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WO2025084581A1 - 편도 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 복막 섬유증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

편도 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 복막 섬유증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2025084581A1
WO2025084581A1 PCT/KR2024/012286 KR2024012286W WO2025084581A1 WO 2025084581 A1 WO2025084581 A1 WO 2025084581A1 KR 2024012286 W KR2024012286 W KR 2024012286W WO 2025084581 A1 WO2025084581 A1 WO 2025084581A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tonsil
mesenchymal stem
peritoneal
derived mesenchymal
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/KR2024/012286
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강덕희
김달아
조철호
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ewha Womans University
Original Assignee
Ewha Womans University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020240080455A external-priority patent/KR20250056092A/ko
Application filed by Ewha Womans University filed Critical Ewha Womans University
Publication of WO2025084581A1 publication Critical patent/WO2025084581A1/ko
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/14—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis
    • A61M1/28—Peritoneal dialysis ; Other peritoneal treatment, e.g. oxygenation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving, preventing or treating peritoneal fibrosis, comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • Fibrosis is a disease in which abnormal production, accumulation, and deposition of extracellular matrix (ECM) by fibroblasts occur, and is the final result of a chronic inflammatory response induced by various stimuli including persistent infection, autoimmune response, allergic response, chemical insult, and tissue damage.
  • ECM extracellular matrix
  • peritoneal fibrosis in particular is characterized by being caused by long-term peritoneal dialysis for the treatment of renal failure, and is considered a major cause of peritoneal structural changes and ultrafiltration disorders in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD).
  • Peritoneal fibrosis is characterized by epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of peritoneal mesothelial cells (MCs) and accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins.
  • EMT epithelial-to-mesenchymal transition
  • MCs peritoneal mesothelial cells
  • ECM extracellular matrix
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor- ⁇ is known to play a key role in the development of peritoneal fibrosis.
  • GPR 78/94 which is related to the level of EMT
  • EMT inhibition can be considered a therapeutic target for preserving peritoneal function.
  • adult stem cells are known to have the ability to regenerate organs and regulate immune responses, and related research is being actively conducted.
  • the sources of adult stem cells currently used in clinical and research include bone marrow, adipose cells, and umbilical cord blood.
  • conventional adult stem cells have limitations in use because the process of extracting tissue is invasive and it is difficult to obtain a sufficient amount.
  • Recently, research results on extracting mesenchymal stem cells from tonsil tissue have been reported, and the tonsil tissue is attracting attention as a new source of adult stem cells. Tonsil-derived stem cells exhibit the same level of stem cell function as other adult stem cells, and can be obtained from tissue discarded during tonsillectomy surgery, so they have the advantage of relatively smooth supply of materials.
  • a composition containing tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof has the effect of inhibiting EMT of the peritoneum and improving, preventing or treating peritoneal fibrosis.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating peritoneal fibrosis comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a peritoneal dialysis fluid containing tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating peritoneal fibrosis comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell refers to an undifferentiated stem cell having self-replication ability and the ability to differentiate into two or more new cells, derived from the tonsil, which is a tissue located in the back of the throat and nose and primarily defends the body from substances such as bacteria invading from the outside, and at the same time functions as a lymphoepithelial immune tissue.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention have the advantages of easy acquisition of the original tissue, the tonsil, compared to stem cells derived from other sources, reuse of the tonsil tissue discarded after surgery, and a very high initial yield.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention have anti-fibrotic and antioxidant properties. These properties are differentiated from other derived mesenchymal stem cells in that they have high expression of anti-fibrotic factors (HGF, BMP7) and antioxidant enzymes (Catalase, glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD)).
  • HGF anti-fibrotic factors
  • BMP7 antioxidant enzymes
  • Catalase, glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD) antioxidant enzymes
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention express at least one selected from the group consisting of HGF, BMP7, Catalase, GPx, and SOD at a high level.
  • This high level of expression refers to, for example, an expression level that is at least 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 150%, 200%, 300%, 400% or more high compared to adipose-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, and/or bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention have the effect of promoting the expression of ZO-1 and E-cadherin, known as epithelial cell markers, and inhibiting the expression of fibronectin and ⁇ -SMA, known as mesenchymal cell markers, and are differentiated from other derived mesenchymal stem cells in that they exhibit superior E-cadherin promoting and fibronectin inhibiting effects.
  • the “tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium” refers to a culture medium or supernatant obtained by culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells and from which tonsil-derived mesenchymal stem cells have been removed, and can be used interchangeably with “tonsil-derived mesenchymal stem cell culture supernatant,” “tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned culture medium,” or “tonsil-derived mesenchymal stem cell culture medium.”
  • the conditioned medium of tonsil-derived mesenchymal stem cells may be a culture medium, a culture supernatant, a concentrate thereof, or a freeze-dried product thereof obtained after culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells and removing the cells.
  • Tonsil-derived mesenchymal stem cells can be conventionally cultured using a stem cell culture medium.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell culture medium may be obtained by culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells obtained from tonsil tissue in a serum or serum-free medium. The supernatant obtained after removing stem cells and macromolecules by centrifugation or filtration using a filter can be used.
  • the obtained supernatant can be used as it is or can be used as a concentrate obtained by concentration.
  • Culture medium and culture conditions for culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells are well known in the art to which the present invention pertains, and those skilled in the art can appropriately select or modify them and use them.
  • the above medium is a medium suitable for maintaining and storing the same cell type as tonsil-derived mesenchymal stem cells, and may be a DMEM medium supplemented with serum.
  • the serum may be, but is not limited to, fetal bovine serum (FBS), and may be 1 to 10 wt% based on the total weight of the serum medium. If necessary, it may include antibiotics, antifungal agents, and mycoplasma inhibitors, and these may be 1 wt% based on the total weight of the medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • Antibiotics include antibiotics commonly used in cell culture, such as penicillin-streptomycin, antifungal agents include amphotericin-B (fungizone), and mycoplasma inhibitors include, but are not limited to, gentamicin, ciprofloxacin, and tylosin.
  • the medium may be a serum-free medium.
  • the serum-free medium may be a low glucose DMEM medium.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium is obtained by culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells in serum-free low glucose DMEM and concentrating the supernatant after removing the cells.
  • EMT When EMT is induced in peritoneal cells, the expression of ZO-1 and E-cadherin, known as epithelial cell markers, decreases, and the expression of ⁇ -SMA and fibronectin, known as mesenchymal cell markers, increases.
  • treatment of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium according to the present invention can minimize EMT-related effects and significantly enhance therapeutic efficacy by enhancing the expression of ZO-1 and E-cadherin and decreasing the expression of ⁇ -SMA and fibronectin in peritoneal cells in which EMT is induced.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium according to the present invention have a superior effect in enhancing E-cadherin expression and inhibiting fibronectin expression compared to mesenchymal stem cells derived from other sources, such as adipose-derived mesenchymal stem cells (AD) or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM).
  • AD adipose-derived mesenchymal stem cells
  • BM bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have the effect of inhibiting the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of the peritoneum.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • EMT means a phenotypic transformation of epithelial cells into mesenchymal cells.
  • EMT is a phenomenon in which tissues acquire motility as cell-to-cell bonds become loose and cytoskeletons change, and cells lose their original cell phenotype and transform into mesenchymal cell phenotypes.
  • EMT When EMT is induced, it can lead to the accumulation of fibroblasts, and the induction of EMT is recognized as an important initial mechanism of peritoneal fibrosis.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have the advantage of significantly enhancing the therapeutic effect by inhibiting the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of the peritoneum from the beginning.
  • EMT epithelial-to-mesenchymal transition
  • peritoneal fibrosis As the number of dialysis cycles increases, symptoms related to fibrosis may significantly worsen and progress. In the characteristics of such peritoneal fibrosis, it is very important to delay the onset of fibrosis symptoms in the early stage and minimize the worsening of symptoms.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention can have excellent efficacy in treating and minimizing the main symptoms of the early mechanism of peritoneal fibrosis as described above, significantly increasing the possible period of peritoneal dialysis, and preventing secondary diseases caused by peritoneal dialysis.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium according to the present invention have the effect of inhibiting the expression of mesenchymal cell-related factors.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have the effect of inhibiting the expression of at least one gene selected from the group consisting of ⁇ -SMA and Fibronectin.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium according to the present invention have the effect of increasing the expression of epithelial cell-related factors.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of promoting the expression of at least one gene selected from the group consisting of ZO-1 and E-cadherin.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of suppressing the expression of at least one gene selected from the group consisting of ⁇ -SMA and Fibronectin, and promoting the expression of at least one gene selected from the group consisting of ZO-1 and E-cadherin.
  • peritoneal dialysis fluid continuous exposure to peritoneal dialysis fluid is known to promote peritoneal EMT and induce oxidative stress, inflammatory damage, endoplasmic reticulum stress, apoptosis, and inflammatory bodies within the tissue, ultimately leading to peritoneal fibrosis.
  • oxidative stress inflammatory damage
  • endoplasmic reticulum stress apoptosis
  • inflammatory bodies within the tissue, ultimately leading to peritoneal fibrosis.
  • the mechanism of peritoneal fibrosis through the TGF- ⁇ signaling pathway is well known, and the induction of oxidative stress is known to be involved in the initial mechanism of peritoneal EMT.
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium have the effect of minimizing actions related to EMT by suppressing oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, apoptosis, inflammatory bodies, etc.
  • oxidative stress increases within the cell, and the expression of NADHP oxidase 4 (NOX4), known as an enzyme generating reactive oxygen species (ROS), increases, and the expression of oxidative stress-related markers such as 8-OHdG (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine), NT (nitrotyrosin) and 4-HNE (4-Hydroxynonenal) increases, and the expression of SOD2 and GSH (Glutathione) decreases.
  • NOX4 NADHP oxidase 4
  • ROS reactive oxygen species
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells according to the present invention or the conditioned medium thereof can suppress oxidative stress within the cell by reducing the protein expression of NOX4, 8-OHdG and NT, and promoting the protein expression of SOD2 and GSH (Glutathione), thereby minimizing the action related to EMT and significantly enhancing the therapeutic efficacy.
  • NOX4, 8-OHdG and NT reducing the protein expression of NOX4, 8-OHdG and NT
  • SOD2 and GSH Glutathione
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have the effect of suppressing intracellular oxidative stress.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of inhibiting the expression of any one or more selected from the group consisting of NOX4, 8-OHdG, and NT.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of promoting the expression of at least one selected from the group consisting of SOD2 and GSH.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of suppressing the expression of at least one selected from the group consisting of NOX4, 8-OHdG and NT, and promoting the expression of at least one selected from the group consisting of SOD2 and GSH.
  • endoplasmic reticulum stress-related markers such as GRP 78/94 (glucose regulatory protein 78/94), IRE1 (inositol-requiring enzyme 1), ATF6 (Activating transcription factor 6), CHOP (C/EBP homologous protein), p-PERK (phosphorylated protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase), p-eIF2 ⁇ (phosphorylated Eukaryotic Initiation Factor 2 alpha), and ATF4 (Activating transcription factor 4), also increases.
  • GRP 78/94 glucose regulatory protein 78/94
  • IRE1 inositol-requiring enzyme 1
  • ATF6 Activating transcription factor 6
  • CHOP C/EBP homologous protein
  • p-PERK phosphorylated protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase)
  • p-eIF2 ⁇ phosphorylated Eukaryotic
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention can minimize the effects related to EMT and significantly enhance the therapeutic efficacy by suppressing endoplasmic reticulum stress by reducing the protein expression of GRP 78, IRE1, ATF6, and CHOP.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have an effect of suppressing endoplasmic reticulum stress.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of inhibiting the expression of any one or more selected from the group consisting of GRP 78, IRE1, ATF6, and CHOP.
  • apoptosis increases, and the expression of Bcl-2 (B-cell lymphoma-2), which is an apoptosis-related marker, decreases, and the expression of Bax (Bcl-2-associated X protein), Bad (Bcl-2-associated agonist of cell death), cytochrome C, cleaved caspase-3, p53, and cleaved PARP (poly ADP ribose polymerase) increases.
  • Bcl-2 B-cell lymphoma-2
  • Bax Bcl-2-associated X protein
  • Bad Bcl-2-associated agonist of cell death
  • cytochrome C cleaved caspase-3
  • p53 cleaved PARP (poly ADP ribose polymerase) increases.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention can minimize the effects related to EMT and significantly enhance the therapeutic efficacy by inhibiting apoptosis by reducing the protein expression of Bax, cleaved caspase-3, and cleaved PARP.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have an effect of inhibiting apoptosis.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of inhibiting the expression of at least one selected from the group consisting of Bax, cleaved caspase-3, and cleaved PARP.
  • NLRP3 inflammasome-related markers such as NLRP3 (NLR family pyrin domain containing 3), ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), cleaved-capase-1, and IL-1 ⁇ (Interleukin 1 beta), also increases.
  • NLRP3 NLR family pyrin domain containing 3
  • ASC Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
  • cleaved-capase-1 cleaved-capase-1
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 beta
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have an effect of suppressing inflammatory bodies.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cell or the conditioned medium thereof according to the present invention has the effect of inhibiting the expression of at least one selected from the group consisting of NLRP3 and ASC.
  • a composition containing tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof was administered to a rat model induced with peritoneal fibrosis, the absorption and transport functions of the peritoneum were improved and the peritoneal thickness was reduced.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention have an effect of preventing or treating peritoneal fibrosis.
  • peritoneal drainage SOD activity is reduced in a rat animal model in which peritoneal fibrosis is induced, and in particular, peritoneal mesothelial cells are known to synthesize hepatocyte growth factor (HGF) and bone morphogenetic factor 7 (BMP7), which are known as anti-fibrotic factors, and high glucose or TGF- ⁇ is known to reduce the production of peritoneal HGF and BMP7, so it can be a good marker for understanding the peritoneal anti-fibrotic mechanism by peritoneal dialysis.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • BMP7 bone morphogenetic factor 7
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium according to the present invention contain a high content of at least one selected from the group consisting of HGF, BMP7, Catalase, GPx, and SOD.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof according to the present invention exhibit antifibrotic and antioxidant properties by containing a high content of HGF and BMP7, known as antifibrotic factors, and Catalase, GPx, and SOD, known as antioxidant enzymes.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof express a higher content of the antifibrotic factors and antioxidant enzymes than adipose-derived mesenchymal stem cells (AD) or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM), and exhibit superior antifibrotic and antioxidant properties.
  • AD adipose-derived mesenchymal stem cells
  • BM bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • peritoneal fibrosis refers to a state in which the peritoneum is fibrosed, which means that fibrous cells are abnormally formed in the peritoneum.
  • peritoneal fibrosis refers to a state in which the peritoneum is fibrosed, which means that fibrous cells are abnormally formed in the peritoneum.
  • it is used to encompass, but is not limited to, retroperitoneal fibrosis or encapsulating peritoneal sclerosis. Fibrosis of the peritoneum can occur, for example, due to peritoneal dialysis.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of peritoneal fibrosis by administering the composition.
  • treatment means any action that improves or beneficially changes the symptoms of the disease by administering the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, those commonly used in the art, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • composition of the present invention may include, but is not limited to, diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when formulated as an oral solid preparation, it includes tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations may include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., and include, but are not limited to, lubricants, such as magnesium stearate and talc.
  • excipient for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when formulated as an oral liquid, it includes a suspension, an oral solution, an emulsion, a syrup, etc., and includes, but is not limited to, a diluent such as water or liquid paraffin, a wetting agent, a sweetener, an air freshener, a preservative, etc.
  • a diluent such as water or liquid paraffin, a wetting agent, a sweetener, an air freshener, a preservative, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when formulated for parenteral use, it includes a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a lyophilized preparation, and a suppository.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include, but are not limited to, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • Bases for suppositories include, but are not limited to, witepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin.
  • the composition may be administered in single or multiple doses at a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount of the present invention means an amount sufficient to prevent or treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical prevention or treatment, and the effective dosage level may be determined according to factors including the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the excretion rate, the treatment period, drugs combined with or used simultaneously with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or the conditioned medium thereof may be administered at 0.0001 to 100 mg/kg per day, and the administration may be administered once a day or in several divided doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, livestock, and humans by various routes, for example, but not limited to, oral administration, intrathecal, intra-auricular, intraperitoneal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine epidural, sublingual, or intracerebrovascular injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain 0.01 to 95 wt%, preferably 1 to 80 wt%, of tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects by taking all of the above factors into consideration, and this can be easily determined by those skilled in the art.
  • subject of the present invention includes an animal or human whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • administration of the pharmaceutical composition according to the present invention By administering the therapeutic composition according to the present invention to a subject, peritoneal fibrosis can be effectively prevented and treated.
  • administration means introducing a given substance into a human or animal by any appropriate method, and the route of administration of the therapeutic composition according to the present invention may be oral or parenteral administration through any common route as long as it can reach the target tissue.
  • the therapeutic composition according to the present invention may be administered by any device through which the active ingredient can move to the target cell.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating peritoneal fibrosis, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells “tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium” or “peritoneal fibrosis” are as described above.
  • subject of the present invention means any animal that has developed or may develop peritoneal fibrosis, and typically may be an animal that can show a beneficial effect by treatment using the tonsil-derived mesenchymal stem cells of the present invention or a conditioned medium thereof, but includes without limitation any subject that has symptoms of peritoneal fibrosis or is likely to have such symptoms.
  • peritoneal fibrosis can be effectively prevented or treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention to the subject.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the tonsil-derived mesenchymal stem cells of the present invention or a conditioned medium thereof for preparing a medicament for preventing or treating peritoneal fibrosis.
  • Another aspect of the present invention provides a composition comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof for use in the prevention or treatment of peritoneal fibrosis.
  • Another aspect of the present invention provides a peritoneal dialysis fluid comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • the above-described tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium are as described above.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells or their conditioned medium of the present invention inhibit EMT of peritoneal cells, and therefore can be included in peritoneal dialysis fluid to improve, delay, prevent or treat peritoneal fibrosis and peritoneal fibrosis.
  • the peritoneal dialysis solution comprising the tonsil-derived mesenchymal stem cells of the present invention or a conditioned medium thereof may include at least one selected from the group consisting of an osmotic agent, a buffer, an electrolyte, and a combination thereof.
  • the osmotic agent may include glucose, a glucose polymer (e.g., maltodextrin, icodextrin), a glucose polymer derivative, a cyclodextrin, a modified starch, a hydroxyethyl starch, a polyol, a fructose, an amino acid, a peptide, a protein, an amino sugar, glycerol, N-acetyl glucosamine (NAG), or a combination thereof.
  • the buffer may include bicarbonate, lactate, pyruvate, acetate, citrate, tris (i.e., trishydroxymethylaminomethane), an amino acid, a peptide, or a combination thereof.
  • Electrolytes may include sodium, potassium, magnesium, calcium, and chloride.
  • the peritoneal dialysis fluid of the present invention may contain one or more dialysis components (elements or components of the dialysis solution) and a therapeutically effective amount of an effective substance, and includes tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof as a component for improving, alleviating, preventing or treating peritoneal fibrosis and peritoneal fibrosis.
  • the peritoneal dialysis fluid may be a dialysis concentrate, and the dialysis fluid may contain tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • the peritoneal dialysis fluid may be used as a single dialysis solution in a single container or as a dialysis unit of a separately contained or multi-chambered container, and may be administered to a patient simultaneously with or with a time difference from the dialysis fluid conventionally used in peritoneal dialysis.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving peritoneal fibrosis, comprising tonsil-derived mesenchymal stem cells or a conditioned medium thereof.
  • improvement of the present invention means any act by which peritoneal fibrosis is improved or beneficially changed by administration of the composition of the present invention.
  • the mesenchymal stem cells derived from the unilateral tonsil or their conditioned medium are preferably included in an amount of 0.00001 to 0.01 wt% relative to the food composition. If it is less than 0.00001 wt%, the effect is insignificant, and if it exceeds 0.01 wt%, the increase in effect relative to the amount used is insignificant, which is uneconomical.
  • the food composition of the present invention may be, for example, any one selected from among noodles, gum, dairy products, ice cream, meat, grains, caffeinated beverages, general beverages, chocolate, bread, snacks, confectionery, candy, pizza, jelly, alcoholic beverages, alcohol, vitamin complexes, and other health supplements, but is not necessarily limited thereto.
  • the food composition of the present invention when used as a food additive, it can be added as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to a conventional method.
  • the food composition includes a health functional food.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body according to Act No. 6727 on Health Functional Foods, and “functionality” refers to consumption for the purpose of obtaining a useful effect for health purposes, such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or physiological effects.
  • the food composition and health functional food of the present invention may include additional ingredients.
  • biotin, folate, pantothenic acid, vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, etc. may be included.
  • minerals such as chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), zinc (Zn), iron (Fe), and calcium (Ca) may be included.
  • amino acids such as cysteine, valine, lysine, and tryptophan may be included.
  • food additives such as preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), coloring agents (tar color, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrate, etc.), bleaching agents (sodium sulfite), bactericides (bleaching powder and high-purity bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), leavening agents (alum, D-potassium hydrogentartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (glucose), film-forming agents, antioxidants (butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), etc.), seasonings (MSG, monosodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcin, cyclamate, saccharin, sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), gum bases, antifoaming agents, solvent, solvent
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells of the present invention or their conditioned medium possess excellent peritoneal EMT inhibitory effects, they can be usefully used for improving and treating peritoneal fibrosis.
  • Figure 1 is an image (A) showing changes in cell morphology upon treatment with TGF- ⁇ under single culture conditions of peritoneal mesothelial cells (HPMCs) and co-culture conditions with tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSCs), and an image (B) and graph (C) showing changes in cell marker expression.
  • HPMCs peritoneal mesothelial cells
  • T-MSCs tonsil-derived mesenchymal stem cells
  • Figure 2 is an image (A) showing changes in cell morphology upon treatment with TGF- ⁇ under general culture conditions for peritoneal mesothelial cells (HPMC) and culture conditions treated with tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM), and an image (B) and graph (C) showing changes in cell marker expression.
  • HPMC peritoneal mesothelial cells
  • T-MSC CM tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • Figure 3 is a graph (A, B) and image (C) showing the change in cell marker expression according to treatment with each derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM, AD-MSC CM, BM-MSC CM) after treatment with TGF- ⁇ in mesothelial cells (Met5A).
  • Figure 4 is an image showing changes in oxidative stress upon treatment with TGF- ⁇ under single culture conditions of peritoneal mesothelial cells (HPMCs) and co-culture conditions with tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSCs) using DCF-DA staining (A) and MitoSox staining (B).
  • HPMCs peritoneal mesothelial cells
  • T-MSCs tonsil-derived mesenchymal stem cells
  • Figure 5 is an image showing the difference in NOX expression confirmed by immunostaining when TGF- ⁇ was treated under general culture conditions of peritoneal mesothelial cells (HPMC) and culture conditions treated with tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM).
  • HPMC peritoneal mesothelial cells
  • T-MSC CM tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • Figure 6 is an image showing the schedule and experimental group composition of animal experiments to establish a peritoneal dialysis rat model.
  • Figure 7 is an image showing the catheter insertion and monitoring process in a peritoneal dialysis rat model.
  • Figure 8 is an image showing the peritoneal thickness of the NC, PD, PP, and PV groups confirmed by Sirius Red staining in an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model.
  • Figure 9 is an image (A) and a graph (B) summarizing the protein expression of epithelial cell and mesenchymal cell markers ZO-1, E-cadherin, fibronectin, and ⁇ -SMA in all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) in an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model using an immunoblot method.
  • Figure 10 is an image showing the expression of SOD2 and nitrotyrosine (NT) in the NC, PD, PP, and PV groups confirmed through immunostaining in an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model.
  • NT nitrotyrosine
  • Figure 11 is an image (A) and a graph (B) summarizing the protein expression of 8-OHdG, NT, 4-HNE, SOD2, and GSH, which are involved in oxidative stress, in all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) of an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model, confirmed by immunoblotting.
  • Figure 12 is an image (A) and a graph (B) summarizing the protein expression of GRP 78/94, IRE1, ATF6, CHOP, p-PERK, p-eIF2 ⁇ , and ATF4 involved in endoplasmic reticulum stress in all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) of an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model, confirmed by immunoblotting.
  • Figure 13 is an image (A) and a graph (B) summarizing the protein expression of Bcl-2, Bax, Bad, cytochrome C, cleaved caspase-3, p53, and cleaved PARP, which are involved in apoptosis, in all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) of an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model, confirmed by immunoblotting.
  • Figure 14 is an image (A) and a graph (B) summarizing the protein expression of NLRP3, ASC, cleaved-capase-1, and IL-1 ⁇ involved in NLRP3 inflammasomes in all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) of an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model, confirmed by immunoblotting.
  • Figure 15 is a graph showing the change in body weight by week for all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) in an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model.
  • Figure 16 is an image showing the engraftment of T-MSCs into the peritoneal tissue of all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) in an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model, using human nuclei antibody staining.
  • Figure 17 is a graph showing the peritoneal function of all experimental groups (NC, NP, NV, PD, PP, PV) confirmed through peritoneal equilibrium test (PET) in an animal experiment using a peritoneal dialysis rat model.
  • Figure 18 is a diagram confirming the expression of anti-fibrotic factors HGF and BMP7 in mesenchymal stem cells of each origin (T-MSC, AD-MSC, BM-MSC).
  • Figure 19 shows the expression of antioxidant enzymes Catalase, GPx, and SOD in mesenchymal stem cells of each origin (T-MSC, AD-MSC, BM-MSC).
  • Peritoneal mesothelial cells were isolated by centrifugation from human omentum treated with 0.05% trypsin-0.02% EDTA for 20 min according to a standard method (Stylianou's method). The cells were cultured in medium M199 containing 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, and 26 mmol/L NaHCO 3 .
  • the media used in the experiment were replaced every two days.
  • peritoneal mesothelial cells HPMC
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells T-MSC, passage 6
  • co-culture of peritoneal mesothelial cells (HPMC) and tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSC) was performed by culturing for 48 hours using the transwell system so that peritoneal mesothelial cells were positioned at the bottom and tonsil-derived mesenchymal stem cells at the top.
  • the culture medium used was CNSM medium provided by Cellatose Therapeutics containing 10% FBS and 1% P/S.
  • HPMC Peritoneal mesothelial cells
  • T-MSC CM tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • T-MSC CM tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • Tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM) was used after concentrating the medium in which tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSC passage 6) had been cultured for 2 days by centrifugation at 4,500 rpm and 4°C for 1 hour using a 3-kDa Amicon Ultra Centrifugal filter unit (EMD Millipore).
  • Example 1 Changes in cell morphology and cell marker expression due to TGF- ⁇ treatment in HPMC and T-MSC co-culture
  • HPMCs cultured alone (Experimental Example 1) and HPMCs co-cultured with T-MSCs (Experimental Example 2) were prepared, and each group was treated with 1 ng/ml of TGF- ⁇ to observe changes in cell morphology and cell markers.
  • HPMC cultured alone for 48 hours and HPMC co-cultured with T-MSC were prepared, and each group was treated with 1 ng/ml of TGF- ⁇ , and changes in cell markers were observed through western blotting (Fig. 1B), and the marker changes compared to the control group were presented graphically (Fig. 1C).
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells alleviated TGF- ⁇ -induced changes in cell morphology and expression of E-cadherin, a-SMA, and fibronectin, which suggests that tonsil-derived mesenchymal stem cells alleviate EMT in peritoneal mesothelial cells (HPMCs).
  • HPMCs peritoneal mesothelial cells
  • Example 2 Changes in cell morphology and cell marker expression due to TGF- ⁇ treatment when HPMC was cultured with T-MSC CM
  • T-MSC CM conditioned medium
  • HPMC cultured alone Example 1
  • HPMC cultured with T-MSC CM Example 3
  • 1 ng/ml of TGF- ⁇ was treated to each group to observe changes in cell morphology and cell markers.
  • Example 2 when HPMC cultured alone were first treated with TGF- ⁇ , it was observed through a microscope that the cells changed in shape from a rectangular parallelepiped to an elongated spindle shape. On the other hand, in the case of HPMC cultured with T-MSC CM, it was confirmed that the change in cell shape was alleviated when treated with TGF- ⁇ (Fig. 2A).
  • HPMC cultured alone for 48 hours and HPMC cultured with T-MSC CM were prepared, and 1 ng/ml of TGF- ⁇ was treated to each group, and changes in cell markers were observed through western blotting (Fig. 2B), and the marker changes compared to the control group were presented graphically (Fig. 2C).
  • tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM) alleviated TGF- ⁇ -induced changes in cell morphology and expression of E-cadherin, a-SMA, and fibronectin, which suggests that tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium alleviates EMT in peritoneal mesothelial cells (HPMCs).
  • HPMCs peritoneal mesothelial cells
  • EMT was induced by treating 2 ng/ml of TGF- ⁇ to the mesothelial cell line Met5A, and then when treated with conditioned media of each derived mesenchymal stem cell (T-MSC CM, AD-MSC CM, BM-MSC CM), changes in cell morphology and cell markers were observed.
  • TGF- ⁇ a mesothelial cell line
  • D-MSC CM adipose-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • BM-MSC CM bone marrow-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium alleviated TGF- ⁇ -induced cell morphological changes and changes in the expression of E-cadherin and fibronectin.
  • T-MSC CM tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • AD-MSC CM or BM-MSC CM derived mesenchymal stem cell conditioned medium
  • T-MSC CM had a more excellent effect in promoting E-cadherin expression and inhibiting Fibronectin expression, indicating that T-MSC CM is more effective in inhibiting EMT than other derived mesenchymal stem cell conditioned medium.
  • T-MSCs tonsil-derived mesenchymal stem cells
  • NOX4 is known to be located in mitochondria and related to mtROS production
  • tonsil-derived mesenchymal stem cell conditioned medium (T-MSC CM) has an effect of suppressing oxidative stress by inhibiting mitochondrial NOX4 expression induced by TGF- ⁇ .
  • catheters for dialysate infusion were inserted in advance 7 days before the start of the experiment.
  • 100 mL/kg of 4.25% Phyzionyl dialysate containing 20 mM methylglyoxal (MGO) was administered daily to the peritoneal dialysis experimental groups (PD, PP, PV), and tonsil-derived mesenchymal stem cells (1.0 x 10 7 cells) were additionally administered once in the second week of the experiment to the PP and PV groups (PP group: intraperitoneal (catheter connection port) injection, PV group: intravenous injection).
  • NP and NV groups were administered tonsil-derived mesenchymal stem cells (1.0 x 10 7 cells) once in the second week of the experiment (NP group: intraperitoneal injection, NV group: intravenous injection).
  • NP group intraperitoneal injection
  • NV group intravenous injection
  • the administration was terminated, the peritoneal function of each experimental group was evaluated, and the peritoneal tissue was analyzed.
  • the schedule and experimental group composition of the animal experiment using the rat model of fibrosis induced by peritoneal dialysis are summarized in Fig. 6.
  • catheter insertion and monitoring were performed as follows.
  • the rat was anesthetized, laid on its left side, and alcohol was sprayed on the right surgical site. Then, using animal clippers, the hair was removed from an area wider than the incision site (approximately 4-6 cm2 ). Then, the skin was incised about 0.3-0.5 cm, and the adjacent muscle layer exposed to the incision site was separated from the skin, and the same method was used to proceed through the back of the animal to the back of the head.
  • a muscle layer about 1-2 mm in diameter (a hole large enough to actually insert the catheter) was incised with scissors, and the first cuff of the catheter was inserted, and the catheter was sutured with non-absorbable sutures to prevent it from falling out.
  • the catheter was inserted between the separated skin and muscle layer and pushed to the very end of the back (the back of the head).
  • the muscles and skin were each sutured using non-absorbable sutures.
  • Povidone solution was applied across the suture site, and the respiratory anesthesia device was removed to monitor whether the experimental animal woke up from anesthesia and moved well. After that, monitoring was performed twice a day for about a week until the wound healed and hair grew.
  • Figure 7 shows images showing the catheter insertion and monitoring process in the above peritoneal dialysis rat model.
  • Example 6 Effect of T-MSCs on peritoneal fibrosis in a rat model of peritoneal fibrosis
  • proteins were quantified from the peritoneal tissue of each experimental group, and the expression of epithelial and mesenchymal cell markers was confirmed through immunoblot (see Figures 9A and 9B).
  • peritoneal fibrosis progresses in the PD group due to peritoneal dialysis, and that peritoneal fibrosis is alleviated when T-MSCs are injected intraperitoneally (PP group) or intravenously (PV group).
  • PP group intraperitoneally
  • PV group intravenously
  • Example 7 Effect of T-MSCs on oxidative stress in a rat model of peritoneal fibrosis
  • peritoneal oxidative stress factors 8-OHdG (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine), NT, 4-HNE (4-Hydroxynonenal), SOD2, and GSH (Glutathione), in each experimental group were confirmed through immunoblot (see Figures 11A and 11B).
  • Example 8 Effect of T-MSCs on endoplasmic reticulum stress in a rat model of peritoneal fibrosis
  • GRP 78/94 glucose regulatory protein 78/94
  • IRE1 inositol-requiring enzyme 1
  • ATF6 Activating transcription factor 6
  • CHOP C/EBP homologous protein
  • p-PERK phosphorylated protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase
  • p-eIF2 ⁇ phosphorylated Eukaryotic Initiation Factor 2 alpha
  • ATF4 Activating transcription factor 4
  • peritoneal dialysis solution injection increased endoplasmic reticulum stress in the PD group, and that peritoneal and intravenous injection of T-MSCs relieved endoplasmic reticulum stress.
  • Example 9 Effect of T-MSCs on apoptosis in a rat model of peritoneal fibrosis
  • peritoneal dialysis solution injection increased apoptosis of peritoneal tissue in the PD group, and apoptosis was inhibited by intraperitoneal and intravenous injection of T-MSCs.
  • Example 10 Effect of T-MSCs on NLRP3 inflammasomes in a rat model of peritoneal fibrosis
  • NLRP3 NLR family pyrin domain containing 3
  • ASC Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
  • cleaved-capase-1 cleaved-capase-1
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 beta
  • NLRP3 inflammasomes increased in the PD group by peritoneal dialysis fluid injection, and NLRP3 inflammasomes were suppressed by intraperitoneal and intravenous injection of T-MSCs.
  • Example 11 Effect of T-MSCs on body weight change in a rat model of peritoneal fibrosis
  • T-MSCs had the effect of suppressing body weight loss in the subject in a rat model induced by peritoneal fibrosis.
  • T-MSCs peritoneal fibrosis progressed in the PD group due to peritoneal dialysis solution injection, and that when T-MSCs were injected intraperitoneally (PP group) or intravenously (PV group), T-MSCs reached the fibrotic area and the engraftment of T-MSCs was maintained for at least 7 days.
  • peritoneal dialysis fluid 100 mL/kg of peritoneal dialysis fluid was injected intraperitoneally into each experimental group. Drainage (D, Dialysate) samples were collected before (D0) and 2 hours after peritoneal dialysis fluid injection, and blood (P, Plasma) samples were collected 2 hours after (P2).
  • Peritoneal movement indices of peritoneal equilibrium testing were the glucose concentration in relation to the drainage-to-drainage ratio before and 2 hours after dialysate injection (D2/D0 Glucose), and the creatinine concentration in relation to the drainage-to-blood ratio 2 hours after dialysate injection (D2/P2 Cr). All indices were measured using an AU680 autoanalyzer (Beckman Coulter, Brea, USA).
  • D2/D0 Glucose significantly decreased in the PD group compared to the NC group, whereas it significantly increased in the PP and PV groups compared to the PD group.
  • D2/P2 Cr significantly increased in the PD group compared to the NC group, but significantly decreased in the PP and PV groups compared to the PD group.
  • peritoneal function of the PD group was significantly reduced by peritoneal dialysis solution injection, and that the absorption and transport function of the peritoneum was improved when T-MSCs were injected intraperitoneally (PP group) or intravenously (PV group).
  • Example 14 Comparison of antifibrotic factor expression between T-MSCs and other derived mesenchymal stem cells
  • Example 15 Comparison of antioxidant enzyme expression between T-MSCs and other derived mesenchymal stem cells

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Abstract

본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 섬유증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 우수한 복막 EMT 억제 효과를 보유함에 따라, 복막 섬유증의 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

편도 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 복막 섬유증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 섬유증의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
섬유증은 섬유아세포에 의한 세포외 기질(ECM)의 비정상적인 생성, 축적 및 침착이 일어나는 질환으로, 지속적인 감염, 자가면역 반응, 알레르기성 반응, 화학적 손상 및 조직 손상을 포함하는 다양한 자극에 의해 유도되는 만성 염증 반응의 최종 결과에 해당한다.
섬유증 중에서도 특히 복막 섬유증(PF, Peritoneal fibrosis)은, 신부전증 치료를 위한 장기간 복막 투석에 의해 발생한다는 특징을 가지고 있으며, 지속적인 외래 복막 투석(CAPD, Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis) 환자의 복막 구조 변화 및 한외 여과 장애의 주요 원인으로 꼽히고 있다. 복막 섬유화의 극단적인 형태인 피막 형성 복막 경화증(ESP, Encapsulating Peritoneal Sclerosis)은 복막 투석을 지속하기 어렵게 만들며, 섬유화-경화증의 특성상 정상 기능으로 복귀가 불가능하기 때문에 한번의 진단만으로도 매우 치명적인 경과를 보인다. 따라서, 복막 섬유증은 그 어떤 섬유증보다도 예방 목적이 우선시되고 있다.
복막 섬유증의 경우 복막 중피 세포(MCs, Mesothelial Cells)의 상피-중간엽 전이(EMT, Epithelial-to-mesenchymal transition) 및 세포외기질(ECM) 단백질의 축적이 특징적으로 나타난다. 형질전환 성장 인자(TGF, Transforming Growth Factor)-β는 복막 섬유증 발달에서 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 복막 투석에 의해 복막 섬유증이 진행된 경우, EMT 수준과 관련이 있는 GPR 78/94의 증가가 관찰되며, 상피 세포 마커로 알려진 E-cadherin의 발현 감소와 중간엽 세포 마커로 알려진 α-SMA 및 Fibronectin의 발현 증가가 함께 관찰된다. EMT는 가역적 과정으로 알려져 있기 때문에, EMT 억제는 복막 기능을 보존하기 위한 치료적 타겟으로 고려될 수 있다.
한편, 성체 줄기세포는 기관 재생과 면역반응 조절 능력을 가지는 것으로 알려져 있으며 관련 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 임상 및 연구에서 사용되고 있는 성체 줄기세포의 공급원은 골수, 지방 세포, 제대혈 등이 있다. 그러나, 종래의 성체 줄기세포는 조직을 채취하는 과정이 침습적이고, 충분한 양을 얻기 어려워 사용에 제한점이 있다. 최근에는 편도선의 조직에서 중간엽 줄기세포를 추출한 연구 결과가 보고되어, 상기 편도조직이 성체 줄기세포의 새로운 공급원으로 주목되고 있다. 편도 유래 줄기세포는 다른 성체 줄기세포와 동일한 수준의 줄기세포능을 나타내며, 편도선 절제 수술 시 버려지는 조직으로부터 얻을 수 있어 재료의 수급이 비교적 원활한 장점이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 조성물이 복막의 EMT를 억제하고 복막 섬유증을 개선, 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 투석액을 제공하는 것이다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포란 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 타 유래 줄기세포와 대비하여 기원 조직인 편도의 획득이 용이하며 수술 후 버려지는 편도 조직의 재활용이 가능하고 초기 수득율이 매우 높은 장점이 있다.
특히, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 항섬유화 및 항산화 특성을 가진다. 이러한 특성은 타 유래 중간엽 줄기세포와 대비하여 항섬유인자 (HGF, BMP7) 및 항산화효소(Catalase, glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD)) 발현이 높다는 점에서 차별성을 가진다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 HGF, BMP7, Catalase, GPx, 및 SOD로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 높은 비율로 발현한다. 이러한 발현 수준의 높음은 예를 들어, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및/또는 골수 유래 중간엽 줄기세포와 대비하여 적어도 5 %, 10 %, 15 %, 20%, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % 또는 그 이상의 높은 발현 수준을 언급한다.
또한, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 상피세포 마커로 알려진 ZO-1 및 E-cadherin의 발현 증진 및 중간엽 세포 마커로 알려진 fibronectin 및 α-SMA의 발현 억제 효과를 가지며, 타 유래 중간엽 줄기세포 대비 우수한 E-cadherin 증진 및 fibronectin 억제 효과를 나타내는 점에서 차별성을 가진다.
본 발명에 있어서, "편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지"는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액으로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 제거된 배양액 또는 상층액을 의미하며, "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 상층액", "편도 유래 중간엽 줄기세포 조건 배양액" 또는 "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 세포를 제거한 후, 수득된 배양액, 배양 상층액 또는 이의 농축물이거나 이의 동결건조물일 수 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상적으로 배양될 수 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 조직으로부터 수득된 편도 유래 중간엽 줄기세포를 혈청 또는 무혈청 배지에서 배양하여 수득된 것일 수 있다. 이를 원심분리나 필터를 이용한 여과에 의해 줄기세포 및 거대분자를 제거한 후에 수득된 상층액을 사용할 수 있다. 또한, 수득된 상층액은 그대로 사용하거나 또는 농축하여 수득된 농축물로 사용할 수 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
상기 배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로서, 혈청이 보충된 DMEM 배지일 수 있다. 혈청은 우태아혈청(FBS)일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 혈청 배지의 총 중량에 대해 1 내지 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 마이코플라스마 억제제 등을 포함할 수 있으며, 이들은 배지의 총 중량에 대해 1 중량%일 수 있다. 항생제는 페니실린-스트렙토마이신 등 세포 배양에서 통상적으로 사용되는 항생제를 포함하고, 항진균제는 암포테리신-B(fungizone) 등을 포함하며, 마이코플라스마 억제제는 겐타마이신, 시프로플록사신, 타일로신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 바람직하게, 상기 무혈청 배지는 low glucose DMEM 배지일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 Low glucose DMEM 하에 배양하여 세포를 제거한 상층액을 농축한 것이다.
복막 세포에 EMT를 유도하는 경우 상피 세포 마커로 알려진 ZO-1 및 E-cadherin의 발현이 감소하고, 중간엽 세포 마커로 알려진 α-SMA 및 fibronectin의 발현이 증가한다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 처리는 EMT가 유도된 복막 세포에서 ZO-1 및 E-cadherin의 발현을 증진시키고, α-SMA 및 fibronectin의 발현을 감소시킴으로써 EMT와 관련된 작용을 최소화하고 치료 효능을 크게 증진시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 타 유래 중간엽 줄기세포, 예컨대 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM)에 대비하여 E-cadherin 발현 증진 및 fibronectin 발현 억제에 보다 우수한 효과를 갖는다.
즉, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 복막의 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 있어서, "EMT"는 상피세포가 중간엽 세포로 표현형 변이되는 것을 의미한다. 구체적으로 EMT는 세포간 결합이 느슨해지고 세포 골격이 변하면서 조직이 운동성을 획득하는 현상으로, 세포가 본래의 세포 표현형을 상실하고 간엽세포의 표현형으로 전환되는 것을 말한다. EMT가 유도되면 섬유 아세포의 축적을 초래할 수 있으며, EMT의 유도는 복막 섬유화의 초기 메커니즘으로 중요하게 인식된다.
이에 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 초기부터 억제함으로써 치료 효과를 크게 증진시킬 수 있는 장점을 가진다. 복막 섬유증의 경우 투석회수가 증가함에 따라 섬유증과 관련된 증상이 크게 악화되고 진행될 수 있다. 이와 같은 복막 섬유증의 특성에 있어서 초기 단계의 섬유증 증상의 시작을 늦추고 증상의 악화를 최소화하는 것이 매우 중요하다. 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 위와 같은 복막 섬유화의 초기 메커니즘에 주된 증상을 치료하고 최소화하여 복막 투석의 가능 기간을 크게 증가시키고, 복막 투석에 의해 발생하는 이차적 질환을 예방하는데 우수한 효능을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 중간엽세포 관련 인자의 발현을 억제하는 효과가 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 α-SMA 및 Fibronectin으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 상피세포 관련 인자의 발현을 증가시키는 효과가 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 ZO-1 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증진하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 α-SMA 및 Fibronectin으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 억제하고, ZO-1 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 증진하는 효과가 있다.
한편, 복막 투석액에 대한 지속적인 노출은 복막 EMT를 진행시키며 조직 내 산화 스트레스, 염증성 손상, 소포체 스트레스, 세포사멸, 염증소체 등을 유발하여, 궁극적으로 복막 섬유증을 초래하는 것으로 알려져 있다. 특히, TGF-β 신호전달경로를 통한 복막 섬유화 기전이 잘 알려져 있으며, 산화스트레스의 유도가 복막 EMT 초기 기전에 관여한다고 알려져 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지가 산화 스트레스, 소포체 스트레스, 세포사멸, 염증소체 등을 억제함으로써, EMT와 관련된 작용을 최소화하는 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 복막 EMT를 유도하는 경우 세포 내에서 산화 스트레스가 증가함과 더불어, 활성 산소종(ROS)의 생성 효소로 알려진 NADHP oxidase 4(NOX4)의 발현이 증가하고, 산화 스트레스 관련 마커인 8-OHdG(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine), NT(nitrotyrosin) 및 4-HNE(4-Hydroxynonenal)의 발현이 증가하고, SOD2 및 GSH(Glutathione)의 발현이 감소한다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 NOX4, 8-OHdG 및 NT의 단백질 발현을 감소시키고, SOD2 및 GSH(Glutathione)의 단백질 발현을 증진시킴으로써 세포 내 산화 스트레스를 억제하여 EMT와 관련된 작용을 최소화하고 치료 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 세포 내 산화 스트레스를 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 NOX4, 8-OHdG, 및 NT로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 SOD2 및 GSH로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증진하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 NOX4, 8-OHdG 및 NT로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 억제하고, SOD2 및 GSH로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증진하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 복막 EMT를 유도하는 경우 소포체 스트레스가 증가함과 더불어, 소포체 스트레스 관련 마커인 GRP 78/94(glucose regulatory protein 78/94), IRE1(inositol-requiring enzyme 1), ATF6(Activating transcription factor 6), CHOP(C/EBP homologous protein), p-PERK(phosphorylated protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase), p-eIF2α(phosphorylated Eukaryotic Initiation Factor 2 alpha) 및 ATF4(Activating transcription factor 4)의 발현이 증가한다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 GRP 78, IRE1, ATF6 및 CHOP의 단백질 발현을 감소시킴으로써 소포체 스트레스를 억제하여 EMT와 관련된 작용을 최소화하고 치료 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 소포체 스트레스를 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 GRP 78, IRE1, ATF6 및 CHOP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 복막 EMT를 유도하는 경우 세포사멸이 증가함과 더불어, 세포사멸 관련 마커인 Bcl-2(B-cell lymphoma-2)의 발현이 감소하고, Bax(Bcl-2-associated X protein), Bad(Bcl-2-associated agonist of cell death), cytochrome C, cleaved caspase-3, p53 및 cleaved PARP(poly ADP ribose polymerase)의 발현이 증가한다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 Bax, cleaved caspase-3 및 cleaved PARP의 단백질 발현을 감소시킴으로써 세포사멸을 억제하여 EMT와 관련된 작용을 최소화하고 치료 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 세포사멸을 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 Bax, cleaved caspase-3 및 cleaved PARP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 복막 EMT를 유도하는 경우 염증소체가 증가함과 더불어, NLRP3 염증소체 관련 마커인 NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3), ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), cleaved-capase-1 및 IL-1β(Interleukin 1 beta)의 발현이 증가한다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 NLRP3 및 ASC의 단백질 발현을 감소시킴으로써 염증소체를 억제하여 EMT와 관련된 작용을 최소화하고 치료 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 염증소체를 억제하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 NLRP3 및 ASC로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 효과가 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 복막 섬유증 유발 랫드 모델에 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 조성물을 투여 시 복막의 흡수 및 수송 기능을 개선하고 복막 두께가 감소하는 효과가 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 복막 섬유증을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
한편, 복막 섬유증이 유도된 랫드 동물모델에서 복막배액 SOD 활성 저하를 보여준 바 있으며, 특히, 복막 중피세포에서는 항섬유 인자로 알려진 간세포성장인자(HGF) 및 골형성인자7(BMP7)를 합성한다고 알려졌고, 고포도당 혹은 TGF-β이 복막 HGF 및 BMP7의 생성을 감소시킨다고 알려져 있으므로 복막투석에 의한 복막 항섬유화 기전을 이해하는 좋은 마커가 될 수 있다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 HGF, BMP7, Catalase, GPx 및 SOD로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 높은 함량으로 함유한다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 항섬유 인자로 알려진 HGF, BMP7 및 항산화효소로 알려진 Catalase, GPx, SOD를 높은 함량으로 함유함으로써 항섬유 특성 및 항산화 특성을 나타낸다. 특히, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM)에 대비하여 상기 항섬유 인자 및 항산화효소를 보다 높은 함량으로 발현하며, 보다 우수한 항섬유 및 항산화 특성을 나타낸다. 이로써 항섬유 및 항산화 특성의 측면에서 복막 섬유증에 대한 치료 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 "복막 섬유증"은 복막이 섬유화된 상태를 의미하는 것으로서 복막에 섬유세포가 비정상적으로 형성된 것을 말한다. 예를 들어, 복막후 섬유증 (Retroperitoneal fibrosis) 또는 피막 형성 복막 경화증(encapsulating peritoneal sclerosis)을 포괄하는 의미로 사용되나, 이로 한정되지 않는다. 복막의 섬유화는 예를 들어, 복막 투석에 의해서 발생할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 조성물의 투여로 복막 섬유증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, “치료”란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물이 경구용 고형 제제로 제제화된 경우 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토즈, 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물이 경구용 액상 제제화된 경우 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물이 비경구용으로 제제화된 경우 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 예방 또는 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 랫트, 랫드, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구 투여, 경막내, 내이, 복강 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막, 설하 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "대상체"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 복막 섬유증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 치료학적으로 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 복막 섬유증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "편도 유래 중간엽 줄기세포", “편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지" 또는 "복막 섬유증"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란 복막 섬유증이 발병하였거나 발병할 수 있는 모든 동물을 의미하며, 전형적으로 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 동물일 수 있으나, 복막 섬유증 증상을 갖거나 이러한 증상을 가질 가능성이 있는 개체이면 제한없이 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 복막 섬유증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 복막 섬유증의 예방 또는 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 또 하나의 양태는 복막 섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 또 하나의 양태는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 투석액을 제공한다.
상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 앞서 설명한 바와 같다. 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 복막 세포의 EMT를 억제하므로, 복막 투석액 중에 포함되어 복막 섬유화 및 복막 섬유증을 개선, 지연, 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 투석액은 삼투제, 완충액, 전해질 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어 삼투제는 포도당, 포도당 중합체(예를 들어, 말토덱스트린, 아이코덱스트린), 포도당 중합체 유도체, 시클로덱스트린, 변성전분, 히드록시에틸 전분, 폴리올, 과당, 아미노산, 펩티드, 단백질, 아미노당, 글리세롤, N-아세틸 글루코사민(NAG) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 완충액은 중탄산염, 락테이트, 피루베이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(즉, 트리스히드록시메틸아미노메탄), 아미노산, 펩티드, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.
전해질은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 염화물을 포함할 수 있다.
본 발명의 복막 투석액은 하나 이상의 투석 성분(투석 용액의 요소 또는 구성 성분) 및 치료적 유효량의 유효물질을 포함할 수 있으며, 복막 섬유화 및 복막 섬유증을 개선, 완화, 예방 또는 치료하기 위한 성분으로 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함한다. 상기 복막 투석액은 투석 농축물일 수 있으며, 투석액에는 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지가 포함될 수 있다. 상기 복막 투석액은 단일 용기 내의 단일 투석 용액 또는 별도로 수용된 또는 다중-챔버를 가진 용기의 투석부로 사용될 수 있으며, 복막 투석 시 기존에 사용되는 투석액과 동시에 또는 시간차를 두고 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 섬유증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 조성물의 투여로 복막 섬유증이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어, 상기 편 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 바람직하게 식품 조성물 대비 0.00001~0.01 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 0.01 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
본 발명의 식품 조성물은 일 예로, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 식품 조성물은 건강기능식품을 포함한다.
상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물 및 건강기능식품은 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid), 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin) 등을 포함할 수 있다. 또한, 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 시스테인, 발린, 라이신, 트립토판 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 우수한 복막 EMT 억제 효과를 보유함에 따라, 복막 섬유증의 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 복막 중피 세포(HPMC)의 단독 배양 조건 및 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)와의 공동 배양 조건에서 TGF-β의 처리 시 세포 형태 변화를 나타낸 이미지(A)와, 세포 마커 발현 변화를 나타낸 이미지(B) 및 그래프(C)이다.
도 2는 복막 중피 세포(HPMC)의 일반 배양 조건 및 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM) 처리 배양 조건에서 TGF-β의 처리 시 세포 형태 변화를 나타낸 이미지(A)와, 세포 마커 발현 변화를 나타낸 이미지(B) 및 그래프(C)이다.
도 3은 중피 세포(Met5A)에 TGF-β의 처리 후 각 유래 별 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM, AD-MSC CM, BM-MSC CM)를 처리함에 따른 세포 마커 발현 변화를 나타낸 그래프(A, B) 및 이미지(C)이다.
도 4는 복막 중피 세포(HPMC)의 단독 배양 조건 및 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)와의 공동 배양 조건에서 TGF-β의 처리 시 산화스트레스 변화를 DCF-DA 염색(A) 및 MitoSox 염색(B)을 통해 확인한 이미지이다.
도 5는 복막 중피 세포(HPMC)의 일반 배양 조건 및 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM) 처리 배양 조건에서 TGF-β의 처리 시 NOX 발현 차이를 면역염색을 통해 확인한 이미지이다.
도 6은 복막 투석 랫드 모델을 구축하기 위한 동물 실험의 스케줄 및 실험군 편성을 나타낸 이미지이다.
도 7은 복막 투석 랫드 모델에서 카테터 삽입 및 모니터링 과정을 보여주는 이미지이다.
도 8은 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험에서 NC, PD, PP, PV군의 복막 두께를 Sirius Red 염색으로 확인한 이미지이다.
도 9는 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험에서 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)에서 상피세포 및 중간엽세포 관련 마커인 ZO-1, E-cadherin, fibronectin 및 α-SMA의 단백 발현을 면역탁본법으로 확인한 이미지(A) 및 이를 정리한 그래프(B)이다.
도 10은 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험에서 NC, PD, PP, PV군의 SOD2 및 nitrotyrosine (NT) 발현을 면역염색을 통해 확인한 이미지이다.
도 11은 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험의 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)에서 산화 스트레스에 관여하는 8-OHdG, NT, 4-HNE, SOD2 및 GSH의 단백 발현을 면역탁본법으로 확인한 이미지(A) 및 이를 정리한 그래프(B)이다.
도 12는 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험의 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)에서 소포체 스트레스에 관여하는 GRP 78/94, IRE1, ATF6, CHOP, p-PERK, p-eIF2α 및 ATF4의 단백질 발현을 면역탁본법으로 확인한 이미지(A) 및 이를 정리한 그래프(B)이다.
도 13은 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험의 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)에서 세포사멸에 관여하는 Bcl-2, Bax, Bad, cytochrome C, cleaved caspase-3, p53 및 cleaved PARP의 단백질 발현을 면역탁본법으로 확인한 이미지(A) 및 이를 정리한 그래프(B)이다.
도 14는 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험의 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)에서 NLRP3 염증소체에 관여하는 NLRP3, ASC, cleaved-capase-1 및 IL-1β의 단백질 발현을 면역탁본법으로 확인한 이미지(A) 및 이를 정리한 그래프(B)이다.
도 15는 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험에서 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)의 주차 별 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험에서 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)의 복막 조직에 T-MSC의 생착 여부를 human nuclei 항체 염색으로 확인한 이미지이다.
도 17은 복막 투석 랫드 모델을 이용한 동물 실험에서 전체 실험군(NC, NP, NV, PD, PP, PV)의 복막 기능을 복막 평형 검사(PET)를 통해 확인한 그래프이다.
도 18은 각 유래 별 중간엽 줄기세포(T-MSC, AD-MSC, BM-MSC)에서 항섬유 인자인 HGF 및 BMP7의 발현을 확인한 도이다.
도 19는 각 유래 별 중간엽 줄기세포(T-MSC, AD-MSC, BM-MSC)에서 항산화효소인 Catalase, GPx 및 SOD의 발현을 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 연구에서 사용되는 모든 물질들은, 다른 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich 및 Sellechem으로부터 구입하여 사용하였다.
실험예 1. 복막 중피 세포(HPMC)의 분리 및 유지
복막 중피 세포(HPMC)는 표준적인 방법(Stylianou's method)에 따라 사람의 장간막(omentum)을 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 20분 동안 처리하여 배양한 뒤 원심분리를 통해 분리하였다. 상기 세포는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 26 mmol/L NaHCO3를 함유하는 배지 M199에서 배양되었다.
실험에 사용된 배지는 2일에 한 번씩 교체되었다.
실험예 2. 복막 중피 세포(HPMC) 및 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)의 공동 배양
6웰 플레이트에 각각의 웰(well)마다 2X105개의 복막 중피세포(HPMC)를 시딩하고, 트랜스웰 인서트(transwell insert)에는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC, passage 6)를 시딩하였다. 다음날, 아래쪽에는 복막 중피세포, 위쪽에는 편도 유래 중간엽 줄기세포가 위치하도록 트랜스웰 시스템을 통해 48시간 동안 배양함으로써 복막 중피 세포(HPMC) 및 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)의 공동 배양을 수행하였다. 배양 배지는 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 셀라토즈테라퓨틱스에서 제공한 CNSM배지를 사용하였다.
실험예 3. 복막 중피 세포(HPMC)에 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM) 처리 배양
6웰 플레이트에 각각의 웰(well)마다 2X105개의 복막 중피세포(HPMC)를 시딩하고 24시간 이후 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM)을 48시간 동안 처리하여 배양함으로써 복막 중피 세포(HPMC) 및 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM) 처리 배양을 수행하였다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM)는 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC passage 6)를 2일 동안 배양한 배지를 3-kDa Amicon Ultra Centrifugal filter unit(EMD Millipore)을 사용하여 4,500 rpm, 4℃에서 1시간동안 원심분리하여 농축시킨 후 사용하였다.
실시예 1. HPMC 및 T-MSC 공동배양 시 TGF-β 처리로 인한 세포 형태 변화 및 세포 마커 발현 변화
TGF-β로 유도된 복막 EMT에서 T-MSC의 효과를 규명하기 위해, 단독 배양한 HPMC(실험예 1) 및 T-MSC와 공동배양한 HPMC(실험예 2)를 준비하고 각 그룹에 1ng/ml의 TGF-β를 처리하여 세포 형태 변화 및 세포 마커 변화를 관찰하였다.
먼저, 단독 배양한 HPMC에 TGF-β처리 시 세포가 직육면체 모양에서 길쭉한 방추 모양으로 형태 변화가 나타나는 것을 현미경을 통해 관찰하였다. 반면, T-MSC와 공동배양한 HPMC의 경우 TGF-β처리 시 세포 형태 변화가 완화된 것을 확인하였다(도 1A).
또한, 48시간 단독 배양한 HPMC와, T-MSC와 공동배양한 HPMC를 준비하고 각 그룹에 1ng/ml의 TGF-β를 처리한 후 western blotting을 통해 세포 마커 변화를 관찰하였으며(도 1B), 대조군 대비 마커 변화를 그래프로 나타내었다(도 1C).
실험 결과, 단독 배양한 HPMC에 TGF-β처리 시 상피 세포 마커인 E-cadherin이 감소하고, 중간엽 세포 마커인 α-SMA 및 Fibronectin이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, T-MSC와 공동 배양한 HPMC의 경우, TGF-β처리에 의한 E-cadherin의 감소와 α-SMA 및 Fibronectin의 증가 등 마커 발현 변화가 현저히 완화된 것을 확인하였다.
정리하면, 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)가 TGF-β로 유도된 세포 형태의 변화와 E-cadherin, a-SMA 및 fibronectin의 발현 변화를 완화시킴을 확인하였으며, 이는 편도 유래 중간엽 줄기세포가 복막 중피 세포(HPMC)에서 일어나는 EMT를 완화시킴을 의미한다. 이를 통해, 편도 유래 중간엽 줄기세포가 파라크린 효과등을 통해 복막 섬유증에 치료 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. HPMC에 T-MSC CM 처리 배양 시 TGF-β 처리로 인한 세포 형태 변화 및 세포 마커 발현 변화
상기 실시예 1과 같은 방식으로, TGF-β로 유도된 복막 EMT에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지(T-MSC CM)의 효과를 규명하기 위해 단독 배양한 HPMC(실험예 1) 및 T-MSC CM 처리 배양 한 HPMC(실험예 3)를 준비하고 각 그룹에 1ng/ml의 TGF-β를 처리하여 세포 형태 변화 및 세포 마커 변화를 관찰하였다.
실시예 1과 마찬가지로, 먼저 단독 배양한 HPMC에 TGF-β 처리 시 세포가 직육면체 모양에서 길쭉한 방추 모양으로 형태 변화가 나타나는 것을 현미경을 통해 관찰하였다. 반면, T-MSC CM 처리 배양한 HPMC의 경우 TGF-β 처리 시 세포 형태 변화가 완화된 것을 확인하였다(도 2A).
또한, 48시간 단독 배양한 HPMC와, T-MSC CM 처리 배양한 HPMC를 준비하고 각 그룹에 1ng/ml의 TGF-β를 처리한 후 western blotting을 통해 세포 마커 변화를 관찰하였으며(도 2B), 대조군 대비 마커 변화를 그래프로 나타내었다(도 2C).
실험 결과, 단독 배양한 HPMC에 TGF-β 처리 시 상피 세포 마커인 E-cadherin이 감소하고, 중간엽 세포 마커인 α-SMA 및 Fibronectin이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, T-MSC CM 처리 배양한 HPMC의 경우, TGF-β 처리에 의한 E-cadherin의 감소와 α-SMA 및 Fibronectin의 증가 등 마커 발현 변화가 현저히 완화된 것을 확인하였다.
정리하면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM)가 TGF-β로 유도된 세포 형태의 변화와 E-cadherin, a-SMA 및 fibronectin의 발현 변화를 완화시킴을 확인하였으며, 이는 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지가 복막 중피 세포(HPMC)에서 일어나는 EMT를 완화시킴을 의미한다. 이를 통해, 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지가 파라크린 효과 등을 통해 복막 섬유증에 치료 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 중피 세포(Met5A)에서 T-MSC 및 타 유래 중간엽 줄기세포 조정배지의 EMT 억제 효과 비교
T-MSC와 타 유래 중간엽 줄기세포의 EMT 억제 효과를 비교하기 위해, 중피 세포주인 Met5A에 2ng/ml의 TGF-β를 처리하여 EMT를 유도하고, 이후 각 유래 별 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM, AD-MSC CM, BM-MSC CM)를 처리했을 때 세포 형태 변화 및 세포 마커 변화를 관찰하였다.
먼저, 중피 세포주인 Met5A에 TGF-β를 처리하고 48시간 후 세포 형태를 관찰한 결과, 세포가 직육면체 모양에서 길쭉한 방추 모양으로 형태 변화가 나타나는 것을 현미경을 통해 관찰하였다. 이후 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM), 지방 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(AD-MSC CM) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(BM-MSC CM)를 각각 처리하고 24시간 후 세포 형태를 관찰한 결과, TGF-β 처리에 의해 발생했던 세포 형태 변화가 완화되는 것을 확인하였다(도에 나타내지 않음).
또한, 중피 세포주인 Met5A에 TGF-β를 처리하여 EMT를 유도하고 각 유래 별 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM, AD-MSC CM, BM-MSC CM)를 처리했을 때 이에 의한 세포 마커 변화를 western blotting 및 RT-PCR을 통해 확인하였다(도 3A 내지 3C).
실험 결과, 중피 세포주(Met5A)에 TGF-β 처리 시 상피 세포 마커인 E-cadherin의 발현이 감소하고, 중간엽 세포 마커인 Fibronectin의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이후 T-MSC CM, AD-MSC CM 또는 BM-MSC CM을 각각 처리하고 24시간 후 세포 마커 변화를 관찰한 결과, 감소했던 E-cadherin의 발현이 증가하고, 증가했던 fibronectin의 발현이 감소 또는 유지되는 것을 확인하였다. 특히, T-MSC CM을 처리한 조건에서 E-cadherin의 발현 증가 및 Fibronectin의 발현 감소 효과가 AD-MSC CM 또는 BM-MSC CM 처리 조건 대비 현저히 우수함을 확인하였다.
정리하면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM)가 TGF-β로 유도된 세포의 형태 변화와 E-cadherin 및 fibronectin의 발현 변화를 완화시킴을 확인하였다. 특히, AD-MSC CM 또는 BM-MSC CM 등 타 유래 중간엽 줄기세포 조정배지에 대비하여, T-MSC CM의 E-cadherin 발현 증진 및 Fibronectin 발현 억제 효과가 보다 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 T-MSC CM이 타 유래 중간엽 줄기세포 조정배지 대비 EMT 억제에 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예 4. T-MSC의 산화 스트레스 억제 효과
TGF-β로 유도된 복막 세포의 EMT에 대하여 T-MSC의 효과를 규명하기 위해, 단독 배양한 HPMC(실험예 1) 및 T-MSC와 공동 배양한 HPMC(실험예 2)를 준비하고 각 그룹에 1ng/ml의 TGF-β을 처리한 후 DCF-DA 염색 및 MitoSox 염색을 통해 산화 스트레스 변화를 관찰하였다(도 4A 및 4B).
실험 결과, 단독 배양한 HPMC 및 T-MSC와 공동 배양한 HPMC 모두 형광을 띠는 세포가 많이 관찰되지 않았다. 그러나, 단독 배양한 HPMC에 TGF-β를 처리한 경우 형광을 띠는 세포가 증가하였으며, T-MSC와 공동배양 한 HPMC의 경우 TGF-β처리에도 형광을 띠는 세포가 크게 증가하지 않음을 확인하였다.
이를 통해, 편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC)가 TGF-β로 유도된 세포 내 산화 스트레스의 증가를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. T-MSC CM의 NOX4 발현 억제 효과
TGF-β로 유도된 복막 세포의 NOX4 발현에 대하여 T-MSC CM의 효과를 규명하기 위해, 단독 배양한 HPMC(실험예 1) 및 T-MSC CM 처리 배양한 HPMC(실험예 3)를 준비하고 각 그룹에 1 ng/ml의 TGF-β를 처리한 후 면역염색을 통해 NOX4 발현 변화를 관찰하였다(도 5).
NOX4는 미토콘드리아에 위치하고 mtROS생성과 관련이 있다고 알려져 있어, 공초점 현미경을 사용하여 NOX4 염색과 MitotrackerTM 적색 염색을 통해 TGF-β에 의해 NOX4의 발현 증가가 HPMC 세포의 미토콘드리아에 위치하는지 조사하였다.
실험 결과, 단독배양한 HPMC에 TGF-β를 처리한 경우 세포의 미토콘드리아에서 NOX4의 발현이 증가하였으나, T-MSC CM 처리 배양한 HPMC의 경우 TGF-β처리에 의해 NOX4 발현이 크게 증가하지 않음을 확인하였다.
이를 통해, 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지(T-MSC CM)가 TGF-β로 유도된 미토콘드리아 내 NOX4 발현을 억제하여, 산화 스트레스를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 4. 복막 투석에 의한 섬유증 유발 랫드 모델 확립
T-MSC를 이용한 동물 실험을 수행하기 위해, 복막 투석에 의한 복막 섬유증 유발 랫드 모델을 구축하였다.
동물 실험을 위한 실험군을 아래와 같이 편성하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2024012286-appb-img-000001
구체적으로, 실험 시작 7일 전에 미리 투석액 주입을 위한 카테터를 삽입하였다. 실험이 시작된 후, 복막 투석 실험군(PD, PP, PV)에게는 20 mM의 메틸글리옥살(methylglyoxal, MGO)을 포함하는 4.25% 피지오닐 투석액 100 mL/kg을 매일 투여하였으며, 그 중 PP군 및 PV군에는 실험 2주 째에 편도 유래 중간엽 줄기세포(1.0 x 107 cells)를 1회 추가로 투여(PP군: 복강(카테터 연결 포트) 주사, PV군: 정맥 주사)하였다. 복막 투석을 수행하지 않은 실험군(NC, NP, NV)에게는 카테터를 삽입하되 투석액은 투여하지 않았으며, 그 중 NP군 및 NV군에는 실험 2주 째에 편도 유래 중간엽 줄기세포(1.0 x 107 cells)를 1회 투여(NP군: 복강 주사, NV군: 정맥 주사)하였다. 실험 3주 후에는 투여를 종료하고 각 실험군의 복막 기능을 평가한 후 복막 조직을 분석하였다. 상기 복막 투석에 의한 섬유증 유발 랫드 모델을 이용한 동물 실험의 스케줄 및 실험군 편성을 정리하여 도 6에 나타내었다.
상기 복막 투석에 의한 섬유증 유발 랫드 모델에서 카테터 삽입 및 모니터링을 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 복막투석액 주입을 위한 카테터 삽입은 실험쥐를 호흡 마취시킨 후, 좌측 옆으로 눕힌 다음 우측 수술 부위에 알코올을 뿌려준 뒤, 동물용 clipper를 이용하여 절개 부위보다 넓은 부위(약 4 - 6 cm2)를 털을 제모하였다. 이후 피부를 약 0.3 - 0.5 cm 정도 절개하고 절개 부분이 노출된 인접한 근육층을 피부로부터 분리시키면서 실험동물 등쪽을 거쳐 후두부 밑까지 같은 방법으로 진행하였다. 복막 손상을 최소화하고자 직경 약 1 - 2 mm 정도(실제로 도관이 삽입될 만큼의 구멍)의 근육층을 가위로 절개하여 도관의 첫번째 cuff을 넣고, 도관이 빠지지 않도록 비-흡수성 봉합사로 봉합하였다. 카테터를 분리했던 피부와 근육층 사이에 넣어가면서 등쪽의 가장 끝 쪽(후두부)으로 밀어 넣었다. 비-흡수성 봉합사를 이용하여 근육과 피부를 각각 봉합하였다. 포비딘 용액을 봉합부위에 걸쳐 도포하고 호흡 마취기를 분리하여 실험동물이 마취에서 깨어나 잘 움직이는지 모니터링 하였다. 이후 상처가 회복되면서 체모가 자랄 때까지 약 1주일 동안 하루에 2회 모니터링하였다.
상기 복막 투석 랫드 모델에서 카테터 삽입 및 모니터링 과정을 보여주는 이미지를 도 7에 나타내었다.
실시예 6. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 복막 섬유화에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따른 각 실험군에서 T-MSC가 복막 섬유화에 미치는 영향을 조사하기 위해, 모든 실험군의 복막 조직을 수집하여 파라핀 절편을 제작하고, Sirius Red 염색을 통해 복막 조직의 콜라겐 축적을 비교하였다(도 8 참조).
실험 결과, NC군에 비해 PD군에서 복막 두께가 증가하였으며, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 복막 두께가 감소함을 확인하였다. 결과적으로, 복막 투석액 주입으로 인해 PD군에서 복막 섬유화가 진행되었고, T-MSC를 복강 주사(PP군) 또는 정맥 주사(PV군)할 경우 복막 섬유화가 완화됨을 확인하였다.
또한, 각 실험군의 복막 조직으로부터 단백질을 정량하고 상피세포 및 중간엽세포 마커의 발현을 immunoblot(면역탁본법)을 통해 확인하였다(도 9A 및 9B 참조).
실험 결과, NC군에 비해 PD군에서 상피세포 마커인 ZO-1 및 E-cadherin 단백질 발현이 감소하였고, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 회복되는 것을 확인하였다. 한편, 중간엽세포 마커인 fibronectin 및 α-SMA 단백질 발현은 NC군에 비해 PD군에서 증가하였으며, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 α-SMA 단백질 발현이 유의하게 완화됨을 확인하였다.
이를 통해, 복막 투석으로 인해 PD군에서 복막 섬유화가 진행되며, T-MSC를 복강주사(PP군) 또는 정맥 주사(PV군)할 경우 복막 섬유화가 완화됨을 확인하였다.
실시예 7. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 산화 스트레스에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따른 각 실험군에서 T-MSC가 산화 스트레스에 미치는 영향을 조사하기 위해, 각 복막 조직으로부터 산화스트레스 마커인 SOD2 및 nitrotyrosin(NT)에 대하여 면역염색을 수행하였다(도 10 참조).
실험 결과, SOD2 염색은 NC군에 비해 PD군에서 감소하였으며, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 증가함을 확인하였다. 또한 NT 면역염색 결과, NC군에 비해 PD군에서 증가하였으나, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 감소함을 확인하였다.
이를 통해, 복막 투석액 주입으로 PD군에서 산화 스트레스가 증가하였으며, T-MSC 복강 및 정맥 주사를 통해 산화 스트레스가 완화됨을 확인하였다.
또한, 각 실험군에서 복막 산화 스트레스 인자인 8-OHdG(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine), NT, 4-HNE(4-Hydroxynonenal), SOD2 및 GSH(Glutathione)의 발현을 immunoblot(면역탁본법)을 통해 확인하였다(도 11A 및 11B 참조).
실험 결과, NC군에 비해 PD군에서 8-OHdG, NT 및 4-HNE 단백질 발현이 유의하게 증가한 반면, SOD2 및 GSH 단백질 발현은 유의하게 감소한 것을 확인하였다. PD군에서 증가하였던 8-OHdG 단백은 T-MSC를 복강(PP군) 및 정맥(PV군) 주사하였을 때 유의하게 감소하였으나 NT 및 4-HNE 단백질 발현에는 큰 차이가 없었다. PD군에서 감소하였던 항산화인자인 SOD2 및 GSH 단백질 발현은 PP군 및 PV군에서 그 발현이 회복되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 복막 투석액 주입으로 PD군에서 산화 스트레스가 증가하며, T-MSC 복강 및 정맥 주사를 통해 산화 스트레스가 완화됨을 확인하였다.
실시예 8. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 소포체 스트레스에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따른 각 실험군에서 T-MSC가 소포체 스트레스에 미치는 영향을 조사하기 위해, 소포체 스트레스에 관여하는 GRP 78/94(glucose regulatory protein 78/94), IRE1(inositol-requiring enzyme 1), ATF6(Activating transcription factor 6), CHOP(C/EBP homologous protein), p-PERK(phosphorylated protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase), p-eIF2α(phosphorylated Eukaryotic Initiation Factor 2 alpha) 및 ATF4(Activating transcription factor 4) 단백질의 발현을 immunoblot(면역탁본법)을 통해 확인하였다(도 12A 및 12B 참조).
실험 결과, NC군에 비해 PD군에서 GRP78/94, IRE1, ATF6, CHOP, pPERK, peIF2α 및 ATF4 단백질 발현이 증가하였고, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 GRP78, IRE1, ATF6 및 CHOP 단백질 발현이 감소한 것을 확인하였다.
이를 통해, 복막 투석액 주입으로 PD군에서 소포체 스트레스가 증가하며, T-MSC 복강 및 정맥 주사를 통해 소포체 스트레스가 완화됨을 확인하였다.
실시예 9. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 세포사멸에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따른 각 실험군에서 T-MSC가 세포사멸에 미치는 영향을 조사하기 위해, 세포사멸에 관여하는 Bcl-2(B-cell lymphoma-2), Bax(Bcl-2-associated X protein), Bad(Bcl-2-associated agonist of cell death), cytochrome C, cleaved caspase-3, p53 및 cleaved PARP(poly ADP ribose polymerase) 단백질의 발현을 immunoblot(면역탁본법)을 통해 확인하였다(도 13A 및 13B 참조).
실험 결과, NC군에 비해 PD군에서 Bcl-2 단백질 발현이 감소하였고, Bax, Bad, cytochrome C, cleaved caspase-3, p53, cleaved PARP 단백질 발현이 증가하였다. 또한, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서 모두 cleaved caspase-3 단백질이 감소하였고, Bax 단백질은 PP군에서, cleaved PARP 단백질은 PV군에서 감소한 것을 확인하였다.
이를 통해, 복막 투석액 주입으로 PD군에서 복막 조직의 세포사멸이 증가하며, T-MSC 복강 및 정맥 주사를 통해 세포사멸이 억제됨을 확인하였다.
실시예 10. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 NLRP3 염증소체에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따른 각 실험군에서 T-MSC가 NLRP3 염증소체에 미치는 영향을 조사하기 위해, NLRP3 염증소체에 관여하는 NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3), ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), cleaved-capase-1 및 IL-1β(Interleukin 1 beta) 단백의 발현을 immunoblot(면역탁본법)을 통해 확인하였다(도 14A 및 14B 참조).
실험 결과, NC군에 비해 PD군에서 NLRP3, ASC, cleaved caspase-1 및 IL-1β 단백질 발현이 증가하였고, PD군에 비해 PP군에서 ASC 단백질 발현이 감소하였으며, PV군에서 NLRP3 단백질 발현이 감소한 것을 확인하였다.
이를 통해, 복막 투석액 주입으로 PD군에서 NLRP3 염증소체가 증가하며, T-MSC 복강 및 정맥 주사를 통해 NLRP3 염증소체가 억제됨을 확인하였다.
실시예 11. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 체중 변화에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따라 복막 섬유증 유발 랫드 모델을 구축하는 동안 각 실험군의 체중 변화를 비교하였다(도 15 참조).
실험이 시작된 D0에서는 전체 실험군 사이에 체중 편차가 크지 않았으나, 실험이 진행될수록 복막투석을 수행한 실험군(PD, PP, PV)에서 체중 저하가 진행되었으며, 실험이 종료되는 D21에서는 PD군, PP군, PV군 순서로 체중 저하가 크게 나타났다.
이를 통해 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC의 투여가 대상체의 체중 저하를 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다.
실시예 12. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC의 복막 내 생착 확인
상기 실험예 4에 따라 복막 섬유증 유발 랫드 모델을 구축한 후, 각 실험군의 복부 조직을 human nuclei 항체를 이용해 염색함으로써 T-MSC의 생착 여부를 확인하였다(도 16 참조).
전체 실험군 중 PV군 및 PP군에서만 T-MSC의 생착이 관찰되었다.
이를 통해 복막 투석액 주입으로 PD군에서 복막 섬유화가 진행되었으며, T-MSC를 복강 주사(PP군) 또는 정맥 주사(PV군)할 경우 섬유화된 부분에 T-MSC가 도달하고 적어도 7일 이상 T-MSC의 생착이 유지됨을 확인하였다.
실시예 13. 복막 섬유증 유발 랫드 모델에서 T-MSC가 복막 기능에 미치는 영향
상기 실험예 4에 따라 복막 섬유증 유발 랫드 모델을 구축한 후, 각 실험군의 복막 평형 검사(PET, Peritoneal Equilibration Test)를 시행하여 비교하였다(도 17 참조).
구체적으로, 각 실험군에 100 mL/kg의 복막 투석액을 복강 주사하였다. 배액(D, Dialysate) 검체는 복막 투석액 주입 전(D0)과 2시간 후(D2)에, 혈액(P, Plasma) 검체는 2시간 후(P2)에 수집하였다. 복막 평형 검사의 복막 이동 지표로는 투석액 주입 전과 주입하고 2시간 후의 배액-배액 비율에 대한 포도당 농도(D2/D0 Glucose) 및 투석액을 주입하고 2시간이 경과했을 때의 배액-혈액 비율에 대한 크레아티닌 농도(D2/P2 Cr)를 사용하였다. 각 지표들은 모두 AU680 자동분석기(Beckman Coulter, Brea, USA)를 통해 측정하였다.
실험 결과, D2/D0 Glucose는 NC군에 비해 PD군에서 유의하게 감소한 반면, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서는 유의하게 증가하였다. 또한, D2/P2 Cr은 NC군에 비해 PD군에서 유의하게 증가하였으나, PD군에 비해 PP군 및 PV군에서는 유의하게 감소하였다.
이를 통해, 복막 투석액 주입으로 PD군의 복막 기능이 현저히 저하되었으며, T-MSC를 복강 주사(PP군) 또는 정맥 주사(PV군)할 경우 복막의 흡수 및 수송 기능이 개선됨을 확인하였다.
실시예 14. T-MSC 및 타 유래 중간엽 줄기세포의 항섬유인자 발현 비교
T-MSC 및 타 유래 중간엽 줄기세포의 항섬유 특성을 비교하기 위해, HMPC(대조군), T-MSC, AD-MSC 및 BM-MSC로부터 항섬유 관련 유전자인 HGF, BMP7의 발현 수준을 Western blotting을 통해 확인하고 이를 도 18에 나타내었다.
비교 결과, T-MSC의 경우 AD-MSC 및 BM-MSC 대비 HGF, BMP7의 발현 수준이 유의하게 높은 것을 확인하였으며, 이를 통해 T-MSC의 항섬유 특성이 AD-MSC 및 BM-MSC 대비 유의하게 높은 것을 알 수 있다.
실시예 15. T-MSC 및 타 유래 중간엽 줄기세포의 항산화효소 발현 비교
T-MSC 및 타 유래 중간엽 줄기세포의 항산화 특성을 비교하기 위해, HMPC(대조군), T-MSC, AD-MSC 및 BM-MSC로부터 항산화 관련 유전자인 Catalase, GPx, SOD의 발현 수준을 Western blotting을 통해 확인하고 이를 도 19에 나타내었다.
비교 결과, T-MSC의 경우 AD-MSC 및 BM-MSC 대비 Catalase, GPx, SOD의 발현 수준이 유의하게 높은 것을 확인하였으며, 이를 통해 T-MSC의 항산화 특성이 AD-MSC 및 BM-MSC 대비 유의하게 높은 것을 알 수 있다.

Claims (20)

  1. 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 복막의 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 억제하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 중간엽세포 관련 인자의 발현을 억제하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 상피세포 관련 인자의 발현을 증가시키는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 세포 내 산화 스트레스를 억제하는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 소포체 스트레스를 억제하는 것인, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 세포 사멸을 억제하는 것인, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 염증소체를 억제하는 것인, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지는 HGF, BMP7, Catalase, GPx 및 SOD으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 높은 함량으로 함유하는 것인, 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 복막 섬유증은 복막 투석에 의해 발생하는 것인, 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 복막 섬유증은 복막후 섬유증(Retroperitoneal fibrosis) 또는 피막 형성 복막 경화증(encapsulating peritoneal sclerosis)인, 약학 조성물.
  12. 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 복막 투석액.
  13. 제12항에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 복막의 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 억제하는 것인, 복막 투석액.
  14. 제12항에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지는 HGF, BMP7, Catalase, GPx 및 SOD으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 높은 함량으로 함유하는 것인, 복막 투석액.
  15. 복막 섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지를 포함하는 조성물.
  16. 복막 섬유증의 예방 또는 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 용도.
  17. 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 치료학적으로 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 복막 섬유증의 예방 또는 치료 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 복막 섬유증은 복막후 섬유증(Retroperitoneal fibrosis) 또는 피막 형성 복막 경화증(encapsulating peritoneal sclerosis)인, 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 복막 섬유증은 복막후 섬유증(Retroperitoneal fibrosis) 또는 피막 형성 복막 경화증(encapsulating peritoneal sclerosis)인, 용도.
  20. 제17항에 있어서, 상기 복막 섬유증은 복막후 섬유증(Retroperitoneal fibrosis) 또는 피막 형성 복막 경화증(encapsulating peritoneal sclerosis)인, 방법.
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