MX2008014603A

MX2008014603A - Produccion de acidos grasos y derivados de los mismos.

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Publication number: MX2008014603A
Application number: MX2008014603A
Authority: MX
Inventors: Jay D Keasling; Zhihao Hu; Chris Somerville; George Church; David Berry; Lisa Friedman; Andreas Schirmer; Shane Brubaker; Stephen B Del Cardayre
Original assignee: Ls9 Inc
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2009-02-06
Also published as: EP2024491A2; JP2010505388A; CA2650773C; JP5933909B2; BRPI0712205A2; CA2650773A1; WO2007136762A3; KR20090029708A; JP6275203B2; JP2016178943A; EP2194119A2; MX356086B; DK2840131T3; JP2014207908A; JP5961662B2; MX344588B; AU2007254151A1; EP2157170A1; ES2528482T3; ES2763624T3

Abstract

Se proporcionan microorganismos genéticamente modificados que producen productos a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), así como métodos de su uso.

Description

PRODUCCION DE ACIDOS GRASOS Y DERIVADOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención Se proporcionan microorganismos genéticamente modificados que producen productos a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos) , asi como métodos de su uso.

Antecedentes de la Invención Se han logrado desarrollos en la tecnología por una dependencia incrementada de fuentes de combustible y estas fuentes de combustible se están llegando a limitar cada vez más y a ser difíciles de adquirir. Con la quema de combustibles fósiles que toma lugar a una proporción sin precedentes, es probable que la demanda de combustible del mundo excederá pronto los suministros actuales de combustible. Como resultado, se han dirigido esfuerzos hacia el aprovechamiento de fuentes de energía renovable, tal como la luz solar, agua, viento, y biomasa. El uso de biomasas para producir nuevas fuentes de combustible que no se deriven de fuentes petroleras (es decir, biocombustible ) ha emergido como una opción alternativa. El biocombustible (biodiesel) es un combustible biodegradable de quema ecológica elaborado de alcanos y ésteres de cadenas largas. Se puede usar biodiesel en la mayoría de las máquinas diesel de combustión interna ya Ref . : 198096 sea en una forma pura, que se refiere como biodiesel "puro", o como una mezcla en cualquier concentración con diesel de petróleo regular. Los métodos actuales para elaborar biodiesel comprenden transesterificación de triacilglicéridos (principalmente aceite vegetal) que conduce una mezcla de ásteres de ácido graso y el producto secundario indeseado, glicerina, que proporciona de esta manera un producto que es heterogéneo de un producto de desperdicio que provoca ineficiencias económicas.

Breve Descripción de la Invención Se describen en la presente microorganismos recombinantes que son capaces de sintetizar productos derivados a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos) , y de liberar opcionalmente estos productos en el caldo de fermentación. Estos derivados de ácidos grasos son útiles, ínter alia, como biocombustibles y productos químicos de especialidad. Estos, biocombustibles y productos químicos de especialidad se pueden usar para elaborar productos adicionales, tal como complementos nutricionales , polímeros, reemplazos de parafina, y productos de cuidado personal. Los microorganismos recombinantes descritos en la presente se pueden modificar para producir varios derivados de ácidos grasos que incluyen, pero no se limitan a, alcoholes de cadena corta tal como etanol, propanol, isopropanol y butanol, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasoso, hidrocarburos y ésteres de ceras. En un ejemplo, la descripción proporciona un método para modificar un microorganismo de modo que produce, y opcionalmente libera, derivados de ácidos grasos generados de una fuente renovable de carbono. Estos microorganismos se manejan genéticamente, por ejemplo, al introducir una secuencia exógena de ADN que codifica para una o más proteínas capaces de metabolizar una fuente renovable de carbono para producir, y en algunos ejemplos para segregar, un derivado de ácido graso. Los microorganismos modificados entonces se pueden usar en un proceso de fermentación para producir derivados útiles de ácidos grasos usando la fuente renovable (biomasa) de carbono como el material de inicio. En algunos ejemplos, se usa un microorganismo existente genéticamente manejable debido a la posibilidad de manejo de su ruta para controlar el crecimiento, producción y reducir o eliminar reacciones secundarias que reducen las eficiencias de la ruta biosintética . Además, estos microorganismos modificados se pueden usar para consumir fuentes renovables de carbono a fin de generar combustibles que se puedan usar directamente como biocombustibles, sin la necesidad de métodos especiales para el almacenamiento, o transporte. En otros ejemplos, los microorganismos que producen de manera natural hidrocarburos se manejan para producir en exceso hidrocarburos al expresar secuencias exógenas de ácido nucleico que incrementan la producción de ácidos grasos. Se proporcionan en la presente microorganismos que producen derivados de ácidos grasos que tienen longitud definida de cadena de carbono, ramificación, y niveles de saturación. En ejemplos particulares, la producción de productos homogéneos disminuye el costo total asociado con la fermentación y separación. En algunos ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos tioesterasa (EC 3.1.2.14), y al menos una cera-sintasa (EC 2.3.1.75). En otros ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos un alcohol-acetiltransferasa (2.3.1.84). En aún otros ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) al menos una acil-CoA-reductasa (EC 1.2.1.50) y al menos una alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). También se proporcionan microorganismos que expresan una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una acil-CoA-reductasa (1.1.1.*) formadora de alcohol graso. Los péptidos de tioesterasa codificados por las secuencias exógenas de ácido nucleico se pueden elegir para proporcionar productos homogéneos. En algunos ejemplos, el microorganismo que se maneja para producir el derivado de ácido graso es E. coli, Z. mobilis, Rhodococcus opacus , Ralstonia eutropha, Vibrio furnissii, Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis, Streptomycetes , Stenotrophomonas maltophila , Pseudomonas o Micrococus leuteus y sus congéneres. En otros ejemplos, los microorganismos que producen hidrocarburos se pueden modificar de manera endógena para producir en exceso de hidrocarburos al optimizar la ruta biosintética de ácidos grasos como se describe en la presente. Los microorganismos de ejemplo que se conocen para producir hidrocarburos y se pueden modificar para producir en exceso hidrocarburos usando las enseñanzas proporcionadas en la presente incluyen Arthrobacter sp. , Bacillus sp. , Botrycoccus braunii, Chromatium sp. , Cladosporium resina (ATCC22711), clostridium pasteurianum VKM, clostridium tenanomorphum , Clostridium acidiurici r Corynebacterium species, cyanobacterial species (Nostoc muscorum , Anacystis , (Synechococcus) nidulans , Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii , Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii , Microcoleus chthonoplaseis , Coccochloris elabens r Agmenellum quadruplicatum, Plectonema terebrans , M vaginatus , y C. scopulorum) , Desulfovibrio desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149) , Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516), Micrococcus lysodeikticus, Mycobacterium species, Penicillium sp. , Aspergillus sp. , Trichoderma virida, Pullularia pullulans , Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456), Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp., Rhodospirillium rubrum (ATCC11170), Rhodomicrobium vannielii, Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis) , Vibrio furnissii MI, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus , Serratia marinorubra , Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri , Sphacelotheca reiliana , y Tilletia sp. (foetida, caries, controversa) . Además de ser manejado para expresar secuencias exógenas de ácido nucleico que permiten la producción de derivados de ácido graso, el microorganismo puede tener adicionalmente uno o más genes endógenos suprimidos o atenuados de manera funcional. Por ejemplo, ackA (EC 2.7.2.7), ackB (EC 2.7.2.7), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (acceso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3, gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa-cintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de los mismos, por ejemplo, se pueden atenuar. Además de ser manejado para expresar secuencias exógenas de ácido nucleico que permiten la producción de derivados de ácido graso, el microorganismo puede tener adicionalmente uno o más genes adicionales sobre-expresados. Por ejemplo, pdh, panK, aceEF (que codifica para el componente Elp-deshidrogenasa y el componente E2p-dihidrolipoamida-acetiltransferasa del piruvato y complejos de 2-oxoglutarato-deshidrogenasa, accesos: NP_414656, NP_414657, EC : 1.2.4.1.2.3.1.61, 2.3.1.12), accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (que codifica para FAS, Accesos: CAD85557, CAD85558, NP_842277, NP_841683, NP_415613, EC : 2.3.1.180, 2.3.1.39, 1.1.1.100, 1.6.5.3, 2.3.1.179), genes que codifican para graso/acil/CoA-reductasas (Accesos: AAC45217, EC 1.2.1.-), UdhA o genes similares (que codifican para piridina-nucleótido-transhidrogenasa, acceso: CAA46822, EC : 1.6.1.1) y genes que codifican para graso-acil-CoA-reducatasas (Accesos: AAC45217, EC 1.2.1.-) . En algunos ejemplos, los microorganismos descritos en la presente producen al menos 1 mg de derivado de ácido graso por litro de caldo de fermentación. En otros ejemplos, los microorganismos producen al menos 100 mg/L, 500 mg/L, 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 100 g/L, o 120 g/L de derivado de ácido graso por litro de caldo de fermentación. En algunos ejemplos, el derivado de ácido graso se produce y libera del microorganismo y en aún otros ejemplos, el microorganismo se lisa antes de la separación del producto. En algunos ejemplos, el derivado de ácido graso incluye una cadena de carbono que es al menos de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34 carbonos de larga. En algunos ejemplos, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, ó 95 % del producto derivado de ácido graso elaborado contiene una cadena de carbonos que es de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, ó 34 carbonos de largo. En aún otros ejemplos, al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ó 95 % del producto derivado de ácido graso contiene 1, 2, 3, 4 ó 5 puntos de insaturación . También se proporcionan métodos para producir derivados de ácidos grasos. Estos métodos incluyen cultivar los microorganismos descritos en la presente y separar el producto del caldo de fermentación. Se describen adicionalmente estos y otros ejemplo en la siguiente descripción detallada.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la ruta biosintéticos de FAS. La Figura 2 muestra las rutas biosintéticas que producen ceras. Se pueden producir ceras de una célula hospedadora usando alcoholes producidos dentro de la célula hospedadora o se pueden producir al adicionar alcoholes exógenos en el medio, un microorganismo diseñado para producir ceras producirá enzimas de cera-sintasa (EC 2.3.1.75) usando secuencias exógenas de ácido nucleico asi como secuencias de tioesterasa (EC 3.1.2.14). Otras enzimas que también se pueden modular para incrementar la producción de cera incluyen enzimas comprendidas en la síntesis de ácidos grasos (enzimas FAS EC 2.3.1.85), acil-CoA-sintasa (EC 2.3.1.86), acil-CoA-reducatasa (EC 1.1.1.*) formadora de alcoholes grasos, y acil-CoA-reductasa (1.2.1.50) y alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). La Figura 3 muestra las rutas biosintéticas que producen alcoholes grasos. Los alcoholes grasos que tienen longitudes definidas de cadenas de carbono se pueden producir al expresar secuencias exógenas de ácidos grasos que codifican para tioesterasas (EC 3.1.2.14), y combinaciones de acil-CoA-reductasas (EC 1.2.1.50), alcohol deshidrogenasas (EC 1.1.1.1) y acil-CoA-reductasas (FAR, EC 1.1.1*) formadoras de alcoholes grasos. Otras enzimas que también se pueden modular para incrementar la producción de alcoholes grasos incluyen enzimas comprendidas en la síntesis de ácidos grasos (enzimas FAS EC 2.3.1.85), y acil-CoA-sintasa (EC 2.3.1.86). La Figura 4 muestra rutas biosintéticas que producen ésteres de ácidos grasos. Los ésteres de ácidos grasos que tienen longitudes definidas de cadenas de carbono se pueden producir al expresar exógenamente varias tioesterasas (EC 3.1.2.14), combinaciones de acil-CoA-reductasa (1.2.1.50), alcohol-deshidrogenasas (EC 1.1.1.1), y acil-CoA-reductasa (FAR, EC 1.1.1*) formadora de alcoholes grasos, asi como, acil-transferasa (EC 2.3.1.85). Otras enzimas que se pueden modular para incrementar la producción de ésteres de ácidos grasos incluyen enzimas comprendidas en la síntesis de ácidos grasos (enzimas FAS, EC 2.3.1.85), y acil-CoA-sintasa (EC 2.3.1.86) . La Figura 5 muestra la producción de alcoholes grasos por la cepa descrita en el Ejemplo 4, co-transformada con pCDFDuet-l-fadD-acrl y plásmidos que contienen varios genes de tioesterasa. Las cepas se cultivan de manera aeróbica a 25°C en el medio mineral M9 con glucosa al 0.4 % en matraces agitados. Se identificaron alcoholes grasos de CIO, C12, C14, C16 y C18 saturados. También se detectaron en algunos ejemplos pequeñas cantidades de alcoholes grasos C16:l y C18:l. Se extrajeron alcoholes grasos a partir de sedimentos celulares usando acetato de etilo y derivatizando con N-trimetilsilil (TMS) o imidazol para incrementar la detección. La Figura 6 muestra la liberación de alcoholes grasos a partir de la cepa de producción. Se liberaron aproximadamente 50 % del alcohol graso producido a partir de las células cuando se cultivaron a 37°C. Las Figuras 7A-7D muestran el espectro de GS-MS de octal-octanoato (C8C8) producido por hospedadores de producción que expresan alcohol-acetil-transferasa (AATs, EC 2.3.1.84) y hospedadores de producción que expresan cera-sintasa (EC 2.3.1.75). La Figura 7A muestra la extracción con acetato de etilo de la cepa C41 (DE3, AfadE/pHZl .43) /pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresó ADP1 (cera-sintasa) . La Figura 7B muestra el extracto con acetato de etilo de la cepa C41(DE3, AfadE/pHZl .43) /pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresó SAAT. La Figura 7C muestra el extracto con acetato de etilo de la cepa C41(DE3, AfadE/pHZl .43) /pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 no contuvo ADPl (cera-sintasa) o SAAT. La Figura 7D muestra el espectro de masa y el patrón de fermentación de C8C8 producido por C41(DE3, AfadE/pHZl.43) /pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZl.43 expresó SAAT). La Figura 8 muestra la distribución de ésteres etílicos elaborados cuando se co-expresó cera-sintasa a partir de A. baylyi ADPl (WSadpl) con el gen de tioesterasa a partir de Cuphea hookeriana en un hospedador de producción. Las Figuras 9A y 9B son cromatogramas del análisis de GC/MS. La Figura 9A muestra un cromatograma del extracto con etilo del cultivo de la cepa LS9001 de E. coli transformada con los plásmidos pCDFDuet-l-fadD-WSadpl, pETDuet-1- ? tesA. Se alimentó etanol a las fermentaciones. La Figura 9B muestra un cromatograma de hexadecanoato de etilo y oleato de etilo usado como referencia. La Tabla 11 identifica varios genes que se pueden sobre expresar o atenuar para incrementar la producción de derivados de ácidos grasos. La tabla también identifica varios genes que se pueden modular para alterar la estructura del producto derivado de ácido graso. Un experto en la técnica apreciará que algunos de los genes que se usan para alterar la estructura del derivado de ácido graso también incrementará una producción de derivados de ácidos grasos.

Descripción Detallada de la Invención Abreviaciones y Términos Las siguientes especificaciones de los términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente descripción y para guiar a aquéllos expertos en la técnica en la práctica de la presente descripción. Como se usa en la presente, "que comprende" significa "que incluye" y las formas singulares "un" o "una" o "el (la)" se incluyen preferencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia "que comprenden las células" incluye una o una pluralidad de estas células, y la referencia "que comprende la tioesterasa" incluye referencia a uno o más péptido de tioesterasa y equivalentes de los mismos conocidos por aquéllos expertos en la técnica, y asi sucesivamente. El término "o" se refiere a un elemento individual de los elementos alternativos señalados o una combinación de dos o más elementos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la frase "actividad de tioesterasa o actividad de acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso" se refiere a actividad de tioesterasa, actividad de acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso, o una combinación tanto de la actividad de acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso y actividad de tioesterasa. A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual corresponde la descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente descripción, se describen más adelante los métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se propone que sean limitantes. Otras características de la descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones. Números de Acceso: Los números de acceso a todo lo largo de esta descripción se derivan de la base de datos NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information) mantenida por el Instituto Nacional de Salud, Estados Unidos de América. Los números de acceso son como se proporcionaron en la base de datos el 27 de Marzo de 2007. Números de Clasificación de Enzima (EC) : Los números EC proporcionados a todo lo largo de esta descripción se derivan de la base de datos de ligandos KEGG, mantenida por la Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomics, patrocinada en parte por la universidad de Tokio, los números EC son como se proporcionaron en la base de datos el 27 de Marzo de 2007. Atenuar: Para disminuir el impacto, actividad o resistencia de algo. En un ejemplo, la sensibilidad de una enzima particular para retroalimentar inhibición o la inhibición provocada por una composición que no es un producto o reactivo (retroalimentación no especifica de la ruta) se disminuye tal que no se impacte la actividad de la enzima por la presencia de un compuesto. Por ejemplo, el gen fabH y su secuencia correspondiente de aminoácidos son sensibles a la temperatura y se pueden alterar para disminuir la sensibilidad a fluctuaciones de temperatura. La atenuación del gen fabH se puede usar cuando se desean aminoácidos ramificados. En otro ejemplo, una enzima que se ha alterado para ser menos activa se puede referir como atenuada. Se puede usar una supresión funcional de una enzima para atenuar una enzima. Una supresión funcional es una mutación, supresión parcial o completa, inserción, u otra variación hecha a una secuencia génica o una secuencia que controla la transcripción de una secuencia génica, que reduce o inhibe la producción del producto génico, o vuelve no funcional al producto génico (es decir, la mutación descrita en la presente para el gen plsB) . Por ejemplo, la supresión funcional de fabR en E. coli reduce la represión de la ruta biosintética de ácidos grasos y permite que E. coli produzca más ácidos grasos insaturados (UFA) . En algunos casos, se describe una supresión funcional como una mutación de supresión. Un experto en la técnica apreciará que hay muchos métodos para atenuar la actividad de una enzima. Por ejemplo, se puede lograr atenuación al introducir cambios de la secuencia de aminoácidos mediante alteración de la secuencia de ácido nucleico, al colocar el gen bajo el control de un promotor menos activo, al expresar ARN de interferencia, ribozimas o secuencias anti-sentido que seleccionan como objetivo al gen de interés o a través de cualquier otra técnica conocida. Fuente de Carbono: Se refiere en general a una sustancia o compuesto adecuado para ser usado como una fuente de carbono para el crecimiento de células procarióticas o eucarióticas o eucarióticas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en varias formas, incluyendo, pero no limitado a polímeros, carbohidratos, ácidos, alcoholes, aldehidos, acetonas, aminoácidos, péptidos, etcétera. Estos incluyen, por ejemplo, varios monosacáridos tal como glucosa, oligasacáridos, polisacáridos, material celulósico, xilosa, y arabinosa, disacáridos, tal como sacarosa, ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato, acetato, etanol, etcétera, o mezcla de los mismos. La fuente de carbono puede ser adicionalmente un producto de fotosíntesis, incluyen, pero no limitado a glucosa. ADNc (ADN complementario) : Una pieza de ADN que carece de segmentos internos no codificantes (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. Se puede sintetizar el ADNc por transcripción inversa a partir del ARN mensajero extraído de las células. Supresión: La remoción de uno o más nucleótidos a partir de una molécula de ácido nucleico o uno o más aminoácidos a partir de una proteína, las regiones en cualquier lado que se unen conjuntamente. Detectable: Capaz de tener una existencia o presencia determinada. Por ejemplo, la producción de un producto a partir de un reactivo, por ejemplo, la producción de ácidos grasos C18, es detectable usando el método proporcionado en el Ejemplo 11 posterior. ADN: Ácido desoxirribonucleótido . ADN es un polímero de cadena larga que incluye el material genético de la mayoría de los organismos vivos (algunos virus tienen genes que incluyen ácido ribonucleico, ARN) . Las unidades repetitivas en los polímeros de ADN son cuatro diferentes nucleótidos, cada uno de los cuales incluye una de las cuatro bases, adenina, guanina, citosina y timina unidas un azúcar de desoxirribosa a la cual se une un grupo fosfato. Los tripletes de nucleótidos, referidos como codones, en las moléculas de ADN, codifican para el aminoácido en un péptido. El término codón también se usa para las secuencias correspondientes (y complementarias) de tres nucleótidos en el ARNm en el cual se transcribe la secuencia de ADN. Endógeno: Como se usa en la presente con referencia a una molécula de ácido nucleico y una célula o microorganismo particular se refiere a una secuencia de ácido nucleico, o péptido, que está en la célula y no se introdujo en la célula usando técnicas de ingeniería recombinante . Por ejemplo, un gen que se expresó en la célula cuando la célula se aisló originalmente de la naturaleza. Un gen aún se considera endógeno si las secuencias de control, tal como secuencias promotoras o intensificadoras que activan la transcripción o traducción se han alterado a través de técnicas recombinantes . Exógeno : Como se usa en la presente con referencia a una molécula de ácido nucleico de una célula particular se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que no se origine de esa célula particular como se encuentra en la naturaleza. De esta manera, una molécula de ácido nucleico que no se presenta de manera natural se considera que es exógena a una célula una vez introducida en la célula. Una molécula de ácido nucleico que se presenta de manera natural también puede ser exógena a una célula particular. Por ejemplo, una secuencia codificante completa aislada de la célula X es un ácido nucleico exógeno con respecto a la célula Y una vez que se introduce la secuencia codificante en la célula Y, aún si X e Y son el mismo tipo de célula. Expresión: El proceso por el cual se convierte la información codificada de un gen en las estructuras y funciones de la célula, tal como una proteina, ARN de transferencia, o ARN ribosómico. Los genes expresados incluyen aquéllos que se transcriben en ARNm y luego se traducen en la proteina y aquéllos que se transcriben en el ARN pero no se traducen en la proteina (por ejemplo, ARN de transferencia y ribosómicos ) Ester Graso: Incluye cualquier éster elaborado a partir de un ácido graso. Las cadenas de carbono en los ácidos grasos pueden contener cualquier combinación de las modificaciones descritas en la presente. Por ejemplo, la cadena de carbono puede contener uno o más puntos de instauración, o uno o más puntos de ramificación, incluyendo ramificación cíclica y se pueden modificar para que sean cortas o largas. Se puede usar cualquier alcohol para formar ésteres de ácidos grasos, por ejemplo, alcoholes derivados de la ruta biosintética de ácidos grasos, alcoholes producidos por el hospedador de producción a través de las rutas biosintéticas no de ácidos grasoso, y alcoholes que se suministran en el caldo de fermentación. Derivados de Ácido Graso: Incluyen productos elaborados en parte a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos del organismo hospedador. La ruta biosintética de ácidos grasos incluye enzimas de ácido graso-sintasa que se puede modificar como se describe en la presente para producir derivados de ácidos grasos y en algunos ejemplos se pueden expresar con enzimas adicionales para producir derivados de ácidos grasos que tienen características deseadas de cadenas de carbonos. Los derivados de ejemplos de ácidos grasos incluyen, por ejemplo, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, ésteres de ácidos grasos que incluyen ceras. Caldo de Fermentación: Incluye cualquier medio que soporte la vida del microorganismo (es decir, un microorganismo que esté activamente metabolizando carbono) . Un medio de fermentación contiene usualmente una fuente de carbono, la fuente de carbono puede ser cualquiera que se pueda utilizar, con o sin enzimas adicionales, por el microorganismo para energía. Hidrocarburo: Incluye compuestos químicos que contienen los elementos carbono (C) e hidrógeno (H) . Todos los hidrocarburos consisten de una estructura de carbono y átomos de nitrógeno unidos a esa estructura. Algunas veces, el término se usa como una forma abreviada del término "hidrocarburo alifático". Esencialmente hay tres tipos de hidrocarburos: (1) hidrocarburos aromáticos, que tienen al menos un anillo aromático; (2) hidrocarburos saturados, también conocidos como alcanos, que carecen de dobles enlaces, triples enlaces o enlaces aromáticos; y (3) hidrocarburos insaturados, que tienen uno o más dobles o triples enlaces entre los átomos de carbono, se dividen en: alquenos, alquinos y dienos. Los hidrocarburos líquidos geológicamente extraídos se refieren como petróleo (literalmente "petróleo") o aceite mineral, en tanto que los hidrocarburos geológicos gaseosos se refieren como gas natural. Todos son fuentes significativas de combustible en materias primas como una materia prima para la producción de productos químicos orgánicos y se encuentran comúnmente en la superficie subyacente de la Tierra usando las herramientas de geología petrolera. Las reservas de petróleo en las rocas sedimentarias son la fuente principal de hidrocarburos para las industrias química y energética. Los hidrocarburos son de importancia económica principal debido a que abarcan los constituyentes de los combustibles fósiles principales (carbón, petróleo, gas natural, etcétera) y biocombustibles , así como plásticos, ceras, solventes y aceites . Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteina, o célula) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en los cuales se presenta de manera natural el componente, tal como otro ADN y ARN cromosómico y extractomosómico, y proteínas. Las moléculas de ácido nucleico y proteínas que se han "aislado" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas por métodos normales de purificación. El término también abarca moléculas de ácido nucleico, y proteínas, preparadas por expresión recombinante en una célula hospedadora así como proteínas y moléculas de ácido nucleico químicamente sintetizadas. En un ejemplo, aislado se refiere a una molécula de ácido nucleico que se presenta de manera natural que no está inmediatamente contigua con ambas de las secuencias con las cuales están inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y una en el extremo 3' en el genoma que se presenta de manera natural del organismo del cual se deriva. Microorganismo: Incluye especies microbianas procarióticas y eucarióticas de los Dominios Archaea, Bacteia y Eucarya, esta última que incluye levadura y hongos filamentosos, protozoarios , algas, y Protista superiores. Los términos "células microbianas" y "microbios" se usan de manera indistinta con el término microorganismo. Molécula de Ácido Nucleico: Abarca moléculas tanto de ARN como de ADN que incluye, sin limitación, ADNc, ADN genómico, y ARNm. Incluye moléculas sintéticas de ácido nucleico, tal como aquellas que se sintetizan de manera química o se producen de manera recombinante . La molécula de ácido nucleico puede ser de doble hebra o de hebra individual. Donde es de hebra individual, la molécula de ácido nucleico puede ser la hebra homosentido o la hebra antisentido. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser circular o lineal. Operablemente Enlazado: Una primera secuencia de ácido nucleico se enlaza de manera operable con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor se enlaza de manera operable a una secuencia codificante si el promotor afecta la trascripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN operablemente enlazadas están contiguas, y donde es necesario para unirse a dos regiones codificantes de proteína, en el mismo marco de lectura. Las configuraciones de genes separados que se transcriben en tándem como un ARN mensajero individual se denotan como operones. Colocando de esta manera a los genes en proximidad cercana, por ejemplo en un vector de plásmido, bajo la regulación transcripcional de un promotor individual, se constituye un operón sintético. ORF (marco de lectura abierto) : Una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican para aminoácidos sin ningún codón de terminación. Usualmente estas secuencias son traducibles en un péptido. Sobre-Expresado: Cuando se hace que un gen se transcriba a una proporción elevada en comparación a la proporción de transcripción endógena para ese gen. En algunos ejemplos, la sobreexpresión incluye adicionalmente una proporción elevada de traducción del gen en comparación a la proporción de traducción endógena para ese gen. Son bien conocidos en la técnica los métodos para probar la sobreexpresión, por ejemplo niveles de ARN transcrito se pueden valorar usando rtPCR y los niveles de proteina se pueden valorar usando análisis en gel de SDS-Page. Purificado: El término purificado no requiere pureza absoluta; más bien, se propone como un término relativo. De esta manera, por ejemplo, una preparación de derivado purificado de ácido graso, tal como una cera, o una preparación de éster de ácido graso, es una en la cual el producto se concentra más que el producto que está en su ambiente dentro de una célula. Por ejemplo, una cera purificada es una que se separa sustancialmente de los componentes celulares (ácidos nucleicos, lipidos, carbohidratos, y otros péptidos) que pueden acompañarlo. En otro ejemplo, una preparación purificada de cera es una en la cual la cera está sustancialmente libre de contaminantes, tal como aquellos que puedan estar presentes después de la fermentación . En un ejemplo, se purifica un éster de ácido graso cuando al menos aproximadamente 50 % en peso de una muestra se compone del éster de ácido graso, por ejemplo cuando al menos aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, o 99 % o más de una muestra se compone del éster de ácido graso. Los ejemplos de métodos que se pueden usar para purificar una cera, alcoholes grasos y ésteres de ácidos grasos, incluyen los métodos descritos en el Ejemplo 11 posterior. Recombinante : Una proteina o molécula de ácido nucleico recombinante es una que tiene una secuencia que no se presenta de manera natural, tiene una secuencia que se elabora por una combinación artificial de dos segmentos de otro modo separados de la secuencia, o ambos. Esta combinación artificial se puede lograr, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas o proteínas de ácido nucleico, tal como técnicas de ingeniería genética. También se usa recombinante para describir moléculas de ácido nucleico que se han manipulado artificialmente, pero contienen las mismas secuencias reguladoras y regiones codificantes que se encuentran en el organismo del cual se aisló el ácido nucleico. Un microorganismo o célula recombinante es uno que contiene una molécula exógena de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante . Liberación: El movimiento de un compuesto desde dentro de una célula (intracelular) hacia fuera de una célula (extracelular) . El movimiento puede ser activo o pasivo. Cuando la liberación es activa se puede facilitar por uno o más péptidos transportadores y en algunos ejemplos puede consumir energía. Cuando la liberación es pasiva, puede ser a través de la difusión a través de la membrana y se puede facilitar por la recolección continua del compuesto deseado a partir del ambiente extracelular, promoviendo de este modo difusión adicional. La liberación de un compuesto también se puede lograr al lisar una célula. Agentes tensoactivos : Sustancias capaces de reducir la tensión superficial de un líquido en el cual se disuelven. Típicamente se componen de un cabezal soluble en agua y un extremo o cadena de hidrocarburo. El gripo soluble en agua es hidrófilo y puede ser ya sea iónico o no iónico, y la cadena de hidrocarburo es hidrófoba. Se usan agentes tensoactivos en una variedad de productos, incluyendo detergentes y limpiadores, y también se usan como auxiliares para textiles, cuerpo y papel, en procesos químicos, en cosméticos y productos farmacéuticos, en la industria de los alimentos y en la agricultura. Además, se pueden usar para ayudar en la extracción y aislamiento de aceites crudos que se encuentra que son difíciles de tener acceso a ambientes o como emulsiones de agua. Hay cuatro tipos de agentes tensoactivos caracterizados por usos variados. Los agentes tensoactivos aniónicos tiene actividad tipo detergente y en general se usan para aplicaciones de limpieza. Los agentes tensoactivos catiónicos contienen hidrocarburos de cadena larga y frecuentemente se usan para tratar proteínas y polímeros sintéticos o son componentes de ablandadores de tejidos y acondicionadores de cabello. Los agentes tensoactivos anfotéricos también contienen hidrocarburos de cadena larga y se usan típicamente en champús. Los agentes tensoactivos no iónicos se usan en general en productos de limpieza. Célula Transformada o Recombinante : Una célula en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico que codifica para acil-CoA-sintasa, por ejemplo por técnicas de biología molecular. La transformación abarca todas las técnicas por las cuales se puede introducir una molécula de ácido nucleico en esta célula, incluyendo, pero no limitado a, transfección con vectores virales, conjugación, trasformación con vectores de plásmidos, e introducción de ADN desnudo por electroporación, lipofección, y aceleración con pistola de partículas. Bajo Condiciones que Permiten la Producción de Producto: cualquier condición de fermentación que permita que un microorganismo produzca un producto deseado, tal como ácidos grasos, hidrocarburos, alcoholes grasos, ceras, o ésteres de ácidos grasos. Usualmente las condiciones de fermentación incluyen intervalos de temperatura, niveles de aeración, y selección de medios, que cuando se combinan permiten que crezca el microorganismo. Los medios de ejemplo incluyen caldos o geles. En general, el medio incluye una fuente de carbono tal como glucosa, fructuosa, celulosa, o similar que se puede metabolizar por el microorganismo directamente, o se pueden usar enzimas en el medio para facilitar la metabolización de la fuente de carbono. Para determinar si las condiciones de cultivo permiten la producción del producto, el microorganismo se puede cultivar durante 24, 36 ó 48, y se puede obtener y analizar una muestra. Por ejemplo, las células en la muestra o el medio en el cual se cultivaron las células se pueden probar para la presencia del producto deseado. Cuando se prueba para la presencia de un producto, se pueden usar ensayos, tal como aquellos proporcionados en los ejemplos posteriores. Vector: Molécula de ácido nucleico como se introduce en una célula, produciendo de este modo una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.

Cera: Una variedad de ásteres de ácidos grasos que forman sólidos o sustancias plegables bajo un conjunto identificado de condiciones físicas. Los ésteres de ácidos grasos que se llaman ceras tienen en general cadenas de carbono más largas que los ésteres de ácidos grasos que no son ceras. Por ejemplo, una cera forma en general una sustancial plegable a temperatura ambiente..

I. Producción de Derivados de Ácidos Grasos El organismo hospedador en el que se transforman secuencias exógenas de ADN, puede ser un organismo hospedador modificado, tal como un organismo que se ha modificado para incrementar la producción de acil-ACP o acil-CoA, para reducir el catabolismo de derivados de ácidos grasos y productos intermediarios, o para reducir la inhibición de retroalimentación en puntos específicos en la ruta biosintética . Además de modificar los genes descritos en la presente, se pueden desviar recursos celulares adicionales para producir en exceso ácidos grasos, por ejemplo, se pueden atenuar las frutas de lactato, succinato y/o acetato, y se puede sobreexpresar acetil-CoA-carboxilasa (ACC) . Las modificaciones al hospedador de producción descritas en la presente pueden ser a través de alteraciones genómicas, sistemas extracromosómicos de expresión, o combinaciones de los mismos. En las Figuras 1 y 2 se proporciona una vista general de la ruta.

A. Acetil-CoA - Malonil-CoA a Acil-ACP La ácido graso-sintasa (FAS) es un grupo de péptidos que catalizan el inicio y alargamiento de cadenas de acilo (Marrakchi et al., Biochemical Society, 30 : 1050-1055 , 2002). La proteina portadora de acilo (ACP) junto con las enzimas en la ruta de FAS controlan la longitud, grado de saturación de ramificación de ácidos grasos producidos. Las enzimas que se pueden incluir en FAS incluyen AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, FabI, FabK, FabL, FabM, FabB, y FabF. Dependiendo del producto deseado, se pueden atenuar o sobreexpresar uno o más de estos genes. Por ejemplo, la ruta biosintética de ácidos grasos en el hospedador de producción usa los precursores acetil-CoA y malonil-CoA (Figura 2). E. coli u otros organismos hospedadores manejados para producir en exceso estos componentes pueden servir como el punto de inicio para pasos subsiguientes de ingeniería genética para proporcionar el producto específico de salida (tal como, ásteres de ácidos grasos, hidrocarburos, alcoholes grasos) . Se pueden hacer varias modificaciones diferentes, ya sea en combinación o de manera individual, a la cepa hospedadora para obtener acetil-CoA/malonil-CoA/ácido graso y la producción de derivados de ácidos grasos. Por ejemplo, para incrementar la producción de acetil-CoA, se puede construir un plásmido con pdh, panK, aceEF, (que codifica paras el componente Elp-deshidrogenasa y el componente E2p-dihidrolipoamida-aciltransferasa de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato-deshidrogenasa) , fabH/fabD/fabG/acpP/fabF, y en algunos ejemplos ADN adicional que codifica para graso-acil-CoA-reductasas y aldehido-descarbonilasas, todos bajo el control de un promotor constitutivo, o de otro modo controlable. Los números de acceso de Genbank de ejemplo para estos genes son: pdH (BAB34380, AAC73227, AAC73226) , panK (también conocido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226) , fabH (AAC74175) , fabD (AAC74176) , fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179) . Adicionalmente, fadE, gpsA, IdhA, pflb, adhE, pta , poxB, ackA, y/o ackB se pueden suprimir, o se pueden reducir sus niveles de expresión, en el microorganismo manejado por transformación con plásmidos condicionalmente replicativos y no replicativos que contienen mutaciones nulas o de supresión de los genes correspondientes, o al sustituir las secuencias promotora o intensificadoras . Los números de acceso de Genbank de ejemplo para estos genes son: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356) , y ackB (BAB81430) . Los microorganismos manejados resultantes se pueden cultivar en un ambiente deseado, por ejemplo uno con glicerol limitado (menos de 1 % p/v en el medio de cultivo) . Como tales, estos microorganismos tendrán niveles incrementados de producción de acetil-CoA. Se puede efectuar la sobreproducción de malonil-CoA al modificar el microorganismo como se describe anteriormente, con ADN que codifica para accABCD (acetil-CoA-carboxilasa, por ejemplo, número de acceso AAC73296, EC 6.4.1.2) incluido en el plásmido sintetizado de novo. Se puede lograr la sobreproducción de ácidos grasos al incluir adicionalmente ADN que codifica para lipasa (por ejemplo, números de acceso CAA89087, CAA98876) en el plásmido sinterizado de novo. En algunos ejemplos, la acetil-CoA-carboxilasa (ACC) se sobreexpresa para incrementar la concentración intracelular de la misma por al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, o al menos 10 veces, por ejemplo con relación a los niveles nativos de expresión. Además, se puede usar la mutación D311E de plsB (por ejemplo, número de acceso AAC77011) para remover limitaciones en la combinación de acil-CoA. Además, se puede incluir la sobreexpresion de un gen sfa (supresor de FabA, por ejemplo, número de acceso AAN79592) en el hospedador de producción para incrementar la producción de ácidos grasos monoinsaturados (Rock et al., J. Bacteriology 178:53825381, 1996).

B. Acil-ACP a Ácido Graso Para modificar un hospedador de producción para la producción de una población homogénea de derivados de ácidos grasos, se pueden atenuar o suprimir funcionalmente uno o más genes endógenos y se pueden expresar una o más tioesterasas. Por ejemplo, se pueden producir derivados de ácidos grasos CIO de series al atenuar tioesterasa C18 (por ejemplo, números de acceso AAC73596 o P0ADA1), que usa C18:1-ACP y que expresa tioesterasa CIO (por ejemplo, número de acceso Q39513) , que usa C10-ACP. De esta manera, que da por resultado una población relativamente homogénea de derivados de ácidos grasos que tienen una longitud de cadena de carbono de 10. En otro ejemplo, se pueden producir derivados de ácidos grasos de C14 al atenuar tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos no de C14 y que expresan la tioesterasa, números de acceso Q39473 (que usa C14-ACP) . En aún otro ejemplo, se pueden producir derivados de ácido graso de C12 al expresar tioesterasas que usan C12-ACP (por ejemplo, número de acceso Q41635) y atenuando tioesterasas que producen ácidos grasos no de C12. Se puede verificar la sobreproducción de acetil-CoA, malonil-CoA y ácidos grasos usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo al usar precursores radioactivos, HPLC, y GC-MS subsiguiente a lisis celular.

Tabla I Tioesterasas Número de Organismo Fuente Gen Producto Acceso preferencial producido AAC73596 E. coli tesA sin C18:l secuencia guia Q41635 Umbellularia fatB C12:0 california Q39513 Cuphea hookeriana fatBl C8 : 0- C10:0 AAC49269 Cuphea hookeriana fatB3 C14 : 0 C16:0 Q39473 Cinnamonum fatB C14 : 0 camphorum CAA85388 Arabidopsis fatB [ 141T]* C16: 1 thaliana NP Arabidopsis fath C18:l 189147; thaliana NP 193041 CAC39106 Bradyrhiízobium fatA C18-.1 japonicum ACC72883 Cuphea hookeriana fatA C18:l *Mayer et al., BMC Plant Biology 7:1-11, 2007 C. Ácido Graso a Acil-CoA Se pueden modificar hospedadores de producción usando péptidos conocidos para producir ácidos grasos de varias longitudes. Un método para elaborar ácidos grasos comprende incrementar la expresión de, o expresar formas más activas de, uno o más péptidos de acil-CoA-sintasa (EC 2.3.1.86). Como se usa en la presente acil-CoA-sintasa incluye péptidos en el número de clasificación de enzimas EC 2.3.1.86, así como cualquier otro péptido capaza de de catalizar la conversión de un ácido graso a acil-CoA. Adicionalmente, un experto en la técnica apreciará que algunos péptidos de acil-CoA-sintasa catalizaran otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de acil-CoA-sintasa aceptaran otros sustratos además de los ácidos grasos. Estos péptidos de acil-CoA-sintasa no específicos por lo tanto también se incluyen. Estas públicamente disponibles las secuencias de los péptidos de acil-CoA-sintasa . En la Tabla 11 se proporcionan números de acceso de Genbank de ejemplo.

D. Acil-CoA a Alcohol Graso Se pueden modificar hospedadores de producción usando polipéptidos conocidos para producir alcoholes grasos a partir de acil-CoA. Un método para elaborar alcoholes grasos comprende incrementar la expresión de, o expresar formas más activas de acil-CoA-reductasa (FAR, EC 1.1.1.*) formadora de alcohol graso, o acil-CoA-reductasas (EC 1.2.1.50) y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). Posteriormente, la acil-CoA-reductasa (FAR, EC 1.1.1.*) formadora de alcohol graso, acil-CoA-reductasas (EC 1.2.1.50) y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) se refieren colectivamente como péptidos formadores de alcoholes grasos. En algunos ejemplos los tres genes formadores de alcoholes grasos se pueden sobreexpresar en un hospedador de producción, y en aún otros ejemplos se pueden sobreexpresar uno o más de los genes formadores de alcoholes grasos . Como se usa en la presente, péptidos formadores de alcoholes grasos incluyen péptidos en los números de clasificación de enzimas EC 1.1.1.*, 1.2.1.50, y 1.1.1.1, asi como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de acil-CoA a alcohol graso. Adicionalmente, un experto en la técnica apreciará que algunos péptidos formadores de alcoholes grasos catalizaran otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de acil-CoA-reductasa aceptaran otros sustratos además de ácidos grasos. Por lo tanto también se incluyen estos péptidos no específicos. Esta públicamente disponible las secuencias de péptidos formadores de alcoholes grasos. Se proporcionan en la Tabla 11 Números de Acceso de GenBank de ejemplo.

Los alcoholes grasos también se pueden describir como agentes tensoactivos basado en hidrocarburo. Para la producción del agente tensioactivo, el microorganismo se modifica de modo que produce un agente tensioactivo a partir de una fuente renovable de carbono. Este microorganismo incluye una primeras secuencia exógena de ADN que codifica para una proteina capaz de convertir un ácido graso a un aldehido graso y una segunda secuencia de ADN exógena que codifica para una proteina capaz de convertir un aldehido graso a un alcohol. En algunos ejemplos, la primera secuencia exógena de ADN codifica para una ácido graso-reductasa . En una modalidad, la segunda secuencia exógena de ADN codifica para aldehido-reductasa microsómica de mamífero o aldehído-deshidrogenasa de cadena larga. En un ejemplo adicional, la primera y- segunda secuencias exógenas de ADN son de un complejo multienzimático a partir de Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins , Acinobacter sp cepa M-l , o Candida lipolytica. En una modalidad, la primera y segunda secuencias heterologas de ADN son de un complejo multienzimático de Acinobacter sp cepa M-l o Candida lipolytica. Las fuentes adicionales de secuencias heterologas de ADN que codifican para ácido graso a proteínas convertidoras de alcohol de cadena larga se pueden usar en la producción de agentes tensoactivos que incluyen, pero no se limitan a, Mortierella alpina (ATCC 32222) , Crytococcus curvatus , (también referido como Apiotricum curvatura) , Alcanivorax jadensis (T9T = DSM 12718 = ATCC 700854), Acinetobacter sp. H01-N, (ATCC 14987) y Rhodococcus opacus (PD630 DSMZ 44193) . En un ejemplo, el derivado de ácido graso es un producto de agente tensioactivo saturado e insaturado que tiene un contenido de átomos de carbono limitado a entre 6 y 36 átomos de carbono. En otro ejemplo, el producto de agente tensioactivo tiene un contenido de átomos de carbono limitado a entre 24 y 32 átomos de carbono. Los hospedadores apropiados para producir agentes tensoactivos pueden ser ya sea microorganismos eucarióticos y procarióticos . Los hospedadores de ejemplo incluyen Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins , Acinobacter sp cepa MM-1, Arabidopsis thalania , o Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, y E. coli manejados para expresar acetil-CoA-carboxilasa . Los hospedadores que demuestran una capacidad innata para sintetizar altos niveles de precursores de agente tensioactivo en la forma de lipidos y aceites, tal como Rhodococcus opacus, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins E. coli manejados para expresar acetil-CoA-carboxilasa y otras bacterias oleaginosas, levadura, y hongos también se pueden usar.

E. Alcoholes Grasos a Esteres Grasos Se pueden modificar hospedadores de producción usando polipéptidos conocidos para producir ásteres grasos de varias longitudes. Un método para elaborar ésteres grasos incluye incrementar la expresión de, o expresar formas más activas de, uno o más péptidos de alcohol-O-acetiltransferasa (EC 2.3.1.84). Estos péptidos catalizan la reacción de acetil-CoA y un alcohol para formar CoA y un éster acético. En algunos ejemplos, los péptidos de alcohol-O-acetiltransferasa se pueden expresar en unión con péptidos de tioesterasa seleccionados, péptidos de FAS y péptidos formadores de alcoholes grasos, permitiendo de esta manera que se controle la longitud de la cadena de carbono, la saturación y el grado de ramificación. En algunos casos, el operón bkd se puede coexpresar para permitir que se produzcan precursores ramificados de ácidos graso. Como se usa en la presente, los péptidos de alcohol- O-acetiltransferasa incluyen péptidos en el número de clasificación de enzimas EC 2.3.1.84, asi como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de acetil-CoA y un alcohol para formar CoA y un éster acético. Adicionalmente, un experto en la técnica apreciará que los péptidos de alcohol-O-acetiltransferasa catalizarán también otras reacciones por ejemplo algunos péptidos de alcohol-O-acetiltransferasa aceptarán otros sustratos además de los alcoholes grasos o tioéster de acetil-CoA, es decir, tal como otros alcoholes y otros tioésteres de acil-CoA. Estos péptidos de alcohol-O- acetiltransferasa de especificidad divergente o no específicos por lo tanto también se incluyen. Están públicamente disponibles las secuencias de los péptidos de alcohol-O-acetiltransferasa . En la Tabla 11 se proporcionan los números de Acceso de GenBank de ejemplo. Son bien conocidos en la técnica los ensayos para caracterizar la actividad de los péptidos particulares de alcohol-O-acetiltransferasa . También se pueden crear O-acetiltransferasas y O-aciltransferasas modificadas que tengan nuevas actividades y especificidades para el grupo acilo donador o la porción de alcohol, aceptadora. Se pueden generar enzimas modificadas a través de planteamientos racionales y evolutivos bien documentados en la técnica .

F. Acil-CoA a Esteres Grasos (biodieseles y ceras) Se pueden modificar hospedadores de producción usando péptidos conocidos para producir ésteres de ácidos grasos a partir de acil-CoA y alcoholes. En algunos ejemplos, los alcoholes se proporcionan en el medio de fermentación y otros ejemplos, y el hospedador de producción puede proporcionar el alcohol como se describe en la presente. Un experto en la técnica apreciará que estructuralmente, los ésteres de ácidos grasos tienen un lado A y un lado B. Como se describe en la presente, el lado A del éster se usa para describir la cadena de carbonos contribuida por el alcohol, y el lado B del éster se usa para describir la cadena de carbonos contribuida por el acil-CoA. Cualquier cadena puede ser saturada o insaturada, ramificada o no ramificada. El hospedador de producción se puede modificar para producir alcoholes grasos o alcoholes de cadena corta. El hospedador de producción también se puede modificar para producir moléculas de acil-CoA especificas. Como se usa en la presente, los ésteres de ácidos grasos son ésteres derivados de un acil graso-tioéster y un alcohol, en donde el lado A y el lado B del éster puede variar en longitud de manera independiente. En general, el lado A del éster es al menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 carbonos de longitud, en tanto que el lado B del éster es de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 carbonos de longitud. El lado A y. el lado B pueden ser de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado. La producción de ésteres grasos, incluyendo ceras de acil-CoA y alcoholes se puede modificar usando polipéptidos conocidos. Como se usa en la presente, las ceras son ésteres de ácidos grasos de cadena larga, en donde el lado A y el lado B del éster pueden variar en longitud y de manera independiente. En general, el lado A del éster es al menos de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 carbonos de longitud. De manera similar, el lado B del éster es al menos de 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ó 26 carbonos de longitud. El lado A y el lado B pueden estar mono-, di- y tri-insaturados . La producción de ásteres grasos, incluyendo ceras de acil-CoA y alcoholes se puede modificar usando polipéptidos conocidos. Un método para elaborar ésteres grasos incluye incrementar la expresión de o expresar formas más activas de una o más cera-sintasas (EC 2.3.1.75) . Como se usa en la presente, las ceras-sintasas incluyen péptidos en el número de clasificación de enzimas EC 2.3.1.75, asi como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de un acil-tioéster a ésteres grasos. Adicionalmente, un experto en la técnica apreciará que algunos péptidos de cera-sintasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de cera-sintasa aceptarán acil-CoA de cadena corta y alcoholes de cadena corta para producir ésteres grasos. Estas cera-sintasas no especificas por lo tanto también se incluyen. Están públicamente disponibles las secuencias de péptidos de cera-sintasas. En la Tabla 11 se proporcionan Números de Acceso de GenBank de ejemplo. Los métodos para identificar la actividad de cera-sintasa se proporcionan en la patente de los Estados Unidos número 7,118,896 que se incorpora en la presente como referencia. En ejemplos particulares, si el producto deseado es un biocombustible basado en éster graso, el microorganismo se modifica de modo que produce un éster graso generado a partir de una fuente renovable de energía. Este microorganismo incluye una secuencia exógena de ADN que codifica para una éster-sintasa de cera que se expresa para conferir en el microorganismo la capacidad de sintetizar un éster graso saturado, insaturado o ramificado a partir de una fuente renovable de energía. En algunos modalidades, las proteínas de la síntesis de éster de cera incluyen, pero no se limitan a: ácido graso-elongasas , acil-CoA-reductasas , aciltransferasas o sintasas de cera, acil-transferasas grasas, diacilglicerol-aciltransferasas, alcohol-aciltransferasas de cera de acil-CoA, éster-sintasa de cera bifuncional/acil-CoA: diacilglicerol-aciltransferasa seleccionada de un complejo multienzimático a partir de Simmondsia chinensis , Acinetobacter sp. cepa ADP1 (anteriormente Acinetobacter calcoaceticus (ADP1) , Pseudomonas aeruginosa , Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana, o Alkaligenes eutrophus. En una modalidad, las ácido graso-elongasas, las acil-CoA-reductasas o sintasas de cera son de un complejo multienzimático de Alkaligenes eutrophus y otros organismos conocidos en la literatura que producen ésteres de ácidos grasos y de cera. Las fuentes adicionales de ADN heterólogo que codifican para proteínas de síntesis de cera útiles en la producción de ésteres grasos incluyen, pero no se limitan a, Mortierella alpina (por ejemplo ATCC 32222) , Crytococcus curvatus, (también referido como Apiotricum curvatura, Alcanivorax jadensis (por ejemplo, T9T = DSM 12718 = ATCC 700854), Acinetobacter sp. HOl-N, (por ejemplo, ATCC 14987) y Rhodococcus opacus (por ejemplo, PD630, DS Z 44193) . Los métodos descritos en la presente permiten la producción de ésteres grasos de longitud variada. En un ejemplo, el producto de ésteres grasos es un producto de ésteres grasos saturados o insaturados que tiene un contenido de átomo de carbono entre 24 y 46 átomos de carbono. En una modalidad, el producto de ésteres grasos tiene un contenido de átomos de carbono entre 24 y 32 átomos de carbono. En otra modalidad, el producto de ésteres grasos tiene un contenido de carbono de 14 y 20 carbonos. En otra modalidad, el éster graso es el éster metílico de C18:l. En otra modalidad, el éster de ácido graso es el éster etílico de C16:l. En otra modalidad, el éster graso es el éster metílico de C16:l. En otra modalidad, el éster de ácido graso es éster octadecílico de octanol . Los hospedadores útiles para producir ésteres grasos pueden ser microorganismos ya sea eucarióticos o procarióticos . En algunas, modalidades, estos hospedadores incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica , E. coli Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins , Acinobacter sp cepa M-l, Candida lipolytica y otros microorganismos oleaginosos. En un ejemplo, se usa la éster-sintasa de cera de Acinetobacter sp. ADP1 en el locus AA017392 (descrito en Kalscheuer y Steinbuchel, J. Biol. Chem. 278:8075-8082, 2003, incorporada en la presente como referencia). En otro ejemplo, se usa la éster-sintasa de cera de Simmondsia chinensis, en el locus AAD38041. Opcionalmente, se puede usar un exportador de éster de cera como un miembro de la familia de FATP para facilitar la liberación de ceras o ésteres en el ambiente extracelular . Un ejemplo de un exportador de éster de cera que se puede usar es la proteina transportadora de ácidos grasos (de cadena larga) CG7400-PA, isoforma A, de Drosophila melanogaster, en el locus NP_524723.

G. Acil-ACP, Acil-CoA a Hidrocarburo Se conoce que una diversidad de microorganismos produce hidrocarburos, tal como alcanos, olefinas e isoprenoides . Muchos de estos hidrocarburos se derivan de la biosintesis de ácidos grasos. La producción de estos hidrocarburos se puede controlar al controlar los genes asociados con la biosintesis de ácidos grasos en los hospedadores nativos. Por ejemplo, la biosintesis de hidrocarburos en las algas Botryococcus braunii se presenta a través de la descarbonilación de aldehidos grasos. Los aldehidos grasos se producen por la reducción de acil-tioésteres grasos por acil-CoA-reductasa grasa. De esta manera, la estructura de los alcanos finales se puede controlar al modificar B. braunii para expresar genes específicos, tal como tioesterasas , que controlan la longitud de cadena de los ácidos grasos que se canalizan en la biosíntesis de alcanos. La expresión de las enzimas que dan por resultado la biosíntesis de ácidos grasos de cadena ramificada en B. braunii dará por resultado la producción de alcanos de cadena ramificada. La introducción de genes que afectan la producción de la desaturación de ácidos grasos dará por resultado la producción de olefinas. Las combinaciones adicionales de estos genes pueden proporcionar control adicional con respecto a la estructura final de los hidrocarburos producidos. Para producir mayores niveles de hidrocarburos nativos o manejados, los genes comprendidos en la biosíntesis de ácidos grasos y sus precursores o en la degradación a otros productos, se pueden expresar, sobre-expresar, o atenuar. Cada uno de estos planteamientos se puede aplicar a la producción de alcanos en Vibrio furnissi MI y sus homólogos funcionales, que producen alcanos a través de la reducción de alcoholes grasos (ver anteriormente para la biosíntesis y manejo de la producción de alcoholes grasos) . Cada uno de estos planteamientos también se puede aplicar a la producción de las olefinas producidas por muchas cepas de Micrococcus leuteus , Stenotrophomonas maltophilia , Jeogalicoccus sp. (ATCC 8456), y microorganismos relacionados. Estos microorganismos producen olefinas internas de cadena larga que se derivan de la condensación de cabezal a cabezal de precursores de ácidos grasos. El control de la estructura y del nivel de los precursores de ácidos grasos usando los métodos descritos en la presente dará por resultado la formación de olefinas de diferente longitud de cadena, diferente ramificación y diferente nivel de saturación. También se pueden producir hidrocarburos usando óxido/reductasas evolucionadas para la reducción de alcoholes primarios. Se conoce que los alcoholes grasos primarios se usan para producir alcanos en microorganismos tal como Vibrio furnissii MI (Myong-Ok, J. Bacteriol., 187:1426-1429, 2005). Una óxido/reductasa dependiente de NAD(P)H es el catalizador responsable. Se pueden producir oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H sintéticas a través del uso de ingeniería evolutiva y se expresan en hospedadores de producción para producir derivados de ácidos grasos. Un experto en la técnica apreciará que el proceso de "evolucionar" una alcohol graso-reductasa para que tenga la actividad deseada, es bien conocido (Kolkman y Stemmer Wat Biotechnol. 19:423-8, 2001, Ness et al., Adv Protein Chem. 55:261-92, 2000, Minshull y Stemmer Curr Opin Chem Biol. 3:284-90, 1999, Huisman y Gray Curr Opin Biotechnol, Aug; 13:352-8, 2002, y ver solicitud de patente de los Estados Unidos número 2006/0195947). Se genera una biblioteca de oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H por métodos normales, tal como PCR propensa a error, mutagénesis aleatoria específica del sitio, mutagénesis de saturación específica del sitio, o mutagénesis específica dirigida al sitio. Adicionalmente , se puede crear una biblioteca a través de la "transposición" de secuencias que codifican para oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H que se presentan de manera natural. La biblioteca se expresa en un hospedador adecuado, tal como E. coli. Las colonias individuales que expresan un miembro diferente de la biblioteca de óxido/reductasas entonces se analizan para su expresión de una óxido/reductasa que puede catalizar la reducción de un alcohol graso. Por ejemplo, cada célula se puede valorar como una bioconversión de célula entera, un extracto celular, una célula permeabilizada, o una enzima purificada. Las alcohol graso-reductasas se identifican por el monitoreo de la oxidación dependiente de alcohol graso de NAD(P)H de forma espectrofotométrica o fluorométricamente . Se monitoriza la producción de alcanos por GC/MS, TLC, u otros métodos. Una óxido/reductasa identificada de esta manera se usa para producir alcanos, alquenos, e hidrocarburos ramificados relacionados. Esto se logra ya sea in vitro o in vivo. Esto último se logra al expresar el gen de alcohol graso-reductasa evolucionado, en un organismo que .produce alcoholes grasos, tal como aquéllos descritos en la presente. Los alcoholes grasos actúan como sustratos para la alcohol-reductasa que producirá alcanos. También se pueden modificar otras oxidorreductasas para catalizar esta reacción, tal como aquéllas que usan hidrógeno molecular, glutationa, FADH, u otras coenzimas reductivas.

II. Ingeniería Genética de Cepa de Producción para Incrementar Producción de Derivados de Ácidos Grasos Se pueden introducir de manera estable o transiente secuencias heterólogas de ADN comprendidas en una ruta biosintética para la producción de derivados de ácidos grasos, en una célula hospedadora, usando técnicas bien conocidas, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, transfección medida con liposoma, conjugación, traducción y similares. Para transformación estable, una secuencia de ADN puede incluir además un marcador seleccionable, tal como, resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a neomicina, tetraciclina, cloranfenicol , canamicina, genes que complementan deficiencias auxotróficas , y similares. Varias modalidades de esta descripción utilizan un vector de expresión que incluye una secuencia heteróloga de ADN que codifica para una proteína comprendida en una ruta metabólica o biosintética. Los vectores adecuados de expresión incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, tal como vectores de baculovirus, vectores de fagos, tal como vectores de bacteriófagos, plásmidos, fagómidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en virus de vaccinia, poliovirus, adenovirus, virus adeno-asociados , SV40, virus de herpes simplex, y similares) , cromosomas artificiales basados en Pl, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualquier otro vector especifico para hospedadores específicos de interés (tal como E. coli, Pseudomonas pisum y Saccharomyces cerevisiae) . Los vectores útiles de expresión pueden incluir uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas. El gen marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen marcador seleccionable no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina-racemasa para Bacilli. En modalidades alternativas, el gen marcador seleccionable es uno que codifica para dihidrofoliato-reductasa o confiere resistencia a neomicina (para el uso en cultivo de células eucarióticas ) , o uno que confiere resistencia a tetraciclina o ampicilina (para el uso en una célula hospedadora procariótica , tal como E. coli) . La secuencia de ADN que codifica para el producto génico de la ruta biosintética en el vector de expresión se enlaza de manera operable a una secuencia de control de expresión apropiada (promotores, intensificadores , y similares) para dirigir la síntesis del producto génico codificado. Estos promotores se pueden derivar de fuentes microbianas o virales, incluyendo CMV y SV40. Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, se pueden usar cualquiera de un número de elementos de control de trascripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos intensificadores de trascripción, terminadores de trascripción, etc., en el vector de expresión (ver, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Ezymology, 153:516-544, 1987). Los promotores adecuados para el uso en células hospedadoras procarióticas incluyen, pero no se limitan a, promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL del bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico, y lacZ de E. coli, los promotores de alfa-amilasa y sigma-específieos de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla del gen de beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloranfenicol-acetil-transferasa . Los promotores procarióticos se revisan por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987; Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamín Cummins (1987); y Sambrook et al., supra . Los ejemplos no limitantes de promotores eucarióticos adecuados para el uso dentro de un hospedador eucarióticos son de origen viral e incluyen el promotor del gen de metalotioneína I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl . Gen, 1:273, 1982); el promotor TK de virus de herpes (McKnight, Cell 31:355, 1982); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature {Londres) 290:304, 1981); el promotor del virus de sarcoma de Rous; el promotor de citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45:101, 1980); el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston, et al., PNAS (EUA) 79:6971, 1982; Silver et al., PNAS (EUA) 81:5951, 1984); y el promotor de IgG (Orlandi et al., PNAS (EUA) 86:3833, 1989). La célula hospedadora microbiana se puede modificar genéticamente con una secuencia de ADN heterologa que codifica para un producto génico de la ruta biosintética que se enlaza operablemente a un promotor inducible. En la técnica son bien conocidos los promotores inducibles. Los promotores inducibles adecuados incluyen, pero no se limitan a procedimiento que se afectan por proteínas, metabolitos, o productos químicos. Estos incluyen: un promotor del virus de leucemia bovina, un promotor de metalotioneína, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de MRP polIII, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV inmediato-temprano humano) así como aquéllos de los operones trp y lac. En algunos ejemplos, una célula hospedadora genéticamente modificada se modifica genéticamente con una secuencia heteróloga de ADN que codifica para un producto génico de la ruta biosintética que se enlaza de manera operable a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados se conocen en la técnica e incluyen, promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MPSV constitutivo, y un promotor de CMV constitutivo . En algunos ejemplos, una célula hospedadora modificada es una que se modifica genéticamente con una secuencia exógena de ADN que codifica para una proteína individual comprendida en una ruta de biosíntesis. En otras modalidades, una célula hospedadora modificada es una que se modifica genéticamente con secuencias exógenas de ADN que codifican para dos o más proteínas comprendidas en una ruta de biosíntesis, por ejemplo, la primera y segunda enzimas en una ruta biosintética.

Donde la célula hospedadora se modifica genéticamente para expresar dos o más proteínas comprendidas en una ruta biosintética, estas secuencias de ADN pueden estar contenidas cada una en un vector de expresión individual o separada. Cuando estas secuencias de ADN están contenidas en un vector de expresión individual, en algunas modalidades, las secuencias de nucleótidos se enlazarán de manera operable a un elemento de control común (por ejemplo, un promotor) , por ejemplo, el elemento de control común controla la expresión de todas las secuencias de ADN que codifican para la proteína de la ruta biosintética, en el vector de expresión individual. Cuando una célula hospedadora modificada se modifica genéticamente con secuencias heterólogas de ADN que codifican para dos o más proteínas comprendidas en una ruta de biosíntesis, una de las secuencias de ADN se puede enlazar de manera operable a un promotor inducible, y se pueden enlazar operablemente una o más de las secuencias de ADN a un promotor constitutivo . En algunas modalidades, la concentración intracelular (por ejemplo, la concentración del intermediario en la célula hospedadora genéticamente modificada) del intermediario de la ruta biosintética se puede incrementar para reforzar adicionalmente el rendimiento del producto final. Se puede incrementar de varias maneras la concentración intracelular del intermediario, incluyendo, pero no limitado a, incremento de la concentración en el medio de cultivo de un sustrato para una ruta biosintética; incremento de la actividad catalítica de una enzima que es activa en la ruta biosintética; incremento de la cantidad intracelular de un sustrato (por ejemplo, un sustrato primario) para una enzima que es activa en la ruta biosintética; y similares. En algunos ejemplos, el derivado de ácido graso o intermediario se produce en el citoplasma de la célula. La concentración citoplásmica se puede incrementar de varias maneras, incluyendo, pero no limitado a, unión del ácido graso a la coenzima A para formar un tioéster de acil-CoA. Adicionalmente, la concentración de los acil-CoA se puede incrementar al incrementar la biosíntesis de CoA en la célula, tal como al sobre-expresar genes asociados con la biosíntesis de pantotenato (panD) o al suprimir los genes asociados con la biosíntesis de glutationa (glutationa-sintasa) .

III. Características de la Cadena de Carbonos Usando las, enseñanzas proporcionadas en la presente, se puede producir una variedad de productos. Estos productos incluyen hidrocarburos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, y ceras. Algunos de estos productos son útiles como biocombustibles y productos químicos de especialidad. Estos productos se pueden diseñar y producir en microorganismos. Los productos se pueden producir tal que contienen puntos de ramificación, niveles de saturación, y longitudes de cadena de carbonos, haciendo de esta manera a estos productos materiales deseables de inicio para el uso en muchas aplicaciones (la Tabla 11 proporciona una descripción de las varias enzimas que se pueden usar solas o en combinación para elaborar varios derivados de ácidos grasos) . En otros ejemplos, la expresión de genes exógenos de FAS que se originan de diferentes especies o variantes modificadas se puede introducir en la célula hospedadora para dar por resultado la biosintesis de metabolitos de ácidos grasos estructuralmente diferentes (en longitud, ramificación, grado de instauración, etc.) como aquélla del hospedador nativo. Estos productos génicos heterologos también se pueden elegir o modificar de modo que no se afecten por los mecanismos regulatorios complejos naturales en la célula hospedadora, y por lo tanto, funcionen de una manera que sea más controlable para la producción del producto comercial deseado. Por ejemplo, las enzimas FAS de Bacillus subtilis , Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia , Rhodococcus , Corynebacteria , Brevibacteria , Mycobacteria, levadura oleaginosa y similares, se pueden expresar en el hospedador de producción. Un experto en la técnica apreciará que cuando se maneja un hospedador de producción para producir un ácido graso a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos que contiene un nivel especifico de instauración, ramificación o longitud de cadena de carbonos, el ácido graso manejado resultante se puede usar en la producción de derivados de ácidos grasos. Por lo tanto, los derivados de ácidos grasos generados a partir del hospedador de producción pueden presentar las características del ácido graso manejado. Por ejemplo, un hospedador de producción se puede modificar para elaborar ácidos grasos de cadena corta, ramificados, y luego usar las enseñanzas proporcionadas en la presente con relación a la producción de alcoholes grasos (es decir, incluyendo enzimas formadoras de alcohol tal como FAR) el hospedador de producción produce alcoholes grasos de cadena corta, ramificados. De manera similar, se puede producir un hidrocarburo al modificar un hospedador de producción para producir un ácido graso que tiene un nivel definido de ramificación, insaturación, y/o longitud de cadena de carbonos, produciendo de este modo una población homogénea de hidrocarburos. Además, cuando se desea un alcohol insaturado, éster de ácido graso o hidrocarburo, la ruta biosintética de ácidos grasos se puede modificar para producir bajos niveles de ácidos grasos saturados y una desaturasa adicional se puede expresar para disminuir la producción de productos saturados.

A. Saturación Se pueden modificar hospedadores de producción para producir ácidos grasos insaturados al modificar el hospedador de producción para sobre-expresar fabB, o al cultivar el hospedador de producción a bajas temperaturas (por ejemplo, menos de 37°C). Este FabB tiene preferencia a cis-d3-decenoil-ACP y da por resultado producción de ácidos grasos insaturados en E. coli. La sobre-expresión de FabB dio por resultado la producción de un porcentaje significativo de ácidos grasos insaturados (de Mendoza et al., J. Biol . Chem., 258:2098-101, 1983). Estos ácidos grasos insaturados entonces se pueden usar como compuestos intermediarios en hospedadores de producción que se manejan para producir derivados de ácidos grasos, tal como alcoholes grasos, ésteres, ceras, olefinas, alcanos, y similares. Un experto en la técnica apreciará que al atenuar fabA, o al sobre-expresar FabB y al expresar tioesterasas especificas (descritas anteriormente) , se pueden producir derivados de ácidos grasos insaturados que tienen una longitud deseada de la cadena de carbonos. De manera alternativa, el represor de la biosintesis de ácidos grasos, FabR (acceso Genbank NP_418398), se puede suprimir, lo que dará por. resultado también producción incrementada de ácidos grasos insaturados en E. coli (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277: pp. 15558, 2002). El incremento adicional en los ácidos grasos insaturados se puede lograr por la sobre-expresión de FabM (trans-2, cis-3-decenoil-ACP-isomerasa, acceso Genbank DAA05501) y expresión controlada de FabK ( trans-2-enoil-ACP- reductasa II, acceso Genbank NP_357969) de Streptococcus pneumoniae (Marrakchi et al., J. Biol. Chem. 277:44809, 2002), en tanto que se suprime Fab I de E. coli ( trans-2-enoil-ACP-reductasa, acceso Genbank NP_415804). Adicionalmente, para incrementar el porcentaje de ésteres de ácidos grasos insaturados, el microorganismo también puede tener fabB (que codifica para ß-cetoacil-ACP-sintasa I, accesos: BAA16180, EC : 2.3.1.41 ) , Sfa (que codifica para un supresor de fabA, acceso: AAC44390) y gnsA y gnsB (ambos que codifican para supresores mutantes nulos de secG, a.k.a., proteínas de choque en frío, acceso: ABD18647.1, AAC74076.A) sobre-expresados. En algunos ejemplos, el gen fabF endógeno se puede atenuar, incrementando de esta manera el porcentaje de palmitoleato (C16:l) producido.

B. Ramificación Incluyendo Porciones Cíclicas Se pueden producir derivados de ácidos grasos que contienen puntos de ramificación, porciones cíclicas y combinaciones de los mismos, usando las enseñanzas proporcionadas en la presente. Se pueden modificar microorganismos que producen de manera natural ácidos grasos rectos (sFA) para producir ácidos grasos de cadena ramificada (brFA) al expresar una o más secuencias exógenas de ácido nucleico. Por ejemplo, E. coli produce de manera natural ácidos grasos rectos (sFA) . Para modificar E. coli para producir brFA, se pueden introducir varios genes y expresar para que proporcionen precursores ramificados (operon bkd) y permitir el inicio de la biosintesis de ácidos grasos a partir de precursores ramificados (fabH) . Adicionalmente, el organismo puede expresarse genes para el alargamiento de brFA (por ejemplo ACP, FabF) y/o al suprimir los genes de E. coli correspondientes que conducen normalmente a los sFA y competirán con los genes introducidos (por ejemplo FabH, FabF) . Los acil-CoA ramificados, 2-metil-buturil-CoA, isovaleril-CoA e isobuturil-CoA son los precursores de brFA. En la mayoría de los microorganismos que contienen brFA éstos se sintetizan en dos pasos (descritos en detalle más adelante) a partir de aminoácidos ramificados (isoleucina, leucina y valina) (Kadena, Microbiol. Rev. 55: pp. 288, 1991) . Para modificar un microorganismo para que produzca brFA, o para sobreproducir los brFA, se puede modificar la expresión o sobre-expresión de una o más de las encimas en estos dos pasos. Por ejemplo, en algunos casos, en los periodos de producción puede tener una encima endógena que puede lograr un paso y por lo tanto, sólo encimas comprendidas en el segundo paso necesarias para que se expresen de manera recombinante . El primer paso en la formación de ácidos grasos ramificados es la producción de los correspondientes a-ceto- ácidos por una aminoácido-aminotransferasa de cadena ramificada. La E. coli tiene esta encima IlvE (EC 2.6.1.42; Genbank acceso YP_026247) . En algunos ejemplos, una aminoácido-aminotransferasa de cadena ramificada heterologa no se puede expresar. Sin embargo, IlvE de E. coli o cualquier otra aminoácido-aminotransferasa de cadena ramificada, por ejemplo ilvE de Lactococcus lactis (Genbank acceso AAF34406) , ilvE de Pseudomonas putida (Genbank acceso NP_745648) o ilvE de Streptomyces coelicolor (Genbank acceso NP_629657) se puede sobre-expresar en un microorganismo hospedador, si la reacción de aminotransferasa resulta ser limitante de la velocidad en la biosintesis de los brFA en el organismo hospedador elegido para la producción de derivados de ácidos grasos. El segundo paso, la descarboxilación oxidativa de los -cetoácidos al correspondiente acil-CoA de cadena ramificada, se cataliza por un complejo de a-cetoácido-deshidrogenasa de cadena ramificada (bkd; EC 1.2.4.4.) (Denoya et al. J. Bacteriol. 177: pp. 3504, 1995), que consiste de las subunidades Ela/ß (descarboxilasa) , E2 (dihidrolipoil-transacilasa) y E3 (dihidrolipoil deshidrogenada) y son similares a los complejos de piruvato y -cetoglutarato-deshidrogenasa . La Tabla 2 muestra los genes bkd potenciales de varios microorganismos, que se pueden expresar en un periodo de producción para proporcionar precursores de acil-CoA de cadena ramificada. Básicamente, cada microorganismo que posee los brFA y/o crece en aminoácidos de cadena ramificada se puede usar como una fuente para aislar los genes bkd para la expresión en hospedadores de producción tal como por ejemplo, E. coli. Adicionalmente , E. coli tiene el componente E3 (como parte de su complejo de piruvato-deshidrogenasa; lpd, EC 1.8.1.4, Genbank acceso NP_414658), por lo tanto puede ser suficiente para expresar sólo los genes El a/ß y E2 bkd.

Tabla 2 Genes bkd de microorganismos seleccionados Organismo Gen Acceso de Genbank número Streptomyces coelicolor bkdAl (Ela) NP_628006 bkdBl (?2ß) NP_628005. bkdCl (E2) NP_628004 Streptomyces coelicolor bkdñ2 (Ela) NP_733618 bkdB2 (El ) NP_628019 bkdC2 (E2) NP_628018 Streptomyces avermitilis bkdA (Ela) BAC72074 bkdB (Elb) BAC72075 bkdC (E2) BAC72076 Streptomyces avermitilis bkdF (Ela) BAC72088 bkdG <?2ß) BAC72089 bkdH (E2) BAC72090 Organismo Gen Acceso de Genbank número Bacillus subtilis bkdñA (Ela) NP_390288 bkdAB (El ) NP_390288 bkdB (E2) NP_390288 Pseudomonas putida bkdAl (Ela) AAA65614 bkdñ2 (El ) AAA65615 bkdC (E2) AAA65617 En otro ejemplo, se puede elaborar isobuturil-CoA en un hospedador de producción, por ejemplo en E. coli a través de la co-expresión de una crotonil-CoA-reductasa (Ccr, EC 1.1.1.9) e isobuturil-CoA-mutasa (subunidad grande IcmA, EC 5.4.99.2; subunidad pequeña IcmB, EC 5.4.99.13) (Han y Reynolds J. Bacteriol. 179: pp. 5157, 1997) . El crotonil-CoA es un intermediario en la biosintesis de ácidos grasos en E. coli y otros microorganismos. Los ejemplos de los genes ccr e icm de microorganismos seleccionados se dan en la Tabla 3.

Tabla 3 Genes Ccr e icm de Microorganismos Seleccionados Organismo Gen Acceso Genbank No.

Streptomyces coelicolor ccr NP_630556 icmA NP_629554 icmB NP_630904 Organismo Gen Acceso Genbank No.

Streptomyces cinnamonensis ccr AAD53915 icmA AAC08713 icmB AJ246005 Además de la expresión de los genes de bkd (ver anteriormente) , el inicio de la biosintesis brFA utiliza ß-cetoacil-acil-proteina portadora-sintasa III (FabH, EC 2.3.1.41) con especificidad para acil-CoA de cadena ramificada (Li et al. J. Bacteriol. 187:pp. 3795, 2005). Los ejemplos de estos FabH se listan en la Tabla 4. Los genes FabH están comprendidos en la biosintesis de ácidos grasos de cualquier microorganismo que contiene bfFA se pueden expresar en un hospedador de producción. Las enzimas Bkd y FabH de los hospedadores de producción que no elaboran de manera natural brFA no pueden soportar la producción de brFA y por lo tanto, se pueden expresar de manera recombinante Bkd y FabH. De manera similar, el nivel endógeno de la producción de Bkd y FabH no puede ser suficiente para producir brFA, por lo tanto, se pueden sobre-expresar. Adicionalmente, otros componentes de la maquinaria de biosintesis de ácidos grasos se pueden expresar tal como proteínas portadoras de acilo (ACP) y candidatos de ß-cetoacil-acil-proteína portadora-sintasa II como proteínas portadoras de acilo (ACP) y ß-cetoacil-acil-proteína portadora-sintasa II {fabF, EC 2.3.1.41) (candidatos se enlistan en Tabla 4). Además de expresar estos genes, algunos genes en la ruta endógena de biosíntesis de ácidos grasos se pueden atenuar en el hospedador de producción. Por ejemplo, en E. coli, los candidatos más probables que interfieren con la biosíntesis de brFA son los genes fabH (Genbank acceso No. NP_415609) y/o genes de fabF (Genbank acceso No. NP_415613) . Como se menciona anteriormente, a través de la combinación de la expresión de genes que soportan la síntesis de brFA y síntesis de alcoholes, se pueden producir alcoholes de cadena ramificada. Por ejemplo, cuando una alcohol-reducatsa tal como Acrl a partir de Acinetobacter baylyi ADPl se co-expresa con un operón bkd, E. coli puede sintetizar isopentanol, y sobre isobutanol o 2-metil-butanol . De manera similar, cuando Acrl se co-expresa con los genes ccr/icm, E. coli puede sintetizar isobutanol. A fin de convertir un hospedador de producción tal como E. coli en un organismo capaz de sintetizar ácidos grasos ?-cíclicos (cyFA) , se necesitan introducir varios genes y expresar para que proporcionen el precursor cíclico, ciclohexilcarbonil-CoA (Cropp et al. Nature Biotech. 18:pp. 980, 2000) . Los genes listados en la Tabla 4 (fabH, ACP y fabF) entonces se pueden expresar para permitir el inicio y alargamiento de ácidos grasoso ?-cíclicos. De manera alternativa, los genes homólogos se pueden aislar de microorganismos que elaboran cyFA y se expresan en E. coli.

Tabla 4 Genes FabH, ACP y fabF de microorganismos Seleccionados con brFA Organismo Gen Acceso Genbank No. Streptomyces coelicolor fabHl NP_ _626634 ACP P_ _626635 fabF NP_ 626636 Streptomyces fabH3 NP_ _823466 avermitilis fabC3 (ACP) P_ _823467 fabF NP_ _823468 Bacillus subtilis fabH_A NP_ _389015 fabH B NP_ _388898 ACP P_ _389474 fabF P_ _389016 Strenotrophomonas SmalDRAFT_ 0818 ZP_ _01643059 maltophilia (FabH) SmalDRAFT_ 0821 ZP_ _01643063 (ACP) SmalDRAFT_ 0822 ZP_ _01643064 (FabF) Organismo Gen Acceso Genbank No. Legionella pneumophila FabH YP_123672 ACP YP_123675 fabF YP_123676 La expresión de los siguientes genes es suficiente para proporcionar ciclohexi lcarboni 1 -CoA en E. coli: ansJ, ansK, ansL, chcA y ansM a partir de la agrupación génica de ansatrienina de Streptomyces collinus (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261:pp. 1999, 1999) o plmJ, plmK, plmL, chcA y plmM a partir de la agrupación génica de foslactomicina B de Streptomyces sp . HK803 (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:pp. 35552, 2003) conjuntamente con el gen chcB (Patton et al., Biochem, 39:pp. 7595, 2000) a partir de S. collinus, S. avermitilis o S. coelicolor (ver Tabla 5 para números de acceso de Genbank) .

Genes para la Síntesis de Ciclohexilcarbonil-CoA Sólo se anota chcA en la entrada Genbank U72144, ansJKLM están de acuerdo con Chen et al. (Eur J. Biochem. 261:pp. 1999, 1999) . Los genes listados en la Tabla 4 {fabH, ACP y fabF) son suficientes para permitir el inicio y alargamiento de ácidos grasos ?-cíclicos, debido a que pueden tener amplia especificidad de sustrato. En el caso que la co-expresión de cualquiera de estos genes con los genes ansJKL /chcAB o pmlJKLM/chcB de la Tabla 5 no produzcan cyFA, se pueden aislar los homólogos de fabH, ACP y/o fabF de microorganismos que elaboran cyFA (por ejemplo al usar cebadores degenerados de PCR o sondas heterólogas de ADN) y se co-expresan. La Tabla 6 lista microorganismos seleccionados que contienen ácidos grasos ?-ciclicos.

Tabla 6 Ejemplos de Microorganismos que Contienen Ácidos Grasos w- Ciclicos * usa cicloheptilcarbonil-CoA y no ciclohexilcarbonil-CoA como precursor para biosintesis de cyFA.

C. Características de Esteres Un experto en la técnica apreciará que un éster incluye un lado A y un lado B. Como se describe en la presente, el lado B se contribuye por un ácido graso producido de la síntesis de novo en el organismo hospedador. En algunos casos, donde el hospedador se maneja adicionalmente para elaborar alcoholes, incluyendo alcoholes grasos, el lado A también se produce por el organismo hospedador. En aún otros ejemplos, el lado A se puede proporcionar en el medio. Como se describe en la presente, al seleccionar los genes deseados de tioesterasa, el lado B, y cuando se están elaborando alcoholes grasos de lado A, se puede diseñar para que tenga ciertas características de la cadena de carbonos. Estas características incluyen puntos de instauración, ramificación, y longitudes deseadas de la cadena de carbono. Los métodos de ejemplo para elaborar ásteres de ácidos grasos de cadena larga, en donde el lado A y B se producen por el hospedador de producción se proporcionan en el Ejemplo 6 posterior. De manera similar, el Ejemplo 5 proporciona métodos para elaborar ésteres de ácidos grasos de cadena media. Cuando tanto el lado A como el lado B se · contribuyen por el hospedador de producción y se producen usando intermediarios de la ruta biosintética de ácidos grasoso tendrán características similares de la cadena de carbonos. Por ejemplo, al menos 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de los ésteres de ácidos grasos producidos tendrán lados A y lados B que varían por 6, 4, ó 2 carbonos de longitud. El lado A y el lado B también presentará niveles similares de ramificación y saturación. Además de producir alcoholes grasos para contribución al lado A, el hospedador puede producir otros alcoholes de cadena corta tal como etanol, propanol, isopropanol, isobutanol y butanol para incorporación en el lado A usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, se puede elaborar butanol para el organismo hospedador. Para crear células productoras de butanol, la cepa LS9001 (descrita en el Ejemplo 1 posterior) se puede modificar adicionalmente para expresar atoB (acetil-CoA acetiltransferasa ) a partir de Escherichia coli K12, ß-hidroxibutiril-CoA deshidrogenada a partir de Butyrivibrio fibrisolvens , crotonasa a partir de Clostridium beijerinckii , butiril-CoA deshidrogenasa a partir de Clostridium beij erinchkii , CoA-acilado aldehido deshidrogenada (ALDH) a partir de Cladosporium fulvum, y adhE que codifica para una aldehido-alcohol-deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum en el vector de expresión pBAD24 bajo el sistema promotor prpBCDE. De manera similar, se puede producir etanol en un hospedador de producción usando los métodos enseñados por Kalscheuer et al., Microbiology 152:2529-2536, 2006, que se incorpora en la presente como referencia. IV. Fermentación La producción y aislamiento de derivados de ácidos grasos se puede mejorar al emplear técnicas especificas de fermentación. Un método para aumentar al máximo la producción en tanto que se reduce a los costos es incrementar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte a los productos de hidrocarburos. Durante los ciclos de vida celular normales, se usa carbono en funciones celulares incluyendo producción de lipidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos, y ácidos nucleicos. La reducción de la cantidad de carbono necesaria para actividades relacionadas al crecimiento puede incrementar la eficiencia de la conversión de la fuente de carbono a el rendimiento. Esto se puede lograr al cultivar primero microorganismos a una densidad deseada, tal como una densidad lograda en el pico de la fase logarítmica del crecimiento. En este punto, se pueden implementar genes de verificación de replicación para determinar el crecimiento de las células. Específicamente, se pueden usar mecanismos de percepción de quorum (revisado en Camilli y Bassler Science 311:1113, 2006 Venturi FEMS Microbio Rev 30:274-291, 2006; y Reading y Sperandio FEMS Microbiol Lett 254:1-11, 2006) para activar genes tal como p53, p21 u otros genes de verificación. Los genes que se pueden activar para detener la replicación y crecimiento celular en E. coli incluyen los genes umuDC, la sobre expresión de los cuales detiene el progreso de la fase estacionaria al crecimiento exponencial (Murli et al., J. of Bact. 182:1127, 2000). UmuC es una ADN-polimerasa que puede llevar a cabo la síntesis trans-lesión sobre lesiones no codificantes, la base mecanística de la mayoría de las mutagénesis UV y químicas. Los productos génicos de umuDC se usan para el proceso de síntesis translesión y también sirven como un punto de verificación de daño de ADN. Un producto génico de umuDC incluye UmuC, UmuD, urauD' , UmuD'2C, UmuD' 2 y UmuD2. De manera simultánea, los genes productores de producto se activarán, reduciendo de este modo al mínimo la necesidad de replicación y rutas de mantenimiento que se van a usar en tanto que se está elaborando el derivado de ácido graso. El porcentaje de carbonos de entrada convertido a productos de hidrocarburos es un activador del costo. Entre más eficiente (es decir entre mayor sea el porcentaje), menos costoso es el proceso. Para fuentes de carbono que contienen oxigeno (es decir, fuentes de glucosa y otras fuentes basadas en carbohidratos), se debe liberar oxigeno en la forma de dióxido de carbono. Por cada dos átomos de oxigeno liberados, también se libera un átomo de carbono que conduce a una eficiencia metabólica teórica máxima de ~34 % (p/p) (para productos derivados de ácidos grasos). Esta cifra, sin embargo, cambia para otros productos de hidrocarburos y fuentes de carbono. Las eficiencias típicas en la literatura son ~<5 %. Los microorganismos manejados que producen productos de hidrocarburos pueden tener más de 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, y 30 % de eficiencia. En un ejemplo, los microorganismos exhibirán una eficiencia de aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %. En otros ejemplos, estos microorganismos exhibirán una eficiencia de aproximadamente 25 % a aproximadamente 30 %, y en otros ejemplos, estos microorganismos exhibirán >30 % de eficiencia. En algunos ejemplos, donde se libera el producto final de la célula, se puede emplear un proceso continúo. En este planteamiento, se puede montar de múltiples maneras un reactor con organismos que produzcan derivados de ácidos grasos. En un ejemplo, se remueve una porción del medio y se deja asentar. Se separan de la capa acuosa los derivados de ácidos grasos, que a su vez, se regresarán a la cámara de fermentación . En un ejemplo, la cámara de fermentación encerrará una fermentación que está sometiéndose a una reducción continúa. En este caso, se creará un ambiente reductivo estable. El equilibrio de electrones se mantendrá por la liberación de dióxido decarbono (en forma gaseosa) . Los esfuerzos para aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H también puede facilitar la estabilización del balance de electrones . La disponibilidad de NADPH intracelular también se puede mejorar al modificar el hospedador de producción para expresar una NADH: NADPH transhidrogenasa . La expresión de una o más NADH: NADPH transhidrogenasa convierte el NADH producido en la glicólisis a NADPH que mejora la producción de derivados de ácidos grasos. Se describe en la presente un sistema para producir y exportar de manera continúa derivados de ácidos grasos de los microorganismos hospedadores recombinantes mediante una proteina de transporte. Muchas proteínas de transporte y de efluvio sirven para excretar una gran variedad de compuestos y se pueden desarrollar para ser selectivos para un tipo particular de derivados de ácidos grasos. De esta manera, en algunas modalidades, una secuencia exógena de ADN que codifica para un transportador de ABC se expresará de manera funcional por el microorganismo hospedador recombinante, de modo que el microorganismo exporte el derivado de ácido graso en el medio de cultivo. En un ejemplo, el transportador de ABC es un transportador de ABC de Caenorhabditis elegans , Arabidopsis thalania, Alkaligenes eutrophus o Rhodococcus erythropolis (locus AAN73268). En otro ejemplo, el transportador de ABC es un transportador de ABC seleccionado de CER5 (locus Atlg51500 o AY734542), AtMRP5, AmiS2 y AtPGPl. En algunos ejemplos, el transportador de ABC es CER5. En aún otro ejemplo, el gen de CER5 es de Arabidopsis (locus Atlg51500, AY734542, At3g21090 y Atlg51460) .. La proteina de transporte, por ejemplo, también puede ser una proteina de efluvio seleccionada de: AcrAB, TolC y AcrEF a partir de E. coli , o tlll618, tlll619 y tll0139 a partir de Thermosynechococcys elongatus BP-1. Además, la proteina de transporte, puede ser, por ejemplo, una proteina de transporte de ácido graso (FATP) seleccionada de Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mycobacterium tuberculosis o Saccharomyces cerevisiae o cualquiera de las FATP de mamífero. Las FATP se pueden resintetizar adicionalmente con las regiones membranosas invertidas a fin de invertir la dirección del flujo de sustrato. De manera específica, las secuencias de aminoácidos que componen los dominios hidrófilos (o dominios de membrana) de la proteína, se pueden invertir en tanto que se mantienen los mismos codones para cada aminoácido particular. La identificación de estas regiones es bien conocida en la técnica . También se pueden elegir hospedadores de producción por su capacidad endógena para liberar derivados de ácidos grasos. La eficiencia de producción de producto y liberación en el caldo de fermentación se puede expresar como una relación de producto intracelular a producto extracelular . En algunos ejemplos la relación puede ser 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, ó 1:5. El hospedador de producción se puede modificar adicionalmente para expresar celulosomas recombinantes , tal como aquéllas descritas en la solicitud PCT número PCT/US2007/003736, que permitirá que el hospedador de producción use material celulósico como una fuente de carbono. Por ejemplo, el hospedador de producción se puede modificar adicionalmente para expresar invertasas (EC 3.2.1.26) de modo que se puede usar sacarosa como una fuente de carbono. De manera similar, el hospedador de producción se puede modificar usando las técnicas descritas en las patentes de los Estados Unidos números 5,000,000, 5,028,539, 5,424,202, 5, 482, 846, y 5, 602, 030 de Ingram et al., de modo que el hospedador de producción pueda asimilar eficientemente el carbono y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono.

IV. Procesamiento de post-Producción Los derivados de ácidos grasos producidos durante la fermentación se pueden separar del medio de fermentación. Se puede usar cualquier técnica conocida para separar los derivados de ácidos grasos del medio acuoso. Un proceso de separación de ejemplo proporcionado en la presente es un proceso de separación de dos fases (bifásico) . Este proceso comprende fermentar los hospedadores de producción genéticamente modificados bajo condiciones suficientes para producir un derivado de ácido graso, permitir que el derivado se recolecte en una fase orgánica y separar la fase orgánica del caldo acuoso de fermentación. Este método se puede practicar tanto en un escenario de fermentación continuo y por lotes . La separación bifásica usa la inmiscibilidad relativa de los derivados de ácidos grasos para facilitar la separación. Inmiscible se refiere a la incapacidad relativa de un compuesto para disolverse en el agua y se define por el coeficiente de división de los compuestos. El coeficiente de división, P, se define como la concentración en equilibrio del compuesto en una fase orgánica (en un sistema bifásico, la fase orgánica usualmente es la fase formada por el derivado de ácido graso durante el proceso de producción, sin embargo, en algunos ejemplos se puede proporcionar una fase orgánica (tal como una capa de octano para facilitar la separación del producto) dividida por la concentración en equilibrio en una fase acuosa (es decir, caldo de fermentación) . Cuando se describe un sistema de dos fases, el P usualmente se analiza en términos de logP. Un compuesto con un logP de 10 se dividirá 10:1 a la fase orgánica, en tanto que un compuesto con logP de 0.1 se dividirá 10:1 a la fase acuosa. Un experto en la técnica apreciará que al elegir un caldo de fermentación y la fase orgánica tal que el derivado de ácido graso que se produce tenga un alto valor de logP, el derivado de ácidos grasos se separará en la fase orgánica, aún a bajas concentraciones en el recipiente de fermentación. Los derivados de ácidos grasos producidos por los métodos descritos en la presente serán relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por lo tanto, el derivado de ácido graso se recolectará en una fase orgánica ya sea de manera intracelular o extracelular . La recolección de los productos en una fase orgánica disminuirá el impacto del derivado de ácido graso en la función celular y permitirá que el hospedador de producción produzca más productos. Señalado de otra manera, la concentración del derivado de ácido graso no tendrá un impacto tan significativo en la célula hospedadora.

Los alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, ceras e hidrocarburos producidos como se describe en la presente permiten la producción de compuestos homogéneos en donde al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % de los alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos y ceras producidas tendrán longitudes de las cadenas de carbonos que varían por menos de 4 carbonos, o menos de 2 carbonos. Estos compuestos también se pueden producir de modo que tienen un grado de saturación relativamente uniforme, por ejemplo al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % de los alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos y ceras estarán mono-, di-, o tri-insaturados. Estos compuestos se pueden usar directamente como combustibles, aditivos de cuidado personal, complementos nutricionales . Estos compuestos también se pueden usar como materia prima para reacciones subsiguientes, por ejemplo, transesterificación, hidrogenación, fraccionamiento catalítico mediante ya sea hidrogenación, pirólisis, o ambos o reacciones de epoxidación para elaborar otros productos.

V. Composiciones de Combustible Los derivados de ácidos grasos descritos en la presente se pueden usar como combustible. Un experto en la técnica apreciará que dependiendo del propósito propuesto del combustible se pueden producir y usar diferentes derivados de ácidos grasos. Por ejemplo, para combustible de automóvil que se propone que se use en climas fríos, puede ser deseable un derivado de ácido graso ramificado y usando las enseñanzas proporcionadas en la presente, se pueden elaborar hidrocarburos ramificados, ásteres de ácidos grasos, y alcoholes. Usando los métodos descritos en la presente, se pueden producir combustibles que comprenden derivados de ácidos grasos relativamente homogéneos que tienen calidades de combustible deseadas. Estos combustibles se pueden caracterizar por características propias de carbonos, su carencia de impurezas en comparación a combustibles derivados de petróleo o biodiesel derivados de triglicéridos, y además, los combustibles basados en derivados de ácidos grasos se pueden combinar con otros combustibles o aditivos de combustibles para producir combustibles que tengan propiedades deseadas.

A. Características Propias de Carbonos Los derivados de ácidos grasos biológicamente producidos representan una nueva materia prima para combustibles, tal como alcoholes, diesel y gasolina. Algunos biocombustibles elaborados usando los derivados de ácidos grasos no se han producido de fuentes renovables y como tales, son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos combustibles se pueden distinguir de combustibles derivados de carbono petroquímico en base a las características propias carbono-isotópicas duales. Adicionalmente, la fuente específica de carbono biosurtido (por ejemplo, glucosa versus glicerol) se puede determinar por la característica propia carbono-isotópica dual (ver, patente de los Estados Unidos número 7,169,588, que se incorpora en la presente como referencia) . Este método distingue de manera útil materiales químicamente idénticos, y aportaciones de carbono en productos por fuente (y posiblemente por año) de crecimiento del componente bioesférico (planta) . Los isótopos, 14C y 13C, tienen información complementaria a este problema. El isótopo de fechado de radiocarbono (1 C) , con su vida media nuclear de 5730 años, permite claramente asignar el carbono espécimen entre materias primas fósiles ("muertas") y bioesféricas ("vivas") [Currie, L. A. "Source Apportionment of Atmospheric Particles, "Characterization of Environmental Partióles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds . , 1 de Vol. I de la IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 3 74]. La suposición básica en el fechado de radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera conduce a la constancia de 14C en organismos vivos. Cuando se trata con una muestra aislada, se puede deducir la edad de una muestra aproximadamente por la relación t=(-5730/0.693) In (A/A . sub . O) (Ecuación 5) donde t = edad, 5730 años es la vida media del radiocarbono, y A y A.sub.O son la actividad especifica de 1C de la muestra y de la norma moderna, respectivamente [Hsieh, Y., Soil Sci. Soc. Am J. , 56, 460, (1992)]. Sin embargo, debido a la prueba nuclear atmosférica desde 1950 y la quema de combustible fósil desde 1850, 1 C ha adquirido una segunda característica de tiempo geoquímica. Su concentración en C02 atmosférico, y por lo tanto en la bioesfera viva, se duplicó aproximadamente en el pico de la prueba nuclear, a mediados de la década de 1960. Puesto que ha regresado gradualmente a la proporción de isótopo de línea base (atmosférico) cosmogónico de estado estable (1 C/12C) de aproximadamente 1.2 x 1012, con una relajación aproximada de "vida media" de 7-10 años. (Esta última vida media no se debe tomar de manera literal; más bien, se debe usar la función de entrada/descomposición nuclear atmosférica detallada para trazar la variación de 14C atmosférico y bioesférico desde el comienzo de la era nuclear) . En este último, la característica de tiempo de 1C bioesférico que mantiene la promesa de fechado anual de carbono bioesférico reciente. Se puede medir 14C por espectrometría de masa en acelerador (AMS) , con resultados dados en unidades de "fracción de carbono moderno" (fM) . Se define fM por Materiales de Referencia Normales (SRM) 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) , conocidos como normas de ácido oxálico HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0.95 veces la relación de isótopos 1 C/12C XOxI (referido a AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera de al pre-revolución industrial corregido por descomposición. Para la bioesfera viviente actual (material vegetal), fM es aproximadamente 1.1. La relación de isótopos de carbono estable (13C/12C) proporciona una ruta complementaria a la discriminación de ruta y designación. La relación 13C/12C en un material biosurtido dado es una consecuencia de la relación 13C/12C en dióxido de carbono atmosférico en el momento en que el dióxido de carbono se fija y también refleja la ruta metabólica precisa. También se presentan variaciones regionales. El petróleo, plantas C3 (de hoja ancha), plantas C.sub.4 (los pastos) , y carbonatos marinos muestran todos diferencias significativas en 13C/12C y valores delta 13C correspondiente. Adicionalmente , la materia de lipido de plantas C3 y C4 analiza diferentemente que los materiales derivados de los componentes de carbohidratos de las mismas plantas como una consecuencia de la ruta metabólica. Dentro de la precisión de medición, 13C muestra grandes variaciones debido a los efectos de fraccionamiento isotópico, lo más significativo de lo cual para la presente invención es el mecanismo fotosintético . La causa principal de diferencias en la relación isótopo de carbono en plantas se asocia cercanamente con diferencias en la ruta del metabolismo de carbono fotosintético en las plantas, particularmente la reacción que se presenta durante la carboxilación primaria, es decir, la fijación inicial de C02 atmosférico. Dos grandes clases de vegetación son aquellas que incorporan el ciclo fotosintético de "C3" (o de Calvin-Benson) y aquéllas que incorporan el ciclo fotosintético de "C4" (o de Hatch-Slack) . Las plantas C3, tal como maderas duras y coniferas, son dominantes en zonas de clima templado. En plantas C3, la fijación de C02 primario y la reacción de carboxilación comprende la enzima ribulosa-1, 5-difosfato-carboxilasa y el primer producto estable es un compuesto de 3 carbonos. Las plantas C4, por otra parte, incluyen plantas tal como pastos tropicales, maíz y caña de azúcar. En plantas C4, una reacción de carboxilación adicional que comprende otra enzima, fosfoenol-piruvato-carboxilasa, es la reacción de carboxilación primaria. El primer compuesto de carbono estable es un ácido de 4 carbonos que se descarboxila de manera subsiguiente. El C02 de esta manera liberado se vuelve a fijar por el ciclo C3. Tanto las plantas C4 como C3 exhiben un intervalo de relaciones isotópicas de 13C/12C, pero los valores típicos son aproximadamente -10 a -14 por mil (C4) y -21 a -26 por mil (C3) [Weber et al., J. Agrie. Food Chem. , 45, 2942 (1997)]. El carbón y el petróleo caen en general en este último intervalo. La escala de medición de 13C se definió originalmente por un ajuste a cero por piedra caliza de belemnita de pee dee (PDB) , donde se dan valores en partes por mil desviaciones de este material. Los valores "A13C", están en partes por mil (por mil) , abreviado %, y se calculan como sigue : tii /12 r r (Ecuación 6) s*c = > CJ x 100% Puesto que se ha agotado el material de referencia de PDB (RM) , se ha desarrollado una serie de RM alternativos en cooperación con IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios internacionales seleccionados de isótopos. Las notaciones de las desviaciones por mil de PDB es A13C . Se hacen mediciones en C02 por espectrometría de masa (IRMS) de relación estable de alta precisión en iones moleculares de masas 44, 45 y 46. Los derivados de ácidos grasos y los biocombustibles , productos químicos y mezclas asociadas de pueden distinguir completamente de sus contrapartes derivadas de petroquímicos en base a 1 C (fM) y la característica propia carbono-isotópica dual, indicando las nuevas composiciones de materia . Los derivados de ácidos grasos descritos en la presente tienen utilidad en la producción de biocombustibles y químicos. Las nuevas composiciones de producto basadas en derivados de ácidos grasos, proporcionadas por la presente invención, se pueden distinguir adicionalmente en base a la característica propia carbono-isotópica dual de estos materiales derivados solos de fuentes petroquímicas. La capacidad para distinguir estos productos es benéfica en el seguimiento de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los combustibles o químicos que comprenden tanto "nuevo" como "viejo" perfiles de isótopos de carbono se pueden distinguir de combustibles y químicos elaborados sólo de "viejos" materiales. Por lo tanto, los presentes materiales se pueden seguir en el comercio en base a su perfil único y para los propósitos de definir competición, y para determinar la vida en anaquel. En algunos ejemplos, se elabora una composición de biocombustible que incluye un derivado de ácido graso que tiene 513C de aproximadamente -10.9 a aproximadamente -15.4, en donde el derivado de ácido graso da cuenta de al menos aproximadamente 85 % de material biosurtido (derivado de un recurso renovable tal como materiales y azúcares celulósicos) en la composición. En otros ejemplos, la composición de biocombustible incluye un derivado de ácido graso que tiene la fórmula X-(CH(R) )nCH3 En donde X representa CH3, -CH2OR1; -C(0)OR2; o - C (O) NR3R4; R es, para cada n, independientemente, ausente, H o alifático inferior; n es un número entero de 8 a 34, tal como de 10 a 24; y R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H y alquilo inferior. Típicamente, cuando R es alifático inferior, R representa una porción de alquilo inferior o alquenilo inferior, ramificada, no ramificada o cíclica. Los grupos R de ejemplo incluyen, sin limitación, metilo, isopropilo, isobutilo, seg-butilo, ciclopentenilo y similares. El derivado de ácido graso se caracteriza adicionalmente como que tiene un 513C de aproximadamente -10.9 a aproximadamente -15.4; y el derivado de ácidos grasos da cuenta de al menos aproximadamente 85 % de material biosurtido en la composición. En algunos ejemplos, el derivado de ácidos grasos en la composición de biocombustible se caracteriza por tener una fracción de carbono moderno ( fM 14C) de al menos aproximadamente 1.003, 1.010, ó 1.5.

B. Derivados de Ácidos Grasos El número de centano (CN) , la viscosidad, el punto de fusión, y el calor de combustión para varios esteres de ácidos grasos se han caracterizado por ejemplo en Knothe, Fuel Processing Technology 86:1059-1070, 2005, que se incorpora en la presente como referencia. Usando las enseñanzas proporcionadas en la presente, se puede modificar un hospedador de producción para producir cualquiera de los ásteres de ácidos grasos descritos en Knothe, Fuel Processing Technology 86: 1059-1070, 2005. Se pueden producir alcoholes (de cadena corta, de cadena larga, ramificados o insaturados) por los hospedadores de producción descritos en la presente. Estos alcoholes se pueden usar como combustibles directamente o se pueden usar para crear un éster, es decir, el lado A de un éster como se describe anteriormente. Este éster solo o en combinación con los otros derivados de ácidos grasos descritos en la presente son útiles como combustibles. De manera similar, los hidrocarburos producidos de los microorganismos descritos en la presente se pueden usar como biocombustibles . Estos combustibles basados en hidrocarburo se pueden diseñar para contener puntos de ramificación, grados definidos de saturación, y longitudes especificas de carbonos. Cuando se usan como biocombustibles solos o en combinación con otros derivados de ácidos grasos, los hidrocarburos se pueden combinar adicionalmente con aditivos u otros combustibles tradicionales (alcoholes, diesel derivado de triglicéricos, y combustibles basados en petróleo) .

C. Impurezas Los derivados de ácidos grasos descritos en la presente son útiles para elaborar biocombustibles. Estos derivados de ácidos grasos se elaboran directamente a partir de ácidos grasos y no del procesamiento químico de triglicéridos . Por consiguiente, los combustibles que comprenden los derivados de ácidos grasos descritos contendrán menos de las impurezas que normalmente se asocian con los biocombustibles derivados de triglicéridos, tal como combustibles derivados de aceites y grasas vegetales. Los biocombustibles de derivados de ácidos grasos crudos descritos en la presente (antes de mezclar el derivado de ácido graso con otros combustibles tal como combustibles tradicionales) contendrán menos catalizador de transesterificación que el diesel petroquímico o el bio-diesel. Por ejemplo, el derivado de ácido graso puede contener menos de aproximadamente 2 %, 1.5 %, 1.0 %, 0.5 %, 0.3 %, 0.1 %, 0.05 %, ó 0 % de un catalizador de transesterificación o una impureza que resulta de un catalizador de transesterificación . Los catalizadores de transesterificación incluyen por ejemplo, catalizadores de hidróxido tal como NaOH, KOH, LiOH, y catalizadores ácidos, tal como catalizadores de ácido mineral y catalizadores de ácido de Lewis. Los catalizadores e impurezas que resultan de catalizadores de transesterificación incluyen, sin limitación, estaño, plomo, mercurio, cadmio, zinc, titanio, circonio, hafnio, boro, aluminio, fósforo, arsénico, antimonio, bismuto, calcio, magnesio, estroncio, uranio, potasio, sodio, litio, y combinaciones de los mismos. De manera similar, los biocombustibles de derivados de ácidos grasos crudos descritos en la presente (antes de mezclar el derivado de ácido graso con otros combustibles tal como diesel petroquimico o biodiesel) contendrán menos glicerol (o glicerina) que los biocombustibles elaborados de triglicéridos . Por ejemplo, el derivado de ácido graso puede contener menos de aproximadamente 2 %, 1.5 %, 1.0 %, .5 %, .3 %, .1 %, .05 %, ó 0 % de glicerol. El biocombustible crudo derivado de derivados de ácidos grasos también contendrá menos alcohol libre (es decir, alcohol que se usa para crear el éster) que el biodiesel elaborado de triglicéridos. Esto es en parte debido a la eficiencia de la utilización del por el hospedador de producción. Por ejemplo, el derivado de ácidos grasos contendrá menos de aproximadamente 2 %, 1.5 %, 1.0 %, .5 %, .3 %, .1 %, .05 %, ó 0 % de alcohol libre. El biocombustible derivado de los derivados de ácidos grasos descritos se puede caracterizar adicionalmente por su baja concentración de azufre en comparación al diesel derivado de petróleo. Por ejemplo, el biocombustible derivado de derivados de ácidos grasos puede tener menos de aproximadamente 2 %, 1.5 %, 1.0 %, .5 %, .3 %, .1 %, .05 %, ó 0 % de azufre.

D. Aditivos Se usan aditivos de combustible para mejorar el desempeño de un combustible o máquina. Por ejemplo, se pueden usar aditivos de combustible para alterar el punto de congelación/formación de gel, punto de turbidez, lubricidad, viscosidad, estabilidad oxidativa, calidad de ignición, nivel de octano, y punto de inflamación. En los Estados Unidos de América, se deben registrar todos los aditivos de combustible con la Agencia de Protección Ambiental y las compañías que vendan el aditivo de combustible y el nombre del aditivo de combustible están públicamente disponibles en el sitio web de la agencia y también al ponerse en contacto con la agencia. Un experto en la técnica apreciará que los derivados de ácidos grasos descritos en la presente se pueden mezclar con uno o más de estos aditivos para impartir una calidad deseada. Un experto en la técnica también apreciará que los derivados de ácidos grasos descritos en la presente se pueden mezclar con otros combustibles tal como biodiesel derivado de triglicéridos , varios alcoholes tal como etanol y butanol, y productos derivados de petróleo, tal como gasolina. En algunos ejemplos, un derivado de ácidos grasos, tal como éster etílico C16:l o éster etílico C18:l, se produce el cual tiene un bajo punto de formación de gel. Este derivado de ácido graso de bajo punto de formación de gel se mezcla con bio-diesel elaborado de triglicéridos para reducir el punto de formación de gel total del combustible. De manera similar, un derivado de ácidos grasos tal como éster etílico C16:l ó éster etílico C18:l se puede mezclar con diesel derivado de petróleo para proporcionar una mezcla que es al menos y frecuentemente mayor que 5 % de biodiesel. En algunos ejemplos, la mezcla incluye al menos 20 % o más del derivado de ácido graso. Por ejemplo, se puede elaborar una composición de biocombustible que incluye al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ó 95 % de un derivado de ácido graso que incluye una cadena de carbonos que es 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ó 22:3. Estas composiciones de biocombustible pueden incluir adicionalmente al menos un aditivo seleccionado de un aditivo de disminución de punto de turbidez que puede disminuir el punto de turbidez a menos de aproximadamente 5°C, o 0°C, un agente tensioactivo, o una microemulsión, al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de combustible diesel de triglicéridos , gasolina derivada de petróleo o combustible diesel de petróleo.

Ej emplos La Figura 1 es un diagrama de la ruta de FAS que muestra las enzimas directamente comprendidas en la síntesis de acil-ACP. Para incrementar la producción de ceras/ésteres de ácidos grasos, y alcoholes grasos, una o más de las enzimas se pueden sobre-expresar o mutar para reducir la inhibición de retroalimentación . Adicionalmente, las enzimas que metabolizan los compuestos intermediarios para elaborar productos no basados en ácidos grasos (reacciones secundarias) se pueden suprimir funcionalmente o atenuar para incrementar el flujo de carbono a través de la ruta biosintética de ácidos grasos. Los Ejemplos 1, 2 y 8 posteriores proporcionan hospedadores de producción de ejemplo que se han modificado para incrementar la producción de ácidos grasos. Las Figuras 2, 3 y 4 muestran las rutas biosintéticas que se pueden modificar para elaborar alcoholes grasos y ásteres de ácidos grasos/cera, respectivamente. Como se ilustra en la Figura 2, la conversión de cada sustrato (acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graso, y acil-CoA) a cada producto (acetil-CoA, malonil-CoA, acil-ACP, ácido graso, y acil-CoA) se puede lograr usando varios polipéptidos diferentes que son miembros de las clases de enzimas indicadas. Los ejemplos posteriores describen microorganismos que se han manejado o se pueden modificar para producir alcoholes grasos específicos y ceras/ésteres de ácidos grasos, específicos e hidrocarburos específicos.

Ejemplo 1.- Construcción de Hospedador de Producción Un hospedador de producción de ejemplo es LS9001. Se produjo LS9001 al modificar C41(DE3) a partir de Overexpress.com (Saint Beausine, Francia) para suprimir funcionalmente el gen fadE (aceil-CoA-deshidrogenasa) . De forma breve, las cepas suprimidas de fadE de E. coli se elaboró usando los cebadores YafV_NotI e Ivry_01 para amplificar aproximadamente 830 pb en la dirección 5' de fadE y los cebadores Lpcaf_ol y LpcaR_Bam para amplificar aproximadamente 960 pb en la dirección 3' de fadE. Se usó PCR de traslape para crear una construcción para la supresión en marco del gen fadE completo. La construcción de supresión de fadE se clonó en el plásmido sensible a temperatura pKOV3, que contuvo un gen SacB para contraselección, y una supresión cromosómica de fadE se elaboró de acuerdo al método de Link et al., J. Bact. 179:6228-6237, 1997. La cepa resultante no fue capaz de degradar los ácidos grasos y acil-CoA grasos (esta supresión funcional se designa en la presente como AfadE) . Las modificaciones adicionales que se pueden incluir en un hospedador de producción incluyen introducir un plásmido que tiene los cuatro genes que son responsables de la actividad de acetil-CoA-carboxilasa en E. coli (accA, B, C, y D, accesos: NP_414727, NP_417721, NP_417722, NP_416819, EC 6.4.1.2). Los genes accABCD se clonaron en dos pasos como operones bicistrónicos en los sitios de Ncol/HindIII y Ndel/Avrll de pACYCDuet-1 (Novagen, Madison, I), el plásmido resultante se llamó pAS004.126. Las modificaciones adicionales que se pueden incluir en un hospedador de producción incluyen la siguiente: sobre-expresión de aceEF (que codifica para el componente Elp-deshidrogasa y el componente de E2p-dihidrolipoamida-aciltransferasa de los complejos de piruvato y 2-oxoglutarato-deshidrogenasa) ; y fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (que codifica para FAS) de cualquier organismo conocido en la técnica que codifica para estas propiedades, incluyendo, por ejemplo, E. coli, Nitrosomonas europaea (ATCC 19718), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia , Rhodococcus, Corynebacteria , Brevibacteria , Mycobacteria , levadura oleaginosa y similares se pueden expresar en el hospedador de producción. De manera similar, se pueden modificar hospedadores de producción para expresar accABCD (que codifica para acetil-co-A-carboxilasa) de Pisum savitum en lugar de, o además de, los homólogos de E. coli. Sin embargo, cuando el hospedador de producción también está produciendo butanol, es menos deseable expresar el homólogo de Pisum savitum. En algunos hospedadores de producción de ejemplo, se pueden suprimir genes o atenuar usando el método de Link, et al., J. Bacteriol. 179:6228-6237, 1997. por ejemplo, los genes que se pueden suprimir o atenuar incluyen gpsA (que codifica para sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa biosintética, acceso NP_418065, EC: 1.1.1.94); IdhA (que codifica para lactato-deshidrogenasa, acceso NP_415898, EC: 1.1.1.28); pflb (que codifica para formiato-acetiltransferasa 1, accesos: P09373, EC : 2.3.1.54); adhE (que codifica para alcohol-deshidrogenasa, accesos: CAA47743, EC: 1.1.1.1, 1.2.1.10); pta (que codifica para fosfotransacetilasa , accesos: NP_416800, EC : 2.3.1.8); poxB (que codifica para piruvato-oxidasa, accesos: NP_415392, EC: 1.2.2.2); ackA (que codifica para acetato-cinasa, accesos: NP_416799, EC: 2.7.2.1) y combinaciones de los mismos. De manera similar, se puede introducir la mutación PlsB[D311E] en LS9001 para atenuar PlsB usando el método descrito anteriormente para la supresión de fadE. Una vez introducida, esta mutación disminuirá la cantidad de carbono que se desvia a la producción de fosfolipidos (ver Figura 1) . De forma breve, se elabora un alelo que codifica para PlsB[D311E] al reemplazar el codón GAC para aspartato 311 con un codón GAA para glutamato. El alelo alterado se elabora por síntesis génica y el alelo tipo silvestre plsB cromosómico se intercambia por el alelo mutante plsB[D311E] usando el método de Link et al. (ver anteriormente).

Ejemplo 2.- Modificaciones del Hospedador de Producción Los siguientes plásmidos se construyeron para la expresión de varias proteínas que se usan en la síntesis de derivados de ácidos grasos. Las construcciones se elaboraron usando métodos normales de biología molecular y todos los genes clonados se pusieron bajo el control de promotores inducibles por IPTG (promotores T7, tac o lac) . El gen ' tesA (gen de tioesterasa A, acceso NP_415027 sin secuencia guía (Cho y Cronan, The J. of Biol. Chem. , 270:4216-9, 1995, EC: 3.1.1.5, 3.1.2.-) de E. coli se clonó en pETDuet-1 digerido con Ndel/Avrll (pETDuet-1 descrito en la presente está disponible de Novagen, Madison, WI) . Los genes que codifican para tioesterasas de planta tipo FatB (TE) de ümbellularia California , Cuphea hookeriana y Cinnamonum camphorum (accesos: UcFatBl=AAA34215, ChFatB2=AAC49269, ChFatB3=AAC72881, CcFatB=AAC49151 se clonaron individualmente en tres diferentes vectores: (i) pETDuet-1 digerido con Ndel/Avrll, (ii) pBluescript KS+ digerido con Xhol/HindIII (Stratagene, La Jolla, CA) (usado para crear proteínas de fusión lacZ::TE N-terminales ) y (iii) pMAL-c2X digerido con Xbal /HindIII (New England Lab, Ipswich, MA) (usado para crear fusiones MalE::TE n-terminales). El gen fadD (que codifica para acil-CoA-sintetasa ) de E. coli se clonó en el derivado de pCDFDuet-1 digerido con Ncol /HindIII , que contuvo el gen acrl (acil-CoA-reductasa) de Acinetobacter baylyi ADPI dentro de los sitios Ndel/Avrll . La Tabla 7 proporciona un resumen de los plásmidos generados para elaborar varias cepas de producción de ejemplo, un experto en la técnica apreciará que se pueden usar diferentes plásmidos y modificaciones genómicas para lograr cepas similares.

Tabla 7 Resumen de Plásmidos Usados en Hospedadores de Producción Plásmido Producto génico de Acceso No. , número EC organismo fuente pETDuet-1-tesA E. coli Accesos: NP_415027, EC.3.1.1.5, 3.1.2.- TesA pETDuet-l-TEuc IMbellularia Q41635 pBluescript-TEuc California pMAL-c2X-TEuc AAA34215 UcFatBl pETDuet-l-TEuc Cuphea hookeriana ABB71581 pBluescript-TEuc ChFatB2 AAC 9269 pMAL-c2X-TEuc ChFatB3 AAC72881 pETDuet-l-TEcc Cinnamonum pBluescript-TEcc camphorum AAC49151 TEci CcFatB pCDFDuet-1- E. coli fadD: accesos fadD-acrl NP_416319, EC 6.2.1.3 acrl: accesos YP_047869 Los plásmidos de expresión elegidos contienen replicones compatibles y marcadores de resistencia a antibióticos, de modo que se puede establecer un sistema de expresión de cuatro plásmidos. Por lo tanto, LS9001 se puede co-transformar con (i) cualquiera de los plásmidos que expresen TE, (ii) el plásmido que expresa FadD, que también expresa acrl, y (iii) plásmido de expresión de sintasa de cera. Cuando se induce con IPTG, la cepa resultante producirá concentraciones incrementadas de alcoholes grasos a partir de fuentes de carbono tal como glucosa. La longitud de la cadena de carbonos y el grado de saturación del alcohol graso producido es dependiente del gen de tioesterasa que se expresa .

Ejemplo 3.- Producción de Alcohol Graso en la Cepa de E. coli Recombinante Se produjeron alcoholes grasos al expresar un gen de tioesterasa y un gen de acil-CoA-reductasa (FAR) exógenamente en un hospedador de producción. De manera más especifica, se transformaron los plásmidos pCDFDuet-l-fadD-acrl (acil-CoA-reductasa) y pETDuet-1- ' tesA (tioesterasa) en la cepa LS9001 de E. coli (descrita en el Ejemplo 1) y se seleccionaron los transformantes correspondientes en placa LB complementada con 100 mg/L de espectinomicina y 50 mg/L de carbenicilina . Se inocularon independientemente cuatro transformantes de LS9001/pCDFDuet-l-fadD-acrl en 3 mL del medio M9 complementado con 50 mg/L de carbenicilina y 100 mg/L de espectinomicina) . Las muestras que contienen los transformantes se cultivaron a 25°C en un agitador (250 rpm) hasta que alcanzaron 0.5 ?06??· Se transfirieron 1.5 mL de cada muestra en un matraz de 250 mL que contiene 30 mL del medio descrito anteriormente. El cultivo resultante se cultivó a 25°C en un agitador hasta que el cultivo alcanzó entre 0.5-1.0 ??e??- Entonces se adicionó IPTG a una concentración final de 1 mM y el cultivo continuó durante 40 horas. Las células entonces se centrifugaron a 4000 rpm y los sedimentos celulares se suspendieron en 1.0 mL de metanol . Entonces se mezclaron 3 mL de acetato de etilo con las células suspendidas. Entonces se adicionaron 3 mL de ¾0 a la mezcla y la mezcla se trató con ultrasonido durante 20 minutos. La muestra resultante se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos y la fase orgánica (la fase superior) que contuvo el alcohol graso y se sometió a análisis de GC/MS. El rendimiento total de alcohol (incluyendo tetradecanol , hexadecanol, hexadecenol y octadecenol) fue de aproximadamente 1-10 mg/L. Cuando una cepa de E. coli que tiene sólo vectores vacíos se cultivó de la misma manera, sólo se encontraron 0.2-0.5 mg/L de alcoholes grasos en el extracto de acetato de etilo.

Ejemplo 4.- Producción y Liberación de Alcohol Graso a Partir de Hospedador de Producción Se expresó Acrl (acil-CoA-reductasa) en E. coli cultivado en glucosa como la única fuente de carbono y energía. La E. coli produjo pequeñas cantidades de alcoholes grasos tal como dodecanol (C12:0-OH), tetradecanol (C14:0-OH) y hexadecanol (C16:0-OH). En otras muestras, se expresó FadD (acil-CoA-sintetasa) conjuntamente con acrl en E. coli y se observó un incremento de cinco veces en la producción de alcohol graso. En otras muestras, se expresaron acrl, fadD, accABCD (acetil-CoA-carboxilasa) (plásmido que tiene accABCD construido como se describe en el Ejemplo 1) junto con varias tioesterasas individuales (TE) en E. coli tipo silvestre, C41 (DE3) y una E. coli C41 (DE3) AfadE, una cepa que carece de acil-CoA-deshidrogenasa . Esto dio por resultado incrementos adicionales en la producción de alcohol graso y en la modulación de los perfiles de alcoholes grasos (ver Figura 5) . Por ejemplo, la sobre-expresión de E. coli 'tesA (pETDuet-1-'tesA) en este sistema logró aproximadamente un incremento de 60 veces en C12:0-OH, C1 : 0-OH y C16:0-OH con C14:0-OH que es el alcohol graso principal. Se obtuvo un resultado muy similar cuando se expresó la enzima ChFatB3 (FatB3 de Cuphea hookeriana en pMAL-c2X-TEcu) . Cuando se expresó la enzima UcFatBl (FatBl de Umbellularia californicain en pMAL-c2X- TEuc) , la producción de alcoholes grasos se incrementó aproximadamente 20 veces y C12:0-OH fue el alcohol graso predominante . La expresión de ChFatB3 y UcFatBl también condujo a la producción de cantidades significativas de los alcoholes grasos insaturados C16:l-OH y C14:l-OH, respectivamente. La presencia de alcoholes grupos también se encontró en el sobrenadante de muestras generadas de la expresión de tesA (Figura 6). A 37°C, se encontraron cantidades aproximadamente iguales de alcoholes grasos en el sobrenadante y en el sedimento celular, en tanto que a 25°C, se encontraron aproximadamente 25 % de los alcoholes grasos en el sobrenadante .

Ejemplo 5.- Esteres de Ácidos Grasos de Cadena Media Las alcohol-acetil-transferasas (AAT, EC 2.3.1.84), que son responsables de la producción de acetato de etilo en varias plantas, se pueden usar para producir ceras de longitud de cadena media, tal como octanoato de octilo, octanoato de decilo, decanoato de decilo, y similares. Los ésteres grasos, sintetizados de alcohol de cadena media (tal como C6, C8) y acil-CoA de cadena media (o ácidos grasos, tal como C6 o C8) tienen un punto de fusión relativamente bajo. Por ejemplo, el hexanoato de hexilo tiene un punto de fusión de -55°C y el octanoato de octilo tiene un punto de fusión de -18 a -17°C.

Los bajos puntos de fusión de estos compuestos los hacen buenos candidatos para el uso como biocombustibles . En este ejemplo, se coexpresó el gen SAAT en un hospedador de producción C41 (DE3, AfadE) con fadD de E. coli y acrl (alcohol-reductasa de A. baylyi ADP1) y se proporcionó ácido octanoico en el caldo de fermentación. Esto dio por resultado la producción de octanoato de octilo. De manera similar, cuando el gen de sintasa de cera de A. baylyi ADP1 se expresó en el hospedador de producción en lugar del gen de SAAT, se produjo octanoato de octilo. Se sintetizó un gen recombinante de SAAT . usando ADN 2.0 (Menlo Park, CA 94025). El ADN sintetizado se basó en la secuencia génica publicada (número de acceso AF193789) y se modificó para eliminar el sitio Ncol . El gen SAAT sintetizado (como un fragmento BamHI-HindIII ) se clonó en pRSET B (Invitrogen, Calsbad, California), se linealizó con BamHI y HindIII . El plásmido resultante, pHZ1.63A se cotransformó en un hospedador de producción de E. coli con pAS004.114B, que tiene un gen fadD de E. coli y el gen acrl de A. baylyi ADP1. Los transformantes se cultivaron en 3 mL del medio M9 con 2 % de glucosa. Después de la inducción de IPTG y la adición de 0.02 % de ácido octanoico, el cultivo se continuó a 25°C durante 40 horas. Después de esto, se adicionaron 3 mL de acetato de etilo al cultivo completo y se mezclaron varias veces con el mezclador. La fase de acetato de etilo se analizó por GC/MS. Sorprendentemente, en el extracto de acetato de etilo, no se encontró acetato de acilo. Sin embargo, se encontró un nuevo compuesto y el compuesto fue octanoato de octilo. En tanto que la cepa de control sin el gen de SAAT [C4KDE3, AfadE) /pRSET B+pAS00 .114B] no produjo octanoato de octilo. También la cepa [C41(DE3, AfadE) /pHZl . 3 B+pAS004.114B] , en la cual el gen de sintasa de cera de A. baylyí ADPl se portó por pHZl.43 produjo octanoato de octilo (ver Figura 7B) . El hallazgo que la actividad de SAAT produce octanoato de octilo no se reportó antes y hace posible producir ceras de cadena media tal como octanoato de octilo, decanoato de octilo, que tienen bajo punto de fusión y son buenos candidatos para ser usados para biocombustible para reemplazar biodisel basado en triglicéridos .

Ejemplo 6.- Producción de Ester de Cera en la Cepa LS9001 de E. coli Se produjeron ésteres de cera al modificar un hospedador de producción de E. coli para expresar una acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso, tioesterasa y una sintasa de cera. De esta manera, el hospedador de producción produjo tanto el lado A como el lado B del éster y la estructura de ambos lados se influenció por la expresión del gen de tioesterasa. De manera más especifica, se amplificó la sintasa de A. baylyi ADPl (llamado WSadpl, accesos AA017391, EC: 2.3.175) con los siguientes cebadores usando ADN genómico de A. baylyi ADPI como la plantilla. Los cebadores fueron (1) Sadpl_NdeI, 5 ' -TCATATGCGCCCATTACATCCG-3 ' , y (2) WSadpl_Avr, 5'-TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3 ' . El producto de PCR se digirió con Ndel y Avrll y se clonó en pCOALDeut-1 para dar pHZ 1.43. El plásmido que tiene WSadpl entonces se cotransformó en la cepa LS9001 de E. coli con tanto pETDuet-1'tesA como pCDFDuet-l-fadD-acrl y se seleccionaron transformantes en placas LB complementadas con 50 mg/L de canamicina, 50 mg/L de carbenicilina y 100 mg/L de espectinomicina . Estos transformantes se inocularon en 3 mL de LBKCS (complemento de caldo LB con 50 mg/L de canamicina, 50 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de espectinomicina y 10 g/L de glucosa) y se cultivaron a 37°C en agitador (250 rpm) . Cuando los cultivos alcanzaron 0.5 OD60o, se transfirieron 1.5 mL de cada cultivo en matraces de 250 mL que contienen 50 mL de LBKCS y los matraces se cultivaron en un agitador (250 rpm) a 37 °C hasta que el cultivo alcanzó 0.5-1.0 ??ß??- Entonces se adicionó IPTG a una concentración final de 1 mM. Los cultivos inducidos se cultivaron a 37 °C en agitador durante otras 40-48 horas.

El cultivo entonces se colocó en tubos cónicos de 50 mL y las células se centrifugaron a 3500 X g durante 10 minutos. El sedimento celular entonces se mezcló con 5 mL de acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo se analizó con GC/MS. El rendimiento intracelular de ceras (que incluyen C16C16, C14:1C16; C18:1C18:1, C2C14, C2C16, C2C16.1, C16C16.1 y C2C18:1) fue aproximadamente 10 mg/L. cuando se cultivó una cepa de E. coli que tiene sólo vectores vacíos, de la misma manera, sólo se encontraron 0.2 mg/L de cera en el extracto de acetato de etilo.

Ejemplo 7.- Producción y Liberación de Ester Etílico Graso de Hospedador de Producción La cepa LS9001 se modificó al transformarla con los plásmidos que tienen un gen de sintasa de cera de A. baylyi (plásmido pHZ1.43) un gen de tioesterasa de Cuphea hookeriana (plásmido pMAL-c2X-TEcu) y un gen fadD de E. coli (plásmido pCDFDuet-l-fadD) . Esta cepa recombinante se cultivó a 25°C en 3 mL del medio M9 con 50 mg/L de canamicina, 100 mg/L de carbenicilina y 100 mg/L de espectinomicina . Después de la inducción con IPTG, el medio se ajustó con una concentración final de 1 % de etanol y 2 % de glucosa. El cultivo se dejó cultivar durante 40 horas después de la inducción con IPTG. Las células se separaron del medio gastado por centrifugación a 3500 X g durante 10 minutos) . El sedimento celular se resuspendió con 3 mL del medio M9. La suspensión celular y el medio gastado entonces se extrajeron con 1 volumen de acetato de etilo. Las fases resultantes de acetato de etilo de la suspensión celular y el sobrenadante se sometieron a análisis de GC-MS. Los resultados mostraron que el éster etílico C16 fue la especie de éster más prominente (como se espera para esta teioesterasa, ver Tabla 1), y que 20 % del éster de ácido graso producido se liberó de la célula (ver Figura 8). Una cepa de E. coli de control C41 (DE3, AfadE) que contiene pCOLADuet-1 (vector vacío para el gen de sintasa de cera) , pMAL-c2X-TEuc (que contiene fatB de U. california) y pCDFDuet-1-fadD (el gen fadD de E. coli) falló en producir cantidades detectables de ésteres etílicos grasos. Los ásteres de ácidos grasos se cuantificaron usando éster etílico de ácido palmítico comercial como la referencia. También se elaboraron ésteres de ácidos grasos usando los métodos descritos en la presente excepto que se adicionó metanol o isopropanol al caldo de fermentación y se produjeron los ésteres esperados de ácidos grasos.

Ejemplo 8.- La Influencia de Varias Tioesterasas en la Composición de Ésteres Etílicos Grasos Producidos en Cepas de E. coli Recombinantes Las tioesterasas FatB3 (C. hookeri ana ) , TesA (E. coli) , y FarB (U. california) se expresaron simultáneamente con sintasa de cera {A. baylyi) . Se construyó un plásmido llamado pHZ1.61 al reemplazar el fragmento Notl-Avrll (que tiene el gen acrl) con el fragmento Notl-Avrll de pHZ1.43 de modo que fadD y la sintasa de cera ADP1 estuvieron en un plásmido y ambas secuencias codificantes estuvieron bajo el control del promotor T7 separado. La construcción de pHZ1.61 hace posible usar un sistema de dos plásmidos en lugar del sistema de tres plásmidos como se describe en el Ejemplo 6. Entonces se cotransformó pHZ1.61 en E. coli C41 (DE3, AfadE) con uno de los varios plásmidos que tienen diferentes genes de tioesterasa señalados anteriormente. Los ásteres etílicos de ácidos grasos totales (sobrenadante y ésteres etílicos de ácidos grasos intracelulares) producidos por estos transformantes se evaluaron usando la técnica descrita en la presente. Los rendimientos y la composición de los ésteres etílicos de ácidos grasos se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8 Los rendimientos (mg/L) y la composición de ésteres etílicos de ácidos grasos por E. coli recombinante C41(DE3, ??adE) /pHZl .61 y plásmidos que tienen varios genes de tioesterasa.

Nota: xTeSa, pETDuet-1- ? tesA; chFatB3, pMAL-c2X-TEcu; ucFatB, pMAL-c2X-TEuc; pMAL, pMAL-c2X, el vector vacío para genes de tioesterasa usados en el estudio.

Ejemplo 9.- Construcción de Hospedador de Producción Los genes que controlan la producción de ácidos grasos están conservados entre los microorganismos. Por ejemplo, la Tabla 9 identifica los homólogos de muchos de los genes descritos en la presente que se conoce que se expresan en microorganismos que producen hidrocarburos. Para incrementar la producción de ácidos grasos, y por lo tanto, la producción de hidrocarburos en microorganismos tal como aquéllos identificados en la Tabla 9, se pueden expresar genes heterólogos, tal como aquéllos de E. coli. Un experto en la técnica también apreciará que los genes que son endógenos a los microorganismos proporcionados en la Tabla 9 también se pueden sobre expresar, o atenuar usando los métodos descritos en la presente. Además, se pueden expresar o atenuar genes que se describen en la Tabla 11, en microorganismos que producen de manera endógena hidrocarburos para permitir la producción de hidrocarburos específicos con longitud definida de cadena de carbonos, puntos de saturación, y puntos de ramificación. Por ejemplo, se introducen en K. radiotolerans secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para acetil-CoA-carboxilasa . Los siguientes genes comprenden el producto de proteína de acetil-CoA-carboxilasa en K. radiotolerans; acetil-CoA-carboxilasa, subunidad alfa (accA/ZP_00618306) , acetil-CoA-carboxilasa, proteína portadora de carboxilo de biotina ( acaB/ZP_00618387 ) , acetil-CoA-carboxilasa subunidad biotina-carboxilasa (<accC/ZP_00618040) , y acetil-CoA-carboxilasa, subunidad de beta (carboxiltransferasa) (accD/ZP_00618306) . Estos genes se clonan en un plásmido tal que elaboran un operón de acetil-CoA-carboxilasa sintético (accABCD) bajo el control de un sistema de expresión de K. radiotolerans tal como el sistema de expresión descrito en Ruyter et al., Appl Environ Microbiol. 62:3662-3667, 1996. La transformación del plásmido en K. radiotolerans mejorará la producción de ácidos grasos. La cepa productos de hidrocarburos de K. radiotolerans también se puede modificar para elaborar hidrocarburos insaturados, ramificados que tienen longitudes específicas de las cadenas de carbonos usando los métodos descritos en la presente.

Hospedadores de Producción de Hidrocarburos Organismo Nombre del gen Acceso No./Seq Número EC ID/Locus Desulfovibrio accA YP_388034 6.4.1.2 desulfuricans G20 Desulfovibrio accC YP_388573/YP_388033 6.3.4.14, desulfuricans G22 Desulfovibrio accD YP_388034 6.4.1.2 desulfuricans G23 Desulfovibrio fabH YP_388920 2.3.1.180 desulfuricans G28 Desulfovibrio fabD YP_388786 2.3.1.39 desulfuricans G29 Desulfovibrio fabG YP_388921 1.1.1.100 desulfuricans G30 Desulfovibrio acpP YP_388922/YP_389150 1.6.5.3, desulfuricans G31 1.6.99.3 Desulfovibrio fabF YP_388923 2.3.1.179 desulfuricans G32 Desulfovibrio gpsA YP_389667 1.1.1.94 desulfuricans G33 Desulfovibrio ldhA YP_388173/YP_390177 1.1.1.28 desulfuricans G34 Erwinia (micrococcus) accA 942060-943016 6.4.1.2 amylovora Organismo . Nombre del gen Acceso No./Seq Número EC ID/Locus Erwinia (micrococcus) accB 3440869-3441336 6.4.1.2 amylovora Erwinia (micrococcus) accC 3441351-3442697 6.3.4.14, amylovora 6.4.1.2 Erwinia (micrococcus) accD 2517571-2516696 6.4.1.2 amylovora Erwinia (micrococcus) fadE 1003232-1000791 1.3.99. -amylovora Erwinia (micrococcus) plsB (D311E) 333843-331423 2.3.1.15 amylovora Erwinia (micrococcus) aceE 840558-843218 1.2.4.1 amylovora Erwinia (micrococcus) aceF 843248-844828 2.3.1.12 amylovora Erwinia (micrococcus) fabH 1579839-1580789 2.3.1.180 amylovora Erwinia (micrococcus) fabD 1580826-1581749 2.3.1.39 amylovora Erwinia (micrococcus) fabG CAA74944 1.1.1.100 amylovora Erwinia (micrococcus) acpP 1582658-1582891 1.6.5.3, amylovora 1.6.99.3 Erwinia (micrococcus) fabF 1582983-1584221 2.3.1.179 amylovora Erwinia (micrococcus) gpsA 124800-125810 1.1.1.94 amylovora Organismo Nombre del gen Acceso No . /Seq Número EC ID/Locus Erwinia (micrococcus) ldhA 1956806-1957789 1.1.1.27, amylovora 1.1.1.28 Kineococcus accA ZP_00618306 6.4.1.2 radiotolerans SRS30216 Kineococcus accB ZP_00618387 6.4.1.2 radiotolerans SRS30216 Kineococcus accC ZP_00618040 / 6.3.4.14, radiotolerans SRS30216 ZP_00618387 6.4.1.2 Kineococcus accD ZP_00618306 6.4.1.2 radiotolerans SRS30216 Kineococcus fadE ZPJD0617773 1.3.99.-radiotolerans SRS30216 Kineococcus plsB (D311E) ZPJD0617279 2.3.1.15 radiotolerans SRS30216 Kineococcus aceE ZP_00617600 1.2.4.1 radiotolerans SRS30216 Kineococcus aceF ZP_00619307 2.3.1.12 radiotolerans SRS30216 Kineococcus fabH ZP_00618003 2.3.1.180 radiotolerans SRS30216 Kineococcus fabD ZP_00617602 2.3.1.39 radiotolerans SRS30216 Kineococcus fabG ZP_00615651 1.1.1.100 radiotolerans SRS30216 Kineococcus acpP ZP_00617604 3.1.26.3, radiotolerans SRS30216 1.6.5.3, 1.6.99.3 Organismo Nombre del gen Acceso No. /Seq Número EC ID/Locus Kineococcus fabF ZP_ _00617605 2. 3. 1.179 radiotolerans SRS30216 Kineococcus gpsA ZP_ _00618825 1. 1. 1.94 radiotolerans SRS30216 Kineococcus ldhA ZP_ _00618879 1. 1. 1.27, radiotolerans SRS30216 1. 1. 1.28 Rhodospirillum rubrum accA YP_ _425310 6. 4. 1.2 Rhodospirillum rubrum accB YP_ _427521 6. 4. 1.2 Rhodospirillum rubrum accC YP_ _427522/YP_ _425144/ 6. 3 4.14, YP_ _427028/YP_ 426209/ 6 4 1.2 YP__427404 Rhodospirillum rubrum accD YP_ _428511 6 4 1.2 Rhodospirillum rubrum fadE YP_ _427035 1 3 99. - Rhodospirillum rubrum aceE YP_ _427492 1 2 4.1 Rhodospirillum rubrum aceF YP_ _426966 2 3 1.12 Rhodospirillum rubrum fabH YP_ _426754 2 3 1.180 Rhodospirillum rubrum fabD YP_ _425507 2 3 1.39 Rhodospirillum rubrum fabG YP _425508/YP_ _425365 1 1 1.100 Rhodospirillum rubrum acpP YP_ _425509 1 6 5.3, 1 6 99.3 Rhodospirillum rubrum fabF YP_ _425510/YP_ _425510/ 2 3 1.179 YP__425285 Rhodospirillum rubrum gpsA YP_ _428652 1 1 1.94, 1 1.1.27 Rhodospirillum rubrum ldhA YP_ _426902/YP_ _428871 1 1 .1.28 Vibrio furnissii accA 1, 16 6 .4 .1.2 Vibrio furnissii accB 2, 17 6 .4 .1.2 Organismo Nombre del gen Acceso No./Seq Número EC ID/Locus Vibrio furnissii accC 3, 18 6.3.4.14, 6.4.1.2 Vibrio furnissii accD 4, 19 6.4.1.2 Vibrio furnissii fadE 5, 20 1.3.99.- Vibrio furnissii plsB (D311E) 6, 21 2.3.1.15 Vibrio furnissii aceE 7, 22 1.2.4.1 Vibrio furnissii aceF 8, 23 2.3.1.12 Vibrio furnissii fabH 9, 24 2.3.1.180 Vibrio furnissii fabD 10, 25 2.3.1.39 Vibrio furnissii fabG 11, 26 1.1.1.100 Vibrio furnissii acpP 12, 27 1.6.5.3, 1.6.99.3 Vibrio furnissii fabF 13, 28 2.3.1.179 Vibrio furnissii gpsA 14, 29 1.1.1.94 Vibrio furnissii ldhA 15, 30 1.1.1.27, 1.1.1.28 Stenotrophomonas accA ZP_01643799 6.4.1.2 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas accB ZP_01644036 6.4.1.2 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas accC ZP_01644037 6.3.4.14, maltophilia R551-3 6.4.1.2 Stenotrophomonas accD ZP_01644801 6.4.1.2 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas fadE ZP_01645823 1.3.99.-maltophilia R551-3 Organismo Nombre del gen Acceso No./Seq Número EC ID/Locus Stenotrophomonas plsB (D311E) ZPJD1644152 2.3.1.15 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas aceE ZP_01644724 1.2.4.1 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas aceF ZP_01645795 2.3.1.12 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas fabH ZP_01643247 2.3.1.180 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas fabD ZP_01643535 2.3.1.39 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas fabG ZP_01643062 1.1.1.100 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas acpP ZP_01643063 3.1.26.3, maltophilia R551-3 1.6.5.3, 1.6.99.3 Stenotrophomonas fabF ZP_01643064 2.3.1.179 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas gpsA ZP_01643216 1.1.1.94 maltophilia R551-3 Stenotrophomonas ldhA ZP_01645395 1.1.1.27, maltophilia R551-3 1.1.1.28 Para Tabla 9, los números de acceso son de Genbank, versión 159.0 a partir del 15 de Abril de 2001, Los números EC son de KEGG, versión 42.0 a partir de Abril 2007 (más actualizaciones diarias hasta incluyendo 05/09/07), resultados para la cepa Ea273 de Erwinia amylovora se toman del centro de secuenciación Sanger, secuencia de disparo completada a partir de 5/9/07 posiciones para Erwinia representan ubicaciones en el pseudos-cromosoma de Sanger, secuencias para Vibrio furnisii MI son del pseudocromosoma LS9 VFM1 , el ción v2, a partir de 9/28/06, incluyen el gen completo, y también pueden incluir secuencia de flanqueo .

Ejemplo 10.- Cepas Adicionales de Producción de Ejemplo. La Tabla 10, posterior, proporciona cepas adicionales de producción de ejemplo. Se describen dos rutas biosintéticas de ejemplo para producir ácidos grasos, alcoholes grasos, y ésteres de cera. Se puede producir un hospedador genéticamente manejado al clonar la expresión de los genes de E. coli, el gen ¾tesA de E. coli, el gen fadD de E. coli en una célula hospedadora. Se pueden seleccionar células hospedadoras de E. coli, levadura, y adicional a la lista. Estos genes también se pueden transformar en una célula hospedadora que se modifica para contener una o más de las manipulaciones genéticas descritas en los Ejemplos 1 y 2, anteriores. Como se proporciona en la Tabla 10, se pueden crear hospedadores adicionales de producción usando los genes exógenos indicados.

Tabla 10 Combinación de Genes Útiles para Elaborar Cepas de Producción Genéticamente Modificadas Ácidos Alcoholes Esteres de Fuentes de genes Genes grasos grasos cera/grasos Péptido Ej 1 Ej 2 Ej 1 Ej 2 Ej 1 Ej 2 Acetil-CoA- E. coli accABCD X X X X X X carboxilasa Tio-esterasa E. coli tesA X X X X Tio-esterasa Cinnamomum ccFatB camphora Umbellularia umFatB X X californica Cuphea chFatB2 hookeriana Cuphea chFatB3 hookeriana Cuphea hookerian chFatA Arabidopsis AtFatAl thaliana Arabidopsis AtFatBl thalian [M141T] Acil-CoA-sintasa E.. coli fadD X X X X X X Acil-CoA- bómbix mori bFAR reductasa Acinetobacter acrl X X baylyi ADP1 Símmondsia UFAR X X chinensis Triticum aestivum Mus muscullus mFARl Mus muscullus mFAR2 Acinetpbacter sp acrMl MI Ácidos Alcoholes Esteres de Fuentes de genes Genes grasos grasos cera/grasos Péptido Ej 1 Ej 2 Ej 1 Ej 2 Ej 1 Ej 2 Homo sapiens hFAR Sintasa de cera- Fundibacter WST9 alcohol-acil- jadensis DSM transferasa 12178 Acinetobacter WHSN X sp. H01-N Acinetobacter WSadpl X baylyi ADP1 Mus muscullus mWS Homo sapiens hWS Fragaria x SAAT ananassa Malus x MpAAT domestica Simmondsía JjWS chinensis (AAD38041 ) Descarbonilasa Arabidopsis cerl thaliana Oryza sativa cerl Transportador Acinetobacter X X sp. H01-N Arabidopsis Cer5 thaliana Ejemplo 11.- Fermentación También se pueden modificar microorganismos hospedadores para expresar umuC y umuD a partir de E. coli en pBAD24 bajo el sistema promotor prpBCDE a través de la síntesis de novo de este gen con los genes de producción de productos finales apropiados. Para la producción de productos de hidrocarburos a escala pequeña, se incubaron células de E. coli BL21(DE3) que tienen pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de productos finales) así como pUMVCl (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobre expresión de acetil-CoA/malonil-CoA) durante la noche en un agitador a 37°C a >200 rpm en matraces de 2 L en 500 mi de medio LB complementado con 75 µ?/????- de ampicilina y 50 µ?/?t?]., de kanamicina hasta que los cultivos alcanzaron un ??e?? de >0.8. Al lograr un OD60o de >0.8, las células se complementaron con propionato de sodio 25 mM (pH 8.0) para activar los sistemas génicos manejados para producción así como para detener la proliferación celular (a través de la activación de las proteínas umuC y umuD) . Se realiza la inducción durante 6 horas a 30°C. Después de la incubación, se examina el medio para el producto usando GC-MS (como se describe más adelante) . Para la producción de productos a gran escala, los microorganismos manejados se cultivan en 10 L/100L o lotes más grandes, se desfermentan e incuban para expresar los productos deseados en base a los genes específicos codificados en los plásmidos como sea apropiado. Se incuban células de E. coli BL21(DE3) que tienen pBAD24 (con resistencia a ampicilina y la ruta de síntesis de productos finales) así como pUMVCl (con resistencia a kanamicina y el sistema de sobre expresión de acetil-CoA/malonil-CoA) de un cultivo de siembre de 500 mL para fermentaciones de 10 L (5 L para fermentaciones de 100 L) en el medio LB (libre de glicerol) a 37°C agitados a >200 rpm hasta que los cultivos alcanzaron un OD6oo de >0.8 (típicamente 16 horas) se incubaron con 50 pg/mL de kanamicina y 75 ug/mL de ampicilina. Se trató el medio continuamente complementado para mantener un propionato de sodio 25 mM (pH 8.0) para activar los sistemas génicos manejados para la producción así como para detener la proliferación celular (a través de la activación de las proteínas umuC y umuD) . Los medios se complementan continuamente con glucosa para mantener una concentración de 90 g/100 mL. Después de la primera hora de inducción, se removieron alicotas de no más de 10 % del volumen celular total cada hora y se dejaron asentar sin agitar para permitir que el producto de hidrocarburo alcanzara la superficie y se sometiera a una separación espontánea de ¦ fases. El componente de hidrocarburo entonces se recolecta y la fase acuosa se retorna a la cámara de reacción. La cámara de reacción se opera de manera continúa. Cuando el ??ß?? cae por debajo de 0.6, las células se reemplazan con un nuevo lote cultivado de un cultivo de siembra. Para la producción de ésteres de cera, subsiguiente al aislamiento, los ésteres de cera se lavan brevemente en HC1 1M para dividir el éster unido, y se regresa a pH 7 con lavado extensivo con agua destilada.

Ejemplo 12.- Caracterización de Producto Para caracterizar y cuantificar los alcoholes grasos y ásteres de ácidos grasos, se usó cromatografía de gases (GC) acoplada con detección de espectros de masa (MS) de impacto de electrones. Primero se derivatizaron muestras de alcoholes grasos con un exceso de N-trimetilsilil (TMS) y imidazol para incrementar sensibilidad de detección. Los ásteres de ácidos grasos no requirieron derivatización . Tanto los derivados de alcohol graso-TMS como los ásteres de ácidos grasos se disolvieron en un solvente volátil apropiado, tal como acetato de etilo. Las muestras se analizaron en una columna capilar DP-5 de 30m usando el siguiente método. Después de una inyección de 1 L sin división en la columna de GC/MS, el horno se mantuvo a 100°C durante 3 minutos. La temperatura se aumentó tipo rampa a 320°C a una velocidad de 20°C/minuto. El horno se mantuvo a 320°C durante 5 minutos adicionales. La velocidad de flujo del gas portador helio fue de 1.3 mL/minuto. Las exploraciones de cuadrupolo Ms de 50 a 550 m/z . se compararon los tiempos de retención y los patrones de fragmentación de los picos del producto con referencias auténticas para confirmar la identidad de los picos. Por ejemplo, el éster etílico de ácido hexadecónico eluyó a 10.18 minutos (Figuras 9A y 9B) el ión de origen de 284 unidades másicas se observó fácilmente. Los más abundantes fueron los iones descendientes producidos durante la fragmentación másica. Esto incluyó el ión descendiente más prevalente de 80 unidades másicas. El alcohol graso derivatizado, hexadecanol-TMS eluyó a 10.29 minutos y el ión descendiente de 313 se puede observar. El ion más prevalerte fue el ión -14 de 299 unidades másicas. Se llevó a acabo la cuantificación al inyectar varias concentraciones de las referencias auténticas apropiadas usando el método de GC/MS descrito anteriormente. Se usó esta información para generar una curva normal con respuesta (cuenta total de ión integrado) versus concentración .

Equivalentes En tanto que en la presente se describen explícitamente ejemplos específicos de la presente invención, la especificación y ejemplos anteriores en la presente son ilustrativos y no restrictivos. Llegarán a ser evidentes para los expertos en la técnica muchas variaciones de la invención, en la revisión de esta especificación incluyendo los ejemplos. El alcance completo de las invenciones se debe determinar por referencia a los ejemplos, junto con su alcance completo de equivalentes, y la especificación, junto con estas variaciones .

Tabla 11 Números de Acceso son de NCBI, GenBank, Emisión 159.0 de abril de 2007 Números EC son de KEGG, Emisión 42.0 de abril de 2007 (más actualizaciones diarias hasta e incluyendo la fecha de esta patente) CATEGORIA I GEN | NOMBRE | ACCESO | NÚMERO EC | MODIFICACIÓN | ÜSO [ ORGANISMO 1. Incremento de Producción de Ácidos Grasos/Incremento de Producción de Producto incrementar acil-CoA reducir catabolismo de derivados e intermedios reducir inhibición de retroalimentación atenuar otras rutas que consumen ácidos grasos accA Aceti 1-CoA-carboxilasa, AAC73296 6.4.1.2 Sobreexpresar incrementar Escherichia subunidad NP_ 14727 producción de coli Malonil-CoA accB Aceti1-CoA-carboxilasa, NP_417721 6.4.1.2 Sobreexpresar incrementar Escherichia subunidad producción de coli Malonil-CoA accC Aceti 1-CoA-carboxilasa, NP_417722 6.4.1.2 Sobreexpresar incrementar Escherichia subunidad producción de coli Malonil-CoA accD Aceti 1-C A-carboxilasa, NP_ 16319 6.4.1.2 Sobreexpresar incrementar Escheri hia subunidad 1.2.4.1, producción de coli Malonil-CoA accE Pi ruvato-deshidrogenasa, NP 414656, 2.3.1.61,2.3.1. Sobreexpresar incrementar Escherichia subunidad El AAC73226 12 producción de coli 1.2.4.1, Aceti1-CoA accF Pi ruvato-deshidrogenasa, NP 414657, 2.3.1.61,2.3.1. Sobreexpresar incrementar Escherichia subunidad E2 AAC73227 12 producción de coli AAC75356, Acet 1-CoA ackA Acetato-cinasa NP_416799 2.7.2.1 Suprimir o incrementar Escherichia reducir producción de coli Acetil-CoA ackB Acetato-cinasa AckB BAB81430 2.7.2.1 Suprimir o incrementar Escherichia reducir producción de coli Acetil-CoA acpP Prot ina portadora de AAC7 178 NINGUNO Sobreexpresar incrementar Escherichia acilo producción de coli Acetil-CoA EadD Acil-CoA-sintasa AP_002424 2.3.1.86 Sobreexpresar Incrementar Escherichia roducción de coli ácidos grasos W3110 Esc erichia AAC74323 1.1.1.1, Suprimir o Incrementar producción adhE Alcohol -deshidrogenase coli CAA47743 1.2.1.10 reduci r de Acetil-CoA muí Incrementar producción Arabídopsis cerl Aldehido-descarbo ilasa BAA11024 4.1.99.5 Sobreexpresar de Acetil-CoA thaliana Deshidrataba de tioéster beta-fabA NP_ 15474 4.2.1.60 Expresar roducción graso E. coli K12 hidroxidecanoilo [proteina portadora de acilo] S- Incrementar producción fabD AAC74176 2.3.1.39 Sobreexpresar E. col i K12 malonilt ransferasa de Acetil-CoA 3-oxoaci [proteína portadora de 2.3.1.17 Suprimir o Incrementar producción CabF AAC74179 E. col K12 acilo] sintasa II 9 reduci r de Acetil-CoA 3-oxoaci [proteína portadora de 1.1.1.10 Incrementar producción fabG AAC74177 Sobreexpresar E. coli K12 acilo] reductasa 0 de Acetil-CoA 3-oxoaci lo- [proteina portadora de 2.3.1.18 Incrementar producción AAC74175 reexpresar E. coli K12 acilo] sintasa ?G? 0 de Acetil-CoA enoil- [proteina portadora de Producción de acil-CoA fabl acilo] reductasa, dependiente de NP_ 15804 1.3.1.9 expresar E. coli K12 graso NA.DH Suprimir producción fabR Represor Transcripcional NP_418398 NINGUNO E. coli K12 reduci r proteína fab2 í 3RJ -hidroximiristol NP_414722 4.2.1.- E. coli K12 1.3.99.3 Suprimir o producción de fadE Aci 1-CoA-deshidrogenasa AAC73325 Acetil paia producción de reduci r 1.3.99.- alcoholes grasos para producción de acrl Reductasa Acil -CoA graso AAC45217 1.2.1- Sobreexpresar E. coli K12 alcohol qraso Suprimir o GST Glutationa-sintasa P04425 6.3.2.3 Incrementar Acetil-CoA E. coli K12 reduci r Deshidrogenasa 3-fosfato-sn- AAC76632, Ec: Suprimir o Incrementar producción gpsA E. coli K12 ice rol biosintético NP 418065 1.1.1.94 ceduci r de Acetil-CoA AAC74462, EC: Su imir producción ldhA Lactato-deshidrogenasa NP 415898 1.1.1.28 reduci r -CoA E. coli K12 Lipas CAA89087, incrementar producción Triglicérido-lipasa 3.1.1.3 Expresar E. coli K12 a CAA98876 Saccharopolys 4.1.1.9, Maloni 1-CoA-descarboxilasa AAA26S00 Sobreexpresar pora 4.1.1.41 erythraea Escherichia panD Asp rtato-l-descarboxilasa BAB96708 4.1.1.11 Sobreexpresar Incrementar Acetil-CoA coli W3110 anK a.k. a Incrementar producción Pantotenato-cinasa AAC76952 2.7.1.33 Sobreexpresar de Acetil-CoA coaA BAB34380 incrementar producción Pi ruvato-deshidrogenasa AAC73227, 1.2.4.1 Sobreexpresar de Acetil-CoA AAC73226 AAC73989, Suprimir o incrementar producción pflB Formiato-acilttansferasa EC: 2.3.1.54 P09373 reducir de Acetil-CoA Reduci r limites en Mu ación plsB Acil ransferasa AAC77011 2.3.1.15 concentración de Acil- D311E CoA E. coli K22 AAC73958, Suprimir o incrementar producción poxB Piruvato 1.2.2.2 NP 415392 reducir de Acetil-CoA AAC75357, Suprimir o incrementar producción pta Fosfo ansacetilasa 2.3.1.8 NP 416800 reducir de Acetil-CoA Pi ridina-nucleótido- Conversión de NADH a CAA 6822 1.6.1.1 Sobreexpresar t anshidroqenasa NADPH o viceversa 3-hidroxibutiril fusionado (3) 2) - 4.2.1.17, -isomerasa 5.1.2.3, Bloquear degradación 5.3.3.8, Suprimir o de ácidos grasos fadB Hidratase y 3-hidroxiacil shid sa AP 003956 1.1.1.35 reduci r E. coli 3- idroxiacil deshidrogenasa; 1.1.1.35, fadj K01692 enoil - idratasa; 3-hidroxibutiril 4.2.1.17, Suprimir o Bloquear degradación Epimerasa AAC75401 5.1.2.3 reduci r de ácidos grasos E. coli Sup imir o Bloquear degradación fadA 3-cetoaci 1-CoA- tiolasa BAE77458 2.3.1.16 reducir de ácidos qrasos E. coli 1.5.1.29, Suprimir o Bloquear degradación fadl Beta-cetoacil-CoA- iolasa AAC75402 E. coli 1.16, reducir de ácidos grasos Suprimir o Bloquear degradación YdiO Acil-coA-deshidrogenasa YP_852786 1.3.99.- E. coli reduci r de ácidos grasos 2. Control de Est ructura 2A.Control de Lonqitud de Cadena Suprimir 1 y Longitud de cadena tesA tioéster P0ADA1 3.1.2.- exp resar C18 tesA sin secuencia AAC73596 Expresar o E. coli guia tioesterasa NP 415027 3.1.1.- sobreexpresar C18:l Umbellular 2 fatB Expresar o ia (umbellular tioesterasa Q41635 3.1.1.- sobreexpresar C12:0 califórnic ia) a faB2 Expresar o Cup ea {umbellular tioes te casa AAC49269 3.1.1.- sobreexpresar C8:0-C10:0 hookeriana ia) fatB tioesterasa AAC72881 3.1.1.- Expresar o Cuphea sobreexpresar C14:0-cl6:0 hookeriana faCB Expresar o Cinamomvn (cínnaraonum) tioesterasa Q39473 3.1.1.- sobreexpresar C14:0 camphora faB[M1 1T] * tioesterasa CAA85388 3.1.1. - Expresar o Arabidopsis sobreexpresar C16:l thaliana fatAl Expresar o eliaitus (Helianthus) tioesterasa AAL79361 3.1.1.- sobreexpresar C18:l annuus NP 189147, Expresar o Arabidopsis Atfata tioesterasa NP 193041 3.1.1. - sobreexpresar C18:l thaliana faCA tioesterasa CAC39106 3.1.1.- Expresar o Brassica sobreexp esa C18:l júncea fatA (cuphea) Expresar o Cuphea tioesterasa AAC72883 3.1.1.- sobreexpresar C18:l hookeziana 2B . Cont rol de Ramificación atenuar FabH expresar FabH de S. Glaucescens y Suprimi r Endogenousa F bH Expresar FabH De B. Subtilis y bloquear endogenousa fabH bdk-E3- dihidroplipoi lo deshidrogenasa Incrementar subunidad EC 1.2.4.4 de rivados de bkd-El- ácidos grasos de alfa/beta cadena subunidad EC 1.2.4.4 ramificada Bkd-£2- Dihidrolip oilo EC Transadla sa 1.2.4.4 Subunidad -subunidad de a-cetoácido- NP_628006 EC Expresar o elaborar precursores de acil- Streptomyces bdkAl descarboxilasa de cadena ranificada de cadena ramificada 1.2.4.4 sobreexpresar coelicolor b- subunidad de a-cetoácido- NP_628005 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces de boxilasa de cadena 1.2.4.4 sobreexpresar aci -coA de cadena coelicolor bdkBl ramificada (Elb) ramificada bdkCl dihidrolipoil- ransa e tí lasa NP_638004 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces (E21 1.2.4.4 sobreexpresar acil-coA de cadena coelicolor ramificada bdfcA2 a- subunidad de a-cetoacido- NP_733618 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces descarboxilasa de cadena 1.2.4.4 sobreexpresar acil-CoA de cadena coelicolor ramificada (Ela) ram f cada bdkB2 b de a-ce oácido- NP_628019 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces descarboxilasa de cadena 1.2.4.4 sobreexp resac acil-coA de cadena coelicolor ramificada (Elb) ramificada bdkC2 dihidrolipoil- transa ce ilasa NP_628018 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces (E2) 1.2.4.4 sobreexpresar acil-CoA de cadena coelicol or ramific da bdtA a- subunidad de a-cetoácido- BAC72074 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces de se rboxilasa de cadena 1.2.4.4 sobreexpresar acil-CoA de cadena avermi tilis ramificada ramificada b- subunidad de a-cetoácido- EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces bdkB descarboxilasa de cadena BAC72075 1.2.4.4 sobreexpresar acil-coA de cadena avermi tilis ramificada ramificada bdfeC dihidrolipoil- transa ce ti lasa BAC72076 EC Expresar o elaborar precursores de Str ptomyces (E2) 1.2.4.4 sobreexpresar acil-coA de cadena avermi tilis ramificada bdk.F a- subunidad de a- ce toác ido- BAC72088 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces de sea rboxil sa de cadena 1.2.4.4 sobreexpresar acil-CoA de cadena avermi tilis ramificada ramificada bdJcG -subunidad de -cetoácido- BAC72089 EC Expresar o e labora recu esores de ec i 1- Streptomyces desca rboxilasa de cadena Tonificada de cadena ranificada 1.2.4.4 sobreexpresar avermi Lilis bdkH din id rolipoil-transace ilasa BAC72090 EC Expresar o elaborar precursores de Streptomyces ÍE2) 1.2.4.4 sobreexpresar acil-coA de cadena avermi tilis ram ficada bdkAA a-subunidad de a-cetoacido- NP_390285 EC Expresar o elaborar precursores de Bacillus descarboxilasa de cadena 1.2.4.4 sobreexpresar acil-CoA de cadena subtilis ramificada (Ela) ramificada -subunidad de a-cetoácido- NP_390284 EC Expresar o elaborar precursores de ecii- Bacillus bdkAB descarboxilasa de cadena ranificada de cadena ranificada 1.2.4.4 sobreexpresar subtil is bdkB dihidrolipoil-transacetilasa NP_390283 EC Expresar o elaborar precursores de Bacillus (E2) 1.2.4.4 sobreexpresar acil-coA de cadena subtilis ramificada -subumdad de -cetoacido- EC Expresar o elaborar precursor de acil- Pseudomonas descarbox de cadena ranificada bdkAl ilasa de cadena ranificada AAA65614 1.2.4.4 sobreexpresar putida subunidad de -cetoácido- EC Expresar o elaborar precursores de acil- Pseudomonas sca rbo ilasa d cadena ranificada de cadena ranificada bdkA2 de (Elb) AAAÓ5ÓÍ5 1.2.4.4 sobreexpresar putida bkdC dihidrolipoil- AAA65617 EC 1.2.4.4 Expresar o laborar precu sores Pseudomonas t ransace til asa sobreex resar de acil-CoA de cadena putida (E2) ramificada lpd NP 414658 1.8.1.4 Expresar o elaborar precursores Esche ichia 5 sobreexp resar de acil-CoA de cadena col i rami f icada llvE YPJD26247 2.6.1.42 Expresar o e laborar a-cetoácidos Esche ichia sobreexpresar ramificados col i llvE AAF34406 2.6.1.42 Expresar o elaborar a-cetoácidos Lactococcus sobreexpresar rami f icados lac tis ??? NP_745648 2.6.1.43 Expresar o elaborar a-cetoácidos Pseudomonas sobreexpresar rami icados putida llvE NP_629657 2.6.1.42 Expresar o elaborar a-cetoácidos Stjeptomy es sobreexpresar ramificados coelicolor ccr crotonil-CoA- NP 630556 1.1.1.9 Expresar o que convierte Streptomyces reductasa sobreexpresar crotonil-CoA a coelicol or butiril-CoA ccr crotonil-CoA- AAD53915 1.1.1.9 Expresar o que convierte Streptomyces reductasa sobreexpresar crotonil-CoA a cinnamonensis butiril-CoA 10 IcmA, isobutiril-CoA- NP 629554 5. .99.2 Expresar o que convierte Streptomyces isobutiril- mu tasa, sub nidad sobreexpresar buti ril-CoA a coelicolor CoA-mu asa A isobutiril-CoA IcmA, isobutiril-CoA- AAC08713 5.4.99.2 Expresar o que convierte Streptomyces ísobutiril- mutasa, subunidad sobreexp resar butiril-CoA a cinnamonensis CoA-rau asa A i sobut i ril-CoA IcmA, isobutir l-CoA- NP 630904 5. .99.13 Expresar o que convierte Streptomyces isobutiril- mu asa, subunidad sobreexp resar butiril-Coñ a coelicol or CoA-mutasa B isobutiril-CoA IcmA, sobutiril-CoA- AJ246005 5. .99.13 Expresar o que convierte Streptomyces isobutiril- mutasa, subunidad sobreexpresar butiril-CoA a cinnamonensis CoA-mutasa B isobuti ril-CoA FabH, AC P y fabB-gen con especificidad para acil- CoAs de cadena carnif cada llvE CAC12788 EC2.6.1.42 sobreexpresar Aminoác ido-amino- S. ca nosus transfe asa de cadena ramificada FabHl Be a-cetoacil-ACP- NP_626634 2.3.1.189 Expresar o Inicio de biosintesis Streptomyces sintasa III sobreexpresar de ácidos g asos de coelicolor cadena ramificada AC Proteína ortadora NP_626635 NINGUNO Expresar o inicio y alargamiento de Strepto yces de aci lo sobreexpresar biosintesis de ácidos grasos coelicol or de cadena ramificada FabF Beta-cetoacil-ACP- NP_626636 2.3.1.179 Expresar o alargamiento de biosintesis Streptomyces sintasa II sobreexpresar de ácidos grasos de cadena coeli col or ramificada F bH3 Be a-cetoacil-ACP- NP_823466 2.3.1.180 Expresar o inicio de biosintesis de Streptomyces sintasa III sobreexpresar ácidos grasos de cadena avermi tilis ramificada FabC3 Proteína portadora NP 823467 NINGUNO Expresar o inicio y alargamiento de Streptomyces (ACP) de aci lo sobreexpresar biosintesis de ácidos grasos avermitilis de cadena ramificada F bF Bet a-ce toaci 1-ACP- NP 823468 2.3.1.179 Expresar o alargamiento de biosintesis Streptomyces sintasa II sobreexpresar de ácido3 grasos de cadena avermi tilis ramificada FabH_A Beta-cetoacil-ACP- NP_389015 2.3.1.180 Expresar o inicio de biosintesis de Bacillus sintasa III sobreexpresar ácidos grasos de cadena subtiliis ramificad FabH_B Beta-cetoacil-ACP- NP_388898 2.3.1.180 Expresar o inicio de biosintesis de Bacillus sintasa III sobreexpresar ácidos grasos de cadena subtiliis ramificada ACP Pro teína por adora NP_3S9474 NINGUNO Expresar o inicio y alargamiento de Bacillus de aci lo sobreexpresar biosintesis de ácidos grasos subtiliis de cadena ramificada FabF Be t a-ce toaci 1-ACP- NP_389016 2.3.1.179 Expresan o alargamiento de biosintesis Bacillus smtasa II sobreexpresar de ácidos grasos de cadena subtiliis ramificada SmalDRAF Beta-cetoacil-ACP- ZP 01643059 2.3.1.180 Expresar o inicio de biosintesis de Stenotrophomonas T 08 sintasa III sobreexpresar ácidos grasos de cadena mal tophilia ramificada 18 SraalDRAF Proteína portadora ZP 01643063 NINGUNO Expresar o inicio y alargamiento de Stenotrophomonas T 08 de aci lo sobreexpresar biosintesis de ácidos grasos mal tophilia de cadena ramificada 21 SmalDRAF Be a-cetoacil-ACP- ZP 01643064 2.3.1.179 Expresar o alargamie to de bios inte sis S t eno trophomonas T 08 sintasa II sobreexpresar de ácidos grasos de cadena mal tophilia ramificada 22 FabH Beta-cetoacil-ACP- YP 123672 2.3.1.180 Expresar o inicio de biosintesis de Legionela sintasa III sobreexpresar ácidos grasos de cadena pneumophila ramificada ACP Pro teína portado a YP 123675 NIGUNO Expresar o inicio y alargamiento de Legionela de aci lo sobreexpresar biosintesis de ácidos grasos pneumophila de cadena rami icada FabF Beta-cetoacil-ACP- YP 123676 2.3.1.179 Expresar o alargami nto de biosintesis Legionela sintasa II sobreexpresar de ácidos grasos de cadena pneumophila ramificada Fa H Bet a-ce toaci 1-ACP- NP 415609 2.3.1.180 suprimir o inicio de biosintesis de Escherichia eolia sintasa III reduci ácidos grasos de cadena ramificada FabF Beta-cetoaci 1-ACP- NP 415613 2.3.1.179 Suprimir o Alargamiento de Escheri chia Para s ntasa reduci r biosintesis de ácidos coli producir grasos de cadena Ácidos ramificada Grasos Ciclicos AnsJ Deshidrasa (putativa) No No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces disponible sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA collinus AnsK CoA-iigasa (putativa) No No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomy es disponible sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA collinus AnsL Deshidrogenasa No No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces (putativa) disponible sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA collinus ChcA Enoil-CoA- reductasa U72144 El.3.1.34 Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA collinus AnsM Oxidorecutasa No No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces (putativa) disponible sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA collinus PlmJ Deshidrasa (putativa) AAQ84158 No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreex resar ciclohexilcarbonil-CoA sp. EK803 PlmK CoA-l gasa (putativa) AAQ8 158 No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreexpresar iclohexilcarbonil-CoA sp. HK8Q3 PlraL Deshidrogenasa AAQ84159 No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces (putativa) sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA sp. HK803 ChcA Enoil-CoA-reductasa AAQ84160 El.3.1.34 Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA sp. HK803 PlmM Oxidorecutasa AAQ8 161 No disponible Expresar o Biosintesis de S rep omyces (putativa) sobreexoresar ciclohexilcarbonil-CoA sp. K803 ChcB Enoil-CoA-is me asa AF268489 No disponible Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA collinus ChcB/Caid Enoil-CoA-isomerasa NP_629292 4.2.1- Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreexpresar ciclohexilcarbóni1-CoA coelicolor ChcB/Caid Enoil-CoA-isome asa NP_824296 4.2.1- Expresar o Biosintesis de Streptomyces sobreexpresar ciclohexilcarbonil-CoA ávermitilia 2C. Control de Nivel de Saturación Sfa Supresor de FabA AAN79592, Can' t find sobreexpresar Incrementar ácidos Ver AAC44390 grasos E. coli también monoinsaturados FabA en expresar Producir ácidos sec. 1 grasos insaturados GnsA Supresores de la ABD18647.1 NINGUNO sobreexpresar Incrementar ésteres E. coli mutación nula secG de ácidos grasos insaturados GnsB Supresores de la AAC74076.1 NINGUNO sobreexpresar Inc rementar este es E. coli mutación nula secG de ácidos grasos insaturados Ver también sección 2A.- puntos con:0 están insaturados (no dobles enlaces) y con :1 están saturados (1 doble enlace) fabB 3-oxoacil- [proteina BAA16180 EC.2.3.1.41 Sobreexpresar Modular p oducción Escherichiá portadora de acilo] de ácidos grasos coli sintasa I insatu ados fabK Trans-2-enoil-ACP- AAF98273 1.3.1.9 Expresar Modula p oducción Streptococcus reductasa II de ácidos grasos pneumoniae insaturados fabL Enoil- {proteina AAU39821 1.3.1.9 Expresar Modular producción Bacillus portadora de acil) - de ácidos grasos lichenifor is reductasa insaturados DSM 13 fabM DAA05501 5.3.3.14 sobreexpresar Modular producción Streptococcus de ácidos grasos mutaris insaturados 3. Producción de Producto Final 3". Producción de Cera AT3G51 70 Alcohol de cadena NP_190765 2.3.1.75 Expresar Producción de cera Arabidopsis larga-O-graso- thaliana acilt ansferasa Tioésterasa (ver 3.1.2.14 Expresar Incrementar sección de control de producción de longitud de cadena) ácidos grasos Acil-CoA- reductasa 1.1.1. * Expresar Convertir acil-CoA fonnadora de alcohol a alcohol graso graso acrl Acil-CoA- reduc asa YP_047869 1.2.1.50 Expresar Conve i acil-CoA Acinectobac cer (ACR1) a alcohol graso sp. ADP1 yqhD Alcohol-deshidrogenasa AP 003562 1.1.1.1 Expresar Incrementar, £. coli W3110 EL01 alargami nto de ácido BAD98251 2.3.1.74 Expresar P oducer ácidos Pichia anqvsta graso grasos de cadena muy larga plsC Aci11rans ferasa AAA16514 2.3.1- Expresar S cha omyces cerevisiae DAGAT Diacilglicerol- AAF19262 2.3.1.20 expresar Producción de cera Arabidopsis transferasa thaliana hWS Alcohol-aciltransferasa AAX48018 Can' t find expresar Producción de Homo sapiens de cera de acil-CoA cera aftl Éster-sintasa de cera AA017391 2.3.1.20 Expresar Producción de Acjnetoiiacte-r sp. bifuncíonal/axi1- cera ADP1 CoA:diacilglicerol- aciltransferasa mWS Cera-ésce -sintasa AAD38041 2.3.1.75 Expresar Producción de Siamondsia (simmondsia) cera chinensis 3B . Producción de Alcohol Graso Varias tioesterasas 3.1.2.14 Expresar Producir (refer a Sec. 2A) acrl Acil-CoA-reductasa YP 047869 1.2.1.50 Expresar Producir ñcinetobacter sp. ADP1 yqhD Alcohol-deshidrogenasa AP 003562 1.1.1.1 Expresar Producir Escherichia eolia BmFAR FAR (aci 1-CoA-reductasa BAC79425 1.1.1.* Expresar reducir acil- Bombyx mori formadora de alcohol CoA graso a qraso) alcohol graso Akrla4 Aldehído-reductasa NP_067448 1.1.1.21 Expresar Producir Mus mvsculus microsómica de mamífero GTNG_1865 Aldehido-deshidrogenasa YP_001125970 1.2.1.48 Expresar Producir Geobacillus 0 de cadena larga ther odeni trificans NGSO-2 FadD Acil-CoA-sintasa NP 416319 EC 6.2.1.3 Expresar Producir más E. coli K12 Para elaborar butanol atoB Acet il-CoA- YP_049388 2.3.1.9 Expresar Producir Erwinia carotovora acetiltransíerasa butyribibrio Hbd Beta-hidroxibutiril - BAD51424 1.1.1.157 Expresar Producir Fibrisolvens CoA-deshidrogenasa CPE0095 C rotonasa BAB79801 4.2.1.17 Expresar Producir Clos tridium perfrinqens Bed Buti ril-CoA- AAM14583 Can' t f ind Expresar Producir Clostridium des idrogenasa beijerinckii ALDH CoA-deshidrogenasa AAT66436 Can' t find Expresar Producir Clostridium acilada beijeri ckii AdhE Aldehido-alcohol - AAN80172 1.1.1.1 Expresar Producir Escherichia coli 5 deshid ogenasa 1.2.1.10 CFT073 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos un péptido seleccionado de accA (EC 6.4.1.2), accB (EC 6.4.1.2), accC (EC 6.4.1.2), accD (EC 6.4.1.2), aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), acpP (AAC74178), fadD (EC 2.3.1.86), cerl (EC 4.1.99.5), fabA (EC4.2.1.60) , fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabl (EC 1.3.1.9), fabZ (EC 4.2.1.-), lipasa (EC 3.1.1.3), malonil-CoA-descarboxilasa (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), panD (EC 4.1.1.11), panK (EC 2.7.1.33), pdh (EC 1.2.4.1), udhA (EC 1.6.1.1) y combinaciones de las mismas, y un péptido que comprende una sintasa de cera (EC 2.3.1.75). 2. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos un péptido seleccionado de accA (EC 6.4.1.2), accB (EC 6.4.1.2), accC (EC 6.4.1.2), accD (EC 6.4.1.2), aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), acpP (AAC74178), fadD (EC 2.3.1.86), cerl (EC 4.1.99.5), fabA (EC4.2.1.60) , fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabl (EC 1.3.1.9), fabZ (EC 4.2.1.-), lipasa (EC 3.1.1.3), malonil-CoA-descarboxilasa (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), panD (EC 4.1.1.11), panK (EC 2.7.1.33), pdh (EC 1.2.4.1), udhA (EC 1.6.1.1) y combinaciones de las mismas, y un péptido que comprende un alcohol-acetiltransferasa (2.3.1.84). 3. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos un péptido seleccionado de accA (EC 6.4.1.2), accB (EC 6.4.1.2), accC (EC 6.4.1.2), accD (EC 6.4.1.2), aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), acpP (AAC74178), fadD (EC 2.3.1.86), cerl (EC 4.1.99.5), fabA (EC .2.1.60), fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabl (EC 1.3.1.9), fabZ (EC 4.2.1.-), lipasa (EC 3.1.1.3), malonil-CoA-descarboxilasa (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), panD (EC 4.1.1.11), panK (EC 2.7.1.33), pdh (EC 1.2.4.1), udhA (EC 1.6.1.1) y combinaciones de las mismas, y un péptido que comprende un alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). 4. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para al menos un péptido seleccionado de accA (EC 6.4.1.2), accB (EC 6.4.1.2), accC (EC 6.4.1.2), accD (EC 6.4.1.2), aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), acpP (AAC74178), fadD (EC 2.3.1.86), cerl (EC 4.1.99.5), fabA (EC4.2.1.60) , fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabl (EC 1.3.1.9), fabZ (EC 4.2.1.-), lipasa (EC 3.1.1.3), malonil-CoA-descarboxilasa (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), panD (EC 4.1.1.11), panK (EC 2.7.1.33), pdh (EC 1.2.4.1), üdhA (EC 1.6.1.1) y combinaciones de las mismas, y un péptido que comprende una acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso (1.1.1.*). 5. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias endógenas atenuadas de ácido nucleico seleccionadas de ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (acceso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa-sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de las mismas, y una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para un segundo péptido que comprende una sintasa de cera (EC 2.3.1.75) o una aciltransferasa (EC 2.3.1.84). 6. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias endógenas atenuadas de ácido nucleico seleccionadas de ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (acceso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa-sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de las mismas, y una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para un péptido que comprende un alcohol-acetiltransferasa (EC 2.3.1.84). 7. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias endógenas atenuadas de ácido nucleico seleccionadas de ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (acceso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa-sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de las mismas, y una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican · para un péptido que comprende un alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). 8. Microorganismo, caracterizado porque comprende una o más secuencias endógenas atenuadas de ácido nucleico seleccionadas de ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (acceso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa-sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de las mismas, y una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para un péptido que comprende una acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso (1.2.1.*). 9. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque es una E. coli. 10. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende adicionalmente un derivado de ácido graso. 11. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende adicionalmente una secuencia nucleica exógena que codifica para ACP, Sfa, o combinaciones de las mismas. 12. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque expresa una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para una enzima seleccionada de uno o más componentes del complejo de ceto-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada (EC 1.2.4.4), Uve (EC 2.6.1.42), lpd (EC 1.8.1.4), Ccr (EC 1.1.19), IcmA (EC 5.4.99.2), IcmB (5.4.99.13), fabH (EC 2.3.1.180), fabF (EC 2.3.1.179), fabH3 (EC 2.3.1.180), fabC3 (NP_823468), beta-cetoacil-ACP-sintasa II (EC 2.3.1.180), enoil-CoA-reductasa (EC 1.3.1.34), enoil-CoA-isomerasa (EC 4.2.1.-), y combinaciones de las mismas, en donde el derivado de ácido graso está ramificado. 13. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el microorganismo expresa una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para una tioesterasa (3.1.2.-, 3.1.1.-). 14. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el microorganismo expresa una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para una enzima seleccionada de fabB (EC 2.3.1.41), fabK (EC 1.2.1.9), fabL (EC 1.2.1.9), fabM (5.3.3.14), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-) y combinaciones de las mismas y en donde el derivado de ácido graso está insaturado. 15. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque fadE está atenuado. 16. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque se sobre-expresan accABCE, fadD. 17. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque está en un recipiente que comprende un caldo de fermentación que comprende al menos 10 mg/L de éster de ácido graso, 10 mg/L de alcohol graso, 10 mg/L de hidrocarburo o al menos 10 mg/L de cera . 18. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el derivado de ácido graso comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dobles enlaces. 19. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el derivado de ácido graso comprende una longitud de cadena de carbono de aproximadamente 8 a aproximadamente 30. 20. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el derivado de ácido graso comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 puntos de ramificación. 21. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende adicionalmente un éster de ácido graso, o cera, que tiene un lado A y un lado B. 22. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el lado A y el lado B se producen por el microorganismo. 23. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el lado A, el lado B, o tanto el lado A como el lado B, comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dobles enlaces. 24. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el lado A, el lado B, o tanto el lado A como el lado B, comprenden una longitud de la cadena de carbono de aproximadamente 1 a aproximadamente 26. 25. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el lado A, el lado B, o tanto el lado A como el lado B, comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 puntos de ramificación de carbonos. 26. Microorganismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el lado A, el lado B, o tanto el lado A como el lado B, comprenden entre 1 y 5 porciones de ciclopropilo. 27. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque es Arthroj acter sp. , Bacillus sp. , Botryococcus braunii, Chromatium sp., Cladosporium resina (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum , Clostridium acidiurici , Corynebacterium species, cyanobacterial species (Nostoc muscorum , Anacystis (Synechococcus) nidulans , Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii , Trichodesmium erythaeum , Oscillatoria williamsii , Microcoleus chthonoplaseis , Coccochloris elabens , Agmenellum quadruplicatum , Plectonema terebrans , M vaginatus , y C. scopulorum) , Desulfovibrio (desulfuricans (ATCC29577), Kíneococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516) , Micrococcus lysodeikticus , Mycobacterium species, Penicillium sp. , Aspergillus sp., Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456) , Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp. , Rhodospirillium rubrum (ATCC 11170) , Rhodomicrobium vanielii , Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis) , Vibrio furnissii MI, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus , Serratia marinorubra , Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri , Sphacelotheca reiliana , o Tilletia sp. (foetida, caries, controversa) . 28. Método para producir un alcohol graso, caracterizado porque comprende cultivar el microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8 bajo condiciones suficientes para producir un alcohol graso; y separar el alcohol graso. 29. Método para producir un éster de ácido graso, caracterizado porque comprende cultivar el microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6, 7 ó 21-25 bajo condiciones suficientes para producir un éster de ácido graso; y separar el éster de ácido graso. 30. Método para producir una cera, caracterizado porque comprende cultivar el microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6, 7 ó 21-25 bajo condiciones suficientes para producir una cera; y separar la cera . 31. Microorganismo seleccionado de Arthrohacter sp. , Bacillus sp. , Botryococcus braunii, Chromatium sp. , Cladosporium resina (ATCC22711) , Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum, Clostridium acidiurici , Corynebacterium species, cyanobacterial species (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans , Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii , Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii, Microcoleus chthonoplaseis , Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum , Plectonema terebrans , M vaginatus , y C. scopulorum) , Desulfovibrio (desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516), Micrococcus lysodeikticus , Mycobacterium species, Penicillium sp. , Aspergillus sp. , Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456) , Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp. , Rhodospirillium rubrum (ATCC 11170) , Rhodomicrobium vanielii , Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwiggi (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis) , Vibrio furnissii MI, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus , Serratia marinorubra , Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri , Sphacelotheca reiliana , o Tilletia sp. (foetida, caries, controversa) , caracterizado porque comprende una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido seleccionado de accA (EC 6.4.1.2), accB (EC 6.4.1.2), accC (EC 6.4.1.2), accD (EC 6.4.1.2), aceE (EC 1.2.4.1, 2.3.1.61, 2.3.1.12), aceF (EC 1.2.4.1, 2.3.4.16, 2.3.1.12), acpP (AAC74178), fadD (EC 2.3.1.86), cerl (EC 4.1.99.5), fabA (EC4.2.1.60) , fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabl (EC 1.3.1.9), fabZ (EC 4.2.1.-), lipasa (EC 3.1.1.3), malonil-CoA-descarboxilasa (EC 4.1.1.9, 4.1.1.41), panD (EC 4.1.1.11), panK (EC 2.7.1.33), pdh (EC 1.2.4.1), udhA (EC 1.6.1.1) y combinaciones de las mismas, en donde el microorganismo produce cantidades incrementadas de hidrocarburos en comparación al microorganismo tipo silvestre. 32. Microorganismo seleccionado de Arthrobacter sp. , Bacillus sp. , Botryococcus braunii, Chromatium sp., Cladosporium resina (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum , Clostridium acidiurici , Corynebacterium species, cyanobacterial species (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans , Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii , Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii , Microcoleus chthonoplaseis , Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum , Plectonema terebrans , M vaginatus , y C. scopulorum) , Desulfovibrio (desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516) , Micrococcus lysodeikticus , Mycobacterium species, Penicillium sp. , Aspergillus sp. , Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456) , Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp. , Rhodospirillium rubrum (ATCC 11170) , Rhodomicrobium vanielii , Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis) , Vibrio furnissii MI, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus , Serratia marinorubra , Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri , Sphacelotheca reiliana , o Tilletia sp. (foetida, caries, controversa) , caracterizado porque comprende una o más secuencias endógenas atenuadas de ácido nucleico seleccionadas de ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (acceso NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), IdhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54), plsB (EC 2.3.1.15), poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutationa-sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de las mismas, en donde el microorganismo produce cantidades incrementadas de hidrocarburos en comparación al microorganismo tipo silvestre. 33. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, caracterizado porque adicionalmente expresa una enzima seleccionada de una sintasa de cera (EC 2.3.1.75), un alcohol-acetiltransferasa (2.3.1.84), un alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), y una acil-CoA-reductasa formadora de alcohol graso (1.1.1.*). 34. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 y 32, caracterizado porque expresa una o más secuencias de ácido nucleico que codifican para una enzima seleccionada de uno o más componentes del complejo de ceto-ácido-deshidrogenasa de cadena ramificada (EC 1.2.4.4), Uve (EC 2.6.1.42), lpd (EC 1.8.1.4), Ccr (EC 1.1.19), IcmA (EC 5.4.99.2), IcmB (5.4.99.13), fabH (EC 2.3.1.180), ACP (acceso NP_626635) , fabF (EC 2.3.1.179), fabH3 (EC 2.3.1.180), fabC3 (NP_823468), beta-cetoacil-ACP-sintasa II (EC 2.3.1.180), enoil-CoA-reductasa (EC 1.3.1.34), enoil-CoA-isomerasa (EC 4.2.1.-), y combinaciones de las mismas, en donde está ramificado el derivado de ácido graso. 35. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 y 32, caracterizado porque expresa una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para una tioesterasa (3.1.2.-, 3.1.1.-). 36. Microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 y 32, caracterizado porque expresa una o más secuencias exógenas de ácido nucleico que codifican para una enzima seleccionada de FadA (EC 2.3.1.16), FadI (EC 2.3.1.16), FadB (EC 2.3.1.41), FadJ (EC 4.2.1.17, EC 5.1.2.3, EC 5.3.3.8, EC 1.1.1.35), FabK (EC 1.2.1.9), FabL (EC

1.

2.1.9), FabM (5.

3.3.14) y combinaciones de las mismas. 37. Método para obtener un derivado purificado de ácido graso, caracterizado porque comprende: cultivar un microorganismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, y 31-36, bajo condiciones suficientes para producir un derivado de ácido graso; permitir que el derivado de ácido graso se separe en una fase orgánica; y purificar el derivado de ácido graso de la fase orgánica. 38. Composición de biocombustible, caracterizado porque comprende: al menos aproximadamente 85 % de un derivado de ácido graso, en donde el derivado de ácido graso comprende una cadena de carbonos seleccionada del grupo que consiste de 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ó 22:3; y al menos un aditivo suficiente para disminuir el punto de turbidez de la composición de biocombustible a menos de aproximadamente 0°C. , 39. Composición de biocombustible, caracterizado porque comprende: al menos aproximadamente 17 % de un derivado de ácido graso, en donde el derivado de ácido graso comprende una cadena de carbonos seleccionada del grupo que consiste de 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ó 22:3; y al menos aproximadamente 80 % de combustible diesel convencional . 40. Composición de biocombustible, o materia prima, caracterizada porque comprende un derivado de ácido graso que tiene 613C de aproximadamente -10.9 a aproximadamente -15.4, en donde el derivado de ácido graso da cuenta de al menos aproximadamente 85 % de material biosurtido en la composición. 41. Composición de biocombustible, o materia prima, caracterizada porque comprende un derivado de ácido graso de la fórmula X-(CH(R) )nCH3 en donde X representa CH3, -CH2OR1; -C(0)OR2; o - C (O) NR3R4; R es, para cada n, independientemente, ausente, H o alifático inferior; n es un número entero de 8 a 34; y R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H y alquilo inferior; en donde el derivado de ácido graso tiene una 613C de aproximadamente -10.9 a aproximadamente -15.4; y el derivado de ácido graso da cuenta de al menos aproximadamente 85 % del material biosurtido en la composición. 42. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el derivado de ácido graso da cuenta de al menos aproximadamente 85 % del material biosurtido derivado de ácido graso en la composición. 43. Composición de biocombustible o materia prima de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el derivado de ácido graso tiene una fracción de carbono moderno (fM14C) de al menos aproximadamente 1.003. 4

4. Composición de biocombustible o materia prima de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque R es, para cada n, seleccionada independientemente de H, metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, seg-butilo y ciclopentenilo . 4

5. Composición de biocombustible o materia prima de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la fórmula (CH(R) )n comprende al menos una porción de alquenilo. 4

6. Composición de biocombustible o materia prima de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el derivado de ácido graso comprende una cadena de carbonos seleccionada del grupo que consiste de 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ó 22:3. 4

7. Composición de biocombustible o materia prima de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque además comprende un alcohol inferior en la composición de biocombustible . 4

8. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el alcohol inferior se selecciona de etanol, butanol, hexanol o combinaciones de las mismas. 4

9. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque además comprende un agente tensioactivo . 50. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque comprende una microemulsión . 51. Composición de biocombustible, caracterizada porque comprende: al menos aproximadamente 55 % de un derivado de ácido graso en donde el derivado de ácido graso comprende una cadena de carbonos seleccionada del grupo que consiste de 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ó 22:3; y al menos un aditivo suficiente para disminuir el punto de turbidez de la composición de biocombustible a menos de aproximadamente 0°C. 52. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el derivado de ácido graso tiene una 513C de aproximadamente -

10.9 a aproximadamente -15.4. 53. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque además comprende un alcohol inferior. 54. Composición de biocombustible, caracterizada porque comprende: al menos aproximadamente 11 % de un derivado de ácido graso en donde el derivado de ácido graso comprende una cadena de carbonos seleccionada del grupo que consiste de 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 ó 22:3; y al menos aproximadamente 80 % de combustible diesel convencional . 55. Composición de biocombustible o materia prima, caracterizada porque comprende un derivado de ácido graso de la fórmula X-(CH(R) )nCH3 en donde X representa CH3, -CH2OR1; -C(0)OR2; o - C (O) NR3R4; R es, para cada n, independientemente, ausente, H o alquilo inferior, con al menos un R que es alquilo inferior; n es un número entero de 8 a 34; R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H y alquilo inferior; y en donde el derivado de ácido graso tiene una 513C de aproximadamente -10.9 a aproximadamente -15.4. 56. Composición de biocombustible de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque el derivado de ácido graso es al menos aproximadamente 10 % de la composición de biocombustible. 57. Composición de biocombustible, caracterizada porque consiste esencialmente de un derivado de ácido graso de la fórmula X-(CH(R) )nCH3 en donde X representa CH3, -CH2OR1; -C(0)OR2; o -C(0)NR3R4; R es, para cada n, independientemente, ausente, H o alquilo inferior; n es un número entero de 8 a 34; y R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H y alquilo inferior; en donde el derivado de ácido graso tiene una 513C de aproximadamente -10.9 a aproximadamente -15.4. 58. Biocombustible de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-57, caracterizado porque comprende menos de .1 % de glicerina. 59. Biocombustible de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-58, caracterizado porque comprende menos de 0.1 % de catalizador de transesterificación .