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WO2025100401A1 - 角膜内皮細胞の製造方法 - Google Patents

角膜内皮細胞の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2025100401A1
WO2025100401A1 PCT/JP2024/039276 JP2024039276W WO2025100401A1 WO 2025100401 A1 WO2025100401 A1 WO 2025100401A1 JP 2024039276 W JP2024039276 W JP 2024039276W WO 2025100401 A1 WO2025100401 A1 WO 2025100401A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
corneal endothelial
neural crest
medium
fgf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/039276
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
幸二 西田
耕一 馬場
進 原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of WO2025100401A1 publication Critical patent/WO2025100401A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing corneal endothelial cells.
  • the cornea is located at the front of the eyeball and is a transparent tissue with a five-layer structure.
  • the corneal endothelial cell layer is a single cell layer present in the deep part of the cornea, and has a barrier function and a pump function, and plays a role in maintaining the transparency of the cornea by keeping the moisture content constant.
  • Corneal endothelial diseases including bullous keratopathy, are serious diseases that can lead to blindness. Therefore, corneal transplants are necessary, which require the provision of corneas from donor patients.
  • the current situation regarding corneal transplants is that there are several thousand patients waiting annually due to a chronic shortage of donors, and there are problems such as rejection reactions associated with corneal transplants from other people.
  • the development of corneal epithelial sheet transplants using stem cells is progressing, but the development of new therapies targeting corneal endothelial cells is still insufficient.
  • Non-Patent Document 1 a method for inducing human corneal endothelial cells that can be evaluated as scientifically and clinically sufficient has not yet been developed.
  • Non-Patent Documents 2, 3 The inventors have developed a two-dimensional culture system that reproduces the development of the entire eye from human pluripotent stem cells (Non-Patent Documents 2, 3). It is known that the main cell groups that make up the developing eye (corneal epithelium, retina, lens epithelium, etc.) appear in specific locations in the concentric zone-like structure (self-formed ectodermal autonomous multi-zone: SEAM) obtained in this culture system. First-in-human clinical studies are currently being conducted using corneal epithelial cell sheets created using the SEAM method.
  • Non-Patent Document 4 The inventors have reported that the transcription factor TFAP2B (Transcription Factor AP-2 Beta; AP-2 ⁇ ) is important for differentiation of neural crest into corneal endothelial cells and for maintaining the high proliferation ability of corneal endothelial cells.
  • the objective of the present invention is to provide a method for producing corneal endothelial cells that have properties closer to those of living corneal endothelial cells than corneal endothelial-like cells produced by conventional methods.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for producing corneal endothelial cells comprising a step of culturing periocular neural crest cells using a medium containing fibroblast growth factor.
  • the glycolysis inhibitor is 2-deoxy-D-glucose.
  • periocular neural crest cells are periocular neural crest cells induced to differentiate from pluripotent stem cells via a SEAM cell population.
  • the pluripotent stem cells are human iPS cells.
  • a method for producing periocular neural crest cells comprising the steps of forming a SEAM cell population from pluripotent stem cells and culturing cells including neural crest cells in the SEAM cell population using a medium containing fibroblast growth factor.
  • the present invention makes it possible to produce corneal endothelial cells that have properties closer to those of living corneal endothelial cells than corneal endothelial-like cells produced by conventional methods, and to provide corneal endothelial cells of a quality suitable for transplantation into humans.
  • FIG. 1 shows the results of observing the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the obtained cells by immunofluorescence staining after a SEAM cell population induced from human iPS cells was detached and dispersed and cultured on a Matrigel-coated culture dish using a differentiation medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and the resulting spheroids were cultured in a corneal endothelial induction medium containing bFGF.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a SEAM cell population was detached and dispersed, and cultured on a Matrigel-coated culture dish using a differentiation medium not containing bFGF, and the resulting spheroids were cultured in a corneal endothelial induction medium containing bFGF.
  • the figure shows the results of observing the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the resulting cells by immunofluorescence staining.
  • a population of SEAM cells induced from human iPS cells was detached and dispersed, and cultured on Matrigel-coated culture dishes using differentiation medium containing or not containing bFGF.
  • periocular neural crest (POM) cell markers AP-2 ⁇ , PITX2
  • corneal endothelial cell markers ZP4, COL8A2
  • neural retinal cell markers MITF, CHX10
  • FIG. 1 shows the results of observing the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the obtained cells by immunofluorescence staining after a SEAM cell population induced from human iPS cells was detached and dispersed and cultured on a Matrigel-coated culture dish using a differentiation medium containing bFGF, and the obtained spheroids were cultured in a corneal endothelial induction medium containing bFGF.
  • human corneal endothelial cell markers AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin
  • FIG. 4 shows the results of observing the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the resulting cells by immunofluorescence staining.
  • FIG. 1 shows the results of observing the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the resulting cells by immunofluorescence staining.
  • FIG. 1 shows the results of observing the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the obtained cells by immunofluorescence staining after a SEAM cell population induced from human iPS cells was detached and dispersed and cultured on a type IV collagen-coated culture dish using a differentiation medium containing bFGF, and the obtained spheroids were cultured in a corneal endothelial induction medium containing bFGF.
  • human corneal endothelial cell markers AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin
  • a SEAM cell population induced from human iPS cells was detached and dispersed, and cultured on a type IV collagen-coated culture dish using a differentiation medium containing bFGF, and the resulting spheroids were cultured in a corneal endothelial induction medium containing no bFGF, and the expression of human corneal endothelial cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2, N-cadherin) in the resulting cells was observed by immunofluorescence staining.
  • FIG. 13 is a diagram showing the conditions for inducing differentiation of human iPS cells and reporter gene-introduced human iPS cells into corneal endothelial cells in Example 6.
  • Figure 11 shows the results of confirming the expression of neural crest marker (AP-2 ⁇ ) and periocular neural crest (POM) cell markers (AP-2 ⁇ , PITX2) by reporter gene expression (green fluorescence for AP-2 ⁇ , red fluorescence for PITX2) in 17-d spheroids recovered from a SEAM cell population induced using reporter gene-transfected human iPS cells under the differentiation induction conditions of Figure 9, and in 24-d spheroids obtained by suspension culture in low-absorbency culture dishes using periocular neural crest induction medium containing bFGF.
  • FIG. 10 shows the results of immunofluorescence staining of the expression of human corneal endothelial cell markers (PITX2, N-cadherin) and retinal pigment epithelial cell marker (MITF) in cells cultured for 70 days using human iPS cells under the differentiation induction conditions of FIG.
  • the present invention provides a method for producing corneal endothelial cells.
  • the method for producing corneal endothelial cells of the present invention may include a step of culturing periocular neural crest cells using a medium containing fibroblast growth factor (FGF).
  • FGF fibroblast growth factor
  • Periocular neural crest cells are also called periocular mesenchymal (POM) cells.
  • POM periocular neural crest
  • FGF is a type of growth factor that is involved in various vital phenomena such as embryonic development, angiogenesis, and wound healing, and 22 types of FGF (FGF1 to FGF14, FGF16 to FGF23) have been identified in humans.
  • FGF1 is known as acidic FGF (aFGF)
  • FGF2 is known as basic FGF (bFGF).
  • aFGF acidic FGF
  • bFGF basic FGF
  • the FGF used in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention may be basic FGF.
  • basic FGF may be abbreviated as "bFGF”.
  • Periocular neural crest cells can be identified by the expression of periocular neural crest cell markers, such as PITX2, AP-2 ⁇ , and FOXC1.
  • Corneal endothelial cells can be identified by the expression of corneal endothelial cell markers, such as PITX2, AP-2 ⁇ , and N-cadherin, and by their characteristic structure in which hexagonal cells are regularly arranged like paving stones.
  • AP-2 ⁇ as a corneal endothelial cell marker, it can be inferred that the manufactured corneal endothelial cells have properties closer to those of living corneal endothelial cells (Non-Patent Document 4), and are considered to have the quality to be transplanted into humans.
  • the medium containing fibroblast growth factor (FGF) is not particularly limited, and a medium in which FGF has been added to a known medium that can be used for culturing animal cells can be used.
  • known animal culture media include BME medium, BMJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, Neurobasal medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the medium may be a known medium for culturing endothelial cells to which FGF has been added.
  • the medium may be a serum-free medium.
  • serum-free supplements such as KnockOut Serum Replacement (KSR), N2 supplement, and B27 supplement can be suitably used as the serum-free medium.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement N2 supplement
  • B27 supplement can be suitably used as the serum-free medium.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement N2 supplement
  • B27 supplement B27 supplement
  • the FGF concentration in the medium is not particularly limited, but for example, when bFGF is used, it may be 1 ng/mL or more, 2 ng/mL or more, 3 ng/mL or more, 4 ng/mL or more, 5 ng/mL or more, or 10 ng/mL or less, 9 ng/mL or less, 8 ng/mL or less, 7 ng/mL or less, or 6 ng/mL or less.
  • the bFGF concentration in the medium may be 2 ng/mL or 4 ng/mL.
  • the medium containing FGF used in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention may further contain a glycolysis inhibitor.
  • the glycolysis inhibitor may be any inhibitor that inhibits glycolysis and inhibits ATP production, and may be, for example, 2-deoxy-D-glucose (2DG).
  • the concentration of 2DG in the medium is not particularly limited, and may be 2 mM or more, 4 mM or more, 6 mM or more, or 8 mM or more, or 20 mM or less, 18 mM or less, 16 mM or less, 14 mM or less, or 12 mM or less.
  • the concentration of 2DG in the medium may be 10 mM.
  • the culture period is not particularly limited, and can be set appropriately by observing cells expressing corneal endothelial cell markers and the characteristic structure of corneal endothelial cells.
  • the culture period may be, for example, 5 weeks or more, 6 weeks or more, 7 weeks or more, 8 weeks or more, 9 weeks or more, or 10 weeks or more.
  • periocular neural crest cells used in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention are not particularly limited, and periocular neural crest cells obtained by known methods can be used.
  • periocular neural crest cells obtained by known methods can be used.
  • the periocular neural crest cells used in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention are preferably periocular neural crest cells induced to differentiate from pluripotent stem cells via a SEAM cell population.
  • Methods for inducing a SEAM cell population from pluripotent stem cells are known, and for example, the methods described in Non-Patent Documents 2 or 3 can be used.
  • Known methods for inducing periocular neural crest cells from pluripotent stem cells via a SEAM cell population include, for example, the method described in Okubo et al. (J Biol Chem. 2020 Mar 13; 295(11): 3456-3465. doi: 10.1074/jbc.RA119.010713. Epub 2020 Feb 7.).
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, sperm stem (GS) cells, embryonic germ (EG) cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts, and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells).
  • ES cells, ntES cells, and iPS cells are preferred, and iPS cells are more preferred.
  • Pluripotent stem cells are preferably mammalian pluripotent stem cells. Mammals are not particularly limited, and include humans, non-human primates, dogs, cats, mice, rats, cows, pigs, sheep, and the like. Humans are particularly preferred. By using human pluripotent stem cells, a cell population corresponding to a safe cell type that can be used in human regenerative medicine can be obtained.
  • corneal endothelial cells produced by the method of producing corneal endothelial cells of the present invention using periocular neural crest cells induced to differentiate from pluripotent stem cells via a SEAM cell population are corneal endothelial cells that have differentiated through the developmental process of the human eye, have properties equivalent to those of corneal endothelial cells in vivo, and are considered to be corneal endothelial cells that can be transplanted into humans.
  • the present invention provides a method for producing periocular neural crest (POM) cells.
  • the method for producing POM cells of the present invention may include the steps of forming a SEAM cell population from pluripotent stem cells and culturing cells in the SEAM cell population, including neural crest cells, using a medium containing fibroblast growth factor.
  • POM cells produced by the method for producing POM cells of the present invention can be suitably used as POM cells in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention.
  • POM cells produced by the method for producing POM cells of the present invention can be suitably used to produce various somatic cells that differentiate via POM cells.
  • the process of forming a SEAM cell population from pluripotent stem cells can be carried out using known methods, for example, as described in Non-Patent Documents 2 or 3.
  • the first embodiment of the method for producing POM cells of the present invention is a method including dispersing cells of a SEAM cell population. Specifically, the method can be carried out by detaching a SEAM cell population to disperse the cells, and then performing adhesion culture of the dispersed cells obtained using a medium containing FGF. That is, in the first embodiment of the method for producing POM cells of the present invention, cells obtained by detaching and dispersing a SEAM cell population can be used as "cells containing neural crest cells in a SEAM cell population".
  • Non-Patent Document 2 Since the present inventors have reported that a SEAM cell population contains neural crest cells (Non-Patent Document 2), confirmation of neural crest cells in dispersed cells of a SEAM cell population may be omitted.
  • FGF is not particularly limited, and may be bFGF.
  • Neural crest cells in dispersed cells of a SEAM cell population can be confirmed as cells expressing neural crest cell markers. Examples of neural crest cell markers include SOX10, SOX9, AP-2 ⁇ , and p75NTR.
  • the medium containing FGF is not particularly limited, and a medium in which FGF has been added to a known medium that can be used for culturing animal cells can be used, similar to the medium used in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention described above.
  • the concentration of FGF in the medium is not particularly limited, but when bFGF is used, for example, it may be 1 ng/mL or more, 5 ng/mL or more, 7 ng/mL or more, 8 ng/mL or more, 9 ng/mL or more, 10 ng/mL or more, or 20 ng/mL or less, 15 ng/mL or less, 13 ng/mL or less, 12 ng/mL or less, or 11 ng/mL or less.
  • a medium containing FGF for example, a medium in which FGF has been added to the differentiation medium described in Example 1 below can be suitably used.
  • a culture dish coated with an extracellular matrix may be used.
  • the extracellular matrix is not particularly limited as long as it is a known extracellular matrix used for cell culture. Examples include Matrigel (trade name), type I collagen, type IV collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, etc.
  • dispersed cells of a SEAM cell population when cultured by adhesion, they are separated into cells that form floating spheroids during the culture period and cells that remain adherent without forming spheroids, but the present inventors have confirmed that POM cells are present among both the cells that form spheroids and the cells that remain adherent.
  • the spheroid cells may be collected and subjected to the method of producing corneal endothelial cells of the present invention, the cells that remain adherent may be subjected to the method of producing corneal endothelial cells of the present invention, or the spheroid cells and adherent cells may be subjected to the method of producing corneal endothelial cells of the present invention without being separated.
  • the culture period is not particularly limited and can be set appropriately by confirming the appearance of cells expressing POM cell markers.
  • the culture period may be 5 days or more, 1 week or more, 2 weeks or more, 3 weeks or more, 4 weeks or more, 5 weeks or more, 6 weeks or more, 7 weeks or more, or 15 weeks or less, 12 weeks or less, 10 weeks or less, 9 weeks or less, or 8 weeks or less.
  • the second embodiment of the method for producing POM cells of the present invention can be carried out by recovering spheroids formed from the second layer of the SEAM cell population and culturing the spheroids using a medium containing FGF. That is, in the second embodiment of the method for producing POM cells of the present invention, spheroids formed from the second layer of the SEAM cell population can be used as "cells containing neural crest cells in the SEAM cell population". Since the present inventors have reported that when a SEAM cell population is cultured, spheroids formed by cells in the second layer contain neural crest cells (Non-Patent Document 2), confirmation of neural crest cells in the spheroids may be omitted.
  • the FGF is not particularly limited, and may be bFGF.
  • the medium containing FGF may be a medium obtained by adding FGF to a known medium that can be used for culturing animal cells, similar to the medium used in the method for producing corneal endothelial cells of the present invention.
  • the concentration of FGF in the medium is not particularly limited, but when bFGF is used, for example, the concentration may be 1 ng/mL or more, 2 ng/mL or more, 3 ng/mL or more, 4 ng/mL or more, 5 ng/mL or more, or 10 ng/mL or less, 9 ng/mL or less, 8 ng/mL or less, 7 ng/mL or less, or 6 ng/mL or less.
  • the medium containing FGF used in the second embodiment preferably further contains a ROCK inhibitor.
  • the medium containing FGF for example, the periocular neural crest induction medium (POMM) described in Example 6 below can be suitably used.
  • the culture dish is preferably, but not limited to, a low-adhesion surface-treated culture dish.
  • the culture period is not particularly limited and can be set appropriately by confirming the appearance of cells expressing POM cell markers.
  • the culture period may be 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or 12 days or less, 11 days or less, 10 days or less, 9 days or less, or 8 days or less.
  • Small spheroids containing neural crest cells at the start of culture proliferate and differentiate during the culture period, and can be recovered as large spheroids containing POM cells.
  • the present invention provides a method for producing corneal endothelial cells from pluripotent stem cells, which is a combination of the first embodiment of the method for producing POM cells of the present invention and the method for producing corneal endothelial cells of the present invention.
  • the present invention also provides a method for producing corneal endothelial cells from pluripotent stem cells, which is a combination of the second embodiment of the method for producing POM cells of the present invention and the method for producing corneal endothelial cells of the present invention.
  • Example 1 Study on differentiation induction method from human iPS cells to human corneal endothelial cells 1
  • Human iPS cell line 201B7 was obtained from the Riken BioResource Center. The cells were seeded on culture dishes coated with laminin 511E8 (iMatrix-511 silk, Nippi) at a concentration of 0.5 ⁇ g/ cm2 , maintained in StemFit medium (Ajinomoto) for 10 days, and then cultured in differentiation medium (DM; GMEM (Life Technologies) containing 10% knockout serum replacement (KSR, Life Technologies), 1 mM sodium pyruvate (Life Technologies), 0.1 mM non-essential amino acids (Life Technologies), 2 mM L-glutamine (Life Technologies), 55 ⁇ M monothioglycerol (Wako), penicillin, and streptomycin) for 17 days to induce SEAM cell population.
  • DM differentiation medium
  • GMEM containing 10% knockout serum replacement
  • KSR knockout serum replacement
  • 1 mM sodium
  • the cells were then washed three times for 10 min with TBS, incubated overnight at 4°C with 1:500 dilutions of Alexa Fluor 488-, 568-, and 647-labeled secondary antibodies (Life technologies) and 1:100 dilutions of Hoechst 33342 (Molecular Probes), and washed three times for 10 min with TBS.
  • the primary antibodies used were anti-AP-2 ⁇ (Cell Signaling Technology, #2509, Rabbit), anti-PITX2 (abcam, ab55599, Mouse), and anti-N-cadherin (R&D Systems, AF6426, Sheep). Observation was performed using a fluorescence microscope (Axio Observer.D1, Carl Zeiss).
  • Example 2 Examination of a method for inducing differentiation of human iPS cells into human corneal endothelial cells 2]
  • (1) Induction of Differentiation from iPS Cells to a SEAM Cell Population A SEAM cell population was induced in the same manner as in (1) of Example 1, except that the culture period was changed to 21 days.
  • AP2 ⁇ -F TTCCTCCCAAATCGGTGACTT (SEQ ID NO: 1)
  • AP2 ⁇ -R CGCCGGTGTTGACAGACAT (SEQ ID NO: 2)
  • PITX2-F GCCAAGGGCCTTACATCCG (SEQ ID NO: 3)
  • PITX2-R GGTGGGGAAAACATGCTCTG (SEQ ID NO: 4)
  • ZP4-F GACTGTGGCACCTGGATAAGA (SEQ ID NO: 5)
  • ZP4-R TCCCACTCAGTGACATAGCAG (SEQ ID NO: 6)
  • COL8A2-F GAGCCAGGAATACGAGGGGA (SEQ ID NO: 7)
  • COL8A2-R TCCAGGGATAGTAATGCCTGAG (SEQ ID NO: 8)
  • MITF-F AGAGTCTGAAGCAAGGCACTG (SEQ ID NO: 9)
  • MITF-R TGCGGTCATTTATGTTAAATCTTC (SEQ ID NO:
  • the neural retinal cell markers (MITF and CHX10) were expressed, whereas the POM markers (AP-2 ⁇ and PITX2) and the corneal endothelial cell markers (ZP4 and COL8A2) were hardly expressed.
  • Example 3 Examination of the usefulness of FGF in inducing differentiation of spheroids formed in a medium containing FGF into corneal endothelial cells 1]
  • (1) Recovery and culture of spheroids A SEAM cell population was induced in the same manner as in (1) of Example 1, except that the culture period was changed to 14 days.
  • the SEAM cell population was detached in the same manner as in (2) of Example 1, and a cell suspension was prepared in a differentiation medium containing bFGF. The cells were then seeded on a 12-well culture plate coated with 1% Matrigel and cultured for 12 weeks.
  • the spheroids in the culture dish were recovered and subjected to adhesion culture for 9 weeks on a 24-well culture plate using a corneal endothelial induction medium containing bFGF (FGF+) or a corneal endothelial induction medium not containing bFGF (FGF-).
  • FGF+ corneal endothelial induction medium containing bFGF
  • FGF- corneal endothelial induction medium not containing bFGF
  • Example 4 Examination 2 of the usefulness of FGF in inducing differentiation of spheroids formed in a medium containing FGF into corneal endothelial cells]
  • (1) Experimental Method The same method as in Example 3 was used, except that the coating extracellular matrix was changed from Matrigel to type IV collagen (Cellmatrix Type IV, Nitta Gelatin). Cellmatrix Type IV (3 mg/mL) was diluted 20-fold with hydrochloric acid (pH 3) and used to coat the culture dish.
  • Example 5 Induction of differentiation into corneal endothelial cells from remaining adherent cells after recovery of spheroids formed in a medium containing FGF]
  • Example 5 Induction of differentiation into corneal endothelial cells from remaining adherent cells after recovery of spheroids formed in a medium containing FGF]
  • the dispersed SEAM cell population was seeded on a 12-well culture plate coated with type IV collagen and cultured for 12 weeks, and the spheroids in the culture dish were collected. Then, the adherent cells remaining on the culture dish were cultured for 9 weeks in a corneal endothelium induction medium containing bFGF. After 9 weeks of adherent culture, the cells were subjected to immunofluorescence staining in the same manner as in Example 1 (4).
  • Example 6 Examination of the usefulness of 2DG in inducing differentiation of POM into corneal endothelial cells (1) Differentiation induction conditions The differentiation induction conditions from human iPS cells to corneal endothelial cells in this example are shown in FIG. 9.
  • the 201B7 cell line and the AP2 ⁇ -EGFP/PITX2-E2-Crimson reporter iPS cell line were used as human iPS cells.
  • This reporter iPS cell line was created by transfecting a targeting gene containing a drug resistance gene into iPS cells by genome editing using CRISPER/Cas9.
  • human iPS cells were maintained in StemFit medium for 10 days (0d), and then cultured for 1 day using differentiation medium (DM) containing 3 ⁇ M CHIR99021. Thereafter, the cells were cultured for 16 days in differentiation medium without CHIR99021 to induce a SEAM cell population, and the clusters of neural crest cells that occurred in zone 2 of the SEAM cell population were collected as spheroids (17d).
  • DM differentiation medium
  • the collected spheroids were transferred to a low-adhesive culture dish (Sumitomo Bakelite MS-1160R) and cultured in suspension for 7 days in periocular neural crest induction medium (POMM; DMEM/F12 containing 20% knockout serum replacement, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM non-essential amino acids, 2 mM L-glutamin, 55 ⁇ M monothioglycerol, 10 ⁇ M Y-27632, penicillin, streptomycin, and 4 ng/mL bFGF) to induce POM, and spheroidal POM were collected (24 d).
  • POMM periocular neural crest induction medium
  • the collected spheroidal POM were seeded on a culture dish coated with type I collagen (Cellmatrix Type I-A, Nitta Gelatin) and cultured for 70 days (70 d) in a medium prepared by adding 10 mM 2-deoxy-D-glucose (2DG) to the corneal endothelium induction medium described in Example 1 (3).
  • type I collagen Cellmatrix Type I-A, Nitta Gelatin
  • FIG. 11 The results of immunofluorescence staining at 70 days are shown in Figure 11.
  • POM spheroids collected at 24 days were cultured on a culture dish coated with type I collagen using corneal endothelial induction medium (HESFM) containing bFGF and 2DG, a structure in which hexagonal cells were regularly arranged like paving stones, a characteristic structure of human corneal endothelial cells, was observed.
  • human corneal endothelial cell markers PITX2 and N-cadherin were expressed, but the retinal pigment epithelial cell marker MITF was not expressed.

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Abstract

本発明は、眼周囲神経堤細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する工程を含む、角膜内皮細胞の製造方法を提供する。本発明により、生体の角膜内皮細胞に近い特性を有し、ヒトへの移植が可能な品質の角膜内皮細胞を提供することができる。

Description

角膜内皮細胞の製造方法
　本発明は、角膜内皮細胞の製造方法に関するものである。
　角膜は眼球の前方に位置し、５層構造を持った透明な組織である。角膜内皮細胞層は角膜深層部に存在する単層の細胞層であり、バリア機能とポンプ機能を持ち、角膜の水分量を一定に保つことで角膜の透明性を維持する役割を果たしている。
　水疱性角膜症を始めとする角膜内皮疾患は失明に至る重篤疾患である。そのため、角膜移植が必要となるが、ドナー患者からの角膜提供が必要となる。しかしながら、角膜移植の状況として、慢性的なドナー不足により年間数千人ほどの待機患者がいること、および他者の角膜移植に伴う拒絶反応等の問題点がある。代替法として、幹細胞を用いた角膜上皮シート移植法などの開発が進んでいるが、角膜内皮細胞を対象とした新たな治療法の開発は未だ十分でない。
　ヒト多能性幹細胞からヒト角膜内皮細胞を誘導するには、眼周囲神経堤を誘導し、そこから角膜内皮細胞を誘導することが求められる。いくつかの方法が提案されているものの、角膜内皮様の細胞を誘導するに留まっており（非特許文献１）、科学的および臨床的に十分であると評価できるヒト角膜内皮細胞の誘導法は未だ開発されていない。
　本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から眼全体の発生を再現させる二次元培養系を開発した（非特許文献２、３）。この培養系で得られる同心円状の帯状構造（self-formed ectodermal autonomous multi-zone：SEAM）には、発生期の眼を構成する主要な細胞群（角膜上皮、網膜、水晶体上皮など）が特定の部位に出現することが知られている。現在、SEAM法から作製した角膜上皮細胞シートによるFirst-in-humanの臨床研究が実施されている。
　本発明者らは、転写因子TFAP2B（Transcription Factor AP-2 Beta; AP-2β）が、神経堤から角膜内皮細胞への分化と角膜内皮細胞の高い増殖能力の維持に重要であることを報告している（非特許文献４）。
Jiagang J. Zhao and Natalie A. Afshari, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016 Dec; 57(15): 6878-6884. Hayashi et al. Nature. 2016 Mar 17;531(7594):376-380. Hayashi et al. Nature Protocols, 2017, 12(4), 683-696. Hara et al. J Biol Chem. 2019, 294(7), 2460-2469.
　本発明は、従来法で製造された角膜内皮様細胞と比較して、より生体の角膜内皮細胞に近い特性を有する角膜内皮細胞を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］眼周囲神経堤細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する工程を含む、角膜内皮細胞の製造方法。
［２］前記培地が、さらに解糖系阻害剤を含む、前記［１］に記載の製造方法。
［３］前記解糖系阻害剤が２－デオキシ－Ｄ－グルコースである、前記［２］に記載の製造方法。
［４］前記眼周囲神経堤細胞が、多能性幹細胞から分化誘導された眼周囲神経堤細胞である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記眼周囲神経堤細胞が、多能性幹細胞からＳＥＡＭ細胞集団を経由して分化誘導された眼周囲神経堤細胞である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、前記［４］または［５］に記載の製造方法。
［７］多能性幹細胞からＳＥＡＭ細胞集団を形成させる工程と、ＳＥＡＭ細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する工程を含む、眼周囲神経堤細胞の製造方法。
［８］ＳＥＡＭ細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する前記工程が、ＳＥＡＭ細胞集団の細胞を分散させることを含む、前記［７］に記載の方法。
［９］前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、前記［７］に記載の製造方法。
　本発明により、従来法で製造された角膜内皮様細胞と比較して、より生体の角膜内皮細胞に近い特性を有する角膜内皮細胞を製造することができ、ヒトへの移植が可能な品質の角膜内皮細胞を提供することができる。
ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含有する分化培地を用いてマトリゲルコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドをbFGFを含有する角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 図１のコントロールとして、SEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有しない分化培地を用いてマトリゲルコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドをbFGFを含有する角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有する分化培地またはbFGFを含有しない分化培地を用いてマトリゲルコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドにおける眼周囲神経堤（POM）細胞マーカー（AP-2β、PITX2）、角膜内皮細胞マーカー（ZP4、COL8A2）、神経網膜細胞マーカー（MITF、CHX10）の発現を、定量RT-PCRで測定した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有する分化培地を用いてマトリゲルコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドをbFGFを含有する角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 図４のコントロールとして、ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有する分化培地を用いてマトリゲルコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドをbFGFを含有しない角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有する分化培地を用いてIV型コラーゲンコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドをbFGFを含有する角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 図６のコントロールとして、ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有する分化培地を用いてIV型コラーゲンコーティングした培養皿で培養し、得られたスフェロイドをbFGFを含有しない角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から誘導したSEAM細胞集団を剥離・分散し、bFGFを含有する分化培地を用いてIV型コラーゲンコーティングした培養皿で培養し、培養皿上に残存した細胞をbFGFを含有する角膜内皮誘導培地を用いて培養し、得られた細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（AP-2β、PITX2、N-cadherin）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。 実施例６におけるヒトiPS細胞およびレポーター遺伝子導入ヒトiPS細胞から角膜内皮細胞への分化誘導条件を示す図である。 図９の分化誘導条件に従い、レポーター遺伝子導入ヒトiPS細胞を用いて誘導したSEAM細胞集団から回収した17ｄのスフェロイド、並びに、bFGFを含有する眼周囲神経堤誘導培地を用いて低吸収性培養皿で浮遊培養して得られた24ｄのスフェロイドにおける神経堤マーカー（AP-2β）および眼周囲神経堤（POM）細胞マーカー（AP-2β、PITX2）の発現を、レポーター遺伝子の発現（AP-2βは緑色蛍光、PITX2は赤色蛍光）で確認した結果を示す図である。 図９の分化誘導条件に従い、ヒトiPS細胞を用いて培養した70ｄの細胞におけるヒト角膜内皮細胞マーカー（PITX2、N-cadherin）および網膜色素上皮細胞マーカー（MITF）の発現を、免疫蛍光染色で観察した結果を示す図である。
〔角膜内皮細胞の製造方法〕
　本発明は、角膜内皮細胞の製造方法を提供する。本発明の角膜内皮細胞の製造方法は、眼周囲神経堤細胞を、線維芽細胞増殖因子（FGF; fibroblast growth factor）を含む培地を用いて培養する工程を含むものであればよい。本明細書において、線維芽細胞増殖因子を「FGF」と略記する場合がある。眼周囲神経堤（Periocular neural crest）細胞は、眼周囲間葉（POM; Periocular Mesenchymal）細胞とも称される。本明細書において、眼周囲神経堤を「POM」と略記する場合がある。
　FGFは胚発生，血管新生，創傷治癒などさまざまな生命現象に関係する増殖因子の一種であり、ヒトでは22種類のFGF（FGF1～FGF14、FGF16～FGF23）が同定されている。FGF1は酸性FGF（acidic FGF、aFGF）として知られており、FGF2は塩基性FGF（basic FGF、bFGF）として知られている。本発明の角膜内皮細胞の製造方法に使用するFGFは、眼周囲神経堤細胞から角膜内皮細胞への分化誘導に寄与するものであれば特に限定されない。本発明の角膜内皮細胞の製造方法に使用するFGFは、塩基性FGFであってもよい。本明細書において、塩基性FGFを「bFGF」と略記する場合がある。
　眼周囲神経堤細胞は、例えばPITX2、AP-2β、FOXC1等の眼周囲神経堤細胞マーカーの発現により特定することができる。角膜内皮細胞は、例えばPITX2、AP-2β、N-cadherin等の角膜内皮細胞マーカーの発現や、六角形の細胞が敷石状に規則的に配列された特徴的構造により特定することができる。特に、角膜内皮細胞マーカーとしてAP-2βの発現を確認することで、製造された角膜内皮細胞が生体の角膜内皮細胞により近い特性を有することが推認され（非特許文献４）、ヒトへの移植が可能な品質を有すると考えられる。
　線維芽細胞増殖因子（FGF）を含む培地は特に限定されず、動物細胞の培養に用いることができる公知の培地にFGFを添加した培地を用いることができる。公知の動物培養用培地としては、例えば、BME培地、BMJb培地、CMRL1066培地、Glasgow MEM（GMEM）培地、Improved MEM Zinc Option培地、Neurobasal培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、これらの混合培地などが挙げられる。培地は公知の内皮細胞培養用培地にFGFを添加した培地であってもよい。培地は無血清培地であってもよい。無血清培地には、KnockOut Serum Replacement（KSR）、N2サプリメント、B27サプリメント等の市販の無血清サプリメントを好適に用いることができる。移植用の角膜内皮細胞を製造する場合は、ゼノフリー培地を用いることが好ましい。
　培地中のFGF濃度は特に限定されないが、例えばbFGFを用いる場合、1 ng/mL以上、2 ng/mL以上、3 ng/mL以上、4 ng/mL以上、5 ng/mL以上であってもよく、10 ng/mL以下、9 ng/mL以下、8 ng/mL以下、7 ng/mL以下、6 ng/mL以下であってもよい。培地中のbFGF濃度は、2 ng/mLあってもよく、4 ng/mLであってもよい。
　本発明の角膜内皮細胞の製造方法で使用するFGFを含む培地は、さらに解糖系阻害剤を含むものであってもよい。解糖系阻害剤としては、解糖系を阻害してATP産生を阻害するものであればよく、例えば、2-デオキシ-D-グルコース（2DG; 2-deoxy-D-glucose）が挙げられる。培地中の2DGの濃度は特に限定されないが、2 mM以上、4 mM以上、6 mM以上、8 mM以上であってもよく、20 mM以下、18 mM以下、16 mM以下、14 mM以下、12 mM以下であってもよい。培地中の2DGの濃度は10 mMであってもよい。
　培養期間は特に限定されず、角膜内皮細胞マーカー発現細胞や角膜内皮細胞の特徴的構を観察することにより、適宜設定することができる。培養期間は、例えば5週間以上、6週間以上、7週間以上、8週間以上、9週間以上、10週間以上であってもよい。
　本発明の角膜内皮細胞の製造方法で使用する眼周囲神経堤細胞は特に限定されず、公知の方法で取得した眼周囲神経堤細胞を用いることができる。例えば、Atkinson-Leadbeaterら（Dev Dyn. 2014 May;243(5):663-75. doi: 10.1002/dvdy.24113. Epub 2014 Feb 24.）に記載の方法、Chenら（Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Jun 1;59(7):3028-3036. doi: 10.1167/iovs.17-23627.）に記載の方法などが挙げられる。
　本発明の角膜内皮細胞の製造方法で使用する眼周囲神経堤細胞は、多能性幹細胞からSEAM細胞集団を経由して分化誘導された眼周囲神経堤細胞であることが好ましい。多能性幹細胞からSEAM細胞集団を誘導する方法は公知であり、例えば非特許文献２または３に記載の方法を用いることができる。多能性幹細胞からSEAM細胞集団を経由して眼周囲神経堤細胞を誘導する公知の方法としては、例えば、Okuboら（J Biol Chem. 2020 Mar 13;295(11):3456-3465. doi: 10.1074/jbc.RA119.010713. Epub 2020 Feb 7.）に記載の方法などが挙げられる。
　多能性幹細胞としては、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹（GS)細胞、胚性生殖（EG）細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが挙げられる。好ましくは、ES細胞、ntES細胞およびiPS細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であることが好ましい。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。ヒト多能性幹細胞を用いることにより、ヒトの再生医療に利用可能な安全な細胞種に応じた細胞集団を取得することができる。
　本発明者らはSEAM細胞集団に神経堤細胞が含まれることを報告している（非特許文献２）。したがって、多能性幹細胞からSEAM細胞集団を経由して分化誘導された眼周囲神経堤細胞を用いて、本発明の角膜内皮細胞の製造方法で製造された角膜内皮細胞は、ヒトの眼の発生過程を経由して分化した角膜内皮細胞であり、生体の角膜内皮細胞と同等の特性を有し、ヒトへの移植が可能な角膜内皮細胞であると考えられる。
〔眼周囲神経堤細胞の製造方法〕
　本発明は、眼周囲神経堤（POM）細胞の製造方法を提供する。本発明のPOM細胞の製造方法は、多能性幹細胞からSEAM細胞集団を形成させる工程と、SEAM細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する工程を含むものであればよい。本発明のPOM細胞の製造方法により製造されたPOM細胞は、上記本発明の角膜内皮細胞の製造方法のPOM細胞として、好適に用いることができる。また、本発明のPOM細胞の製造方法により製造されたPOM細胞は、POM細胞を経由して分化する各種体細胞を製造するために、好適に用いることができる。
　多能性幹細胞からSEAM細胞集団を形成させる工程は、例えば非特許文献２または３に記載の公知の方法を用いて実施することができる。
（１）第一の実施形態
　本発明のPOM細胞の製造方法の第一の実施形態は、SEAM細胞集団の細胞を分散させることを含む方法である。具体的には、SEAM細胞集団を剥離して細胞を分散させ、FGFを含有する培地を用いて得られた分散細胞を接着培養することにより実施することができる。すなわち、本発明のPOM細胞の製造方法の第一の実施形態では「SEAM細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞」として、SEAM細胞集団を剥離・分散して得られた細胞を用いることができる。本発明者らはSEAM細胞集団に神経堤細胞が含まれることを報告しているので（非特許文献２）、SEAM細胞集団の分散細胞中の神経堤細胞の確認を省略してもよい。FGFは特に限定されず、bFGFであってもよい。SEAM細胞集団の分散細胞中の神経堤細は、神経堤細胞マーカー発現細胞として確認することができる。神経堤細胞マーカーとしては、例えば、SOX10、SOX9、AP-2β、p75NTR等が挙げられる。
　FGFを含有する培地は特に限定されず、上記本発明の角膜内皮細胞の製造方法で用いる培地と同様に、動物細胞の培養に用いることができる公知の培地にFGFを添加した培地を用いることができる。培地中のFGF濃度は特に限定されないが、例えばbFGFを用いる場合、1 ng/mL以上、5 ng/mL以上、7 ng/mL以上、8 ng/mL以上、9 ng/mL以上、10 ng/mL以上であってもよく、20 ng/mL以下、15 ng/mL以下、13 ng/mL以下、12 ng/mL以下、11 ng/mL以下であってもよい。FGFを含有する培地としては、例えば、後段の実施例１に記載の分化培地にFGFを添加した培地を好適に用いることができる。
　培養には、細胞外マトリックスでコーティングした培養皿を用いてもよい。細胞外マトリックスは、細胞培養に用いられる公知の細胞外マトリックスであれば特に限定されない。例えば、マトリゲル（商品名）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン等が挙げられる。
　第一の実施形態において、SEAM細胞集団の分散細胞を接着培養すると、培養期間中に浮遊状のスフェロイドを形成する細胞と、スフェロイドを形成せずに接着したままの細胞に分離するが、本発明者らは、スフェロイドを形成する細胞と接着したままの細胞の両方にPOM細胞が存在することを確認している。したがって、スフェロイド細胞を回収して、本発明の角膜内皮細胞の製造方法に供してもよく、接着したままの細胞を本発明の角膜内皮細胞の製造方法に供してもよく、スフェロイド細胞と接着細胞を分けずに本発明の角膜内皮細胞の製造方法に供してもよい。
　培養期間は特に限定されず、POM細胞マーカーを発現する細胞の出現を確認することにより適宜設定することができる。培養期間は5日以上、1週間以上、2週間以上、3週間以上、4週間以上、5週間以上、6週間以上、7週間以上であってもよく、15週間以下、12週間以下、10週間以下、9週間以下、8週間以下であってもよい。
（２）第二の実施形態
　本発明のPOM細胞の製造方法の第二の実施形態は、SEAM細胞集団の第2層から形成されたスフェロイドを回収し、FGFを含有する培地を用いてスフェロイドを培養することにより実施することができる。すなわち、本発明のPOM細胞の製造方法の第二の実施形態では「SEAM細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞」として、SEAM細胞集団の第2層から形成されたスフェロイドを用いることができる。本発明者らはSEAM細胞集団を培養すると第2層の細胞が形成するスフェロイドに神経堤細胞が含まれていることを報告しているので（非特許文献２）、スフェロイド中の神経堤細胞の確認を省略してもよい。FGFは特に限定されず、bFGFであってもよい。
　FGFを含有する培地は、上記本発明の角膜内皮細胞の製造方法で用いる培地と同様に、動物細胞の培養に用いることができる公知の培地にFGFを添加した培地を用いることができる。培地中のFGF濃度は特に限定されないが、例えばbFGFを用いる場合、1 ng/mL以上、2 ng/mL以上、3 ng/mL以上、4 ng/mL以上、5 ng/mL以上であってもよく、10 ng/mL以下、9 ng/mL以下、8 ng/mL以下、7 ng/mL以下、6 ng/mL以下であってもよい。第二の実施形態で用いるFGFを含有する培地は、さらにROCK阻害剤を含有することが好ましい。FGFを含有する培地としては、例えば、後段の実施例６に記載の眼周囲神経堤誘導培地（POMM）を好適に用いることができる。
　培養皿には、低接着表面処理された培養皿を用いることが好ましいが、これに限定されない。培養期間は特に限定されず、POM細胞マーカーを発現する細胞の出現を確認することにより適宜設定することができる。培養期間は4日以上、5日以上、6日以上、7日以上であってもよく、12日以下、11日以下、10日以下、9日以下、8日以下であってもよい。培養開始時の神経堤細胞を含む小型のスフェロイドは、培養期間中に増殖および分化して、POM細胞を含む大型のスフェロイドとして回収することができる。
〔多能性幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法〕
　本発明は、上記本発明のPOM細胞の製造方法の第一の実施形態に続いて上記本発明の角膜内皮細胞の製造方法を組み合わせた形態の、多能性幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法を提供する。また、本発明は、上記本発明のPOM細胞の製造方法の第二の実施形態に続いて上記本発明の角膜内皮細胞の製造方法を組み合わせた形態の、多能性幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法を提供する。これらの発明により、ヒトの眼の発生過程を経由して分化誘導された角膜内皮細胞を提供することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：ヒトiPS細胞からヒト角膜内皮細胞への分化誘導法の検討１〕
（１）iPS細胞からSEAM細胞集団への分化誘導
　ヒトiPS細胞株201B7を理研バイオリソースセンターより入手した。ラミニン511E8（iMatrix-511 silk、ニッピ）を0.5μg/cm2の濃度でコーティングした培養皿に播種し、StemFit培地（味の素）を用いて10日間維持後、分化培地（DM; 10% knockout serum replacement (KSR、Life technologies)、 1mM sodium pyruvate (Life Technologies)、0.1mM non-essential amino acids (Life Technologies)、2mM L-glutamine (Life Technologies)、 55μM monothioglycerol (Wako) 、penicillin、streptomycin を含有するGMEM (Life Technologies)）にて17日間培養し、SEAM細胞集団を誘導した。なお、SEAM細胞集団に神経堤細胞が含まれることは本発明者らにより報告されているため（非特許文献２参照）、実施例１－５では神経堤マーカーの確認を行っていない。
（２）分散したSEAM細胞集団の培養
　得られたSEAM細胞集団をPBSで洗浄し、アキュターゼを用いて細胞を剥離した。剥離した細胞を遠心分離して回収し、分化培地（DM）に懸濁した。bFGF (FUJIFILM) 10ng/mLを含有する分化培地（FGF＋）と、bFGFを含有しない分化培地（FGF－）を用いた。1％マトリゲルでコーティングした12ウェル培養プレート（DM1mL含有）に1.4×106cells/mLで細胞を播種し、12週間接着培養した。培養期間中に、bFGFの有無に関わらず、培養皿内に浮遊する球状の細胞塊（スフェロイド）が形成された。
（３）スフェロイドの回収および接着培養によるヒト角膜内皮細胞への分化誘導
　12週間培養した時点において、培養皿内のスフェロイドを回収し、角膜内皮誘導培地（HESFM; 5% FBS、0.3mM L-ascorbic acid 2-phosphate、1μM SB431542、10μM Y-27632、penicillin、streptomycin、2ng/mL bFGF を含有するHuman Endothelial SFM (Gibco)）を用いて24ウェル培養プレート（Falcon）上で6週間接着培養を行った。
（４）免疫蛍光染色
　6週間接着培養後の細胞に免疫蛍光染色を行った。培地を除去して4％パラホルムアルデヒドをウェルに添加し、細胞を固定した。トリス緩衝生理食塩水（TBS, TaKaRa Bio）で10分間の洗浄を3回行った。非特異反応をブロックするために5％ロバ血清と0.3％Triton X-100を含むTBSで1時間インキュベーションした。その後、ヒト角膜内皮細胞マーカー検出用の一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。続いてTBSで10分間3回洗浄し、Alexa Fluor 488-, 568-, 647-標識二次抗体（Life technologies）の1：500希釈液およびHoechst 33342（Molecular Probes）の1：100希釈液と共に4℃で一晩インキュベートし、TBSで10分間の洗浄を3回行った。一次抗体には、抗AP-2β抗体（Cell Signaling Technology, #2509, Rabbit）、抗PITX2抗体(abcam, ab55599, Mouse)、抗N-cadherin抗体(R&D Systems, AF6426, Sheep)を用いた。観察には蛍光顕微鏡（Axio Observer.D1, Carl Zeiss）を用いた。
（５）結果
　FGF＋群の免疫蛍光染色の結果を図１に、FGF－群の免疫蛍光染色の結果を図２に示した。FGF＋群では、ヒト角膜内皮細胞の特徴的な構造である六角形の細胞が敷石状に規則的に配列された構造が観察され（位相差顕微鏡画像参照）、ヒト角膜内皮細胞マーカーであるAP-2β、PITX2、N-cadherinがいずれも発現していた。一方、FGF－群では、特徴的な構造も、ヒト角膜内皮細胞マーカーの発現も観察されなかった。
〔実施例２：ヒトiPS細胞からヒト角膜内皮細胞への分化誘導法の検討２〕
（１）iPS細胞からSEAM細胞集団への分化誘導
　培養期間を21日間に変更した以外は、実施例１の（１）と同じ方法でSEAM細胞集団を誘導した。
（２）分散したSEAM細胞集団の培養
　実施例１の（２）と同じ方法でSEAM細胞集団を剥離して、bFGFを含有する分化培地（FGF＋）とbFGFを含有しない分化培地（FGF－）でそれぞれ細胞懸濁液を調製し、1％マトリゲルでコーティングした培養皿に播種した。その後5日間接着培養し、培養皿内のスフェロイドを回収した。
（３）定量RT-PCR
　回収したスフェロイドからSepasol-RNA I Super G（ナカライテスク、Cat.09379-55)を使用して全RNAを取得した。SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Thermo fisher）を用いて、製造者のプロトコールに従って逆転写を行い、得られたcDNAをテンプレートとしてPCRを行った。蛍光プローブとしてSYBR Green（ThermoFisher）を用いた。サーモサイクリングプログラムは、95℃で20秒の初期サイクルの後、95℃で3秒を40サイクル、95℃で15秒、60℃で60秒のサイクルで実施した。使用したプライマーを以下に示す。
AP2β-F　：TTCCTCCCAAATCGGTGACTT（配列番号１）
AP2β-R　：CGCCGGTGTTGACAGACAT（配列番号２）
PITX2-F ：GCCAAGGGCCTTACATCCG（配列番号３）
PITX2-R ：GGTGGGGAAAACATGCTCTG（配列番号４）
ZP4-F　 ：GACTGTGGCACCTGGATAAGA（配列番号５）
ZP4-R　 ：TCCCACTCAGTGACATAGCAG（配列番号６）
COL8A2-F：GAGCCAGGAATACGAGGGGA（配列番号７）
COL8A2-R：TCCAGGGATAGTAATGCCTGAG（配列番号８）
MITF-F　：AGAGTCTGAAGCAAGAGCACTG（配列番号９）
MITF-R　：TGCGGTCATTTATGTTAAATCTTC（配列番号１０）
CHX10-F ：GGCGACACAGGACAATCTTTA（配列番号１１）
CHX10-R ：GGCAGCTCCGTTTTCATGG（配列番号１２）
（４）結果
　結果を図３に示した。（A）はAP-2β（POMマーカー）、（B）はPITX2（POMマーカー）、（C）はZP4（角膜内皮細胞マーカー）、（D）はCOL8A2（角膜内皮細胞マーカー）、（E）はMITF（神経網膜細胞マーカー）、（F）はCHX10（神経網膜細胞マーカー）である。FGF＋群の細胞では、POMマーカーであるAP-2βとPITX2、および、角膜内皮細胞マーカーであるZP4とCOL8A2が発現しており、神経網膜細胞マーカーであるMITFとCHX10は発現していないことが確認された。一方FGF－群の細胞では、FGF＋群とは逆に神経網膜細胞マーカー（MITFとCHX10）が発現しており、POMマーカー（AP-2βとPITX2）および角膜内皮細胞マーカー（ZP4とCOL8A2）はほとんど発現していなかった。この結果から、SEAM細胞集団に含まれる神経堤細胞からPOMへの分化誘導には、FGFが必須であることが明らかになった。
〔実施例３：FGFを含有する培地で形成されたスフェロイドから角膜内皮細胞への分化誘導におけるFGFの有用性の検討１〕
（１）スフェロイドの回収および培養
　培養期間を14日間に変更した以外は、実施例１の（１）と同じ方法でSEAM細胞集団を誘導した。実施例１の（２）と同じ方法でSEAM細胞集団を剥離して、bFGFを含有する分化培地で細胞懸濁液を調製し、1％マトリゲルでコーティングした12ウェル培養プレートに播種し12週間培養した。12週間培養した時点において、培養皿内のスフェロイドを回収し、bFGFを含有する角膜内皮誘導培地（FGF＋）またはbFGFを含有しない角膜内皮誘導培地（FGF－）を用いて、24ウェル培養プレート上で9週間接着培養を行った。
（２）免疫蛍光染色
　実施例１の（４）と同じ方法で、9週間接着培養後の細胞の免疫蛍光染色を行った。
（３）結果
　FGF＋群の免疫蛍光染色の結果を図４に、FGF－群の免疫蛍光染色の結果を図５に示した。FGF＋群では、ヒト角膜内皮細胞の特徴的な構造である六角形の細胞が敷石状に規則的に配列された構造が観察され（位相差顕微鏡画像参照）、ヒト角膜内皮細胞マーカーであるAP-2β、PITX2、N-cadherinがいずれも発現していた。一方、FGF－群では、ヒト角膜内皮細胞の特徴的構造を有する細胞は少数であり、ヒト角膜内皮細胞マーカーの発現量も少なかった。この結果から、POMから角膜内皮細胞への分化誘導には、FGFが必須であることが明らかになった。
〔実施例４：FGFを含有する培地で形成されたスフェロイドから角膜内皮細胞への分化誘導におけるFGFの有用性の検討２〕
（１）実験方法
　コーティングする細胞外マトリックスをマトリゲルからIV型コラーゲン（Cellmatrix TypeIV、新田ゼラチン）に変更した以外は、実施例３と同じ方法で行った。Cellmatrix TypeIV（3mg/mL）を塩酸（pH3）で20倍希釈して、培養皿をコーティングした。
（２）結果
　FGF＋群の免疫蛍光染色の結果を図６に、FGF－群の免疫蛍光染色の結果を図７に示した。FGF＋群では、ヒト角膜内皮細胞の特徴的な構造である六角形の細胞が敷石状に規則的に配列された構造が観察され（位相差顕微鏡画像参照）、ヒト角膜内皮細胞マーカーであるAP-2β、PITX2、N-cadherinがいずれも発現していた。一方、FGF－群では、ヒト角膜内皮細胞の特徴的構造を有する細胞は少数であり、ヒト角膜内皮細胞マーカーの発現量も少なかった。この結果から、コーティングする細胞外マトリックスを変更しても、同じ結果が得られることが明らかになった。
〔実施例５：FGFを含有する培地で形成されたスフェロイド回収後の残存接着細胞からの角膜内皮細胞への分化誘導〕
（１）実験方法
　実施例４と同じ方法で、分散したSEAM細胞集団をIV型コラーゲンでコーティングした12ウェル培養プレートに播種して12週間培養を行い、培養皿内のスフェロイドを回収した。続いて、培養皿上に残存した接着細胞を、bFGFを含有する角膜内皮誘導培地で9週間培養した。9週間接着培養後の細胞に、実施例１の（４）と同じ方法で免疫蛍光染色を行った。
（２）結果
　結果を図８に示した。ヒト角膜内皮細胞の特徴的な構造である六角形の細胞が敷石状に規則的に配列された構造が観察され（位相差顕微鏡画像参照）、ヒト角膜内皮細胞マーカーであるAP-2β、PITX2、N-cadherinがいずれも発現していた。この結果から、分散したSEAM細胞集団を、FGFを含有する分化培地で培養することにより分化誘導される眼周囲神経堤（POM）細胞は、スフェロイドを形成する細胞だけに存在するのではなく、スフェロイドを形成しない接着細胞にも存在することが明らかになった。
〔実施例６：POMから角膜内皮細胞への分化誘導における2DGの有用性の検討〕
（１）分化誘導条件
　本実施例のヒトiPS細胞から角膜内皮細胞への分化誘導条件を図９に示す。本実施例では、ヒトiPS細胞として、201B7細胞株およびAP2β-EGFP/PITX2-E2-CrimsonレポーターiPS細胞株を用いた。このレポーターiPS細胞株はCRISPER/Cas9を用いてゲノム編集によって薬剤耐性遺伝子を含むターゲティングジーンをiPS細胞にトランスフェクションすることで作製した。実施例１と同様に、ヒトiPS細胞をStemFit培地で10日間維持培養後（0ｄ）、3μM CHIR99021を添加した分化培地（DM）を用いて1日間培養した。その後CHIR99021を添加しない分化培地で16日間培養してSEAM細胞集団を誘導し、SEAM細胞集団のゾーン2に生じた神経堤細胞のクラスターをスフェロイドとして回収した（17ｄ）。回収したスフェロイドを低吸着性培養皿（住友ベークライト MS-1160R）に移し、眼周囲神経堤誘導培地（POMM; 20% knockout serum replacement、1mM sodium pyruvate、0.1mM non-essential amino acids、2mM L-glutamin、55μM monothioglycerol、10μM Y-27632、penicillin、streptomycin、4ng/mL bFGF を含有するDMEM/F12）を用いて7日間浮遊培養してPOMを誘導し、スフェロイド状のPOMを回収した（24ｄ）。回収したスフェロイド状のPOMを、I型コラーゲン（Cellmatrix TypeI-A、新田ゼラチン）をコーティングした培養皿に播種し、実施例１（３）に記載の角膜内皮誘導培地に10mM 2-deoxy-D-glucose（2DG）を添加した培地を用いて70日目（70ｄ）まで培養した。
（２）17ｄおよび24ｄにおける免疫蛍光染色
　17ｄおよび24ｄの細胞におけるAP-2βの発現をAP2β-EGFPレポーター遺伝子の発現（緑色蛍光）で確認し、PITX2の発現をPITX2-E2-Crimsonレポーター遺伝子の発現（赤色蛍光）で確認した。
（３）70ｄにおける免疫蛍光染色
　実施例１（４）と同じ方法で、70ｄの細胞の免疫蛍光染色を行った。1次抗体には、抗PITX2抗体、抗N-cadherin抗体および抗MITF抗体を用いた。PITX2およびN-cadherinは角膜内皮細胞マーカーである。MITFは網膜色素上皮細胞マーカーであり、陰性対照として使用した。
（４）結果
　17ｄおよび24ｄにおけるレポーター遺伝子発現の結果を図１０に示した。DM培地で17日間培養して誘導したSEAM細胞集団中に、AP-2β陽性の神経堤細胞のクラスター（スフェロイド）が認められた。17ｄに回収した神経堤細胞のスフェロイドを眼周囲神経堤誘導培地で培養した24ｄのスフェロイドは、AP-2βおよびPITX2陽性であり、POMに分化していることが認められた。
　70ｄにおける免疫蛍光染色の結果を図１１に示した。24ｄに回収したPOMのスフェロイドを、bFGFと2DGを含む角膜内皮誘導培地（HESFM）を用いてI型コラーゲンをコーティングした培養皿で接着培養すると、ヒト角膜内皮細胞の特徴的な構造である六角形の細胞が敷石状に規則的に配列された構造が観察された。また、ヒト角膜内皮細胞マーカーであるPITX2とN-cadherinが発現し、網膜色素上皮細胞マーカーのMITFは発現していなかった。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (9)

  1. 　眼周囲神経堤細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する工程を含む、角膜内皮細胞の製造方法。
  2. 　前記培地が、さらに解糖系阻害剤を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記解糖系阻害剤が２－デオキシ－Ｄ－グルコースである、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記眼周囲神経堤細胞が、多能性幹細胞から分化誘導された眼周囲神経堤細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記眼周囲神経堤細胞が、多能性幹細胞からＳＥＡＭ細胞集団を経由して分化誘導された眼周囲神経堤細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項４または５に記載の製造方法。
  7. 　多能性幹細胞からＳＥＡＭ細胞集団を形成させる工程と、ＳＥＡＭ細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する工程を含む、眼周囲神経堤細胞の製造方法。
  8. 　ＳＥＡＭ細胞集団中の神経堤細胞を含む細胞を、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて培養する前記工程が、ＳＥＡＭ細胞集団の細胞を分散させることを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項７に記載の製造方法。
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