanilidas halogenados; 3,4,4'-triclorocarbanilidas (Triclocarban® o TCC); 3-trifluorometil-4,4'-diclorocarbanilida; 3,3',4-triclorocarbanilida; clorohexidina y su digluconato; diacetato y diclorhidrato; ácido undecenoico; tiabendazol, hexetidina; poli(hexametilenobiguanida) clorhidrato (Cosmocil®); compuestos de plata, tales como, sales orgánicas de plata o sales inorgánicas de plata, cloruro de plata, incluyendo formulaciones de estos, tales como, JM Acticare® y partículas micronizadas de plata.

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. La temperatura ambiente indica una temperatura del intervalo de 20-25°C.

EJEMPLOS Materiales y métodos Cepas y medios. Bacillus subtilis NCIB3610 y sus derivados fueron cultivados en medio de Luria-Bertani (LB) a 37°C o medio de MSgg (Branda et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98: 1 1621 (2001)) a 23°C. Los medios sólidos contienen 1.5% de Bacto agar. Cuando se consideró apropiado, los antibióticos se agregaron en las siguientes concentraciones para el crecimiento de B. subtilis: 10 pg por mi de tetraciclina, y 5 pg por mi de eritromicina, 500 pg por mi de espectinomicina.

Cepas utilizadas en este caso: Todas las cepas de B. subtilis son derivados de NCIB 3610, una cepa silvestre que forma biopelículas resistentes (Branda et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:1 1621 (2001 )); Cepa FC5 (PepsA-lacZ cat) (Chu et ál., Mol. Microbiol. 59:1216 (2006)); Cepa FC122 (PyqXM-lacZ spec) (Chu et ál., Mol. Microbiol. 59: 1216 (2006)); Cepa IKG55 (AracX::spec AylmE::tetR); Cepa DR-30 (tasA-mCherry cat); Cepa IKG40 (yqxM2); Cepa IKG44 (yqxM6); Cepa IKG50 (yqxM2 tasA-mCherry); Cepa IKG51 {yqxM6 tasA-mCherry); Staphylococcus aureus SC01 de la colección de laboratorio de Kolter.

Construcción de las cepas. Las cepas se construyeron usando métodos estándar (J. Sambrook, D. W. Russell, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001 ). La mutagénesis por PCR de flanqueo largo se usó para crear AracX::spec y AyimE::tetR (Wach, Yeast 12:259 (1996)). Se introdujo ADN en los derivados de la cepa PY79 mediante transformación mediada por ADN de células competentes (Gryczan et ál., J. Bacteriol. 134:318 (1978)). La transducción mediada por fagos SPP1 se usó para introducir mutaciones relacionadas con la resistencia de los antibióticos de derivados de PY79 en NCIB3610 (Yasbin et ál., J. Virol. 14:1343 (1974)).

Reactivos. Los aminoácidos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO). 14C-D-tirosina y 14C-L-prolina se obtuvieron de American Radiolabeled Chemicals, Inc (St. Louis, MO).

Formación de colonias y capas. Para la formación de colonias sobre el medio sólido, primero las células se cultivaron en una fase de crecimiento exponencial en caldo de LB y se salpicaron 3 µ? de cultivo sobre un medio de MSgg sólido que contiene 1.5% de Bacto agar. Las placas se incubaron a 23°C. Para la formación de capas en medio líquido, las células se cultivaron en fase exponencial y se mezclaron 6 µ? de cultivo con 6 mi de medio en una placa de 12 pocilios (VWR). Las placas se incubaron a 23°C. Las imágenes de las colonias y las capas fueron tomadas usando una cámara SPOT (Diagnostic Instruments, USA).

Preparación del medio acondicionado. Las células se cultivaron en medio de LB en fase exponencial. Se agregó 0.1 mi de cultivo a 100 mi de medio de MSgg y se cultivó sin agitar en un vaso de precipitación de 500 mi a 23°C. Luego, se recogieron la capa y el medio acondicionado mediante centrifugación a 8,000 rpm durante 15 min. El medio acondicionado (fluido sobrenadante) se retiró y filtró a través de un filtro de 0.22 µ??. Los filtrados se almacenaron a 4°C. Para la purificación adicional, la actividad de inhibición de biopelículas se dividió en un cartucho Sep Pak C-18 usando la elución gradual de 0% a 100% de metanol con pasos de 5%.

Identificación y cuantificación de D-aminoácidos en el medio acondicionado. (A) Cuantificación de aminoácidos. Las soluciones estándar de Tir, Leu, Met y Trp se prepararon en varias concentraciones (0.001 - 0.2 mM). Estas soluciones se analizaron mediante LC/MS con un sistema de solvente gradiente gradual de 0% a 60%, luego a 100% de CH3CN con 0.1% de ácido fórmico (0-12-20 min) (Thermo Scientific Hypercarb 4.6 mm ? 100 mm, 5 pm) para obtener las curvas de calibración de cada concentración de aminoácidos mediante integración del conteo de iones. Las muestras de medio acondicionado se analizaron mediante LC/MS de la misma manera para medir las concentraciones totales de todos los cuatro aminoácidos quirales. (B) Identificación de aminoácidos. La muestra se secó en un SpeedVac y disolvió en 100 µ?_ 1 N de NaHC03. Se preparó una solución de 10 mg/mL de L-FDAA (A/-(2,4-dinitro-5-fluoro-fenil)-L-alaninoamida) en acetona y se agregaron 50 pide la solución de acetona a la muestra en 1 N NaHC03. La mezcla de reacción se incubó a 80°C durante 5 min y se agregaron 50 pL de 2N HCI para inactivar la reacción. Los derivados se analizaron mediante LC/MS usando un sistema de solvente gradiente de 10% a 100% CH3CN con 0.1 % de ácido fórmico durante 30 min (Agilent 1200 Series HPLC/ 6130 Series MS, Fenomenex Luna C18, 4.6 mm ? 100 mm, 5 pm). Se compararon los tiempos de retención de los L-FDAA-aminoácidos con los L-FDAA-aminoácidos auténticos estándar.

Tinción con cristal violeta. La tinción con cristal violeta se realizó tal como se describe anteriormente (OToole et ál., Mol. Microbiol. 30:295 (1998)), salvo que las células se cultivaron en placas de 6 pocilios. Los pocilios se tiñeron con 500 pl de tinte de cristal violeta al 1.0%, se lavaron dos veces con 2 mi de agua destilada dos veces y se secaron por completo.

Microscopía fluorescente. Para el análisis de microscopía fluorescente, se cosechó 1 mi de cultivo. Las células se lavaron con amortiguador de PBS y se suspendieron en 50 pl de amortiguador de PBS. Las láminas de recubrimiento se trataron previamente con poli L-lisina (Sigma). Las muestras se examinaron usando un microscopio Olympus workstation BX61. Las imágenes fueron tomadas usando el programa de software automático SimplePCI y se analizaron con el programa MetaMorph (Universal Imaging Corporation).

Microscopía electrónica de transmisión e inmunomarcado. Las muestras se diluyeron con agua destilada y absorbieron sobre una rejilla cubierta con carbono o formvar/carbono. La superficie de la rejilla se hizo hidrofílica antes de su uso con una descarga luminiscente en un evaporador a vacío. Una vez que se absorbió la muestra sobre la superficie de la película, el exceso de muestra se secó sobre un papel de filtro (Whatman #1 ) y se hizo flotar la rejilla en 5 µ? de la solución de tinción (1 -2% de acetato de uranilo acuoso) durante unos pocos minutos y luego se secó. Las muestras se secaron y examinaron en un microscopio Tecnai™ G2 Spirit BioTWIN a un voltaje acelerado de 80 KV. Las imágenes fueron tomadas con una cámara AMT 2k CCD.

Para la inmunolocalización de TasA, se hicieron flotar muestras diluidas sobre rejillas de níquel en amortiguador de bloqueo que consiste en 1 % de leche seca no grasa en PBS con 0.1 % de Tween 20 durante 30 min, se incubaron durante 2 h con anticuerpo primario anti-TasA diluido 1 :150 en amortiguador de bloqueo, se enjuagaron en PBST, luego se expusieron a anticuerpo secundario cabra anti conejo con oro de 20 nm (Ted Pella, Inc., Redding, CA) durante 1 h y se enjuagaron. Todas las rejillas se tiñieron con acetato de uranilo y citrato de plomo, luego se visualizaron tal como se describe anteriormente.

Ensayos de la actividad de ß-galactosidasa. Las células se cultivaron en medio de MSgg a 37°C en un baño de agua con agitación. En cada momento se recogió 1 mi de cultivo. La actividad de ß-galactosidasa se determinó tal como se describió anteriormente (Chai et ál., Mol. Microbiol. 67:254 (2008)).

Incorporación de aminoácidos en la pared celular. Las células en 50 mi de cultivo en la fase exponencial media del crecimiento se cosecharon mediante centrifugación y se lavaron con 0.05 M de amortiguador de fosfato (pH 7) y se volvieron a suspender en 5 mi del mismo amortiguador. Las células se trataron con 10 pCi/ml de 14C-D-tirosina o 1 C-L-prolina y se incubaron adicionalmente a 37°C durante 2 horas. La radioactividad de las células enteras y la fracción de la pared celular se controlaron y las muestras se retiraron en intervalos. Para la medición de la incorporación en células enteras, se recogieron muestras de 0.1 mi. Para la medición de la incorporación en la pared celular, se recogieron muestras de 0.5 mi. Las células se cosecharon mediante centrifugación y se volvieron a suspender en amortiguador de SM [0.5 M de sucrosa, 20 mM de MgCI2 y 10 mM de fosfato de potasio a pH (6.8)] que contiene 0.1 mg/ml de lisozima. Luego, las células se incubaron a 37 °C durante 10 min. Luego, los protoplastos resultantes se retiraron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 min, dejando el material de la pared celular en el fluido sobrenadante. Se confirmó que la fracción de la pared celular no contenía proteína mediante análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos antisigma A. Por último, se agregaron 10 mi de ácido trifluoroacético al 5% a las muestras de células enteras y el material de la pared celular se mantuvo en hielo al menos durante 30 min. El material insoluble de TCA se recogió en filtros Millipore (tamaño de poro de 0.22 µ?t?, Millipore) y se lavó con TCA al 5%. Los filtros se secaron al aire y colocaron en recipientes de centelleo y los conteos insolubles en TCA por minuto se determinaron usando un conteo de centelleo.

EJEMPLO 1 Análisis de los D-aminoácidos en la formación de biopelículas por parte de B. Subtilis B. subtilis forma una capa gruesa en la interfaz aire-líquido de cultivos en reposo luego de tres días de incubación en medio que produce biopelícula (Figura 1A). Luego de la incubación durante tres a cinco días adicionales, sin embargo, la capa pierde su integridad estructural (Figura 1 B). Para investigar si las biopelículas maduras producen un factor que provoca la desintegración de la biopelícula, se analizó el efecto de extractos concentrados y parcialmente purificados de medio acondicionado en la formación de una capa cuando se agregaron al medio fresco. Con este propósito, el medio acondicionado de un cultivo de ocho días se aplicó a una columna Sep Pak C18. Luego, el eluato concentrado de la columna se agregó a un cultivo recién inoculado. Una cantidad del eluato concentrado correspondiente al 25% del material de un volumen equivalente de medio acondicionado fue suficiente para prevenir la formación de una capa (Figura 1C). Como control, se observó que la adición del eluato concentrado preparado usando medio acondicionado de un cultivo de tres días no surtió efecto o muy poco efecto sobre la formación de una capa (Figura 1 D). La purificación adicional del factor se alcanzó eluyendo el cartucho de forma gradual con concentraciones cada vez mayores de metanol. La elución con 40% de metanol dio como resultado una fracción que era altamente activa en la inhibición de la formación de una capa (Figura 1 E). Sin embargo, este material no surtió efecto o muy poco en el crecimiento celular. La actividad inhibidora de biopelículas fue resistente al calentamiento a 100 °C durante 2 horas y al tratamiento con proteinasa K (Figura 1 F).

Se analizaron D-tirosina, D-leucina, D-triptófano y D-metionina para inhibir la formación de biopelículas por parte de B. subtilis, tanto en medio líquido como sólido (Figuras 2A, 5, 6). La figura 2A muestra los efectos de agregar D-tirosina (3 µ?), D-leucina (8.5 mM), L-tirosina (7 mM) o L-leucina (8.5 mM) a cultivos recién inoculados en medio que produce biopelícula luego de la incubación durante 3 días sobre la formación de una capa. Tanto la D-tirosina como la D-leucina mostraron una inhibición considerable del crecimiento de biopelículas, en comparación con los L-aminoácidos correspondientes. De manera similar, la figura 5 muestra pocilios que contienen medio de MSgg complementado con D-triptófano (0.5 mM), D-metionina (2 mM), L-triptófano (5 mM) o L-metionina (5 mM) que fueron inoculados con la cepa NCIB3610 e incubados durante 3 días. Solamente los D-aminoácidos fueron activos en la inhibición de la formación de biopelículas.

La figura 6 muestra placas que contienen medio de MSgg sólido complementado con D-tirosina (3 µ?) o D-leucina (8.5 mM) que fueron inoculados con la cepa NCIB3610 e incubados durante 4 días. Tanto la D- tirosina como la D-leucina inhibieron la formación de biopelículas.

D-metionina, D-triptófano, D-tirosina y D-leucina mostraron una inhibición considerable del crecimiento de biopelículas, en comparación con los L-aminoácidos correspondientes. Por el contrario, los L-isómeros y D-isómeros correspondientes de otros aminoácidos, tales como D-alanina y D-fenilalanina, no fueron eficaces en el ensayo de inhibición de biopelículas de B. subtilis.

Luego, se determinó la concentración mínima (MIC significa mínima concentración inhibitoria) necesaria para prevenir la formación de biopelículas. Tal como se muestra en la figura 2B, la actividad de los D-aminoácidos individuales variaba, siendo la D-tirosina la más eficaz. D-metionina, D-triptófano y D-leucina presentaron una MIC de alrededor de 1 mM, mientras que D-tirosína presentó una MIC de alrededor de 100 nM. Sorprendentemente, una mezcla de los cuatro D-aminoácidos (en cantidades equimolares) fue particularmente potente, con una MBIC de <10 nM. Por lo tanto, los D-aminoácidos actúan de forma sinergística. Los D-aminoácidos no solamente previnieron la formación de biopelículas sino que también desintegraron la biopelículas existentes. La figura 2C muestra cultivos de 3 días a los que se les agregó D-tirosina (3 µ?) o una mezcla de D-tirosina, D-triptófano, D-metionina y D-leucina (2.5 nM cada uno), o no se les agregaron aminoácidos (sin tratar), a lo que le siguió una incubación adicional durante 8 horas. La adición de D-tirosina o una mezcla de los cuatro D-aminoácidos provocó la desintegración notoria de capas en un período de 8 horas.

Los D-am¡noác¡dos son generados por aminoácidos racemasas, enzimas que convierten el estereocentro a-carbono de estos aminoácidos de formas L a D (Yoshimura et l., J. Biosci. Bioeng. 96:103 (2003)). Se obtuvo prueba genética que concuerda con la ¡dea de que el factor inhibitorio de biopelículas son los D-aminoácidos, usando mutantes de ylmE y racX, genes cuyos productos previstos exhiben una similitud de secuencias con las racemasas conocidas. Los mutantes de cepas de ylmE o racX por sí solos mostraron un leve retraso en la desintegración de la capa (no se muestran los datos). La figura 7 muestra NCIB3610 (tipo salvaje) y una cepa muíante doblemente eliminada para ylmE y racX (IKG155) que fueron cultivados en placas de 12 pocilios e incubados durante 5 días. La desintegración de las capas formadas por células doblemente mutantes para las racemasas putativas se retrasó considerablemente, lo que sugiere que las cepas en las que se reduce especialmente la actividad de la racemasa también exhiben una menor inhibición de antibiopelículas. Además, el medio acondicionado del doble muíante no fue eficaz para inhibir la formación de biopelículas, a diferencia del medio acondicionado de tipo salvaje. La figura 2D muestra el efecto del eluato concentrado de la columna Sep Pak C-18 del medio acondicionado de un cultivo de 8 días de tipo salvaje o de una cepa (IKG55) doblemente mulante de ylmE y racX, en la que el doble mutanle mueslra una acumulación considerable de biopelículas.

Luego, se determinó si los D-aminoácidos se produjeron durante la maduración de la biopelícula y si eran lo suficientemeníe abundaníes como para desintegrar las biopelículas maduras. Por consiguiente, se llevó a cabo la LC/MS, seguida de la identificación de los D-aminoácidos, usando derivatización con Na-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-alaninamida (L-FDAA) en medio acondicionado recogido en períodos tempranos y tardíos luego de la formación de la capa. Los resultados mostraron que la D-tirosina (6 µ?), D-leucina (23 µ?) y D-metionina (5 µ?) estaban presentes en concentraciones necesarias para inhibir la formación de biopelícualas, o superiores a estas, al día 6, pero en concentraciones de <10 nM al día 3, por ej., a un nivel que no es suficiente para inhibir la formación de biopelículas.

De manera similar al medio acondicionado, los D-aminoácidos no inhibieron el crecimiento celular ni inhibieron la expresión de los operones de la matriz eps y yqxM (Figuras 8 y 9A-9B). La Figura 8 muestra el efecto de los D-aminoácidos en el crecimiento celular. Las células se cultivaron en medio de MSgg que contiene D-tirosina (3 µ?), D-leucina (8.5 mM) o la mezcla de cuatro D-aminoácidos (2.5 nM cada uno) agitando. El crecimiento celular en los cultivos tratados con D-aminoácidos fue básicamente el mismo que en la muestra no tratada. La figura 9A muestra la expresión de PyqxM-lacZ mediante la cepa FC122 (que transporta P^M-lacZ) y la figura 9B muestra la expresión de PepsA-lacZ mediante la cepa FC5 (que transporta PepSA-facZ) que se cultivaron en medio de MSgg que contiene D-tirosina (3 µ?), D-leucina (8.5 mM) o la mezcla de los cuatro D-aminoácidos (2.5 nM cada uno) agitando. Nuevamente, la expresión de yqxM y eps para las muestras tratadas con D-aminoácidos fue básicamente la misma que la muestra no tratada.

Se registró anteriormente que los D-aminoácidos se incorporan en el péptido cruzado del componente peptidoglicano de la pared celular. Para confirmar, las células se cultivaron en medio que produce biopelículas y se incubaron con 14C-D-tirosina o con 14C-L-prolina (10 pCi/ml) durante 2 h a 37°C. La figura 3A muestra la incorporación de D-tirosina radiactiva én la pared celular. Usando 1 C-D-tirosina, se mostró que la D-tirosina (pero no 14C -L-prolina) se incorporó en la pared celular. Los resultados se presentan como un porcentaje de la incorporación total en las células (360,000 cpm/ml para L-prolina y 46,000 cpm/ml para D-tirosina).

Para analizar si los D-aminoácidos incorporados en la pared celular pueden provocar el desprendimiento de las fibras TasA a la célula, se examinó la localización de una fusión funcional de TasA con el indicador fluorescente mCherry. La figura 3B muestra la fluorescencia total de las células que contienen una fusión traduccional funcional de tasA-mCherry. Las células se cultivaron en fase estacionaria agitando en medio que produce biopelículas en presencia o ausencia de D-tirosina (6 µ?). Tal como se muestra en la figura 3B, el tratamiento con D-tirosina no surtió efecto o muy poco en la acumulación total de TasA-mCherry. En cambio, cuando las células se lavaron por centrifugación, se volvieron a suspender y luego se examinaron por microscopía fluorescente, se observó que las células no tratadas (que a menudo se encontraban en grupos) estaban bastante cubiertas de TasA-mCherry. Por el contrario, las células tratadas con D-tirosina (que en su mayor parte no se encontraban en grupos) mostraron solamente niveles bajos de fluorescencia. Se obtuvieron resultados similares con D-leucina y con la mezcla equimolar de los cuatro D-aminoácidos. También se analizó la localización de la proteína TasA no modificada mediante microscopía de transmisión electrónica usando anticuerpos antiTasA etiquetados con oro. La figura 3D muestra la asociación celular de las fibras TasA mediante microscopía electrónica. Se incubaron cultivos de 24 horas sin (imágenes 1 y 2) o con (imágenes 3-6) D-tirosina (0.1 mM) durante 12 horas adicionales. Se tiñieron fibras TasA mediante etiquetado inmuno-oro usando anticuerpos antiTasA, y se visualizaron mediante microscopía de transmisión electrónica, tal como se describe en los Ejemplos. Las células eran mutantes con respecto al operón eps (Aeps) ya que la ausencia de exopolisacárido mejora significativamente la imagenología de fibras TasA. Las flechas llenas indican grupos de fibras; las flechas abiertas indican fibras individuales. La barra de escala es de 500 nm. La barra de escala en las ampliaciones de las imágenes 2, 4 y 6 es 100 nm. Las imágenes 1 y 2 muestran grupos de fibras ligados a las células, las imágenes 3, 4 y 6 muestran fibras individuales y grupos separados de las células y las imágenes 3-5 muestran células con poco o nada de material de fibras. Se observó que las fibras TasA estaban sujetados a las células de las capas no tratadas (figura 3D, imágenes 1 y 2). Por el contrario, las células tratadas durante 12 horas con D-tirosina consistían en una mezcla de células que en su mayor parte no estaban cubiertas con fibras TasA y fibras sin TasA o conjuntos de fibras que no estaban sujetadas a las células (figura 3D, imágenes 3-6). Sin intención de limitarse a la teoría, uno de los mecanismos mediante los cuales se tratan las biopelículas con D-tirosina puede ser provocar el desprendimiento de las fibras por parte de las células.

Se obtuvieron pruebas genéticas de que los D-aminoácidos actúan interrumpiendo la sujeción de las fibras TasA de las células mediante el aislamiento de los mutantes resistentes a la D-tirosina. La figura 4A muestra células cultivadas durante 3 días en medio que produce biopelícula sólido (imágenes superiores) o líquido (imágenes inferiores) que contenía o no contenía D-tirosina. Las papilas arrugadas aparecieron espontáneamente en las colonias planas formadas durante el crecimiento en medio sólido que contiene D-tirosina (figura 4A) o D-leucina (no se muestran los datos). Cabe destacar que dichas papilas no aparecieron en las placas que contienen los cuatro D-aminoácidos activos. Cuando se purifican, estos mutantes espontáneos producen colonias y capas arrugadas en presencia de D-tirosina o D-leucina. Dichos mutantes se aislaron y la mayoría de ellos contenían una mutación en o cerca del operón yqxM. Se examinaron detalladamente dos mutaciones y se descubrió que eran mutaciones del marco de lectura próximas al extremo 3' del gen yqxM de longitud de 759 pares de bases. yqxM2 era una inserción de G:C en el par de bases 728 en el marco de lectura abierto de yqxM y yqxM6 era una supresión de A:T en el par de bases 568 (Figura 4B). La figura 4B muestra una secuencia de aminoácidos abreviada para YqxM. Los residuos especificados por los codones en donde las mutaciones del marco de lectura de yqxM2 e yqxM6 dieron como resultado los cambios indicados en las secuencias se encuentran subrayados.

La figura 3C muestra la asociación celular de TasA-mCherry mediante microscopía fluorescente. Las células de tipo salvaje y las células mutantes yqxM6 (IKG51 ) que contienen la fusión de tasA-mCherry se cultivaron en fase estacionaria (DO=1.5) agitando en medio que produce biopelícula en presencia o ausencia (sin tratar) de D-tirosina (6 µ?) tal como se indicó, lavada en PBS, y se visualizaron mediante microscopía fluorescente. La microscopía fluorescente mostró que la presencia de yqxM2 y yqxM6 restituyó el agrupamiento y la cobertura de las células con TasA-mCherry de las células tratadas con D-tirosina (figura 3C). Obras anteriores muestran que YqxM es necesaria para la asociación de TasA con las células (Branda et él., Mol. Microbiol. 59:1229 (2006)). Sin intención de limitarse a la teoría, este descubrimiento de que el efecto inhibitorio de biopelículas de los D-aminoácidos puede ser superado por los mutantes de YqxM, refuerza la opinión de que el efecto de la incorporación de D-aminoácidos en la pared celular es afectar la sujeción de las fibras TasA a la célula. Un dominio cerca del extremo C de YqxM puede provocar la liberación de TasA en respuesta a la presencia de D-tirosina o D-leucina en la pared celular.

EJEMPLO 2 Análisis de D-aminoácidos en la formación de biopelículas por parte de S. aureus y P. aeruginosa Se examinó el efecto de los D-aminoácidos en la formación de biopelículas por parte de otras bacterias. La bacteria patogénica Staphylococcus aureus forma biopelículas sobre las superficies plásticas (Otto, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322:207 (2008)), que se pueden detectar retirando las células no unidas y tiñendo las células unidas con cristal violeta. La figura 2E muestra S. aureus (cepa SC01) que fue cultivada en placas de poliestireno de 12 pocilios durante 24 horas a 37°C en medio de TSB que contiene glucosa (0.5%) y NaCI (3%). De manera adicional, se agregó D-tírosina (50 µ?) o la mezcla de D-aminoácidos (15 nM cada uno) o no se agregaron aminoácidos (sin tratar) a los pocilios. Se visualizaron las células unidas al poliestireno retirando las células no unidas y luego tiñiéndolas con cristal violeta. La figura 2E muestra que las concentraciones de 50 µ? de D-tirosina y las concentraciones de 50 nM de D-aminoácidos mezclados (D-tirosina, D-leucina, D-triptófano y D-metíonina; 50 nM cada uno) eran altamente eficaces para prevenir la formación de biopelículas mediante la bacteria patogénica.

Además, la figura 10 demuestra que 10 µ? de D-tirosina era eficaz para prevenir la formación de biopelículas mediante Pseudomonas aeruginosa, mientras que 1 µ? de una mezcla equimolar de D-tirosina, D- leucina, D-triptófano y D-metionina era eficaz. La figura 10 muestra la inhibición de la formación de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa mediante los D-aminoácidos. La cepa P014 de P. aeruginosa se cultivó en placas de poliestireno de 12 pocilios durante 48 horas a 30°C en medio de M63 que contiene glicerol (0.2%) y ácidos casamino (20 pg/ml). De manera adicional, se agregó D-tirosina o la mezcla equimolar de D-aminoácidos o no se agregaron aminoácidos (sin tratar). Se visualizaron las células unidas al poliestireno retirando las células no unidas y luego tiñiéndolas con cristal violeta. Los pocilios se tiñeron con 500 µ? de tinte de cristal violeta al 1.0%, se lavaron dos veces con 2 mi de agua destilada dos veces y se secaron por completo.

EJEMPLO 3 Mezclas de D-aminoácidos activas inhibiendo las biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa Dos mezclas distintas son muy activas para prevenir la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus. Una es una mezcla equimolar de D-tirosina, D-metionina, D-leucina y D-triptófano. La mezcla de D-aminoácidos de D-trp, D-met, D-tir y D-leu era activa en una concentración considerablemente menor que los aminoácidos individuales en todas las cepas bacterianas analizadas B. subtilis, Staphylococcus aureus (figura 1 1 ) y Pseudomonas aeruginosa (figura 12). Para los experimentos registrados en la Tabla 1 , el organismo/cepa utilizado fue S.a. Harvard SC01 , el medio de cultivo fue TSB y la inoculación de las células se realizó a 2x109 cfu. Para los experimentos registrados en la Tabla 2, el organismo/cepa utilizado fue S.a. Harvard PA14, el medio de cultivo fue M63 y la inoculación de las células se realizó a 1.5x109 cfu. La biopelícula se visualizó usando el método con cristal violeta. Los datos se muestran a continuación en las Tablas 1 y 2: TABLA 1 (Datos de la figura 11) TABLA 2 (datos de la figura 12) La mezcla equimolar de D-tirosina, D-fenilalanina, D-prolina es aun más eficaz que la mezcla que antecede. Además, la mezcla es más activa como una mezcla que cada uno de los aminoácidos de forma individual (Figuras 13 y 14). Para los experimentos registrados en las Tablas 3 y 4, el organismo/cepa utilizado fue S.a. Harvard SC01 , el medio de cultivo fue TSB y la inoculación de las células se realizó a 2x109 cfu. La biopelícula se visualizó usando el método con cristal violeta. Los datos se muestran en las Tablas 3 y 4: TABLA 3 (Datos de la figura 13) TABLA 4 (Datos de la figura 14) EJEMPLO 4 Método de cuantificación alternativo para la formación de biopelículas en Staphylococcus aureus Se retiraron por completo las células plantónicas mediante una pipeta de Gilson y luego se golpearon suavemente sobre una toalla de papel. Luego, se tomó cuidadosamente una imagen fotográfica de las placas de biopelícula contra un fondo negro (Figuras 15 y 16). Para los experimentos registrados en las Tablas 5 y 6, el organismo/cepa utilizado fue S.a. Harvard SC01 , el medio de cultivo fue TSB y la inoculación de las células se realizó a 2x109 cfu. La biopelícula se visualizó usando el método visual contra un fondo negro. Los datos se muestran en las Tablas 5 y 6: TABLA 5 (Datos de la figura 15) TABLA 6 (Datos de la figura 16) Se retiraron las células de biopelícula de las placas que anteceden en las Tablas 5 y 6 volviendo a suspenderlas en PBS, y se determinó su DO600 usando un espectrofotómetro (Figura 17). Para los experimentos registrados en la Tabla 7, el organismo/cepa utilizado fue S.a. Harvard SC01 , el medio de cultivo fue TSB y la inoculación de las células se realizó a 2x109 cfu. La biopelícula se visualizó midiendo el DO600 de las bacterias absorbidas. Los datos se muestran en la Tabla 7: TABLA 7 (Datos de la figura 17) EJEMPLO 5 Efecto de los D-aminoácidos en la formación de las biopelículas de Staphylococcus aureus sobre superficies epoxi Para probar la posibilidad de desarrollar métodos de liberación controlada de D-aminoácidos de distintas superficies, las superficies epoxi se incubaron durante 24 horas en mezclas de D-aminoácidos. Se secaron por completo e incubaron en un medio fresco de TSB inoculado con Staphylococcus aureus. Para los experimentos registrados en las Tablas 8 y 9, el organismo/cepa utilizado fue S.a. Harvard SC01 , el medio de cultivo fue TSB y la inoculación de las células se realizó a 2x109 cfu. La biopelícula se visualizó usando el método visual contra un fondo negro. Tal como se muestra en las Figuras 18 y 19, las mezclas de D-aminoácidos (como se describe anteriormente) disminuyen enormemente la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus en los sustratos empapados. Los datos se muestran en las Tablas 8 y 9: TABLA 8 (Datos de la figura 18) TABLA 9 (Datos de ta Figura 19) De manera adicional, se incubaron superficies de Norland Optical Adhesive 61 con D-tirosina, D-prolina, D-fenilalanina durante 24 hrs. Se secaron por completo e incubaron en un medio fresco de TSB con Staphylococcus aureus. La mezcla de D-aminoácidos (pero no la mezcla de L- aminoácidos) disminuyó enormemente la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus.

Para este ejemplo, los sustratos poliméricos se moldearon en polidimetilsiloxano (SYLGARD 184, Dow Corning) de UVO-1 14 (Tecnología Epoxi) y polímeros Norland Optical Adhesive 61 (Productos Norland) curables con UV.

EJEMPLO 6 Formas adicionales de observar el efecto de los D-aminoácidos en la formación de biopelícula en Pseudomonas aeruginosa De manera similar a la Bacillus subtilis, la Pseudomonas aeruginosa forma una arquitectura compleja en el medio definido. Estas estructuras complejas requieren la formación y armado apropiados de la matriz extracelular. La adición de D-tirosina (500 µ?) o D-triptófano (500 µ?) inhibió la formación de biopelículas en el medio definido en Pseudomonas aeruginosa (Figura 20) mientras que la adición de L-tirosina (500 µ?) o L-triptófano no lo hizo. Se obtuvieron resultados similares con Bacillus subtilis. Para estos experimentos, el organismo/cepa fue P.a. Harvard PA14, el medio de cultivo fue M63 y la inoculación de las células se realizó a 1.5x109 cfu.

Un método alternativo para observar la formación de biopelículas en una placa de 6 pocilios con o sin D-aminoácidos y usando tinción con Syto-9 es el siguiente: las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa se lavaron dos veces con PBS y luego se fijaron al menos durante una hora en 5% de glutaraldehído en PBS. Las biopelículas fijadas luego se enjuagaron una vez más con PBS y se empaparon en 0.1 % v/v de Tritón X-100 en PBS (PBST) durante 15 minutos. La solución se intercambió con 0.1 nM de SYTOX verde (Invitrogen) en PBST frío y se agitó suavemente en la oscuridad al menos durante 15 minutos. Las imágenes fluorescentes de las biopelículas se captaron con un microscopio Leica DMRX usando una lámpara Xe y un cubo de filtro Leica K3. Tal como se muestra en la Figura 21 , se produjo una gran disminución de la cantidad de células unidas al fondo de la placa de biopelícula en presencia de D-tirosina. La cantidad de células simples unidas se cuantificó usando imágenes J. La disminución de la cantidad de células unidas a las superficies epoxi empapadas con D-aminoácidos en comparación con el control de L-aminoácidos fue considerablemente mayor.

TABLA 10 (Datos de la figura 21) EJEMPLO 7 Evaluación del efecto de los D-aminoácidos sobre los patógenos gram negativos Para evaluar la posibilidad de una actividad antibiopelícula de espectro se probó el cuarteto equimolar eficaz de D-tirosina, D- fenilalanina y D-prolina con respecto al patógeno gram negativo Proteus mirabilis. Tal como se muestra en la Figura 22, la mezcla de D-aminoácidos fue activa con respecto a Proteus mirabilis. La biopelícula de la Tabla 1 1 se visualizó usando el método con cristal violeta. Los datos se muestran en la Tabla 1 1 : TABLA 11 (Datos de la figura 22) EJEMPLO 8 Evaluación del efecto de los D-aminoácidos sobre un patógeno gram positivo Para evaluar la posibilidad de una actividad antibiopelícula de amplio espectro se probó el cuarteto equimolar eficaz de D-tirosina, D-fenilalanina y D-prolina con respecto al patógeno gram positivo Streptococcus mutans. Tal como se muestra en la Figura 23, la mezcla de D-aminoácidos fue activa con respecto a Streptococcus mutans. La biopelícula de la Tabla 12 se visualizó usando el método con cristal violeta. Los datos se muestran en la Tabla 12: TABLA 12 (Datos de la figura 23) EJEMPLO 9 Recubrimiento que contiene D-tirosina Se incorpora D-tirosina, 0.5% en peso basado en el peso de los sólidos de resina, en un recubrimiento de poliéster uretano de dos componentes basado en un poliol poliéster comercialmente disponible y en isocianurato comercialmente disponible. El sistema de recubrimiento es catalizado con 0.015% de dilaurato de dibutiiestaño basado en los sólidos de resina totales.

La formulación de recubrimiento se aplica mediante reducción sobre láminas de vidrio transparentes de aproximadamente 4" x 6" con un espesor de película de alrededor de 2 mils (0.002").

Estas películas son curadas en un horno a 120°F (49°C).

EJEMPL0 10 Polímero que contiene una mezcla de D-aminoácidos Se preparan láminas de goma de silicona líquida como se describe en la patente estadounidense No. 5,973,030. También se incluyen en las formulaciones 0.01 a 1 porcentaje en peso de una mezcla de D-aminoácidos, en una proporción de 1 :1 : 1 :1 de D-tirosina:D-leucina:D-metionina:D-triptófano.

EJEMPLO 11 Recubrimiento industrial a base de agua que contiene una mezcla de D- aminoácidos Una formulación de recubrimiento industrial acrílica transparente a base de agua que contiene 1 porcentaje en peso de una mezcla de D-aminoácidos, en una proporción de 1 :1 : 1 :1 de D-tirosina:D-leucina:D-metionina:D-triptófano se cubre sobre láminas de vidrio con un espesor de 2 mils.

EJEMPLO 12 Recubrimiento industrial a base de solvente que contiene una mezcla de D-aminoácidos Se prepara un recubrimiento de poliuretano a base de solvente que contiene 1 porcentaje en peso de una mezcla de D-aminoácidos, en una proporción de 1 : 1 :1 :1 de D-tirosina:D-leucina:D-metionina:D-triptófano. El recubrimiento se aplica a láminas de vidrio con un espesor de 2 mils.

EJEMPLO 13 Recubrimiento industrial a base de agua curable con UV que contiene una mezcla de D-aminoácidos Un recubrimiento industrial a base de agua curable con UV se formula mezclando con un agitador a alta velocidad los ingredientes (ver tabla a continuación).

A la formulación preparada, se agrega una mezcla de D- aminoácidos en una proporción de 1 :1 : 1 : 1 de D-tirosina:D-leucina:D- metionina:D-triptófano, y se agita a alta velocidad de cizallamiento (2000 rpm) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A los efectos de comparación, las formulaciones de control que no contienen D-aminoácidos se preparan de la misma manera.

El recubrimiento se aplica con un recubridor de corte de 50 pm a paneles de aluminio blancos recubiertos, se seca durante 10 minutos a 60°C y se cura con dos lámparas de vapor de mercurio a media presión (2 x 80 W/cm) a 5 m/min.

EJEMPLO 14 Recubrimiento industrial a base de solvente que contiene una mezcla de D-aminoácidos Los recubrimientos de poliuretano a base de solvente 2 Pack se preparan de acuerdo con el siguiente procedimiento: La mezcla de D-aminoácidos, en una proporción de 1 :1 :1 :1 de D-tirosina:D-leucina:D-metionina:D-triptófano se agrega al aglutinante y solvente como una formulación base y se agita a alta velocidad de cizallamiento durante 10 minutos hasta que se alcanza un tamaño de partícula inferior a 5 pm.

Formulación base: La formulación de recubrimiento se preparó mezclando los ingredientes del componente A y agregando el componente B al final antes de la aplicación (ver la tabla a continuación). El contenido de la mezcla de D-aminoácidos en la formulación total es 0.1 % en peso.

Cada formulación de recubrimiento es atomizada sobre paneles de aluminio blancos recubiertos (espesor seco de la película: 40 m) y se seca 30 minutos a 80°C.

EJEMPLO 15 Formulación representativa de agua en aceite Se prepara la siguiente emulsión de agua en aceite que contiene 0.1 % en peso/peso de mezcla de D-aminoácidos en una proporción de 1 :1 : 1 :1 de D-tirosina:D-leucina:D-metionina:D-triptófano.

Emulsión de agua en aceite: Parte A Parafina líquida 7.5 partes Isohexadecano 6.0 PEG-7 Aceite de ricino hidrogenado 4.1 Palimitato de isopropilo 2.0 Cera microcristalina 0.5 Alcohol de lanolina 0.6 Parte B agua dil. a 100 partes de formulación total Sulfato de magnesio 1.0 Glicina 3.20 Parte C mezcla de D-aminoácidos 20 partes de 0.5% en peso/peso de solución acuosa EJEMPLO 16 Formulación representativa de aceite en agua Se prepara la siguiente emulsión de aceite en agua que contiene 0.1 % en peso/peso de mezcla de D-aminoácidos en una proporción de 1 :1 : 1 :1 de D-tirosina:D-leucina:D-metionina:D-triptófano.

Emulsión de aceite en agua: Parte A Stearet-2 Stearet-21 1.0 PEG-15 éter de estearilo 6.0 éter de dicaprililo 6.0 Parte B agua dil. a 100 partes de formulación total Poliacrilato de sodio 0.2 Parte C mezcla de D-aminoácidos partes de 0.5% peso/peso de solución acuosa EJEMPLO 17 Inhibición in vivo de la formación de biopelículas de S. Aureus El análisis in vivo de un D-aminoácido o una combinación de dos o más D-aminoácidos se lleva a cabo tal como se describe en Anguita-Alonso et ál., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51 :2594 (2007).

EJEMPLO 18 Inhibición alternativa in vivo de la formación de biopelículas de S.

Aureus El análisis in vivo de un D-aminoácido o una combinación de dos o más D-aminoácidos se lleva a cabo tal como se describe en Beenken et ál. , J. Bacteriology, 186:4665 (2004).

EJEMPLO 19 Preparación de una mezcla acuosa estable de D-Tir, D-Leu, D-Trp y D-Met Los aminoácidos D-Met y D-Leu se disuelven individualmente en agua desionizada a temperatura ambiente usando una concentración de 5 mg/mL. En general, se prepara una solución de 10 mL para cada aminoácido. Se disuelve el D-triptófano en agua desionizada a 5 mg/mL, pero se requiere un leve calentamiento, 40 - 50°C durante 5 - 10 minutos. Se disuelve D- tirosina a 5 mg/mL en 0.05 M de HCI y se requiere calentamiento, 40 - 50°C durante 5 - 10 minutos. Se puede usar un baño de sonicación caliente para ayudar a la solución de los aminoácidos. Todas las soluciones se combinan y se filtran en condiciones de esterilización a temperatura ambiente, lo que da como resultado alrededor de 40 mL de solución madre.

EJEMPLO 20 Preparación de una mezcla acuosa estable de D-Tir, D-Pro y D-Fe Se prepara una solución acuosa tal como se describe en el Ejemplo 19.

EJEMPLO 21 Preparación de una mezcla acuosa estable de D-Tir, D-Asp y D-Glu Se prepara una solución acuosa tal como se describe en el Ejemplo 19.

EJEMPLO 22 Preparación de una mezcla acuosa estable de D-Tir, D-Arg, D-His y D-Lis Se prepara una solución acuosa tal como se describe en el Ejemplo 19.

EJEMPLO 23 Preparación de una mezcla acuosa estable de D-Tir, D-lle, D-Val- y D-Asn Se prepara una solución acuosa tal como se describe en el Ejemplo 19.

EJEMPLO 24 Preparación de una mezcla acuosa estable de D-Tir, D-Cis, D-Ser. D-Tre y D-GIn Se prepara una solución acuosa tal como se describe en el Ejemplo 19.

EQUIVALENTES Debe reconocerse que si bien la invención ha sido descrita junto con su descripción detallada, la descripción que antecede pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que es definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para tratar, reducir o inhibir la formación de biopelícula por bacterias, el método comprende: poner en contacto un artículo con una composición que comprende una cantidad eficaz de un D-aminoácido, dicha composición básicamente no contiene el L-aminoácido correspondiente, de este modo se trata, reduce o inhibe la formación de la biopelícula, en donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina y una combinación de estos.

2.- Un método para tratar, reducir o inhibir la formación de biopelícula por bacterias, el método comprende: poner en contacto un artículo con una composición que comprende una cantidad eficaz de una combinación de D-aminoácidos, de este modo se trata, reduce o inhibe la formación de la biopelícula.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la combinación de D-aminoácidos es una combinación de dos o más D-aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D- fenilalanina, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano y D-tirosina.

4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque el artículo es uno o más que se selecciona del grupo que consiste en un equipamiento industrial, sistemas de cañerías, masas de agua, superficies de la casa, textiles y papel.

5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 o 3, caracterizado además porque el artículo es uno o más componentes que participan en la recolección de agua condensada, recirculación del agua, transporte del agua de alcantarilla, proceso y fabricación de pulpa de papel, y procesamiento y transporte de agua.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 o 3, caracterizado además porque el artículo es un desagüe, bañera, electrodoméstico para la cocina, mesada, cortina de baño, lechada de relleno, baño, instalación industrial de producción de bebidas o alimentos, piso, barco, muelle, plataforma petrolera, puerto de captación de agua, tamiz, tubería de agua, sistema de refrigeración o central eléctrica.

7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 o 3, caracterizado además porque el artículo se fabrica con un material seleccionado del grupo que consiste en metal, aleación metálica, polímero sintético, polímero natural, cerámica, madera, vidrio, cuero, papel, tela, inorgánicos no metálicos, materiales compuestos y combinaciones de estos.

8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado además porque el contacto comprende aplicar un recubrimiento al artículo, dicho recubrimiento comprende una cantidad eficaz del D-aminoácido.

9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la composición comprende D-tirosina.

10. - El método de conformidad con la reivindicación reivindicación 9, caracterizado además porque la composición comprende adicionalmente uno o más de D-leucina, D-triptófano y D-metionina.

1 1 . - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque comprende adicionalmente poner en contacto la superficie con un biocida.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la composición comprende polihexametileno biguanida, clorhexidina, xilitol, triclosán o dióxido de cloro.

13. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la composición básicamente no contiene detergente.

14. - Un artículo recubierto resistente a la formación de biopelícula, que comprende: un artículo que comprende un recubrimiento en al menos una superficie expuesta, el recubrimiento comprende una cantidad eficaz de D-aminoácido y básicamente no contiene el L-aminoácido correspondiente, de esta manera se trata, reduce o inhibe la formación de biopelícula, en donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D-prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina y una combinación de estos.

15. - La composición o artículo recubierto de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la composición comprende D-tirosina.

16. - La composición o artículo recubierto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada además porque comprende adicionalmente un biocida.

17. - La composición o artículo recubierto de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el biocida comprende polihexametileno biguanida, clorhexidina, xilitol, triclosán o dióxido de cloro.

18. - Una composición resistente a la formación de biopelículas, que comprende: una base fluida; y una cantidad eficaz de un D-aminoácido distribuida en la base, de este modo se trata, reduce o inhibe la formación de la biopelícula, en donde la composición básicamente no contiene el L-aminoácido correspondiente, y donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D-alanina, D-cisteína, ácido D-aspártico, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-lisina, D-leucina, D-asparagina, D- prolina, D-glutamina, D-arginina, D-serina, D-treonina, D-valina, D-triptófano, D-tirosina, y una combinación de estos.

19. - La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la base fluida se selecciona de un líquido, gel, pasta.

20. - La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la composición se selecciona del grupo que consiste en agua, formulaciones para lavar, formulaciones desinfectantes, pinturas y formulaciones de recubrimiento.