[go: up one dir, main page]

ME02069B - Vezujuci agensi notch1 receptora i postupci njihove primene - Google Patents

Vezujuci agensi notch1 receptora i postupci njihove primene

Info

Publication number
ME02069B
ME02069B MEP-2015-20A MEP2015A ME02069B ME 02069 B ME02069 B ME 02069B ME P2015 A MEP2015 A ME P2015A ME 02069 B ME02069 B ME 02069B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
antibody
seq
cancer
antibodies
tumor
Prior art date
Application number
MEP-2015-20A
Other languages
English (en)
Inventor
Austin Gurney
Timothy Charles Hoey
Maureen Fitch Bruhns
Fumiko Axelrod
Original Assignee
Oncomed Pharm Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncomed Pharm Inc filed Critical Oncomed Pharm Inc
Publication of ME02069B publication Critical patent/ME02069B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/18—Kallidins; Bradykinins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/22—Tachykinins, e.g. Eledoisins, Substance P; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

 
OPIS PRONALASKA
 
Oblast Pronalaska
 
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije koje sadrže agens koji vezuje humani Notch receptor i postupke primene kompozicija za karakterizaciju, dijagnostikovanje, i tretiranje raka i drugih oboljenja. Naročito, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se posebno vezuju za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupke tretiranja raka, postupke koji obuhvataju primenu terapeutske efikasne količine antitela koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regijona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptor proteina i inhibira rast tumora.
 
Stanje Tehnike
 
[0002] Rak je jedan od vodećih izazivača smrti u razvijenom svetu, rezultujući preko 500,000 smrtnih ishoda godišnje samo u Sjedinjenim Američkim Državama. Preko jednog milijona ljudi je dijagnostikovano sa rakom u U.S. svake godine, i uopšte je procenjeno da više od 1 od 3 ljudi će razviti neki oblik raka tokom njihovog života. Misli se da ima više od 200 različitih tipova raka, četiri od njih – dojke, pluća, debelo crevo, i prostata - predstavljaju preko polovinu svih novih slučajeva (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).
 
[0003] Rak nastaje iz nepravilnosti mehanizama da kontrolišu normalni razvoj tkiva i održavanje, i sve više se smatra da matične ćelije igraju centralnu ulogu (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). Tokom normalnog životinjskog razvoja, ćelije većine ili svih tkiva su izvedene iz normalnih prekursora, koje se nazivaju matične ćelije (Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35-71). Matične ćelije su ćelije koje: (1) imaju obimni proliferativni kapacitet; 2) su sposobne da iz asimetrične ćelijske deobe generišu jednu ili više vrsta progena sa redukovanim proliferativnim i/ili razvijenim potencijalom; i (3) su sposobne za simetrične ćelijske deobe za samo obnovu ili samo održavanje. Najbolji primer obnove odrasle ćelije diferencijacijom matičnih ćelija je hematopični sistem gde razvojni nezreli prekursori (hematopoetične i roditeljske ćelije) odgovaraju molekularnim signalima da obrazuju raznovrsnu krv i limfoidne ćelijske tipove. Druge ćelije, uključujući ćelije creva, grudnog duktalnog sistema, i kože su konstantno dopunjene iz male populacije matičnih ćelija u svakom tkivu, i skorašnja istraživanja predlažu da većina drugih tkiva odraslih osoba takođe kultiviše matične ćelije, uključujući moždane.
 
[0004] Čvrsti tumori su sastavljeni od heterogenih ćelijskih populacija. Na primer, rak dojke predstavlja smešu ćelija raka i normalnih ćelija, uključujući mesenchymal (stromal) ćelije, inflamatorne ćelije, i endotelijalne ćelije. Klasični modeli raka drže da fenotipične dinstiktivne ćelijske populacije raka sve imaju sposobnost da se razmnožavaju i dovode do nastajanja novog tumora. U klasičnom modelu, heterogenost tumorne ćelije rezultira iz faktora sredine kao i tekućih mutacija unutar ćelija raka koje rezultuju u raznim populacijama tumorogenskih ćelija. Ovaj model se ogleda u ideji da će sve populacije tumornih ćelija imati neki stepen tumorigenskog potencijala. (Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cancer 12:122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57:1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391; Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes & Cancer 82: 173-183; Beerman H et al., 1991, Cytometry 12:147-54; Aubele M & Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53; Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884).
 
[0005] Alternativni model za posmatranu heterogenost čvrste tumorne ćelije je taj da čvrsti tumori rezultiraju iz "čvrste tumorne matične ćelije" (ili "raka matične ćelije" iz čvrstog tumora) tako da zatim prolazi haotični razvoj kroz obe sistemske i asimetrične putanje ćelijske deobe. U ovom modelu matične ćelije, čvrsti tumori sadrže dinstiktivni i ograničeni (moguće čak i retki) podset ćelija koje dele osobine normalnih "matičnih ćelija", tako da se intenzivno razmnožavaju i efikasno dovode i do dodatnog povećanja čvrstih tumornih matičnih ćelija (samo obnavljanje) i do većine tumornih ćelija čvrstog tumora da nedostaje kancerogeni potencijal. Zaista, mutacije sa produženim životom populacije matičnih ćelija može inicirati formiranje matičnih ćelija raka koje podvlače rast i održavanje tumora i čije prisustvo doprinosi neuspehu aktuelnih terapeutskih pristupa.
 
[0006] Priroda matičnih ćelija raka je prvo otkrivena u raku krvi, akutna mieloidna leukemija (AML) (Lapidot et al., 1994, Nature 367:645-8). Skoro je prikazano da maligni humani tumori dojke slično kultivišu male, različite populacije matičnih ćelija raka koje su obogaćene sa sposobnošću da obrazuju tumore kod imunodificijentnih miševa. ESA+, CD44+, CD24-/niski, Lin-ćelijska populacija je pronađena da je 50-nabor obogaćen za kancerogene ćelije u poređenju sa nefrakcionisanim tumornim ćelijama (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100:3983-8). Sposobnost da se prospektivno izoluju kancerogene ćelije raka je dozvolila istraživanje kritičnih biloških putanja koja podvlače kancerogenost u ovim ćelijama, i prema tome obećavaju razvoj bolje dijagnostičke analize i terapeutika za pacijente obolele od raka. Prema tome cilj je da ovaj pronalazak bude usmeren ka tome.
[0007] Normalne matične ćelije i matične ćelije raka dele sposobnost da se razmnožavaju i same obnavljaju, te stoga nije iznenađujuće da veliki broj gena koji regulišu normalni razvoj matičnih ćelija doprinose obrazovanju tumora (prikazano u Reya et al., 2001, Nature 414:105-111 and Taipale & Beachy, 2001, Nature 411:349-354). Predmetni pronalazak identifikuje Notch receptor, na primer, Notch1, kao marker raka matične ćelije, koji implicira Notch signalni put u održavanju matičnih ćelija raka i kao meta za lečenje raka preko eliminacije ovih kancerogenih ćelija.
 
[0008] Notch signalni put je jedan od nekoliko kritičnih regulatora embrionskog formiranja obrazaca, post-embrijonskog održavanja tkiva, i biolgije matične ćelije. Naročito, Notch signal je uključen u postupak bočne inhibicije između susedne ćelije i igra veoma važnu ulogu u određivanju ćelije tokom asimetričnih deoba ćelije. Neregulisani Notch signal je povezan sa velikim brojem humanih rakova gde mogu da menjaju razvojnu sudbinu tumornih ćelija kako bi ih održali u nediferenciranom i proliferativnom stanju (Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69). Prema tome formiranje kancera može se odvijati uzurpacijom homeostatičnih mehanizama koji kontrolišu normalni razvoj i obnavljanje tkiva od strane populacije matičnih ćelija (Beachy et al., 2004, Nature 432:324).
 
[0009] Notch receptor je prvo identifikovan kod Drosophila mutanata sa haplo insuficijencijom koja rezultira u zarezima na krilu margine, gde gubitak funkcije dovodi do stvaranja embrijonskog smrtonosnog "neurogenskog" fenotipa gde se ćelije epidermisa prebacuju u nervno tkivo (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). Notch receptor je pojedinačni propusni transmembranski receptor koji sadrži veliki broj tandemskih epidermalnih ripitera faktora rasta (EGF) i tri Notch/LIN-12 ripitera obogaćena cisteinom (LNRs) sa velikim brojem vanćelijskih domena (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; ocenjen u Artavanis et al., 1999, Science 284:770). LNRs i dodatni C-krajnji rep od približno 103 amino kiseline vanćelijskog domena su ovde označeni kao "membranski proksimalni region". Ovaj region je takođe poznat kao, i odnosi se kao Notch negativni regulatorni region (NRR).
 
[0010] Sisarski Notch receptori podležu cepanju u oba obrazujuća zrela receptora i prate vezivanje liganda kako bi aktivirali donji tok signal. Proteaza slična furinu cepa prekursore Notch receptora tokom zrelosti kako bi se generisali jukstamembranski heterodimeri koji obuhvataju ne-kovalentnu povezanu vanćelijsku podjedinicu i transmembransku podjedinicu koje se drže zajedno u auto-inhibitornom stanju. Vezivanje liganda olakšava ovu inhibiciju i izaziva cepanje Notch receptora sa ADAM-tipskom metaloproteazom i gama-sekretazom, od kojih kasnije otpušta intraćelijski domen (ICD) u citoplazmu, dozvoljavajući da se translocira u nukleus kako bi aktivirao gensku transkripciju. Cepanje od strane ADAM se dešava unutar ne-ligadnog vezujućeg cepanja domena unutar jukstamembranskog negativnog regulatornog regiona (NRR) (Videti Fig. 1A). U Notch1 receptoru ovaj region obuhvata od oko 1427 amino kiselina do oko 1732 amino kiselina.
 
[0011] Četiri sisarska Notch proteina su identifikovani (Notch1, Notch2, Notch3, i Notch4), i mutacije u ovim receptorima uvek rezultiraju u razvojnim abnormalitetima i humane patologije obuhvataju nekoliko rakova kao što je opisano u više detalja u nastavku (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25).
 
[0012] Notch receptor je aktiviran transmembranskim ligandima pojedinačnog prolaza Delta, Serrated, Lag-2 (DSL) familije. Postoji pet poznatih Notch liganada kod sisara: Delta-like 1 (DLL1), Delta-like 3 (DLL3), Delta-like 4 (DLL4), Jagged 1 i Jagged 2 okarakterisani sa DSL domenom i tandemskim EGF ripiterima unutar vanćelijskog domena. Vanćelijski domen Notch receptora međusobno deluje sa njegovim ligandima, tipično na susednim ćelijama, rezultujući u dve proteolitičke podele Notch; jedna vanćelijska podela posreduje sa ADAM ((A Disintegrin And Metallopeptidase) Dizintegrin i Metalopeptidaza) proteazom, a jedna podela unutar transmembranskog domena posreduje sa gama sekretazom. Ovo kasnije cepanje generiše Notch intraćelijski domen (ICD), koji potom ulazi u nukleus gde aktivira CBF1, Suppressor of Hairless [Su(H)], Lag-2 (CSL) familiju transkripcionih faktora kao glavni efektori donjeg toka kako bi se povećala transkripcija nuklearnih baznih heliks-loop-heliks transkriptivnih faktora Hairy and Enhancer of Split [E(spl)] roda (Artavanis et al., 1999, Science 284:770; Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543). Alternativni intraćelijski putevi koji obuhvataju citoplazmični protein Deltex identifikovan u Drosophila (mala muva) mogu takođe postojati kod sisara (Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33), i ovaj Deltex-zavisni put može delovati tako da potiskuje ekspresiju Wnt ciljanih gena (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85).
 
[0013] Hematopoetične matične ćelije (HSCs) su najbolje shvaćene matične ćelije u krvi, i Notch signaliziranje je implicirano i u njihovom normalnom održavanju kao i u leukemijskoj transformaciji (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73). HSCs su retke populacije ćelija koje borave u stromalnom niche unutar koštane srži odrasle osobe. Ove ćelije su okarakterisane i sa jedinstvenim genskim ekspresionim profilom kao i sa sposobnosti da kontinualno dovodi do povećanja diferencijalnih roditeljskih ćelija kako bi se rekonstruisao celi hematopoetični sistem. Konstitutivna aktivacija Notch1 signala u HSCs i roditeljskim ćelijama uspostavlja besmrtne ćelijske linije koje generišu i limfoidne i mieloidne ćelije in vitro i u rekonstrukcijskim analizama dužeg vremenskog perioda (Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81), i prisustvo Jagged1 povećava engraftment populaciju ćelije ljudske koštane srži obogaćen za HSCs (Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72). Skoro, Notch signal je prikazan u HSCs in vivo i pokazuje da je uključen u inhibiciju HSC diferencijacije. Dalje, Notch signal izgleda da je potreban za Wnt-posredovanje HSC samo-obnavljanja (Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314).
 
[0014] Notch signalni put takođe igra izvesnu ulogu u održavanju neuronskih matičnih ćelija i impliciran i u njihovom normalnom održavanju kao i u tumoru mozga (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73; Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63; Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800). Neurološke matične ćelije dovode do povećanja svih neuroloških i glijalnih ćelija u nervnom sistemu sisara tokom razvoja, skoro je identifikovan i kod mozga odrasle osobe (Gage, 2000, Science 287:1433-8). Mišija deficijencija za Notch1; Notch ciljane gene Hes1, 3, i 5; i regulator Notch signala presenilin1 (PS1) pokazuju smanjeni broj embrionskih neuroloških matičnih ćelija. Dalje, neurološke matične ćelije kod odrasle osobe su smanjene u mozgu PS1 heterozigotnih miševa (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58). Redukcija kod neuroloških matičnih ćelija izgleda da rezultuje iz njihove prevremene diferencijacije u neurone (Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50) predlažući da Notch signal reguliše diferencijaciju i samo-obnavljanje neurološke matične ćelije.
 
[0015] Nenormalan Notch signal je impliciran u većem broju humanih rakova. Notch1 gen kod ljudi je prvo identifikovan u podjedinici T-ćelije akutne limfoblastične leukemije kao translocirani lokus koji rezultuje u aktivaciji Notch puta (Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61). Konstitutivna aktivacija Notch1 signala u T-ćelijama kod modela miša slično generiše T-ćelijske limfome koje predlažu uzročnu ulogu (Robey et al., 1996, Cell 87:483-92; Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9; Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48). Skoro Notch1 pokazuje mutacije, umetanje, i brisanje proizvedenog nenormalnog Notch1 signala koji je pronađen da je učestalo prisutan i kod dečijih i odraslih T-ćelijske akutne limfoblastične leukemije/limfome (Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33).
 
[0016] Učestalo ubacivanje mišijeg tumornog virusa dojke i u Notch1 i Notch4 lokus u tumore dojke i rezultovanje u aktivaciji Notch proteinskih fragmenata prvo implicira Notch signal u raku dojke (Gallahan & Callahan, 1987, J. Virol. 61:66-74; Brennan & Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). Dalje studije kod transgenskih miševa su potvrdile ulogu za Notch u duktalnom granjanju tokom normalnog razvoja mlečne žlezde, i konstitutivni aktivni oblik Notch4 u mlečnim epitelijalnim ćelijama inhibira epitelijalnu diferencijaciju i rezultuje u formiranju tumora (Jhappan et al., 1992, Genes & Dev. 6:345-5; Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:563-77; Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol. 196:204-17; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). Trenutno, dokaz za ulogu Notch kod ljudskog raka dojke je ograničen na ekspresiju Notch receptora u karcinomima dojke i njihova koleracija sa kliničkim ishodom (Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86; Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86). Dalje, prevelika ekspresija Notch puta je posmatrana kod raka grlića materice (Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8), karcinoma bubrežnih ćelija (Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32), karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4), endometrijalnih rakova (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9), i neuroblastoma (van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8) ukazuju na potencijalnu ulogu Notch u razvoju velikog broja neoplazme. Zanimljivo, Notch signal može igrati ulogu u održavanju nediferencijalnog stanja Apc-mutant neoplastičnih ćelija debelog creva (van Es & Clevers, 2005, Trends in Mol. Med. 11:496-502).
 
[0017] Notch put je takođe uključen u višestrukim aspektima vaskularnog razvoja koji uključuje proliferaciju, migraciju, diferencijaciju glatkih mišića, angiogenezu i arterialno-venoznu diferencijaciju (Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543). Na primer, homozigne prazne mutacije u Notch1/4 i Jagged1 kao i heterozigni gubitak DLL4 rezultuje u nekoliko teških varijabilnih defekata u arterijalnom razvoju i yolk sac vaskularizaciji. Dalje, DLL1-oskudan i Notch-2-hipomorfični mišiji embrioni pokazuju krvarenje koje je verovatno rezultat slabog razvoja vaskularne strukture (Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52; Xue et al.,
1999, Hum. Mel Genet. 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21; McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502). Kod ljudi, mutacije u Jagged1 su povezane sa Alagille sindromom, razvojni poremećaj koji uključuje vaskularne defekte, i mutacije u Notch3 su odgovorne za nasleđenu vaskularnu demenciju (Cadasil) gde je sud homeostazije defektivan (Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10).
 
[0018] Identifikacija Notch1, Notch4, DLL1 i DLL4 kao genski ekspresovan u matičnim ćelijama raka u poređenju sa normalnim epitelijama dojke predlaže da ciljanje Notch puta može pomoći u eliminaciji ne samo većeg broja nekancerogenskih ćelija raka, ali kancerogenskih ćelija koje su odgovorne za obrazovanje i ponavljanje čvrstih tumora. Dalje, zbog istaknute uloge angiogeneze u obrazovanju tumora i održavanju, ciljanje Notch puta može takođe efikasno inhibirati agiogenezu, izgladnjavanje raka hranjivim materijama i doprineti njegovoj eliminaciji.
 
[0019] Anti-Notch antitela i njihova moguća primena kao anti-kancerni terapeutici su prikazani. Videti, npr., U.S. Patentnu Objavu Prijave Br.. 2008/0131434 i 2009/0081238. Videti takođe Međunarodnu Objavu Br. WO 2008/057144, WO 2008/076960, i WO 2008/50525. WO 2007/145840 opisuje kompozicije i postupke za dijagnostikovanje i tretiranje raka. WO 2004/094475 opisuje tkivni faktor antitela i njihovu primenu. DE 4425115 opisuje postupke za modifikovanje stabilnosti antitela.
 
OPIS PRONALASKA
 
[0020] Pronalazak je definisan zahtevima. Ti aspekti/primeri predmetnog pronalaska koji čine pronalazak su definisani zahtevima.
 
KRATAK OPIS PRONALASKA
 
[0021] Predmetni pronalazak obezbeđuje agense koji se vezuju za ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora i kompozicije, kao što su farmaceutske kompozicije, koje sadrže te agense. Pronalazak dalje obezbeđuje postupke ciljanja matičnih ćelija raka sa agensima. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju smanjivanje učestalosti matičnih ćelija raka u tumoru, smanjivanje broja matičnih ćelija raka u tumoru, smanjivanje kancerogenosti tumora, i/ili smanjivanje kancerogenosti tumora smanjivanjem broja ili učestalosti matičnih ćelija raka u tumoru. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke primene agenasa u lečenju raka i/ili inhibiciji rasta tumora.
 
[0022] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora (npr., humani Notch1). U nekim slučajevima, ne-ligandna vezujuća membrana proksimalnog regiona Notch1 receptora obuhvata oko 1427 amino kiselina do oko 1732 amino kiselina humanog Notch1 receptora. U nekim slučajevima, membrana proksimalnog regiona Notch1 receptora obuhvata SEQ ID NO: 2. U nekim slučajevima, antitelo posebno vezano za ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona bar jednog dodatnog Notch receptora člana roda.
 
[0023] U nekim slučajevima, antitelo je antagonist Notch1. U nekim slučajevima, antitelo inhibira signalizacijom ili aktivacijom Notch1 receptora. U nekim slučajevima, antitelo inhibira Notch1 aktivnost. U nekim slučajevima, antitelo inhibira odvajanje unutar membrane proksimalnog regiona. U nekim slučajevima, antitelo inhibira odvajanje Notch1 receptora (npr., odvajanje na S2 mestu sa metaloproteazom) i/ili inhibira aktivaciju Notch1 receptora vezivanjem liganda. U nekim slučajevima, antitelo inhibira otpuštanje ili formiranje intraćelijskog domena (ICD) Notch1. U nekim slučajevima, antitelo inhibira rast tumora.
 
[0024] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 i sadrži teški lanac CDR1 koji sadrži RGYWIE (SEQ ID NO: 15), teški lanac CDR2 koji sadrži QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16), i/ili teški lanac CDR3 koji sadrži FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17); i/ili (b) laki lanac CDR1 koj sadrži RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), laki lanac CDR2 koji sadrži GTNNRAP (SEQ ID NO: 19), i/ili laki lanac CDR3 koji sadrži ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20). U nekim slučajevima, antitelo sadrži variabilnu regiona teškog lanca koji sadrži:
(a) teški lanac CDR1 koj sadrži RGYWIE (SEQ ID NO: 15), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinsku supstituciju; (b) teški lanac CDR2 koji sadrži QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinsku supstituciju; i/ili (c) teški lanac CDR3 koj sadrži FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije. U nekim slučajevima, antitelo sadrži (ili dalje obuhvata) varijabilnu regiona lakog lanca koji sadrži: (a) laki lanac CDR1 koji sadrži RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije; (b) laki lanac CDR2 koj sadrži GTNNRAP(SEQ ID NO: 19), ili njegovu varijantu koja sadrži 1,2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije; i/ili (c) laki lanac CDR3 koji sadrži ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije. U nekim slučajevima, amino kiselinske supstitucije su konzervativne amino kiselinske supstitucije.
 
[0025] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo, 52M51, dobijen od strane hibridomske ćelijske linije deponovane kod Američkog Tipa Kulturne Kolekcije (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, pod uslovima Budimpeštanskog Sporazuma 7 Avgusta, 2008, i dodeljen naznačeni broj PTA-9405. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje humanizovanu verziju antitela 52M51, 52M51H4L3, kao što je kodirano sa DNK deponovanim kod ATCC, pod uslovima Budimpeštanskog Sporazuma od 15 Oktobra, 2008, i dodeljen naznačeni broj PTA-9549. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje je vezano za isti epitop kao epitop za koji je vezano antitelo 52M51.
 
[0026] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje vezuje ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 i antitelo obuhvata, sadrži, ili uglavnom se sastoji od antitela "52R43" kao što je kodirano sa DNK deponovane kod ATCC pod uslovima Budimpeštanskog Sporazuma od 15 Oktobra, 2008, i dodeljen naznačeni broj PTA-9548. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se sastoji od 52R43 za posebno vezivanje za ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1. Farmaceutske kompozicije koje sadrže 52R43 i postupci lečenja raka koji sadrže primenjivanu terapeutsku efikasnu količinu 52R43 antitela su isto obezbeđene.
 
[0027] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se takmiči sa antitelima kao što je opisano u prethodno navedenim primerima i/ili aspektima, kao i drugim aspektima/primerima opisani negde drugde ovde, za posebno vezivanje za ne-ligandnu vezujuću membranu regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 (npr., u kompetitivnoj vezujućoj analizi). Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela koja su opisana ovde i postupci lečenja raka koji obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine antitela su takođe obezbeđeni.
 
[0028] U nekim slučajevima jednog od gore navedenog aspekta ili primera, kao i drugih aspekata i/ili primera opisanih negde drugde u nastavku teksta, antitelo je rekombinantno antitelo. U nekim slučajevima, antitelo je monoklonalno antitelo, hemijsko antitelo, humanizovano antitelo, ili ljudsko antitelo. U nekim slučajevima, antitelo je fragment antitela. U nekim slučajevima, antitelo ili fragment antitela je monovalentno, monospecifično, bivalentno, bispecifično, ili multispecifično. U nekim slučajevima, antitelo je konjugovano do citotoksičnog ostatka. U nekim slučajevima, antitelo je izolovano. U još nekim primerima, antitelo je suštinski čisto.
 
[0029] Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela opisana ovde i postupci za tretiranje raka koji sadrže primenjivu terapeutsku efikasnu količinu antitela opisanu ovde su takođe obezbeđeni. U nekim lsučajevima, farmaceutske kompozicije dalje sadrže farmaceutski prihvatljivi nosač.
 
[0030] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid. U nekim slučajevima, polipeptid je antitelo (npr., antitelo koje posebno vezuje Notch1), teški lanac ili laki lanac antitela, i/ili fragment antitela. U nekim lsučajevima, polipeptid je izolovan. U nekim slučajevima, polipeptid je suštinski čist. U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, ili SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 24 i/ili amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, ili SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata bar porciju amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 24, i/ili bar porciju amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, ili SEQ ID NO: 32. Farmaceutske kompozicije koje sadrže i polipeptid i farmaceutski prihvatljivi nosač su dalje obezbeđeni, pošto su ćelijske linije te koje proizvode polipeptid.
 
[0031] U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata: (a) polpeptid koji ima bar oko 80% sekvencne identičnosti na SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 24; i/ili (b) polipeptid koji ima bar oko 80% sekventne identičnosti na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid je antitelo (npr., antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1). U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata polipeptid koji ima bar oko 85%, bar oko 90%, bar oko 95%, bar oko 98%, ili oko 100% sekvencne identičnosti na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, polipeptid sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca 52M51 antitela. U nekim slučajevima, polipeptid sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca humanizovanog 52M51 antitela. U nekim slučajevima, polipeptid sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 52R43.
 
[0032] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotidni molekul koji enkodira bilo koja antitela i/ili polipeptide prethodno navedenih aspekata, kao i drugih aspekata/primera kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, ekspresioni vektor obuhvata polinukleotidni molekul. U drugim primerima, ćelija domaćina obuhvata ekspresioni vektor. U nekim slučajevima, ćelija domaćina obuhvata polinukleotidni molekul. U nekim slučajevima, ćelija domaćina je ćelijska linija ili hibridomska ćelijska linija. U nekim slučajevima, hibridomska ćelijska linija proizvodi 52M51 antitelo ili humanizovano 52M51 antitelo.
 
[0033] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak inhibitorne aktivnosti Notch1 u ćeliji, koji obuhvata kontakt ćelije sa efikasnom količinom bilo kojih antitela ili polipeptida opisanih u prethodno navedenim aspektima i primerima, kao i drugih aspekata/primera opisani ovde u nastavku. U nekim slučajevima, ćelija je tumorna ćelija.
 
[0034] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak inhibitornog rasta tumora u subjektu, postupak koji obuhvata primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bilo kojih antitela ili polipeptida opisanih u prethodno navedenim aspektima i primerima, kao i drugim aspektima/primerima opisani ovde u nastavku. U nekim slučajevima, tumor obuhvata matične ćelije raka. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju ciljanje matičnih ćelija raka sa antitelima. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju redukciju frekvencije matičnih ćelija raka u tumoru, redukciju broja matičnih ćelija raka u tumoru, redukciju kancerogenosti tumora, i/ili redukciju kancerogenosti tumora redukcijom broja ili frekvencije matičnih ćelija raka u tumoru. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju inhibitornu aktivnost Notch1 receptora i/ili inhibitorni rast tumora. U nekim slučajevima, tumor je odabran iz grupe koja se sastoji od tumora dojke, kolorektalnog tumora, tumora jetre, bubrežnog tumora, plućnog tumora, tumora pankreasa, tumora jajnika, tumora prostate, tumora glave i vrata.
 
[0035] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke tretiranja raka na subjektu. U nekim slučajevima, postupak obuhvata primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bilo kojih antitela ili polipeptida opisanih u prethodno navedenim aspektima i/ili primerima, kao i u drugim aspektima/primerima opisani ovde u nastavku. U nekim slučajevima, rak koji treba da se leči je rak dojke, kolorektalni rak, rak jetre, rak bubrega, rak pluća, rak pankreasa, gastrointestinalni rak, melanom, rak jajnika, rak prostate, rak debelog creva, rak bešike, glioblastoma, i rak glave i vrata. U nekim lsučajevima svakog prethodno navedenog aspekta ili primera, kao i drugih aspekata i/ili primera opisani ovde u nastavku, postupak tretiranja raka obuhvata inhibiciju rasta tumora.
 
[0036] U dodatnom aspektu, opis obezbeđuje postupak inhibicije rasta tumora u subjektu, postupak obuhvata primenu na subjekta terapeutski efikasne količine antitela koje se posebno vezuje za neligandu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1, pri čemu vezivanje inhibira aktivnost Notch1.
 
[0037] U drugom aspektu, opis obezbeđuje postupak redukcije kancerogenosti tumora koji obuhvataju matične ćelije raka redukcijom frekvencije ili broja matičnih ćelija raka u tumoru, postupak koji obuhvata kontakt tumora sa efikasnom količinom antitela koji inhibiraju aktivnost Notch1.
 
[0038] U nekim slučajevima svakog prethodno navedenog aspekta i/ili primera, kao i drugih aspekata ili primera opisanih ovde, postupci dalje obuhvataju primenu na subjekta bar jednog dodatnog anti-kancerogenog i/ili terapeutskog agensa. U nekim slučajevima svakog prethodno navedenog aspekta i/ili primera, kao i drugih aspekata ili primera opisanih ovde, antitelo ili polipeptid se primenjuje na subjekat u kombinaciji sa dodatnim lečenjem za rak. U nekim slučajevima, dodatno lečenje za rak obuhvata terapiju zračenja, hemoterapije, i/ili dodatnu terapiju antitelom. U nekim slučajevima, hemoterapija obuhvata taksol, irinotekan, gemcitabin i/ili oksaliplatin. U nekim slučajevima, dodatni antitelni terapeutik je antitelo koje posebno vezuje sekundarni humani Notch receptor (npr., Notch2) ili humani Notch receptor ligand (npr., DLL4 ili JAG1). U nekim slučajevima, dodatni antitelni terapeutik je antitelo koje posebno vezuje VEGF. U nekim slučajevima, tretirani subjekt je čovek.
 
[0039] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak tretiranja raka kod ljudi, pri čemu rak koji obuhvata matične ćelije raka nije okarakterisan sa prevelikom ekspresijom od strane matičnih ćelija raka jednog ili više Notch receptora, obuhvata primenu na ljude terapeutski efikasne količine antitela koji se vezuje za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora i blokira ligandnu aktivnost Notch1 receptora
 
[0040] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak tretiranja raka kod ljudi koji obuhvata primenu na ljude terapeutski efikasnih količina (a) prvo antitela koji vezuje Notch1 receptor i inhibira rast metičnih ćelija raka koji prekomerno ekspresuju Notch receptore; i (b) drugo antitela koji vezuje Notch receptor i blokira ligandnu aktivnost Notch receptora.
 
[0041] Pronalazak takođe obezbeđuje drugi postupak lečenja raka, gde je rak odabran iz grupe koja se sastoji od raka dojke, kolona, pankreasa, prostate, pluća, rektuma i debelog creva, koji obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela koji blokira ligandnu aktivnost Notch1 receptora.
 
[0042] Pronalazak dodatno obezbeđuje: humanizovano antitelo koje vezuje Notch1 i blokira ligandnu aktivnost Notch1 receptora; kompoziciju koja obuhvata humanizovano antitelo i farmaceutski prihvatljivi nosač; i imunokonjugat koji obuhvata humanizovano antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom.
 
[0043] Štaviše, pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji enkodira humanizovano antitelo; vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu; ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor; kao i postupak proizvodnje humanizovanog antitela koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu tako da je nukleinska kiselina ekspresovana i, opciono, dalje sadrži oporavljeno humanizovano antitelo iz kulture ćelije domaćina (npr., iz medijuma kulture ćelije domaćina).
 
[0044] Pronalazak se dalje odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo koje vezuje Notch konjugovan za jedan ili više molekula caliheamicina, i na primenu takvih konjugata za tretiranje Notch koji iskazuje rak, npr., rak u kome matične ćelije raka previše ekspresuju Notch.
[0045] Primeri čvrstih tumora koji mogu biti tretirani primenom teraputske kompozicije instantne specifikacije, na primer, antitela koji vezuje membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora obuhvata, ali nisu ograničeni na, sarkome i karcinome kao što su fibrosarkoma, miksosarkoma, liposarkoma, hondrosarkoma, osteogena sarkoma, hordoma, angiosarkoma, endoteliosarkoma, limfangiosarkoma, limfangioendoteliosarkoma, sinovioma, mesotelioma, Ewing-ov tumor, leiomiosarkoma, rabdomiosarkoma, kolonalni karcinom, rak pankreasa, rak dojke, rak jajnika, rak prostate, karcinom kvuamozne ćelije, karcinom bazalne ćelije, adenokarcinom, karcinom znojne žlezde, karcinom lojne žlezde, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinom, cistadenokarcinom, moždani karcinom, bronhogenski karcinom, karcinom bubrežne ćelije, hepatom, karcinom žučnih puteva, horiokarcinom, seminom, embrionalni karcinom, Wilms-ov tumor, rak grlića materice, tumor testisa, karcinom pluća, karcinom malih ćelija pluća, karcinom bešike, epitelialni karcinom, gliom, astrocitoma, meduloblastom, kraniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, akustična neuroma, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, i retinoblastoma.
 
[0046] Gde su aspekti ili primeri pronalaska opisani u terminima Markush grupe ili drugih grupnih alternativa, predmetni pronalazak obuhvata ne samo celu listu koja je u celosti navedena, već takođe svaki član grupe pojedinačno i svih mogućih podgrupa glavne grupe, i takođe odsustvo jednog ili više članova grupa glavne grupe. Predmetni pronalazak takođe jasno pokazuje jedan ili više članova grupe u zahtevanom pronalasku.
 
KRATAK OPIS CRTEŽA
 
[0047]
 
Slika 1: Identifikacija Antitela koji ciljaju Membranu Proksimalnog Regijona Notch koji Inhibira Notch Signal.
(A) Šema Notch receptora i 52M antigenske regije. 52M antigen obuhvata područje Notch1 receptora primenjivan na odvajanje od strane furina tokom mutacije receptora i odvajanje od strane ADAM (Disintegrin i Metaloproteaza) proteaza praćeno vezivanjem liganda. Naknadno procesuiranje od strane gama-sekretaze izaziva otpuštanje intraćelijskog domena (ICD) Notch tako da aktivira gensku transkripciju u nukleusu. (B) Luciferazni nivoi (y-osa) izvedeni iz Notchl-Hela ćelija kultivisani u prisustvu rastvorenog Notch liganda (hDLL4-fc) i Notch1 receptor antitela. Rezultati iz ne-transfektovanih (NT) ćelija sa i bez hDLL4-Fc su prikazani sa krajnje leve strane x-ose. Antitela 52M Notch1 receptora su prikazana duž x-ose i upoređena sa DBZ, Notch gama-sekretaza inhibitorom (GSI), i 21M18, anti-DLL4 antitelom. Antitela Notch1 receptora 52M51, 52M63, 52M74 i 52M80 svi značajno inhibiraju Notch signal kao što je ukazano smanjenjem u aktivnosti luciferaze. (C) Nivoi Luciferaza (y-osa) izvedeni iz Notch1-Hela ćelija kultivisani u prisustvu rastvorljivog Notch liganda (hDLL4-fc) i Notch1 receptor antitela. Rezultati iz ne-transfektovanih (NT) ćelija sa i bez hDLL4-Fc su prikazani sa krajnje leve strane na x-osi. 52M51 murin hibridom izvedenog antitela i humanizovane varijante 52M51-H4/L3 su prikazane duž x-ose pri raznim koncentracijama kao što je ukazano. Oba roditeljska murinska antitela 52M51 i humanizovana varijanta značajno inhibira Notch signal kao što je ukazano smanjenjem aktivnosti luciferaze. (D) Western blot analiza ICD formacije posle ligandno-posredne stimulacije Notch1 koja iskazuje Hela ćelije. Minimalni ICD je proizveden u odsustvu DLL4 liganda (-DLL4), ali formulacija je stimulisana prisustvom DLL4. Antitela 52M51, 52M63, 52M74, i 52M80 smanjuju ICD formiranje na pozadinskim nivoima uprkos prisustvu DLL4.
Slika 2: Antitelo Notch1 Receptora 52M51 Inhibira Formiranje Tumora In vivo.
(A) NOD/SCID miševi ubrizgani sa C8 kolonskim tumornim ćelijama su tretirani sa kontrolnim antitelom (kvadrati) ili anti- Notch1 antitelom 52M51 (trouglovi), i zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani). Tretiranje sa 52M51 antitelima značajno (p=0.0006) inhibira rast tumora u poređenju sa kontrolnim. (B) Individualna zapremina tumora izmerena iz životinja u (A) izmerena na dan 48 i 55 za kontrolni (levo) nasuprot 52M51 (desno) tretiranom mišu. Linija razgraničava prosek svake eksperimentalne grupe. (C) NOD/SCID miš ubrizgan sa PE 13 ćelijama tumora dojke su tretirani sa kontrolnim antitelom (crni kvadrati) ili anti-Notch1 antitelima koji ne inhibiraju Notch signal kao što je prikazano na Slici 1B: 52M1 (crni trouglovi) i 52M2 (sivi krugovi). Zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani). Tretiranje sa 52M1 i 52M2 nije uspelo da deluje na rast tumora kada se poredi sa kontrolno tretiranim životinjama. (D) NOD/SCID miševi ubrizgani sa PE13 ćelijama tumora dojke su tretirani sa kontrolnim antitelom (kvadrati) ili anti-Notch1 antitelom 52M8 (trouglovi) koji ne ihnibiraju Notch signal kao što je prikazano na Slici 1B. Zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani). Tretiranje sa 52M8 nije uspelo da deluje na rast tumora kada se poredi sa kontrolno tretiranim životinjama.
Slika 3: Antitelo Anti-Notch1 Receptora 52R43 Inhibira Rast Tumora In vivo
(A) NOD/SCID miševi ubrizgani sa M2 tumornim ćelijama melanoma su tretirani sa kontrolnim antitelom (kvadrati) ili anti-Notch1 antitelom 52R43 (krugovi), i zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani). (B) NOD/SCID miševi ubrizgani sa Lu24 ćelijama tumora pluća su tretirani sa kontrolnim antitelom (kvadrat) ili anti-Notch1 antitelom 52R43 (krugovi), i zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani). (C) NOD/SCID miševi ubrizgani sa PN8 tumronim ćelijama pankreasa su tretirani sa kontrolnim antitelom (kvadrati) ili anti-Notch1 antitelom 52R43 (krugovi), i zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani). (D) NOD/SCID miševi ubrizgani sa ćelijama T1 tumora dojke su tretirani sa kontrolnim antitelom (kvadrat), anti-Notch1 antitelom 52R43 (zatvoreni krugovi), taksolom (trouglovi) ili 52R43 i taksolom (otvoreni krugovi) i zapremina tumora (y-osa, mm3) je izmerena tokom vremena (x-osa, dani).
 
DETALJAN OPIS PRONALASKA
 
[0048] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove agense, koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, peptide kao što su antitela, koja vezuju jedan ili više humanih Notch receptora. Notch-vezujući agensi obuhvataju antagoniste humanog(ih) Notch receptora. Takođe su obezbeđeni srodni polipeptidi i polinukleotidi, kompozicije koje sadrže Notch-vezujuće agense, i postupke dobijanja Notch-vezujćih agenasa. Postupci primene novih Notch-vezujućih agenasa, kao što su postupci inhibicije rasta tumora i/ili tretiranja raka, su dalje obezbeđeni.
 
[0049] Predmetni pronalazak dalje identifikuje molekule (npr., antitela) koji se posebno vezuju za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora in vivo. Vezujuća ligandna regiona Notch, koja je neophodna i dovoljna za vezivanje liganda, je identifikovana kao EGF ponavljanje 11 i 12, predlagajući ovaj region Notch receptora kao važnu u Notch signaliziranju i kancerogenosti (Rebay et al., 1991, Cell 67:687; Lei et al., 2003, Dev. 130:6411; Hambleton et al., 2004, Structure 12:2173). Neočekivano, antitela koja se vezuju van ligandnog vezujućeg domena vanćelijskog domena humanog Notch receptora su pronađena da inhibiraju rast tumorne ćelije in vivo (videti U.S. Patentu Objavu Br. 2008/0131434). Prema tome, antitela koja vezuju van ligandnog vezujućeg domena vanćelijskog domena jednog ili više humanog Notch receptora - Notch1, Notch2, Notch3, i Notch4 – imaju vrednost kao potencijalni kancerogeni terapeutici.
 
[0050] Monoklonalna antitela koja se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1, koja uključuju monoklonalno antitelo 52M51, sada su identifikovana (Primer 1). Humanizovana 52M51 antitela su takođe generisana (Primer 2). Nekoliko antitela, uključujući 52M51 i humanizovanu varijantu 52M51, inhibiraju ligandno-indukovani Notch1 signal (Primer 3 i Slika 1B i C), uprkos vezivanju za Notch1 u regionu van ligandno vezujućeg regiona. Sposobnost nekoliko antitela da inhibiraju formiranje Notch intraćelijskog domena (ICD) takođe je sada demonstrirana (Primer 3 i Slika 1D). 52M51 je pronađen da inhibira rast tumornskih ćelija in vivo u ksenograft modelu (Primer 5 i Slika 2A i B). Dodatno, drugo antitelo 52R43 je pronađeno da inhibira rast tumorskih ćelija in vivo u višestrukim ksenograft modelima (Primer 7 i Slika 3A-D).
 
Definicija
 
[0051] "Antagonist" Notch receptor kao što je ovde korišćeno je termin koji obuhvata bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira, ili neutralizuje biološku aktivnost Notch puta. Pogodni molekuli antagoniste posebno obuhvataju antagonist antitela ili fragmente antitela. Termin "antagonist" je ovde korišćen kako bi obuhvatio bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira, ili neutralizuje ekspresiju Notch receptora.
 
[0052] Termin "antitelo" ovde je korišćen da označava imunoglobulinski molekul koji prepoznaje i posebno se vezuje za metu, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljenihidrat, polinukleotid, lipid, ili kombinacije prethodno navedenih itd., kroz bar jedno mesto prepoznavanja unutar varijabilnog regiona imunoglobulinskog molekula. Kao što je ovde korišćeno, termin obuhvata netaknuta poliklonalna antitela, netaknuta monoklonalna antitela, fragmente antitela (kao što su Fab, Fab’, F(ab’)2, i Fv fragmenti), mutante pojedinačnog lanca Fv (scFv) mutanata, multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela koja su generisana iz bar dva netaknuta antitela, monovalentna ili monospecifična antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzije proteina koje sadrže antigensku određenu porciju antitela, i bilo koji drugi modifikovani imunoglobulinski molekul koji sadrži antigensko mesto prepoznavanja toliko dugo da antitela pokazuju željenu bilošku aktivnost. Antitelo može biti bilo koji od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, ili njihovih podklasa (izotipovi) (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), zasnovan na identitetu njihovih konstantnih domena teškog lanca naziva alfa, delta, epsilon, gama, i mu, respektivno. Različite klase imunoglobulina imaju različitu i dobro poznatu podjedinicu struktura i trodimenzijalnih konfiguracija. Antitela mogu biti gola ili konjugovana za druge molekule kao što su toksini, radioizotopi, itd.
 
[0053] Kao što je ovde korišćeno, termin "fragment antitela" se odnosi na porciju netaknutog antitela i odnosi se na antigenske utvrđene promenjive regione netaknutih antitela. Primeri fragmenata antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab’, F(ab’)2, i Fv fragmente, linearna antitela, antitela pojedinačnog lanca, i multispecifičnih antitela iz fragmenata antitela.
 
[0054] "Fv antitelo" se odnosi na minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto prepoznavanja antigena i vezivanja ili kao dvostruki lanac, gde jedan varijabilni domen teškog lanca i jedan varijabilni domen lakog lanca obrazuju ne-kovalentni dimer, ili kao pojedinačni lanac (scFv), gde je varijabilni domen jednog teškog lanca i varijabilni domen jednog lakog lanca kovanlentno vezan sa fleksibilnim peptidnim linkerom tako da su dva lanca povezana u sličnoj dimeričnoj strukturi. U ovoj konfiguraciji komplementarni utvrđeni regioni (CDRs) svakog varijabilnog domena međusobno reaguju kako bi definisali antigensku-vezujuću specifičnost Fv dimera. Alternativno, pojedinačni varijabilni domen (ili pola Fv) se može koristiti da se prepoznaje i veže antigen, iako generalno sa nižim afinitetom.
 
[0055] "Monoklonalno antitelo" kao što je ovde korišćeno se odnosi na homogenu antitelnu populaciju koja je uključena u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje pojedinačne antigenske determinante, ili epitopa. Ovo je suprotno poliklonalnim antitelima koji tipično obuhvataju različita antitela koja su upućena protiv različitih antigenskih determinanti. Termin "monoklonalno antitelo" obuhvata oba netaknuta i pune dužine monoklonalna antitela kao i fragmente antitela (npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), mutante pojedinačnog lanca (scFv), spojene proteine koji sadrže porcije antitela, i bilo koji drugi modifikovani imunoglobulinski molekul koji sadrži mesto prepoznavanja antigena. Dalje, "monoklonalno antitelo" se odnosi na takva antitela koja su napravljena na bilo koji način koji obuhvata ali nije ograničen na, hibridom, selekciju fage, rekombinantnu ekspresiju, i transgenske životinje.
 
[0056] Kao što je ovde korišćeno, termin "humanizovano antitelo" se odnosi na ne-humana (npr. murin) antitela koja su posebni imunoglobulinski lanci, himerni imunoglobulini, ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne ne-humane sekvence. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini gde su ostaci iz komplementarnih utvrđenih regiona (CDRs) zamenjeni sa ostacima iz CDR ne-humanih vrsta (npr., miš, pacov, zec, hrčak, itd.) koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost. U nekim slučajevima, Fv ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajućim ostacima u antitelu iz nehumanih vrsta koja imaju željenu specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost. Humanizovano antitelo može dalje biti modifikovano supstitucijom dodatnih ostataka ili u Fv okvirnom regionu i/ili u okviru zamenjenih ne-humanih ostataka kako bi se refinisala i opstimizovala antitelna specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost. Uopšteno, humanizovano antitelo će obuhvatiti značajno sve od bar jednog, i tipično dva ili tri, varijabilna domena koja sadrže sve ili značajno sve, CDR regione koji odgovaraju ne humanom imunoglobulinu gde svi, ili značajno svi, FR regioni su oni humani imunoglobulini konsenzualne sekvence. Humanizovano antitelo može takođe sadržati bar porciju imunoglobulina konstantnog regiona ili domena (Fc), koja je tipično humani imunoglobulin. Primeri postupaka koji su korišćeni da generišu humanizovana antitela su opisana U.S. Pat. 5,225,539.
[0057] "Varijabilni region" antitela se odnosi na varijabilni region antitela lakog lanca ili varijabilni region teškog lanca, ili sam ili u kombinaciji. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca svaki sadrži četiri okvira regiona (FR) povezana sa tri komplementarna utvrđena regiona (CDRs) takođe poznati kao hipervarijabilni regioni. CDRs u svakom lancu su držani zajedno u neposrednoj blizini od strane FRs i, sa CDRs iz drugog lanca, doprinoseći formiranju antigenskog mesta vezivanja antitela. Postoje bar dve tehnike za utvrđivanje CDRs: (1) pristupo zasnovan na unakrsnoj sekvencnoj varijabilnosti (odn., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); i (2) pristup zasnovan na kristalografskoj studiji kompleksa antigen-antitelo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). Dodatno, kombinacije ova dva pristupa su ponekad korišćeni u tehnici za utvrđivanje CDRs.
 
[0058] Termin "humano antitelo" kao što je ovde korišćeno označava proizvodnju antitela od strane ljudi ili antitelo koje ima amino kiselinsku sekvencu koja odgovara proizvodnji antitela od strane ljudi koja predstavlja primenu bilo kojih tehnika koje su poznate u tehnici. Ova definicija humanog antitela obuhvata netaknuta antitela pune dužine, njihove fragmente, i/ili antitela koja sadrže bar jedan humani polipeptid teškog i/ili lakog lanca kao što je, na primer, antitelo koje obuhvata mišiji laki lanac i ljudski teški lanac polipeptida.
 
[0059] Termin "himerna antitela" se odnosi na antitela gde je amino kiselinska sekvenca imunoglobulinskog molekula izvedena iz dve ili više vrsta. Obično, varijabilni region oba lakih i teških lanaca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenom iz jedne vrste sisara (npr., miš, pacov, zec, itd.) sa željenim specifikacijama, afinitetima, i/ili sposobnostima, dok su konstantni regioni homogenovani na sekvencama u antitelima izvedenih iz drugih vrsta (uglavnom ljudi) kako bi se izbeglo izazivanje imunog odgovora u tim vrstama. Termin himerno antitelo obuhvata monovalentna, divalentna i polivalentna antitela.
 
[0060] Termin "epitop" ili "antigenska determinanta" se ovde korist naizmenično i odnosi se na onu porciju antigena koji je sposoban da se prepozna i posebno veže za određeno antitelo. Kada je antigen polipeptid, epitopi mogu biti obrazovani oba iz konjugovanih amino kiselina i nekonjugovanih amino kiselina postavljeni blizu jedne druge od strane tercijalnog savijanja proteina. Epitopi obrazovani iz konjugovanih amino kiselina (takođe se odnose kao linerani epitopi) se obično zadržavaju nakon proteinske denaturacije, pri čemu se epitopi obrazovani tercijalnim savijanjem (takođe se odnose kao konformacijski epitopi) obično gube nakon proteinske denaturacije. Epitop obično obuhvata bar 3, a više, bar 5 ili 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
 
[0061] To da se antitelo "selektivno vezuje" ili "posebno vezuje" za epitop ili receptor znači da antitelo reaguje ili se povezuje češće, brže, sa većim izdržajem, sa večim afinitetom, ili sa nekom kombinacijom prethodno navedenog epitopa ili receptora nego sa alternativnim supstancama, uključujući nesrodne proteine. "Selektivno vezuje" ili "posebno vezuje" označava, na primer, da se antitelo vezuje za protein sa KD od oko 0.1 µM ili manje, ponekad oko 1 µM ili manje, ponekad oko 0.1 µM ili manje i ponekad oko 0.01 µM ili manje. Zbog sekvencnog identiteta između homogenog proteina u različitim vrstama, posebno vezivanje može obuhvatati antitelo koje prepoznaje Notch receptor u više od jedne vrste. Podrazumeva se da, u nekim slučajevima, antitelo ili vezujući ostatak koji se posebno vezuje za prvu metu može ili ne mora posebno vezivati za sekundarnu metu. Kao takav, "posebno vezivanje" ne zahteva (iako može da obuhvata) ekskluzivno vezivanje, odn. vezivanje za pojedinačnu metu. Uopšteno, ali nije neophodno, referenca za vezivanje označava posebno vezivanje.
 
[0062] Nadmetanje između antitela je utvrđeno analizom gde imunoglobulin pod studijom inhibira posebno vezivanje referentnog antitela na uobičajeni antigen. Poznati su višestruki tipovi kompetitivnih vezujućih analiza, na primer: direktna ili indirektna radioimuna analiza čvrste faze (RIA), direktna ili indirektna enzimska imuno analiza čvrste faze (EIA), umetnuta kompetitivna analiza (videti Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); direktna biotin naznačena analiza čvrste faze EIA (videti Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); direktna naznačena analiza čvrste faze, direktno naznačena umetnuta analize čvrste faze (videti Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)); direktno naznačena RIA čvrste faze korišćenjem 125I oznake (videti Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); direktna biotin-avidin EIA čvrsta faza (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); i direktno naznačena RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Obično, takve analize obuhvataju primenu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćeliju koja nosi bilo koju od ovih, naznačeni testirani imunoglobulin i naznačenu referencu imunoglobulina. Kompetitivna inhibicija je izmerena utvrđivanjem količine naznačene veze na čvrstoj površini ili ćelijama u prisustvu testiranog imunoglobulina. Obično je testiran imunoglobulin prisutan u višku. Antitela identifikovana kompetitivnom analizom (antitela koja se nadmeću) obuhvataju antitela koja se vezuju za isti epitop kao referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop dovoljno proksimalan za vezu epitopa referentnim antitelom za prostornu prepreku koja se dešava. Obično, kada je antitelo koje se nadmeće prisutno u višku, onda će inhibirati posebno vezivanje referentnog antitela u odnosu na uobičajeni antigen od bar 50 ili 75%.
 
[0063] Termin "izolovan" ili "prečišćen" se odnosi na materijal koji je bitno ili suštinski slobodan od komponenti koje ga normalno prate u njegovom prorodnom stanju. Čistoća i homogenost su obično određeni primenom analitičkih hemijskih tehnika kao što je poliakrilamidna gel elektroforeza ili visoko izvedena tečna hromatografija. Protein (npr., antitelo) ili nukleinska kiselina, koja predstavlja preovlađujuće vrste prisutne u dobijanju, je značajno prečišćen. Naročito, u nekim slučajevima, izolovana nukleinska kiselina koja sadrži gen je odvojena iz otvorenih okvira koji se čitaju, tako da prirodno slabi gen i kodira proteine osim proteina kodiranog od strane gena. Izolovano antitelo je odvojeno iz drugih ne-imunoglobulinskih proteina i iz drugih imunoglobulinskih proteina sa različitim antigenom koji se posebno vezuje. Može takođe da znači da nukleinska kiselina ili protein je bar 85% čist, bar 95% čist, i u nekim slučajevima, bar 99% čist.
 
[0064] Kao što je ovde korišćeno, termin "rak" i "kancerogeno" odnosi se ili opisuje fiziološko stanje kod sisara gde su populacije ćelija okarakterisane sa neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri raka obuhvataju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju. Određenije, primeri kao što je rak, obuhvataju, ali nisu ograničeni na, skvamozne ćelije raka, rak pluća malih ćelija, rak pluća ne malih ćelija, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatoćelijski rak, gastrointestinalni rak, rak pankreasa, glioblastom, rak grliča materice, rak jajnika, rak jetre, rak bešike, hepatom, rak dojke, kolonalni rak, kolorektalni rak, endometrialni ili uterinski karcinom, karcinom pljuvačnih žlezda, rak bubrega, rak jetre, rak prostate, vulvalni rak, rak tiroidne žlezde, hepatični karcinom i razne vrste raka glave i vrata.
 
[0065] "Tumor" i "neoplazma" kao što je ovde korišćeno se odnosi na bilo koju masu tkiva koja rezultuje iz prevelikog rasta ćelije ili proliferacije, ili benignog (nekancerogenog) ili malignog (kancerogenog) koji obuhvata pre-kancerogene lezije.
 
[0066] Termin "proliferativni poremećaj" i "proliferativno oboljenje" odnosi se na poremećaje povezane sa abnormalnom ćelijskom proliferacijom kao što je rak.
 
[0067] "Metastaza", kao što je ovde kroišćeno, odnosi se na postupak kojim se rak širi ili prebacuje iz mesta porekla na druge regione tela uz razvoj sličnih kanerogenih lezija na novoj lokaciji. "Metastatična" ili "metastazna" ćelija je ona koja gubi adhezioni kontakt sa susednim ćelijama i migrira preko krvotoka ili limfe iz primarnog mesta oboljenja do napadnutih susednih telesnih struktura.
 
[0068] Termini "matična ćelija raka" ili "matična ćelija tumora" ili "matična ćelija čvrstog tumora" se ovde koriste naizmenično i odnose se na populaciju ćelija iz čvrstog tumora tako da: (1) ima proširenu proliferativnu sposobnost; 2) su sposobne na asimetričnu ćelijsku deobu generišući jednu ili više vrsta različitih potomstava sa redukovanom proliferacijom ili razvojnim potencijalom; i (3) su sposobne na simetrijsku ćelijsku deobu za samo obnavljanje ili samo održavanje. Ove osobine "matične ćelije raka" ili "matične ćelije tumora" ili "matične ćelije čvrstog tumora" dodeljuju na ove matične ćelije raka sposobnost da obrazuju opipljive tumore nakon serijskih transplatacija u imunokompromitovanim miševima u poređenju sa većinom tumorskih ćelija koji ne formiraju tumore. Matične ćelije raka podvrgavaju se samo obnavljanju nasuprot diferencijaciji na haotičan način tako da obrazuju tumore sa abnormalnim ćelijskim tipovima koji mogu da se menjaju tokom vremena kada se mutacija odigrava.
 
[0069] Termin "ćelije raka" ili "ćelije tumora" se odnosi na ukupnu populaciju ćelija izvedenih iz tumora koji obuhvataju obe ne-tumorne ćelije, koje obuhvataju obimnu populaciju tumornih ćelija, i tumorne matične ćelije (matične ćelije raka).
 
[0070] Kao što je ovde korišćeno "kancerogeno" se odnosi na funkcionalne osobine matične ćelije čvrstog tumora koji obuhvata osobine samo obnavljanja (podstičući dodatno kancerogenost matičnih ćelija raka) i proliferacije da generišu sve druge ćelije tumora (podstičući diferencijaciju i prema tome ne-kancerogene tumorne ćelije) koje dozvoljavaju da matične ćelije čvrstog tumora obrazuju tumor.
 
[0071] Kao što je ovde korišćeno, "kancerogenost" tumora se odnosi na sposobnost slučajnog uzorkovanja ćelija iz tumora da obrazuju opipljive tumore nakon serije transplatacije u imunokompromitovanim miševima.
 
[0072] Kao što je ovde korišćeno, termini "markeri matičnih ćelija raka" ili"markeri raka matičnih ćelija" ili "markeri matičnih ćelija tumora" ili "markeri matičnih ćelija čvrstog tumora" se odnose na gen ili gene ili protein, polipeptid, ili peptid iskazan genom ili genima čiji nivo iskazivanja, sam ili u kombinaciji sa drugim genima, je u uzajamnoj vezi sa prisutnim kancerogenim ćelijama raka kada se poredi sa ne-kancerogenim ćelijama. Korelacija se može odnositi na ili povećanje ili smanjenje iskazivanja gena (npr., povećani ili smanjeni nivoi mRNA ili peptid kodiran od strane gena).
 
[0073] Termini "oznaka gena matične ćelije raka" ili "oznaka gena matične ćelije tumora" ili "oznaka matične ćelije raka" su ovde korišćeni naizmenično tako da se odnose na oznake gena koje sadrže gene različito iskazane u matičnim ćelijama raka u poređenju sa drugim ćelijama ili populacijama ćelija, na primer normalno epitelno tkivo dojke. U nekim slučajevima, oznake gena matične ćelije raka obuhvataju gene koji su različito iskazani u matičnim ćelijama raka nasuprot normalnog epitela dojke od strane količine promene, na primer od strane 2 količine smanjene i/ili povišene ekspresije, i dalje ograničen primenom statističke analize kao što je, na primer, P vrednost t-testa duž višestrukih uzoraka. U drugom rešenju, drugačije iskazani geni u matičnim ćelijama raka su podeljeni u oznake gena matične ćelije raka zasnovane na uzajamnoj vezi njihovih ekspresija sa izabranim genom u kombinaciji sa njihovim preklopima ili procentom iskazane promene. Oznake matičnih ćelija su predvidljive i retrospektivno i prospektivno sa aspekta kliničke promenjljivosti, uključujući, ali nije ograničen na, metastazu i smrt.
 
[0074] Termin "genetički test" kao što je ovde korišćeno se odnosi na postupke pri čemu je genetička promena pacijenta ili uzorka tumora kod pacijenta analizirana. Analiza može obuhvatati detekciju DNK, RNK, hromozoma, proteina ili metabolita da detektuju nasledne ili somatske genotipe ili karotipe povezane sa oboljenjem za kliničke svrhe.
 
[0075] Kao što je ovde korišćeno, termini "biopsi" ili "biopsi tkivo" se odnose na uzorak tkiva ili tečnosti koja je uklonjen iz subjekta za svrhe određivanja da li uzorak sadrži kancerogeno tkivo. U nekim slučajevima, biopsi tkivo ili tečnost je dobijeno zbog toga što se sumnja da subjekat ima rak. Biopsi tkivo ili tečnost je potom ispitano na prisustvo ili odsustvo raka.
 
[0076] Kao što je korišćeno ovde, termin "subjekat" se odnosi na bilo koju životinju (npr., sisar), koji obuhvata, ali nije ograničen na ljude, ne-humane primate, glodare, i slično, koji predstavljaju primaoce određene terapije. Obično, termini "subjekat" i "pacijent" su korišćeni naizmenično ovde kao referenca za ljudske subjekte.
 
[0077] "Farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na dozvoljene ili dozvoljavajuće od strane regulacione agencije Federalne ili državne uprave ili su navedene u U.S. Farmakopeji ili drugoj opštoj priznatoj farmakopeji za primenu na životinje, uključujući ljude.
 
[0078] "Farmaceutski prihvatljivi ekscipijent, nosač ili adjuvans" ili "prihvatljivi farmaceutski nosač" se odnosi na ekscipijent, nosač ili adjuvans koji mogu biti primenjivani na subjekat, zajedno sa bar jednim antitelom predmetnog pronalaska, i koji neuništava njihovu farmakološku aktivnost i nije toksičan kada se primenjuje u dozama dovoljnim da se dostavi terapeutska količina antitela. Dodatno, "farmaceutski prihvatljivi nosač" ne aktivira imuni odgovor u prijemnom subjektu. Primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, bilo koje standardne farmaceutske nosače kao što je fosfatni pufer slanog rastvora, voda, i razne uljne/vodene emulzije. Neki razređivači aerosola ili parenteralne primene su fosfatni puferni slani rastvor ili normalni slani rastvor (0.9%).
 
[0079] "Farmaceutski prihvatljivi nosač" se odnosi na razblaživače, adjuvanse, ekscipijense, ili nosače gde je bar jedno antitelo predmetnog pronalaska primenjivano.
 
[0080] Termin "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" ili "terapeutski efikasna" se odnosi na količinu antitela, polipeptida, polinukleotida, malog organskog molekula, ili drugi lek efikasan da "leči" oboljenje ili poremećaj kod subjekta ili sisara. U slučaju raka, terapeutski efikasna količina leka ima terapeutski efekat i kao takav može smanjiti broj ćelija raka; smanjiti kancerogenost, učestalost kancera ili kapacitet kancera; smanjiti broj ili učestalost matičnih ćelija raka; smanjiti veličinu tumora; inhibirati ili zaustaviti infiltraciju ćelije raka u periferne organe koji obuhvataju, na primer, širenje raka u meko tkivo i kosti; inhibira i zaustavlja metastazu tumora; inhibira i zaustavlja rast tumora; otkriva neki obim jednog ili više simptoma povezani sa rakom; smanjuje morbiditet i mortaliter; poboljšava kvalitet života; ili kombinaciju takvih efekata. U meri agensa, primer antitela, sprečava rast i/ili ubija postojeće ćelije raka, može da se odnosi kao citostatički i/ili citotoksični.
 
[0081] Termini kao što su "lečenje" ili "terapija" ili "da leči" ili "ublažava" ili "da ublažava" se odnose i na 1) terapeutska merenja koja leče, usporavaju, smanjuju simptome, i/ili zaustavljaju napredovanje dijagnostikovanog patološkog stanja ili poremećaja i 2) profilaktička ili preventivna merenja koja sprečavaju ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Tako onima kojima je potrebno lečenje obuhvata ona koja su već sa poremećajem; onih koji su skloni da imaju poremećaj; i onih kojima će poremećaj biti sprečen. Subjekat je uspešno "lečen" prema postupcima predmetnog pronalaska ako pacijent pokazuje jedan ili više navedenog: smanjenje broja ili potpuno odsustvo ćelija raka; smanjenje u veličini tumora; inhibicija ili odsustvo infiltracije ćelije raka u periferne organe koji obuhvataju širenje raka u meko tkivo ili kosti; inhibicija ili odsustvo metastaze tumora; inhibicija ili odsustvo rasta tumora; ublažavanje jednog ili više simptoma koji su povezani sa određenim rakom; smanjenje morbiditeta i mortaliteta; poboljšanje kvaliteta života; smanjenje kancerogenosti; smanjenje u broju ili učestalosti matičnih ćelija raka; ili neke kombinacije efikasnosti.
 
[0082] Kao što je ovde korišćeno, termini "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" se odnose na polimer sastavljen od mnoštvo nukleotidnih jedinica (ribonukleotid ili deoksiribonukleotid ili srodne strukturne varijante) povezane preko fosfodiestarskih veza, uključujući ali nije ograničen na, DNK ili RNK. Termin obuhvata sekvence koje obuhvataju bilo koje poznate osnovne analoge DNK i RNK.
 
[0083] Termin "gen" se odnosi na nukleinsku kiselinsku (npr., DNK) sekvencu koja obuhvata kodiranje sekvenci neophodne za proizvodnju polipeptida, prekursora, ili RNK (npr., rRNK, tRNK). Polipeptid može biti kodiran sa punom dužinom kodirajuće sekvence ili sa bilo kojim delom kodirajuće sekvence toliko dugo do god željene aktivnosti ili funkcionalne osobine (npr., enzimska aktivnost, vezivanje liganda, signalna transdukcija, imunogeničnost, itd.) polipetida pune dužine ili fragmenta su zadržane. Termin takođe obuhvata kodirajuću regiona strukturnog gena i sekvence locirane u susedstvu kodirajućeg regiona na oba 5’ i 3’ kraja na razdaljini od 1 kb ili više na oba kraja tako da gen odgovara dužini mRNK pune dužine. Termin "gen" odgovara i cDNK i genomskim oblicima gena.
 
[0084] Termin "rekombinantan" kada se koristi sa referentnom ćelijom, nukleinskom kiselinom, proteinom ili vektorom pokazuje da je ćelija nukleinska kiselina, protein ili vektor modifikovan ubacivanjem heterogene nukleinske kiseline ili proteina, promena nativne nukleinske kiseline ili proteina, ili da je ćelija izvedena iz ćelije tako da modifikuje. Prema tome, npr., rekombinantni ćelijski ekspresioni geni koji nisu pronađeni unutar prirodnog (ne-rekombinantnog) oblika ćelije ili ekspresionih nativnih gena koji su previše iskazani ili drugačije iskazane abnormalnosti kao što je, na primer, izražen kao ne-prirodni prikazani fragmenti ili podeljene varijante. Pod terminom "rekombinantna nukleinska kiselina" ovde se podrazumeva nukleinska kiselina, originalno obrazovana in vitro, uopšteno, manipulacijom nukleinske kiseline, npr., primenom polimeraze i endonukleaze, u obliku koji nije uobičajeno pronađen u prirodi. Na ovaj način, postignuto je operativno vezivanje različitih sekvenci. Stoga izolovana nukleinska kiselina, u linearnom obliku, ili ekspresioni vektor obrazovan in vitro sa vezujućim DNK molekulima koji nisu normalno povezani, se smatraju rekombinantnim za svrhu ovog pronalaska. Shvaćeno je da je jednom rekombinovana nukleinska kiselina napravljena i ubačena u ćeliju domaćina ili organizam, repliciraće ne-rekombinantno, odn., primenom in vivo ćelijske mašinerije ćelije domaćina radije nego in vitro manipulacija; međutim, takve nukleinske kiseline, jednom proizvedene rekombinantno, iako zatim zamenjen ne-rekombinantno, se još uvek smatraju rekombinantno za svrhu pronalaska. Slično, "rekombinantni protein" je protein napravljen primenom rekombinantnih tehnika, odn. kroz ekspresiju rekombinantne nukleinske kiseline kao što je prikazano ovde.
 
[0085] Kao što je odve korišćeno, termin "vektor" je korišćen kao referenca za molekule nukleinske kiseline koja prenosi DNK segment(e) iz jedne ćelije u drugu. Vektori su često izvedeni iz plazmida, bakterofaga, ili biljnih ili životinjskih virusa.
[0086] Kao što je ovde korišćeno, termin "genska ekspresija" se odnosi na postupak konvertujuće genetske informacije koja kodira u genu u RNK (npr., mRNK, rRNK, tRNK, ili snRNA) kroz "transkripciju" gena (npr., preko enzimske aktivacije RNK polimeraze), i za protein kodirajuće gene, u protein putem "translacije" mRNK. Ekspresija gena može biti regulisana u mnogim fazama u postupku. "Gornja regulacije" ili "aktivacije" se odnosi na regulaciju koja povećava proizvodnju proizvoda genske ekspresije (npr., RNK ili protein), dok "donja regulacija" ili "suzbijanje" se odnosi na regulaciju koja smanjuje proizvodnju. Molekuli (npr., transkripcioni faktori) koji su uključeni u gornju regulaciju ili donju regulaciju se često nazivaju "aktivatori" i "suzbijači", respektivno.
 
[0087] Termini "polipeptid" ili "peptid" ili "protein" ili "fragment proteina" su korišćeni naizmenično ovde tako da se odnosi na polimer amino kiselinskog ostatka. Termini se primenjuju na amino kiselinske polimere gde je jedan ili više amino kiselinskih ostataka veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne prikazane amino kiseline, kao i prirodnih prikazanih amino kiselinskih polimera i ne-prirodnih prikazanih amino kiselinskih polimera.
 
[0088] Termin "amino kiselina" se odnosi na prirodno prikazane sintetičke amino kiseline, kao i amino kiselinske analoge i amino kiselinske mimetike koji funkcionišu slično prirodno prikazanim amino kiselinama. Prirodno prikazane amino kiseline su one koje kodiraju genetički kod, kao i one amino kiseline koje su kasnije modifikovane, npr., hidroksiprolin, gamakarboksiglutamat, i O-fosfozerin. "Amino kiselinski analozi" se odnose na jedinjenja koja imaju istu baznu hemijsku strukturu kao prirodno prikazane amino kiseline, npr., alfa karbon koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, i R grupu, npr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi mogu imati modifikovane R grupe (npr. norleucin) ili modifikovane peptidne bočne veze, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodno prikazana amino kiselina. "Amino kiselinski mimetici" se odnose na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja se razlikuje od opšte hemisjke strukture amino kiseline, ali koje deluju slično prirodno prikazanim amino kiselinom.
 
[0089] "Konzervativne modifikovane varijante" se primenjuju i na sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline. "Amino kiselinske varijante" se odnose na sekvence amino kiseline. U pogledu na posebne sekvence amino kiseline, konzervativne modifikovane varijante se odnose na one amino kiseline koje ne kodiraju sekvencu amino kiseline, do bitnih ili povezanih (npr., prirodno graničnih) sekvenci. Zbog degeneracije genetičkog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira većinu proteina. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju amino kiselinu alanin. Prema tome, na svakoj poziciji gde je alanin određen sa kodonom, kodon može biti izmenjen u druge odgovarajuće kodone opisane bez promene kodiranog polipeptida. Takve varijante amino kiseline su "tihe varijante", koje predstavljaju jednu vrstu konzervativnih modifikovanih varijanti. Svaka sekvenca amino kiseline ovde koja kodira polipeptid takođe opisuje tihe varijante nukleinske kiseline. Prepoznatljivo je da u izvesnim kontekstima svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji predstavlja uobičajeni jedini kodon za metionin, i TGG, koji predstavlja obično jedini kodon za triptofan) može biti modifikovan kako bi dao funkcionalni identični molekul. Prema tome, tihe varijante nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid je impliciran u opisanu sekvencu u odnosu na ekspresioni proizvod, ali ne u odnosu na aktualne ispitivane sekvence.
 
[0090] Što se tiče amino kiselinskih sekvenci, biće prepoznatljivo da pojedinačne supstitucije, brisanja ili dodavanje na sekvencu nukleinske kiseline, peptida, polipeptida, ili proteina koja preinači, dodaje ili briše pojedinačnu amino kiselinu ili mali procenat amino kiselina u kodiranoj sekvenci je "konzervativna modifikovana varijanta" koja obuhvata gde se promena dešava u supstituciji amino kiseline sa hemijski sličnom amino kiselinom. Konzervativne supstitucijone tabele koje obezbeđuju funkcionalno slične amino kiseline su dobro poznate u tehnici. (Videti, na primer, Tabelu 1). Vodič koji se odnosi koja će amino kiselinska promena verovatno biti fenotipično tiha se takođe može pronaći u Bowie et al., 1990, Science 247:1306 1310. Takve konzervativno modifikovane varijante su pored i ne isključuju polimorfne varijante, intervrsne homologe, i alela pronalaska. Obično, konzervativne supstitucije obuhvataju: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Aspartinsku kiselinu (D), Glutaminsku kiselinu (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) Cistein (C), Metionin (M) (videti, npr., Creighton, Proteins (1984)). Kao što je ukazano, promene su obično neznatne prirode, kao što su supstitucije konzervativne amino kiseline koje značajno ne utiču na savijanje ili aktivaciju proteina.
 
Tabela 1. Konzervativne Amino Kiselinske Supstitucije
Original Amino Kiseline
Primeri Konzervativnih Supstitucija
Alanin
Valin, Isoleucin, Leucin, Glicin, Serin
Arginin
Lizin, Histidin, Glutamin, Asparagin
Asparagin
Glutamin, Histidin, Lizin, Arginin
Aspartinska Kiselina
Glutaminska Kiselina, Asparagin
Cistein
Serin, Alanine, Metionin
Glutamin
Asparagin
Glutaminska Kiselina
Aspartinska Kiselina, Glutamin
Glicin
Prolin, Alanin
Histidin
Asparagin, Glutamin, Lizin, Arginin
Izoleucin
Leucin, Valin, Metionin, Alanin, Fenilalanin, Norleucin
Leucin
Norleucin, Izoleucin, Valin, Metionin, Alanin, Fenilalanin
Lizin
Arginin, Glutamin, Asparagin, Histidin
Metionin
Leucin, Fenilalanin, Izoleucin, Valin, Cistein
Fenilalanin
Leucin, Valin, Izoleucin, Alanin, Tirozin
Prolin
Alanin, Glicin
Serin
Treonin
Treonin
Serin
Tritofan
Tirozin, Fenilalanin
Tirozin
Triptofan, Fenilalanin, Treonin, Serin
Valin
Izoleucin, Metionin, Leucin, Fenilalanin, Alanin, Norleucin
 
[0091] Kao što je korišćeno u predmetnom pronalasku i zahtevima, pojedinačni oblici obuhvataju množinu oblika ukoliko kontekst jasno upučuje na drugačije.
 
[0092] Shvaćeno je da kad god su primeri opisani ovde sa jezikom "koji sadrži" inače analogno primerima opisani terminima "koji se sastoji" i/ili "koji se sastoji bitno od" su takođe obezbeđeni.
 
Izvesni Primeri Predmetnog Pronalaska
 
[0093] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije i postupke za analizu, dijagnozu, karakterizaciju, i lečenje raka. Naročito, u nekim slučajevima, predmetni pronalazak obezbeđuje agense, uključujući antagoniste, koji vezuju Notch receptore i postupke primene agenasa ili antagonista da inhibiraju rast tumora i leče rak ili druga oboljenja kod ljudskih pacijenata. U nekim slučajevima, antagonisti su antitela koja se posebno vezuju za ne-ligandni vezujući region vanćelijskog domena humanog Notch receptora.
 
[0094] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. U nekim slučajevima, antitelo vezuje region humanog Notch1 koji obuhvata oko 1427 amino kiselina do oko 1732 amino kiselina. U nekim slučajevima, antitelo se vezuje za region koji sadrži SEQ ID NO: 2. U nekim slučajevima, antitelo koje se posebno vezuje za neligandni veujući membranu proksimalnog region vanćelijskog domena bar jednog dodatnog Notch receptora.
 
[0095] U nekim slučajevima, antitelo je antagonist humanog Notch1. U nekim slučajevima, antitelo inhibira ligandno indukovanu signalnu Notch1 putanju. U nekim slučajevima, antitelo inhibira aktivnost Notch1. U drugim primerima, antitelo inhibira odvajanje Notch1 receptora. U nekim slučajevima, antitelo inhibira odvajanje Notch1 na mestu unutar membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena. U nekim slučajevima, antitelo inhibira otpuštanje ili obrazovanje intraćelijskog domena (ICD) Notch1. U nekim slučajevima, antitelo redukuje kancerogenost tumora koji obuhvata matične ćelije raka. U nekim slučajevima, antitelo inhibira rast tumora koji sadrži matične ćelije raka. U nekim slučajevima, antitelo inhibira rast tumora.
 
[0096] U nekim slučajevima, antitelo koje se posebno vezuje za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora je monoklonalno antitelo. U nekim slučajevima, antitelo koje se posebno vezuje za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je himerno antitelo, je humanizovano antitelo, je humano antitelo, je fragment antiteloa, ili je bispecifično antitelo. U nekim slučajevima, predmetni pronalazak obezbeđuje hibridom koji proizvodi antitelo koje se posebno vezuje za neligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora.
 
[0097] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak inhibicije rasta tumora u subjektu, postupak koji obuhvata primenu na subjekta terapeutski efikasne količine antitela koje se posebno vezuje za neligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptor proteina. U nekim slučajevima, tumor obuhvata matične ćelije raka. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju ciljanje matičnih ćelija raka sa antitelima. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata primenu terapeutski efikasne količine monoklonalnog antitela. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata primenu terapeutski efikasne količine himernog antitela. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata primenu terapeutski efikasne količine humanizovanog antitela. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata primenu terapeutski efikasne količine humanog antitela.
 
[0098] U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata redukciju matičnih ćelija raka u tumoru, redukciju broja matičnih ćelija raka u tumoru, redukciju kancerogenosti tumora, i/ili redukciju kancerogenosti tumora smanjenjem broja ili frekvencije matičnih ćelija raka u tumoru. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata inhibiciju aktivnosti Notch1 receptora. U nekim slučajevima, tumor uključuje, ali nije ograničen na, tumor dojke, kolorektalni tumor, tumor bubrega, tumor pluća, tumor jetre, tumor pankreasa, tumor jajnika, tumor prostate i tumor glave i vrata.
 
[0099] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja raka kod subjekta kome je potrebno koji obuhvata primenu na subjekta terapeutski efikasne količine antitela koji se posebno vezuje za neligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog tumora humanog Notch1 receptor proteina i inhibira rast tumora kod subjekta. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine monoklonalnog antitela. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine himernog antitela. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine humanizovanog antitela. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine humanog antitela.
 
[0100] U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela konjugovan za citotoksični ostatak koji se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela bilo kojih aspekata i/ili primera, kao i drugih aspekata i/ili primera koji su ovde opisani, u kombinaciji sa terapijom zračenja. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela bilo kojih aspekata i/ili primera, kao i drugih aspekata i/ili primera koji su ovde opisani, u kombinaciji sa hemoterapijom. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela koji se posebno vezuje za ne-ligandnu membranu proksimalnog region vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora koji osim tumora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, tumor dojke, kolorektalni tumor, tumor pluća, tumor pankreasa, tumor prostate, ili tumor glave i vrata.
 
[0101] U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata identifikaciju pacijenta kome je potrebno lečenje primenom genetičkog testa koji sadrži antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog region vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora; i primenu terapeutski efikasne količine antitela na pacijente. U nekim slučajevima, postupak lečenja raka obuhvata identifikaciju pacijenta kome je potrebno lečenje sa antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora primenom genetičkog testa koji detektuje znake matične ćelije raka, i primenu teraputski efikasne količine antitela koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora.
 
[0102] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak identifikacije molekula koji se vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog region vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora, postupak obuhvata: i) inkubiranje molekula sa ne-ligandnom vezujućom membranom proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora; ii) utvrđivanje da li se molekul vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora; i iii) utvrđivanje da li molekul inhibira rast tumora. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje postupak identifikovanja molekula koji se vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora, postupak obuhvata: i) inkubaciju molekula sa ne-ligandnom vezujućom membranom proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora koji sadrži SEQ ID NO: 2; ii) utvrđivanje da se molekul vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora koji sadrži SEQ ID NO: 2; i iii) utvrđivanje da li molekul inhibira rast tumora.
 
[0103] U nekim slučajevima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora.
 
[0104] U nekim lsučajevima, predmetini pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja antitela koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora.
 
[0105] U nekim slučajevima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora.
 
[0106] U nekim slučajevima, antagonisti protiv Notch receptora, kao što je Notch1, deluju vanćelijski tako da deluju nakon ili inhibira funkciju Notch receptora. U nekim slučajevima, antagonist Notch receptora je proteinski. U nekim slučajevima, proteinski antagonisti Notch1 receptora su antitela koja se posebno vezuju za vanćelijski epitop Notch1 receptora. Vanćelijsko vezivanje antagoniste protiv Notch1 receptora može inhibirati signal Notch receptora inhibiranjem suštinske aktivnosti (npr. kinaza aktivnosti) Notch1 receptora i/ili sternim inhibiranjem interakcije, na primer, Notch receptora sa jednim od njegovih liganada. Dalje, vanćelijsko vezivanje antagoniste za Notch receptor može regulisati ekspresiju ćelijske površine Notch receptora kao što je, na primer, internalizacija Notch receptora i/ili smanjenje prenosa ćelijske površine Notch receptora. Vanćelijsko vezivanje antagoniste za Notch receptor može inhibirati odvajanje Notch receptora i smanjiti otpuštanje ICD Notch.
 
[0107] U nekim slučajevima, antagonisti protiv Notch receptora vezuju se za Notch receptor i imaju jedan ili više sledećih efekata: inhibiciona proliferacija ćelija tumora, aktiviranje smrti ćelije u ćelijama tumora, ili sprečavanje metastaze tumornih ćelija. U nekim slučajevima, antagonisti Notch receptora aktiviraju smrt ćelije preko konjugovanog toksina, hemoterapeutskog agansa, radioizotopa, ili drugog takvog agensa. Na primer, antitelo protiv Notch receptora je konjugovano za toksin koji je aktiviran u tumornim ćelijama iskazanog Notch receptora proteinskom internalizacijom. U drugim primerima, antagonisti Notch receptora posreduju ćelijskoj smrti ćelije koja izražava Notch receptor preko antitelne zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC). ADCC uključuje ćeliju lizina sa efektornim ćelijama koje prepoznaju de Fc antitela. Mnogi limfociti, monociti, tkiva makrofage, granulociti i eozinofili, na primer, imaju Fc receptore i mogu posredovati citolizom (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497). U nekim slučajevima, antagonist Notch receptora predstavlja antitelo koje aktivira ćalijsku smrt ćelije koju iskazuje Notch receptor aktiviranjem komplemento-zavisne citotoksičnosti (CDC). CDC obuhvata vezivanje serumske dopune na deo Fc antitela i potom aktivacije dopunjenog proteina kaskada, rezultujući u oštećenju ćelijske membrane i eventualno ćelijske smrti. Biloška aktivnost antitela je poznata za određivanje, u velikoj meri, konstantnog domena ili Fc regiona molekula antitela (Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2. Izdanje, Williams & Wilkins, str. 218 (1984)). Antitela različitih klasa i podklasa se razlikuju u tom smislu, što su antitela iste podklase ali iz različitih vrsta. Od humanih antitela, IgM je najefikasnija klasa antitela koja vezuje dopunu, praćen sa IgG1, IgG3, i IgG2, gde IgG4 izgleda savaim drugačije u aktivaciji dopunjene kaskade (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). Prema predmetnom pronalasku, dobijena su antitela ovih klasa koja imaju željenu bilošku aktivnost.
 
[0108] Sposobnost bilo kog posebnog antitela protiv Notch receptora da posreduju lizin ciljane ćelije komplementarnom aktivnošću i/ili ADCC može biti testirana. Ćelije od interesa su porasle i označene in vitro; antitelo je dodato ćelijskoj kulturi u kombinaciji sa ili dopunjenim serumom ili imunim ćelijama koje mogu biti aktivirane antigenom antitelnih kompleksa. Citoliza ciljanih ćelija je detektovana, na primer, otpuštanjem oznake iz liziranih ćelija. U stvari, antitela mogu biti skenirana primenom pacijentovog vlastitog seruma kao izvor dopunjenih i/ili imunih ćelija. Antitelo koje je sposobno aktiviranju dopunjenog ili posrednog ADCC u in vitro testu mogu potom biti korišćene teraputski kod tačno određenog pacijenta.
 
[0109] U nekim slučajevima, Notch-vezujući agens ili antagonist je antitelo koje nema jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo nema antitelno-zavisnu ćelijsku citotoksičnu (ADCC) aktivnost, i/ili nema dopunjeno-zavisnu citotoksičnu (CDC) aktivnost. U nekim slučajevima, antitelo se ne vezuje za Fc receptor i/ili dopunjene faktore. U nekim slučajevima, antitelo nema efektornu funkciju.
 
[0110] U drugim primerima, antagonisti Notch receptora mogu aktivirati ćelijsku smrt indirektno inhibicijom angiogeneze. Angiogeneza predstavlja postupak gde se obrazuju novi krvni sudovi iz već postojećih sudova i predstavlja fundamentalni postupak potreban za normalni rast, na primer, tokom razvoja embriona, zarastanja rana i kao odgovor na ovulaciju. Rast čvrstog tumora više od 1-2 mm2 takođe zahteva angiogenezu za snabdevanje hranjivim materijama i kiseonikom bez čega ćelije tumora umiru. Stoga, u nekim slučajevima, antagonist Notch receptora cilja vaskularne ćelije koje iskazuju Notch receptor koje obuhvataju, na primer, endotelijalne ćelije, ćelije glatkih mišića ili komponente vanćelijskog matriksa potreban za vaskularno sastavljanje. U drugim primerima, antagonist Notch receptora inhibira signal faktora rasta potreban za angažovanje, spajanje, održavanje ili preživljavanje vaskularne ćelije.
 
[0111] Predmetni pronalazak obezbeđuje razne polipeptide, koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, antitela i fragmente antitela. U nekim slučajevima, polipeptid je izolovan. U nekim alternativnim slučajevima, polipeptid je značajno čist.
 
[0112] U nekim slučajevima, polipeptidi predmetnog pronalaska mogu biti rekombinantni polipeptidi, prirodni polipeptidi, ili sintetički polipeptidi koji sadrže sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, ili SEQ ID NO: 32 (sa ili bez naznačenih signalnih sekvenci).
 
[0113] Pronalazak obezbeđuje polipeptid koji obuhvata teški lanac i/ili laki lanac predviđen u SEQ ID NO: 10 i/ili SEQ ID NO: 4, respektivno (sa ili bez naznačivanja pretpostavljenih signalnih sekvenci). U nekim slučajevima, polipeptid je antitelo. U nekim slučajevima, polipeptid posebno vezuje ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora.
 
[0114] Pronalazak dalje obezbeđuje polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 32, i/ili SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 24. U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 8 i sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 14. U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 28 i sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 24. U nekim slučajevima, polipeptid obuhvata sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 32 i sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO:24. U nekim slučajevima, polipeptid je antitelo. U nekim slučajevima, polipeptid posebno vezuje ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora.
 
[0115] U tehnici će se prepoznati da neke amino kiselinske sekvence pronalaska mogu varirati bez značajnog efekta strukture ili funkcije proteina. Ako se razmatraju takve razlike u sekvenci, treba da se zapamti da će biti izvesnih područja na proteinu koje utvrđuju aktivnost. Prema tome, pronalazak dalje obuhvata varijante polipeptida koji pokazuju značajnu aktivnost. Takvi mutanti obuhvataju brisajuće, ubacivajuće, ponavljajuće, i tipske supstitucije. Može se pronaći vodič koji se odnosi na to koja amino kiselinska promena će biti fenotipski neprimetna u Bowie, J.U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 1990, 247:1306-1310.
 
[0116] Prema tome, fragmenti, derivati, ili analozi polipeptida pronalaska mogu biti: (i) oni gde je jedan ili više amino kiselinskih ostatak supstituisano sa očuvanim ili ne-očuvanim amino kiselinskim ostatkom (češće očuvanim amino kiselinskim ostatkom) i tako supstituisani amino kiselinski ostatak može ili ne može biti kodiran od strane genetičkog koda; ili (ii) oni gde jedna ili više amino kiselinskih ostataka obuhvataju supstitucionu grupu; ili (iii) oni gde je zreli polipeptid spojen za drugo jedinjenje, kao što je jedinjenje koje će povećati polu vek polipeptida (na primer, polietilen glikol); ili (iv) oni gde su dodatne amino kiseline spojene za zreli polipeptid, kao što je vodeća ili sekreciona sekvenca ili sekvenca koja je angažovana za prečišćavanje zrelog polipeptida ili proproteinske sekvence. Takvi fragmenti, derivati, i analozi su u okviru obima objašnjenja koje je navedeno ovde.
 
[0117] Od posebnog značaja su supstitucije naelektrisanih amino kiselina sa drugim naelektrisanim amino kiselinama i sa neutralnim ili negativno naelektrisanim amino kiselinama. Ovo poslednje se dobija u proteinima sa smanjenim pozitivnim naelektrisanjem. Sprečavanje agregacije je jako poželjno. Agregacija proteina ne samo da rezultuje u gubutku aktivnosti, već takođe može biti problematično kada se dobijaju farmaceutske formulacije, zbog toga što mogu biti imunogenske. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 1967, 2:331-340; Robbins et al., Diabetes 1987, 36:838-845; Cleland et al. Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10:307-377).
 
[0118] Naravno, broj načinjenih amino kiselinskih supstitucija zavisi od više faktora, uključujući i one koji su opisani ovde. U nekim slučajevima, broj supstitucija za bilo koji dat polipeptid neće biti viši od 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 ili 3.
 
[0119] Polipeptidi predmetnog pronalaska obuhvataju polipeptide SEQ ID NO: 14, kao i polipeptide koji imaju bar 90% sličnosti (u izvesnom vremenu bar 90% identičnosti sekvence) sa polipeptidima SEQ ID NO: 14 i bar 95% sličnosti (u izvesnom vremenu bar 95% identičnosti sekvence) sa polipeptidima SEQ ID NOs: 14, i u još drugim primerima, polipeptid koji ima bar 96%, 97%, 98%, ili 99% sličnosti (u izvesnom vremenu 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence) sa polipeptidima SEQ ID NOs: 14. Polipeptidi predmetnog pronalaska obuhvataju polipeptide SEQ ID NO: 8, kao i polipeptide koji imaju bar 90% sličnosti (u izvesnom vremenu bar 90% identičnosti sekvence) sa polipeptidima SEQ ID NO: 8 i bar 95% sličnosti (u izvesnom vremenu bar 95% identičnosti sekvence) sa polipeptidima SEQ ID NOs: 8, i još drugim primerima, polipeptid koji ima bar 96%, 97%, 98%, ili 99% sličnosti (u izvesnom vremenu bar 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence) sa polipeptidima SEQ ID NOs: 8. Kao što se zna u tehnici "sličnost" između dva polipeptida je utvrđena poređenjem amino kiselinske sekvence i njegove očuvane amino kiselinske supstitucije jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida.
 
[0120] Fragmenti ili delovi polipeptida predmetnog pronalaska mogu biti angažovani za proizvodnju odgovarajućeg polipeptida pune dužine sa sintezom peptida; njihovim, fragmenti mogu biti angažovani kao intermedijeri za proizvodnju polipeptida pune dužine. Fragmenti ili delovi polinukleotida predmetnog pronalaska se mogu koristiti za sintezu polinukleotida pune dužine predmetnog pronalaska.
 
[0121] U nekim slučajevima, fragment proteina ovog pronalaska je deo ili ceo protein koji je sposoban da se vezuje za Notch1 receptor proteina. Ovaj fragment ima visoku sposobnost za Notch receptor ili ligand Notch1 receptora. Izvesni fragmenti spojenih proteina su proteinski fragmenti koji sadrže bar deo Notch vezujućeg domena polipeptidnog agensa ili antagonistu spojenog za bar deo konstantnog regiona imunoglobulina. Afinitet je tipično u opsegu od oko 10-11 do 10-12 M, iako se afinitet može jako razlikovati od fragmenata različitih veličina, koji su u opsegu od 10-7 do 10-13 M. U nekim slučajevima, fragment je oko 10-110 amino kiselina u dužini i sadrži Notch vezujući domen polipeptidnog agensa ili antagoniste koji je vezan za bar deo konstantnog regiona imunoglobulina.
 
[0122] Polipeptidi i analozi mogu se dalje modifikovati tako da sadrže dodatne hemijske ostatke koji inače nisu deo proteina. Derivatizovani ostaci mogu poboljšati rastvorljivost, biološki polu vek i/ili apsorpciju proteina. Ostaci mogu takođe redukovati ili eliminisati bilo koje neželjene sporedne efekte proteina i slično. Pregled hemijskih ostataka se može pronaći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20. izda., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
 
[0123] Izolovani polipeptidi opisani ovde se mogu dobiti bilo kojim pogodnim postupkom koji je poznat u tehnici. Takvi postupci se kreću od direktne sinteze proteina do postupaka koji konstruišu DNK sekvencu koja kodira izolovane polipeptidne sekvence i iskazuju te sekvence u pogodnom transformisanom domaćinu.
 
[0124] U nekim slučajevima rekombinantnog postupka, DNK sekvenca je konstruisana izolovanjem ili sintetizovanjem DNK sekvence koja kodira divlji tip proteina koji je od interesa. Opciono, sekvenca može biti mutagenizovana mutagenezom određenog mesta kako bi se dobili njihovi funkcionalni analozi. Videti, npr. Zoeller et al., Proc.-Nat Acad. Sci. USA 1984, 81:5662-5066 i U.S. Pat. 4,588,585. Drugi postupak konstrukcije DNK sekvence koja kodira polipeptid koji je od interesa bi bila hemijska sinteza primenom oligonukleotidnog sintetizera. Takvi oligonukleotidi mogu biti konstruisani na osnovu amino kiselinske sekvence željenog polipeptida i selektuju te kodone koji su favorizovani u ćeliji domaćina gde će rekombinantni polipeptid od posebnog interesa biti dobijen.
 
[0125] Standardni postupci se mogu primenjivati na sintezu izolovane polinukleotidne sekvence koja kodira izolovani polipeptid od posebnog interesa. Na primer, kompletna amino kiselinska sekvenca se može koristiti da se konstruiše pozadinsko prenosni gen. Dalje, može se sintetizovati DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira za određeni izolovani polipeptid. Na primer, nekoliko malih oligonukleotidna koji kodiraju za proteine željenog polipeptida mogu biti sintetizovani, a potom vezani. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5’ ili 3’ ispusta za dopunski skup.
 
[0126] Kada skup (sintezom, mutagenezom diktiranog mesta, ili drugim postupcima), mutant DNK sekvence koje kodiraju određeni izolovani polipeptid od posebnog interesa će biti ubačene u ekspresioni vektor i operativno vezane za ekspresiono kontrolnu sekvencu odgovarajuće za ekspresiju proteina u željenom domaćinu. Odgovarajući skup može biti potvrđen nukleotidnim sekvencioniranjem, ograničenim mapiranjem, i ekspresijom biloške aktivnosti polipeptida u pogodnom domaćinu. Kao što je opšte poznato iz tehnike, u cilju da se dobije visoko iskazani nivoi transfektovanog gena u domaćinu, gen je operativno vezan za transkripcione i translacione ekspresione kontrolne sekvence koje su funkcionalne u odabranim ekspresionim domaćinima.
 
[0127] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana antitela protiv ne-ligande vezujuće membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora. Antitelo, ili fragment antitela, može biti bilo koje monoklonalno ili poliklonalno antitelo koje posebno prepoznaje membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1. U nekim slučajevima, predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonalna antitela, ili njihove fragmente, koji se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 kao što je opisano ovde. U nekim slučajevima, monoklonalna antitela, ili njihovi fragmenti, su himerna ili humanizovana antitela koja se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora kao što je opisano ovde. U drugim primerima, monoklonalna antitela, ili njihovi fragmenti, su humana antitela koja se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog humanog Notch1 receptora kao što je ovde opisano.
 
[0128] Antitela protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora nalazi primenu u eksperimentalnim, dijagnostičkim i terapeutskim postupcima koji su ovde opisani. U nekim slučajevima, antitela predmetnog pronalaska se koriste kako bi se detektovala ekspresija Notch1 receptora u biloškim uzorcima kao što je, na primer, biopsija tkiva pacijenta, pleuralni izliv, ili uzorak krvi. Tkiva za biopsiju mogu biti podeljena, a protein detektovan korišćenjem, na primer, imunofluorescencije ili imunohistohemije. Alternativno, pojedinačne ćelije iz uzoraka su izolovane, a proteinska ekspresija detektovana na fiksiranim ili živim ćelijama primenom FACS analize. Dalje, antitela se mogu koristiti na proteinskim nizovima kako bi se detektovala ekspresija Notch1 receptora, na primer, na tumornim ćelijama, u ćelijskim lizatima, ili u drugim proteinskim uzorcima. U drugim primerima, antitela predmetnog pronalaska se koriste kako bi se inhibirao rast tumornih ćelija kontaktiranjem antitela sa ćelijama tumora ili u in vitro ćeliji zasnovanoj analizi ili in vivo životinjskim modelima. U još drugim primerima, antitela se koriste za lečenje raka kod humanih pacijenata primenom terapeutski efikasne količine antitela protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora.
 
[0129] Poliklonalna antitela se mogu dobiti bilo kojim poznatim postupcima. Poliklonalna antitela su pokrenuta imunizacijom životinja (npr. zeca, pacova, miša, koze, magarca, itd.) višestrukim podkožnim ili intraperitonealnim ubrizgavanjem relevantnog antigena (prečišćeni peptidni fragment, rekombinantni protein pune dužine, spojeni protein, itd.) opciono konjugovanim do ključnog prilepka hemocijanina (KLH), serum albumina, itd., razblaženog u sterilnom slanom rastvoru i kombinovan sa adjuvansima (npr., Kompletni ili Nekopletni Freund-ov Adjuvans) kako bi se obrazovala stabilna emulzija. Poliklonalno antitelo je potom obnovljeno iz krvi, ascita i slično, životinje tako imunizovane. Prikupljena krv je ugrušen, i serum dekantovan, izbistren centrifugiranjem, i analiziran za titer antitela. Poliklonalna antitela mogu biti prečišćena iz seruma ili ascita prema standarnim postupcima u tehnici slično uključujući hromatografiju, hromatografiju jonske razmene, gelastu elektroforezu, dijalizu, itd.
 
[0130] Monoklonalna antitela se mogu dobiti primenom hibridoma postupaka, kao što su one opisane od strane Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497. Primenom hibridoma postupaka, miševi, hrčci, ili druge odgovarjuće domaće životinje, su imunizirane kao što je prethodno opisano kako bi se izmamila proizvodnja antitela od strane limfocita koja će se posebno vezati za imuniziran antigen. Alternativno, limfociti mogu biti imunizirani in vitro. Prateći imunizaciju, limfociti su izolovani i spojeni sa pogodnom mieloma ćelijskom linijom primenom, na primer, polietilen glikola, kako bi se obrazovale hibridoma ćelije koje potom mogu biti selektovane van nekondenzovanih limfocita i mieloma ćelija. Hibridomi koji proizvode monoklonalna antitela diktirana posebno protiv izabranog antigena kao što je utvrđeno imunotaloženjem, imunoapsorbovanjem, ili sa in vitro vezanom analizom kao što je radioimunoanaliza (RIA) ili enzimski vezana imunosorbentna analiza (ELISA) može biti propagirana ili in vitro kulturom primenom standarnih postupaka (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press, 1986) ili in vivo kao ascita tumori kod životinja. Monoklonalna antitela mogu potom biti prečišćena iz kulturnog medijuma ili ascitne tečnosti kao što je prethodno opisano za poliklonalna antitela.
 
[0131] U nekim slučajevima predmetnog pronalaska, antitelo je antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. U nekim slučajevima, antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 14; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 8. U nekim slučajevima, antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima bar 95% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 14, /ili varijabilni region lakog lanca koji ima bar 95% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 8. U nekim slučajevima, antitelo je monoklonalno antitelo ili fragment antitela.
 
[0132] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje vezuje ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 i obuhvata teški lanac CDR1 koji sadrži RGYWIE (SEQ ID NO: 15), teški lanac CDR2 koj sadrži QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16), i/ili teški lanac CDR3 koji sadrži FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17). U nekim slučajevima, antitelo dalje obuhvata laki lanac CDR1 koji sadrži RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), laki lanac CDR2 koji sadrži GTNNRAP (SEQ ID NO: 19), i/ili laki lanac CDR3 koji sadrži ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20). U nekim slučajevima, antitelo obuhvata teški lanac CDR1 koji sadrži RGYWIE (SEQ ID NO: 15), teški lanac CDR2 koji sadrži QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), i/ili teški lanac CDR3 koji sadrži FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17); i laki lanac CDR1 koji sadrži RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), laki lanac CDR2 koji sadrži GTNNRAP (SEQ ID NO: 19), i/ili laki lanac CDR3 koji sadrži ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20. U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži: (a) teški lanac CDR1 koji sadrži RGYWIE (SEQ ID NO: 15), ili njegove varijante koje sadrže 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije; (b) teški lanac CDR2 koji sadrži QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16), ili njegove varijante koje sadrže 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije; i/ili (c) teški lanac CDR3 koji sadrži FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17), ili njegove varijante koje sadrže 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije. U drugim primerima, antitelo obuhvata varijabilni region lakog lanca koji sadrži: (a) laki lanac CDR1 koji sadrži RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), ili njegove varijante koje sadrže 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije; (b) laki lanac CDR2 koji sadrži GTNNRAP(SEQ ID NO: 19), ili njegove varijante koje sadrže 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije; i/ili (c) laki lanac CDR3 koji sadrži ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20), ili njegove varijante koje sadrže 1, 2, 3, ili 4 amino kiselinske supstitucije. U nekim slučajevima, amino kiselinske supstitucije su konzervativne amino kiselinske supstitucije.
 
[0133] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo, 52M51, dobijeno iz hibridom ćelijske linije sa ATCC pod uslovima Budipeštanskog Sporazuma 7 Avgusta, 2008 i dodeljenog broja PTA-9405. U nekim slučajevima, antitelo predstavlja humanizovanu verziju 52M51. U nekim slučajevima, antitelo je humanizovana verzija 52M51, "52M51H4L3", kao što je kodirano sa DNK deponovan sa ATCC pod uslovima Budipeštanskog Sporazuma 15 Oktobra, 2008 i dodeljenog broja PTA-9549. U nekim slučajevima, antitelo je humanizovana verzija 52M51, "52M51 H4L4". U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao epitop za koje se antitelo 52M51 vezuje. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se takmiči sa bilo kojim antitelima kao što je opisano u prethodnim primerima i/ili aspektima, kao i u drugim aspektima/primerima opisani ovde negde drugde, za posebno vezivanje za ne-ligandnu membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch 1 receptora. Takođe su obezbeđene i farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antitela i postupci lečenja raka koji obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine antitela.
 
[0134] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo, 52R43, koje je kodirano sa DNK deponovan sa ATCC pod uslovima Budipeštanskog Sporazuma 15. Oktobra, 2008 i dodeljenim brojem PTA-9548. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao epitop za koji se antitelo 52R43 vezuje. U nekim slučajevima, opis obezbeđuje antitelo koje sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet i/ili šest CDRs 52R43. U nekim slučajevima, opis obezbeđuje antitelo koje se takmiči sa 52R43. Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela i postupci lečenja raka koji obuhvataju primenu terapeutskih efikasnih količina antitela su takođe obezbeđeni.
 
[0135] Alternativno, monoklonalna antitela mogu takođe biti napravljena primenom rekombinantnih DNK postupaka kao što je opisano u U.S.Pat. Br. 4,816,567. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonalno antitelo su izolovani iz zrelih B-ćelija ili hibridoma ćelija, kao što je sa RT-PCR primenom oligonukleotidnih primera koji posebno pojačavaju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela, i njihova sekvenca je određena primenom konvencionalnih postupaka. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance su potom klonirani u pogodne ekspresione vektore koji su potom transfektovani u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli cells, majmunskih COS ćelija, ćelija jajnika kineskih hrčaka (CHO), ili ćelijskih mieloma koji drugačije ne proizvode imunoglobulinski protein. Ćelije domaćina su skenirane za monoklonalno antitelnu proizvodnju i antitela sa željenim osobinama su odabrana. Takođe, rekombinantna monoklonalna antitela ili njihovi fragmenti željenih vrsta mogu biti izolovani iz prikazane biblioteke faga kao što je opisano (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
 
[0136] Polinukleotid(i) koji kodira(ju) monoklonalno antitelo može dalje biti modifikovan(i) na više različitih načina primenom rekombinantne DNK tehnologije kako bi se generisala alternativna antitela. U nekim slučajevima, konstantni domeni lakih i teških lanaca, na primer, mišijeg monoklonalnog antitela se mogu supstituisati 1) za one regione, na primer, humanog antitela kako bi se generisalo hemijsko antitelo ili 2) za ne-imunoglobulinski polipeptid kako bi se generisalo spojeno antitelo. U nekim slučajevima, konstantni regioni su skraćeni ili uklonjeni kako bi se generisao željeni fragment antitela monoklonalnog antitela. Dalje, mutageneza diktiranog mesta ili visoke gustine varijabilnog regiona se može koristiti da se optimizuje specifičnost, afinitet, itd. monoklonalnog antitela.
 
[0137] Više uopšteno, modifikovana antitela korisna u predmetnom pronalasku mogu biti dobijena ili izvedena iz bilo kog antitela. Dalje, roditeljski ili prekursor antitela, ili njihov fragment, korišćen za generisanje prikazanih modifikovanih antitela mogu biti mišija, humana, himerna, humanizovana, ne-humanog primata ili primatizovana. U drugom slučaju, modifikovana antitela predmetnog pronalaska mogu obuhvatati pojedinačne lančane antitelne konstrukcije (kao što je opisano u U.S. Pat. Br. 5,892,019) koje imaju izmenjen konstantan domen kao što je ovde opisano. Stoga, bilo koji od ovih tipova antitela modifikovanih prema tehnikama ovde navedenim su kompatibilna sa ovim pronalaskom.
 
[0138] Prema predmetnom pronalaskom, tehnike mogu biti prilagođene za proizvodnju antitela pojedinačnog lanca specifične za polipeptid pronalaska (videti U.S. Pat. Br. 4,946,778). Dodatno, postupci mogu biti prilagođeni za konstrukciju Fab ekspresione biblioteke (Huse, et al., 1989, Science, 246:1275-1281) kako bi se dozvolila brza i efikasna identifikacija monoklonalnih Fab fragmenata sa željenom osobinom za Notch ili njegove derivate, fragmente, analoge ili homologe. Fragmenti antitela koji sadrže idiotipe polipeptida pronalaska mogu biti proizvedena tehnikama u tehnici koja uključuju, ali nisu ograničena na: (a) F(ab’)2 fragment dobijen iz pepsina digestijom molekula antitela; (b) Fab fragment generisan redukcijom disulfidnih mostova F(ab’)2 fragmenta, (c) Fab fragment generisan lečenjem molekula antitela sa papin i redukcionim agensom, i (d) Fv fragmenti.
 
[0139] Bispecifična antitela su takođe unutar obima pronalaska. Bispecifična antitela su monoklonalna, poželjno humana ili humanizovana, antitela koja imaju vezujuću sposobnost za bar dva različita antigena.
 
[0140] Postupci za dobijanje bispecifičnih antitela su poznati u tehnici. Na primer, u predmetnom slučaju, jedna od vezujućih osobina je za antigenski polipeptid pronalaska (Notch1 ili njegov fragment), dok sekundarna vezujuća meta je bilo koji drugi antigen, i povoljno je površinski ćelijski protein, ili receptor podjedinice. Rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela je zasnovana na ko-ekspresiji dva imunoglobulinska para teškog lanca/lakog lanca, gde dva teška lanca imaju različite osobine (Milstein i Cuello, Nature 1983, 305:537-539). Zbog nasumičnog rasporeda imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) daju potencijalne smeše deset različitih molekula antitela, od koji samo jedan ima korektnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula se obično postiže sa određenom hromatografijom.
 
[0141] Antitelni varijabilni domeni sa željenim vezujućim osobinama mogu se spojiti za imunoglobulinske konstantne domenske sekvence. Fuzija je sa imunoglobulinom konstantnog domena teškog lanca, koji sadrži bar deo vezujućih, CH2 i CH3 regiona. Prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca može biti prisutno na bar jednom od spojeva. DNK koja kodira fuzije imunoglobulina teškog lanca i, ako se želi, koji kodira fuzije imunoglobulinskog lakog lanca, su ubačena u odvojene ekspresione vektore, i ko transfektovani u pogodni domaći organizam. Dalji detalji generisanih bispecifičnih antitela se mogu pronaći u Suresh et al., Methods in Enzymology 1986, 121:210.
 
[0142] Bispecifična antitela se mogu dobiti kao antitela sa punom dužinom ili fragmenti antitela. Tehnike za generisanje bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela se mogu dobiti primenom himernog vezivanja. Dodatno, Brennan et al., Science 1985, 229:81 opisuje postupak gde netaknuta antitela su proteolitički odcepljena kako bi se generisali F(ab’)2 fragmenti.
 
[0143] Dodatno, Fab’ fragmenti mogu biti direktno oporavljena iz E. coli i hemijski kuplovana kako bi se obrazovala bispecifična antitela (Shalaby et al., J. Exp. Med. 1992, 175:217-225). Ovi postupci se mogu koristiti u proizvodnju potpunog humanizovanog bispecifičnog molekula antitela F(ab’)2.
 
[0144] Antitela sa više od dva nosača su takođe razmatrana. Na primer, trispecifična antitela se mogu dobiti (Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60).
 
[0145] Ovaj pronalazak takođe obuhvata bispecifična antitela koja posebno prepoznaju membransko proksimalnog region vanćelijskog domena Notch1 receptora. Bispecifična antitela su antitela koja su sposobna za posebno prepoznavanje i vezivanje bar dva različita epitopa. Različiti epitopi mogu biti ili u okviru samog molekula (npr. isti Notch1) ili na različitim molekulima tako da oba, na primer, antitela mogu posebno prepoznati i vezati Notch1 receptor, kao i, na primer, 1) efektorni molekul na leukocitu kao što je receptor T-ćelije (npr. CD3) ili Fc receptor (npr. CD64, CD32, ili CD16) ili 2) citotoksični agens kao što je opisano u više detalja u nastavku. Bispecifična antitela mogu biti netaknuta antitela ili fragmenti antitela. Tehnike za dobijanje bispecifičnih antitela su uobičajene u tehnici (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol., 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol., 152:5368; and U.S. Pat. No. 5,731,168).
 
[0146] Primeri bispecifičnih antitela mogu se vezati za dva različita epitopa, od kojih bar jedan potiče iz polipeptida pronalaska. Alternativno, anti-antigenski nastavak imunoglobulinskog molekula se može kombinovati sa nastavkom koji se vezuje za aktivirajući molekul na leukocitu kao što je molekul receptora T ćelije (npr. CD2, CD3, CD28, ili B7), ili Fc receptori za IgG tako da se fokusira ćelijski odbrambeni mehanizmi ćelije koja iskazuje određeni antigen. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti kako bi diktirali citotoksične agense na ćelije koje iskazuju određeni antigen. Ova antitela poseduju antigenski vezujući nastavak i nastavak koji vezuje citotoksični agens ili radionukleotidni helator, kao što je EOTUBE, DPTA, DOTA, ili TETA.
 
[0147] Heterokonjugovana antitela su takođe u okviru obima predmetnog pronalaska. Heterokonjugovana antitela se sastoje od dva kovalentno povezana antitela. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju imune ćelije ka neželjenim ćelijama (U.S. Pat. 4,676,980). Smatra se da se antitela mogu dobiti in vitro primenom poznatih postupaka u sintetičkoj proteinskoj hemiji, uključujući ona koja uključuju unakrsno vezujuće agense. Na primer, imunotoksini mogu biti konstruisani primenom disulfidne reakcije zamene ili obrazovanjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ovu svrhu obuhvataju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
 
[0148] Za svrhe predmetnog pronalaska, trebalo bi napomenuti da modifikovana antitela mogu obuhvatati bilo koji tip varijabilnog regiona koji obezbeđuje za spajanje antitela sa membransko proksimalnogm regionom vanćelijskog domena Notch1 receptora. U tom pogledu, varijabilni region može obuhvatati ili biti izveden iz bilo kog tipa sisara koji može biti izazvan da otpočne humoralni odgovor i generiše imunoglobuline protiv željenog tumora povezanog antigena. Kao takav, varijabilni region modifikovanih antitela može biti, na primer, humani, mišji, ne-humanog primata (npr. cynomolgus majmuni, macaques, itd) ili vučijeg porekla. U nekim slučajevima, oba regiona, i varijabilni i konstantni region, modifikovanih imunoglobulina su humani. U nekim slučajevima, varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično izvedeni iz ne-humanog izvora) mogu biti slojni ili posebno prilagođeni da poboljšaju vezujuće sposobnosti ili smanje imunogeničnost molekula. U tom pogledu, varijabilni regioni korisni u predmetnom pronalasku mogu biti humanizovani ili inače izmenjeni kroz uključivanje amino kiselinskih sekvenci.
 
[0149] U nekim slučajevima predmetnog pronalaska monoklonalnog antitela protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora je humanizovano antitelo. Hunamizovana antitela su antitela koja sadrže minimalnu sekvencu iz ne-humanih (npr., mišiji) antitela unutar varijabilnih regiona. Takva antitela se koriste terapeutski da smanje antigeničnost i HAMA (humano anti-mišije antitelo) odgovore kada se primenjuje na humani subjekat. U praksi, humanizovana antitela su tipična humana antitela sa minimumom do bez ne-humanih sekvenci. Humano antitelo je antitelo dobijeno od strane humanog ili antitela koja imaju amino kiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu dobijenom od strane čoveka.
 
[0150] Humanizovana antitela mogu biti dobijena primenom raznih tehnika poznate u tehnici. Antitelo može biti humanizovano zamenom CDR humanog antitela sa onim koji nije humano antitelo (npr. miš, pacov, zec, hrčak, itd.) koje ima željenu specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). Humanizovano antitelo može dalje biti modifikovano supstitucijom dodatnog ostatka ili u Fv regionskom okviru i/ili unutar zamenjenih ne-humanih ostataka da preradi i optimizuje antitelnu specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost.
 
[0151] U nekim slučajevima predmetnog pronalaska, antitelo je humanizovano antitelo koje se posebno vezuje za ne-ligandnu vezujuću membranu prokismalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. U nekim slučajevima, antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 24; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima bar 95% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 24, i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima bar 95% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 32.
 
[0152] U nekim slučajevima, humanizovano antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 24, i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 28. U nekim slučajevima, humanizovano antitelo obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 24, i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 32.
 
[0153] Humana antitela mogu biti direktno dobijena primenom raznih tehnika koja su poznata u tehnici. Besmrtni humani limfociti imunizovani in vitro ili izolovani iz imunizovanog pojedinca koji proizvodi antitelo diktiran protiv ciljanog antigena mogu biti generisana (Videti, na primer, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; i U.S. Patent 5,750,373). Takođe, humano antitelo može biti selektovano iz biblioteke faga, gde biblioteka faga iskazuje humana antitela (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humanizovana antitela mogu takođe biti dobijena u transgenskim miševima koji sadrže humani imunoglobulinski lokus koji su sposobni, nakom imunizacije, da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogenog imunoglobulinskog proizvoda. Na primer, opisano je da homozigodno brisanje antitela teškog lanca koji se pridružuju regionu (JH) gena u himernim i germ-linijskim mutiranim miševima rezultuje u kompletnoj inhibiciji endogenozne proizvodnje antitela. Prenos humanog germ-linijskog imunoglobulinskog genskog poretka u takav germ-linijske mutirane miševe će rezultovati u proizvodnji humanih antitela nakon antigenskog izazova. (Videti, na primer, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258; Bruggemann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33; U.S. Patenti 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016
 
[0154] Alternativno, tehnologija prikaza fage se može koristiti za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, iz imunoglobulinskih varijabilnih (V) domenskih genskih repertoara iz neimunozovanih donora. Prema ovoj tehnici, antitela V domen gena su klonirana u okviru u ili veći ili manji presvućeni proteinski gen filamentozne bakteriofage, kao što je M13 ili fd, i prikazana su kao funkcionalni fragmenti antitela površine fagne čestice. Pošto filamentozna čestica sadrži jednolančanu DNK kopiju fagnog genoma, selekcije zasnovane na funkcionalnim osobinama antitela takođe rezultuju u selekciji gena koja kodira antitelo koje pokazuje ove osobine. Prema tome, fagni mimici nekih osobina B-ćelije. Fagni prikaz može biti izveden u raznim formatima. Nekoliko izvora V-genskih segmenata se može koristiti za fagni prikaz. Najrazličitija anti-okazolonska antitela su izolovana iz malih nasumično odabrane kombinatorne biblioteke V gena izvedenih iz slezine imuniziranih miševa. Repertoar V gena iz neimuniziranih humanih donora može biti konstruisan i antitela na najrazličitijim antigenima (uključujući sopstvene antigene) mogu biti izolovani.
 
[0155] Kao što je diskutovano gore, humana antitela mogu takođe biti generisana sa in vitro aktiviranim B ćelijama (videti U.S. Pat. Br. 5,567,610 i 5,229,275).
 
[0156] Podrazumeva se da presađivanje celih ne-humanih varijabilnih domena na humanim konstantnim regionima će proizvesti "klasična" himerna antitela. U kontekstu predmetne prijave termin "himerna antitela" će označavati bilo koje antitelo gde je imunoreaktivni region ili mesto dobijeno ili izvedeno iz prvih vrsta i konstantnog regiona (koji može biti netaknut, delimičan ili modifikovan prema ovom pronalasku) je dobijeno iz sekundarnih vrsta. U nekim slučajevima, antigenski vezujući region ili mesto će biti iz ne-humanog izvora (npr. miš) i konstantni region je ljudski. Dok imunogenska specifičnost varijabilnog regiona uopšteno nije pod uticajem njegovog izvora, manja je verovatnoća da će humani konstantni region je izazvati imuni odgovor iz ljudskog subjekta nego što će konstantni region iz ne-humanog izvora.
 
[0157] Varijabilni domeni u oba, teških i lakih lanaca, su izmenjeni sa bar delimičnom zamenom jednog ili više CDRs i, ako je neophodno, sa delimično okvirno regionskom zamenom i promenom sekvence. Iako CDRs može biti izveden iz antitela iste klase ili čak podklase kao antitelo pošto je antitelo iz kojeg je okvirna regiona izvedena, predviđeno je će CDRs biti izveden iz antitela različite klase i poželjno iz antitela iz različitih vrsta. Mora biti naglašeno da neće biti neophodno da se zamene svi CDRs sa kompletnim CDRs iz donora varijabilnog regijona da se prebaci antigenska vezujuća sposobnost jednog varijabilnog domena na drugi. Radije, može biti samo neophodno da se prebace oni ostaci koji su neophodni da održavaju aktivnost antigenskog vezujućeg mesta. Dajuća objašnjena su prikazana u U.S. Pat. Br. 5,585,089, 5,693,761 i 5,693,762, biće unutar tehnike, ili izvođenjem rutinske eksperimentacije ili pokušajem i greškom koja testira dobijanje funkcionalnog antitela sa redukovanom imunogenošću.
 
[0158] Uprkos izmenama u varijabilnom regionu, biće jasno da će modifikovana antitela ovog pronalaska obuhvatati antitela, ili njihove imunoreaktivne fragmente, gde je bar frakcija jednog ili više konstantnih regionskih domena izbrisana ili drugačije izmenjena tako da obezbedi željene biohemijske karakteristike kao što je povećana lokalizacija tumora ili smanjenje serumskog polu veka kada se poredi sa antitelom približno iste imunogenosti koja obuhvata nativni ili neizmenjen region. U nekim slučajevima, konstantni region modifikovanih antitela će obuhvatati humani konstatni region. Modifikacije do konstatnog regiona kompatibilnog sa ovim pronalaskom obuhvata dodavanja, brisanja ili supstitucije jedne ili više amino kiselina u jednom ili više domena. To je, modifikovana antitela koja su ovde opisana mogu obuhvatati izmene ili modifikacije jednog ili više od tri teška lanca konstantnih domena (CH1, CH2 ili CH3) i/ili laka lanca konstatnog domena (CL). U nekim slučajevima pronalaska, razmatrani su modifikovani konstatntni regioni gde je jedan ili više domena delimično ili upotpunosti izbrisano. U drugim slučajevima, modifikovana antitela će obuhvatati domen izbrisane konstrukcije ili varijante gde je celi CH2 domen uklonjen (ΔCH2 konstrukcija). U još drugim primerima, izostavljen konstantni regionski domen će biti zamenjen sa kratkim amino kiselinskim razmakom (npr. 10 ostataka) koji obezbeđuje neku od molekulske fleksibilnosti obično saopšten odustvom konstatntnog regiona.
[0159] Pored njihove konfiguracije, u tehnici je poznato da konstantni region posreduje nekoliko efektornih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente dopune za antitela aktivira komplementarni sistem. Aktivacija komplementa je važno u opsonizaciji i liziji ćelije patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše inflamacioni odgovor i takođe može biti uključen u autoimunu hipersenzitivnost. Dalje, antitela se vezuju za ćelije preko Fc regiona, sa Fc receptorskim mestom na antitelnom Fc regionu koji se vezuje za Fc receptor (FcR) za ćeliju. Postoji veći broj Fc receptora koja su specifična za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mi receptore). Vezivanje antitela za Fc receptore na površinama ćelije aktivira veliki broj važnih i raznih biloških odgovora uključujući engulfment i uništenje čestica prekrivenog antitela, jasnoće imunih kompleksa, lizija ciljanih ćelija presvućenog antitela od strane ćelija ubica (nazvan antitelna zavisna ćelijska posredovana citotoksičnost, ili ADCC), otpuštanje inflamatornih medijatora, placentalni prenos i kontrola imunoglobulinske proizvodnje. Iako su razni Fc receptori i mesta receptora bili analizirani do izvesnog obima, ostalo je još dosta nepoznatog vezano za njihovu lokaciju, strukturu i funkcionalnost.
 
[0160] I ako ne ograničava obim predmetnog pronalaska, veruje se da antitela obuhvataju regione modifikovane kao što je opisano ovde obezbeđene za izmenjene efektorske funkcije, zauzvrat, deluju na biološki profil primenjivanog antitela. Na primer, brisanje ili neaktivnost (kroz upućene mutacije ili druge načine) konstantnog regionskog domena može umanjiti vezivanje Fc receptora cirkulisanog modifikovanog antitela čime se povećava lokalizacija tumora. U drugim slučajevima može biti da konstantne regionske modifikacije, u skladu sa ovim pronalaskom, posreduju komplementarnom vezivanju i prema tome smanjuju serumski polu vek i nespecifično povezivanje konjugovanog citotoksina. Ipak, druge modifikacije konstatnog regiona mogu se koristiti za eliminaciju disulfidnih veza ili oligosaharidnih ostataka koji dozvoljava povećanje lokalizacije u odnosu na antigensku specifičnost ili antitelesnu fleksibilnost. Slično, modifikacije konstantnog regiona u odnosu na ovaj pronalazak mogu se lako uraditi primenom dobro poznatih biohemijskih ili molekulskih angažovanih tehnika.
 
[0161] Biće napomenuto da modifikovana antitela mogu biti angažvana za spajanje CH3 domena direktno na zglobni region određenih modifikovanih antitela. U drugim konstrukcijama može biti poželjno da se obezbedi peptidni stvarač prostora između zglobnog regiona i modifikovanih CH2 i/ili CH3 domena. Na primer, kompatibilne konstrukcije mogu biti iskazane tamo gde je CH2 domen izbrisan, a preostali CH3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) je spojen za zglobni region sa 5-20 amino kiselinskih razmaka. Takvi razmaci mogu biti dodati, na primer, kako bi osigurali da regulatorni elementi konstantnog domena ostanu slobodni i pristupačni ili da zglobni region ostane fleksibilan. Međutim, trebalo bi da bude zabeleženo da amino kiselinski razmaci mogu, u nekim slučajevima, dokazati da su imunogenski i izmamiti neželjeni imuni odgovor protiv konstrukcije. Prema tome, bilo koji razmak dodat konstrukciji će biti relativno ne-imunogenetski ili, čak izostavljen zajedno ako se željene biohemijske kvalitete modifikovanih antitela žele održati.
 
[0162] Pored brisanja celih konstantnih regionskih domena, biće jasno da antitela predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđena delimičnim brisanjem ili supstitucijom nekoliko ili čak pojedinačnih amino kiselina. Na primer, mutacija jedne amino kiseline u odabranom području CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji Fc vezivanje i prema tome poveća lokalizaciju tumora. Slično, može biti poželjno da se jednostavno izbriše do jednog ili više konstantnih regionskih domena koji kontrolišu efektorsku funkciju (npr. komplementarno CLQ vezivanje) tako da se mogu modulirati. Takva delimična brisanja konstantnih regiona mogu poboljšati odabrane karakteristike antitela (serumski polu vek) dok se ostavljaju druge željene funkcije povezane sa netaknutim subjektom konstantnog regionskog domena. Štaviše, kao što je ukazano gore, konstantni regioni prikazanih antitela mogu biti modifikovani kroz mutaciju ili substituciju jedne ili više amino kiselina koje pojačavaju profil rezultujuće konstrukcije. U tom plogledu moguće je prekinuti aktivnost omogućenu sa održanim mestom vezivanja (npr. Fc vezivanje) dok se suštinski održava konfiguracija i imunogenski profil modifikovanog antitela. Ipak drugi slučajevi mogu da sadrže dodavanje jedne ili više amino kiselina konstantnom regionu kako bi se povećale željene karakteristike kao što je efektorna funkcija ili predviđa više vezivanja citotoksina ili ugljohidrata. U takvim slučajevima, može biti poželjno da se ubace ili zamene određene sekvence izvedene iz odabranih konstantnih regionskih domena.
 
[0163] U nekim slučajevima pronalaska, može biti poželjno da se koristi fragment antitela, radije nego netaknuto antitelo, kako bi se povećala penetracija tumora, na primer. Razne tehnike su poznate za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni preko proteolitičke digestije netaknutih antitela (na primer Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 i Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Međutim, ovi fragmenti su sada obično dobijeni direktno rekombinacijom ćelija domaćina kao što je opisano ovde. Prema tome Fab, Fv, i scFv fragmenti antitela mogu svi biti iskazani u, i izlučeni iz, E. coli ili drugih ćelija domaćina, tako dozvoljavajući dobijanje velike količine ovih fragmenata. Alternativno, takvi fragmenti antitela mogu biti izolovani iz antitelne fagne biblioteke koja je diskutovana ovde. Fragment antitela može takođe biti linerani fragmenti kao što je opisano u U.S. Pat. Br. 5,641,870, na primer, i može biti monospecifičan ili bispecifičan. Druge tehike za proizvodnju fragmenata antitela će biti očigledne stručnjaku iz odgrovarjuće oblasti tehnike.
 
[0164] Dalje može biti poželjno, pogotovo u slučaju fragmenata antitela, da se modifikuje antitelo u cilju da se poveća njegov serumski polu vek. Ovo može biti postignuto, na primer, inkorporacijom prepravljenog receptora koji vezuje epitop u fragment antitela ili inkorporacijom epitopa u peptidni znak koji je potom spojen za fragment antitela ili na kraju ili u sredini (npr., sa DNK ili peptidnom sintezom).
 
[0165] Predmetni pronalazak dalje obuhvata varijante i ekvivalente koji su značajno homologni za himerna, humanizovana i humana antitela, ili njihove fragmente antitela, navedena u ovom tekstu. Oni mogu sadržati, na primer, konzervativne supstitucione mutacije, odn. supstituciju jedne ili više amino kiselina sa sličnim amino kiselinama. Na primer, konzervativna supstitucija se odnosi na supstituciju amino kiseline sa drugim unutar iste opšte klase kao što je, na primer, jedna kiselinska amino kiselina sa drugom kiselinskom amino kiselinom, jedna bazna amino kiselina sa drugom baznom amino kiselinom ili jedna neutralna amino kiselina sa drugom neutralnom amino kiselinom. Šta je namenjeno sa konzervativnom amino kiselinskom supstitucijom je opšte poznato u tehnici.
 
[0166] Pronalazak se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže antitelo konjugovano za citotoksični agens. Citotoksični agensi obuhvataju hemoterapeutske agense, agense inhibitora rasta, toksine,
 
[0167] (npr., enzimski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), radioaktivne izotope (odn., a radiokonjugat), itd. Hemoterapeutski agensi korisni u generisanju takvih imunokonjugata obuhvataju, na primer, metotreksat, adriamicin, doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge umetnute agense. Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti potom mogu biti korišćeni uključujući dipteria A lanac, nevezujući aktivni fragmenti dipteria toksina, eksotoksin A lanac, ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfasarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Fitolaka amerikanski proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i trikoteceni. U nekim slučajevima, antitela mogu biti konjugovana do radioizotopa, kao što su 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re i 188Re primenom bilo kog broja opšte poznatih helatora ili direktnih oznaka. U drugim primerima, otkrivene kompozicije mogu sadržati antitela spojena za lekove, prolekove, ili limfokine kao što je interferon. Konjugati antitela i citotoksični agens su napravljeni primenom raznih bifunkcionalnih agenasa za proteinsko kuplovanje kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridiiditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijumski derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocianati (kao što je tolien 2,6-diiszocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Konjugati antitela i jedan ili više manjih toksičnih molekula, kao što je kaliheamicin, maitansinoidi, trihoten, i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju toksičnu aktivnost, se takođe mogu koristiti. U nekim slučajevima, modifikovana antitela mogu biti složena sa drugim imunološkim aktivnim ligandima (npr., antitela ili njihovi fragmenti) gde rezultujući molekul se vezuje za obe neoplastične ćelije i efektornu ćeliju kao što je T ćelija.
 
[0168] Bez obzira kako su korisni kvantiteti dobijeni, antitela predmetnog pronalaska se mogu koristiti u jednom od brojnih konjugata (odn. imunokonjugat) ili nekonjugovanih oblika. Alternativno, antitela ovog pronalaska se mogu koristiti u nekonjugovanom ili "golom" obliku kako bi upregnuli prirodni odbrambeni mehanizam subjekta koji obuhvata komplementno-zavisnu citotoksičnost (CDC) i antitelesnu zavisnu ćelijsku toksičnost (ADCC) kako bi eliminisali malignatne ćelije. Selekcija od kojih će konjugovano ili nekonjugovano modifikovano antitelo za primenu zavisiti od tipa i stanja raka, primene dopune lečenja (npr., hemoterapija ili spoljašnje zračenje) i stanja pacijenta. Biće jasno da jedan može lako napraviti takvu selekciju u pogledu učenja koje je prikazano ovde.
 
[0169] Konkurencijske analize mogu biti korišćene kako bi se utvrdilo da li dva antitela vezuju isti epitop prepoznavanjem identičnih ili sterno preklapajućih epitopa. Bilo koji postupak poznat od strane stručnog lica u tehnici za utvrđivanje kompetitivnog vezivanja (kao što je npr., imunoanaliza opisana ovde u nekom drugom delu) se može koristiti.
 
[0170] Antitela predmetnog pronalaska se mogu analizirati za imunospecifično vezivanje sa bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Imunoanaliza koja može da se koristi obuhvata, ali nije ograničena na, kompetitivne i ne kompetitivne sistemske analize primenom tehnika kao što je Biacore analiza, FACS analiza, imunofluorescencija, imunocitohemija, Western blot analiza, radioimunoanaliza, ELISA, "sendvič" imunoanaliza, analiza imunotaloženja, reakcija taloženja, reakcija gel difuzionog taloženja, imunodifuziona analiza, aglutinacijska analiza, komplement-fiksaciona analiza, imunoradiometrijska analiza, fluorescentna imunoanaliza, i protein A imunoanaliza. Takve analize su rutinske i opšte poznate u tehnici (videti, npr., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).
[0171] U nekim slučajevima predmetnog pronalaska, imunospecifičnost antitela protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je utvrđena primenom ELISA. ELISA analiza obuhvata pripremu antigena, presvlačenje bunarčića ploče koja sadrži 96 bunarčića sa antigenom, dodavanje antitela protiv matične ćelije raka konjugovan do detektovanog jedinjenja kao što je enzimski supstrat (npr. peroksidaza rena ili alkalinea fosfataza) u bunarčiće, inkubaciju za jedan period vremena i detektovanje prisustva antigena. Alternativno, antitelo protiv membransko proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora nije konjugovano do detektovanog jedinjenja, ali umesto drugog konjugovanog antitela koje prepoznaje antitelo protiv membransko proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je dodat bunarčiću. Dalje, umesto presvlačenja bunarčića sa antigenom, antitelo protiv membransko proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora može biti obloženo u bunarčiću, a drugo antitelo konjugovano za detektovano jedinjenje može biti dodato prateći dodavanje antigena obloženom bunarčiću. Poznato je stručnjaku iz odgovarajuće oblasti koji parametri mogu biti modifikovani kako bi se povećala signalna detekcija kao i druge varijante ELISAs poznate u tehnici (videti npr.. Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1).
 
[0172] Vezujuća sposobnost antitela za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora i smanjena stopa interakcije antitelo-antigen može biti određena kompetitivnim vezujućim analizama. Jedan primer kompetitivne vezujuće analize je radioimunoanaliza koja obuhvata inkubaciju označenog antigena (npr. 3H ili 125I), ili fragmenta ili njihovih varijanti, sa antitelom od interesa u prisustvu povećanih količina neoznačenog antigena praćen detekcijom veze antitela na označeni antigen. Afinitet antitela protiv membransko proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora i smanjenih stopa vezivanja može biti određen iz podataka analize Scatchardovog dijagrama. U nekim slučajevima, Biacor kinetička analiza se koristi da se utvrdi vezivanje na i van stopa antitela protiv membransko proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. Biacor kinetička analiza obuhvata analiziranje vezivanja i odvajanja antitela od čipova sa imobilizanim antigenom, na primer, Notch1 receptora, na njihovoj površini.
 
[0173] U nekim slučajevima, pronalazak obuhvata izolaciju polinukleotida koji kodiraju polipeptid koji sadrži antitelo ili njegov fragment, protiv ne-ligandne vezujuće membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. Termin "polinukleotid koji kodira polipeptid" obuhvata polinukleotid koji uključuje samo kodirajuće sekvence za polipeptid kao i polinukleotid koji obuhvata dodatno kodiranje i/ili ne kodiranje sekvenci. Polinukleotidi pronalaska mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK. DNK obuhvata cDNK, genomsku DNK, i sintetičku DNK; i može biti dvolančana ili jednolančana, i ako je jednolančana onda može biti kodirajuća nit ili ne kodirajuća (anti-sensna) nit. Polinukleotidi pronalaska mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK, gde DNK obuhvata cDNK, genomsku DNK, i sintetičku DNK. DNK može biti dvolančana ili jednolančana, i ako je jednolančana onda može biti kodirajuća nit ili ne kodirajuća (anti-sensna) nit.
 
[0174] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na varijante, ovde prethodno opisanih polinukleotida, koji kodiraju fragmente, analoge, i derivate. Varijanta polinukleotida može biti alelska varijanta polinukleotida koja se javlja u prirodi ili varijanta polinukleotida koja se ne javlja u prirodi.
 
[0175] Kao što je ovde navedeno, polinukleotid može imati kodirajuću sekvencu koja predstavlja alelsku varijantu kodirajuće sekvence prikazanih polipeptida koja se javlja u prirodi. Kao što se zna u tehnici, alelska varijanta je alternativni oblik polinukleotidne sekvence koja ima supstituciju, brisanje ili dodavanje jednog ili više nukleotida, koji bez posebnog značaja menjaju funkciju kodiranog polipeptida.
 
[0176] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polinukleotide, gde kodirajuća sekvenca za zreli polipetid može biti spojena u istom čitajućem okviru za polinukleotid koji pomaže u ekspresiji i sekreciji polipetida iz ćelija domaćina, na primer, vodeća sekvenca koja funkcioniše kao sekretorna sekvenca za konrolu transporta polipetida iz ćelije. Polipeptid koji ima vodeću sekvencu je preprotein i može imati vodeću sekvencu odcepljenu od strane ćelije domaćina kako bi se obrazovao zreli oblik polipeptida. Polinukleotidi mogu takođe da kodiraju za proprotein koji predstavlja zreli protein plus dodatni 5’ amino kiselinski ostaci. Zreli protein koji ima prosekvencu je proprotein i predstavlja neaktivni oblik proteina. Jednom kada je prosekvenca odcepljena, aktivni zreli protein preostaje. Prema tome, na primer, polinukleotid predmetnog pronalaska može kodirati za zreli protein, ili za protein koji ima prosekvencu ili za protein koji ima i prosekvencu i presekvencu (vodeću sekvencu).
 
[0177] Polinukleotidi predmetnog pronalaska mogu takođe imati kodirajuću sekvencu spojenu u okviru marker sekvence koja dozvoljava prečišćavanje polipeptida predmetnog pronalaska. Markerna sekvenca može biti heksahistidin oznaka snabdevena sa pQE-9 vektorom kako bi se dokazalo prečišćavanje zrelog polipeptida spojenog za marker u slučaju bakterijskog domaćina, ili, na primer, marker sekvenca može biti hemagglutinin (HA) oznaka kada je korišćen sisarski domaćin, npr. COS-7 ćelije. HA oznaka odgovara epitopu izvedenom iz uticaja hemagglutinin proteina (Wilson et al., 1984, Cell 37:767).
[0178] Drugi primeri pronalaska obuhvataju izolovane amino kiselinske molekule koji sadrže polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja je bar 90% identična, 95% identična, i u nekim slučajevima, bar 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa prikazanim sekvencama. U nekim slučajevima polinukleotidi imaju nukleotidnu sekvencu bar 90% identičnu sa SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 25 ili 29 (sa ili bez signalne sekvence). U nekim slučajevima, polinukleotidi imaju nukleotidnu sekvencu bar 90% identičnu sa SEQ ID NOs: 7 ili 13. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji hibridizuje u polunukleotid koji kodira polipeptide SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 30, 31, ili 32. U nekim slučajevima, polinukleotidi hibridizuju u polinukleotide SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 25 ili 29. U nekim slučajevima, polinukleotidi hibridizuju pod strogim uslovima hibridizacije.
 
[0179] Kao što je ovde korišćeno, fraze "hibridizira" ili "selektivno hibridizuje" ili "posebno hibridizuje" se odnose na vezovanje ili dupliranje molekula samo za određenu nukleotidnu sekvencu pod strogim uslovima hibridizacije kada je ta sekvenca prisutna u kompleksnoj smeši (npr., biblioteka DNK ili RNK). Videti, npr., Andersen (1998) Nucleic Acid Hybridization Springer-Verlag; Ross (ed. 1997) Nucleic Acid Hybridization Wiley.
 
[0180] Kao što je ovde korišćeno, fraza "strogi uslovi hibridizacije" se odnosi na uslove pod kojima će uzorak biti hibridiziran do njegove ciljane sekvence, obično u smeši kompleksa nukleinske kiseline, ali ni do jedne druge sekvence. Strogi uslovi su sekvencno-zavisni ili biće različiti u različitim uslovima. Duže sekvence se hibridizuju posebno na višim temperaturama. Obiman vodić do hibridizacije nukleinskih kiselina je pronađen u Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Uopšteno, strogi uslovi su odabrani da budu oko 5-10 °C niži nego termalna tačka topljenja (Tm) za određenu sekvencu pri različitom jonskom jačinom. Tm je temperatura (pod definisanom jonskom jačinom, pH, i nukleinskom koncentracijom) od čega je 50% proba komplementarno na cilj hibridizovan do željene sekvence na ekvilibrijumu (pošto su ciljane sekvence prisutne u višku, na Tm, 50% proba su zauzete u ekvilibrijumu). Strogi uslovi će biti oni gde je koncentracija soli manja od oko 1.0 M natrijumovog jona, obično oko 0.01 do 1.0 M natrijum jonske koncentracije (ili drugih soli) na pH 7.0 do 8.3 i temperatura je bar oko 30 °C za kratke probe (npr., 10 do 50 nukleotide) i bar oko 60 °C za duge probe (npr., više od 50 nukleotida). Strogi uslovi takođe mogu biti postignuti sa dodatkom destabilizirajućih agenasa kao što je formamid. Za visoku strogoću hibridizacije, pozitivni signal je bar dva puta pozadinska, ili 10 puta pozadinska hibridizacija. Primeri visoke strogoće ili strogi hibridizacijski uslovi obuhvataju: 50% formamida, 5x SSC, i 1% SDS inkubiran na 42 °C ili 5x SSC i 1% SDS inkubiran na 65 °C, sa ispiranjem sa 0.2x SSC i 0.1% SDS na 65 °C. Za PCR, temperatura oko 36 °C je tipična za primenu niske strogoće, iako temperature prekalenja mogu varirati od oko 32 °C do oko 48 °C u zavisnosti od prajmerske dužine. Za veoma strogo PCR pojačanje temperatura od oko 62 °C je tipična, iako temperature prekalenja mogu varirati od oko 50 °C do oko 65 °C, u zavisnosti od prajmerske dužine i specifičnosti. Tipični ciklični uslovi za obe visoke i niske strogoće primene obuhvataju fazu denaturacije od 90 °C do 95 °C za 30-120 sek, faza prekaljivanja traje 30-120 sek, a faza ekstenzije od oko 72 °C za 1-2 min.
 
[0181] Polinukleotidnom koji ima nukleotidnu sekvencu bar, na primer, 95% "identičnu" sa referentnom nukleotidnom sekvencom se namerava da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična sa referentnom sekvencom prihvaćenom da polinukleotidna sekvenca može obuhvatati najviše pet tačaka mutacije po svakom 100 nukleotidu referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu bar 95% identičnu sa referentnom nukleotidnom sekvencom, najviše 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili supstituisano sa drugim nukleotidom, ili broj nukleotida najviše 5% od ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci se može ubaciti u referentnu sekvencu. Ove mutacije referentne sekvence se mogu desiti na amino- ili karboksitermalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između onih termalnih pozicija, smenjeni ili pojedinačno među nukleotidima u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence.
 
[0182] Iz praktičnih razloga, da li je bilo koji određeni molekul nukleinske kiseline bar 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan prema referentnoj sekvenci može biti određen konvencionalno primenom poznatih kompjuterskih programa kao što je Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit koristi lokalni homologni algoritam Smith i Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), da bi se pronašao najbolji segment homologa između dve sekvence. Kada se koristi Bestfit ili bilo koji drugi sekvencionalni svrstavajući program da bi se utvrdilo da li je odgovarajuća sekvenca, na primer, 95% identična sa referentnom sekvencom prema predmetnom pronalasku, parametri su podešeni, naravno, tako da je procenat identičnosti izračunat preko pune dužine referentne nukleotidne sekvence i da su dozvoljeni međuprostori u homologu najviše 5% od ukupnog broja nukelotida u referentnoj sekvenci.
 
[0183] Polinukleotidne varijante mogu sadržati izmene u kodirajućim regionima, ne kodirajućim regionima, ili oba. U nekim slučajevima polinukleotidne varijante sadrže izmene koje stvaraju tihe supstitucije, dodavanja, ili brisanja, ali ne manjaju osobine ili aktivnosti kodirajućeg polipeptida. U nekim slučajevima, nukleotidne varijante su dobijene tihim supstitucijama na osnovu degeneracije genetičkog koda. Polinukleotidne varijante mogu biti dobijene za niz razloga, npr., da se optimizuje kodonska ekspresija za određenog domaćina (izmenjeni kodoni u humanoj mRNK prema onima poželjnim od strane bakterijskog domaćina kao što je E. coli).
 
[0184] Polipeptidi predmetnog pronalaska mogu biti rekombinovani polipeptidi, prirodni polipeptidi, ili sintetički polipeptidi koji sadrže antitelo, ili njihovi fragmenti, protiv ne-ligandne vezujuće membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. U tehnici će biti prepoznatljivo da neke amino kiselinske sekvence pronalaska mogu biti raznolike bez značajnog efekta strukture ili funkcije proteina. Prema tome, pronalazak dalje obuhvata varijante polipeptida koje pokazuju značajnu aktivnost ili koje obuhvataju regione antitela, ili njihove fragmente, protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora. Takvi mutanti obuhvataju brisanje, ubacivanje, inverzije, ponavljanje, i vrste supstitucije.
 
[0185] Polipeptidi i polinukleotidi predmetnog pronalaska su obezbeđeni u izolovanom obliku, a ponekad su prečišćeni do homogenosti.
 
[0186] Izolovani polipeptidi opisani ovde mogu biti proizvedeni bilo kojim pogodnim postupcima koji su poznati u tehnici. Takvi postupci se kreću od postupaka direktne sinteze proteina do konstruisanja DNK sekvence koja kodira izolovanu polipeptidnu sekvencu i iskazuje ove sekvence u pogodnom transformisanom domaćinu. Na primer, cDNK može biti dobijen skriningom humane cDNK biblioteke sa označenim DNK fragmentom koji kodira polipeptid (na primer, nukleotid SEQ ID NO: 1) i identifikuje pozitivne klonove sa autoradiografijom. Naredne runde pločnog prečišćavanja i hibridizacije su izvedene primenom uobičajenih postupaka.
 
[0187] U nekim slučajevima rekombinantog postupka, DNK sekvenca je kostruisana izolovanjem ili sintezom DNK sekvence koja kodira divlji soj proteina od interesa. Opciono, sekvenca može biti mutagenezirana sa mutagenezom određenog mesta kako bi se dobili njihovi funkcionalni analozi. (Videti, npr. Zoeller et al., 1984, Proc. -Nat Acad. Sci. USA, 81:5662-5066 i U.S. Pat. No. 4,588,585.) Drugi postupak konstrukcije DNK sekvence koja kodira polipeptid od interesa će biti hemijska siteza primenom oligonukleotidnog sintetizera. Takvi oligonukleotidi mogu biti dizajnirani na osnovu amino kiselinske sekvence željenog polipeptida i koji selektuju te kodone koji su poželjni u ćeliji domaćina gde će rekombinantni polipeptid od interesa biti dobijen.
 
[0188] Standardni postupci se mogu primenjivati na sintezu izolovane polinukleotidne sekvence koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, potpuna amino kiselinska sekvenca može biti korišćena kako bi se konstruisao pozadinsko translatorni gen. Dalje, DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni izolovani polipeptid može biti sintetizovan. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju porcije željenog polipeptida mogu biti sintetizovani i potom vezani. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5’ ili 3’ preklopa za komplementarne skupine.
 
[0189] Jednom postavljen (sintezom, mutagenezom diktiranog mesta ili drugim postupkom), mutirane DNK sekvence koje kodiraju određeni izolovani polipeptid od interesa će biti ubačen u ekspresioni vektor i operativno povezan za ekspresiono kontrolnu sekvencu određenu za ekspresiju proteina u željenom domaćinu. Odgovarajući skup može biti potvrđen nukleotidnim sekvencionisanjem, restrikcionim mapiranjem, i ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u pogodnom domaćinu. Kao što je dobro poznato iz tehnike, u cilju da se dobije visoko ekspresioni nivoi transfektovanog gena u domaćinu, gen je operativno povezan za transkripcione i translatorne ekspresione kontrolne sekvence koje su funkcionalne u ovom ekspresionom domaćinu.
 
[0190] Rekombinantni ekspresioni vektori su korišćeni da se poboljša i iskaže DNK koji kodira markere matične ćelije raka polipeptidnih fuzija. Rekombinantni ekspresioni vektori su replicirane DNK konstrukcije koje imaju sintetičke ili cDNAizvedene DNK fragmente koji kodiraju marker matične ćelije raka polipeptidne fuzije ili bioekvivalentni analogno operativno vezan za pogodne transkripcione ili translatorne regulatorne elemente izvedene iz sisarskih, mikrobnih, virusnih ili insektnih gena. Transkripciona jedinica uopšteno obuhvata skup (1) genetičkog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u genskoj ekspresiji, na primer, transkripcioni promoteri ili pojačivači, (2) strukturne ili kodirajuće sekvence koja je prepisana u mRNK i prevedena u protein, i (3) odgovarajućih transkriptivnih i translatornih inicijalnih i terminacijskih sekvenci, kao što je opisano u nastavku u više detalja. Takvi regulatorni elementi mogu obuhvatati operativnu sekvencu do kontrolne transkripcije. Sposobnost da se replicira u domaćinu, obično dodeljena od strane porekla replikacije, i selektuje gen kako bi se olakšalo prepoznavanje transformanata dodatno može biti ubačeno. DNK regioni su operativno povezani kada su funkcionalno povezani jedan za drugi. Na primer, DNK za pojedinačni protein (sekretorni lider) je operativno povezan za DNK za polipeptid ukoliko je iskazan kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter je operativno povezan za kodirajuću sekvencu ukoliko kontroliše transkripciju sekvence; ili ribozomsko mesto vezivanja je operativno povezano za kodirajuću sekvencu ukoliko je pozicioniran tako da dozvoli translaciju. Uopšteno, operativno vezan označava susedni i, u slučaju sekretornih lidera, označava susedni i čitajući okvir. Strukturni elementi koji su namenjeni za primenu u kvašćevom ekspresionom sistemu obuhvata vodeću sekvencu koja omogućava vanćelijsku sekreciju traslatornog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, tamo gde je protein iskazan bez vodeće ili transportne sekvence, može obuhvatati N-terminalni metionin ostatak. Ovaj ostatak može opciono biti naknadno otcepljen iz ekspresionog rekombinantnog proteina kako bi se obezbedio finalni proizvod.
 
[0191] Izbor ekspresione kontrolne sekvence i ekspresionog vektora će zavisiti od izbora domaćina. Široki spektar ekspresionih kombinacija domaćin/vektor može biti angažovan. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine, obuhvataju, na primer, vektore koji sadrže ekspresione kontrolne sekvence iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni ekspresioni vektori za bakterijske domaćine obuhvataju poznate bakterijske plazme, kao što su plazmidi iz Esherichia coli, uključujući pCR1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, i domaćine šireg spektra plazmida, kao što je M13 i filamentozne jednolančane DNK fage.
 
[0192] Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju markera proteina matične ćelije raka obuhvata prokariote, kvasac, insekt ili više eukariotske ćelije. Prokarioti obuhvataju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacili. Više eukaritoske ćelije obuhvataju ustanovljene ćelijske linije sisarskog porekla kao što je opisano u nastavku. Translacioni sistemi slobodnih ćelija takođe mogu biti obuhvaćeni. Odgovarajuće klonirajući i ekspresioni vektori za primenu sa bakterijskim, gljivičnim, kvaščevim, i sisarskim ćelijskim domaćinima su opisani od strane Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).
 
[0193] Razni sisarski ili insektni sistemi ćelijskih kultura su takođe povoljno angažovani da ekspresuju rekombinantni protein. Ekspresija rekombinantih proteina u sisarskim ćelijama može biti izvedena zbog toga što su takvi proteini uopšteno tačno preklopljeni, odgovarajuće modifikovani i potpuno funkcionalni. Primeri pogodnih sisarskih linija ćelijskog domaćina obuhvata COS-7 linije bubrežnih ćelija majmuna, opisani od strane Gluzman (1981, Cell, 23:175), i ćelijske linije sposobne da ekspresuju odgovarajući vektor koji obuhvata, na primer, L ćelije, C127, 3T3, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa i BHK. Sisarski ekspresioni vektori mogu obuhvatati netranskriptovane elemente kao što su poreklo replikacije, pogodni promoter i pojačano vezivanje za gen kako bi bio ekspresovan, i druge 5’ ili 3’ bočne netraskriptovane sekvence, i 5’ ili 3’ netraslatorne sekvence, kao što su neophodna ribozomska mesta vezivanja, poliadenilaciono mesto, spojeni donor i akceptorska mesta, i transkripcione krajnje sekvence. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u insektnim ćelijama su pregledan od strane Luckow i Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47.
 
[0194] Proteini dobijeni transformisanim domaćinom mogu biti prečišćeni prema bilo kom pogodnom postupku. Takvi standardni postupci obuhvataju hromatografiju (npr., jonska razmena, sposobnost i dimenzionisanje kolonskom hromatografijom), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost, ili bilo koju drugu standardnu tehniku za proteinsko prečišćavanje. Oznake afiniteta kao što je heksahistidin, maltoza vezujući domen, influentna presvučena sekvenca i glutation-S-transferaza mogu biti vezane za protein kako bi dozvolili lakše prečišćavanje prolaskom preko odgovarajuće kolone. Izolovani proteini mogu takođe biti fizički okarakterisani primenom takvih tehnika kao što je proteoliza, nuklearna magnetna rezonanca i kristalografija x-zrakom.
 
[0195] Na primer, supernatanti iz sistema koji luče rekombinantni protein u kulturnom medijumu mogu biti prvo koncentrovani primenom komercijalno dostupnog proteinskog koncentracionog filtera, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Prateći koncentracioni korak, koncentrat može biti primenjen do pogodnog matriksa prečišćavanja. Alternativno, jonska razmena može angažovati, na primer, matriks ili supstrat koji ima pendant dietilaminoetil (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaros, dekstran, celuloza ili druge vrste uobičajeno angažovane u proteinskom prečišćavanju. Alternativno, korak katjonske razmene može biti angažovan. Pogodne katjonske razmene obuhvataju razne ne rastvorljive matrice koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. Konačno, jedan ili više koraka reverzno fazne performance tečne hromatografije (RP-HPLC) angažuje hidrofobni RP-HPLC medij, npr., silika gel koji ima pandam metila ili drugih alifatičnih grupa, koji može biti angažovan za dalje prečišćavanje rekombinantnog proteina ili protein-Fc kompozicije matične ćelije raka. Neki ili svi prethodno navedeni koraci prečišćavanja, u raznim kombinacijama, mogu takođe biti angažovani da obezbede homogeni rekombinantni protein.
 
[0196] Rekombinantni protein dobijen u bakterijskoj kulturi je obično izolovan sa početnom ekstrakciom iz ćelijskih pelata, praćen sa jednom ili više koncentracija, isoljavanja, vodene jonske razmene ili koracima eksluzione hromatografije. Tečna hromatografija visoke performance (HPLC) može biti korišćena za finalne korake prečišćavanja. Mikrobijalne ćelije angažovane u ekspresiji rekombinantnog proteina može biti prekinuta sa bilo kojim uobičajenim postupkom, uključujući ciklizaciju zamrzavanje odmrzavanje, sonizacija, mehaničko prekidanje, ili primena ćelijskih lizirajućih postupaka.
 
[0197] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za inhibiciju rasta kancerogenih ćelija iskazujući marker matične ćelije raka primenom antagonista markera matične ćelije raka koji su opsani ovde. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta kancerogenih ćelija koje iskazuju marker matične ćelije raka, na primer Notch1 receptor, obuhvata kontaktiranje ćelije sa antagonistom protiv marker matične ćelije raka in vitro. Na primer, imortalizovana ćelijska linija ili ćelijska linija raka koja iskazuje marker matične ćelije raka u medijumu kome je dodat antagonist ekspresionog markera matične ćelije da inhibira rast ćelije. U nekim slučajevima, tumorne ćelije koje obuhvataju matične ćelije tumora su izolovane iz uzorka pacijenta kao što je, na primer, biopsija tkiva, pleural izlivanje, ili uzorak krvi, i kultivisane u medijumu kome je dodat antagonist markera matične ćelije raka da inhibira ćelijski rast. U nekim slučajevima, antagonist je antitelo koje posebno prepoznaje epitop proteinskog markera matične ćelije raka. Na primer, antitela protiv proteinskog markera matične ćelije raka se mogu dodati kulturnom medijumu izolovanih matičnih ćelija raka da inhibira ćelijski rast.
 
[0198] U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta kancerogenih ćelija koje iskazuju marker matične ćelije raka obuhvata kontaktiranje ćelije sa antagonistom protiv markera matične ćelije in vivo. U nekim slučajevima, postupak inhibicije rasta kancerogenih ćelija koje iskazuju Notch1 obuhvataju kontaktiranje ćelija sa antitelo koje se posebno vezuje za ne ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona humanog Notch1 receptora. U nekim slučajevima, antitelo inhibira rast kancerogenih ćelija inhibicijom ligand-indukovanog Notch1 signala. U nekim slučajevima, antitelo inhibira rast kancerogenih ćelija inhibiranjem cepanja Notch1. U nekim slučajevima, antitelo inhibira rast kancerogenih ćelija redukovanjem frekvencije ili broja matičnih ćelija u tumoru.
 
[0199] U nekim slučajevima, kontaktiranje kancerogene ćelije sa antagonistom sa markerom matične ćelije raka je preduzeto u životinjskom modelu. Na primer, ksenografti koji iskazuju marker matične ćelije raka su rasli u imunokompromizovanom mišu (npr. NOD/SCID miš) koji su primenjivali antagonist na marker matične ćelije da inhibira rast tumora. U nekim slučajevima, matične ćelije raka koje iskazuju marker matične ćelije raka su izolovane iz uzorka pacijenta kao što je, na primer, biopsija tkiva, pleural izlivanje, i ubrizgavan u imunokompromizovane miševe koji su potom primenjivali antagonist protiv markera matične ćelije raka da inhibira rast tumorne ćelije. U nekim slučajevima, antagonist markera matične ćelije raka je primenjivan u isto vreme ili kratko posle ubacivanja kancerogenih ćelija u životinju kako bi se sprečio tumorni rast. U nekim slučajevima, antitelo protiv markera matične ćelije raka se primenjuje kao terapeutski agens kada su kancerogene ćelije porasle do određene veličine.
 
[0200] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela, polipeptide ili druge agense koji ciljaju marker matične ćelije raka. Ove farmaceutske kompozicije su našle primenu u inhibiciji rasta tumora, rasta tumornih ćelija i lečenju raka kod ljudskih pacijenata.
 
[0201] Formulacije su pripremljene za skladištenje i korišćene kombinovanjem prečiščavajućih antagonista (npr., antitelo) predmetnog pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim nosačem (npr., nosačem, ekscipijensom, itd.)(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na, netoksične pufere kao što je fosfat, citrat, i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidansi koji uključuju aksorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što je metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol; polipeptidi male molekulske mase (manje od oko 10 amino kiselinskih ostataka); proteini kao što je serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; amino kiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; ugljohidrati kao što je monosaharid, disaharid, glukoza, manoza, ili dekstrin; helatni agensi kao što je EDTA; šećeri kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra jon koji obrazuje soli kao što je natrijum; metalni kompleksi kao što je Zn-protein kompleksi; i/ili ne jonske površinske supstance kao što je TWEEN ili polietilen glikol (PEG).
 
[0202] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska se može primenjivati na mnogo načina ili za lokalno ili sistemsko lečenje. Primena može biti lokalna (kao što je na sluznici koja uključuje vaginalno i rektalno nanošenje) kao što su transdermalni flasteri, masti, losioni, kreme, gelovi, kapi, supozitoriji, sprejevi, tečnosti i praškovi; pulmonarna kao što je inhalacijom ili uduvavanje praškova ili aerosolova (uključujući sa raspršivačem), intratrahealna, intranazalna, epidermalna i transdermalna; oralna; parenteralna uključujući intravenozno, intraarterijalno, intratumoralno, podkožno, intraperitonealno ili intramuskularno ubrizgavanje ili infuziju; ili intrakranialna kao što je asintratekalno ili intraventrikularno.
 
[0203] Terapeutska formulacija može biti u jediničnom doznom obliku. Takve formulacije obuhvataju tablete, pilule, kapsule, praškovi, granule, rastvore ili suspenzije u vodi ili ne vodenom medijumu, ili supozitorije za oralnu, parenteralnu, ili rektalnu primenu ili za primenu inhalacijom. U čvrstim kompozicijama kao što su tablete, glavni aktivni sastojak je smeša sa farmaceutskim nosačem. Konvencionalni tabletni sastojci obuhvataju kukuruzni skrob, laktozu, saharozu, sorbitol, talk, stearinska kiselina, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat ili guma, i druge razblaživače (npr., voda) kako bi obrazovali čvrstu performulacijsku kompoziciju koja sadrži homogenu smešu jedinjenja predmetnog pronalaska, ili njihovu ne-toksičnu farmaceutsku prihvatljivu so. Čvrsta preformulacijska kompozicija je potom podeljena u jedinične dozne formulacije tipa koji je ovde opisan. Tablete, pilule, itd. nove kompozicije mogu biti obložene ili drugačije sastavljene tako da obezbedi dozni oblik koji pruža prednosti produženog dejstva. Na primer, tableta ili pilula može sadržati unutrašnju kompoziciju obloženu drugom komponentom. Dalje, dve komponente mogu biti odvojene sa enteričnim slojem koji služi da pruži otpor dezintegracije i dozvoli unutrašnjoj komponenti da prođe netaknuta kroz stomak ili da bude odložena u otpuštanju. Različiti materijali mogu biti korišćeni za takve enterične slojeve ili obloge, takvi materijali koji obuhvataju veći broj polimernih kiselina i smeša polimernih kiselina sa takvim materijalima kao šelak, cetil alkohol i celuloza acetat.
 
[0204] Farmaceutske fomrulacije obuhvataju antitela predmetnog pronalaska kompleksiranog sa lipozomima (Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030; i U.S. Patents 4,485,045 i 4,544,545). Lipozomi sa povećanim vremenom cirkulacije su opisani u U.S. Pat. Br. 5,013,556. Neki lipozomi mogu biti generisani reverzno faznim uparavanjem sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol, i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi su propušteni kroz filtere definisane veličine pore kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom.
 
[0205] Antitela mogu takođe biti zarobljena u mikrokapsule. Takve mikrokapsule su dobijene, na primer, tehnikama fazne separacije ili međuprostornom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatinizovane mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima davanja leka (na primer, lipozomi, albumin mikrosfera, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u mikroemulzijama kao što je opisano u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).
 
[0206] Dodatno mogu se dobiti i preparati sa kontinuiranim otpuštanjem. Pogodni primeri preparata sa kontinuiranim otpuštanjem obuhvataju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitela, čije matrice su u obliku oblikovanih članova (npr. filmova, ili mikrokapsula). Primeri matrica sa kontinuiranim otpuštanjem obuhvataju poliestre, hidrogelove kao što je poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(v nilalkohol), polilaktide (U.S. Patent 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i 7 etil-L-glutamata, ne-degradabilne etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT TM (ubrizgavajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetat), saharoza acetat izobutirat, i poli-D(-)-3-hidroksibuterna kiselina. U nekim slučajevima antitela se mogu koristiti kako bi se lečila razna stanja okarakterisana sa ekspresijom i/ili povećanim odgovorom ćelija na marker matične ćelije raka. Posebno je predviđeno da će se antitela protiv markera matične ćelije, na primer Notch1, koristiti za lečenje proliferativnih poremećaja koji uključuju, ali nisu ograničena na, benigne i maligne tumore bubrega, jetre, bešike, dojke, stomaka, jajnika, debelog creva, rektuma, prostate, pluća, stidnice, tiroidne žlezde, glave i vrata, mozga (glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, itd), krvi i limfe (leukemija i limfoma).
 
[0207] U nekim slučajevima, lečenje obuhvata kombinovanu primenu antitela ili drugog agensa predmetnog pronalaska i hemoterapeutskog agensa ili koktela više različitih hemoterapeutskih agenasa. Lečenje sa antitelom se može desiti pre, istovremeno sa, ili posle primene hemoterapija. Hemoterapije obuhvaćene sa pronalaskom obuhvataju hemijske supstance ili lekove koji su poznati u tehnici i komercijalno su dostupni, kao što je doksorubicin, 5-fluorouracil, citosin arabinozid ("Ara-C"), ciklofosfamid, tiotepa, busulfan, citoksin, taksol, metotreksat, cisplatin, melfalan, vinblastin i karboplatin. Kombinovana primena može uključivati istovremenu primenu, ili u pojedinačnoj farmaceutskoj formulaciji ili primenom odvojenih formulacija, ili uzastopnu primenu u bilo kom redosledu, ali uopšteno unutar vremenskog perioda tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno ispoljavati svoje biološke aktivnosti. Priprema i redosled doziranja za takve hemoterapeutske agense može se koristiti prema instrukcijama proizvođača ili je određeno empirijski. Priprema i redosled doziranja za takvu hemoterapiju su takođe opisani u Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
 
[0208] Hemoterapeutski agensi korisni u predmetnom pronalasku takođe obuhvataju, ali nisu ograničeni na, alkilatne agense kao što je tiotepa i ciklofosfamid (Citoksan); alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbohion, meturedopa, i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaoramid i trimetilolomelamim nitrogen mustarde kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil mustard; nitrosuree kao što su carmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su aklacinomisini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, cactinomicin, caliheamicin, carabicin, caminomicin, carzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, ezorubicin, idarubicin, markelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što je metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgene kao što su calusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenaline kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljače folne kiseline kao što su frolinilna kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demecolcin; diazihion; elformitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK.; razoksan; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazihion; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paclitaksel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platinuma kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platinum; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vincristin; vinorelbin; navelbin; novantron; teniposid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT11; topoizomeraza inhibitor RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoinska kiselina; esperamicini; kapecitabin; i farmaceutske prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kojih prethodno navedenih. Hemoterapeutski agensi takođe obuhvataju anti-hormonalne agense koji deluju tako da regulišu ili inhibiraju dejstvo hormona na tumorima kao što su anti-estrogeni koji obuhvataju na primer tamoksifen, raloksifen, aromataza inhibirajući 4(5)-imidazoli, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i toremifen (Fareston); i antiandrogene kao što su flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid, i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kojih prethodno navedenih.
 
[0209] U nekim slučajevima, hemoterapeutski agens je topoizomeraza inhibitor. Topoizomeraza inhibitori su hemoterapeutski agensi koji se mešaju sa dejstvom enzima topoizomeraza (npr., topoizomeraza I ili II). Inhibitori topoizomeraze obuhvataju, ali nisu ograničeni na, doksorubicin HCL, daunorubicin citrat, mitoksantron HCL, actinomicin D, etoposid, topotekan HCL, tenipozid (VM-26), i irinotecan.
 
[0210] U nekim slučajevima, hemoterapeutski agens je anti-metabolitski. Anti-metabolit je hemijski sa strukturom koja je slična metabolitu potrebnom za normalne biohemijske reakcije, a ipak dovoljno različite da deluju sa jednom ili više normalnih funkcija ćelija, kao što je deoba. Anti-metaboliti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, gemcitabin, fluorouracil, kapecitabin, metotreksat natrijum, ralitreksed, Pemetreksed, tegafur, citozin arabinozid, Tioguanin (GlaxoSmithKline), 5-azacitidin, 6-merkaptopurin, azatioprin, 6-tioguanin, pentostatin, fludarabin fosfat, i cladribin, kao i famaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivati bilo kojih prethodno navedenih.
 
[0211] U nekim slučajevima, lečenje obuhvata kombinovanu primenu antitela ili drugog agensa predmetnog pronalaska i terapije zračenja. Lečenje sa atitelom može se desiti pre, u toku sa, ili posle primene terpaije zračenja. Bilo koji rasporedi doziranja takve terapije zračenja se mogu koristiti kao što je određeno od strane stručnog praktičara.
 
[0212] U nekim slučajevima, lečenje može obuhvatati kombinovanu primenu antitela predmetnog pronalaska sa drugim antitelima protiv dodatnih tumornih povezanih antigena koji uključuju, ali nisu organičeni na, antitela koja se vezuju za EGF receptor (EGFR) (Erbitux®), erbB2 receptor (HER2) (Herceptin®), i vaskularnim endotelijalnim faktorom rasta (VEGF) (Avastin®). Dalje, lečenje može obuhvatati primenu jednog ili više citokina; može biti praćeno hiruškim uklanjanjem ćelija raka; i/ili bilo kojom drugom terapijom koja se smatra neophodnom od strane lekara.
 
[0213] Za lečenje oboljenja, odgovarajuća doza antitela ili drugog agensa predmetnog pronalaska zavisi od vrste oboljenja koje se leči, ozbiljnosti i toka bolesti, odgovora oboljenja, da se antitelo primenjuje za terapeutske ili preventivne svrhe, prethodnog lečenja, istorije bolesti pacijenta, i tako dalje sve u diskreciji lekara. Antitelo ili agens se može primenjivati na vreme ili tokom serije tretmana koja traju od sedam dana do nekoliko meseci, ili dok izlečenje nije uočeno ili umanjeno stanje oboljenja nije postignuto (npr. redukcija u veličini tumora). Optimalno doziranje može biti izračunato iz merenja akumulacije leka u telu pacijenta i zavisiće pre svega od relativne snage pojedinačnog antagoniste. Lekar može lako da odredi optimalnu dozu za uzimanje, metodologiju doziranja i stope ponavljanja. Uopšteno, doziranje je od 0.01 µg do 100 mg po kg telesne težine, i može biti data jednom ili više puta na dan, nedeljno, mesečno ili godišnje. Lekar može da proceni stopu ponavljanja za doziranje zasnovano na merenju vremena prebivališta i koncentracije antitela u telesnim tečnostima ili tkivima.
 
[0214] Predmetni pronalazak obezbeđuje opremu koja obuhvata antitela koja su ovde opisana i koja se mogu koristiti kako bi se izveli postupci pronalaska opisani ovde. U nekim slučajevima, oprema obuhvata bar jedno prečišćeno telo protiv markera matične ćelije raka, u jednoj ili više posuda. U nekim slučajevima, oprema obuhvata bar jedno prečišćeno antitelo protiv neligandne vezujuće membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora, u jednoj ili više posuda. U nekim slučajevima, oprema obuhvata antitelo 52M51 ili humanizovanu varijantu 52M51. U nekim slučajevima, oprema obuhvata antitelo 52R43. U nekim slučajevima, opreme sadrže sve komponente neophodne i/ili dovoljne da se izvede analiza detekcije, uključujući sve kontrole, uputstva za izvođenje analize, i bilo koji neophodan softver za analizu i prikazivanje rezultata. Stručna osoba u tehnici će lako prepoznati da prikazana antitela predmetnog pronalaska mogu biti lako ikorporirana u jedno od ustanovljenih formata opreme koja su dobro poznata u tehnici.
 
[0215] U nekim slučajevima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak identifikacije molekula koji se vezuje za neligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona van
ćelijskog domena humanog Notch1 receptora i inhibira rast tumora, postupak obuhvata: i) inkubaciju molekula sa neligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora; ii) utvrđivanje da li se molekul vezuje za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch receptora; i iii) utvrđivanje da li molekul inhibira rast tumora. Molekuli koji posebno vezuju membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, polipeptide i antitela.
 
[0216] Skrining može biti izveden primenom bilo kog pogodnog postupka koji je poznat u tehnici. U nekim slučajevima, skrining se izvodi in vitro. U nekim slučajevima, ćelije koje izražavaju ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog region vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora su inkubirane sa označenim molekulom i posebno vezivanje označenog molekula za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je utvrđeno sa FACS analizom. U nekim slučajevima, ne-ligandno vezujuća membrana proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je iskazana sa fagnim displejem, i molekuli koji se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptor su identifikovani. Drugi pogodni postupci za identifikovanje molekula koji se posebno vezuju za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona humanog Notch1 receptora obuhvata, ali nije ograničen na, ELISA; Western (ili imuno) upijanje; i kvasac-dva-hibrid.
 
[0217] Molekuli koji se posebno vezuju za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora su potom testirani na inhibiciju rasta tumorne ćelije. Testiranje može biti izvedeno primenom bilo kog pogodnog postupka koji je poznat u tehnici. U nekim slučajevima, molekuli koji se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora su testirani na sposobnost da se inhibira rast tumora in vitro. U nekim slučajevima, molekuli koji posebno vezuju membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora su inkubirani sa ćelijama tumora u kulturi i proliferacija tumornih ćelija u prisustvu molekula koji posebno vezuju membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je utvrđena i upoređena sa inkubiranim ćelijama tumora sa ne-ligandnim vezujućim molekulom. U nekim slučajevima, molekuli koji se posebno vezuju za ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora su testirani na sposobnost da inhibiraju rast tumora in vivo. U nekim slučajevima, molekuli koji posebno vezuju membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora su ubrizgani u životinjski ksenograft model i rast tumora kod lečenih životinja sa molekulima koji se posebno vezuju za membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 receptora je utvrđen i poredi se sa životinjama lečeni sa ne-vezujučim kontrolnim molekulom.
 
PRIMERI
 
Primer 1
 
[0218] Antitela su generisana protiv ne-ligandnog vezujućeg regiona Notch1, prvenstveno ne-ligandno vezujuće membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena. U nekim rešenjima, rekombinantni polipeptidni fragmenti humanog Notch1 vanćelijskog domena su generisani kao antigeni za proizvodnju antitela. Standardna rekombinantna DNK tehnologija je korišćena da se izoluju polinukleotidi koji kodiraju membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 amino kiselina 1427-1732 (SEQ ID NO: 1). Ovi polinukelotidi su odvojeno vezani u okviru N terminala za humani Fc i histidin oznaku i klonirani u transferni plazmidni vektor za bakulovirus-posrednu ekspresiju u insektnim ćelijama. Standardna transfekcija, infekcija, i ćelijski kultruni protokoli su korišćeni za dobijanje rekombinantnih insektnih ćelija koje iskazuju odgovarajući Notch1 polipeptid koji odgovara membrani proksimalnog regiona koji sadrži amino kiseline 1427-1732 (SEQ ID NO: 2) (O’Reilly et al., 1994, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press).
 
[0219] Notch1 membraa proksimalnog regiona (Notch1 amino kiseline 1472-1732) polipeptida je prečišćena iz insektnih ćelijskih lizata primenom proteina A i Ni++-helatne sposobnosti hromatografije koje su poznate obučenom stručnjaku iz tehnike. Prečišćena Notch1 membrana proksimalnog regiona polpeptida je dializovana protiv PBS (pH=7), koncentrovan do približno 1 mg/ml, i sterilno filtriran u prirpemi za imunizaciju.
 
[0220] Miševi (n=3) su imunizirani sa prečišćenim antigenskim proteinom (Rastvori Antitela; Mountain View, CA) primenom standardnih tehnika. Krv iz pojedinačnih miševa je skenirana približno 70 dana posle početne imunizacije za antigensko prepoznavanje primenom ELISA i FACS analiza (kao što je ovde opisano). Dve životinje sa najvišim titrima antitela su odarbane za finalno antigensko pojačanje posle čega su ćelije jetre izolovane za hibridomsko dobijanje. Hibridomske ćelije su obložene na 1 ćeliji po bunarčiću na ploči od 96 bunarčića, i supernatant iz svakog bunarčića skrinovan sa ELISA i FACS analizom protiv Notch1 membrane proksimalnog regiona polipeptida. Nekoliko hibridoma sa visokim antitelnim titrom je selektovano i uvećano u statičnoj kulturnoj boci. Antitela su prečišćena iz supernatantnog hibridoma primenom proteina A ili proteina G agarozne hromatografije. Prečišćena monoklonalna antitela su testirana ponovo sa FACS kao što je ovde opisano. Nekoliko antitela koja prepoznaju membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 je izolovan. Hibridomska ćelijska linija koja iskazuje antitelo 52M51 je deponovano sa ATCC pod uslovima Budimpeštanskog Sporazuma 7. Avgusta, 2008 i dodeljen ATTC Patent Depozitna Oznaka PTA-9405. Nukleotid i predviđene proteinske sekvence oba teškog lanca (SEQ ID NO: 9 i 10) i lakog lanca (SEQ ID NO: 3 i 4) antitela 52M51 su utvrđene.
 
Humana Antitela
 
[0221] U alternativnim rešenjima, humana antitela koja posebno prepoznaju ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch1 receptora su izolovani primenom fagne displej tehnologije. U izvesnim rešenjima, sintetička antitelna biblioteka koja sadrži humane antitelne varijabilne domene je skenirana za određeno i visoko afinitetno prepoznavanje Notch receptorskog antigena opisanog ovde. U izvesnim rešenjima, humana Fab fagna displejna biblioteka je skenirana primenom serije rekombinantnih proteina koji sadrže ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena Notch 1 receptora. Ukratko, 2x1013 Fab koji prikazuje fagne čestice su inkubirane sa rekombinantnim proteinom (pasivno imobilisan) u prvoj rundi, ne-specifične fage su isprane, i potom specifične fage su elirane sa ili niskom pH (ćelije) ili DTT (rekombinantni protein). Eluirani učinak je korišćen kako bi se inficirala TG1 F+ bakterija, spašena sa pomoćnom fagom, i potom Fab prikaz induciran sa IPTG (0.25 mM). Ovaj postupak je ponovljen za dve dodatne runde i potom treća runda je prikazana u ELISA protiv pasivnog imobilizovanog antigena (5 µg/ml).
 
[0222] CDR kasete u biblioteci su posebno zamenjene preko jedinstvenih mesta bočne restrikcije za optimizaciju antitela. Optimizovani humani varijabilni regioni su potom klonirani u Ig ekspresionom vektoru koji sadrži humani IgG1 teški lanac i kapa laki lanac za ekspresiju humanih antitela u CHO ćelijama.
 
Mapiranje Epitopa
 
[0223] Kako bi identifikovali antitela koja prepoznaju posebno ne-ligandno vezujuću membranu proksimalnog regiona Notch1 receptora vanćelijskog domena, mapiranje epitopa je izvedeno. U izvesnim rešenjima, ekspresioni plazmidni vektori sisara koji sadrži CMV promoter gornjeg toka polinukleotida koji kodiraju fragmente vanćelijskog Notch1 domena kao Fc fuzioni proteini se generišu korišćenjem standardne rekombinantne DNK tehnologije. U nekim rešenjima, mapiranje epitopa 52M serije ne-ligandno vezujućeg regiona antitela je učinjeno korišćenjem serija spojenih proteina i brisanjem membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 iz oko 1427 amino kiseline do oko 1732 amino kiseline. Ovi rekombinantni spojeni proteini su iskazani u prolazno transfektovanim HEK 293 ćelijama iz kojih je kondicioni medijum prikupljen 24 do 48 sati post-transfekcije za ELISA.
 
[0224] U nekim rešenjima, Notch1 spojeni proteinski fragmenti su odvojeni na SDS-PAGE gelovima i sondirani sa oba anti-Fc antitela kako bi se detektovalo prisustvo svih spojenih proteina nasuprot anti-Notch1 antitela kako bi se detektovali domeni prepoznati sa svakim anti-Notch antitelom.
 
[0225] Kako bi se identifikovali specifični epitopi unutar vanćelijskih domena prepoznati od strane antigena protiv Notch1, korišćen je SPOTs sistem (Sigma Genosys, The Woodlands, TX). Serija od 10 ostataka linearnih peptida koji se preklapaju sa jednom amino kiselinom i pokrivaju celokupni Notch1 vanćelijski domen je sintetizovana i kovalentno vezana za celuloznu membranu sa SPOT sinteznom tehnikom. Membrana je preinkubirana 8 sati na sobnoj temperaturi sa blokirajućim puferom i hibridizovana sa antitelom preko noći na 4°C. Memebrana je potom isprana, inkubirana sa sekundarnim antitelom, konjugirana do ren peroksidaze (HRP) (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ), ponovo isprana, i vizualizovana sa signalno razvojnim rastvorom koji sadrži 3-amino-9-etilkarbazol. Potom su prema tome utvrđeni posebni epitopi prepoznatih antitela.
 
Himerna antitela
 
[0226] Posle su identifikovana monoklonalna antitela koja posebno propoznaju ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog domena vanćelijskog domena Notch1 receptora, ova antitela su modifikovana da prevaziđu humani antimišiji antitelni (HAMA) imuni odgovor kada su korišćena antitela glodara kao terapeutski agensi. Varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca odabranog monoklonalnog antitela su izolovani sa RT-PCR iz hibridomskih ćelija i ligirani u okviru humanog IgG1 teškog lanca i kapa lakog lanca konstantnih regiona, respektivno, u sisarskim ekspresionim vektorima. Alternativno, humani Ig ekspresioni vektor kao što je TCAE 5.3 je korišćen da sadrži humani IgG1 teški lanac i kapa laki lanac konstantnih regionskih gena na istom plazmidu (Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66:4137-42). Ekspresioni vektori koji kodiraju himarne teške lance i lake lance su potom ko-transfektovane u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) za himerni antitelni proizvod. Imunoreaktivnost i afinitet himernih antitela se poredi sa srodnim mišijim antitelima sa ELISA i FACS.
 
Humanizovana antitela
 
[0227] Pošto su himerni antitelni terapeutici još uvek često antigenska, koja proizvode humani anti-himerni antitelni (HACA) imuni odgovor, himerna antitela protiv ne-ligandne vezujuće membrane proksimalnog domena vanćelijskog domena Notch1 receptora može zahtevati dalju humanizaciju. Kako bi se generisala humanizovana antitela tri kratke hipervarijabilne sekvence, ili komplementarno utvrđeni regioni (CDRs), himerna antitela teškog i lakog lanca varijabilnih domena prethodno opisani, su angažovani primenom rekombinantne DNK tehnologije u varijabilni domenski okvir sekvenci humanog teškog i lakog lanca, respektivno, i potom klonirani u sisarski ekspresioni vektor za ekspresiju u CHO ćelijama. Imunoreaktivnost i afinitet humanizovanih antitela se poredi sa srodnim himernim antitelima sa ELISA i FACS. Dodatno, mutageneza diktiranog mesta ili visoke gustine varijabilnog regiona se može koristiti da optimizuju specifičnost, afinitet, itd. himanizovanog antitela.
 
 
 
Primer 2
 
[0228] Humanizovana antitela protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 su generisani. Varijabilni domeni mišijeg monoklonarnog antitela 52M51 su izolovani i sekvencionirani iz hibridomske linije primenom degenerativnog PCR u suštini opisanog u Larrick, J.M., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250 and Jones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio/Technology 9: 88. Humani teški i laki lanac varijabilnog okvira regiona će verovatno biti strukturno slični u odnosu na srodne 52M51 antitelne amino kiselinske sekvence koje se potom smatraju kao referenca humanih okvirnih regiona da pomognu da vode dizajn novih sintetičkih okvira. Kako bi se identifikovali humani okvirski regioni koji drže sličnost sa 52M51 mišijim okvirima, predviđene proteinske sekvence kodirane sa VH i VL mišijim varijabilnim domenima 52M51 se porede sa humanim antitelnim sekvencama kodirane sa ekspresionim humanim cDNK korišćenjem BLAST pretraživača za humanu sekvencu deponovanu u Genbanku. Korišćenjem ovog modela, ekspresione humane cDNK sekvence (npr. genbanka DA975021, DB242412) i germlinskih Vh domena (npr. IGHV1-24) su odabrani za dalju analizu u obrazovanju okvira teškog lanca. Slično, ekspresione humane cDNK sekvence (npr. genbanka CD709370, CD707373) i germlinije V1 (npr. IGLV7-46, IGLV8-61) se smatraju u obrazovanju okvira lakog lanca.
 
[0229] Amino kiselinske razlike između kandidatnog humanizovanog okvira teških lanaca i srodnog mišijeg monoklonalnog antitela 52M51 teškog lanca varijabilnog domena i lakog lanca varijabilnih domena su procenjeni za slične važne, i procene da li svaka razlika u poziciji doprinosi pravilnom preklapanju i funkciji varijabilnog domena. Ova analiza je vođena ispitivanjem čvrstih kristalnih kristala drugih fragmenata antitela (npr., struktura Fab 2E8 kao što je opisano u Trakhanov et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999, 55:122-28, kao i druge proteinske strukturne kristale (npr., proteinska baza podata struktura 1ADQ i 1GIG)). Strukture su modelirane korišćenjem kompjuterskog softvera koji obuhvata Jmol, brz PDB, i Pymol. Značaj je dat potencijalnom uticaju amino kiseline na datom položaju na pakovanju β-liste okvira, interakcija između varijabilnih domena teškog i lakog lanca, stepen rastvorljivosti izlaganja amino kiselinskog bočnog lanca, i verovatnoća da će amino kiselina da utiče na poziciju CDR petlji. Iz ove analize, devet kandidata VH lanaca spojeni u okvir za humani IgG2 konstantni region i osam kandidata V1 lanaca spojeni u okvir sa humanim IgLC1 konstantnim regionom su zamišljeni i hemijski sintetizovani. Kandidati imaju teške lance koje obuhvataju: i) sintetički okvir dizajniran da liče prirodnim humanim okvirima i ii) srodno 52M51 mišije antitelo CDRs.
 
[0230] Funkcionalnost svake varijante kandidata humanizovanog teškog i lakog lanca je testirana sa kotransfekcijom u ćelijama sisara. Svaki od devet kandidata humanizovanih 52M51 teških lanaca opisani prethodno je kotransfektovano u HEK 293 ćelije sa mišijim 52M51 lakim lancem cDNK, i uslovni medijum je analiziran sa ELISA za Notch1 vezujuću aktivnost. 52M51 varijanta teškog lanca koja pokazuje najenergičnije vezivanje je odabrana. Ova varijanta "52M51-H4" (SEQ ID NO: 22) sadrži, u odnosu na mišiju CDRs, varijacije na 3 poziciji okvira sa Vh okvirom, Kabat pozicije 20, 48, i 71 u poređenju sa primerom humanog okvira (npr. IGHV1-24). 52M51-H4 humanizovani teški lanac je potom kotransfektovan u HEK293 ćelije sa svakim od osam kandidata humanizovanih lakih lanaca, uslovni medijum je ponovo analiziran na antigensko vezivanje sa ELISA. Dve varijane lakog lanca "2M51 L3" (SEQ ID NO: 26) i "52M51 L4" (SEQ ID NO: 30) su pronađene da pokazuju bolje vezivanje nego drugi kandidati i izabrani su za dalje studiranje. Varijanta 52M51-L3 sadrži, u odnosu na mišiju CDRs, varijaciju na 1 poziciji okvira na Kabat poziciji 49 u poređenju sa primerom humanog okvira (npr., IGLV7-46). Dve varijante humanizovanih antitela, 52M51H4L3 i 52M51H4L4, su razvijene. 52M5H4L3, kao kodirana sa DNK deponovana sa ATCC, pod uslovima Budipeštanskog Sporazuma 15 Oktobra, 2008, i dodljen je naznačeni broj PTA-9549.
 
[0231] Afiniteti humanog i mišijeg Notch1 su određeni primenom Biacore 2000 instrumenta. Ukratko, rekombinantni humani i mišiji Notch1 proteini su imobilisani na CM5 čipu korišćenjem standardne aminske osnovne hemije (NHS/EDC). Različite koncentracije antitela su ubrizgane preko proteinskih površina i kinetički podaci su prikupljeni tokom vremena. Podatak je podešen primenom simultane globalne podešavajuće jednačine kako bi se dobile konstante odvajanja (KD, nM) za svaki Notch1 (Tabela 2).
 
Tabela 2
IgG Konstatnte Odvajanja (KD)
Antitelo
Humani Notch1 (nM)
Mišiji Notch1 (nM)
52M51
2.86
NB
52M51H4L3
4.33
NB
52M51H4L4
7.35
NB
 
Primer 3
 
Notch Receptorsa Signalizacija
 
[0232] U nekim rešenjima, određena je sposobnost antitela Notch1 receptora da blokira ligandno posredovanje Notch signala. U nekim rešenjima, HeLa ćelije konstruisane da prekomerno iskažu Notch1 (Notchl-Hela) kultivisane u DMEM suplementu sa antibioticima i 10% FCS je ko-transfektovano sa 1) pGL4 8X CBS luciferaze svica koji sadrži Notch odgovorni promoterni gornji tok luciferaze svica promoter reportnog gena da izmeri Notch signalne nivoe u odgovoru na DLL4 ligand; i 2) Renilla luciferaza reporter (Promega; Madison, WI) kao unutrašnja kontrola za transfekcionu efikasnost. Transfektovane ćelije su dodate kultivisanim pločama presvučene preko noći sa 200 ng/bunarčića hDLL4-fc proteina, i antitela na Notch1 su potom dodata kulturnom ćelijskom medijumu. 48 sati preteći transfekciju, nivoi luciferaze su izmereni primenom opreme za dvostruku analizu luciferaze (Promega; Madison, WI) sa aktivnošću luciferaze svica normalizovan na aktivnost Renilla luciferaze. Sposobnost antitela da inhibira putanju aktivnosti Notch1 je potom određena. Antitela 52M51, 52M63, 52M74, i 52M80, generisana protiv membrane proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 (Fig. 1A) značajno smanjuje aktivnost luciferaze koji ukazuje na smanjenje Notch1 signala kada se poredi sa drugim Notch1 antitelima (Fig. 1B). Dalje, humanizovana varijanta antitela 52M51, varianta 52M51 H4/L3 pokazuje sličnu potentnost u smanjenju aktivnosti luciferaze (Fig. 1C).
 
Notch Receptorska Aktivnost i ICD Formacije
 
[0233] Odvajanje Notch receptora od strane furina, ADAM, i gama-sekretaze rezultuje u formiranju Notch intraćelijskog domena (ICD) koji potom aktivira donji tok Notch signala u nukleusu. U nekim rešenjima, sposobnost antitela Notch1 receptora da blokira ligandno posredovanu receptorsku aktivnost je određena sa analizom Western blot. Notch1-Hela ćelije su rasle u suspenziji kulture u 293-SMII medijumu (Gibco). Kultivisane ćelije su prebačene u ploču sa 96 bunarčića gde su odabrani bunarčići prethodno presvučeni sa humanim DLL4-fc spojenim proteinom (2 mg/ml) u DMEM plus 2% FBS i 1 mM MG132 (Calbiochem). Antitela koja su generisana protiv membransko proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 su dodate ćelijskom kulturnom medijumu, i ćelije su inkubirane na 37°C pet sati. Bunarčići su potom aspirirani i ćelije su ponovo suspendovane u 2X SDS tekućem puferu. Uzorci su sonirani na sobnoj temperaturi, i potom podvrgnuti SDS-PAGE i Western blot analizom primenom antitelne specifičnosti za odvajanje Notch1 ICD prema preporukama proizvođača (Ćelijska Signalana Tehnologija). 52M51 zajedno sa 52M63, 52M74, i 52M80, svi značajno ihibiraju generaciju ICD posle ligandne stimulacije (Fig. 1D).
 
 
Primer 4
 
In vivo prevencija rasta tumora primenom ne-ligandnog vezujućeg regiona anti-Notch receptora antitela
 
[0234] Ćelije tumora iz uzorka pacijenta koji su prošli kao ksenograft kod miševa su pripremljeni za ubrizgavanje u eksperimentalne životinje. Tumori su ustanovljeni u OncoMed Pharmaceuticals pridržavajući se procedure koja je ranije opisana (Videti A1-Hajj et al., 2003; Dalerba et al., 2007) i obuhvata: UM-PE13 i T3 (karcinom ćelije dojke), OMPC9, OMP-C8, OMP-C6, i Colo-205 (tumorne ćelije debelog creva); i OMP-PN4 (karcinom ćelije pankreasa). Tkivo tumora je uklonjeno pod sterilnim uslovima, iseckan u male delove, usitnjen potpuno korišćenjem sterilnih oštrica, i pojedinačne suspenzije jedne ćelije dobijene enzimskim varenjem i mehaničkim prekidanjem. Rezultujući delovi tumora su izmešani sa ultra čistim kolagenom III u kulturnom medijumu (200-250 jedinice kolagena po mL) i inkubirani na 37°C 3-4 sata sa pipetiranjem gore i dole kroz 10-mL pipetu svakih 15-20 min. Svarene ćelije su filtrirane kroz 45 ul najlonsku mrežu, isprane sa RPMI/20% FBS, i isprane dva puta sa HBSS. Disocirane tumorne ćelije su potom ubrizgane podkožno u NOD/SCID miševe 6-8 nedelja kako bi se izazvao rast tumora. Za UM-PE13 i T3 ćelije tumora dojke, 50,000 ćelija u 100 ul su ubrizgane u masno tkivo desne dojke (n=20) zajedno sa implantacijom estrogenske granule. Za OMP-C9 ćelije tumora debelog creva, 50,000 ćelija u 100 ul su ubrizgane u levi region boka (n=20). Za OMP-C8 ćelije tumora debelog creva, 10,000 ćelije u 100 ul su ubrizgane u desno područje boka (n=10). Za OMP-C6 ćelije tumora debelog creva, 10,000 ćelije u 100 ul su ubrizgane u desni bok (n = 10). Sve ćelije tumora su ubrizgane u smešu PBS (bez magnezijuma ili kalcijuma) i BD Matrigela (BD Biosciences) u odnosu 1:1.
 
[0235] Tri dana posle ubrizgavanja tumorne ćelije, započeto je lečenje antitelom. Svaka ubrizgana životinja je primila 10 mg/kg anti-Notch1 antitela ili PBS kao kontrolni intraperitonealno (i.p.) dva puta nedeljno od ukupno 6 do 8 nedelja. Životinje ubrizgane sa PE13 ćelijama primile su injekcije u masno jastuče desne gornje dojke u odnosu na injekcije estrogene granule. Životinje ubrizgane sa C9, C8, ili C6 ćelija primile su injekcije u desni donji kvadrant abdomena. Veličina tumora je procenjena dva puta nedeljno.
 
[0236] U nekim rešenjima, antitela protiv membrane prokismalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch1 su testirana za efikasnost formiranja tumora dojke. PE13 tumorne ćelije dojke (50,000 ćelija po ubrizgavanju) su implantirane podkožno u masne jastučiće dojke. Dva dana prateći ćelijsku implantaciju, životinje su tretirane ili sa kontrolnim antitelom ili 52M antitelima 52M1, 52M2, i 52M8 (koje su bez anti-Notch signalne kapacitivnosti, videti Slika 1B) na 10 mg/kg doze i.p. dva puta nedeljno. Lečenje sa non-Notch1 inhibitorom antitela nemaju efekat na rast tumora kada se poredi sa kontrolnim lečenim životinjama (Slika 2C i 2D). U nekim rešenjima, životinje ubrizgane sa PE13 tumornim ćelijama dojke su lečene sa kontrolnim antitelom ili 52M51 na 10 mg/kg doze i.p. dva puta nedeljno. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno, i dejstvo 52M51 na rast tumora dojke je utvrđeno.
 
[0237] U alternativnim rešenjima, disocirane tumorne ćelije su prvo postavljene u tumorigenske i ne-tumorigenske ćelije zasnovane na ćelijskim površinama markera pre ubrizgavanja u eksperimentalne životinje. Pogotovo, disocijacija tumornih ćelija kao što je ovde opisano su isprane dva puta sa Hepes pufernim slanim rastvorom (HBSS) koji sadrži 2% telećeg seruma neaktivnog pri zagrevanju (HICS) i resuspendovan na 106 ćelija po 100 ul. Antitela su dodata i ćelije su inkubirane 20 min na ledu praćeno sa dva ispiranja sa HBSS/2% HICS. Antitela uključuju anti-ESA (Biomeda, Foster City, CA), anti-CD44, anti-CD24, i Vezivne markere anti-CD2, -CD3, -CD 10, -CD 16, -CD 18, -CD31, -CD64, i -CD140b (kolektivno se odnose kao Lin; PharMingen, San Jose, CA). Antitela su direktno konjugovana do fluorohroma do pozitivno ili negativno selektovanih ćelija koje iskazuju ove markere. Mišije ćelije su eliminisane selektovanjem protiv H2Kd+ ćelija, i mrtve ćelije su eliminisane primenom boja vitalnosti 7AAD. Protok citometrije je izveden na FACSVantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Mesto raspršavanja i profili naprednog raspršavanja su korišćeni kako bi se eliminisale ćelijske grudvice. Izolovane ESA+, CD44+, CD24-/niska, Lintumorigenske ćelije su potom ubrizgane podkožno u NOD/SCID miša kako bi se izazvao rast tumora.
 
Primer 5
 
In vivo lečenje tumora primenom anti-Notch1 receptor antitela
 
[0238] Tumorne ćelije iz uzorka paciejnta (biopsija čvrstog tumora ili pleuralni izliv) koji je propušten kao ksenograft kod miševa su pripremljene za ponovno propuštanje u eksperimentalne životinje. Tumorno tkivo je uklonjeno, iseckano na male delove, usitljeno potpuno primenom sterilnih oštrica, i pojedinačne ćelijske suspenzije dobijene enzimskim varenjem i mehaničkim prekidanjem. Disocirane tumrone ćelije su potom ubrizgane podkožno u masno tkivo dojke, za tumore dojke, ili u bok, za tumore koji nisu vezani za dojku, NOD/SCID miševa kako bi se izazvao rast tumora. U nekim rešenjima, ESA+, CD44+, CD24-/nisku, Lin- tumorgenske ćelije su izolovane kao što je prethodno opisano u više detalja i ubrizgane.
 
[0239] U nekim rešenjima, sveže izolovane C8 tumorne ćelije debelog creva (225 ćelija po životinji) su implantirane podkožno u NOD/SCID miš. Prateći ubrizgavanje tumorne ćelije. životinje su praćene na tumroni rast. Tumori su ostavljeni da narastu za 48 dana dok ne dostignu prosečnu veličinu od približno 210 mm3 i raspoređeni su u dve grupe (n=10 po grupi). Životinje su tretirane sa ili kontrolnim antitelom ili antitelom koje se vezuje za membransko proksimalnog region vanćelijskog domena humanog Notch1, 52M51, (10 mg/kg) doziran i.p. dva puta nedeljno. Veličina tumora je procenjena na dan 55, 57, i 62. Životinje tretirane sa 52M51 pokazuju statistički značajnu (p=0.0006) inhibiciju rasta tumora kada se poredi sa kontrolno tretiranim životinjama (Slika 2A i 2B).
 
[0240] Na kraju tretmana sa antitelom, tumori su uzeti za dalju analizu. U nekim rešenjima, porcija tumora je analizirana sa imunofluorescencijom kako bi se procenila penetracija antitela u tumor i tumorni odgovor. Porcija svakog dobijenog antitela iz anti-Notch1 receptora tretiranih i kontrolnog antitela tretiranih miševa je brzo zamrznuta u tečnom azotu, ugrađen u O.C.T., i isečen na kriostatu kao 10 um sekcije na staklenim slajdovima. Alternativno porcija svakog tumora je fiksirana sa formalinom, ugrađenim parafinom, i iseckan na mikrotome kao 10 um sekcija na staklenim slajdovima. Sekcije su post-fiksirane i inkubirane sa hromofor označenim antitelima koja posebno prepoznaju ubrizgana antitela kako bi detektovali anti-NOTCH1 receptor ili kontrolna antitela prisutna u biopsiji tumora. Dalje antitela koja detektuju različiti tumor i tumorno regrutovane ćelijske vrste kao što su, na primer, anti-VE kadherin (CD144) ili anti-PECAM-1 (CD31) antitela kako bi se detektovale vaskularne endotelijalne ćelije, alfa-aktin antitela anti-glatkih mišića kako bi se detektovale vaskularne glatke mišićne ćelije, anti-Ki67 antitela kako bi se detektovale proliferativne ćelije, TUNEL analiza za detektovanje umurićih ćelija, i anti-intraćelijski domen (ICD) Notch fragment antitela kako bi se detektovao Notch signal koji može da se koristi za procenu uticaja antitelnog lečenja na angiogenezi, rasta tumora i tumorne morfologije.
 
[0241] Efekat anti-Notch1 receptora antitelnog lečenja na genskoj ekspresiji tumorne ćelije je takođe procenjen. Ukupna RNK je ekstrakovana iz porcije svakog dobijenog tumora iz Notch1 antitela tretiranog i kontrolonog antitela tretiranog miša i korišćena za kvantitativni RT-PCR. Ekspresioni nivoi Notch1, komponente Notch signalnog puta koji uključuje, i dodatne markere matičnih ćelija raka prethodno identifikovani koji obuhvataju, na primer CD44 su analizirani u odnosu na domaći gen GAPDH kao unutrašnja kontrola. Promene u genskoj ekspresiji tumorne ćelije nakon tretmana sa antitelom Notch1 receptora su takođe određene.
 
[0242] Dodatno, efekat tretiranja antitela anti-Notch1 receptora na prisustvo matičnih ćelija raka u tumoru je procenjena. Uzorci tumora iz Notch1 versus kontrolnom antitelu tretiranog miša su isečeni na male delove, upotpunosti usitnjeni primenom sterilnih oštirca, i pojedinačne ćelijske suspenzije dobijene enzimskim varenjem i mehaničkom disrupcijom. Disocirane tumorne ćelije su potom analizirane sa FACS analizom na prisustvo kancerogenih matičnih ćelija raka zasnovane na ekspresiji ESA+, CD44+, CD24-/niske, Lin- površinskog ćelijskog markera kao što je prethodno opisano u više detalja.
 
[0243] Kancerogenost ćelija izolovane na osnovu ESA+, CD44+, CD24-/niske, Lin- eskpresije koja prati anti-Notch1 antitelni tretman se zatim može proceniti. 5,000, 1,000, 500, i 100 izolovani ESA+, CD44+, CD24-/niski, Lin- matične ćelije raka iz Notch1 tretiranog antitelom versus tretiranog kontrolnog antitela miševa su ponovo ubrizgane u masni jastučić dojke NOD/SCID miša. Kancerogenost matičnih ćelija raka zasnovana na broju ubrizganih ćelija potrebne za konzistentno obrazovanje tumora je prema tome određeno.
 
[0244] Na suprot in vivo efikasnosti 52M51, antitelo koje inhibira Notch1 signal, u kolonskom ksenografskom modelu prethodno opisanom, izvesna druga antitela koja prepoznaju membranu proksimalnog regiona Notch 1, ali ne inhibiraju Notch 1 signal, su pronađene da nemaju anti-tumornu efikasnost in vivo u dojci ksenograft modela. Antitela 52M51, 52M2, i 52M8, od kojih je nađeno da svaki neprimetno inhibira Notch signal (Primer 3 i Slika 1B), su ubrizgana u NOD/SCID miš koji je prethodno ubrizgan sa PE13 tumornim ćelijama dojke. Svako antitelo 52M1, 52M2, i 52M8 nije uspelo da deluje na rast tumora u ksenograftskom modelu kada se poredi sa kontrolno tretiranim životinjama (Slika 2C (52M1, 52M2) i Slika 2D (52M8)).
 
Primer 6
 
Lečenje humanog raka primenom antitela anti-Notch receptora
 
[0245] Ovaj primer opisuje postupke za lečenje raka primenom antitela protiv Notch receptora kako bi ciljao tumore koji sadrže matične ćelije raka i/ili ćelije tumora gde je ekspresija Notch receptora detektovana.
 
[0246] Prisustvo ekspresije markera matične ćelije raka može prvo biti utvrđeno iz biopsije tumora. Ćelije tumora iz biopsije pacijenta kome je dijagnostikovan rak su uklonjene pod sterilnim uslovima. U nekim rešenjima, tkivo biopsije je sveže zamrznuto u tečnom azotu, ugrađen u O.C.T., i isečen na kriostalu kao 10 um sekcija na staklenim slajdovima. Alternativno tkivo biopsije je fiksirano formalinom, ugrađeno prafinom, i isečeno na mikrotome kao 10 um sekcija na staklenim slajdovima. Sekcije su inkubirane sa antitelima protiv Notch receptora kako bi se detektovala proteinska ekspresija. Dodatno, prisustvo matičnih ćelija raka se može utvrditi. Uzorci biopsije tkiva su odsečeni na male delove, usitnjeni potpuno primenom sterilnih oštrica, i ćelije su podvrgnute enzimskom varenju i mehaničkom prekidanju kako bi se dobila pojedinačna ćelijska suspenzija. Disocirane tumorne ćelije su potom inkubirane sa anti-ESA, -CD44, -CD24, -Lin, i -Notch1 antitelima kako bi se detektovale matične ćelije raka, i prisustvo ESA+, CD44+, CD24-/nisko, Lin-, Notch+ matičnih ćelija tumora je određeno protokom citometrije kao što je prethodno opisano u više detalja.
 
[0247] Pacijenti oboleli od raka čiji tumori su dijagnostikovani kao oni koji iskazuju Notch receptor su tretirani sa antitelima anti-Notch receptora. Humanizovana ili humana monoklonalna antitela anti-Notch receptora generisani kao što je prethodno opisano su prečišćeni i formulisani sa pogodnim farmaceutskim nosačem u PBS za ubrizgavanje. Pacijenti su tretirani sa Notch antitelima jednom nedeljno u periodu od 10 nedelja, ali u nekim slučajevima jednom nedeljno bar oko 14 nedelja. Svaka primena antitela bi trebalo da bude farmaceutska efikasna doza od oko 2 do oko 100 mg/ml i u nekim slučajevima između oko 5 do oko 40 mg/ml. Antitelo se može primenjivati pre, istovremeno sa, ili posle standardnih radioterapijskih režima ili hemoterapijskih režima primenom jednog ili više hemoterapeutskih agenasa, kao što su oksaliplatin, fluorouracil, leucovorin, ili streptozocin. Pacijenti su praćeni kako bi se utvrdilo da li je takvo lečenje rezultovalo u anti-tumornom odgovoru, na primer, zasnovano na tumornoj regresiji, redukciji u obrazovanju novih tumora, ili drugi načini procene progresa oboljenja.
 
Primer 7
 
Dodatna studija in vivo lečenja tumora primenom antitela anti-Notch1 receptora
 
[0248] U jednom rešenju, M2 melanomske ćelije 10,000) su ubrizgane podkožno u NOD-SCID miševe. Tumori su ostavljeni da rastu 35 dana dok ne dostignu zapreminu koja je približno 110 mm3. Miševi koji imaju tumor su nasumice podeljeni u dve grupe (n=10) i tretirane sa ili kontrolnim antitelom ili anti-Notch1 antitelom 52R43. Antitela su dozirana dva puta nedeljno sa 10 mg/kg. Zapremine tumora su merene naznačenim danima. Kao što je prikazano na Slici 3A, anti-Notch1 lečenje sa 52R43 smanjuje rast tumora relativno u odnosu na kontrolnu grupu (p=0.02).
 
[0249] U jednom rešenju, Lu24 tumorne ćelije pluća (30,000) su ubrizgane podkožno u NOD-SCID miševe. Tumori su ostavljeni da rastu 35 dana dok ne dostignu zapreminu koja je približno 205 mm3. Miševi koji imaju tumor su nasumice podeljeni u dve grupe (n=8) i tretirane sa ili kontrolnim antitelom ili anti-Notch1 antitelom 52R43. Antitela su dozirana dva puta nedeljno sa 10 mg/kg. Zapremine tumora su merene naznačenim danima. Kao što je prikazano na Slici 3B, anti-Notch1 lečenje sa 52R43 smanjuje rast tumora relativno u odnosu na kontrolnu grupu (p=0.04).
 
[0250] U jednom rešenju, PN8 tumorne čelije pankreasa (50,000) su ubrizgane podkožno u NOD-SCID miševe. Tumori su ostavljeni da rastu 27 dana dok ne dostignu zapreminu koja je približno 115 mm3. Miševi koji imaju tumor su nasumice podeljeni u dve grupe (n=8) i tretirane sa ili kontrolnim antitelom ili anti-Notch1 antitelom 52R43. Antitela su dozirana dva puta nedeljno sa 10 mg/kg. Zapremine tumora su merene naznačenim danima. Kao što je prikazano na Slici 3C, anti-Notch1 lečenje sa 52R43 smanjuje rast tumora relativno u odnosu na kontrolnu grupu (p=0.005).
 
[0251] U jednom rešenju, T1 tumorne ćelije dojke (300,000) su ubrizgane podkožno u NOD-SCID miševe. Tumori su ostavljeni da rastu 27 dana dok ne dostignu zapreminu koja je približno130 mm3. Miševi koji imaju tumor su nasumice podeljeni u četiri grupe (n=10) i tretirane sa ili kontrolnim antitelom ili anti-Notch1 antitelom 52R43, taksolom, ili kombinacijom 52R43 i taksola. Antitela su dozirana jednom nedeljno sa 15 mg/kg i taksol je doziran jednom nedeljno sa 12 mg/kg. Zapremine tumora su merene naznačenim danima. Kao što je prikazano na sici 3D, anti-Notch1 lečenje sa 52R43 smanjuje rast tumora relativno u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.0001), a kombinacija grupe je smanjenja relativno u odnosu na sam taksol (p=0.001)
 
SEKVENCE
 
[0252]
SEQ ID NO: 1
Notch1 Polinukleotidne kodirajuće amino kiseline 1427-1732.
 
 
SEQ ID NO: 2
Notch1 amino kiseline 1427-1732
 
 
[0253] Sekvence mišijeg antitela 52M51:
 
SEQ ID NO: 3
52M51 Polinukleotidna sekvenca lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
 
SEQ ID NO: 4
52M51 Amino kiselinska sekvenca lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
SEQ ID NO: 5
52M51 Polinukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
SEQ ID NO: 6
52M51 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
SEQ ID NO: 7
52M51 Polinukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
 
 
SEQ ID NO: 8
52M51 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
 
SEQ ID NO: 9
52M51 Polinukleotidna sekvenca teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
SEQ ID NO: 10
52M51 Amino kiselinska sekvenca teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
SEQ ID NO: 11
52M51 Polinukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
SEQ ID NO 12:
52M51 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca je podvučena)
 
 
SEQ ID NO: 13
52M51 Polinukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
 
SEQ ID NO: 14
52M51 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
 
SEQ ID NO: 15
52M51 Teškog lanca CDR1
RGYWIE
 
SEQ ID NO:16
52M51 Teškog lanca CDR2
QILPGTGRTNYNEKFKG
 
SEQ ID NO:17
52M51 Teškog lanca CDR3
FDGNYGYYAMDY
 
SEQ ID NO:18
52M51 Teškog lanca CDR1
RSSTGAVTTSNYAN
 
SEQ ID NO:19
52M51 Lakog lanca CDR2
GTNNRAP
 
SEQ ID NO:20
52M51 Lakog lanca CDR3
ALWYSNHWVFGGGTKL
 
Humanizovane 52M51 sekvence:
[0254]
 
SEQ ID NO: 21
52M51-H4 Polinukleotidna sekvenca teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
 
 
 
SEQ ID NO: 22
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 23
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regona teškog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
 
SEQ ID NO: 24
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regona teškog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
 
SEQ ID NO: 25
52M51-H4 Polinukleotidna sekvenca lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 26
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 27
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regona lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 28
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regona lakog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
 
 
 
SEQ ID NO: 29
52M51-H4 Polinukleotidna sekvenca lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 30
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 31
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regona lakog lanca (Pretpostavljena signalna sekvenca)
 
 
SEQ ID NO: 32
52M51-H4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regona lakog lanca bez pretpostavljene signalne sekvence
 
22
 

Claims (18)

1. Izolovano monoklonalno antitelo koje posebno vezuje ne-ligandnu vezujuću membranu proksimalnog regiona vanćelijskog domena humanog Notch 1, koji sadrži:(a) teški lanac CDR1 koji sadrži RGYWIE (SEQ ID NO: 15), teški lanac CDR2 koji sadrži QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16), i teški lanac CDR3 koji sadrži FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17); i(b) laki lanac CDR1 koji sadrži RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18), laki lanac CDR2 koji sadrži GTNNRAP (SEQ ID NO: 19), i laki lanac CDR3 koji sadrži ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20).
2. Antitelo prema zahtevu 1, gde antitelo sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO:24 i varijabilni region lakog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO:28 ili SEQ ID NO:32; ili (b) varijabilni region teškog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO:14 i varijabilni region lakog lanca koji ima bar 90% sekvencne identičnosti sa SEQ ID NO:8.
3. Antitelo prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde je antitelo hemijsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, fragment antitela, bispecifično antitelo, monospecifično antitelo, monovalentno antitelo, IgG1 antitelo, ili IgG2 antitelo.
4. Antitelo prema zahtevu 1, koje obuhvata iste varijabilne regione teškog i lakog lanca kao polipeptid kodiran sa plazmidom deponovanim kao ATCC Patent Depozitna Oznaka PTA-9549.
5. Antitelo prema jednom od zahteva 1 do 3, koje sadrži: (a) polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 32; ili (b) polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 i polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.
6. Antitelo prema zahtevu 5, koje sadrži polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koje sadrži polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 i polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 ili 30.
8. Antitelo kodirano sa polinukleotidom deponovanim kod ATCC kao PTA-9549.
9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3 kodiran polinukleotidom koji sadrži SEQ ID NO: 21 i SEQ ID NO: 25 ili 29.
10. Izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9.
11. Ćelija domaćina: (a) koja proizvodi antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9; ili (b) koja sadrži polinukleotidni molekul prema zahtevu 10.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
13. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za primenu u lečenju oboljenja.
14. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za primenu u lečenju raka.
15. Primena antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za proizvodnju medikamenta za lečenje raka.
16. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za primenu prema zahtevu 14 ili primenu prema zahtevu 15, gde lečenje smanjuje kancerogenost tumora i/ili smanjuje učestalost matičnih ćelija raka u tumoru.
17. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za primenu prema zahtevu 14 ili zahtevu 16 ili primena prema zahtevu 15 ili zahtevu 16, gde je rak odabran iz grupe koja se sastoji od raka dojke, kolorektalnog raka, hepatik raka, raka bubrega, raka jetre, raka pluća, raka pankreasa, gastrointestinalnog raka, melanoma, raka jajnika, raka prostate, raka debelog creva, raka bešike, glioblastoma, i raka glave i vrata.
18. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za primenu prema bilo kom od zahteva 14, 16 ili 17 ili primena prema bilo kom od zahteva 15 do 17, gde lečenje obuhvata primenu antitela, i dalje obuhvata primenu dodatnog lečenja raka na subjektu; poželjno gde je dodatno lečenje za rak terapija zračenja, hemoterapija, ili dodatni antitelni terapeutik.
MEP-2015-20A 2008-07-08 2009-07-08 Vezujuci agensi notch1 receptora i postupci njihove primene ME02069B (me)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7909508P 2008-07-08 2008-07-08
US11270108P 2008-11-07 2008-11-07
US11269908P 2008-11-07 2008-11-07
PCT/US2009/003995 WO2010005567A2 (en) 2008-07-08 2009-07-08 Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
EP09794822.8A EP2307459B1 (en) 2008-07-08 2009-07-08 Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME02069B true ME02069B (me) 2015-05-20

Family

ID=41507637

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2015-63A ME02148B (me) 2008-07-08 2009-07-08 Notch-vezivni agensi i antagonisti i postupci za njihovo korišćenje
MEP-2015-20A ME02069B (me) 2008-07-08 2009-07-08 Vezujuci agensi notch1 receptora i postupci njihove primene

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2015-63A ME02148B (me) 2008-07-08 2009-07-08 Notch-vezivni agensi i antagonisti i postupci za njihovo korišćenje

Country Status (31)

Country Link
US (11) US8435513B2 (me)
EP (4) EP2899211A1 (me)
JP (2) JP5560270B2 (me)
KR (2) KR101640099B1 (me)
CN (3) CN102316897B (me)
AU (2) AU2009269095B2 (me)
BR (2) BRPI0914004A2 (me)
CA (2) CA2729306C (me)
CO (2) CO6390041A2 (me)
CR (1) CR20110069A (me)
CY (2) CY1116195T1 (me)
DK (2) DK2307051T3 (me)
DO (2) DOP2011000004A (me)
EA (2) EA201170157A1 (me)
ES (2) ES2535614T3 (me)
HR (2) HRP20150443T1 (me)
IL (2) IL210221A (me)
MA (2) MA32449B1 (me)
ME (2) ME02148B (me)
MX (2) MX2011000233A (me)
MY (2) MY155603A (me)
NZ (2) NZ590127A (me)
PL (2) PL2307051T3 (me)
PT (2) PT2307051E (me)
RS (2) RS53924B1 (me)
SG (2) SG192467A1 (me)
SI (2) SI2307051T1 (me)
SM (2) SMT201500047B (me)
UA (1) UA101672C2 (me)
WO (2) WO2010005567A2 (me)
ZA (2) ZA201009280B (me)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6984522B2 (en) * 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US9540694B2 (en) * 2006-05-19 2017-01-10 The Johns Hopkins University HEYL as a therapeutic target and a diagnostic marker for neoplasia and uses therefor
PL2032166T3 (pl) 2006-06-13 2013-09-30 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworów
JP5386364B2 (ja) 2006-12-18 2014-01-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体とＮｏｔｃｈ３関連疾患の予防及び治療におけるその使用
CA2676008A1 (en) 2007-01-24 2008-07-31 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
CN102316897B (zh) 2008-07-08 2014-11-05 昂考梅德药品有限公司 Notch结合剂和拮抗剂及其应用方法
US9132189B2 (en) 2008-07-08 2015-09-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 binding agents and methods of use thereof
AR073717A1 (es) * 2008-10-01 2010-11-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 de murino y humano, y metodos de uso
CA2765989C (en) 2009-06-18 2016-11-29 Pfizer Inc. Anti notch-1 antibodies
RU2012117619A (ru) * 2009-09-30 2013-11-10 Дженентек, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ДЕЙСТВИЮ АНТАГОНИСТА Notch1, С ПОМОЩЬЮ АНТАГОНИСТА Notch3
PL2488204T3 (pl) 2009-10-16 2016-10-31 Kombinacja terapeutyczna i zastosowanie przeciwciał antagonistycznych względem dll4 i środków antyhipertensyjnych
AU2011205316B2 (en) * 2010-01-13 2015-05-28 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 binding agents and methods of use thereof
MX360640B (es) 2010-03-01 2018-11-09 Tau Therapeutics Llc Star Diagnosis e imagenologia de cancer.
MA34291B1 (fr) * 2010-05-03 2013-06-01 Genentech Inc Compositions et méthodes de diagnostic et de traitement d'une tumeur
CN105884896A (zh) 2010-12-15 2016-08-24 惠氏有限责任公司 抗缺刻蛋白1抗体
US20130058947A1 (en) * 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
MX2014002967A (es) * 2011-09-12 2015-04-13 Tau Therapeutics Llc Antagonistas de los productos del agrupamiento de unigenes hs.459642 para la inhibicion de la proliferacion, del desarrollo o de la diferenciacion de las celulas madre incluyendo las celulas madre cancerosas.
DK3485903T5 (da) 2011-09-23 2024-09-02 Mereo Biopharma 5 Inc Vegf/dll4-bindende midler og anvendelser deraf
TW201329105A (zh) * 2011-10-04 2013-07-16 Thr Trustees Of Columbia University In The City Of New York 人類ｎｏｔｃｈ１引誘物
US9663573B2 (en) 2011-10-05 2017-05-30 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using Notch2 antagonists
AU2012339681A1 (en) * 2011-11-16 2014-06-19 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Human NOTCH receptor mutations and their use
KR101535219B1 (ko) * 2011-11-18 2015-07-09 한국생명공학연구원 Ｎｏｔｃｈ３에 대한 인간 단일클론항체
US9534058B2 (en) 2012-02-08 2017-01-03 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-CD324 monoclonal antibodies and uses thereof
EP2849785A4 (en) * 2012-05-16 2015-12-16 Oncomed Pharm Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH NOTCH2 / 3 ANTIBODIES
RU2018130986A (ru) 2012-08-13 2018-10-09 Дженентек, Инк. Антитела к jagged и способы их применения
WO2014039908A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for regenerating hair cells and/or supporting cells
WO2014047426A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating hematological malignancies with notch1 antibodies
HK1208371A1 (en) * 2012-10-09 2016-03-04 桑比欧公司 Methods and compositions for treatment of retinal degeneration
AU2013337811A1 (en) 2012-10-31 2015-05-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist
TWI589590B (zh) 2012-11-07 2017-07-01 輝瑞股份有限公司 抗切口３（ａｎｔｉ-ｎｏｔｃｈ３）抗體及抗體-藥物共軛體
EP2935330B1 (en) * 2012-12-19 2019-04-24 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-notch3 antibodies
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
SG10201803131TA (en) * 2013-02-18 2018-06-28 Univ Health Network Methods for generating hepatocytes and cholangiocytes from pluripotent stem cells
EP2970468B1 (en) 2013-03-13 2021-07-07 Novartis AG Notch2 binding molecules for treating respiratory diseases
JP2016514130A (ja) * 2013-03-14 2016-05-19 ノバルティス アーゲー Ｎｏｔｃｈ３に対する抗体
CA2900969A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating pancreatic cancer
HK1211963A1 (en) 2013-03-15 2016-06-03 豪夫迈．罗氏有限公司 Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
US9518121B2 (en) 2014-02-12 2016-12-13 Genentech, Inc. Anti-Jagged1 antibodies and methods of use
US20170023576A1 (en) * 2014-04-04 2017-01-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch3 antibodies and uses thereof
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
GB201416832D0 (en) * 2014-09-24 2014-11-05 Glaxosmithkline Plc Methods of treatment
EP3212773B1 (en) 2014-10-29 2021-09-15 Massachusetts Eye and Ear Infirmary Efficient delivery of therapeutic molecules to cells of the inner ear
JP6827415B2 (ja) 2014-10-31 2021-02-10 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド 疾患の処置のための併用療法
CN105986001B (zh) * 2015-02-12 2019-12-03 上海交通大学 一种基于膜结合蛋白和荧光互补的高通量猎物拮抗剂筛选方法
WO2016138034A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 The Regents Of The University Of California Binding-triggered transcriptional switches and methods of use thereof
TWI609687B (zh) * 2015-04-14 2018-01-01 美國禮來大藥廠 平滑肌肉瘤之標靶性治療
MX381139B (es) * 2015-04-16 2025-03-12 Eisai R&D Man Co Ltd Anticuerpo anti-notch4 humano.
CN108025001A (zh) * 2015-07-24 2018-05-11 安可初克公司 用于治疗免疫系统功能障碍的γ分泌酶调节剂
ES2968074T3 (es) 2015-09-23 2024-05-07 Mereo Biopharma 5 Inc Anticuerpo bi-específico anti-VEGF/DLL4 para su uso en el tratamiento del cáncer de ovario resistente al platino
CN105585636B (zh) * 2015-11-24 2020-03-03 南方医科大学 一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用
EP3430046A4 (en) * 2016-03-16 2019-10-23 Abeome Corporation NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES TO IL-25 AND USES THEREOF
ES2931955T3 (es) 2016-04-29 2023-01-05 Aveo Pharmaceuticals Inc Anticuerpo anti-Notch3
US11400116B2 (en) 2016-05-06 2022-08-02 The Regents Of The University Of California Systems and methods for targeting cancer cells
WO2017205651A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Human notch1 based fusion proteins as decoy inhibitors of jagged-notch signaling and dll-notch signaling
EP3504245A4 (en) 2016-08-23 2020-04-22 The Regents of The University of California PROTEOLYTICLY CLEAVABLE CHIMERAL POLYPEPTIDES AND METHOD FOR USE THEREOF
KR20210117359A (ko) * 2016-11-07 2021-09-28 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 라임병에 사용하기 위한 dna 항체 작제물
US20200103419A1 (en) 2017-03-27 2020-04-02 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Blood biomarkers and diagnostic methods for small vessel diseases
US11453718B2 (en) 2017-03-27 2022-09-27 The Schepens Eye Research Institute, Inc. NOTCH3 agonist compositions and methods for treating small vessel diseases
US11325957B2 (en) * 2017-06-19 2022-05-10 Cell Design Labs, Inc. Methods and compositions for reducing the immunogenicity of chimeric notch receptors
CN107557343B (zh) * 2017-08-09 2020-09-25 苏州大学附属儿童医院 抗人dll4单克隆抗体3f9
US11590152B2 (en) 2018-01-26 2023-02-28 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Treatment of hearing loss
WO2019199165A1 (en) * 2018-04-10 2019-10-17 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Chimeric notch receptors
US11117932B2 (en) * 2018-07-20 2021-09-14 The Hong Kong Polytechnic University Peptides for specific inhibition of Jag 1-Notch 1 pathway
CA3118692A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Alsatech, Inc. Cell-based gene therapy for neurodegenerative diseases
CN111334575A (zh) * 2020-02-18 2020-06-26 至本医疗科技（上海）有限公司 Notch家族基因变异在预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用
MX2023000617A (es) * 2020-07-17 2023-02-13 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso.
CN112625125B (zh) * 2021-01-18 2021-12-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一株中和新型冠状病毒感染的单抗
CN116917009A (zh) 2021-02-19 2023-10-20 美国迈胜医疗系统有限公司 用于粒子治疗系统的机架
US20240252636A1 (en) * 2021-06-24 2024-08-01 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Dual egfr-muci chimeric cantigen receptor t cells
TW202340251A (zh) * 2022-01-19 2023-10-16 美商建南德克公司 抗ｎｏｔｃｈ２抗體及結合物及其使用方法
CN118344474B (zh) * 2024-05-28 2024-11-15 中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心) 口蹄疫病毒O型、A型和Asia1型广谱中和性猪源单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (153)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US6344321B1 (en) 1990-06-11 2002-02-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands which bind to hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) or its receptor c-met
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
TW205553B (me) 1991-04-25 1993-05-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
IE20030749A1 (en) 1991-05-03 2003-11-12 Indiana University Foundation Human notch and delta binding domains in torporythmic proteins, and methods based thereon
IL101728A (en) 1991-05-03 2007-08-19 Univ Yale Human Abandonment and Delta, Restrictive Areas of Effect in Tophoric Proteins, and Methods Based on Them
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US20050112121A1 (en) 1992-04-30 2005-05-26 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
US5756291A (en) 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
DE4425115A1 (de) 1994-07-15 1996-01-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Modifizierung der Stabilität von Antikörpern
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
WO1996036361A1 (en) 1995-05-18 1996-11-21 The Regents Of The University Of Michigan Dna binding antibodies
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
WO1997037004A1 (en) 1996-03-30 1997-10-09 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the production of activated marked tumor-specific t cells and use thereof in treatment of tumors
EP0921818A4 (en) 1996-05-31 2002-09-25 Nat American Red Cross THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC METHODS AND COMPOSITIONS BASED ON JAGGED / NOTCH PROTEINS AND AMINO ACIDS
FR2751986B1 (fr) 1996-08-01 1998-12-31 Inst Nat Sante Rech Med Gene implique dans le cadasil, methode de diagnostic et application therapeutique
NZ335549A (en) 1996-11-07 2001-07-27 Lorantis Ltd Use of a notch-ligand for affecting infectious tolerance and in the manufacture of a medicament for immunotherapy
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6379925B1 (en) 1997-06-18 2002-04-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Angiogenic modulation by notch signal transduction
WO1998057621A1 (en) 1997-06-18 1998-12-23 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Angiogenic modulation by notch signal transduction
US6692919B1 (en) 1997-07-23 2004-02-17 Yale University Activated forms of notch and methods based thereon
US6004528A (en) 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
US7361336B1 (en) 1997-09-18 2008-04-22 Ivan Bergstein Methods of cancer therapy targeted against a cancer stem line
US20060057573A1 (en) 2002-02-15 2006-03-16 Somalogic, Inc Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
AU768269B2 (en) 1998-10-02 2003-12-04 Government of The United States of America, as represented by The Secretary Department of Health & Human Services, The National Institutes of Health, The Apoptosis inducing agents and methods
US20030054360A1 (en) 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US20030003572A1 (en) 1999-03-05 2003-01-02 David J. Anderson Isolation and enrichment of neural stem cells from uncultured tissue based on cell-surface marker expression
US20020010320A1 (en) 1999-04-05 2002-01-24 James W. Fett Chemeric and humanized antibodies to angiogenin
ES2353268T3 (es) 1999-07-02 2011-02-28 Morphosys Ag Generacion de elementos de union especifica que se unen a (poli)peptidos codificados por fragmentos de adn genomico o est.
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030031670A1 (en) 1999-11-08 2003-02-13 Jack R. Wands Diagnosis and treatment of malignant neoplasms
DE10031380A1 (de) 2000-06-28 2002-01-10 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Übertragung von Alkyliden-Gruppen auf organischen Verbindungen
US20050089518A1 (en) 2001-12-07 2005-04-28 Clarke Michael F. Prospective identification and characterization of breast cancer stem cells
US20080194022A1 (en) 2000-08-03 2008-08-14 Clarke Michael F Isolation and use of solid tumor stem cells
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
WO2002018544A2 (en) 2000-08-31 2002-03-07 Loyola University Chicago Method and reagents for treatment of skin disorders by modulating the notch pathway
US6689744B2 (en) 2000-09-22 2004-02-10 Genentech, Inc. Notch receptor agonists and uses
EP2322648A1 (en) 2000-09-26 2011-05-18 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
WO2002059318A1 (en) 2000-10-02 2002-08-01 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology A humanized antibody to surface antigen s of hepatitis b virus and a preparing method thereof
EP1381631B1 (en) * 2001-04-24 2010-10-13 Bayer Corporation Human anti timp-1 antibodies
US7356224B2 (en) 2001-07-03 2008-04-08 Brown University Research Foundation Method and apparatus for detecting multiple optical wave lengths
AU2002339157A1 (en) 2001-11-14 2003-05-26 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
GB0201674D0 (en) 2002-01-25 2002-03-13 Lorantis Ltd Medical treatment
EP2365004B1 (en) 2002-06-21 2016-01-06 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
DE10228103A1 (de) 2002-06-24 2004-01-15 Bayer Cropscience Ag Fungizide Wirkstoffkombinationen
JP2006515747A (ja) 2002-11-01 2006-06-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
US20050124565A1 (en) 2002-11-21 2005-06-09 Diener John L. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
WO2004052389A2 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Singapore General Hospital Pte Ltd. Nogo, caspr, f3 nb-3 useful in the treatment of injury and disease to the central nervous system
JP2007525167A (ja) 2003-04-01 2007-09-06 ジェンザイム・コーポレーション 乳房内皮細胞発現パターン
US7425328B2 (en) * 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
US7563748B2 (en) 2003-06-23 2009-07-21 Cognis Ip Management Gmbh Alcohol alkoxylate carriers for pesticide active ingredients
US7329742B2 (en) 2003-09-04 2008-02-12 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
GB0321805D0 (en) 2003-09-18 2003-10-15 Univ Wales Medicine Human tumour growth patterns
BRPI0416934A (pt) 2003-11-26 2007-01-16 Health Research Inc método para reduzir a gravidade dos distúrbios das células plasmáticas ou para o tratamento dos distúrbios das células plamáticas, método para reduzir a dose de um agente citotóxico, e, método para reduzir a produção de il-6 ou de vegf pelos fibroblastos que se acham em contato com as células plasmáticas cancerosas
CA2554779A1 (en) 2004-02-03 2005-08-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer
FR2867784B1 (fr) 2004-03-17 2006-06-09 Commissariat Energie Atomique Aptameres selectionnes a partir de cellules vivantes tumorales et leurs applications
EP1730531B1 (en) 2004-03-24 2014-01-15 Technion Research and Development Foundation, Limited Electrode
US20050239134A1 (en) 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
WO2005111072A2 (en) 2004-04-29 2005-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Notch-based fusion proteins and uses thereof
WO2006000020A1 (en) 2004-06-29 2006-01-05 European Nickel Plc Improved leaching of base metals
US20070077245A1 (en) 2004-08-04 2007-04-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. NOTCH mutations leading to increased receptor signaling
GB0421838D0 (en) 2004-09-30 2004-11-03 Congenia S R L Cancer markers
WO2006053063A2 (en) 2004-11-05 2006-05-18 The Regents Of The University Of California Notch-1 assay to detect neurodegenerative diseases
NZ555216A (en) 2004-11-10 2010-05-28 Hubrecht Lab Treatment of an intestinal adenoma and/or adenocarcinoma by inhibition of notch pathway activation
US10538742B2 (en) 2004-11-12 2020-01-21 Cambridge Enterprise Limited Methods and means related to cancer stem cells
CA2604844A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cancer-related genes
BRPI0611707A2 (pt) 2005-06-29 2012-04-24 Compumedics Ltd conjunto de sensor com ponte condutiva
WO2007053648A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20090305310A1 (en) 2005-11-22 2009-12-10 University Of Vermont And State Agricultural College Methods for Determining Notch Signaling and Uses Thereof
NZ568739A (en) 2005-12-16 2010-09-30 Regeneron Pharma Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with delta-like ligand 4 antagonists
WO2007075914A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies against orthopoxviruses
AR059922A1 (es) 2006-04-01 2008-05-07 Galaxy Biotech Llc Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos
US20080241150A1 (en) * 2006-05-15 2008-10-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human NOTCH1 and 2 and isolated LNR domains from human NOTCH1
CA2654000A1 (en) 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
CA2654304A1 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
PL2032166T3 (pl) 2006-06-13 2013-09-30 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworów
TW200801513A (en) 2006-06-29 2008-01-01 Fermiscan Australia Pty Ltd Improved process
WO2008050525A1 (en) 2006-09-29 2008-05-02 Konica Minolta Opto, Inc. Retardation film
EA018260B1 (ru) 2006-09-29 2013-06-28 Онкомед Фармасьютикалз, Инк. Антитела к дельта-подобному лиганду 4 человека и их применение
US7700113B2 (en) 2006-10-19 2010-04-20 Maine Medical Research Institute, A Division Of Maine Medical Center Inhibiting breast cancer cell growth by administering an intracellular domain of NOTCH2
JP5478254B2 (ja) * 2006-10-19 2014-04-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ノッチ３アゴニスト抗体とノッチ３関連疾患の治療におけるその使用
CL2007002989A1 (es) 2006-10-19 2008-05-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch3; acido nucleico que los codifica; vector y celula que lo comprende; metodo de produccion; y su uso para el diagnostico de enfermedades relacionadas con notch3.
US20100068688A1 (en) 2006-11-06 2010-03-18 Howard Shapiro Management of teaching processes for individualized instruction in a multistudent environment
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
JP5386364B2 (ja) 2006-12-18 2014-01-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｎｏｔｃｈ３アンタゴニスト抗体とＮｏｔｃｈ３関連疾患の予防及び治療におけるその使用
AU2007338734A1 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
CA2676008A1 (en) 2007-01-24 2008-07-31 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
WO2008091222A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Bioinvent International Ab Dll4 signaling inhibitors and uses thereof
WO2008100563A2 (en) 2007-02-14 2008-08-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
JP2010520280A (ja) 2007-03-05 2010-06-10 ボード オブ リージェンツ， ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ＮｏｔｃｈまたはＮｕｍｂ特異的免疫療法との相乗効果を有する、癌細胞の再生のネガティブな遺伝的制御
US20100099090A1 (en) * 2007-03-05 2010-04-22 Bristol-Mayers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to ctla-4 antagonists
PE20090321A1 (es) * 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
CL2008002085A1 (es) 2007-07-16 2008-11-21 Genentech Inc Anticuerpo humanizado anti-cd79b/igbeta/b29; polinucleotido codificacnte, vector, celula huesped; metodo de fabricacion; inmunoconjugado; composicion farmaceutica; uso para tratar cancer; metodo in vitro para determinar presencia de cd79b, oinhibir crecimiento de celulas quqe expresa cd79b; ensayo in vitro para detectar celulas b
KR20100076947A (ko) 2007-08-23 2010-07-06 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 인간화 노치 융합 단백질 조성물 및 치료방법
EP2195451A4 (en) 2007-08-28 2011-01-19 Merck Sharp & Dohme EXPRESSION PROFILES OF BIOMARKERGENIC IN NOTCH-MEDIATED CANCER DISEASES
US8377886B2 (en) 2007-09-14 2013-02-19 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Use of gamma secretase inhibitors and notch pathway inhibitors for treatment and prevention of renal disease
WO2009036167A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Vanderbilt University Targeting of notch3 receptor function for cancer therapy
US20120082659A1 (en) 2007-10-02 2012-04-05 Hartmut Land Methods And Compositions Related To Synergistic Responses To Oncogenic Mutations
US8119366B2 (en) 2007-10-05 2012-02-21 Trojan Technologies, Ltd. Antennapedia-dominant negative mastermind-like construct
CA2720763A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the notch pathways and uses thereof
WO2010000020A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Cathrx Ltd A catheter
CN102316897B (zh) 2008-07-08 2014-11-05 昂考梅德药品有限公司 Notch结合剂和拮抗剂及其应用方法
US9132189B2 (en) 2008-07-08 2015-09-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 binding agents and methods of use thereof
AR073717A1 (es) 2008-10-01 2010-11-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 de murino y humano, y metodos de uso
US8425930B2 (en) 2009-03-13 2013-04-23 The Regents Of The University Of California Prebiotic oligosaccharides
RU2012117619A (ru) 2009-09-30 2013-11-10 Дженентек, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ДЕЙСТВИЮ АНТАГОНИСТА Notch1, С ПОМОЩЬЮ АНТАГОНИСТА Notch3
DE102009047243A1 (de) 2009-11-27 2011-06-01 Orgentec Diagnostika Gmbh Monospezifische Polypeptidreagenzien
AU2011205316B2 (en) 2010-01-13 2015-05-28 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch1 binding agents and methods of use thereof
AU2011215685B2 (en) 2010-02-12 2015-08-20 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
JP5450221B2 (ja) 2010-04-14 2014-03-26 株式会社神戸製鋼所 高電流密度ガスシールドアーク溶接方法
CN107011438B (zh) 2010-05-04 2020-11-20 戊瑞治疗有限公司 结合csf1r的抗体
WO2012003472A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-notch1 antibodies
PL2683406T3 (pl) 2011-03-11 2019-11-29 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Przeciwciała anty-cd40 i ich zastosowania
AU2012339681A1 (en) 2011-11-16 2014-06-19 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Human NOTCH receptor mutations and their use
EP2849785A4 (en) 2012-05-16 2015-12-16 Oncomed Pharm Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH NOTCH2 / 3 ANTIBODIES
WO2014039533A2 (en) 2012-09-04 2014-03-13 Eleison Pharmaceuticals, Llc Preventing pulmonary recurrence of cancer with lipid-complexed cisplatin
WO2014047426A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating hematological malignancies with notch1 antibodies
TWI589590B (zh) 2012-11-07 2017-07-01 輝瑞股份有限公司 抗切口３（ａｎｔｉ-ｎｏｔｃｈ３）抗體及抗體-藥物共軛體
CA2900969A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating pancreatic cancer
WO2015134627A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with notch1 antibodies
US20170023576A1 (en) 2014-04-04 2017-01-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch3 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT2307459E (pt) 2015-03-11
US20110311552A1 (en) 2011-12-22
ZA201009280B (en) 2012-04-25
AU2009269095B2 (en) 2016-05-19
US20130296536A1 (en) 2013-11-07
KR101640099B1 (ko) 2016-07-15
US20170183405A1 (en) 2017-06-29
MA32449B1 (fr) 2011-07-03
HK1151296A1 (en) 2012-01-27
CN102112490A (zh) 2011-06-29
CA2729602A1 (en) 2010-01-14
KR20110028621A (ko) 2011-03-21
SMT201500120B (it) 2015-07-09
CY1116195T1 (el) 2017-02-08
IL210222A (en) 2016-05-31
PL2307051T3 (pl) 2015-07-31
NZ590131A (en) 2012-10-26
MY159815A (en) 2017-02-15
ME02148B (me) 2015-10-20
US9505832B2 (en) 2016-11-29
HRP20150443T1 (hr) 2015-05-22
CN104402998A (zh) 2015-03-11
EP2899211A1 (en) 2015-07-29
JP2012501626A (ja) 2012-01-26
IL210221A0 (en) 2011-03-31
CR20110069A (es) 2011-07-11
WO2010005566A3 (en) 2010-09-16
SG192467A1 (en) 2013-08-30
CA2729306C (en) 2015-08-18
EP2307051B1 (en) 2015-02-11
US20170198031A1 (en) 2017-07-13
US20140011271A1 (en) 2014-01-09
US8945547B2 (en) 2015-02-03
PT2307051E (pt) 2015-05-21
ES2535614T3 (es) 2015-05-13
EP2307051A2 (en) 2011-04-13
EA201170158A1 (ru) 2011-08-30
US8226943B2 (en) 2012-07-24
DOP2011000004A (es) 2011-04-15
MA32448B1 (fr) 2011-07-03
MY155603A (en) 2015-11-13
SMT201500047B (it) 2015-05-05
US20150197563A1 (en) 2015-07-16
EA201170157A1 (ru) 2011-08-30
SI2307051T1 (sl) 2015-04-30
JP2012501625A (ja) 2012-01-26
JP5560270B2 (ja) 2014-07-23
CO6612253A2 (es) 2013-02-01
SI2307459T1 (sl) 2015-04-30
CY1116230T1 (el) 2017-02-08
NZ590127A (en) 2012-11-30
WO2010005566A2 (en) 2010-01-14
US9499613B2 (en) 2016-11-22
IL210221A (en) 2014-02-27
JP5560271B2 (ja) 2014-07-23
MX2011000233A (es) 2011-05-19
DK2307051T3 (en) 2015-04-20
MX2011000236A (es) 2011-02-24
US20120288496A1 (en) 2012-11-15
RS53924B1 (sr) 2015-08-31
ES2531541T3 (es) 2015-03-17
HRP20150256T1 (hr) 2015-04-10
US8425903B2 (en) 2013-04-23
US8945873B2 (en) 2015-02-03
WO2010005567A2 (en) 2010-01-14
CA2729306A1 (en) 2010-01-14
US20130260455A1 (en) 2013-10-03
BRPI0914007A2 (pt) 2015-11-17
BRPI0914004A2 (pt) 2015-11-17
HK1151218A1 (en) 2012-01-27
CO6390041A2 (es) 2012-02-29
US8980260B2 (en) 2015-03-17
AU2009269095A1 (en) 2010-01-14
EP2307459A4 (en) 2012-07-18
EA026109B1 (ru) 2017-03-31
US20100111958A1 (en) 2010-05-06
SG192468A1 (en) 2013-08-30
KR101682490B1 (ko) 2016-12-05
ZA201100029B (en) 2012-03-28
PL2307459T3 (pl) 2015-05-29
EP2307051A4 (en) 2012-07-18
AU2016216568A1 (en) 2016-09-01
WO2010005567A3 (en) 2010-05-27
IL210222A0 (en) 2011-03-31
DOP2011000002A (es) 2011-04-15
US8945874B2 (en) 2015-02-03
CN102112490B (zh) 2014-10-22
RS53750B1 (sr) 2015-06-30
EP2307459B1 (en) 2015-01-07
EP2924051A1 (en) 2015-09-30
DK2307459T3 (da) 2015-02-09
US8435513B2 (en) 2013-05-07
EP2307459A2 (en) 2011-04-13
UA101672C2 (uk) 2013-04-25
US20150166963A1 (en) 2015-06-18
CN102316897A (zh) 2012-01-11
AU2009269096A1 (en) 2010-01-14
CN102316897B (zh) 2014-11-05
AU2009269096B2 (en) 2016-05-12
KR20110031315A (ko) 2011-03-25
US20130280277A1 (en) 2013-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2307459B1 (en) Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
JP5535633B2 (ja) 癌の診断および処置のための組成物および方法
US9132189B2 (en) Notch1 binding agents and methods of use thereof
AU2009269096B9 (en) Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof
HK1151296B (en) Notch1 receptor binding agents and methods of use thereof