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WO2025158059A1 - Composition biocompatible particuliere comprenant des elements cellulaires heterogenes utile pour l'administration de therapies cellulaires - Google Patents

Composition biocompatible particuliere comprenant des elements cellulaires heterogenes utile pour l'administration de therapies cellulaires

Info

Publication number
WO2025158059A1
WO2025158059A1 PCT/EP2025/051893 EP2025051893W WO2025158059A1 WO 2025158059 A1 WO2025158059 A1 WO 2025158059A1 EP 2025051893 W EP2025051893 W EP 2025051893W WO 2025158059 A1 WO2025158059 A1 WO 2025158059A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solution
cellular elements
composition
density
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2025/051893
Other languages
English (en)
Inventor
Jérome Jean-Charles Paul HARDOUIN
Anais Caroline MACHADO
Andrea SOVERA
Clément Pierre Etienne Rieu
Maxime FEYEUX
Kevin Pascal Stéphane ALESSANDRI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Treefrog Therapeutics SAS
Original Assignee
Treefrog Therapeutics SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR2400774A external-priority patent/FR3158634A1/fr
Priority claimed from FR2400777A external-priority patent/FR3158633A1/fr
Priority claimed from FR2400778A external-priority patent/FR3158635A1/fr
Application filed by Treefrog Therapeutics SAS filed Critical Treefrog Therapeutics SAS
Publication of WO2025158059A1 publication Critical patent/WO2025158059A1/fr
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates

Definitions

  • the present invention relates to the field of biocompatible compositions, in particular injectable compositions.
  • the invention relates in particular to a particular biocompatible composition comprising a solution and heterogeneous cellular elements suspended in said solution.
  • Cell therapy involves transplanting cells to restore the function of a tissue or organ, using an injection of therapeutic cells.
  • composition of the injection medium comprising the cells to be inoculated is a fundamental challenge for any injectable therapy.
  • drugs can dissolve in liquid and can be administered as a solution, such as in an IV drip.
  • Liquid suspensions containing very small particles also behave like solutions and can also be administered by IV drip.
  • composition is cellularized, that is to say it includes cells, it is injected in suspension.
  • erythrocytes sediment in the blood at a relative speed of up to 20 mm per hour, and when certain cells are aggregated into clumps or microtissue, this relative speed can exceed 100 mm per hour, or even 300 mm per hour in certain cases.
  • Particle sedimentation in solid-liquid suspensions is a subject widely addressed in many fields such as chemistry, geology and biology, particularly via pharmaceutical applications or bioprinting.
  • the settling rate of solid particles such as cells in a liquid refers to the rate at which particles move downward or settle to the bottom of a container by gravity. This sedimentation phenomenon occurs when particles, due to their mass and density, are heavier than the medium in which they are suspended.
  • the cells can be heterogeneous. Indeed, the cells can be found in very varied forms, we then speak of cellular elements.
  • the cellular elements can be in the form of isolated cells, cellular microtissues or clusters of cells having a different density and/or size and/or number of cells. Consequently, when using suspensions comprising heterogeneous cellular elements, the cells are distributed heterogeneously in their medium, depending on several parameters, such as the size, shape and density of the cells, as well as the physicochemical properties of the medium.
  • the first injection volume may contain many more cells than those distributed subsequently. This density gradient creates heterogeneity in the different injection volumes which can impair the effectiveness of the cell therapy.
  • maintaining biological stability is fundamental to ensure the preservation of living cells in their environment, particularly when injecting viable cells for use in cell therapy.
  • the osmolality, concentration and diversity of ionic species is essential to maintain the homeostasis of cells in suspension.
  • the invention proposes a new biocompatible composition, comprising a solution and cellular elements in suspension, said cellular elements being chosen from isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells and their mixtures, at least two of said cellular elements having a different density and/or size and/or number of cells, said composition being characterized by:
  • the density/viscosity couple makes it possible to modulate the maximum relative speed of the cellular elements in relation to the solution, thus providing numerous advantages to the composition according to the invention, namely:
  • a maximum relative speed of less than 20 mm.h-1 reduces the mechanical stress exerted on cellular elements, thus minimizing the risks of alteration of their structure or metabolism, which can improve their viability;
  • a maximum relative speed of less than 20 mm h-1 allows the cells to remain evenly distributed in the solution, thus avoiding the formation of concentration gradients;
  • composition according to the invention has a density and/or viscosity particularly suited to the cellular elements in suspension so as to promote a uniform distribution of the cellular elements in suspension in the solution.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements, in which the osmolality of the cellular elements in the solution is between -180 and 360 mOsmol .kg-1, preferably between 220 and 360 mOsmol .kg-1.
  • the composition comprising cellular elements and a solution has an osmolality between -180 and 360 mOsmol.kg-1, preferably between 220 and 360 mOsmol.kg-1.
  • the osmolality of the cellular elements makes it possible to form an environment favorable to the survival of the cellular elements such as an isotonic environment.
  • the inventors have developed a biocompatible composition, suitable for many uses, controlling the sedimentation rate of heterogeneous cellular elements suspended in the solution while presenting a biological stability adapted to cells, in particular human or animal cells.
  • the composition according to the invention has a density of between 997 and 1600 kg/m3, preferably between 1025 and 1100 kg/m3, in particular between 1047 and 1090 kg/m3.
  • the density of the composition according to the invention is homogeneous, consequently, each cellular element is subject to the same density over the entire volume of the composition.
  • the composition according to the invention has a viscosity at rest measured at 25°C of between 0.01 and 1.5 Pa.s, preferably of between 0.01 and 1 Pa.s, in particular between 400 and 1200 mPa.s, more preferably 400 and 1000 mPa, even more preferably between 500 and 800 mPa.s, in particular between 500 and 900 mPa.s.
  • the composition according to the invention has a density of between 997 and 1600 kg/m3 and a viscosity of between 400 and 1200 mPa.s.
  • the rheological characteristics of the composition according to the invention make it possible to use the composition according to the invention in injection devices without the fluid friction or shear forces encountered during injection deteriorating the precision of the injection and impacting the viability and integrity of the cells. Indeed, excessively high viscosity and/or density can lead to increased resistance during the flow of the composition through the injection means, associated with viscous friction forces likely to damage the cellular elements.
  • the inventors have achieved a biocompatible composition with rheological characteristics adapted to heterogeneous cellular elements based on the density/viscosity pair of the solution comprising said cellular elements.
  • the composition comprises at least one encapsulated cellular element, preferably contained in a three-dimensional microcompartment comprising an external hydrogel layer.
  • the biocompatible composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the cells constituting the cellular elements are chosen from neural cells, neuronal cells, glial cells, cardiac cells, retinal cells, lymphocytes, hepatocytes, endothelial cells, mesenchymal stem cells, keratinocytes, fibroblasts, pre-adipocytes, adipocytes, pancreatic islet cells and mixtures thereof.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the cellular elements consist of at least 2 different cell types.
  • composition according to the invention is particularly suitable for all cell types.
  • the invention relates to the biocompatible composition according to the invention for its use in the treatment of diseases in cell therapy.
  • the biocompatible composition according to the invention is used as an injectable composition in humans or animals.
  • the composition according to the invention makes it possible to obtain a precise dosage of the injected cellular elements, thus making it possible to improve:
  • Controlling the dosage when injecting cellular elements makes it possible to minimize variations between samples and obtain reliable and reproducible data. This is particularly important during comparative experiments or when testing the efficacy of new cell therapies.
  • the invention also relates to a process for preparing a biocompatible composition according to the invention comprising the implementation of the following steps: (a) Preparation or recovery of a composition comprising a solution (A) and a set of cellular elements of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells;
  • step (b) Preparation of a biocompatible composition
  • a biocompatible composition comprising the cellular elements of the composition of step (a), a solution (B) and optionally the solution (A) so that the composition resulting from step (b) has a density of between 800 and 2000 kg/m3 and a viscosity measured using a rheometer at 25°C of between 0.01 and 1.5 Pa.s.
  • step (c) Optionally recovery of the biocompatible composition resulting from step (b), comprising a solution and cellular elements suspended in said solution, of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, having:
  • the method according to the invention makes it possible to prepare a biocompatible composition having the combination of an optimal density and viscosity to maintain the heterogeneous cellular elements in suspension at a maximum relative speed compared to the solution of less than 20 mm. h-1.
  • the biocompatible composition of step (a) has a maximum relative speed of the cellular elements compared to the solution greater than 20 mm. h-1.
  • Such a method advantageously makes it possible to adapt the rheological characteristics, in particular the density and viscosity, of a composition so as to make the distribution of heterogeneous cellular elements within the composition homogeneous.
  • the composition of step (c) can be used in numerous applications, in particular in cell therapy.
  • the invention relates to a kit comprising:
  • a biocompatible composition comprising a solution and cellular elements in suspension, said cellular elements being chosen from isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells and their mixtures, at least two of said cellular elements having a different density and/or size and/or number of cells, said composition being characterized by: - a density between 800 and 2000 kg/m3;
  • the rheological characteristics of the composition make it possible to maintain the homogeneity of distribution of the cellular elements in the composition while preventing obstruction of the injection system.
  • the invention relates to a kit comprising:
  • biocompatible preparation (1) comprising at least one biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium hyaluronate and mixtures thereof, or modified forms of these molecules; and at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and mixtures thereof, or modified forms of these molecules;
  • biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan,
  • a biocompatible preparation (2) comprising cellular elements, said cellular elements being chosen from isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells and mixtures thereof, at least two of said cellular elements having a different density and/or size and/or number of cells; so that the mixture of the preparation (1) and the preparation (2) forms a composition having a density of between 800 and 2000 kg/m3, a viscosity at rest measured using a rheometer at 25°C of between 0.01 Pa.s and 1.5 Pa.s, and a maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution of less than 20 mm.h-1.
  • Figure 1 represents a sequence of images showing the stability in suspension of cellular elements over time in a composition according to the invention, and a composition outside the invention.
  • Figure 2 represents the comparative study of the impact of prolonged immersion (6h) of cellular elements in a solution, on a panel of production batches of microtissues of interest.
  • Figure 3 is a schematic representation of a comparative study evaluating the impact of an injection procedure on the viability of cellular elements within the composition according to the invention.
  • Figure 4 is a graphical representation of a study evaluating the different shear deformations of the composition according to the invention.
  • the term "density agent” means a biocompatible chemical species, soluble in aqueous solution and used to increase the density thereof while not significantly altering the biocompatibility of the solution with the cellular elements in suspension. More particularly, when a density agent within the meaning of the invention is introduced at a concentration greater than 10% by mass into an aqueous solution, this does not result in a modification of the rheological behavior of the solution. In addition, the addition of such an agent does not increase the osmolality of the solution beyond 360 mOsm. In other words, the addition of a density agent within the meaning of the invention at a concentration greater than 10% by mass in a solution does not result in a phase transition such as gelation.
  • cell cluster means a three-dimensional grouping of cells held together by adhesive interactions or by the presence of interstitial tissue.
  • biocompatible means the ability of a substance or composition to interact favorably with biological systems, such as tissues, organs or living organisms, without causing harmful reactions, excessive irritation or unwanted damage.
  • biological systems such as tissues, organs or living organisms
  • biocompatible this means that it is designed and formulated in such a way as to minimize the risks of toxicity, inflammation, rejection or other unwanted responses from the organism and/or cellular elements.
  • human cells means human cells or immunologically humanized non-human mammalian cells. Even when not specified, the cells, stem cells, progenitor cells and tissues according to the invention consist of or are obtained from human cells or from immunologically humanized non-human mammalian cells.
  • progenitor cell means a stem cell already engaged in cell differentiation but not yet differentiated.
  • embryonic stem cell means a pluripotent stem cell derived from the inner cell mass of the blastocyst.
  • the pluripotency of embryonic stem cells can be assessed by the presence of markers such as the transcription factors OCT4, NANOG and SOX2 and surface markers such as SSEA4/5, Tra-1-60 and Tra-1-81.
  • the embryonic stem cells used in the context of the invention are obtained without destroying the embryo from which they originate, for example using the technique described in Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)): 113-117).
  • embryonic stem cells of human beings can be excluded.
  • pluripotent stem cell or “pluripotent cell” means a cell that has the capacity to form all the tissues present in the entire organism of origin, without being able to form an entire organism as such.
  • Human pluripotent stem cells may be referred to as hPSCs in the context of the present invention.
  • they may be induced pluripotent stem cells (iPSCs or hiPSCs for human induced pluripotent stem cells), embryonic stem cells or MUSE cells (for "Multilineage-differentiating Stress Enduring").
  • induced pluripotent stem cell means a pluripotent stem cell induced to pluripotency by genetic reprogramming of differentiated somatic cells. These cells are in particular positive for pluripotency markers, such as alkaline phosphatase staining and expression of the proteins NANOG, SOX2, OCT4 and SSEA4/5. Examples of methods for obtaining induced pluripotent stem cells are described in the articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5): 861-872) and Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106).
  • the term "cell layer” or “cell base” means several cells forming a layer or base that can be structured around a lumen; this may be, for example, a cellular tissue or micro-tissue or a three-dimensional grouped culture.
  • the thickness of the cell layer may be variable. This layer is organized in three dimensions in the microcompartment.
  • Rheological behavior refers to the response of a material to stresses and strains applied to it. It describes how the material flows or deforms under the effect of external forces. There are several types of rheological behavior, such as elasticity, plasticity, viscosity, and viscoelasticity.
  • density means the density of the entities concerned (cellular elements or solutions) expressed in mg/mL.
  • the density of solutions is measured at a temperature of 20°C using a densimeter.
  • the density is measured by the density gradient method. This consists of preparing solutions calibrated in density and isotonic. These solutions of known density are then introduced in successive layers into a tube so as to form a density gradient from bottom to top, each layer being denser than the layer directly above. Typically, density gradients are prepared in density increments of 5 kg/m3. The density of the cellular elements is therefore given with a resolution of +/- 5 kg/m3.
  • the cellular elements are injected onto the upper part of the tube. These sediment and stabilize in or between the layer(s) whose density is closest to them. The reading is taken once all the cellular elements have stabilized, typically after 1 hour.
  • colored synthetic beads of calibrated densities may be introduced simultaneously, their equilibrium position providing a positive control of the position measurement of the cellular elements. All of these measurements are made at or within the temperature range of intended use because temperature can differentially affect the density of water, solutions, and cellular elements.
  • average density of cellular elements within the meaning of the invention, is meant the average density of cellular elements such as microcompartments.
  • the average density of cellular elements is measured by the density gradient method. This method, well known to those skilled in the art, consists of preparing calibrated solutions of known density. These solutions are then introduced into a tube so as to form a density gradient from bottom to top, each layer being denser than the layer directly above. Once the density gradient is formed in the tube, the cellular elements are introduced into said tube and sediment by stabilizing in or between the layers whose density is closest to them. The reading is taken once all the cellular elements are stabilized, typically after 1 hour. In parallel with the injection of the cellular elements, colored synthetic beads of known density are also introduced into said tube so as to form a positive control. The average density is then calculated according to the distribution of the cellular elements within said tube.
  • Fast diameter of a cellular element within the meaning of the invention, we mean the distance between two tangents, these two tangents being parallel, such that the entire cellular element is between these two parallel tangents.
  • differentiated cells are understood to mean cells which have a particular phenotype, as opposed to pluripotent stem cells which are not differentiated or progenitor cells which are in the process of differentiating.
  • the term "cellular element” means a component which comprises at least one human, animal or plant cell and which is presented in different forms such as isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells, encapsulated cells, encapsulated microtissues, clusters of cells or not and mixtures thereof.
  • the microtissues and/or clusters, encapsulated or not may contain one or more lumens.
  • modified forms of these molecules within the meaning of the invention, it is meant that the molecules have been modified by adding one or more molecular groups to one or more functional groups present on the molecules.
  • hyaluronic acid is made up of a monomer assembly, each of the monomers comprising hydroxyl, carboxyl, and N-acetyl functional groups capable of serving as a base for attaching molecular groups.
  • the hydroxyl and carboxyl groups are preferred sites for attaching lipids, polymers or other active molecules to the hyaluronic acid monomer.
  • amine groups can also be added to the N-acetyl functional group.
  • hyaluronic acid esters hyaluronic acid dialdehydes, hyaluronic acid N-deacetylated or Cys-hyaluronic acids.
  • Dextran also consisting of monomer, has hydroxyl functional groups accessible to a wide variety of addition reactions (hydroxyl group chemistry).
  • the term "largest dimension” means the value of the largest Feret diameter.
  • the dimension of the cellular elements can be obtained by various techniques. In particular, it can be characterized using a Coulter effect measuring device. Alternatively, it can be determined optically by microscopy.
  • microcompartment or “capsule” also means a partially or totally enclosed three-dimensional structure containing one or more cellular elements.
  • the structure preferably consists of a rigidified hydrogel outer layer and a hollow inner part comprising at least one cellular element and possibly other elements such as an extracellular matrix or an extracellular matrix substitute.
  • microtissue means a community of cells exhibiting cellular interactions, optionally mechanical cohesion, and at least partially recapitulating a cellular composition present in a human tissue in a physiological or pathological situation.
  • a microtissue exhibits a specific topology of distribution of the cells that compose it.
  • a microtissue has a largest dimension of at least 50 pm, more preferably between 50 pm and 1.3 mm, in particular between 100 pm and 800 pm.
  • osmolality of cellular elements means a measurement of the total concentration of dissolved particles within the cellular elements, expressed in osmoles per kilogram of water (osmol/kg H2O).
  • osmolality can be measured using a freezing point osmometer of the “Osmotech XT” type. It should be noted that the use of different models of freezing point osmometers may make the measurement impossible. Indeed, the composition of the solutions and their viscosity make the measurement of osmolality complex and require high-power devices. Alternatively, the osmolality measurement can be calculated by extrapolation based on a measurement of a dilution of the solution, which allows the use of standard devices.
  • active ingredient means one or more substances responsible for a pharmacological or therapeutic activity.
  • biological stability means maintaining the integrity of cellular elements.
  • tissue or “biological tissue” within the meaning of the invention, we mean the common meaning of tissue in biology, that is to say the intermediate level of organization between the cell and the organ.
  • a tissue is a set of similar cells of the same origin (most often from a common cell lineage, although they can find their origin by association of distinct cell lineages), grouped in clusters, networks or bundles (fibers).
  • a tissue forms a functional whole, that is to say that its cells contribute to the same function.
  • Biological tissues regenerate regularly and are assembled together to form organs.
  • sedimentation velocity threshold or “maximum sedimentation velocity” within the meaning of the invention, is meant the maximum measured relative velocity of vertical displacement within the solution relative to the reference frame of the system, container or fluidic element in which the suspension is contained.
  • the maximum relative velocity is expressed in mm/h.
  • the relative velocity is defined as positive in the case where the cellular elements sediment in the solution, and negative if the latter rise in the solution.
  • maximum qualifies the absolute value of the velocity regardless of its sign, in the sense that it is important in the context of the invention that the cellular elements remain in suspension, which implies that their relative velocity is, in absolute value, as low as possible.
  • viscosity means the dynamic viscosity that characterizes the resistance of a fluid to laminar flow. It is expressed in Pa.s. In the case of non-Newtonian fluids, this viscosity may depend on the shear stresses applied to the fluid. In particular, “shrew-thinning fluid” means a fluid whose viscosity decreases with the shear rate. Similarly, a “threshold fluid” is a fluid whose viscosity is very significant at low shear rates, then drops sharply beyond a threshold shear rate value.
  • viability means the proportion of healthy cells in a sample of cellular elements.
  • the proportion of healthy cells is evaluated with regard to the metabolic activity of a sample of cells. Metabolic activity is quantified by the concentration of ATP measured in a suspension of lysed cellular elements.
  • the technique used is marketed under the name "CelITiter-GIo® 3D Cell Viability Assay”. It is specifically designed to determine the viability of cells in 3D microtissue spheroids.
  • the test reagent penetrates large spheroids and has an increased lytic capacity, which allows for a more accurate determination of viability compared to other test methods.
  • viability is expressed as a percentage relative to a control condition. In this case, viability is said to be "relative". For example, if condition A is taken as a reference, a viability of 85% for condition B reflects a 15% decrease in viability compared to condition A. :ible according to the invention
  • the subject of the present invention is a biocompatible composition, comprising a solution and cellular elements in suspension, said cellular elements being chosen from isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells and their mixtures, at least two of said cellular elements having a different density and/or size and/or number of cells, said composition being characterized by:
  • the inventors have developed a biocompatible composition that allows heterogeneous cellular elements to be kept in suspension while maintaining their biological stability over a long period.
  • the rheological characteristics of the solution advantageously allow the homogeneity of distribution of the cellular elements within the composition to be maintained.
  • the maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution is less than 15 mm.h-1, preferably less than 10 mm.h-1; in particular less than 5 mm.h-1, even more preferably less than 1 mm.h-1.
  • the maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution is between 0.01 and 20 mm.h-1, preferably between 0.01 and 10 mm.h-1, in particular between 0.01 and 5 mm.h-1, even more preferably between 0.01 and 1 mm.h-1.
  • the osmolality of the cellular elements in the solution is between -180 and 360 mOsml.kg-1, preferably between 220 and 360 mOsmol .kg-1.
  • the cellular elements and the solution are close to osmotic equilibrium, which means that the ion concentration gradients of the composition are balanced and do not cause osmotic shock.
  • the composition according to the invention comprises a solution comprising at least one ion chosen from sodium, calcium, magnesium, chlorine and potassium ions and mixtures thereof.
  • the composition according to the invention comprises a solution comprising sodium, calcium, chlorine and potassium ions.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution is an aqueous solution.
  • the composition comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution has a pH of between 7.0 and 7.6.
  • the pH of the solution is particularly suited to the survival of cellular elements.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises a biocompatible pH buffer, preferably chosen from phosphate buffered saline (PBS), citric acid or Hepes, and preferably the PBS buffer referenced at number 4004200 of the European Pharmacopoeia.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the PBS buffer referenced at number 4004200 of the European Pharmacopoeia.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution also comprises at least one active ingredient and/or a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the aqueous solution is the culture medium for the cellular elements.
  • the composition according to the invention comprises a solution comprising at least one element chosen from sodium chloride (NaCl), calcium chloride (CaCl), potassium chloride (KCl), magnesium chloride (MgCl2) and mixtures thereof.
  • the diversity of ions contained in the solution makes it possible to ensure a balanced environment conducive to the proper functioning of the cellular processes of the cellular elements within the composition according to the invention.
  • composition according to the invention comprises:
  • the solution and the cellular elements suspended in said solution are close to osmotic equilibrium, guaranteeing a stable environment for the cellular elements, without risk of osmotic shock.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution is isotonic with respect to the cellular elements.
  • the composition according to the invention has a density of between 997 and 1600 kg/m3, even more preferably between 1025 and 1100 kg/m3, in particular between 1047 and 1090 kg/m3.
  • the density of the composition according to the invention contributes to reducing the maximum sedimentation rate of the cellular elements compared to the solution.
  • the composition according to the invention comprising a solution and cellular elements in suspension, has a density of the solution between the density of the cellular element having the lowest density and the density of the cellular element having the greatest density.
  • the composition according to the invention comprising a solution and cellular elements in suspension, has a density of the solution lower than the density of the cellular element having the lowest density.
  • the composition according to the invention has a density equal to the average of the densities of all the cellular elements present in the composition, with a tolerated variation of 20 kg/m3, preferably 10 kg/m3. In this way, the density of the composition is centered on the density of the average of the densities of all the cellular elements.
  • composition according to the invention comprising a solution and cellular elements suspended in said solution, has a density of the solution greater than the density of the cellular element having the greatest density.
  • the maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution is less than 20 mm/h.
  • the difference in density between the solution and the average density of the cellular elements verifies the following inequality:
  • the composition according to the invention has a viscosity at rest measured at 25°C of between 0.01 and 1.5 Pa.s, preferably between 0.01 and 1 Pa.s, in particular between 400 and 1200 mPa.s, more preferably 400 and 1000 mPa, even more preferably between 500 and 800 mPa.s, in particular between 500 and 900 mPa.s.
  • the viscosity of the composition makes it possible to prevent the sedimentation of the cellular elements suspended in the solution while allowing the use of the composition according to the invention, in particular the injection of said composition. Consequently, the composition according to the invention has a viscosity high enough to keep the cellular elements in suspension while having a viscosity low enough to minimize frictional stresses when the composition is injected, in particular using an injection means such as a syringe or a cannula.
  • the composition according to the invention having a maximum relative speed of the cellular elements compared to the solution of less than 1 mm. h-1 can be stored for up to 6 hours before use.
  • the composition according to the invention maintains the uniform distribution of the heterogeneous cellular elements for 6 hours.
  • composition according to the invention can be stored for a long period without affecting the uniform distribution of the heterogeneous cellular elements, thus ensuring precise dosage, in particular during its injection.
  • composition according to the invention comprises a solution and heterogeneous cellular elements suspended in said solution.
  • Said cellular elements are chosen from isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells and mixtures thereof, of which at least two, preferably a majority, even more preferably all of said cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells.
  • the composition comprises at least one encapsulated cellular element, preferably contained in a three-dimensional microcompartment comprising an external hydrogel layer.
  • the microcompartment may be a solid ball of hydrogel.
  • the composition comprises at least one encapsulated cellular element, preferably contained in a hollow three-dimensional microcompartment comprising an external hydrogel layer and an internal part hollow containing the encapsulated cellular element(s).
  • the hollow internal part may also contain extracellular matrix and/or one or more extracellular matrix substitutes and/or a solution and/or other elements.
  • the external hydrogel layer of the microcompartment may comprise or consist exclusively of alginate.
  • the alginate may in particular be a sodium alginate, composed of 80% ⁇ -L-guluronate and 20% ⁇ -D-mannuronate, having a Young's modulus greater than 10 kPa, preferably greater than 60 kPa, more preferably greater than 100 kPa.
  • the external hydrogel layer comprises alginate, said alginate having an average molecular weight of 100 to 400 kDa, more preferably a molecular weight of between 150 and 250 kDa.
  • the concentration of the alginate solution intended to form said outer layer of the microcompartment is preferably between 0.5 and 5% by mass, more preferably the concentration is equal to 2% (plus or minus 0.5%) by mass.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements, encapsulated or not, suspended in said solution, in which the cells constituting the cellular elements are mature cells and/or progenitors and/or stem cells.
  • the cells constituting all or part of the cellular elements are chosen from neural cells, neuronal cells, glial cells, cardiac cells, retinal cells, lymphocytes, hepatocytes, endothelial cells, mesenchymal stem cells, keratinocytes, fibroblasts, pre-adipocytes, adipocytes, pancreatic islet cells and mixtures thereof.
  • composition according to the invention is suitable for maintaining all cell types in suspension, the cellular elements being encapsulated or not.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the cellular elements consist of at least 2 different cell types.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which at least 20%, preferably at least 30%, in particular at least 40% of the cellular elements are in the form of a microtissue.
  • the composition according to the invention comprises between 10 and 55% of the cellular elements in the form of a microtissue.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which at least one element cellular is a microtissue preferably having a larger dimension of at least 50 pm, more preferably between 50 pm and 1.3 mm, in particular between 100 pm and 800 pm.
  • the biocompatible composition according to the invention comprises at least one microtissue whose largest dimension is at least 50 ⁇ m.
  • the inventors succeeded in maintaining the cellular elements, in this embodiment including at least one microtissue, in suspension in a composition in liquid form. This characteristic makes it possible to make the composition easily injectable.
  • the composition according to the invention is in liquid form. More particularly, the composition according to the invention is in liquid form and comprises a solution in liquid form and cellular elements suspended in said solution.
  • biocompatible composition is not in gel form.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which less than 15%, preferably less than 10%, in particular less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1% of the cellular elements are in the form of isolated cells.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution in which no cellular element is in the form of an isolated cell.
  • the percentage of cellular elements in the form of microtissue or isolated cells is expressed as the cumulative volume of cellular elements.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the volume fraction of the cellular elements is between 0.01 and 80% by volume, preferably between 0.01 and 60%, in particular between 0.01 and 50%, more preferably between 0.01 and 45%, even more preferably between 15 and 30%.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the cellular elements have a largest dimension less than 1.3 mm, preferably less than 1 mm, in particular less than 700 pm, even more preferably less than 500 pm.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the cellular elements have a largest dimension of between 50 pm and 1.3 mm, preferably between 100 pm and 800 pm.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the cellular element having the largest dimension has a largest dimension less than 1.3 mm, preferably less than 700 pm, more preferably less than 500 pm.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the composition comprises between 1 million and 500 million cells per mL of solution, preferably at least 5 million cells, in particular 50 million cells.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the composition comprises between 1 and 100 million cells per mL of solution, preferably between 1 and 50 million cells, in particular between 1 and 10 million cells, more preferably between 2 and 6 million cells, even more preferably between 3 and 5 million cells per mL of solution.
  • composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises:
  • biocompatible viscosity agent preferably at least one biocompatible viscosity agent having a molecular weight between 0.05 MDa and 5 MDa.
  • the density and viscosity agents make it possible to modulate the rheological characteristics of the solution so that the maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution is less than 20 mm. h-1, preferably between 0.01 and 20 mm. h-1.
  • the composition according to the invention also comprises at least one biocompatible osmolality adjusting agent.
  • Said at least one osmolality adjusting agent makes it possible to adapt the osmolality of the solution in order to make the solution compatible with the survival of the cellular elements.
  • At least one agent for adjusting the osmolality of the solution is chosen from mannitol, sorbitol, sodium chloride and their mixtures, or modified forms of these molecules.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, sodium chloride, glycerol or sorbitol, and mixtures thereof, or modified forms of these molecules.
  • the solution comprises at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, sodium chloride, glycerol or sorbitol, and mixtures thereof, or modified forms of these molecules.
  • the density agents suitable for the composition according to the invention are selected according to several parameters, namely:
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises at least one density agent, preferably dextran.
  • the solution comprises at least one density agent, preferably dextran.
  • the solution comprises dextran
  • the latter preferably has a molecular weight of between 20 and 80 KDa, in particular 30, 35 or 40 kDa.
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises at least one biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium hyaluronate and mixtures thereof, or modified forms of these molecules.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • the viscosity agents suitable for the composition according to the invention are selected according to several parameters, namely:
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises at least one viscosity agent chosen from sodium hyaluronate and/or CMC.
  • the solution comprises sodium hyaluronate
  • the latter preferably has a molecular weight of less than 1 MDa, even more preferably between 80 and 1 MDa, in particular between 80 and 600 kDa.
  • the solution includes CMC, it preferably has a molecular weight between 40kDa and 1MDa, even more preferably between 50 and 400kDa.
  • the components of the solution are all biocompatible, thus ensuring that the composition according to the invention will be well tolerated by the body, particularly in the case of injection.
  • composition according to the invention comprises:
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises:
  • the composition according to the invention comprises a solution and cellular elements suspended in said solution, in which the solution comprises: between 10 and 20% by mass of dextran having a molecular weight of 20 and 80kDa relative to the total mass of the solution;
  • CMC having a molecular weight of between 40 and 1 MDa relative to the total mass of the solution and/or between 0.3 and 10% by weight of sodium hyaluronate with a molecular weight of between 80 and 1 MDa relative to the total mass of the solution
  • composition according to the invention can be obtained by any suitable method known to those skilled in the art.
  • the composition according to the invention is a biocompatible composition obtained according to a preparation method comprising the following steps:
  • step (a) Preparation or recovery of a composition comprising a solution (A) and a set of cellular elements of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a largest dimension of at least 50 pm;
  • step (b) Preparation of a biocompatible composition comprising the cellular elements of the composition of step (a), a solution (B) and optionally the solution (A) so that the composition resulting from step (b) has a density of between 800 and 2000 kg/m3 and a viscosity at rest measured using a rheometer at 25°C of between 0.01 and 1.5 Pa.s.
  • step (c) Optionally recovery of the biocompatible composition resulting from step (b), comprising a solution and cellular elements suspended in said solution, of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a larger dimension of at least 50 pm, having:
  • step (a) concerns the preparation of a composition
  • it comprises the implementation of the following steps:
  • step 3 Recovery of a composition comprising cellular elements resulting from the centrifugation of step 3), of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a larger dimension of at least 50 pm.
  • step (b) comprises implementing the following steps:
  • step (a) *the density of the cellular element having the lowest density and the density of the cellular element having the greatest density of said cellular elements present in the composition resulting from step (a);
  • step (b3) Sterilization of the solution (B) resulting from step (b2) so as to obtain a sterilized solution (B);
  • step (b4) Optionally, adjusting the pH of the sterilized solution (B) from step (b3);
  • step (b2) of preparing the solution (B) is carried out by adding a biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium hyaluronate and mixtures thereof, or modified forms of these molecules.
  • a biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide,
  • step (b2) of preparing the solution (B) is carried out by adding at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and their mixtures, or modified forms of these molecules.
  • biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and their mixtures, or modified forms of these molecules.
  • step (b2) of preparing the solution (B) also comprises the addition of at least one element chosen from sodium chloride (NaCl), calcium chloride (CaCl2), potassium chloride (KCl), magnesium chloride (MgCl2) and their mixtures.
  • NaCl sodium chloride
  • CaCl2 calcium chloride
  • KCl potassium chloride
  • MgCl2 magnesium chloride
  • step (b) comprises implementing the following steps:
  • step (b4) Optionally, adjustment of the pH of the solution (B) resulting from step (b2);
  • step (b3) Sterilization of the solution (B) resulting from step (b4) so as to obtain a sterilized solution (B);
  • step (b5) Preparation of a biocompatible composition comprising the cellular elements of the composition resulting from step (a) with the sterilized solution (B) resulting from step (b3) or (b4) and optionally with the solution (A) so that the difference in density between the density of the solution resulting from step (b5) and the average density of the cellular elements of the composition resulting from step (b5) verifies the inequality mentioned above in step (b).
  • step (b4) of adjusting the pH of the solution (B) is carried out upstream of step (b3) of sterilizing the solution (B).
  • the invention also relates to a process for preparing a composition according to the invention comprising the implementation of the following steps:
  • composition comprising a solution (A) and a set of cellular elements of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a largest dimension of at least 50 pm;
  • step (b) Preparation of a biocompatible composition
  • a biocompatible composition comprising the cellular elements of the composition of step (a), a solution (B) and optionally the solution (A) so that the composition resulting from step (b) has a density of between 800 and 2000 kg/m3 and a viscosity at rest measured using a rheometer at 25°C of between 0.01 and 1.5 Pa.s.
  • step (c) Optionally recovery of the biocompatible composition resulting from step (b), comprising a solution and cellular elements suspended in said solution, of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, having: - a density between 800 and 2000 kg/m3;
  • the method according to the invention makes it possible to achieve a balance between density and viscosity as a function of the heterogeneous cellular elements so that the maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution is less than 20mm/h.
  • step (a) concerns the preparation of a composition
  • it comprises the implementation of the following steps:
  • step 3 Recovery of a composition comprising cellular elements resulting from the centrifugation of step 3), of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a largest dimension of at least 50 pm.
  • the cell culture of step 1) is carried out within a bioreactor.
  • At least one cellular element of step 1) comprises at least one encapsulated cell, preferably in alginate.
  • At least one cellular element of step 1) is contained in a three-dimensional microcompartment comprising an external hydrogel layer.
  • step (a) may also comprise a step 2') aimed at removing the capsule so as to recover the cellular element before step 3) of centrifugation.
  • Step 2') consists of removing the capsule, preferably removing the external hydrogel layer.
  • step 2') can be carried out in particular by hydrolysis, dissolution, piercing and/or rupture by any biocompatible means, i.e. non-toxic to the cells.
  • the removal can be carried out using a saline phosphate buffer, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel comprises alginate and/or laser microdissection.
  • the composition of step (a) comprises at least two distinct cell types.
  • step (b) comprises the implementation of the following steps:
  • step (a) *the density of the cellular element having the lowest density and the density of the cellular element having the greatest density of said cellular elements present in the composition resulting from step (a);
  • step (b3) Sterilization of the solution (B) resulting from step (b2) so as to obtain a sterilized solution (B);
  • step (b4) Optionally, adjusting the pH of the sterilized solution (B) from step (b3);
  • preparation step (b2) is carried out by adding a biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium hyaluronate and mixtures thereof, or modified forms of these molecules.
  • a biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium
  • step (b2) of preparing the solution (B) is carried out by adding at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and their mixtures, or modified forms of these molecules.
  • biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and their mixtures, or modified forms of these molecules.
  • step (b2) of preparing the solution (B) also comprises the addition of at least one element chosen from sodium chloride (NaCl), calcium chloride (CaCl2), potassium chloride (KCl), magnesium chloride (MgCl2) and their mixtures.
  • NaCl sodium chloride
  • CaCl2 calcium chloride
  • KCl potassium chloride
  • MgCl2 magnesium chloride
  • the person skilled in the art will be able to adapt the density and viscosity by varying the concentrations of at least one density agent and/or at least one viscosity agent.
  • the solution (B) resulting from step (b2) comprises:
  • the dextran solution preferably having a molecular weight of 20kDa and 80KDa;
  • CMC preferably having a molecular weight of between 40 and 1 MDa relative to the total mass of the solution and/or between 0.3 and 10% by weight of sodium hyaluronate with a molecular weight of between 80 and 800 kDa.
  • the solution (B) resulting from step (b2) is produced with stirring, preferably using a paddle mixer or magnetic bar.
  • step (b3) is carried out by filtration through meshes of size between 0.01 and 0.22 pm.
  • step (b4) consists of adding a biocompatible pH buffer, preferably chosen from phosphate buffer, citric acid or Hepes, and preferably the saline phosphate buffer referenced at number 4004200 of the European Pharmacopoeia with the sterilized solution (B) of step (b3) so that the sterilized solution (B) has a pH of between 7 and 7.6.
  • a biocompatible pH buffer preferably chosen from phosphate buffer, citric acid or Hepes, and preferably the saline phosphate buffer referenced at number 4004200 of the European Pharmacopoeia
  • step (b5) of preparing a composition comprising the cellular elements of the composition resulting from step (a) with the sterilized solution (B) resulting from step (b3) or (b4) comprises a step of extracting the cellular elements from the composition resulting from step (A).
  • step (b5) comprises an extraction step aimed at isolating the cellular elements from the solution (A) present in the composition resulting from step (a).
  • the method for preparing a composition according to the invention comprises the implementation of the following steps:
  • composition comprising a solution (A) and a set of cellular elements of which at least two cellular elements have a density and/or a different size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a largest dimension of at least 50 pm;
  • step (a) *the density of the cellular element having the lowest density and the density of the cellular element having the greatest density of said cellular elements present in the composition resulting from step (a);
  • step (b3) Sterilization of the solution (B) resulting from step (b2) so as to obtain a sterilized solution (B);
  • step (b4) Optionally, adjusting the pH of the sterilized solution (B) from step (b3);
  • step (c) Optionally recovery of the biocompatible composition resulting from step (b), comprising a solution and cellular elements suspended in said solution, of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, having:
  • - a viscosity at rest measured using a rheometer at 25°C is between 0.01 and 1.5 Pa.s; and - a maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution of less than 20 mm. h-1.
  • the method for preparing a composition according to the invention comprises the implementation of the following steps:
  • composition comprising a solution (A) and a set of cellular elements of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a largest dimension of at least 50 pm, comprising the following steps:
  • step (a) *the density of the cellular element having the lowest density and the density of the cellular element having the greatest density of said cellular elements present in the composition resulting from step (a);
  • step (b3) Sterilization of the solution (B) resulting from step (b2) so as to obtain a sterilized solution (B);
  • step (b4) Optionally, adjusting the pH of the sterilized solution (B) from step (b3);
  • step (c) Optionally recovery of the biocompatible composition resulting from step (b), comprising a solution and cellular elements suspended in said solution, of which at least two cellular elements have a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a larger dimension of at least 50 pm, having:
  • the composition of step (a) also comprises a solution in which said cellular elements are suspended.
  • the maximum relative velocity of the cellular elements with respect to the solution is greater than 20 mm. h- 1.
  • the method according to the invention comprises a step of cryopreservation of the composition resulting from step (a).
  • the method according to the invention comprises a step of cryopreservation of the composition resulting from step (a)
  • said method also comprises a step of thawing the cryopreserved composition.
  • step (b) comprises implementing the following steps:
  • step (a) *the density of the cellular element having the lowest density and the density of the cellular element having the greatest density of said cellular elements present in the composition resulting from step (a);
  • step (b4) Optionally, adjustment of the pH of the solution (B) resulting from step (b2);
  • step (b3) Sterilization of the solution (B) resulting from step (b4) so as to obtain a sterilized solution (B);
  • step (b5) Preparation of a biocompatible composition comprising the cellular elements of the composition resulting from step (a) with the sterilized solution (B) resulting from step (b3) or (b4) and optionally with the solution (A) so that the difference in density between the density of the solution resulting from step (b5) and the average density of the cellular elements of the composition resulting from step (b5) verifies the inequality mentioned above in step (b).
  • step (b4) of adjusting the pH of the solution (B) is carried out upstream of step (b3) of sterilizing the solution (B).
  • composition according to the invention for its use
  • the invention relates to the composition according to the invention for its use as a medicament.
  • the biocompatible composition according to the invention has rheological characteristics and a relative speed of the cellular elements particularly suitable for its use in cell therapy.
  • the composition can be used in the treatment of diseases in cell therapy.
  • the relative speed of the cellular elements advantageously allows the quantity of cellular elements in a given volume of composition to be controlled.
  • the composition according to the invention can be used for multiple use.
  • the composition can be used to carry out several injections while maintaining the viability of the cellular elements, even if the injections are spaced apart by a period of several hours.
  • the relative speed of the cellular elements makes it possible to inject for a constant volume a quantity of cellular elements presenting a low standard deviation, preferably a standard deviation of less than 20%.
  • composition according to the invention can be used as an injectable composition.
  • the composition according to the invention can be used by injection using an injection means at the injection site.
  • said injection means is a cannula.
  • control of the rheological characteristics of the composition according to the invention makes it possible to optimize the administration of the cellular elements and, consequently, of the therapeutic cells in a precise and efficient manner.
  • the control of these parameters makes it possible to adjust the injection rate, the injection volume and thus to ensure a homogeneous distribution of the cellular elements in the area of interest.
  • the invention relates to a kit comprising:
  • an injection method preferably a cannula.
  • the kit according to the invention allows the practitioner to have all the elements necessary to optimize the effectiveness of the injection of cellular elements.
  • the kit according to the invention comprises:
  • biocompatible composition according to any of the embodiments previously described in which the cellular elements have a largest dimension less than 0.8 times the smallest internal diameter of the cannula, preferably less than 0.75, in particular between 0.2 and 0.7.
  • the kit according to the invention comprises a biocompatible composition according to any of the embodiments previously described in solid form.
  • the kit according to the invention also comprises water.
  • the kit according to the invention also comprises an element chosen from sodium chloride (NaCl), calcium chloride (CaCl2), potassium chloride (KCl), magnesium chloride (MgCl2) and mixtures thereof.
  • NaCl sodium chloride
  • CaCl2 calcium chloride
  • KCl potassium chloride
  • MgCl2 magnesium chloride
  • the invention relates to a kit comprising:
  • biocompatible preparation (1) comprising at least one biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium hyaluronate and mixtures thereof, or modified forms of these molecules; and at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and mixtures thereof, or modified forms of these molecules;
  • biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan,
  • a biocompatible preparation (2) comprising cellular elements, said cellular elements being chosen from isolated cells, cellular microtissues, clusters of cells and mixtures thereof, at least two of said cellular elements having a different density and/or size and/or number of cells, preferably at least one cellular element is a microtissue having a largest dimension of at least 50 pm; so that the mixture of the preparation (1) and the preparation (2) forms a composition having a density of between 800 and 2000 kg/m3, a viscosity at rest measured using a rheometer at 25°C of between 0.01 Pa.s and 1.5 Pa.s, and a maximum relative speed of the cellular elements with respect to the solution of less than 20 mm.h-1.
  • the biocompatible preparation (2) comprises a solution.
  • the kit according to the invention also comprises water.
  • the kit according to the invention comprises a biocompatible preparation (1) in solid form.
  • the preparation (1) in solid form, comprises at least one biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan, chitosan, xanthan gum, gellan gum, polyacrilamide, polyvinylpyrrolidone, polyethylene oxide, casein, collagen, sodium hyaluronate and mixtures thereof, or modified forms of these molecules, and at least one biocompatible density agent chosen from dextran, mannitol, NaCl, glycerol, sorbitol and mixtures thereof, or modified forms of these molecules.
  • biocompatible viscosity agent chosen from PVA, carboxymethyl cellulose (CMC), methylcellulose, hydroxyethylcellulose, ethylhydrocyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), alginate, pullulan
  • the kit according to the invention also comprises an element chosen from sodium chloride (NaCl), calcium chloride (CaCl2), potassium chloride (KCl), magnesium chloride (MgCl2) and mixtures thereof.
  • NaCl sodium chloride
  • CaCl2 calcium chloride
  • KCl potassium chloride
  • MgCl2 magnesium chloride
  • the objective of this example is to evaluate the sedimentation rate of cellular elements in different compositions, namely a composition comprising cellular elements and a Hank's balanced salt solution (HBSS) (A) (not the invention), and the composition according to the invention comprising a solution (B) developed to maintain the homogeneity of distribution of the cellular elements and prevent obstruction of the injection system.
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • the cellular elements are a mixture of microtissues with a largest dimension of at least 50 pm, isolated cells and aggregates of neuronal cells.
  • Phase 1 preparation of cellular elements
  • the flasks were removed from the liquid nitrogen and placed in a CryoPod at -180°C.
  • HBSS calcium, magnesium, glucose
  • HBSS calcium, magnesium, glucose
  • the 25 ml tube was centrifuged at 300 G, 5 minutes, and the maximum of the supernatant was removed with P1000 then P20.
  • HBSS calcium, magnesium, glucose
  • the 1.5 mL tubes were centrifuged at 300G for 5 min and the maximum of the supernatant was removed with P1000 then P20.
  • the cellular elements were resuspended in 1 ml of HBSS (solution (A)) and in the other in 1 ml of solution (B).
  • the tubes were installed on the assembled device for taking pictures.
  • the calculated maximum sedimentation rate (average of 5 maximum rates for solution (B) and average of 3 maximum rates for microtissue solution (A)) is:
  • composition according to the invention comprising the cellular elements and the solution (B) makes it possible to maintain said cellular elements in suspension in said solution (B) for several hours. Within the composition according to the invention, certain cellular elements are still in suspension after 12 hours of sedimentation.
  • the composition outside the invention comprises the cellular elements and the solution (A) does not allow the cellular elements to be maintained in suspension in said solution (A) for a long time.
  • the cellular elements sediment very quickly in low viscosity solutions with no density match, such as HBSS (calcium, magnesium, glucose) with a resting viscosity value of about 1 mPa.s and a density of about 1.0038 g/cm.3
  • the objective of this example is to evaluate the viability of the cellular elements after 12 hours of sedimentation within the composition according to the invention.
  • composition according to the invention comprises the following elements:
  • the sedimentation time is 12 hours, which corresponds to a maximum stability limit in the context of the use of the composition according to the invention in cell therapy.
  • Production batches are referenced by the prefix “PAR”, followed by an incremental code ranging from 19 to 22. They correspond to production batches of successive cellular elements.
  • Control A suspension of cellular elements resuspended in a reference cell culture medium, at a ratio of 20% volume of cellular elements and 80% reference culture medium.
  • Composition according to the invention A suspension of cellular elements resuspended in a solution, at a ratio of 20% volume of cellular elements and 80% solution.
  • Viability is measured. The result is expressed by normalizing the viability value of the immersion condition in the solution by the viability obtained in the control condition.
  • Example 3 Evaluation of the impact of the procedure for injecting the composition according to the invention on the viability of cellular elements.
  • the objective of this example is to evaluate the impact of the procedure for injecting the composition according to the invention on the viability of the cellular elements.
  • the experiment consists of comparing the viability of a known volume of composition according to the invention having undergone an injection procedure under the conditions of the invention, with the viability of a known volume of composition according to the invention which has not undergone an injection procedure.
  • the viability of cellular elements having undergone an injection procedure is measured immediately after injection, then after 24 hours of re-culture in a reference culture medium.
  • composition according to the invention used during this example has the same composition (Table 5) and the same rheological characteristics (Table 6) as the composition according to the invention described in Example 2.
  • the injection protocol comprises the following steps: a) Preparation of the composition according to the invention according to the method according to the invention; b) Filling a syringe with the composition according to the invention; c) Injecting the composition according to the invention using the syringe from step b) into a cannula with an injection flow rate of 50 pL.min; d) Injecting the composition according to the invention using the cannula onto a matrix at a flow rate of between 18 pL and 2 pL per minute; e) Rinsing the composition according to the invention and resuspending the cellular elements in a culture medium; f) Putting the culture medium comprising the cellular elements in an incubator for 24 hours.
  • step e The viability of the cellular elements is measured at the end of step e) and at the end of step f). The experiment was carried out 3 times.
  • composition according to the invention can be used as an injectable composition. of a composition according to the invention via a rheological measurement in oscillation
  • composition according to the invention comprises a solution characterized in Table 7 as well as cellular elements.
  • the cellular elements of the composition used in this example are a mixture of microtissues having a largest dimension of at least 50 pm, isolated cells and aggregates of neural cells.
  • composition according to the invention was verified by conventional rheological measurements in oscillation scanning with an Anton Paar MCR 302 rheometer.
  • the angular frequency is constant and fixed at 10 rad/s.
  • the shear strain varies from 0.001 to 10% and the temperature is constant and regulated at 20°C.
  • the storage modulus (G') represents the elastic part of the deformation. It is linked to the capacity of the material to store energy during deformation and is proportional to the rigidity of the material. It therefore determines the importance of its elastic response and is therefore associated with elastic solid behavior, therefore gel behavior.
  • the Loss Modulus (G”) represents the viscous part of the deformation. It is related to the dissipation of energy in the form of heat and is proportional to the damping behavior of the material. It determines the importance of its viscous response and is therefore associated with fluid behavior.
  • the storage modulus (G') will be greater than the loss modulus (G''). Conversely, in the case of a liquid material, the loss modulus (G'') will be greater than the storage modulus (G').
  • Example 4 Study of the viability of cellular elements in a solution comprising CMC.
  • the objective of this example is to evaluate the viability of cellular elements after 12 hours of immersion in a solution containing CMC.
  • the M4 solution was mixed with cellular elements with a controlled cellular elements/solution volume ratio so as to form a composition according to the invention.
  • the cellular elements are a mixture of microtissues with a largest dimension of at least 50 pm, isolated cells and aggregates of neuronal cells.
  • composition according to the invention was stored at room temperature for 12 hours.
  • the cellular elements are then rinsed in an excess of reference culture medium.
  • the microtissues are then recovered and the viability is measured by a cell viability bioluminometric assay. The result is expressed as luminescence signals renormalized by the CM control signal. To assess cell viability, 7 analytical replicates were performed for each condition.
  • results of this example show a maintenance of the viability of the composition according to the invention comprising the M4 solution and the cellular elements (96% compared to a 12-hour control in a reference culture medium).
  • Example 4 demonstrates that the composition according to the invention, comprising solution M4 and cellular elements, makes it possible to maintain high cell viability after 12 hours of immersion at room temperature.

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Abstract

L'invention concerne le domaine technique des compositions biocompatibles, notamment injectables. En particulier, l'invention a pour objet une composition biocompatible, comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), ladite composition étant caractérisée par : - une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3; - une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s; et - une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1.

Description

COMPOSITION BIOCOMPATIBLE PARTICULIERE COMPRENANT DES ELEMENTS
CELLULAIRES HETEROGENES UTILE POUR L'ADMINISTRATION DE THERAPIES
CELLULAIRES
Domaine technique
La présente invention se rapporte au domaine des compositions biocompatibles, notamment injectables. L'invention a en particulier pour objet une composition biocompatible particulière comprenant une solution et des éléments cellulaires hétérogènes en suspension dans ladite solution.
Art antérieur
Depuis plus de 20 ans, la médecine régénérative et plus particulièrement la thérapie cellulaire, suscite un intérêt grandissant chez les professionnels de santé et le grand public. La thérapie cellulaire consiste à greffer des cellules pour restaurer la fonction d'un tissu ou d'un organe, et ce, au moyen d'une injection de cellules thérapeutiques.
Aujourd'hui, la thérapie cellulaire fait face à de nombreux défis inhérents à l'administration de cellules dans l'organisme.
Outre les difficultés de mise en culture à grande échelle de cellules thérapeutiques adaptés à l'organe ciblé, la composition du milieu d'injection comprenant les cellules à inoculer est un défi fondamental pour toute thérapie injectable.
En général, les médicaments peuvent se dissoudre dans un liquide et peuvent se distribuer sous forme de solution, notamment dans une perfusion. Lessuspensions liquides comprenant de très petites particules se comporte également comme des solutions et peuvent également être administrées également par perfusion.
En revanche, dès lors que la composition est cellularisée, c'est-à-dire qu'elle comprend des cellules, elle est injectée en suspension.
Contrairement aux solutions qui forment un liquide homogène et fluide, les cellules en suspension sédimentent naturellement en fonction du temps.
A titre d'exemple, les érythrocytes « normaux » sédimentent dans le sang à une vitesse relative pouvant atteindre 20 mm par heure, et lorsque certaines cellules sont agrégées en amas ou microtissu, cette vitesse relative peut dépasser 100 mm par heure, voire 300mm par heure dans certains cas. La sédimentation des particules dans les suspensions solides-liquides est un sujet largement abordé dans de nombreux domaines telles que la chimie, la géologie et la biologie notamment via des applications pharmaceutiques ou en bio-impression.
La vitesse de sédimentation de particules solides telles que des cellules dans un liquide fait référence à la vitesse à laquelle les particules se déplacent vers le bas ou se déposent au fond d'un récipient par gravité. Ce phénomène de sédimentation se produit lorsque les particules, en raison de leur masse et de leur densité, sont plus lourdes que le milieu dans lequel elles sont suspendues.
Lors de l'utilisation d'une suspension de cellules, les cellules peuvent être hétérogènes. En effet, les cellules peuvent se trouver sous des formes très variées, on parle alors d'éléments cellulaires. A titre d'exemple, les éléments cellulaires peuvent être sous forme de cellules isolées, de microtissus cellulaires ou d'amas de cellules présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s). Par conséquent, lors de l'utilisation de suspensions comprenant des éléments cellulaires hétérogènes, les cellules sont réparties de façon hétérogènes dans leur milieu, et ce, en fonction de plusieurs paramètres, tels que la taille, la forme et la densité des cellules, ainsi que des propriétés physicochimiques du milieu.
Sans contrôle de ces paramètres, la plus grande concentration de cellules se retrouve, par gravité, vers dans la partie basse du dispositif comprenant la suspension d'éléments cellulaires.
A titre d'exemple, en thérapie cellulaire, lors de l'injection d'une suspension comprenant des éléments cellulaires hétérogènes, le premier volume d'injection peut contenir beaucoup plus de cellules que celles distribuées ultérieurement. Ce gradient de densité créer une hétérogénéité dans les différents volumes d'injection pouvant nuire l'efficacité de la thérapie cellulaire.
Par ailleurs, au-delà du maintien de l'homogénéité de la répartition des cellules dans leur milieu, le maintien de la stabilité biologique est fondamental pour garantir la conservation de cellules vivantes dans son milieu, en particulier lors de l'injection de cellules viables pour son utilisation en thérapie cellulaire. En effet, l'osmolalité, la concentration et la diversité des espèces ioniques est essentiel pour maintenir l'homéostasie des cellules en suspension.
Il existe donc un besoin important pour une composition biocompatible comprenant des éléments cellulaires hétérogènes, capable de maintenir :
- l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires au sein de la composition de façon à pouvoir contrôler précisément la quantité de cellules contenue dans un volume donné ; et
- la stabilité biologique des éléments cellulaires en suspension.
Résumé de l'invention Pour répondre à ce besoin, l'invention propose une nouvelle composition biocompatible, comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), ladite composition étant caractérisée par :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 ;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1.
Le couple densité/viscosité permet de moduler la vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution apportant ainsi de nombreux avantages à la composition selon l'invention, à savoir :
- une augmentation de la viabilité cellulaire : Une vitesse relative maximale inférieure à 20 mm.h-1 réduit le stress mécanique exercé sur les éléments cellulaires, minimisant ainsi les risques l'altération de leur structure ou de leur métabolisme, ce qui peut améliorer leur viabilité ;
- une précision analytique accrue : Dans le cadre d'analyses et de mesures spécifiques, une vitesse relative maximale inférieure à 20mm. h-1 permet une meilleure précision et une plus grande sensibilité des résultats ;
- une meilleure homogénéité : Une vitesse relative maximale inférieure à 20mm. h-1 permet aux cellules de rester réparties de manière homogène dans la solution, évitant ainsi la formation de gradients de concentration ;
- une meilleure reproductibilité expérimentale : En maintenant une vitesse relative maximale inférieure à 20mm. h-1, les variations dues à la sédimentation différentielle des éléments cellulaires hétérogènes sont réduites.
La composition selon l'invention présente une densité et/ou une viscosité particulièrement adaptée aux éléments cellulairesensuspension de façon à favoriser une distribution uniforme des éléments cellulaires en suspension dans la solution.
Selon un objet préféré, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires, dans laquelle l'osmolalité des éléments cellulaires dans la solution est comprise entre -180 et 360 mOsmol .kg-1, préférentiellement entre 220 et 360 mOsmol .kg- 1. En d'autres termes, la composition comprenant des éléments cellulaires et une solution présente une osmolalité comprise entre -180 et 360 mOsmol.kg-1, préférentiellement entre 220 et 360 mOsmol .kg-1.
Avantageusement, l'osmolalité des éléments cellulaires permet de former un environnement favorable à la survie des éléments cellulaires tel qu'un environnement isotonique.
De manière surprenante, les inventeurs ont mis au point une composition biocompatible, adaptée à de nombreuses utilisations, contrôlant la vitesse de sédimentation des éléments cellulaires hétérogènes en suspension la solution tout en présentant une stabilité biologique adapté aux cellules, notamment aux cellules humaines ou animales.
De façon préférée, la composition selon l'invention présente une densité comprise entre 997 et 1600 kg/m3, préférentiellement entre 1025 et 1100 kg/m3, notamment entre 1047 et 1090 kg/m3.
Avantageusement, la densité de la composition selon l'invention est homogène, par conséquent, chaque éléments cellulaires est soumis à la même densité sur l'ensemble du volume de la composition.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention présente une viscosité au repos mesurée à 25°C comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s, préférentiellement comprise entre 0,01 et 1 Pa.s, notamment entre 400 et 1200mPa.s, plus préférentiellement 400 et lOOOmPa, encore plus préférentiellement entre 500 et HOOmPa.s, notamment entre 500 et 900mPa.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention présente une densité comprise entre 997 et 1600 kg/m3 et une viscosité comprise entre 400 et 1200 mPa.s.
Avantageusement, les caractéristiques rhéologiques de la composition selon l'invention permettent de pouvoir utiliser la composition selon l'invention dans des dispositifs d'injection sans que les forces de frottement fluides ou de cisaillements rencontrées lors de l'injection détériorent la précision de l'injection et n'impactent la viabilité et l'intégrité des cellules. En effet, une viscosité et/ou une densité trop élevée peut entrainer une résistance accrue lors de l'écoulement de la composition à travers le moyen d'injection, associée à des forces de friction visqueuses susceptibles d'endommager les éléments cellulaires.
Les inventeurs, sont parvenus à une composition biocompatible présentant des caractéristiques rhéologiques adaptées aux éléments cellulaires hétérogène en se basant sur le couple densité/viscosité de la solution comprenant lesdits éléments cellulaires.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend au moins un élément cellulaire encapsulé, préférentiellement contenu dans un microcompartiment en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel. Préférentiellement, la composition biocompatible selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle les cellules constituant les éléments cellulaires sont choisies parmi les cellules neurales, les cellules neuronales, les cellules gliales, les cellules cardiaques, les cellules de la rétine, les lymphocytes , les hépatocytes, les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses, les kératinocytes, les fibroblastes, les pré-adipocytes, les adipocytes, les cellules des îlots pancréatiques et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle les éléments cellulaires sont constitués d'au moins 2 types cellulaires différents.
Avantageusement, la composition selon l'invention est particulièrement est adaptée à tous types cellulaires.
Selon un autre objet, l'invention porte sur la composition biocompatible selon l'invention pour son utilisation dans le traitement de maladies en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, la composition biocompatible selon l'invention est utilisée en tant que composition injectable chez l'Homme ou l'Animal.
Avantageusement, en garantissant une distribution uniforme des éléments cellulaires au sein de la solution, la composition selon l'invention permet d'obtenir un dosage précis des éléments cellulaires injecté permettant ainsi d'améliorer :
- l'efficacité thérapeutique : Lors de l'injection d'éléments cellulaires à des fins thérapeutiques, le dosage précis est essentiel pour obtenir le résultat désiré. Une quantité insuffisante d'éléments cellulaires peut ne pas être efficace, tandis qu'une surdose d'élément cellulaires peut entraîner des effets indésirables. En ajustant avec précision le dosage, il est possible de maximiser l'efficacité thérapeutique tout en minimisant les risques pour le patient ;
- la précision expérimentale : La maîtrise du dosage lors de l'injection d'éléments cellulaires permet de minimiser les variations entre les échantillons et d'obtenir des données fiables et reproductibles. Cela est particulièrement important lors d'expériences comparatives ou de tests de l'efficacité de nouvelles thérapies cellulaires.
- l'optimisation des ressources : Les ressources utilisées pour la production de d'éléments cellulaires, telles que les cultures cellulaires et les produits de culture, peuvent être coûteuses. Un dosage précis permet de minimiser le gaspillage de ces ressources en évitant les surdoses inutiles.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition biocompatible selon l'invention comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes : (a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) ;
(b) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition de l'étape (a), une solution (B) et optionnellement la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b) présente une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 et une viscosité mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s.
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), présentant :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de préparer une composition biocompatible présentant l'association d'une densité et d'une viscosité optimale pour maintenir les éléments cellulaires hétérogènes en suspension à une vitesse relative maximale par rapport à la solution inférieure 20mm. h-1.
Préférentiellement, la composition biocompatible de l'étape (a) présente une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution supérieure à 20mm. h-1.
Un tel procédé permet avantageusement d'adapter les caractéristiques rhéologiques, notamment la densité et la viscosité, d'une composition de façon à rendre homogène la répartition des éléments cellulaires hétérogènes au sein de la composition. De cette façon, la composition de l'étape (c) peut être utilisée dans de nombreuses applications, notamment en thérapie cellulaire.
Selon un autre objet, l'invention concerne un kit comprenant :
* une composition biocompatible, comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), ladite composition étant caractérisée par : - une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 ;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1, et
* éventuellement un moyen d'injection, préférentiellement une canule.
Avantageusement, les caractéristiques rhéologiques de la composition permettent de maintenir l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires dans la composition tout en prévenant l'obstruction du système d'injection.
Enfin, selon un dernier objet, l'invention concerne un kit comprenant :
- une préparation (1) biocompatible comprenant au moins un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules ; et au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules ;
- une préparation (2) biocompatible comprenant des éléments cellulaires, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) ; de façon à ce que le mélange de la préparation (1) et la préparation (2) forme une composition présentant une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3, une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s, et une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
Brève description des Figures :
[Figure 1] La figure 1 représente une séquence d'images montrant la stabilité en suspension d'éléments cellulaires dans le temps dans une composition selon l'invention, et une composition hors invention. [Figure 2] La figure 2 représente l'étude comparative de l'impact de l'immersion prolongée (6h) d'éléments cellulaires dans une solution, sur un panel de lots de production de microtissus d'intérêt.
[Figure 3] La figure 3 est une représentation schématique d'une étude comparative évaluant l'impact d'une procédure d'injection sur la viabilité des éléments cellulaires au sein de la composition selon l'invention.
[Figure 4] La figure 4 est une représentation graphique d'une étude évaluant les différentes déformations de cisaillement de la composition selon l'invention.
Description détaillée de l'invention
Définitions :
Par « agent de densité » au sens de l'invention, on entend une espèce chimique biocompatible, soluble en solution aqueuse et utilisée pour augmenter la densité de celle-ci tout en n'altérant pas sensiblement la biocompatibilité de la solution avec les éléments cellulaires en suspension. Plus particulièrement, lorsqu'un agent de densité au sens de l'invention est introduit à une concentration supérieure à 10% en masse dans une solution aqueuse, cela n'entraine pas de modification du comportement rhéologique de la solution. De manière complémentaire, l'ajout d'un tel agent n'augmente pas l'osmolalité de la solution au-delà de 360mOsm. En d'autres termes, l'ajout d'un agent de densité au sens de l'invention à une concentration supérieure à 10% en masse dans une solution n'entraine pas de transition de phase tel que la gélification.
Par « amas de cellules » au sens de l'invention, on entend un regroupement tri-dimensionnel de cellules maintenues solidaires les unes des autres par des interactions adhésives ou par la présence de tissu interstitiel.
Par « biocompatible » au sens de l'invention, on entend la capacité de d'une substance ou composition à interagirde manière favorable avec lessystèmes biologiques, tels que les tissus, les organes ou les organismes vivants, sans causer de réactions nocives, d'irritation excessive ou de dommages indésirables. Lorsqu'une substance ou composition est qualifiée de biocompatible, cela signifie qu'elle est conçue et formulée de manière à minimiser les risques de toxicité, d'inflammation, de rejet ou d'autres réponses indésirables de la part de l'organisme et/ou des éléments cellulaires.
Par « cellules humaines » au sens de l'invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n'est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l'invention sont constitués ou sont obtenus à partirde cellules humaines ou à partirde cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Par « cellule progénitrice » au sens de l'invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation cellulaire mais pas encore différenciée.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA4/5, Tra-l-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d'êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l'invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans le contexte de la présente invention. Il peut s'agiren particulierde cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammationgénétique de cellulessomatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA4/5. Des exemples de procédés permettant l'obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917- 1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « couche de cellules » ou « assise de cellules » au sens de l'invention, on entend plusieurs cellules formant une couche ou une assise pouvant être structurée autour d'une lumière, il peut s'agir par exemple d'un tissu ou d'un micro-tissu cellulaire ou d'une culture groupée en trois dimensions. L'épaisseur de la couche de cellules pouvant être variable. Cette couche est organisée en trois dimensions dans le microcompartiment.
Par « comportement rhéologique » au sens de l'invention, on entend la réaction d'un matériau aux contraintes et aux déformations qui lui sont appliquées. Il décrit comment la matière s'écoule ou se déforme sous l'effet de force externe. Il existe plusieurs types de comportements rhéologiques tels que l'élasticité, la plasticité, la viscosité et la visco-élasticité.
Par « densité » au sens de l'invention, on entend la masse volumique des entités concernées (éléments cellulaires ou solutions) exprimée en mg/mL. Dans le contexte de l'invention, la densité des solutions est mesurée à la température de 20°C à l'aide de d'un densimètre. Dans le cas des éléments cellulaires, la densité est mesurée par la méthode de gradient de densité. Celle-ci consiste à préparer des solutions étalonnées en densité et isotoniques. Ces solutions à densité connues sont ensuite introduites en couches successives dans un tube de façon à former un gradient de densité de bas en haut, chaque couche étant plus dense que la couche directement supérieure. Typiquement, les gradients de densité sont préparés par incréments de densité de 5 kg/m3. La densité des éléments cellulaires est donc donnée à une résolution de +/- 5 kg/m3. Une fois le gradient de densité formé, les éléments cellulaires sont injectés sur la partie supérieure du tube. Ces-derniers sédimentent et se stabilisent dans ou entre la ou les couches dont la densité leur est la plus proche. La lecture s'effectue une fois que tous les éléments cellulaires sont stabilisés, typiquement après lh. Avantageusement, des billes synthétiques colorées de densités calibrées peuvent être introduites simultanément, leur position d'équilibre fournissant un contrôle positif de la mesure de position des éléments cellulaires. Toutes ces mesures sont réalisées à la température ou au sein de l'intervalle de température d'utilisation projetée car la température peut différentiellement affecter la densité de l'eau, des solutions et des éléments cellulaires.
Par « densité moyenne des éléments cellulaires », au sens de l'invention, on entend la masse volumique moyenne des éléments cellulaires tels que des microcompartiment. Dans le contexte de l'invention, la densité moyenne des éléments cellulaire est mesurée par la méthode de gradient de densité. Cette méthode, bien connu de l'Homme du métier, consiste à préparer des solutions étalonnées à densité connues. Ces solutions sont ensuite introduites dans un tube de façon à former un gradient de densité de bas en haut, chaque couche étant plus dense que la couche directement supérieure. Une fois que le gradient de densité est formé dans le tube, les éléments cellulaires sont introduits dans ledit tube est sédimentent en se stabilisant dans ou entre les couches dont la densité leur est la plus proche. La lecture est réalisée une fois que tous les éléments cellulaires sont stabilisés, typiquement après 1 heure. Parallèlementà l'injection des éléments cellulaires, des billes synthétiques colorées de densité connues sont également introduites dans ledit tube de façon à former un contrôle positif. La densité moyenne est ensuite calculée en fonction de la répartition des éléments cellulaires au sein dudit tube.
Par « diamètre de Feret » d'un élément cell ulaire au sens de l'invention, on entend la distance comprise entre deux tangentes, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de l'élément cellulaire soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par cellules « différenciées » au sens de l'invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui ne sont pas différenciées ou des cellules progénitrices qui sont en cours de différenciation. Par « élément cellulaire » au sens de l'invention, on entend un composant qui comprend au moins une cellule humaine, animale ou végétale et se présentant sous différentes formes telles que des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules, des cellules encapsulées, des microtissus encapsulés, des amas de cellules ou non et leurs mélanges. Les microtissus et/ou amas, encapsulés ou non, peuvent contenir une ou plusieurs lumières.
Par « formes modifiées de ces molécules » au sens de l'invention, on entend que les molécules ont été modifiées par ajout d'un ou plusieurs groupes moléculaires sur un ou plusieurs groupes fonctionnels présents sur les molécules. A titre d'exemple, l'acide hyaluronique est constitué d'un assemblage de monomère, chacun des monomères comprend des groupes fonctionnels hydroxyl, carboxyl, et N-acetyl suceptible de servir de base pour fixer des groupes moléculaires. Les groupes hydroxyl et carboxyl sont des sites privilégiés pour la fixation de lipides, polymères ou d'autres molécules actives sur le monomère d'acide hyaluronique. De manière complémentaire, des groupes amines peuvent également être ajouté sur le groupe fonctionnel N-acetyl. On peut ainsi créer des acides hyaluronique-esters, acides hyaluronique -dialdéhydes, acides hyaluronique -N-deacétylés ou Cys- acides hyaluronique. De façon similaire, le Dextran, constitué également de monomère possède des groupes fonctionnels hydroxyl accessibles à une grande variété de réactions d'addition (chimie des groupements hydroxyl).
Par « la plus grande dimension » au sens de l'invention, on entend la valeur du plus grand diamètre de Feret. La dimension des éléments cellulaires peut être obtenue par différentes techniques. Notamment, elle peut être caractérisée au moyen d'un appareil de mesure à effet Coulter. Alternativement, elle peut être déterminée optiquement par microscopie.
Par « maintenir les éléments cellulaires en suspension » au sens de l'invention, on entend ralentir la vitesse de sédimentation des éléments cellulaire sans impacter leur survie.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l'invention, on entend également une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant un ou plusieurs éléments cellulaires. La structure est préférentiellement constituée d'une couche externe en hydrogel rigidifiée et d'une partie interne creuse comprenant au moins un élément cellulaire et éventuellement d'autres éléments tels qu'une matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extracellulaire.
Par « microtissu » au sens de l'invention, on entend une communauté de cellules présentant des interactions cellulaires, optionnellement une cohésion mécanique et récapitulant au moins partiellement une composition cellulaire présente dans un tissu humain en situation physiologique ou pathologique. De façon typique un microtissus présente une topologie spécifique de répartition des cellules qui le compose. Au sens de l'invention, un microtissu présente une plus grande dimension d'au moins 50pm, plus préférentiellement comprise entre 50pm et 1,3 mm, notamment entre 100pm et 800pm.
Par « osmolalité des éléments cellulaires » au sens de l'invention, on entend une mesure de la concentration totale des particules dissoutes au sein des éléments cellulaires, exprimée en osmoles par kilogramme d'eau (osmol/kg H2O).
Elle englobe les solutés actifs, tels que les électrolytes et les molécules non ioniques. Dans le contexte de l'invention, l'osmolalité peut être mesurée au moyen d'un osmomètre à point de congélation de type « Osmotech XT ». Il est à noter que l'utilisation de modèles différents d'osmomètres à point de congélation pourra rendre la mesure impossible. En effet la composition des solutions et leur viscosité rendent la mesure d'osmolalité complexe et nécessitent des appareils de forte puissance. Alternativement, la mesure d'osmolalité pourra se calculer par extrapolation sur la base d'une mesure d'une dilution de la solution, ce qui permet l'utilisation d'appareils standards.
Par « principe actif » au sens de l'invention, on entend une ou plusieurs substance(s) responsable(nt) d'une activité pharmacologique ou thérapeutique.
Par « stabilité biologique » au sens de l'invention, on entend le maintien de l'intégrité des éléments cellulaires.
Par « tissu » ou « tissu biologique »au sens de l'invention, on entend le sens commun de tissu en biologie c'est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la cellule et l'organe. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus souvent issus d'un lignage cellulaire commun, bien qu'elles puissent trouver leur origine par association de lignages cellulaires distincts)., regroupées en amas, réseau ou faisceau (fibre). Un tissu forme un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même fonction. Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Par « seuil de vitesse de sédimentation » ou « vitesse de sédimentation maximale » au sens de l'invention, on entend la vitesse relative maximale mesurée de déplacement vertical au sein de la solution relativement au référentiel du système, récipient ou élément fluidique dans lequel la suspension est contenue. La vitesse relative maximale s'exprime en mm/h. Par convention, on définit la vitesse relative comme positive dans le cas où les éléments cellulaires sédimentent dans la solution, et négative si ces-derniers remontent dans la solution. Le terme « maximale » qualifie la valeur absolue de la vitesse indifféremment de son signe, au sens qu'il importe dans le contexte de l'invention que les éléments cellulaires se maintiennent en suspension, ce qui implique que leur vitesse relative soit, en valeur absolue, la plus faible possible. Par « viscosité » au sens de l'invention, on entend la viscosité dynamique qui caractérise la résistance d'un fluide à un écoulement laminaire. Elle est exprimée en Pa.s. Dans le cas des fluides non-Newtoniens, cette viscosité peut dépendre des contraintes de cisaillement appliquées au fluide. Notamment, par « fluide rhéofluidifiant » on entend un fluide dont la viscosité diminue avec le taux de cisaillement. Similairement, on appelle « fluide à seuil » un fluide dont la viscosité est très significative à faible taux de cisaillement, puis chute brutalement au-delà d'une valeurseuil de taux de cisaillement. Cesdeux catégoriesde fluides sont avantageuses dans le cadre de l'invention puisque la viscosité haute au repos permet d'empêcher la sédimentation, tandis que la fluidification aux forts taux de cisaillementfacilite l'écoulement de la solution et limite les forces de frictions visqueuses sur les éléments biologiques, par exemple au cours de l'injection. Dans le contexte de l'invention, la viscosité peut être mesurée à 25°C à l'aide d'un rhéomètre par la méthode de la courbe de viscosité en cisaillement mesurée en confinant le fluide dans une géométrie Cone-Plan de 25mm de diamètre, un angle de 1°, de surface sablée et sur une gamme de taux de cisaillement allant de ÿ = 0.1 s-1 à ÿ = 1000 s-1.
Par « viscosité au repos », on entend la viscosité dynamique mesurée au repos, c'est-à-dire à un très faible taux de cisaillement ÿsur le fluide, typiquement ÿ = 0.1 s-1 .
Par « viabilité » au sens de l'invention, on entend la proportion de cellules saines dans un échantillon d'éléments cellulaires. Dans le contexte de l'invention, la proportion de cellules saines est évaluée au regard de l'activité métabolique d'un échantillon de cellules. L'activité métabolique est quantifiée par la concentration d'ATP dosée dans une suspension d'éléments cellulaires lysés. La technique utilisée est commercialisée sous le nom de test « CelITiter-GIo® 3D Cell Viability Assay ». Il est spécifiquement conçu pour déterminer la viabilité des cellules dans les sphéroïdes de microtissus en 3D. Le réactif du test pénètre dans les sphéroïdes de grande taille et possède une capacité lytique accrue, ce qui permet une détermination plus précise de la viabilité par rapport é d'autres méthodes de test. Préférentiellement, la viabilité est exprimée en pourcentage par rapport à une condition de contrôle. Dans ce cas, la viabilité est dite « relative ». Par exemple, si la condition A est prise comme référence, une viabilité de 85% pour la condition B traduit une baisse de 15% de viabilité par rapport à la condition A. :ible selon l'invention
La présente invention a pour objet une composition biocompatible, comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), ladite composition étant caractérisée par :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3; - une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1.
De façon surprenante, les inventeurs ont mis au point une composition biocompatible permettant de maintenir des éléments cellulaires hétérogènes en suspension tout en maintenant leur stabilité biologique, et ce, sur de longue période. Ainsi, les caractéristiques rhéologiques de la solution permettent avantageusement de maintenir l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires au sein de la composition.
Selon un mode de réalisation, la vitesse relative maximale deséléments cellulaires par rapport à la solution est inférieure à 15 mm.h-1, préférentiellement inférieur à 10 mm.h-1; notamment inférieur à 5 mm.h-1, encore plus préférentiellement inférieur à 1 mm.h-1.
Selon un autre mode de réalisation, la vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution est comprise entre 0,01 et 20 mm.h-1, préférentiellement entre 0,01 et 10 mm.h-1, notamment entre 0,01 et 5 mm.h-1, encore plus préférentiellement entre 0,01 et 1 mm.h-1.
Ainsi, plus la vitesse de sédimentation maximale des éléments cellulaires est faible, plus l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires en suspension dans la solution est conservée dans le temps.
Préférentiellement, l'osmolalité des éléments cellulaires dans la solution est comprise entre -180 et 360 mOsml.kg-1, préférentiellement entre 220 et 360 mOsmol .kg-1. De cette façon, les éléments cellulaires et la solution sont proches de l'équilibre osmotique, ce qui signifie que les gradientsde concentrations d'ions de la composition sont équilibrés et ne provoquent pas de choc osmotique.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend une solution comprenant au moins un ion choisis parmi des ions sodium, le calcium, le magnésium, le chlore et le potassium et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend une solution comprenant des ions sodium, calcium, chlore et potassium.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution est une solution aqueuse. Selon un mode de réalisation, la composition comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution présente un pH compris entre 7,0 et 7,6.
Avantageusement, le pH de la solution est particulièrement adapté à la survie des éléments cellulaires.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend un tampon de pH biocompatible, préférentiellement choisi parmi le tampon phosphate salin (PBS), l'acide citrique ou l'Hepes, et de façon préférée le tampon PBS référencé au numéro 4004200 de la pharmacopée européenne.
Selon une variante, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend également au moins un principe actif et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la solution aqueuse est le milieu de culture des éléments cellulaires.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution comprenant au moins un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaC 12), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
Avantageusement, la diversité d'ions contenus dans la solution permet d'assurer un environnement équilibré et propice au bon fonctionnement des processus cellulaires des éléments cellulaires au sein de la composition selon l'invention.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend :
- entre 0,01 et 0,9% en masse de NaCI par rapport à la masse totale de la solution ; et/ou
- entre 0,01 et 0,04%% en masse de CaCI2 par rapport à la masse totale de la solution ; et/ou
- entre 0,01 et 0,05% en masse de KCI par rapport à la masse totale de la solution.
Avantageusement, la solution et les éléments cellulaires en suspension dans ladite solution sont proches de l'équilibre osmotique garantissant un environnement stable pour les éléments cellulaires, sans risque de choc osmotique.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution est isotonique par rapport aux éléments cellulaires. Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention présente une densité comprise entre 997 et 1600 kg/m3, encore plus préférentiellement entre 1025 et 1100 kg/m3, notamment entre 1047 et 1090 kg/m3.
Avantageusement, la densité de la composition selon l'invention contribue à diminution de la vitesse de sédimentation maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution.
Selon une variante, la composition selon l'invention comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, présente une densité de la solution comprise entre la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité.
Selon une autre variante, la composition selon l'invention comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, présente une densité de la solution inférieure à la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité.
Selon une autre variante, la composition selon l'invention présente une densité égale à la moyenne des densités de tous leséléments cellulaires présents dans la composition, avec une variation tolérée de 20 kg/m3, préférentiellement de 10 kg/m3. De cette façon, la densité de la composition est centrée sur la densité de la moyenne des densités de tous les éléments cellulaires.
Enfin, selon une autre variante, la composition selon l'invention comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, présente une densité de la solution supérieure à la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité.
Avantageusement, dans tous les modes de réalisation selon l'invention, la vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution est inférieure à 20mm/h.
Selon un mode de réalisation, la différence de densité entre la solution et la densité moyenne des éléments cellulaires vérifie l'inégalité suivante :
[Math 1]
V \ < F- 2 ù | | = ps — p0 avec ps représentant la densité de la composition exprimée en kg/m3, et p0 représentant la densité moyenne des éléments cellulaires, mesurée à l'aide de la technique de gradient de densité exprimée en kg/m3, où D représente la plus grande dimension des éléments cellulaires exprimée en mètre, où vc représente le seuil de vitesse de sédimentation acceptable exprimée en m.s-1; où F = 18. pc/g ~ 9,81 avec pc représente la viscosité maximale au repos de la solution exprimée en Pa.s, g représentant la constante de pesanteur exprimée en m.s-2; et où vc.= 5,56*10-6 m.s-1.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention présente une viscosité au repos mesurée à 25°C comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s, préférentiellement comprise entre 0,01 et l Pa.s, notamment entre 400 et 1200mPa.s, plus préférentiellement 400 et lOOOmPa, encore plus préférentiellement entre 500 et HOOmPa.s, notamment entre 500 et 900mPa.
La viscosité de la composition permet de prévenir la sédimentation des éléments cellulaires en suspension dans la solution tout en permettant l'utilisation de la composition selon l'invention, notamment l'injection de ladite composition. Par conséquent, la composition selon l'invention dispose d'une viscosité suffisamment élevée pour maintenir les éléments cellules en suspension tout en ayant une viscosité suffisamment faible pour minimiser les contraintes de friction lorsque la composition est injectée, notamment l'aide d'un moyen d'injection tel qu'une seringue ou une canule.
Ainsi, plus la vitesse relative maximale des éléments cellulaires est faible, plus l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires en suspension dans la solution est conservée dans le temps.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention présentant une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 1mm. h-1 peut être conservée jusqu'à 6 heures avant utilisation. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la composition selon l'invention conserve la distribution uniforme des éléments cellulaires hétérogènes pendant 6 heures.
Avantageusement, la composition selon l'invention peut être conservée pendant une longue période sans affecter la distribution uniforme des éléments cellulaires hétérogènes permettant ainsi d'assurer un dosage précis, notamment lors de son injection.
La composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires hétérogènes en suspension dans ladite solution. Lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, dont au moins deux, préférentiellement une majorité, encore plus préférentiellement tous lesdits éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend au moins un élément cellulaire encapsulé, préférentiellement contenu dans un microcompartiment en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel. Le microcompartiment peut être une boule pleine d'hydrogel. Préférentiellement la composition comprend au moins un élément cellulaire encapsulé, préférentiellement contenu dans un microcompartiment en trois dimensions creux comprenant une couche externe en hydrogel et une partie interne creuse contenant le ou les élément(s) cellulaire(s) encapsulés. La partie interne creuse peut contenir également de la matrice extracellulaire et/ou un ou plusieurs substituts de matrice extracellulaire et/ou une solution et/ou d'autres éléments.
Selon un mode de réalisation particulier, la couche externe en hydrogel du microcompartiment peut comprendre ou être constituée exclusivement d'alginate. L'alginate peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de |3- D-mannuronate, ayant un module de Young supérieur à lOkPa, préférentiellement supérieur à 60 kPa, plus préférentiellement supérieur à 100 kPa. Selon un mode de réalisation, la couche externe en hydrogel comprend de l'alginate, ledit alginate présentant un poids moléculaire moyen de 100 à 400 kDa, plus préférentiellement un poids moléculaire compris entre 150 et 250kDa. Lorsque l'hydrogel de la couche externe du microcompartiment est de l'alginate, la concentration de la solution d'alginate destinée à former ladite couche externe du microcompartiment, est préférentiellement comprise entre 0,5 et 5% en masse, plus préférentiellement la concentration est égale à 2% (plus ou moins 0,5%) en masse.
De façon préférée, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires, encapsulés ou non, en suspension dans ladite solution, dans laquelle les cellules constituant les éléments cellulaires sont des cellules matures et/ou des progéniteurs et/ou des cellules souches. Préférentiellement, les cellules constituant tout ou partie des éléments cellulaires sont choisis parmi les cellules neurales, les cellules neuronales, les cellules gliales, les cellules cardiaques, les cellules de la rétine, les lymphocytes, les hépatocytes, les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses, les kératinocytes, les fibroblastes, les pré-adipocytes, les adipocytes, les cellules des îlots pancréatiques et leurs mélanges.
Avantageusement, la composition selon l'invention est adaptée à maintenir en suspension tous types cellulaires, les éléments cellulaires étant encapsulés ou non.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle les éléments cellulaires sont constitués d'au moins 2 types cellulaires différents.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle au moins 20%, préférentiellement au moins 30%, notamment au moins 40% des éléments cellulaires sont sous la forme d'un microtissu.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend entre 10 et 55% des éléments cellulaires sous la forme d'un microtissu.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant préférentiellement une plus grande dimension d'au moins 50pm, plus préférentiellement comprise entre 50pm et 1,3 mm, notamment entre 100pm et 800pm.
Ainsi, dans ce mode de réalisation, la composition biocompatible selon l'invention comprend au moins un microtissu dont la plus grande dimension est d'au moins 50pm. De manière inattendue, les inventeurs ont réussi à maintenir les éléments cellulaires, dans ce mode de réalisation incluant au moins un microtissu, en suspension dans une composition sous forme liquide. Cette caractéristique permet de rendre la composition facilement injectable.
Dans le contexte de l'invention, la composition selon l'invention est sous forme liquide. Plus particulièrement, la composition selon l'invention est sous forme liquide et comprend une solution sous forme liquide et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution.
En outre, il est avantageux que la composition biocompatible ne soit pas sous forme de gel.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle moins de 15%, préférentiellement moins de 10% notamment moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% des éléments cellulaires sont sous la forme de cellules isolées.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulairesen suspension dans ladite solution dans laquelle aucun élément cellulaire est sous la forme de cellule isolée. Dans le contexte de l'invention, le pourcentage des éléments cellulaires sous la forme de microtissu ou de cellules isolées est exprimé en volume cumulé des éléments cellulaires.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la fraction volumique des éléments cellulaires est comprise entre 0,01 et 80% en volume, préférentiellement comprise entre 0,01 et 60%, notamment entre 0,01 et 50%, plus préférentiellement entre 0,01 et 45%, encore plus préférentiellement entre 15 et 30%.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle les éléments cellulaires présentent une plus grande dimension inférieure à 1,3 mm, préférentiellement inférieure à 1 mm, notamment inférieur à 700 pm, encore plus préférentiellement inférieure à 500 pm.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle les éléments cellulaires présentent une plus grande dimension comprise entre 50pm et 1,3 mm, préférentiellement entre 100pm et 800pm. En d'autres termes, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle l'élément cellulaire présentant la plus grande dimension présente une plus grande dimension inférieure à 1,3 mm, préférentiellement inférieure à 700 pm, de manière préférée inférieure à 500 pm.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la composition comprend entre 1 million et 500 millions cellules par mL de solution, préférentiellement au moins 5 millions de cellules, notamment 50 millions de cellules.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la composition comprend entre 1 et 100 millions de cellules par mL de solution, préférentiellement entre 1 et 50 millions de cellules, notamment entre 1 et 10 millions de cellules, plus préférentiellement entre 2 et 6 millions de cellules, encore plus préférentiellement entre 3 et 5 millions de cellules par mL de solution.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend :
- de l'eau ;
- au moins un agent de densité biocompatible; et
- au moins un agent de viscosité biocompatible, préférentiellement au moins un agent de viscosité biocompatible présentant un poids moléculaire compris entre 0,05 MDa et 5MDa.
Avantageusement, les agents de densité et de viscosité permettent de moduler les caractéristiques rhéologiques de la solution de façon à ce que la vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution soit inférieure à 20mm. h-1, préférentiellement comprise entre 0,01 et 20mm. h-1.
De façon préférée, la composition selon l'invention comprend également au moins un agent d'ajustement de l'osmolalité biocompatible. Ledit au moins un agent d'ajustement de l'osmolalité permet d'adapter l'osmolalité de la solution afinde rendre la solution compatible avec la survie des éléments cellulaires.
Préférentiellement, au moins un agent d'ajustement de l'osmolalité de la solution est choisi parmi le mannitol, le sorbitol, le chlorure de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le chlorure de sodium, le glycérol ou le sorbitol, et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Les agents de densité adaptés à la composition selon l'invention sont sélectionnés en fonction de plusieurs paramètres, à savoir :
- leur biocompatibilité, c'est-à-dire qu'ils ne doivent pas impacter la survie des éléments cellulaires
- leur forte solubilité dans la solution ;
- leur faible impact sur la viscosité de la solution.
De façon préférée, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend au moins un agent de densité, préférentiellement du dextran. Lorsque la solution comprend du dextran, celui-ci présente préférentiellement un poids moléculaire compris entre 20 et 80KDa, notamment 30, 35 ou 40kDa.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend au moins un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Les agents de viscosité adaptés à la composition selon l'invention sont sélectionnés en fonction de plusieurs paramètres, à savoir :
- leur biocompatibilité, c'est-à-dire qu'ils ne doivent pas impacter la survie des éléments cellulaires ;
- leur stabilité à 37°C, température d'injection chez l'Homme.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend au moins un agent de viscosité choisi parmi le hyaluronate de sodium et/ou la CMC. Lorsque la solution comprend du hyaluronate de sodium, celui-ci présente préférentiellement un poids moléculaire inférieur à lMDa, encore plus préférentiellement compris entre 80 et lMDa, notamment entre 80 et 600kDa. Lorsque la solution comprend de la CMC, celle-ci présente préférentiellement un poids moléculaire compris entre 40kDa et lMDa, encore plus préférentiellement comprise entre 50 et 400kda.
Avantageusement, les composants de la solution sont tous biocompatibles, permettant ainsi de garantir que la composition selon l'invention sera bien tolérée par l'organisme, notamment en cas d'injection.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend :
- entre 0,01 et 30% en masse d'agent (s) de densité par rapport à la masse totale de la solution
- entre 0,01 et 8% en masse d'agent (s) de viscosité par rapport é la masse totale de la solution.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend :
- du hyaluronate de sodium et/ou du CMC ; et
- du dextran.
Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend une solution et des éléments cellulaire en suspension dans ladite solution, dans laquelle la solution comprend : entre 10 et 20% en masse de dextran présentant un poids moléculaire de 20 et 80kDa par rapport à la masse totale de la solution ;
- entre 3 et 6% en masse de CMC présentant un poids moléculaire compris entre 40 et lMDa par rapport à la masse totale de la solution et/ou entre 0,3 et 10% en poids de hyaluronate de sodium de poids molécules compris entre 80 et lMDa par rapport à la masse totale de la solution
La composition selon l'invention peut être obtenu par tout procédé adapté connu de l'homme du métier. Toutefois, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon l'invention est une composition biocompatible obtenue selon un procédé de préparation comprenant les étapes suivantes :
(a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm ; (b) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition de l'étape (a), une solution (B) et optionnellement la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b) présente une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 et une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s.
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm, présentant :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
Préférentiellement, lorsque l'étape (a) concerne la préparation d'une composition, elle comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
1) Mise en culture d'au moins un élément cellulaire ;
2) Rinçage de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 1) ;
3) Centrifugation de la culture d'éléments cellulaires issus de l'étape 2) ;
4) Récupération d'une composition comprenant des éléments cellulaires issues de la centrifugation de l'étape 3), dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (b) comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ;
*la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a);
*la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ; *la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a)
(b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b2) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) stérilisée de l'étape (b3) ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b5) présente :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
De façon préférée, l'étape (b2) de préparation de la solution (B) est réalisée en ajoutant un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Préférentiellement, l'étape (b2) de préparation de la solution (B) est réalisée en ajoutant au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Préférentiellement, l'étape (b2) de préparation de la solution (B) comprend également l'ajout d'au moins un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, l'étape (b) comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ;
*la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a); *la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a)
(b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) issue de l'étape (b2) ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b4) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la différence de densité entre la densité de la solution issue de l'étape (b5) et la densité moyenne des éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (b5) vérifie l'inégalité précitée à l'étape (b).
Dans ce mode de réalisation, l'étape (b4) d'ajustement du pH de la solution (B) est réalisée en amont de l'étape (b3) de stérilisation de la solution (B).
Procédé de préparation d'une composition biocompatible selon l'invention
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une composition selon l'invention comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm ;
(b) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition de l'étape (a), une solution (B) et optionnellement la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b) présente une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 et une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s.
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), présentant : - une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de parvenir à un équilibre entre densité et la viscosité en fonction des éléments cellulaires hétérogène de façon à ce que la vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution soit inférieure à 20mm/h.
Préférentiellement, lorsque l'étape (a) concerne la préparation d'une composition, elle comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
1) Mise en culture d'au moins un élément cellulaire ;
2) Rinçage de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 1) ;
3) Centrifugation de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 2) ;
4) Récupération d'une composition comprenant des éléments cellulaires issues de la centrifugation de l'étape 3), dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm.
Selon un mode de réalisation, la mise en culture de cellules de l'étape 1) est réalisée au sein d'un bioréacteur.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, au moins un élément cellulaire de l'étape 1) comprend au moins une cellule encapsulée, préférentiellement dans de l'alginate.
De façon préférée, au moins un élément cellulaire de l'étape 1) est contenu dans un microcompartiment en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel.
Lorsque l'étape 1) comprend la mise en culture d'au moins un élément cellulaire encapsulé, l'étape (a) peut comprendre également une étape 2') visant à éliminer la capsule de façon à récupérer l'élément cellulaire avant l'étape 3) de centrifugation.
L'étape 2') consiste à éliminer la capsule, préférentiellement éliminer la couche externe en hydrogel. Préférentiellement l'étape 2') peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser. Tl
Selon un mode de réalisation, la composition de l'étape (a) comprend au moins deux types cellulaires distincts.
De façon préférée, l'étape (b) comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ;
*la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a);
*la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a)
(b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b2) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) stérilisée de l'étape (b3) ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b5) présente :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
De façon préférée, l'étape (b2) de préparation est réalisée en ajoutant un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules. Préférentiellement, l'étape (b2) de préparation de la solution (B) est réalisée en ajoutant au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Préférentiellement, l'étape (b2) de préparation de la solution (B) comprend également l'ajout d'au moins un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
Avantageusement, l'Homme du métier pourra adapter à façon la densité et la viscosité en variant les concentrations d'au moins un agent de densité et/ou d'au moins un agent de viscosité.
Selon un mode de réalisation particulier, la solution (B) issue de l'étape (b2) comprend :
- entre 10 et 20% en masse par rapport à la masse totale de la solution de dextran présentant préférentiellement un poids moléculaire de 20kDa et 80KDa;
- entre 3 et 6% en masse de CMC présentant préférentiellement un poids moléculaire compris entre 40 et lMDa par rapport é la masse totale de la solution et/ou entre 0,3 et 10% en poids de hyaluronate de sodium de poids molécules compris entre 80 et 800kDa.
Selon un mode de réalisation préféré, la solution (B) issue de l'étape (b2) est réalisée sous agitation, préférentiellement à l'aide d'un mélangeur à pâle ou barreau aimanté.
Préférentiellement, la stérilisation de l'étape (b3) est réalisée par filtration au travers de mailles de taille comprise entre 0,01 et 0,22pm.
Selon un mode de réalisation, l'étape (b4) consiste à ajouter un tampon de pH biocompatible, préférentiellement choisi parmi le tampon phosphate, l'acide citrique ou l'Hepes, et de façon préférée le tampon phosphate salin référencé au numéro 4004200 de la pharmacopée européenne avec la solution (B) stérilisée de l'étape (b3) de façon à ce que la solution (B) stérilisée présente un pH compris entre 7 et 7,6.
Selon un mode de réalisation, l'étape (b5) de préparation d'une composition comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) comprenant une étape d'extraction des éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (A). En d'autres termes, selon ce mode de réalisation, l'étape (b5) comprend une étape d'extraction visant à isoler les éléments cellulairesde la solution (A) présent dans la composition issue de l'étape (a).
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de préparation d'une composition selon l'invention comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm ;
(bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ;
*la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a);
*la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a)
(b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b2) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) stérilisée de l'étape (b3) ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b5) présente :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1 ;
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), présentant :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et - une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de préparation d'une composition selon l'invention comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm comprenant les étapes suivantes :
1) Mise en culture d'au moins un élément cellulaire ;
2) Rinçage de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 1) ;
3) Centrifugation de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 2) ;
4) Récupération d'une composition comprenant des éléments cellulaires issues de la centrifugation de l'étape 3), dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) ;
(bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ;
*la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a);
*la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a)
(b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b2) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) stérilisée de l'étape (b3) ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b5) présente :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3; - une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et
1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1 ;
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm, présentant :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'étape (a) comprend également une solution dans laquelle lesdits éléments cellulaires sont en suspension. Lorsque la composition de l'étape (a) comprend une solution et des éléments cellulaires en suspension, la vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport é la solution est supérieure à 20 mm. h- 1.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape de cryopréservation de la composition issue de l'étape (a). Lorsque le procédé selon l'invention, comprend une étape de cryoconservation de la composition issue de l'étape (a), ledit procédé comprend également une étape de décongélation de la composition cryoconservée.
Selon un mode de réalisation, l'étape (b) comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ;
*la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a);
*la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a) (b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) issue de l'étape (b2) ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b4) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la différence de densité entre la densité de la solution issue de l'étape (b5) et la densité moyenne des éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (b5) vérifie l'inégalité précitée à l'étape (b).
Dans ce mode de réalisation, l'étape (b4) d'ajustement du pH de la solution (B) est réalisée en amont de l'étape (b3) de stérilisation de la solution (B).
Composition selon l'invention pour son utilisation
Selon un autre aspect, l'invention concerne la composition selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament.
Avantageusement, la composition biocompatible selon l'invention présente des caractéristiques rhéologiques et une vitesse relative des éléments cellulaires particulièrement adapté pour son utilisation en thérapie cellulaire.
De façon préférée, la composition peut être utilisée dans le traitement de maladies en thérapie cellulaire.
La vitesse relative des éléments cellulaires permet avantageusement de maîtriser la quantité d'éléments cellulaires dans un volume de composition donné.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention peut être utilisée en usage multiple. En d'autres termes, la composition peut être utilisée pour réaliser plusieurs injections tout en conservant la viabilité des éléments cellulaires, et ce, même si les injections sont espacées d'une période de plusieurs heures.
Avantageusement, la vitesse relative des éléments cellulaires permet d'injecter pour un volume constant une quantité d'éléments cellulaires présentant un faible écart type, préférentiellement un écart type inférieur à 20%.
Préférentiellement, la composition selon l'invention peut être utilisée en tant que composition injectable.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention peut être utilisée en injection à l'aide d'un moyen d'injection au niveau du site d'injection. Préférentiellement, ledit moyen d'injection est une canule.
Avantageusement, la maîtrise des caractéristiques rhéologiques de la composition selon l'invention permet d'optimiser l'administration des éléments cellulaires et, par conséquent, des cellules thérapeutiques de manière précise et efficace. La maîtrise de ces paramètres permet d'ajuster à façon le débit d'injection, le volume d'injection et ainsi d'assurer une répartition homogène des éléments cellulaires dans la zone d'intérêt.
Kit 1
Selon un autre aspect, l'invention concerne un kit comprenant :
- une composition biocompatible selon l'un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit ; et
- un moyen d'injection, préférentiellement une canule.
Avantageusement, le kit selon l'invention permet, pour le praticien, d'avoir tous les éléments nécessaires pour optimiser l'efficacité de l'injection des éléments cellulaires.
Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend :
- une canule
-une composition biocompatible selon l'un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit dans laquelle les éléments cellulaires présentent une plus grande dimension inférieure à 0,8 fois le plus petit diamètre interne de la canule, préférentiellement inférieure à 0,75, notamment comprise entre 0,2 et 0,7.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le kit selon l'invention comprend une composition biocompatible selon l'un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit sous forme solide.
Préférentiellement, le kit selon l'invention comprend également de l'eau.
Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend également un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
Kit 2 :
Enfin, selon un dernier aspect, l'invention concerne un kit comprenant :
- une préparation (1) biocompatible comprenant au moins un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules ; et au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules ;
- une préparation (2) biocompatible comprenant des éléments cellulaires, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) préférentiellement au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm ; de façon à ce que le mélange de la préparation (1) et la préparation (2) forme une composition présentant une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3, une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s, et une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1.
Selon un mode de réalisation préféré, la préparation (2) biocompatible comprend une solution.
Préférentiellement, le kit selon l'invention comprend également de l'eau.
Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend une préparation (1) biocompatible sous forme solide.
Selon un mode de réalisation, la préparation (1), sous forme solide, comprenant au moins un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules, et au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
Selon un mode de réalisation, le kit selon l'invention comprend également un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
L'objectif de cet exemple est d'évaluer la vitesse de sédimentation des éléments cellulaires dans différentes compositions, à savoir une composition comprenant des éléments cellulaires et une solution (A) saline équilibrée de Hank (HBSS) (hors invention), et la composition selon l'invention comprenant une solution (B) développée pour maintenir l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires et prévenir l'obstruction du système d'injection.
Après obtention des éléments cellulaires, ceux-ci ont été cryoconservés dans des flacons et conservés dans du liquide azoté. Les flacons comprenant les éléments ont ensuite été décongelés avec une estimation de 10 millions de cellules.
Dans le cadre de cet exemple, les éléments cellulaires sont un mélange de microtissus présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm, de cellules isolées et d'agrégats de cellules de neurones.
Les résultats de la caractérisation des éléments cellulaires ont permis de mesurer la densité et la plus grande dimension des éléments cellulaires, à savoir :
Densité des éléments cellulaires : 1056 kg/m3 ;
Plus grande dimension des éléments cellulaires : 200pm soit 0,0002 m.
La solution (B) décrite dans le tableau 1 ci-dessous a été préparée en conditions stériles et caractérisée dans le tableau 2. [Tableau 1]
[Tableau 2 ] La solution (A) a également été préparée en conditions stériles et caractérisée dans le tableau 3.
[Tableau 3]
Préparation des compositions :
Phase 1 : préparation des éléments cellulaires
Les flacons ont été retirés de l'azote liquide et placés dans un CryoPod à -180°C. Les flacons comprenant les éléments cellulaires ont été placés dans une enceinte thermostasée à 37°C et retirés lorsqu'il ne restait plus qu'un petit morceau de glace (=2min).
Après une légère remise en suspension des cellules, le contenu a été transféré dans un tube de 25 ml contenant 9 ml de HBSS (calcium, magnésium, glucose), à température ambiante.
Les flacons ont été rincés avec 1 ml de HBSS (calcium, magnésium, glucose) pour recueillir le maximum de d'éléments cellulaires
Le tube de 25 ml a été centrifugé à 300 G, 5 minutes, et le maximum du surnageant a été éliminé avec P1000 puis P20.
Les éléments cellulairesont été remisen suspension dans 1 ml de HBSS (calcium, magnésium, glucose).
Phase 2 : Aliquoter les échantillons
Un volume et une concentration indéterminés de la suspension cellulaire ont été aliquotés dans deux tubes Eppendorf de 1,5 ml.
Les tubes de l,5mL ont été centrifugés à 300G, 5min. et le maximum du surnageant a été éliminé avec P1000 puis P20.
Dans un échantillon, les éléments cellulaires ont été remis en suspension dans 1 ml de HBSS (solution (A)) et dans l'autre dans 1 ml de solution (B).
Phase 3 : Évaluation de la vitesse de sédimentation
Les tubes ont été installés sur l'appareil assemblé pour prendre des photos.
Des photos ont été prises à chaque minute pendant 12 heures, voir Figure 1. Avec le logiciel Image J, un suivi manuel des trajectoires des éléments cellulaires, sur un film en time lapse enregistré avec la caméra, a été effectué afin d'évaluer la vitesse de sédimentation.
Une moyenne de 5 vitesses de sédimentation d'éléments cellulaires dans la solution (B), au cours de 10/12 trajectoires, a été prise pour évaluer la valeur de la vitesse de sédimentation maximale. Dans la solution (A), seules 3 vitesses de d'éléments cellulaires, au cours de 4 trajectoires, ont été prises pour déterminer la valeur en raison de la sédimentation rapide et de la difficulté à suivre exactement le même élément cellulaire.
La vitesse de sédimentation maximale calculée (moyenne de 5 vitesses maximales pour la solution (B) et moyenne des 3 vitesses maximales pour la solution (A) de microtissus) est :
* d'environ 363mm/h dans la solution (A) hors invention ;
* d'environ l,66mm/h dans la solution (B) selon l'invention, dans laquelle la différence de densité entre la solution et la densité moyenne des éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (b5) vérifie l'inégalité [Math 1],
Le tableau 4 ci-dessous vérifie l'inégalité [Math 1] pour la solution (A) et la solution (B) avec Vc = 5,56*10-6m.s-l.
[Tableau 4]
Conclusions :
La composition selon l'invention comprenant les éléments cellulaireset la solution (B) permet de maintenir en suspension lesdits éléments cellulaires en suspension dans ladite solution (B) pendant plusieurs heures. Au sein de la composition selon l'invention, certains éléments cellulaires sont encore en suspension après 12 heures de sédimentation.
En revanche, la composition hors invention, comprend les éléments cellulaires et la solution (A) ne permet pas de maintenir durablement les éléments cellulaires en suspension dans ladite solution (A). Les éléments cellulaires sédimentent très rapidement dans les solutions à faible viscosité et sans correspondance de densité, comme le HBSS (calcium, magnésium, glucose) avec une valeur de viscosité au repos d'environ 1 mPa.s et une densité d'environ l,0038g/cm.3
Exemple 2 :
L'objectif de cet exemple est d'évaluer la viabilité des éléments cellulaires après 12h de sédimentation au sein de la composition selon l'invention.
Pour la réalisation de cet exemple, la composition selon l'invention comprend les éléments suivants :
[Tableau 5]
[Tableau 6] Les résultats de la caractérisation des éléments cellulaires ont permis de mesurer la densité et la plus grande dimension des éléments cellulaires, à savoir :
Densité des éléments cellulaires : 1065 kg/m3 ;
Plus grande dimension des éléments cellulaires : 200pm soit 0,0002 m;
Dans le contexte de cet exemple, la durée de sédimentation est de 12 heures, ce qui correspond à une borne maximale de stabilité dans le cadre de l'utilisation de la composition selon l'invention en thérapie cellulaire.
Protocole expérimental Conditions
Les lots de production sont référencés par le préfixe « PAR », suivi d'un indicatif incrémental allant de 19 à 22. Ils correspondent à des lots de production d'éléments cellulaires successifs.
1) Pour chaque lot, on prépare deux types d'échantillons :
Contrôle : Une suspension d'éléments cellulaires resuspendus dans un milieu de culture cellulaire de référence, à un ratio de20% de volume d'éléments cellulaires et 80 % de milieu de culture de référence.
Composition selon l'invention : Une suspension d'éléments cellulaires resuspendus dans une solution, à un ratio de 20% de volume d'éléments cellulaires et 80 % de solution.
2) Une fois les échantillons préparés, ces-derniers sont conservés en tubes fermés à température ambiante pendant 12h.
3) Leséléments cellulairessont ensuite rincésdans un excès de milieude culture de référence.
4) Les éléments cellulaires sont ensuite remis en culture pendant 24h dans un milieu de culture de référence.
5) La viabilité est mesurée. Le résultat est exprimé en normalisant la valeur de viabilité de la condition d'immersion dans la solution par la viabilité obtenue dans la condition de contrôle.
Résultats
Les résultats de cet exemple sont décrits à la figure 2. Cette expérience montre une baisse de viabilité moyenne autour de 25% après une immersion de 12h dans la solution considérée, par rapport à un contrôle de 12h dans un milieu de culture de référence. Dans le cadre de l'exemple, cette baisse de viabilité est acceptable compte-tenu du critère d'acceptation de 70% de viabilité relative.
Exemple 3 : Evaluation de l'impact de la procédure d'injection de la composition selon l'invention sur la viabilité des éléments cellulaires.
L'objectif de cet exemple est d'évaluer l'impact de la procédure d'injection de la composition selon l'invention sur la viabilité des éléments cellulaires.
Dans le contexte de l'invention, il est important de vérifier que la viscosité de la solution, nécessaire au maintien de l'homogénéité de répartition des éléments cellulaires, n'induit pas des efforts de cisaillement trop importants pendant l'injection, qui pourraient dégrader la viabilité des cellules.
L'expérience consiste à comparer la viabilité d'un volume connu de composition selon l'invention ayant subi une procédure d'injection dans les conditions de l'invention, à la viabilité d'un volume connu de composition selon l'invention n'ayant pas subi de procédure d'injection.
Les effets de cisaillements subis au cours de l'injection pouvant avoir un effet différé sur la viabilité des cellules, la viabilité des éléments cellulaires ayant subi une procédure d'injection est mesurée immédiatement après l'injection, puis après 24h de remise en culture dans un milieu de culture de référence.
La composition selon l'invention utilisée au cours de cet exemple présente la même composition (tableau 5) et les mêmes caractéristiques rhéologiques (tableau 6) que la composition selon l'invention décrite dans l'exemple 2.
Le protocole d'injection comprend les étapes suivantes : a) Préparation de la composition selon l'invention selon le procédé selon l'invention ; b) Remplir une seringue de la composition selon l'invention ; c) Injecter la composition selon l'invention à l'aide de la seringue de l'étape b) dans une canule avec un débit d'injection de 50pL.min ; d) Injecter la composition selon l'invention à l'aide de la canule sur une matrice à un débit compris entre 18pL à 2pL par minute ; e) Rincer la composition selon l'invention et resuspendre les éléments cellulaires dans un milieu de culture ; f) Mettre le milieu de culture comprenant les éléments cellulaires dans un incubateur pendant 24h.
La viabilité des éléments cellulaires est mesurée à l'issue de l'étape e) et à l'issue de l'étape f). L'expérience a été réalisée 3 fois.
Résultats :
Les mesures de viabilité décrit à la figure 3 ne montrent pas d'impact significatif de la procédure d'injection sur la viabilité dans les conditions de l'exemple. La légère baisse observée directement après l'injection pourrait traduire une baisse transitoire de l'activité métabolique des cellules, qui n'est cependant pas retrouvée après 24h de culture.
Par conséquent, la composition selon l'invention peut être utilisée en tant que composition injectable. d'une composition selon l'invention via une mesure rhéologique en en oscillation
Pour la réalisation de cet exemple, la composition selon l'invention comprend une solution caractérisée dans le tableau 7 ainsi que des éléments cellulaires.
[Tableau 7]
Les éléments cellulaires de la composition utilisée dans le cadre de cet exemple sont un mélange de microtissus présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm, de cellules isolées et d'agrégats de cellules de neurones.
Enfin, certains paramètres physicochimiques de la composition selon l'invention ont été caractérisé dans le tableau 8 ci-dessous.
[Tableau 8]
Le comportement de la composition selon l'invention a été vérifiée par des mesures rhéologiques classiques en balayage en oscillation avec un rhéomètre anton Paar MCR 302. La fréquence angulaire est constante et fixée à 10 rad/s. La déformation de cisaillement y varie de 0.001 à 10 % et la température est constante et régulée à 20°C.
Deux paramètres ont été mesurés pour caractériser les propriétés viscoélastiques de la composition: le module de stockage (G') et le module de Perte (G'') :
-Le module de stockage (G') représente la partie élastique de la déformation. Il est lié à la capacité du matériau à emmagasiner de l'énergie pendant la déformation et est proportionnel à la rigidité du matériau. Il détermine donc l'importance de sa réponse élastique et par conséquent associé à un comportement de solide élastique, donc de gel. -Le module de Perte (G”) représente la partie visqueuse de la déformation. Il est lié à la dissipation d'énergie sous forme de chaleur et est proportionnel au comportement amortissant du matériau. Il détermine l'importance de sa réponse visqueuse et par conséquent associé à un comportement de fluide.
Dans le cadre d'un matériau rigide ou structuré, le module de stockage (G') sera supérieur au module de Perte (G''). A l'inverse dans le cadre d'un matériau liquide, le module de Perte (G'') sera supérieur au module de stockage (G').
Les résultats présentés à la figure 4 ont montré que G1' était constant selon les différentes déformations de cisaillement à température constante et toujours inférieur à G" traduisant un comportement liquide de la composition.
Exemple 4 : Etude de la viabilité des éléments cellulaires dans une solution comprenant du CMC.
L'objectif de cet exemple est d'évaluer la viabilité des éléments cellulaires après 12h d'immersion au sein d'une solution comprenant du CMC.
Les différentes solutions utilisées au sein de cet exemple sont décrites dans le tableau 9 ci- dessous.
[Tableau 9]
Pour la réalisation de cet exemple, la solution M4 a été mélangée avec des éléments cellulaires avec un rapport de volume éléments cellulaire / solution contrôlé de façon à former une composition selon l'invention.
Dans le cadre de cet exemple, les éléments cellulaires sont un mélange de microtissus présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm, de cellules isolées et d'agrégats de cellules de neurones.
La composition selon l'invention a été conservées à température ambiante pendant 12 heures.
Les éléments cellulaires sont ensuite rincés dans un excès de milieu de culture de référence. Les microtissus sont ensuite récupérés et la viabilité est mesurée par un bioluminométrique de viabilité cellulaire. Le résultat est exprimé en signaux de luminescence renormalisés par le signal contrôle CM. Pour évaluer la viabilité cellulaire, 7 réplicas analytiques ont été effectués pour chaque condition.
Les résultats de cet exemple montrent un maintien de la viabilité de la composition selon l'invention comprenant la solution M4 et les éléments cellulaire (96% par rapport à un contrôle de 12h dans un milieu de culture de référence).
En conclusion, l'exemple 4 démontre que la composition selon l'invention, comprenant la solution M4 et des éléments cellulaires, permet de maintenir une viabilité cellulaire élevée après 12 heures d'immersion à température ambiante.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Composition biocompatible, comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amasde cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), ladite composition étant caractérisée par :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 ;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm. h-1.
[Revendication 2] Composition selon la précédente revendication, caractérisée en ce que au moins un élément cellulaire est un microtissu présentant une plus grande dimension d'au moins 50pm.
[Revendication 3] Composition biocompatible selon la précédente revendication, caractérisée en ce que l'osmolalité des éléments cellulairesdans la solution est comprise entre -180 et 360 mOsml.kg’1.
[Revendication 4] Composition biocompatible selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la solution comprend une solution comprenant au moins un ion choisi parmi l'ion sodium, l'ion calcium, l'ion chlore, l'ion potassium et leurs mélanges.
[Revendication s] Composition biocompatible selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la solution comprend une solution comprenant au moins un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
[Revendication s] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- Entre 0,01 et 0,9% en masse de NaCI par rapport à la masse totale de la solution ; et/ou
- Entre 0,01 et 0,04% en masse de CaCI2 par rapport à la masse totale de la solution ; et/ou
- Entre 0,01 et 0,05% en masse de KCI par rapport à la masse totale de la solution. [Revendication 7] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un élément cellulaire contenu dans un microcompartiment en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel.
[Revendication s] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que cellules constituant les éléments cellulaires sont des cellules matures et/ou des progéniteurs et/ou des cellules souches.
[Revendication 9] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que les cellules constituant les éléments cellulaires sont choisis parmi les cellules neurales, les cellules neuronales, les cellules glia les, les cellules cardiaques, les cellules de la rétine, les lymphocytes , les hépatocytes, les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses, les kératinocytes, les fibroblastes, les pré-adipocytes, les adipocytes, les cellules des îlots pancréatiques et leurs mélanges.
[Revendication 10] Composition biocompatible selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la fraction volumique des éléments cellulaires est comprise entre 0,01% et -60% en volume.
[Revendication 11] Composition biocompatible selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la solution comprend :
- de l'eau,
- au moins un agent de densité biocompatible
- au moins un agent de viscosité biocompatible, préférentiellement de poids moléculaire compris entre 0,05 MDa - 5MDa
[Revendication 12] Composition biocompatible selon la précédente revendication, caractérisée en ce qu'elle comprend également au moins un agent d'ajustement de l'osmolalité.
[Revendication 13] Composition selon la précédente revendication, caractérisée en ce que le au moins un agent de densité est choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol ou le sorbitol, et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
[Revendication 14] Composition selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que l'agent de viscosité est choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethyl cellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules. [Revendication 15] Composition selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- entre 0,01 et 30% en masse d'agent (s) de densité par rapport à la masse totale de la solution ; et/ou
- entre 0,01 et 8% en masse d'agent de viscosité par rapport à la masse totale de la solution.
[Revendication 16] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la composition est obtenue par la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) ;
(b) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition de l'étape (a) et une solution (B) et optionnellement la solution (A) de façon à ce que de façon à ce que la composition issue de l'étape (b) présente une densité comprise entre 0,8 et 2 g/ml et une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s ;
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), présentant :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 ;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm. h-1.
[Revendication 17] Composition selon l'une des précédentes revendications pour son utilisation dans le traitement de maladies en thérapie cellulaire.
[Revendication 18] Composition pour son utilisation selon la précédente revendication, en injection à l'aide d'une canule au niveau du site d'injection.
[Revendication 19] Procédé de préparation d'une composition biocompatible selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) Préparation ou récupération d'une composition comprenant une solution (A) et un ensemble d'éléments cellulaires dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) ;
(b) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition de l'étape (a) et une solution (B) et optionnellement la solution (A) de façon à ce que de façon à ce que la composition issue de l'étape (b) présente une densité comprise entre 0,8 et 2 g/ml et une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s ;
(c) Optionnellement récupération de la composition biocompatible issue de l'étape (b), comprenant une solution et des éléments cellulaires en suspension dans ladite solution, dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s), présentant :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3 ;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm. h-1.
[Revendication 20] Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
1) Mise en culture d'au moins un élément cellulaire ;
2) Rinçage de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 1) ;
3) Centrifugation de la culture d'éléments cellulaires issues de l'étape 2) ;
4) Récupération d'une composition comprenant des éléments cellulaires issues de la centrifugation de l'étape 3), dont au moins deux éléments cellulaires présentent une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s).
[Revendication 21] Procédé selon la précédente revendication, caractérisée en ce que au moins un élément cellulaire comprend au moins une cellule encapsulée, préférentiellement dans de l'alginate.
[Revendication 22] Procédé selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que la composition de l'étape (a) comprend une solution dans laquelle lesdits éléments cellulaires sont en suspension.
[Revendication 23] Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la composition de l'étape (a) présente une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution supérieure à 20mm. h-1.
[Revendication 24] Procédé selon l'une des revendications 19 à 23, caractérisé en ce que l'étape (b) comprend la mise en œuvre des étapes suivantes : (bl) Caractérisation d'au moins un paramètre rhéologique choisi parmi ; *la densité de l'élément cellulaire ayant la plus faible densité et la densité de l'élément cellulaire ayant la plus grande densité desdits éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a);
*la densité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la viscosité de la composition issue de l'étape (a) ;
*la plus grande dimension des éléments cellulaires présent dans la composition issue de l'étape (a)
(b2) Préparation d'une solution (B) comprenant au moins un agent de densité et/ou au moins un agent de viscosité et de l'eau ;
(b3) Stérilisation de la solution (B) issue de l'étape (b2) de façon à obtenir une solution (B) stérilisée ;
(b4) Optionnellement, ajustement du pH de la solution (B) stérilisée de l'étape (b3) ;
(b5) Préparation d'une composition biocompatible comprenant les éléments cellulaires de la composition issue de l'étape (a) avec la solution (B) stérilisée issue de l'étape (b3) ou (b4) et optionnellement avec la solution (A) de façon à ce que la composition issue de l'étape (b5) présente :
- une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3;
- une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C est comprise entre 0,01 et 1,5 Pa.s ; et
- une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20mm. h-1.
[Revendication 25] Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que l'étape (b2) de préparation de la solution (B) est réalisée en ajoutant au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules.
[Revendication 26] Procédé selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisé en ce que l'étape (b2) de préparation de la solution (B) est réalisée en ajoutant un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethylcellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules. [Revendication 27] Procédé de préparation selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce que l'étape (b2) de préparation de la solution (B) comprend au moins un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium ( KCI ), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
[Revendication 28] Procédé de préparation selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que l'étape (b2) est réalisée sous agitation.
[Revendication 29] Kit comprenant :
- une composition biocompatible selon l'une des revendication 1 à 18 ; et
- un moyen d'injection, préférentiellement une canule.
[Revendication 30] Kit selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la composition biocompatible est sous forme solide.
[Revendication 31] Kit comprenant :
- une préparation (1) biocompatible comprenant au moins un agent de viscosité biocompatible choisi parmi le PVA, le carboxyméthyl cellulose (CMC), le méthylcellulose, l'hydroxyethyl cellulose, l'éthylhydrocyethylcellulose, l'hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC), l'alginate, le pullulane, le chitosan, la gomme de xanthan, la gomme de gellane, le polyacrilamide, le polyvinylpyrrolidone, le polyethylene oxide, la caséine, le collagene, le hyaluronate de sodium et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules ; et au moins un agent de densité biocompatible choisi parmi le dextran, le mannitol, le NaCI, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges, ou des formes modifiées de ces molécules ;
- une préparation (2) biocompatible comprenant des éléments cellulaires, lesdits éléments cellulaires étant choisis parmi des cellules isolées, des microtissus cellulaires, des amas de cellules et leurs mélanges, au moins deux desdits éléments cellulaires présentant une densité et/ou une taille et/ou un nombre de cellules différent(s) ; de façon à ce que le mélange de la préparation (1) et la préparation (2) forme une composition présentant une densité comprise entre 800 et 2000 kg/m3, une viscosité au repos mesurée à l'aide d'un rhéomètre à 25°C comprise entre 0,01 Pa.s et 1,5 Pa.s, et une vitesse relative maximale des éléments cellulaires par rapport à la solution inférieure à 20 mm.h-1.
[Revendication 32] Kit selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la préparation (2) comprend une solution.
[Revendication 33] Kit selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisé en ce qu'il comprend de l'eau. [Revendication 34] Kit selon l'une des revendications 30 à 33, caractérisé en qu'il comprend au moins un élément choisi parmi du chlorure de sodium (NaCI), du chlorure de calcium (CaCI2), du chlorure de potassium (KCI), du chlorure de magnésium (MgCI2) et leurs mélanges.
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