[go: up one dir, main page]

MD3582853T2 - Compuși di-nucleotidici ciclici pentru tratamentul cancerului - Google Patents

Compuși di-nucleotidici ciclici pentru tratamentul cancerului

Info

Publication number
MD3582853T2
MD3582853T2 MDE20200009T MDE20200009T MD3582853T2 MD 3582853 T2 MD3582853 T2 MD 3582853T2 MD E20200009 T MDE20200009 T MD E20200009T MD E20200009 T MDE20200009 T MD E20200009T MD 3582853 T2 MD3582853 T2 MD 3582853T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
compound
bond
group
mmol
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Application number
MDE20200009T
Other languages
English (en)
Inventor
Dae-Shik Kim
Frank Fang
Atsushi Endo
Hyeong-Wook Choi
Ming-Hong Hao
Xingfeng Bao
Kuan-Chun Huang
Original Assignee
Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Man Co Ltd filed Critical Eisai R&D Man Co Ltd
Publication of MD3582853T2 publication Critical patent/MD3582853T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/213—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids containing cyclic phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6581—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6587—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms having two phosphorus atoms as ring hetero atoms in the same ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Sunt prezentaţi compuşi utili pentru tratamentul cancerului.

Description

REFERINŢE LA APLICAŢII ÎNRUDITE
Această aplicaţie revendică beneficiul Cererii de brevet provizorie US nr. 62/460.562, depusă la 17 februarie 2017; Cererea de brevet provizorie US nr. 62/479.169, depusă la 30 martie 2017; Cererea de brevet provizorie US nr. 62/551.645, depusă la 29 august 2017; Cererea de brevet provizorie US nr. 62/551.647, depusă la 29 august 2017; şi Cererea de brevet provizorie US nr. 62/551.668, depusă la 29 august 2017.
CONTEXT
STING (stimulator al genelor interferonului) este o moleculă de semnalizare în răspunsul înnăscut la dsA DNdin citozol. Deleţia STING a fost raportată în mai multe tipuri de cancere la om. În plus, dereglarea semnalizării STING în cancerele umane a fost raportată şi în melanom (Xia T, şi colab., "Recurrent Loss of STING Signaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis" Cancer Res. 2016) şi cancer de colon. (Xia T, şi colab., "Deregulation of STING Signaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Corelates With Tumorigeneza" Cell Rep. 2016;14:282-97). Interesant este că în acele studii, rezultatele analizei genomice au arătat că pierderea expresiei STING nu se datorează ştergerii sau mutaţiei genei, ci prin modificări epigenetice. (Xia, Cancer Res. 2016; Xia, Cell Rep. 2016). Activitatea de protecţie a cancerului STING este susţinută şi de dovezi obţinute din studiile pe modele de şoarece. Soarecii STING knockout au demonstrat un control deficient al tumorii. (Woo SR, şi colab. "STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immune recognition of immunogenic tumors" Immunity 2014;41:830-42).
În plus, rolul STING în protejarea ontogenezei a fost demonstrat în mai multe modele spontane de şoarece, inclusiv gliom (Ohkuri T, şi colab., "Protective role of STING against gliomagenesis: Rational use of STING agonist in anti-glioma immunotherapy" Oncoimmunology. 2015;4:e999523), şi cancer de colon (Zhu Q, et al., "Cutting edge: STING mediates protection against colorectal tumorigenesis by governing the magnitude of intestinal inflammation" J. Immunol. 2014;193:4779-82). Acest efect antitumoral se poate datora capacităţii sale de a contracara supraactivarea NF-kB şi STAT3. (Okihuri 2015). Activarea căii STING a arătat, de asemenea, activitate puternică în modelele preclinice de tumori de şoarece. (Woo 2014; Chandra D, şi colab. "STING ligand c-di-GMP improves cancer vaccination against metastatic breast cancer" Cancer Immunol Res. 2014;2:901-10; Corrales L, şi colab., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity" Cell Rep. 2015;11:1018-30; Curran E, şi colab. "STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunity against Acute Myeloid Leukemia" Cell Rep. 2016;15:2357-66; Tang CH, şi colab. "Agonist-Mediated Activation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells" Cancer Res. 2016;76:2137-52). Această activitate antitumorală se datorează probabil perturbării vascularizaţiei tumorii şi este urmată de inducerea răspunsului imun adaptativ. (Corrales L, şi colab., "The host STING pathway at the interface of cancer and immunity" J. Clin. Invest. 2016;126:2404-11). Dinucleotidele ciclice cu diferite structuri multiciclice au fost propuse recent ca posibili modulatori ai STING (WO 2015/185565 A1). De asemenea, derivaţii ciclic-GMP-AMP (cGAMP) ca agenţi pentru modificarea semnalizării mesagerului secund şi ca lianţi ai STING au fost descrişi (WO 2014/179335 A1). Mai mult, activarea STING prin analogi ciclici de adenozină-inozin monofosfat (cAIMP) a fost explorată pentru a dezvolta imunoterapii ţintite spre STING (Lioux T, şi colab. "Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine-lnosine Monophosphate (cAIMP) Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes (STING)" J. Med. Chem. 2016;59:10253-267). În consecinţă, stimularea directă a STING într-un micromediu tumoral de către un agonist poate reprezenta o abordare pentru tratarea mai multor tipuri de cancer.
SCURT REZUMAT
Realizările pot furniza un compus cu Formula (I):
(în care P1 este fosforul din stânga jos şi P2 fosforul din dreapta sus, aşa cum este descris mai sus) având substituenţi şi stereochimia aşa cum este indicat în Tabelul 1, de mai jos, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. El
indică o singură legătură sau o dublă legătură.
Acolo unde un atom de fosfor are patru substituenţi care diferă, acel atom de fosfor va fi un stereocentru. SpSp/RpRp/SpRp/RpSp se referă la stereochimia fosforului aşa cum este indicat.
TABELUL 1
Compus # n Geometrie (Trans, Cis, sau Saturat) X1 X2 configuraţie stereochimică (P1) configuraţie stereochimică (P2) 1 1 Trans SH SH S R 2 1 Trans SH SH R R 3 1 Trans SH SH S S 4 1 Cis SH SH R R 5 1 Cis SH SH S R 6 1 Saturat SH SH S R 8 2 Trans SH SH Nedeterminat Nedeterminat 9 1 Trans OH OH n/a n/a 11 2 Trans SH SH Nedeterminat Nedeterminat 12 2 Trans SH SH Nedeterminat Nedeterminat
Realizările pot furniza în continuare un compus cu Formula (II):
având substituenţi şi stereochimia aşa cum este indicat în Tabelul 2, de mai jos, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestora. Acolo unde un atom de fosfor are patru substituenţi care diferă, acel atom de fosfor va fi un stereocentru.
TABELUL 2
Compus # R4a Configuraţie geometrică configuraţie stereochimică (P1, P2) 13 -OH trans S,R 14 -OH trans R,R 15 -F trans S,R 16 -F trans R,R
Realizările pot furniza în continuare un compus cu Formula (III):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care
R1a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F;
R1b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, în care cel puţin unul dintre R1a şi R1b este -H;
R4a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F;
R4b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, în care cel puţin unul dintre R4a şi R4b este -H;
P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R;
Z este -O- sau -NH-;
X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S;
X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5;
în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchilC1-6, -C(O)alchilC1-6, şi -CH2OC(O)OalchilC1-6;
L1 în formula (III) este patru, cinci sau şase atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă sau o legătură triplă şi în care (i) fie 0, sau 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă; sau (ii) 0, 1 sau 2 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; şi (iii) în care când 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă sau 0 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă; şi (iv) în care, când 2 apariţii de
în L1 indică o legătură dublă, acele legături duble sunt fie legături adiacente, sau legături alternante;
în care X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH2-, sau - CH-, în care -CH2- sau -CH- este nesubstituit sau substituit prin (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2, sau (v) -D, şi când X10 sau X15 este o legătură, această legătură nu este o dublă legătură sau triplă legătură;
şi în care oricare doi membri adiacenţi ai grupului incluzând X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 poate forma opţional, cu atomi suplimentari, un cicloalchil C3 sau un heterocicloalchil C3, numitul heterocicloalchil C3 incluzând un atom de N sau O;
în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (III).
În unele exemple de realizare în care L1 include o legătură triplă sau mai mult de o legătură dublă, L1 poate fi, de exemplu,
sau
Realizările pot furniza în continuare un compus cu Formula (III):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care
R1a este selectat din grupul constând din -H şi -F;
R1b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R1a şi R1b nu poate fi -F;
R4a este selectat din grupul constând din -H şi -F;
R4b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R4a şi R4b nu poate fi -H;
P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R;
X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S;
X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5;
în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchilC1-6, şi -C(O)alchilC1-6;
L1 în formula (III) este patru sau cinci atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă şi în care fie 0, sau 1 apariţie
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans;
în care X10 şi X14 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH-, sau -CH2-, şi în care, când X10 sau X14 este o legătură, această legătură nu este o dublă legătură;
în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (III).
Realizările pot furniza un compus cu Formula (IV):
(IV) sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care
R1a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F;
R1b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, în care cel puţin unul dintre R1a şi R1b este -H;
R4a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F;
R4b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, în care cel puţin unul dintre R4a şi R4b este -H;
P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R;
X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S;
X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5;
în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchilC1-6, -C(O)alchilC1-6, şi -CH2OC(O)OalchilC1-6;
L1 în formula (IV) este patru, cinci sau şase atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă sau o legătură triplă şi în care (i) fie 0, sau 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă; sau (ii) 0, 1 sau 2 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; şi (iii) în care când 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă sau 0 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă; şi (iv) în care, când 2 apariţii de
în L1 indică o legătură dublă, acele legături duble sunt fie legături adiacente, sau legături alternante;
în care X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH2-, sau - CH-, în care -CH2- sau -CH- este nesubstituit sau substituit prin (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2, sau (v) -D, şi când X10 sau X15 este o legătură, această legătură nu este o dublă legătură sau triplă legătură;
şi în care oricare doi membri adiacenţi ai grupului incluzând X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 poate forma opţional, cu atomi suplimentari, un cicloalchil C3 sau un heterocicloalchil C3, numitul heterocicloalchil C3 incluzând un atom de N sau O;
în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (IV).
Realizările pot furniza în continuare un compus cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care
R1a este selectat din grupul constând din -H şi -F;
R1b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R1a şi R1b nu poate fi -F;
R4a este selectat din grupul constând din -H şi -F;
R4b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R4a şi R4b nu poate fi -H;
P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R;
X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S;
X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5;
în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchilC1-6, şi -C(O)alchilC1-6;
L1 în formula (IV) este patru sau cinci atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă şi în care fie 0, sau 1 apariţie
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans;
în care X10 şi X14 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH-, sau -CH2-, şi în care, când X10 sau X14 este o legătură, această legătură nu este o dublă legătură;
în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (IV).
Realizările pot furniza un compus cu Formula (V):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care
R1a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F;
R1b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, în care cel puţin unul dintre R1a şi R1b este -H;
R4a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F;
R4b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, şi în care cel puţin unul dintre R4a şi R4b este -H;
P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R;
X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S;
X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5;
în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchilC1-6, -C(O)alchilC1-6, şi -CH2OC(O)OalchilC1-6;
L1 în formula (V) este patru, cinci sau şase atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă sau o legătură triplă şi în care (i) fie 0, sau 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă; sau (ii) 0, 1 sau 2 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; şi (iii) în care când 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă sau 0 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă; şi (iv) în care, când 2 apariţii de
în L1 indică o legătură dublă, acele legături duble sunt fie legături adiacente, sau legături alternante;
în care X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH2-, sau - CH-, în care -CH2- sau -CH- este nesubstituit sau substituit prin (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2, sau (v) -D, şi când X10 sau X15 este o legătură, această legătură nu este o dublă legătură sau triplă legătură;
şi în care oricare doi membri adiacenţi ai grupului incluzând X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 poate forma opţional, cu atomi suplimentari, un cicloalchil C3 sau un heterocicloalchil C3, numitul heterocicloalchil C3 incluzând un atom de N sau O;
în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (IV).
Realizările pot furniza în continuare un compus cu Formula (V):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care
R1a este selectat din grupul constând din -H şi -F;
R1b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R1a şi R1b nu poate fi -F;
R4a este selectat din grupul constând din -H şi -F;
R4b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R4a şi R4b nu poate fi -H;
P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R;
X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S;
X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchil C1-6, şi -C(O)alchil C1-6;
L1 în formula (V) are patru sau cinci atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă şi în care fie 0, sau 1 apariţie
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans;
în care X10 şi X14 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH-, sau -CH2-, şi în care, când X10 sau X14 este o legătură, această legătură nu este o dublă legătură;
în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (IV).
În unele realizări ale compuşilor şi/sau sărurilor, aşa cum este raportat în formulele de mai sus, (i) configuraţia stereochimică a lui P1 şi P2 sunt ambele R, configuraţia stereochimică a lui P1 este R şi P2 este S sau configuraţia stereochimică a lui P1 este S şi P2 este R; (ii) o apariţie a
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este trans; şi (iii) Z este -O-.
Alte variante de realizare ale compuşilor şi/sau sărurilor, aşa cum sunt raportate în Formulele de mai sus, pot fi găsite în alte aspecte de aici. De exemplu, unele realizări furnizează un compus sau o sare acceptabilă farmaceutic în care R1a şi R4a sunt fiecare -F. În unele variante de realizare, R1b şi R4b sunt fiecare -F. În unele variante de realizare B1 şi B2 sunt fiecare
În unele variante de realizare X1a şi X2a sunt ambele =O şi X1b şi X2b sunt ambele -SH. În unele variante de realizare L1 este
În unele variante de realizare, linkerul are o lungime de patru atomi de carbon. În unele variante de realizare linkerul are o lungime de cinci atomi de carbon.
Unele variante de realizare furnizează un compus selectat din grupul constând din:
şi
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Realizările pot furniza un compus sau sare acceptabilă farmaceutic cu unul sau mai multe dintre (i) o valoare EC50 sub 100 micromolar într-un test de raportare celulară care exprimă varianta genetică STING HAQ; (ii) o valoare EC50 sub 100 micromolar în celulele reporter care exprimă varianta STING AQ umană; (iii) o valoare EC50 sub 100 micromolar în celulele reporter care exprimă varianta STING WT umană; şi (iv) o valoare EC50 sub 100 micromolar în celulele reporter care exprimă varianta umană STING REF. O variantă de realizare oferă un compus având următoarea structură:
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Alte variante de realizare pot furniza o sare acceptabilă farmaceutic a unui compus raportat aici, în care sarea este o sare de diamoniu. Alte variante de realizare pot furniza compuşi raportaţi aici ca o sare de trietilamină (TEA). Alte variante de realizare pot furniza o compoziţie farmaceutică incluzând un compus sau sare aşa cum este raportat aici şi un excipient acceptabil farmaceutic.
Realizările pot furniza o metodă de tratare a cancerului cuprinzând administrarea la un pacient a unui compus, sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportat aici.
Utilizarea unui compus sau a unei săruri acceptabile farmaceutic a acestuia, aşa cum este raportat aici, pentru prepararea unei compoziţii farmaceutice pentru tratarea cancerului.
Exemplele de realizare pot furniza utilizarea unui compus, sări acceptabile farmaceutic sau compoziţie farmaceutică raportată aici într-un tratament pentru cancer.
Exemplele de realizare pot furniza o metodă de tratare a cancerului cuprinzând identificarea unui individ care are un cancer tratabil printr-un compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau o compoziţie farmaceutică raportată aici; şi administrarea la respectivul individ a unei cantităţi eficiente farmaceutic din compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică prin care cancerul a fost identificat ca fiind tratabil.
În unele realizări individul este identificat ca având un cancer tratabil printr-un compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică raportată aici prin prezenţa unei alele varianta REF STING la pacient.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela REF STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela WT STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela AQ STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela HAQ STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
În unele variante de realizare cancerul este selectat din grupul constând din limfom, melanom, cancer colorectal, cancer mamar, leucemie mieloidă acută, cancer de colon, cancer hepatic, cancer de prostată, cancer pancreatic, cancer renal şi gliom. În unele variante cancerul este metastatic.
În unele variante ale compuşilor cu formulele prezentate aici, una dintre legăturile din L1 este o legătură dublă. În alte variante de realizare, acea dublă legătură are o geometrie trans. În alte variante de realizare L1 este saturat. În anumite variante de realizare L1 include cinci atomi de carbon. În alte variante de realizare L1 include 4 atomi de carbon.
Realizările pot furniza în plus amestecuri de compuşi aşa cum sunt raportate aici, inclusiv amestecuri de stereoizomeri ai acestor compuşi. De exemplu, se poate furniza un amestec de Compus 11 şi Compus 12, sau poate fi furnizat un amestec de Compus 2 şi Compus 4. Desigur, acestea nu sunt exemple limitative şi sunt posibile alte amestecuri.
Variante de realizare particulare sunt prezentate în Tabelul 3 de mai jos.
TABELUL 3
Compus Nr. Structură 1 2 3 4 5 6 8 9
11
23
În tabelul de mai sus, Compuşii 8, 11 şi 12 sunt desenaţi cu aceeaşi formulă structurală şi se referă la trei stereoizomeri separaţi. Solicitantul notează, totuşi, că chiralitatea fosforului din Compusul 8 nu este neapărat aceeaşi cu chiralitatea fosforului pentru alţi compuşi marcaţi "Stereoizomer 1", cum ar fi, de exemplu, Compusul 21. Acelaşi lucru este valabil şi pentru alţi stereoizomeri.
Variantele de realizare se pot referi la linkeri C4-C6 care pot fi legaţi covalent la fiecare capăt de baze purinice sau pirimidinice care fac parte dintr-o dinucleotidă ciclică. Într-o variantă de realizare, linkerii sunt linkeri butenă, pentenă sau hexenă legaţi la fiecare capăt la baze purinice. Într-o altă variantă de realizare, linkerii sunt linkeri butenă legaţi la fiecare capăt la baze purinice; într-o altă variantă de realizare, linkerii sunt linkeri transbutenă cu dubla legătură situată între cei doi atomi de carbon centrali.
Următoarele variante de realizare numerotate sunt ilustrative ale utilizării acestor linkeri C4-C6:
1. Un compus cu Formula (X):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care:
A1 şi A2 sunt fragmente zaharice şi pot fi identice sau diferite;
B3 şi B4 sunt baze purinice sau pirimidinice care pot fi aceleaşi sau diferite şi care formează nucleotide cu, respectiv, A1 şi A2;
L este un linker alchil;
X19 şi X20 sunt aceiaşi sau diferiţi şi sunt selectaţi din grupul constând din -O-, -CH-, -NH- şi -S-, în care -CH- şi -NH- pot fi substituiţi sau nesubstituiţi.
2. Compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic din exemplul de realizare numerotat 1, în care -CH- şi -NH- ale lui X19 şi X20 poate fi înlocuit cu alchil C1-6.
3. Compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic din exemplul de realizare numerotat 1, în care L este butenă, pentenă sau hexan.
4. Compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic din exemplul de realizare numerotat 3, în care L este un linker transbutenă cu o legătură dublă în centrul său.
Compuşii sau sărurile acceptabile farmaceutic ale exemplelor de realizare numerotate pot fi utili, de exemplu, pentru tratarea cancerului. A1, A2, B3, şi B4 mai poate fi substituit cu, de exemplu, hidroxil, halogen sau metoxi. Fiecare fosfor din Formula (X) poate fi substituit, de exemplu, cu -SH, -OH, =O sau =S până când valenţa sa a fost satisfăcută.
Exemplele de analogi de dinucleotide ciclice care pot beneficia de linkerii din prezenta invenţie includ, dar nu se limitează la, cei identificaţi în US 2014/0205653 A1; US 2014/0329889 A1; US 2014/0341976 A1; US 2015/0056224 A1; US 2016/0362441 A1; US 2017/0158724 A1; US 2017/044206 A1; US 5.547.941; US 7.569.555 B2; US 7.592.326 B2; US 7.709.458 B2; US 9.549.944 B2; WO 2009/133560 A1; WO 2015/074145 A1; WO 2015/077354 A1; WO 2015/185565 A1; WO 2016/100261 A1; WO 2016/120305 A1; WO 2016/145102 A1; WO 2017/027645 A1; WO 2017/027646 A1; WO 2017/075477 A1; WO 2017/093933 A1; WO 2017/123657 A1; WO 2017/175156 A1; EP 1740.192 B1; CN 102199183 A; Corrales, L. şi colab., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity," Cell Reports, 11: 1018-1030 (2015); şi Lioux, T. şi colab., "Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine-Inosine Monophosphate (cAIMP) Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes (STING)," J. Med. Chem., 59: 10253-10267 (2016). Toate aceste documente, inclusiv compuşii din acestea, sunt încorporate aici ca referinţă; dacă vreo componentă a oricăruia dintre aceste documente contrazice sau nu este în concordanţă cu ceva din această specificaţie, atunci această specificaţie controlează.
în unele exemple de realizare, un compus aşa cum este raportat aici este furnizat ca acid liber. În unele exemple de realizare, compusul este furnizat ca sare NH4 sau ca sare de trietilamină (TEA).
Exemplele de realizare pot furniza o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are nevoie de acesta, incluzând administrare pacientului a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un compus raportat aici, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, aşa cum s-a menţionat mai sus.
În unele realizări, compusul este administrat ca acid liber. În unele variante de realizare, compusul este administrat ca sare de diamoniu (NH4). Sunt avute în vedere compoziţii farmaceutice incluzând un compus cu Formula I, Formula II, Formula III, Formula IV, Formula V, Tabelul 3 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, precum şi un excipient acceptabil farmaceutic. Realizările pot furniza un compus conform cu Formula I în care n este 1; geometria despre legătura dublă este trans; X1 şi X2 sunt fiecare SH; stereochimia la P1 este S; şi stereochimie la P2 este R; sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
Realizările pot furniza o metodă de tratare a cancerului la un pacient cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, sau a unei compoziţii farmaceutice, aşa cum este raportat aici. Cancerele tratate aşa cum sunt raportate aici pot fi cancere metastatice. Acestea pot fi selectate dintre, de exemplu, limfom, melanom, cancer colorectal, cancer de sân, leucemie mieloidă acută, cancer de colon, cancer de ficat, cancer de prostată, cancer pancreatic, cancer renal şi gliom. Sunt de asemenea avute în vedere utilizări ale compuşilor, sărurilor şi compoziţiilor farmaceutice pentru tratamentul cancerului şi/sau prepararea unui medicament pentru tratamentul cancerului.
Realizările pot furniza o metodă de tratare a cancerului, inclusiv identificarea unui individ care are un cancer tratabil printr-un compus, sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici şi administrarea individului a unui compus, sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică prin care pacientul a fost identificat ca tratabil. În unele variante de realizare, individul este identificat ca având un cancer care poate fi tratat printr-un compus, sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportat aici prin prezenţa unei variante alele umane REF STING la pacient.
Variantele de realizare pot furniza o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela REF STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, sau a unei compoziţii farmaceutice aşa cum este raportat aici.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela WT STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela AQ STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
Unele variante de realizare furnizează o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are alela HAQ STING cuprinzând administrarea la respectivul pacient a unui compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau compoziţie farmaceutică aşa cum este raportată aici.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
FIG. 1 prezintă o sinteză a Compusului 1a şi Compusului 2a.
FIG. 2A şi FIG. 2B prezintă o sinteză alternativă a Compusului 1 şi Compusului 1a. Sinteza alternativă este de asemenea arătată în FIG. 2C prin FIG. 2E.
FIG. 3 arată o spectrogramă 1H RMN pentru Compusul 1.
FIG. 4A, FIG. 4B, şi FIG. 4C, arată rezultatele cristalografiei cu raze X (desene ORTEP) pentru, respectiv, un cristal asimetric al Compusului 1, o primă moleculă din cristalul asimetric şi o a doua moleculă din cristalul asimetric.
FIG. 4D arată rezultatele cristalografiei cu raze X (desen ORTEP) pentru un cristal al Compusului 2.
FIG. 5A şi FIG. 5B prezintă o cale de sinteză pentru Compuşii 18, 19 şi 20.
FIG. 6 prezintă o hartă a vectorului de expresie pentru WT STING (pLenti-WT uman STING-Puro).
FIG. 7 şi FIG. 8 însoţesc Exemplul 108 şi arată activitatea curativă a Compusului 1a într-un model de tumoare duală CT26.
FIG. 9 însoţeşte Exemplul 109 şi prezintă un grafic al volumului tumorii pentru tumorile tratate şi curba de supravieţuire.
FIG. 10 însoţeşte Exemplul 110 şi prezintă un grafic al volumului tumorii pentru tumorile tratate şi curba de supravieţuire.
FIG. 11 prezintă o imagine a structurii cristaline cu raze X a WT STING uman în complex cu Compusul 1.
FIG. 12 prezintă domeniul C-terminal REF STING uman în complex cu Compusul 1.
FIG. 13 prezintă un exemplu de sinteză a Compusului 38 şi Compusului 39.
DESCRIEREA DETALIATĂ A REALIZĂRILOR
Aici sunt furnizaţi compuşi care pot fi utili în tratarea cancerului. Compuşii pot activa stimulatorul genelor interferonului (STING).
În unele variante de realizare, compusul este furnizat ca acid liber. În unele variante de realizare, compusul este furnizat ca, de exemplu, o sare NH4 sau o sare TEA. Referirea la un număr de compus urmat de un "a" va indica o sare de diamoniu a compusului dat. De exemplu, "Compusul 1a" se referă la sarea de diamoniu a Compusului 1.
Realizările pot furniza o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are nevoie de acesta, incluzând administrarea pacientului a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un compus cu Formula I, Formula II, Formula III, Formula IV sau Formula V sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
În unele variante de realizare, compusul este administrat ca acid liber. În unele variante de realizare, compusul este administrat ca, de exemplu, o sare diamoniu (NH4). Compoziţiile farmaceutice pentru tratarea cancerului pot fi, de asemenea, furnizate incluzând un compus raportat aici sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, precum şi un excipient acceptabil farmaceutic.
Realizările aşa cum sunt raportate aici pot fi utilizate pentru a trata cancerul sau pentru a prepara medicamente utile pentru tratamentul cancerului. "Cancer" poate include, dar nu se limitează la, cancer de colon, cancer de ficat, melanom, cancer colorectal, cancer de sân, leucemie mieloidă acută şi gliom.
Specialiştii în domeniu vor recunoaşte că acolo unde substituenţii se leagă de atomii de fosfor (P1,P2) au atât legături simple, cât şi duble, pot fi susceptibile la tautomerizare. De exemplu, compuşii pot tautomeriza la echilibru. Un exemplu este prezentat mai jos:
Astfel de tautomeri ar trebui consideraţi ca fiind în domeniul de aplicare al revendicărilor. O reprezentare structurală a oricărui tautomer pentru un compus dat va reprezenta acelaşi compus.
În unele variante de realizare, compusul selectat din grupul constând din compuşii raportaţi aici este furnizat ca un acid liber sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În unele variante de realizare, compusul selectat din grupul constând din compuşii raportaţi aici este furnizat ca o sare NH4, care poate fi o sare de diamoniu.
Aşa cum este folosit aici, "alchil C1-6"; sau alchil "C1-6" este destinat să includă grupări C1, C2, C3, C4, C5 sau C6 de hidrocarburi alifatice saturate cu catenă dreapt[ (liniară) şi grupări C3, C4, C5 sau C6 de hidrocarburi alifatice saturate ramificate. De exemplu, alchil C1-6 este destinat să includă grupări C1, C2, C3, C4, C5 şi alchil C6. Exemplele de alchil includ fragmente având de la unu la şase atomi de carbon, cum ar fi, dar fără a se limita la, metil, etil, n-propil, i-propil, n-butil, s-butil, t-butil, n-pentil, s-pentil sau n-hexil. În mod similar, "alchil C1-3" sau "alchil C1-C3" este destinat să includă grupări C1, C2, sau C3 de hidrocarburi alifatice saturate cu catenă liniară (liniară) şi grupări C3 de hidrocarburi alifatice saturate ramificate.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "cicloalchil C3-6"; sau "cicloalchil C3-6"; se referă la un inel de hidrocarbură nearomatică saturată sau nesaturată având 3 până la 6 atomi de carbon (de ex., C3-C6). Exemplele de cicloalchil includ, dar nu se limitează la, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclohexil, cicloheptil, ciclopentenil şi ciclohexenil. Termenul "cicloalchil C5-6"; sau "cicloalchil C5-6"; se referă la un inel de hidrocarbură nearomatică saturată sau nesaturată având 5 sau 6 atomi de carbon (de ex., C5-6).
Termenul "heterocicloalchil C5-6"; sau "heterocicloalchil C5-6" se referă la un monociclu saturat sau nesaturat cu 5-6 membri având unul sau mai mulţi heteroatomi (cum ar fi O, N sau S), dacă nu se specifică altfel. Termenul "heterocicloalchil C4-6"; sau "heterocicloalchil C4-6" se referă la un monociclu saturat sau nesaturat cu 4-6 membri având unul sau mai mulţi heteroatomi (cum ar fi O, N sau S), dacă nu se specifică altfel. Exemplele de grupări heterocicloalchil includ, dar nu se limitează la, piperidinil, piperazinil, pirolidinil, dioxanil, tetrahidrofuranil, izoindolinil, indolinil, imidazolidinil, pirazolidinil, oxazolidinil, izoxazolidinil, triazolidinil, oxiranil, azetidinil, oxetanil, tietanil, 1,2,3,6-tetrahidropiridinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiofen, dihidropiranil, piranil, morfolinil, 1,4-diazepanil, 1,4-oxazepanil şi altele asemenea.
Exemplele suplimentare de grupări heterocicloalchil includ, dar nu sunt limitate la, acridinil, azocinil, benzimidazolil, benzofuranil, benzotiofuranil, benzotiofenil, benzoxazolil, benzoxazolinil, benztiazolil, benztriazolil, benztetrazolil, benzizoxazolil, benzizotiazolil, benzimidazolinil, carbazolil, 4aH-carbazolil, carbolinil, cromanil, cromenil, cinolinil, decahidrochinolinil, 2H,6H-1,5,2-ditiazinil, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofuran, furanil, furazanil, imidazolidinil, imidazolinil, imidazolil, 1H-indazolil, indolenil, indolinil, indolizinil, indolil, 3H-indolil, izatinoil, izobenzofuranil, izocromanil, izoindazolil, izoindolinil, izoindolil, izochinolinil, izotiazolil, izoxazolil, metilendioxifenil, morfolinil, naftiridinil, octahidroizochinolinil, oxadiazolil, 1,2,3-oxadiazolil, 1,2,4-oxadiazolil, 1,2,5-oxadiazolil, 1,3,4-oxadiazolil, 1,2,4-oxadiazol5(4H)-onă, oxazolidinil, oxazolil, oxindolil, pirimidinil, fenantridinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, fenoxatinil, fenoxazinil, ftalazinil, piperazinil, piperidinil, piperidonil, 4-piperidonil, piperonil, pteridinil, purinil, piranil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolinil, pirazolil, piridazinil, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinil, piridil, pirimidinil, pyrrolidinil, pirolinil, 2H-pirolil, pirolil, chinazolinil, chinolinil, 4H-chinolizinil, chinoxalinil, chinuclidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidroizochinolinil, tetrahidrochinolinil, tetrazolil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, 1,2,3-tiadiazolil, 1,2,4-thiadiazolil, 1,2,5-tiadiazolil, 1,3,4-tiadiazolil, tiantrenil, tiazolil, tienil, tienotiazolil, tienooxazolil, tienoimidazolil, tiofenil, triazinil, 1,2,3-triazolil, 1,2,4-triazolil, 1,2,5-triazolil, 1,3,4-triazolil şi xantenil.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "aril C5-6" sau "aril C5-C6"; se referă la un inel de hidrocarbură aromatică având 5 până la 6 atomi de carbon (de ex., C5-C6) care nu conţine nici un heteroatom în structura inelului.
Termenul "heteroaril C3-6"; sau "heteroaril C3-C6; se referă la un monociclic aromatic cu 3-6 membri având unul sau mai mulţi heteroatomi (cum ar fi O, N sau S), dacă nu se specifică altfel, cu excepţia faptului că un ciclu heteroaril va include nu mai mult de un atom de oxigen sau un atom de sulf. Termenul "alchenil C2-6"; include grupări alifatice nesaturate având 2, 3, 4, 5 sau 6 atomi de carbon şi care conţin cel puţin o legătură dublă. De exemplu, termenul "alchenil C2-6"; include grupări alchenil cu catenă liniară (de ex., etenil, propenil, butenil, pentenil, hexenil) şi grupări alchenil ramificate. În anumite variante de realizare, un lanţ liniar sau o grupare alchenil ramificată are şase sau mai puţini atomi de carbon în scheletul său (de ex., C2-C6 pentru lanţ liniar, C3-C6 pentru lanţ ramificat). Termenul "alchenil C2-6"; include grupări alchenil care conţin doi până la şase atomi de carbon.
Termenul "alchinil C2-6"; include grupări alifatice nesaturate având 2, 3, 4, 5 sau 6 atomi de carbon şi care conţin cel puţin o legătură triplă. De exemplu, "alchinil"; include grupări alchinil cu catenă liniară (de ex., etinil, propinil, butinil, pentinil, hexinil) şi grupări alchinil ramificate. În anumite variante de realizare, o grupare alchinil cu catenă liniară sau ramificată are şase sau mai puţini atomi de carbon în scheletul său (de ex., C2-C6 pentru catena dreaptă, C3-C6 pentru catena ramificată). Termenul "alchinil C2-C6"; include grupări alchinil care conţin doi până la şase atomi de carbon.
Metode de tratament
Realizările pot furniza o metodă de tratare a cancerului la un pacient care are nevoie de acesta, incluzând administrarea pacientului a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un compus raportat aici sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
În unele variante de realizare, compusul administrat este furnizat ca un acid liber sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În unele variante de realizare, compusul administrat este furnizat ca o sare NH4 a unui acid liber sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia. În unele variante de realizare, compusul este furnizat ca o sare NH4.
Termenul "substituit opţional"; se referă la un fragment având substituenţi desemnaţi s[ înlocuiasc[ unul sau mai mulţi atomi de hidrogen pe unul sau mai mulţi atomi care poartă hidrogen în fragment.
Substanţele chimice aşa cum sunt denumite sau descrise sunt destinate să includă toţi izotopii naturali ai atomilor care apar în compuşii prezenţi. Izotopii includ acei atomi care au acelaşi număr atomic, dar numere de masă diferite. Cu titlu de exemplu general şi fără limitare, izotopii de 1H hidrogen include tritiu şi deuteriu şi izotopi ai 12C carbon include 13C;i 14C.
Dozări
Doza optimă pentru tratamentul cancerului poate fi determinată empiric pentru fiecare individ folosind metode cunoscute şi va depinde de o varietate de factori, inclusiv de activitatea agenţilor; vârsta, greutatea corporală, starea generală de sănătate, sexul şi dieta individului; timpul şi calea de administrare; şi alte medicamente pe care persoana le ia. Dozele optime pot fi stabilite folosind teste de rutină şi proceduri care sunt bine cunoscute în domeniu. Administrarea compuşilor de mai sus poate fi pe orice cale adecvată.
"Sare acceptabilă farmaceutic" aşa cum este utilizat aici se referă la sărurile de adiţie acidă sau sărurile de adiţie de bază ale compuşilor din prezenta dezvăluire. O sare acceptabilă farmaceutic este orice sare care păstrează activitatea compusului părinte şi nu conferă nici un efect dăunător sau nedorit nejustificat asupra subiectului căruia i se administrează şi în contextul în care este administrată. Sărurile acceptabile farmaceutic includ, dar nu se limitează la, complecşi metalici şi săruri ale acizilor anorganici şi carboxilici. Sărurile acceptabile farmaceutic includ, de asemenea, săruri metalice precum aluminiu, calciu, fier, magneziu, mangan şi săruri complexe. În plus, sărurile acceptabile farmaceutic includ, dar nu se limitează la, săruri acide cum ar fi acetic, aspartic, alchilsulfonic, arilsulfonic, axetil, benzensulfonic, benzoic, bicarbonic, bisulfuric, bitartric, butiric, edetat de calciu, camsilic, carbonic, clorbenzoic, edetic, edisilic, estolic, esil, esilic, formic, fumaric, gluceptic, gluconic, glutamic, glicolic, glicolilarsanilic, hexamic, hexilrezorcinoic, hidrabamic, bromhidric, clorhidric, clorhidrat, hidroiodic, hidroxinaftonic, izetionic, lactic, lactobionic, maleic, malic, malonic, mandelic, metansulfonic, metilnitric, metilsulfuric, mucic, muconic, napsilic, nitric, oxalic, p-nitrometansulfonic, pamoic, pantotenic, fosforic, monohidrogen fosforic, dihidrogen fosforic, ftalic, poligalacturoric, propionic, salicilic, stearic, succinic, sulfamic, sulfonilic, sulfonic, sulfanic, sulfonic, sulfuric, tanic, tartric, teoclic, toluensulfonic şi altele asemenea. De asemenea, pot fi preparate săruri de sodiu şi săruri de potasiu.
Exemplele de realizare pot fi săruri de diamoniu. Sărurile acceptabile farmaceutic pot fi derivate din aminoacizi incluzând, dar fără a se limita la, cisteină. Metodele de producere a compuşilor ca săruri sunt cunoscute specialiştilor în domeniu (vezi, de ex., Stahl şi colab., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH; Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002; Berge şi colab., J. Pharm. Sci. 66: 1, 1977 ).
O "cantitate eficientă" dintr-un agent terapeutic este o cantitate suficientă pentru a oferi un beneficiu terapeutic observabil în comparaţie cu cancerul lăsat netratat la un subiect sau pacient.
Agenţii activi aşa cum sunt raportaţi aici pot fi combinaţi cu un purtător acceptabil farmaceutic pentru a furniza formulări farmaceutice ale acestora. Alegerea particulară a purtătorului şi a formulării va depinde de calea particulară de administrare pentru care este destinată compoziţia.
"Purtător acceptabil farmaceutic" aşa cum este utilizat aici se referă la un purtător, adjuvant sau vehicul netoxic care nu distruge activitatea farmacologică a compusului cu care este formulat. Purtătorii, adjuvanţii sau vehiculele acceptabile farmaceutic care pot fi utilizaţi în compoziţiile acestei invenţii includ, dar nu se limitează la, acid sorbic, sorbat de potasiu, amestecuri parţiale de gliceride de acizi graşi vegetali saturaţi, apă, săruri sau electroliţi, fosfat acid disodic, fosfat acid de potasiu, clorură de sodiu, săruri de zinc, silice coloidal[, trisilicat de magneziu, polivinil pirolidonă, substanţe pe bază de celuloză, polietilenglicol, carboximetilceluloză de sodiu, poliacrilaţi, ceruri, polietilenglicol şi grăsime de lână.
Compoziţiile prezentei invenţii pot fi adecvate pentru administrare parenterală, orală, spray de inhalare, topică, rectală, nazală, bucală, vaginală sau cu rezervor implantat etc. În unele exemple de realizare, formularea cuprinde ingrediente care provin din surse naturale sau nenaturale. În unele variante de realizare, formularea sau purtătorul poate fi furnizat într-o formă sterilă. Exemple nelimitative de purtător steril includ apă fără endotoxine sau apă apirogenă.
Termenul "parenteral" aşa cum este utilizat aici include tehnici de injecţie sau perfuzie subcutanată, intravenoasă, intramusculară, intraarticulară, intrasinovială, intrasternală, intratecală, intrahepatică, intralezională şi intracraniană. În realizări particulare, compuşii sunt administraţi intravenos, oral, subcutanat sau prin administrare intramusculară. Formele injectabile sterile ale compoziţiilor din invenţie pot fi suspensii apoase sau oleaginoase. Aceste suspensii pot fi formulate conform tehnicilor cunoscute în domeniu utilizând agenţi adecvaţi de dispersare sau umectare şi agenţi de suspendare. Preparatul injectabil steril poate fi, de asemenea, o soluţie sau suspensie injectabilă sterilă într-un diluant sau solvent netoxic acceptabil parenteral. Printre vehiculele şi solvenţii acceptabili care pot fi utilizaţi sunt apă, soluţie Ringer şi soluţie izotonică de clorură de sodiu. În plus, uleiurile sterile fixate sunt convenţional utilizate ca un solvent sau mediu de suspendare.
În acest scop, poate fi folosit orice ulei fixat blând inclusiv mono- sau di-gliceride sintetice. Acizii graşi şi derivaţii săi gliceridici sunt utili în prepararea injectabilelor, ca şi uleiurile naturale acceptabile farmaceutic, cum ar fi ulei de măsline sau ulei de ricin, în special în variantele lor polioxietilate. Aceste soluţii sau suspensii pot conţine, de asemenea, un diluant sau dispersant alcool cu catenă lungă, cum ar fi carboximetil celuloză sau similar, agenţi de dispersie care sunt utilizaţi în mod obişnuit în formularea de forme de dozare acceptabile farmaceutic, incluzând emulsii şi suspensii. Pot fi utilizaţi şi alţi surfactanţi utilizaţi în mod obişnuit, cum ar fi Tweens, Spans şi alţi agenţi de emulsifiere care sunt utilizaţi în mod obişnuit la fabricarea unor forme de dozare solide, lichide sau alte forme acceptabile farmaceutic în scopuri de formulare.
Pentru administrare orală, un compus sau sare poate fi furnizat într-o formă de dozare orală acceptabilă, incluzând, dar fără a se limita la, capsule, tablete, suspensii sau soluţii apoase. În cazul tabletelor pentru uz oral, purtătorii utilizaţi în mod obişnuit includ, dar nu se limitează la, lactoză şi amidon de porumb. Se pot adăuga de asemenea agenţi de lubrifiere, cum ar fi stearat de magneziu. Pentru administrarea orală sub formă de capsule, diluanţii utili includ lactoza şi amidonul de porumb uscat. Atunci când sunt necesare suspensii apoase pentru utilizare orală, ingredientul activ este combinat cu agenţi de emulsifiere şi suspendare. Dacă se doreşte, se pot adăuga, de asemenea, anumiţi agenţi de îndulcire, aromatizare sau coloranţi. În plus, se pot adăuga şi conservanţi. Exemplele adecvate de conservanţi acceptabili farmaceutic includ, dar nu se limitează la, diverşi agenţi antibacterieni şi antifungici, cum ar fi solvenţi, de exemplu etanol, propilenglicol, alcool benzilic, clorbutanol, săruri de amoniu cuaternar şi parabeni (cum ar fi metil paraben, etil paraben, propil paraben etc.).
"Eliberarea imediată" este menită să includă o eliberare convenţională, în care eliberarea medicamentului începe imediat după administrare. Aşa cum este utilizat aici, termenul "eliberare imediată" include forme de dozare care permit medicamentului să se dizolve în conţinutul gastrointestinal, fără intenţia de a întârzia sau prelungi dizolvarea sau absorbţia medicamentului. Obiectivul este ca medicamentul să fie eliberat rapid după administrare, de exemplu să fie posibilă eliberarea a cel puţin 80% din medicament în aproximativ 30 de minute după începerea dizolvării într-un test de dizolvare.
"Eliberare susţinută" sau "eliberare prelungită" include forme de dozare ale căror caracteristici de eliberare a medicamentului în timp şi/sau locaţie sunt alese pentru a îndeplini obiective terapeutice sau de comoditate care nu sunt oferite de formele de dozare convenţionale, cum ar fi o soluţie sau o formă de dozare cu eliberare imediată.
Termenul "stare de echilibru" înseamnă că a fost atins un nivel în plasmă pentru un anumit agent activ şi care este menţinut cu dozele ulterioare de agent activ la un nivel care este la sau peste nivelul terapeutic minim eficient şi este sub nivelul minim de toxicitate plasmatic pentru un anumit agent activ.
Termenul "formulare unică" aşa cum este utilizat aici se referă la un singur purtător sau vehicul formulat pentru a furniza cantităţi eficiente din ambii agenţi terapeutici unui pacient. Vehiculul unic este conceput pentru a furniza o cantitate eficientă din fiecare dintre agenţi împreună cu orice purtători sau excipienţi acceptabili farmaceutic. în unele variante de realizare, vehiculul este o tabletă, capsulă, pilulă sau un plasture.
Termenul "doză unitară" este utilizat aici pentru a semnifica administrarea simultană a ambilor agenţi împreună, într-o formă de dozare, la pacientul care este tratat. În unele variante de realizare, doza unitară este o singură formulare. În anumite variante de realizare, doza unitară include unul sau mai multe vehicule astfel încât fiecare vehicul include o cantitate eficientă dintr-un agent împreună cu purtători şi excipienţi acceptabili farmaceutic. În unele variante de realizare, doza unitară este una sau mai multe tablete, capsule, pilule sau plasturi administrate pacientului în acelaşi timp.
Termenul "interval de doză" aşa cum este utilizat aici se referă la o limită superioară şi inferioară a unei variaţii acceptabile a cantităţii de agent specificate. De obicei, o doză dintr-un agent în orice cantitate din intervalul specificat poate fi administrată pacienţilor aflaţi în tratament.
Termenul "tratare" este utilizat aici pentru a însemna ameliorarea, reducerea sau atenuarea a cel puţin unui simptom al unei boli la un subiect. De exemplu, în legătură cu cancerul, termenul "tratare" poate însemna oprirea, întârzierea debutului (adică, perioada anterioară manifestării clinice a unei boli sau simptom al unei boli) şi/sau reducerea riscului de a dezvolta sau agrava un simptom al unei boli. Termenul "protejare" este utilizat aici pentru a însemna prevenirea întârzierii sau tratarea, sau toate, după caz, dezvoltarea sau continuarea sau agravarea simptomelor bolii la un subiect.
Termenul "subiect" sau "pacient" este destinat să includă animale care sunt capabile să sufere de sau să fie afectate de cancer. Exemplele de subiecţi sau pacienţi includ mamifere, de ex., oameni, câini, vaci, cai, porci, oi, capre, pisici, şoareci, iepuri, şobolani şi animale transgenice non-umane. În anumite variante de realizare, subiectul este un om, de ex., un om care suferă de, riscă să sufere de cancer sau este posibil să sufere de cancer.
Termenul "în jurul a" sau "aproximativ" înseamnă de obicei în 20%, mai preferabil în 10%, şi cel mai preferabil încă în 5% dintr-o valoare sau un interval dat. Alternativ, în special în sistemele biologice, termenul "în jurul a" înseamnă aproximativ în interiorul unui log (adică, un ordin de mărime), de preferinţă într-un factor de doi dintr-o valoare dată.
Utilizarea termenilor "o" şi "un" şi "ul" şi referiri similare în contextul descrierii invenţiei (în special în contextul următoarelor revendicări) trebuie interpretate ca acoperă atât singularul cât şi pluralul, cu excepţia cazului în care e altfel indicat aici sau clar contrazis de context. Termenii "cuprinzând", "având", "incluzând" şi "conţinând" trebuie interpretaţi ca termeni cu caracter deschis (adică, însemnând "incluzând, dar fără a se limita la"), dacă nu se specifică altfel. Menţionarea intervalelor de valori în acest document este doar destinată să servească drept o metodă scurtă de referire individual[ la fiecare valoare separată care se încadrează în interval, dacă nu se indică altfel aici, şi fiecare valoare separată este încorporată în specificaţie ca şi cum ar fi menţionată individual aici.
Exemple de tulburări proliferative celulare care pot fi tratate folosind unul sau mai mulţi compuşi dezvăluiţi aici, dar nu se limitează la cancer, o afecţiune precanceroasă sau precanceroasă şi leziuni metastatice în ţesuturi şi organe din organism. Tulburările proliferative celulare pot include hiperplazia, metaplazia şi displazia.
Un compus dezvăluit aici, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, poate fi utilizat pentru a trata sau a preveni o tulburare proliferativă celulară, sau pentru a trata sau a preveni cancerul, la un subiect care are un risc crescut de a dezvolta cancer în raport cu populaţia în general, sau utilizat pentru a identifica candidaţii potriviţi în astfel de scopuri.
Formulări farmaceutice şi căi de administrare
Aici sunt furnizate formulări farmaceutice care cuprind un compus sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia pentru tratamentul cancerului. Formulările farmaceutice pot cuprinde suplimentar un purtător sau excipient, stabilizator, agent de aromatizare şi/sau agent de colorare.
Compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia poate fi administrată folosind o varietate de căi de administrare cunoscute specialiştilor în domeniu. Căile de administrare includ administrarea orală. În anumite variante de realizare, o formulare farmaceutică care cuprinde compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia poate fi luată oral sub formă de lichid, sirop, tabletă, capsulă, pulbere, stropire, tabletă de mestecat sau disc dizolvabil. Alternativ, formulările farmaceutice ale prezentei invenţii pot fi administrate intravenos sau transdermic. Căile suplimentare de administrare sunt cunoscute specialiştilor în domeniu (vezi, de ex., Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR, Ed., Ediţia a 20-a, Mack Publishing Co., Easton, Pa.).
În unele variante de realizare, compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic este formulată ca pastă, jeleu sau suspensie. De exemplu, medicamentul este dizolvat, captat sau suspendat sub formă de particule de medicament, particule microîncapsulate sau particule de medicament-polimer într-o soluţie gelatinoasă sau semisolidă. Un avantaj al unei formulări de jeleu oral este că este mai uşor să se administreze medicamentul pacienţilor care au dificultăţi în înghiţirea tabletelor, capsulelor sau pastilelor. În anumite variante de realizare, compusul este bine amestecat şi suspendat într-un mediu adecvat pentru a forma o pastă sau un gel. Agenţii suplimentari pot fi opţional amestecaţi pentru a oferi aromă în timpul administrării orale. Untul de arahide sau alginatul, aromat cu zmeură şi un îndulcitor sunt exemple ale numeroşilor agenţi de mascare a gustului adecvaţi. În diferite variante de realizare, pasta sau jeleul pot fi de asemenea formulate cu lianţi sau excipienţi adecvaţi cunoscuţi în domeniu pentru administrare locală.
Metodele de preparare a formulărilor cu eliberare susţinută sub formă de tablete, capsule sau pilule sunt cunoscute în domeniu. În unele variante de realizare, formularea cu eliberare susţinută este preparată prin acoperirea ingredientului activ al medicamentului cu un polimer, de preferinţă un polimer insolubil în apă. De exemplu, un polimer insolubil în apă utilizat în domeniul farmaceutic ca agent de acoperire cu eliberare susţinută, agent de acoperire enterică sau agent de acoperire gastrică. Polimerul insolubil în apă poate include, de exemplu, etil celuloză, şelac purificat, şelac alb, copolimer metacrilat de aminoalchil RS, ftalat de hidroxipropil metilceluloză, succinat de acetat de hidroxipropil metilceluloză, carboximetiletil-celuloză, ftalat de acetat de celuloz[, copolimer L acid metacrilic, copolimer LD acid metacrilic, copolimer S acid metacrilic, copolimer E metacrilat de aminoalchil, sau polivinil acetal dietilaminoacetat.
Tipul, gradul de substituţie şi greutatea moleculară a polimerilor insolubili în apă pot depinde de solubilitatea ingredientului activ în apă sau alcool, nivelul dorit de eliberare susţinută şi altele asemenea. Polimerii insolubili în apă pot fi utilizaţi fie singuri, fie în combinaţie. Mai poate fi încorporat un ulei hidrogenat, acid stearic sau cetanol ca agent auxiliar de acoperire şi o trigliceridă cu catenă medie, triacetină, citrat de trietil sau cetanol ca plastifiant.
În unele variante de realizare, formularea cu eliberare susţinută este o tabletă sau granulă de tip matrice. Ingredientul activ poate fi acoperit cu până la 3 tipuri diferite de polimeri. Aceste trei tipuri diferite de polimeri pot include: 1) un polimer insolubil în apă, cum ar fi etilceluloza; 2) un polimer de gelifiere independent de pH, cum ar fi hidroxipropil metilceluloza; şi 3) un polimer de gelifiere dependent de pH, cum ar fi alginatul de sodiu. Aceste trei tipuri diferite de polimeri pot fi utilizate împreună pentru a atenua viteza de eliberare a medicamentelor.
Forme de dozare: Proprietăţi de eliberare
Formulările cu eliberare susţinută pot atinge un grad susţinut al efectului. Cu toate acestea, expunerea şi/sau biodisponibilitatea ingredientului activ poate varia în funcţie de o varietate de factori, cum ar fi, de exemplu, fereastra de absorbţie, purtătorii sau excipienţii utilizaţi în formulare, modul de administrare a formulării şi/ sau timpul de tranzit al ingredientului activ prin tractul gastrointestinal al pacientului.
O terapie poate conţine cel puţin o porţiune de eliberare susţinută pentru efectuarea unei funcţii de eliberare susţinută şi o porţiune de eliberare imediată pentru realizarea unei funcţii de eliberare imediată. În anumite variante de realizare, atunci când terapia este într-o formă de dozare unică, aceasta poate fi sub formă de tablete formate dintr-un amestec de granule cu eliberare susţinută care constituie o porţiune cu eliberare susţinută şi granule cu eliberare imediată care constituie o porţiune cu eliberare imediată, un preparat de capsulă obţinut prin umplerea unei capsule cu granule cu eliberare susţinută şi granule cu eliberare imediată, sau tablete acoperite prin presare în care un strat exterior care constituie o porţiune cu eliberare imediată este format pe un miez interior care constituie o porţiune cu eliberare susţinută. Nu există, totuşi, nici o limitare la exemplele de realizare de mai sus.
Mai mult, nu există limitări speciale privind starea de reţinere a medicamentului în compoziţie sau într-o porţiune cu eliberare imediată sau o porţiune cu eliberare susţinută; compusul poate fi dispersat uniform în compoziţie, porţiune cu eliberare imediată sau porţiune cu eliberare susţinută sau poate fi conţinut doar într-o parte a compoziţiei, porţiune cu eliberare imediată sau porţiune cu eliberare prelungită sau poate fi conţinut astfel încât să existe un gradient de concentraţie.
O porţiune cu eliberare susţinută din compoziţia conform prezentei invenţii poate conţine cel puţin o substanţă polimerică nedependentă de pH sau o substanţă polimerică dependentă de pH pentru controlul eliberării medicamentului.
O substanţă polimerică nedependentă de pH utilizată aici poate cuprinde o substanţă polimerică a cărei stare de încărcare se modifică cu greu în condiţii de pH găsite în general în tractul gastrointestinal, în special de la pH 1 la pH 8. Aceasta înseamnă, de exemplu, o substanţă polimerică care nu are grupări funcţionale a căror stare de încărcare se modifică în funcţie de pH, cum ar fi grupările funcţionale bazice, cum ar fi grupările amino sau grupările funcţionale acide, cum ar fi grupările de acid carboxilic. Reţineţi că substanţa polimerică nedependentă de pH poate fi inclusă pentru a conferi compoziţiei conform prezentei invenţii o funcţie de eliberare susţinută, dar poate fi inclusă şi în alt scop. Mai mult, substanţa polimerică nedependentă de pH utilizată în prezenta invenţie poate fi insolubilă în apă sau se poate umfla în apă sau se poate dizolva în apă pentru a forma un gel.
Exemplele de substanţe polimerice insolubile în apă nedependente de pH includ, dar fără a se limita la, eteri de celuloză, esteri de celuloză şi copolimeri acid metacrilic-acid acrilic (denumirea comercială Eudragit, fabricată de Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germania). Exemplele includ, dar nu se limitează la, alchil eteri de celuloză, cum ar fi etilceluloza (denumire comercială Ethocel, fabricată de Dow Chemical Company, SUA), etil metilceluloză, etil propilceluloză sau izopropilceluloză şi butilceluloză, aralchil eteri de celuloză, cum ar fi benzil celuloză, eteri de cianoalchil celuloză cum ar fi cianoetilceluloza, esterii acizilor organici de celuloză, cum ar fi butirat acetat de celuloză, acetat de celuloză, propionat de celuloză sau butirat de celuloză şi propionat de acetat de celuloză, copolimeri acrilat de etil-metil metacrilat (denumire comercială Eudragit NE, fabricat de Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germany), şi copolimer RS metacrilat de aminoalchil (denumire comercială Eudragit RL, Eudragit RS). Nu există limitări speciale privind diametrul mediu al particulelor unui polimer insolubil în apă utilizat în prezenta invenţie, dar, de obicei, cu cât acest diametru mediu al particulei este mai mic, cu atât performanţa este mai bună, diametrul mediu al particulei fiind de preferinţă de la 0,1 la 100 µm, mai preferabil de la 1 la 50 µm, în mod deosebit preferabil de la 3 la 15 µm, cel mai preferabil de la 5 la 15 µm. Mai mult decât atât, exemplele de substanţe polimerice nedependente de pH solubile în apă sau umflate în apă includ, dar nu se limitează la, oxid de polietilenă (denumirea comercială Polyox, fabricată de Dow Chemical Company, greutate moleculară 100.000 până la 7.000.000), hidroxipropil celuloză slab substituită (denumire comercială L-HPC, fabricată de Shin-Etsu Chemical, Japonia), hidroxipropil celuloză (denumire comercială HPC, fabricată de Nippon Soda, Co., Ltd, Japonia), hidroxipropil metilceluloză (denumiri comerciale Metolose 60SH, 65SH, 90SH, produs de Shin-Etsu Chemical, Japonia) şi metilceluloză (denumirea comercială Metolose SM, fabricată de Shin-Etsu Chemical, Japonia).
În unele exemple de realizare o singură substanţă polimerică nedependentă de pH poate fi conţinută în compoziţie sau poate fi conţinută o multitudine de substanţe polimerice nedependente de pH. Substanţa polimerică nedependentă de pH, dacă este utilizată în exemplele de realizare raportate aici, poate fi o substanţă polimerică insolubilă în apă, mai preferabil etilceluloză, un copolimer acrilat de etil-metacrilat de metil (denumire comercială Eudragit NE) sau un copolimer metacrilat de aminoalchil RS (denumirea comercială Eudragit RL, Eudragit RS). De preferat este cel puţin unul dintre etilceluloză şi un copolimer de metacrilat de aminoalchil RS. Cel mai de preferat este etilceluloza. Nu există limitări speciale asupra cantităţii de substanţă polimerică nedependentă de pH conţinută în compoziţie; această cantitate poate fi ajustată după caz, în conformitate cu scopul, cum ar fi controlul eliberării susţinute de medicament.
O substanţă polimerică dependentă de pH care poate fi utilizată în exemplele de realizare raportate aici poate fi o substanţă polimerică a cărei stare de încărcare se modifică în condiţii de pH găsite în general în tractul gastrointestinal, în special de la pH 1 la pH 8. Aceasta înseamnă, de exemplu, o substanţă polimerică care nu are grupări funcţionale a căror stare de încărcare se modifică în funcţie de pH, cum ar fi grupările funcţionale bazice, cum ar fi grupările amino sau grupările funcţionale acide, cum ar fi grupările de acid carboxilic. Grupările funcţionale dependente de pH ale substanţei polimerice dependente de pH sunt, de preferinţă, grupări funcţionale acide, substanţa polimerică dependentă de pH având cel mai preferabil grupări de acid carboxilic.
O substanţă polimerică nedependentă de pH utilizată în prezenta invenţie poate fi insolubilă în apă sau se poate umfla în apă sau se poate dizolva în apă pentru a forma un gel. Exemple de substanţe polimerice dependente de pH utilizate în prezenta invenţie includ, dar nu se limitează la, substanţe polimerice enterice. Exemplele de substanţe polimerice enterice includ, dar nu se limitează la, copolimeri acid metacrilic-metacrilat de metil (Eudragit L100, Eudragit S100, fabricat de Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germania), copolimeri acid metacrilic-acrilat de etil (Eudragit L100-55, Eudragit L30D-55, fabricat de Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germania), ftalat de hidroxipropil metilceluloză (HP-55, HP-50, fabricat de Shin-Etsu Chemical, Japonia), succinat de acetat de hidroxipropil metilceluloză (AQOAT, fabricat de Shin-Etsu Chemical, Japonia), carboximetil etilceluloză (CMEC, fabricat de Freund Corporation, Japonia) şi ftalat de acetat de celuloză.
Exemple de substanţe polimerice dependente de pH care se umflă în apă sau se dizolvă în apă pentru a forma un gel includ, dar nu se limitează la, acid alginic, pectină, polimer carboxivinil şi carboximetil celuloză. În prezenta invenţie, o singură substanţă polimerică dependentă de pH poate fi conţinută în compoziţie sau poate fi conţinută o multitudine de substanţe polimerice dependente de pH. Substanţa polimerică dependentă de pH utilizată în prezenta invenţie este, de preferinţă, o substanţă polimerică enterică, mai preferabil un copolimer acid metacrilic-acrilat de etil, un copolimer acid metacrilic-metacrilat de metil, ftalat de hidroxipropil metilceluloză sau succinat de acetat de hidroxipropil metilceluloză, de preferinţă copolimer acid acrilic-acrilat de etil.
Când se utilizează o substanţă polimerică dependentă de pH în procesul de fabricare a unei compoziţii conform prezentei invenţii, un produs disponibil comercial de tip pulbere sau de tip granular sau un tip de suspensie în care substanţa polimerică dependentă de pH a fost dispersată în solvent în prealabil poate fi utilizat ca atare, sau un astfel de produs disponibil comercial poate fi utilizat dispersat în apă sau într-un solvent organic. Cu cât este mai mic diametrul particulelor substanţei polimerice dependente de pH, cu atât performanţa este mai bună, substanţa polimerică dependentă de pH fiind de preferinţă de tip pulbere. În cazul unui copolimer acid metacrilic-acrilat de etil, un exemplu este Eudragit L100-55. Nu există limitări speciale privind diametrul mediu al particulelor unei substanţe polimerice dependente de pH utilizat în prezenta invenţie, dar diametrul mediu al particulei este, de preferinţă, de la 0,05 la 100 µm, mai preferabil de la 0,05 la 70 µm, cel mai preferabil de la 0,05 la 50 µm. Mai mult, nu există limitări speciale ale cantităţii de substanţă polimerică dependentă de pH, de exemplu, în cazul unei substanţe polimerice enterice, cantitatea este în general de la 0,1 la 90 părţi în greutate, de preferinţă de la 1 la 70 părţi în greutate, mai preferabil de la 5 la 60 de părţi în greutate, în mod special preferabil de la 10 la 50 de părţi în greutate, raportat la 100 de părţi în greutate de compoziţie.
O terapie în conformitate cu exemplele de realizare raportate aici poate conţine în plus oricare dintre diferiţii aditivi, cum ar fi oricare dintre diferiţii purtători acceptabili farmacologic, cum ar fi diluanţi, lubrifianţi, lianţi şi dezintegranţi, precum şi conservanţi, coloranţi, îndulcitori, plastifianţi, agenţi de acoperire a filmului şi aşa mai departe, după cum este necesar. Exemplele de diluanţi includ, dar nu se limitează la, lactoză, manitol, fosfat dibazic de calciu, amidon, amidon pregelatinizat, celuloză cristalină, anhidridă silicică uşoară, silicat de aluminiu sintetic, metasilicat de aluminat de magneziu sau altele asemenea. Exemplele de lubrifianţi includ, dar nu se limitează la, stearat de magneziu, stearat de calciu, talc, stearil fumarat de sodiu sau altele asemenea. Exemplele de lianţi includ, dar nu se limitează la, hidroxipropil celuloză, metilceluloză, carboximetil celuloză de sodiu, hidroxipropil metilceluloză, polivinilpirolidonă sau altele asemenea. Exemplele de dezintegranţi includ, dar nu se limitează la, carboximetil celuloză, calciu carboximetil celuloză, croscarmeloză sodică, carboximetil amidon de sodiu, hidroxipropil celuloză slab substituită sau altele asemenea. Exemplele de conservanţi includ, dar nu se limitează la, esteri ai acidului paraoxibenzoic, clorbutanol, alcool benzilic, alcool fenetilic, acid dehidroacetic, acid sorbic sau altele asemenea. Exemplele preferate de coloranţi includ, dar nu se limitează la, pigmenţi lacuri insolubile în apă, pigmenţi naturali (de ex., .beta.-caroten, clorofilă, oxid feric roşu), oxid feric galben, oxid feric roşu, oxid feric negru sau altele asemenea. Exemplele preferate de îndulcitori includ, dar nu se limitează la, zaharină sodică, glicirizat dipotasic, aspartam, stevia sau altele asemenea. Exemplele de plastifianţi includ, dar nu se limitează la, esteri ai acidului gras de glicerol, citrat de trietil, propilenglicol, polietilenglicol sau altele asemenea. Exemplele de agenţi de acoperire cu peliculă includ, dar nu se limitează la, hidroxipropil metilceluloză, hidroxipropil celuloză sau altele asemenea.
Metode de fabricaţie
Pentru fabricarea exemplelor de realizare aşa cum sunt raportate aici, poate fi utilizată o singură metodă convenţională sau o combinaţie de metode convenţionale. De exemplu, atunci când se fabrică granule care conţin medicament ca porţiune cu eliberare susţinută sau porţiune cu eliberare imediată, granularea este operaţia principală, dar aceasta poate fi combinată cu alte operaţiuni cum ar fi amestecarea, uscarea, cernerea şi clasificarea. Ca metodă de granulare, de exemplu, se poate utiliza o metodă de granulare umedă în care se adaugă un liant şi un solvent la pulbere şi se efectuează granularea, o metodă de granulare uscată în care pulberea este comprimată şi se efectuează granularea, o metodă de granulare topită în care se adaugă un liant care se topeşte la încălzire şi se realizează încălzirea şi granularea, sau altele asemenea.
Mai mult, în conformitate cu metoda de granulare, se poate utiliza o metodă de operare cum ar fi o metodă de granulare cu amestecare folosind un mixer planetar, un mixer cu şurub sau altele asemenea, o metodă de granulare cu amestecare de mare viteză folosind un mixer Henschel, un mixer Super sau altele asemenea, o metodă de granulare prin extrudare folosind un granulator cilindric, un granulator rotativ, un granulator cu extrudare cu şnec, un granulator tip moară cu peleţi sau altele asemenea, o metodă de granulare umedă cu forfecare mare, o metodă de granulare în pat fluidizat, o metodă de granulare prin compresie, o metodă de granulare prin zdrobire, sau poate fi utilizată o metodă de granulare prin pulverizare. După granulare, uscare folosind un uscător, un pat fluidizat sau altele asemenea, cracarea şi cernerea pot fi efectuate pentru a obţine granulele sau granulele fine pentru utilizare. Mai mult, poate fi utilizat un solvent de granulare la prepararea compoziţiei conform prezentei invenţii. Nu există limitări speciale pentru un astfel de solvent de granulare, care poate fi apa sau oricare dintre diferiţii solvenţi organici, de exemplu, apă, un alcool inferior, cum ar fi metanolul sau etanolul, o cetonă cum ar fi acetona sau metil etil cetona, clorura de metilen sau un amestec al acestora.
Pentru granulele cu eliberare susţinută conţinute în exemplele de realizare, cel puţin un medicament şi cel puţin unul selectat dintre substanţele polimerice nedependente de pH şi substanţele polimerice dependente de pH sunt amestecate împreună, se adaugă un diluant şi un liant după cum este necesar şi se efectuează granularea pentru a obţine materie granulară. Materia granulară obţinută este uscată utilizând un uscător cu tavă, un uscător cu pat fluidizat sau altele asemenea, iar cernerea este efectuată folosind o moară sau un oscilator, prin care pot fi obţinute granulele cu eliberare susţinută. Alternativ, ca metodă de fabricare a granulelor cu eliberare susţinută în prezenta invenţie, este posibil să se adauge cel puţin un medicament, cel puţin unul selectat dintre substanţe polimerice nedependente de pH şi substanţe polimerice dependente de pH şi, după caz, un diluant şi un liant utilizând un compactor uscat, cum ar fi un compactor cu role sau o maşină de tabletare cu melci, şi se efectuează turnarea prin comprimare în timp ce se amestecă, apoi se realizează granularea prin cracare la o dimensiune adecvată. Materia granulară preparată utilizând un astfel de granulator poate fi utilizată ca atare ca granule sau granule fine conform prezentei invenţii sau poate fi spartă în continuare folosind o moară electrică, un granulator cu role, o moară cu rotor de viteză sau altele asemenea, şi cernută pentru a obţine granule cu eliberare susţinută. Reţineţi că granulele cu eliberare imediată pot fi, de asemenea, fabricate ca şi granulele cu eliberare susţinută.
Un produs turnat prin compresie poate fi fabricat ca o porţiune cu eliberare susţinută sau o porţiune cu eliberare imediată care conţine medicament sau ca o compoziţie raportată aici folosind o singură metodă convenţională sau o combinaţie de metode convenţionale. De exemplu, cel puţin un medicament, cel puţin unul selectat dintre substanţe polimerice nedependente de pH şi substanţe polimerice dependente de pH, un diluant cum ar fi manitol sau lactoză, un liant cum ar fi polivinilpirolidona sau celuloza cristalină, un dezintegrant cum ar fi carmeloza de sodiu sau crospovidonă, şi un lubrifiant cum ar fi stearat de magneziu sau talc sunt utilizate, şi tabletarea este realizată folosind o metodă obişnuită, prin care produsul turnat prin comprimare poate fi obţinut. În acest caz, tabletarea este operaţia principală în metoda de fabricare a produsului turnat prin compresie, dar aceasta poate fi combinată cu alte operaţiuni, cum ar fi amestecarea, uscarea, formarea acoperirii cu zahăr şi acoperirea.
Exemplele de metodă de tabletare includ, dar nu se limitează la, turnarea prin comprimare directă în care cel puţin un medicament şi aditivii acceptabili farmacologic sunt amestecaţi împreună şi apoi amestecul este turnat direct prin comprimare în tablete folosind o maşină de tabletare şi comprimare granule uscată sau umedă a granulelor în care granulele cu eliberare susţinută sau granulele cu eliberare imediată conform prezentei invenţii sunt supuse turnării prin comprimare după adăugarea unui lubrifiant sau a unui dezintegrant, după cum este necesar. Nu există limitări speciale pentru maşina de tabletare utilizată în turnarea prin compresie; de exemplu, poate fi utilizată o maşină de tabletare cu o singură perforare, o maşină de tabletare rotativă sau o maşină de tabletare de acoperire prin presare.
Granulele cu eliberare susţinută sau granule cu eliberare imediată care conţin medicamentul sau produsul turnat prin comprimare conform exemplelor de realizare de aici pot fi utilizate ca atare sub formă de granule sau tablete ca compoziţie, dar pot fi, de asemenea, supuse unei prelucrări suplimentare pentru fabricarea compoziţiei. De exemplu, produsului sau granulelor turnate prin comprimare li se poate da o acoperire de film folosind un material de bază de film, cum ar fi etilceluloză, cazeină, metilceluloză, hidroxipropil metilceluloză, copolimer L de acid metacrilic, ftalat de acetat de celuloză, şelac sau altele asemănătoare, sau se poate administra un zaharid de acoperire folosind un lichid de acoperire cu zaharid care conţine zaharoză, alcool zaharic, pudră de gumă arabică, talc sau altele asemenea, producând astfel tablete filmate sau tablete acoperite cu zahăr. Un solvent în această tehnică de acoperire poate fi apa purificată, dar se poate utiliza, de asemenea, un solvent organic cum ar fi un alcool, o cetonă, un eter sau o hidrocarbură clorurată sau un amestec al acestora. De exemplu, etanolul, acetona, clorura de metilen sau altele asemenea pot fi utilizate ca solvent organic. Mai mult decât atât, ca aparat de acoperire, poate fi utilizat un aparat utilizat în mod obişnuit în tehnicile de acoperire pentru fabricarea medicamentelor, cu exemple care includ un aparat de acoperire prin pulverizare în care acoperirea este realizată prin pulverizarea unui lichid de acoperire sau altele asemenea şi un granulator cu pat fluidizat cu rotor pentru stratificare.
În cazul fabricării preparatelor de capsule, preparatele de capsule pot fi fabricate prin umplerea de granule cu eliberare susţinută sau granule cu eliberare imediată ca mai sus, sau mini-tablete în capsule de gelatină tare sau capsule HPMC utilizând o maşină automată de umplere a capsulelor. Alternativ, în cazul preparatelor pentru administrare per tub sau a unui sirop uscat care este utilizat în amestec cu apă sau altele asemenea atunci când sunt luate, granulele cu eliberare susţinută sau granulele cu eliberare imediată ca mai sus pot fi amestecate cu un agent de îngroşare sau un dispersant, astfel încât pentru a dispersa aceste granule, amestecul fiind apoi transformat în granule sau tablete. Mai mult, un lichid sau un jeleu poate fi preparat folosind apă şi substanţe selectate dintre dispersanţi, emulgatori, agenţi de îngroşare, conservanţi, ajustori de pH, îndulcitori, arome, parfumuri şi aşa mai departe. Cu toate acestea, în ceea ce priveşte alte metode de fabricaţie, nu există limitări la cele de mai sus.
Pentru ca exemplele de realizare descrise aici să poată fi înţelese mai pe deplin, sunt prezentate următoarele exemple. Trebuie înţeles că aceste exemple au doar scop ilustrativ şi nu trebuie interpretate ca limitative.
EXEMPLE
Următoarele abrevieri pot fi utilizate pe parcursul exemplelor.
Toate: alil
BOP: (Benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfoniu hexafluorofosfat
DMT: 4,4'-Dimetoxitritil
(DMTO-:
)
Bz: benzoil
ib: izobutiril
Baza Hunig: i-Pr2NEt (diizopropiletilamină)
AlilOH: alcool alilic
OToate: -OCH2CHCH2
ACN: acetonitril
Toate: -CH2CHCH2
2-NitroBnBr: Bromură de 2-nitrobenzil Bz: benzoil
ib: izobutiril
i-Pr: izopropil
CE: cianoetil
(-OCE:
)
DEAD: azodicarboxilat de dietil
DIAD: azodicarboxilat de diizopropil
DCM: diclormetan
DDTT: N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamidă
DMOCP: 2-oxid de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinan
TBS: t-butildimetilsilil
3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-onă:
Exemplul 1 -- Sinteză de Compus 1a
O schemă completă a acestei sinteze este disponibilă în FIG. 1.
Etapa A
La un amestec de (2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4- fluorotetrahidrofuran-3-il (2-cianoetil) diizopropilfosforamidită (Compusul 100) (amestec de diastereomeri fosforici; 80,0 g, 91,332 mmol, 1 echiv., ChemGenes Corporation catalog # ANP-9151), alcool alilic, (9,63 mmol, 142 mmol, 1,55 echiv.) şi trifenilfosfină (38,3 g, 146 mmol, 1,60 echiv.) în THF (1,1 l) s-a adăugat DEAD (soluţie 40% în greutate în toluen; 54,2 ml, 137 mmol, 1,5 echiv.) la temperatura ambiantă. Agitarea a fost continuată la temperatura ambiantă şi reacţia a fost monitorizată prin LC/MS. După completare (19 h), amestecul a fost concentrat în vid (35 °C) şi amestecul rezultat a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (800 gx 2 coloane, 40 până la 60% EtOAc în n-heptan tamponat cu 0,5% trietilamină) pentru a da Compusul 101 ca spumă albă (84,2 g, randament cantitativ, amestec de diastereomeri de fosfor).
1H RMN (3:2 amestec de diastereomeri de fosfor , 400 MHz, CDCl3) δ 1,14 - 1,21 (m, 12 H) 2,40 (t, J=6,2 Hz, 1,2 H) 2,59 (t, J=6,2 Hz, 0,8 H) 3,27 (d, J=8,6 Hz, 1 H) 3,52 - 3,66 (m, 5 H) 3,78 (s 2,4 H) 3,79 (s 3,6 H) 4,28 - 4,34 (m, 1 H) 4,84 - 4,96 (m, 0,4 H) 4,99 (d, J=5,5 Hz, 2 H) 4,95 - 5,10 (m, 0,6 H) 5,05 (d, J=10,9 Hz, 1 H) 5,22 (d l, J=17,6 Hz, 1 H) 5,64 (d l, J=53,2 Hz, 0,6 H) 5,70 (d l, J=51,6 Hz, 0,4 H) 5,96 - 6,75 (m, 1 H) 6,20 (d, J=16,0 Hz, 0,6 H) 6,24 (d, J=17,2Hz, 0,4 H) 6,74 - 6,79 (m, 4 H) 7,02 - 7,06 (m, 2H) 7,17 - 7,24 (m, 8 H) 7,32 - 7,34 (m, 2 H) 7,41 - 7,44 (m, 2 H) 8,11 (s, 1H) 8,52 (s, 0,4 H) 8,54 (s, 0,6 H).
Etapa B
La o soluţie de Compus 101 (3,00 g, 3,28 mmol, 1 echiv.) în acetonitril (30 ml) s-a adăugat apă (0,118 ml, 6,55 mmol, 2,0 echiv.) şi sare trifluoracetat de piridină (0,759 g, 3,93 mmol, 1 echiv.). După agitare la temperatura ambiantă timp de 1 minut, s-a adăugat terţ-butilamină (14,5 g, 21,0 ml, 0,20 mol, 60 echiv). După scindarea completă a grupării cianoetil (monitorizată prin LC/MS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi azeotropat de două ori cu acetonitril. Amestecul brut a fost dizolvat în DCM (45,0 ml) şi tratat cu apă (0,118 ml, 6,55 mmol, 2,0 echiv.) şi NaHSO4-SiO2 (1,18 g, 6,55 mmol, 2 echiv.) la temperatura ambiantă. După scindarea completă a grupării DMT (monitorizată prin LC/MS, aproximativ 1 oră), amestecul de reacţie a fost filtrat şi clătit de două ori cu DCM/MeOH (9/1, 20 ml). Filtratele combinate au fost concentrate în vid şi tratate cu un amestec 1:1 de n-heptan/toluen ( ∼ 30 ml). Stratul superior a fost îndepărtat prin decantare. Aceeaşi operaţiune a fost repetată încă o dată cu n-heptan/toluen (1/1, 30 ml) şi stratul inferior a fost azeotropat de două ori cu acetonitril pentru a da Compusul 102 (randament teoretic 100% asumat). Produsul a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
Etapa C
La un amestec de Compus 102 (1,56 g, 3,27 mmol, 1 echiv.) şi Compus 101 (3,00 g, 3,28 mmol, 1 echiv.) în acetonitril (30 ml) s-a adăugat sare trifluoroacetat de piridină (uscat azeotropic cu piridină, 03,694 g; mmol, 1,25 echiv). După 5 minute, s-a adăugat DDTT (0,840 g, 4,09 mmol, 1,30 echiv., ChemGenes Corporation catalog # RN-1588) şi, la sulfurizarea completă (monitorizată prin LC/MS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid. Reziduul a fost dizolvat în DCM (30 ml) şi tratat cu apă (0,57 ml, 32 mmol, 10 echiv.) şi acid dicloracetic 6% (1,56 ml, 18,9 mmol, 6,0 echiv.) în DCM (30 ml). După 20 de minute, reacţia a fost stinsă cu piridină (20 ml) şi concentrată în vid. Reziduul a fost azeotropat cu piridină pentru a da Compusul 103 (3,22 g, randament teoretic 100% estimat). Produsul a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
Etapa D
La o soluţie de Compus 103 (3,22 g, 3,15 mmol, 1 echiv.) în piridină (100 ml) s-a adăugat DMOCP (1,45 ml, 7,88 mmol, 2,50 echiv.) la temperatura ambiantă. După macrociclizarea completă (monitorizată prin LC/MS), s-a adăugat apă (1,7 ml, 94,5 mmol, x10 ori faţă de DMOCP) urmată de 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-onă (0,795 g, 4,73 mmol, 1,5 echiv). După sulfurizarea completă (aproximativ 40 minute), amestecul de reacţie a fost parţial concentrat în vid la aproximativ 15 ml şi turnat într-un amestec de soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (50 ml) şi apă (30 ml). După 10 minute de agitare la temperatura ambiantă, amestecul a fost extras cu un amestec 1:1 de EtOAc/MTBE (60 ml x 3 ori). Straturile organice au fost combinate, spălate cu saramură (25 ml), uscate pe Mg2SO4 si concentrat în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (0-20% MeOH în DCM) pentru a da Compusul 104 (3,31 g, 3,20 mmol, randament teoretic 100% estimat) sub forma unui ulei maro. Produsul a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
Etapa E
La o soluţie de compus 104 (3,31 g, 3,20 mmol, 1 echiv.) în acetonitril (66,2 ml) s-a adăugat bromură de 2-nitrobenzil (2,42 g, 11,2 mmol, 3,50 echiv) şi trietilamină (1,78 ml, 12,8 mmol, 4,00 echiv.). După reacţia completă (monitorizată prin LC/MS, aproximativ 20 de ore la temperatura ambiantă), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (60% acetat de etil/n-heptan până la 100% acetat de etil) pentru a da 0,568 g produs ca amestec de diastereomeri de fosfor. Separarea HPLC preparativă a diastereomerilor a dat Compusul 105 ( izomer SR; 0,225 g, 0,180 mmol, 5,6% randament total din Compusul 101) şi Compusul 106 (izomer RR; 0,187 g, 0,149 mmol, 4,7% randament total din Compusul 1).
Compus 105 (SpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,63 (s, 1H), δ = 8,61 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,65 - 7,44 (m, 8H), 7,40 - 7,31 (m, 4H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,15 - 5,89 (m, 5H), 5,61 (dd, J = 52,0, 5,1 Hz, 1H), 5,55 (ddd, J = 51,2, 4,7, 2,7 Hz, 1H) 5,51 - 5,42 (m, 1H), 5,31 - 5,22 (m, 2H), 5,11 (dd, J = 3,9, 9,8 Hz, 2H), 5,04 - 4,95 (m, 4H), 4,55 - 4,37 (m, 7H), 4,29 - 4,12 (m, 3H)
Compus 106 (RpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,65 (s, 2H), 8,06 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 2H), 7,98 (s, 2H), 7,57 - 7,52 (m, 6H), 7,47 - 7,32 (m, 6H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,15 (d, J = 18,7 Hz, 2H), 6,09 - 5,99 (m, 2H), 5,82-5,76 (m, 2H), 5,60 (dd, J = 51,8, 4,9 Hz, 2H), 5,27 (dd, J = 1,2, 17,2 Hz, 2H), 5,12 (dd, J = 1,0, 10,4 Hz, 2H), 5,06 - 4,96 (m, 4H), 4,55 - 4,40 (m, 4H), 4,36 - 4,24 (m, 4H), 4,21 - 4,02 (m, 2H)
Condiţii HPLC preparativă:
Instrument Agilent 1200 Coloană HPLC Coloană Waters Sunfire Prep C18 OBD, 5 um, 30 x 250 mm, #186003969 Debit 50 ml/min faza mobilă A: ap, B: acetonitril Gradient Timp (min) 0 8 9,9 10 12 B% 50 99 99 50 50 Timp de rulare 12 min Volum de injectare 150 ul (0,08 g/ml în acetonitril) detecţie UV 254 nm Timp de retenţie Compus 105 (SpRp) 7,7min Compus 106 (RpRp) 8,0 min
Etapa F
La o soluţie încălzită (90 °C) de compus 105 (519 mg, 0,414 mmol, 1 echiv.) în toluen (519 ml) s-a adăugat Hoveyda-Grubbs Catalyst™ a doua generaţie ((1,3-Bis-(2,4, 6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dicloro(o-izopropoxifenilmetilen)ruteniu, disponibil la SIGMA-ALDRITCH® Catalog Nr. 569755; CAS 301224-40-8; 91 mg, 0,15 mmol, 0,35 echiv) şi chinonă (0,102 ml, 1,243 mmol, 3,0 echiv). Amestecul a fost încălzit la reflux şi progresul reacţiei a fost monitorizat prin LC/MS. După 3 ore s-a adăugat un catalizator suplimentar (91 mg, 0,15 mmol, 0,35 echiv.) şi reacţia a fost continuată timp de încă 3 ore. După răcire, amestecul a fost tratat cu DMSO (0,59 ml, 8,3 mmol, 20 echiv.) la temperatura ambiantă timp de 15 ore, concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 66% acetat de etil în n-heptan până la 100% acetat de etil) pentru a da Compusul 107 (200 mg, 0,163 mmol, randament 39%) ca spumă maro uscată.
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,19 (s, 1H), 8,12 (dd, J = 7,8 Hz, 1,9 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,63 (d l, J = 7,0 Hz, 1H), 7,53 - 7,41 (m, 10H), 7,35 - 7,30 (m, 2H), 7,25 - 7,20 (m, 4H), 6,23 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,86 - 5,75 (m, 1H), 5,75 (dt, J = 15,3, 5,0 Hz, 1H), 5,67 (dt, J = 15,3, 4,7 Hz, 1H), 5,60 (dd, J = 52,0, 3,9 Hz. 1H), 5,48 (dd, J = 50,4, 3,9 Hz. 1H)5,50 - 5,39 (m, 1H), 4,91 - 4,64 (m, 4H), 4,57 - 4,25 (m, 9H), 4,15 (d, J = 7,03 Hz, 1H), 4,11 (d, J = 7,03 Hz, 1H).
Etapa G
La o soluţie de compus 107 (88 mg, 0,072 mmol, 1 echiv.) în 1,4-dioxan (1,76 ml) s-a adăugat tiofenol (0,88 ml, 8,55 mmol, 119 echiv.) şi trietilamină (0,88 ml, 6,31 echiv). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă. După reacţia completă (monitorizată prin LC/MS, 13 ore), s-au adăugat metanol (5,28 ml) şi hidroxid de amoniu 28% (3,52 ml) şi amestecul rezultat a fost încălzit la 50°C. După reacţia completă (monitorizată prin LC/MS, 5 ore), amestecul a fost răcit la temperatura ambiantă şi suspensia maronie rezultată a fost filtrată şi clătită cu apă (15 ml). Filtratul a fost filtrat din nou pentru a îndepărta solidele suplimentare. Filtratul final a fost extras de două ori cu un amestec 1:1 de toluen şi heptan (30 ml). Stratul apos a fost concentrat în vid şi apoi resuspendat în apă (6 ml). Solidul rezultat a fost filtrat şi filtratul a fost supus la HPLC preparativă pentru a da sare de diamoniu a Compusului 1 (denumită şi Compus 1a) (39 mg, 0,050 mmol, randament 70%) sub forma unui solid alb.
Compus 1a (SpRp, trans) 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ = 9,05 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 6,34 (s l, 2H), 5,88 (s l, 2H), 5,66 (d l, J = 51,6 Hz, 1H), 5,59 (d l, J = 52,2 Hz, 1H) 5,01 (s l, 2H), 4,68 - 4,34 (m, 6H), 4,07 - 3,82 (m, 2H), 3,79 - 3,55 (m, 2H); 31P RMN (162 MHz, CD3OD) δ = 55,48 (s, 1P), 55,16 (s, 1P).
Compus 1a condiţii HPLC preparativă:
Instrument Agilent 1200/1260 AS/FC Coloană HPLC Waters XBridge C18, 10 x 100 mm, # 1413 Debit 3,0 ml/min Temperatura coloanei 35 °C faza mobilă A: 0,1% NH4OH în apă, B: 0,1% NH4OH în acetonitril Gradient (B%) 0 → 50 Timp de rulare 20 min Volum de injectare 50 ul (4 mg/ml în apă) detecţie UV 260 nm Timp de retenţie 6,5 min
Exemplul 1.1 -- Sinteza alternativă pentru Compusul 1a
O cale de sinteză alternativă pentru Compusul 1a este setată în FIG. 2A şi FIG. 2B, ca şi în FIG. 2C şi raportat mai jos.
Etapa 1
Compusul 129 (570 g, 1,53 mol, 1 greutate, 1 vol, 1 echiv) a fost dizolvat în piridină (2,85 l, 35,2 mol, 4,89 greutate, 5,0 vol, 23 echiv). Amestecul a fost răcit la 2,6°C şi tratat cu clorură de 4,4'-dimetoxitritil (DMTC1; 543 g, 1,60 mol, 0,953 în greutate, 1,05 echiv). Amestecul a fost agitat la 0 până la 5 °C timp de 2 h şi apoi lăsat să se încălzească la temperatura ambiantă. Reacţia a fost monitorizată prin LC/MS şi conversia completă a fost confirmată după agitare peste noapte. Amestecul de reacţie a fost răcit la sub 5°C şi stins prin tratament cu MeOH (124 ml, 3,05 mol, 0,172 greutate, 0,217 vol, 2,0 echiv.) timp de 15 minute. Amestecul a fost co-evaporat cu toluen (2,00 l, 3,04 greut., 3,51 vol.) sub vid şi apoi diluat cu un amestec de EtOAc (2,850 l, 4,5 greut., 5,0 vol.) şi n-heptan (2,85 l, 3,42 gr., 5.0 vol). Stratul organic a fost spălat cu NaHCO3 saturat (9% în greutate soluţie în apă; 2,0 l, 3,5 vol). S-a adăugat un EtOAc suplimentar (2,85 l, 4,5 greutate, 5,0 vol) pentru a dizolva complet produsul brut. După agitare timp de 5 minute, cele două straturi au fost separate. Stratul organic a fost spălat cu apă (2,0 l, 3,5 greut., 3,5 vol). Solidul a început să precipite încet din stratul organic. Stratul de apă a fost separat. Stratul organic a fost apoi concentrat la aprox. 1 vol. Produsul brut a fost suspendat cu un amestec de n-heptan (2,00 l, 2,40 greut., 3,51 vol) şi toluen (0,50 l, 0,76 gr., 0,88 vol.). După agitare timp de 15 minute, solidul galben pal a fost colectat prin filtrare în vid. Turta de filtrare a fost clătită secvenţial cu: (1) un amestec de n-heptan (0,60 l, 0,72 gr., 1,05 vol.) şi toluen (0,30 l, 0,46 greut., 0,53 vol.), apoi (2) n-heptan (3,00 L, 3,6 greutate, 5,26 vol). Solidul a fost uscat fără căldură timp de 30 de minute şi apoi transferat în tăvi pentru uscare la 50 °C într-un cuptor cu vid peste noapte pentru a da Compusul 130 ca solid galben pal (996,7 g, 1,47 mol, 1,75 greutate, randament 97%).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,99 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,64 - 7,59 (m, 1H), 7,57 - 7,50 (m, 2H), 7,41 - 7,36 (m, 2H), 7,32 - 7,15 (m, 7H), 6,83 - 6,76 (m, 4H), 6,31 (dd, J = 2,5, 17,0 Hz, 1H), 5,68 (ddd, J = 2,3, 4,7, 52,7 Hz, 1H), 4,88 - 4,77 (m, 1H), 4,26 - 4,21 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,57 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,43 (dd, J = 4,1, 10,7 Hz, 1H), 2,60 (s l, 1H)
Etapa 1'
Compusul 129 (430 g, 1,15 mol, 1 greutate, 1 vol., 1 echiv) şi imidazol (118 g, 1,73 mol, 0,274 g, 1,50 echiv) au fost dizolvate în DMF (1,72 l, 3,78 greutate, 4,0 vol) şi amestecul rezultat a fost răcit la 5°C. S-a adăugat TBS-CI (191 g, 1,27 mol, 0,444 greutate, 1,10 echiv). Amestecul a fost agitat la 0 până la 11 °C timp de 2 h, lăsat să se încălzească lent la temperatura ambiantă (progresul monitorizat prin LCMS). Reacţia a fost completă la 6 h după adăugarea de TBS-CI, totuşi lăsată să se agite la temperatura ambiantă pentru încă 20 h. Amestecul a fost răcit la 2°C şi tratat cu metanol (93 ml, 74 g, 2,3 mol, 0,17 greutate, 0,22 greutate, 2,0 echiv.) timp de 10 minute. Amestecul de reacţie a fost diluat cu un amestec de MTBE (1,72 l, 1,23 kg, 2,96 gr., 4,0 vol.) şi EtOAc (1,72 l, 1,55 kg, 3,60 gr., 4,0 vol.) urmat de NH4Cl saturată (soluţie 28% în greutate în apă; 2,15 l, 5,0 vol). Solidele au început să cadă încet din soluţie. Amestecul a fost lăsat să se încălzească la 24 °C şi s-a adăugat apă (1,08 l, 1,08 kg, 2,5 greutate, 2,5 vol) la (T-internă = 22 °C). Mai multe solide au început să precipite din amestec. La amestec s-au adăugat apă suplimentar (1,08 l, 1,08 kg, 2,5 gr., 2,5 vol.) şi MTBE (1,40 l, 1,04 kg, 2,4 gr., 3,3 vol.). Solidul alb murdar a fost colectat prin filtrare în vid. Reactorul a fost clătit cu apă (320 ml, 0,74 vol.) şi apoi MTBE (1,80 l, 1,33 kg, 3,10 greutate, 4,19 vol.) pentru a transfera orice solid rămas în filtru. Turta de filtrare a fost clătită secvenţial cu: (1) apă (1,80 l, 1,80 kg, 4,2 greutate, 4,2 vol). (2) apă (1,80 l, 1,80 kg, 4,2 gr., 4,2 vol.), (3) un amestec de MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5 gr., 2,1 vol.) şi n-heptan (0,90 l, 0,62 kg, 1,4) greutate, 2,1 vol), (4) un amestec de MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5 greutate, 2,1 vol) şi n-heptan (0,90 l, 0,62 kg, 1,4 greutate, 2,1 vol). Solidul recuperat a fost uscat sub vid la 40°C timp de 2 zile pentru a da Compusul 133 ca solid alb (483 g, 0,991 mol, 1,12 în greutate, randament 86%).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,97 (s, 1H), 8,82 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,64 - 7,58 (m, 1H), 7,56 - 7,51 (m, 2H), 6,40 (dd, J= 2,3, 16,0 Hz, 1H), 5,45 (ddd, J = 2,7, 4,3, 53,1 Hz, 1H), 4,75 - 4,66 (m, 1H), 4,22 - 4,17 (m, 1H), 4,07 (dd, J = 2,3, 11,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 2,7, 11,7 Hz, 1H), 2,38 (dd, J = 2,7, 7,0 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,11 (s, 3H).
Etapa 2
Compusul 130 (993 g, 1,47 mol, 1 greutate, 1 vol., 1 echiv) şi imidazol (150 g, 2,20 mol, 0,151 g, 1,5 echiv) au fost dizolvate în DMF (3,48 l, 3,28 greutate, 3,5 vol) şi amestecul rezultat a fost răcit la 5°C. S-a adăugat TBS-CI (244 g, 1,62 mol, 0,245 greutate, 1,10 echiv). Reacţia a fost agitată la 0 până la 5 °C timp de 2 h, lăsată să se încălzească lent la temperatura ambiantă şi progresul monitorizat prin LCMS. După 17 h, s-au adăugat suplimentar imidazol (100 g, 1,47 mol, 0,10 g, 1,0 echiv) şi TBS-CI (111 g, 735 mmol, 0,112 g, 0,50 echiv) şi agitarea a fost continuată la temperatura ambiantă timp de 2 h şi la 35 °C timp de 2 h. Amestecul rezultat a fost răcit la 13,6 °C şi tratat cu MeOH (119 ml, 2,94 mol, 2 echiv.) timp de 10 minute. Într-un reactor separat s-a adăugat gheaţă (5 kg, 5 greut) şi NH4Cl saturată (soluţie 28% în greutate în apă; 5,0 l, 5 vol). Amestecul de reacţie a fost adăugat la amestecul gheaţă/NH4Cl. Un solid alb murdar a început să precipite imediat din soluţie. La amestec s-au adăugat încă 2 kg de gheaţă (2 kg, 2 greutate) şi apă (3,0 l, 3 vol). Balonul de reacţie a fost clătit cu apă (0,50 l, 0,5 vol) şi soluţia de clătire a fost adăugată la amestec. La amestec s-a adăugat n-heptan (2,00 l, 2 vol) şi s-a continuat agitarea timp de 10 minute. Solidul alb murdar a fost colectat prin filtrare în vid. Turta de filtrare a fost clătită cu: (1) apă (4,0 l, 4,0 vol), (2) apă (4,0 l, 4,0 vol), (3) n-heptan (4,0 l, 4,0 vol), (4) n- heptan (4,0 l, 4,0 vol). Solidul recuperat a fost uscat sub vid la 45°C timp de 4 zile pentru a da Compusul 131 ca solid alb murdar (1,095 kg, 1,39 mol, 1,10 greutate, randament 94%).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 9,09 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,02 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,63 - 7,59 (m, 1H), 7,55 - 7,50 (m, 2H), 7,37 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,29 - 7,17 (m, 7H), 6,79 (d, J = 7,9 Hz, 4H), 6,29 (dd, J = 2,9, 16,2 Hz, 1H), 5,60 (ddd, J = 2,7, 3,9, 53,1 Hz, 1H), 4,78 (ddd, J = 4. 7, 6,4, 15,8 Hz, 1H), 4,26 - 4,22 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,58 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,26 (dd, J = 3,7, 10,7 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,02 (s, 3H)
Etapa 3
Compusul 131 (1000 g, 1,27 mol, 1 greutate, 1 vol, 1 echiv) şi trans-2-buten-1,4-diol (geometria olefinei confirmată de 1H-RMN; 335 g, 3,80 mol. 0,335 greutate, 3,0 echiv.) au fost azeotropate de două ori cu THF (3,0 l, 3,0 vol). Reziduul a fost dizolvat într-un amestec de THF (10 I, 10 vol) şi toluen (15 I, 15 vol). S-a adăugat trifenilfosfină (432 g, 1,65 mol, 0,432 în greutate, 1,3 echiv.) şi apoi amestecul de reacţie a fost răcit la -5°C. DIAD (0,320 l, 1,65 mol, 333 g, 0,333 greutate, 0,320 vol, 1,3 echiv.) a fost adăugat încet timp de 20 de minute menţinând T-intern sub 5 °C. Reacţia a fost agitată la 0 - 5 °C timp de 1 h şi monitorizată prin LCMS. Baia de gheaţă a fost îndepărtată şi amestecul a fost lăsat să se încălzească la temperatura camerei. După agitare peste noapte (17 h), s-au adăugat o trifenilfosfină (83 g, 0,32 mol, 0,083 greutate, 0,25 echiv.) şi DIAD (62 ml, 0,32 mol, 64 g, 0,064 greutate, 0,062 vol, 0,25 echiv). După încă 1 h la temperatura camerei, amestecul de reacţie a fost diluat cu MTBE (10 l, 10 vol), spălat de două ori cu NaCI semisaturat soluţie în apă (soluţie 18% în greutate în apă; 2 x 4l) şi concentrat în vid până la un ulei gros. Amestecul a fost re-dizolvat într-un amestec de MTBE (4,00 l, 4 vol) şi n-heptan (0,50 l, 0,5 vol) şi apoi răcit la 0°C. La soluţie s-a adăugat un cristal de sămânţă de oxid de trifenilfosfină. Solidele au început încet să precipite din soluţie şi au fost agitate peste noapte. Solidul alb a fost colectat prin filtrare în vid şi clătit cu MTBE (2 l, 2 vol) pentru a izola 540 g de oxid de trifenilfosfină. Filtratul a fost concentrat şi purificat prin Biotage 150L KP-Sil (SiO2 5 kg; pretratat cu 1% TEA în Hep/etOAc; eluanţi: heptan/EtOAc (48 l de 33% EtOAc cu 1% TEA, 24 l de 50% EtOAc cu 1% TEA, 24 l de 66% EtOAc cu 1% TEA) → 100% EtOAc cu 1% TEA). Coloana a fost monitorizată prin TLC (2:1 EtOAc/n-heptan). Fracţiunile de produs curat au fost combinate şi concentrate sub vid pentru a da Compusul 132 ca spumă solidă de culoare albă pal (634 g, a conţinut 14% în greutate coprodus derivat de DIAD, net 545 g, 0,63 mol, 50% randament ajustat). Fracţiunile de amestec au fost combinate şi concentrate sub vid pentru a da spumă solidă galben pal (750 g), care a fost supus repurificării prin Biotage 150M HP-Sphere (2,5 kg SiO2; pretratat cu 1% TEA în Hep/EtOAc; proba încărcată cu eluenţi de toluen: Hep/EtOAc/1%TEA (12 l de 50% EtOAc cu 1% TEA, 16 l 66% EtOAc cu 1% TEA) → EtOAc cu 1% TEA). Coloana a fost monitorizată prin TLC (2/1/0,03 EtOAc/n-hep/TEA). Fracţiunile de produs curat au fost combinate şi concentrate sub vid pentru a da Compusul 132 suplimentar ca spumă solidă de culoare albă pal (206 g, 0,24 mol, randament 18%).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,58 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,43 - 7,37 (m, 2H), 7,32 - 7,28 (m, 2H), 7,24 - 7,15 (m, 8H), 7,03 - 6,98 (m, 2H), 6,78 - 6,73 (m, 4H), 6,18 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,88 (td, J = 5,5, 15,6 Hz, 1H), 5,77 (td, J = 5,1, 15,6 Hz, 1H), 5,60 (ddd, J = 2,7, 4,3, 53,1 Hz, 1H), 5,03 - 4,96 (m, 2H), 4,91 (ddd, J = 4,5, 6,6, 16,6 Hz, 1H), 4,18 - 4,14 (m, 1H), 3,88 - 3,82 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,52 (dd, J = 2,7, 10,9 Hz, 1H), 3,14 (dd, J = 3,5, 10,9 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,01 (s, 3H).
Etapa 4
Compusul 132 (800 g, 0,930 mol, 1 greutate, 1 vol, 1 echiv) şi Compusul 133 (522 g, 1,07 mol, 0,652 greutate, 1,15 echiv.) au fost uscate azeotropic cu THF (2 x 3 l, 2 x 3,8 vol) şi re-dizolvate în THF (9,60 l, 8,45 kg, 12,0 vol) la temperatura camerei. S-a adăugat trifenilfosfină (317 g, 1,21 mol, 0,396 în greutate, 1,30 echiv.) şi amestecul a fost răcit sub -5°C. A fost adăugat DIAD (226 ml, 1,16 mol, 235 g, 0,294 greutate, 0,283 vol, 1,25 echiv.), T-internă sub 7°C. Reacţia a fost lăsată să se încălzească încet la temperatura camerei. Reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După 21 de ore, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid până la un ulei gros, azeotropat cu n-heptan (2,00, 1,37 kg, 1,71 greutate, 2,50 vol) şi apoi redizolvat într-un amestec de MTBE (2,40 l, 1,78 kg, 2,2 greutate, 3,0 vol) şi n-heptan (800 ml, 547 g, 0,68 greutate, 1,0 vol). Soluţia a fost însămânţată cu oxid de trifenilfosfină şi răcită la 5°C, diluată cu n-heptan (400 ml, 274 g, 0,34 greutate, 0,50 vol) şi agitată la 5°C timp de 30 minute. Precipitatul solid alb a fost colectat prin filtrare în vid şi clătit cu un amestec 2:1 (v/v) de MTBE şi n-heptan (1,8 l) pentru a da oxid de trifenilfosohină (455 g). Filtratul a fost concentrat sub vid şi purificat prin Biotage 150 L KP-Sil (SiO2 5 kg; pretratat cu 1% TEA; proba încărcată prin dizolvarea în eluenţi toluen: 9:1 heptan/EtOAc (16 l) şi 15 TEA, 3,6:1 (46 l), 2:1 (20 l) şi 1% TEA, 1:1 (30 l) şi 1% TEA şi 100% EtOAc (16 l) şi 1% TEA). Fracţiunile de produs curat combinate au fost concentrate sub vid pentru a da Compusul 134 ca spumă solidă de culoare albă murdar (662,2 g). Fracţiunile de amestec au fost combinate şi concentrate sub vid (480 g). Un solid alb insolubil format prin diluare cu toluen (300 ml) înainte de încărcare pe Biotage 150L a fost îndepărtat prin filtrare în vid. Materialul solubil în toluen a fost purificat prin Biotage 150M HP-Sphere (SiO2 2,5 kg (pretratat cu 1% TEA); încărcarea probei cu toluen; eluanţi: 2:1 heptan/EtOAc (26 l) cu gr/1% TEA, 1:1 (25 l) cu gr/1% TEA, 1:4 (34 l) cu gr/1% TEA). Coloana a fost monitorizată prin TLC (1:1 heptan/EtOAc). Fracţiunile de produs curat combinate au fost concentrate sub vid pentru a da Compusul 134 suplimentar ca spumă solidă alb murdar (165,5 g. Total 662,2+165,5 g = 827,7 g, 930 mmol, 1,03 g, randament 67%).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,47 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,38 - 7,31 (m, 5H), 7,27 - 7,19 (m, 6H), 7,14 - 7,06 (m, 3H), 6,93 - 6,87 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,26 (dd, J = 2,0, 16,0 Hz, 1H), 6,15 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,86 (dd, J = 4,7, 15,2 Hz, 1H), 5,80 (dd, J = 4,7, 15,2 Hz, 1H), 5,51 (ddd, J = 2,7, 4,3, 52,8 Hz, 1H), 5,31 (ddd, J = 2,0, 4,3, 52,8 Hz, 1H), 4,87 (d, J = 4,7 Hz, 2H), 4,85 - 4,81 (m, 1H), 4,79 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,71 - 4,59 (m, 1H), 4,20 - 4,13 (m, 2H), 4,06 (dd, J = 2,7, 11,3 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 2,7, 11,7 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,52 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,18 (dd, J = 3,9, 10,9 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 6H), 0,07 (s, 3H)
Etapa 5-6
La o soluţie de Compus 134 (410,7 g, 309 mmol, 1 greutate, 1 vol., 1 echiv.) în piridină (1,23 l, 1,21 kg, 15,2 mol, 2,9 greut, 3,0 vol, 49 echiv.) s-a adăugat difenil fosfit (90 ml, 109 g, 0,46 mol, 0,26 greutate, 0,22 vol, 1,5 echiv). Reacţia a fost agitată la temperatura camerei şi a fost monitorizată prin LCMS. După 2 h (conversie 80%) s-a adăugat un fosfit de difenil suplimentar (29,9 ml, 36,2 g, 155 mmol, 0,088 greutate, 0,073 vol, 0,50 echiv). După încă 1 h s-a adăugat un fosfit de difenil suplimentar (6,0 ml, 7,2 g, 31 mmol, 0,018 greutate, 0,015 vol, 0,10 echiv.) şi reacţia a fost continuată pentru încă 0,5 h (conversie 98%). Amestecul de reacţie a fost adăugat la un amestec de NaHCO3 saturat (soluţie 9% în greutate în apă; 2,1 l, 5 vol.) şi apă (1,0 l ml, 2,5 vol.) în timp ce se menţine T-internă la 4,7 până la 12 °C. Reactorul a fost clătit cu un volum mic de EtOAc. Agitarea a fost continuată la temperatura camerei timp de 30 de minute şi s-a monitorizat reacţia prin LCMS (conversie 100%). Amestecul de reacţie a fost extras de două ori cu un amestec 1:1 de EtOAc şi MTBE (2 x 8,2 l, 2 x 20 vol). Straturile organice combinate au fost spălate cu apă (4,1 l, 10 vol), concentrate in vid şi azetropate cu toluen (3 x 4,1 l, 3 x 10 vol; alimentare continuă) pentru îndepărtarea piridinei pentru a da Compusul 135 (0,55 echiv piridină rămasă).
Etapa 6 - Compusul brut 135 a fost dizolvat în diclormetan (3,08 l, 4,07 kg, 9,9 greutate, 7,5 vol) la temperatura ambiantă. S-a adăugat apă (55,7 ml, 0,136 vol., 10 echiv) urmată de o soluţie de acid dicloracetic (77 ml, 120 g, 0,93 mol, 0,29 gr., 0,19 vol., 3,0 echiv) în DCM (3,08 l, 7,5 vol.) în timp ce se păstrează T-ra internă sub 25 °C. (Transformat într-o soluţie portocalie). După 30 de minute, s-a adăugat trietilsilanul (Et3SiH; 494 ml, 359 g, 3,09 mol, 0,875 greutate, 1,20 vol, 10,0 echiv.) (T-internă a trecut de la 18,2 °C la 17 °C) şi agitarea a fost continuată timp de 20 min. S-a adăugat trietilamină (431 ml, 313 g, 3,09 mol, 0,762 greut., 1,05 vol, 10,0 echiv) (T-internă a fost de la 17,8 °C la 22 °C). Amestecul a fost concentrat la 1,55 kg (3,8 g), redizolvat în EtOAc (6,2 l, 5,5 kg, 14 g, 15 vol), spălat secvenţial cu: (1) apă (1,0 l, 2,5 vol.) şi NaHCO3 saturat (9% în greutate soluţie în apă, 0,82 l, 2,0 vol). Soluţia de EtOAc produs brut a fost depozitată la -20 °C peste noapte.; 0,82 l, 2,0 vol) şi în ziua următoare, soluţia a fost concentrată in vid la 25 °C. Amestecul brut astfel obţinut (654 g) a fost triturat cu: (1) n-heptan (3,01 l, 7,5 vol.), (2) un amestec de n-heptan (2,46 l, 6,0 vol.) şi toluen (0,82 l, 2,0 vol.). Partea de soluţie (supernatant) a fost decantată şi solidul rămas la fund a fost dizolvat în acetonitril (4,1 l, 10 vol). Amestecul a fost concentrat în vid la 25 °C şi a fost azeotropat cu acetonitril de două ori pentru a da Compusul 136. Produsul a fost utilizat pentru etapa ulterioară fără purificare (un randament teoretic asumat de 100%).
Etapa 7
Etapa 7a Compusul 136 (337 g, 309 mmol, 1 greutate, 1 vol, 1 echiv.) a fost dizolvat în piridină anhidră (13,5 l, 13,2 kg, 39 greutate, 40 vol) la temperatura camerei. S-a adăugat trietilamină (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0,28 greutate, 0,38 vol, 3,0 echiv.) urmată de 2-oxid de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinan (DMOCP; 103 g, 556 mmol, 0,31 greutate, 1,80 echiv). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă timp de 30 de minute şi monitorizat prin LCMS (conversie 100%) pentru a genera Compusul 137.
Etapa 7b TEA (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0,28 gr., 0,38 vol., 3,0 echiv.), apă (100 ml, 5,56 mol, 0,30 gr., 0,30 gr., 18 echiv.) şi sulf (34,7 g, 1,08 mol, 0,10 greut., 3,5 echiv.) s-au adăugat la amestecul de mai sus de Compus 137. După 90 de minute (conversie 100%), NaHCO3 (soluţie 9% în greutate în apă; 3,37 l, 10 vol) s-a adăugat în timp ce se menţine T-internă sub 30 °C (16,6 °C până la 27 °C). Amestecul rezultat a fost filtrat pentru îndepărtarea sărurilor. Filtratul a fost concentrat amestecul in vid, diluat cu MTBE (5,1 l, 15 vol) şi spălat de două ori cu NaCI (30% în greutate soluţie în apă; 2 x 1,35 l, 2 x 4 vol). Solidele insolubile au fost filtrate şi filtratul a fost concentrat în vid şi azeotropat cu toluen (4,0 l, 2 vol). Solidul rezultat a fost îndepărtat prin filtrare şi amestecul brut a fost dizolvat în toluen şi purificat prin Biotage 150L KP-Sil (SiO2 5 kg; pretratat cu Hep/EtOAc/TEA (1,5/1,5/0,03 CV); eluat cu: EtOAc/TEA (3/0,03 CV), EtOAc/MeOH/TEA (4/0,2/0,04 CV), EtOAC/MeOH/TEA (2/0,2/0,02CV) Coloana a fost monitorizată prin TLC (EtOAC/MeOH /TEA=9/1/0,1). Fracţiunile care conţin izomer Sp au fost combinate şi concentrate sub vid pentru a da Compusul 138 ca spumă solidă de culoare roz deschis (izomer Sp; 154 g, 128 mmol, 0,46 greutate, randament 41,3%). Fracţiunile care conţin izomer Rp au fost combinate şi concentrate sub vid pentru a da Compusul 240 ca spumă solidă de culoare roz deschis ( Rp izomer; 64 g, 53 mmol, 0,19 greutate, randament 17%).
Compus 138 (izomer Sp):
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,51 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,49 - 7,44 (m, 2H), 7,38 - 7,27 (m, 4H), 7,25 - 7,21 (m, 2H), 7,14 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 6,44 (dd, J = 2,5, 13,9 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 5,78 (td, J = 6,3, 15,6 Hz, 1H), 5,69 (td, J = 4,7, 15,6 Hz, 1H), 5,56 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 1H), 5,20 - 5,06 (m, 1H), 4,95 - 4,79 (m, 4H), 4,69 (dd, J = 4,3, 16,0 Hz, 1H), 4,54 - 4,38 (m, 3H), 4,35 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,32 - 4,29 (m, 1H), 4,05 (dd, J = 1,6, 11,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 3,1, 11,7 Hz, 1H), 3,14 - 3,06 (m, 6H), 1,30 (t, J = 7,4 Hz, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,06 (s, 3H), 0,05 (s, 3H)
Compus 240 (izomer Rp):
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,54 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,39 - 7,09 (m, 10H), 6,39 (dd, J = 2,3, 14,1 Hz, 1H), 6,13 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 3,1 Hz, 2H), 5,68 (dd, J = 4,3, 51,2 Hz, 1H), 5,43 - 5,29 (m, 1H), 5,10 - 4,96 (m, 3H), 4,90 - 4,83 (m, 2H), 4,78 - 4,72 (m, 1H), 4,52 (ddd, J = 3,9, 6,6, 17,2 Hz, 1H), 4,44 - 4,35 (m, 2H), 4,31 - 4,26 (m, 1H), 4,20 - 4,12 (m, 2H), 3,87 (dd, J = 3,5, 11,7 Hz, 1H), 3,79 - 3,77 (m, 1H), 3,15 - 3,09 (m, 6H), 1,33 (t, J = 7,4 Hz, 9H), 0,94 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 3H)
Etapa 8
Compusul 138 (221 g, 183 mmol, 1 gr., 1 vol., 1 echiv.) a fost dizolvat într-un amestec de piridină (530 ml, 6,56 mol, 519 g, 2,3 gr., 2,4 vol.) şi TEA (2,65 l, 19,0 mol, 1,93 kg, 8,7 greutate, 12 vol, 104 echiv). S-a adăugat trihidrofluorură de trietilamină (264 ml, 1,62 mol, 262 g, 1,2 greutate, 1,2 vol, 8,9 echiv ca complex, 27 echiv HF) şi amestecul a fost agitat la RT în timp ce conversia a fost monitorizată prin LCMS. După 3 h (conversie 97%), s-a adăugat metoxitrimetilsilan (TMSOMe; 1,40 l, 10,2 mol, 1,06 kg, 4,8 g, 6,3 vol, 55 echiv.) şi agitarea a fost continuată timp de 30 minute. Un solid lipicios a acoperit reactorul. Partea de soluţie (supernatant) a fost decantată. Solidul a fost triturat de două ori cu toluen (2 x 2,2 l, 2 x 10 vol; supernantul a fost decantat). Solidul brut rămas în reactor a fost dizolvat în diclormetan (2,2 l, 10 vol) şi spălat cu NH4Cl (soluţie 28% în greutate în apă; 2,2 l, 10 vol). Stratul apos a fost extras înapoi cu diclormetan (2,2 l, 10 vol). Straturile organice combinate au fost spălate cu un amestec de NaCI (soluţie de 36% în greutate în apă; 1,1 l, 5 vol.) şi apă (1,1 l, 5 vol.), apoi concentrate sub vid pentru a da Compusul 139 ca spumă maro uscată (152 g, 155 mmol, 0,70 greut, randament 85%) Produsul a fost preluat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
Etapa 9
Compusul 139 (150 g, 153 mmoli, 1 greutate, 1 vol., 1 echiv.) a fost azeotropat cu acetonitril (4 l, 27 vol) şi apoi redizolvat în acetonitril (1,05 l, 0,83 kg, 5,5 greutate, 7,0 vol) la temperatura camerei. S-a adăugat bromură de 2-nitrobenzil (44,4 g, 205 mmol, 0,30 greutate, 1,34 echiv) la temperatura camerei şi reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După 23 h s-au adăugat (conversie 100%), EtOAc (1,50 l, 10 vol), NH4Cl (28% în greutate soluţie în apă; 300 ml, 2 vol.) şi apă (300 ml, 2 vol.) (pH = 6) şi amestecul rezultat a fost concentrat parţial sub vid la 25 °C până la o greutate de 1,11 kg. S-a adăugat EtOAc (2,25 l, 15 vol) şi amestecul a fost agitat timp de 5 minute. Cele două straturi au fost separate. Stratul apos a fost extras cu acetat de etil (750 ml, 5 vol). Straturile organice combinate au fost spălate secvenţial cu: (1) un amestec de NaCI (36% în greutate soluţie în apă; 300 ml, 2 vol.) şi apă (300 ml, 2 vol.) şi (2) apă (600 ml, 4 vol.). Stratul organic a fost apoi concentrat sub vid şi azeotropat cu n-heptan (1,50 l, 10 vol). S-a adăugat MTBE (0,95 l, 6,3 vol) la solidul brut şi amestecul a fost încălzit la 40°C. Amestecul a fost diluat cu EtOAc (300 ml, 2 vol) şi răcit lent la 0°C. Solidul dens a fost lăsat să se depună şi supernatantul a fost pompat printr-un tub de frită cu filtru. Solidul a fost clătit de două ori cu MTBE (2 x 300 ml, 2 x 2 vol.; supernatantul a fost pompat prin tubul de frită cu filtru de fiecare dată) şi uscat sub vid la 40 °C peste noapte pentru a da Compusul 140 ca solid galben pal (156 g). Filtratul a fost concentrat sub vid obţinând un ulei maro (17,8 g), care a fost supus purificării prin Biotage Snap-Ultra 340 g (eluenţi: 0 până la 5% MeOH în EtOAc) pentru a da compusul 140 suplimentar ca solid galben pal (5,8 g). Total 156 g + 5,8 g = 161,8 g (152 mmol net, 95% pur, 99% randament)
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,46 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,09 - 8,06 (m, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,54 - 7,51 (m, 1H), 7,49 - 7,45 (m, 4H), 7,37 - 7,28 (m, 3H), 7,24 - 7,19 (m, 3H), 7,16 - 7,11 (m, 2H), 6,22 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 6,14 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,83 - 5,61 (m, 3H), 5,60 - 5,48 (m, 1H), 5,07 (dd, J = 3,5, 51,6 Hz, 1H), 5,06 - 4,96 (m, 1H), 4,79 (dd, J = 4,9, 15,8 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 4,67 - 4,56 (m, 1H), 4,48 - 4,40 (m, 3H), 4,37 - 4,30 (m, 1H), 4,27 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 4,19 - 4,13 (m, 1H), 3,93 - 3,85 (m, 1H), 3,85 - 3,78 (m, 1H)
Etapa 10-11
Etapa 10 Compusul 140 (95% pur, net 73,2 g, 72,3 mmol, 1 greutate, 1 vol., 1 echiv.) şi 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraizopropilfosforodiamidită (25,3 ml, 79,5 mmol, 0,33 vol., 0,35 vol., 1,10 echiv.) au fost azeotropate cu acetonitril anhidru de trei ori (3 x 2 l), redizolvate în diclormetan (0,73 l, 10 vol) şi răcite la 0-5°C. S-a adăugat tetrazolidă de diizopropilamoniu (6,19 g, 36,1 mmol, 0,085 greutate, 0,50 echiv.). Amestecul de reacţie rezultat a fost agitat la 0 °C timp de 10 h, încălzit la 10 °C timp peste 2 h, menţinut la 10 °C timp de 10 h şi încălzit la temperatura camerei timp de 2 h. Reacţia a fost monitorizată prin LCMS şi TLC (EtOAc cu 0,5% TEA). După 18 h, s-a adăugat acetonitril anhidru (0,73 l, 10 vol) şi amestecul a fost depozitat la -20°C timp de 3 zile.
Etapa 11a Amestecul din Etapa 10 a fost încălzit la temperatura ambiantă şi adăugat printr-o pâlnie de picurare în porţii (100 ml la fiecare 30 de minute, timp de 9 h) într-un amestec de sare de trifluoroacetat de piridină (azeotropat în prealabil cu piridină de două ori; 41,9 g, 217 mmol, 0,57 greutate, 3,0 echiv.) şi acetonitril (5,85 l, 80 vol). Reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După 13 h, s-a adăugat o soluţie de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraizopropilfosforodiamidită (5,8 ml, 18 mmol, 0,25 echiv.) în acetonitril (24 ml) timp de 4 h. Cantitatea de reactiv suplimentar a fost determinată pe baza Compusului 140 de reaminare (∼ 30% pe baza LCMS). S-a observat mai multă conversie a diolului după 6 h.
Etapa 11b S-a adăugat ((dimetilaminometiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazolin-3-tionă (DDTT; 20,8 g, 101 mmol, 0,28 în greutate, 1,4 echiv.) şi agitarea a fost continuată timp de 1 h. Amestecul de reacţie a fost parţial concentrat la ∼ 800 ml şi diluat cu MTBE (1,46 l, 20 vol), NaHCO3 (soluţie 9% în greutate în apă; 1,1 l, 15 vol.) şi apă (0,37 l, 5 vol). pH= 8. Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu un amestec de MTBE (1,46 l, 20 vol) şi EtOAc (1,10 l, 15 vol). Straturile organice combinate au fost spălate de două ori cu NaCI apos 30% (2 x 0,73 l, 2 x 10 vol), concentrate sub vid la 35 °C şi azeotropate cu toluen (1,46 l, 20 vol). LCMS şi TLC (EtOAc) au indicat Compusul 143 (SpRp, dorit): Compusul 241 (SpSp) = 5: 1
Produsul brut a fost purificat prin Biotage 150M KP-Sil, (SiO2 2,5 kg; eluanţi: EtOAc/Hep: 2:1 (4 CV), 3:1 (2,5 CV), 4:1 (2,5 CV), 100% EA (3 CV), 5-10% MeOH în EA 4 CV) pentru a da Compusul 143 (36 g, 31,5 mmol, randament 44%).
Compus 143 (SpRp): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,59 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,03 - 7,99 (m, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,56 - 7,53 (m, 2H), 7,49 - 7,40 (m, 5H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 7,24 - 7,16 (m, 4H), 6,92 (s, 1H), 6,29 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 6,08 (d, J = 20,7 Hz, 1H), 5,97 - 5,83 (m, 1H), 5,76 (td, J = 4,7, 15,6 Hz, 1H), 5,61 - 5,51 (m, 2H), 5,40 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 5,29 - 5,17 (m, 1H), 4,91 (dd, J = 7,4, 14,9 Hz, 1H), 4,86 - 4,75 (m, 3H), 4,63 (dd, J = 3,7, 9,2 Hz, 1H), 4,58 - 4,43 (m, 5H), 4,34 - 4,19 (m, 4H), 2,79 (td, J = 5,9, 16,8 Hz, 1H), 2,66 (td, J = 6,3, 16,8 Hz, 1H).
Compus 241 (SpSp) 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,11 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,56 - 7,40 (m, 7H), 7,33 - 7,28 (m, 2H), 7,23 - 7,17 (m, 4H), 6,22 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,85 (dd, J = 3,5, 51,2 Hz, 1H), 5,75 - 5,45 (m, 5H), 4,95 - 4,23 (m, 14H), 2,82 (t, J = 6,1 Hz, 2H).
Etapa 12
Compusul 143 (71,6 g, 62,6 mmol, 1 greutate, 1 voi, 1 echiv) a fost dizolvat în 1,4-dioxan (0,43 l, 6 vol). S-a adăugat tiofenol (215 ml, 2,09 mol, 230 g, 3,2 g, 3 vol, >30 echiv) urmat de trietilamină (215 ml, 1,54 mol, 156 g, 2,2 g, 3 vol). S-a observat o oarecare exotermă (T-internă a crescut cu ∼ 7 °C), prin urmare, baia de apă/gheaţă a fost folosită pentru a răci şi controla T-internă sub 27 °C. Reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După 2 h, s-au adăugat MeOH (0,57 l, 8 vol) şi NH4OH (28% în greutate; 15 mol, 0,57 l, 8 vol, >200 echiv). Amestecul rezultat a fost încălzit la 50°C timp de 5 h, răcit la temperatura camerei şi agitat peste noapte. După 14 h, s-a adăugat apă (0,72 l, 10 vol.) (nu s-a observat solid) şi amestecul a fost extras de trei ori cu un amestec 1:1 (v/v) de n-heptan şi toluen (3 x 0,86 l, 3 x 12) vol), urmat de toluen (0,57 l, 8 vol). Stratul apos a fost concentrat în vid la 40-50°C şi diluat cu apă (1,07 l, 15 vol). Suspensia rezultată a fost păstrată peste noapte la temperatura camerei. Solidul rezultat a fost filtrat, clătit cu apă (0,36 l, 5 vol). Filtratul a fost încă tulbure şi s-a filtrat prin celită şi un filtru Kuno. Tulburarea a fost încă prezentă. S-a adăugat HCI (soluţie 1,0 M în apă; 132 ml, 132 mmol, 2,1 echiv.) timp de 1 h şi pH-ul a fost verificat (pH <2). Agitarea a fost continuată la temperatura camerei timp de 1 h şi amestecul a fost filtrat. Turta de filtrare a fost crescută cu apă (8 x 0,20 l), uscată într-un cuptor cu vid la 35 °C timp de 2 zile şi fără căldură timp de 1 zi pentru a da Compusul 1 ca solid portocaliu pal (44,88 g, 60,1 mmol, 0,63 în greut., randament 96%).
Etapa 13
La acidul liber Compus 1 (22,42 g, 30,03 mmol, 1 greutate, 1 vol, 1 echiv) s-a adăugat amoniac (soluţie 2,0 M în MeOH; 220 ml, 440 mmol, 10 vol, 15 echiv). S-a adăugat EtOH (55 ml, 2,5 vol) şi soluţia rezultată a fost filtrată printr-un filtru Kuno (0,45 microni; PTFE), crescând cu un amestec 1:1 (v/v) de MeOH şi EtOH (90 ml, 4 vol). Filtratul a fost concentrat în vid la 30 °C dând un solid alb murdar, care a fost uscat la temperatura camerei peste noapte, măcinat cu o spatulă (uşor de spart) şi uscat în continuare în vid la temperatura camerei. Solidul izolat a fost apoi suspendat în toluen (250 ml) şi agitat la temperatura camerei timp de 30 minute. Solidul a fost apoi colectat prin filtrare în vid şi clătit cu toluen de două ori (2 x 50 ml). Solidul a fost apoi uscat sub vid într-un cuptor cu vid pentru a da 22,4 g de Compus 1a (sarea de di-amoniu a Compusului 1).
Recristalizare: Compusul 1a (22,14 g, 28,36 mmol, 1 greutate, 1 vol., 1 echiv.) a fost dizolvat într-un amestec de apă (664 ml, 30 vol.) şi hidroxid de amoniu (28% în greutate; 2,5 ml, 18 mmol, 0,63 echiv) (pH = 9-10) şi extras cu toluen de trei ori (3 x 300 ml, 3 x 14 vol.), EtOAc de trei ori (3 x 200 ml, 3 x 9 vol.) şi toluen de trei ori (3 x 300 ml, 3 x 14 vol.). Stratul apos rezultat a fost tratat cu HCI (soluţie 1,0 M în apă; 90 ml, 90 mmol, 3,2 echiv.) pe o perioadă de 3,5 ore (pH ≤2). Amestecul a fost agitat timp de 30 de minute şi apoi precipitatul solid a fost colectat prin filtrare în vid. Turta de filtrare a fost spălată cu apă de trei ori (3 x 200 ml, 3 x 9 vol) şi uscată în vid peste noapte. S-au adăugat amoniac (soluţie 2,0 M în MeOH; 250 ml, 500 mmol, 17,6 echiv.) şi etanol (100 ml) la solid şi amestecul rezultat a fost concentrat în vid până când au apărut cristale (∼ 100 ml), moment în care concentrarea a fost oprită şi amestecul a fost agitat timp de 20 de minute. S-a adăugat etanol (45 ml) şi amestecul a fost parţial concentrat (45 ml îndepărtaţi). Aceeaşi operaţiune a fost repetată de încă două ori şi apoi amestecul a fost răcit la 0 °C şi agitat timp de 3,5 h. Solidul alb a fost colectat prin filtrare în vid şi spălat cu etanol rece (20 ml) urmat de acetat de etil (2 x 50 ml). Solidul alb a fost uscat sub vid la temperatura camerei timp de 3 zile pentru a da Compusul 1a ca solid alb (16,6 g, 21,3 mmol, 0,75 greutate, randament 75%). Filtratul a fost concentrat sub vid şi uscat sub vid la temperatura camerei timp de 3 zile pentru a da Compusul 1a ca solid alb murdar (4,16 g, 5,3 mmol, randament 18%).
Exemplul 1.2 - Analiza 1H RMN a Compusului 1
O spectrogramă 1H NMR a Compusului 1a este arătat în FIG. 3. Spectrul rezultat a fost: 1H-RMN Spectru (400MHz, DMSO-d6, δH 2,49 ppm, 80 °C)
δ(ppm) : 3,05-3,13(4H, m), 3,70(1H, dd, J=13, 5 Hz), 3,78(1H, dd, J=12, 4Hz), 4,21-4,24(2H, m), 4,28(1H, m), 4,38(1H, m), 4,53-4,68(2H, m), 5,22(1H, m), 5,76(2H, s), 5,78(1H, m), 6,26(1H, m), 6,29(1H, m), 8,13(1H, s), 8,14(1H, s), 8,36(1H, s l), 8,59(1H, s l).
Exemplul 1.3 - Analiza cu raze X a Compusului 1
Aproximativ 2 mg de compus 1 s-au dizolvat în 600 ul de apă. 120 ul din această soluţie au fost puse într-un alt flacon de sticlă şi apoi acest flacon a fost depozitat într-un recipient fix cu 3 ml de MeCN la temperatura camerei timp de 1 săptămână. Acesta este Metoda de difuzie a vaporilor H2O/MeCN de preparare a probei.
Un bloc incolor monocristal (0,1 × 0,1 × 0,1 mm) găsit în soluţia de cristalizare a fost dispersat în Parabar 10312 lichid şi a fost montat pe un Dual-Thickness MicroMounts™ (MiTeGen). Datele de difracţie au fost colectate la -160 °C pe XtaLAB PRO P200 MM007HF (Rigaku) cu metoda de oscilaţie a axei ω utilizând radiaţia Cu-Kα monocromată în oglindă cu mai multe straturi.
FIG. 4A prezintă o figură ORTEP a moleculelor de Compus 1 într-o unitate asimetrică, împreună cu un număr de molecule de apă dezordonate. FIG. 4B prezintă structura cristalină a uneia dintre moleculele Compusului 1 din FIG. 4A. FIG. 4C prezintă structura cristalină a celeilalte molecule a Compusului 1 prezentată în FIG. 4A.
Structura cristalină a Compusului 1 a fost rezolvată cu un factor R final de 0,1354. Parametrul Flack a fost aproape zero (0,083(17)), indicând configuraţia absolută a Compusului 1 este (R, S). Analiza structurii cristaline a indicat, de asemenea, că multe molecule de apă au fost prezente în canalul mare al Compusului 1, ceea ce a indicat că moleculele de apă au putut să alunece cu uşurinţă din canal. Analiza a confirmat, de asemenea, că conformaţiile ambelor molecule independente cristalografic şi unitatea asimetrică au fost aproape aceleaşi.
Alţi parametri ai analizei cu raze X sunt prezentaţi mai jos:
Temperatura 113 K Lungime de undă 1,54184 Е Sistem cristalin, grup spaţial Monoclinic, P21 Parametrul reţelei a = 8,1584(3) Е b = 35,451(2) Е c= 15,9146(6) Е β = 91,313(3) ° Volum 4601,7(4) Е3 Valoare Z, densitate calculată 4, 1,127 g/cm3 Mărime cristal 0,1 × 0,1 × 0,1 mm Număr total de reflecţii/număr unic de reflecţii 52006/17198 [R(intensitate)=0,0876] Integralitate 92,2 % Determinarea fazei Metode directe (SHELXT Versiunea 2014/5) Metoda de rafinare Cele mai mici pătrate cu matrice completă pe F2 (SHELXL versiunea 2014/7) Date/parametru 17198/1116 Indicator de bunăstare a potrivirii 1,545 Reziduuri: R(I>2σ(I)) 0,1354 Reziduuri: Rw 0,3886 Parametrul Flack 0,083(17) Diferenţa maximă şi minimă de vârf 1,17 şi -0,88 e-/Е3
Exemplul 2 -- Sinteza Compusului 2
Compusul 106 ( izomerul RpRp al Compusului 105) obţinut din Exemplul 1, Etapa E a fost procesat separat prin Exemplul 1, Etapa F şi Exemplul 1, Etapa G pentru a da Compusul 2a (izomer RR al Compusului 1a):
Compus 108 (RpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,12 (dd, J =8,2, 0,8 Hz, 2H), 7,99 (s, 2H), 7,96 (s, 2H), 7,65 - 7,48 (m, 10H), 7,38 - 7,33 (m, 2H), 7,26 - 7,24 (m, 4H), 6,22 (d, J = 17,6 Hz, 2H), 5,95 - 5,84 (m, 2H), 5,71 (dd, J = 50,8, 3,9 Hz, 2H) 5,73 - 5,71 (m, 2H), , 4,88 - 4,77 (m, 4H), 4,59 - 4,38 (m, 8H), 4,19 (m, 2H).
Compus 2a (RpRp, trans) 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ = 8,70 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 6,34 (s l, 2H), 5,83 (s l, 2H), 5,73 - 5,53 (m, 2H), 5,38 - 5,01 (m, 2H), 4,76 - 4,32 (m, 6H), 3,95 (s l, 2H), 3,69 - 3,64 (m, 2H); 31P RMN (162 MHz, CD3OD) δ= 55,57 (s, 1P), 55,32 (s, 1P).
Exemplul 2.1 - Analiza cu raze X a Compusului 2
Compusul 2 (0,5 mg) a fost cântărit şi dizolvat în soluţie de acetonitril/amoniac 28%. Apoi, această soluţie a fost păstrată la temperatura camerei cu capac fixat lejer. După 2 săptămâni a apărut cristalul în formă de tijă.
Un bloc incolor monocristal (0,1 × 0,1 × 0,5 mm) găsit în soluţia de cristalizare a fost dispersat în Parabar 10312 lichid şi a fost montat pe un Dual-Thickness MicroMounts™ (MiTeGen). Datele de difracţie au fost colectate la -160 °C pe XtaLAB PRO P200 MM007HF (Rigaku) cu metoda de oscilaţie a axei ω utilizând radiaţia Cu-Kα monocromată în oglindă cu mai multe straturi.
FIG. 4D arată o figură ORTEP a moleculei Compusului 2.
Alţi parametri ai analizei cu raze X sunt prezentaţi, mai jos:
Temperatura 113 K Lungime de undă 1,54187 Е Sistem cristalin, grup spaţial Monoclinic, P2 Parametrul reţelei a = 14,20210(11) Е b = 7,99219(7) Е c= 19,03500(14) Е β = 94,2005(7)° Volum 2154,78(3) Е3 Valoarea Z 2 Mărime cristal 0,1 × 0,1 × 0,5 mm Număr total de reflecţii/număr unic de reflecţii 29195/8152 [R(intensitate)=0,0216] Integralitate 94,8 % Determinarea fazei Metode directe (SHELXT Versiunea 2014/5) Metoda de rafinare Cele mai mici pătrate cu matrice completă pe F2 (SHELXL versiunea 2014/7) Date/parametru 8152/518 Indicator de bunăstare a potrivirii 1,099 Reziduuri: R(I>2σ(I)) 0,0711 Reziduuri: Rw 0,2133 Parametrul Flack 0,020(8) Diferenţa maximă şi minimă de vârf 1,95 şi -0,64 e-/Е3
Exemplul 3 - Sinteza Compusului 3
Compusul 109 ( izomerul SpSp al Compusului 105) obţinut din Exemplul 1, Etapa E a fost procesat separat prin Exemplul 1, Etapa F şi Exemplul 1, Etapa G pentru a da Compusul 3a (izomer SS al Compusului 1a):
Compus 109 (isomer SpSp al Compusului 105): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,52 (s, 2H), 7,99 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,91 (s, 2H), 7,63 - 7,40 (m, 10H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 7,23 - 7,16 (m, 4H), 6,10 - 5,93 (m, 4H), 5,92 - 5,75 (m, 2H), 5,62 - 5,50 (m, 2H), 5,26 - 5,16 (m, 2H), 5,09 - 5,03 (m, 2H), 4,98 - 4,91 (m, 4H), 4,61 - 4,25 (m, 10H)
Compus 3a (SpSp, trans): 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ = 8,97 (s l, 1H), 8,84 (s l, 1H), 8,21 (s l, 2H), 6,31 (s l, 2H), 6,08 (d l, J = 53,5 Hz, 1H), 5,89 (s l, 2H), 5,63 (d l, J = 52,4 Hz, 1H), 5,13 - 4,96 (m, 2H), 4,72 - 4,32 (m, 6H), 4,01 (d l, J = 9,8 Hz, 2H), 3,67 (s l, 2H).
Exemplul 4 -- Sinteză de Compus 4a
Compusul 107 obţinut din Exemplul 2, Etapa F, izolat ca singur izomer cis prin cromatografie pe silicagel, a fost procesat separat prin Exemplul 1, Etapa G pentru a da Compusul 4a.
Compus 107: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,13 (s, 2H), 8,12 - 8,08 (m, 2H), 7,91 (s, 2H), 7,65 - 7,55 (m, 4H), 7,54 - 7,45 (m, 6H), 7,33 - 7,27 (m, 2H), 7,23 - 7,16 (m, 4H), 6,14 (d, J = 17,6 Hz, 2H), 5,88 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 2H), 5,76 - 5,61 (m, 4H), 5,21 - 4,99 (m, 4H), 4,60 - 4,46 (m, 4H), 4,45 - 4,37 (m, 2H), 4,30 - 4,13 (m, 4H), 3,49 (d, J = 5,1 Hz, 2H)
Compus 4a (RpRp, cis al 1a, Compus 4a): 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,48 (s l, 2H), 8,02 (s l, 2H), 6,29 (d, J = 14,8 Hz, 2H), 5,99 (s l, 2H), 5,43 (d, J = 51,2 Hz, 2H), 5,03 - 4,88 (m, 2H), 4,43 (d l, J = 11,7 Hz, 2H), 4,32 (d l, J = 9,4 Hz, 2H), 4,27 - 4,17 (m, 2H), 4,21 - 4,02 (m, 2H), 3,97 (dd l, J = 6,1, 12,3 Hz, 2H).
Exemplul 5 -- Sinteza Compusului 5
Izomerul cis obţinut din Exemplul 1, Etapa F a fost prelucrat separat prin Exemplul 1, Etapa G pentru a da Compusul 5a.
Compus 111 (izomer cis al Compusului 107): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,48 (s, 1H), 8,15 - 8,09 (m, 1H), 8,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,65 - 7,06 (m, 11H), 6,07 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 20,3 Hz, 1H), 5,97 - 5,79 (m, 1H), 5,84 (dd, J = 3,5, 51,2 Hz, 1H), 5,54 - 5,47 (m, 1H), 5,50 (dd, J = 3,9, 52,0 Hz, 1H), 5,38 - 5,21 (m, 2H), 5,18 - 5,02 (m, 2H), 5,02 - 4,95 (m, 1H), 4,78 - 4,69 (m, 1H), 4,60 - 4,16 (m, 10H) Compound 5a (SpRp, cis al 1a): 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,88 (s l, 1H), 8,51 (s l, 1H), 8,16 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 6,38 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 6,33 (d, J = 14,1 Hz, 1H), 6,14 - 6,09 (m, 2H), 6,01 (d, J = 49,2 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 49,6 Hz, 1H), 5,02 - 4,87 (m, 2H), 4,76 - 3,92 (m, 8H), 3,75 - 3,56 (m, 2H)
Exemplul 6 -- Sinteză de Compus 6a (SpRp)
La o soluţie de compus 1a (1,5 mg, 2,0 µmol) în MeOH/H2O (0,6/0,5 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat hidroxid de paladiu pe cărbune (20 % în greutate bază uscată, 2 mg). Amestecul rezultat a fost tratat cu hidrogen (balon) în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După consumarea completă a materiei prime, amestecul a fost filtrat şi clătit cu metanol până când tot produsul s-a îndepărtat. Filtratul a fost concentrat în vid şi reziduul a fost dizolvat în apă (1 ml). Purificarea RHPLC a furnizat compusul 6a (0,9 mg).
LCMS (MS m/z 749,2 [M+H]+)
Exemplul 7 -- Sinteza Compusului 9
La o soluţie de 107 (3,7 mg, 3,02 µmol) în EtOH (1,5 ml) s-a adăugat hidroxid de amoniu (1 ml). Amestecul rezultat a fost încălzit la 50 °C timp de 8 h şi răcit la temperatura ambiantă. Solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă. Reziduul a fost tratat cu 2 ml apă şi solidul rezultat a fost filtrat. Filtratul a fost supus HPLC preparativă pentru a da compusul 9a (2,5 mg).
Compus 9a : 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,67 (s l, 1H), 8,50 (s l, 1H), 8,25 (s l, 1H), 8,12 (s l, 1H), 6,47 - 6,28 (m, 2H), 5,92 - 5,79 (m, 2H), 5,74 (d, J= 50,8 Hz, 1H), 5,32 (d, J= 52,4 Hz, 1H), 5,16 - 4,95 (m, 2H), 4,71 - 4,25 (m, 6H), 4,17 - 3,97 (m, 2H), 3,83 - 3,61 (m, 2H).
LCMS: MS m/z 715,2 [M+H]+.
Exemplul 8 -- Căi de sinteză pentru compuşii 8a, 11a şi 12a
Cu Compusul 112 şi compusul 102 ca materii prime, compuşii 8, 11 şi 12 au fost preparaţi prin aceleaşi secvenţe de reacţie ca cele descrise în Exemplul 1.
Condiţii HPLC preparativă pentru fracţiunile A şi B
Instrument Agilent 1200 Coloană HPLC Coloană Waters Sunfire Prep C18 OBD, 5 um, 19 x 100 mm, #186002567 Debit 20 ml/min faza mobilă A: ap, B: acetonitril Gradient Timp (min) 0 8 9,9 10 11 B% 40 99 99 40 40 Timp de rulare 12 min Volum de injectare 250 ul (0,03 g/ml în acetonitril) detecţie UV 254 nm Timp de retenţie Fracţiune A 5,3 min Fracţiune B 5,8 min
Compus 8a: Fracţiunea A a fost trecută prin Etapa G, Exemplul 1 pentru a da doi izomeri care au fost separaţi prin HPLC. Compusul 8a a fost un izomer cu rulare mai rapidă (timp de retenţie: 4,1 min) şi Compusul 37a (timp de retenţie: 4,5 min) a fost un izomer cu funcţionare mai lentă.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9,01 (s, 1H), 8,61 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 6,34 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 6,31 (d, J = 10,9 Hz, 1H), 5,92 (dd, J = 2,7, 51,2 Hz, 1H), 5,85 - 5,71 (m, 2H), 5,37 (d, J = 51,6 Hz, 1H), 4,81 - 4,56 (m, 6H), 4,52 (d l, J = 12,1 Hz, 1H), 4,42 (d l, J = 9,4 Hz, 3H), 4,05 (dd, J = 4,1, 11,9 Hz, 1H), 3,95 (dd l, J = 4,3, 12,1 Hz, 1H), 3,94 - 3,84 (m, 1H), 3,62 (dd l, J = 4,9, 15,4 Hz, 1H), 2,71 - 2,58 (m, 1H), 2,46 - 2,33 (m, 1H) 31P RMN (162 MHz, METANOL-d4) δ = 55,36 (s, 1P), 55,18 (s, 1P) LCMS: MS m/z 761,2 [M+H]+
Compus 37a: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,95 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,15 (s l, 1H), 6,34 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 6,31 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,96 - 5,68 (m, 3H), 5,40 (dd, J = 2,7, 51,6 Hz, 1H), 4,85 (s, 3H), 4,58 (d l, J = 12,1 Hz, 1H), 4,49 (d l, J = 12,1 Hz, 1H), 4,43 - 4,33 (m, 3H), 4,29 (dd, J = 8,6, 14,1 Hz, 1H), 4,05 (dd, J = 4,5, 11,9 Hz, 1H), 3,95 (dd, J = 4,9, 12,3 Hz, 1H), 3,94 - 3,86 (m, 1H), 2,67 - 2,55 (m, 1H), 2,52 - 2,40 (m, 1H).
Condiţii HPLC preparativă a Compusului 8a/37a:
Instrument Agilent 1200/1260 AS/FC Coloană HPLC Waters XBridge C18, 10 x 100 mm, # 1413 Debit 4,0 ml/min Temperatura coloanei 35 °C faza mobilă A: 0,1% NH4OH în apă, B: 0,1% NH4OH în acetonitril Gradient (B%) 0 → 50 Timp de rulare 20 min Volum de injectare 50 ul (4 mg/ml în apă) detecţie UV 260 nm Timp de retenţie Compus 8a 4,1 min Compus 37a 4,5 min
Fracţiunea B a fost trecută prin Etapa G, Exemplul 1 pentru a da doi izomeri care au fost separaţi prin HPLC preparativă descrisă mai jos. Compusul 11a a fost un izomer cu rulare mai rapidă (timp de retenţie: 11,2 min) şi compusul 12a este un izomer de rulare mai lentă (timp de retenţie: 12,1 min)
Compus 11a: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,63 (s l, 2H), 8,18 (s l, 1H), 8,17 (s l, 1H), 6,34 (d, J = 13,3 Hz, 1H), 6,32 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 5,86 - 5,65 (m, 2H), 5,48 (d, J = 48,5 Hz, 1H), 5,35 (d, J = 43,8 Hz, 1H), 4,84 - 4,53 (m, 6H), 4,47 - 4,36 (m, 2H), 4,05 - 3,91 (m, 2H), 3,96 - 3,85 (m, 1H), 3,70 - 3,54 (m, 1H), 2,66 - 2,54 (m, 1H), 2,43 - 2,30 (m, 1H)
Compus 12a:1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,56 (s l, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,95 (s l, 1H), 6,35 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 6,31 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 5,82 - 5,65 (m, 2H), 5,50 (d, J = 51,2 Hz, 1H), 5,36 (d, J = 53,9 Hz, 1H), 4,74 - 4,33 (m, 8H), 4,26 - 4,16 (m, 1H), 4,07 - 3,93 (m, 3H), 2,64 - 2,44 (m, 2H).
Condiţii HPLC preparativă a Compusului 11a/12a:
Instrument Agilent 1200/1260 AS/FC Coloană HPLC Waters Xterra C18, 10 x 100mm # 3128 Debit 3,0 ml/min Temperatura coloanei 35 °C faza mobilă A: 0,1% acid formic în apă, B: 0,1% acid formic în acetonitril Gradient (B%) 0 → 30 Timp de rulare 20 min Volum de injectare 50 ul (2,5 mg/ml în apă) detecţie UV 260 nm Timpi de retenţie Compus 11a 11,2 min Compus 12a 12,1 min
Exemplul 9 -- Căi de sinteză pentru compuşii 13 şi 14
Cu Compusul 114 şi Compusul 115 ca materii prime, Compuşii 13 şi 14 au fost preparaţi prin aceleaşi secvenţe de reacţie ca cele descrise în Exemplul 1 plus etapa de deprotejare TBS.
Compus 116: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 9,36 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,76 (s, 2H), 8,07 (dd l, J = 1,8, 7,6 Hz, 3H), 8,05 - 8,00 (m, 2H), 7,99 (s, 1H), 7,87 - 7,82 (m, 1H), 7,70 - 7,65 (m, 1H), 7,63 - 7,55 (m, 3H), 7,55 - 7,41 (m, 6H), 7,39 - 7,35 (m, 1H), 7,30 - 7,26 (m, 1H), 6,37 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,36 - 5,27 (m, 2H), 5,15 (ddd, J= 3,7, 8,4, 11,7 Hz, 1H), 4,64 - 4,43 (m, 4H), 4,43 - 4,38 (m, 1H), 4,37 - 4,30 (m, 1H), 4,23 - 4,13 (m, 2H), 4,11 - 3,98 (m, 2H), 3,97 - 3,86 (m, 1H), 0,97 (s, 9H), 0,83 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,18 (s, 3H), 0,16 (s, 3H), -0,13 (s, 3H).
Compus 13a: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,78 (s l, 1H), 8,47 (s l, 1H), 8,21 (s l, 1H), 8,08 (s l, 1H), 6,44 - 6,21 (m, 1H), 6,19 - 6,03 (m, 1H), 6,01 - 5,78 (m, 2H), 5,38 - 4,95 (m, 2H), 4,67- 4,45 (m, 5H), 4,45 - 4,35 (m, 1H), 4,34 - 4,29 (m, 1H), 4,25 (d l, J= 11,3 Hz, 1H), 4,18 - 3,89 (m, 2H), 3,88 - 3,54 (m, 2H). 31P RMN (162 MHz, METANOL-d4) δ = 56,89 (s l, 1P), 56,37 (s l, 1P)
Compus 117 (izomer Rp1Rp2 al Compusului 116): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 9,36 (s l, 1H), 9,11 (s l, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,14 - 7,96 (m, 6H), 7,72 - 7,27 (m, 13H), 6,44 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,84 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,59 - 5,50 (m, 1H), 5,48 - 5,44 (m, 1H), 5,33 - 5,24 (m, 1H), 4,75 - 3,85 (m, 11H), 0,90 (s, 9H), 0,79 (s, 9H), 0,20 (s, 3H), 0,11 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), -0,21 (s, 3H)
Compus 14a (izomer Rp1Rp2 al compusului 13a) LCMS: MS m/z 743,17 [M+H]+
Exemplul 10 -- Căi de sinteză pentru compuşii 15 şi 16
La o soluţie de Compus A (2,63 g, 2,46 mmol echiv.) în MeCN (26,3 ml) s-a adăugat terţ-butilamină ( 13,15 mmol, 124,1 echiv.). După agitare timp de 1 h la temperatura ambiantă, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi azeotropat cu MeCN. Reziduul a fost dizolvat în MeCN (52,6 ml) şi tratat cu 1-(bromometil)-2-nitrobenzen (1,064 g, 4,925 mmol) şi trietilamină (0,755 ml, 5,42 mmol). După reacţia completă (monitorizată prin LC/MS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană de silicagel (66% acetat de etil/n-heptan la 100% acetat de etil) pentru a da 0,226 g de Compus 118. Produsul izolat a fost dizolvat în DMF (5 ml) şi s-au adăugat bromură de alil (0,046 ml, 0,528 mmol) şi carbonat de potasiu (0,073 g, 0,528 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce progresul a fost monitorizat prin LCMS. După 19 ore, amestec 1/1 de MTBE/EtOAc (12/12 ml), s-a adăugat o soluţie de NH4Cl apos saturat (15 ml) şi apă (10 ml). Stratul organic a fost separat, spălat cu saramură (5 ml) de două ori, uscat pe MgSO4 si concentrat în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (50% acetat de etil/n-heptan până la 100% acetat de etil) pentru a da 37 mg de produs bis-alilat. Produsul izolat (37 mg, 0,027 mmol) a fost dizolvat în toluen (55 ml) şi încălzit la reflux uşor (120-125oC, baie de ulei). O soluţie de Hoveyda-Grubbs Catalyst 2nd Generation s-au adăugat ((1,3-Bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dicloro(o-izopropoxifenilmetilen)ruteniu; disponibil la SIGMA-ALDRITCH® Catalog Nr. 569755; CAS 301224-40-8; 8,5 mg, 0,014 mmol) şi chinonă (5,9 mg, 0,054 mmol) în toluen (10 ml). Amestecul a fost încălzit la reflux şi progresul reacţiei a fost monitorizat prin LC/MS. După consumarea completă a materiei prime, amestecul a fost răcit la temperatura ambiantă şi tratat cu DMSO (0,059 ml, 0,81 mmol) timp de 15 ore. Amestecul rezultat a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 66% acetat de etil în n-heptan până la 100% acetat de etil) pentru a da Compusul 119 (2,2 mg).
Compus 119:1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,49 (s, 1H), 8,12 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,05 - 8,02 (m, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,70 - 7,10 (m, 17H), 6,27 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 6,15 - 6,05 (m, 1H), 5,97 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,94 - 5,72 (m, 3H), 4,94 (s l, 2H), 4,86 - 4,69 (m, 2H), 4,67 - 4,60 (m, 1H), 4,60 - 4,44 (m, 4H), 4,39 - 4,33 (m, 1H), 4,31 - 4,10 (m, 6H), 0,96 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,19 (s, 3H)
Compusul 119 a fost trecută prin Etapa G din Exemplul 1, urmată de deprotejarea TBS cu TEA 3HF pentru a da compusul 15a.
Compus 15a: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,76 (s l, 1H), 8,44 (s l, 1H), 8,24 (s l, 1H), 8,07 (s l, 1H), 6,45 - 6,19 (m, 2H), 6,12 - 5,75 (m, 2H), 5,54 (d l, J = 51,6 Hz, 1H), 5,67 - 5,06 (m, 2H), 4,66 - 4,37 (m, 3H), 4,47 - 4,37 (m, 1H), 4,36 - 4,22 (m, 2H), 4,17 - 3,94 (m, 2H), 3,94 - 3,80 (m, 1H) 3,80 - 3,59 (m, 2H)
Compusul 16 a fost obţinut din compusul B (izomer RR al compusului A) prin aceleaşi secvenţe ca cele descrise în compusul 15.
Compus 120 (izomer Rp1Rp2 al Compusului 119: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,89 (s, 1H), 8,10 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,85 - 7,74 (m, 4H), 7,69 - 7,61 (m, 2H), 7,58 (s, 1H), 7,55 - 7,48 (m, 1H), 7,45 - 7,30 (m, 6H), 7,22 - 7,15 (m, 1H), 7,13 - 7,04 (m, 3H), 6,76 - 6,68 (m, 1H), 6,31 - 6,22 (m, 1H), 6,22 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 6,12 - 5,99 (m, 2H), 5,94 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,92 - 5,81 (m, 1H), 5,67 (dd, J = 3,5, 51,2 Hz, 1H), 5,08 - 4,93 (m, 2H), 4,87 - 4,77 (m, 1H), 4,60 - 4,22 (m, 8H), 4,21 - 4,16 (m, 1H), 4,11 - 4,02 (m, 1H), 3,94 (d l, J = 11,7 Hz, 1H), 3,66 (dd, J = 4,7, 11,3 Hz, 1H), 0,90 (s, 9H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H)
Compus 16a: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,54 (s l, 1H), 8,24 (s l, 1H), 8,17 (s l, 1H), 8,08 (s l, 1H), 6,44 - 6,23 (m, 2H), 6,07 - 5,68 (m, 2H), 5,43 (d, J = 50,4 Hz, 1H), 5,31 - 5,05 (m, 2H), 4,69 - 4,26 (m, 6H), 4,19 - 3,90 (m, 2H), 3,90 - 3,57 (m, 3H)
Exemplul 11 -- Căi de sinteză ale compuşilor analogi adenină/guanină (A/G) -- Compus 21, Compus 22 şi Compus 23
Cu Compusul 121 şi compusul 101 ca materii prime, analogii adenină/guanină au fost preparaţi prin aceleaşi secvenţe de reacţie ca cele descrise în Exemplul 1.
Condiţii HPLC preparative pentru separarea compuşilor C, D şi E
Instrument Agilent 1100 Coloană HPLC Coloană Waters Sunfire Prep C18 OBD, 5 um, 19 x 100 mm, #186002567 Debit 12 ml/min faza mobilă A: ap, B: acetonitril Gradient Timp (min) 0 13 14,5 14,51 16 B% 40 99 99 40 40 Timp de rulare 16 min Volum de injectare 150 ul (0,027 g/ml în acetonitril) detecţie UV 254 nm Timp de retenţie Compus C 9,9 min Compus D 9,4 min Compus E 9,0 min
Compus D: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,60 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,04 - 8,01 (m, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,99 - 7,95 (m, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,63 - 7,51 (m, 5H), 7,46 - 7,41 (m, 1H), 7,39 - 7,30 (m, 3H), 7,25 - 7,20 (m, 2H), 6,96 - 6,84 (m, 1H), 6,19 - 5,99 (m, 4H), 5,67 (dd, J = 4,3, 52,3 Hz, 1H), 5,47 (dd, J = 1,4, 17,4 Hz, 1H), 5,36 - 5,24 (m, 4H), 5,14 - 5,09 (m, 1H), 5,08 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 5,04 - 4,98 (m, 2H), 4,51 - 4,30 (m, 10H), 4,21 - 4,13 (m, 1H), 2,83 - 2,67 (m, 1H), 1,16 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,14 (d, J = 6,6 Hz, 3H)
Compusul D a fost trecut prin Etapele F şi G, Exemplul 1 pentru a da Compusul 22.
Compus 22: LCMS: MS m/z 763,07 [M+H]+
Compus C: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 9,08 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,07 - 8,02 (m, 2H), 8,02 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,55 -7,30 (m, 9H), 7,24 - 7,19 (m, 2H), 6,58 - 6,45 (m, 1H), 6,23 - 5,97 (m, 4H), 5,97 - 5,86 (m, 1H), 5,63 - 5,57 (m, 1H), 5,54 - 5,47 (m, 1H), 5,48 - 5,44 (m, 1H), 5,35 - 5,30 (m, 1H), 5,29 - 5,22 (m, 1H), 5,18 - 5,13 (m, 2H), 5,11 - 5,07 (m, 1H), 5,02 - 4,97 (m, 2H), 4,51 - 4,22 (m, 9H), 4,14 - 4,07 (m, 1H), 2,99 - 2,85 (m, 1H), 1,20 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,17 (d, J = 7,0 Hz, 3H)
Compusul C a fost trecut prin Etapele F şi G în Exemplul 1 pentru a da Compus 21 Compusul 21: LCMS: MS m/z 763,13 [M+H]+
Compus E: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,99 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,02 - 7,94 (m, 2H), 7,93 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,68 - 7,63 (m, 1H), 7,60 - 7,55 (m, 1H), 7,54 - 7,49 (m, 2H), 7,45 - 7,31 (m, 5H), 7,25 - 7,21 (m, 2H), 6,22 - 5,94 (m, 6H), 5,56 (dd l, J = 5,1, 51,5 Hz, 1H), 5,54 - 5,46 (m, 1H), 5,34 - 5,29 (m, 1H), 5,29 - 5,22 (m, 2H), 5,16 - 5,08 (m, 3H), 5,02 - 4,96 (m, 2H), 4,62 - 4,54 (m, 1H), 4,52 - 4,26 (m, 9H), 2,93 - 2,81 (m, 1H), 1,21 (d, J = 2,3 Hz, 3H), 1,20 (d, J = 2,0 Hz, 3H)
Compusul E a fost trecut prin Etapele F şi G în Exemplul 1 pentru a da Compus 23: LCMS: MS m/z 763,18 [M+H]+
Exemplul 12 -- Sinteza Compusului 24
Cu compusul F, Compusul 24a a fost preparat prin aceleaşi secvenţe de reacţie ca cele descrise în Exemplul 1.
Compus 24: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,95 (s l, 1H), 8,29 (s l, 1H), 8,23 (s l, 1H), 8,08 (s l, 1H), 6,31 (d l, J = 12,9 Hz, 2H), 6,23 - 6,07 (m, 1H), 6,04 - 5,84 (m, 2H), 5,71 (d l, J = 50,8 Hz, 1H), 5,27 - 4,32 (m, 7H), 4,27 - 4,16 (m, 1H), 4,12 (dd, J = 5,7, 11,9 Hz, 1H), 4,07 - 3,98 (m, 1H), 3,78 - 3,62 (m, 2H), 1,40 (d, J = 7,0 Hz, 3H)
Exemplul 13 - Sinteza Compusului 18, Compusului 19 şi Compusului 20
O cale pentru această sinteză este prezentată în FIG. 3.
La o soluţie de 9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-ol (100 mg, 37 mmol) şi baza Hunig (0,129 ml, 0,74 mmol) în DMF (1 ml) s-a adăugat BOP (327 mg,, 74 mmol) la 20°C. Amestecul a fost agitat la 20°C peste noapte. UPLC-MS a indicat că reacţia a fost finalizată. Solventul a fost îndepărtat pe rotavapor cu vid înalt. Reziduul a fost dizolvat în DCM şi purificat folosind Biotage (24 g coloană Si-gel, EtOAc în heptan = 0 până la 100%, 10 vol., 100%, 10 vol.) pentru a produce 105 mg de aduct BOP la 73% randament.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ ppm 3,74 - 3,84 (m, 1 H) 3,92 - 4,00 (m, 1 H) 4,12 - 4,19 (m, 1 H) 4,62 - 4,74 (m, 1 H) 5,37 - 5,57 (m, 1 H) 6,41 - 6,52 (m, 1 H) 7,47 - 7,55 (m, 1 H) 7,57 - 7,64 (m, 2 H) 8,03 - 8,14 (m, 1 H) 8,36 - 8,46 (m, 1 H) 8,86 (s, 1 H)
La o soluţie de (2R,3R,4R,SR)-5-(6-((1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)oxi)-9H-purin-9-il )-4-fluoro-2-(hidroximetil)tetrahidrofuran-3-ol (135 mg, 0,349 mmol) în alcool alilic (3 ml) s-a adăugat carbonat de cesiu (500 mg, 1,535 mmol) la 20°C. Amestecul a fost agitat la 20°C timp de 1 h. UPLC-MS a indicat că reacţia a fost finalizată. Reacţia a fost prelucrată cu NaHCO3 sat./saramură şi extras cu EtOAc/Hept. Stratul organic a fost uscat pe Na2SO4 si filtrat. Solventul şi substanţele organice volatile din filtrat au fost îndepărtate prin rotavapor. Reziduul a fost purificat folosind Biotage (coloană de 12 g Si-gel, EtOAc în heptan = 0 până la 100 %, 10 vol., 100%, 10 vol.) pentru a se obţine 100 mg de aduct alil dorit la 92% randament.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ ppm 8,56 (s, 1 H) 8,47 (s, 1 H) 6,29 - 6,41 (m, 1 H) 6,06 - 6,21 (m, 1 H) 5,33 - 5,53 (m, 2 H) 5,22 - 5,31 (m, 1 H) 5,02 - 5,14 (m, 2 H) 4,56 - 4,71 (m, 1 H) 4,10 - 4,18 (m, 1 H) 3,88 - 3,96 (m, 1 H) 3,70 - 3,79 (m, 1 H)
La o soluţie de diizopropilfosforamidită (150 mg, 0,164 mmol) şi (2R,3R,4R,5R)-5-(6-(aliloxi)-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-(hidroximetil) tetrahidrofuran-3-ol (76 mg, 0,246 mmol) în acetonitril (1069 µl, 20,47 mmol) au fost adăugate site moleculare (3 A, 150 mg) la 20°C. Amestecul a fost agitat la 20°C timp de 1 h înainte de a fi adăugat 1H-imidazol-4,5-dicarbonitril (38,7 mg, 0,328 mmol) la RT. Amestecul a fost agitat la RT timp de 1 h. UPLC-MS a indicat că reacţia a fost finalizată. S-a adăugat (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamidă (37,0 mg, 0,18 mmol). UPLC-MS a indicat că sulfurarea a fost finalizată în 30 de min. NaHCO3 sat./saramură şi extras cu EtOAc/Hept. Stratul organic a fost uscat pe Na2SO4 si filtrat. Solventul şi substanţele organice volatile din filtrat au fost îndepărtate prin rotavapor. Reziduul a fost purificat utilizând Biotage (25 g coloană Si-gel, EtOAc în heptan = 0 până la 100%, 15 vol., 100%, 10 vol.).
1H RMN (500 MHz, METANOL-d4, doi diastereomeri ∼1:1) δ ppm 8,62 - 8,63 (m, 1 H) 8,57 - 8,58 (m, 1 H) 8,48 - 8,50 (m, 1 H) 8,44 - 8,46 (m, 1 H) 8,40 - 8,41 (m, 1 H) 8,38 - 8,39 (m, 1 H) 8,33 - 8,35 (m, 1 H) 8,25 - 8,27 (m, 1 H) 7,22 - 7,33 (m, 11 H) 7,11 - 7,20 (m, 17 H) 7,05-7,11 (m, 4 H) 6,83 - 6,92 (m, 6 H) 6,65 - 6,77 (m, 11 H) 6,28 - 6,41 (m, 5 H) 6,23 - 6,28 (m, 2 H) 6,10 - 6,22 (m, 5 H) 6,00 - 6,10 (m, 4 H) 5,89 - 6,00 (m, 5 H) 5,52 - 5,57 (m, 2 H) 5,45 - 5,52 (m, 3 H) 5,41 - 5,45 (m, 1 H) 5,24 - 5,34 (m, 4 H) 5,13 - 5,17 (m, 3 H) 5,07 - 5,12 (m, 5 H) 4,93 - 4,98 (m, 4 H) 4,88 - 4,93 (m, 5 H) 4,73 - 4,82 (m, 3 H) 4,50 - 4,59 (m, 2 H) 4,36 - 4,48 (m, 4 H) 4,27 - 4,36 (m, 5 H) 4,16 - 4,27 (m, 5 H) 3,83 - 4,04 (m, 5 H) 3,73 - 3,78 (m, 13 H) 3,64 - 3,73 (m, 4 H) 3,52 - 3,58 (m, 1 H) 3,45 - 3,51 (m, 2 H) 3,35 - 3,41 (m, 2 H) 3,16 - 3,23 (m, 2 H) 3,08 - 3,15 (m, 2 H) 2,84 - 2,93 (m, 2 H) 2,79 - 2,83 (m, 2 H) 2,70 - 2,77 (m, 2 H) 2,61 - 2,69 (m, 3 H)
La o soluţie de O-((2R,3R,4R,SR)-5-(6-(N-alilbenzamido)-9H-purin-9-il)-2-((bis(4-metoxifenil)(fenil) metoxi)metil)-4-fluorotetrahidrofuran-3-il) O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-(aliloxi)-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3 -hidroxitetrahidrofuran-2-il)metil) O-(2-cianoetil) fosforotioat (120 mg, 0,104 mmol) în acetonitril (4171 µl, 79,852 mmol) au fost adăugate site moleculare (3A, 1 greutate) la 20°C. Amestecul a fost agitat la 20°C timp de 1 h înainte de a fi adăugată tripirolidinofosfină (71,6 µl, 0,311 mmol). Tetrazol 0,45 M în ACN (253 µl, 0,114 mmol) a fost apoi adăugat în 7 porţii, la interval de 2 minute. TLC (EtOAc/Hept=2:1, RfSM=0,7, RfProd=0,0 până la 0,6) a fost incomplet. S-au adăugat 2X din reactivul de fosforilare şi terazol. Amestecul de reacţie a fost agitat la RT timp de 10 min. Nici UPLC-MS, nici TLC nu au indicat vreun SM rămas. Amestecul de reacţie a fost transferat într-un balon care conţine acetonitril (20,8 ml), apă (104 µl, 5,776 mmol) şi sare de trifluoracetat de piridină (421 mg, 2,178 mmol). Amestecul a fost agitat timp de 10 min. UPLC-MS a indicat că s-a format produsul dorit. Amestecul de reacţie a fost amestecat cu EtOAc şi spălat cu HCI [0,1 N]/saramură şi apoi NaHCO3 sat./saramură pentru a preveni deprotejarea DMT. Stratul apos a fost extras din nou cu EtOAc (1X). Stratul organic combinat a fost uscat pe Na2SO4 si apoi filtrat. Solvenţii şi substanţele volatile din filtrat au fost îndepărtate prin rotavapor pentru a obţine produsul brut care a fost utilizat pentru etapa următoare fără purificare suplimentară.
Intermediarul de hidrogen fosfonat brut a fost dizolvat în DCM (2635 µl, 40,946 mmol) şi apă (29,5 µl, 1,638 mmol) înainte de a fi adăugat acid dicloracetic (135 µl, 1,638 mmol) în DCM (2635 µl, 40,946 mmol) la 20°C. Amestecul a fost agitat la 20°C timp de 5 minute. UPLC-MS a indicat că reacţia a fost finalizată. Reacţia a fost neutralizată cu piridină (510 µl, 6,308 mmol). Volatilele au fost îndepărtate pe rotavapor şi apoi rotavapor la vid înalt. Reziduul a fost azeotrop cu piridină încă o dată înainte de a fi utilizat pentru ciclizare.
Fosfonatul de hidrogen deprotejat cu DMT brut (80 mg, 0,087 mmol) a fost dizolvat în piridină (1831 µl, 22,639 mmol) înainte de 2-oxid de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinan (48,2 mg, 0,261). mmol) a fost adăugat la temperatura camerei. Amestecul a fost agitat la RT timp de 10 min. UPLC nu a arătat nici un pic SM la 2,1 min. Reacţia a fost stinsă prin adăugarea de apă (47,1 µl, 2,612 mmol) urmată de adăugarea imediată de 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-onă (21,97 mg, 0,131 mmol). După 10 minute, UPLC a arătat că nu a mai rămas material iniţial. Reacţia a fost agitată la RT timp de 1 h. Nu a fost găsită nici o modificare pe UPLC-MS. Amestecul de reacţie a fost diluat cu EtOAc şi spălat cu NaHCO3 sat. şi saramură. Stratul organic a fost uscat pe Na2SO înainte de a fi filtrat. Reziduul după evaporarea solventului a fost dizolvat în MeOH înainte de NH3-H2O a fost adăugată. Amestecul a fost agitat timp de 5 minute înainte ca toţi solvenţii şi volatilele să fie îndepărtate pe rotavapor şi rotavapor cu vid înalt.
Intermediarul CDN a fost dizolvat în acetonitril (1484 µl, 28,417 mmol) şi 1,4-dioxan (496 µl, 5,797 mmol) înainte de TEA (39,6 µl, 0,284 mmol) şi 1-(bromometil)-2-nitrobenzen. (49.1 mg, 0,227 mmol) s-a adăugat la 20°C. Amestecul a fost agitat la 20°C timp de 16 h. UPLC-MS a indicat că reacţia a fost incompletă. Nici TLC (EtOAc) nici HPLC nu au indicat vreo bromură de o-nitrobenzil rămasă. S-a adăugat 1-(bromometil)-2-nitrobenzen (49,1 mg, 0,227 mmol) şi TEA (39,6 µl, 0,284 mmol). Reacţia a fost agitată timp de 5 h. Reacţia a fost prelucrată cu NaHCO3 sat./saramură şi extras cu EtOAc/Hept. Stratul organic a fost uscat pe Na2SO4 si filtrat. Solventul şi substanţele organice volatile din filtrat au fost îndepărtate prin rotavapor. Reziduul a fost purificat utilizând Biotage (12 g coloană Si-gel, EtOAc în heptan = 0 până la 100%, 15 vol., 100%, 10 vol.,10% MeOH in EtOAc, 6 vol). Fracţiunile care au conţinut produsul dorit au fost combinate. Evaporarea solventului a dat produsul dorit. TLC prep. (EtOAc) a fost utilizată pentru a izola izomerul cel mai polar care conduce la produsul final Compus 18. Alţi doi izomeri au fost separaţi utilizând TLC prep.(EtOAc/DCM=1:1, rulând de 3 ori). Izomerul mai polar a fost transformat în Compusul 19 şi izomerul mai puţin polar a fost transformat în Compusul 20.
Cel mai polar produs din primul p-TLC (EtOAc), desemnat Compusul 128-1: 1H RMN (500 MHz, cloroform-d) δ ppm 8,62 (s, 1 H) 8,55 (s, 1 H) 8,00 - 8,07 (m, 2 H) 7,99 (s, 1 H) 7,96 (s, 1 H) 7,56 - 7,64 (m, 2 H) 7,48 - 7,56 (m, 3 H) 7,42 - 7,48 (m, 1 H) 7,34 - 7,42 (m, 2 H) 7,29 - 7,34 (m, 1 H) 7,18 - 7,25 (m, 2 H) 6,09 - 6,21 (m, 3 H) 5,98 - 6,09 (m, 2 H) 5,63 - 5,75 (m, 1 H) 5,52 - 5,63 (m, 1 H) 5,42 - 5,51 (m, 2 H) 5,32 (dd, J=10,27, 0,98 Hz, 1 H) 5,27 (dd, J=17,12, 1,47 Hz, 1 H) 5,13 (d, J=5,87 Hz, 2 H) 5,09 - 5,12 (m, 1 H) 4,95 - 5,05 (m, 2 H) 4,36 - 4,54 (m, 7 H) 4,23 - 4,31 (m, 2 H) 4,15 - 4,21 (m, 1 H) Produs mai puţin polar din a doua oară p-TLC, desemnat Compus 128-2 (EtOAc/DCM=1:1, 3X) 1H RMN (400 MHz, metanol-d4) δ ppm 8,75 (s, 1 H) 8,59 (s, 1 H) 8,43 (s, 1 H) 8,39 (s, 1 H) 8,01 - 8,07 (m, 2 H) 7,38 - 7,56 (m, 7 H) 7,27 - 7,35 (m, 1 H) 7,15 - 7,26 (m, 3 H) 6,45 (d, J=19,91 Hz, 1 H) 6,38 (d, J=19,52 Hz, 1 H) 5,95 - 6,26 (m, 4 H) 5,83 (dd, J=51,54, 4,69 Hz, 1 H) 5,73 (dd, J=51,54, 4,69 Hz, 1 H) 5,46 - 5,57 (m, 1 H) 5,28 - 5,36 (m, 1 H) 5,19 - 5,28 (m, 1 H) 5,16 (dt, J=5,56, 1,51 Hz, 2 H) 5,03 - 5,10 (m, 1 H) 4,95 (d l, J=5,50 Hz, 2 H) 4,41 - 4,62 (m, 4 H) 4,28 - 4,40 (m, 2 H) 4,12 - 4,27 (m, 4 H) Less polar Product from the second time p-TLC, designated Compus 128-3 (EtOAc/DCM=1:1, 3X) 1H RMN (400 MHz, cloroform-d) δ ppm 8,53 (s, 1 H) 8,36 (s, 1 H) 7,95 - 8,02 (m, 2 H) 7,95 (s, 1 H) 7,89 (s, 1 H) 7,53 - 7,61 (m, 2 H) 7,44 - 7,53 (m, 4 H) 7,36 - 7,44 (m, 2 H) 7,25 - 7,31 (m, 1 H) 7,12 - 7,20 (m, 2 H) 5,91 - 6,18 (m, 4 H) 5,85 - 5,91 (m, 1 H) 5,72 - 5,79 (m, 1 H) 5,61 - 5,72 (m, 1 H) 5,47 - 5,57 (m, 1 H) 5,40 - 5,47 (m, 1 H) 5,25 - 5,32 (m, 1 H) 5,15 - 5,23 (m, 1 H) 4,99 - 5,14 (m, 3 H) 4,92 (d, J=5,47 Hz, 2 H) 4,52 - 4,60 (m, 2 H) 4,37 - 4,52 (m, 4 H) 4,35 (d, J=3,13 Hz, 1 H) 4,30 (d, J=5,47 Hz, 1 H) 4,25 (d, J=2,74 Hz, 1 H) 4,20 (d, J=4,69 Hz, 1 H)
La soluţia de reflux de 2-nitrobenzil protejat cu CDN (10 mg, 8,696 µmol) în toluen (20 ml, 187,761 mmol) s-a adăugat soluţia de Hoveyda-Grubbs Catalyst a 2a Generaţie ((1,3-Bis-(2,4, 6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dicloro(o-izopropoxifenilmetilen)ruteniu, disponibil la SIGMA-ALDRITCH® Catalog Nr. 569755; CAS 301224-40-8; 2,73 mg, 4,348 µmol) şi benzochinonă (2,350 mg, 0,022 mmol) în TOLUEN (2 ml). Soluţia rezultată a fost refluxată timp de 4 h (temperatura băii de ulei 120-125 °C). TLC (EtOAc, Rfsm=0,8, Rfptijă =0,3) şi UPLC-MS au indicat că reacţia a fost incompletă. S-a adăugat 1 ml de soluţie de catalizator Ru. Reacţia a fost refluxată pentru încă 2 h. Au mai rămas o mulţime de SM nereacţionaţi. S-a adăugat încă 1 ml de soluţie de catalizator Ru. Reacţia a fost refluxată pentru încă 2 h. Nu a fost detectat nici un SM la HPLC cu fază inversă. Amestecul de reacţie a fost răcit la RT şi stins cu DMSO (0,019 ml, 0,261 mmol). Evaporarea solventului a dat produsul brut care a fost purificat pe coloană Si-gel (10 g coloană Si-gel, eluant de la 50 la 100%, 15 vol., 100%, 10 vol.). Fracţiunile care conţin produsele cu MS dorit au fost combinate şi rotoevaporate. Reziduul a fost purificat încă o dată pe TLC prep. (EtOAc).
La CDN-ul purificat prin pTLC blocat cu punte (2,5 mg, 2,228 µmol) (izomerul trans) în 1,4-dioxan (0,5 ml, 5,845 mmol) s-a adăugat tiofenol (0,25 ml, 2,428 mmol) şi TEA (0,25 ml, 1,794 mmol) la 20°C. Amestecul a fost agitat la RT timp de 3 h. UPLC a indicat că conversia a fost finalizată.
S-a adăugat metanol (1,5 ml) care a fost urmat de adăugarea de 29% NH3 în H2O (1,0 ml). Amestecul rezultat a fost încălzit la 50 °C timp de 6 h şi răcit la RT.
Suspensia amestecului de reacţie a fost filtrată şi clătită cu apă (25 ml). S-au format precipitări în filtrat după clătirea cu apă. Filtratul a fost filtrat din nou pentru a îndepărta partea solidă.
Filtratul rezultat a fost extras cu un amestec de tol/Hep (3X, 1/1, 25 ml fiecare). Stratul apos a fost concentrat în vid şi apoi dizolvat în apă (6 ml). Precipitatele au fost filtrate încă o dată. UPLC a indicat că s-a format produsul dorit. Produsul a fost purificat prin HPLC cu fază inversă folosind aceeaşi metodă pentru a purifica alţi analogi pe bază de CDN blocaţi.
Pentru Compus 18, LCMS: MS m/z 748,11 [M+H]+ 746,15 [M-H]-
Pentru Compus 19, LCMS: MS m/z 748,06 [M+H]+ 746,17 [M-H]-
Pentru Compus 20, LCMS: MS m/z 748,09 [M+H]+ 746,21 [M-H]-
Exemplul 13 -- Sinteza Compusului 26
La o soluţie de Compus 150 (0,70 g, 2,256 mmol) în piridină (10,5 ml) 0°C s-a adăugat clorură de 4,4'-dimetoxitritil (0,803 g, 2,369 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată peste noapte în timp ce s-a încălzit la temperatura ambiantă. La finalizare (monitorizat de LCMS), s-a adăugat o soluţie de NH4Cl sat (10 ml) şi MTBE (20 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu MTBE/EtOAc (3/1, 12 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă de 30% NaCI (5 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Purificarea produsului brut prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 50% până la 70% EtOAc în n-heptan) au dat 0,942 g de Compus 151.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,47 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,43 - 7,35 (m, 2H), 7,30 - 7,26 (m, 4H), 7,25 - 7,17 (m, 3H), 6,82 - 6,75 (m, 4H), 6,28 (dd, J = 2,3, 17,6 Hz, 1H), 6,22 - 6,10 (m, 1H), 5,63 (ddd, J = 2,7, 4,7, 53,1 Hz, 1H), 5,47 (qd, J = 1,4, 17,3 Hz, 1H), 5,31 (dd, J = 1,2, 10,6 Hz, 1H), 5,13 (t, J = 1,4 Hz, 1H), 5,12 (t, J = 1,2 Hz, 1H), 4,89 - 4,76 (m, 1H), 4,21 (td, J = 3,2, 6,8 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,55 (dd, J = 2,7, 10,9 Hz, 1H), 3,44 (dd, J = 4,3, 10,9 Hz, 1H), 2,29 - 2,21 (m, 1H).
La o soluţie de compus 151 (0,942 g, 1,538 mmol) în DMF (7,5 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat 3-((bis(diizopropilamino)fosfino)oxi)propanitril (0,927 g, 3,075 mmol), 0,45 M 1,2,3,4-tetrazol (2,8 ml, 1,2 mmol) şi 1-metilimidazol (30 µl, 0,38 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă timp de 4 h. După finalizare (monitorizată prin LCMS), s-au adăugat TEA (0,50 ml, 3,6 mmol), DMF (11,3 ml) şi apă (1,9 ml). Amestecul rezultat a fost extras cu n-heptan (3 ml de fiecare dată) de trei ori. Stratul de DMF a fost diluat cu apă (4 ml) şi extras cu un amestec de toluen/n-heptan (1/1, 10 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă 30% de NaCI de două ori (3 ml de fiecare dată), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Purificarea reziduului prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 33% până la 40% EtOAc în n-heptan cu 1% TEA) au dat 1,115 g de Compus 152 (amestec diastereomeric 3:2) ca o spumă solidă albă.
Un amestec de Compus 152 (1,115 g, 1,372 mmol) şi Compus 158 (0,650 g, 2,095 mmol) a fost azeotropat cu MeCN (20 ml de fiecare dată) de două ori. La reziduul rezultat s-au adăugat MeCN (20,0 ml) şi 1 H-imidazol-4,5-dicarbonitril (0,243 g, 2,058 mmol). După reacţia completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost tratat cu (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamidă (0,422 g, 2,058 mmol). După sulfurizarea completă, s-au adăugat o soluţie de NaHCO3 saturat (20 ml) şi MTBE (30 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu un amestec de MTBE/EtOAc (15/15 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă 30% de NaCI (10 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Purificarea reziduului prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 33% până la 100% EtOAc în n-heptan cu 1% TEA) au dat 0,88 g de Compus 153.
LC/MS (ESI) m/z 1076,48 [M+Na]+.
La o soluţie de Compus 153 (0,880 g, 0,835 mmol) în piridină (8,8 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat difenil fosfit (0,323 g, 1,67 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 1 h şi monitorizat prin LCMS. După terminare, amestecul a fost adăugat într-un amestec de soluţie NaHCO3 apos saturat (13,2 ml) şi apă (4,4 ml) menţinând în acelaşi timp temperatura internă T sub 30 °C, clătind cu EtOAc (8,8 ml). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă şi hidroliza a fost monitorizată prin LCMS. După finalizare, amestecul a fost extras de două ori cu un amestec de EtOAc/MTBE (1/1, 26 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă de 30% NaCI (3 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Reziduul a fost azeotropat cu toluen (7 ml de fiecare dată) de două ori. Produsul brut a fost dizolvat în diclormetan (6,6 ml) şi tratat cu apă (0,15 ml, 8,35 mmol) şi acid dicloroacetic 6% (0,41 ml, 5,0 mmol) în diclormetan (6,6 ml) la temperatura ambiantă. După deprotejarea DMT completă (monitorizată prin LCMS), s-a adăugat trietilsilan (2,7 ml, 17 mmol). După 10 minute de agitare, amestecul rezultat a fost tratat cu piridină (4,4 ml) şi TEA (1 ml) şi concentrat în vid. Reziduul a fost triturat cu n-heptan (8,8 ml de fiecare dată) de trei ori şi azeotropat cu MeCN de două ori. Produsul brut (Compusul 154) a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
LC/MS (ESI) m/z 814,29 [M-H]-.
La o soluţie de Compus 154 (0,681 g, 0,835 mmol) în piridină (68 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafoforinan-2-oxid (0,462 g, 2,505 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată timp de 1 h la temperatura ambiantă şi monitorizată prin LCMS. După terminare, s-au adăugat apă (0,45 ml, 25 mmol) (10 echiv. DMOCP) şi sulf (0,134 g, 4,175 mmol). După sulfurizarea completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost tratat cu o soluţie apoasă NaHCO3saturată (13,6 ml) şi concentrat în vid. Reziduul a fost tratat cu EtOAc (27 ml) şi apă (13,6 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu un amestec de MTBE/EtOAc (1/1, 27 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă de 30% NaCI (13,6 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Purificarea reziduului prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 0% până la 10% MeOH în EtOAc) au dat 0,693 g (randament teoretic) de Compus 155.
LC/MS (ESI) m/z 830,23 [M+H]+.
La o soluţie de Compus 155 (0,693 g, 0,835 mmol) în acetonitril (14 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat terţ-butilamină (14 g, 131 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată timp de 10 min şi monitorizată prin LCMS. După finalizare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi azeotropat cu MeCN de două ori. La reziduul rezultat s-au adăugat acetonitril (14 ml) şi bromură de 2-nitrobenzil (0,541 g, 2,51 mmol). După ce a fost agitat peste noapte, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 100 g, 75% până la 100% EtOAc în n-heptan şi 0% până la 10% MeOH în EtOAc) pentru a da 0,103 g de Compus 156.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,59 (s, 2H), 8,05 (d l, J = 8,2 Hz, 2H), 8,03 (s, 2H), 7,58 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,45 - 7,37 (m, 2H), 6,20 (d l, J = 18,8 Hz, 2H), 6,21 - 6,08 (m, 2H), 5,98 - 5,83 (m, 2H), 5,69 (dd, J = 4,7, 52,0 Hz, 1H), 5,47 (d l, J = 17,2 Hz, 2H), 5,31 (d l, J = 10,6 Hz, 2H), 5,14 (d l, J = 5,5 Hz, 4H), 4,54 - 4,46 (m, 2H), 4,45 - 4,40 (m, 2H), 4,37 - 4,26 (m, 4H), 4,21 - 4,11 (m, 2H).
Pe baza metodologiei sintetice, a datelor RMN (simetrice) şi a timpului de retenţie HPLC (izomerul de eluare cel mai lent), solicitanţii cred că compusul 156 are stereochimia fosforului RR. Această atribuire stereochimică ar fi supusă confirmării prin cristalografie cu raze X.
La o soluţie de Compus 156 (0,103 g, 0,098 mmol) în toluen (103 ml) la reflux s-a adăugat o soluţie de Catalizator Hoveyda-Grubbs de a 2a generaţie ((1,3-Bis-(2,4,6-trimetilfenil)- 2-imidazolidiniliden)dicloro(o-izopropoxifenilmetilen)ruteniu, disponibil la SIGMA-ALDRITCH® Catalog Nr. 569755; CAS 301224-40-8; 31 mg, 0,049 mmol) şi chinonă (32 mg, 0,295 mmol) în toluen (10 ml). Amestecul a fost agitat la reflux timp de 2 h şi s-a adăugat catalizator suplimentar (16 mg, 0,025 mmol). După terminare, amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi tratat cu DMSO (0,14 ml, 2,0 mmol) peste noapte. Amestecul rezultat a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 0% până la 10% metanol în EtOAc) pentru a da produsul dorit, care a fost purificat în continuare prin TLC pre (EtOAc) pentru a da 3,6 mg de compus 157.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,11 (dd, J = 1,2, 8,2 Hz, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,68 (s, 2H), 7,67 - 7,58 (m, 4H), 7,52 - 7,48 (m, 2H), 6,26 (d, J = 17,6 Hz, 2H), 6,02 - 5,97 (m, 2H), 5,97 - 5,88 (m, 2H), 5,68 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 2H), 5,15 (d l, J = 10,9 Hz, 2H), 4,99 (d l, J= 10,9 Hz, 2H), 4,56 - 4,44 (m, 8H), 4,25 (t l, J= 6,1 Hz, 2H).
La Compusul 157 (3,6 mg, 3,5 µmol) s-au adăugat 1,4-dioxan (0,11 ml), tiofenol (0,045 ml, 0,44 mmol) şi TEA (0,054 ml, 0,39 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După conversie completă, s-a adăugat apă (0,5 ml). Amestecul rezultat a fost extras de trei ori cu un amestec de n-heptan/toluen (1/1, 0,4 ml de fiecare dată) şi apoi toluen (0,3 ml). Stratul apos a fost concentrat în vid şi tratat cu apă (0,5 ml). Solidul rezultat a fost filtrat, clătit cu apă (0,5 ml). Uscarea prin îngheţare a filtratelor combinate a dat 2,0 mg de sare bis-TEA Compus 26 ca solid spumă albă.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,67 (s, 2H), 8,18 (s, 2H), 6,41 (d, J = 14,8 Hz, 2H), 6,07 - 6,01 (m, 2H), 5,56 (dd, J = 3,1, 51,2 Hz, 2H), 5,48 - 5,41 (m, 2H), 5,08 (d l, J = 12,1 Hz, 2H), 4,99 - 4,88 (m, 2H), 4,52 (d l, J = 12,5 Hz, 2H), 4,40 (d l, J = 9,8 Hz, 2H), 3,98 (dd, J = 5,7, 12,3 Hz, 2H), 3,14 (q, J = 7,4 Hz, 12H), 1,27 (t, J = 7,4 Hz, 18H).
Exemplul 15 -- Sinteza Compusului 27
Compusul 27 a fost preparat din Compusul 159, un produs secundar în Etapa 11b al unei căi pentru Compusul 1 prezentat în FIG. 2B.
La o soluţie de Compus 159 (2,0 g, 1,75 mmol) în metanol (24 ml) s-a adăugat 28% hidroxid de amoniu (12 ml). Amestecul rezultat a fost încălzit la 50 °C timp de 5 h şi răcit la temperatura ambiantă. După finalizare (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă, tratat cu apă (20 ml) şi extras de trei ori cu un amestec de toluen/EtOAc (1/1, 24 ml de fiecare dată). Stratul apos a fost acidulat cu acid clorhidric 1,0 M (3,5 ml, 3,5 mmol), agitat la temperatura ambiantă timp de 30 min şi 0°C timp de 30 min. Suspensia rezultată a fost filtrată, clătită cu apă (20 ml). Turta a fost uscată într-un cuptor cu vid la 35 °C peste noapte şi dizolvată cu un amestec de 28% NH4OH (2 ml) şi MeOH (20 ml). Soluţia rezultată a fost concentrată în vid şi tratată cu EtOH (4 ml) pentru a se obţine o suspensie. Solidul rezultat a fost colectat prin filtrare şi uscat în vid. S-au obţinut 70 mg de Compus 27 ca solid alb.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9,03 (s l, 1H), 8,31 (s l, 1H), 8,26 (s l, 1H), 8,13 (s l, 1H), 6,43 - 6,24 (m, 2H), 5,97 - 5,83 (m, 2H), 5,71 (d l, J = 51,6 Hz, 1H), 5,64 (d l, J = 50,0 Hz, 1H), 5,12 - 4,99 (m, 1H), 4,96 - 4,90 (m, 1H), 4,68 - 4,32 (m, 6H), 4,14 - 3,97 (m, 2H), 3,77 - 3,62 (m, 2H).
Exemplul 16 -- Sinteza Compusului 28
Compusul 28 a fost preparat din Compusul 160, un produs în Etapa 11 a căii pentru Compusul 1 prezentat în FIG. 2B, folosind aceeaşi metodă pentru Compusul 27.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,70 (s l, 1H), 8,49 (s l, 1H), 8,24 (s l, 1H), 8,10 (s l, 1H), 6,52 - 6,26 (m, 2H), 5,94 - 5,78 (m, 2H), 5,69 (d l, J = 54,7 Hz, 1H), 5,48 - 5,26 (m, 1H), 5,14 (d l, J = 53,1 Hz, 2H), 5,06 - 4,94 (m, 1H), 4,74 - 4,19 (m, 4H), 4,10 - 3,93 (m, 2H), 3,76 - 3,58 (m, 2H)
Exemplul 17 -- Sinteza Compusului 29
Compusul 161 (5,0 g, 6,329 mmol) şi but-2-in-1,4-diol (1,907 g, 22,153 mmol) au fost azetropate cu THF de două ori. Reziduul a fost dizolvat în THF (50,0 ml) şi toluen (75 ml). S-a adăugat trifenilfosfină (2,158 g, 8,228 mmol) şi soluţia rezultată a fost răcită sub 5°C. S-a adăugat prin picurare DIAD (1,60 ml, 8,23 mmol) menţinând T internă sub 10 °C. Soluţia rezultată a fost agitată la 0-5 °C în timp ce progresul a fost monitorizat prin LCMS. După terminare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid pentru a îndepărta cea mai mare parte a THF. Reziduul a fost diluat cu MTBE (50,0 ml) şi spălat de două ori cu soluţie apoasă 30% de NaCI (40,0 ml de fiecare dată) şi de două ori cu apă (25 ml de fiecare dată). Soluţia organică a fost concentrată în vid şi purificată prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 100 g, 50% până la 70% EtOAc în n-heptan tamponat cu 1% TEA) pentru a da 4,671 g de Compus 162.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,61 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,43 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,33 - 7,27 (m, 3H), 7,24 - 7,18 (m, 8H), 7,05 - 7,01 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,20 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,59 (td, J = 3,1, 53,1 Hz, 1H), 5,19 (d l, J = 2,3 Hz, 2H), 4,93 - 4,83 (m, 1H), 4,18 - 4,15 (m, 1H), 4,01 (d l, J = 6,3 Hz, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,53 (dd, J = 2,7, 10,9 Hz, 1H), 3,17 (dd, J = 3,7, 11,1 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,02 (s, 3H).
Compusul 162 (4,671 g, 5,444 mmol), Compusul 163 (3,32 g, 6,805 mmol) şi trifenil fosfină (1,856 g, 7,077 mmol) au fost dizolvate în THF (56,1 ml) şi răcite sub 5°C. La soluţia rezultată s-a adăugat DIAD (1,3 ml, 6,8 mmol)) menţinând T-ra internă sub 10 °C. După consumarea completă a Compusului 162 (monitorizat prin LCMS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2, 340 g, 55% până la 70% EtOAc în n-heptan tamponat cu 1% TEA) pentru a da 3,879 g de Compus 164 ca o spumă solidă albă.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,51 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,41 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,36 - 7,32 (m, 4H), 7,28 - 7,13 (m, 8H), 6,98 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 6,79 - 6,74 (m, 4H), 6,29 (dd, J = 2,0, 16,4 Hz, 1H), 6,19 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,53 (ddd, J = 2,7, 4,7, 53,1 Hz, 1H), 5,33 (ddd, J = 2,0, 3,9, 53,1 Hz, 1H), 5,23 - 5,21 (m, 1H), 5,05 - 5,01 (m, 2H), 4,99 - 4,94 (m, 2H), 4,81 (ddd, J = 4,3, 6,7, 16,7 Hz, 1H), 4,71 - 4,60 (m, 1H), 4,21 - 4,14 (m, 2H), 4,08 - 4,03 (m, 1H), 3,89 (dd, J = 3,1, 11,7 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 0,91 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 6H), 0,00 (s, 3H).
La o soluţie de Compus 164 (1,5 g, 1,13 mmol) în piridină (12,0 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat difenil fosfit (0,35 g, 1,8 mmol) la temperatura ambiantă. Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După terminare, amestecul de reacţie a fost adăugat într-un amestec de NaHCO3 apos saturat (22,5 ml) şi apă (7,5 ml) menţinând T-ra internă sub 30 °C. După ce hidroliza a fost completă (monitorizată prin LCMS), amestecul rezultat a fost extras de două ori cu un amestec de EtOAc/MTBE (30,0/30,0 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu NaCI apos 30% (15,0 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate in vid. Reziduul a fost azeotropat cu toluen de trei ori şi dizolvat în diclormetan (11 ml), apă (0,20 ml, 11 mmol) şi acid dicloroacetic 6% (0,57 ml, 6,9 mmol) în diclormetan (11 ml) la temperatura ambiantă. După îndepărtarea completă a grupării DMT (monitorizată prin LCMS), s-a adăugat trietilsilan (1,8 ml, 11 mmol). După 10 minute de agitare, s-a adăugat TEA (1,6 ml, 11 mmol)) şi amestecul rezultat a fost concentrat în vid. Reziduul a fost dizolvat în EtOAc (22,5 ml), spălat cu apă (3,8 ml) şi soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (8%) (3,0 ml), s-a uscat peste MgSO4, filtrat şi concentrat în vid. Produsul brut a fost triturat de două ori cu n-heptan (33,8 ml) şi un amestec de n-heptan (9,0 ml) şi toluen (3,0 ml). Supernatantul a fost decantat şi solidul rămas la fund a fost dizolvat în acetonitril. Soluţia rezultată a fost concentrată în vid şi azeotropată cu acetonitril de două ori. Produsul brut, Compusul 165, a fost utilizat pentru următoarea etapă fără purificare (se presupune un randament teoretic de 100%).
LC/MS (ESI) m/z 1089,74 [M+H]+.
La o soluţie de Compus 165 (1,231 g, 1,13 mmol) în piridină (100 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat TEA (0,47 g, 3,4 mmol) şi DMOCP (0,375 mg, 2,03 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După completare, s-au adăugat apă (0,41 ml, 22,6 mmol) şi apoi sulf (0,181 g, 5,651 mmol). După sulfurizare completă (monitorizată prin LCMS), s-au adăugat NaHCO3 apos saturat (8%) (24,6 ml) şi apă (10 ml). Amestecul rezultat a fost concentrat in vid la ~50 ml şi extras de două ori cu un amestec de MTBE/EtOAc (31/31 ml) de fiecare dată. Straturile organice combinate au fost spălate cu NaCI apos 30% (25 ml), uscate pe MgSO4, filtrate, concentrate în vid şi purificate prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 100 g, 0 până la 10% metanol în acetat de etil tamponat cu 1% TEA) pentru a da Compusul 166 (0,484 g).
LC/MS (ESI) m/z 1103,65 [M+H]+.
La o soluţie de compus 166 (0,484 g,, 402 mmol) în piridină (1,2 ml) şi TEA (5,8 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat Et3N 3HF (0,581 ml, 3,563 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizat prin LCMS. După conversia completă, s-a adăugat metoxitrimetilsilan (3,9 ml, 28 mmol). După 20 min de agitare la temperatura ambiantă, supernatantul a fost decantat. La reziduu s-a adăugat toluen (5 ml) şi după 10 min de agitare, stratul de toluen a fost decantat. Aceeaşi operaţiune s-a repetat încă o dată. Produsul brut rezultat a fost dizolvat în diclormetan (10 ml), spălat cu soluţie apoasă saturată de NH4Cl (27% în greutate) (5 ml) şi 30% NaCI apos (2,4 ml) şi uscat pe MgSO4. Filtrarea urmată de concentrarea stratului organic rezultat a dat 0,386 g solid maro pal care a fost azeotropat de două ori cu MeCN. Produsul brut rezultat a fost dizolvat în MeCN (4,6 ml) şi tratat cu bromură de 2-nitrobenzil (0,103 g, 0,475 mmol) la temperatura ambiantă. După ce alchilarea a fost completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 0 până la 5% MeOH în EtOAc) pentru a da 0,251 g de Compus 167 ca solid alb.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,42 (s l, 1H), 8,31 (s l, 1H), 8,22 (s l, 1H), 8,10 - 8,04 (m, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,53 - 7,37 (m, 8H), 7,32 - 7,27 (m, 3H), 7,24 - 7,16 (m, 2H), 6,18 (d l, J = 16,8 Hz, 1H), 6,26 - 6,14 (m, 1H), 5,56 (d, J = 53,1 Hz, 1H), 5,48 - 5,37 (m, 1H), 5,31 (s l, 1H), 5,15 (d l, J = 17,6 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,88 - 4,77 (m, 1H), 4,76 - 4,66 (m, 1H), 4,58 - 4,33 (m, 3H), 4,29 (d l, J = 5,9 Hz, 1H), 4,21 (s l, 1H), 4,13 - 4,06 (m, 1H), 3,93 - 3,79 (m, 2H).
Compusul 167 (0,224 g, 0,222 mmol) şi 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooxi)propannitril (0,081 ml, 0,255 mmol) au fost dizolvaţi în MeCN (5 ml) şi concentrat. Aceeaşi operaţiune s-a repetat încă de două ori. Amestecul rezultat a fost dizolvat în diclormetan (2,2 ml), răcit la 0°C şi tratat cu tetrazolidă de diizopropilamoniu (0,019 g, 0,111 mmol). Amestecul de reacţie a fost adus la temperatura ambiantă peste noapte şi diluat cu MeCN (2,2 ml). Soluţia rezultată a fost adăugată timp de 10 h cu ajutorul unei pompe cu seringă într-o soluţie de sare de trifluoroacetat de piridină (0,129 g, 0,665 mmol) în MeCN (18 ml). După încă 1 h de agitare, s-a adăugat 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooxi)propannitril (0,04 ml, 0,12 mmol) în MeCN (1 ml) timp de 4 h. S-a adăugat (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamidă (0,064 g, 0,311 mmol). După sulfurizare completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi reziduul rezultat a fost preluat cu MTBE (4,5 ml). Soluţia organică rezultată a fost spălată cu soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (8%) (4 ml) şi apă (2 ml). Straturile apoase combinate au fost extrase înapoi cu un amestec de MTBE/EtOAc (4/4 ml). Straturile organice combinate au fost spălate de două ori cu NaCI apos 30% (2 ml de fiecare dată), uscate pe MgSO4, filtrate, concentrate în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 50% până la 100% EtOAc în n-heptan) pentru a da 64 mg de Compus 168.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,57 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 8,06 - 8,01 (m, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,62 - 7,56 (m, 2H), 7,55 - 7,50 (m, 2H), 7,49 - 7,43 (m, 3H), 7,42 - 7,34 (m, 2H), 7,30 - 7,18 (m, 5H), 6,33 (d, J= 15,2 Hz, 1H), 6,10 (d, J= 20,7 Hz, 1H), 5,95 - 5,77 (m, 1H), 5,54 (dd, J = 4,3, 52,8 Hz, 1H), 5,46 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 1H), 5,32 - 5,18 (m, 1H), 5,10 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 4,85 - 4,81 (m, 2H), 4,78 (d l, J = 12,1 Hz, 1H), 4,64 (dd l, J = 4,1, 9,2 Hz, 1H), 4,55 (dd, J = 2,7, 12,1 Hz, 1H), 4,52 - 4,44 (m, 3H), 4,38 - 4,20 (m, 4H), 2,75 (td, J= 6,3, 17,6 Hz, 1H), 2,58 (td, J= 5,9, 17,2 Hz, 1H).
La o soluţie de Compus 168 (40 mg, 0,035 mmol) în 1,4-dioxan (0,5 ml), s-au adăugat tiofenol (0,24 ml, 2,3 mmol) şi TEA (0,24 ml, 1,7 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După completare, s-au adăugat metanol (0,64 ml) şi hidroxid de amoniu 28% (0,64 ml). Amestecul rezultat a fost încălzit la 50°C, agitat timp de 5 h şi răcit la temperatura ambiantă. După deprotejarea completă (monitorizată prin LCMS), amestecul rezultat a fost tratat cu apă (0,80 ml) şi extras de trei ori cu un amestec de n-heptan/toluen (1/1, 0,5 ml de fiecare dată) şi apoi toluen (0,3 ml). Stratul apos a fost concentrat în vid la 40-50°C şi tratat cu apă (1 ml). Solidul rezultat a fost filtrat, clătit cu apă (0,3 ml). Filtratele combinate au fost tratate cu HCI 1,0 M (0,07 ml, 0,07 mmol). Suspensia rezultată a fost filtrată şi clătită cu apă (1 ml). Turta de filtrare a fost dizolvată cu o soluţie 2,0 M de amoniac (1,0 ml, 2,0 mmol) în MeOH. Soluţia rezultată a fost concentrată în vid la 0,5 ml şi tratată cu EtOH (0,5 ml). Aceeaşi operaţiune s-a repetat încă de două ori. La soluţia rezultată s-a adăugat EtOAc (0,9 ml) prin picurare. Au avut loc precipitări. Solidul rezultat a fost colectat prin filtrare, clătit cu un amestec 4/1 de EtOAc/EtOH (0,4 ml) şi uscat în vid peste noapte la temperatura ambiantă. S-au obţinut 12 mg de Compus 29.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,88 (s l, 1H), 8,50 (s l, 1H), 8,20 (s l, 1H), 8,12 (s l, 1H), 6,42 - 6,17 (m, 2H), 5,84 - 5,54 (m, 1H), 5,52 (d, J= 51,6 Hz, 1H), 5,06 - 4,78 (m, 2H), 4,77 - 4,55 (m, 3H), 4,49 (d l, J= 10,2 Hz, 1H), 4,42 (s l, 2H),4,09 - 3,77 (m, 4H).
Exemplul 18 -- Sinteza Compusului 25
La o soluţie de catalizator Hoveyda-Grubbs de a 2a generaţie (0,996 g, 1,585 mmol) în diclormetan (40,0 ml) la reflux s-a adăugat prop-2-en-d5-1-ol (10,0 g, 158 mmol). După 1 h, s-a adăugat suplimentar 1 % mol Catalizator Hoveyda-Grubbs de a 2a generaţie (0,996 g, 1,585 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la reflux peste noapte, răcită la temperatura ambiantă şi concentrată în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 340 g
0% până la 10% MeOH în EtOAc) pentru a da 4,2 g de Compus 170 ca ulei maro.
13C RMN (101 MHz, METANOL-d4) δ = 130,87 (t, J = 23,8 Hz, 2C), 62,22 (quin, J = 21,9 Hz, 2C).
Cu Compusul 170 ca materie primă, compuşii Compus 171 au fost preparaţi prin aceeaşi secvenţă de reacţie (Etapa 1 până la 11) aşa cum este descrisă în calea sintetică pentru Compusul 1 din FIG. 2A şi FIG. 2B.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,59 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,02 - 7,96 (m, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,58 - 7,50 (m, 2H), 7,48 - 7,37 (m, 5H), 7,34 - 7,27 (m, 2H), 7,24 - 7,14 (m, 4H), 6,90 (s, 1H), 6,28 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 6,14 - 6,03 (m, 1H), 5,97 - 5,81 (m, 1H), 5,49 (dd, J = 4,7, 52,3 Hz, 2H), 5,43 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 1H), 5,30 - 5,15 (m, 1H), 4,75 (d l, J = 12,1 Hz, 1H), 4,61 (dd l, J = 4,3, 9,4 Hz, 1H), 4,53 (dd, J = 2,9, 11,9 Hz, 1H), 4,47 - 4,41 (m, 3H), 4,32 - 4,18 (m, 4H), 2,79 (td, J = 7,0, 17,2 Hz, 1H), 2,66 (td, J = 6,3, 16,8 Hz, 1H)
Cu Compusul 171 ca materie primă, Compusul 25 a fost preparat prin aceeaşi secvenţă de reacţie (Etapa 12-13) aşa cum este descrisă în FIG. 2A şi FIG. 2B.
1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ = 9,03 (s l, 1H), 8,30 (s l, 1H), 8,24 (s l, 1H), 8,10 (s l, 1H), 6,44 - 6,13 (m, 2H), 0,00 (d, J = 52,4 Hz, 1H), 0,00 (d, J = 51,2 Hz, 1H), 4,71 - 4,32 (m, 6H), 4,09 - 3,98 (m, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 1H).
Exemplul 19 -- Sinteza Compusului 31 (fie RpRp, fie SpSp)
Un amestec de (E)-but-2-en-1,4-diol (0,10 g, 1,135 mmol) şi Compusul 172 (2,52 g, 2,55 mmol) a fost azeotropat cu THF de două ori şi dizolvat în THF (5,0 ml) şi toluen (7,5 ml). La soluţia rezultată s-a adăugat trifenilfosfină (0,714 g, 2,724 mmol). Soluţia rezultată a fost răcită sub 5 °C şi tratată cu DIAD (0,53 ml, 2,72 mmol) menţinând în acelaşi timp T internă sub 10 °C. Amestecul de reacţie rezultat a fost agitat peste noapte în timp ce a fost încălzit la temperatura ambiantă. După ce reacţia a fost completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g pretratat cu 1% TEA în n-heptan/EtOAc (1/1), 50% până la 66% EtOAc în n-heptan) pentru a da 2,46 g de Compus 173 ca spumă solidă albă. Acest material a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
La o soluţie de Compus 173 (2,387 g, 1,177 mmol echiv.) în acetonitril (28,6 ml) s-a adăugat apă (0,085 ml, 4,7 mmol), echiv.) şi sare trifluoracetat de piridină (0,500 g, 2,589 mmol) la temperatura ambiantă. După 1 minut, s-a adăugat 2-amino-2-metilpropan (19,1 ml, 182 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După terminare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi azeotropat cu MeCN. Reziduul a fost dizolvat în diclormetan (24 ml) şi tratat cu apă (0,42 ml) şi acid dicloroacetic 6% (1,2 ml, 14 mmol) în diclormetan (24 ml). După deprotejarea DMT completă (monitorizată prin LCMS), reacţia a fost stinsă cu piridină (12 ml) şi amestecul de reacţie a fost concentrat în vid. Reziduul rezultat a fost tratat cu un amestec de n-heptan/toluen (15/15 ml) şi stratul superior a fost decantat. Aceeaşi operaţiune s-a repetat încă o dată. Uscarea reziduului rămas în vid a dat Compusul 174, care a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
LC/MS (ESI) m/z 1151,64 [M+H]+.
La o soluţie de compus 174 (1,355 g, 1,177 mmol) în piridină (271 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat TEA (0,98 ml, 7,1 mmol) şi 2-oxid de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinan (0,869 g, 4,708 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă până când toată materia primă a fost consumată (monitorizată prin LCMS). După reacţia completă, s-au adăugat apă (0,85 ml, 47 mmol) (10 echiv. DMOCP) şi apoi sulf (0,377 g, 11,77 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS După sulfurare completă, amestecul de reacţie a fost tratat cu NaHCO3 apos saturat (27 ml) şi apă (10 ml) şi s-a concentrat în vid. La reziduul rezultat s-a adăugat un amestec de MTBE/EtOAc (34/34 ml), o soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (27 ml) şi apă (20 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu un amestec de EtOAc/MTBE (34/34 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă de 30% NaCI (7 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 0% până la 20% MeOH în EtOAc cu 1% TEA) pentru a da 56 mg de Compus 175 (simetric pe baza RMN; fie izomer RpRp, fie SpSp).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 9,09 (s, 2H), 8,46 (s, 2H), 7,56 - 7,05 (m, 10H), 6,37 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,28 - 6,22 (m, 2H), 5,29 (ddd, J = 4,7, 7,8, 11,7 Hz, 2H), 5,00 (d l, J = 13,7 Hz, 2H), 4,84 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,76 (d l, J = 13,3 Hz, 2H), 4,31 (s l, 2H), 4,28 - 4,20 (m, 2H), 4,16 - 4,08 (m, 2H), 3,00 - 2,77 (m, 12H), 1,12 - 0,99 (m, 18H), 0,96 (s, 18H), 0,34 (s, 6H), 0,25 (s, 6H).
La o soluţie de compus 175 (56 mg, 0,0405 mmol) în metanol (1,1 ml) s-a adăugat hidroxid de amoniu 28% (0,22 ml). Amestecul rezultat a fost agitat la 50 °C timp de 5 h, răcit la temperatura ambiantă, concentrat in vid şi azeotropat cu MeCN de două ori. La reziduul rezultat s-a adăugat piridină (0,22 ml), TEA (0,11 ml) şi TEA 3HF (0,11 ml, 0,69 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la 50°C timp de 5 h, răcit la temperatura ambiantă, tratat cu metoxitrimetil silan (0,90 ml, 6,50 mmol) timp de 30 min. Amestecul rezultat a fost concentrat în vid şi dizolvat în apă (5 ml). Soluţia apoasă rezultată a fost extrasă de trei ori cu toluen (5 ml de fiecare dată) şi concentrată in vid. Produsul brut a fost dizolvat în 1 ml apă, filtrat printr-un filtru cu seringă şi acidulat în HCI pentru a obţine pH <3. Amestecul rezultat a fost păstrat într-un congelator (5°C) timp de 2 zile şi solidul rezultat a fost colectat prin filtrare. Solidul a fost dizolvat în 2M NH3 în MeOH (1,5 ml) şi concentrat în vid pentru a da 2,8 mg de Compus 31 ca amestec de NH3 şi sare de TEA. Produsul a fost dizolvat în EtOH (1 ml), tratat cu 0,1 ml TEA, concentrat la 0,5 ml şi păstrat într-un congelator (-20 °C) peste noapte. Supernatantul a fost îndepărtat şi solidul rămas a fost uscat în continuare în vid pentru a da 0,8 mg de sare bis TEA Compus 31 (simetric prin RMN; fie izomer RpRp, fie SpSp).
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,26 - 7,83 (m, 4H), 6,37 (s l, 2H), 5,89 (s l, 2H), 5,36 - 5,07 (m, 2H), 4,95 (d l, J = 3,5 Hz, 2H), 4,58 (dd l, J = 6,3, 10,6 Hz, 2H), 4,43 (s l, 2H), 4,12 - 4,00 (m, 4H), 3,89 - 3,70 (m, 2H), 3,19 (q, J= 7,2 Hz, 12H), 1,30 (t, J= 7,4 Hz, 18H)
Exemplul 20 -- Sinteza Compusului 32
La o soluţie de Compus 177 (2,0 g, 2,532 mmol) şi (+)-2,3-O-izopropiliden-L-treitol (Compus 176) (1,232 g, 7,595 mmoli) în THF (20,0 ml) şi toluen (30,0) ml) s-a adăugat trifenilfosfină (0,930 g, 3,544 mmol). Soluţia rezultată a fost răcită sub 5 °C şi tratată cu DIAD (0,64 ml, 3,3 mmol). Amestecul de reacţie a fost încălzit la temperatura ambiantă. După 8 hore de agitare la temperatura ambiantă, DIAD suplimentar (0,64 ml) şi PPh3 s-au adăugat (0,93 g). După agitarea peste noapte la temperatura ambiantă, amestecul de reacţie a fost agitat la 40°C timp de 2 zile şi concentrat în vid. Purificarea reziduului prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 100 g pretratat cu 1% TEA în n-heptan/EtOAc (1/1), 50% până la 70% EtOAc în n-heptan) au dat 0,524 g de Compus 178 ca o spumă solidă albă.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,62 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,40 - 7,09 (m, 12H), 7,01 - 6,92 (m, 2H), 6,80 - 6,73 (m, 4H), 6,16 (dd, J = 2,7, 16,8 Hz, 1H), 5,49 (ddd, J = 3,1, 4,3, 53,1 Hz, 1H), 4,85 - 4,75 (m, 2H), 4,63 (dd, J= 3,9, 14,8 Hz, 1H), 4,30 - 4,19 (m, 2H), 4,18 - 4,12 (m, 1H), 3,94 (tt, J = 3,5, 8,2 Hz, 1H), 3,84 (td, J = 5,5, 12,1 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,53 (dd, J = 2,7, 10,9 Hz, 1H), 3,17 (dd, J = 3,5, 10,9 Hz, 1H), 2,94 (t l, J = 5,5 Hz, 1H), 0,89 (s, 6H), 0,83 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), -0,01 (s, 3H)
La o soluţie de Compus 178 (0,409 g, 0,84 mmol) în THF (6 ml) s-au adăugat trifenilfosfină (0,191 g, 0,728 mmol) şi DIAD (0,142 ml, 0,728 mmol). După 40 h de agitare la temperatura ambiantă, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană (SiO2 50 g pretratat cu 1% TEA în n-heptan/EtOAc (1/1), 50% până la 66% EtOAc în n-heptan) pentru a da 0,533 g de Compus 180.
LC/MS: LRMS (ESI) m/z 1403,86 [M+H]+.
Cu Compusul 180 ca materie primă, Compusul 181 a fost preparat prin aceeaşi secvenţă de reacţie (Etapa 5-11) aşa cum este descrisă în FIG. 2A şi FIG. 2B.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,72 (s, 1H), 8,14 - 8,06 (m, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,62 - 7,53 (m, 6H), 7,53 - 7,45 (m, 1H), 7,43 - 7,33 (m, 2H), 7,30 - 7,24 (m, 3H), 7,19 - 7,12 (m, 2H), 6,11 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 6,05 (d, J = 19,5 Hz, 1H), 5,89 (dd, J = 3,5, 52,3 Hz, 1H), 5,57 - 5,46 (m, 1H), 5,41 (dd, J = 3,5, 53,1 Hz, 1H), 5,18 - 5,04 (m, 1H), 4,83 (dd, J= 4,7, 14,4 Hz, 1H), 4,78 - 4,73 (m, 1H), 4,70 (d l, J= 12,1 Hz, 1H), 4,64 - 4,48 (m, 4H), 4,46 - 4,35 (m, 4H), 4,33 - 4,27 (m, 2H), 4,16 - 4,06 (m, 2H), 4,05 - 3,96 (m, 1H), 2,55 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 1,26 (s, 6H).
La o soluţie de Compus 181 (3,2 mg, 2,629 µmol) în diclormetan (0,5 ml) s-a adăugat terţ-butilamină (0,5 ml, 4,7 mmol). După 30 min de agitare, soluţia de reacţie a fost concentrată în vid şi azeotropată cu MeCN de două ori. Reziduul a fost dizolvat în acetonitril (1 ml) şi tratat cu 1-(bromometil)-2-nitrobenzen (1,7 mg, 7,9 µmol). După alchilare completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost concentrat cu purjare cu azot. Purificarea reziduului prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 4 g, 80% până la 100% EtOAc în n-heptan) au dat 2 mg de Compus 182.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,12 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H), 8,03 - 8,00 (m, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,70 - 7,29 (m, 13H), 7,21 (dt, J = 2,7, 7,6 Hz, 4H), 6,07 (d, J= 19,9 Hz, 1H), 5,94(d, J= 21,1 Hz, 1H), 5,91 - 5,77 (m, 1H), 5,81 (dd, J = 4,3, 51,5 Hz, 1H), 5,62 - 5,49 (m, 1H), 5,54 (dd, J = 3,1, 52,7 Hz, 2H), 4,83 (q, J = 5,9 Hz, 1H), 4,72 - 4,63 (m, 2H), 4,61 - 4,28 (m, 13H), 1,42 (s, 3H), 1,28 (s, 3H).
La Compusul 182 (2,0 mg, 1,5 µmol) s-au adăugat acid acetic (0,8 ml) şi apă (0,2 ml). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă timp de 14 h şi la 45-50 °C timp de 24 h, concentrat în vid şi azeotropat cu toluen de două ori. La reziduu s-au adăugat 1,4-dioxan (0,12 ml), tiofenol (60 µl) şi apoi TEA (60 µl). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După terminare, s-au adăugat metanol (160 µl) şi hidroxid de amoniu 28% (160 µl). Amestecul rezultat a fost agitat la 50 °C până când debenzolizarea a fost completă (monitorizată prin LCMS). După terminare, s-a adăugat apă (0,3 ml). Solidul rezultat a fost filtrat, clătit cu apă (0,2 ml). Filtratul a fost extras de două ori cu toluen (0,5 ml de fiecare dată) şi concentrat în vid la 40-50 °C. Reziduul a fost tratat cu apă (0,5 ml) şi solidul rezultat a fost filtrat, clătind cu apă (0,1 ml). Purificarea HPLC a straturilor apoase combinate în condiţiile descrise mai jos a dat 1,5 mg de Compus 32.
LC/MS: LRMS (ESI) m/z 781,23 [M+H]+.
Condiţii HPLC preparativă pentru Compusul 32:
Instrument Agilent 1200/1260 AS/FC Coloană HPLC Waters Xterra C18, 10 x 100mm # 1414 Debit 3,0 ml/min Temperatura coloanei 35 °C faza mobilă A: 0,1% NH4OH în apă, B: 0,1% NH4OH în acetonitril Gradient (B%) 0 → 5 Timp de rulare 20 min Volum de injectare 50 ul (1 mg/ml în apă) detecţie UV 260 nm Timpi de retenţie 12,7 min
Exemplul 21 -- Sinteza Compusului 33 şi Compusului 34
La o soluţie de 9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-2-il)-1,9-dihidro-6H-purin-6-onă Compusul 183 (5,00 g, 18,5 mmol) în piridină (75 ml) la 0°C s-au adăugat Ac2O (7,0 ml, 74 mmol) şi DMAP (0,565 g, 4,626 mmol). Amestecul rezultat a fost încălzit la temperatura ambiantă şi agitat în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După terminare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi tratat cu EtOAc (200 ml) şi apă (50 ml). Au avut loc precipitări. Solidul rezultat a fost colectat prin filtrare şi clătit cu MTBE. Uscarea în vid la 40°C peste noapte a dat 5,81 g de Compus 193 ca solid alb.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12,53 (s l, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,15 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 6,37 (dd, J = 2,7, 19,1 Hz, 1H), 5,86 (ddd, J= 2,7, 5,1, 51,6 Hz, 1H), 5,62 (ddd, J= 5,5, 7,0, 16,0 Hz, 1H), 4,49 - 4,38 (m, 2H), 4,26 (dd, J= 4,7, 12,1 Hz, 1H), 2,19 (s, 3H), 2,04 (s, 3H).
La o soluţie de compus 193 în diclormetan (40,0 ml) la 0°C s-au adăugat încet DMF (1,3 ml, 16,9 mmol) şi clorură de tionil (1,28 ml, 17,5 mmol). Amestecul rezultat a fost încălzit la reflux şi agitat până când toată materia primă a fost consumată (monitorizat prin LCMS). După terminare, amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi tratat cu soluţie de NaHCO3 apos saturat (40 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras de două ori cu diclormetan (30 ml fiecare). Straturile organice combinate au fost uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid pentru a da 2,81 g de Compus 184 ca maro pal.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,79 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 6,29 (dd, J = 2,0, 18,0 Hz, 1H), 5,79 (ddd, J = 1,6, 4,7, 51,6 Hz, 1H), 5,53 (ddd, J = 5,1, 7,6, 17,8 Hz, 1H), 4,58 - 4,48 (m, 2H), 4,33 (dd, J = 3,9, 12,5 Hz, 1H), 2,20 (s, 3H), 2,07 (s, 3H).
La o soluţie de compus 184 (0,22 g, 0,59 mmol) într-un amestec de THF (7,7 ml) şi NMP (0,77 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat acetilacetonat de fier (III) (0,021 g, 0,059 mmol) şi 0,5M 3- bromură de butenilmagneziu (1,77 ml, 0,885 mmol) în THF. După ce reacţia a fost completă (monitorizată prin LCMS), s-au adăugat MTBE (10 ml) şi HCI 0,1 N (10 ml). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă timp de 10 min. Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu un amestec de EtOAc/MTBE (1/1, 10 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă de NaCI 30% (5 ml), uscate pe MgSO4 si concentrate în vid. Produsul brut a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,90 (s, 1H), 8,16 (s, 1H), 6,26 (dd, J = 2,0, 18,4 Hz, 1H), 5,98 - 5,85 (m, 1H), 5,90 - 5,73 (m, 1H), 5,63 (ddd, J = 4,9, 7,5, 17,7 Hz, 1H), 5,12 - 5,05 (m, 1H), 4,98 (dd, J= 1,6, 10,2 Hz, 1H), 4,54 - 4,50 (m, 2H), 4,31 (dd, J = 5,1, 12,9 Hz, 1H), 3,30 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 2,70 - 2,64 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 2,05 (s, 3H).
Produsul brut Compus 194 (0,232 g, 0,590 mmol în teorie) a fost dizolvat în metanol (1,5 ml) şi tratat cu amoniac 2,0 M (1,5 ml, 3,0 mmol) în MeOH la temperatura ambiantă. După deacetilarea completă, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 0% până la 5% MeOH în EtOAc) pentru a da 0,17 g de Compus 185.
LCMS: MS (ESI) m/z 309,20 [M+H]+
La o soluţie de compus 185 (1,22 g, 2,928 mmol) în piridină (9,0 ml) la 0° s-a adăugat 4,4'-(cloro(fenil)metilen)bis(metoxibenzen) (1,042 g, 3,075 mmol). Amestecul de reacţie a fost lăsat să se încălzească la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După finalizare, s-au adăugat MTBE (18 ml) şi o soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (9,0 ml). După 10 min de agitare, straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu MTBE (18,0 ml). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă 30% NaCI (10 ml), filtrate şi concentrate în vid. Purificare prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 50% până la 100% acetat de etil în heptan cu 1% TEA) pentru a da 1,53 g de Compus 195 ca solid portocaliu.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,86 - 8,78 (m, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,40 - 7,36 (m, 2H), 7,31 - 7,18 (m, 7H), 6,79 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,29 (dd, J = 2,3, 17,2 Hz, 1H), 5,92 (tdd, J = 6,4, 10,4, 17,0 Hz, 1H), 5,70 (ddd, J = 2,7, 4,7, 52,8 Hz, 1H), 5,09 (dd, J = 1,6, 17,2 Hz, 1H), 4,97 (dd, J = 1,6, 10,2 Hz, 1H), 4,90 - 4,77 (m, 1H), 4,26 - 4,19 (m, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,56 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,43 (dd, J = 4,3, 10,9 Hz, 1H), 3,33 - 3,28 (m, 2H), 2,70 - 2,64 (m, 2H), 2,20 (dd, J = 2,5, 7,2 Hz, 1H).
La o soluţie de compus 195 (1,530 g, 2,505 mmol) în diclormetan (23 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat tetrazolidă de 3-bis(diizopropilamino)fosfino)oxi)propannitril (2,8 ml, 1,2 mmol) şi 1-metilimidazol (0,493 g, 2,881 mmol). Amestecul reacţia a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce progresul a fost monitorizat prin LCMS. După completare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 40% până la 66% EtOAc în n-heptan cu 1% TEA) pentru a da 1,80 g de Compus 186 ca o spumă solidă portocalie pal.
Compusul 186 (1,8 g, 2,22 mmol) şi Compusul 185 (1,110 g, 2,664 mmol) au fost dizolvaţi în acetonitril (21,6 ml) şi concentraţi în vid. Aceeaşi operaţiune s-a repetat încă o dată. Amestecul rezultat a fost dizolvat în acetonitril (21,6 ml) şi tratat cu trifluoracetat de piridiniu (0,514 g, 2,664 mmol) la temperatura ambiantă. După ce reacţia a fost completă (monitorizată prin LCMS), s-a adăugat ((dimetilamino-metiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazaolin-3-tionă (0,911 g, 4,439 mmol) şi amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă. După sulfurizarea completă (monitorizată prin LCMS), o soluţie apoasă saturată de NaHCO3 s-a adăugat soluţie (30 ml) şi amestecul rezultat a fost extras de trei ori cu MTBE (30 ml de fiecare dată). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă de NaCI 30% (20 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Purificare prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 100 g, 0% până la 10% MeOH în EtOAc cu 1% TEA) au dat 0,481 g de Compus 196 şi 1,315 g de Compus 197.
Compus 196: LCMS: MS (ESI) m/z 1073,25 [M+Na]+
Compus 197: LCMS: MS (ESI) m/z 995,23 [M-H]-
La o soluţie de sare TEA Compus 197 (1,315 g, 1,197 mmol) în MeCN (20 ml) la temperatura ambiantă s-a adăugat bromură de 2-nitrobenzil (0,388 g, 1,796 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După terminare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 100 g, 0% până la 5% MeOH în EtOAC) pentru a da 0,90 g de Compus 188.
LCMS: MS (ESI) m/z 1154,29 [M+Na]+
La o soluţie de compus 188 (1,35 g, 1,192 mmol) în toluen (540 ml) la reflux uşor (110-112 oC T internă) s-a adăugat o soluţie de Hoveyda-Grubbs Catalyst de a 2a Generaţie (0,187 g, 0,298 mmol) şi chinonă (0,322 g, 2,981 mmol)) în toluen (20 ml). Soluţia rezultată a fost agitată la 110-112°C în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După 4 h, s-a adăugat catalizator suplimentar (0,10 g, 0,16 mmol) şi agitarea a continuat la reflux. După completare, amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi tratat cu DMSO (2,54 ml, 35,8 mmol). După 3 ore de agitare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 0% până la 15% MeOH în EtOAC) pentru a da un amestec de Compus 198 şi Compus 199. Amestecul a fost dizolvat în diclormetan (2 ml) şi tratat cu apă (0,021 ml, 1,2 mmol) şi acid dicloroacetic 6% (0,098 ml, 1,2 mmol) în diclormetan (2 ml). După 10 min, reacţia a fost stinsă cu piridină (1 ml) şi concentrată în vid. Reziduul s-a dizolvat în diclormetan (50 ml) şi s-a spălat cu soluţie apoasă de NaCI 30% (15 ml de fiecare dată) de două ori şi s-a uscat pe MgSO4. Purificarea produsului brut prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g, 5% până la 10% MeOH în DCM) au dat 0,25 g de Compus 198.
Compus 199:LCMS: MS (ESI) m/z 1104,31 [M+H]+
Compus 198:LCMS: MS (ESI) m/z 802,16 [M+H]+
Compusul 198 (0,233 g, 0,291 mmol) şi 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooxi)propannitril (0,111 ml, 0,349 mmol) au fost dizolvate în MeCN (10 ml) şi concentrate în vid. Aceeaşi operaţie s-a repetat încă de două ori. Amestecul rezultat a fost dizolvat în diclormetan (2,3 ml), răcit la 0- 5°C şi tratat cu tetrazolidă de diizopropilamoniu (0,025 g, 0,145 mmol). Amestecul de reacţie a fost adus la temperatura ambiantă peste noapte şi apoi diluat cu acetonitril (2,3 ml). Soluţia rezultată a fost adăugată timp de 7 h cu o pompă cu seringă într-o soluţie de sare de trifluoracetat de piridină (0,168 g, 0,872 mmol) în MeCN (18,6 ml). S-a adăugat apoi 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooxi)propannitril (40 mg, 0,133 mmol) în MeCN (2 ml) timp de 2 ore. După 1 h de agitare, s-a adăugat (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamidă (0,119 g, 0,581 mmol) şi soluţia de reacţie a fost agitată până când sulfurarea a fost completă (monitorizată prin LCMS). După finalizare, amestecul a fost concentrat în vid, dizolvat în MTBE (5 ml) şi tratat cu NaHCO3 apos saturat (3,50 ml) şi apă (1,2 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras cu un amestec de MTBE/EtOAc (5/3 ml). Straturile organice combinate au fost spălate de două ori cu soluţie apoasă de NaCI 30% (2,3 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Purificarea produsului brut prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 0% până la 20% MeOH în EtOAc) au dat 119 mg de Compus 190 (58 mg de izomeri cu eluare mai rapidă şi 61 mg izomeri cu eluare mai lentă).
La o soluţie de izomeri cu eluare rapidă ai Compusului 190 (58 mg, 0,062 mmol) în diclormetan (1,8 ml) s-a adăugat terţ-butilamină (1,2 ml, 11 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă până când toată materia primă a fost consumată (monitorizată prin LCMS). După comletare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid, azeotropizat cu acetonitril de două ori şi dizolvat în acetonitril (1,7 ml). La soluţia rezultată s-a adăugat 1-(bromometil)-2-nitrobenzen (40,3 mg, 0,187 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După alchilare completă, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 0% până la 5% MeOH în EtOAC) pentru a da 19 mg de Compus 191 (izomer SpRp).
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,42 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,13 (dd, J = 1,2, 8,2 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,98 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,69 - 7,67 (m, 1H), 7,61 - 7,34 (m, 5H), 6,33 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 6,19 (d, J = 19,9 Hz, 1H), 6,09 - 5,93 (m, 1H), 5,82 - 5,66 (m, 2H), 5,67 (dd, J = 3,5, 50,8 Hz, 1H), 5,35 - 5,32 (m, 2H), 4,62 - 4,29 (m, 11H), 3,35 - 3,28 (m, 1H), 3,18 - 3,14 (m, 2H), 3,01 - 2,91 (m, 1H), 2,84 - 2,78 (m, 1H), 2,60 - 2,49 (m, 3H).
Izomerul cu eluare mai lentă al Compusului 190 (60 mg) a fost procesat prin aceeaşi secvenţă de reacţie ca cea descrisă în compusul Compus 191 pentru a da 14 mg de Compus 192 şi 7 mg de Compus 191.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,18 (s, 2H), 8,10 (s, 2H), 8,10 (dd, J = 1,0, 8,0 Hz, 2H), 7,66 - 7,57 (m, 4H), 7,53 - 7,46 (m, 2H), 6,31 (d, J = 17,6 Hz, 2H), 6,19 - 6,05 (m, 2H), 5,84 (dd, J = 4,3, 50,8 Hz, 2H), 5,39 - 5,30 (m, 2H), 4,58 - 4,46 (m, 6H), 4,45 - 4,39 (m, 2H), 4,19 (ddd, J = 3,1, 6,3, 10,2 Hz, 2H), 3,32 (td, J = 3,5, 15,6 Hz, 2H), 3,06 (td, J = 6,3, 15,2 Hz, 2H), 2,67 - 2,57 (m, 4H).
Pe baza metodologiei sintetice, a datelor RMN (simetrice), a timpului de retenţie HPLC (izomerul cu cea mai lentă eluare) şi a activităţilor biologice ale Compusului 34, care a fost derivat din Compusul 192, solicitanţii cred că Compusul 192 are stereochimia fosforului RR. Această atribuire stereochimică ar fi supusă confirmării prin cristalografie cu raze X
La o soluţie de compus 192 (26 mg, 0,026 mmol) în 1,4-dioxan (0,52 ml) s-au adăugat tiofenol (0,26 ml, 2,5 mmol) şi apoi TEA (0,26 ml, 1,9 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă până când deprotejarea a fost completă (monitorizată prin LCMS). După terminare, s-a adăugat apă (2 ml). Amestecul rezultat a fost extras de trei ori cu toluen (2 ml de fiecare dată). Stratul apos a fost concentrat în vid la 40-50°C şi dizolvat în apă (2 ml). Amestecul rezultat a fost extras de patru ori cu un amestec de EtOAc/MTBE (1/1 ml de fiecare dată). Stratul apos a fost concentrat în vid pentru a da sarea bis-TEA a Compusului 33.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9,06 (s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 6,43 (d, J = 14,4 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 6,27 (dd, J = 3,5, 51,1 Hz, 1H), 5,63 (dd, J = 2,7, 51,5 Hz, 1H), 5,30 - 5,14 (m, 2H), 5,06 - 4,91 (m, 2H), 4,58 (d l, J = 12,5 Hz, 1H), 4,52 - 4,39 (m, 3H), 4,07 (dd, J = 4,7, 11,7 Hz, 1H), 3,98 (dd, J = 5,1, 12,5 Hz, 1H), 3,43 - 3,34 (m, 2H), 3,22 (q, J = 7,2 Hz, 12H), 2,98 - 2,86 (m, 2H), 2,79 - 2,45 (m, 4H), 1,32 (t, J = 7,4 Hz, 18H)
Cu Compusul 192 ca materie primă, Compusul 34 a fost preparat prin aceeaşi secvenţă de reacţie ca cea descrisă în Compusul 33.
1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,77 (s, 2H), 8,49 (s, 2H), 6,39 (d, J = 15,2 Hz, 2H), 5,71 (dd, J = 3,1, 51,2 Hz, 2H), 5,24 - 5,13 (m, 2H), 5,02 (dtd, J = 3,1, 9,0, 25,4 Hz, 2H), 4,54 (d l, J = 12,1 Hz, 2H), 4,42 (d l, J = 9,8 Hz, 2H), 3,99 (dd, J = 5,9, 12,1 Hz, 2H), 3,20 (q, J = 7,3 Hz, 12H), 2,90 (ddd, J = 3,5, 10,2, 14,1 Hz, 2H), 2,81 - 2,70 (m, 2H), 2,55 - 2,43 (m, 2H), 1,30 (t, J= 7,4 Hz, 18H).
Exemplul 22 -- Sinteza Compusului 35 şi Compusului 36
La sarea disodică a Compusului 200 (0,10 g, 0,126 mmol) s-au adăugat bromură de 2-nitrobenzil (0,068 g, 0,316 mmol) şi MeCN (2,0 ml). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După terminare, amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 0% până la 5% MeOH în DCM) pentru a da 115 mg de Compus 201.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,13 (dd, J = 0,8, 8,2 Hz, 1H), 8,06 (s, 1H), 8,03 (dd, J = 1,0, 8,0 Hz, 1H), 7,80 (s l, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,70 - 7,65 (m, 1H), 7,62 - 7,54 (m, 2H), 7,53 - 7,47 (m, 2H), 7,45 - 7,39 (m, 1H), 7,34 - 7,27 (m, 1H), 6,23 (d l, J = 16,8 Hz, 1H), 6,14 (d l, J = 18,8 Hz, 1H), 5,95 (s l, 2H), 5,77 (td, J = 5,1, 15,2 Hz, 2H), 5,71 (td, J = 5,1, 15,6 Hz, 1H), 5,63 - 5,55 (m, 1H), 5,47 (d l, J = 11,7 Hz, 1H), 4,58 - 4,27 (m, 11H), 4,18 - 4,10 (m, 1H), 4,05 - 3,71 (m, 2H)
La o soluţie de compus 201 (77 mg, 0,076 mmol) în 2,2,2-frifluoretanol (2 ml) s-au adăugat O-(2,4-dinitrofenil)hidroxilamină (36,5 mg, 0,183 mmol) şi bis[rodiu(α,α,α',α'-tetrametil-1,3-benzendipropionic)] (5,74 mg, 0,015 mmol) într-o porţie. Amestecul a fost agitat la temperatura ambiantă peste noapte, diluat cu DCM (10 ml) şi tratat cu soluţie de NaHCO3 apos saturat (10 ml). Straturile au fost separate şi stratul apos a fost extras de două ori cu DCM (10 ml fiecare). Straturile organice combinate au fost uscate pe MgSO4 şi purificate prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 0% până la 15% MeOH în EtOAc) pentru a da 3,3 mg de Compus 202.
LCMS: MS m/z 1032,07 [M+H]+
Compusul 35 şi Compusul 36
La o soluţie de Compus 202 (3,3 mg, 3,2 µmol) în 1,4-dioxan (0,40 ml) s-au adăugat tiofenol (0,2 ml, 1,9 mmol) şi TEA (0,2 ml, 1,4 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După completare, amestecul de reacţie a fost tratat cu apă (2 ml) şi extras de trei ori cu toluen (2 ml de fiecare dată). Stratul apos a fost concentrat în vid la 40-50°C şi dizolvat în apă (1,5 ml). Solidul rezultat a fost filtrat, clătit cu apă (0,5 ml). Separarea prin HPLC a filtratelor combinate în condiţiile descrise mai jos a dat Compusul 35 (timp de retenţie: 8,4 min) şi Compusul 36 (timp de retenţie: 8,9 min)
Compus 35
LCMS: MS m/z 762,08 [M+H]+
Compus 36
LCMS: MS m/z 762,22 [M+H]+
Condiţii HPLC preparativă ale Compusului 35/Compusului 36:
Instrument Agilent 1200/1260 AS/FC Coloană HPLC Waters Xterra C18, 10 x 100mm # 3128 Debit 3,0 ml/min Temperatura coloanei 35 °C faza mobilă A: 0,1% acid formic în apă, B: 0,1% acid formic în acetonitril Gradient (B%) 0 → 50 Timp de rulare 20 min Volum de injectare 50 ul (1 mg/ml în apă) detecţie UV 260 nm Timpi de retenţie Compus 35 8,4 min Compus 36 8,9 min
Exemplul - 23 -- Sinteza Compusului 38 şi Compusului 39
FIG. 13 prezintă un exemplu de sinteză a Compusului 38 şi Compusului 39.
Etapa 1
La o soluţie de compus 203 (5,82 g, 9,314 mmol) şi alcool alilic (0,95 ml, 14 mmol) în THF (50 ml) la 0 °C s-a adăugat o soluţie de DIAD (2,4 ml, 11,6 mmol) şi trifenilfosfină (2,93 g, 11,2 mmol) în toluen (25 ml) menţinând în acelaşi timp T internă sub 10 °C. Soluţia rezultată a fost încălzită la temperatura ambiantă şi agitată în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După completare (5 h), amestecul a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (100 g, 20% până la 60% EtOAc în n-heptan) pentru a da 4,56 g de Compus 204 ca ulei roz.
Compus 204: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,55 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 7,46 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,31 - 7,23 (m, 1H), 7,20 - 7,10 (m, 2H), 6,02 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 6,07 - 5,95 (m, 1H), 5,21 (dd, J = 1,6, 17,2 Hz, 1H), 5,05 (dd, J = 1,4, 10,4 Hz, 1H), 5,00 (d, J= 5,5 Hz, 2H), 4,82 (t, J= 4,9 Hz, 1H), 4,22 - 4,16 (m, 1H), 4,05 - 4,00 (m, 2H), 3,82 (dd, J = 2,5, 11,5 Hz, 1H), 0,95 (s, 9H), 0,81 (s, 9H), 0,14 (s, 3H), 0,13 (s, 3H), 0,00 (s, 3H), -0,23 (s, 3H).
Etapa 2
La Compusul 204 (4,56 g, 6,858 mmol) s-a adăugat acid acetic (80 ml) şi apă (20 ml). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă peste noapte şi la 35 °C timp de 1 zi. Amestecul rezultat a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2, 50 g, 33% până la 60% EtOAc în n-heptan) pentru a da 3,22 g de Compus 205 ca o spumă solidă albă.
Compus 205: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,56 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,51 - 7,47 (m, 2H), 7,32 - 7,27 (m, 1H), 7,20 - 7,16 (m, 2H), 6,06 - 5,95 (m, 1H), 5,72 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,26 (dd, J = 5,5, 7,8 Hz, 1H), 5,20 (dd, J = 1,6, 17,2 Hz, 1H), 5,06 (dd, J = 1,6, 10,2 Hz, 1H), 5,03 - 4,98 (m, 2H), 4,23 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,14 (s, 1H), 3,92 (dd, J = 1,6, 12,9 Hz, 1H), 3,68 (d l, J = 12,9 Hz, 1H), 0,75 (s, 9H), -0,14 (s, 3H), -0,62 (s, 3H).
Etapa 3
La un Compus 205 (3,22 g, 5,847 mmol) în THF (120 ml) la temperatura ambiantă au fost adăugate apă (30 ml) şi trifenilfosfină (2,454 g, 9,355 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După completare (18h), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid şi azeotropat cu MeCN de trei ori. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 (NH) 55 g, 20% până la 100% EtOAc în n-heptan) pentru a da 4,82 g de Compus 206 (puritate 63% presupusă). Produsul a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară.
Compus 206: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,56 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,54 (qd, J = 1,6, 7,6 Hz, 2H), 7,31 - 7,27 (m, 1H), 7,19 - 7,15 (m, 2H), 6,07 - 5,94 (m, 1H), 5,84 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,50 (d l, J = 10,6 Hz, 1H), 5,20 (dd, J = 1,6, 17,2 Hz, 1H), 5,05 (dd, J = 1,4, 10,4 Hz, 1H), 5,02 - 4,98 (m, 2H), 4,95 - 4,91 (m, 1H), 4,16 - 4,08 (m, 2H), 3,96 (dd, J = 1,6, 12,9 Hz, 1H), 3,73 (dd, J = 2,0, 5,5 Hz, 1H), 3,73 - 3,67 (m, 1H), 0,78 (s, 9H), - 0,20 (s, 3H), -0,46 (s, 3H).
Etapa 4
La o soluţie de Compus 206 (4,82 g, puritate 63%, 5,72 mmol) în piridină (39,0 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat TEA (1,3 ml, 8,6 mmol) şi tritil-CI (1,753 g, 6,289 mmol). După completarea reacţiei (monitorizată prin LC/MS), s-a adăugat soluţie de NaHCO3 saturat (60 ml). Amestecul rezultat a fost extras de trei ori cu un amestec de MTBE/EtOAc (1/1, 70 ml de fiecare dată). Straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie apoasă de NaCI 30% (30 ml) şi s-au uscat pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 50 g pretratat cu 1% TEA în EtOAc/n-heptan, 20% până la 100% EtOAc în n-heptan cu 1% TEA) pentru a da 1,484 g de Compus 207 ca solid alb.
Compus 207: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,49 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,50 - 7,46 (m, 8H), 7,31 - 7,22 (m, 7H), 7,20 - 7,14 (m, 5H), 6,11 (d, J= 6,3 Hz, 1H), 6,07 - 5,94 (m, 1H), 5,20 (dd, J = 1,2, 17,2 Hz, 1H), 5,06 (dd, J = 1,4, 10,4 Hz, 1H), 5,03 - 4,98 (m, 2H), 4,84 (dd, J= 3,1, 10,6 Hz, 1H), 4,52 (t, J= 5,7 Hz, 1H), 3,78 (d, J= 1,6 Hz, 1H), 3,64 - 3,57 (m, 1H), 3,26 - 3,16 (m, 3H), 0,77 (s, 9H), -0,18 (s, 3H), -0,63 (s, 3H).
Etapa 5
La o soluţie de compus 207 (0,50 g, 0,652 mmol) în MeCN (6 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat 3-((bis(diizopropilamino)fosfaneil)oxi)propannitril (0,393 g, 1,304 mmol) şi trifluoracetat de piridiniu (0,113 g, 0,587 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După completare (1 h), soluţia rezultată a fost tratată cu hidrogen sulfurat gazos (barbotare) timp de 1 min, urmată de trifluoracetat de piridiniu (0,252 g, 1,304 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După completare (1 h), amestecul rezultat a fost diluat cu MTBE (60 ml). Soluţia rezultată a fost spălată cu apă (15 ml de fiecare dată) de două ori şi soluţie apoasă de NaCI 30% (15 ml) şi uscată pe Na2SO4, filtrată şi concentrată în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 25% până la 40% EtOAc în n-heptan) pentru a da 0,411 g de Compus 208 (amestec diastereomeric 1:1 P) ca spumă solidă albă.
Compus 208 (amestec diastereomeric 1:1 P) 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,49 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,54 - 7,47 (m, 4H), 7,46 - 7,38 (m, 14H), 7,32 - 7,27 (m, 2H), 7,23 - 7,04 (m, 20H), 6,11 - 5,99 (m, 2H), 5,98 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 1,6, 6,3 Hz, 1H), 5,23 (dd, J = 1,6, 6,3 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 1,6, 6,3 Hz, 1H), 5,09 (dd, J = 1,2, 6,3 Hz, 1H), 5,02 (d l, J = 5,5 Hz, 4H), 4,57 - 4,45 (m, 2H), 4,43 - 4,34 (m, 1H), 4,32 - 4,04 (m, 8H), 3,23 - 3,19 (m, 1H), 3,10 (s l, 2H), 3,06 - 2,99 (m, 1H), 2,96 - 2,89 (m, 2H), 2,73 (dt, J = 1,4, 6,4 Hz, 2H), 2,65 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,83 (s, 9H), 0,01 (s, 3H), -0,09 (s, 6H), -0,11 (s, 3H).
Etapa 6
La o soluţie de compus 208 (0,411 g,, 457 mmol) şi Compus 206 (0,293 g, 0,502 mmol) în acetonitril (5 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat DIEA (0,16 ml, 0,91 mmol) şi CCl4 (0,18 ml, 1,8 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizat prin LCMS. După completare (1 h), amestecul rezultat a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 33% până la 100% EtOAc în n-heptan) pentru a da 0,461 g de Compus 210 (amestec diastereomeric 1:1 P) ca o spumă solidă albă.
Compus 210: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,52 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,55 - 7,37 (m, 20H), 7,33 - 6,99 (m, 30H), 6,09 - 5,97 (m, 4H), 5,96 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 5,87 (d, J= 1,2 Hz, 1H), 5,82 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,28 - 5,17 (m, 4H), 5,11 - 5,04 (m, 4H), 5,03 - 4,96 (m, 8H), 4,75 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 4,70 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 4,46 - 4,33 (m, 3H), 4,31 - 4,18 (m, 5H), 4,12 - 3,96 (m, 8H), 3,89 (d l, J = 11,7 Hz, 1H), 3,78 - 3,67 (m, 3H), 3,57 (dd, J = 2,9, 4,1 Hz, 1H), 3,56 - 3,44 (m, 2H), 3,08 - 3,01 (m, 2H), 2,99 - 2,93 (m, 1H), 2,91 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 2,77 - 2,73 (m, 1H), 2,72 - 2,53 (m, 4H), 0,84 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,82 (s, 9H), 0,00 (s, 3H), -0,05 (s, 6H), -0,08 (s, 3H), -0,12 (s, 3H), -0,15 (s, 3H), -0,18 (s, 3H), -0,18 (s, 3H).
Etapa 7
La o soluţie de compus 210 (0,461 g, 0,324 mmol) în MeCN (5,5 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat 3-((bis(diizopropilamino)fosfaneil)oxi)propannitril (0,195 g, 0,648 mmol) şi trifluoracetat de piridiniu (0,050 g, 0,259 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După completare (40 min), soluţia rezultată a fost tratată cu hidrogen sulfurat gazos timp de 1 min şi apoi tratată cu trifluoracetat de piridiniu (0,138 g, 0,713 mmol). După completare (monitorizată prin LCMS), soluţia rezultată a fost diluată cu MTBE (30 ml), spălată cu apă (10 ml fiecare) de două ori şi soluţie apoasă 30% NaCI (10 ml), uscată pe Na2SO4, filtrată şi concentrată în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 33% până la 60% EtOAc în n-heptan) pentru a da 0,329 g de Compus 211 ca o spumă solidă albă.
Compus 211: LC/MS (ESI) m/z 1555,48 [M+H]+.
Etapa 8
La o soluţie de Compus 211 (0,329 g, 0,211 mmol) în diclormetan (7,2 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat apă (0,032 ml, 1,8 mmol) şi acid dicloroacetic (0,29 ml, 3,6 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizat prin LCMS. După terminare (30 min), amestecul de reacţie a fost o soluţie de NaHCO3 saturat (25 ml). Amestecul rezultat a fost extras de două ori cu DCM (30 ml de fiecare dată). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie apoasă 30% de NaCI (20 ml), uscate pe MgSO4, filtrate şi concentrate în vid. Produsul brut Compus 212 (0,278 g randament teoretic) a fost utilizat în etapa următoare fără purificare ulterioară.
Compus 212: LC/MS (ESI) m/z 1313,40[M+H]+.
Etapa 9
La o soluţie de Compus 212 (0,278 g, 0,212 mmol) în diclormetan (55,6 ml) la temperatura ambiantă s-au adăugat trietilamină (1,0 ml, 7,2 mmol) şi CCl4 (1,0 ml, 10 mmol). Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După completare (30 min), amestecul de reacţie a fost concentrat la ~20 ml în vid şi diluat cu MTBE (30 ml). Amestecul rezultat a fost spălat cu apă (10 ml) şi soluţie apoasă de NaCI 30% (10 ml fiecare) de două ori, uscat pe MgSO4, filtrat şi concentrat în vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 25 g, 20% până la 75% EtOAc în n-heptan) pentru a da 71 mg de Compus 213 (izomer SpRp), 43 mg de Compus 214 (fie izomer RpRp sau SpSp, rf mai mare la TLC (SiO2)), şi 24 mg de Compus 215 (fie izomer RpRp sau SpSp, rf mai mic la TLC (SiO2)).
Compus 213 (SpRp izomer) 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,58 (s, 1H), 8,44 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,46 (dd, J= 7,2, 15,4 Hz, 4H), 7,36 - 7,27 (m, 2H), 7,18 (q, J= 7,6 Hz, 4H), 6,09 (s, 1H), 5,98 (s, 1H), 6,06 - 5,95 (m, 2H), 5,25 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 5,21 (dd, J = 1,4, 10,4 Hz, 1H), 5,12 - 5,03 (m, 3H), 5,00 - 4,92 (m, 3H), 4,87 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 4,60 (d l, J = 11,7 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 4,44 (d l, J = 11,3 Hz, 1H), 4,39 - 4,32 (m, 2H), 4,26 - 4,08 (m, 8H), 3,75 (dd, J = 11,3, 16,0 Hz, 1H), 3,49 (dd, J = 8,2, 10,6 Hz, 1H), 2,82 - 2,72 (m, 3H), 2,61 (td, J= 5,9, 17,2 Hz, 1H), 0,99 (s, 9H), 0,96 (s, 9H), 0,32 (s, 3H), 0,23 (s, 6H), 0,22 (s, 3H).
Compus 214 (fie izomer RpRp sau SpSp, izomer rf mai mare pe TLC (SiO2) izomer): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,60 (s, 2H), 8,18 (s, 2H), 7,50 (d, J = 7,0 Hz, 4H), 7,37 - 7,31 (m, 2H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,05 - 5,93 (m, 4H), 5,22 (dd, J = 1,6, 17,2 Hz, 2H), 5,09 (dd, J = 1,0, 10,4 Hz, 2H), 5,00 - 4,83 (m, 6H), 4,61 (dd, J = 1,2, 11,7 Hz, 2H), 4,25 (dq, J = 4,3, 10,8 Hz, 2H), 4,09 (dd l, J = 3,7, 10,4 Hz, 2H), 4,04 (td, J = 5,5, 10,9 Hz, 2H), 3,99 - 3,88 (m, 4H), 3,70 (dd, J = 11,9, 15,0 Hz, 2H), 2,71 (td, J = 5,5, 17,1 Hz, 2H), 2,49 - 2,37 (m, 2H), 0,98 (s, 18H), 0,25 (s, 6H), 0,24 (s, 6H).
Compus 215 (fie izomer RpRp sau SpSp, izomer rf mai scăzut pe TLC (SiO2) izomer): 1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,54 (s, 2H), 8,06 (s, 2H), 7,47 - 7,44 (m, 4H), 7,32 - 7,27 (m, 2H), 7,20 - 7,15 (m, 4H), 6,06 - 5,95 (m, 2H), 5,92 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 5,22 (dd, J = 1,2, 17,2 Hz, 2H), 5,07 (dd, J = 1,4, 10,4 Hz, 2H), 5,04 - 4,94 (m, 6H), 4,62 - 4,52 (m, 2H), 4,46 - 4,40 (m, 2H), 4,40 - 4,22 (m, 8H), 3,81 (dd, J = 6,6, 12,1 Hz, 2H), 2,89 - 2,71 (m, 4H), 0,88 (s, 18H), 0,08 (s, 6H), -0,07 (s, 6H).
Etapa 10
La o soluţie de compus 213 (71 mg, 0,054 mmol) în toluen (28,4 ml) la reflux s-a adăugat o soluţie de Hoveyda-Grubbs Catalyst de a 2a Generaţie (17,0 mg, 0,027 mmol) şi P-benzochinonă (11,70 mg, 0,108 mmol) în toluen (8 ml). Amestecul a fost încălzit la reflux şi progresul reacţiei a fost monitorizat prin LC/MS. După 3 h, s-a adăugat catalizator suplimentar (8,5 mg, 0,0135 mmol) în toluen (2,5 ml) şi reacţia a fost continuată timp de încă 2,5 h. După răcire, amestecul a fost concentrat în vid şi purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel (SiO2 10 g, 33% până la 66% acetat de etil în n-heptan) pentru a da 17 mg de Compus 216 (trans/cis = 5/1) ca spumă maro uscată.
Compus 216: 1H RMN (numai izomer trans , 400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,37 (s, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,41 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,36 - 7,27 (m, 3H), 7,24 - 7,13 (m, 5H), 5,97 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 5,75 (td, J = 5,5, 15,2 Hz, 1H), 5,69 (td, J = 5,5, 15,6 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 5,1, 15,2 Hz, 1H), 4,94 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 4,85 (dd, J = 5,1, 15,2 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 4,67 (d l, J = 12,1 Hz, 1H), 4,45 (d l, J = 10,2 Hz, 1H), 4,42 - 4,34 (m, 2H), 4,28 - 4,19 (m, 2H), 4,19 - 4,06 (m, 4H), 3,96 - 3,84 (m, 1H), 3,82 - 3,68 (m, 1H), 3,56 (dd l, J = 12,1, 14,5 Hz, 1H), 3,33 (dd, J = 9,0, 10,9 Hz, 1H), 2,83 - 2,78 (m, 2H), 2,72 (td, J = 5,6, 16,6 Hz, 1H), 2,39 (td, J = 6,3, 17,2 Hz, 1H), 1,00 (s, 18H), 0,42 (s, 3H), 0,40 (s, 3H), 0,34 (s, 3H), 0,30 (s, 3H).
Compus 217
Compusul 214 obţinut din Etapa 9 a fost procesat separat prin Etapa 10 pentru a da Compusul 217 (amestec 5/1 de izomeri trans/cis).
1H RMN (numai izomer trans , 400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,47 (s, 2H), 8,14 (s, 2H), 7,43 - 7,38 (m, 4H), 7,36 - 7,29 (m, 2H), 7,22 (t, J = 7,0 Hz, 4H), 5,83 (s, 2H), 5,77 (t, J = 3,3 Hz, 2H), 5,17 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 5,11 - 5,04 (m, 2H), 4,70 (dd l, J = 3,5, 16,4 Hz, 2H), 4,62 (d l, J = 12,1 Hz, 2H), 4,16 - 4,08 (m, 6H), 3,93 (dd l, J = 3,7, 11,9 Hz, 2H), 3,74 - 3,64 (m, 2H), 3,49 (t, J = 12,9 Hz, 2H), 2,42 (td, J = 5,9, 18,4 Hz, 2H), 2,13 (ddd, J = 5,5, 7,8, 16,8 Hz, 2H), 1,00 (s, 18H), 0,40 (s, 6H), 0,34 (s, 6H).
Compus 218
Compusul 215 obţinut din Etapa 9 a fost procesat separat prin Etapa 10 pentru a da Compusul 218.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 8,14 (s, 2H), 8,12 (s, 2H), 7,49 - 7,43 (m, 2H), 7,36 - 7,27 (m, 4H), 7,19 - 7,12 (m, 4H), 5,96 (s, 2H), 5,67 - 5,54 (m, 2H), 4,95 - 4,82 (m, 4H), 4,69 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,60 - 4,09 (m, 12H), 3,63 (dd, J = 8,8, 16,2 Hz, 2H), 2,93 (td, J = 5,9, 17,2 Hz, 2H), 2,82 - 2,72 (m, 2H), 0,99 (s, 18H), 0,30 (s, 6H), 0,27 (s, 6H).
Etapa 11
La Compusul 216 (trans/cis = 5/1, 17 mg, 0,013 mmol) s-a adăugat o soluţie de metilamină (2 ml) (33% în EtOH) la temperatura ambiantă. Soluţia rezultată a fost agitată la temperatura ambiantă în timp ce a fost monitorizată prin LCMS. După terminare (1 h), amestecul de reacţie a fost concentrat în vid. La reziduu s-au adăugat piridină (0,9 ml), TEA (0,45 ml) şi trihidrofluorură de trietilamină (0,36 ml, 2,2 mmol). Amestecul rezultat a fost agitat la 50-60 °C timp de 4 h şi răcit la temperatura ambiantă. După deprotejarea TBS completă (monitorizată prin LCMS), amestecul de reacţie a fost tratat cu metoxitrimetilsilan (1,5 ml, 12 mmol) şi agitat timp de 1 h. S-a adăugat apă (3 ml) şi amestecul rezultat a fost extras cu toluen (3 ml de fiecare dată) de două ori şi EtOAc (2 ml de fiecare dată) de două ori. Stratul apos a fost filtrat prin filtru cu seringă şi filtratul a fost supus HPLC preparativă pentru a da 5,3 mg de Compus 38 şi 1,1 mg de Compus 220.
Compus 38 (SpRp, trans): 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9,27 (s l, 1H), 8,47 (s l, 1H), 8,21 (s l, 1H), 8,09 (s l, 1H), 6,19 - 5,96 (m, 2H), 5,94 - 5,71 (m, 2H), 5,13 - 4,68 (m, 2H), 4,55 - 4,39 (m, 2H), 4,38 - 4,23 (m, 1H), 4,20 - 3,91 (m, 5H), 3,75 - 3,50 (m, 4H).
Compus 220 (SpRp, cis): 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9,08 (s, 1H), 8,72 (s l, 1H), 8,55 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 6,22 - 6,14 (m, 2H), 6,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 5,01 (d, J= 3,9 Hz, 1H), 4,41 (d l, J= 9,8 Hz, 1H), 4,34 - 4,25 (m, 3H), 4,24 - 4,18 (m, 1H), 4,15 (dd, J= 6,1, 11,5 Hz, 1H), 4,08 - 3,99 (m, 4H), 3,71 - 3,57 (m, 3H).
Compusul 39 şi Compusul 222
Compusul 217 a fost procesat separat prin Etapa 11 pentru a da Compusul 39 şi Compusul 222.
Compus 39 (izomer trans): 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,83 (s l, 1H), 8,43 (s l, 1H), 8,17 (s l, 1H), 8,11 (s l, 1H), 6,17 - 5,95 (m, 2H), 5,93 - 5,63 (m, 2H), 5,10 - 4,78 (m, 2H), 4,69 - 4,53 (m, 1H), 4,52 - 4,35 (m, 2H), 4,12 - 3,92 (m, 5H), 3,76 - 3,44 (m, 4H).
Compus 222 (cis izomer): 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8,71 (s l, 2H), 8,18 (s, 2H), 6,17 - 6,06 (m, 4H), 4,37 (d l, J = 9,8 Hz, 2H), 4,33 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 4,27 (dd l, J = 7,0, 13,7 Hz, 2H), 4,06 (dd, J = 7,0, 11,3 Hz, 2H), 4,19 - 4,03 (m, 2H), 4,01 (d l, J = 9,8 Hz, 2H), 3,74 (ddd, J= 3,9, 6,4, 10,5 Hz, 2H).
Compus 40
Compusul 218 a fost procesat separat prin Etapa 11 pentru a da Compusul 40: 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9,34 - 8,88 (m, 2H), 8,73 (s l, 1H), 8,34 - 8,02 (m, 2H), 6,20 - 5,96 (m, 2H), 5,89 (s l, 2H), 5,25 - 4,95 (m, 2H), 4,76 - 4,64 (m, 1H), 4,47 - 4,22 (m, 2H), 4,20 - 4,07 (m, 2H), 4,07 - 3,93 (m, 2H), 3,82 - 3,55 (m, 3H), 3,54 - 3,38 (m, 2H)
Exemplul 24 - Sinteza Compusului 30
Compus 2 (1,1 mg, 1,4 µmol) a fost adăugat într-o soluţie de iodometil izopropil carbonat (13,75 mg, 0,056 mmol) în acetonă/apă (0,4/0,10 ml) la temperatura ambiantă. Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă în întuneric în timp ce reacţia a fost monitorizată prin LCMS. După completare (2 h), amestecul de reacţie a fost diluat cu apă (0,4 ml) şi extras cu n-neptan de trei ori (0,5 ml fiecare). Purificarea produsului brut în stratul apos a furnizat 0,5 mg de Compus 30.
1H RMN (400 MHz, CLOROFORM-d) δ = 7,92 (s, 2H), 7,72 (s l, 2H), 6,22 (d, J = 17,2 Hz, 2H), 6,19 - 6,03 (m, 2H), 5,98 (t l, J = 6,3 Hz, 2H), 5,82 - 5,77 (m, 2H), 5,68 (dd, J = 2,3, 51,6 Hz, 1H), 5,54 (dd, J = 10,9, 13,7 Hz, 2H), 5,48 (dd, J = 10,9, 12,9 Hz, 2H), 4,94 (quin, J = 6,2 Hz, 2H), 4,71 - 4,63 (m, 2H), 4,63 - 4,56 (m, 2H), 4,50 - 4,43 (m, 2H), 4,22 - 4,12 (m, 2H), 4,05 - 3,90 (m, 2H), 1,33 (d, J = 4,3 Hz, 6H), 1,32 (d, J = 4,3 Hz, 6H).
Exemplul 103 - Testul de raportare a activităţii agonistului HAQ STING
Celule THP1-Dual™ (InvivoGen, Cat# thpd-nfis) au fost aplicate pentru determinare EC50. Celule THP1-Dual™ au fost caracterizate pentru a transporta genotipul HAQ STING de către furnizorul Invivogen (Insight 201402-1). Celulele au fost crescute şi menţinute în condiţiile recomandate de producător. Inducerea căii factorului de reglare a interferonului (IRF) descrisă în manualul producătorului a fost urmată pentru determinarea EC50. Pe scurt, celulele au fost însămânţate şi tratate cu diferite concentraţii de compus timp de 20 h în timp ce au fost incubate la 37 °C, 5% CO2. Celulele au fost resuspendate şi s-a adăugat soluţie QUANTI-Luc™ (Cat. #: rep-qlc1). Emisia de lumină rezultată a fost măsurată cu luminometru (Envision, Perkin Elmer). Semnalele obţinute au fost reprezentate grafic şi EC50 a fost calculat cu software-ul GraphPad Prism7.
Valorile EC50 sunt raportate în Tabelele 4-8 de mai jos. Valorile EC50 pot fi dintr-un singur test sau o medie a testelor multiple. Înaintea fiecărui tabel este o structură utilizată pentru revizuirea tabelului respectiv.
TABELUL 4
Linker (atomi de carbon în lanţ între (m) şi (n), inclusiv) Xa la 2' P chiralitate Număr compus EC50 STING uman (µM) lungime m n geometrie 2' faţă 3' faţă HAQ WT AQ REF Linker 4 de carbon 1 1 trans S S 223 * N/E N/E N/E Xa= OH S R 13 26,7 N/E N/E N/E R R 14 58,2 69,8 * * cis S R * N/E N/E N/E S S 225 * N/E N/E N/E N/E N/E N/E TBD Neaplicabil (ester fosfodi) 226 * N/E N/E N/E TBD 227 * N/E N/E N/E 228 * N/E N/E N/E trans Xa= F S R 15 24,7 11,6 13,1 66,7 R R 16 28,8 25,7 20,4 66,7 cis R R 229 * N/E N/E N/E Linker 5 de carbon 2 1 trans Xa= OH R R 230 * N/E N/E N/E TBD 231 * N/E N/E Trans (2:1 mix) TBD 232 * N/E N/E Trans (3:1 mix) S R 233 * N/E N/E N/E 1 2 trans S R 234 * N/E N/E N/E TBD 235 * N/E N/E TBD 236 * N/E N/E cis S R 237 * N/E N/E N/E TBD 238 * N/E N/E TBD R R 239 * N/E N/E N/E S R 240 * N/E Linker 6 de carbon 2 2 TBD S R 241 * N/E N/E N/E TBD S R 242 * N/E N/E N/E TBD R R 243 * N/E N/E N/E * Indică activitatea nu a fost măsurabilă în intervalul de concentraţie experimentală.
"N/E" indică "neevaluat".
EC50 STING uman (µM) a fost măsurat utilizând forma de sare de amoniu a fiecărui compus din Tabelul 4.
TABELUL 5
4 carbon Legături P Număr compus EC50 STING uman (µ M) linkeri (între NH în lanţ) chiralitate Xb HAQ WT AQ REF trans - Xa= OH 9 39,2 18,0 30,9 31,7 RR 30 N.D. N.D. N.D. N.D. SR -SH 1 4,1 0,9 1,2 4,8 SS 3 16,4 9,9 13,7 42,7 RR 2 6,1 3,4 3,5 11,4 Trans/cis mix RR 10 17,9 9,0 10,2 34,3 cis SS 244 * >100 >100 >100 RR 4 10,6 3,9 8,2 >100 SR 5 87,1 49,1 >100 >100 saturat SR 6 10,5 5,7 9,0 42,0 5C cis/trans TBD N.D. 245 * N/E N/E N/E 246 * N/E N/E N/E 5C trans N.D. 8 69,7 68,7 81,0 >100 5C trans N.D. 7** 10,7 8,0 9,0 66,7 5C trans N.D. 37 87,2 >100 82,2 >100 5C trans N.D. 11 6,8 N/E N/E N/E 5C trans N.D. 12 8,2 N/E N/E N/E * Indică activitatea nu a fost măsurabilă în intervalul de concentraţie experimentală. **Compusul 7 este un amestec 1:1 de Compus 11 şi Compus 12. "N/E" indică "nedisponibil". "N.D." indică "nedeterminat."
EC50 STING uman (µM) a fost măsurat utilizând forma de sare de amoniu a fiecărui compus listat în Tabelul 5.
TABELUL 6
Pereche de bază Xc= Y= geometrie P chiralitate Număr compus EC50 hSTING (µM) HAQ REF AG NH2 cis N.D. 247 * N/E trans 22 41,2 N/E N.D. 21 83,3 N/E TBD 23 62,3 N/E AI cis 248 * N/E 249 * N/E trans 18 2,3 N/E 19 94,1 N/E 20 2,8 N/E II SH RR 26 2,3 7,4 H SR 33 21,5 * RR 34 2,3 * SS 250 * * - SR 35 44,5 67,2 SR 36 31,4 94,1 AA SR 32 15,7 * SR 29 0,62 8,4 trans SR 25 0,73 3,0 Xa= OH S 27 9,8 27,6 R 28 10,2 18,4 * Indică activitatea nu a fost măsurabilă în intervalul de concentraţie experimentală. "N/E" indică "neevaluat". "N.D." indică "nedeterminat."
EC50 STING uman (µM) a fost măsurat utilizând forma de sare de amoniu a fiecărui compus listat în Tabelul 6, cu excepţia Compusului 26, Compusului 31, Compusului 33 şi Compusului 34, toate acestea fiind testate ca săruri bis-TEA.
TABELUL 7
Pereche de bază geometrie P chiralitate Număr compus EC50 hSTING (µM) HAQ REF AA trans SS sau RR 251 * * SS sau RR 252 * * RR 31 20,2 * * Indică activitatea nu a fost măsurabilă în intervalul de concentraţie experimentală.
EC50 STING uman (µM) a fost măsurat utilizând forma de sare de amoniu a fiecărui compus din Tabelul 7.
Tabelul 8
Xd= geometrie P chiralitate Număr compus EC50 hSTING (µM) HAQ REF Xa= OH trans SR 38 79,9 * SS sau RR 39 29,6 * * Indică activitatea nu a fost măsurabilă în intervalul de concentraţie experimentală.
EC50 STING uman (µM) a fost măsurat utilizând forma de sare de amoniu a fiecărui compus din Tabelul 8.
Exemplul 104 - Testul de raportare specific variantei STING
STING uman are 4 variante majore, inclusiv variantele WT, HAQ, REF şi AQ. REF-STING, denumit şi R232H, de exemplu, apare la aproximativ 14% din populaţia umană. Comparativ cu alela de tip sălbatic, R232H are un răspuns scăzut la dinucleotidele ciclice bacteriene şi metazoare. Detaliile acestor 4 variante majore, precum şi alte variante rare sunt raportate de Yi G, şi colab., "Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotids" PLoS One 2013; 8:e77846. Liniile celulare reporter specifice variantei STING au fost stabilite prin utilizarea celulelor THP1-Dual™ KO-STING (InvivoGen, Cat # thpd-kostg) şi trei vectori de expresie a proteinei varianta STING. Harta vectorului de expresie pentru WT STING este prezentată în FIG. 6. Pentru ceilalţi doi vectori de expresie, în acel vector au fost utilizate secvenţe diferite de varianta STING, cu WT STING înlocuită cu secvenţa de nucleotide corespunzătoare.
Vectorii care exprimă varianta STING pentru WT-STING, REF-STING şi AQ-STING au fost preparaţi şi transfectaţi stabil în celule THP1-Dual™ KO-STING pentru a prepara teste reporter specifice variantei STING pentru WT-STING, REF-STING şi AQ -STING, respectiv. Valorile EC50 au fost determinate aşa cum este descris mai sus în Exemplul 103 pentru testul de raportare a activităţii agonistului HAQ STING. Rezultatele sunt prezentate mai jos în Tabelul 9. Secvenţele de ADN utilizate pentru aceste variante STING sunt prezentate în SECV ID NR: 1 (Secvenţa de nucleotide a WT STING uman), SECV ID NR: 2 (Secvenţa de nucleotide a REF STING uman) şi SECV ID NR: 3 (Secvenţa de nucleotide a AQ Sting uman).
WT STING uman:
REF STING uman:
AQ STING uman:
Exemplul 105 -- Testul de raportare a activităţii agonistului STING la şoarece
Celule RAW-Lucia™ ISG (InvivoGen, Cat# rawl-isg) au fost utilizate pentru un test de raportare a agonistului STING la şoarece. Valorile EC50 au fost determinate aşa cum este descris mai sus în Exemplul 103 în testul de raportare a activităţii agonistului HAQ STING. Rezultatele sunt prezentate mai jos în Tabelul 9.
Exemplul 106 - Test de fluorimetrie cu scanare diferenţială (DSF).
Un test DSF a fost folosit pentru a măsura interacţiunea fizică dintre compus şi proteina STING recombinantă. Proteina STING recombinantă trunchiată (a.a.155-341) (SECV ID NR: 4) a fost exprimată în E. coli şi izolată pentru test, aşa cum este descris mai jos. Matricea de analiză a fost preparată în plăci cu 384 de godeuri până la un volum final de 10 µl per godeu constând din 1 µM proteină STING recombinată (a.a. 155-341) (SECV ID NR: 4), 100 mM PBS pH 7,4, suplimentat cu 100 mM KC1, colorant portocaliu 5X SYPRO şi compus 50 µM (concentraţie finală de DMSO 0 - 1%. Testele au fost efectuate pe un sistem QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System folosind un gradient de temperatură de la 25 °C la 95 °C la o viteză de 0,05 °C/min şi filtre de excitare şi emisie la 470 şi, respectiv, 586 nm. Conform curbelor derivate de fluorescenţă atribuite de software-ul Applied Biosystems® Protein Thermal Shift (versiunea algoritmului 1.3.), s-a calculat topirea termică (Tm) a proteinei STING recombinate nelegate şi legate de ligand proteinei STING recombinante şi diferenţa de topire termică (dTm D).
În general, compuşii cu valori ΔTm mai mari decât 0 sunt consideraţi a avea o interacţiune fizică cu proteina testată, iar valoarea ΔTm este asociată pozitiv cu afinitatea de legare a compusului. Aici, Compusul 1a a arătat ΔTm de 17,6 (Tabelul 9), indicând interacţiunea fizică cu proteina STING.
Tabelul 9 Caracterizarea compusului 1a in vitro
Compus EC50 de STING uman (µM) EC50 de STING de şoarece (µM) DSF WT STING ΔTm (°C) WT HAQ REF AQ 1a 0,9 4,1 4,8 1,2 3,4 17,6
Exemplul 107 --Test de stimulare PBMC umană ex vivo
Sânge uman de la 5 donatori sănătoşi a fost colectat folosind tuburi cu heparină sodică BD Vacutainer de 10,0 ml (cat# 367874). Izolarea celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC) a fost realizată utilizând tuburi SIGMA ACCUSPIN 50 ml (cat# A2055) şi sigma ACCUSPIN System-HISTOPAQUE-1077 (cat# A7054) folosind protocolul furnizat de producător. Stratul de PBMC a fost recoltat şi spălat cu soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) 1x aşa cum este sugerat de Sigma. PBMC au fost numărate şi în final suspendate la 1x10e6/ml în RPMI (coring cat # 10-041-CV) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) (Gibco cat # 20140.79). 1 ml de celule (1x10e6) au fost transferate în eprubetă Falcon de 5 ml cu fund rotund din polipropilenă (cat # 352063) şi stimulate cu diferite concentraţii (0, 0,1, 1, 10 uM) timp de 24 de ore într-un incubator cu 5% CO2 la 37°C.
După 24 de ore de incubare, tuburile au fost centrifugate la 1400 rpm timp de 5 minute şi supernatanţii au fost recoltaţi. Supernatantul a fost depozitat la -80 °C pentru măsurarea ulterioară a IFNβ. Măsurarea IFNβ a fost efectuată utilizând kitul de bază IFN-β uman (Meso Scale Diagnostics cat # K151ADA) şi a fost utilizat protocolul furnizat de producător. Estimarea IFN-beta a fost realizată prin citirea plăcii de testare la MESO SECTOR Imager 2400 şi folosind programul MSD Discovery Workbench 4.0. După 24 de ore, proteina IFNβ a fost analizată. Rezultatele au arătat că compusul 1a poate induce producţia primară de proteină PBMC IFNβ umană într-o manieră dependentă de doză.
Rezultatele prezentate în Tabelul 10 reflectă o medie a măsurătorilor efectuate folosind cinci donatori diferiţi.
Tabelul 10 Test de stimulare PBMC umană ex vivo
PBS (Control) Compus 1a 0,1µM 1µM 10µM IFNβ (pg/ml) 0 21,3±17,8 227,5±62,4 540,2±215,0
Pentru cuantificarea ARNm IFNβ, ARN-ul total a fost izolat utilizând kitul RNeasy Mini (Qiagen, Germania) conform protocolului producătorului. ARNm IFNβ a fost cuantificat prin test qPCR. Pe scurt, ARN-ul total (400 ng până la 1000 ng) a fost convertit în ADNc într-un volum de reacţie de 60 µl utilizând SuperScript VILO MasterMix (Life Technologies, SUA). ADNc-urile obţinute (10 ng) au fost ulterior amplificate utilizând testele de expresie Applied Biosystems TaqMan folosind primeri specifici ARN pentru IFNB1 (Hs01077958_s1) şi GAPDH (Hs99999905_m1). O analiză qPCR a fost efectuată cu TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, SUA) pe sistemul Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex Real-Time PCR, cu o etapă iniţială de 2 min la 50°C urmată de 95°C timp de 2 s şi 40 de cicluri de 95 °C timp de 1 s şi 60 °C timp de 20 s. Expresia relativă a genei a fost calculată după normalizare faţă de gena de referinţă GAPDH folosind metoda 2-ΔΔCT. Calculele au fost efectuate folosind software-ul Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex v1.2.2. Modificările orificiului ARNm IFNβ faţă de probele tratate cu vehicul sunt rezumate în Tabelul 11. Rezultatele au arătat că compusul 1a poate induce ARNm IFNβ în PBMC primar într-o manieră dependentă de doză şi timp. Tabelul 11 arată o medie calculată de la cinci donatori diferiţi.
Tabelul 11 -- Test de stimulare PBMC umană ex vivo de 3 h şi 24 h (ARNm)
ARNm IFNβ (modificări multe faţă de probele tratate cu vehicul) Compus 1a 0,1µM 1µM 10µM tratament 3-h 51,0 ± 21,7 219,8 ± 69,8 1973,3 ± 1023,0 tratament 24-h 28,1 ±28,9 10652,3 ± 4992,4 24157,3 ± 9224,2
Exemplul 108 -- Efectul anticancer al compusului 1a asupra modelului de tumoare duală CT26
Compusul 1a a fost testat pentru activitatea sa anticanceroasă în modelul de tumoare duală CT26, care este un model de cancer de colon la şoarece. Femele de şoareci Balb/cJ în vârstă de 5-6 săptămâni (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) au fost implantate subcutanat cu celule tumorale CT26 pe ambele părţi ale fiecărui animal, 105 celule pentru fiecare parte. Pentru studiul A, tratamentul a fost început la 5 zile (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg şi 5 mg/kg) după implantarea tumorii, când tumorile medii au ajuns la aproximativ 100 mm3. Pentru studiul B, tratamentul a fost început la 8 zile (0,6 mg/kg şi 10 mg/kg) după implantarea tumorii, când tumorile medii au ajuns la aproximativ 120 mm3. Schema de tratament este descrisă în Tabelul 12 şi Tabelul 13.
Tabelul 12 Schema de dozare pentru studiul A
Grup Nr. de animale Tratament Calea şi programarea A 6 Vehicul (1 x PBS) I.T.*; doză singură B 6 5 mg/kg compus 1a I.T.; doză singură C 6 2,5 mg/kg compus 1a I.T.; doză singură D 6 1,25 mg/kg compus 1a I.T.; doză singură *I.T. este intratumoral.
Tabelul 13 Schema de dozare pentru studiu B
Grup Nr. de animale Tratament Calea şi programarea A 5 Vehicul (1 x PBS) I.T.*; doză singură B 5 10 mg/kg compus 1a I.T.; doză singură C 5 0,6 mg/kg compus 1a I.T.; doză singură *I.T. este intratumoral.
Toţi şoarecii din studiu au două tumori CT26 subcutanate. "Tumoarea tratată" indică tumoarea cu administrare directă a compusului, în timp ce "tumoare netratată" indică tumoarea fără administrare directă a compusului. Volumul tumorii a fost urmărit pe tot parcursul experimentului. Volumul tumorii este măsurat de două ori pe săptămână după începerea tratamentului. Sarcina tumorală este calculată din măsurătorile şublerului cu formula pentru volumul unui elipsoid prolat (LxW2)/2 unde L şi W sunt măsurătorile respective de lungime şi lăţime ortogonale (mm).
Compusul 1a a arătat activitate puternică şi curativă în modelul de tumoare duală CT26 (FIG. 7 şi FIG. 8). Pentru tumorile tratate, a fost detectată o rată de vindecare de 20% chiar şi la cea mai mică doză testată în studiu (Figura 8, doză de 0,6 mg/kg). În acelaşi timp, cea mai mare doză (10 mg/kg) a vindecat 100% dintre animalele cu acea tumoare la sfârşitul studiului. Pentru tumorile netratate, a fost evident şi un efect antitumoral dependent de doză. Grupul cu doză superioară (10 mg/kg) a prezentat efecte curative de 80%; toate dozele mai mici au prezentat şi activitate de inhibare a creşterii tumorii. Prin urmare, a fost observată o fereastră terapeutică de 0,6 mg/kg până la 10 mg/kg pentru compusul 1a, cu activitate antitumorală observată nu numai local, ci şi sistemic, pe baza efectelor la locul tumorii distale neinjectate. În concluzie, aceste rezultate indică faptul că administrarea locală a compusului 1a poate induce activitate anti-cancer atât locală, cât şi sistemică (abscopală).
Exemplul 109 -- Efectul anti-cancer al compusului 1a asupra modelului metastatic hepatic CT26
Compusul 1a a fost testat pentru activitatea sa anti-cancer într-un model metastatic hepatic CT26. şoareci femele BALB/cJ în vârstă de 5-6 săptămâni anesteziaţi (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) au fost implantaţi intra-splenic cu celule tumorale CT26 care exprimă luciferaza (5 x 105 celule per şoarece). O perioadă ulterioară de aşteptare de zece minute a permis celulelor tumorale să circule în ficatul animalelor. Splinele au fost apoi îndepărtate şi animalele au fost suturate şi lăsate să se recupereze. Trei zile mai târziu, celulele tumorale CT26 (105 celule per şoarece) au fost din nou implantate, de data aceasta subcutanat (sc) sub zona membrului anterior drept, pentru a permite dezvoltarea unei mase tumorale pentru administrarea compusului. La nouă zile după injectarea intra-splenică, compusul (10 mg/kg) a fost administrat intratumoral, o singură dată, în tumora sc.
Efectul local anti-cancer al compusului a fost măsurat prin efectul său asupra tumorii sc, în timp ce efectul abscopal al compusului a fost evaluat prin supravieţuirea globală a şoarecilor trataţi în comparaţie cu şoarecii martor trataţi cu vehicul, pe baza efectului dăunător al masei tumorale în creştere în fiecare ficat de şoarece. Compusul 1a a arătat atât activitate puternică faţă de tumorile sc locale, cât şi activitate sistemică curativă la 9 din 10 animale tratate (FIG. 9). 9). Aceste rezultate indică faptul că administrarea locală a compusului 1a poate induce atât activitate anti-cancer locală, cât şi sistemică (abscopală), inclusiv leziuni profunde, cum ar fi în ficat.
Exemplul 110 -- Efectul anticancer al compusului 1a asupra modelului ortotopic al creierului GL261
Compusul 1a a fost testat pentru activitatea sa anti-cancer într-un model ortotopic cerebral GL261. GL261 este o linie celulară de gliom murin. Celule de gliom de şoarece care exprimă luciferaza GL261 (2x104 celule/şoarece) au fost implantate intracranian în şoareci albino B6 femele de 5-6 săptămâni (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). Trei până la 4 zile mai târziu, celulele GL261 au fost implantate subcutanat (106 celule/şoarece) sub zona membrului anterior drept pentru a permite dezvoltarea unei mase tumorale pentru administrarea compusului. La zece zile după implantarea celulelor tumorale intracraniene, compusul (10 mg/kg) a fost administrat intratumoral, o singură dată, în tumoarea sc. Efectul local anti-cancer al compusului a fost măsurat prin efectul său asupra tumorii sc, în timp ce efectul abscopal al compusului a fost evaluat prin supravieţuirea globală a şoarecilor trataţi în comparaţie cu şoarecii martor trataţi cu vehicul, pe baza efectului dăunător al masei tumorale în creştere în fiecare creier de şoarece. Compusul 1a a prezentat atât activitate puternică la tumorile sc locale, cât şi activitate sistemică curativă la 5 din 8 animale tratate (FIG. 10). Aceste rezultate indică faptul că administrarea locală a compusului 1a poate induce atât activitate anti-cancer locală, cât şi sistemică (abscopală), inclusiv leziuni profunde, cum ar fi în creier.
Exemplul 111 - Complex de confirmare a structurii cu raze X cu WT STING
Pentru a înţelege în continuare mecanismul de legare a ţintei noilor noştri compuşi, a fost determinată structura cristalină cu raze X a WT STING în complex cu compuşii.
A. Exprimarea şi purificarea domeniului C-terminal WT STING (reziduul 155-341)
Secvenţa de ADN care codifică proteina STING umană WT de la aminoacidul 155 la 341 (SECV ID NR: 4) a fost clonată în vectorul pET21b, urmând o etichetă His-TEV-Sumo la capătul său N-terminal (SECV ID NR: 5). Secvenţa pET21b a fost depusă în addgene şi este disponibilă aici: addgene.org/vector-database/2550/; secvenţa respectivă este încorporată prin referinţă aici.
Codonul E coli BL21 (DE3) plus celulele au fost transformate cu această plasmidă, iar expresia proteinei recombinante a fost indusă cu 0,1 mM izopropil β-D-1-tiogalactopiranozidă (IPTG). Proteina a fost purificată din fracţia solubilă a lizatului celular prin cromatografie de afinitate Ni-NTA. Eticheta His-TEV-Sumo a fost îndepărtată de sumo protează şi a fost separată de WT STING 155-341 fără etichetă, utilizând o a doua coloană de afinitate Ni-NTA. Proteina a fost purificată în continuare prin cromatografie cu schimb de anioni şi cu excludere a mărimii şi a fost stocată într-un tampon care conţine 20 mM Tris·HCl pH 7,5 şi 150 mM NaCI la o concentraţie de 35 mg/ml.
B. Cristalizarea şi determinarea structurii domeniului C-terminal WT STING în complex cu Compusul 1
Pentru a co-cristaliza WT STING 155-341, cu Compusul 1, proteina WT STING a fost diluată la 10 mg/ml folosind tampon de stocare (20 mM Tris HCI pH 7,5 şi 150 mM NaCI) şi amestecată cu Compusul 1 (100 mM stoc în DMSO) în raport molar 1:5. Amestecul a fost incubat timp de 4 ore la 4 °C şi centrifugat la 13.000 rpm timp de 20 min înainte de cristalizare. Tăvile ecranului de cristalizare au fost instalate folosind metoda de difuzie a vaporilor cu picătură suspendată la 18°C. Cristalele au fost crescute prin amestecarea a 1 µl de soluţie WT STING/Compus 1 cu un volum egal de soluţie de godeu, care conţine 100 mM HEPES pH 7,5, 200 mM CaCl2 şi 15% (greutate/vol) PEG 8000. 20% (greutate/vol) PEG 400 a fost utilizat ca reactiv crioprotector atunci când cristalele au fost congelate rapid în azot lichid. Seturile de date de difracţie au fost colectate cu un detector Pilatus la linia de lumină SSRF BL19U1 şi procesate cu HKL3000 şi programul SCALEPACK2MTZ în suita de software CCP4.
Structura WT STING 155-341 legat de Compusul 1 a fost determinată prin înlocuire moleculară utilizând programul PHASER (Maximum Likelihood Molecular Replacement), cu PDB ID 4F9E ca model de căutare iniţial. Prezenţa compusului 1 între interfaţa dimerului WT STING a fost confirmată într-o hartă a diferenţelor Fo-Fc calculată cu fazele modelului. Modelul a fost construit şi completat manual cu programul Coot şi rafinat cu programul Refmac5 în suita de software CCP4. Structura finală rafinată a fost raportată la o rezoluţie de 2,38 Е în grupul spaţial P212121 cu celula unitară măsurată la a = 33,820, b = 78,110, c = 132,212, α = 90,00, β = 90,00, y = 90,00. Două copii ale WT STING 155-341 au fost identificate în fiecare unitate asimetrică care se leagă la o moleculă de compus 1 la interfaţa dimerului.
C. Interacţiunea compusului 1 cu WT STING observată în structura cristalină cu raze X
FIG. 11 prezintă o imagine a structurii cristaline cu raze X a WT STING uman în complex cu Compusul 1. Am examinat structura cristalină cu raze X a WT STING uman în complexul cu compusul 1, care a fost co-cristalizat dintr-o probă de compus 1a. Compusul se leagă la un buzunar de interfaţă format dintr-un dimer al proteinei WT STING. Cele două feţe ale bazei adeninei ale compusului formează interacţiunea de stivuire π-π cu Tyr240 şi, respectiv, gruparea guanidină a Arg238. Linkerul trans olefină formează interacţiunea van der Waals cu porţiunea alifatică a lanţului lateral al Arg 238. Substituentul fluor din poziţia C2' a grupului riboză al compusului se cuibăreşte într-o gaură hidrofobă definită de Thr263, Pro264 şi Tyr163. Gruparea tiofosfat încărcată negativ a compusului formează o punte de sare cu interacţiunile Arg238 şi legare-H cu Ser162 şi, respectiv, Thr267. În plus, gruparea tiofosfat formează, de asemenea, interacţiune electrostatică cu gruparea guanidină a Arg 232. Regiunea buclei LID a WT STING, constând din reziduul 226 până la 243, se înfăşoară în jurul celor două grupuri de bază şi al linkerului trans olefină.
Exemplul 112 - Determinarea structurii cristaline cu raze X a REF STING în complex cu Compusul 1.
A. Exprimarea şi purificarea domeniului C-terminal REF STING (rezidu 155-341, SECV ID NR: 6)
Secvenţa de ADN care codifică proteina umană REF STING de la aminoacidul 155 la 341 (SECV ID NR: 6) a fost clonată în vectorul pET21b, urmând o etichetă His-TEV-Sumo la capătul său N-terminal (SECV ID NR: 7). Secvenţa pET21b a fost depusă în addgene şi este disponibilă aici: addgene.org/vector-database/2550/; secvenţa respectivă este încorporată prin referinţă aici.
Codonul E coli BL21 (DE3) plus celulele au fost transformate cu această plasmidă, iar expresia proteinei recombinante a fost indusă cu 0,1 mM izopropil β-D-1-tiogalactopiranozidă (IPTG). Proteina a fost purificată din fracţia solubilă a lizatului celular prin cromatografie de afinitate Ni-NTA. Eticheta His-TEV-Sumo a fost îndepărtată de proteaza sumo şi a fost separată de REF STING_155-341 fără etichetă folosind o a doua coloană de afinitate Ni-NTA. Proteina a fost purificată în continuare prin cromatografie cu schimb de anioni şi cu excludere a mărimii şi a fost stocată într-un tampon care conţine 20 mM Tris·HCl pH 7,5 şi 150 mM NaCI la o concentraţie de 24 mg/ml.
B. Cristalizarea şi determinarea structurii domeniului C-terminal REF STING în complex cu Compusul 1
Pentru a co-cristaliza REF STING_155-341 cu Compusul 1, proteina REF STING a fost diluată la 10 mg/ml folosind tampon de stocare (20 mM Tris HCI pH 7,5 şi 150 mM NaCI) şi amestecată cu Compusul 1 (100 mM stoc în DMSO) în raport molar 1:5. Amestecul a fost incubat timp de 4 ore la 4 °C şi centrifugat la 13.000 rpm timp de 20 min înainte de cristalizare. Tăvile ecranului de cristalizare au fost setate folosind metoda de difuzie a vaporilor cu picătură suspendată la 18°C. Cristalele au fost crescute prin amestecarea a 1 µl de soluţie REF STING/Compus 1 cu un volum egal de soluţie de godeu, care conţine 100 mM HEPES pH 7,5, 200 mM CaCl2 şi 15% (gr/vol) PEG 8000. 20% (greutate/vol) PEG 400 a fost utilizat ca reactiv crioprotector atunci când cristalele au fost congelate rapid în azot lichid. Seturile de date de difracţie au fost colectate cu un detector Pilatus la linia de lumină SSRF BL18U1 şi procesate cu HKL3000 şi programul SCALEPACK2MTZ în suita de software CCP4. Această structură este arătată în FIG. 12.
Structura REF STING 155-341, legată de Compusul 1 a fost determinată prin înlocuire moleculară utilizând programul PHASER (Maximum Likelihood Molecular Replacement), folosind structura WT STING 155-341 determinată anterior (aşa cum este descris mai sus) ca model de căutare iniţial. Prezenţa compusului 1 între interfaţa dimerului REF STING a fost confirmată într-o hartă a diferenţelor Fo-Fc calculată cu fazele modelului. Modelul a fost construit şi completat manual cu programul Coot şi rafinat cu programul Refmac5 în suita de software CCP4. Structura finală rafinată a fost raportată la o rezoluţie de 2,76 Е în grupul spaţial P212121 cu celula unitară măsurată la a = 33,733, b = 77,831, c = 131,689, α = 90,00, β = 90,00, y = 90,00. Două copii ale REF STING 155-341 au fost identificate în fiecare unitate asimetrică care se leagă la o moleculă de Compus 1 la interfaţa dimerului.
C. Interacţiunea compusului 1 cu REF STING observată în structura cristalină cu raze X
FIG. 12 prezintă structura cristalină cu raze X a REF STING uman în complex cu Compusul 1, care a fost co-cristalizat dintr-o probă de Compus 1a. Compusul se leagă la un buzunar de interfaţă format dintr-un dimer al proteinei STING. Cele două feţe ale bazei adeninei ale compusului formează interacţiunea de stivuire π-π cu Tyr240 şi, respectiv, gruparea guanidină a Arg238. Linkerul trans olefină formează interacţiunea van der Waals cu porţiunea alifatică a lanţului lateral al Arg238, în timp ce porţiunea guanidină a lanţului lateral al Arg238 formează interacţiunea de stivuire π-π cu gruparea imidazol a lanţului lateral al His232 din exterior. Linkerul de olefină este în contact cu perechea de interacţiune a lanţurilor laterale ale Arg238 şi His232. Substituentul fluor din poziţia C2' a grupului riboză al compusului se cuibăreşte într-o gaură hidrofobă definită de Thr263, Pro264 şi Tyr163. Gruparea tiofosfat încărcată negativ a compusului formează o punte de sare cu interacţiunile Arg238 şi legare-H cu Ser162 şi, respectiv, Thr267. Regiunea buclei LID a REF STING, constând din reziduul 226 până la 243, se înfăşoară în jurul celor două grupuri de bază şi al linkerului trans olefină.
Exemplul 113 - Comparaţii
Valorile EC50 au fost calculate pentru testele STING umane ale WT STING, HAQ STING, AQ STING şi REF STING, în comparaţii cap la cap utilizând Compusul 1a din prezenta dezvăluire, un ligand STING natural (2'3' cGAMP) şi presupusul agonist STING ML RR-S2 CDA, aşa cum este raportat în Corrales, şi colab., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity," Cell Reports (2015) 11:1018-1030, care este încorporat ca referinţă aici. Testele au fost efectuate aşa cum este descris în exemplele prezentate mai sus. Reţineţi că valorile de analiză raportate în Tabelul 14 au fost limitate la testele efectuate în comparaţiile cap la cap şi este posibil să nu reflecte valorile medii determinate pe un număr mai mare de încercări, aşa cum este raportat în Tabelul 5 sau în altă parte. Reţineţi în continuare că "2'3' cGAMP" este acelaşi cu "ML cGAMP" aşa cum este raportat în Rapoartele celulelor publicate.
Tabelul 14
Compus Kd (WT) (µM) EC50 uman (mM) (test de 20-h) WT HAQ AQ REF 2'3' cGAMP 0,07 61,7 57,9 56,5 33-100 ML RR-S2 CDA 0,4 5,9 8,4 5,5 >100 Compus 1a 0,04 0,6 1,9 1,0 3,9
Tabelul 14 prezintă, de asemenea, constantele de legare de disociere (Kd) pentru legarea WT STING umană la fiecare dintre cei trei compuşi testaţi, măsurate prin calorimetrie de titrare izotermă (ITC). ITC este o tehnică de titrare microcalorimetică care măsoară proprietăţile termodinamice asociate cu interacţiunile intermoleculare. Pe baza acestor teste, Compusul 1a pare să formeze cea mai puternică legătură cu WT STING dintre compuşii testaţi.
Materiale
Proteina umană recombinantă de tip sălbatic STING (aa, 139-379, H232R) a fost generată prin exprimarea unui construct în E coli care codifică un domeniu citozolic al WT STING uman cuprinzând aminoacizii 139-379.
Reactivi
Sursele de reactivi utilizaţi în acest studiu sunt prezentate mai jos:
Reactiv Sursa Catalog Nr. IX PBS fără Calciu sau Magneziu Corning 21-040-CV Apă MilliQ-deionizată MilliQ Z000Q0V0T0 Liquinox Alconox 1201 NaOH EM SXO593-1 Metanol EMD Millipore MX0475-1 Compuşi: Compus 1a 2'3' cGAMP ML RR-S2 CDA
Prepararea tamponului proteic
Proteina STING a fost stocată la -60 °C în alicote de 90 µl şi 100 µl fiecare la o concentraţie de 3,0 mg/ml şi respectiv 20 mg/ml, în PBS, pH 7,5 care conţine 5% glicerol. În ziua analizei, alicotele de proteină au fost dezgheţate, diluate la 400 µl şi schimbate cu tampon în PBS utilizând o unitate de filtru centrifugal Amicon Ultra (limită de 10k MW, 0,5 ml) cu cel puţin patru centrifugări de 10 min 14000 xg cu un Eppendorf de microcentrifugă şi apoi se diluează în final la 20 µM până la 30 µM (dependent de experiment) cu IX PBS. Concentraţia de proteine a fost determinată folosind un spectrofotometru Nanodrop 2000 şi un coeficient de extincţie a proteinei de 22140 (M-1cm-1).
Preparare eşantion
Două sute µl de soluţii stoc 1 mM de compus 1a, 2'3' cGAMP şi ML RR-S2CDA au fost furnizate prin tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml. Înainte de fiecare experiment, probele au fost diluate la concentraţii de 200 uM până la 500 uM (dependent de experiment).
Metode
Testele au fost efectuate pe o unitate Affinity ITC (TA Instruments nr. 609003.901) echipată cu accesoriu de curăţare ITC (TA Instruments nr. 601800.901). Soluţia de proteină STING, aproximativ 400 µl care a conţinur 20 µM până la 30 µM proteină STING, a fost pipetată în celula de calorimetru de 185 µl permiţând o supraîncărcare acceptabilă. Celula de referinţă a conţinut o cantitate echivalentă de apă Milli-Q. Incubarea a fost efectuată la 25 °C cu injecţii de 20 x 2,5 µl de compuşi de la 100 µM până la 300 µM. Software-ul de control a fost ITC Run Ver. 3.3.0.0 (TA Instruments) a fost utilizat pentru a obţine termogramele constând din mai multe vârfuri de căldură brută (µcal/sec) reprezentând viteza căldurii la fiecare injecţie. Software-ul de analiză Nano Analyze Ver. 3,70 (TA Instruments) a fost utilizat pentru a corecta linia de bază, pentru a corecta pentru martor sau pentru căldura de diluţie a probei (la saturaţie) şi pentru a integra vârfurile vitezei căldurii producând valorile "Q" reprezentate grafic. Izotermele rezultate au fost potrivite cu un model independent pentru a deriva parametrii termodinamici.
Valorile Kds şi n (raporturile molare la punctele de inflexiune ale curbei) au fost derivate şi raportate. Condiţiile optime pentru concentraţiile de proteină şi ligand au fost derivate din experimente preliminare.
Rezultate
Au fost determinate termogramele vitezei căldurii şi izotermele rezultate ale acestora pentru legarea compuşilor testaţi la STING uman recombinant de tip sălbatic (aa, 139-379, H232R). Legarea fiecărui compus la STING a fost endotermă, aşa cum este indicat de vitezele căldurii negative cu căldură de diluţie exotermă (direcţie pozitivă) (observată după ce compusul a atins saturaţia proteinei). S-a demonstrat că 2'3' cGAMP produce un răspuns endotermic similar la diferite variante STING. Compusul 1a a furnizat cel mai scăzut Kd de 0,04 µM, urmat de 2'3' cGAMP cu un Kd de 0,07 µM şi apoi ML RR-S2 CDA cu un Kd de 0,40 µM. Toţi compuşii au furnizat valori n apropiate de 0,5, sugerând că proteina STING a fost prezentă ca un dimer şi s-a legat 1 mol de compus la 2 mol de STING.
Exemplul 114 - Identificarea metaboliţilor potenţiali
Compusul 1a a fost incubat în hepatocite de şoarece CD-1, şobolan Sprague Dawley, câine Beagle, maimuţă Cynomolgus şi om, pentru a evalua formarea metaboliţilor majori.
Materiale
Hepatocitele combinate crioconservate au fost achiziţionate de la ThermoFisher Scientific (Waltham, MA), Xenotech, LLC (Kansas City, KS) şi In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD), iar mediile adecvate au fost achiziţionate de la In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD) şi Life Technologies (Carlsbad, CA). Soluţia de colorare AOPI şi tamponul fosfat au fost obţinute de la Corning Life Sciences (Tewksbury, MA) şi, respectiv, Nexcelom Bioscience (Lawrence, MA). Toate substanţele chimice, reactivii şi solvenţii utilizaţi în analiză au fost de calitate analitică sau HPLC.
Proiecte şi proceduri experimentale
Incubaţii de hepatocite
Compusul 1a a fost cântărit şi dizolvat în HPLC-apă conţinând 0,12% acid formic PBS pentru a obţine 1020 mmol/l. Soluţia a fost apoi diluată de 2,5 ori individual la 4 mmol/l şi apoi diluată în continuare de 21000 de ori cu mediu Williams E care conţine 0,1% albumină serică umană şi 2 mmol/l L-glutamină pentru a face soluţia stoc de lucru cu o concentraţie de 20 µmol/l.
Înainte de incubare, hepatocitele crioconservate au fost dezgheţate într-o baie de apă la 37°C. Un tub de hepatocite crioconservate a fost adăugat la fiecare tub conic de 50 ml de mediu de recuperare a hepatocitelor crioconservate (UCRM) obţinut de la Laboratoarele ADMET In Vitro (Columbia, MD). Celulele au fost rotite într-o centrifugă Beckman (Brea, CA) cu un rotor GH 3,8 la 740 rpm timp de 10 minute la temperatura camerei 4°C. Supernatantul a fost îndepărtat şi celulele au fost resuspendate în mediu de placare pentru numărare. După ce celulele au fost resuspendate în mediu de placare, 20 µl din resuspensie au fost transferaţi şi amestecaţi cu 20 µl de soluţie de colorare AOPI. Soluţia a fost amestecată uşor şi celulele au fost numărate folosind un celometru (Nexcelom, Lawrence, MA). După numărare, celulele au fost apoi resuspendate la 1 sau 2 milioane de celule viabile/ml în mediu Williams E care conţinea 2 mmol/l L-glutamina (pH 7,4).
Suspensia de hepatocite (50 µl/godeu) a fost adăugată într-o placă cu 48 de godeuri. S-au adăugat cincizeci de microlitri de soluţie stoc de lucru care conţinea Compusul 1a (20 µmol/l) pentru a începe reacţia. Placa a fost plasată într-un incubator de cultură de ţesuturi (5% CO2/95% atmosferă umidificată cu aer şi 37 °C), iar reacţiile au fost încheiate cu 200 µl de soluţie de stopare constând din 100% metanol/acetonitril (1/1, v/ v) cu 2010 ng/ml furosemid şi 0,2 µmol/l (R)-propranolol la 5, 30, 60, 120, 180 şi 240 minute. Amestecul a fost centrifugat şi filtrat, şi supernatantul a fost colectat pentru analiză. Concentraţiile finale de hepatocite crioconservate au fost 1 x 106 celule/ml. Concentraţia finală de incubare a Compusului 1a a fost de 10 µmol/l.
LC-MS/Condiţii MS pentru identificarea metaboliţilor
Sistemul LC-MS/MS a fost compus dintr-un HPLC Shimadzu şi un spectrometru hibrid AB-SCIEX TripleTOF 5600 şi spectrometru de masă TOF (Framingham, MA). HPLC Shimadzu (Kyoto, Japonia), a constat dintr-un modul magistrală de comunicaţii (CBM-20A), un auto-sampler (SIL-30AC) cu un schimbător de rack ataşat (Rack Changer II), două pompe (LC-30AD) şi o coloană cuptor (CTO-30A). Spectrometrul de masă a fost calibrat utilizând soluţiile de calibrare AB-SCIEX APCI atât negative cât şi pozitive (Framingham, MA). Probele obţinute din incubaţii cu hepatocite au fost analizate atât în modul de scanare negativ cât şi pozitiv. Metoda analitică de bază şi condiţiile instrumentale sunt rezumate mai jos. Modificarea setărilor spectrometrului a fost dependentă de necesitatea analitului.
Condiţii: LC-MS/MS
Chromatografie LC30AD Shimadzu Setări: Tip coloană Agilent Eclipse XDB-C8, 5µ, 2,1x150mm, part# 993700-906, serial# USSN002817 Faze mobile A: apă/metanol = 95/5 (v/v) cu 5 mM acetat de amoniu B: metanol/apă = 95/5 (v/v) cu 5 mM acetat de amoniu Gradienţi 0-1min la 1%B; 1-5min liniar la 10%B; 5-13min liniar la 95%B; 13-19,9min la 95%B; 19,9-20min liniar la 1%B; 20-24min la 1% B Debit 0,4 ml/min Timp de analiză 24 min Tava de probe 4 °C Temperatura Volum de injecţie 15 µl Spectrometru de masă AB Sciex Hybrid Quadrupole-TOF LC-MS/MS Triple TOF 5600 Setări: Sursă de ioni Sursă de ioni DuoSpray Polaritate Negativă sau Positivă Voltaj spray de ioni (ISVF) 4500 V sau 5500 V Temperatura (TEM) 550 °C Cortină de gaz (CUR) 30 GS1 50 GS2 50 Setări TOF-MS: CE -5.000 sau 5.000 DP -100.000 sau 100.000 domeniu scanare: 120.0 - 1000.0 Setări TOF MS^2: CE -60.000 sau 60.000 CES 5.000 DP -100.000 sau 100.000 Domeniu scanare: 100.0 - 1000.0
Analiza datelor de activitate
Datele de spectrometrie de masă au fost obţinute utilizând AB-Sciex Analyst TF (Versiunea 1.5.1; Framingham, MA). Cromatogramele şi spectrele au fost obţinute folosind AB-Sciex PeakView (Versiunea 2.2.0.1; Framingham, MA). Comparaţia zonelor de vârf relative pentru cromatogramele ionice extrase s-a bazat pe ± 0,0002 Da al raportului exact aşteptat masă-la-sarcină (m/z) pentru fiecare analit de interes.
Rezultate
Nu a fost detectat nici un metabolit din incubările cu hepatocite. În condiţiile analitice prezentate, Compusul 1a a arătat un timp de retenţie de aproximativ 7,8 minute. În modul de scanare negativ, Compusul 1a a arătat ionul molecular deprotonat m/z 745 (C24H25F2N10O8P2S2 -) şi ionul molecular dublu deprotonat m/z 372 (C24H24F2N10O8P2S2 2 -). Principalii ioni de produs MS/MS cu m/z 533 (C19H19FN10O4PS- )şi m/z 186 (C9H8N5 - ) au fost observaţi. În modul de scanare pozitiv, Compusul 1a a arătat ionul molecular protonat m/z 747 (C24H27F2N10O8P2S2 +) şi principalii ioni de produs MS/MS cu m/z 651 (C24H26F2N10O6PS+), m/z 252 (C10H11FN5O2 +), şi m/z 188 (C9H10N5 +). Datele MS şi MS/MS confirmă structura Compusului 1a.
Compusul 1a a fost stabil în incubările cu hepatocite de şoarece, şobolan, câine, maimuţă şi om. În acest studiu nu a fost identificat nici un metabolit aparent al Compusului 1a. În probele obţinute din incubări cu hepatocite, numai Compusul 1a însuşi a putut fi detectat şi confirmat prin fragmentele de spectrometrie de masă în tandem (MS/MS).
Toate documentele la care se face referire în această dezvăluire sunt încorporate prin referinţă aici, deşi dacă vreun document încorporat contrazice această specificaţie scrisă, atunci această specificaţie scrisă va controla. Cei cu experienţă în domeniu vor recunoaşte că pot fi făcute diferite schimbări şi modificări la materialul furnizat aici şi că acel material se află în scopul şi spiritul dezvăluirii.
LISTA DE SECVENŢE
SECV ID NR: 1 (WT STING uman):
SECV ID NR: 2 (REF STING uman):
SECV ID NR: 3 (AQ STING uman):
SECV ID NR: 4 (WT STING reziduuri 155-341):
SECV ID NR: 5 (His-TEV-Sumo-WT STING 155-341)
SECV ID NR: 6 (REF STING reziduuri 155-341):
SECV ID NR: 7 (His-TEV-Sumo-REF STING 155-341)
LISTA DE SECVENŢE
<110> Eisai R&D Management Co., Ltd.
Kim, Dae-Shik
Fang, Frank
Endo, Atsushi
Choi, Hyeong-Wook
Hao, Ming-Hong
Bao, Xingfeng
Huang, Kuan-Chun
<120> Compuşi pentru Tratamentul Cancerului
<130> 0080171-000371
<150> 62/460562
<151> 2017-02-17
<150> 62/479169
<151> 2017-03-30
<150> 62/551645
<151> 2017-08-29
<150> 62/551647
<151> 2017-08-29
<150> 62/551668
<151> 2017-08-29
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1140
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 1140
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 1140
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 311
<212> PRT
<213> Secvenţă Artificială
<220>
<223> Construct His-TEV-Sumo-WT STING
<400> 5
<210> 6
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 311
<212> PRT
<213> Secvenţă Artificială
<220>
<223> Construct His-TEV-Sumo-REF STING 155-341
<400> 7

Claims (20)

1. Compus cu Formula (III):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care R1a este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F; R1b este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F, în care cel puţin unul din R1a şi R1b este -H; R4a este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F; R4b este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F, în care cel puţin unul din R4a şi R4b este -H; P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R; Z este -O- sau -NH-; X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S; X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H, -alchil C1-6, -C(O)alchil C1-6, şi -CH2OC(O)Oalchil C1-6; L1 în formula (III) este patru, cinci sau şase atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă sau o legătură triplă şi în care (i) fie 0, sau 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă; sau (ii) 0, 1 sau 2 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; şi (iii) în care când 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă sau 0 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă; şi (iv) în care, când 2 apariţii de
în L1 indică o legătură dublă, acele legături duble sunt fie legături adiacente, sau legături alternante; în care X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 sunt selectate independent dintre o legătură, - CH2-, sau -CH-, în care -CH2- sau -CH- este substituit sau nesubstituit de (i) -OH, (ii) - F, (iii) -Cl, (iv) -NH2, sau (v) -D, şi când X10 sau X15 este o legătură, care legătură nu este o dublă legătură sau triplă legătură; şi în care oricare doi membri adiacenţi ai grupului incluzând X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 poate forma opţional, cu atomi suplimentari, un cicloalchil C3 sau un heterocicloalchil C3, numitul heterocicloalchil C3 incluzând un atom de N sau O; în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (III).
2. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic conform revendicării 1, în care: R1a este selectat din grupul constând din -H şi -F; R1b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R1a şi R1b nu pot fi amândouă - F; R4a este selectat din grupul constând din -H şi -F; R4b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R4a şi R4b nu pot fi amândouă -F; P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R; X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S; X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H,alchil C1-6, şi -C(O) alchil C1-6; L1 în formula (III) este patru sau cinci atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă şi în care fie 0, sau 1 apariţie
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; în care X10 şi X14 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH-, sau -CH2-, şi în care, când X10 sau X14 este o legătură, care legătură nu este o dublă legătură; în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (III).
3. Compus cu Formula (IV):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care R1a este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F; R1b este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F, în care cel puţin unul din R1a şi R1b este -H; R4a este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F; R4b este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F, în care cel puţin unul din R4a şi R4b este -H; P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R; X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S; X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchil C1-6, -C(O)alchil C1-6, şi -CH2OC(O)Oalchil C1-6; L1 în formula (IV) este patru, cinci sau şase atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă sau o legătură triplă şi în care (i) fie 0, sau 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă; sau (ii) 0, 1 sau 2 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; şi (iii) în care când 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă sau 0 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă; şi (iv) în care, când 2 apariţii de
în L1 indică o legătură dublă, acele legături duble sunt fie legături adiacente, sau legături alternante; în care X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 sunt selectate independent dintre o legătură, - CH2-, sau -CH-, în care -CH2- sau -CH- este substituit sau nesubstituit de (i) -OH, (ii) - F, (iii) -Cl, (iv) -NH2, sau (v) -D, şi când X10 sau X15 este o legătură, care legătură nu este o dublă legătură sau triplă legătură; şi în care oricare doi membri adiacenţi ai grupului incluzând X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 poate forma opţional, cu atomi suplimentari, un cicloalchil C3 sau un heterocicloalchil C3, numitul heterocicloalchil C3 incluzând un atom de N sau O; în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r în Formula (IV), sau în care R1a este selectat din grupul constând din -H şi -F; R1b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R1a şi R1b nu pot fi amândouă - F; R4a este selectat din grupul constând din -H şi -F; R4b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R4a şi R4b nu pot fi amândouă -F; P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R; X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S; X1b şi X2b sunt aceleaşi sau diferite şi sunt independent selectate dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchil C1-6, şi -C(O)alchil C1-6; L1 în formula (IV) este patru sau cinci atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă şi în care fie 0, sau 1 apariţie
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; în care X10 şi X14 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH-, sau -CH2-, şi în care, când X10 sau X14 este o legătură, care legătură nu este o dublă legătură; în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (IV).
4. Compus cu Formula (V):
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care R1a este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F; R1b este selectat din grupul constând din -H, -OH, şi -F, în care cel puţin unul din R1a şi R1b este -H; R4a este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F; R4b este selectat din grupul constând din -H, -OH şi -F, şi în care cel puţin unul dintre R4a şi R4b este -H; P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R; X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S; X1b şi X2b sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchil C1-6, -C(O)alchil C1-6, şi -CH2OC(O)Oalchil C1-6; L1 în formula (V) este patru, cinci sau şase atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă sau o legătură triplă şi în care (i) fie 0, sau 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă; sau (ii) 0, 1 sau 2 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; şi (iii) în care când 1 apariţie a
în L1 indică o legătură triplă sau 0 apariţii ale
în L1 indică o legătură dublă; şi (iv) în care, când 2 apariţii de
în L1 indică o legătură dublă, acele legături duble sunt fie legături adiacente, sau legături alternante; în care X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 sunt selectate independent dintre o legătură, - CH2-, sau -CH-, în care -CH2- sau -CH- este substituit sau nesubstituit de (i) -OH, (ii) - F, (iii) -Cl, (iv) -NH2, sau (v) -D, şi când X10 sau X15 este o legătură, care legătură nu este o dublă legătură sau triplă legătură; şi în care oricare doi membri adiacenţi ai grupului incluzând X10, X11, X12, X13, X14, şi X15 poate forma opţional, cu atomi suplimentari, un cicloalchil C3 sau un heterocicloalchil C3, numitul heterocicloalchil C3 incluzând un atom de N sau O; în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile la punctele q şi r pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r în Formula (V), sau în care R1a este selectat din grupul constând din -H şi -F; R1b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R1a şi R1b nu pot fi amândouă - F; R4a este selectat din grupul constând din -H şi -F; R4b este selectat din grupul constând din -H şi -F, în care R4a şi R4b nu pot fi amândouă -F; P1 şi P2 fiecare are în mod independent o configuraţie stereochimică S sau R; X1a şi X2a sunt identice sau diferite şi sunt selectate independent dintre =O sau =S; X1b şi X2b sunt aceleaşi sau diferite şi sunt independent selectate dintre -OR5 şi -SR5; în care R5 este selectat din grupul constând din -H, alchil C1-6, şi -C(O)alchil C1-6; L1 în formula (V) are patru sau cinci atomi de carbon în lungime şi este
în care
indică o legătură simplă, o legătură dublă şi în care fie 0, sau 1 apariţie
în L1 indică o legătură dublă, în care geometria fiecărei legături duble este cis sau trans; în care X10 şi X14 sunt independent selectate dintre o legătură, -CH-, sau -CH2-, şi în care, când X10 sau X14 este o legătură, care legătură nu este o dublă legătură; în care B1 şi B2 sunt selectate independent dintre:
în care legăturile în punctele q şi r de pe B1 şi B2 sunt ataşate la punctele q şi r din Formula (IV).
5. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic conform oricăreia dintre revendicările 1-4., în care (i) configuraţia stereochimică a P1 şi P2 sunt amândouă R, configuraţia stereochimică a P1 este R şi P2 este S, sau configuraţia stereochimică a P1 este S şi P2 este R; (ii) o apariţie a
în L1 indică o dublă legătură, în care geometria dublei legături este trans; şi (iii) Z este -O- şi, preferabil, în care R1a şi R4a sunt fiecare -F sau R1b şi R4b sunt fiecare -F.
6. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic din oricare dintre revendicările 1-5, în care B1 şi B2 sunt fiecare
şi, preferabil, în care X1a şi X2a sunt amândouă =O, şi X1b şi X2b sunt amândouă -SH.
7. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic din oricare dintre revendicările 1-6, în care L1 este patru sau cinci carboni în lungime şi, preferabil, în care L1 este
8. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, selectat din grupul constând din:
şi
în care compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic a acestuia este preferabil selectat din grupul constând din:
şi
9. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic din oricare dintre revendicările 1-9, în care compusul sau sarea acceptabilă farmaceutic are (i) o valoare EC50 mai mică de 100 micromolar în celulele reporter care exprimă varianta HAQ a STING uman; (ii) o valoare EC50 mai mică de 100 micromolar în celule reporter care exprimă varianta AQ a STING uman; (iii) o valoare EC50 valoare mai mică de 100 micromolar în celule reporter care exprimă varianta WT a STING uman; sau (iv) o valoare EC50 mai mică de 100 micromolar în celule reporter care exprimă varianta REF a STING uman.
10. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic conform revendicării 8, în care compusul este:
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
11. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic conform revendicării 8, în care compusul este:
, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
12. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic conform revendicării 8, în care compusul este:
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
13. Compus sau sare acceptabilă farmaceutic conform revendicării 8, în care compusul este:
sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.
14. Compus sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia în care compusul este:
15. O sare acceptabilă farmaceutic din oricare dintre revendicările 1-14, în care sarea este o sare de diamoniu.
16. Compusul din oricare dintre revendicările 10-14.
17. O compoziţie farmaceutică cuprinzând un compus conform oricăreia din revendicările 1-15 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, şi un excipient acceptabil farmaceutic.
18. Un compus, o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia sau o compoziţie farmaceutică din oricare dintre revendicările 1-15 şi 17 pentru utilizare în tratamentul cancerului, în care cancerul este de preferinţă selectat din grupul constând din limfom, melanom, cancer colorectal, cancer mamar, leucemie mieloidă acută, cancer de colon, cancer hepatic, cancer de prostată, cancer pancreatic, cancer renal şi gliom.
19. Un compus, o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia sau o compoziţie farmaceutică din oricare dintre revendicările 1-15, 17 sau 18 pentru utilizare în tratamentul cancerului la un pacient având • REF STING alele sau • WT STING alele sau • AQ STING alele sau • HAQ STING alele.
20. Compus, o sare acceptabilă farmaceutic sau o compoziţie farmaceutică din revendicarea 18 pentru utilizare în tratamentul cancerului, în care respectivul cancer este metastatic.
MDE20200009T 2017-02-17 2018-02-17 Compuși di-nucleotidici ciclici pentru tratamentul cancerului MD3582853T2 (ro)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762460562P 2017-02-17 2017-02-17
US201762479169P 2017-03-30 2017-03-30
US201762551645P 2017-08-29 2017-08-29
US201762551668P 2017-08-29 2017-08-29
US201762551647P 2017-08-29 2017-08-29
PCT/US2018/018556 WO2018152450A1 (en) 2017-02-17 2018-02-17 Cyclic di-nucleotides compounds for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3582853T2 true MD3582853T2 (ro) 2022-04-30

Family

ID=61521844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20200009T MD3582853T2 (ro) 2017-02-17 2018-02-17 Compuși di-nucleotidici ciclici pentru tratamentul cancerului

Country Status (33)

Country Link
US (4) US20200055883A1 (ro)
EP (3) EP3582854A1 (ro)
JP (2) JP2020510638A (ro)
KR (1) KR102645790B1 (ro)
CN (3) CN110461416B (ro)
AU (1) AU2018221170B2 (ro)
CA (1) CA3053932A1 (ro)
CL (1) CL2019002304A1 (ro)
CO (1) CO2019008783A2 (ro)
CY (1) CY1126855T1 (ro)
DK (1) DK3582853T3 (ro)
ES (1) ES2906299T3 (ro)
HR (1) HRP20220110T1 (ro)
HU (1) HUE057665T2 (ro)
IL (1) IL268721B (ro)
JO (1) JOP20190194B1 (ro)
LT (1) LT3582853T (ro)
MA (1) MA47501A (ro)
MD (1) MD3582853T2 (ro)
MX (1) MX394380B (ro)
NZ (1) NZ757357A (ro)
PE (1) PE20191686A1 (ro)
PH (1) PH12019501914B1 (ro)
PL (1) PL3582853T3 (ro)
PT (1) PT3582853T (ro)
RS (1) RS62842B1 (ro)
SG (1) SG11201907496RA (ro)
SI (1) SI3582853T1 (ro)
SM (1) SMT202200054T1 (ro)
TW (1) TWI766948B (ro)
UA (1) UA125310C2 (ro)
WO (2) WO2018152453A1 (ro)
ZA (1) ZA201906111B (ro)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20170192A1 (ar) 2016-12-01 2019-01-30 Takeda Pharmaceuticals Co داي نوكليوتيد حلقي
MX389798B (es) 2017-01-20 2025-03-20 Arcus Biosciences Inc Azolopirimidina para el tratamiento de trastornos relacionados con el cáncer.
CA3057377A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Hydro-Quebec Salts for use in electrolyte compositions or as electrode additives
WO2019084060A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Silverback Therapeutics, Inc. CONJUGATES AND METHODS OF USE FOR THE SELECTIVE DELIVERY OF IMMUNOMODULATORY AGENTS
CN111566119A (zh) 2017-11-10 2020-08-21 武田药品工业有限公司 Sting调节剂化合物以及制备和使用方法
CN111511754B (zh) 2017-12-20 2023-09-12 捷克共和国有机化学与生物化学研究所 活化sting转接蛋白的具有膦酸酯键的2’3’环状二核苷酸
US10966999B2 (en) 2017-12-20 2021-04-06 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3′3′ cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein
US11478479B2 (en) 2018-02-16 2022-10-25 Arcus Biosciences, Inc. Dosing with an azolopyrimidine compound
TWI833744B (zh) 2018-04-06 2024-03-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 3'3'-環二核苷酸
TWI818007B (zh) 2018-04-06 2023-10-11 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 2'3'-環二核苷酸
CN112512531B (zh) * 2018-06-01 2024-04-09 卫材R&D管理有限公司 用于膀胱癌的治疗的方法
MX2020013322A (es) * 2018-08-16 2021-02-22 Eisai R&D Man Co Ltd Sales de compuestos y cristales de los mismos.
AU2019339344A1 (en) 2018-09-12 2021-03-18 Silverback Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease with immune stimulatory conjugates
WO2020135715A1 (zh) * 2018-12-29 2020-07-02 上海济煜医药科技有限公司 作为肿瘤免疫类的化合物及其应用
JP7621974B2 (ja) 2019-05-09 2025-01-27 アリゴス セラピューティクス インコーポレイテッド Ｓｔｉｎｇモジュレータとしての修飾環状ジヌクレオシド化合物
TWI826690B (zh) * 2019-05-23 2023-12-21 美商基利科學股份有限公司 經取代之烯吲哚酮化物及其用途
WO2021003279A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 Eisai R&D Management Co., Ltd.. System for enhancing therapeutic compliance of the anti-cancer compound e7766
CA3151322A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Silverback Therapeutics, Inc. Combination therapy with immune stimulatory conjugates
JP2022177332A (ja) * 2019-10-24 2022-12-01 日東電工株式会社 オリゴヌクレオチドを製造する方法
US11179473B2 (en) 2020-02-21 2021-11-23 Silverback Therapeutics, Inc. Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof
TW202200136A (zh) 2020-04-10 2022-01-01 日商小野藥品工業股份有限公司 癌治療方法
US20230210968A1 (en) 2020-06-11 2023-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Ribonucleoprotein approach to boost the sting signaling for cancer immunotherapy
CN116209678A (zh) 2020-07-01 2023-06-02 安尔士制药公司 抗asgr1抗体缀合物及其用途
CN111909223A (zh) * 2020-07-17 2020-11-10 清华大学 环二核苷酸共价修饰物及其制备方法和应用
WO2022079175A1 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination of a sting agonist and a complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist
EP4240488A1 (en) 2020-11-09 2023-09-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibody drug conjugates
CN120737157A (zh) * 2022-09-16 2025-10-03 上海大学 一种具有抗炎活性的多肽类化合物及其制备方法与应用
CN120813607A (zh) 2023-02-28 2025-10-17 卫材R&D管理有限公司 抗psma抗体、缀合物和使用方法

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2257704B (en) 1991-07-18 1995-03-01 Erba Carlo Spa Cyclic oligonucleotides phosphorothioates
CA2560058C (en) 2004-03-15 2011-10-18 David K.R. Karaolis A method for inhibiting cancer cell proliferation or increasing cancer cell apoptosis
US7592326B2 (en) 2004-03-15 2009-09-22 Karaolis David K R Method for stimulating the immune, inflammatory or neuroprotective response
US8076303B2 (en) 2005-12-13 2011-12-13 Spring Bank Pharmaceuticals, Inc. Nucleotide and oligonucleotide prodrugs
GB0607950D0 (en) 2006-04-21 2006-05-31 Novartis Ag Organic compounds
WO2009133560A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Smart Assays Non-hydrolyzable and permeable cyclic bis-[nucleotide monophosphate] derivatives and uses thereof
CN102199183B (zh) 2010-03-26 2013-12-18 北京大学 环二鸟苷酸及其类似物和制备方法
AU2013271375B2 (en) 2012-06-08 2018-03-22 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
AU2013358892B2 (en) * 2012-12-13 2018-06-21 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
JP2016524593A (ja) * 2013-04-29 2016-08-18 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター セカンドメッセンジャーのシグナル伝達を変えるための組成物及び方法
ES2822584T3 (es) 2013-05-03 2021-05-04 Univ California Inducción de dinucleótidos cíclicos del interferón tipo I
PE20160080A1 (es) 2013-05-18 2016-02-21 Aduro Biotech Inc Composiciones y metodos para activar la senalizacion que depende del estimulador del gen de interferon
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
EP3071209A4 (en) 2013-11-19 2017-08-16 The University of Chicago Use of sting agonist as cancer treatment
WO2015074145A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Brock University Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants
JP6462006B2 (ja) 2014-06-04 2019-01-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓｔｉｎｇのモジュレーターとしての環式ジヌクレオチド
US11058758B2 (en) 2014-11-20 2021-07-13 National Institutes Of Biomedical Innovation, Health And Nutrition TH1-inducing adjuvant comprising combination of different nucleic acid adjuvants, and use of same
CN107148424B (zh) 2014-12-16 2021-01-08 凯拉治疗股份公司 用于诱导细胞因子的环状二核苷酸
WO2016096577A1 (en) * 2014-12-16 2016-06-23 Invivogen Combined use of a chemotherapeutic agent and a cyclic dinucleotide for cancer treatment
WO2016100261A2 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Lipogen Llc Method of treating cancer with cgamp or cgasmp
GB201501462D0 (en) 2015-01-29 2015-03-18 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compounds
US10449211B2 (en) 2015-03-10 2019-10-22 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
WO2017011622A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Spring Bank Pharmaceuticals, Inc. Compounds and compositions that induce rig-i-and other pattern recongnition receptors
WO2017011920A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Compounds and uses thereof in the treatment of cancers and other medical conditions
EA034786B1 (ru) 2015-08-13 2020-03-20 Мерк Шарп И Доум Корп. Циклические динуклеотидные соединения в качестве агонистов sting
US9809597B2 (en) 2015-08-20 2017-11-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ganciclovir derivatives for modulating innate and adaptive immunity and for use in immunotherapy
EP3344262A4 (en) 2015-09-01 2019-03-20 Innate Tumor Immunity, Inc. IMMUNOCELLS WITH INCREASED IMMUNITY OR RESISTANCE TO AN IMMUNOSUPPRESSIVE CYTOKINE AND USE THEREOF
EP3368072A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Aduro BioTech, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD FOR ACTIVATING SIGNALING DEPENDENT ON THE STIMULATOR OF THE INTERFERON GENE
RU2020113165A (ru) 2015-12-03 2020-06-09 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Циклические пуриновые динуклеотиды в качестве модуляторов sting
JP6801956B2 (ja) 2015-12-04 2020-12-16 株式会社エクセディ モータサイクル用クラッチ装置
US10723756B2 (en) 2016-01-11 2020-07-28 Innate Tumor Immunity Inc. Cyclic dinucleotides for treating conditions associated with STING activity such as cancer
SMT202500412T1 (it) 2016-01-11 2025-11-10 Innate Tumor Immunity Inc Dinucleotidi ciclici per il trattamento di condizioni associate all’attività di sting quali il cancro
NZ746112A (en) 2016-03-18 2023-01-27 Immune Sensor Llc Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use
JP2019510802A (ja) 2016-04-07 2019-04-18 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ タンパク質調節物質として有用な複素環アミド
US10537590B2 (en) 2016-09-30 2020-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
JOP20170188A1 (ar) 2016-11-25 2019-01-30 Janssen Biotech Inc ثنائي النوكليوتيدات الحلقية كمنبهات ستينغ (sting)
WO2018140831A2 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Silverback Therapeutics, Inc. Tumor targeting conjugates and methods of use thereof
WO2018198084A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Lupin Limited Cyclic di-nucleotide compounds with tricyclic nucleobases
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190120266A (ko) 2019-10-23
EP4008403A1 (en) 2022-06-08
JOP20190194A1 (ar) 2019-08-15
IL268721B (en) 2022-04-01
CO2019008783A2 (es) 2020-01-17
NZ757357A (en) 2025-09-26
RU2019129127A (ru) 2021-03-17
MX394380B (es) 2025-03-24
MA47501A (fr) 2019-12-25
SMT202200054T1 (it) 2022-03-21
ZA201906111B (en) 2023-12-20
KR102645790B1 (ko) 2024-03-11
BR112019017084A2 (pt) 2020-04-14
UA125310C2 (uk) 2022-02-16
PL3582853T3 (pl) 2022-02-21
PT3582853T (pt) 2022-02-02
AU2018221170A1 (en) 2019-10-10
JOP20190194B1 (ar) 2023-09-17
JP2020508304A (ja) 2020-03-19
DK3582853T3 (da) 2022-02-07
EP3582853A1 (en) 2019-12-25
US11339188B2 (en) 2022-05-24
LT3582853T (lt) 2022-02-10
US20200055883A1 (en) 2020-02-20
IL268721A (en) 2019-10-31
EP3582853B1 (en) 2021-11-17
CN110536719A (zh) 2019-12-03
US20180237468A1 (en) 2018-08-23
AU2018221170B2 (en) 2024-03-28
TW201842918A (zh) 2018-12-16
HUE057665T2 (hu) 2022-06-28
HRP20220110T1 (hr) 2022-04-15
WO2018152450A1 (en) 2018-08-23
CA3053932A1 (en) 2018-08-23
RU2019129127A3 (ro) 2021-06-08
CL2019002304A1 (es) 2020-01-10
CY1126855T1 (el) 2024-12-13
US20200299321A1 (en) 2020-09-24
JP2020510638A (ja) 2020-04-09
JP6672532B2 (ja) 2020-03-25
WO2018152453A1 (en) 2018-08-23
MX2019009796A (es) 2019-10-22
CN110461416B (zh) 2024-01-26
US20190345192A1 (en) 2019-11-14
SI3582853T1 (sl) 2022-04-29
ES2906299T3 (es) 2022-04-18
PE20191686A1 (es) 2019-11-19
CN117866030A (zh) 2024-04-12
RS62842B1 (sr) 2022-02-28
EP3582854A1 (en) 2019-12-25
US10246480B2 (en) 2019-04-02
PH12019501914B1 (en) 2024-02-21
PH12019501914A1 (en) 2020-03-16
SG11201907496RA (en) 2019-09-27
CN110461416A (zh) 2019-11-15
TWI766948B (zh) 2022-06-11
US10618930B2 (en) 2020-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102645790B1 (ko) 암의 치료를 위한 시클릭 디뉴클레오티드 화합물
EP3801561B1 (en) Methods for the treatment of bladder cancer
RU2790175C2 (ru) Циклические ди-нуклеотидные соединения для лечения рака
ES3021247T3 (en) Salts of compounds and crystals thereof
HK40016436B (en) Cyclic di-nucleotides compounds for the treatment of cancer
BR112019017084B1 (pt) Compostos dinucleotídeos cíclicos, composições farmacêuticas que compreendem os mesmos e uso dos ditos compostos para o tratamento de câncer
RU2795220C2 (ru) Способы лечения рака мочевого пузыря