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ES2396823B1 - Producción de biodiesel a partir de glicerina. - Google Patents

Producción de biodiesel a partir de glicerina. Download PDF

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Abstract

Producción de biodiesel a partir de glicerina.#La presente invención describe cepas bacterianas de la especie B. subtilis CECT 7968 y 7969, capaces de expresar los genes mutados sintéticos heterólogos: pdc y adhB originarios de Z.mobilis, ?tesA originario de E. coli y atfl originario de Acinetobacter sp. ADP1. Adicionalmente, dichas cepas pueden sobre-expresan al menos uno de los genes de los complejos enzimáticos ACC (acetil-CoA carboxilasa) y acil CoA sintetasa. Mediante dichas cepas se produce un incremento en la producción de biocombustible, preferentemente biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono. Además, la presente invención describe el uso de dichas cepas bacterianas para la producción de dicho biocombustible, biodiesel, a partir de glicerina, así como un procedimiento de síntesis de biocombustible, preferentemente biodiesel, mediante la utilización de las cepas descritas en la presente invención y el biocombustible propiamente obtenido.

Description

Producción de biodiesel a partir de glicerina.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención divulga un procedimiento para la síntesis de ésteres etílicos de ácidos grasos, también conocidos como biodiesel (FAEE en sus siglas en inglés) a partir de glicerina o glicerol. Por tanto la presente invención puede englobarse dentro del campo de las biorefinerías industriales.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La glicerina cruda o glicerol es un subproducto del proceso de fabricación de biodiesel en las biorefinerías industriales. La principal función del biodiesel es su utilización como combustible en sustitución de los combustibles derivados del petróleo, debido a los problemas inherentes que genera el uso de combustibles derivados del petróleo, en cuanto a contaminación, efecto invernadero y calentamiento global, existiendo así la necesidad de una fuente renovable del petróleo que, además, pueda producirse económicamente.
En este sentido, el biodiesel puede ser utilizado en la mayoría de los motores de combustión interna diesel, ya sea en forma pura, lo que se conoce como "biodiesel limpio", o como una mezcla a cualquier concentración con combustible diesel derivado de petróleo. El biodiesel ofrece ventajas frente a los derivados diesel del petróleo, incluyendo, la reducción de emisiones de gases durante su combustión, además de ser capaz de mantener un ciclo de dióxido de carbono equilibrado, ya que se basa en el uso de materiales biológicos renovables, es biodegradable y da mayor seguridad debido a su alto punto de inflamación y baja inflamabilidad. Otra ventaja es el menor desgaste de los motores, gracias a las buenas propiedades de lubricación que presenta.
Uno de los usos a los que se puede dedicar la glicerina que se obtiene como subproducto en la producción de biodiesel es la propia obtención de biodiesel mediante un proceso alternativo que comprende utilizar dicha glicerina (glicerol) como sustrato en procesos fermentativos bacterianos.
El biodiesel se obtiene principalmente, a partir de aceites vegetales o grasas animales, mediante procesos industriales de esterificación y transesterificación (Figura 1) (Karmakar A., et al 2010). La glicerina formada en el proceso de obtención de biodiesel industrial, en un desecho industrial del que hay que deshacerse, debido al bajo coste del mismo en los últimos años.
Actualmente, una de las preocupaciones más importantes en el campo de las biorefinerías industriales, es como dar salida a este subproducto que está causando un gran impacto negativo a nivel económico y medioambiental en dichas empresas. Una planta de biodiesel de origen vegetal que genere alrededor de 250.000 toneladas de biodiesel/año, produce un 10% de glicerina, es decir, unas 25.000 toneladas/año de glicerina. Deshacerse de dicho subproducto implica unos enormes gastos, como por ejemplo, el transporte del mismo para, eventualmente, proceder a su posterior comercialización. Ante esta situación, el desarrollo de procesos biotecnológicos encaminados a la conversión de la glicerina cruda en productos de alto valor añadido, es una “necesidad”. Estos procesos biotecnológicos podrían incorporarse en plantas de biodiesel ya existentes, donde se procesaría in situ la glicerina generada como subproducto de la fabricación de dicho biodiesel, o dar lugar a biorefinerías que integren múltiples procesos, en un concepto análogo al utilizado para las refinerías industriales, las cuáles producen múltiples combustibles y productos a partir del petróleo.
Desde hace años se han venido utilizado diferentes cepas bacterianas, principalmente de la especie Escherichia coli, para la producción de FAEE, lográndose avances significativos en el entendimiento de la vía de la síntesis de lípidos y su regulación en bacterias. Dicha regulación se ha presentado, en el pasado, como el principal factor limitante para la utilización de bacterias o plantas como "fábricas" de aceites o combustibles. Vaneechoutte M. et al, describen que para producir FAEE a partir de E. coli, es necesaria la esterificación del etanol producido en el metabolismo de la síntesis de dichos FAEE con los restos acilo unidos a la Coenzima A, mediante la sobre-expresión de la enzima sintetasa de triacilgliceroles y ceras (Atf1) de Acinetobacter baylyi (Atsumi S, et al. 2008). Dicha cepa de E. coli transformada, es capaz de producir concentraciones de FAEE de 1.3 g/L con un rendimiento de producción de 0.018 g/(L/h) en presencia de glucosa y ácido oleico (Atsumi S, et al. 2008). En este mismo sentido, Kalscheuer R. et al, demostraron que mediante la expresión heteróloga en E. coli de las enzimas piruvato decarboxilasa (Pdc) y alcohol deshidrogenasa (AdhB) de Zymomonas mobilis y la sintetasa inespecífica (Atf1) de Acinetobacter cepa baylyi ADP1, se consigue la producción de FAEE (Kalscheuer R. et al 2008). Dicha síntesis del etanol se combinó con la posterior esterificación del mismo con los restos de acilo del Coenzima A de ácidos grasos cuando las bacterias se cultivaban en condiciones aeróbicas, en presencia de glucosa y ácido oleico.
La solicitud de patente internacional WO2011/038134, divulga también la producción de biodiesel a partir de organismos bacterianos modificados genéticamente. Dicha solicitud internacional muestra ejemplos de bacterias E. coli capaces de producir biodiesel gracias a la expresión o sobreexpresión de un gen que codifica para una tioesterasa, de un gen que codifica para una Acil-CoA sintetasa y de un gen que codifica para una éster-sintasa. El biocombustible generado por las bacterias descritas en dicha solicitud internacional está compuesto principalmente por ácidos grasos lineales de número par de carbonos, en promedio, el 50% de los mismos, con una insaturación.
Otros autores también han divulgado la producción de biocombustibles a partir de la conversión de glicerol en etanol por medio de diferentes cepas de E.coli modificadas genéticamente con el propósito de producir dichos biocombustibles (Shams Yazdani S. et al 2008; da Silva GP. et al. 2009; Choi WJ. 2008). Otras especies bacterianas, también han sido modificadas genéticamente para la producción de dicho biocombustible mediante la transformación de glicerol en etanol. Por ejemplo, cepas mutantes de Klebsiella pneumoniae, obtenidas mediante irradiación
y transformadas con los genes pdc y adhII obtenidos de Z. mobilis y que sobre-expresan las enzimas pdc y adh, respectivamente, muestran una producción de etanol a partir de glicerol de 25 g/L (Oh BR. et al, 2011). Hasta la fecha, las principales cepas bacterianas utilizadas para la síntesis de FAEE a partir de glicerol han sido cepas patógenas (o potencialmente patógenas), como por ejemplo, Z. mobilis y E. coli, como se ha comentado previamente.
La finalidad de la obtención de dichas cepas bacterianas, capaces de sintetizar FAEE a partir de glicerol, es que dichas cepas sean capaces de secretar al exterior los FAEE sintetizados. En este sentido, las bacterias remanentes que queden en el medio, al ser tóxicas, pueden constituir un problema de manejo de residuos tóxicos, ya que, por ejemplo, E. coli es la responsable de la contaminación entérica de aguas de consumo (coliformes).
La presente invención describe un método de producción de biodiesel (FAEE) a partir de glicerina como fuente de carbono, mediante la transformación de bacterias no patógenas, del género Bacillus, con diferentes genes mutados sintéticos heterólogos, implicados en la síntesis de dichos FAEE. Las bacterias del género Bacillus están aprobadas para consumo en humanos y son utilizadas a gran escala en la industria como biofactorías para la producción de diferentes enzimas y proteínas (Westers et al. 2004). Más específicamente, la invención divulga bacterias de la especie Bacillus subtilis transformadas con genes mutados sintéticos heterólogos, diseñados específicamente para aumentar su expresión en las bacterias de dicha especie. En este sentido, se han aislado los genes de las enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) (SEQ ID NO: 1) y alcohol deshidrogenasa (adhB) (SEQ ID NO: 3) pertenecientes a Zymomonas mobilis, además de la porción activa de la enzima tioesterasa A (’tesA) (SEQ ID NO: 5) de Escherichia coli y la sintetasa de triacilgliceroles y ceras (atf1) (SEQ ID NO: 7) de Acinetobacter sp. ADP1. A partir de las secuencias de dichos genes, se han obtenido los correspondientes genes mutados sintéticos de las enzimas pdc (SEQ ID NO: 2), adhB (SEQ ID NO: 4),’tesA (SEQ ID NO: 6) y atf1 (SEQ ID NO: 8), con los que se ha transformado a las bacterias B. subtilis descritas en la presente invención. Además, para incrementar el rendimiento en la producción de biodiesel mediante las bacterias descritas en la presente invención, se puede sobre-expresar, en las mismas, al menos uno de los propios genes de B. subtilis que codifican para las enzimas acil-CoA sintetasas (lcfA, yhfL e yhfT) (E.C.
6.2.1.1) y para las cuatro subunidades de la enzima acetil-CoA carboxilasa (accDABC) (E.C. 6.4.1.2). Es interesante indicar que, además, las bacterias del género B. subtilis son capaces de crecer utilizando glicerol como única fuente de carbono y energía.
Al mismo tiempo, la utilización de las cepas descritas en la invención para la síntesis de FAEE a partir de glicerina, presentan las siguientes ventajas:
A nivel de procesos en general (habilidad para consumir sustratos, masa celular máxima
alcanzable, rendimientos, etc), B. subtilis es tanto o más eficiente que E. coli (Westers et al.,
2004).
B. subtilis no es patógena y de hecho se utiliza como probiótico para animales de consumo humano. Además, los FAEE serían secretados fuera de la célula y las bacterias remanentes, en lugar de constituir un problema de manejo de residuos tóxicos, tendrían valor agregado, mientras que E. coli o K. pneumoniae no podrían utilizarse para tal fin, al ser patógenas.
La ruta de síntesis de ácidos grasos en B. subtilis permite manipular con relativa sencillez modificaciones en la metilación omega-terminal de los FAEE, lo que puede llevar a la producción de biocombustibles con distintas o mejores propiedades que los FAEE lineales sintetizados habitualmente, como por ejemplo la producción de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados.
B. subtilis secreta eficientemente enzimas hidrolíticas, como glucanasas, amilasas, lipasas, celulasas, etc, lo que permite adaptar dicha bacteria para la degradación de otros compuestos baratos, como fuente de carbono, que no son asimilables directamente por E. coli u otros organismos.
Las modificaciones genéticas propuestas en la presente invención son muy estables en B. subtilis ya que la sencilla integración en distintos lugares de su genoma hace innecesario el uso de plásmidos replicativos.
Por lo tanto, para resolver el problema del exceso de glicerina derivada de los procesos de producción de biodiesel, junto con la necesidad de obtener un biocombustible que no presente, como se ha mencionado anteriormente, tantas desventajas como los combustibles derivados del petróleo, la presente invención describe cepas de la especie B. subtilis capaces de incrementar la producción de biodiesel a partir del propio subproducto, glicerina, como fuente de carbono, al estar transformadas con genes mutados sintéticos heterólogos, capaces de inducir una expresión más eficiente en B. subtilis, obtenidos en base a los genes: pdc (SEQ ID NO:1) y adhB (SEQ ID NO:3) originarios de Z. mobilis, ´tesA (SEQ ID NO:5) originario de E. coli y atf1 (SEQ ID NO:7) originario de Acinetobacter sp. ADP1. Adicionalmente, las cepas de la presente invención, sobre-expresan al menos uno de los genes de los complejos enzimáticos ACC (acetil-CoA carboxilasa) (E.C. 6.4.1.2) y acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1). La presente invención describe a su vez el uso de dichas cepas para la síntesis de biodiesel y un método de obtención de biodiesel, a partir de glicerina como fuente de carbono, basado en el uso de dichas cepas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
Para solventar los problemas expuestos anteriormente, la presente invención describe cepas bacterianas de la especie B. subtilis CECT 7968 y 7969, que han sido transformadas con genes mutados sintéticos heterólogos optimizados para una expresión más eficiente en B. subtilis y que además, para incrementar el rendimiento en la producción de biodiesel mediante el uso de dichas cepas bacterianas, sobre-expresan al menos uno de los propios genes bacterianos que codifican para los complejos enzimáticos ACC (E.C. 6.4.1.2) y acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1), dando lugar a una mayor producción de biodiesel a partir del propio subproducto, glicerina, como fuente de carbono. Dichos genes codifican para enzimas implicadas en el metabolismo lipídico bacteriano, especialmente en la síntesis de lípidos a partir de glicerina como fuente de carbono. Los genes sintéticos mutados heterólogos, con los que son transformadas las bacterias B. subtilis de la presente invención son: pdc (SEQ ID NO:2) y adhB (SEQ ID NO:4) obtenidos a partir de los genes pdc (SEQ ID NO: 1) y adhB (SEQ ID NO:2) de Z. mobilis, ´tesA (SEQ ID NO:6) obtenido a partir del gen `tesA (SEQ ID NO: 5) de E. coli y atf1 (SEQ ID NO: 8) obtenido a partir del gen atf1 (SEQ ID NO: 7) de Acinetobacter sp. ADP1. Adicionalmente, las cepas bacterianas descritas en la presente invención, sobre-expresan, al menos uno de los genes que codifican para los complejos enzimáticos ACC (acetil-CoA carboxilasa) (E.C. 6.4.1.2) y acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1).
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de las cepas descritas anteriormente, CECT 7968 y 7969, para la producción de biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de biodiesel, a partir de glicerina como fuente de carbono, mediante la utilización de las cepas bacterianas descritas en la presente invención (CECT 7968 y 7969). La composición del biodiesel así producido puede ser utilizado como un combustible diesel solo, o mezclado con diesel de petróleo de acuerdo a las proporciones habituales, lo que resulta en perfiles de emisión más limpios.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición de combustible, incluyendo, por ejemplo, una composición de diesel, que comprende un éster graso producido por un método o un microorganismo genéticamente modificado según se describe en la presente invención. En ciertas realizaciones, la composición del combustible comprende además uno o más aditivos de combustible adecuados. El combustible obtenido mediante el procedimiento descrito en la presente invención haciendo uso de las cepas CECT 7968 y CECT 7969 está formado preferentemente por etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados saturados, de número impar de carbono, siendo preferentemente dichos etil-ésteres de ácidos grasos: iso-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12-metiltetradecanoico), n-C15:0 (n-pentadecanoico); iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14-metilhexadecanoico) y n-C17:0 (n-heptadecanoico). El combustible obtenido mediante el procedimiento descrito previamente también puede estar formado por etil-ésteres de ácidos grasos ramificados de número par de carbonos (aunque este tipo de ácidos grasos son minoritarios), siendo preferentemente dicho etil-ésteres: iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (n-hexadecanoico), isoC18:0 (16-metilheptadecanoico) y n-C18:0 (n-octadecanoico); según se describe, para ambos casos (etilésteres de numero impar o par de carbonos), en el Ejemplo 3.
Salvo disposición en contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia, a la que pertenece esta invención.
Como se usa aquí, el término "biodiesel" es un biocombustible que puede ser un sustituto del diesel derivado del petróleo. El biodiesel puede ser utilizado en motores de combustión interna diesel, ya sea en forma pura, lo que se conoce como "limpio", o como una mezcla de cualquier concentración con diesel derivado de petróleo. En una realización, el biodiesel puede incluir ésteres o hidrocarburos, tales como aldehídos, alcanos o alquenos. El término "biocombustible" se refiere a cualquier tipo de combustible derivado de biomasa o fuentes biológicas, en general. Los biocombustibles pueden sustituir a los combustibles basados en petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles incluyen todos los combustibles de transporte (por ejemplo, la gasolina, diesel, jet fuel, etc), los combustibles para calefacción, y los combustibles para generar electricidad. Los biocombustibles son una fuente de energía renovable.
El término "fuente de carbono" se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para ser utilizado como suministrador de átomos de carbono para el crecimiento de las células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden ser de varias formas, incluyendo, sin carácter limitativo, a ácidos grasos orgánicos, como por ejemplo el succinato, lactato y acetato, los polímeros, los hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Los mismos también incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa; oligosacáridos, como los fructo-oligosacáridos y galacto-oligosacáridos, polisacáridos como xilosa y arabinosa, disacáridos, tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico, como la metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio, ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, alcoholes, tales como glicerol, metanol, etanol, propanol, o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo, sin carácter limitativo, a la glucosa. Una fuente de carbono preferida es el glicerol o glicerina.
A efectos de la presente invención, el término "elemento promotor", "promotor", o "secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ADN que funciona como un interruptor que activa la expresión de un gen. Si el gen se activa, se dice que se transcribe o participa en la transcripción. La transcripción implica la síntesis de ARNm del gen. Un promotor, por lo tanto, actúa como elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para la iniciación de la transcripción del gen en ARNm.
A efectos de la presente invención, los términos "glicerina" y "glicerol" son sinónimos y se usan indistintamente.
A efectos de la presente invención, se describe el término "regulón" como un grupo de genes regulados por el mismo factor de transcripción. Los genes regulados pueden estar agrupados, caso de los operones, o dispersos a lo largo del genoma.
A efectos de la presente invención se define el término "operón" como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes que se transcriben a partir de un mismo promotor y su expresión está coordinada por los mismos sistemas.
A efectos de la presente invención se define el término "heterólogo" relativo a genes, proteínas, tejidos, células, etc, como perteneciente a un individuo de un género o especie diferente a la del individuo del que se aísla.
A efectos de la presente invención el término "célula u organismo hospedador" o "célula u organismo huésped", se refiere a una célula u organismo que puede ser modificada genéticamente para expresar, sobre-expresar o infra-expresar, genes específicos seleccionados. Ejemplos no limitativos de células u organismos huésped incluyen células vegetales, animales, humanas, bacterianas o fúngicas. Las células huésped preferidas en la presente invención son células bacterianas.
A efectos de la presente invención, el término "sobre-expresar" o "sobre-expresión" hace referencia a un nivel de expresión o concentración mayor de un ácido nucleico, polipéptido, proteína, enzima, hidrato de carbono, grasa, hidrocarburo, etc, en una célula dada en comparación con el nivel de expresión o concentración de dicho ácido nucleico, polipéptido, proteína, enzima, hidrato de carbono, grasa, hidrocarburo, en el mismo tipo de célula pero perteneciente a un fenotipo silvestre. Por ejemplo, un polipéptido puede ser "sobre-expresado" en una célula huésped recombinante cuando el polipéptido está presente en una concentración mayor que en la célula no recombinante de la misma especie.
Como se usa aquí, el término "polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido que es producido por técnicas de ADN recombinante, donde por lo general, el ADN o ARN que codifica el polipéptido expresado se inserta en un vector de expresión adecuado que a su vez es utilizado para transformar una célula huésped para producir el polipéptido o ARN.
El término "genes mutados" se refiere a la introducción de mutaciones en la región codificante de los genes con la finalidad de incrementar la producción proteíca. Los criterios usados para llevar a cabo las mutaciones se describen en el Ejemplo 2 de la presente invención.
A efectos de la presente invención se define el término "sintético" referido a secuencias génicas o proteicas obtenidas artificialmente mediante procedimientos de ingeniería genética.
Descripción de las Figuras
Figura 1. Esquema de la síntesis de biodiesel a partir de aceites vegetales y/o grasas animales.
Figura 2. Diagrama de las rutas metabólicas modificadas en B. subtilis para incrementar la síntesis de biodiesel a partir de glicerina. Los genes que se muestran dentro de cuadrados (pdc, adhB, ’tesA y atf1) son los genes mutados sintéticos heterólogos, que pertenecen a especies diferentes a B. subtilis y, que se han obtenido de forma sintética, optimizando el uso de codones específicos para este organismo. Los genes que aparecen incluidos en una elipse (accDABC, lcfA, yhfL y yhfT), son los genes que, alternativamente, pueden sobre-expresarse en dichas bacterias, mediante promotores específicos para incrementar y potenciar la producción de biodiesel. glpF: facilitador de glicerol; glpT: transportador de glicerol-3P; glpK: glicerol kinasa; glpD: glicerol-3P deshidrogenasa; pdc: piruvato decarboxilasa; adhB: alcohol deshidrogenasa; atf1: sintetasa de ceras-triacilglicéridos; pdh: piruvato deshidrogenasa; accDABC: acetil-CoA carboxilasa; fabD: malonil-CoA:ACP transferasa; lcfA,yhfL,yhfT: acil-CoA sintetasas.
Descripción detallada de la invención
La presente invención describe cepas bacterianas de la especie B. subtilis CECT 7968 y CECT 7969, capaces de producir biodiesel (FAEE) a partir de glicerina como fuente de carbono y que están transformadas con un vector de expresión que expresa el plásmido pNAKA62 que porta los genes mutados sintéticos heterólogos: pdc (SEQ ID NO: 2) y adhB (SEQ ID NO: 4) originarios de Z. mobilis, ’tesA (SEQ ID NO: 6) originario de E. coli y atf1 (SEQ ID NO: 8) originario de Acinetobacter sp. ADP1, bajo el control de un promotor inducible. En el caso de la presente invención, dicho promotor es el promotor Pspac, inducible mediante isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG). Mencionar que, a efectos de la presente invención, puede utilizarse cualquier promotor inducible o constitutivo conocido en el estado de la técnica para el mismo fin. Además, las bacterias CECT 7968 y CECT 7969, descritas en la presente invención sobre-expresan al menos uno de los genes que codifican para las enzimas ACC (E.C. 6.4.1.2) y Acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1), potenciando así la síntesis de biodiesel a partir de glicerol, ya que dichos genes son expresados en muy poca (ACC) o nula cantidad (Acil CoA sintetasa) en la fase exponencial del crecimiento bacteriano.
La producción de biodiesel a partir de glicerina, como fuente de carbono y mediante el uso de las cepas bacterianas CECT 7968 y CECT 7969 descritas en la presente invención, ha sido llevada a cabo mediante diferentes estrategias capaces de modificar el metabolismo de las mismas, produciendo un incremento en la síntesis y concentración de ácidos grasos junto con un incremento en la síntesis de etanol. Dichos incrementos tienen como resultado final la síntesis de biodiesel, a partir del propio subproducto, glicerina, como fuente de carbono. Las cepas bacterianas CECT 7968 y CECT 7969 presentan un incremento en la síntesis de ácidos grasos y etanol gracias a la transformación de las mismas con el vector de expresión pDR67 que porta el plásmido pNAKA62 capaz de expresar, como hemos mencionado anteriormente los cuatro genes mutados sintéticos heterólogos: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO: 8, y además, alternativamente, dichas cepas, mediante la transformación de las mismas con un vector que porta un plásmido capaz de sobre-expresar al menos uno de los genes del complejo enzimático ACC (E.C. 6.4.1.2) y/o acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.1), aumentan el rendimiento en la producción de dicho biodiesel.
Los genes que se muestran en la Figura 2 dentro de cuadrados (pdc, adhB, ’tesA y atf1) son los genes mutados sintéticos heterólogos, que pertenecen a especies diferentes a B. subtilis y, que se han obtenido de forma sintética, optimizando el uso de codones específicos para este organismo. Por otro lado, los genes que aparecen incluidos en una elipse (accDABC, lcfA, yhfL y yhfT) en dicha Figura 2, son los genes que, alternativamente, pueden sobre-expresarse en dichas bacterias, mediante promotores específicos, como por ejemplo, promotores inducibles por IPTG (Pspac o Pspachy) y/o promotores fuertes y constitutivos (Pacp), para incrementar y potenciar la producción de biodiesel. Dichos promotores facilitan e incrementan la producción de biodiesel gracias al incremento en la expresión de los genes de los complejos ACC y acil-CoA sintetasa, durante la fase exponencial del crecimiento de B. subtilis, ya que su expresión es baja, en el caso del complejo accDABC, o nula, en el caso del complejo acil-CoA sintetasas.
Como se ha comentado previamente, el incremento en la síntesis y concentración de ácidos grasos producido mediante la modificación de las rutas metabólicas de las cepas de la invención, es consecuencia de la expresión del gen mutado sintético heterólogo que codifica para la enzima ´tesA (SEQ ID NO: 6) originario de E. coli. Dicha enzima cataliza la hidrólisis de la unión tioéster entre grupos acilos y la proteína transportadora de acilos (ACP). En este sentido, cepas de E. coli que expresan el dominio catalítico de dicha enzima sintetizan gran cantidad de ácidos grasos debido a la disminución de la retroalimentación negativa que los acil-ACPs ejercen sobre la sintetasa de ácidos grasos (FAS). Así, las cepas de la presente invención, expresan el dominio catalítico mutado de la tioesterasa ´tesA de E. coli (SEQ ID NO: 6), mediante la optimización del uso de codones específicos para las bacterias B. subtilis. Por otro lado, para potenciar y aumentar el rendimiento en la síntesis de dichos ácidos grasos, las cepas bacterianas descritas en la presente invención, pueden sobre-expresar el complejo enzimático ACC y a su vez, para potenciar e incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel, también pueden sobreexpresar el complejo enzimático acil-CoA ligasa. Ambos complejos se sobre-expresan mediante la transformación de las mismas con vectores de expresión que portan plásmidos bajo el control de promotores fuertes y constitutivos específicos, como por ejemplo el promotor Pacp-accDABC para la sobre-expresión de la acil CoA carboxilasa (ACC) o promotores inducibles, como es el caso del promotor Pspac o Pspachy, inducibles en presencia de IPTG.
El ciclo de elongación de los ácidos grasos en B. subtilis, en particular, es llevado a cabo por la sintetasa de ácidos grasos (FAS). Brevemente, la isoforma FabF de la sintetasa de ácidos grasos, cataliza la condensación de malonil-ACP con el acil-ACP para producir la elongación del ácido graso, la isoforma FabG reduce el cetoácido formado, la isoforma FabZ cataliza la deshidratación del hidroxiácido y finalmente la isoforma FabI (y eventualmente FabL) reduce el doble enlace formado, generando un nuevo acil-ACP con dos carbonos más que al comenzar el ciclo. El complejo enzimático FAS, descrito en la Figura 2, se puede sobre-expresar en las cepas de B. subtilis de la presente invención para incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono. Dicha sobreexpresión puede llevarse a cabo mediante diferentes estrategias. Una de dichas estrategias implica la eliminación del represor global de la síntesis de ácidos grasos, el FapR (fapR-), lo que implica una actividad FAS, en B. subtilis 5 veces mayor que en cepas que poseían dicho represor (fapR+) (Schujman,G.E. et al. 2003). Otra de las estrategias que pueden utilizarse es la sobre-expresión del complejo enzimático ACC (E.C.6.4.1.2). Dicho complejo cataliza la síntesis de malonil-CoA a partir de acetil-CoA. En E. coli la sobre-expresión de este complejo aumenta en más de 10 veces la actividad FAS, siempre que se eliminen los acil-ACPs de cadena larga formados, mediante, por ejemplo, la expresión del gen `tesA (Davis, M.S. et al. 2000). Las cepas de la presente invención, pueden para incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel, sobre-expresar los genes que comprenden dicho complejo enzimático ACC (accD, accA, accB y accC). Para ello, se ha construido un operón sintético, accDABC, que comprende los cuatro genes en conjunto, mientras que en las bacterias silvestres sin transformar, se encuentran los operones accDA y accBC, por separado. El operón sintético accDABC obtenido, se incluyó en el plásmido pGES468 bajo el control de un promotor que como hemos mencionado anteriormente, puede ser fuerte y constitutivo, como por ejemplo el promotor Pacp-accDABC, o inducible como el Pspac-accDABC, en presencia de por ejemplo, IPTG, aunque puede utilizarse cualquier promotor conocido en el estado de la técnica. Además, para la eliminación de los acilACPs de cadena larga formados por las cepas descritas en la presente invención, las mismas, expresan el gen mutado heterólogo ´tesA (SEQ ID NO: 6).
El incremento en la síntesis de etanol, producido por las cepas descritas en la presente invención, se ha obtenido mediante la expresión de los genes mutados sintéticos heterólogos que codifican para las enzimas pdc (SEQ ID NO: 2) y adhB (SEQ ID NO: 4) de Z. mobilis. A partir de acetil-CoA, dichas enzimas, pdc y adhB, generan acetaldehído y posteriormente etanol. Los genes pdc y adhB de la especie bacteriana Z. mobilis han sido empleados exitosamente para transformar bacterias Gram negativas, como por ejemplo E. coli (Kalscheuer, R., et al,. 2006). Por lo tanto, mediante el incremento de la concentración de etanol y de acil-CoAs, así como la expresión del gen mutado sintético heterólogo Atf1 (SEQ ID NO: 8), las cepas descritas en la presente invención son capaces de esterificar el etanol sintetizado junto con los restos acilo unidos a la acil-CoA dando lugar a la producción de biodiesel a partir de glicerina, obtenida como subproducto del proceso de fabricación de biodiesel en biorefinerías, como fuente de carbono (ver Figura 2).
Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest
Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España), con nº de depósito:
CECT 7968 depositada el 23 de Junio de 2011, que comprende en su genoma las construcciones: thrC::lacI-Pspachy-lcfA amyE::Pspac-pdc-adh-atf1-´tesA.
CECT 7969 depositada el 23 de Junio de 2011, que comprende en su genoma las construcciones: thrC::lacI-Pspachy-yhfL amyE::Pspac-pdc-adh-atf1-´tesA.
Uno de los objetos de la presente invención se refiere a una construcción génica que comprende al menos los genes seleccionados entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, junto con un promotor.
En una realización preferida de la presente invención, la construcción génica se caracteriza por que además comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas que codifican para al menos uno de los genes que forman los complejos enzimáticos Acil CoA sintetasa (E.C.6.2.1.1) y/o ACC (E.C.6.4.1.2) seleccionados entre: lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC y/o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de la presente invención, la construcción génica se caracteriza por que dichos genes pertenecen a la especie bacteriana B. subtilis.
En otra realización preferida, la construcción génica descrita en la presente invención se caracteriza por que el promotor es inducible o constitutivo. El promotor inducible es preferentemente el promotor Pspac o Pspachy, inducibles por la adición en el medio de cultivo de isopropil-β-Dtiogalactósido (IPTG). El promotor constitutivo es preferentemente el promotor Pacp.
En otra realización preferida, la construcción génica descrita en la presente invención se caracteriza por que se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: pNAKA62, pNAKA52, pNAKA53 y/o combinaciones de las mismas.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un vector de expresión caracterizado por comprender las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
En una realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que además comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas que codifican para al menos uno de los genes que forman los complejos enzimáticos Acil CoA sintetasa (E.C.6.2.1.1) y/o ACC (E.C.6.4.1.2) seleccionados entre: lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC y/o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que las secuencias nucleotídicas que codifican para al menos uno de los genes que forman los complejos enzimáticos Acil CoA sintetasa (E.C.6.2.1.1) y/o ACC (E.C.6.4.1.2) (lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC) pertenecen a la especie bacteriana B. subtilis.
En otra realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que comprende al menos una de las construcciones génicas descritas en la presente invención.
En una realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que consiste en el plásmido pNAKA62. En otra realización preferida, el vector de expresión consiste en los plásmido pNAKA62 y pNAKA52. En otra realización preferida, el vector de expresión consiste en los plásmido pNAKA62 y pNAKA53.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a una célula hospedadora transformada con cualquiera de los vectores de expresión descritos previamente. En una realización preferida, la célula es preferentemente una célula bacteriana. En otra realización preferida, la célula es una célula bacteriana del género Bacillus, preferentemente de de la especie B. subtilis.
En otra realización preferida, la célula hospedadora se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: CECT 7968 y/o CECT 7969.
Otro de los objetos descritos en la presente invención, se refiere al uso de la/s célula/s CECT 7968 y/o CECT 7969 descritas, para la producción de biocombustible, preferentemente, biodiesel.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método de producción de biocombustible que comprende cultivar las cepas bacterianas descritas en la presente invención en presencia de una fuente de carbono, en condiciones adecuadas.
En una realización preferida, el método descrito en la presente invención se caracteriza por que la fuente de carbono es glicerina, preferentemente glicerina como subproducto.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que comprende, además, el aislamiento del biocombustible producido.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que el aislamiento del biocombustible se realiza mediante cualquier procedimiento disponible en la técnica usualmente aplicada en el sector, preferentemente se realiza mediante solventes orgánicos, como por ejemplo: hexano, acetato de etilo, etc.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que el biocombustible obtenido está compuesto por etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que los etil-esteres de ácidos grasos son preferentemente: iso-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12metiltetradecanoico), n-C15:0 (n-pentadecanoico); iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (nhexadecanoico), iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14-metilhexadecanoico), n-C17:0 (nheptadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y n-C18:0 (n-octadecanoico).
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que el biocombustible es biodiesel.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que además comprende la adición de al menos un aditivo.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a una composición de biocombustible que comprende etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados.
En una realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que los etil-ésteres de ácidos grasos están formados por cadenas carbonadas y totalmente saturadas del tipo: iso-C15 (13metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12-metiltetradecanoico), n-C15:0 (n-pentadecanoico); iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (n-hexadecanoico), iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteisoC17:0 (14-metilhexadecanoico), n-C17:0 (n-heptadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y nC18:0 (n-octadecanoico).
En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que es una composición de biodiesel y además puede comprender al menos un aditivo adecuado.
A efectos de la presente invención, el término aditivo, se refiere a una sustancia química agregada a un producto para mejorar sus propiedades y asegurar el correcto funcionamiento de los motores.
Los ejemplos que se detallan a continuación tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.
Ejemplo 1. Caracterización del crecimiento de B. subtilis en medios conteniendo glicerol recuperado de distintos procesos industriales, como fuente de carbono.
Para corroborar que las bacterias B. subtilis crecen en presencia de glicerol o glicerina como fuente de carbono, se procedió a la cuantificación mediante un kit comercial del contenido en glicerol de dos muestras provenientes de procesos industriales. Una de las muestras provenía del procesamiento de aceite de soja (AS) y la otra provenía de descartes de aceites de frituras (AF). En ambos casos el contenido de glicerol (pureza) fue aproximadamente 50% (p/v), mientras que la glicerina comercial tiene un porcentaje de pureza del 87%. El aspecto del AS es más límpido que el aspecto del AF. Ambos aumentan marcadamente la turbidez de los medios acuosos, sugiriendo un importante remanente lipídico de ácidos grasos, fosfolípidos u otros productos orgánicos. El pH de ambos aceites es aproximadamente
9.
Se analizó, por tanto, la utilidad de ambas muestras como fuente de carbono y energía en cultivos de bacterias B. subtilis silvestres JH642 en medio de cultivo mínimo de Spizizen (SPI) formado por (NH4)2 SO4, 2,0 g/l; KH2PO4, 14,0 g/l; K2HPO4, 6,0 g/l; Citrato de Na, 1,0 g/l; MgSO4 7 H2O, 0,2 g/l. Suplementado con triptófano al 0,01 %, fenilalanina al 0,01 % y treonina 0,01% (concentraciones finales). Se utilizó como control glicerina comercial. El crecimiento de los cultivos de las bacterias B. subtilis silvestres JH642 no se pudo analizar directamente por medida de absorbancia, debido a la turbidez generada por las impurezas de las muestras comerciales. Por este motivo, se obtuvieron alícuotas del medio de cultivo y se centrifugaron antes de proceder a la medida de absorbancia, y se resuspendieron en medio fresco, agregando el mismo volumen centrifugado. Las bacterias crecidas en AS alcanzaron, con el tiempo, valores de crecimiento similares a los obtenidos para los cultivos de bacterias B. subtilis silvestres JH642 crecidas en glicerol, aunque la fase de latencia (período de tiempo durante el que el inóculo bacteriano se adapta a las condiciones del medio sobre el que se ha sembrado y efectúa se ajuste metabólico) fue mayor y la velocidad de crecimiento menor. En cambio, el crecimiento en AF fue menor y a una velocidad muy baja, por lo que resultó una fuente menos adecuada para el crecimiento de bacterias B. subtilis silvestres. Por lo tanto, mediante el presente ejemplo, se pone de manifiesto que las cepas bacterianas silvestres de la especie B. subtilis son capaces de crecer en cultivos con glicerina cruda como única fuente de carbono.
Ejemplo 2. Obtención de las cepas CECT 7968 y 7969 de la especie B. subtilis capaces de producir biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono.
Un inconveniente en la expresión de genes heterólogos en bacterias de la especie B. subtilis, es el distinto uso de codones de dicha especie bacteriana Gram positiva, respecto al uso de dichos codones por parte de bacterias Gram negativas. Esto es así por la diferente disponibilidad de ARNt para cada codón en distintos organismos. Para resolver dicho inconveniente y maximizar la traducción de los genes mutados sintéticos heterólogos adhB (SEQ ID NO:4), pdc (SEQ ID NO:2), ´tesA (SEQ ID NO:6) y atf1 (SEQ ID NO:8), todos ellos provenientes de bacterias Gram negativas, se han mutado las secuencias de los mismos para su expresión en B. subtilis. Para ello, se ha determinado la frecuencia de utilización de codones en once genes codificantes para proteínas ribosomales (rplA, rplJ con nº de acceso al GenBank: D50303.1; rplC, rplD, rplB, rpsC con nº de acceso al GenBank: U43929.1; rplF, rpsE con nº de acceso al GenBank: L47971.1; rpsD con nº de acceso al GenBank: S45404.1 y rpsG con nº de acceso al GenBank: D64127.1), los cuales son altamente expresados en B. subtilis. Una vez conocidos los codones más frecuentemente utilizados en dichas bacterias, se determinó en las secuencias de los genes de interés: adhB (SEQ ID NO:3), pdc (SEQ ID NO: 1), ’tesA (SEQ ID NO: 5) y atf1 (SEQ ID NO: 7), los codones cuya frecuencia de uso fue menor a un 20%. Dichos codones que presentaron una frecuencia de expresión muy baja, fueron reemplazados por el codón de mayor uso encontrado en el análisis de los genes ribosomales de B. subtilis, siempre teniendo en cuenta que el nuevo codón introducido debe codificar para el mismo aminoácido que el codón al que sustituye, es decir, la sustitución de un codón por otro debe ser conservativa, no alterar en ningún momento la secuencia aminoacídica de la proteína final.
Una vez obtenidas las nuevas secuencias de los cuatro genes heterólogos, la síntesis in vitro de los mismos fue realizada por la empresa Blue Heron Biotechnology (Bothell, USA) la cual proporcionó los cuatro genes mutados sintéticos heterólogos, cada uno clonado en el sitio SmaI del vector derivado del Bluescript SK, al que se le eliminó el sitio de múltiple clonado Dichos vectores fueron posteriormente utilizados para transformar bacterias competentes E. coli DH5a para conservar y amplificar los plásmidos.
Posteriormente se procedió al subclonado de los genes mutados sintéticos heterólogos, en el vector de expresión pDR67 (Ireton K, 1993), obteniéndose el plásmido pNAKA62 (pDR67 (HindIII/BglII) + pdc-adh-atf1-’tesA), que contiene las secuencias mutadas heterólogas sintéticas de los cuatro genes de interés, pdc-adh-atf1-’tesA (SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:6, respectivamente). En este plásmido, pNAKA62, los cuatro genes quedan bajo el control del promotor Pspac, inducible en presencia de isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) en el medio de cultivo, pero pueden utilizarse cualquier otro plásmido conocido en es estado de la técnica para el mismo fin, ya sea inducible
o constitutivo, en función de las exigencias del procedimiento. Además, el plásmido pNAKA62 contiene la región inicial y final del gen amyE, flanqueando al operón y un cassette de resistencia para el antibiótico cloranfenicol. Mediante el uso del plásmido pNAKA62 se transformaron cepas silvestres JH642 de B. subtilis, obteniéndose la cepa denominada LN72 (JH642/pNAKA62(amyE::Pspac-pdc-adhatf1-`tesA)). Se confirmó la inserción del plásmido en el locus amyE por pérdida de actividad amilasa de la cepa obtenida. Por tanto, dicha cepa LN72 es capaz de expresar los genes sintéticos heterólogos pdc (SEQ ID NO:2), adh (SEQ ID NO:4), atf1 (SEQ ID NO:8) y ’tesA (SEQ ID NO:6) siendo así capaz de incrementar la síntesis de ácidos grasos y etanol, en presencia de glicerina como fuente de carbono y producir biodiesel.
Para incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel mediante las cepas descritas en la presente invención, es recomendable sobre-expresar, al menos uno de los genes que forman el complejo acil-Co ligasas (E.C.6.2.1.1) así como el complejo ACC (E.C.6.4.1.2). Para la sobre-expresión de al menos uno de los genes del complejo enzimático acil-CoA ligasas (E.C.6.2.1.1), se eligieron los genes lcfA e yhfL. Brevemente, se amplificaron dichos genes mediante PCR utilizando como molde ADN cromosomal de la cepa silvestre de B. subtilis JH642 y como cebadores los definidos como SEQ ID Nos: 9-13. Para ello, se construyó el plásmido pNAKA60 subclonando el gen lacI, que codifica para el represor Lac, y el promotor Pspachy en el vector pDG1731 (Guérout-Fleury AM., 1996). Dicho plásmido pNAKA60 contiene la región inicial y final del gen thrC, flanqueando a lacI-Pspachy y un cassette de resistencia para el antibiótico espectinomicina. A continuación, se subclonaron en dicho plásmido los genes lcfA e yhfL, codificantes para acil-CoA-ligasas, generándose los plásmidos pNAKA52 y pNAKA53, respectivamente. Con dichas construcciones se transformaron las cepas LN72, obteniéndose las cepas CECT 7968 y CECT 7969, respectivamente. Se confirmó la integración de dichos genes en el locus trhC por generación de auxotrofía para el aminoácido treonina, por lo que las cepas se han convertido en auxótrofas para dicho aminoácido. Además, los cuatro genes mutados sintéticos se expresan en el locus amyE, por lo que dichas cepas ya no pueden degradar almidón. Las cepas CECT 7968 y CECT 7969, contienen, por lo tanto, los locus amyE y thrC con todos los genes necesarios para la biosíntesis de biodiesel bajo el control del promotor inducible por IPTG, Pspac, aunque como se ha comentado a lo largo de la presente invención, puede seleccionarse cualquier promotor, ya sea inducible o constitutivo, conocido en el estado de la técnica.
De la misma manera que se ha mencionado anteriormente, para sobre-expresar las cuatro subunidades del complejo enzimático de la acetil-CoA carboxilasa (AccDABC) en las cepas descritas en la presente invención, para conseguir, si se desea, un mayor rendimiento en la síntesis de biodiesel, se siguió el mismo protocolo que se ha descrito para la sobre-expresión de las enzimas del complejo Acil-CoA ligasas. Brevemente, se realizó la amplificación de los genes accDA y accBC, mediante PCR utilizando como molde ADN cromosomal de la cepa silvestre de B. subtilis JH642 y como cebadores los definidos como SEQ ID Nos: 13-16. Se hicieron clonados sucesivos para obtener finalmente el plásmido pGES468, que contiene el operón accDABC bajo control del promotor inducible por IPTG, Pspac, aunque, como se ha mencionado anteriormente, puede seleccionarse cualquier promotor, ya sea inducible
o constitutivo, conocido en el estado de la técnica. Mediante dicho plásmido, si se desea, se procede a la transformaron cepas de las cepas B. subtilis CECT 7968 y CECT7969, para incrementar la expresión del complejo enzimático de la acetil-CoA carboxilasa e incrementar el rendimiento de la síntesis de biodiesel mediante las cepas descritas en la presente invención.
Ejemplo 3. Producción de biodiesel mediante las cepas de B. subtilis CECT 7968 y 7969.
Las cepas de B. subtilis CECT 7968 y CECT 7969 descritas en la presente invención, se cultivaron en 50 ml de medio de cultivo mínimo SPI formado por (NH4)2 SO4, 2,0 g/l; KH2PO4, 14,0 g/l; K2HPO4, 6,0 g/l; Citrato de Na, 1,0 g/l; MgSO4 7H2O, 0,2 g/l. Suplementado con glucosa al 0,5 %; triptófano al 0,01 %, fenilalanina al 0,01 % y treonina al 0,01% (concentraciones finales) e IPTGM 500 M a 37°C hasta la fase estacionaria (DO600nm=1.5). Posteriormente, se agregó a cada cultivo un volumen de 10 ml de hexano y se procedió a la extracción de los lípidos sintetizados por dichas cepas bacterianas, a temperatura ambiente durante 20 min. La extracción puede realizarse mediante procedimientos de extracción orgánica en presencia de cualquier compuesto de dicha naturaleza como solvente, como puede ser, por ejemplo, el hexano o el acetato de etilo. Tras centrifugar, se evaporó la fase orgánica mediante una corriente de N2 a temperatura ambiente, y posteriormente, mediante cromatografía de capa gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), se analizó la composición del biocombustible obtenido.
Dicho análisis de la composición del biocombustible obtenido, puso de manifiesto la presencia de etíl-ésteres de ácidos grasos o biodiesel de cadena carbonada y totalmente saturada, formada preferentemente por: iso-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12-metiltetradecanoico), n-C15:0 (n-pentadecanoico); iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (n-hexadecanoico), iso-C17:0 (15metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14-metilhexadecanoico), n-C17:0 (n-heptadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y n-C18:0 (n-octadecanoico). Estas especies constituyeron aproximadamente el 10% de la muestra lipídica, siendo el resto principalmente ácidos grasos libres. Los etíl-ésteres fueron identificados utilizando estándares y confirmados por su espectro de masas. Dicho biodiesel producido, como puede observarse está formado por ácidos grasos ramificados, en su mayor parte y saturados, a diferencia de otros biocombustibles producidos, por ejemplo, por cepas de E. coli que están formados principalmente por ácidos grasos lineales de número par de carbono, en promedio, el 50% con una insaturación. Ambos extractos obtenidos de los cultivos de las cepas CECT 7968 y CECT 7969 descritas en la presente invención, presentaron la misma composición.
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13.
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Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Construcción génica que comprende al menos los genes caracterizados por las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, junto con al menos un promotor.
  2. 2.
    Construcción génica según la reivindicación 1 caracterizada por que además comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas que codifican para los genes seleccionados entre: lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC y/o cualquiera de sus combinaciones.
  3. 3.
    Construcción génica según la reivindicación 2 caracterizada por que las secuencias nucleotídicas que codifican para los genes lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC pertenecen a la especie bacteriana B. subtilis.
  4. 4.
    Construcción génica según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada por que el promotor es inducible o constitutivo.
  5. 5.
    Construcción génica según la reivindicación 4 caracterizado por que el promotor inducible es el promotor Pspac o Pspachy.
  6. 6.
    Construcción génica según la reivindicación 4 caracterizada por que el promotor constitutivo es el promotor Pacp.
  7. 7.
    Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: pNAKA62, pNAKA52, pNAKA53 y/o combinaciones de las mismas.
  8. 8.
    Vector de expresión que comprende las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
  9. 9.
    Vector de expresión según la reivindicación 8 caracterizado por que además comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas que codifican para los genes seleccionados entre: lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC y/o cualquiera de sus combinaciones.
  10. 10.
    Vector de expresión según la reivindicación 9 caracterizado por que las secuencias nucleotídicas que codifican para los genes lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC pertenecen a la especie bacteriana B. subtilis.
  11. 11.
    Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 caracterizado por comprender al menos uno de las construcciones génicas según las reivindicaciones 1 a 7.
  12. 12.
    Vector de expresión según la reivindicación 11 que consiste en el plásmido pNAKA62.
  13. 13.
    Vector de expresión según la reivindicación 11 que consiste en los plásmidos pNAKA62 y pNAKA52.
  14. 14.
    Vector de expresión según la reivindicación 11 que consiste en los plásmidos pNAKA62 y pNAKA53.
  15. 15.
    Célula transformada con cualquiera de los vectores de expresión de las reivindicaciones 8 a 14.
  16. 16.
    Célula según la reivindicación 15 caracterizada por ser una célula bacteriana.
  17. 17.
    Célula según la reivindicación 16 caracterizada por ser una célula bacteriana del género Bacillus.
  18. 18.
    Célula según la reivindicación 17 caracterizada por ser de de la especie B. subtilis.
  19. 19.
    Célula según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 caracterizada por que se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: CECT 7968 o CECT 7969.
  20. 20.
    Uso de las células de las reivindicaciones 15 a 19 para la producción de biocombustible.
  21. 21.
    Uso según la reivindicación 20 caracterizado por que el biocombustible es biodiesel.
  22. 22.
    Método de producción de biocombustible que comprende cultivar las células de las reivindicaciones 15 a 19 en presencia de una fuente de carbono, en condiciones adecuadas.
  23. 23.
    Método según la reivindicación 22 donde la fuente de carbono es glicerina.
  24. 24.
    Método según la reivindicación 23 caracterizado por que la glicerina utilizada como fuente de carbono es un subproducto.
  25. 25.
    Método según las reivindicaciones 22 a 24 que además comprende el aislamiento del biocombustible producido.
  26. 26.
    Método según la reivindicación 25 donde el aislamiento se realiza mediante procedimientos de extracción orgánica.
  27. 27.
    Método según las reivindicaciones 22 a 26 caracterizado por que el biocombustible obtenido está compuesto por ácidos grasos ramificados y saturados.
  28. 28.
    Método según la reivindicación 27 caracterizado por que los ácidos grasos son preferentemente: isoC15:0, n-c15:0, anteiso-C15:0, iso-C16:0, n-C16:0, iso-C17:0, n-c17:0, anteiso-C17:0 y n-C18:0.
  29. 29.
    Método según las reivindicaciones 22 a 28 caracterizado por que el biocombustible es biodiesel.
  30. 30.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29 caracterizado por que además comprende la adición de al menos un aditivo.
  31. 31.
    Composición de biocombustible que comprende etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y saturados.
  32. 32.
    Composición según la reivindicación 31 caracterizada por que los etil-ésteres de ácidos grasos son: iso-C15:0, n-c15:0, anteiso-C15:0, iso-C16:0, n-C16:0, iso-C17:0, n-c17:0, anteiso-C17:0 y n-C18:0.
  33. 33.
    Composición según las reivindicaciones 31 a 32 caracterizada por que el biocombustible es biodiesel.
  34. 34.
    Composición según las reivindicaciones 31 a 33 caracterizada por que además comprende al menos un aditivo.
    Figura 1
    Figura 2
    LISTADO DE SECUENCIAS
    <110> Iden Biotechnology S.L.
    <120> Producción de biodiesel a partir de glicerina
    <130> P-03963
    <160> 16
    <170> PatentIn version 3.5
    <210> 1
    <211> 1707
    <212> DNA
    <213> Zymomonas mobilis
    <400> 1 atgagttata ctgtcggtac ctatttagcg gagcggcttg tccagattgg tctcaagcat 60 cacttcgcag tcgcgggcga ctacaacctc gtccttcttg acaacctgct tttgaacaaa 120 aacatggagc aggtttattg ctgtaacgaa ctgaactgcg gtttcagtgc agaaggttat 180 gctcgtgcca aaggcgcagc agcagccgtc gttacctaca gcgtcggtgc gctttccgca 240 tttgatgcta tcggtggcgc ctatgcagaa aaccttccgg ttatcctgat ctccggtgct 300 ccgaacaaca atgaccacgc tgctggtcac gtgttgcatc acgctcttgg caaaaccgac 360 tatcactatc agttggaaat ggccaagaac atcacggccg ccgctgaagc gatttatacc 420 ccggaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgattaaaa ctgctcttcg tgagaagaag 480 ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc cctgcgccgc tcctggaccg 540 gcaagcgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagctt ctttgaatgc agcggttgaa 600 gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg tcctcgtcgg cagcaagctg 660 cgcgcagctg gtgctgaaga agctgctgtc aaatttgctg atgctcttgg tggcgcagtt 720 gctaccatgg ctgctgcaaa aagcttcttc ccagaagaaa acccgcatta catcggtacc 780 tcatggggtg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga tgaaagaagc cgatgcggtt 840 atcgctctgg ctcctgtctt taacgactac tccaccactg gttggacgga tattcctgat 900 cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgtcg ttaacggcat tcgcttcccc 960 agcgtccatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga aagtttccaa gaaaaccggt 1020 gctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080
    ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140 aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200 ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acattggttg gtccgttcct 1260 gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320 ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtc gctcagatgg ttcgcctgaa actgccggtt 1380 atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440 tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgaca gcggtgctgg taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560 gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680 cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707
    <210> 2
    <211> 1707
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> secuencia mutada sintética del gen pdc
    <400> 2 atgtcttata ctgttggtac ttatttagct gaacgtcttg ttcaaattgg tcttaaacat 60 cacttcgcag ttgctggtga ctacaacctt gttcttcttg acaaccttct tcttaacaaa 120 aacatggaac aagtttattg ctgtaacgaa cttaactgcg gtttctctgc agaaggttat 180 gctcgtgcta aaggtgcagc agcagctgtt gttacttact ctgttggtgc tctttctgca 240 ttcgatgcta tcggtggtgc ttatgcagaa aaccttcctg ttatccttat ctctggtgct 300 cctaacaaca acgaccacgc tgctggtcac gttcttcatc acgctcttgg taaaactgac 360 tatcactatc aacttgaaat ggctaaaaac atcactgctg ctgctgaagc tatttatact 420 cctgaagaag ctcctgctaa aatcgatcac gttattaaaa ctgctcttcg tgaaaaaaaa 480 cctgtttatc ttgaaatcgc ttgcaacatt gcttctatgc cttgcgctgc tcctggacct 540 gcatctgcac ttttcaacga cgaagcatct gacgaagcat ctcttaacgc agctgttgaa 600 gaaactctta aattcatcgc taaccgcgac aaagttgctg ttcttgttgg ttctaaactt 660
    cgcgcagctg gtgctgaaga agctgctgtt aaattcgctg atgctcttgg tggtgcagtt 720 gctactatgg ctgctgcaaa atctttcttc ccagaagaaa accctcatta catcggtact 780 tcttggggtg aagtttctta tcctggtgtt gaaaaaacta tgaaagaagc tgatgctgtt 840 atcgctcttg ctcctgtttt caacgactac tctactactg gttggactga tattcctgat 900 cctaaaaaac ttgttcttgc tgaacctcgt tctgttgttg ttaacggtat tcgcttccct 960 tctgttcatc ttaaagacta tcttactcgt cttgctcaaa aagtttctaa aaaaactggt 1020 gctcttgact tcttcaaatc tcttaacgca ggtgaactta aaaaagctgc tcctgctgat 1080 ccttctgctc ctcttgttaa cgcagaaatc gctcgtcaag ttgaagctct tcttactcct 1140 aacactactg ttattgctga aactggtgac tcttggttca acgctcaacg catgaaactt 1200 cctaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg caatggggtc acattggttg gtctgttcct 1260 gctgctttcg gttatgctgt tggtgctcct gaacgtcgca acatccttat ggttggtgat 1320 ggttctttcc aacttactgc tcaagaagtt gctcaaatgg ttcgccttaa acttcctgtt 1380 atcatcttcc ttatcaacaa ctatggttac actatcgaag ttatgatcca tgatggtcct 1440 tacaacaaca tcaaaaactg ggattatgct ggtcttatgg aagttttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgact ctggtgctgg taaaggtctt aaagctaaaa ctggtggtga acttgcagaa 1560 gctatcaaag ttgctcttgc aaacactgac ggtccaactc ttatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga acttgttaaa tggggtaaac gcgttgctgc tgctaactct 1680 cgtaaacctg ttaacaaact tctttag 1707
    <210> 3
    <211> 1152
    <212> DNA
    <213> Zymomonas mobilis
    <400> 3 atggcttctt caacttttta tattcctttc gtcaacgaaa tgggcgaagg ttcgcttgaa 60 aaagcaatca aggatcttaa cggcagcggc tttaaaaatg cgctgatcgt ttctgatgct 120 ttcatgaaca aatccggtgt tgtgaagcag gttgctgacc tgttgaaagc acagggtatt 180 aattctgctg tttatgatgg cgttatgccg aacccgactg ttaccgcagt tctggaaggc 240 cttaagatcc tgaaggataa caattcagac ttcgtcatct ccctcggtgg tggttctccc 300
    catgactgcg ccaaagccat cgctctggtc gcaaccaatg gtggtgaagt caaagactac 360 gaaggtatcg acaaatctaa gaaacctgcc ctgcctttga tgtcaatcaa cacgacggct 420 ggtacggctt ctgaaatgac gcgtttctgc atcatcactg atgaagtccg tcacgttaag 480 atggccattg ttgaccgtca cgttaccccg atggtttccg tcaacgatcc tctgttgatg 540 gttggtatgc caaaaggcct gaccgccgcc accggtatgg atgctctgac ccacgcattt 600 gaagcttatt cttcaacggc agctactccg atcaccgatg cttgcgcctt gaaggctgcg 660 tccatgatcg ctaagaatct gaagaccgct tgcgacaacg gtaaggatat gccagctcgt 720 gaagctatgg cttatgccca attcctcgct ggtatggcct tcaacaacgc ttcgcttggt 780 tatgtccatg ctatggctca ccagttgggc ggctactaca acctgccgca tggtgtctgc 840 aacgctgttc tgcttccgca tgttctggct tataacgcct ctgtcgttgc tggtcgtctg 900 aaagacgttg gtgttgctat gggtctcgat atcgccaatc tcggtgataa agaaggcgca 960 gaagccacca ttcaggctgt tcgcgatctg gctgcttcca ttggtattcc agcaaatctg 1020 accgagctgg gtgctaagaa agaagatgtg ccgcttcttg ctgaccacgc tctgaaagat 1080 gcttgtgctc tgaccaaccc gcgtcagggt gatcagaaag aagttgaaga actcttcctg 1140 agcgctttct aa 1152
    <210> 4
    <211> 1152
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Secuencia mutada sintética del gen adhB
    <400> 4 atggcttctt ctactttcta tattcctttc gttaacgaaa tgggtgaagg ttctcttgaa 60 aaagcaatca aagaccttaa cggttctggt ttcaaaaacg ctcttatcgt ttctgatgct 120 ttcatgaaca aatctggtgt tgttaaacaa gttgctgacc ttcttaaagc acaaggtatt 180 aactctgctg tttatgatgg tgttatgcct aaccctactg ttactgcagt tcttgaaggt 240 cttaaaatcc ttaaagataa caactctgac ttcgttatct ctcttggtgg tggttctcct 300 catgactgcg ctaaagctat cgctcttgtt gcaactaacg gtggtgaagt taaagactac 360 gaaggtatcg acaaatctaa aaaacctgct cttcctctta tgtctatcaa cactactgct 420
    ggtactgctt ctgaaatgac tcgtttctgc atcatcactg atgaagttcg tcacgttaaa 480 atggctattg ttgaccgtca cgttactcct atggtttctg ttaacgatcc tcttcttatg 540 gttggtatgc caaaaggtct tactgctgct actggtatgg atgctcttac tcacgcattc 600 gaagcatatt cttctactgc agctactcct atcactgatg cttgcgctct taaagctgct 660 tctatgatcg ctaaaaacct taaaactgct tgcgacaacg gtaaagatat gccagctcgt 720 gaagctatgg cttatgctca attccttgct ggtatggctt tcaacaacgc ttctcttggt 780 tatgttcatg ctatggctca ccaacttggt ggttactaca accttcctca tggtgtttgc 840 aacgctgttc ttcttcctca tgttcttgct tataacgctt ctgttgttgc tggtcgtctt 900 aaagacgttg gtgttgctat gggtcttgat atcgctaacc ttggtgataa agaaggtgca 960 gaagctacta ttcaagctgt tcgcgatctt gctgcttcta ttggtattcc agcaaacctt 1020 actgaacttg gtgctaaaaa agaagatgtt cctcttcttg ctgaccacgc tcttaaagat 1080 gcttgtgctc ttactaaccc tcgtcaaggt gatcaaaaag aagttgaaga acttttcctt 1140 tctgctttct aa 1152
    <210> 5
    <211> 555
    <212> DNA
    <213> Escherichia coli
    <400> 5 atggcagcgg acacgttatt gattctgggt gatagcctga gcgccgggta tcgaatgtct 60 gccagcgcgg cctggcctgc cttgttgaat gataagtggc agagtaaaac gtcggtagtt 120 aatgccagca tcagcggcga cacctcgcaa caaggactgg cgcgccttcc ggctctgctg 180 aaacagcatc agccgcgttg ggtgctggtt gaactgggcg gcaatgacgg tttgcgtggt 240 tttcagccac agcaaaccga gcaaacgctg cgccagattt tgcaggatgt caaagccgcc 300 aacgctgaac cattgttaat gcaaatacgt ctgcctgcaa actatggtcg ccgttataat 360 gaagccttta gcgccattta ccccaaactc gccaaagagt ttgatgttcc gctgctgccc 420 ttttttatgg aagaggtcta cctcaagcca caatggatgc aggatgacgg tattcatccc 480 aaccgcgacg cccagccgtt tattgccgac tggatggcga agcagttgca gcctttagta 540 aatcatgact cataa 555 <210> 6
    <211> 555
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Secuencia mutada sintética del gen ´tesA
    <400> 6 atggcagctg acactttact tattcttggt gattctcttt ctgctggtta tcgtatgtct 60 gcttctgctg cttggcctgc tcttcttaac gataaatggc aatctaaaac ttctgtagtt 120 aacgcttcta tctctggtga cacttctcaa caaggacttg ctcgccttcc tgctcttctt 180 aaacaacatc aacctcgttg ggttcttgtt gaacttggtg gtaacgacgg tcttcgtggt 240 ttccaaccac aacaaactga acaaactctt cgccaaattc ttcaagatgt taaagctgct 300 aacgctgaac cacttttaat gcaaatccgt cttcctgcaa actatggtcg ccgttataac 360 gaagcattct ctgctattta ccctaaactt gctaaagaat tcgatgttcc tcttcttcct 420 ttcttcatgg aagaagttta ccttaaacca caatggatgc aagatgacgg tattcatcct 480 aaccgcgacg ctcaaccttt cattgctgac tggatggcta aacaacttca acctttagta 540 aaccatgact cttaa 555
    <210> 7
    <211> 1377
    <212> DNA
    <213> Acinetobacter cepa baylyi ADP1
    <400> 7 atgcgcccat tacatccgat tgattttata ttcctgtcac tagaaaaaag acaacagcct 60 atgcatgtag gtggtttatt tttgtttcag attcctgata acgccccaga cacctttatt 120 caagatctgg tgaatgatat ccggatatca aaatcaatcc ctgttccacc attcaacaat 180 aaactgaatg ggcttttttg ggatgaagat gaagagtttg atttagatca tcattttcgt 240 catattgcac tgcctcatcc tggtcgtatt cgtgaattgc ttatttatat ttcacaagag 300 cacagtacgc tgctagatcg ggcaaagccc ttgtggacct gcaatattat tgaaggaatt 360 gaaggcaatc gttttgccat gtacttcaaa attcaccatg cgatggtcga tggcgttgct 420 ggtatgcggt taattgaaaa atcactctcc catgatgtaa cagaaaaaag tatcgtgcca 480 ccttggtgtg ttgagggaaa acgtgcaaag cgcttaagag aacctaaaac aggtaaaatt 540
    aagaaaatca tgtctggtat taagagtcag cttcaggcga cacccacagt cattcaagag 600 ctttctcaga cagtatttaa agatattgga cgtaatcctg atcatgtttc aagctttcag 660 gcgccttgtt ctattttgaa tcagcgtgtg agctcatcgc gacgttttgc agcacagtct 720 tttgacctag atcgttttcg taatattgcc aaatcgttga atgtgaccat taatgatgtt 780 gtactagcgg tatgttctgg tgcattacgt gcgtatttga tgagtcataa tagtttgcct 840 tcaaaaccat taattgccat ggttccagcc tctattcgca atgacgattc agatgtcagc 900 aaccgtatta cgatgattct ggcaaatttg gcaacccaca aagatgatcc tttacaacgt 960 cttgaaatta tccgccgtag tgttcaaaac tcaaagcaac gcttcaaacg tatgaccagc 1020 gatcagattc taaattatag tgctgtcgta tatggccctg caggactcaa cataatttct 1080 ggcatgatgc caaaacgcca agccttcaat ctggttattt ccaatgtgcc tggcccaaga 1140 gagccacttt actggaatgg tgccaaactt gatgcactct acccagcttc aattgtatta 1200 gacggtcaag cattgaatat tacaatgacc agttatttag ataaacttga agttggtttg 1260 attgcatgcc gtaatgcatt gccaagaatg cagaatttac tgacacattt agaagaagaa 1320 attcaactat ttgaaggcgt aattgcaaag caggaagata ttaaaacagc caattaa 1377
    <210> 8
    <211> 1377
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Secuencia mutada sintética del gen atf1
    <400> 8 atgcgcccat tacatcctat tgatttcatc ttcctttctc ttgaaaaacg tcaacaacct 60 atgcatgtag gtggtttatt ccttttccaa attcctgata acgctccaga cactttcatt 120 caagaccttg ttaacgatat ccgtatctct aaatctatcc ctgttccacc attcaacaac 180 aaacttaacg gtcttttctg ggatgaagat gaagaattcg atttagatca tcatttccgt 240 catattgcac ttcctcatcc tggtcgtatt cgtgaacttc ttatttatat ttctcaagaa 300 cactctactc ttcttgatcg tgcaaaacct ctttggactt gcaacattat tgaaggaatt 360 gaaggtaacc gtttcgctat gtacttcaaa attcaccatg ctatggttga tggtgttgct 420 ggtatgcgtt taattgaaaa atctctttct catgatgtaa cagaaaaatc tatcgttcca 480
    ccttggtgtg ttgaaggaaa acgtgcaaaa cgcttacgtg aacctaaaac aggtaaaatt 540 aaaaaaatca tgtctggtat taaatctcaa cttcaagcta cacctacagt tattcaagaa 600 ctttctcaaa cagtattcaa agatattgga cgtaaccctg atcatgtttc ttctttccaa 660 gctccttgtt ctattcttaa ccaacgtgtt tcttcttctc gtcgtttcgc agcacaatct 720 ttcgaccttg atcgtttccg taacattgct aaatctctta acgttactat taacgatgtt 780 gtacttgctg tatgttctgg tgcattacgt gcttatctta tgtctcataa ctctcttcct 840 tctaaaccat taattgctat ggttccagct tctattcgca acgacgattc tgatgtttct 900 aaccgtatta ctatgattct tgcaaacctt gcaactcaca aagatgatcc tttacaacgt 960 cttgaaatta tccgccgttc tgttcaaaac tctaaacaac gcttcaaacg tatgacttct 1020 gatcaaattc ttaactattc tgctgttgta tatggtcctg caggacttaa catcatttct 1080 ggtatgatgc caaaacgcca agcattcaac cttgttattt ctaacgttcc tggtccacgt 1140 gaaccacttt actggaacgg tgctaaactt gatgcacttt acccagcttc tattgtatta 1200 gacggtcaag cacttaacat tacaatgact tcttatttag ataaacttga agttggtctt 1260 attgcatgtc gtaacgcact tccacgtatg caaaacttac ttacacattt agaagaagaa 1320 attcaacttt tcgaaggtgt aattgcaaaa caagaagata ttaaaacagc taactaa 1377
    <210> 9
    <211> 37
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador directo del gen LcfA
    <400> 9 ggagcttcta gatctaaagg ggaggtttta tgcagtc 37
    <210> 10
    <211> 36
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador inverso del gen LcfA
    <400> 10 ttgcttgcat gctcatggat ccttcctata gaaatg 36 <210> 11
    <211> 36
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador directo del gen yhfL
    <400> 11 ggcttcacta atctagatct attcattcac ttaagg 36
    <210> 12
    <211> 35
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador inverso del gen yhfL
    <400> 12 aacgaagtcg acggatccgc tttttcattt tattg 35
    <210> 13
    <211> 33
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador directo del operon accDA
    <400> 13 agcgagtcta gatgttgcgg aaggcattat gac 33
    <210> 14
    <211> 38
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador inverso del operón accDA
    <400> 14 aaaagcatgc cgtcgactta gtttaccccg atatattg 38
    <210> 15
    <211> 37
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence <220>
    <223> Cebador directo del operón accBC
    <400> 15 tataaatcta gaaatgtcga ccataggagt gcgattg
    <210> 16
    <211> 32
    <212> DNA
    <213> Artificial Sequence
    <220>
    <223> Cebador inverso del operón accBC
    <400> 16 ttcatcgcat gcacctccgt aaaaattatg ag 32
    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
    N.º solicitud: 201131400
    ESPAÑA
    Fecha de presentación de la solicitud: 18.08.2011
    Fecha de prioridad:
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional
    DOCUMENTOS RELEVANTES
    Categoría
    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas
    X
    DUAN, Y. et al., ‘De novo biosynthesis of biodiesel by Escherichia coli in optimized fed-batch 1-4,6-8,10-13,
    cultivation’, PLOS ONE, 2011, Vol. 6, No. 5, página e20265, ISSN: 1932-6203 (electronic), Epub:
    15,21,22,26-28,
  35. 23.05.2011, Introducción, Figura 1; Resultados; Materiales y Métodos, Tabla 2.
    31-40
    Y
    Materiales y Métodos, Tabla 2; Figura 1. 1-28,31-36
    X
    WO 2008119082 A2 (LS9 INC.) 02.10.2008, reivindicaciones 105-109,113-115. 37-40
    Y
    Página 3, línea 7 – página 5, línea 17. 1-28,31-36
    X
    WO 2011038134 A1 (LS9 INC.) 31.03.2011, párrafos [0144]-[0160]. 37-40
    Y
    Párrafos [0022],[0036]. 1-28,31-36
    X
    STEEN, E.J. et al., ‘Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass’, NATURE, 2010 Enero, Vol. 463, No. 7280. Páginas 559-562, ISSN: 0028-0836, páginas 560-1, Figura 3. 37-40
    A
    KALSCHEUER, R. et al., ‘Microdiesel: Escherichia coli engineered for fuel production’, MICROBIOLOGY, 2006, Vol. 152, No. 9, páginas 2529-2536, ISSN: 1350-0872, todo el documento. 1-40
    A
    SHARP, P.M. et al., ‘Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity’, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1988, Vol. 16, No. 17, páginas 8207-8211, ISSN: 0305-1048, todo el documento. 1-36
    A
    SHIELDS, D.C. et al., ‘Synonymous codon usage in Bacillus subtilis reflects both translational selection and mutational biases’, Nucleic Acids Res. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1987, Vol. 15, No. 19, páginas 8023-8040, ISSN: 0305-1048, todo el documento. 1-36
    A
    HONG, W.K. et al, ‘Enhanced production of ethanol from glycerol by engineered Hansenula polymorpha expressing pyruvate decarboxylase and aldehyde dehydrogenase genes from Zymomonas mobilis’, , 2010 Agosto, Vol. 32, No. 8, páginas 1077-1082, ISSN: 0141-5492, Epub: 31.03.2010, todo el documento. 1-40
    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
    Fecha de realización del informe 28.01.2013
    Examinador J. L. Vizán Arroyo Página 1/6
    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS
    N.º solicitud: 201131400
    ESPAÑA
    Fecha de presentación de la solicitud: 18.08.2011
    Fecha de prioridad:
    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional
    DOCUMENTOS RELEVANTES
    Categoría
    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas
    A
    WO 2010130806 A1 (DEINOVE) 18.11.2010, todo el documento. 1-40
    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
    Fecha de realización del informe 28.01.2013
    Examinador J. L. Vizán Arroyo Página 2/6
    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
    Nº de solicitud: 201131400
    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD
    C12N9/02 (2006.01) C12N9/10 (2006.01) C12N1/21 (2006.01) C12P7/64 (2006.01) C12N9/16 (2006.01)
    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)
    C12N, C12P
    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)
    INVENES, EPODOC, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, EBI
    Informe del Estado de la Técnica Página 3/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201131400
    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.01.2013 Declaración
    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
    Reivindicaciones Reivindicaciones Reivindicaciones Reivindicaciones (1-4),5,(6-8),9,(10-13),14,(15),16-20,(21,22),23-25,(2628),29,30,(31-36)(en parte) (1-4,6-8,10-13,15,21,22,26-28,31-36)(en parte),37-40 (1-4),5,(6-8),9,(10-13),14,(15),16-20,(21,22),23-25,(2628),(31-36)(en parte) SI NO SI NO
    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).
    Base de la Opinión.-
    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.
    Informe del Estado de la Técnica Página 4/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201131400
    1. Documentos considerados.-
    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.
    Documento
    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
    D01
    DUAN, Y. et al., PLoS One. (2011), 6(5): e20265.
    D02
    WO 2008119082 A2 (LS9 INC.) 02.10.2008
    D03
    WO 2011038134 A1 (LS9 INC.) 31.03.2011
    D04
    STEEN, E.J. et al., Nature, (2010 Jan), 463 (7280): 559-62. 2010
    D05
    KALSCHEUER, R. et al., Microbiology, (2006),152(Pt 9): 2529-36. 2006
    D06
    SHARP, P.M. et al., Nucleic Acids Res., (1988), 16(17):8207-11. 1988
    D07
    SHIELDS, D.C. et al., Nucleic Acids Res., (1987), 15(19): 8023-40. 1987
    D08
    HONG, W.K. et al, Biotechnol. Lett., (2010 Aug), 32(8):1077-82. 2010
    D09
    WO 2010130806 A1 (DEINOVE) 18.11.2010
    En D1-D4 se describe la biosíntesis de biocombustible mediante microorganismos modificados genéticamente.
  36. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración
    1. NOVEDAD (Art. 4.1. y Art. 6.1. de la Ley de Patentes).
    1.1. Reivindicación independiente 1 (en parte).
    1.1.1. El objeto de las reivindicaciones 1 a 3 consiste en una construcción génica que comprende variantes de las secuencias mutantes SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 18 derivadas del gen pdc de Zymomonas mobilis y codificadoras de la actividad piruvato descarboxilasa, de las secuencias mutantes SEQ ID NO 4 o SEQ ID NO 19 derivadas del gen adhBde Zymomonas mobilis y codificadoras de la actividad alcohol deshidrogenasa, de las secuencias mutantes SEQ ID NO 6 o SEQ ID NO 17 o SEQ ID NO 20 o SEQ ID NO 21 derivadas del gen tesA de Escherichia coli y codificadoras de la actividad tiosterasa A, y de las secuencias mutantes SEQ ID NO 8 o SEQ ID NO 22 derivadas del gen atf1 de Acinetobacter sp. ADP1 y codificadoras de la actividad sintetasa de triacilgliceroles y ceras. Según la reivindicación 4, la construcción comprende además variantes de los genes accABCD codificadores de las cuatro subunidades de la enzima acetil-CoA carboxilasa.
    1.1.2. En el documento D1 se describen construcciones plasmídicas que comprenden los genes pdc y adhBde Zymomonas mobilis, tesA de Escherichia coli y atf1 de Acinetobacter sp., codificadores de las enzimas piruvato descarboxilasa, alcohol deshidrogenasa, tiosterasa A y sintetasa de triacilgliceroles y ceras, respectivamente. Además, se describe una construcción que comprende los genes accABCD de E.coli (cf. D1: Materiales y Métodos, Tabla 2). Por consiguiente, se considera que el objeto de protección de la reivindicación independiente 1 y el de las dependientes (2-4, 6-8, 10-13, 15, 21, 22, 26-28, 31-36) (en parte) no es nuevo sobre la base del documento D1.
    1.2. Reivindicación independiente 37.
    1.2.1. El objeto de la reivindicación 37 consiste en un biocombustible que comprende etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y saturados.
    En los documentos D1-D4 se describen biocombustibles que comprenden alquil-ésteres de ácidos grasos que incluyen metil-y etil-ésteres de ácidos grasos (cf. D1: Resultados y Discusión. D2: Reivindicaciones 105-109, 113-115. D3: Párrafos [0144]-[0160]; Reivindicación 50. D4: páginas 560-1, Figura 3). Por consiguiente, se considera que el objeto de protección de la reivindicación independiente 37 y el de las dependientes 38, 39 y 40 no es nuevo sobre la base del documento D1-D4.
    1.3. La presente solicitud no satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones (1-4, 6-8, 10-13, 15, 21, 22, 26-28, 31-36) (en parte), 37-40 no es nuevo de acuerdo con el Art. 6.1. de la Ley de Patentes.
    Informe del Estado de la Técnica Página 5/6
    OPINIÓN ESCRITA
    Nº de solicitud: 201131400
  37. 2. ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 4.1. y Art. 8.1. de la Ley de Patentes).
  38. 2.1. Reivindicación independiente 1 (en parte).
  39. 2.1.1. El documento D1 constituye el estado de la técnica más próximo. En él se describen construcciones plasmídicas que comprenden los genes pdc y adhBde Zymomonas mobilis, tesA de Escherichia coli y atf1 de Acinetobacter sp. Además, se describe una construcción que comprende los genes accABCD de E.coli (cf. D1: Materiales y Métodos, Tabla 2).
  40. 2.1.2. El problema técnico a resolver por el objeto de la reivindicación independiente 1 puede ser considerado, por consiguiente, como la provisión de una construcción génica que comprenda nuevas variantes de las secuencias de los genes pdc y adhBde Zymomonas mobilis, tesA de Escherichia coli y atf1 de Acinetobacter sp.
  41. 2.1.3. La solución propuesta en la reivindicación 1 consiste básicamente en las secuencias mutantes indicadas en el apartado
    1.1.1. Según la descripción, dichas secuencias han sido optimizadas según el uso predominante de codones de Bacillus subtilis para su expresión mejorada en dicha bacteria Gram-positiva. Esta característica técnica constituye la diferencia básica entre la construcción génica de la solicitud y la descrita en D1 (cf. D1: Tabla 2). En el estado de la técnica se han descrito los codones de uso más frecuente en Bacillus subtilis y su aplicación en el diseño de sistemas de expresión de genes heterólogos (cf. D6-D7). Por otro lado, se ha divulgado la obtención de bacterias modificadas genéticamente, entre las que se incluyen Bacillus subtilis, que expresan genes mutantes heterólogos que codifican actividades enzimáticas relacionadas con la biosíntesis de compuestos derivados de ácidos grasos. Las secuencias de estos genes han sido optimizadas según el uso de codones predomínate en los diferentes microorganismos considerados (cf. D2: página 3, línea 7 – página 5, línea 17. D3: párrafos [0022] y [0036]).
    Por consiguiente, se considera que ante el problema técnico planteado, el experto en la materia combinaría las enseñanzas divulgadas en D1 con las de D2 y D3 llegando a la solución propuesta en la reivindicación 1 o a una equivalente. Por todo ello, se considera que la reivindicación 3 (en parte) y las reivindicaciones dependiente (2-4), 5, (6-8), 9, (10-13), 14, (15), 16-20, (21, 22), 23-25, (26-28), (31-35) (en parte) no son inventivas.
  42. 2.2. La presente solicitud no satisface el criterio establecido en el Art. 4.1. de la Ley de Patentes porque el objeto de la invención, definido en las reivindicaciones (1-4), 5, (6-8), 9, (10-13), 14, (15), 16-20, (21, 22), 23-25, (26-28), (31-36) (en parte) no implica actividad inventiva de acuerdo con el Art. 8.1. de la Ley de Patentes.
    Informe del Estado de la Técnica Página 6/6
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