MD3191511T2 - Lianți TNF îmbunătățiți - Google Patents
Lianți TNF îmbunătățiți Download PDFInfo
- Publication number
- MD3191511T2 MD3191511T2 MDE20170066T MDE20170066T MD3191511T2 MD 3191511 T2 MD3191511 T2 MD 3191511T2 MD E20170066 T MDE20170066 T MD E20170066T MD E20170066 T MDE20170066 T MD E20170066T MD 3191511 T2 MD3191511 T2 MD 3191511T2
- Authority
- MD
- Moldova
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- tnf
- disclosure
- compound
- Prior art date
Links
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 title description 175
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 137
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 266
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 238
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 233
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 182
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 176
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 174
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 129
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 123
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 119
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 101
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 57
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 48
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 46
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 46
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 29
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 26
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 26
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 26
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 22
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 22
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 20
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 20
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 20
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 19
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 19
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 18
- 229920000120 polyethyl acrylate Polymers 0.000 description 18
- 102220041913 rs587780812 Human genes 0.000 description 18
- 102200058105 rs63750815 Human genes 0.000 description 18
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 17
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 17
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 17
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 16
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 102220612213 Calcyclin-binding protein_E1D_mutation Human genes 0.000 description 14
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 14
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 102220570985 Uncharacterized protein C7orf57_A74S_mutation Human genes 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 13
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 11
- 102220473254 Emerin_S49A_mutation Human genes 0.000 description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 11
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 10
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 9
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 102200090720 rs137852501 Human genes 0.000 description 8
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 8
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229940090100 cimzia Drugs 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 208000002399 aphthous stomatitis Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102220604944 Killer cell immunoglobulin-like receptor 3DL2_P40A_mutation Human genes 0.000 description 5
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 5
- 201000010927 Mucositis Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 5
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 4
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 4
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 101000693967 Trachemys scripta 67 kDa serum albumin Proteins 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102220550734 Microtubule-associated tumor suppressor 1_Q75K_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 102220469588 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-2_D60A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 102200139755 rs11575292 Human genes 0.000 description 3
- 102220068439 rs781650198 Human genes 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 3
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 102200076863 c.119C>T Human genes 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 2
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003870 intestinal permeability Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 102200076873 rs104894831 Human genes 0.000 description 2
- 102220091529 rs148370267 Human genes 0.000 description 2
- 102200057517 rs1800054 Human genes 0.000 description 2
- 102220074137 rs796052043 Human genes 0.000 description 2
- 102220097514 rs876659683 Human genes 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- NBGAYCYFNGPNPV-UHFFFAOYSA-N 2-aminooxybenzoic acid Chemical class NOC1=CC=CC=C1C(O)=O NBGAYCYFNGPNPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100028169 BET1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 101710138653 BET1-like protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N Conferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OCC3C4(C)CCC(=O)C(C)(C)C4CC=C3C)=CC=C21 VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061958 Food Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L To-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125385 biologic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013066 combination product Substances 0.000 description 1
- 229940127555 combination product Drugs 0.000 description 1
- JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N conferone Natural products CC1=CCC2C(C)(C)C(=O)CCC2(C)C1COc3cccc4C=CC(=O)Oc34 JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- CHVYWISGAZDJOG-UHFFFAOYSA-N disodium;diazide Chemical compound [Na+].[Na+].[N-]=[N+]=[N-].[N-]=[N+]=[N-] CHVYWISGAZDJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 208000010227 enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229940125425 inverse agonist Drugs 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 230000004682 mucosal barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 102220282738 rs1333679774 Human genes 0.000 description 1
- 102200007335 rs1554292444 Human genes 0.000 description 1
- 102220267892 rs1555193020 Human genes 0.000 description 1
- 102220243676 rs1555601019 Human genes 0.000 description 1
- 102200092884 rs34933313 Human genes 0.000 description 1
- 102220082637 rs61743884 Human genes 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 1
- 201000005671 spondyloarthropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002452 tumor necrosis factor alpha inhibitor Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Organic Insulating Materials (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
Abstract
Prezenta invenţie se referă la domeniile variabile unice ale catenei grele de imunoglobulină (denumite în continuare "ISV" sau "ISVD"- immunoglobulin single variable domains) care se leagă la factorul de necroză tumorală alfa conform revendicării anexate. Alte aspecte, variante de realizare, caracteristici, utilizări şi avantaje ale invenţiei vor fi evidente pentru persoana de specialitate pe baza dezvăluirii de faţă.
Description
În prezenta cerere, resturile de aminoacizi/poziţiile aminoacizilor într-un domeniu variabil al catenei grele de imunoglobulină vor fi indicate prin numerotarea conform Kabat. Din considerente de comoditate, Figura 1 prezintă un tabel care enumără unele dintre poziţiile aminoacizilor care vor fi menţionate în mod specific în prezenta şi numerotarea acestora conform unor sisteme de numerotare alternative (cum ar fi Aho şi IMGT. Notă: dacă nu este indicat în mod explicit altfel, pentru descrierea prezentată şi revendicări, numerotarea Kabat este decisivă, alte sisteme de numerotare fiind date numai pentru referinţă).
În ceea ce priveşte CDR-urile, aşa cum este binecunoscut în domeniu, există mai multe convenţii pentru a defini şi descrie CDR-urile unui fragment VH sau VHH, cum ar fi definiţia Kabat (care se bazează pe variabilitatea secvenţei şi este cel mai frecvent utilizat) şi definiţia Chothia (care se bazează pe localizarea regiunilor de buclă structurală). De exemplu, se face referire la website-ul http://www.bioinf.org.uk/abs/. Pentru scopurile prezentei descrieri şi a revendicărilor, chiar dacă CDR-urile conform Kabat pot fi de asemenea menţionate, CDR-urile sunt cel mai preferabil definite pe baza definiţiei Abm (care se bazează pe software-ul de modelare a anticorpilor de la Oxford Molecular's AbM), deoarece este considerat a fi un compromis optim între definiţiile Kabat şi Chothia. Se face din nou referire la website-ul http://www.bioinf.org.uk/abs/.
Boala inflamatorie intestinală (IBD), boala Crohn (CD) şi colita ulcerativă (UC) sunt boli cronice, invalidante şi progresive. Cele mai multe terapii cu medicamente non-biologice, cum ar fi aminosalicilaţii, steroizii şi imunomodulatoarele, oferă o îmbunătăţire simptomatică, dar nu reuşesc să oprească procesul inflamator şi nu schimbă cursul bolii. Apariţia agenţilor anti-tumorali de necroză factor-α (anti-TNF-α) (infliximab, adalimumab, certolizumab pegol) a modificat în mod semnificativ modul în care este tratată IBD prin schimbarea cursului bolii (mai puţine operaţii, mai puţine spitalizări, o mai bună calitate a vieţii, reducerea steroidului, o mai mare atenuare clinică şi rate de vindecare a mucoaselor atât în cazul CD cât şi în cazul UC) şi calitatea vieţii pacienţilor şi a productivităţii muncii (a se vedea Amiot şi Peyrin-Biroulet 2015 Ther Adv Gastroenterol 8: 66-82). Cea mai obişnuită cale de administrare pentru acestor proteine terapeutice este injectarea. Deoarece majoritatea acestor proteine au un timp de înjumătăţire plasmatică redus, pentru a fi eficiente trebuie să fie administrate frecvent sau în doze mari. Administrarea sistemică este asociată, în plus, cu un risc crescut de infecţii. Împreună, aceasta conduce la pierderea complianţei pacientului (a se vedea Singh şi colaboratorii 2008 J Pharm Sci 97:2497-2523).
Cu toate acestea, efectele secundare nedorite pe termen lung şi infecţiile oportuniste, incluzând tuberculoza şi limfomul non-Hodgkins, sunt cauzate de imunosupresia generalizată şi constituie rezultatul injecţiilor sistemice repetate ale tratamentului cu anticorp monoclonal utilizat în mod curent (Ali şi colaboratorii, 2013; Galloway şi colaboratorii, 2011; Ford & Peyrin-Biroulet, 2013; Kozuch & Hanauer, 2008; Schreiber şi colaboratorii, 2007; Syed şi colaboratorii, 2013).
Administrarea pe cale orală a anticorpilor anti-TNF-α ar trebui să evite unele dintre aceste reacţii adverse.
Cu toate acestea, aceşti agenţi anti-TNF-α sunt proteine complexe. Administrarea pe cale orală conduce la degradarea în mediul acid şi bogat în proteaze a tractului gastro-intestinal (GI).
În utilizarea proteinelor de momeală pentru a proteja anticorpul terapeutic, a fost recent efectuat un studiu pe bază de pacienţi cuprinzând anticorpi colostrali bovini policlonali pentru TNF alfa uman (AVX-470) administrat pe cale orală de Avaxia Biologics Inc. la pacienţii cu colită ulcerativă. Totuşi, studiul a fost întrerupt.
Prin urmare, este nevoie de noi medicamente IBD.
ISVD-urile (şi în special nanocorpii) care se pot lega de TNF şi utilizările acestora sunt bine cunoscute în domeniu, de exemplu din WO 2004/041862 şi WO 2006/122786, care descriu nanocorpi împotriva TNF şi utilizarea acestora pentru prevenirea şi/sau tratamentul bolilor şi tulburărilor asociate cu şi/sau mediate de semnalizarea TNF-α sau TNF-α, cum ar fi inflamaţia, artrita reumatoidă, boala Crohn, colita ulcerativă, sindromul de intestin inflamat, scleroza multiplă, boala Addison, hepatita autoimmună, parotita autoimmună, diabetul tip 1, epididimita, glomerulonefrita, boala Graves, sindromul Guillain-Barre, boala Hashimoto, anemia hemolitică, lupusul eritematos sistemic, infertilitatea masculină, miastenia gravis, pemfigusul, psoriazis, febra reumatică, sarcoidoza, sclerodermia, sindromul Sjogren, spondiloartropatiile, tiroidita şi vasculita.
WO 2006/122786 a dezvăluit în calitate de SEQ ID NO: 125 un nanocorp anti-TNF-α specific menţionat ca NC55TNF_NC7 (PMP6C11). Secvenţa acestui nanocorp din stadiul tehnicii este dată în tabelul A prezentat în cele ce urmează ca SEQ ID NO: 58. Tabelul A oferă de asemenea (ca SEQ ID NO: 1) secvenţa unei versiuni optimizate a secvenţei (menţionată în prezenta ca "Referinţa A") a acestui liant TNF din stadiul tehnicii, împreună cu CDR-urile acestuia (conform convenţiilor Kabat şi Abm). Aşa cum se poate vedea din alinierea din figura 2, versiunea optimizată a secvenţei conţine, comparativ cu secvenţa din stadiul tehnicii a SEQ ID NO: 58, următoarele mutaţii: Q1E, A14P, Q27F, S29F, P40A, A49S, K73N, Q75K, V78L, D82aN, K83R şi Q108L (conform numărătorii Kabat).
WO 2015/1733256 se referă la domeniile de imunoglobulină îmbunătăţite, cuprinzând extensii C-terminale care împiedică legarea aşa numiţilor anticorpi preexistenţi ("PEAs"). WO 2015/1733256 dezvăluie SEQ ID NO: 345 ca un nanocorp anti-TNF-α specific, care, de asemenea este menţionat în prezenta ca TNF345 (SEQ ID NO: 59). Aşa cum se poate vedea din alinierea din figura 2, versiunea optimizată pentru secvenţă, referinţa A conţine, comparativ cu secvenţa din stadiul tehnicii din SEQ ID NO: 59, următoarele mutaţii: V11L şi L89V (conform numărătorii Kabat).
Recent, a fost propus un cocktail de fragmente de anticorpi VHH monoclonali de llama neutralizatoare de toxină pentru terapia orală potenţială (Hussack şi colaboratorii, 2011 J Biol Chem 286, 8961-76.). Totuşi, Dumoulin şi colaboratorii (2002 Protein Sci, 11, 500-15), Harmsen şi colaboratorii (2006 Appl Microbiol Biotechnol, 72, 544-51) şi Hussack şi colaboratorii (2012 Methods Mol Biol, 911, 417-29) au afirmat că fragmentele de anticorpi de llama de un singur domeniu par a fi foarte susceptibile la distrugerea proteolitică în sistemul gastrointestinal uman.
WO2007/025977 descrie un tratament al enterocolitei cronice, care implică secreţia in situ a nanocorpilor anti-mTNF de bacteriile L. lactis la administrare pe cale orală.
PREZENTAREA PE SCURT A INVENŢIEI
Prezenta invenţie îşi propune să ofere lianţi TNF îmbunătăţiţi cu, cum ar fi anti-TNF ISVD-uri. Lianţii TNF îmbunătăţiţi oferiţi prin invenţie sunt, de asemenea menţionaţi, în prezenta ca şi "Lianţi TNF conform invenţiei" sau "Lianţi TNF".
Mai precis, prezenta invenţie urmăreşte să furnizeze lianţi-TNF îmbunătăţiţi care ar fi utili în tratarea bolilor tractului digestiv cum ar fi, de exemplu, boala inflamatorie intestinală (IBD), sindromul intestinului iritabil, boala Crohn, colita ulcerativă, mucozita, stomatita aftoasă, boala celiacă, traume ale tractului digestiv şi cancere la nivelul tractului digestiv. Aceşti lianţi-TNF ar trebui, de preferinţă, să fie stabili şi acceptabili pentru administrare orală.
Este de aşteptat ca lianţii-TNF administraţi pe cale orală nu numai să neutralizeze TNF în lumenul tractului digestiv, ci să obţină acces la lamina propria şi submucoasă, deoarece bariera intestinală a tractului digestiv poate fi încălcată sau compromisă prin inflamaţie şi/sau ulceraţie gravă, incluzând, dar fără a se limita la, boala parodontală, stomatita aftoasă, infecţii bacteriene, virale, fungice sau parazitare ale tractului digestiv, ulcere peptice, ulcere asociate stresului sau infecţiei cu H. pylori, leziuni cauzate de refluxul esofagian, boala inflamatorie intestinală, leziuni cauzate de cancerul tractului digestiv, intoleranţă alimentară, inclusiv boala celiacă sau ulcere induse de NSAID-uri sau alte medicamente ingerate sau administrate sistemic.
Prin urmare, invenţia urmăreşte să furnizeze lianţi TNF îmbunătăţiţi care sunt variante ale Referinţei A şi care au legare redusă prin factori de interferenţă (în general menţionaţi ca "anticorpi preexistenţi" sau "PEA") care pot fi prezenţi în serul unor subiecţi umani sănătoşi, precum şi de la pacienţi. Se face referire la WO 2012/175741, WO 2013/024059 şi, de asemenea, de exemplu la Holland şi colaboratorii (J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203) precum şi la cele care au fost publicate în cererea PCT publicată WO2015/173325 (Cerere nr. PCT/EP2015/060643) aparţinând Ablynx N.V. înregistrată la data de 13 mai, 2015 şi intitulată "Domenii variabile de imunoglobuline îmbunătăţite".
Aşa cum este descris în continuare, lianţii TNF conform invenţiei au, de preferinţă, aceeaşi combinaţie de CDR-uri (adică CDR1, CDR2 şi CDR3) aşa cum sunt prezente în Referinţa A.
Liantul TNF conform invenţiei este un domeniu variabil unic de imunoglobulină (ISVD) având secvenţa de aminoacizi conform SEQ ID NO: 40.
Câţiva lianţi TNF preferaţi dar nelimitativi, conform dezvăluirii sunt enumeraţi în Figura 3 ca SEQ ID NO: 8 până la 41, 62, 63, 64, 65, 66 şi 69. Figura 4 prezintă o aliniere a secvenţelor SEQ ID NO: 8-41 cu SEQ ID NO: 1 (Referinţa A) şi SEQ ID NO: 58 (PMP6C11). Lianţii din SEQ ID NO: 22 până la 41, 62-66 şi 69 sunt exemple de lianţi TNF conform dezvăluirii care au o extensie de alanină C-terminală, adică un rest de alanină la capătul C-terminal al secvenţei ISVD (de asemenea, uneori denumită ca "poziţia 114") în comparaţie cu secvenţa C-terminală obişnuită VTVSS (SEQ ID NO: 55, prezentă în Referinţa A). Aşa cum este descris în WO 2012/175741 (dar, de asemenea, de exemplu, în WO 2013/024059 şi WO2015/173325), această extensie de alanină C-terminală poate preveni legarea aşa-numiţilor "anticorpi preexistenţi" (presupuşi a fi IgG) la un epitop presupus care este situat la regiunea C-terminală a ISVD. Acest epitop se presupune că include, printre alte resturi, resturile de aminoacizi expuse la suprafaţă ale secvenţei C-terminale VTVSS, precum şi restul de aminoacid din poziţia 14 (şi resturile de aminoacid următoare/apropiate de acesta în secvenţa de aminoacizi cum ar fi poziţiile 11, 13 şi 15) şi poate cuprinde, de asemenea, restul de aminoacid din poziţia 83 (şi resturile de aminoacid următoare/aproape de acesta în secvenţa de aminoacizi, cum ar fi poziţiile 82, 82a, 82b şi 84) şi/sau restul de aminoacid din poziţia 108 (şi resturile de aminoacid următoare/aproape de acesta în secvenţa de aminoacizi, cum ar fi poziţia 107).
Totuşi, deşi prezenţa unei astfel de alanine C-terminale (sau o extensie C-terminală în general) poate reduce foarte mult (şi într-o mulţime de cazuri, chiar împiedică în mod esenţial pe deplin) legarea "anticorpilor preexistenţi" care pot fi găsiţi în serurile de la o serie de subiecţi (atât subiecţi sănătoşi cât şi pacienţi), s-a constatat că serurile unor subiecţi (cum ar fi serurile de la pacienţi cu unele boli imune, cum ar fi SLE) pot conţine anticorpi preexistenţi care se pot lega la regiunea C-terminală a unui ISVD (atunci când o astfel de regiune este expusă), chiar dacă ISVD conţine o astfel de alanină C-terminală (sau mai general, o astfel de extensie C-terminală). Se face din nou referire la cererea PCT publicată WO2015/173325) înregistrată de cesionar la data de 13 mai 2015 şi intitulată "Domenii variabile de imunoglobuline îmbunătăţite".
În consecinţă, un obiectiv specific al invenţiei este acela de a furniza lianţi TNF care sunt variante îmbunătăţite ale nanocorpului anti-TNF la care se face referire în prezenta ca "Referinţa A" şi care au legare redusă prin aşa-numiţii "anticorpi preexistenţi" şi în particular de tipul descris în WO2015/173325 (adică acei anticorpi preexistenţi care se pot lega la o regiune C-terminală expusă a unui ISVD chiar în prezenţa unei extensii C-terminale).
În general, invenţia realizează acest obiectiv prin asigurarea unui domeniu variabil unic de imunoglobulină (ISVD) având secvenţa de aminoacizi conform SEQ ID NO: 40. De asemenea, sunt dezvăluite secvenţele de aminoacizi care sunt variante ale secvenţei din SEQ ID NO: 1 care cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1):
- 89T; sau - 89L în combinaţie cu 11V; sau - 89L în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 112K sau 112Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 112K sau 112Q; sau - 11V în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 11V în combinaţie cu 112K sau 112Q. În particular, în lianţii TNF furnizaţi în dezvăluire: - restul de aminoacid de la poziţia 11 este ales, de preferinţă dintre L sau V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, V sau L; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q; şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q;
astfel încât (i) poziţia 89 este T; sau (ii) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V; sau (iii) poziţia 89 este L şi poziţia 110 este K sau Q; sau (iv) poziţia 89 este L şi poziţia 112 este K sau Q; sau (v) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V şi poziţia 110 este K sau Q; sau (vi) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V şi poziţia 112 este K sau Q; sau (vii) poziţia 11 este V şi poziţia 110 este K sau Q; sau (vii) poziţia 11 este V şi poziţia 112 este K sau Q.
Dintre secvenţele de aminoacizi furnizate de dezvăluire, sunt în mod special preferate secvenţele de aminoacizi în care poziţia 89 este T sau în care poziţia 11 este V şi poziţia 89 este L (opţional în combinaţie adecvată cu o mutaţie 110K sau 110Q şi/sau o mutaţie 112K sau 112Q şi, în particular, în combinaţie cu o mutaţie 110K sau 110Q). Chiar mai preferate sunt secvenţele de aminoacizi în care poziţia 11 este V şi poziţia 89 este L, în mod opţional cu o mutaţie 110K sau 110Q.
Într-un exemplu preferat în mod deosebit, în lianţii TNF furnizaţi în dezvăluire, restul de aminoacid de la poziţia 11 este V, restul de aminoacid de la poziţia 89 este L, restul de aminoacid de la poziţia 110 este T şi restul de aminoacid de la poziţia 112 este S.
Într-un exemplu preferat în mod particular, prezenta dezvăluire se referă la lianţi TNF, cum ar fi domeniile variabile unice de imunoglobulină (ISVD), care au:
- o CDR1 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); şi - o CDR2 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); şi - o CDR3 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum a fost definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(iile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi care nu iau în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt de preferinţă prezente numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este L; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este T; şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este S; şi - restul de aminoacid de la poziţia 49 este A; şi - restul de aminoacid de la poziţia 74 este S. Aşa cum a fost menţionat, secvenţele de aminoacizi furnizate de invenţia descrisă în revendicarea anexată se pot lega (şi în particular se pot lega în mod specific) de TNF. Secvenţele de aminoacizi furnizate de invenţie au de preferinţă valoarea EC50, în analiza pe bază de celule utilizând celulele KYM descrise în exemplul 1, sub 3), din WO 04/041862 care este mai mare decât 50 nM, mai preferabil mai mare de 25 nM, cum ar fi mai mică de lOnM. Tabelul B prezintă câteva combinaţii posibile nelimitative ale resturilor de aminoacizi care pot fi prezente la poziţiile 11, 89, 110 şi 112 în lianţii TNF conform dezvăluirii. Combinaţiile care sunt preferate, în mod special, sunt indicate boldate, şi cele mai preferate combinaţii sunt indicate boldate/cu subliniere. Cu toate acestea, la optimizarea secvenţelor ("optimizarea secvenţei") lianţilor TNF în ceea ce priveşte reducerea la minimum sau eliminarea site-urilor de legare pentru anticorpii preexistenţi pe de o parte şi umanizarea pe de altă parte, diferite proprietăţi ale lianţilor TNF, incluzând stabilitatea, au fost (remarcabil) influenţate în mod negativ. În particular, temperatura de topire ca o măsură pentru stabilitatea fizică a scăzut, producerea atât în gazda eucariotă P. pastoris cât şi în gazdă procariotică E. coli a fost diminuată şi stabilitatea în fluidele Gl a fost redusă. În loc de a "muta înapoi" site-urile de legare pentru PEA-uri şi mutaţiile de umanizare, compromiţând astfel optimizarea secvenţei, inventatorii prezentei au descoperit, în mod surprinzător, că resturile de aminoacizi 49 şi/sau 74 ar putea fi modificate astfel încât să fie satisfăcute ambele cerinţe reciproc aparent exclusive. Tabelele B-1 şi B-2 prezintă câteva combinaţii posibile nelimitative ale resturilor de aminoacizi care pot fi prezente la poziţiile 11, 89, 110, 112, 49 şi/sau 74 în lianţii TNF conform dezvăluirii. Lianţii TNF furnizaţi în dezvăluire sunt, în continuare, aşa cum sunt descrişi în descriere, exemple şi figurile din prezenta, adică au CDR-uri care sunt aşa cum au fost descrise în prezenta şi au un grad global de identitate de secvenţă (aşa cum este definit în prezenta) cu secvenţa din SEQ ID NO: 1 care este dezvăluită în prezenta şi/sau poate avea un număr limitat de "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este descris în prezenta) cu (una dintre) aceste secvenţe de referinţă. Lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele CDR-uri (conform convenţiei Kabat): - o CDR1 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid TADMG (SEQ ID NO: 2); şi - o CDR2 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); şi - o CDR3 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO:4). În mod alternativ, atunci când CDR-urile sunt date în conformitate cu convenţia Abm, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele CDR-uri: - o CDR1 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid GFTFSTADMG (SEQ ID NO:5); şi - o CDR2 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTY (SEQ ID NO:6); şi - o CDR3 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO:4). De asemenea, un liant TNF conform dezvăluirii are, de preferinţă: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%; şi/sau - nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(iile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi care nu iau în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt de preferinţă prezente numai în cadre şi nu în CDR-uri). În ceea ce priveşte diferitele aspecte şi aspectele preferate ale lianţilor TNF conform dezvăluirii, atunci când vine vorba de gradul de identitate de secvenţă faţă de SEQ ID NO: 1 şi/sau de numărul şi tipul de "diferenţe de aminoacizi" care pot fi prezente într-un astfel de liant conform invenţiei (adică în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1), trebuie menţionat faptul că, atunci când se spune că (i) o secvenţă de aminoacizi conform invenţiei are un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa SEQ ID NO: 1 de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95% (în care CDR-urile, oricare extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi mutaţiile de la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112, cerute prin aspectul specific implicat nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate a secvenţei); şi/sau când se spune că (ii) o secvenţă de aminoacizi conform invenţiei nu are mai mult de 7, de preferinţă nu mai mult de 5, cum ar fi de exemplu doar 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" cu secvenţa din SEQ ID NO: 1 (din nou, neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă şi neluând în considerare mutaţiile din poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 cerute de aspectul specific implicat), atunci acesta include, de asemenea, secvenţe care nu au diferenţe de aminoacizi cu secvenţa SEQ ID NO: 1, altele decât mutaţiile din poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 cerute de aspectul specific implicat) şi oricare extensie C-terminală care poate fi prezentă. Astfel, într-un aspect specific al dezvăluirii, lianţii TNF conform invenţiei pot avea identitate de secvenţă de 100% cu SEQ ID NO: 1 (incluzând CDR-urile, dar fără a lua în considerare mutaţia(ţiile) sau combinaţia de mutaţii la poziţiile 11, 49, 74, 89, 110 şi/sau 112 dezvăluite în prezenta şi/sau oricare extensie C-terminală care poate fi prezentă) şi/sau pot să nu aibă diferenţe de aminoacizi cu SEQ ID NO: 1 (adică altele decât mutaţia(ţiile) sau combinaţia de mutaţii de la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 dezvăluite în prezenta şi oricare extensie C-terminală care poate fi prezentă). Când sunt prezente oricare diferenţe de aminoacizi (adică pe lângă oricare extensie C-terminală şi mutaţiile de la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 care sunt cerute de aspectul specific al invenţiei, implicat), aceste diferenţe de aminoacizi pot fi prezente în CDR-uri şi/sau regiuni cadru, dar acestea sunt prezente, de preferinţă, numai în regiunile cadru (aşa cum sunt definite de convenţia Abm, adică nu în CDR-uri aşa cum sunt definite conform convenţiei Abm); adică astfel încât lianţii TNF conform dezvăluirii au aceleaşi CDR-uri (definite conform convenţiei Abm) aşa cum sunt prezente în SEQ ID NO: 1. De asemenea, atunci când un liant TNF conform dezvăluirii, conform oricărui aspect al invenţiei are una sau mai multe diferenţe de aminoacizi cu secvenţa SEQ ID NO: 1 (în afară de mutaţiile de la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 care sunt necesare prin aspectul specific implicat), unele exemple specifice, dar nelimitative, ale unor astfel de mutaţii/diferenţe de aminoacizi care pot fi prezente (adică în comparaţie cu secvenţele din SEQ ID NO: 1) sunt de exemplu E1D, P40A, P40L, P40S (şi în particular P40A), S49A, A74S, L78V, T87A sau oricare combinaţie adecvată a acestora. De asemenea, lianţii TNF conform dezvăluirii pot cuprinde în mod adecvat (o combinaţie adecvată de) mutaţii D60A, E61D şi/sau P62S, în particular ca un motiv ADS la poziţiile 60-62 (a se vedea SEQ ID NO: 39 pentru un exemplu nelimitativ). Alte exemple de mutaţii sunt (o combinaţie adecvată a) una sau mai multe substituţii potrivite "de umanizare"; de exemplu, se face referire la WO 2009/138519 (sau în stadiul tehnicii citat în WO 2009/138519) şi WO 2008/020079), precum şi tabelele A-3 până la A-8 din WO 2008/020079 (care sunt liste care prezintă posibile substituţii de umanizare). Dintre mutaţiile menţionate mai înainte, este preferată prezenţa unei mutaţii S49A, A74S şi/sau L78V (sau orice combinaţie adecvată a oricăror două dintre acestea, incluzând toate trei dintre acestea) (a se vedea SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, şi 62-63). Figura 5 prezintă o aliniere a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 31 şi SEQ ID NO: 36 până la 41. De asemenea, atunci când lianţii TNF conform invenţiei sunt prezenţi la şi/sau formează partea N-terminală a polipeptidei sau compusului în care aceştia sunt prezenţi, atunci aceştia conţin de preferinţă un D la poziţia 1 (adică o mutaţie E1D comparativ cu Referinţa A). În consecinţă, într-un alt aspect, invenţia se referă la o polipeptidă conform invenţiei (care este descrisă, în prezenta, în cele ce urmează) care are un liant TNF conform invenţiei (care este aşa cum este descris în cele ce urmează) la capătul N-terminal al acesteia, în care respectivul liant TNF conform invenţiei are un D la poziţia 1. În mod similar, atunci când un liant TNF conform invenţiei este utilizat în format monovalent, acesta are, de preferinţă, atât o extensie C-terminală X (n) aşa cum este descrisă în prezenta cât şi un D în poziţia 1. Unele exemple preferate dar nelimitative de lianţi TNF monovalenţi cu un D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală sunt date ca SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, şi 62-63, de preferinţă SEQ ID NO: 36, 39 şi 40, cel mai preferabil, SEQ ID NO: 40. În acest sens, trebuie remarcat faptul că lianţii TNF ai SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, şi 62-63 pot fi de asemenea utilizaţi într-un compus sau polipeptidă conform dezvăluirii care nu este într-un format monovalent. În acest caz, atunci când liganzii TNF ai SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, şi 62-63 vor avea, de preferinţă, un E în loc de un D la capătul lor N-terminal (adică o mutaţie D1E în comparaţie cu secvenţele din SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, şi 62-63) atunci aceştia nu sunt prezenţi la capătul N-terminal al respectivei polipeptide sau a compusului conform dezvăluirii (în schimb, de preferinţă ISVD N-terminal a numitei polipeptide sau a compusului conform dezvăluirii va avea un D la poziţia 1; de asemenea, aceştia, de preferinţă nu vor conţine o extensie C-terminală (cum ar fi alanina C-terminală prezentă în SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 şi 62-63) atunci când aceştia nu sunt prezenţi la capătul C-terminal al compusului sau polipeptidei (în schimb, de preferinţă, ISVD C-terminal al numitei polipeptide sau a compusului conform dezvăluirii va avea o extensie C-terminală). Prin intermediul unor exemple preferate, dar nelimitative, SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38 şi 62-63 sunt de asemenea exemple de lianţi TNF conform dezvăluirii care au alte diferenţe de aminoacizi cu SEQ ID NO: 1, adică S49A, A74S şi/sau L78V. Astfel, într-un aspect specific, invenţia se referă la lianţii TNF conform invenţiei (adică având mutaţii la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 aşa cum este descris în prezenta şi, de asemenea, în continuare fiind aşa cum este descris în prezenta) care au cel puţin o combinaţie adecvată a unei mutaţii S49A, A74S şi/sau L78V şi de preferinţă o combinaţie adecvată a oricăror două dintre aceste mutaţii, cum ar fi toate cele trei mutaţii. Lianţii TNF conform invenţiei, atunci când aceştia sunt utilizaţi într-un format monovalent şi/sau atunci când sunt prezenţi la şi/sau formează capătul C-terminal al proteinei, polipeptidei sau a altui compus sau construct în care aceştia sunt prezenţi (sau când aceştia, cu alte cuvinte au un capăt C-terminal "expus" într-o astfel de proteină, polipeptidă sau alt compus sau construct, prin care se înţelege, în general, că respectivul capăt al C-terminal al ISV nu este asociat sau legat de un domeniu constant (cum ar fi domeniul CH1); se face din nou referire la WO 2012/175741 şi WO 2015/1733256), de preferinţă au de asemenea o extensie C-terminală cu formula (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă, 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este ales în mod independent dintre resturile de aminoacizi care se găsesc în mod natural (deşi conform unui aspect preferat, acesta nu cuprinde nici un rest de cisteină) şi de preferinţă este ales, în mod independent din grupul constând din alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I). Conform unor exemple preferate, dar nelimitative ale unor astfel de extensii C-terminale X(n), X şi n pot fi după cum urmează:
(a) n = 1 şi X = Ala;
(b) n = 2 şi fiecare X = Ala;
(c) n = 3 şi fiecare X = Ala;
(d) n = 2 şi cel puţin un X = Ala (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
(e) n = 3 şi cel puţin un X = Ala (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
(f) n = 3 şi cel puţin doi X = Ala (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
(g) n = 1 şi X = Gly;
(h) n = 2 şi fiecare X = Gly;
(i) n = 3 şi fiecare X = Gly;
(j) n = 2 şi cel puţin un X = Gly (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
(k) n = 3 şi cel puţin un X = Gly (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
(l) n = 3 şi cel puţin doi X = Gly (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
(m) n = 2 şi fiecare X = Ala sau Gly;
(n) n = 3 şi fiecare X = Ala sau Gly;
(o) n = 3 şi cel puţin un X = Ala sau Gly (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile); sau
(p) n = 3 şi cel puţin doi X = Ala sau Gly (cu restul(resturile) de aminoacid(acizi) care rămâne(rămân) X fiind selectat în mod independent dintre oricare aminoacid care se găseşte în mod natural dar, de preferinţă fiind selectat în mod independent dintre Val, Leu şi/sau Ile);
cu aspectele (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) şi (n) preferate în mod particular, cu aspectele în care n =1 sau 2 preferate şi aspectele în care n = 1 preferate în mod particular.
De asemenea, trebuie remarcat faptul că, de preferinţă, orice extensie C-terminală prezentă într-un liant TNF conform invenţiei nu conţine un rest de cisteină (liber) (cu excepţia cazului în care restul de cisteină menţionat este utilizat sau destinat pentru o funcţionalizare ulterioară, de exemplu pentru pegilare).
Unele exemple specifice dar nelimitative de extensii C-terminale utile sunt următoarele secvenţe de aminoacizi: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA sau GAG.
Când lianţii TNF conform dezvăluirii conţin mutaţii la poziţiile 110 sau 112 (opţional în combinaţie cu mutaţiile din poziţia 11 şi/sau 89 aşa cum a fost descris în prezenta), resturile de aminoacid C-terminal ale cadrului 4 (începând de la poziţia 109) pot fi după cum urmează: (i) dacă nu este prezentă nici o extensie C-terminală: VTVKS (SEQ ID NO: 43), VTVQS (SEQ ID NO: 44), VKVSS (SEQ ID NO: 45) sau VQVSS (SEQ ID NO: 46); sau (ii) dacă este prezentă o extensie C-terminală: VTVKSX(n) (SEQ ID NO: 47), VTVQSX(n) (SEQ ID NO: 48), VKVSSX(n) (SEQ ID NO: 49) sau VQVSSX(n) (SEQ ID NO: 50), cum ar fi VTVKSA (SEQ ID NO: 51), VTVQSA (SEQ ID NO: 52), VKVSSA (SEQ ID NO: 53) sau VQVSSA (SEQ ID NO: 54). Când lianţii TNF conform dezvăluirii nu conţin mutaţii la poziţiile 110 sau 112 (dar numai mutaţii în poziţia 11 şi/sau 89 aşa cum a fost descris în prezenta), resturile de aminoacizi C-terminale ale cadrului 4 (începând de la poziţia 109) vor fi, de obicei, fie: (i) când nu este prezentă nici o extensie C-terminală: VTVSS (SEQ ID NO: 55) (ca în secvenţa SEQ ID NO: 1); sau (ii) când este prezentă o extensie C-terminală: VTVSSX(n) (SEQ ID NO: 56) cum ar fi VTVSSA (SEQ ID NO: 57). În aceste secvenţe C-terminale, X şi n sunt aşa cum au fost definiţi în prezenta pentru extensiile C-terminale.
Aşa cum se poate observa din alinierea din figura 4 precum şi din figura 3, lianţii TNF din SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, şi 62-63 au atât o mutaţie E1D cât şi o extensie alanină C-terminală. Aşa cum s-a menţionat, prezenţa atât a unui D la poziţia 1, cât şi a unei extensii C-terminale fac ca aceşti lianţi TNF (şi alţi lianţi TNF conform invenţiei cu un D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală) adecvaţi în mod particular pentru utilizare într-un format monovalent (adică pentru scopurile descrise în prezenta).
În consecinţă, într-un alt aspect, invenţia se referă la un liant TNF conform invenţiei (care este aşa cum este descris, în prezenta, în continuare) care are un D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală X(n) (care este, de preferinţă, un rest Ala unic). Lianţii TNF menţionaţi sunt de preferinţă (utilizaţi şi/sau destinaţi pentru utilizare) într-un format monovalent. Într-un aspect specific, respectivul liant TNF monovalent este SEQ ID NO: 40.
Unele exemple preferate dar nelimitative de lianţi TNF conform dezvăluirii sunt date în SEQ ID NO: 8 până la 41 şi 62-69 şi fiecare dintre aceste secvenţe formează un alt aspect al dezvăluirii (la fel ca proteinele, polipeptidele sau alţi compuşi sau constructe care cuprind una din aceste secvenţe).
Unii lianţi TNF deosebit de preferaţi conform dezvăluirii sunt secvenţele din SEQ ID NOs: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 şi 62-63 (sau, aşa cum este descris în prezenta, variante ale acestora cu un E la poziţia 1 şi/sau fără o extensie C-terminală, în funcţie de utilizarea intenţionată a acestora într-o polipeptidă sau un compus conform dezvăluirii).
Astfel, într-un prim aspect, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care are:
- o CDR1 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid TADMG (SEQ ID NO: 2); şi - o CDR2 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); şi - o CDR3 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum s-a definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(iile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri dar sunt, de preferinţă, prezente numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este ales în mod independent şi, de preferinţă este ales, în mod independent din grupul constând din alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
în care:
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este ales, de preferinţă dintre L sau V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, V sau L; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q; şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q;
astfel încât (i) poziţia 89 este T; sau (ii) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V; sau (iii) poziţia 89 este L şi poziţia 110 este K sau Q; sau (iv) poziţia 89 este L şi poziţia 112 este K sau Q; sau (v) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V şi poziţia 110 este K sau Q; sau (vi) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V şi poziţia 112 este K sau Q; sau (vii) poziţia 11 este V şi poziţia 110 este K sau Q; sau (vii) poziţia 11 este V şi poziţia 112 este K sau Q.
Într-un alt aspect, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care are:
- o CDR1 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid TADMG (SEQ ID NO: 2); şi - o CDR2 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); şi
- o CDR3 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având:
- un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
care domeniu variabil unic de imunoglobulină cuprinde următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 89T; sau - 89L în combinaţie cu 11V; sau - 89L în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 112K sau 112Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 112K sau 112Q; sau - 11V în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 11V în combinaţie cu 112K sau 112Q. În mod particular, lianţii TNF conform dezvăluirii, de preferinţă au nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi de exemplu doar 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri); În particular, în lianţii TNF furnizaţi prin dezvăluire, restul de aminoacid din poziţia 11 este V, restul de aminoacid din poziţia 89 este L, restul de aminoacid din poziţia 110 este T şi restul de aminoacid din poziţia 112 este S. Aşa cum este descris în prezenta, câteva exemple specifice, dar nelimitative, ale unor astfel de mutaţii/diferenţe de aminoacizi care pot fi prezente (adică în combinaţie adecvată) sunt de exemplu E1D, P40A, P40L, P40S (şi în particular P40A), S49A, A74S, L78V, T87A sau oricare combinaţie adecvată a acestora, precum şi de exemplu (o combinaţie adecvată de) D60A, E61D şi/sau mutaţii P62S (în special ca motiv ADS la poziţiile 60-62) şi (o combinaţie adecvată a, de exemplu a se vedea SEQ ID NO: 39) una sau mai multe substituţii "de umanizare" potrivite. Aşa cum s-a menţionat, de asemenea este preferată prezenţa unei mutaţii S49A, A74S şi/sau L78V (sau oricare combinaţie adecvată a oricăror două dintre acestea, incluzând toate cele trei), (precum şi prezenţa unui D la poziţia 1 când liantul TNF este prezent la şi/sau formează capătul N-terminal al unui compus sau a unei polipeptide conform dezvăluirii sau este în format monovalent). Liantul TNF conform invenţiei, cum ar fi un ISVD, cuprinde o alanină în poziţia 49 (A49). Într-un alt aspect preferat, liantul TNF conform dezvăluirii, cum ar fi un ISVD, cuprinde o serină în poziţia 74 (S74). Într-un aspect preferat, liantul TNF conform dezvăluirii, cum ar fi un ISVD, cuprinde o asparagină în poziţia 73 (N73) şi sau o lizină în poziţia 75 (K75). Aşa cum s-a menţionat, în dezvăluire, secvenţele de aminoacizi în care poziţia 89 este T sau în care poziţia 11 este V şi poziţia 89 este L (opţional în combinaţie adecvată cu o mutaţie 110K sau 110Q şi/sau o mutaţie 112K sau 112Q şi, în special în combinaţie cu o mutaţie 110K sau 110Q) sunt preferate în mod deosebit. Chiar mai preferate sunt secvenţele de aminoacizi în care poziţia 11 este V şi poziţia 89 este L, opţional cu o mutaţie 110K sau 110Q. Astfel, într-un aspect preferat, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care are: - o CDR1 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid TADMG (SEQ ID NO: 2); şi - o CDR2 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); şi - o CDR3 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4). şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
în care:
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este ales, de preferinţă dintre L sau V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este T; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q (şi este de preferinţă T); şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q (şi este de preferinţă S). Într-un alt aspect preferat, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină având: - o CDR1 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid TADMG (SEQ ID NO: 2); şi - o CDR2 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); şi - o CDR3 (conform Kabat) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
în care:
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este L; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q; şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q. Într-un aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat): - 11V în combinaţie cu 89L; sau - 11V în combinaţie cu 110K sau 110Q; - 11V în combinaţie cu 112K sau 112Q; - 11V în combinaţie cu 89L şi 110K sau 110Q; sau - 11V în combinaţie cu 89L şi 112K sau 112Q;
şi au CDR-uri (conform Kabat) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum este descris în prezenta.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 89L în combinaţie cu 11V; sau - 89L în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 112K sau 112Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 112K sau 112Q;
şi au CDR-uri (conform Kabat) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum este descris în prezenta.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 110K sau 110Q în combinaţie cu 11V; sau - 110K sau 110Q în combinaţie cu 89L; sau - 110K sau 110Q în combinaţie cu 11V şi 89L;
şi au CDR-uri (conform Kabat) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum este descris în prezenta.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 112K sau 112Q în combinaţie cu 11V; sau - 112K sau 112Q în combinaţie cu 89L; sau - 112K sau 112Q în combinaţie cu 11V şi 89L;
şi au CDR-uri (conform Kabat) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum este descris în prezenta.
Într-un alt aspect, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind un T la poziţia 89 şi au CDR-uri (conform Kabat) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum este descris în prezenta.
Într-un alt aspect, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind o V la poziţia 11 şi o L la poziţia 89 şi au CDR-uri (conform Kabat) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum este descris în prezenta.
Aşa cum s-a menţionat, lianţii TNF conform dezvăluirii conform aspectelor prezentate anterior sunt, de preferinţă, în continuare, astfel încât să conţină o combinaţie adecvată a unei mutaţii S49A, A74S şi/sau L78V şi, de preferinţă, o combinaţie adecvată a oricăror două dintre aceste mutaţii, cum ar fi toate trei dintre aceste mutaţii (şi din nou, atunci când liantul TNF este monovalent sau prezent la capătul N-terminal al unui compus sau polipeptidă conform dezvăluirii, de preferinţă, de asemenea, o mutaţie E1D).
Într-un alt aspect, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care are:
- o CDR1 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); şi - o CDR2 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); şi - o CDR3 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
în care:
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este ales, de preferinţă dintre L sau V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, V sau L; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q; şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q;
astfel încât (i) poziţia 89 este T; sau (ii) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V; sau (iii) poziţia 89 este L şi poziţia 110 este K sau Q; sau (iv) poziţia 89 este L şi poziţia 112 este K sau Q; sau (v) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V şi poziţia 110 este K sau Q; sau (vi) poziţia 89 este L şi poziţia 11 este V şi poziţia 112 este K sau Q; sau (vii) poziţia 11 este V şi poziţia 110 este K sau Q; sau (vii) poziţia 11 este V şi poziţia 112 este K sau Q.
Într-un alt aspect, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină având:
- o CDR1 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); şi - o CDR2 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); şi - o CDR3 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
care domeniu variabil unic de imunoglobulină cuprinde următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 89T; sau - 89L în combinaţie cu 11V; sau - 89L în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 112K sau 112Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 112K sau 112Q; sau - 11V în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 11V în combinaţie cu 112K sau 112Q. Aşa cum s-a menţionat, atunci când un liant TNF conform invenţiei este utilizat într-un format monovalent şi/sau este prezent la capătul C-terminal al unui compus conform dezvăluirii (aşa cum este definit în prezenta), liantul TNF (şi, în consecinţă, compusul care rezultă conform dezvăluirii) are, de preferinţă, o extensie C-terminală X(n), care extensie C-terminală poate fi aşa cum este descris în prezenta pentru lianţii TNF conform invenţiei şi/sau aşa cum este descris în WO 2012/175741 sau WO2015/173325. Aşa cum s-a menţionat în dezvăluire, secvenţele de aminoacizi în care poziţia 89 este T sau în care poziţia 11 este V şi poziţia 89 este L (opţional în combinaţie adecvată cu o mutaţie 110K sau 110Q şi/sau o mutaţie 112K sau 112Q şi în special în combinaţie cu o mutaţie 110K sau 110Q) sunt preferate în mod deosebit. Chiar mai preferate sunt secvenţele de aminoacizi în care poziţia 11 este V şi poziţia 89 este L, opţional cu o mutaţie 110K sau 110Q. Astfel, într-un aspect preferat, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care are: - o CDR1 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); şi - o CDR2 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); şi - o CDR3 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
în care:
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este ales, de preferinţă dintre L sau V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este T; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q (şi este, de preferinţă T); şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q (şi este, de preferinţă S). Într-un alt aspect preferat, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care are: - o CDR1 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); şi - o CDR2 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); şi - o CDR3 (în conformitate cu Abm) care este secvenţa de aminoacid PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4); şi având: - un grad de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă, precum şi CDR-urile nu sunt luate în considerare pentru determinarea gradului de identitate de secvenţă) de cel puţin 85%, preferabil cel puţin 90%, mai preferabil cel puţin 95%;
şi/sau
- nu mai mult de 7, cum ar fi nu mai mult de 5, de preferinţă nu mai mult de 3, cum ar fi numai 3, 2 sau 1 "diferenţe de aminoacizi" (aşa cum este definit în prezenta şi neluând în considerare niciuna dintre mutaţiile enumerate mai înainte în poziţia(ţiile) 11, 89, 110 sau 112 care pot fi prezente şi neluând în considerare nici o extensie C-terminală care poate fi prezentă) cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 (în care diferenţele de aminoacizi menţionate, dacă sunt prezente, pot fi prezente în cadre şi/sau CDR-uri, dar sunt prezente, de preferinţă, numai în cadre şi nu în CDR-uri);
şi opţional având:
- o extensie C-terminală (X)n, în care n este 1 până la 10, de preferinţă 1 până la 5, cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 (şi, de preferinţă 1 sau 2, cum ar fi 1); şi fiecare X este un rest de aminoacid (de preferinţă care se găseşte în mod natural) care este selectat, în mod independent şi, de preferinţă este selectat, în mod independent din grupul constând în alanină (A), glicină (G), valină (V), leucină (L) sau izoleucină (I);
în care:
- restul de aminoacid de la poziţia 11 este V; şi - restul de aminoacid de la poziţia 89 este L; şi - restul de aminoacid de la poziţia 110 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre T, K sau Q; şi - restul de aminoacid de la poziţia 112 este ales, în mod convenabil de preferinţă dintre S, K sau Q. Într-un aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat): - 11V în combinaţie cu 89L; sau - 11V în combinaţie cu 110K sau 110Q; - 11V în combinaţie cu 112K sau 112Q; - 11V în combinaţie cu 89L şi 110K sau 110Q; sau - 11V în combinaţie cu 89L şi 112K sau 112Q;
şi au CDR-uri (în conformitate cu Abm) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum a fost descris în prezenta.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 89L în combinaţie cu 11V; sau - 89L în combinaţie cu 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 112K sau 112Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 110K sau 110Q; sau - 89L în combinaţie cu 11V şi 112K sau 112Q;
şi au CDR-uri (în conformitate cu Abm) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum a fost descris în prezenta.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 110K sau 110Q în combinaţie cu 11V; sau - 110K sau 110Q în combinaţie cu 89L; sau - 110K sau 110Q în combinaţie cu 11V şi 89L;
şi au CDR-uri (în conformitate cu Abm) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum a fost descris în prezenta.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind următoarele resturi de aminoacizi (adică mutaţii în comparaţie cu secvenţa din SEQ ID NO: 1) la poziţiile menţionate (numerotare conform Kabat):
- 112K sau 112Q în combinaţie cu 11V; sau - 112K sau 112Q în combinaţie cu 89L; sau - 112K sau 112Q în combinaţie cu 11V şi 89L;
şi au CDR-uri (în conformitate cu Abm) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum a fost descris în prezenta.
Într-un alt aspect, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind un T la poziţia 89 şi au CDR-uri (în conformitate cu Abm) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum a fost descris în prezenta.
Într-un alt aspect, lianţii TNF conform dezvăluirii cuprind o V la poziţia 11 şi o L la poziţia 89 şi au CDR-uri (în conformitate cu Abm) şi au un grad global de identitate de secvenţă cu secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 care sunt aşa cum a fost descris în prezenta.
Aşa cum s-a menţionat, lianţii TNF conform dezvăluirii, conform aspectelor de mai înainte sunt, de preferinţă, în continuare, astfel încât să conţină o combinaţie adecvată a mutaţiei S49A, A74S şi/sau L78V şi, de preferinţă, o combinaţie adecvată a oricăror două dintre aceste mutaţii, cum ar fi toate trei dintre aceste mutaţii (şi din nou, atunci când liantul TNF este monovalent sau prezent la capătul N-terminal al unui compus sau polipeptidă conform invenţiei, de preferinţă, de asemenea, o mutaţie E1D).
Invenţia se referă la un liant TNF aşa cum este definit în revendicarea anexată şi în particular la un liant TNF care este într-un format monovalent şi care are un D la poziţia 1 (şi/sau o mutaţie E1D) şi o extensie C-terminală X(n) aşa cum este definit în revendicarea anexată (cum ar fi un rest de alanină C-terminală).
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care este sau constă în mod esenţial dintr-o secvenţă de aminoacid aleasă dintre una din următoarele secvenţe de aminoacizi: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 şi SEQ ID NO: 68.
Într-un alt aspect specific, dar nelimitativ, dezvăluirea se referă la un domeniu variabil unic de imunoglobulină care este sau constă în mod esenţial dintr-o secvenţă de aminoacid aleasă dintre una din următoarele secvenţe de aminoacizi: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 şi SEQ ID NO: 68.
Pentru scopurile invenţiei, tractul digestiv constă din gură, faringe, esofag, stomac, intestin subţire (duoden, jejun, ileu), intestin gros (cecum, colon, rect) şi anus.
Pentru scopurile invenţiei, se înţelege că "tractul gastrointestinal" sau "tractul GI" include stomacul, intestinul subţire (duoden, jejun, ileu), intestinul gros (cecum, colon, rect) şi anus. Termenul "digestie gastrică" aşa cum este utilizat în prezenta, se înţelege că descrie digestia în stomac, intestin subţire şi/sau intestin gros.
Termenul "degradare gastrică" a unui anticorp este utilizat în prezenta pentru a se referi la degradarea unui ISVD, compus sau polipeptidă conform invenţiei în stomac, intestin subţire, intestin gros de enzime endogene sau exogene prezente în stomac, intestin subţire şi intestin gros sau datorită expunerii la condiţii acide în timpul digestiei gastrice.
Termenul "ISVD stabilizat", "compuşi stabilizaţi" şi "polipeptide stabilizate", aşa cum este utilizat în prezenta, este înţeles pentru a descrie un ISVD, respectiv compus sau polipeptidă, care a fost proiectat pentru a îl(o) face mai stabil(ă) la degradarea în tractul digestiv atunci când este administrat local. În comparaţie cu un ISVD, compus sau polipeptidă care nu a fost prelucrat sau obţinut în conformitate cu invenţia, un ISVD compus sau polipeptidă stabilizat(ă), care este obţinut în conformitate cu invenţia este degradat mai încet sau într-o măsură mai mică prin digestia gastrică, cum ar fi digestia cu enzime endogene sau exogene prezente în stomac, intestinul subţire şi intestinul gros şi/sau în condiţiile acide prezente în stomac. "ISVD-rile stabilizate", "compuşii stabilizaţi" şi "polipeptidele stabilizate" sunt de asemenea denumiţi "ISVD-uri cu stabilitate îmbunătăţită la degradarea în tractul GI", "compuşi cu stabilitate îmbunătăţită la degradare în tractul GI" şi, respectiv, "polipeptide cu stabilitate îmbunătăţită la degradarea în tractul GI".
Administrarea topică a unui ISVD, compus sau polipeptidă la nivelul tractului digestiv este provocatoare deoarece tractul digestiv degradează şi digeră ISVD-urile, compuşii şi polipeptidele aplicate(ţi) local. În stomac, pH-ul scăzut şi pepsin proteaza degradează ISVD-urile, compuşii şi polipeptidele ingerate(ţi). În intestinul subţire, enzimele tripsină şi chimotripsină, printre altele, degradează ISVD-urile compuşii şi polipeptidele ingerate(ţi). În intestinul gros, proteazele derivate din bacterii degradează ISVD-urile compuşii şi polipeptidele ingerate(ţi). ISVD-urile, compuşii şi polipeptidele cu stabilitate îmbunătăţită la digestia gastrică ar fi preferate pentru aplicarea topică pe tractul Gi.
ISVD-urile, compuşii şi polipeptidele stabilizate(ţi) pot fi generate(ţi) prin mutaţia unuia sau a mai multor resturi de aminoacizi care sunt sensibile la degradarea gastrică în resturile de aminoacizi care sunt rezistente la degradarea gastrică. ISVD-urile, compuşii şi polipeptidele stabilizate(ţi) pot fi generate(ţi) prin mutaţia fragmentelor de resturi de aminoacizi multiple care cresc stabilitatea la degradarea gastrică.
Prin urmare, prezenta dezvăluire se referă la identificarea resturilor de aminoacizi care conferă stabilitatea liantului TNF conform invenţiei şi creşterea stabilităţii liantului TNF. De preferinţă, liantul TNF este mai rezistent la degradarea gastrică prin una sau mai multe condiţii de pH scăzut sau prin activităţile uneia sau mai multor proteaze cum ar fi pepsină, tripsină, chimotripsină şi/sau proteaze derivate din bacterii.
Într-o variantă de realizare, dezvăluirea se referă la o metodă de identificare a unui rest de aminoacid care conferă stabilitatea unui ISVD, compus sau polipeptidă la degradarea gastrică, metodă care cuprinde etapele de: (a) degradare a unui ISVD, compus sau polipeptidă cu una sau mai multe proteaze în fragmente; şi (b) analizarea fragmentelor din etapa (a) printr-un mijloc adecvat, cum ar fi de exemplu LC-MS; identificând astfel restul(urile) de aminoacizi care conferă stabilitatea unui ISVD, compus sau polipeptidă la degradarea gastrică.
Într-o variantă de realizare, dezvăluirea se referă la o metodă de îmbunătăţire a stabilităţii unui ISVD, compus sau polipeptidă la degradarea gastrică, metoda cuprinzând etapele (a) şi (b) prezentate anterior, urmate de: (c) mutarea restului (resturilor) care conferă stabilitatea unui ISVD, compus sau polipeptidă pentru degradarea gastrică; şi (d) repetarea etapelor (a) şi (b) prezentate anterior; prin care absenţa unuia sau a mai multor fragmente indică o stabilitate îmbunătăţită a ISVD, a compusului sau a polipeptidei la degradarea gastrică.
În prezenta descriere:
- termenul "domeniu variabil unic de imunoglobulină" (denumit de asemenea "ISV" sau ISVD") este utilizat, în general, pentru a se referi la domenii variabile de imunoglobulină (care pot fi domenii cu catenă lungă sau catenă uşoară, incluzând domeniile VH, VHH sau VL) care pot forma un site de legare a antigenului funcţional fără interacţiunea cu un alt domeniu variabil (de exemplu, fără o interacţiune VH/VL aşa cum este necesară între domeniile VH şi VL ale anticorpului monoclonal cu 4 catene convenţional). Exemplele de ISVD-uri vor fi clare pentru o persoană de specialitate şi includ, de exemplu, nanocorpi (incluzând un VHH, VHH umanizat şi/sau VHs camelizat cum ar fi VH's uman camelizat), IgNAR, domenii, anticorpi (cu un singur domeniu) (cum ar fi dAb's™) care sunt domenii VH sau care sunt derivate dintr-un domeniu VH şi anticorpi (cu un singur domeniu) (cum ar fi dAb's™) care sunt domenii VL sau care sunt derivate dintr-un domeniu VL. Cu excepţia cazului în care se indică în mod explicit altfel, sunt preferate în general ISVD-uri care sunt bazate pe şi/sau derivate din domenii variabile de catenă grea (cum ar fi domeniile VH sau VHH). Cel mai preferabil, cu excepţia cazului în care se indică în mod explicit altfel în acest document, un ISVD va fi un nanocorp. - termenul "nanocorp" este, în general, aşa cum este definit în WO 2008/020079 sau WO 2009/138519 şi astfel, într-un aspect specific, în general desemnează un VHH, VHH umanizat sau VH camelizat (cum ar fi un VH uman camelizat) sau, în general, VHH optimizat pentru secvenţă (cum ar fi de exemplu optimizat pentru stabilitate chimică şi/sau solubilitate, suprapunere maximă cu regiunile cadru umane cunoscute şi exprimare maximă). Este de remarcat faptul că termenii nanocorp sau nanocorpi sunt mărci comerciale înregistrate ale Ablynx N.V. şi, prin urmare, pot fi denumite, de asemenea, ca Nanobody® şi/sau Nanobodies®); - În general, dacă nu este indicat altfel, ISVD-urile, nanocorpii, polipeptidele, proteinele şi alţi compuşi şi constructe la care se face referire în prezenta vor fi destinate utilizării în profilaxia sau tratamentul bolilor sau tulburărilor la om (şi/sau opţional, de asemenea, la animalele cu sânge cald şi în special la mamifere). Astfel, în general, ISVD-urile, nanocorpii, polipeptidele, proteinele şi alţi compuşi şi constructe descrişi(se) în prezenta sunt de preferinţă astfel încât aceştia(acestea) pot fi utilizaţi(te) ca şi/sau pot fi în mod adecvat o parte a unui medicament (biologic) sau a altui compus farmaceutic sau terapeutic activ şi/sau un produs farmaceutic sau compoziţie. Un astfel de medicament, compus sau produs este, de preferinţă, astfel încât este adecvat pentru administrarea la o fiinţă umană, de exemplu pentru profilaxia sau tratamentul unui subiect care necesită o(un) astfel de profilaxie sau tratament sau, de exemplu, ca parte a unui studiu clinic. Aşa cum este descris, în prezenta în cele ce urmează, pentru acest scop, un astfel de medicament sau compus poate conţine alte fragmente, entităţi sau unităţi de legare în afară de ISVD-urile furnizate prin invenţie (care, aşa cum a fost descris în prezenta, poate fi, de exemplu, unul sau mai multe alte fragmente terapeutice în plus şi/sau una sau mai multe alte fragmente care influenţează proprietăţile farmacocinetice sau farmacodinamice ale produsului biologic pe bază de ISVD sau pe bază de nanocorp, cum ar fi timpul de înjumătăţire al acestuia). Exemple adecvate de alte astfel de fragmente terapeutice sau de altă natură vor fi clare pentru persoanele de specialitate şi, de exemplu, pot cuprinde, în general, orice proteină, polipeptidă sau alt domeniu de legare sau unitate de legare terapeutic activă, precum şi, de exemplu, modificări precum cele descrise la paginile 149 până la 152 din WO 2009/138159. Un produs biologic pe bază de ISVD sau pe bază de nanocorp este, de preferinţă, un agent terapeutic sau destinat utilizării ca agent terapeutic (care include profilaxia şi diagnosticul) şi, în acest scop, conţine de preferinţă cel puţin un ISVD împotriva unei ţinte relevante din punct de vedere terapeutic (cum ar fi de exemplu RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 sau alte interleukine etc.). Pentru unele exemple specifice, dar nelimitative, ale unor astfel de produse biologice pe bază de ISVD sau pe bază de nanocorp, se face referire la exemplele 8 până la 18 şi de asemenea, de exemplu, la diverse cereri de brevete ale Ablynx N.V. (cum ar fi de exemplu şi fără limitare WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 şi WO 2009/068627), precum şi de exemplu (şi fără limitare) la cererile de brevete cum ar fi WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 şi WO 2007/085814. De asemenea, aşa cum este descris mai departe în prezenta, fragmentul suplimentar poate fi un ISVD sau un nanocorp aşa cum este descris în prezenta direcţionat împotriva unei proteine serice (umane) cum ar fi albumina serică (umană), şi un astfel de ISVD sau nanocorp poate găsi, de asemenea, utilizări terapeutice în mod special în şi/sau pentru prelungirea timpului de înjumătăţire al lianţilor TNF descrişi în prezenta. De exemplu, se face referire la WO 2004/041865, WO 2006/122787 şi WO 2012/175400, care descriu, în general, utilizarea de nanocorpi care leagă albumina din ser pentru prelungirea timpului de înjumătăţire. De asemenea, în prezenta descriere, cu excepţia cazului în care se menţionează în mod explicit altfel, toţi termenii menţionaţi în prezenta au semnificaţia dată în WO 2009/138519 (sau în stadiul tehnicii citat în WO 2009/138519) sau WO 2008/020079 (sau în stadiul tehnicii citat în WO 2008/020079). De asemenea, în cazul în care o metodă sau o tehnică nu este descrisă în mod specific în prezenta, aceasta poate fi realizată aşa cum este descris în WO 2009/138519 (sau în stadiul tehnicii citat în WO 2009/138519) sau WO 2008/020079 (sau în stadiul tehnicii citat în WO 2008/020079). De asemenea, aşa cum este descris în prezenta, oricare produs sau compoziţie farmaceutică care cuprinde oricare ISVD sau compus conform invenţiei poate cuprinde, de asemenea, una sau mai multe componente suplimentare cunoscute per se pentru utilizare în produse sau compoziţii farmaceutice (adică în funcţie de forma farmaceutică dorită) şi/sau de exemplu unul sau mai mulţi alţi compuşi sau principii active destinate utilizării terapeutice (adică pentru a furniza un produs de combinaţie). De asemenea, când sunt utilizaţi în prezenta descriere sau în revendicări, următorii termeni au acelaşi înţeles ca cel prezentat şi/sau, dacă este cazul, pot fi determinaţi în modul descris în paginile 62-75 din WO 2009/138519: "agonist", "antagonist", " agonist invers", "rest de aminoacid neîncărcat, non-polar", "rest de aminoacid neîncărcat, polar", " rest de aminoacid încărcat, polar", " identitate de secvenţă", "exact la fel" şi "diferenţă de aminoacizi" (când se face referire la o secvenţă în comparaţie cu două secvenţe de aminoacizi), "(în) (formă)' în mod esenţial izolată; "domeniu", "domeniu de legare", "determinant antigenic", "epitop", "împotriva" sau "direcţionat împotriva" (un antigen),"specificitate" şi "timp de înjumătăţire". În plus, termenii "care modulează" şi "a modula", "site de interacţiune", "specific pentru", "a bloca încrucişat", "blocat încrucişat" şi "blocare încrucişată" şi "în mod esenţial independent de pH" sunt aşa cum sunt definiţi în (şi/sau pot fi determinaţi aşa cum este descris în) paginile 74-79 din WO 2010/130832 aparţinând Ablynx N.V.. De asemenea, când se face referire la un construct, compus, proteină sau polipeptidă conform invenţiei, termeni precum "monovalent", "bivalent" (sau "multivalent"), "bispecific" (sau "multispecific"), şi "biparatopic" (sau "multiparatopic") poate avea semnificaţia dată în WO 2009/138519, WO 2010/130832 sau WO 2008/020079. Termenul "timp de înjumătăţire" aşa cum este utilizat în prezenta în legătură cu un ISVD, nanocorp, produs biologic bazat pe ISVD şi produs biologic bazat pe nanocorp sau orice altă secvenţă de aminoacizi, compus sau polipeptidă la care se face referire în prezenta poate fi în general definit aşa cum este descris în paragraful o) la pagina 57 din WO 2008/020079 şi, aşa cum este menţionat în prezenta, se referă la timpul necesar pentru concentraţia serică a secvenţei de aminoacizi, compus sau polipeptidă care urmează să fie redusă cu 50%, in vivo, de exemplu datorită degradării secvenţei sau a compusului şi/sau clearance-ului sau sechestrării secvenţei sau compusului prin mecanisme naturale. Timpul de înjumătăţire in vivo al unei secvenţe de aminoacizi, compus sau polipeptidă conform invenţiei poate fi determinat în orice mod cunoscut per se, cum ar fi prin analiză farmacocinetică. Metodele adecvate vor fi clare pentru persoanele de specialitate în domeniu şi pot fi, de exemplu, în general, aşa cum este descris în paragraful o) de la pagina 57 din WO 2008/020079. După cum se menţionează şi la paragraful o) de la pagina 57 din WO 2008/020079, timpul de înjumătăţire poate fi exprimat utilizând parametri precum t1/2-alfa, t1/2-beta şi suprafaţa de sub curbă (AUC). În acest sens, trebuie remarcat faptul că termenul "timp de înjumătăţire" aşa cum se utilizează în prezenta se referă în special la timpul de înjumătăţire t1/2-beta sau terminal (în care t1/2-alfa şi/sau AUC sau ambele pot fi menţinute în afara consideraţiilor). De exemplu, se face referire la partea experimentală prezentată în cele ce urmează, precum şi la manualele standard, cum ar fi Kenneth, A şi colaboratorii: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists şi Peters şi colaboratorii, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Referinţa se face de asemenea la "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, ediţia a 2-a rev. (1982). În mod similar, termenii "creşterea timpului de înjumătăţire" sau "timpul de înjumătăţire crescut" sunt de asemenea definiţi la paragraful o) de la pagina 57 din WO 2008/020079 şi în special se referă la o creştere a t1/2-beta, cu sau fără o creştere a valorilor t1/2-alfa şi/sau AUC sau a ambelor. În consecinţă, într-un aspect, prezenta dezvăluire se referă la un compus aşa cum este descris în prezenta, în care compusul menţionat mai cuprinde un fragment de legare a proteinei serice. Într-un alt aspect, prezenta dezvăluire se referă la un compus aşa cum este descris în prezenta, în care respectivul fragment de legare a proteinei serice se leagă de albumină serică. Atunci când un termen nu este definit în mod specific în prezenta, acesta are înţelesul obişnuit în domeniu, care va fi clar pentru persoana de specialitate. De exemplu, se face referire la manualele standard, cum ar fi Sambrook şi colaboratorii, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel şi colaboratorii, ed, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing şi Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y, (1985); Old şi colaboratorii, "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt şi colaboratorii, "Immunology" (Ed. a-6-a), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt şi colaboratorii, Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); şi Janeway şi colaboratorii, "Immunobiology" (Ed. a-6-a), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), precum şi la stadiul tehnicii generale menţionate în acestea. De asemenea, aşa cum a fost indicat deja în prezenta, resturile de aminoacizi ale nanocorpilor sunt numerotate conform numerotării generale pentru VHs date de Kabat şi colaboratorii ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), aşa cum se aplică domeniilor VHH de Camelids în articolul Riechmann şi Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; sau referinţele menţionate în acesta. Conform acestei numerotări, FR1 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 1-30, CDR1 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 31-35, FR2 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 36-49, CDR2 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 50-65, FR3 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 66-94, CDR3 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 95-102, şi FR4 a unui nanocorp cuprinde resturile de aminoacizi de la poziţiile 103-113. \tab. Metodele alternative de numerotare a resturilor de aminoacizi ale domeniilor VH, metode care, de asemenea, pot fi aplicate într-o manieră analoagă domeniilor VHH de la camelide şi nanocorpi, sunt metoda descrisă de Chothia şi colaboratorii (Nature 342, 877-883 (1989)), aşa-numita "definiţie AbM" şi aşa-numita "definiţie de contact". Cu toate acestea, în dezvăluirea prezentă, aspecte şi figuri, va fi urmată numerotarea conform Kabat aşa cum este aplicată domeniilor VHH de către Riechmann şi Muyldermans, dacă nu se indică altceva. Trebuie de asemenea remarcat faptul că figurile, orice listă de secvenţe şi partea experimentală/exemplele sunt date numai pentru a ilustra în detaliu invenţia şi nu ar trebui interpretate sau considerate ca limitând sfera invenţiei şi/sau a revendicării anexate în nici un fel, cu excepţia cazului în care, în prezenta, se indică în mod explicit altfel. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la proteine, polipeptide şi alte constructe, molecule sau entităţi chimice care cuprind sau constau în mod esenţial în lianţii TNF conform invenţiei, aşa cum este descris în prezenta (adica care cuprind sau constau, în mod esenţial, dintr-unul sau mai mulţi astfel de lianţi TNF, cum ar fi unul, doi sau trei astfel de lianţi TNF); la metode de exprimare/producere a lianţilor TNF conform invenţiei şi/sau pentru exprimarea/producerea proteinelor, polipeptidelor şi a altor constructe, molecule sau entităţi chimice care le cuprind; la compoziţii şi produse (cum ar fi compoziţii şi produse farmaceutice) care cuprind lianţii TNF conform invenţiei şi/sau proteine, polipeptide şi alte constructe, molecule sau entităţi chimice care le cuprind; la secvenţa de nucleotide şi la acizii nucleici care codifică lianţii TNF conform invenţiei şi/sau care codifică proteinele sau polipeptidele care le cuprind; şi la utilizările (şi în special utilizări terapeutice, profilactice şi de diagnosticare) a lianţilor TNF conform invenţiei şi a proteinelor, polipeptidelor şi altor constructe, molecule sau entităţi chimice care le cuprind. Acestea şi alte aspecte, variante de realizare, avantaje, aplicaţii şi utilizări ale dezvăluirii vor deveni clare din descrierea în detaliu prezentată. În consecinţă, într-un alt aspect, dezvăluirea se referă la proteine (cum ar fi proteine de fuziune), polipeptide, constructe, compuşi sau alte entităţi chimice care cuprind sau constau, în mod esenţial, din cel puţin un liant TNF conform invenţiei (cum ar fi unul, doi sau trei) (denumiţi în mod colectiv în prezenta "compuşi conform dezvăluirii", "polipeptide conform dezvăluirii", "constructe conform dezvăluirii", sau "proteine de fuziune conform dezvăluirii"). Prin urmare, compusul conform dezvăluirii poate fi o polipeptidă. Astfel de compuşi conform dezvăluirii pot, pe lângă unul sau mai mulţi lianţi TNF conform invenţiei, să mai conţină una sau mai multe alte secvenţe de aminoacizi, entităţi chimice sau fragmente. Aceste alte secvenţe de aminoacizi, entităţi sau fragmente chimice pot conferi una sau mai multe proprietăţi dorite compusului (care rezultă) conform dezvăluirii şi/sau pot modifica proprietăţile compusului (care rezultă) conform dezvăluirii într-o manieră dorită, de exemplu pentru a furniza compusul (care rezultă) conform dezvăluirii cu o activitate biologică şi/sau terapeutică dorită (de exemplu, pentru a oferi compusul care rezultă conform dezvăluirii cu afinitate şi, de preferinţă, eficacitate faţă de o altă ţintă relevantă din punct de vedere terapeutic astfel încât compusul rezultat să devină "bispecific" faţă de TNF şi acea altă ţintă relevantă din punct de vedere terapeutic), pentru a asigura un timp de înjumătăţire dorit şi/sau (altfel) să modifice sau să îmbunătăţească proprietăţile farmacocinetice şi/sau farmacodinamice, pentru a direcţiona compusul conform dezvăluirii către celule, ţesuturi sau organe specifice (incluzând celulele canceroase şi ţesuturile canceroase), pentru a asigura un efect citotoxic şi/sau pentru a servi ca marcaj detectabil sau marcaj. Unele exemple nelimitative ale unor astfel de secvenţe de aminoacizi, entităţi chimice sau fragmente sunt: - unul sau mai mulţi linkeri adecvaţi (cum ar fi un linker 9GS, 15GS sau 35GS); şi/sau - unul sau mai multe domenii de legare sau unităţi de legare care sunt direcţionate împotriva unei ţinte relevante din punct de vedere terapeutic, alta decât TNF (adică astfel încât să se asigure un compus conform invenţiei care este bispecific atât faţă de TNF, cât şi faţă de cealaltă ţintă relevantă din punct de vedere terapeutic); şi/sau - unul sau mai multe domenii de legare sau unităţi de legare care asigură o creştere a timpului de înjumătăţire (de exemplu, un domeniu de legare sau o unitate de legare care se poate lega de o proteină serică cum ar fi albumina serică); şi/sau - unul sau mai multe domenii de legare sau unităţi de legare care ţinteşte compusul conform dezvăluirii către o celulă, ţesut sau organ dorit (cum ar fi o celulă de cancer); şi/sau - unul sau mai multe domenii de legare sau unităţi de legare care asigură o specificitate crescută faţă de TNF (de obicei, acestea vor putea să se lege de TNF, dar, în general, prin ei înşişi nu vor fi funcţionali faţă de TNF); şi/sau - un domeniu de legare, o unitate de legare sau o altă entitate chimică care permite ca compusul conform dezvăluirii să fie internalizat într-o celulă (dorită) (de exemplu, un nanocorp anti-EGFR de internalizare aşa cum este descris în WO 2005/044858); şi/sau - un fragment care îmbunătăţeşte timpul de înjumătăţire cum ar fi o grupare de polietilenglicol adecvată (adică PEGilare) sau o secvenţă de aminoacizi care asigură o perioadă de înjumătăţire crescută cum ar fi albumina serică umană sau un fragment adecvat al acesteia (adică albumină de fuziune) sau, de exemplu, o peptidă de legare a albuminei serice aşa cum este descris în WO 2008/068280; şi/sau - o sarcină utilă precum o sarcină utilă citotoxică; şi/sau - un marcaj sau un marcaj detectabil, cum ar fi un marcaj radiologic sau un marcaj fluorescent; şi/sau - un marcaj care poate ajuta la imobilizarea, detectarea şi/sau purificarea compusului conform dezvăluirii, cum ar fi un marcaj HIS sau un marcaj FLAG3; şi/sau - un marcaj care poate fi funcţionalizat, cum ar fi un marcaj de tip GGC sau GGGC C-terminal; şi/sau - o extensie C-terminală X(n), care poate fi aşa cum este descrisă în prezenta în continuare pentru lianţii TNF conform invenţiei şi/sau aşa cum este descrisă în WO 2012/175741 sau WO2015/173325. Deşi mai puţin preferat în mod obişnuit, nu este exclus, de asemenea, că compuşii conform dezvăluirii pot conţine, de asemenea, una sau mai multe părţi sau fragmente ale unui anticorp convenţional (de preferinţă uman) (cum ar fi o parte Fc sau un fragment funcţional al acestuia sau unul sau mai multe domenii constante) şi/sau dintr-un anticorp doar catena grea Camelid (cum ar fi unul sau mai multe domenii constante). Într-un aspect particular, prezenta dezvăluire se referă la un construct care cuprinde sau constă în mod esenţial dintr-un ISVD aşa cum este definit în prezenta sau un compus aşa cum este definit în prezenta şi care mai cuprinde una sau mai multe alte grupări, resturi, fragmente sau unităţi de legare, legate, în mod opţional prin unul sau mai mulţi linkeri peptidici. Într-un alt aspect particular, prezenta dezvăluire se referă la un construct aşa cum este definit în prezenta, în care respectiva una sau mai multe alte grupări, resturi, fragmente sau unităţi de legare este(sunt) aleasă(alese) din grupul constând dintr-o moleculă de polietilenglicol, proteine serice sau fragmente ale acestora, unităţi de legare care se pot lega la proteinele serice, o porţiune Fc şi proteine mici sau peptide care se pot lega de proteinele serice. Atunci când compuşii conform dezvăluirii conţin unul sau mai multe alte domenii de legare sau alte unităţi de legare (de exemplu, un alt domeniu de legare în mod esenţial nefuncţional sau unitate de legare faţă de TNF, care asigură o specificitate crescută faţă de TNF, un domeniu de legare sau o unitate de legare faţă de o altă ţintă terapeutică alat decât TNF, un domeniu de legare sau o unitate de legare faţă de o ţintă cum ar fi albumina serică umană care asigură un timp de înjumătăţire crescut şi/sau un domeniu de legare sau o unitate de legare care vizează compusul conform dezvăluirii la o anumită celulă, ţesut sau organ şi/sau care permite ca compusul conform dezvăluirii să fie internalizat într-o celulă), aceste alte domenii de legare sau unităţi de legare cuprind, de preferinţă, unul sau mai multe ISVD-uri, şi mai preferabil toate sunt ISVD-uri. De exemplu şi fără limitare, aceşti unul sau mai multe domenii de legare suplimentare sau unităţi de legare pot fi unul sau mai mulţi nanocorpi (incluzând un VHH, un VHH umanizat şi/sau un VH camelizat cum ar fi VH's uman camelizat), un anticorp (domeniu unic) care este un domeniu VH sau care este derivat dintr-un domeniu VH, un dAb care este sau constă în mod esenţial dintr-un domeniu VH sau care este derivat dintr-un domeniu VH sau chiar un anticorp domeniu (unic) sau un dAb care este sau constă în mod esenţial din domeniul VL. În mod special, aceste unul sau mai multe domenii de legare sau unităţi de legare, atunci când sunt prezente, pot cuprinde unul sau mai mulţi nanocorpi, şi în special toţi sunt nanocorpi. Când un compus conform dezvăluirii are un ISVD la capătul său C-terminal (care ISVD C-terminal poate fi un liant TNF conform invenţiei sau poate fi, de exemplu, dacă este prezent în compusul invenţiei, un alt ISVD, în mod esenţial nefuncţional faţă de TNF care asigură o specificitate crescută faţă de TNF, un ISVD împotriva unei ţinte terapeutice, alta decât TNF, un ISVD împotriva unei ţinte cum ar fi albumina serică umană care asigură un timp de înjumătăţire crescut sau un ISVD care ţinteşte compusul conform dezvăluirii către o anumită celulă, ţesut sau organ şi/sau care permite ca compusul conform dezvăluirii să fie internalizat într-o celulă), atunci compusul conform dezvăluirii (adică respectivul ISVD C-terminal) are, de preferinţă, o extensie C-terminală X(n), care extensie C-terminală poate fi aşa cum este descris în prezenta pentru lianţii TNF conform dezvăluirii şi/sau aşa cum este descris în WO 2012/175741 sau WO2015/173325. Când un compus conform dezvăluirii conţine în plus faţă de unul sau mai mulţi lianţi TNF conform invenţiei, oricare altul dintre ISVD-uri (care unul sau mai multe ISVD-uri suplimentare pot, aşa cum s-a menţionat, să fie un ISVD în mod esenţial nefuncţional faţă de TNF care asigură specificitate crescută faţă de TNF, un ISVD împotriva unei ţinte terapeutice, alta decât TNF, un ISVD împotriva unei ţinte cum ar fi albumina serică umană care asigură un timp de înjumătăţire crescut şi/sau un ISVD care ţinteşte compusul conform dezvăluirii către o celulă, ţesut sau organ şi/sau care permite ca compusul conform dezvăluirii să fie internalizat într-o celulă) şi unde astfel de ISVD-uri suplimentare sunt nanocorpi sau ISVD-uri care sunt, care constau, în mod esenţial şi/sau care sunt derivate din secvenţele VH, conform unui aspect preferat al dezvăluirii, respectivul(respectivele) unul sau mai multe (şi de preferinţă toate) ISVD-urile suplimentare prezente în compusul conform dezvăluirii va conţine în secvenţa lor una sau mai multe mutaţii cadru care reduc legarea prin anticorpii preexistenţi. În particular, conform acestui aspect al dezvăluirii, astfel de ISVD-uri suplimentare pot conţine (o combinaţie adecvată de) resturi/mutaţii de aminoacizi la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 care sunt aşa cum sunt descrise în WO2015/173325 şi/sau care sunt, în mod esenţial aşa cum este descris în prezenta pentru lianţii TNF conform invenţiei. Într-un aspect specific, atunci când compusul conform dezvăluirii are un astfel de ISVD la capătul C-terminal (adică nu are liantul TNF conform invenţiei la capătul C-terminal al acestuia), atunci cel puţin ISVD menţionat care este prezent la şi/sau formează capătul C-terminal are astfel de mutaţii cadru care reduc legarea prin anticorpi preexistenţi (şi ISVD-ul C-terminal menţionat va avea, de preferinţă, de asemenea o extensie C-terminală X(n) aşa cum este descris în prezenta). Aşa cum s-a menţionat, atunci când compusul conform dezvăluirii trebuie să aibă o durată de înjumătăţire crescută (adică în comparaţie cu liantul TNF monovalent conform invenţiei), compusul conform dezvăluirii conţine, de preferinţă, cel puţin un ISVD (cum ar fi unul) (şi în special nanocorp) care asigură un astfel de timp de înjumătăţire crescut. Un astfel de ISVD va fi, de obicei, direcţionat împotriva unei proteine serice adecvate cum ar fi transferina şi în special împotriva albuminei serice (umane). În particular, un astfel de ISVD sau nanocorp poate fi un (singur) anticorp domeniu sau dAb împotriva albuminei serice umane aşa cum este descris, de exemplu în EP 2 139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400, WO 2014/111550 şi poate fi, în special, un nanocorp de legare a albuminei serice, aşa cum este descris în WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400 sau WO2015/173325. ISVD-urile de legare a albuminei serice preferate în mod special sunt nanocorpul Alb-1 (a se vedea WO 2006/122787) sau variantele umanizate ale acestuia cum ar fi Alb-8 (WO 2006/122787, SEQ ID NO: 62), Alb-23 (WO 2012/175400, SEQ ID NO: 1) şi alte variante umanizate (şi de preferinţă, de asemenea, optimizate în secvenţă) ale Alb-1 şi/sau variantele Alb-8 sau Alb-23 (sau mai general ISVD-uri care au în mod esenţial aceleaşi CDR-uri ca Alb-1, Alb-8 şi Alb-23). Din nou, aşa cum s-a menţionat, o astfel de ISVD de legare a albuminei serice, atunci când este prezent, poate conţine în secvenţa sa una sau mai multe mutaţii cadru care reduc legarea prin anticorpi preexistenţi. În particular, atunci când un astfel de ISVD de legare a albuminei serice este un nanocorp sau un anticorp cu domeniu (unic) care este, constă în mod esenţial din şi/sau este derivat dintr-un domeniu VH, ISVD care leagă albumina serică poate conţine (o combinaţie adecvată de) resturi de aminoacizi/mutaţii la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 care sunt aşa sunt descrise în WO2015/173325 şi/sau care sunt în mod esenţial aşa cum este descris în prezenta pentru lianţii TNF conform invenţiei. De exemplu, WO2015/173325 descrie un număr de variante de Alb-1, Alb-8 şi Alb-23 care conţin resturi de aminoacizi/mutaţii la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 care reduc legarea prin anticorpii preexistenţi care pot fi utilizaţi în compuşii conform dezvăluirii. Într-un aspect particular, dar nelimitativ al dezvăluirii, invenţia furnizează un compus conform dezvăluirii, cum ar fi o polipeptidă conform dezvăluirii, cuprinzând pe lângă unul sau mai multe blocuri de structurare a unui construct, de exemplu ISVD-uri, TNF de legare, cel puţin un bloc de structurare a unui construct care leagă albumina serică, cum ar fi un ISVD care leagă albumina serică, de preferinţă care leagă albumină serică umană, aşa cum este descris în prezenta, în care ISVD de legare a albuminei serice, menţionat constă, în mod esenţial, din 4 regiuni cadru (FR1, respectiv până la FR4) şi 3 regiuni de determinare a complementarităţii (CDR1 până la CDR3 respectiv), în care CDR1 este SFGMS, CDR2 este SISGSGSDTLYADSVKG şi CDR3 este GGSLSR. De preferinţă ISVD care leagă albumina serică umană, menţionat este ales din grupul constând în Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 sau Alb223 (conform Tabelului D). Din nou, atunci când un astfel de ISVD de legare a albuminei serice este prezent la capătul C-terminal al unui compus conform dezvăluirii, ISVD care leagă albumina serică (şi ca rezultat, compusul conform invenţiei) are, de preferinţă, o extensie C-terminală Xn), care extensie C-terminală poate fi aşa cum este descrisă în prezenta pentru lianţii TNF conform invenţiei şi/sau aşa cum este descris în WO 2012/175741 sau WO2015/173325. De asemenea, de preferinţă acesta are mutaţii care reduc legarea anticorpilor preexistenţi, cum ar fi (o combinaţie adecvată) de resturi de aminoacizi/mutaţii la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 descrise în WO2015/173325. Totuşi, aşa cum s-a menţionat, în sfera invenţiei sunt, de asemenea, incluse alte mijloace de creştere a timpului de înjumătăţire al unui compus conform dezvăluirii (cum ar fi PEGilare, fuziune cu albumina umană sau un fragment corespunzător al acesteia sau utilizarea unei peptide de legare a albuminei serice adecvate), deşi mai puţin preferate. Prin urmare, într-o variantă de realizare prezenta dezvăluire se referă la un compus aşa cum este descris în prezenta, în care respectivul fragment de legare a proteinei serice este o polipeptidă pe bază pe non-anticorp. Într-o altă variantă de realizare prezenta dezvăluire se referă la un compus aşa cum este descris în prezenta cuprinzând, suplimentar, PEG. În general, atunci când un compus conform dezvăluirii are o durată de înjumătăţire crescută (de exemplu, prin prezenţa unui ISVD care creşte timpul de înjumătăţire sau a oricărui alt mod adecvat de creştere a timpului de înjumătăţire), compusul care rezultă conform dezvăluirii are, de preferinţă, un timp de înjumătăţire (aşa cum s-a definit în prezenta), care este de cel puţin de 2 ori, de preferinţă de cel puţin 5 ori, de exemplu de cel puţin 10 ori sau de peste 20 ori, mai mare decât timpul de înjumătăţire al liantului TNF monovalent conform invenţiei (aşa cum este măsurat la om şi/sau un model animal adecvat, cum ar fi şoarece sau maimuţă cynomolgus). În particular, un compus conform dezvăluirii are, de preferinţă, un timp de înjumătăţire (aşa cum este definit în prezenta) la subiecţii umani de cel puţin 1 zi, de preferinţă cel puţin 3 zile, mai preferabil cel puţin 7 zile, cum ar fi cel puţin 10 zile. Va fi clar conform dezvăluirea din prezenta că compuşii conform dezvăluirii care se bazează pe unul sau mai multe ISVD-uri pot avea diferite "formate", de exemplu în mod esenţial poate să fie monovalent, bivalent sau trivalent, poate fi monospecific, bispecific, trispecific etc. şi poate fi biparatopic (aşa cum este definit în prezenta şi de exemplu în WO 2009/068625). De exemplu, un compus conform dezvăluirii poate fi: - (în mod esenţial) monovalent, adică (în mod esenţial) cuprinzând un singur liant TNF conform invenţiei. Aşa cum s-a menţionat, atunci când este utilizat în format monovalent, un liant TNF conform invenţiei are, de preferinţă, o extensie C-terminală X(n) aşa cum este descris mai departe în prezenta. Un astfel de compus conform invenţiei poate avea, de asemenea, timpul de înjumătăţire prelungit; - (în mod esenţial) bivalent sau trivalent şi monospecific. Un astfel de compus conform dezvăluirii va cuprinde două sau mai multe ISVD-uri faţă de TNF, care pot fi identice sau diferite şi când sunt diferite pot fi direcţionate împotriva aceluiaşi epitop pe TNF sau împotriva diferiţilor epitopi pe TNF (în ultimul caz, astfel încât să asigure un compus biparatopic sau multiparatopic conform dezvăluirii). Un astfel de compus al dezvaluirii poate fi de asemenea timpul de înjumătăţire prelungit; - (în mod esenţial) bivalent, trivalent (sau multivalent) şi bispecific sau trispecific (sau multispecific). Un astfel de compus conform dezvăluirii va fi direcţionat împotriva TNF şi cel puţin a unei alte ţinte. Aşa cum este descris în prezenta, respectiva altă ţintă poate fi, de exemplu, o altă ţintă relevantă din punct de vedere terapeutic (adică alta decât TNF), astfel încât să furnizeze un compus conform dezvăluirii care este bispecific cu privire la TNF şi la respectiva altă ţintă terapeutică. Această altă ţintă poate fi, de asemenea, o ţintă care asigură un timp de înjumătăţire crescut (cum ar fi albumina serică umană), astfel încât să furnizeze un compus conform dezvăluirii care are o timpul de înjumătăţire crescut. Aşa cum s-a menţionat anterior, o astfel de ţintă poate permite, de asemenea, ca compusul conform dezvăluirii să fie ţintit către celule, ţesuturi sau organe specifice sau poate permite ca compusul conform dezvăluirii să fie internalizat într-o celulă. Este, de asemenea, posibilă combinarea acestor abordări/ISVD-uri, de exemplu, pentru a furniza un compus conform dezvăluirii care este bispecific pentru TNF şi pentru cel puţin o altă ţintă relevantă din punct de vedere terapeutic şi care are timpul de înjumătăţire prelungit. Din nou, de preferinţă, atunci când aceşti compuşi conform dezvăluirii conţin unul sau mai multe ISVD-uri, altele decât cel puţin un liant TNF conform invenţiei, cel puţin unul şi de preferinţă toate celelalte ISVD-uri vor conţine în secvenţa sa una sau mai multe mutaţii cadru care reduc legarea prin anticorpi preexistenţi (cum ar fi, în particular, o combinaţie de resturi de aminoacizi/mutaţii la poziţiile 11, 89, 110 şi/sau 112 care este aşa cum s-a descris în prezenta pentru lianţii TNF conform invenţiei şi/sau aşa cum este descris, n general, în WO2015/173325). De asemenea, atunci când astfel de compuşi conform dezvăluirii au un liant TNF conform invenţiei la capătul C-terminal al acestora, atunci liantul TNF C-terminal menţionat (şi ca rezultat, compusul conform dezvăluirii) va avea, de preferinţă, o extensie C-terminală X(n) aşa cum este descris în prezenta. În mod similar, atunci când astfel de compuşi conform dezvăluirii au un alt ISVD la capătul lor C-terminal (adică nu este un liant TNF conform invenţiei, ci, de exemplu, un ISVD care extinde timpul de înjumătăţire), atunci respectivul ISVD C-terminal (şi ca rezultat, compusul conform invenţiei) va avea de preferinţă o extensie C-terminală X(n) aşa cum este descris în prezenta şi/sau va conţine în secvenţa sa una sau mai multe mutaţii cadru care reduc legarea prin anticorpi preexistenţi (din nou, aşa cum este descris mai departe în prezenta şi în WO2015/173325). Aşa cum va fi clar pentru persoana de specialitate, atunci când un compus conform dezvăluirii este destinat utilizării topice (de exemplu pe piele sau în ochi) sau este de exemplu menit să aibă o acţiune terapeutică (localizată) undeva în, de exemplu, tractul GI (gastrointestinal; de exemplu, după administrarea pe cale orală sau administrarea prin supozitor) sau în plămâni (de exemplu, după administrarea prin inhalare) sau este altfel menit să fie aplicat direct la locul de acţiune intenţionat (de exemplu, prin injectare directă), un compus conform dezvăluirii nu va necesita, de obicei, prelungirea timpului de înjumătăţire. De asemenea, pentru tratamentul anumitor afecţiuni sau semne acute, poate fi de preferat să nu existe un timp de înjumătăţire prelungit. În aceste cazuri, este preferată utilizarea unui compus monovalent conform dezvăluirii sau a unui compus conform dezvăluirii (cuprinzând liantul TNF) fără prelungirea timpului de înjumătăţire (de exemplu, un compus conform invenţiei care este bivalent sau biparatopic faţă de TNF). Unele exemple preferate, dar nelimitative ale unor astfel de compuşi conform dezvăluirii sunt reprezentaţi schematic în Tabelul C-1 prezentat în cele ce urmează şi fiecare dintre acestea formează un alt aspect al invenţiei. Alte exemple de compuşi adecvaţi, conform prezentei dezvăluiri, fără prelungirea timpului de înjumătăţire, vor fi clare pentru persoana de specialitate, bazată pe dezvăluirea de faţă. Aşa cum va fi clar pentru persoana de specialitate, atunci când un compus conform dezvăluirii este destinat administrării sistemice şi/sau pentru prevenirea şi/sau tratamentul unei boli cronice sau unei tulburări cronice, va fi preferat de obicei ca respectivul compus conform dezvăluirii să aibă timpul de înjumătăţire crescut (aşa cum este definit în prezenta), adică în comparaţie cu liantul (lianţii) TNF prezent(prezenţi) într-un astfel de compus conform dezvăluirii. Mai preferabil, un astfel de compus conform dezvăluirii va conţine un ISVD care prelungeşte timpul de înjumătăţire, cum ar fi, de preferinţă, un ISVD şi, în special, un nanocorp care se leagă la albumina serică umană (aşa cum este descris în prezenta). Unele exemple preferate, dar nelimitative ale unor astfel de compuşi conform dezvăluirii sunt reprezentaţi schematic în Tabelul C-2 prezentat în cele ce urmează şi fiecare dintre acestea formează un alt aspect al invenţiei. Alte exemple de compuşi adecvaţi conform dezvăluirii cu prelungirea timpului de înjumătăţire vor fi clare pentru persoanele de specialitate bazate pe dezvăluirea de faţă. În general, pentru compuşii conform dezvăluirii cu prelungirea timpului de înjumătăţire, este mai preferată prezenţa unei extensii C-terminale. Domeniile variabile unice de imunoglobulină pot fi utilizate ca un "bloc de structurare a unui construct" pentru prepararea unui compus, cum ar fi o polipeptidă conform dezvăluirii, care poate conţine, opţional, unul sau mai multe "blocuri de structurare a unui construct" suplimentare, cum ar fi ISVD-uri, împotriva aceluiaşi sau a altui epitop pe TNF şi/sau împotriva unuia sau mai multor alte antigene, proteine sau ţinte decât TNF, de exemplu blocuri de structurare a unui construct care au un mod de acţiune terapeutic. În general, compuşii, polipeptidele sau constructele care cuprind sau constau în mod esenţial dintr-un singur bloc structural al unui construct, un domeniu variabil unic de imunoglobulină sau un nanocorp unic vor fi denumiţi în continuare compuşi "monovalenţi" sau polipeptide "monovalente" sau, respectiv, "constructe monovalente". Compuşii, polipeptidele sau constructele care cuprind două sau mai multe blocuri de structurare a unui construct sau unităţi de legare (cum ar fi de exemplu, ISVD-uri) vor fi de asemenea menţionaţi în prezenta ca compuşi, polipeptide sau constructe "multivalenţi(te)" şi blocurile de structurare a unui construct/ISVD prezente în astfel de compuşi, polipeptide sau constructe vor fi de asemenea menţionate în prezenta ca fiind într-un "format multivalent". De exemplu, un compus "bivalent" sau polipeptidă "bivalentă" poate cuprinde două domenii variabile unice de imunoglobulină, opţional legate printr-o secvenţă linker, în timp ce un compus "trivalent" sau polipeptidă "trivalentă" poate cuprinde trei domenii variabile unice de imunoglobulină, opţional legate prin două secvenţe linker; în timp ce un compus "tetravalent" sau polipeptidă "tetravalentă" poate cuprinde patru domenii variabile unice de imunoglobulină, opţional legate prin intermediul a trei secvenţe linker, etc. Într-un compus, polipeptidă sau construct multivalent, cele două sau mai multe ISVD-uri, cum ar fi nanocorpi pot fi aceleaşi sau diferite şi pot fi direcţionate împotriva aceluiaşi antigen sau determinant antigenic (de exemplu împotriva aceleiaşi(aceloraşi) părţi sau epitop(i) sau împotriva unor părţi diferite sau epitopi diferiţi) sau pot fi direcţionate, în mod alternativ împotriva antigenilor diferiţi sau determinanţilor antigenici; sau orice combinaţie adecvată a acestora. Compuşii, polipeptidele sau constructele care conţin cel puţin două blocuri de structurare a unui construct (cum ar fi de exemplu, ISVD-uri) în care cel puţin un bloc de structurare a unui construct este direcţionat împotriva unui prim antigen (adică, TNF) şi cel puţin un bloc de structurare a unui construct este direcţionat împotriva unui al doilea antigen (adică, diferit de TNF) vor fi de asemenea menţionaţi drept compuşi "multispecifici", polipeptide "multispecifice" sau constructe "multispecifice", respectiv blocuri de structurare a unui construct (cum ar fi de exemplu, ISVD-uri) prezente în astfel de compuşi, polipeptide sau constructe vor fi de asemenea menţionaţi(te) în prezenta ca fiind într-un "format multispecific". Astfel, de exemplu, un compus "bispecific" sau polipeptidă "bispecifică" conform dezvăluirii este un compus sau polipeptidă care cuprinde cel puţin un ISVD direcţionat împotriva unui prim antigen (adică, TNF) şi cel puţin un alt ISVD direcţionat împotriva unui al doilea antigen (adică, diferit de TNF), în timp ce un compus "trispecific" sau polipeptidă "trispecifică" conform dezvăluirii este un compus sau polipeptidă care cuprinde cel puţin un ISVD direcţionat împotriva unui prim antigen (adică, TNF), cel puţin un alt ISVD direcţionat împotriva unui al doilea antigen (adică, diferit de TNF) şi cel puţin un alt ISVD direcţionat împotriva unui al treilea antigen (adică, diferit atât de TNF, cât şi de al doilea antigen); etc. Compuşii "multiparatopici", polipeptidele "multiparatopice" şi constructele "multiparatopice", cum ar fi de exemplu, compuşii "biparatopici", polipeptidele "biparatopice" sau constructele "biparatopice" sau compuşii "triparatopici", polipeptidele "triparatopice" sau constructele "triparatopice", cuprind sau constau, în mod esenţial, din două sau mai multe blocuri de structurare a unui construct care au fiecare un paratop diferit. În consecinţă, ISVD-urile conform invenţiei care leagă TNF pot fi, în mod esenţial, în formă izolată (aşa cum este definită în prezenta) sau pot forma o parte a unui compus, a unei polipeptide sau a unui construct, care pot cuprinde sau constau în mod esenţial din unul sau mai multe ISVD-uri care leagă TNF şi care mai pot cuprinde, în plus, una sau mai multe secvenţe de aminoacizi (toate opţional legate prin unul sau mai mulţi linkeri adecvaţi). Prezenta dezvăluire se referă la un compus, polipeptidă sau construct care cuprinde sau constă în mod esenţial din cel puţin un ISVD conform invenţiei, cum ar fi unul sau mai multe ISVD-uri conform invenţiei (sau fragmente adecvate ale acestora), legând TNF aşa cum este definit în prezenta. Unul sau mai multe ISVD-uri conform invenţiei poate(pot) fi utilizat(e) ca o unitate de legare sau bloc de structurare a unui construct într-un astfel de compus, polipeptidă sau construct, astfel încât să furnizeze un compus, polipeptidă sau construct monovalent(ă), multivalent(ă) sau, respectiv, multiparatopic(ă) toate aşa cum este descris în prezenta. Prezenta dezvăluire se referă de asemenea la un compus sau polipeptidă care este monovalent(ă) cuprinzând sau constând în mod esenţial dintr-o polipeptidă monovalentă sau ISVD conform invenţiei. Prezenta dezvăluire se referă de asemenea la un compus, polipeptidă sau construct care este un compus multivalent, polipeptidă multivalentă sau, respectiv, construct multivalent cum ar fi de exemplu, un compus, polipeptidă sau construct bivalent(ă) sau trivalent(ă) care cuprinde sau constă, în mod esenţial, din două sau mai multe ISVD-uri conform invenţiei (pentru compuşii sau polipeptidele multivalenţi(te) şi multispecifici(ce) care conţin unul sau mai multe domenii VHH şi prepararea acestora, se face, de asemenea, referire la Conrath şi colaboratorii (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001), precum şi de exemplu la WO 96/34103, WO 99/23221 şi WO 2010/115998). Dezvăluirea se referă în continuare la un compus sau o polipeptidă multivalent(ă) (denumit(ă), de asemenea în prezenta şi un "compus (compuşi) multivalent(ţi) conform invenţiei" şi, respectiv "polipeptidă(e) multivalent(e) conform invenţiei") care cuprinde(cuprind) sau constă(constau) (în mod esenţial) în cel puţin un ISVD (sau fragmente adecvate ale acestuia) direcţionate împotriva TNF, de preferinţă TNF uman şi un ISVD suplimentar. Într-un aspect, în forma sa cea mai simplă, compusul, polipeptida sau constructul multivalent(ă) conform invenţiei este un compus, o polipeptidă sau un construct bivalent(ă), conform dezvăluirii cuprinzând un prim ISVD, cum ar fi un nanocorp, direcţionat împotriva TNF şi un al doilea ISVD identic, cum ar fi un nanocorp, îndreptat împotriva TNF, în care numitele primul şi al doilea ISVD-uri, cum ar fi nanocorpi, pot fi opţional legate printr-o secvenţă de legătură (linker) (aşa cum este definită în prezenta). În forma cea mai simplă, un compus, o polipeptidă sau un construct multivalent(ă) conform dezvăluirii poate fi un compus, o polipeptidă sau un construct trivalent(ă) conform dezvăluirii cuprinzând un prim ISVD, cum ar fi nanocorp, direcţionat împotriva TNF, un al doilea ISVD identic, cum ar fi nanocorp, direcţionat împotriva TNF şi un al treilea ISVD identic, cum ar fi nanocorp, direcţionat împotriva TNF, în care primul, al doilea şi al treilea ISVD-uri de imunoglobulină, cum ar fi nanocorpi, pot fi legate opţional prin una sau mai multe şi în special două secvenţe de linker. Într-un alt aspect, compusul, polipeptida sau constructul multivalent(ă) conform dezvăluirii poate fi un compus, o polipeptidă sau un construct bispecific(ă) conform dezvăluirii, cuprinzând un prim ISVD, cum ar fi un nanocorp, direcţionat împotriva TNF şi un al doilea ISVD, cum ar fi un nanocorp, direcţionat împotriva unui al doilea antigen, în care respectivele primul şi al doilea ISVD-uri, cum ar fi nanocorpi, pot fi opţional legate printr-o secvenţă linker (aşa cum este definită în prezenta); în timp ce un compus, polipeptidă sau construct conform dezvăluirii poate fi, de asemenea, un compus, polipeptidă sau construct trispecific(ă) conform dezvăluirii, cuprinzând un prim ISVD, cum ar fi nanocorp, direcţionat împotriva TNF, un al doilea ISVD, cum ar fi nanocorp, direcţionat împotriva unui al doilea antigen şi un al treilea ISVD, cum ar fi nanocorp, direcţionat împotriva unui al treilea antigen, în care respectivele primul, al doilea şi al treilea ISVD-uri, cum ar fi nanocorpi, pot fi opţional legate prin una sau mai multe şi în special două secvenţe de linker. Într-un aspect particular, compusul, polipeptida sau constructul conform dezvăluirii este un compus, o polipeptidă sau, respectiv, un construct trivalent(ă) bispecific(ă). Un compus, polipeptidă sau construct trivalent(ă), bispecific(ă), conform dezvăluirii în forma cea mai simplă al(a) acestuia(acesteia) poate fi un compus, polipeptidă sau construct trivalent(ă), conform invenţiei (aşa cum este definit în prezenta) cuprinzând două ISVD-uri identice, cum ar fi nanocorpi, împotriva TNF şi un al treilea ISVD, cum ar fi un nanocorp, direcţionat împotriva unui alt antigen, în care respectivele primul, al doilea şi al treilea ISVD-uri, cum ar fi nanocorpi, pot fi opţional legate prin una sau mai multe şi în special două secvenţe de linker. Într-un alt aspect, compusul sau polipeptida conform dezvăluirii este un compus sau o polipeptidă bispecific(ă). Un compus, o polipetidă sau un construct bispecific(ă), conform dezvăluirii în forma lor cea mai simplă pot fi un compus o polipeptidă sau un construct bivalent(ă) conform invenţiei (aşa cum este definit în prezenta), cuprinzând un ISVD, cum ar fi un nanocorp, împotriva TNF şi un al doilea ISVD, cum ar fi un nanocorp, direcţionat împotriva unui alt antigen, în care respectivele primul şi al doilea ISVD-uri, cum ar fi nanocorpi, pot fi opţional legate printr-o secvenţă linker. Într-un aspect preferat, compusul, polipeptida sau constructul multivalent(ă) conform dezvăluirii cuprinde sau constă, în mod esenţial, din două sau mai multe domenii variabile unice de imunoglobulină direcţionate împotriva TNF. Într-un aspect, dezvăluirea se referă la un compus, polipeptidă sau construct care cuprinde sau constă în mod esenţial din cel puţin două ISVD-uri conform invenţiei, cum ar fi 2, 3 sau 4 ISVD-uri (sau fragmente adecvate ale acestora), care leagă TNF. Cele două sau mai multe ISVD-uri pot fi opţional legate prin unul sau mai mulţi linkeri peptidici. Într-un aspect preferat, compusul, polipeptida sau constructul conform dezvăluirii cuprinde sau constă în mod esenţial din cel puţin două ISVDS-uri, în care respectivele cel puţin două ISVD-uri pot fi identice sau diferite, dar din care cel puţin un ISVD este direcţionat împotriva TNF, cum ar fi TNF de legare. Într-un aspect particular, compusul, polipeptida sau constructul conform dezvăluirii cuprinde sau constă, în mod esenţial, din cel puţin două ISVD-uri, în care respectivele cel puţin două ISVD-uri sunt alese, în mod independent din grupul constând în SEQ ID NO: 8 - 41 şi 61-66 şi 69. Afinităţile relative pot depinde de localizarea ISVD-urilor în compusul, polipeptida sau constructul care rezultă conform dezvăluirii. Se va aprecia că ordinea ISVD-urilor într-un compus sau polipeptidă conform dezvăluirii (orientarea) poate fi aleasă în funcţie de cerinţele specialiştilor în domeniu. Ordinea ISVD-urilor individuale, precum şi dacă compusul sau polipeptida cuprinde un linker este o chestiune de alegere a designului. Unele orientări, cu sau fără linkeri, pot oferi caracteristici de legare preferate în comparaţie cu alte orientări. De exemplu, ordinea unui prim ISVD (de exemplu ISVD 1) şi un al doilea ISVD (de exemplu ISVD 2) în compusul, polipeptida sau constructul conform dezvăluirii poate fi (de la capătul N-terminal la C-terminal): (i) ISVD1 (de exemplu nanocorp 1) - \tab - ISVD 2 (de exemplu nanocorp 2); sau (ii) ISVD 2 (de exemplu nanocorp 2) - \tab - ISVD 1 (de exemplu nanocorp 1); (în care linkerul este opţional). Toate orientările sunt incluse în invenţie. Compuşii, polipeptidele şi constructele care conţin o orientare a ISVD-urilor care furnizează caracteristicile de legare dorite pot fi identificate cu uşurinţă prin screening-ul de rutină. În compuşii sau constructele conform dezvăluirii, cum ar fi polipeptidele conform dezvăluirii, cele două sau mai multe blocuri de structurare a unui construct, cum ar fi de exemplu ISVD-uri, şi opţional una sau mai multe alte grupări, medicamente, agenţi, resturi, fragmente sau unităţi de legare pot fi legate direct una de cealaltă (aşa cum este descris, de exemplu, în WO 99/23221) şi/sau pot fi legate între ele prin unul sau mai multe elemente de spaţiere sau linkeri adecvate(ţi) sau orice combinaţie a acestora. Elementele de spaţiere sau linkerii adecvate(ţi) pentru utilizare în compuşii sau polipeptidele multivalenţi(te) şi multispecifici(ce) vor fi clare(i) pentru persoanele de specialitate şi pot fi, în general, orice linker sau element de spaţiere utilizat în domeniu pentru a lega secvenţele de aminoacizi. De preferinţă, respectivul linker sau element de spaţiere este adecvat pentru utilizare în construirea compuşilor, constructelor, proteinelor sau polipeptidelor care sunt destinate pentru utilizare farmaceutică. Într-o variantă de realizare, dezvăluirea se referă la un compus sau o polipeptidă aşa cum este definit(ă) în prezenta, în care ISVD-urile menţionate sunt legate direct unul cu celălalt sau sunt legate printr-un linker. Într-o altă variantă de realizare, dezvăluirea se referă la un compus sau polipeptidă aşa cum este definit(ă) în prezenta, în care un prim ISVD şi/sau un al doilea ISVD şi/sau un al treilea ISVD şi/sau posibil un ISVD care se leagă albumina serică sunt legate printr-un linker. Unii linkeri şi elemente de spaţiere preferaţi(te) în mod special includ elemente de spaţiere şi linkeri care sunt utilizaţi în domeniu pentru a lega fragmentele de anticorpi sau domeniile de anticorpi. Aceştia includ linkerii menţionaţi în literatura de specialitate generală citată anterior, precum şi, de exemplu, linkeri care sunt utilizaţi în domeniu pentru a construi diacorpi sau fragmente ScFv (în această privinţă trebuie totuşi menţionat faptul că în timp ce în diacorpi şi în fragmentele ScFv, secvenţa de legare utilizată ar trebui să aibă o lungime, un grad de flexibilitate şi alte proprietăţi care permit domeniilor VH şi VL pertinente care se reunesc să formeze un site de legare a antigenului complet, nu există o limitare particulară asupra lungimii sau a flexibilităţii linkerului utilizat în polipeptida conform dezvăluirii, deoarece fiecare ISVD, cum ar fi un nanocorp, formează de la sine un site de legare a antigenului complet). De exemplu, un linker poate fi o secvenţă de aminoacizi adecvată şi, în special, secvenţe de aminoacizi între 1 şi 50, de preferinţă între 1 şi 30, cum ar fi între 1 şi 10 resturi de aminoacizi. Unele exemple preferate de astfel de secvenţe de aminoacizi includ linkeri gly-ser, de exemplu de tip (glyxsery)z, cum ar fi (de exemplu (gly4ser)3 sau (gly3ser2)3, aşa cum este descris în WO 99/42077 şi linkerii GS30, GS15, GS9 şi GS7 descrişi în cererile aparţinând Ablynx menţionate în prezenta (a se vedea, de exemplu, WO 06/040153 şi WO 06/122825), precum şi regiunile asemănătoare balamalelor, cum ar fi regiunile balama ale anticorpilor cu catenă grea care se găsesc în mod natural sau secvenţele similare (cum este descris în WO 94/04678). Linkerii preferaţi sunt descrişi în Tabelul E, de exemplu SEQ ID NO: 85-100. Unii alţi linkeri preferaţi în mod deosebit sunt poli-alanina (cum ar fi AAA), precum şi linkerii GS30 (SEQ ID NO: 85 în WO 06/122825) şi GS9 (SEQ ID NO: 84 în WO 06/122825). Într-o variantă de realizare, invenţia se referă la un compus aşa cum este definit în prezenta, în care respectivul linker este ales din grupul constând în linkeri din 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS şi 40GS. Alţi linkeri adecvaţi cuprind, în general, compuşi organici sau polimeri, în special acei adecvaţi pentru utilizarea în proteine pentru utilizare farmaceutică. De exemplu, fragmentele poli(etilenglicol) au fost utilizate pentru a lega domeniile de anticorpi, a se vedea de exemplu WO 04/081026. Este inclus în sfera de cuprindere a dezvăluirii faptul că lungimea, gradul de flexibilitate şi/sau alte proprietăţi ale linkerului (linkerilor) utilizat(ţi) (deşi nu sunt critice, aşa cum este de obicei pentru linkerii utilizaţi în fragmentele ScFv) pot avea o anumită influenţă asupra proprietăţilor compusului sau constructului final conform dezvăluirii, cum ar fi polipeptida conform dezvăluirii, incluzând, dar fără a se limita la afinitate, specificitate sau aviditate pentru o chemokină sau pentru unul sau mai mulţi dintre ceilalţi antigeni. Pe baza dezvăluirii din prezenta, persoana calificată va fi capabilă să determine linkerul (linkerii) optim pentru utilizare într-un compus sau construct specific conform dezvăluirii, cum ar fi polipeptida conform dezvăluirii, opţional după anumite experimente de rutină limitate. De exemplu, în compuşii sau polipeptidele multivalenţi(te) conform dezvăluirii care cuprind blocuri de structurare a unui construct, cum ar fi ISVD-uri sau nanocorpi direcţionate împotriva TNF şi a altei ţinte, lungimea şi flexibilitatea linkerului sunt de preferinţă astfel încât să permită fiecărui bloc de structurare a unui construct, cum ar fi un ISVD, conform prezentei invenţii din polipeptidă să se lege de ţinta apropiată, de exemplu, determinantul antigenic pe fiecare dintre ţinte. Din nou, pe baza dezvăluirii din prezenta, persoana calificată va fi în măsură să determine linkerul (linkerii) optim(i) pentru utilizare într-un compus sau construct specific conform dezvăluirii, cum ar fi o polipeptidă conform invenţiei, opţional după anumite experimente de rutină limitate. Este, de asemenea, în sfera de cuprindere a dezvăluirii că linkerul (linkerii) utilizat(ţi) conferă una sau mai multe alte proprietăţi favorabile sau funcţionalitate compuşilor sau constructelor descrişi(se), cum ar fi polipeptidele conform dezvăluirii şi/sau furnizează unul sau mai multe site-uri pentru formarea derivaţilor şi/sau pentru ataşarea grupărilor funcţionale (de exemplu, aşa cum este descris în prezenta pentru derivaţii ISVD-urilor conform invenţiei). De exemplu, linkerii care conţin unul sau mai multe resturi de aminoacizi încărcate pot conferi proprietăţi hidrofile îmbunătăţite, în timp ce linkerii care formează sau conţin mici epitopi sau marcaje pot fi utilizaţi în scopul detectării, identificării şi/sau purificării. Din nou, pe baza dezvăluirii din prezenta, persoana calificată va fi capabilă să determine linkerii optimi pentru utilizare într-un compus, polipeptidă sau construct specific(ă) conform dezvăluirii, opţional după anumite experimente de rutină limitate. În fine, atunci când sunt utilizaţi doi sau mai mulţi linkeri în compuşi sau constructe cum ar fi polipeptidele conform dezvăluirii, aceşti linkeri pot fi aceiaşi sau diferiţi. Din nou, pe baza dezvăluirii din prezenta, persoana calificată va fi în măsură să determine linkerii optimi pentru utilizare într-un compus sau construct specific sau polipeptidă specifică conform dezvăluirii, opţional după unele experimente de rutină limitate. Pentru o descriere generală a compuşilor şi polipeptidelor multivalenţi(te) şi multispecifici(e) care conţin unul sau mai mulţi nanocorpi şi prepararea acestora, se face de asemenea referire la Conrath şi colaboratorii, J. Biol. Chem, Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; precum şi de exemplu la WO 1996/34103, WO 1999/23221, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 sau WO 2009/068627. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la secvenţe de nucleotide sau acizi nucleici care codifică secvenţe de aminoacizi, lianţi TNF, polipeptide, proteine de fuziune, compuşi şi constructe descrişi(se) în prezenta. Dezvăluirea include în plus constructe genetice care includ secvenţele de nucleotide menţionate anterior sau acizii nucleici şi unul sau mai multe elemente pentru constructele genetice cunoscute per se. Constructul genetic poate fi sub formă de plasmidă sau vector. Din nou, astfel de constructe pot fi în general aşa cum sunt descrise în cererile de brevet publicate aparţinând Ablynx N.V, cum ar fi de exemplu WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 sau WO 2009/068627. Într-un aspect, dezvăluirea se referă la un acid nucleic care codifică un ISVD, o polipeptidă, un compus sau un construct conform dezvăluirii. Într-un alt aspect dezvăluirea se referă la un vector de expresie cuprinzând un acid nucleic conform dezvăluirii. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la gazde sau la celule gazdă care conţin astfel de secvenţe de nucleotide sau acizi nucleici şi/sau care exprimă (sau sunt capabile să exprime), secvenţele de aminoacizi, lianţii TNF, polipeptidele, proteinele de fuziune, compuşii şi constructele descrişi(se) în prezenta. Din nou, astfel de celule gazdă pot fi în general aşa cum sunt descrise în cererile de brevet publicate aparţinând Ablynx N.V, cum ar fi de exemplu WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 sau WO 2009/068627. Într-un aspect, dezvăluirea se referă la o gazdă sau o celulă gazdă cuprinzând un acid nucleic conform dezvăluirii sau un vector de expresie conform dezvăluirii. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la o metodă pentru prepararea unei secvenţe de aminoacizi, a lianţilor TNF, a polipeptidelor, a proteinei de fuziune, a compuşilor sau a constructului aşa cum este descris în prezenta, metodă care cuprinde cultivarea sau menţinerea unei celule gazdă aşa cum este descrisă în prezenta în condiţii astfel încât respectiva celulă gazdă produce sau exprimă o secvenţă de aminoacizi, lianţi TNF, polipeptide, proteina de fuziune, compuşi sau constructul aşa cum este descris în prezenta şi, opţional, cuprinde izolarea secvenţei de aminoacizi produsă, a lianţilor TNF produşi, a polipeptidelor produse, a proteinei de fuziune produse, a compuşilor produşi sau a constructului produs. Din nou, astfel de metode pot fi realizate aşa cum este descris în general în cererile de brevet publicate aparţinând Ablynx N.V, cum ar fi de exemplu WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 sau WO 2009/068627. Într-un aspect particular, dezvăluirea se referă la o metodă pentru producerea unui ISVD conform invenţiei sau a unui compus conform dezvăluirii sau a unei polipeptide conform dezvăluirii, metoda menţionată cuprinzând cel puţin etapele de:
a) exprimarea, într-o celulă gazdă adecvată sau într-un organism gazdă adecvat sau într-un alt sistem de exprimare adecvat, a unei secvenţe de acid nucleic aşa cum s-a definită în prezenta; urmată în mod opţional de:
b) izolarea şi/sau purificarea ISVD conform invenţiei, a compusului conform dezvăluirii sau, respectiv, a polipeptidei conform dezvăluirii.
Dezvăluirea se referă, de asemenea, la o compoziţie care cuprinde cel puţin o secvenţă de aminoacizi, un liant TNF, o polipeptidă, o proteină de fuziune, un compus sau un construct aşa cum este descris în prezenta.
Dezvăluirea se referă, de asemenea, la o compoziţie farmaceutică care cuprinde cel puţin o secvenţă de aminoacizi, un liant TNF, o polipeptidă, o proteină de fuziune, un compus sau un construct aşa cum este descris în prezenta şi, opţional, cel puţin un purtător, diluant sau excipient şi/sau adjuvant acceptabili farmaceutic şi/sau cuprinde, în mod opţional una sau mai multe alte polipeptide şi/sau compuşi active(i) farmaceutic. Astfel de preparate, purtători, excipienţi şi diluanţi pot fi, în general, aşa cum este descris în cererile de brevet publicate aparţinând Ablynx N.V, cum ar fi de exemplu WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 sau WO 2009/068627.
Când secvenţele de aminoacizi, lianţii TNF, polipeptidele, proteinele de fuziune, compuşii sau constructele descrişi(se) în prezenta au un timp de înjumătăţire crescut, ei sunt, de preferinţă, administraţi în circulaţie. Ca atare, aceştia pot fi administraţi în orice mod adecvat care permite intrarea în circulaţie a secvenţelor de aminoacizi, a lianţilor TNF, a polipeptidelor, a proteinelor de fuziune, a compuşilor sau a constructelor, cum ar fi intravenos, prin injecţie sau perfuzie sau în oricare altă manieră adecvată (incluzând administrarea pe cale orală, administrarea subcutanată, administrarea intramusculară, administrarea prin piele, administrarea intranazală, administrarea prin plămâni etc.) care permite intrarea în circulaţie a secvenţelor de aminoacizi, a lianţilor TNF, a polipeptidelor, a proteinelor de fuziune, a compuşilor sau a constructelor. Metodele adecvate şi căile de administrare vor fi clare pentru persoana de specialitate, din nou, de exemplu, urmând de asemenea, învăţătura tehnică din cererile de brevet publicate aparţinând Ablynx N.V, cum ar fi de exemplu WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 sau WO 2009/068627.
Într-un alt aspect, dezvăluirea se referă la o metodă pentru prevenirea şi/sau tratamentul a cel puţin o boală sau tulburare care poate fi prevenită sau tratată prin utilizarea unei secvenţe de aminoacizi, a unui liant TNF, a unei polipeptide, a unei proteine de fuziune, a unui compus sau a unui construct aşa cum este descris în prezenta, metodă care cuprinde administrarea, unui subiect care are nevoie de aceasta a unei cantităţi active din punct de vedere farmaceutic dintr-o secvenţă de aminoacizi, dintr-un liant TNF, dintr-o polipeptidă, dintr-o proteină de fuziune, dintr-un compus sau dintr-un construct conform invenţiei şi/sau dintr-o compoziţie farmaceutică ce îi(le) cuprinde. Bolile şi tulburările care pot fi prevenite sau tratate prin utilizarea unei polipeptide, a unei proteine de fuziune, a unui compus sau a unui construct aşa cum este descris în prezenta vor fi, în general, identice cu bolile şi tulburările care pot fi prevenite sau tratate prin utilizarea fragmentului terapeutic care este prezent în polipeptidă, în proteina de fuziune, în compusul sau în constructul conform invenţiei. În mod particular, prezenta dezvăluire se referă la compusul, compoziţia, constructul, polipeptida, liantul TNF sau ISVD-ul aşa cum este descris în prezenta pentru utilizare ca medicament.
În contextul prezentei invenţii, termenul "prevenire şi/sau tratament" nu cuprinde numai prevenirea şi/sau tratarea bolii, ci cuprinde, în general, de asemenea prevenirea declanşării bolii, încetinirea sau inversarea progresului bolii, prevenirea sau încetinirea declanşării unuia sau a mai multor simptome asociate cu boala, reducerea şi/sau atenuarea unuia sau a mai multor simptome asociate bolii, reducerea severităţii şi/sau a duratei bolii şi/sau a oricăror simptome asociate cu aceasta şi/sau prevenirea creşterii în continuare a severităţii bolii şi/sau a oricăror simptome asociate acesteia, prevenirea, reducerea sau inversarea oricăror degradări fiziologice cauzate de boală şi, în general, orice acţiune farmacologică care este benefică pentru pacientul care urmează a fi tratat. O compoziţie conform dezvăluirii nu trebuie să conducă la o vindecare completă sau să la eradicarea oricărui simptom sau manifestare a unei boli, pentru a constitui un agent terapeutic viabil. Aşa cum este recunoscut în domeniul pertinent, medicamentele utilizate ca agenţi terapeutici pot reduce severitatea unei stări de boală date, dar nu trebuie să anuleze orice manifestare a bolii pentru a fi consideraţi ca agenţi terapeutici utili. În mod similar, un tratament administrat profilactic nu trebuie să fie complet eficient în prevenirea declanşării unei afecţiuni pentru a constitui un agent profilactic viabil. Reducerea pur şi simplu a impactului unei boli (de exemplu, prin reducerea numărului sau gravităţii simptomelor acesteia sau prin creşterea eficacităţii unui alt tratament sau prin producerea unui alt efect benefic) sau reducerea probabilităţii apariţiei sau agravării bolii la un subiect, este suficient.
Într-o variantă de realizare, o indicaţie că o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic dintr-o compoziţie a fost administrată pacientului este o îmbunătăţire susţinută faţă de valoarea iniţială a unui indicator care reflectă severitatea tulburării particulare. Compoziţiile farmaceutice conform prezentei dezvăluiri cuprind o cantitate eficientă terapeutic dintr-un ISVD, compus sau polipeptidă din prezenta dezvăluire formulată împreună cu unul sau mai mulţi purtători sau excipienţi acceptabili farmaceutic. Printr-o "cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic" dintr-un ISVD, compus sau polipeptidă conform dezvăluirii se înţelege o cantitate din compoziţie care conferă un efect terapeutic subiectului tratat, la un raport beneficiu/risc rezonabil aplicabil oricărui tratament medical. Efectul terapeutic este suficient pentru a "trata" pacientul aşa cum este utilizat termenul în prezenta.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un construct, un compus, un liant TNF, un ISVD sau o polipeptidă aşa cum este descris în prezenta, pentru utilizare în tratamentul unei boli şi/sau tulburări ale tractului digestiv.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un construct, un compus, un liant TNF, un ISVD sau o polipeptidă aşa cum este descris în prezenta, în care boala şi/sau tulburarea respectivă a tractului digestiv este boala inflamatorie intestinală (IBD), sindromul intestinului iritabil, boala Crohn, colita ulcerativă, mucozita, stomatita aftoasă, boala celiacă, traume ale tractului digestiv şi cancere la nivelul tractului digestiv.
Pacienţii cu sindrom de intestin iritabil au permeabilitatea intestinală modificată, în ciuda faptului că au apărut puţine modificări histologice detectabile în intestine (Dunlop Am J Gastroenterol. iunie 2006; 101(6): 1288-94). Pacienţii cu boală celiacă au permeabilitatea intestinală modificată şi deteriorarea caracteristică a bolilor intestinului subţire care se deosebeşte de IBD. Boala inflamatorie intestinală se crede că rezultă dintr-un răspuns imun dereglat iniţiat de interacţiunile microbian-gazdă. Sistemul imunitar răspunde la bacteriile cometologice nepatogene care generează inflamaţia cronică. În mod similar, în enterocolita necrotizantă, un sistem imunitar subdezvoltat sub presiune generează un răspuns inadecvat la bacteriile intestinale normale, inducând o formă potenţial letală de colită (Jilling şi colaboratorii, 2006, J Immunol, 177, 3273-82).
Subiectul care urmează să fie tratat poate fi oricare animal cu sânge cald, dar este în special un mamifer şi, mai ales, o fiinţă umană. Aşa cum va fi clar pentru persoana de specialitate, subiectul care urmează să fie tratat va fi în special o persoană care suferă de sau prezintă riscuri de bolile şi tulburările menţionate în prezenta.
Într-o altă variantă de realizare, dezvăluirea se referă la o metodă pentru imunoterapie şi în special pentru imunoterapie pasivă, metodă care cuprinde administrarea, unui subiect care suferă de sau prezintă risc de bolile şi tulburările menţionate în prezenta, a unei cantităţi active din punct de vedere farmaceutic dintr-o secvenţă de aminoacizi, dintr-un liant TNF, dintr-o polipeptidă, dintr-o proteină de fuziune, dintr-un compus sau dintr-un construct conform dezvăluirii şi/sau dintr-o compoziţie farmaceutică care îi(le) conţine.
Secvenţa de aminoacizi, liantul TNF, polipeptida, proteina de fuziune, compusul sau constructul şi/sau compoziţiile care îi(le) cuprind sunt administrate conform unui regim de tratament care este adecvat pentru prevenirea şi/sau tratarea bolii sau a tulburării care trebuie prevenită sau tratată. Clinicianul va fi, în general, în măsură să determine un regim de tratament adecvat, în funcţie de factori cum ar fi boala sau tulburarea care trebuie prevenită sau tratată, gravitatea bolii care trebuie tratată şi/sau gravitatea simptomelor acesteia, secvenţa de aminoacizi, liantul TNF, polipeptida, proteina de fuziune, compusul sau constructul specific(ă) conform dezvăluirii care urmează a fi utilizat(ă), calea specifică de administrare şi formularea sau compoziţia farmaceutică care urmează să fie utilizată, vârsta, sexul, greutatea, dieta, starea generală a pacientului şi factori similari bine cunoscuţi clinicianului.
În general, regimul de tratament va cuprinde administrarea uneia sau mai multor secvenţe de aminoacizi, liganzi TNF, polipeptide, proteine de fuziune, compuşi sau constructe conform dezvăluirii sau a uneia sau mai multor compoziţii care le(îi) cuprind în una sau mai multe cantităţi sau doze eficiente din punct de vedere farmaceutic. Cantitatea(cantităţile) sau dozele specifice care trebuie administrate pot fi determinate de clinician, din nou pe baza factorilor menţionaţi anterior.
În general, pentru prevenirea şi/sau tratamentul bolilor şi tulburărilor menţionate în prezenta şi în funcţie de boala sau tulburarea specifică de tratat, eficacitatea şi/sau timpul de înjumătăţire al proteinelor de fuziune specifice sau al constructelor care urmează a fi utilizate, calea de administrare specifică şi formularea sau compoziţia farmaceutică specifică utilizată, secvenţele de aminoacizi, lianţii TNF, polipeptidele, proteinele de fuziune, compuşii sau constructele conform dezvăluirii vor fi administrate, în general, într-o cantitate cuprinsă între 1 gram şi 0,01 micrograme per kg greutate corporală per zi, de preferinţă între 0,1 grame şi 0,1 micrograme per kg greutate corporală per zi, cum ar fi aproximativ 1, 10, 100 sau 1000 micrograme per kg greutate corporală per zi, fie în mod continuu (de exemplu, prin perfuzie), ca doză zilnică unică sau ca doze divizate multiple în timpul zilei. În general, clinicianul va fi în măsură să determine o doză zilnică adecvată, în funcţie de factorii menţionaţi în prezenta. De asemenea, va fi clar faptul că, în anumite cazuri, clinicianul poate alege să se abată de la aceste cantităţi, de exemplu pe baza factorilor menţionaţi mai înainte şi a judecăţii pe baza competenţei lui. În general, unele indicaţii privind cantităţile care trebuie administrate pot fi obţinute din cantităţile administrate în mod obişnuit pentru anticorpi convenţionali comparabili sau fragmente de anticorpi faţă de aceeaşi ţintă administrată în mod esenţial pe aceiaşi cale, luând totuşi în considerare diferenţele de afinitate/aviditate, eficacitate, biodistribuţie, timp de înjumătăţire şi factori similari bine cunoscuţi specialiştilor în domeniu.
În mod obişnuit, în metoda prezentată anterior, va fi utilizată o secvenţă de aminoacizi unică, un liant TNF, o polipeptidă, o proteină de fuziune, un compus sau un construct conform dezvăluirii. Totuşi, este în sfera de cuprindere a dezvăluirii să se utilizeze două sau mai multe secvenţe de aminoacizi, lianţi TNF, polipeptide, proteine de fuziune, compuşi sau constructe conform dezvăluirii în combinaţie.
Secvenţele de aminoacizi, liantul TNF, polipeptidele, proteinele de fuziune, compuşii sau constructele conform dezvăluirii pot fi, de asemenea, utilizate(ţi) în combinaţie cu unul sau mai alţi mulţi compuşi sau principii suplimentare active din punct de vedere farmaceutic, adică, ca regim de tratament combinat, care poate sau nu poate să conducă la un efect sinergic. Din nou, clinicianul va fi în măsură să selecteze astfel de compuşi sau principii suplimentare, precum şi un regim de tratament combinat adecvat, pe baza factorilor citaţi mai înainte şi a opiniei sale de specialitate.
În particular, secvenţele de aminoacizi, lianţii TNF, polipeptidele, proteinele de fuziune, compuşii sau constructele descrise pot fi utilizate(ţi) în combinaţie cu alţi compuşi sau principii activi din punct de vedere farmaceutic care sunt sau pot fi utilizaţi pentru prevenirea şi/sau tratamentul bolilor şi tulburărilor care pot fi prevenite sau tratate cu secvenţe de aminoacizi, lianţi TNF, polipeptide, proteine de fuziune, compuşi sau constructe conform dezvăluirii şi ca un rezultat efectul sinergic poate să fie sau poate să nu fie obţinut.
Eficacitatea regimului de tratament utilizat conform dezvăluirii poate fi determinată şi/sau urmată în orice mod cunoscut per se pentru boala sau tulburarea implicată, aşa cum va fi clar pentru clinician. Clinicianul va fi, de asemenea, în măsură, dacă este cazul şi de la caz la caz, să schimbe sau să modifice un anumit regim de tratament, astfel încât să se obţină efectul terapeutic dorit, să fie evite, să fie limitate sau să fie reduse efectele secundare nedorite şi/sau să se obţină un echilibru adecvat între realizarea efectului terapeutic dorit pe de o parte şi evitarea, limitarea sau reducerea efectelor secundare nedorite pe de altă parte.
În general, regimul de tratament va fi urmat până când se atinge efectul terapeutic dorit şi/sau până când efectul terapeutic dorit va fi menţinut. Din nou, acest lucru poate fi determinat de medic.
Deoarece secvenţele de aminoacizi, lianţii TNF, polipeptidele, proteinele de fuziune, compuşii sau constructele conform dezvăluirii sunt capabile să se lege la TNF, acestea(aceştia) pot fi utilizate(ţi) în special pentru prevenirea şi/sau tratamentul bolilor sau tulburărilor care pot fi tratate cu alte medicamente biologice (cum ar fi anticorpi, de exemplu adalimumab/HUMIRA™ sau Infliximab/REMICADE™) care sunt capabile să se lege la TNF şi/sau să moduleze TNF. Astfel de boli şi tulburări vor fi clare pentru persoana calificată. Lianţii TNF conform invenţiei pot fi utilizaţi, în special, pentru prevenirea şi tratamentul bolilor şi afecţiunilor menţionate în WO 2004/041862 şi WO 2006/122786.
Aşa cum s-a menţionat, un aspect specific al dezvăluirii se referă la lianţii TNF conform invenţiei care sunt în format monovalent. Aceşti lianţi TNF monovalenţi conform invenţiei sunt adecvaţi în mod special pentru aplicaţii topice (incluzând aplicaţii pe piele, în tractul GI sau în plămâni) şi/sau pentru administrare topică (de exemplu pe piele), administrare pe cale orală (de exemplu în tractul GI), administrarea prin supozitor (din nou, spre exemplu în tractul GI) şi/sau administrarea la plămâni (de exemplu, prin inhalare). Ca atare, aceştia pot fi utilizaţi pentru prevenirea şi/sau tratamentul bolilor şi afecţiunilor pielii, plămânilor sau tractului GI care pot fi prevenite sau tratate prin aplicarea unui inhibitor al TNF pe piele, plămâni sau, respectiv, în tractul GI (cum ar fi boli inflamatorii şi/sau autoimune care afectează pielea, plămânii sau, respectiv tractul GI).
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un compus, un constructor, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul este administrat(ă) local tractului digestiv.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un compus, un constructor, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris(ă) în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul este administrat(ă) pe cale orală într-o formă de dozare adecvată pentru administrare orală la nivelul tractului gastrointestinal (GI).
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un compus, un construct, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris(ă) în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul este administrat(ă) într-o formă de dozare pentru administrare pe cale orală în tractul GI în care forma de dozare este selectată dintre tablete, capsule, pilule, pulberi, granule, emulsii, microemulsii, soluţii, suspensii, siropuri şi elixiruri.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un compus, un construct, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris(ă) în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul este administrat(ă) rectal pentru tratamentul unei boli sau tulburări a tractului digestiv.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un compus, un construct, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris(ă) în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul este administrat(ă), rectal, într-o formă de dozare pentru administrare rectală, de preferinţă selectată dintre supozitoare şi clisme.
Într-o variantă de realizare, prezenta dezvăluire se referă la o compoziţie, un compus, un construct, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris(ă) în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul este administrat(ă), parenteral prin injecţie subcutanată, injecţie intravenoasă, injecţie intramusculară, injecţie intralezională sau tehnici de perfuzare.
Unele exemple specifice, dar nelimitative, ale unor astfel de boli şi tulburări sunt bolile sau tulburările tractului GI cum ar fi boala inflamatorie intestinală (IBD), boala Crohn, sindromul intestinului iritabil, colita ulcerativă, mucozita, stomatita aftoasă, boala celiacă, traume ale tractului digestiv şi/sau cancere la nivelul tractului digestiv. Aşa cum s-a menţionat, atunci când sunt utilizaţi în aceste scopuri, lianţii TNF monovalenţi conform invenţiei au de preferinţă o mutaţie D (sau E1D) în poziţia 1 şi o extensie C-terminală (cum ar fi o alanină C-terminală) şi lianţii TNF ai SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63, şi 65-66 în particular ai SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 şi 69, mai particular ai SEQ ID NO: 40 sunt exemple preferate de lianţi TNF conform invenţiei care sunt în mod special potriviţi pentru aceste scopuri.
Astfel, într-un alt aspect, invenţia se referă la un liant TNF conform invenţiei (aşa cum este descris în prezenta) care este în mod esenţial în format monovalent (şi care, de preferinţă, are o mutaţie D sau E1D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală cum ar fi alanină C-terminală) pentru utilizare în prevenirea şi tratamentul bolilor şi afecţiunilor pielii, plămânilor sau tractului GI şi în special în prevenirea şi tratamentul bolilor inflamatorii şi/sau a bolilor autoimune care afectează pielea, plămânii sau tractul GI. Liantul TNF menţionat este SEQ ID NO: 40.
Invenţia se referă, de asemenea, la un liant TNF conform invenţiei (aşa cum este descris în prezenta) care este în mod esenţial în format monovalent (şi care, de preferinţă, are o mutaţie D sau E1D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală cum ar fi alanina C-terminală) pentru utilizare în prevenirea şi tratamentul bolilor sau afecţiunilor tractului GI, cum ar fi boala inflamatorie intestinală (IBD), boala Crohn, sindromul intestinului iritabil, colita ulcerativă, mucozita, stomatita aftoasă, boala celiacă, traume ale tractului digestiv şi/sau cancere ale tractului digestiv, în special boala IBD şi boala Crohn. Din nou, liantul TNF menţionat este SEQ ID NO: 40.
Dezvăluirea se referă de asemenea la o compoziţie farmaceutică destinată pentru (şi/sau adecvată pentru) aplicare topică pe piele, administrare prin inhalare sau altă administrare la plămâni şi/sau administrare orală, administrare rectală sau altă administrare tractului GI, care cuprinde un liant TNF conform invenţiei care este, în mod esenţial, în format monovalent (şi care, de preferinţă, ca o mutaţie D sau E1D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală cum ar fi alanina C-terminală). Din nou, liantul TNF menţionat este ales, de preferinţă, din grupul constând în SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63, şi 65-68, în particular SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 şi 69, cel mai bine SEQ ID NO: 40.
Invenţia se referă, de asemenea, la utilizarea unui liant TNF conform invenţiei care este, în mod esenţial, în format monovalent (şi care de preferinţă are o mutaţie D sau E1D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală cum ar fi alanina C-terminală) într-o metodă pentru prevenirea sau tratamentul unei boli sau tulburări ale pielii unui subiect care are nevoie de un astfel de tratament.
Invenţia se referă, de asemenea, la utilizarea unui liant TNF conform invenţiei care este, în mod esenţial, în format monovalent (şi care de preferinţă are o mutaţie D sau E1D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală cum ar fi alanina C-terminală) într-o metodă pentru prevenirea sau tratamentul unei boli sau tulburări ale pielii, a unui subiect care are nevoie de un astfel de tratament.
Invenţia se referă, de asemenea, la utilizarea unui liant TNF conform invenţiei care este, în mod esenţial, în format monovalent (şi care, de preferinţă are o mutaţie D sau E1D la poziţia 1 şi o extensie C-terminală cum ar fi alanina C-terminală) într-o metodă pentru prevenirea sau tratamentul bolilor sau afecţiunilor tractului GI cum ar fi boala inflamatorie intestinală (IBD), boala Crohn, sindromul intestinului iritabil, colita ulcerativă, mucozita, stomatita aftoasă, boala celiacă, traume ale tractului digestiv şi/sau cancere ale tractului digestiv, în special IBD sau boala Crohn, a unui subiect care are nevoie de un astfel de tratament.
Aşa cum s-a menţionat anterior, în locurile de inflamaţie, bariera mucoasei tractului digestiv este adesea compromisă, din cauza căreia proteinele administrate pe cale orală pot intra în ţesuturile intestinale şi în circulaţia sistemică. Într-o variantă de realizare, invenţia se referă, de asemenea, la o compoziţie, un compus, un construct, un liant TNF, o polipeptidă sau un ISVD aşa cum este descris în prezenta, în care compoziţia, compusul, constructul, liantul TNF, polipeptida sau ISVD-ul ajunge la ţesuturile intestinale şi în circulaţia sistemică a unui pacient.
Alte aspecte, variante de realizare, avantaje şi aplicaţii ale invenţiei vor deveni clare din descrierea mai detaliată din prezenta.
Invenţia va fi descrisă acum în cele ce urmează prin următoarele aspecte preferate, exemple şi figuri nelimitative în care:
- Figura 1 reprezintă un tabel care enumeră unele dintre poziţiile de aminoacizi care vor fi menţionate în mod specific în prezenta şi numerotarea lor conform unor sisteme de numerotare alternative (cum ar fi Aho şi IMGT); - Figura 2 ilustrează un aliniament al SEQ ID NO: 1, 59 şi 58; - Figura 3 listează secvenţele de aminoacizi menţionate în prezenta; - Figura 4 ilustrează un aliniament al SEQ ID NO: 1, 8 până la 41 şi 58; - Figura 5 ilustrează un aliniament al SEQ ID NO: 1, 31 şi 36 până la 41; - Figura 6 prezintă două reprezentări grafice corespunzătoare punctelor de date obţinute în exemplul 1, în care au fost testate 96 probe de ser (66 de la subiecţi sănătoşi umani şi 30 de pacienţi SLE) pentru legarea la următoarele secvenţe de aminoacizi: SEQ ID NO:58 (cu mutaţia Q108L), Referinţa A, Referinţa A (L11V, V89L)-Ala, Referinţa A (L11V, A74S, V89L)-Ala şi Referinţa A (L11V, S49A, V89L)-Ala. Fiecare punct reprezintă nivelul de legare pentru una din cele 96 de probe testate. Punctele de date afişate în panoul din dreapta şi panoul din stânga sunt aceleaşi; în panoul din dreapta, punctele de date măsurate cu fiecare eşantion individual pentru fiecare compus testat (adică cu SEQ ID NO:58 (Q108L), Referinţa A, Referinţa A (L11V, V89L)-A, Referinţa A (L11V, A74S, V89L)-A şi Referinţa A (L11V, S49A, V89L)-A) sunt conectate folosind o linie (ca rezultat, declinaţia liniei oferă o indicaţie a măsurii în care legarea anticorpilor preexistenţi este redusă când se introduc mutaţiile conform invenţiei şi alanina C-terminală); - Figura 7 reprezintă un tabel cu datele de legare (5 coloane care dau nivele de legare PreAb normalizate (RU la 125 secunde) şi 4 coloane care dau procentajul de reducere a legării PreAb comparativ cu Referinţa A a punctelor de date compilate în Figura 6. - Figura 8 (A) site-uri de scindare tripsină şi chimotripsină determinate cu anticipare ("P") şi experimental ("E") pe baza secvenţei A016600015. (B) analiza A016600015 pe gel SDS PAGE colorat cu Coomassie. (C) Rezultat reprezentativ al unei analize de digestie triptică prin RPC LC-MS a secvenţei A016600015. - Figura 9 ilustrare schematică a modelului SHIME. - Figura 10 ilustrează competiţia FACS asupra celulelor HEK293 H-mTNF tratate cu Enbrel (EC30 = 0,02 nM; panoul A) şi Enbrel (EC90 = 0,2 nM, panoul B). IRR000027 = nanocorp irelevant. - Figura 11 prezintă rezultatele exprimării A016600021, A016600039 şi A016600040 pe un gel 12% NuPage Bis-Tris în condiţii nereducătoare, s-a aplicat o probă de 5 µl. Liniile sunt după cum urmează: (1) A016600021; (2) A016600039; (3) A016600040; (4) comparator irelevant; (5) comparator irelevant; (6) Precision Plus Protein Standard (BioRad); (7) Standard 0.5µg; (8) Standard 1.0µg; (9) Standard 2,5µg.
EXEMPLE
Inventatorii prezentei au propus optimizarea secvenţei de aminoacizi ("Sequence Optimization") a lianţilor TNF. În acest caz, lianţii TNF sunt destinaţi administrării orale şi din această cauză lianţii TNF ar trebui, de preferinţă, să fie stabili la protează. Mai mult, în procesul de optimizare a secvenţei se intenţionează de asemenea (1) umanizarea lianţilor TNF; (2) eliminarea epitopilor potenţiali ai anticorpilor preexistenţi; precum şi (3) eliminarea unor site-uri pentru modificări post-translaţionale (PTM). În acelaşi timp, aceste caracteristici ar trebui aduse în conformitate cu caracteristicile funcţionale ale lianţilor TNF, adică inhibarea TNFα, care ar trebui să fie, de preferinţă, aproximativ aceeaşi sau chiar ameliorată.
Exemplul 1: Producerea nanocorpului în Pichia pastoris şi purificarea prin legarea proteinei-A
Celulele Pichia pastoris X33 care conţin constructele nanocorp anti-TNFα au fost crescute în plăci cu 24 godeuri (30°C, 250 rpm) (24mL) într-un tampon citrat BGCM. După două zile, mediul a fost trecut la un tampon conţinând metanol (citrat BMCM) pentru a induce exprimarea. S-a adăugat metanol proaspăt periodic pentru a compensa consumul de metanol şi evaporarea şi mediul a fost recoltat după două zile. Nanocorpii au fost purificaţi prin capturare pe coloana proteină-A (Poros) sau MEP Hypercel (Pall) urmată de eluţia în tampon de glicină conform instrucţiunilor producătorului. Nanocorpii au fost ulterior desalinaţi faţă de PBS utilizând o coloană de 2 mL Zebaspin (Pierce). Fracţiunile au fost concentrate utilizând coloane VivaSpin (MWCO 5000, PES). Concentraţiile fracţiunilor de nanocorpi au fost măsurate utilizând Trinean Dropsense. Concentrarea s-a bazat pe măsurarea OD280 cu normalizare pentru valorile OD340. Puritatea şi integritatea nanocorpilor au fost verificate prin analize SDS-PAGE şi MS folosind un sistem HPLC cu fază inversă cuplat cu un spectrometru de masă ESI-Q-TOF (Q-TOF Ultimate (Waters)).
Exemplul 2: Umanizarea
Secvenţele de proteine ale lianţilor TNF conform prezentei invenţii sunt în cele din urmă recuperate din Ilamas şi sunt parţial distincte de anticorpii omologi care se găsesc în mod natural la om. Prin urmare, aceşti lianţi TNF sunt potenţial imunogeni atunci când sunt administraţi pacienţilor umani.
În general, pentru scopurile umanizării, secvenţele de nanocorpi sunt făcute mai omoloage faţă de secvenţa consens a liniei germinale umane. Cu excepţia resturilor caracteristice "marcajelor" nanocorpi, aminoacizii specifici din regiunile cadru care diferă între nanocorp şi o secvenţă consens a unei linii germinale umane sunt modificate faţă de omologul uman astfel încât structura, activitatea şi stabilitatea proteinei să fie păstrate, de preferinţă, intacte.
În acest caz, după o aliniere cu baza de date a genei germinale umane V, DP51 a fost identificată ca având cea mai mare omologie cu SEQ ID NO: 58. Toate permutările posibile au fost elaborate în vederea modificării secvenţei parenterale nanocorp mai conformă cu secvenţa consens a liniei germinate DP51 umană, păstrând de preferinţă celelalte caracteristici nanocorp intacte sau aceste caracteristici sunt chiar ameliorate.
În cele din urmă au fost introduse un total de 12 resturi de aminoacizi în SEQ ID NO: 58: 1E, 14P, 27F, 29F, 40A, 49S, 73N, 75K, 78L, 82aN, 83R şi 108L. În mod perceptibil, Q27F şi S29F sunt parte a CDR1, dar nu afectează legarea (cf. SEQ ID NO: 1; datele nu sunt prezentate).
Exemplul 3: Reducerea legării anticorpilor preexistenţi
3.1 Partea experimentală
Probele umane utilizate în exemplul 3.2 prezentat în cele ce urmează au fost obţinute fie din surse comerciale, fie de la voluntari umani (după ce au fost obţinute toate consimţămintele şi aprobările necesare) şi au fost utilizate în conformitate cu cerinţele de reglementările şi legale aplicabile (incluzând dar fără limitare la cele referitoare la secretul medical şi confidenţialitatea pacientului).
În exemplul 3.2 prezentat în cele ce urmează, dacă nu se indică în mod explicit altfel, legarea anticorpilor preexistenţi care sunt prezenţi în probele utilizate (adică de la voluntari sănătoşi, pacienţi cu artrită reumatoidă (RA) şi pacienţi cu SLE) la nanocorpii testaţi a fost determinată utilizând ProteOn după cum urmează:
Nanocorpii au fost capturaţi fie pe albumină serică, fie printr-un marcaj FLAG3 utilizând anti-FLAG M2 monoclonal.
În cazul legării anticorpilor preexistenţi la nanocorpii capturaţi pe albumină serică umană (HSA) a fost evaluată utilizând ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). S-a utilizat PBS/Tween (soluţie salină tamponată cu fosfat, pH 7,4, 0,005% Tween20) ca tampon de eluare şi experimentele au fost efectuate la temperatura de 25°C. Liniile de ligand ale unui ProteOn GLC Sensor Chip au fost activate cu EDC/NHS (debit 30µl/min) şi s-a injectat HSA la 10µg/ml în tampon ProteOn Acetat pH 4,5 (debit 100µl/min) pentru a obţine niveluri de imobilizare de aproximativ 3200 RU. După imobilizare, suprafeţele au fost dezactivate cu etanolamină HCl (debit de 30 µl/min). Nanocorpii au fost injectaţi timp de 2 minute la 45μl/min pe suprafaţa HSA pentru a obţine un nivel de captare a nanocorpilor de aproximativ 200 RU. Probele conţinând anticorpi preexistenţi au fost centrifugate timp de 2 minute la 14000 rpm şi supernatantul a fost diluat 1:10 în PBS-Tween20 (0,005%) înainte de a fi injectat timp de 2 minute la 45 µl/min urmată de o etapă de disociere de 400 secunde ulterioară. După fiecare ciclu (adică înainte de o nouă etapă de captare a nanocorpilor şi de injecţie a probei de sânge), suprafeţele HSA au fost regenerate cu o injecţie de 2 minute de HCI (100 mM) la 45 µl/min. Procesarea senzorgramelor şi analiza datelor a fost efectuată cu ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzorgramele care arată legarea anticorpului pre-existent au fost obţinute după dublă referenţiere prin scăderea 1) disocierii nanocorp-HSA şi 2) legării nespecifice faţă de banda de ligand de referinţă. Nivelurile de legare a anticorpilor preexistenţi au fost determinate prin stabilirea punctelor de raportare la 125 secunde (5 secunde după terminarea asocierii). Reducerea procentuală a legării anticorpului pre-existent a fost calculată în raport cu nivelele de legare la 125 secunde a unui nanocorp de referinţă.
În cazul legării anticorpilor preexistenţi pe nanocorpii marcaţi cu FLAG capturaţi pe anti-FLAG M2 monoclonal (Sigma) aceasta a fost evaluată utilizând ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). S-a utilizat PBS/Tween (soluţie salină tamponată cu fosfat, pH 7,4, 0,005% Tween20) ca tampon de rulare şi experimentele au fost efectuate la temperatura de 25°C. Benzile de ligand ale unui ProteOn GLC Sensor Chip au fost activate cu EDC/NHS (debit 30 µl/min) şi mAb anti-FLAG M2 a fost injectat la 10 µl/min în tampon ProteOn Acetat pH 4,5 (debit 100 µl/min) pentru a realiza nivelurile de imobilizare de aproximativ 4000 RU. După imobilizare, suprafeţele au fost dezactivate cu etanolamină HCl (debit de 30 µl/min). Nanocorpii au fost injectaţi timp de 2 minute la 45 μl/min pe suprafaţa anti-FLAG M2 pentru a obţine un nivel de captare a nanocorpilor de aproximativ 100 RU. Pentru a reduce legarea non-specifică a probelor de sânge la suprafaţa anti-FLAG M2 la probele de sânge s-a adăugat 100 nM 3xFLAG peptidă (Sigma). Probele conţinând anticorpi preexistenţi au fost centrifugate timp de 2 minute la 14000 rpm şi supernatantul a fost diluat 1:10 în PBS-Tween20 (0,005%) înainte de a fi injectat timp de 2 minute la 45 µl/min urmată de o etapă de disociere ulterioară de 600 secunde. După fiecare ciclu (adică înainte de o nouă etapă de captare a nanocorpului şi de injecţie de probe de sânge), suprafeţele anti-FLAG M2 au fost regenerate cu o injecţie de 10 secunde de Glicină pH1,5 (10 mM) la 150 µl/min. Procesarea senzorgramelor şi analiza datelor a fost efectuată cu ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzorgramele care arată legarea anticorpului pre-existent au fost obţinute după dublă referire prin scăderea 1) disocierii nanocorp-anti-FLAG M2 şi 2) legării nespecifică la banda de ligand de referinţă. Nivelurile de legare a anticorpilor preexistenţi au fost determinate prin stabilirea punctelor de raportare la 125 secunde (5 secunde după terminarea asocierii). Reducerea procentuală a legării anticorpului pre-existent a fost calculată în raport cu nivelele de legare la 125 secunde a unui nanocorp de referinţă.
3.2: Introducerea mutaţiilor conform invenţiei în Referinţa A (SEQ ID NO: 1) conduce la o α reducere a legării prin anticorpii preexistenţi.
Au fost utilizate următoarele secvenţe de aminoacizi: SEQ ID NO: 58 (cu mutaţia Q108L), Referinţa A, Referinţa A (L11V, V89L)-Ala, Referinţa A (L11V, A74S, V89L)-Ala şi Referinţa A (L11V, S49A, V89L)-Ala, toate cu un marcaj N-terminal HIS6-FLAG3 (SEQ ID NO: 42). Aceşti nanocorpi au fost testaţi pentru legarea prin anticorpii preexistenţi care sunt prezenţi în probele de la 96 probe de ser de la voluntari umani sănătoşi. Compuşii au fost captaţi utilizând marcajul FLAG şi legarea a fost măsurată utilizând ProteOn conform protocolului dat în preambulul acestei părţi experimentale.
Rezultatele sunt ilustrate în figura 6. Figura 7 prezintă rezultatele pentru fiecare probă care formează unul dintre punctele de date din Figura 6.
Se poate observa că pentru majoritatea celor 96 de probe testate, introducerea mutaţiilor conform invenţiei conduce la o reducere a legării anticorpilor preexistenţi, gradul de reducere general fiind dependent de nivelul la care anticorpii preexistenţi din fiecare eşantion a fost capabil să se lege la referinţa A.
Exemplul 4: Evaluarea stabilităţii chimice
Stabilitatea chimică a diferiţilor nanocorpi umanizaţi şi/sau optimizaţi a fost evaluată prin teste de oxidare forţată şi de solicitare la temperatură.
S-a luat în considerare un nou compus de referinţă, adică A016600015 (SEQ ID NO: 61). Acest nou compus de referinţă este mai potrivit pentru candidaţii prezumaţi clinic şi, astfel, permite o mai bună evaluare a impactului mutaţiilor. A016600015 este identic cu Referinţa A (SEQ ID NO: 1) cu excepţia unei alanine C-terminale şi a unui aspartat la restul de aminoacid 1. C-terminalul Ala a fost introdus în vederea reducerii PEA-rilor în conformitate cu WO 2012/175741 (Cf. Exemplului 3). Glutamatul N-terminal a fost înlocuit cu un aspartat la restul de aminoacid 1 după evaluarea formării piroglutamatului. Activitatea noii Referinţe A016600015 a fost practic identică cu referinţa A (datele nu sunt prezentate). Acest nou compus A016600015 este utilizat în continuare în cadrul exemplelor ca compus de referinţă, cu excepţia cazului în care se indică altceva.
Pe baza rezultatelor din Exemplul 3, au fost introduse mutaţiile anti-PEA L11V şi V89L (printre altele) în comparaţie cu noul compus de referinţă A016600015, rezultând A016600018 (SEQ ID NO: 37) şi A016600019 (SEQ ID NO: 38). Secvenţele sunt prezentate în figura 3.
4.1 Stabilitate la oxidare forţată
Probele de nanocorpi ale compusului de referinţă A016600015 (1 mg/ml) au fost supuse timp de patru ore la temperatura camerei şi în întuneric la 10 mM H2O2 în PBS, în paralel cu probele de control fără H2O2, urmată de comutarea tamponului la PBS utilizând coloane de spin de desalinizare Zeba (0,5 ml) (Thermo Scientific). Eşantioanele de solicitare şi de control au fost apoi analizate prin RPC pe o maşină Series 1200 sau 1290 (Agilent Technologies) pe o coloană Zorbax 300SB-C3 (Agilent Technologies) la temperatura de 70°C. Oxidarea nanocorpilor a fost cuantificată prin determinarea % zonei de vârf a pre-vârfurilor care au apărut ca urmare a solicitării oxidative, comparativ cu vârful proteinei principale.
Nu s-au observat variante în probele de solicitare la oxidare a compusului de referinţă A16600015 (datele nu sunt prezentate).
4.2 Stabilitatea la solicitarea la temperatură
Probele de nanocorpi (1-2 mg/ml) au fost depozitate în PBS timp de patru săptămâni la temperatura de -20°C (control negativ) 25 şi 40°C. După această perioadă de incubaţie, nanocorpii au fost digeraţi cu Trypsin sau LysC. Peptidele probelor de solicitare şi de control au fost apoi analizate prin RPC pe o maşină Series 1290 (Agilent Technologies) pe o coloană Acquity UPLC BEH300-C18 (Agilent Technologies) la temperatura de 60°C. Coloana este cuplată la un spectrometru de masă Q-TOF (6530 Accurate Mass Q-TOF (Agilent)). Integrarea hărţii peptidei UV 214 nm sau cromatogramele EIC (Cromatograma cu ion extras) permit o cuantificare fiabilă a unei anumite modificări.
Doar la temperatura de 40°C s-au observat unele variante de izomerizare şi piro-glutamat. În mod special, restul de aminoacid 54D, care este localizat în CDR2 expus mediului şi potenţial supus izomerizării, nu a demonstrat practic nici o izomerizare. Izomerizarea restului de aminoacid 1 a fost inapreciabil în cazul în care nanocorpii au fost menţinuţi la temperatura de sau sub 25°C pentru perioade lungi de timp.
4.3 Temperaturile de topire ale testului de transfer termic (TSA)
Temperatura de topire a nanocorpului este o măsură a stabilităţii biofizice a acestuia.
Temperaturile de topire ale diferiţilor nanocorpi au fost evaluate printr-un test de transfer termic (TSA), în mod esenţial, în conformitate cu Ericsson şi colaboratori 2006 (Anals of Biochemistry, 357: 289-298). Pe scurt, 5 µl de nanocorpi monovalenţi purificaţi (800 µg/ml) au fost incubaţi cu 5 µL de sonda fluorescentă Sypro Orange (Invitrogen, S6551) (concentraţie finală 10 x) în 10 µL tampon (100 mM fosfat, 100 mM borat, 100 mM citrat, 115 mM NaCI, tamponat la pH diferit, variind de la 3,5 la 9). Probele au fost încălzite într-o maşină LightCycler 480II (Roche), de la temperatura de 37 până la 99°C la o viteză de 4,4°C/s, după care acestea au fost răcite la temperatura de 37°C la o viteză de 0,03°C/s. După întinderea indusă de căldură, sunt expuşi plasturi hidrofobi ai proteinelor la care se leagă Sypro Orange, rezultând o creştere a intensităţii fluorescenţei (Ex/Em = 465/580 nm). Punctul de inflexiune al primei derivate a curbei de intensitate a fluorescenţei serveşte ca măsură a temperaturii de topire (Tm).
Compusul de referinţă A016600015 (SEQ ID NO: 61) a fost comparat cu A016600018 (SEQ ID NO: 37) şi A016600019 (SEQ ID NO: 38). Spre deosebire de A016600015, ambii A016600018 şi A016600019 cuprind mutaţiile anti-PEA L11V şi V89L în conformitate cu Exemplul 3.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4.3
Tabelul 4.3
NB ID anti-PEA cantitate (µg) Tm (°C) pH7 A016600015 - 87 59 A016600018 L11V V89L 38 59 A016600019 L11V V89L 16 56
După cum se poate observa din tabelul 4.3, mutaţiile anti-PEA par a nu avea vreun efect asupra Tm (A016600018) sau un efect negativ asupra Tm (A016600019). În mod deosebit, diferenţa dintre A016600018 ("00018") şi A016600019 ("00019") este 78L şi, respectiv, 78V. În ansamblu, toate efectele acestei diferenţe în restul de aminoacid 78 s-au dovedit a fi nesemnificative în comparaţie cu introducerea mutaţiilor anti-PEA (a se vedea de asemenea în cele ce urmează).
La producere, s-a observat, de asemenea, faptul că exprimarea acestor variante cuprinzând mutaţiile anti-PEA a fost sub-optimală. Acest lucru a fost cuantificat suplimentar utilizând metoda din Exemplul 1.
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.3.
Într-adevăr, cantitatea care poate fi regăsită de la ambele variante cuprinzând mutaţiile anti-PEA a fost de aproximativ 2 ori mai mică (A016600018) sau chiar de 4 ori mai mică (A016600019) decât de la nanocorpul de referinţă. Aceasta a fost o surpriză totală pentru inventatori, deoarece introducerea acestor mutaţii anti-PEA L11V şi V89L nu a dus la o scădere atât de importantă a capacităţii de a recupera nanocorpii înainte, aşa cum a fost determinată pentru orice altă clonă.
4.4 Stabilitatea proteazei
Se intenţionează ca inhibitorii TNF să poată fi administraţi pe cale orală. Cu toate acestea, stomacul şi intestinele constituie un mediu natural ostil, deoarece sunt concepute pentru descompunerea enzimatică şi absorbţia alimentelor parţial solide. În general, proteoliza unui substrat proteic poate să apară numai dacă 8-10 resturi de aminoacizi din catena polipeptidică se pot lega şi se pot adapta la stereochimia specifică a site-ului activ al proteazei (Fontana şi colaboratorii 2004 Acta Biochim Pol, 51, 299-321).Prin urmare, susceptibilitatea la scindarea enzimatică depinde în mare măsură de proprietăţile fizice ale substratului.
Pentru a identifica potenţialele site-uri de degradare a proteazei şi pentru a proiecta variante mai stabile, inventatorii prezentei au stabilit să identifice site-urile de scindare ale tripsinei şi chimotripsinei conform metodelor standard.
Site-urile de proteaze anticipate ("P") din SEQ ID NO: 58 şi şi noul compus de referinţă A016600015 ("00015") sunt reprezentate ca "X" în Figura 8A atât pentru tripsină cât şi pentru chimotripsină.
Din această figură se poate concluziona deja că:
- CDR3 cuprinde 9 site-uri posibile de scindare a proteazei. - mutaţia de umanizare Q75K (VH3-DP51) a introdus un site de scindare a tripsinei potenţial. - mutaţia de umanizare K73N (VH3-DP51) a eliminat un site de scindare a tripsinei potenţial. - mutaţiile anti-PEA L11V şi V89L au fost neutre în această privinţă, adică aceste mutaţii nu au introdus sau nu au eliminat posibilele site-uri de scindare a proteazei, aşa cum era de aşteptat. Pentru a evalua site-urile de scindare ale proteazelor anticipate într-un număr mai mare in vivo, nanocorpii au fost digeraţi cu tripsină şi chimotripsină. În particular, nanocorpii anti-TNFα au fost incubaţi în soluţii de 10% tripsină sau α-chimotripsină. Două µg nanocorp au fost supuse digestiei triptice timp de 2 ore, 4 ore şi peste noapte la temperatura de 37°C sau digestiei chimotriptice timp de 2 ore, 4 ore sau peste noapte la temperatura de 25°C. Reacţia proteolitică a fost oprită prin adăugarea de TFA (0,1% final). Amestecurile de reacţie au fost ori analizate prin RPC LC-MS, ori separate pe un gel SDS PAGE şi colorate cu albastru Coomassie. Utilizând ImageQuant (GE), cantitatea de material intact a fost calculată şi normalizată la 0h ca punct de timp de referinţă. Un rezultat reprezentativ al unei digerări triptice pe un gel SDS PAGE colorat cu Coomassie este furnizat în Figura 8B. Un rezultat reprezentativ al unei analize de digestie triptică prin RPC LC-MS este furnizat în figura 8C. Site-urile de scindare confirmate experimental ("E") sunt reprezentate în figura 8A sub formă de tripsină ("E") şi chimotripsină ("E"). Din figura 8A este clar că numărul real de site-urilor de scindare este redus. Cu toate acestea, diferitele site-uri de recunoaştere triptică şi chimotriptică rămân. Pentru a optimiza rezistenţa la tripsină au fost selectate 5 poziţii pentru a realiza o variantă optimizată: R38, K64, S94, P95 şi R96, rezultând varianta A016600013; SEQ ID NO: 65. Totuşi, mutarea acestor site-uri a determinat scăderea nivelurilor de exprimare şi acumularea intracelulară a variantei (A016600013; SEQ ID NO: 65). De fapt, atunci când restul de aminoacid 38 a fost mutat înapoi, ceea ce a îmbunătăţit exprimarea, varianta rezultată (A016600014; SEQ ID NO: 66) a fost total contrară aşteptărilor mai mult protează sensibilă decât compusul de referinţă A016600015 (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, s-a decis să nu fie mutate aceste poziţii în compusul de referinţă şi în nanocorpii aflaţi în studiu, adică A016600018 şi A016600019. Un rezumat al rezultatelor este prezentat în tabelul 4.4.
Tabelul 4.4
% Nanocorp intact după incubare (ore) cu proteaze Tripsină Chimotripsină Nanocorp L11 V89 0h 2h 4h ON 0h 2h 4h ON A016600015 . . 100 95 99 79 100 16 18 15 A016600019 V L 100 83 91 78 100 27 39 31 A016600018 V L 100 89 85 63 100 38 31 14
Exemplul 5: Stabilitatea fluidelor intestinale derivate de la un model SHIME
Pentru a investiga stabilitatea nanocorpilor anti-TNFα în tractul GI uman, nanocorpii au fost incubaţi în 5 fluide diferite derivate dintr-un SHIME (Simulator al ecosistemului microbian intestinal uman), reprezentând tractul gastrointestinal uman (GI). Modelul SHIME este un model dinamic validat din punct de vedere ştiinţific, al tractului gastrointestinal complet, care este utilizat pentru a studia parametrii fizico-chimici, enzimatici şi microbieni în tractul gastrointestinal într-o setare in vitro.
Modelul SHIME constă în cinci reactoare care simulează, în mod secvenţial stomacul (condiţii acide şi digestia pepsinei), intestinul subţire (procesele digestive) şi cele 3 regiuni ale intestinului gros, adică colonul ascendent ("A"), transversal ("T") şi descendent ("D") (procese microbiene). Controlul atent al parametrilor de mediu din aceste reactoare a permis formaţiuni microbiene complexe şi stabile, care sunt foarte asemănătoare în structură şi funcţie formaţiunii microbiene din diferitele regiuni ale colonului uman (a se vedea figura 9). Toate fluidele GI au fost furnizate de ProDigest (Technologiepark 4, 9052 Zwijnaarde, Belgia). Anticorpii anti-TNF au fost testaţi pentru o perioadă maximă de 39 de ore în fluidele GI. După incubare în fluidele GI, stabilitatea nanocorpilor a fost determinată prin testarea funcţionalităţii într-o analiză ELISA de competiţie. Nanocorpii au fost testaţi la o concentraţie fixă de 100 μg/ml la temperatura de 37°C în 5 fluide GI diferite în modelul SHIME. La momente diferite de timp, probele au fost prelevate şi depozitate la temperatura de -20°C cu sau fără adăugarea de inhibitori ai proteazei, conform schemei din tabelul 5.1. Probele au fost transferate pe plăci ELISA acoperite şi ulterior au fost testate în analiza ELISA de competiţie. Pe scurt, A016600015 a fost acoperit la o concentraţie de 1 µg/ml în PBS. După blocare, s-a adăugat o concentraţie fixă de 0,3 nM biot-hTNFα împreună cu o serie de titrare a variantelor în diferite fluide GI. Detectarea a fost efectuată cu extravidină-HRP.
Tabelul 5.1 Schema de incubaţie
Fluid Momente de timp SI rapid 0, 1, 2, 4, 6, 8h* SI aliment 0, 1, 2, 4, 6, 8h* Colon A 0, 1, 2, 4, 8, 15, 20, 24h Colon T 0, 1, 2, 4, 8, 15, 20, 24, 39h Colon D 0, 1, 2, 4, 8, 15, 20, 24, 32h PBS 0, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 20, 24, 32h *după adăugarea la incubare a 1 mg/ml pefabloc şi 1 µM pepstatină (inhibitori ai proteazei)
Un rezultat reprezentativ în colon "T" este prezentat tabelul 5.2
Tabelul 5.2
0h 1h 2h 4h 8h 15h 20h 24h 39h 00015 IC50 7,3E-10 5,0E-10 6,4E-10 6,2E-10 9,7E-10 1,3E-09 1,9E-09 2,8E-09 2,0E-08 raport 1,00 0,69 0,88 0,85 1,34 1,72 2,56 3,88 27,41 % 100% 145% 113% 117% 75% 58% 39% 26% 4% 00018 IC50 5,7E-10 5,5E-10 6,9E-10 1,2E-09 2,8E-09 9,5E-09 3,2E-08 4,2E-08 6,2E-07 raport 1,00 0,97 1,22 2,19 4,96 16,68 55,58 73,79 1097,18 % 100% 103% 82% 46% 20% 6% 2% 1% 0% 00019 IC50 5,0E-10 4,7E-10 4,5E-10 9,1E-10 7,2E-10 1,7E-09 3,0E-09 5,2E-09 4,1E-08 raport 1,00 0,93 0,89 1,81 1,43 3,36 6,02 10,32 82,22 % 100% 108% 112% 55% 70% 30% 17% 10% 1%
Pe baza rezultatelor obţinute cu fluide derivate din diferite compartimente SHIME, evaluarea stabilităţii permite o clasificare a nanocorpilor reprezentând stabilitatea în toate compartimentele GI: 00015> 00019> 00018.
În mod colectiv, eliminarea site-urilor de scindare a proteazelor pare să nu aibă nici un efect pozitiv, cum ar fi asupra stabilităţii şi sensibilităţii proteazei a acestei familii de nanocorpi. Introducerea mutaţiilor anti-PEA L11V şi V89L în A16600015 pare să aibă un efect negativ asupra stabilităţii acestui nanocorp particular.
Exemplul 6: Variante stabilizate
Deoarece eliminarea site-urilor de scindare ale proteazei nu a condus la rezultatele anticipate, inventatorii au prezentat în continuare variante elaborate de anti-TNF-α, care ar fi în mod inerent mai stabile, dar în care mutaţiile de umanizare şi anti-PEA nu au fost, de preferinţă, compromise. Aceasta a necesitat o abordare neconvenţională având în vedere diferitele resturi de aminoacizi care prezintă caracteristici care se exclud reciproc, cum ar fi umanizare versus stabilitatea proteazei faţă de afinitate.
6.1 Legătura cisteinei internă şi eliminarea site-ului de scindare a chimotripsinei CDR3
Localizat în CDR3 şi care afectează, potenţial, proprietăţile de legare, s-a decis totuşi să se construiască o variantă în care restul de aminoacid Y100d, care este un site de scindare a chimotripsinei, să fie eliminat printr-o substituţie Y100dL (A016600046 100dL, SEQ ID NO: 62). Varianta A016600045 (SEQ ID NO: 69) a fost proiectată pentru a evalua în continuare impactul tirozinei la poziţia 100d a CDR3.
În plus, inventatorii au emis ipoteza că ar putea fi proiectate variante care ar fi în mod inerent stabile prin introducerea unei legături disulfidice intradomeniu (cf. Wozniak-Knopp şi colaboratorii 2012 PLoS One. 2012; 7(1): e30083). Aceasta ar necesita introducerea a două resturi de cisteină care ar trebui să se cupleze pentru a forma o cistină. După rezolvarea structurii proteice a nanocorpului şi a interacţiunii acestuia cu TNF-α ţintă prin studii de cristalizare (datele nu sunt prezentate), inventatorii au decis să modifice mutaţiile aminoacizilor S49C şi I69C pentru introducerea unei legături disulfidice intradomeniu, deşi restul de aminoacid S49 este adiacent cu CDR2 şi a fost introdus în scopul umanizării (care corespunde liniei germinative umane DP51, a se vedea exemplul 2). Noua variantă care cuprinde S49C, I69C şi Y100dL este adnotată A016600052 (SEQ ID NO: 63).
Pentru a evalua în profunzime influenţa aminoacidului din poziţia 49, acest rest de aminoacid a fost mutat la o alanină. În mod special, această mutaţie la poziţia 49 ar corespunde catenei IgHV3-IgHJ a liniei germinative umane-totuşi diferită. Toate variantele dintre cele noi A016600046 (SEQ ID NO: 62), A016600016 (SEQ ID NO: 36), A016600020 (SEQ ID NO: 39) şi A016600021 (SEQ ID NO: 40) cuprind A49.
În plus, în varianta A016600020 (SEQ ID NO: 39) poziţiile D60A, E61D şi P62S au fost evaluate având în vedere stabilitatea fizică. Resturile de aminoacizi A60, D61 şi S62 sunt localizate adiacent site-ului Y58 de scindare a chimotripsinei confirmat experimental şi în cadrul CDR2 conform Kabat, ceea ce implică un risc ridicat de pierdere a eficienţei.
Mai mult, un site de scindare al proteazei a fost introdus accidental de către mutaţia Q75K de umanizare. Fără a fi legaţi de nici o teorie, inventatorii au emis ipoteza că schimbarea restului de aminoacid localizat în apropiere, A74S, ar putea afecta atât sensibilizarea umanizării cât şi sensibilitatea proteazei, dar numai într-o anumită măsură, adică s-a sperat că atât umanizarea cât şi sensibilitatea proteazelor au fost diminuate la un nivel acceptabil. Variantele care cuprind S74 sunt A016600016 ("00016"), A016600020 ("00020"), A016600021("00021"), A016600046 ("00046") şi A016600052 ("00052") (SEQ ID NO:s 36, 39, 40, 62 şi, respectiv, 63). Varianta comparator a fost A016600038 ("00038"; SEQ ID NO: 64), care este identică cu A016600021 (SEQ ID NO: 40), dar cu 74S în loc de 74A.
Secvenţele care rezultă sunt furnizate în figura 3.
6.2 Caracteristicile variantelor stabilizate
În continuare, aceste variante au fost evaluate pentru diferite caracteristici, în mod esenţial aşa cum s-a stabilit în exemplele 3 şi 4.
În primul rând, a fost determinată producerea variantelor 00016, 00020 şi 00021 în P. pastoris conform exemplului 1.
Un rezumat al rezultatelor obţinute este prezentat în tabelul 6.2A.
Tabelul 6.2A
Nanocorp L11 S49 D60 E61 P62 A74 L78 V89 Canti tate (µg) Tm la pH7 (°C) Stabilitate în fluid GI (ordonare) A016600021 V A S V L 332 65 1 A016600016 V A S . L 499 65 2 A016600020 V A A D S S V L 374 75 3
Din aceste rezultate se poate observa că aceste mutaţii au condus la o creştere a producerii a mai mult de 4-5 ori producerea compusului de referinţă, care a produs 87 μg (cf. exemplul 4.3) sau chiar mai mult de 20-30 decât variantele foarte înrudite 00018 şi 00019.
În continuare, stabilitatea termică a acestor variante a fost determinată conform exemplului 4.3. Un rezumat al rezultatelor obţinute este de asemenea furnizat în tabelul 6.2A.
Nu numai că producerea a crescut dramatic, dar şi stabilitatea termică a crescut, în mod neaşteptat, cu 5-16°C comparativ cu compusul de referinţă, dar chiar şi până la 16-19°C comparativ cu variantele mai apropiate 00018 şi 00019.
În mod neaşteptat, restul de aminoacid A49 elimină influenţa resturilor de aminoacizi anti-PEA V11 şi L89 asupra producerii şi stabilităţii.
Diferite variante ale exemplului 6.1 au fost evaluate împreună în fluidele GI derivate din modelul SHIME conform exemplului 5.
Un rezumat al activităţii care rezultă la sfârşitul perioadei de incubare în diferite condiţii ale A016600021, A016600038, A016600046 şi A016600052 este prezentat în tabelul 6.2B. Incubarea în PBS a confirmat stabilitatea inerentă a nanocorpilor (datele nu sunt prezentate).
Tabelul 6.2B C/CO vs timp în ore CD colon A CD colon D CD colon T SI rapid* SI alimente* UC2 colon A UC2 colon D UC2 colon T A016600021 66 58 76 65 31 86 57 71 A016600038 48 41 47 60 33 77 50 59 A016600046 47 29 62 52 24 92 59 ≥100 A016600052 41 49 40 ND ND 64 43 55 A016600039 38 26 39 23 20 78 20 55 A016600040 38 40 19 67 24 91 83 63 A016600045 85 ≥100 49 60 26 68 41 ≥100 *bolnav; ND este nedeterminat; CD este boala Crohn; UC este colita ulcerativă
Variantele A016600046 Y100dL (SEQ ID NO: 62) în care a fost îndepărtat un site de scindare a proteazei şi varianta A016600052 (SEQ ID NO: 63), care a fost stabilizată în continuare prin intermediul unei legături cisteină intradomeniu, nu a oferit nici o îmbunătăţire în acest sens. În mod deosebit, valoarea IC50 a variantelor 00046 şi 00052 a crescut de 2-5 ori comparativ cu 00021 (1,13 nM şi respectiv 3,56 nM comparativ cu 0,67 nM) din cauza mutaţiei în CDR3.
Rezultatele SHIME, în mod esenţial, au confirmat şi extins rezultatele Tm şi a producerii. În plus, modelul SHIME a arătat că varianta 00021 (SEQ ID NO: 40) este în mod constant mai stabilă decât varianta A016600040 ("00040", SEQ ID NO: 67) şi varianta 00038 (SEQ ID NO: 64) ceea ce constituie un indiciu pentru contribuţia pozitivă a unei serine la poziţia 74.
În mod special, varianta A016600039 (SEQ ID NO: 68) care este identică cu varianta 00040 (SEQ ID NO: 67), dar pentru A74S, a arătat că S74 a fost în mod constant mai puţin stabilă decât A74 în modelul SHIME.
Pe baza tuturor rezultatelor, incluzând rezultatelor obţinute cu fluide provenite din diferite compartimente SHIME, o evaluare generală a stabilităţii permite o clasificare a nanocorpilor reprezentând stabilitatea în toate compartimentele GI: 00021 > 00016 > 00020 > 00040 > 00015 > 00019 > 00018.
Prin urmare, mutaţiile anti-PEA, L11V şi V89L în A16600015 par să aibă un efect negativ asupra stabilităţii acestui nanocorp particular, care ar putea fi atenuat de 49A, dar nu de 49C-69C. Mai mult, în nanocorpii care cuprind mutaţiile anti-PEA, L11V şi V89L, restul de aminoacizi 74S a fost benefic pentru stabilitate în modelul SHIME.
6.3 A016600021 are caracteristici favorabile (peste A016600039 şi A016600040)
Pentru administrarea pe cale orală se crede că pot fi necesare doze mari pe lângă stabilitate. Pentru a avea costuri acceptabile, candidatul este produs, de preferinţă, în cantităţi mari este purificat fără pierderi considerabile şi este formulat la o concentraţie ridicată. Astfel, inventatorii au stabilit experimente pentru a testa aceşti parametri.
În primul rând, inventatorii au propus să compare nivelurile de exprimare ale A016600039 şi A016600040 cu A016600021.
Aşa cum se poate vedea în figura 11A, exprimarea A016600039 (SEQ ID NO: 68) a fost considerabil mai mică decât nivelurile de exprimare ale A01660021 (SEQ ID NO: 40) şi A016600040 (SEQ ID NO: 67). Aceste rezultate au fost, de asemenea, cuantificate prin AKTAmicro, a căror rezultate sunt prezentate în tabelul 6.3
Tabelul 6.3
Clonă Randament Aktaµ (g/L mediu lipsit de celule) A016600021 6,3 A016600039 0,49 A016600040 2,3
În ceea ce priveşte caracteristicile de fabricare a A016600021 faţă de A016600040, ambele au fost testate la solubilitate maximă în timpul concentrării bulionului de fermentaţie. Solubilitatea maximă în bulionul de fermentaţie clarificată este de numai 30g/l pentru A016600040 (vs> 75g/l pentru A016600021). În plus, s-au întâlnit pierderi majore în timpul purificării ulterioare a A016600040.
Prin urmare, în plus faţă de stabilitate, A016600021 are, de asemenea, caracteristici favorabile de producere şi purificare, în mod neaşteptat, peste A016600039 şi A016600040.
Pe baza caracteristicilor avantajoase de stabilitate, de exprimare şi de purificare, inventatorii s-au concentrat asupra A016600021, a cărei solubilitate a fost determinată. Spre surprinderea completă a inventatorilor, A016600021 a fost solubilă la o cantitate, fără precedent, de 200 mg/ml H2O.
Exemplul 7: Variantele stabilizate depăşesc valorile de referinţă
Variantele A016600021 (SEQ ID NO: 40), A016600038 (SEQ ID NO: 64) şi A016600045 (SEQ ID NO: 69) au fost evaluate pentru legarea la TNF uman legat de membrană (mTNF) într-un test de competiţie cu Enbrel (Etanercept) un agent terapeutic anti-TNF bazat pe TNF-R2. Astfel, a fost generată o linie celulară care exprimă în mod stabil o formă non-scindabilă a TNF uman prin transfecţia celulelor HEK293H cu un vector de exprimare eucariot care codifică varianta TNF uman, R77T/S78T (denumită HEK293H-mTNF), aşa cum s-a descris anterior (Harashima şi colaboratorii, 2001 J Immunol 166:130-136). După selectarea prin co-exprimare a genei de rezistenţă la puromicină, sortarea celulelor individuale care exprimă mTNF a fost realizată prin FACS (Aria FACS BD) după colorarea celulelor cu Remicade (Infliximab) şi IgG anti-uman F(ab')2 de capră secundar, ads-PE de şoarece. Exprimarea constitutivă a TNF-ului legat de membrană asupra clonelor individuale selectate a fost confirmată prin citometrie de flux (BD FACS Array).
La primul exemplu, a fost evaluată legarea Enbrel la mTNF pe aceste celule. Astfel au fost însămânţate 5.105 celule ale unei singure clone HEK293H-mTNF în plăci cu 96 de godeuri cu fund rotund şi incubate în mod direct cu concentraţii diferite de Enbrel diluat în tampon FACS (PBS suplimentat cu 10% FBS şi 0,05% azidă de sodiu) timp de 90 de minute la temperatura de 4°C. Celulele au fost spălate cu tampon FACS şi colorate cu anticorp ads-PE de şoarece IgG anti-uman F(ab')2 de capră secundar timp de 30 de minute la temperatura de 4°C. După spălarea şi incubarea celulelor în tampon FACS în prezenţa iodului TO-PRO-3 pătat fără luciu, legarea Enbrel la mTNF pe celulele HEK293H-mTNF viabile a fost măsurată prin citirea pe BD FACS Array. Din curba de răspuns a dozei obţinute, valorile EC30 şi EC90 ale Enbrel pentru legarea la mTNF au fost definite ca fiind 0,02nM şi, respectiv 0,2nM. Ambele concentraţii au fost ulterior aplicate în testul de competiţie cu nanocorpii care ţintesc TNF.
Pentru a evalua legarea mTNF a A016600021, A016600038 şi A016600045, a fost stabilit un experiment de competiţie cu Enbrel la concentraţii EC30 şi EC90 fixate. Eficienţa nanocorpilor anti-TNF a fost comparată cu compusul de referinţă Cimzia (certolizumab pegol). În plus, a fost inclus un nanocorp irelevant (IRR00027) ca un control negativ. În acest test, s-au aplicat aceleaşi condiţii ca cele descrise anterior pentru legarea Enbrel, cu excepţia primei etape de incubare care în acest experiment implică co-tratarea celulelor cu o concentraţie fixă de Enbrel (EC30 sau EC90) în combinaţie cu diferite concentraţii de nanocorpi anti-TNF sau Cimzia variind de la 300 nM la 12,5 pM. Citirea pe BD FACS Array a determinat legarea Enbrel la celulele HEK293H-mTNF, care a fost redusă în mod clar la co-tratamentul cu concentraţii crescătoare de nanocorpi, precum şi cu Cimzia indicând competiţia agenţilor anti-TNF cu Enbrel pentru legarea la mTNF. Valorile IC50 ale agenţilor anti-TNF au fost determinate aşa cum este indicat în tabelul 7.
Tabelul 7 Enbrel (EC30: 0,02nM) Enbrel (EC90: 0,2nM) A016600021 0,43nM 0,65nM A016600038 0,43nM 0,70nM A016600045 0,54nM 0,76nM Cimzia 7,9nM 4,8nM
Rezultatele obţinute demonstrează faptul că A016600021, A016600038 şi A016600045 au o eficienţă de 6-7 ori mai bună decât Cimzia la EC90 şi o eficienţă de 15-18 ori mai bună decât Cimzia la EC30. Variantele stabilizate au o eficienţă comparabilă de competiţia cu Enbrel pentru legarea mTNF.
Într-o competiţie FACS s-a demonstrat că nanocorpii ar putea, de asemenea, să inhibe complet legarea Enbrel la mTNF. Acest lucru ar fi un indiciu pentru o adecvare superioară ca medicament pentru administrare pe cale orală. În contrast, concentraţiile mari de Cimzia au determinat numai blocarea parţială a legării Enbrel (figura 10).
Tabelul A: Referinţa A şi CDR-urile acesteia şi PMP6C11
SEQ ID NO Descriere Secvenţa 58 NC55TNF-NC7 (PMP6C11). WO06/122786: SEQ ID NO: 125 59 WO2015/173325SEQ ID NO: 345 1 Referinţa A: 2 CDR1 (Kabat) TADMG 3 CDR2 (Kabat) RISGIDGTTYYDEPVKG 4 CDR3 (Kabat/Abm) PRYADQWSAYDY 5 CDR1 (Abm) GFTFSTADMG 6 CDR2 (Abm) RISGIDGTTY 7 CDR3 (Kabat/Abm) PRYADQWSAYDY Notă: SEQ ID NO: 4 este identică cu SEQ ID NO: 7
Tabelul B: Combinaţii posibile ale aminoacizilor la poziţiile 11, 89, 110 şi 112
POZIŢIE POZIŢIE 11 89 110 112 11 89 110 112 L T T S V T T S C L T T K C V T T K O L T T Q O V T T Q M L T K S M V T K S B L T Q S B V T Q S I I N L V T K N V V T K A L V T Q A V V T Q T L V K S T V V K S I L V Q S I V V Q S O O V L T S N L L T K N V L T K L L T Q V L T Q L L K S V L K S L L Q S V L Q S
Tabelul C-1: Reprezentarea schematică a câtorva compuşi conform invenţiei fără un ISVD care prelungeşte timpul de înjumătăţire
-X(n) - - -X(n) - - -X(n) - - -X(n) - - - - -X(n) - - -X(n) Legenda: - " " reprezintă un liant TNF conform invenţiei - "-" reprezintă fie o legătură directă covalentă, fie un linker adecvat, cum ar fi un linker 9GS, 15GS sau 35GS - "X(n)" reprezintă o extensie C-terminală aşa cum este definită în prezenta, cum ar fi un rest de alanină unic. - " " reprezintă un domeniu de legare sau o unitate de legare (şi în special ISVD) împotriva TNF diferit de liantul TNF conform invenţiei. - " " reprezintă un domeniu de legare sau unitate de legare (şi în special ISVD) care direcţionează compusul conform invenţiei la o anumită celulă, ţesut sau organ
Tabelul C-2: Reprezentarea schematică a câtorva compuşi conform invenţiei cu un ISVD care prelungeşte timpul de înjumătăţire
- - - -X(n) - -X(n) - - - - - - - - -X(n) - - -X(n) - - -X(n) - - - - - - - - - - - - - -X(n) - - -X(n) - - -X(n) - - -X(n) - - -X(n) - -X(n) - - - - - - -X(n) - - - -X(n) Legenda: - " " reprezintă un liant TNF conform invenţiei - "-" reprezintă fie o legătură directă covalentă, fie un linker adecvat, cum ar fi un linker 9GS, 15GS sau 35GS - "X(n)" reprezintă o extensie C-terminală aşa cum este definită în prezenta, cum ar fi un rest de alanină unic. - " " reprezintă un domeniu de legare sau o unitate de legare care extinde timpul de înjumătăţire (şi în special un ISVD care extinde timpul de înjumătăţire), cum ar fi un ISVD (şi în special nanocorp) împotriva albuminei serice (umane); - " " reprezintă un domeniu de legare sau o unitate de legare (şi în special ISVD) împotriva TNF diferit de liantul TNF conform invenţiei. - " " reprezintă un domeniu de legare sau unitate de legare (şi în special ISVD) care direcţionează compusul conform invenţiei la o anumită celulă, ţesut sau organ
Tabelul E: Diferite secvenţe de aminoacid ("ID" se referă la SEQ ID NO, asa cum s-a utilizat în prezenta)
Denumire ID Secvenţă de aminoacid linker 5GS 85 GGGGS linker 7GS 86 SGGSGGS linker 8GS 87 GGGGCGGGS linker 9GS 88 GGGGSGGGS linker 10GS 89 GGGGSGGGGS linker 15GS 90 GGGGSGGGGSGGGGS linker 18GS 91 GGGGSGGGGSGGGGGGGS linker 20GS 92 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS linker 25GS 93 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS linker 30GS 94 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS linker 35GS 95 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS linker 40GS 96 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Balama G1 97 EPKSCDKTHTCPPCP Balama 9GS-G1 98 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP Llama regiunea balamalei lungi superioare 99 EPKTPKPQPAAA Balama G3 100
Claims (1)
1. Domeniu variabil unic de imunoglobulină (ISVD) având secvenţa de aminoacid conform SEQ ID NO: 40.
999. SDODR
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 3 (continuare)
Fig. 3 (continuare)
Fig. 3 (continuare)
Fig. 3 (continuare)
Fig. 3 (continuare)
Fig. 4
Fig. 4 (continuare)
Fig. 5
Fig. 6
Fig. 7
Fig. 7 (continuare)
Fig. 7 (continuare)
Fig. 7 (continuare)
Fig. 7 (continuare)
Fig. 8
Fig. 8
Fig. 9
Fig. 10
Fig. 11
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562254375P | 2015-11-12 | 2015-11-12 | |
| PCT/EP2016/077595 WO2017081320A1 (en) | 2015-11-12 | 2016-11-14 | Improved tnf binders |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MD3191511T2 true MD3191511T2 (ro) | 2018-03-31 |
Family
ID=57348648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MDE20170066T MD3191511T2 (ro) | 2015-11-12 | 2016-11-14 | Lianți TNF îmbunătățiți |
Country Status (37)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10544211B2 (ro) |
| EP (2) | EP3191511B1 (ro) |
| JP (2) | JP6962915B2 (ro) |
| KR (2) | KR102641194B1 (ro) |
| CN (1) | CN108473563B (ro) |
| AU (2) | AU2016352943B2 (ro) |
| BR (1) | BR112018009714A8 (ro) |
| CA (2) | CA3234178A1 (ro) |
| CL (1) | CL2018001291A1 (ro) |
| CO (1) | CO2018005915A2 (ro) |
| CR (1) | CR20180311A (ro) |
| CY (1) | CY1120303T1 (ro) |
| DK (1) | DK3191511T3 (ro) |
| DO (1) | DOP2018000122A (ro) |
| EC (1) | ECSP18042569A (ro) |
| ES (1) | ES2662418T3 (ro) |
| GT (1) | GT201800095A (ro) |
| HK (1) | HK1248716A1 (ro) |
| HR (1) | HRP20171949T1 (ro) |
| HU (1) | HUE035805T2 (ro) |
| IL (2) | IL310373A (ro) |
| LT (1) | LT3191511T (ro) |
| MA (1) | MA41653A (ro) |
| MD (1) | MD3191511T2 (ro) |
| ME (1) | ME02954B (ro) |
| MX (1) | MX385207B (ro) |
| NO (1) | NO2768984T3 (ro) |
| PE (1) | PE20181317A1 (ro) |
| PH (1) | PH12018501025A1 (ro) |
| PL (1) | PL3191511T3 (ro) |
| PT (1) | PT3191511T (ro) |
| RS (1) | RS56676B1 (ro) |
| SG (1) | SG11201803975SA (ro) |
| SI (1) | SI3191511T1 (ro) |
| SM (1) | SMT201700590T1 (ro) |
| TN (1) | TN2018000159A1 (ro) |
| WO (1) | WO2017081320A1 (ro) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11644471B2 (en) | 2010-09-30 | 2023-05-09 | Ablynx N.V. | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
| NZ780183A (en) | 2011-06-23 | 2024-12-20 | Ablynx Nv | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
| PT3248986T (pt) | 2014-05-16 | 2022-04-05 | Ablynx Nv | Domínios variáveis de imunoglobulina |
| KR20250099289A (ko) | 2014-05-16 | 2025-07-01 | 아블린쓰 엔.브이. | 개선된 면역글로불린 가변 도메인 |
| NO2768984T3 (ro) * | 2015-11-12 | 2018-06-09 | ||
| GB201522394D0 (en) | 2015-12-18 | 2016-02-03 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
| CA3163764A1 (en) * | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Ablynx Nv | Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting tnfa and ox40l |
| CN114981300B (zh) | 2019-12-06 | 2025-10-31 | 艾伯霖克斯公司 | 包含靶向TNFα和IL-23的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽 |
| CN112300289B (zh) * | 2019-12-30 | 2022-06-10 | 中国药科大学 | RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用 |
| KR20230123497A (ko) | 2020-12-18 | 2023-08-23 | 아블린쓰 엔.브이. | IL-6 및 TNF-α를 표적화하는 면역글로불린 단일 가변도메인을 포함하는 폴리펩티드 |
| US20250026842A1 (en) * | 2021-11-29 | 2025-01-23 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Modified protein or polypeptide |
| EP4611728A1 (en) * | 2022-11-04 | 2025-09-10 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Nlrp12 and nlrc5 modulators and methods for using the same to modulate diseases |
| TW202440614A (zh) | 2022-12-23 | 2024-10-16 | 比利時商艾伯霖克斯公司 | 基於蛋白質的接合載體 |
| TW202448926A (zh) | 2023-02-17 | 2024-12-16 | 比利時商艾伯霖克斯公司 | 結合新生兒fc受體之多肽 |
Family Cites Families (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0656946B2 (en) | 1992-08-21 | 2010-03-31 | Vrije Universiteit Brussel | Immunoglobulins devoid of light chains |
| EP0739981A1 (en) | 1995-04-25 | 1996-10-30 | Vrije Universiteit Brussel | Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes |
| BR9813276A (pt) | 1997-10-27 | 2000-08-22 | Unilever Nv | Proteìna multivalente de ligação de antìgeno, sequências de nucleotìdeos, vetor de expressão, célula hospedeira, processo para preparação de proteìna multivalente de ligação de antìgeno, e, uso da mesma |
| US20020155604A1 (en) | 1998-02-19 | 2002-10-24 | Jeffrey A. Ledbetter | Compositions and methods for regulating lymphocyte activation |
| US20060002935A1 (en) | 2002-06-28 | 2006-01-05 | Domantis Limited | Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor |
| US9321832B2 (en) | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
| EP3299393A1 (en) | 2002-11-08 | 2018-03-28 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor |
| WO2005044858A1 (en) | 2003-11-07 | 2005-05-19 | Ablynx N.V. | Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor |
| NZ540771A (en) | 2003-01-10 | 2009-05-31 | Ablynx Nv | Recombinant VHH single domain antibody from camelidae against von willebrand factor (vWF) or against collagen |
| DK1639011T3 (da) | 2003-06-30 | 2009-02-16 | Domantis Ltd | Pegylerede enkelt-domæne antistoffer (dAb) |
| BRPI0518151A2 (pt) | 2004-10-13 | 2009-06-16 | Ablynx Nv | polipetìdeos contra amiloide-beta, ácido nucléico que codifica tal polipetìdeo, composição compreendendo tal polipetìdeo, método para produzir um polipetìdeo e uso do mesmo |
| KR20070086896A (ko) | 2004-12-02 | 2007-08-27 | 도만티스 리미티드 | 항ｉｌ1ｒ1 단일 도메인 항체 및 치료적 용도 |
| CN103254309B (zh) * | 2005-05-18 | 2017-09-26 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM |
| CN101213214B (zh) | 2005-05-20 | 2014-06-25 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对冯威勒布兰特因子的单一结构域vhh抗体 |
| DE102005023617A1 (de) * | 2005-05-21 | 2006-11-23 | Aspre Ag | Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display |
| ES2626610T3 (es) | 2005-08-30 | 2017-07-25 | Intrexon Actobiotics Nv | Bacterias de ácido láctico productoras del anti-TNF alfa para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal |
| EP1957537A2 (en) | 2005-12-01 | 2008-08-20 | Domantis Limited | Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
| KR20080077238A (ko) | 2005-12-01 | 2008-08-21 | 도만티스 리미티드 | 인터루킨 1 수용체 타입 1에 결합하는 비경쟁적 도메인항체 포맷 |
| FR2894741B1 (fr) | 2005-12-08 | 2009-12-04 | Centre Nat Etd Spatiales | Chaine de reception par satellite |
| WO2007085814A1 (en) | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Domantis Limited | Fusion proteins that contain natural junctions |
| EP2057191A1 (en) | 2006-08-18 | 2009-05-13 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| JP2010511397A (ja) | 2006-12-05 | 2010-04-15 | アブリンクス エン．ヴェー． | 血清タンパク質と結合可能なペプチド |
| CN101796072B (zh) | 2007-05-24 | 2014-09-24 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽 |
| CN101970490A (zh) | 2007-11-27 | 2011-02-09 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对异二聚体细胞因子和/或其受体的氨基酸序列以及包括所述氨基酸序列的多肽 |
| DE102008023620A1 (de) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | Mettler-Toledo (Albstadt) Gmbh | Funktionseinheit mit einer aufrufbaren Funktion und Verfahren zu deren Aufruf |
| US9212226B2 (en) | 2008-05-16 | 2015-12-15 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against CXCR4 and other GPCRs and compounds comprising the same |
| BRPI1008014A2 (pt) * | 2009-02-19 | 2016-10-04 | Glaxo Group Ltd | domínio variável simples, ligante multiespecífico, antagonistas de tnfr1, e de receptor de tnf-alfa, uso do agonista de tnfr, antagonista anti-tnfr1, polipeptídeo ou ligante multiespecífico, método para tratar e/ou prevenir uma condição ou doença, ácido nucleico, vetor, e, hospedeiro |
| EP2417163B1 (en) | 2009-04-10 | 2019-02-27 | Ablynx N.V. | Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders |
| WO2010130832A2 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against dickkopf-1 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with bone loss and/or osteolytic lesions |
| BR112012001681A2 (pt) | 2009-07-16 | 2019-09-24 | Graxo Group Ltd | domínios variáveis de ligação de anti-albumina sérica aperfeiçoados |
| US9120855B2 (en) | 2010-02-10 | 2015-09-01 | Novartis Ag | Biologic compounds directed against death receptor 5 |
| US20150158948A9 (en) | 2011-03-28 | 2015-06-11 | Francis Descamps | Bispecific anti-cxcr7 immunoglobulin single variable domains |
| EP2723771B1 (en) | 2011-06-23 | 2019-09-11 | Ablynx NV | Serum albumin binding proteins |
| NZ780183A (en) * | 2011-06-23 | 2024-12-20 | Ablynx Nv | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
| PE20141522A1 (es) * | 2011-08-17 | 2014-11-17 | Glaxo Group Ltd | Proteinas y peptidos modificados |
| WO2014111550A1 (en) | 2013-01-17 | 2014-07-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Modified anti-serum albumin binding proteins |
| PT3248986T (pt) * | 2014-05-16 | 2022-04-05 | Ablynx Nv | Domínios variáveis de imunoglobulina |
| NO2768984T3 (ro) | 2015-11-12 | 2018-06-09 | ||
| EP3414268A1 (en) * | 2016-02-12 | 2018-12-19 | Ablynx NV | Method for the production of immunoglobulin single variable domains |
-
2012
- 2012-10-19 NO NO12841612A patent/NO2768984T3/no unknown
-
2016
- 2016-11-13 MA MA041653A patent/MA41653A/fr unknown
- 2016-11-14 DK DK16798122.4T patent/DK3191511T3/en active
- 2016-11-14 PT PT167981224T patent/PT3191511T/pt unknown
- 2016-11-14 ES ES16798122.4T patent/ES2662418T3/es active Active
- 2016-11-14 US US15/501,011 patent/US10544211B2/en active Active
- 2016-11-14 JP JP2018524836A patent/JP6962915B2/ja active Active
- 2016-11-14 CA CA3234178A patent/CA3234178A1/en active Pending
- 2016-11-14 CR CR20180311A patent/CR20180311A/es unknown
- 2016-11-14 TN TNP/2018/000159A patent/TN2018000159A1/en unknown
- 2016-11-14 SI SI201630013T patent/SI3191511T1/en unknown
- 2016-11-14 KR KR1020187016731A patent/KR102641194B1/ko active Active
- 2016-11-14 HU HUE16798122A patent/HUE035805T2/en unknown
- 2016-11-14 RS RS20171299A patent/RS56676B1/sr unknown
- 2016-11-14 SG SG11201803975SA patent/SG11201803975SA/en unknown
- 2016-11-14 ME MEP-2017-291A patent/ME02954B/me unknown
- 2016-11-14 HR HRP20171949TT patent/HRP20171949T1/hr unknown
- 2016-11-14 PE PE2018000766A patent/PE20181317A1/es unknown
- 2016-11-14 EP EP16798122.4A patent/EP3191511B1/en active Active
- 2016-11-14 SM SM20170590T patent/SMT201700590T1/it unknown
- 2016-11-14 PL PL16798122T patent/PL3191511T3/pl unknown
- 2016-11-14 LT LTEP16798122.4T patent/LT3191511T/lt unknown
- 2016-11-14 EP EP17184686.8A patent/EP3266798A3/en not_active Withdrawn
- 2016-11-14 CA CA3005085A patent/CA3005085C/en active Active
- 2016-11-14 WO PCT/EP2016/077595 patent/WO2017081320A1/en not_active Ceased
- 2016-11-14 AU AU2016352943A patent/AU2016352943B2/en active Active
- 2016-11-14 IL IL310373A patent/IL310373A/en unknown
- 2016-11-14 KR KR1020247005963A patent/KR20240029115A/ko active Pending
- 2016-11-14 IL IL259269A patent/IL259269B2/en unknown
- 2016-11-14 BR BR112018009714A patent/BR112018009714A8/pt active Search and Examination
- 2016-11-14 CN CN201680076588.6A patent/CN108473563B/zh active Active
- 2016-11-14 MD MDE20170066T patent/MD3191511T2/ro unknown
- 2016-11-14 MX MX2018005992A patent/MX385207B/es unknown
-
2017
- 2017-03-13 US US15/456,824 patent/US9745372B2/en active Active
- 2017-12-01 HK HK18108106.4A patent/HK1248716A1/en unknown
- 2017-12-19 CY CY20171101330T patent/CY1120303T1/el unknown
-
2018
- 2018-05-11 CL CL2018001291A patent/CL2018001291A1/es unknown
- 2018-05-11 DO DO2018000122A patent/DOP2018000122A/es unknown
- 2018-05-11 GT GT201800095A patent/GT201800095A/es unknown
- 2018-05-15 PH PH12018501025A patent/PH12018501025A1/en unknown
- 2018-06-05 EC ECIEPI201842569A patent/ECSP18042569A/es unknown
- 2018-06-08 CO CONC2018/0005915A patent/CO2018005915A2/es unknown
-
2021
- 2021-10-14 JP JP2021168871A patent/JP7357038B2/ja active Active
-
2023
- 2023-01-10 AU AU2023200113A patent/AU2023200113A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7357038B2 (ja) | 改善されたｔｎｆ結合因子 | |
| JP6669722B2 (ja) | Ｃｄ３結合ドメイン | |
| EP3161007B1 (en) | Multispecific antibody constructs | |
| AU2016208161A1 (en) | IL-17A-binding polypeptides | |
| JP2025146842A (ja) | 抗ｇａｌ９免疫阻害性結合分子 | |
| JP2025160405A (ja) | 特異的結合分子 | |
| US20230242677A1 (en) | Multi-specific antibodies | |
| RU2774823C2 (ru) | Усовершенствованные агенты, связывающие tnf | |
| HK1238660A1 (en) | Improved tnf binders | |
| HK1238660B (en) | Improved tnf binders | |
| CN118401563A (zh) | 抗gucy2c纳米抗体及其应用 |