DE10251184A1 - Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren - Google Patents
Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren Download PDFInfo
- Publication number
- DE10251184A1 DE10251184A1 DE10251184A DE10251184A DE10251184A1 DE 10251184 A1 DE10251184 A1 DE 10251184A1 DE 10251184 A DE10251184 A DE 10251184A DE 10251184 A DE10251184 A DE 10251184A DE 10251184 A1 DE10251184 A1 DE 10251184A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- amino acid
- amino acids
- inactivated
- coli
- recombinant microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title description 13
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 title description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 102000004674 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- -1 N-carbamoylamino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 150000001469 hydantoins Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229930195711 D-Serine Natural products 0.000 claims abstract description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 29
- 108010000622 N-carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010055053 3-dehydroshikimate dehydratase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100035717 Serine racemase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010006152 Serine racemase Proteins 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 claims description 4
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 claims description 4
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 4
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- 229930182827 D-tryptophan Natural products 0.000 claims 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 7
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102100036238 Dihydropyrimidinase Human genes 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 108091022884 dihydropyrimidinase Proteins 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 101150059880 dsdA gene Proteins 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 description 4
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 101710090249 D-hydantoinase Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 3
- 229930182832 D-phenylalanine Natural products 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241001524201 Arthrobacter crystallopoietes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108030000855 D-amino-acid N-acetyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 108010088443 hydantoin racemase Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWBQXMAXLAHHTK-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-(2-methylpropanoylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O BWBQXMAXLAHHTK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AIFYCUKWFYJXJO-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-(propan-2-ylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(C)N[C@@H](CS)C(O)=O AIFYCUKWFYJXJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- DZNJSBHVDXLTIK-UHFFFAOYSA-N 1-(hydroxymethyl)imidazolidine-2,4-dione Chemical compound OCN1CC(=O)NC1=O DZNJSBHVDXLTIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYEMHOTUCUFTLO-UHFFFAOYSA-N 1-ethylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CCN1CC(=O)NC1=O JYEMHOTUCUFTLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000006534 Amino Acid Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108010008830 Amino Acid Isomerases Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 241001508395 Burkholderia sp. Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108050004635 D-amino acid aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589625 Ralstonia pickettii Species 0.000 description 1
- 241001400590 Richia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000589497 Thermus sp. Species 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940053195 antiepileptics hydantoin derivative Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- RSAZYXZUJROYKR-UHFFFAOYSA-N indophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 RSAZYXZUJROYKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
- C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf spezielle E. coli Mutanten, die für die Synthese von D-Aminosäuren verwendet werden können sowie auf ein solches Verfahren. DOLLAR A Die Mutanten zeichnen sich durch Difizienzen in bestimmten D-aminosäureabbauenden Enzymen aus.
Description
- Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren gerichtet. Insbesondere werden diese enzymatisch über die sogenannte Hydantoinaseroute unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen gewonnen. Gleichfalls behandelt die vorliegende Erfindung derart modifizierte Mikroorganismen.
- D-Aminosäuren sind in der organischen Synthese als Intermediate zur Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffen häufig eingesetzte Verbindungen.
- Die enzymatische Hydrolyse von 5-substituierten Hydantoinen zu N-Carbamoyl-aminosäuren und deren Weiterreaktion zu den entsprechenden enantiomerenangereicherten Aminosäuren ist eine Standardmethode in der organischen Chemie ("Enzyme Catalysis in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1st and 2nd Ed.). Die Enantiodifferenzierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoinhydrolyse durch Hydantoinasen erfolgen oder aber wahlweise bei der Spaltung der N-Carbamoyl-aminosäuren mittels enantioselektiver Carbamoylasen. Da die Enzyme nur jeweils eine optische Antipode der entsprechenden Verbindung umsetzen, wird versucht, die andere im Gemisch (in-situ) zu razemisieren, um den vollständigen Umsatz des razemischen leicht herstellbaren Hydantoins in die korrespondierende enantiomerenangereicherte Aminosäure zu gewährleisten. Die Razemisierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoine mittels chemischer (Base, Säure, erhöhte Temp.) oder enzymatischer Verfahren erfolgen oder aber auf der Stufe der N-Carbamoylaminosäuren mittels z.B. Acetylaminosäurerazemasen (
DE10050124 ) vonstatten gehen. Letztere Variante funktioniert erfolgreich naturgemäß nur bei Einsatz von enantioselektiven Carbamoylasen. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Sachverhalt. - Schema 1:
- Es hat sich herausgestellt, dass die Verwendung rekombinanter Mikroorgansimen, welche Hydantoinase-, Carbamoylase- und Razemaseaktivitäten besitzen, zur Herstellung unterschiedlicher D-Aminosäuren problematisch sind. In
1 wird die Umsetzung von Hydroxymethylhydantoin und Ethylhydantoin mit E.coli JM109 transformiert mit einer D-Carbamoylase und D-Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 (gem. PatentanmeldungDE10114999.9 undDE10130169.3 ) aufgezeigt. Die Reaktionsbedingungen sind entsprechend Beispiel 1 gewählt. Wie1 beispielhaft zeigt, erfolgt bei der Umsetzung unterschiedlicher 5-monosubstituierter Hydantoine ein starker Abbau der gebildeten D-Aminosäuren. Dies reduziert die erreichbare Ausbeute und erschwert die Produktaufarbeitung. - Dem Fachmann ist bekannt, dass am Abbau von D-Aminosäuren unterschiedliche Enzyme wie D-Aminosäureoxidasen [EC 1.4.3.3], D-Aminosäuredehydrogenasen [EC 1.4.99.1], D-Aminosäureaminotransferasen [EC 2.6.1.21], D-Aminosäure-N-acetyltransferasen [EC 2.3.1.36], D-Hydroxyaminosäuredehydratasen [EC 4.2.1.14] und D-Aminosäurerazemasen [EC 5.1.1.10] beteiligt sein können. Ebenso sind dem Fachmann unterschiedliche Methoden bekannt, um diese Gene gezielt oder auch ungezielt zu inaktivieren [The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of Gram-negative bacteria. Alexeyev, Mikhail F. BioTechniques (1999), 26(5), 824-828; One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko, Kirill A. and Wanner, Barry L. PNA5 (2000), 97(12), 6640–6645; D-amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12: positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene, Wild, Jadwiga and Klopotowski, T. Mol.Gen.Genet. (1981), 181(3), 373–378.].
- Leider unbekannt und unvorhersagbar ist jedoch der zu erwartende Effekt auf das Zellwachstum beim Inaktivieren der unterschiedlichen Enzyme. Ebenso kann nicht vorhergesagt werden, welches Enzym oder ob eine Kombination von unterschiedlichen Enzymen inaktiviert werden muss, um den Abbau einer bestimmten D-Aminosäure im gewünschten Ausmaß zu reduzieren.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der zur Produktion von D- Aminosäuren über die Carbamoylase-/Hydantoinaseroute befähigt ist und der eine höhere Ausbeute an produzierter D-Aminosäure ermöglichen hilft. Dieser sollte im technischen Maßstab unter ökonomischen wie ökologischen Gesichtspunkten vorteilhaft einsetzbar sein. Insbesondere sollte er ein sehr gutes Wachstumsverhalten unter normalen wirtschaftlich sinnvollen Bedingungen, sowie hinreichende genetische und physikalische Stabilität und eine hinreichend schnelle Umsetzungsgeschwindigkeit für Hydantoine besitzen.
- Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Ansprüche 1 bis 5 beziehen sich auf bestimmte derart modifizierte Mikroorganiimen, während Ansprüche 6 und 7 ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren schützt.
- Dadurch, dass man einen rekombinanten Mikroorganismus zur Herstellung von D-Aminosäuren ausgehend von N-Carbamoylaminosäuren oder 5'monosubstituierten Hydantoinen bereitstellt, bei dem durch Mutagenese das Gen kodierend für eine D-Aminosäureoxidase und/oder das Gen kodierend für eine D-Serindehydratase inaktiviert ist, gelangt man überraschend und dennoch vorteilhaft zur Lösung der genannten Aufgaben. Insbesondere ist es als überraschend zu werten, dass rekombinant hergestellte Mikroorganismen mit dem erfindungsgemäßen Genprofil tatsächlich stabil sind und D-Aminosäuren in für industrielle Größenordnungen ausreichendem Maße zu produzieren im Stande sind.
- Als Mikroorganismen für rekombinante Ausführungsformen können im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommende Organismen wie Pilze z.B. Aspergillus sp., Streptomyces sp., Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, oder auch Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus sp. herangezogen werden.
- Als bevorzugte erfindungsgemäße Mikroorganismen können solche der Gattung Escherichia coli angesehen werden. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, BL21, W3110, RR1, DH5α, TOP 10– oder HB101. Die Herstellung derart modifizierter Organismen kann nach dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen. Dieser dient zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge der rekombinanten Enzyme. Die Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
- Die besagten Nukleinsäuresequenzen werden also nach bekannten Methoden mit Plasmiden oder Vektoren in einen Wirtsorganismus kloniert und die so exprimierten Polypeptide können mit geeigneten Screening-Methoden detektiert werden. Zur Detektion sind grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für die gebildeten Moleküle geeignet. Insbesondere eigenen sich grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für Ammoniak bzw. Ammoniumionen wie Nessler-Reagenz (Vogel, A., I., (1989) Vogel's textbook of quantitative chemical analysis, John Wiley & Sons, Inc., 5th ed., 679–698, New York) die Indophenolreaktion auch Berthelot'sche Reaktion genannt (Wagner, R., (1969) Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie, Vom Wasser, VCH-Verlag, Bd. 36, 263–318, Weinheim) insbesondere die enzymatische Bestimmung mittels der Glutamat-Dehydrogenase (Bergmeyer, H.,U., und Beutler, H.-O. (1985) Ammonia, in: Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3rd Edition, Vol. 8: 454-461, Weinheim) aber auch der Nachweis mit Ammonium-sensitiven Elektroden. Weiterhin dienen HPLC-Methoden zum Nachweis von Aminosäuren wie z.B. ein Derivativ-Verfahren auf der Basis von o-Pthaldialdehyd und N-Isobutyryl-Cystein zur Enantiomerentrennung von Aminosäuren (Brückner, H., Wittner R., und Godel H., (1991) Fully automated high-performance liquid chromatographic Separation of DL-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine. Application to food Samples, Anal. Biochem. 144, 204-206).
- Als Plasmide oder Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61–89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- Besonders bevorzugte Klonierungsvektoren von D-Carbamoylasen in E.coli sind beispielsweise Derivate von pBR322, pACYC184, pUC18 oder pSC101, welche konstitutive als auch induzierbare Promotoren zur Expressionskontrolle tragen können. Besonders bevorzugte Promotoren sind lac, tac, trp, trc, T3, T5, T7, rhaBAD, araBRD, λpL und phoA-Promotoren, welche dem Fachmann hinlänglich bekannt sind [Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli, Makrides S.C. Microbiol.Rev. 60(3), 512– 538].
- Die Inaktivierung der D-Aminosäureoxidase (dadA) bzw. der D-Serindehydratase (dsdA) dieser Organismen erfolgt dabei nach dem Fachmann bekannten eingangs beschriebenen Methoden. Zur Erzeugung der rekombinanten Ausführungsarten der D-Serindehydratase bzw. D-Aminosäureoxidase defizienten Stämme mit D-Carbamoylaseaktivität sind dem Fachmann die grundlegenden molekularbiologischen Methoden also bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Ebenso sind Gensequenzen unterschiedlicher D-Carbamoylasen z.B. aus Agrobacterium sp., Arthrobacter sp. oder Bacillus sp. und Ralstonia pickettii bekannt, die bevorzugt verwendet werden (u.a. aus
US 5858759 ,US 5807710 ,US 6083752 ,US 6083752 ,US 6083752 ,US 6083752 ,US 6083752 ). - Für die Herstellung der Organismen, welche zusätzlich eine Hydantoinase und ggf. eine Hydantoin- oder Carbamoylracemase aufweisen, können gleiche Methoden angewandt werden. Als Hydantoinasen sind dabei bevorzugt solche aus Thermus sp., Bacillus sp., Mycobacterium sp., Corynebacterium sp., Agrobacterium sp., E.coli, Burkholderia sp., Pseudomonas sp., oder Arthrobacter sp. einzusetzen. Hydantoinrazemase können bevorzugt aus Pseudomonas sp., Arthrobacter sp., oder Agrobacterium sp., ggf. unter Zugabe von Hilfsstoffen, wie Metallionen, beispielsweise Mn2+-Ionen angewandt werden.
- So konnten die erfolgreichen Mutanten Escherichia coli DSM 15181 und Escherichia coli DSM 15182 hergestellt werden. Diese bilden daher zusammen mit den aus ihnen ableitbaren weiteren Mutanten einen nächsten Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
- Im gleichfalls erfindungsgemäßen Verfahren wird z.B. ein Hydantoin in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Wasser, welches mit weiteren wasserlöslichen oder nicht wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln versetzt sein kann, bei pH-Werten zwischen 6,0 und 11, bevorzugt zwischen 7 und 10, und einer Temperatur zwischen 10°C und 100°C, bevorzugt zwischen 30°C und 70°C, besonders bevorzugt zwischen 37°C und 60°C mit den besagten Zellen oder Zellbestandteilen umgesetzt. Für die Anwendung können die betrachteten Enzyme auch in freier Form verwendet werden. Weiterhin können die Enzyme auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
- Möglich ist ebenfalls die Verwendung der rekombinanten Zellen in geflockter, quervernetzter oder immobilisierter Form, beispielsweise unter Verwendung von Agar, Agarose, Carrageenan, Alginate, Pectine, Chitosan, Polyacrylamide und andere synthetische Träger (Chemical aspects of immobilized Systems in biotechnologies. Navratil, Marian; Sturdik, Ernest. Chemicke Listy (2000), 94(6), 380–388; Industrial applications of immobilized biocatalysts and biomaterials. Chibata, Ichiro. Advances in Molecular and Cell Biology (1996), 15A(Biochemical Technology), 151– 160; Immobilization of genetically engineered cells: a new strategy for higher stability. Kumar, P. K. R.; Schuegerl, K. Journal of Biotechnology (1990), 14(3–4), 255–72.).
- Demgemäß bildet einen nächsten Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren mit einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus. Vorzugsweise werden D-Aminobuttersäure, D-Serin, D-Methionin, D- Tryptophan und D-Phenlyalanin hergestellt.
- Bei diesem Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren werden bevorzugt Organismen mit D-carbamoylaseaktiven und hydantoinaseaktiven und dadA und/oder dsdA inaktivierten Zellen verwendet. Hierbei ist zu erwähnen, dass als Edukt sowohl L-, D- oder DL-Carbamoylaminosäuren als auch 5-monosubstituierte Hydantoine in Frage kommen, welche über hinlänglich bekannte Hydantoinasen in die entsprechenden Carbamoylaminosäuren überführt werden können ("Enzyme Catalysis in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1st and 2na Ed.). Die verwendeten dadA und/oder dsdA defizienten Stämme können dabei die Carbamoylase und Hydantoinase, gegebenenfalls auch eine Hydantoinrazemase oder Carbamoylaminosäurerazemase koexprimieren und sowohl in freier oder auch immobilisierter Form eingesetzt werden (s.o ).
- Wie sich nun gezeigt hat, ist die Inaktivierung unterschiedlicher Enzyme erforderlich, um für unterschiedliche D-Aminosäuren den Abbau in ausreichendem Maße (< 10% Abbau innerhalb von >10 Stunden) zu reduzieren (siehe
2 ). Für den Abbau von D-Serin zeigte sich überraschenderweise, dass die Inaktivierung des Gens der D-Aminosäureoxidase (dadA) nicht ausreicht, um deren Abbau effektiv zu reduzieren. Für eine effektive Reduzierung des Abbaus dieser Aminosäure musste zusätzlich die D-Serindehydratase inaktiviert werden. In der Literatur war im Gegensatz dazu berichtet worden, dass durch eine Inaktivierung von dadA ein > 3 fach reduzierter Abbau von D-Serin erreicht wird [D-Amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12: positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene. Wild, J.; Klopotowski, T. Mol. Gen. Genet. (1981), 181(3), 373–378]. Ebenfalls im Gegensatz zu den dort beschriebenen Ergebnissen, zeigte sich überraschenderweise, dass D-Serin sehr viel schneller abgebaut wird als beispielsweise D-Methionin. - Der Abbau aromatischer und aliphatischer D-Aminosäuren, wie beispielsweise D-Phenylalanin, D-Methionin oder D-Aminobuttersäure, wird im Gegensatz zu D-Serin ausreichend durch eine Inaktivierung der D-Aminosäureoxidase erreicht. Für D-Phenylalanin zeigen jedoch überraschenderweise beide Deletionen (ΔdsdA & ΔdadA) einen positiven Effekt, wohingegen für D-Methionin die Deletion in dsdA keinen zusätzlichen Effekt zeigt. Diese Ergebnisse sind in
2 zusammengefasst (Abbau unterschiedlicher Aminosäuren mit unterschiedlichen Mutanten von E.coli BW25113. E.coli ET3 besitzt eine Deletion der D-Aminosäureoxidase (ΔdadA); E.coli ET4 besitzt zusätzlich eine Deletion der D-Serindehydratase (ΔdsdA). Reaktionsbedingungen siehe Beispiel 3). - Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als von der Offenbarung mitumfasst.
- Die Organismen DSM15181 (ET3) und DSM15182 (ET4) wurden durch die Degussa AG am 10.09.2002 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt. SEQUENZPROTOKOLL
- Beispiele
- Beispiel 1: Produktion von D-Aminosäuren mittels rekombinanten E.coli Zellen
- Chemisch kompetente E.coli JM109 (Promega) wurden mit pJAVI16 (siehe
3 ) transformiert. Dieses Plasmid trägt eine D-Carbamoylase und eine D-Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM20117. Die Sequenzen der D-Hydantoinase und D-Carbamoylase sind in Seq. 1 und 3 dargestellt (siehe auchDE10114999.9 bzw.DE10130169.3 ) - Die mit pJAVIERI6 transformierten E.coli Zellen wurden auf LBamp-Platten (Ampicillinkonzentration: 100ug/ml) vereinzelt. 2,5 ml LBamp-Medium mit 1mM ZnC12 wurden mit einer einzelnen Kolonie beimpft und 30 Stunden bei 37°C und 250rpm inkubiert. Diese Kultur wurde in 100ml LBamp-Medium mit 1mM ZnCl2 und 2g/1 Rhamnose 1:50 verdünnt und 18h bei 30°C inkubiert. Die Kultur wurde 10 min bei 100008 zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Biomasse gewogen. Die Biomasse wurde mit unterschiedlichen Hydantoinderivaten, z.B. 100mM DL-Hydroxymethylhydantoin bzw. DL-Ethylhydantoin, pH 7.5, versetzt, so dass sich eine Biomassenkonzentration von 40g Biofeuchtmasse pro Liter ergibt. Die Reaktionslösung wurde bei 37°C inkubiert. Nach unterschiedlichen Zeiten wurden Proben genommen, zentrifugiert und die entstandenen Aminosäuren mittels HPLC quantifiziert.
- Beispiel 2: Erzeugung DsdA und DadA defizienten E.coli Stämmen
- DadA wurde in E.coli BW25113 (Bei CGSC unter der Nummer CGSC7636 hinterlegt) gemäß der von Datsenko & Wanner beschriebenen Methode deletiert (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko, Kirill A, and Wanner, Barry L. PNAS (2000), 97(12), 6640–6645). Hierzu wurden folgende Primer zur Amplifikation der Chloramphenicolresistenz aus pKD13 (Bei CGSC unter der Nummer CGSC7633 hinterlegt) verwendet:
- Eine Transformation des Amplifikats in E.coli BW25113 (pKD46) (hinterlegt bei CGSC unter der Nummer CGSC7630) und Selektion kanamycinresistenter Klone ermöglichte die Isolierung von E.coli ET2. Nach Entfernung der Chloramphenicolresistenz gemäß des Protokolls von Datsenko & Wanner konnte der Stamm E.coli ET3 isoliert werden. Zur Deletion von dsdA in E.coli ET3 wurde wiederum die Chloramphenicolresistenz aus pKD13 mit folgenden Primern amplifiziert:
- Eine Transformation des Amplifikats in E.coli ET3 (pKD46) und Selektion kanamycinresistenter Klone ermöglichte die Isolierung von E.coli ET4, welcher sowohl ein Deletion in dadA als auch in dsdA trägt.
- Beispiel 3 Untersuchung des Abbaus von D-Aminosäuren
- 2,5 ml LB-Medium wurden mit einer einzelnen Kolonie von E.coli BW25113, E.coli ET3 und E.coli ET4 beimpft und 18 Stunden bei 37°C und 250rpm inkubiert. Diese Kulturen wurden in 100ml LB-Medium 1:50 verdünnt und 18h bei 37°C inkubiert. Die Kulturen wurden 10 min bei 10000g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Biomasse gewogen. Die Biomasse wurde mit unterschiedlichen 100mM D-Aminosäurelösungen, pH7,5 (z.B. D-Methionin, D-Phenylalanin, D-Aminobuttersäure, D-Serin) so versetzt, dass sich eine Biomassenkonzentration von 100g Biofeuchtmasse pro Liter ergibt. Diese Reaktionslösungen wurden bei 37°C inkubiert und nach 10 Stunden zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mittels HPLC auf die verbleibende Aminosäurekonzentration untersucht. Die Angabe Abbau wurde aus dem Quotienten der Anfangskonzentration und Endkonzentration nach 10 Stunden Inkubation berechnet.
Claims (7)
- Rekombinanter Mikroorganismus zur Herstellung von D-Aminosäuren ausgehend von N-Carbamoylaminosäuren oder 5'monosubstituierten Hydantoinen bei dem durch Mutagenese das Gen kodierend für eine D-Aminosäureoxidase und/oder das Gen kodierend für eine D-Serindehydratase inaktiviert ist.
- Mikroorganismus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Organismus der Gattung Escherichia coli handelt.
- Mikroorganismus nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein D-Carbamoylasegen aus Agrobacterium sp., Arthrobacter sp. oder Bacillus sp. besitzt.
- Escherichia coli DSM 15181 und daraus abgeleitete Mutanten.
- Escherichia coli DSM 15182 und daraus abgeleitete Mutanten.
- Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren mit einem Mikroorganismus nach Anspruch 1–5.
- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Aminobuttersäure, D-Serin, D-Methionin, D-Tryptophan und D-Phenlyalanin herstellt.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10251184A DE10251184A1 (de) | 2002-11-04 | 2002-11-04 | Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren |
| PCT/EP2003/011432 WO2004042047A1 (en) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutants for the preparation of d-amino acids |
| AT03775186T ATE439430T1 (de) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren |
| CA002511751A CA2511751A1 (en) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutants for the preparation of d-amino acids |
| AU2003283269A AU2003283269A1 (en) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutants for the preparation of d-amino acids |
| US10/527,061 US20060228787A1 (en) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutants for the preparation of d-amino acids |
| CNB2003801024249A CN100510052C (zh) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | 用于制备d-氨基酸的突变株 |
| JP2004548747A JP2006504428A (ja) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Ｄ−アミノ酸の製造のための突然変異株 |
| EP03775186A EP1558727B1 (de) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren |
| DE60328813T DE60328813D1 (de) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren |
| US12/357,218 US9194009B2 (en) | 2002-11-04 | 2009-01-21 | Mutants for the preparation of D-amino acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10251184A DE10251184A1 (de) | 2002-11-04 | 2002-11-04 | Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10251184A1 true DE10251184A1 (de) | 2004-05-13 |
Family
ID=32103290
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10251184A Withdrawn DE10251184A1 (de) | 2002-11-04 | 2002-11-04 | Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren |
| DE60328813T Expired - Lifetime DE60328813D1 (de) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE60328813T Expired - Lifetime DE60328813D1 (de) | 2002-11-04 | 2003-10-15 | Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20060228787A1 (de) |
| EP (1) | EP1558727B1 (de) |
| JP (1) | JP2006504428A (de) |
| CN (1) | CN100510052C (de) |
| AT (1) | ATE439430T1 (de) |
| AU (1) | AU2003283269A1 (de) |
| CA (1) | CA2511751A1 (de) |
| DE (2) | DE10251184A1 (de) |
| WO (1) | WO2004042047A1 (de) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2012008017A (es) | 2010-01-08 | 2012-10-03 | Harvard College | Métodos y composiciones para tratar biopelículas. |
| WO2012151555A1 (en) | 2011-05-04 | 2012-11-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and coatings for treating biofilms |
| CN104053772A (zh) | 2011-11-16 | 2014-09-17 | 赢创工业集团股份有限公司 | 乙内酰脲酶的突变体 |
| CN107937377A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-04-20 | 江南大学 | 一种d‑n‑氨甲酰水解酶及应用 |
| WO2019183344A1 (en) | 2018-03-21 | 2019-09-26 | Case Western Reserve University | Thermoresponsive compositions and methods for preventing and disrupting biofilms |
| CN110699396B (zh) * | 2019-11-15 | 2022-03-01 | 江南大学 | 一种级联反应制备d-芳香族氨基酸的方法 |
| EP4105335A1 (de) | 2021-06-16 | 2022-12-21 | Evonik Operations GmbH | Enzymatisches verfahren zur herstellung von l-glufosinat-p-alkylestern |
| CN119301263A (zh) | 2022-03-14 | 2025-01-10 | 赢创运营有限公司 | 用于制备l-草铵膦p-酯的酶方法 |
| CN116926139A (zh) * | 2022-04-12 | 2023-10-24 | 元素驱动(杭州)生物科技有限公司 | 一种n-乙酰-d-氨基酸、d-氨基酸、d-氨基酸衍生物的制备方法 |
| WO2023232225A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Evonik Operations Gmbh | Enzymatic method for the diastereoselective production of l-glufosinate p-esters |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1277125B1 (it) * | 1995-12-21 | 1997-11-04 | Eniricerche Spa | Mutanti termostabili della d-n-alfa-carbamilasi |
| US5728555A (en) * | 1996-09-30 | 1998-03-17 | Monsanto Company | Preparation of d-amino acids by direct fermentative means |
| WO1999051722A2 (de) * | 1998-04-02 | 1999-10-14 | Degussa-Hüls Aktiengesellschaft | Rekombinante l-n-carbamoylase aus arthrobacter aurescens, verfahren zur herstellung von l-aminosäuren mittels dieser |
| DE10114999A1 (de) * | 2001-03-26 | 2002-10-10 | Degussa | D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 |
-
2002
- 2002-11-04 DE DE10251184A patent/DE10251184A1/de not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-10-15 WO PCT/EP2003/011432 patent/WO2004042047A1/en not_active Ceased
- 2003-10-15 AT AT03775186T patent/ATE439430T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-10-15 DE DE60328813T patent/DE60328813D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-15 CA CA002511751A patent/CA2511751A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-15 AU AU2003283269A patent/AU2003283269A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-15 US US10/527,061 patent/US20060228787A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-15 CN CNB2003801024249A patent/CN100510052C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-15 EP EP03775186A patent/EP1558727B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-15 JP JP2004548747A patent/JP2006504428A/ja active Pending
-
2009
- 2009-01-21 US US12/357,218 patent/US9194009B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090203091A1 (en) | 2009-08-13 |
| CA2511751A1 (en) | 2004-05-21 |
| DE60328813D1 (de) | 2009-09-24 |
| AU2003283269A1 (en) | 2004-06-07 |
| WO2004042047A1 (en) | 2004-05-21 |
| CN1708583A (zh) | 2005-12-14 |
| EP1558727B1 (de) | 2009-08-12 |
| ATE439430T1 (de) | 2009-08-15 |
| US20060228787A1 (en) | 2006-10-12 |
| CN100510052C (zh) | 2009-07-08 |
| JP2006504428A (ja) | 2006-02-09 |
| EP1558727A1 (de) | 2005-08-03 |
| US9194009B2 (en) | 2015-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9194009B2 (en) | Mutants for the preparation of D-amino acids | |
| DE69333668T2 (de) | Für eine decarbamylase mit verbesserter thermostabilität kodierende dna und ihre verwendung | |
| Yamamoto et al. | Production of S-(+)-ibuprofen from a nitrile compound by Acinetobacter sp. strain AK226 | |
| EP1950287B1 (de) | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene | |
| DE60313866T2 (de) | Polypeptide mit alpha-h alpha amino acid amide racemase aktivitität und nukleinsäuren kodierend dafür | |
| EP1247869B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren | |
| DE3875953T2 (de) | Verfahren zur herstellung von organischen chemischen verbindungen. | |
| DE10129711B4 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat | |
| EP1205542B1 (de) | L-Aminosäure-Oxidase aus Rhodococcus-Arten | |
| EP1318193B1 (de) | D-Amidase aus Variovorax | |
| EP1197563B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren | |
| DE102004014280A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren mittels eines Ganzzellkatalysators | |
| EP1200601B1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren aus ihren racemischen n-acetyl-d,l-derivaten durch enzymatische racemat-spaltung mittels isolierter, rekombinanter enzyme | |
| DE60211135T2 (de) | D-carbamoylase aus arthrobacter crystallopoietes dsm 20117 | |
| EP1074628B1 (de) | N-Acetylaminosäureracemase | |
| DE10240603A1 (de) | Verwendung von Malat-Dehydrogenase zur NADH-Regenerierung | |
| DE60220797T2 (de) | Nucleinsäuresequenzen kodierend für enantioselektive amidasen | |
| EP0377083A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren | |
| US4906572A (en) | Method of culturing amino acid racemase-producing microorganism of genus pseudomonas | |
| WO1997033987A1 (de) | Verfahren zur herstellung von n-geschützten d-prolinderivaten | |
| AU2002212690A1 (en) | Process for producing d-serine | |
| DE102004043748A1 (de) | Biokatalysator zur Hydrolyse von Cyanid | |
| EP1199369B1 (de) | Verwendung der Acetylaminosäureracemase aus Amycolatopsis orientalis zur Racemisierung von Carbamoylaminosäuren | |
| DE10244347A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Carbamoylaminosäuren | |
| DE10130169A1 (de) | Aktivierte rec-D-Hydantoinasen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: DEGUSSA GMBH, 40474 DUESSELDORF, DE |
|
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: EVONIK DEGUSSA GMBH, 40474 DUESSELDORF, DE |
|
| 8141 | Disposal/no request for examination |