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WO2012020991A2 - 실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물 - Google Patents

실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2012020991A2
WO2012020991A2 PCT/KR2011/005853 KR2011005853W WO2012020991A2 WO 2012020991 A2 WO2012020991 A2 WO 2012020991A2 KR 2011005853 W KR2011005853 W KR 2011005853W WO 2012020991 A2 WO2012020991 A2 WO 2012020991A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composition
tyrosine
preventing
amino acid
silk amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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Application number
PCT/KR2011/005853
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English (en)
French (fr)
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WO2012020991A3 (ko
Inventor
임우택
김윤배
이정용
연성호
이진채
구교철
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WORLDWAY CO Ltd
Original Assignee
WORLDWAY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by WORLDWAY CO Ltd filed Critical WORLDWAY CO Ltd
Priority to CN2011800493075A priority Critical patent/CN103209697A/zh
Publication of WO2012020991A2 publication Critical patent/WO2012020991A2/ko
Publication of WO2012020991A3 publication Critical patent/WO2012020991A3/ko
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing and improving brain disease and a method for producing the same using silk amino acids and tyrosine as active ingredients.
  • Parkinsonism (Parkinsonism or Parkinson's disease, PD) is a serious brain disease estimated to have more than half a million patients in the United States alone, resulting in the loss of dopamine neurons in the substantia nigra pars compacta (SN) region. It is characterized by the loss of exercise ability due to the reduced dopamine secretion in the striatum, and the current standard treatment for Parkinson's disease is dopamine precursor L-3,4-dihydroxyphenylalanine ( L -DOPA or Levo-DOPA). In addition, the drug significantly alleviates the symptoms, but long-term use is known to have serious side effects.
  • L -DOPA dopamine precursor L-3,4-dihydroxyphenylalanine
  • Silk is a protein polymer, the composition, structure and composition of which are completely different depending on the type of insect. The most commonly characterized silks are from silkworms (Bombyx mori) and spiders (Nephila clavipes and Araneus diadematus). .
  • Silk consists of two polypeptides, sericin and fibroin, and as its chemical composition is found to be pure natural amino acids, various effects according to the physiological activity of the composition amino acids have been suggested.
  • the inventors of the present invention while studying a composition for preventing / treating brain diseases that can be administered for a long time without serious side effects, the composition of silk amino acid with tyrosine inhibits exercise ability, dopamine increase, nerve cell protection due to dopamine and dopamine neuronal abnormalities It confirmed that the effect was excellent, and completed this invention.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing and improving brain diseases.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing a composition for preventing and improving brain diseases.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing and / or treating a brain disease, which comprises administering the composition.
  • the present invention provides a composition for preventing and improving brain diseases, including silk amino acids and tyrosine as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for producing a composition for preventing and improving brain diseases comprising silk amino acids and tyrosine as an active ingredient, and a method for preventing and / or treating brain diseases comprising administering the composition.
  • composition of the present invention has the effect of preventing, ameliorating, and treating brain diseases by protecting dopaminergic neurons or increasing the concentration of dopamine and / or its metabolites.
  • 1 shows TH-positive neurons in the area of black matter (SN) in the brain 15 days after 6-OHDA administration.
  • Figure 2 shows TH-positive neurons in the area of black matter (SN) in the brain 30 days after 6-OHDA administration.
  • the present invention relates to a composition for preventing, treating and improving brain diseases, including silk amino acid and tyrosine as active ingredients.
  • the present invention provides a method for producing a composition for preventing, treating and improving cerebral disease, comprising mixing silk amino acid and tyrosine.
  • the present invention provides a method for preventing and / or treating a brain disease comprising administering a composition comprising silk amino acid and tyrosine as an active ingredient.
  • the present invention provides a brain disease prevention, treatment and improvement of the composition comprising a silk amino acid (typical amino acid) and tyrosine (tyrosine) as an active ingredient.
  • a silk amino acid typically amino acid
  • tyrosine tyrosine
  • the present invention also provides the use of a composition comprising silk amino acids and tyrosine as an active ingredient for the manufacture of a medicament for the prevention, improvement and treatment of brain diseases.
  • Silk amino acid of the present invention can be prepared using silkworm or silkworm pupa.
  • the silk amino acid of the present invention can be prepared using the silk protein.
  • the silk protein may be fibroin and / or sericin.
  • the silk amino acid may be prepared by acid hydrolysis of silkworm, silkworm pupae or silk protein, but is not limited thereto.
  • the tyrosine may be synthetic tyrosine or natural tyrosine.
  • the tyrosine of the present invention may also be derived from silk, cocoon and the like. However, if it is tyrosine, there will be no problem in implementing this invention, and it will be said that it corresponds to the tyrosine of this invention regardless of its origin.
  • the brain disease is not limited to Parkinson's disease, cerebral infarction, stroke, dementia, but will be applicable if the brain disease associated with abnormalities of dopamine and / or dopaminergic neurons.
  • the composition for preventing and improving brain diseases of the present invention can prevent, treat, and improve brain diseases by increasing the concentration of dopamine or preventing, delaying, and protecting nerve cells from being destroyed.
  • the composition of the present invention can restore and improve the motor function of the body inhibited by brain diseases.
  • the composition for preventing and improving brain diseases of the present invention may include 0.01 to 50 parts by weight of tyrosine, preferably 0.02 to 20 parts by weight, and most preferably 0.02 to 12 parts by weight, based on 100 parts by weight of the composition. We can include vice. With respect to 100 parts by weight of the composition, when the tyrosine exceeds 50 parts by weight, the prevention / improvement effect of the brain disease is increased, and when mixing tyrosine and silk amino acids, it is difficult to homogeneously mix and excessively increase the mixing time. The efficiency of the process is lowered. In addition, when tyrosine is less than 0.01 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition, it is difficult to expect an increase in the prevention / improvement of brain diseases due to the addition of tyrosine.
  • composition for preventing and improving brain diseases of the present invention may be a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the pharmaceutical composition for preventing and improving brain diseases of the present invention can be administered orally or parenterally and can be used in the form of a general pharmaceutical preparation.
  • Preferred pharmaceutical preparations include oral preparations such as tablets, hard or soft capsules, solutions, suspensions and the like, which can be used in the form of excipients in conventional pharmaceutically acceptable carriers such as oral preparations, Binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, suspending agents, preservatives or extenders can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition for preventing and improving brain diseases of the present invention may be determined by a specialist depending on various factors such as the patient's condition, age, sex, and complications, but generally 0.1 mg to 10 g per kg of adult, preferably Preferably from a dose of 10 mg to 5 g.
  • it is intended to contain a daily dose of the pharmaceutical composition or a dose of 1/2, 1/3 or 1/4 thereof per unit dosage form, and may be administered 1 to 6 times a day.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the patient of the present invention is a brain disease patient.
  • the patient of the present invention may be a patient having a disease such as Parkinson's disease, cerebral infarction, stroke, dementia, but is not limited thereto.
  • Patients with brain diseases associated with abnormalities of dopamine and / or dopaminergic neurons correspond to patients of the invention.
  • the present invention also provides a food composition for preventing and improving brain diseases.
  • the food is not limited to, but not limited to, health supplements, health functional foods, functional foods, and the like, and natural foods, processed foods, and general food materials, including the addition of the composition for preventing and improving brain diseases of the present invention.
  • the food composition for preventing and improving brain diseases of the present invention may be added as it is or used with other food or food compositions, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the blending amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of its use (prevention, health or therapeutic treatment). Generally, 0.1 to 70 parts by weight, preferably 2 to 50 parts by weight, of the brain disease prevention and improvement composition of the present invention may be added to 100 parts by weight of the raw material of the food or beverage during the preparation of the food or beverage.
  • the effective dose of the composition for preventing and improving brain diseases can be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, but may be less than the above range in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control. In addition, since the active ingredient has no problem in terms of safety, it may be used in an amount above the above range.
  • the food composition for preventing and improving brain diseases can be used in the form of oral preparations, such as tablets, hard or soft capsules, liquids, suspensions, etc., these preparations are acceptable conventional carriers, such as oral administration
  • oral preparations such as tablets, hard or soft capsules, liquids, suspensions, etc.
  • these preparations are acceptable conventional carriers, such as oral administration
  • excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, suspending agents, preservatives or extenders can be used.
  • Examples of foods to which the composition for preventing and improving brain diseases can be added include meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, Beverages, teas, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, but are not limited to these kinds of foods.
  • Silk amino acid was obtained from World Way, Inc. as a pale yellow powder obtained by acid hydrolysis of silk protein, which was used while stored at 4 ° C. Prior to administration, the required amount by concentration was dissolved in sterile purified water and administered orally, and the solvent control group was administered the same amount of sterile purified water.
  • a composition was prepared in which silk amino acids were mixed with tyrosine. Specifically, a composition containing 2 parts by weight of tyrosine (Example 1), a composition containing 4 parts by weight of tyrosine (Example 2), and a composition containing 8 parts by weight of tyrosine (executed) based on 100 parts by weight of the silk amino acid Example 3), the composition which mixed 12 weight part tyrosine (Example 4), the composition which mixed 16 weight part tyrosine (Example 5), and the composition which mixed 20 weight part tyrosine (Example 6).
  • SD rats of 14-15 days of gestation bred under the same conditions were killed by cervical dislocation, and the abdomen was excised to separate fetuses under aseptic conditions.
  • the ventral midbrain containing black matter was excised from the brains of the isolated fetuses, and neurons were cultured.
  • the brain tissues from which the meninges were completely removed were washed with DMEM / F12 1: 1 culture medium to remove blood, and then isolated cells were obtained using a small diameter Paster pipette and transferred to a centrifuge tube, followed by centrifugation at 700 rpm for 8 minutes.
  • the precipitated cells were then resuspended in culture and the same procedure repeated twice, followed by DMEM / F12 containing 10% fetal calf serum and 2 mM glutamine, 50 U / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin. After floating in a 1: 1 culture medium, the number of cells was measured under an optical microscope, and 6 ⁇ 10 6 cells were cultured in a 60 mm cell culture plate, and 6 ⁇ 10 4 cells were cultured in each well in a 96 well plate. Serum-free cultures were used for culturing neural neurons.
  • the culture vessel was coated with poly-L-lysine (10 ⁇ g / mL), washed three times with distilled water, and then used after removing water. After treatment for 24 hours in the MPP + culture medium of day four a concentration started to culture investigate toxicity to dopamine neurons silk amino acid, tyrosine, Examples 1 to 6 and L -DOPA (positive control) to a pre-treatment prior to one MPP + for 1 Until the end of the experiment.
  • Tyrosine Daily recommended amount 840mg / 60kg
  • Example 2 As a result of combining the results of Experimental Example 2, it was confirmed that the composition of Example 2 added 4% tyrosine significantly increased the content of dopamine, DOPAC, HVA, and the most suitable concentration of tyrosine does not aggregate with each other, Hereinafter, the in vivo test was conducted using the composition of Example 2.
  • the experimental animals were supplied with 7-week-old male Sprague-Dawley (SD) rats from Daehan Biolink (Neongbuk-neum) and used for about 200-250 g of body weight after approximately 1 week of acclimatization. Animals were housed in rats two by two. The environment of the animal laboratory was adjusted to a temperature of 23 ⁇ 2 ° C, a relative humidity of 55 ⁇ 10%, a ventilation frequency of 12 times / hour, a lighting cycle of 12 hours, and an illuminance of 150-300 Lux. Purina Rat Chow ® biopia (Gunpo, Gyeonggi-do, Korea) was used as a pellet-type solid feed for experimental animals. The experiment was conducted in accordance with the Institute's Standard Operation Procedures (SOP) with the approval of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the Chungbuk National University.
  • SOP Institute's Standard Operation Procedures
  • IACUC Institutional Animal Care and Use Committee
  • the silk amino acid, silk amino acid, and tyrosine compositions of the present invention were dissolved in sterile purified water (5 mL / kg) at doses (50, 160 or 500 mg / kg) for 30 days from the induction of Parkinson's disease for 31 days.
  • sterile purified water 5 mL / kg
  • Tyrosine was also administered orally (40 mg / kg) and L- DOPA (positive control) was injected intraperitoneally (25 mg / kg).
  • T turn the time until the animal's head is turned upward with the head of the animal facing up on the top of the rod with a rough surface of 10 mm diameter and 55 cm in length
  • T LA the time to the bottom
  • Example 2 At 30 days after 6-OHDA administration, 86% of brain-induced animals fell during the pole test, indicating that the brain injury was further developed. However, the improvement effect of the composition of Example 2 was further enhanced than day 15, only 15% and 17% dropped at 50 and 160 mg / kg, respectively, and showed a similar effect to L-DOPA (positive control) at 500 mg / kg There was no animal falling. In addition, only 15% of animals fell in the tyrosine-treated group, and no falling animals were observed in the L- DOPA (positive control) -treated group as in the 15th day. In the silk amino acid group, 50 mg / kg to 500 mg / kg was ineffective at 15 days compared to the Parkinson's group.
  • the Parkinson's group had a 53% increase in drop rate, whereas the silk amino acid group was 50 mg / kg to 500 mg / kg.
  • the drop rate was increased by up to 16%, indicating that the drop rate increase was significantly reduced compared to the Parkinson's group.
  • T turn which is the time the animal heads down on the pole
  • T LA which is the time to reach the bottom
  • T turn and T LA decreased in the silk amino acid treatment group than in the Parkinson's group, but not in the high dose group.
  • the T turn and T LA were significantly improved to about 8 and 30 seconds, respectively, showing the best effect.
  • T turn and T LA were delayed to 46 and 81 seconds, respectively, indicating more severe physical dysfunction than day 15.
  • This severe bodily dysfunction was significantly improved overall with administration of the composition of Example 2, with a significant decrease in T turn in the 160 mg / kg dose group and T LA in the 50 mg / kg and 500 mg / kg dose groups.
  • tyrosine which had little effect on day 15, significantly reduced both T turn and T LA to 17 and 43 seconds on day 30.
  • the silk amino acid administration group shortened T turn and T LA , but the effect was lower than that of the tyrosine administration group and the composition administration group of Example 2 in which tyrosine and silk amino acid were mixed.
  • T turn and T LA were significantly improved to 18 seconds and 40 seconds, respectively (Table 4).
  • the ipsilateral forelimb (the left and right brains) is responsible for the other side of the body, and the left forefoot is damaged when the right brain is damaged.
  • Loss of function i.e., the ratio of force to the right forefoot.
  • Example 2 On day 15, 38% of normal animals used the right forefoot during standing up 10 times because normal animals used the left and right forelimbs at about the same frequency. In contrast, Parkinson's disease-induced animals that injured the right brain with 6-OHDA and reduced the function of the left foot increased the use of intact right paw to 68%.
  • the composition of Example 2 was administered to the right foot biased use, the dose-dependent frequency of bias was improved.
  • the concentration was restored to 50%.
  • tyrosine or L- DOPA (positive control) group also significantly improved the use of the right forefoot.
  • 50 mg / kg and 160 mg / kg did not show a significant effect in the silk amino acid group, but improved to a significant level in the 500 mg / kg group (Table 5).
  • Example 2 On the other hand, on the 30th day, the effect of the composition of Example 2 was further enhanced, and improved to the normal control level at the high dose as well as the 160 mg / kg administration group.
  • the tyrosine-treated group was slightly weaker than the 15th day, and the L- DOPA (positive control) -treated group showed the same effect as the normal control group.
  • the levels were similar at both 15 and 30 days (Table 5).
  • Apomorphine (0.05 mg / kg) was injected subcutaneously and the number of times the animal was contralateral circling for 1 hour using CCTV was recorded. At this time, the rotation was recorded once when the 360-degree full rotation using CCTV.
  • the animals were anesthetized by anesthesia 30 minutes after the administration of the test substance on the following day, i.e., on days 16 and 31.
  • Brain tissues were perfused with cold saline, fixed in 10% neutral formalin solution for 24 hours, and stored in 30% sucrose solution for 1 week. 40 ⁇ m frozen sections were prepared so that the fixed brain tissue showed black matter (AP -3.00 ⁇ -3.16).
  • TH In order to determine the degree of death of dopamine neurons by 6-OHDA, immunostaining was performed on TH to measure the number of neurons containing TH. In order to remove endogenous peroxidase present in the tissues, the cells were treated with 3% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and then pretreated with 3% bovine serum albumin (BSA) for 120 minutes at room temperature. Tissue slides were reacted with anti-TH primary antibody (rabbit polyclonal IgG, 1: 100, Millipore, Temecula, USA) overnight at 4 ° C and washed several times with phosphate-buffered saline (PBS).
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 2 In the administration group of the composition, the low dose (50 mg / kg) did not recover to about 30, but the medium dose (160 mg / kg) recovered to 55, especially the high dose (500 mg / kg). Esau excels at about 145. In comparison, the tyrosine (40 mg / kg) group recovered to about 115 and showed a significant cytoprotective effect. The L- DOPA (positive control) 25 mg / kg group also did not meet the effect of the high dose group of the Example 2 composition. Significant improvement was shown. On the other hand, the silk amino acid administration group had no significant effect at low dose (50 mg / kg), but significantly recovered to 53 at medium dose (160 mg / kg) and improved to about 83 at high dose (500 mg / kg). (Table 7).
  • the number of dopamine neurons in Parkinson's disease-causing animals was about 50, which was significantly reduced compared to 250 in normal animals.
  • the composition of Example 2 was restored to about 70 at low doses, significantly improved to about 125 at medium doses, and particularly to about 190 at high doses for excellent cytoprotective efficacy. Showed. Tyrosine also showed excellent protection against about 145.
  • L- DOPA positive control group
  • silk amino acid in the high dose administration group is about 102 cells protection The effect was the lowest.
  • Dopamine and its metabolite 3,4-dehydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and 3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid (homovanillic acid (HVA)) were analyzed from the brain tissues of some animals. Perfusion of the cerebral tissue with cold saline, rapid extraction and weighing was performed, followed by adding 0.1 M perchloric acid (500 ⁇ L) and 10-5 M isoproterenol (50 ⁇ L) containing 0.05% disodium ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Homogenized.
  • DOPAC 3,4-dehydroxyphenylacetic acid
  • HVA 3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid
  • HPLC high performance liquid chromatograph
  • the HPLC system consists of a solvent delivery pump (Waters Model 1525), an electrochemical detector (Waters Model 2465), and a Watchers 120 ODS-BP column (5 ⁇ m, 150 x 4.6 mm), with 0.1 M citric acid monohydrate, 0.1 M for the mobile phase.
  • Sodium acetate, 100 ⁇ M EDTA, 0.01% sodium octane sulfonate (SOS) and 7% methanol were used, and the flow rate was 1 mL / min.
  • composition for preventing and improving cerebral disease including silk amino acid and tyrosine of the present invention as an active ingredient has an excellent effect in preventing and treating Parkinson's disease, cerebral infarction, stroke or dementia.

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Abstract

본 발명은 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 파킨슨병, 뇌경색, 뇌졸중 또는 치매에 있어 뛰어난 효과를 갖는다.

Description

실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물
본 발명은 실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
파킨슨병(Parkinsonism 또는 Parkinson's disease, PD)은 미국에서만 50만 명 이상의 환자가 있는 것으로 추산되는 심각한 뇌질환으로, 뇌 흑질(substantia nigra pars compacta (SN) 부위의 도파민 신경세포(dopamine neurons) 소실에 따라 선조체(striatum)에서의 dopamine 분비 감소로 운동능력이 상실되는 것이 특징이다. 현재의 파킨슨병 표준 치료제로는 도파민 전구체인 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA 또는 Levo-DOPA)가 사용되고 있는 바, 이 약물은 증상을 상당히 완화시켜 주지만 장기간 사용할 경우 심각한 부작용이 동반되는 것으로 알려져 있다.
실크(silk)는 단백질 중합체로써 구성물질, 구조, 성분이 곤충의 종류에 따라 완전히 다르며, 가장 보편적으로 특성화된 실크로는 누에(Bombyx mori)와 거미 (Nephila clavipes 및 Araneus diadematus)로부터 유래된 것이 있다. Silk는 세리신(sericin)과 피브로인(fibroin) 두 가지 폴리펩타이드로 이루어져 있으며, 그 화학적 조성이 순수 천연 아미노산(amino acids)임이 밝혀짐에 따라 그 조성 아미노산의 생리활성에 따른 다양한 효능이 제시되고 있다.
본 발명자들은 심각한 부작용 없이 장기간 투약이 가능한 뇌질환 예방/치료용 조성물을 연구하던 중, 실크 아미노산을 티로신과 혼합한 조성물이 도파민 및 도파민성 신경세포 이상으로 인한 운동능력 저해, 도파민 증가, 신경세포 보호에 효과가 뛰어난 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뇌질환 예방 및 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌질환 예방 및 개선용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 투약하는 단계를 포함하는, 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물의 제조 방법 및 상기 조성물을 투약하는 단계를 포함하는 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 도파민성 신경세포를 보호하거나 도파민 및/또는 그 대사산물의 농도를 증가시킴으로써, 뇌질환을 예방하거나 개선, 치료하는 효과를 갖는다.
도 1은 6-OHDA 투여 15일 후 뇌내 흑질(SN) 부위의 TH 양성 신경세포를 나타낸다.
도 2는 6-OHDA 투여 30일 후 뇌내 흑질(SN) 부위의 TH 양성 신경세포를 나타낸다.
본 발명은 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물에 대한 것이다.
또한 본 발명은 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 혼합하는 단계를 포함하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투약하는 단계를 포함하는 뇌질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 조성물의 뇌질환 예방, 치료 및 개선 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 뇌질환의 예방, 개선 및 치료용 의약의 제조를 위한, 실크 아미노산 및 티로신을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 실크 아미노산(silk amino acid)은 누에 또는 누에번데기를 이용하여 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 실크 아미노산은 실크 단백질을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 실크 단백질은 피브로인 및/또는 세리신일 수 있다. 상기 실크 아미노산은 누에, 누에번데기 또는 실크 단백질을 산 가수분해하여 제조할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 티로신은 합성 티로신일 수도 있으며, 천연 티로신일 수도 있다. 또한 본 발명의 티로신은 실크, 누에고치 등으로부터 유래할 수도 있다. 그러나 티로신이면 본 발명을 실시하는데 문제가 없는바, 그 유래에 관계없이 본 발명의 티로신에 해당한다고 할 것이다.
상기 뇌질환은 파킨슨병, 뇌경색, 뇌졸중, 치매이나 이에 한정되는 것은 아니며 도파민 및/또는 도파민성 신경세포의 이상과 관련된 뇌질환이면 이에 해당한다 할 것이다.
본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 조성물은 도파민의 농도를 증가시키거나 신경세포가 파괴되는 것을 예방, 지연, 보호함으로써 뇌질환을 예방, 치료 및 개선할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 뇌질환으로 인하여 저해된 신체의 운동 기능을 회복, 개선시킬 수 있다.
본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 티로신을 0.01 내지 50 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 20 중량부 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.02 내지 12 중량부 포함할 수 있다. 조성물 100 중량부에 대하여, 티로신이 50 중량부를 초과하게 되면 뇌질환의 예방/개선 효능이 증가하는 것에 비하여, 티로신과 실크 아미노산의 혼합 시, 균질하게 혼합하기가 어렵고 혼합 시간도 과도하게 증가하여 전체적인 공정의 효율이 낮아진다. 또한 조성물 100 중량부에 대하여 티로신이 0.01 중량부 미만이 되면, 티로신 첨가로 인한 뇌질환 예방/개선 효능의 증가를 기대하기 어렵다.
본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물이 될 수 있다.
본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 환자는 뇌질환 환자이다. 본 발명의 환자는 파킨슨병, 뇌경색, 뇌졸중, 치매 등의 질환을 갖는 환자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 도파민 및/또는 도파민성 신경세포의 이상과 관련된 뇌질환을 갖는 환자면 본 발명의 환자에 해당한다.
또한 본 발명은 뇌질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 조성물을 첨가한 것도 포함된다.
본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 뇌질환 예방 및 개선용 조성물을 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 뇌질환 예방 및 개선용 조성물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 뇌질환 예방 및 개선용 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 뇌질환 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료>
실크 아미노산
실크 아미노산은 실크 단백질을 산 가수분해(acid hydrolysis)하여 얻은 미황색의 분말로 월드웨이㈜로부터 제공받았으며, 이를 4 ℃에서 보관하면서 사용하였다. 투여 전 농도별 필요량을 멸균정제수에 용해하여 경구로 투여하였으며, 용매대조군은 같은 멸균정제수를 동일량으로 투여하였다.
in vitro test
<실험예 1>
phosphate buffer(pH 6.8)에 최종농도 200, 500, 1,000, 1,500 및 2,000 μg/mL가 되도록 실크 아미노산을 녹여, 96-웰 플레이트에 각각 70 μL씩 넣고, mushroom tyrosinase(2,000 U/mg) 20 μL와 10 mM L-DOPA 10 μL를 첨가하였다. 이를 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후 microplate reader(Infinite 200, Tecan Group Ltd., Switzerland)를 이용해 475 nm에서 흡광도를 측정하여 티로신네이즈의 활성도를 비교하였다.
그 결과, 실크 아미노산의 농도가 증가할수록 티로신네이즈의 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 즉, 실크 아미노산의 농도가 200-500 μg/mL 범위에서는 티로시네이즈 활성에 유의한 변화가 없었으나, 실크 아미노산의 농도가 1000 μg/mL인 경우 티로시네이즈의 활성도가 약 5%, 1,500 μg/mL에서는 약 10%, 그리고 1,500 μg/mL에서는 약 14% 감소되었다(표 1). 그러므로 실크 아미노산은 티로시네이즈의 활성을 촉진시키지 않는 것으로 확인되었다.
표 1
Figure PCTKR2011005853-appb-T000001
<실험예 2>
실시예 1 내지 6의 제조
실크 아미노산을 티로신(tyrosine)과 혼합한 조성물을 제조하였다. 이를 구체적으로 살펴보면, 실크 아미노산 100 중량부에 대하여 2 중량부의 티로신을 혼합한 조성물(실시예 1), 4 중량부의 티로신을 혼합한 조성물(실시예 2), 8 중량부의 티로신을 혼합한 조성물(실시예 3), 12 중량부의 티로신을 혼합한 조성물(실시예 4), 16 중량부의 티로신을 혼합한 조성물(실시예 5), 20 중량부의 티로신을 혼합한 조성물(실시예 6)이다.
도파민 신경세포 배양 및 MPP+ 처리
동일 조건에서 사육된 임신 14-15일의 SD 래트를 경부탈골시켜 치사시키고, 복부를 절제하여 무균 조건 하에 태아를 분리하였다. 분리된 태아의 뇌로부터 흑질을 포함한 복측중뇌를 절제하여, 신경세포를 배양하였다. 뇌막을 완전히 제거한 뇌조직을 DMEM/F12 1:1 배양액으로 세척하여 혈액을 제거한 후, 소구경의 파스테르 피펫을 사용하여 단리세포를 얻어 원심관에 옮겨 700 rpm으로 8분간 원심분리하였다. 그 후 침전된 세포를 배양액으로 다시 부유시키고 동일한 과정을 2회 반복하여 수행한 후, 10 % 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12 1:1 배양액으로 부유한 후 광학현미경하에서 세포 수를 측정하고 60 mm 세포배양 플레이트에 6×106 cells, 96 well plate에는 각 well 당 6×104 세포를 배양하였다. 순수신경세포의 배양을 위해 혈청을 함유하지 않은 배양액을 사용하였다. 배양 시작 18-20 시간 후 우태아 혈청 대신 20 ㎍/㎖ 인슐린, 40 ㎍/㎖ 트랜스페린, 60 mM 셀레늄, 20 mM 프로게스테론, 100 μM 푸트레신(putrescin), 1 mM 피루베이트, 2 mM L-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.25 % 글루코스가 첨가된 DMEM/F12 1:1 배양액으로 교환하고, 37 ℃, 5 % CO2, 95 % air의 인큐베이터에서 배양하였다. 배양용기는 poly-L-lysine (10 ㎍/㎖)로 코팅하고 증류수로 3번 세척한 후 수분을 없앤 다음 사용하였다. 배양을 시작한 4 일째 일정 농도의 MPP+ 배양액에 24시간 동안 처리한 후 도파민 신경세포에 대한 독성을 알아보고 실크 아미노산, 티로신, 실시예 1 내지 6 및 L-DOPA (양성대조군)를 MPP+ 처리 1일 전부터 전처리하여 실험이 끝날 때까지 처리하였다.
결과
MPP+ 처리 24 시간 후, 배양 신경세포의 도파민, DOPAC(dihydroxyphenyl acetic acid), HVA(Homovanillic acid) 함량을 측정하였다(표 2). 파킨슨병을 유발시키자, 도파민, DOIPAC이 감소하였으며, HVA는 검출이 되지 않을 정도로 감소하였다. MPP+ 및 실크 아미노산을 처리한 군은 도파민 및 DOPAC 함량이 증가하였으나 유의한 수준은 아니었으며, HVA는 현저히 증가하였다. 그러나 실크 아미노산 및 티로신을 처리한 군(실시예 1 내지 6)은 도파민, DOPAC, HVA가 모두 유의한 수준으로 증가한 것이 확인되었다. 티로신만을 처리한 군은 도파민 및 HVA는 유의하게 증가하였으나 DOPAC는 파킨슨 군보다 오히려 감소하였다.
표 2
Figure PCTKR2011005853-appb-T000002
티로신일일 권장량 : 840mg/60kg
정상세포의 도파민, DOPAC, HVA함량 = 100%
In vivo test
실험예 2의 결과를 종합하여 볼 때, 티로신 4 %를 추가한 실시예 2의 조성물이 도파민, DOPAC, HVA의 함량도 유의하게 증가시키면서, 티로신끼리 서로 뭉치지도 않는 가장 적합한 농도로 확인되었는바, 이하 실시예 2의 조성물을 이용하여 in vivo 시험을 진행하였다.
<실험동물>
실험동물은 대한바이오링크(충북 음성)로부터 7주령 수컷 Sprague-Dawley (SD) 래트를 공급받아 약 1주간 순화과정을 거친 후 체중 약 200-250 g에 사용하였다. 동물은 래트용 케이지에 2마리씩 수용하였다. 동물실험실의 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150-300 Lux로 조절되었다. 실험동물용 pellet형 고형사료인 Purina Rat Chow® 바이오피아(경기도 군포)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.
<모델 동물의 준비>
모든 수술절차는 무균상태를 유지하면서 진행되었다. 래트를 enfluorane으로 흡입마취시키고 stereotaxic instrument에 보정한 다음, Hamilton syringe (26 gauge needle)를 사용하여 6-OHDA (8 μg)+ascorbic acid (0.6 μg)/3 μl saline을 우측 medial forebrain bundle [target coordinates: bregma로부터 anteroposterior (AP), -4.0; mediolateral (ML), 0.8; dorsoventral (DV), 8.0 mm]에 주사함으로써 파킨슨병을 유도하였다.
<약물 투여>
파킨슨병 모델 래트에, 파킨슨병의 유도 30분 전부터 31일간 본 발명의 실크 아미노산, 실크 아미노산 및 티로신 조성물을 멸균정제수(5 ㎖/㎏)에 용량별(50, 160 또는 500 ㎎ /㎏)로 용해하여 경구투여하였다. 티로신 역시 경구 투여하였으며(40 ㎎ /㎏), L-DOPA(양성대조군)는 복강 내로 주사하였다(25 ㎎ /㎏).
<실험예 3> Pole test
시험개시 15일과 30일째에 시험물질 투여 30분 후 직경 10 mm, 길이 55 cm의 거친 표면을 가진 봉의 상단부에 동물의 머리가 위로 향하도록 올려놓고 동물이 머리를 아래로 향할 때까지의 시간, 즉 turning time (Tturn)과 바닥으로 내려올 때까지의 시간, 즉 landing time (TLA)을 측정하였다. Landing 중 신체기능 이상으로 떨어지는 동물의 비율을 기록하였고, 이 경우 TLA을 90초로 하였다.
15일째에 정상동물은 떨어지는 예가 없었으나 6-OHDA 투여 파킨슨병 모델동물에서는 33%가 떨어져 뇌손상에 따른 운동기능 이상을 보여 주었다. Pole로부터의 낙하는 머리를 아래로 향할 때보다는 바닥으로 내려오는 도중에 떨어짐으로써 뇌손상에 따른 앞발의 신체 지지력이 약화되었기 때문으로 추정되었다. 이러한 신체기능 이상에 대해 실시예 2의 조성물 투여군은 50 mg/kg 및 500 mg/kg 투여 시는 효과가 없었지만, 중간용량인 160 mg/kg에서는 17%의 동물만이 낙하하였다. 한편, 실크 아미노산만 투여한 군에서는 모든 용량에서, 개선된 효과를 찾아볼 수 없었으며, 40 mg/kg의 tyrosine을 투여한 군에서는 17%의 동물만이 떨어졌다. 특히 L-DOPA(양성대조군) 25 mg/kg 투여군에서는 낙하하는 동물이 없었다(표 3).
6-OHDA 투여 후 30일째에는 뇌손상 유발동물의 86%가 pole test 도중 낙하하여 뇌손상이 더욱 진행되었음을 보여 주었다. 하지만 실시예 2의 조성물의 개선효과는 15일째보다 더욱 증진되어 50 및 160 mg/kg에서는 각각 15%와 17%만이 낙하하였으며, 500 mg/kg에서는 L-DOPA(양성대조군)와 비슷한 효과를 나타내어 떨어지는 동물이 없었다. 또한 티로신 투여군에서도 15%의 동물만이 낙하하였으며, L-DOPA(양성대조군) 투여군에서는 15일째와 마찬가지로 떨어지는 동물이 관찰되지 않았다. 실크 아미노산 투여군에서는 15일째 50 mg/kg ~ 500 mg/kg 투여 시, 파킨슨군에 비하여 효과가 없었으나 30일째 파킨슨군은 낙하율이 53% 증가한 반면 실크 아미노산 투여군은 50 mg/kg ~ 500 mg/kg 투여시, 낙하율이 최대 16% 증가하여, 파킨슨 군에 비하여 낙하율 증가량이 유의하게 감소하는 것으로 확인되었다.
표 3
Figure PCTKR2011005853-appb-T000003
한편, 15일째에 pole 위에서 동물이 머리를 아래로 향하는 시간인 Tturn과 바닥으로 내려올 때까지의 시간인 TLA를 측정한 결과, 정상동물에서는 각각 약 15초와 32초가 소요되었다. 이에 비해 파킨슨병 유발동물에서는 각각 34초와 48초로 정상동물의 약 2배와 1.5배로 유의하게 지연되었다. 실시예 2의 조성물 투여 시에는 이러한 신체기능 이상이 현저히 개선되었는데, Tturn과 TLA이 50 mg/kg에서는 각각 14초와 46초, 160 mg/kg에서는 각각 14초와 33초, 그리고 500 mg/kg에서는 각각 15초와 31초로 용량 의존적으로 유의하게 감소하여 고용량에서는 정상수준으로 회복되었다. 티로신 투여여군에서는 흥미롭게도 15일째에 거의 효과가 나타나지 않았으나 30일째에는 17초와 43초로 모두 유의하게 효과가 나타났다. 실크 아미노산 투여군에서는 Tturn, TLA이 모두 파킨슨군보다 감소하기는 하였으나, 고용량 투여군에서도 정상수준까지 감소하지는 않았다. L-DOPA(양성대조군) 투여군에서는 Tturn과 TLA이 각각 약 8초와 30초로 현저하게 개선되어 가장 좋은 효과를 보여 주었다.
파킨슨병 유발 30일째에는 Tturn과 TLA이 각각 46초와 81초로 지연되어 15일째에 비해 더 심한 신체기능 이상을 보여 주었다. 이러한 심각한 신체기능 이상은 실시예 2의 조성물 투여로 전반적으로 상당히 개선되었는바, 160 mg/kg 투여군에서는 Tturn이, 50 mg/kg 및 500 mg/kg 투여군에서는 TLA가 유의하게 감소하였다. 흥미롭게도 15일째에는 거의 효과가 없던 tyrosine은 30일째에는 Tturn과 TLA을 17초와 43초로 모두 유의하게 단축시켰다. 실크 아미노산 투여군은 Tturn과 TLA을 단축시켰으나 티로신 투여군 및 티로신과 실크 아미노산이 혼합된 실시예 2의 조성물 투여군에 비하여 효과가 떨어졌다. 한편, L-DOPA(양성대조군) 투여군에서는 Tturn과 TLA이 각각 18초와 40초로 현저하게 개선되었다(표 4).
표 4
Figure PCTKR2011005853-appb-T000004
<실시예 4> 실린더 테스트
CCTV가 설치된 glass cyclider (21 x 34 cm)에 동물을 넣고 10회 일어서는 행동 중 뇌손상 유발부위와 같은 쪽 앞발(ipsilateral forelimb, 좌우 뇌는 신체의 반대편을 관장하므로 우측 뇌가 손상받았을 때 좌측 앞발의 기능이 소실됨), 즉 우측 앞발에 힘을 실어 지탱하는 비율을 분석하였다.
15일째에 cylinder 벽을 짚고 일어서는 행동에 있어서 정상동물은 좌우 앞발을 사용하는 빈도가 거의 동일하여 10회 일어서는 동작 중 우측 앞발만을 사용한 경우가 38%로 기록되었다. 이에 비해 6-OHDA로 우측 뇌를 손상시켜 좌측발의 기능을 저하시킨 파킨슨병 유발동물에서는 온전한 우측 앞발만을 사용한 비율이 68%로 증가하였다. 이러한 우측발 편중 사용에 대해 실시예 2의 조성물을 투여했을 때에는 용량의존적으로 편중빈도가 개선되었는 바, 500 mg/kg 투여군에서는 50%로 정상수준까지 회복되었다. 또한 tyrosine이나 L-DOPA(양성대조군) 투여군 역시 우측 앞발 사용이 상당히 개선되었다. 반면 실크 아미노산만을 투여한 군에서는 50 mg/kg, 160 mg/kg 투여 시 유의한 효과가 보이지 않았고, 500 mg/kg 투여한 군에서 유의한 수준으로 개선되었다(표 5).
한편 30일째에는 실시예 2의 조성물의 효과가 더욱 증진되었는데, 고용량에서는 물론 160 mg/kg 투여군에서도 정상대조군 수준으로 개선되었다. 티로신 투여군은 15일째에 비하여 효과가 오히려 약간 약해졌으며, L-DOPA(양성대조군) 투여군은 15일째와 마찬가지로 정상대조군 수준의 효과를 보였다. 반면 실크 아미노산 투여군에서는 15일째와 30일째 모두 수준이 비슷하였다(표 5).
표 5
Figure PCTKR2011005853-appb-T000005
<실험예 5> Apomorphine turning test
Apomorphine (0.05 mg/kg)을 피하로 주사하고 CCTV를 이용하여 1시간 동안 동물이 뇌손상 반대편으로 회전(contralateral circling)하는 횟수를 기록하였다. 이 때 회전은 CCTV를 이용하여 360도 완전히 회전했을 때를 1회로 기록하였다.
실험 15일째에 0.05 mg/kg의 apomorphine을 피하로 주사했을 때 정상동물에서는 분당 2회의 회전을 보인 반면, 파킨슨병 유발동물에서는 분당 8회로 회전수가 4배 늘었다. 이러한 회전현상은 실크 아미노산, 티로신, L-DOPA (양성대조군), 실시예 2 조성물의 투여로 용량의존적으로 개선되었다(표 6).
30일째에서도 파킨슨병 유발군에서의 회전수가 분당 5회로 정상동물의 0.7회에 비해 7배 이상 크게 증가하여 심한 뇌손상을 보여 주었다. 이러한 현상은 실시예 2의 조성물 500 mg/kg 투여군, L-DOPA(양성대조군) 투여군, 티로신 투여군에서 절반 수준으로 유의하게 감소하였다(표 6).
표 6
Figure PCTKR2011005853-appb-T000006
<실험예 6> 뇌세포 사멸율 측정
신체기능 측정 다음 날, 즉 16일과 31일째에 시험물질 투여 30분 후 동물을 마취시켜 부검하였다. 뇌조직을 cold saline으로 관류한 후 10% 중성 formalin 용액에 24시간 고정한 후 30% sucrose 용액에 1주일간 보관하였다. 고정한 뇌조직을 흑질(AP -3.00 ~ -3.16) 부위가 나타나도록 40 μm 동결절편을 제작하였다.
6-OHDA에 의한 도파민 신경의 사멸 정도를 파악하기 위하여 TH 함유 뉴론 수를 측정하기 위하여 TH에 대한 면역염색을 수행하였다. 조직 내 존재하는 endogenous peroxidase를 제거하기 위해 3% 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)로 처리한 후 실온에서 3% bovine serum albumin (BSA)로 120분간 전처리하였다. 조직슬라이드를 1차 항체인 anti-TH primary antibody (rabbit polyclonal IgG, 1:100, Millipore, Temecula, USA)와 4℃에서 overnight 반응시킨 후 phosphate-buffered saline (PBS)으로 수회 세척하였다. 다시 2차 항체인 green Alexa Fluor 488- 또는 red Alexa Fluor 594 (red)-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:200, Molecular probes, Eugene, USA)와 실온에서 1시간 반응시키고 PBS로 세척한 후 봉입하였다.
6-OHDA 투여로 인한 뇌내 흑질(SN) 부위의 TH 양성 신경세포, 즉 도파민 뉴론의 사멸에 대한 시험물질의 보호효과를 관찰하기 위해 면역 염색한 결과, 정상동물에서는 세포체가 선명하게 밀집되어 보였으며, 세포체 내는 물론 축삭(axons)과 수지상돌기(dendrites)로 구성된 섬유(fibers)에도 양성반응을 보이는 다량의 TH가 확인되었다(도 1A). 반면 파킨슨병 유발동물에서는 15일째에 대부분의 도파민 신경세포가 사멸하였으며, 잔류한 세포 역시 축삭과 수지상돌기가 소실된 형상을 보여 주었다(도 1B). 실시예 2의 조성물의 경우, 50 mg/kg 투여군(도시하지 않음) 및 160 mg/kg 투여군(도 1C)에 비하여, 500 mg/kg 투여군에서는 도파민 뉴론이 거의 정상으로 유지된 것(도 1D)이 확인되었다. 한편 티로신 및 L-DOPA(양성대조군) 25 mg/kg 투여군 역시 좋은 효과를 보였다(각각 도 1E 및 도 1F). 실크 아미노산 투여군은 저용량에서는 도파민 뉴런 사멸 정도에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 증가하기는 하나 다른 투여군에 비하여 효과가 좋은 것은 아니었다(도시하지 않음).
6-OHDA 투여 후 30일째에도 정상동물(도 2A)에 비하여 파킨슨병 유발동물에서는 대부분의 도파민 신경세포가 사멸하였으며, 잔류한 세포 역시 축삭과 수지상돌기가 소실되는 현상을 보여 주었다(도 2B). 15일째에 비하여 30일째에는 실시예 2의 조성물 160 mg/kg 투여군에서도 상당한 세포보호 효과가 관찰되었으며(도 2C), 고용량인 500 mg/kg 투여군에서는 거의 정상수준으로 유지되었다(도 2D). 한편 실시예 2 조성물을 500 mg/kg 투여한 군보다는 낮았지만 티로신 투여군에서도 우수한 세포보호 효과가 나타났으며(도 2E), L-DOPA(양성대조군) 투여군에서도 좋은 효과가 확인되었다(도 2F). 실크 아미노산 투여군 역시 15일째에 비하여 세포보호 효과가 증가하였으나 유의한 수준은 아니었다(도시하지 않음).
6-OHDA 투여로 인한 도파민 뉴론의 사멸과 그에 대한 시험물질의 보호효과를 정량화하기 위하여 TH 양성 세포수를 계수한 결과, 400배 현미경 시야당 세포수에 있어서 15일째에 정상동물은 약 210개인데 비해 파킨슨병 유발군에서는 약 20개로 크게 감소하였다. 실시예 2 조성물의 투여군의 경우 저용량(50 mg/kg)에서는 약 30개로 유의한 수준으로 회복되지 않았지만 중간용량(160 mg/kg)에서는 55개로 유의하게 회복되었으며, 특히 고용량(500 mg/kg)에서는 약 145개로 탁월하게 개선되었다. 이에 비하여 tyrosine (40 mg/kg) 투여군에서는 약 115개로 회복되어 상당한 세포보호 효과를 보여 주었으며, L-DOPA(양성대조군) 25 mg/kg 투여군 역시 실시예 2 조성물의 고용량 투여군의 효과에는 못 미쳤지만 유의한 개선효과를 보여 주었다. 한편, 실크 아미노산 투여군은 저용량(50 mg/kg)에서는 유의한 영향을 미치지 않았으나, 중간용량(160 mg/kg)에서는 53개로 유의하게 회복되었으며, 고용량(500 mg/kg)에서는 약 83개로 개선되었다(표 7).
30일째에도 파킨슨병 유발동물의 도파민 뉴론수는 약 50개로 정상동물의 250개에 비해 현저히 줄어들었다. 이러한 6-OHDA의 신경세포 독성에 대하여, 실시예 2의 조성물은 저용량 투여시 약 70개로 회복시켰으며, 중간용량에서는 약 125개로 유의하게 개선시켰고, 특히 고용량에서는 약 190개로 회복시킴으로써 탁월한 세포보호 효능을 보여 주었다. 티로신 역시 약 145개로 우수한 보호효과를 나타냈다. 한편, L-DOPA(양성대조군)는 약 120개로 좋은 효과를 보여 주었으나 실시예 2의 조성물의 고용량 투여군 또는 티로신에 비해 상대적으로 약한 효능을 발휘하였고, 실크 아미노산은 고용량 투여군에서도 약 102개로 세포 보호효과가 가장 낮았다.
표 7
Figure PCTKR2011005853-appb-T000007
<실험예 7> Dopamine 및 그 분해산물 농도 분석
일부 동물의 뇌조직으로부터 dopamine 및 그 대사산물인 3,4-dehydroxyphenylacetic acid (DOPAC)과 3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid (homovanillic acid, HVA)를 분석하였다. 대뇌조직을 cold saline으로 관류하고 신속하게 적출하여 중량을 측정한 다음, 0.05% disodium ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)가 함유된 0.1 M perchloric acid (500 μL)와 10-5 M isoproterenol (50 μL)을 넣고 균질화하였다.
균질액을 12,000 rpm (0℃)에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 30배 희석한 다음 10 μL를 high performance liquid chromatograph (HPLC)에 주입하여 분석하였다. HPLC system은 Solvent delivery pump (Waters Model 1525), Electrochemical detector (Waters Model 2465) 및 Watchers 120 ODS-BP column (5 μm, 150 x 4.6 mm)로 구성되었으며, mobile phase로는 0.1 M citric acid monohydrate, 0.1 M sodium acetate, 100 μM EDTA, 0.01% sodium octane sulfonate (SOS), 7% methanol을 사용하였고, flow rate는 1 mL/min이었다.
6-OHDA 투여로 인한 뇌조직 내 dopamine과 그 대사산물인 DOPAC 및 HVA의 농도를 분석한 결과, 파킨슨병 유발동물에서는 대조군에 비해 dopamine은 약 45%, DOPAC은 약 25% 수준으로 감소하였으며, HVA는 분석 가능한 수준 이하로 떨어졌다. 6-OHDA에 의한 이러한 dopamine과 그 대사물의 저하는 실시예 2의 조성물을 투여함으로써(500 mg/kg) 모두 유의하게 회복되었다. 티로신 역시 도파민과 그 대사물의 농도를 효과적으로 회복시켰으며. 특히 L-DOPA(양성대조군) 25 mg/kg 는 도파민과 HVA를 정상 수준 이상으로 회복시켰다. 그러나 실크 아미노산은 HVA는 효과적으로 회복시켰으나, 도파민 및 DOPAC 증가량은 유의한 수준은 아니었다(표 8).
표 8
Figure PCTKR2011005853-appb-T000008
본 발명의 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 및 개선용 조성물은 파킨슨병, 뇌경색, 뇌졸중 또는 치매의 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 갖는다.

Claims (10)

  1. 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 뇌질환은 파킨슨병, 뇌경색, 뇌졸중 또는 치매인 것을 특징으로 하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    도파민성 신경세포를 보호하거나 도파민의 농도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 실크 아미노산은 실크 단백질을 산 가수분해한 산물인 것을 특징으로 하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 50의 중량부의 티로신을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 뇌질환 예방 및 개선용 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌질환의 예방 및 치료 방법.
  8. 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 혼합하는 단계를 포함하는 뇌질환 예방, 치료 및 개선용 조성물의 제조 방법.
  9. 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 조성물의 뇌질환 예방, 치료 및 개선 용도.
  10. 뇌질환의 예방, 개선 및 치료용 의약의 제조를 위한, 실크 아미노산(silk amino acid) 및 티로신(tyrosine)을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
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