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WO2025053209A1 - ホスホジエステラーゼ及びその用途 - Google Patents

ホスホジエステラーゼ及びその用途 Download PDF

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WO2025053209A1
WO2025053209A1 PCT/JP2024/031834 JP2024031834W WO2025053209A1 WO 2025053209 A1 WO2025053209 A1 WO 2025053209A1 JP 2024031834 W JP2024031834 W JP 2024031834W WO 2025053209 A1 WO2025053209 A1 WO 2025053209A1
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WO
WIPO (PCT)
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less
phosphodiesterase
nucleic acid
present
gmp
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2024/031834
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English (en)
French (fr)
Inventor
杏匠 酒井
七星 高羽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Enzyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amano Enzyme Inc filed Critical Amano Enzyme Inc
Publication of WO2025053209A1 publication Critical patent/WO2025053209A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L31/00—Edible extracts or preparations of fungi; Preparation or treatment thereof
    • A23L31/10—Yeasts or derivatives thereof
    • A23L31/15—Extracts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Definitions

  • the present invention relates to a novel phosphodiesterase and uses thereof. More specifically, the present invention relates to a novel phosphodiesterase derived from Leptographium sp. that has excellent 5'-guanosine monophosphate (GMP) production ability even under conditions of high substrate concentration, and uses thereof.
  • GMP 5'-guanosine monophosphate
  • nucleic acid seasonings such as yeast extract are widely used as umami ingredients. It is known that the umami taste of yeast extract is mainly due to the 5'-guanosine monophosphate (GMP) contained in the extract.
  • GMP 5'-guanosine monophosphate
  • a commonly used method is to produce GMP by allowing phosphodiesterase to act on nucleic acids in yeast.
  • One such phosphodiesterase that is widely used is one derived from bacteria of the genus Penicillium (Patent Document 1).
  • the object of the present invention is to provide a novel phosphodiesterase capable of producing high levels of GMP even under conditions of high substrate concentration, and to provide a method for efficiently producing a GMP-containing composition, such as a yeast extract, using the enzyme.
  • the present invention provides the following.
  • [1] A phosphodiesterase derived from a bacterium of the genus Leptographium, which contains an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 60% or more identity thereto, and has high GMP-producing ability even in the presence of a high concentration of nucleic acid.
  • [2] The phosphodiesterase according to [1], wherein the Leptographium bacterium is Leptographium procerum.
  • a method for producing a composition containing 5'-guanosine monophosphate comprising contacting a composition containing a nucleic acid with the phosphodiesterase according to any one of [1] to [3] or the enzyme preparation according to any one of [4] to [7].
  • a vector comprising the nucleic acid described in claim 1.
  • a cell comprising the vector described in.
  • GMP can be efficiently produced from nucleic acids even under high substrate concentration conditions. Furthermore, according to the present invention, it is possible to produce compositions containing GMP, including yeast extract, under reaction conditions that could not be adopted when using conventional enzymes.
  • Phosphodiesterase The present invention provides a phosphodiesterase derived from a bacterium of the genus Leptographium, which contains an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence that is 60% or more identical to said amino acid sequence, and has high GMP-producing ability even in the presence of a high concentration of nucleic acid (hereinafter, sometimes referred to as the "phosphodiesterase of the present invention").
  • Phosphodiesterase is an enzyme that hydrolyzes one of the bonds of a phosphodiester bond.
  • the phosphodiesterase of the present invention is derived from a bacterium of the genus Leptographium, and is characterized by being resistant to substrate inhibition even in the presence of high concentrations of its substrate nucleic acid, and by having high phosphodiesterase activity (particularly GMP-generating activity in the present invention).
  • Leptographium procerum Leptographium terrebrantis
  • Leptographium wingfieldii Leptographium abietinum
  • Leptographium serpenum Leptographium serpenum
  • Leptographium spp. s Leptographium lundbergii, Leptographium wageneri, Leptographium longiclavatum, Leptographium sinense, and Leptographium murrayi, but are not limited thereto.
  • the Leptographium genus bacterium may be Leptographium procerum. More preferably, the Leptographium procerum NBRC110178 strain may be used. This strain is available from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biotechnology Center (NBRC).
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • NBRC Biotechnology Center
  • the phosphodiesterase of the present invention is characterized by having high resistance to substrate inhibition.
  • the ratio of substrate (i.e., nucleic acid) and phosphodiesterase at which the phosphodiesterase of the present invention can exert its properties is not particularly limited as long as the desired effect is achieved, but is usually 1000 U or less per 1 mg of nucleic acid, preferably 900 U or less, 800 U or less, 700 U or less, 600 U or less, 500 U or less, 400 U or less, 300 U or less, 200 U or less, 100 U or less, 90 U or less, 80 U or less, 70 U or less, 60 U or less, 50 U or less, 45 U or less, 40 U or less, 35 U or less, 30 U or less, or 25 U or less, and more preferably 20 U or less, 15 U or less, 13.5 U or less, 10 U or less, or 5 U or less.
  • the lower limit is not particularly limited as long as the desired effect is achieved, but is usually 0.01 U or more, preferably 0.1 U or more, 1 U or more, or 5 U or more per 1 mg of nucleic acid.
  • the ratio of substrate (nucleic acid):phosphodiesterase is usually 0.01 to 1000 U, preferably 0.1 to 500 U, 1 to 300 U, 5 to 100 U, 10 to 90 U, 10 to 60 U, 10 to 40 U, or 10 to 20 U per 1 mg of nucleic acid, but is not limited thereto.
  • phosphodiesterase activity is defined as the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of phosphate per minute when phosphodiesterase (particularly ribonuclease) is allowed to act on 3'-AMP as a substrate, and 1 U is defined as this amount.
  • the phosphodiesterase of the present invention has a higher ability to produce 5'-guanosine monophosphate (sometimes referred to as "GMP" in this specification) at a high substrate concentration than existing phosphodiesterases.
  • the phosphodiesterase of the present invention can also be defined in terms of its ability to produce GMP at a high substrate concentration as follows. ⁇ Condition 1> Ribonucleic acid concentration: 40 mg/ml Reaction temperature: 70° C.
  • Reaction time 180 minutes pH of reaction solution: 5.5 Amount of phosphodiesterase added per mg of substrate RNA: 60.8 U
  • the amount of GMP produced is 15 mg/mL or more (preferably 16 mg/mL or more, more preferably 17 mg/mL or more)
  • Ribonucleic acid concentration 60 mg/ml
  • Reaction time 180 minutes pH of reaction solution: 5.5 Amount of phosphodiesterase added per 1 mg of substrate RNA: 40.5 U
  • the amount of GMP produced is 20 mg/mL or more (preferably 21 mg/mL or more, more preferably 22 mg/mL or more)
  • the phosphodiesterase of the present invention can be defined as follows: ⁇ Condition 3> Ribonucleic acid concentration: 120 mg/ml Reaction temperature: 70° C. Reaction time: 180 minutes pH of reaction solution: 5.5 Amount of phosphodiesterase added per mg of substrate RNA: 20.3 U
  • the amount of GMP produced is 19 mg/mL or more (preferably 20 mg/mL or more, more preferably 21 mg/mL or more)
  • the phosphodiesterase of the present invention can be defined as follows: ⁇ Condition 4> Ribonucleic acid concentration: 180 mg/ml Reaction temperature: 70° C. Reaction time: 180 minutes pH of reaction solution: 5.5 Amount of phosphodiesterase added per mg of substrate RNA: 13.5 U
  • the amount of GMP produced is 13 mg/mL or more (preferably 14 mg/mL or more, more preferably 15 mg/mL or more)
  • the phosphodiesterase of the present invention has a GMP production ability that is at least 2.6 times higher than that of a control phosphodiesterase under the following conditions.
  • Ribonucleic acid concentration 240 mg/ml
  • Reaction temperature 70° C.
  • Reaction time 180 minutes pH of reaction solution: 5.5
  • Amount of phosphodiesterase added per 1 mg of substrate RNA 10.1 U
  • the amount of GMP produced is 8 mg/mL or more (preferably 9 mg/mL or more, more preferably 10 mg/mL or more)
  • the phosphodiesterase of the present invention comprises or consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence that is 60% or more, preferably 70% or more, 80% or more, or 90% or more (more preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the phosphodiesterase that comprises or consists of an amino acid sequence that is 60% or more, preferably 70% or more, 80% or more, or 90% or more (more preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be a phosphodiesterase having a GMP production ability equal to or greater than that of a phosphodiesterase consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the identity (%) of the amino acid sequence may be determined by a method known per se, for example, it can be calculated and determined using sequence comparison software such as Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • the active center of the phosphodiesterase of the present invention is the seven amino acids (DSYRATA (SEQ ID NO:5), D and R are the binding sites) located at positions 45 to 51 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 (corresponding to positions 65 to 71 in SEQ ID NO:2). Therefore, the phosphodiesterase of the present invention may have no substitutions at positions 45 to 51 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and may have substitutions at other positions.
  • the phosphodiesterase of the present invention derived from Leptographium sp. can be prepared by a method known per se.
  • the phosphodiesterase of the present invention derived from Leptographium sp. can be prepared by isolating it from a culture solution of Leptographium sp.
  • the phosphodiesterase of the present invention can be prepared by introducing a nucleic acid encoding the phosphodiesterase of the present invention into a microorganism for protein expression using recombinant gene technology or genome editing technology and culturing the microorganism.
  • a preparation method is a method in which the target phosphodiesterase is recovered from the culture solution or cells of Leptographium sp.
  • the cells When phosphodiesterase is secreted from the cells, the cells can be removed from the culture solution using filtration or centrifugation as necessary, and the phosphodiesterase can be separated and/or purified from the culture solution from which the cells have been removed.
  • the bacterial cells when phosphodiesterase is not secreted from the bacterial cells, the bacterial cells can be recovered from the culture medium, and the recovered bacterial cells can be subjected to pressure treatment or ultrasonic treatment to disrupt the cells, after which the phosphodiesterase can be separated and/or purified.
  • a method for separating and/or purifying phosphodiesterase a method for separating and/or purifying protein that is known per se can be used. Examples of such methods include, but are not limited to, centrifugation, UF concentration, salting out, and various chromatography methods using ion exchange resins, etc.
  • the phosphodiesterase of the present invention When the phosphodiesterase of the present invention is prepared using a microorganism, the phosphodiesterase of the present invention may or may not be isolated and/or purified from the microorganism. When the phosphodiesterase of the present invention is purified, the purity of the purified phosphodiesterase is not particularly limited.
  • the phosphodiesterase of the present invention may be a nuclease or a ribonuclease.
  • the present invention also provides an enzymatic preparation for degrading a composition with high nucleic acid content (hereinafter, sometimes referred to as the "enzymatic preparation of the present invention"), which contains the phosphodiesterase of the present invention.
  • the phosphodiesterase of the present invention is characterized by having a higher GMP production ability than existing phosphodiesterases at high substrate concentrations. Therefore, by utilizing this aspect of the phosphodiesterase of the present invention, it is possible to efficiently decompose nucleic acids in compositions containing high concentrations of the nucleic acids, compared to existing phosphodiesterases.
  • the amount of the phosphodiesterase of the present invention in the decomposition enzyme preparation of the present invention is not particularly limited.
  • the amount of the phosphodiesterase is usually 0.0001 to 100% by weight, preferably 0.001 to 100% by weight, based on the weight of the enzyme preparation of the present invention.
  • the decomposition enzyme preparation of the present invention may contain components other than the phosphodiesterase of the present invention.
  • Such components include, but are not limited to, additives such as stabilizers, buffers, preservatives, excipients, suspending agents, antiseptics, pH adjusters, and physiological saline.
  • Excipients include, but are not limited to, starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, and glycerol.
  • Buffers include, but are not limited to, phosphates, citrates, and acetates.
  • Stabilizers include, but are not limited to, propylene glycol, ascorbic acid, and the like.
  • Preservatives include, but are not limited to, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, and methylparaben.
  • Preservatives include, but are not limited to, ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, and chlorobutanol.
  • pH adjusters include, but are not limited to, acetate buffer, phosphate buffer, MES buffer, HEPES buffer, PIPES buffer, Bis-tris buffer, MOPS buffer, etc. These additives may be contained alone or in combination of multiple types.
  • the form of the decomposition enzyme preparation of the present invention is not particularly limited as long as the biological activity of the phosphodiesterase of the present invention is maintained, and it may be in any form, such as a solid, semi-solid, powder, slurry, or liquid.
  • the nucleic acid-rich composition to which the decomposing enzyme of the present invention is applied means a composition that contains a large amount of nucleic acid to such an extent that the GMP production ability of an existing phosphodiesterase (e.g., phosphodiesterase derived from bacteria of the genus Penicillium) is reduced by substrate inhibition.
  • the nucleic acid-rich composition may be a composition that contains a large amount of nucleic acid endogenously (e.g., high nucleic acid yeast), or may be a composition in which nucleic acid has been added from outside to increase the nucleic acid concentration.
  • the nucleic acid concentration contained in the high nucleic acid content composition is not particularly limited as long as it is sufficient to cause a decrease in the activity of existing phosphodiesterase, but is usually 35 mg/mL or more, preferably 40 mg/mL or more, 45 mg/mL or more, 50 mg/mL or more, 55 mg/mL or more, 60 mg/mL or more, 65 mg/mL or more, 70 mg/mL or more, 75 mg/mL or more, 80 mg/mL or more, 85 mg/mL or more, 90 mg/mL or more, 95 mg/mL or more, 100 mg/mL or more, 110 mg/mL or more, 120 mg/mL or more, 130 mg/mL or more, 140 mg/mL or more, 150 mg/mL or more, 160 mg/mL or more, 170 mg/mL or more, and ...
  • the concentration may be, but is not limited to, 0 mg/mL or more, 180 mg/mL or more, 190 mg/mL or more, 200 mg/mL or more, 210 mg/mL or more, 220 mg/mL or more, 230 mg/mL or more, 240 mg/mL or more, 250 mg/mL or more, 260 mg/mL or more, 270 mg/mL or more, 280 mg/mL or more, 290 mg/mL or more, 300 mg/mL or more, 350 mg/mL or more, 400 mg/mL or more, 500 mg/mL or more, 600 mg/mL or more, 700 mg/mL or more, 800 mg/mL or more, 900 mg/mL or more, 1000 mg/mL or more, 1100 mg/mL or more, or 1200 mg/mL or more.
  • the upper limit of the nucleic acid concentration is not particularly limited, but is usually 10,000 mg/mL or less, preferably 9,000 mg/mL or less, 8,000 mg/mL or less, 7,000 mg/mL or less, 6,000 mg/mL or less, 5,000 mg/mL or less, 4,000 mg/mL or less, 3,500 mg/mL or less, 3,400 mg/mL or less, 3,300 mg/mL or less, 3,200 mg/mL or less, 3,100 mg/mL or less, 3,000 mg/mL or less, 2,900 mg/mL or less, 2,800 mg/mL or less, mL or less, 2700 mg/mL or less, 2600 mg/mL or less, 2500 mg/mL or less, 2400 mg/mL or less, 2300 mg/mL or less, 2200 mg/mL or less, 2100 mg/mL or less, 2000 mg/mL or less, 19 00mg/mL or less, 1800mg/mL or less, 1800mg
  • the amount of the decomposition enzyme of the present invention to be added to a composition with a high nucleic acid content may vary depending on the amount of the phosphodiesterase of the present invention contained in the decomposition enzyme of the present invention, the reaction conditions of the enzyme, etc., but may be appropriately determined using a method known per se.
  • the present invention also provides an enzymatic preparation for producing a GMP-containing composition, which contains the phosphodiesterase of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the "enzymatic preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention").
  • the phosphodiesterase of the present invention can efficiently produce GMP using nucleic acid as a substrate, particularly under conditions of high substrate concentration.
  • the phosphodiesterase of the present invention can be suitably used in the production of compositions containing GMP, including yeast extract.
  • the phosphodiesterase of the present invention is less likely to cause substrate inhibition even under conditions of high substrate concentration, and as a result, it is possible to produce compositions with a high GMP content.
  • the amount of the phosphodiesterase of the present invention in the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention, the components other than the phosphodiesterase, the form, etc. are the same as those described for the decomposition enzyme preparation of the present invention.
  • the amount of the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention to be added may vary based on the amount of the phosphodiesterase of the present invention in the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention, reaction conditions, etc., but may be appropriately determined using a method known per se.
  • the subject to which the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention is applied is not particularly limited, but since the phosphodiesterase of the present invention contained in the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention uses nucleic acid as a substrate and aims to produce GMP, it is essential that the subject to which the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention is applied contains nucleic acid.
  • the nucleic acid may be derived from the subject or may be added from the outside.
  • yeast extract is a process for producing yeast extract using the enzyme preparation for producing a GMP-containing composition of the present invention.
  • Yeast grown by a conventional method is collected, and the collected yeast is disrupted using a homogenizer or ultrasonic treatment, and the intracellular components are extracted with a solvent.
  • the resulting extract is filtered to remove solids, and then the resulting liquid is concentrated by evaporation or centrifugation to prepare a yeast extract.
  • the phosphodiesterase of the present invention is added to the prepared yeast extract, and the reaction is carried out for 1 to 24 hours under conditions of 50 to 90°C and pH 4.0 to 7.0, thereby converting the nucleic acid (particularly RNA) contained in the yeast extract into GMP.
  • the timing of the action of the phosphodiesterase of the present invention on the yeast or yeast extract is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, and may be any of the steps of the yeast disruption step, the intracellular components extraction step with a solvent, the extract solution filtering to remove solids, or the concentration step.
  • the yeast used as the raw material may be a yeast characterized by containing a large amount of nucleic acid. This aspect can be interpreted as a method for producing a yeast extract containing a high concentration of GMP, which includes a step of allowing the phosphodiesterase of the present invention to act on yeast or yeast extract (hereinafter, this may be referred to as the "method for producing the yeast extract of the present invention").
  • the GMP content of such a yeast extract may be, but is not limited to, usually 1 mg/mL or more, preferably 2 mg/mL or more, 3 mg/mL or more, 4 mg/mL or more, 5 mg/mL or more, 6 mg/mL or more, 7 mg/mL or more, 8 mg/mL or more, or 9 mg/mL or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually 1000 mg/mL or less, preferably 900 mg/mL or less, 800 mg/mL or less, 700 mg/mL or less, 600 mg/mL or less, 500 mg/mL or less, 450 mg/mL or less, 400 mg/mL or less, or 350 mg/mL or less, 300 mg/mL or less, 250 mg/mL or less, 200 mg/mL or less, 190 mg/mL or less, 180 mg/mL or less, 170 mg/mL or less, 160 mg/mL or less, 150 mg/mL or less, 140 mg/mL or less, 130 mg/mL or less.
  • a specific embodiment of the method for producing a yeast extract of the present invention is as follows: A method for producing a yeast extract, comprising the steps of: A first step of providing a composition comprising a nucleic acid; A second step of allowing the phosphodiesterase of the present invention to act on the composition containing the nucleic acid prepared in the first step; and a step of recovering the composition containing GMP prepared in the second step.
  • the nucleic acid used in this embodiment may be chemically synthesized or derived from a living organism.
  • the species of organism from which the nucleic acid is derived is not particularly limited, but may preferably be yeast.
  • the nucleic acid concentration of the composition containing the nucleic acid prepared in the first step is preferably high.
  • a nucleic acid concentration is not particularly limited as long as it is sufficient to cause a decrease in the activity of existing phosphodiesterase, but is usually 35 mg/mL or more, preferably 40 mg/mL or more, 45 mg/mL or more, 50 mg/mL or more, 55 mg/mL or more, 60 mg/mL or more, 65 mg/mL or more, 70 mg/mL or more, 75 mg/mL or more, 80 mg/mL or more, 85 mg/mL or more, 90 mg/mL or more, 95 mg/mL or more, 100 mg/mL or more, 110 mg/mL or more, 120 mg/mL or more, 130 mg/mL or more, 140 mg/mL or more, 150 mg/mL or more, 160 mg/mL or more, 170 mg/mL or more.
  • 180 mg/mL or more 180 mg/mL or more, 190 mg/mL or more, 200 mg/mL or more, 210 mg/mL or more, 220 mg/mL or more, 230 mg/mL or more, 240 mg/mL or more, 250 mg/mL or more, 260 mg/mL or more, 270 mg/mL or more, 280 mg/mL or more, 290 mg/mL or more, 300 mg/mL or more, 350 mg/mL or more, 400 mg/mL or more, 500 mg/mL or more, 600 mg/mL or more, 700 mg/mL or more, 800 mg/mL or more, 900 mg/mL or more, 1000 mg/mL or more, 1100 mg/mL or more, or 1200 mg/mL or more, but are not limited to these.
  • the upper limit of the nucleic acid concentration is not particularly limited, but is usually 10,000 mg/mL or less, preferably 9,000 mg/mL or less, 8,000 mg/mL or less, 7,000 mg/mL or less, 6,000 mg/mL or less, 5,000 mg/mL or less, 4,000 mg/mL or less, 3,500 mg/mL or less, 3,400 mg/mL or less, 3,300 mg/mL or less, 3,200 mg/mL or less, 3,100 mg/mL or less, 3,000 mg/mL or less, 2,900 mg/mL or less, 2,800 mg/mL or less, mL or less, 2700 mg/mL or less, 2600 mg/mL or less, 2500 mg/mL or less, 2400 mg/mL or less, 2300 mg/mL or less, 2200 mg/mL or less, 2100 mg/mL or less, 2000 mg/mL or less, 19 00mg/mL or less, 1800mg/mL or less, 1800mg
  • yeast extract of the present invention it is possible to obtain liquid or solid (typically, powdered, granular, etc.) yeast extract.
  • the yeast extract obtained by the method for producing yeast extract of the present invention can be used to enhance or adjust the flavor of various foods and beverages.
  • Examples of applicable foods and beverages include processed seafood products (chikuwa, kamaboko, hanpen, dried squid, dried fish, salted fish, fish sausage, tsukudani, canned foods, etc.), processed meat products (ham, bacon, sausage, jerky, corned beef, formed meat, etc.), processed vegetables (canned and bottled vegetables, processed tomatoes, processed mushrooms, pickled vegetables, dried vegetables, tsukudani, etc.), noodles and breads (various types of noodles, bread, sweet bread, etc.), processed grain products (cereals, oatmeal, muesli, processed rice products, wheat gluten, barley tea, etc.), dairy products (milk, processed milk, dairy drinks, concentrated milk, powdered milk, condensed milk, fermented milk, lactic acid bacteria drinks, butter, cheese, ice cream, etc.), processed fruit products (canned and bottled fruit jams, marmalades, dried fruits, etc.), sweets and desserts (biscuits, baked goods, rice confectioneries,
  • the present invention also provides a nucleic acid represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or a nucleic acid having 60% or more sequence identity thereto (hereinafter, sometimes referred to as the "nucleic acid of the present invention"), a vector containing the nucleic acid (hereinafter, sometimes referred to as the "vector of the present invention”), or a cell containing the vector (hereinafter, sometimes referred to as the "cell of the present invention”).
  • the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid that encodes the above-mentioned phosphodiesterase of the present invention.
  • the amino acid sequence of the phosphodiesterase of the present invention is as described above. When the amino acid sequence is known, a person skilled in the art can determine the nucleic acid sequence that encodes the amino acid sequence using a method known per se. Note that SEQ ID NO: 3 is a nucleic acid that encodes the phosphodiesterase of the present invention (without a signal sequence), and SEQ ID NO: 4 is a nucleic acid that encodes the phosphodiesterase of the present invention (with a signal sequence).
  • the nucleic acid of the present invention may have a codon replaced with a degenerate codon, so long as it encodes the phosphodiesterase of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention may not be SEQ ID NO:3 or SEQ ID NO:4 itself, so long as it encodes the phosphodiesterase of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention comprises or consists of a nucleic acid represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or a nucleic acid that is 60% or more, preferably 70% or more, 80% or more, or 90% or more (more preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) identical to the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the nucleic acid that comprises or consists of a nucleic acid that is 60% or more, preferably 70% or more, 80% or more, or 90% or more (more preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) identical to the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 3 or 4 may be a nucleic acid encoding a phosphodiesterase having a GMP-producing ability equal to or greater than that of a phosphodiesterase consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the identity (%) of the nucleic acid sequence may be determined by a method known per se.
  • the nucleic acid of the present invention may be unmodified in the nucleic acid encoding the amino acid at the active center of the phosphodiesterase of the present invention (i.e., GACTCGTATCGGGCCACGGCA, SEQ ID NO:6 (corresponding to positions 133 to 153 in SEQ ID NO:3 or positions 193 to 213 in SEQ ID NO:4)), or may be modified at any other position.
  • the nucleic acid of the present invention may be one in which the nucleic acid encoding the amino acid at the active center of the phosphodiesterase of the present invention (i.e., DSYRATA (SEQ ID NO: 5)) is modified from SEQ ID NO: 6.
  • the vector of the present invention may be any vector as long as it contains the nucleic acid of the present invention.
  • the vector may be a cloning vector or an expression vector.
  • the cloning vector or expression vector may be appropriately selected depending on the host cell.
  • the cloning vector may be, but is not limited to, M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEM-T, pDIRECT, and pT7.
  • the expression vector may be, but is not limited to, pGEX, pET, and the like.
  • the cells of the present invention are not particularly limited as long as they are cells capable of amplifying the vector of the present invention, or cells capable of expressing the phosphodiesterase of the present invention by introducing the vector of the present invention.
  • Examples of such cells include, but are not limited to, E. coli, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells.
  • the activity of each phosphodiesterase was measured based on the phosphodiesterase activity test method in the 9th edition of the Food Additives Standards.
  • adenosine-3'-monophosphate 20 mg was dissolved in 10 mL of sodium barbital hydrochloride buffer (pH 5.0) and filtered using a membrane filter (0.45 ⁇ m) to prepare a substrate solution.
  • a membrane filter 0.45 ⁇ m
  • 0.50 g of 2,4-diaminophenol dihydrochloride and 10.0 g of sodium hydrogen sulfite were weighed, dissolved in water to make 50 mL, and then filtered.
  • 0.4 mL of the substrate solution prepared just before use was left at 70 ⁇ 0.5 °C for exactly 5 minutes, 0.1 mL of enzyme solution was added, and left at 70 ⁇ 0.5 °C for exactly 15 minutes.
  • Test Example 1 Measurement of Enzyme Activity Solutions were prepared by adding ribonucleic acid (derived from yeast; manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the phosphodiesterase obtained in Example 1 or the phosphodiesterase of the comparative example so as to obtain various substrate concentrations and enzyme activities per substrate shown in Table 1, and were reacted at 70°C for 180 minutes. After completion of the reaction, the enzyme was inactivated by boiling at 100°C for 5 minutes.
  • ribonucleic acid derived from yeast; manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • nuclease derived from the genus Penicillium Compared to nuclease derived from the genus Penicillium, nuclease derived from the genus Leptographium showed high GMP production even at high substrate concentrations. According to the present invention, it has been demonstrated that high amounts of GMP can be produced even at substrate concentrations as high as 40 mg/ml or more.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of the phosphodiesterase used in this example (without signal sequence)
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of the phosphodiesterase used in this example (with signal sequence (intact sequence))
  • SEQ ID NO:3 A base sequence encoding the amino acid sequence (without signal sequence) of the phosphodiesterase used in this example.
  • SEQ ID NO:4 A base sequence encoding the amino acid sequence (with signal sequence) of the phosphodiesterase used in this example.
  • SEQ ID NO:5 An amino acid sequence of the active center of the phosphodiesterase used in this example.
  • SEQ ID NO:6 A base sequence encoding the amino acid sequence of the active center of the phosphodiesterase used in this example.
  • GMP can be efficiently produced from nucleic acids even under high substrate concentration conditions. Furthermore, according to the present invention, compositions containing GMP, including yeast extract, can be produced under reaction conditions that could not be adopted when using conventional enzymes. Therefore, the present invention is extremely useful, for example, in the field of food manufacturing.

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Abstract

本発明は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と６０％以上同一のアミノ酸配列を含む、高濃度の核酸存在下でも高いＧＭＰ生成能を有するＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼを提供する。

Description

ホスホジエステラーゼ及びその用途
　本発明は、新規ホスホジエステラーゼ及びその用途に関する。より詳細には、本発明は、高基質濃度の条件下でも優れた５’－グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）生成能を有する、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来の新規ホスホジエステラーゼ及びその用途に関する。
　近年、食品市場において、植物性代替食品や減塩食品のシェアが伸びている。これら製品では淡泊な味を改善するために、うま味成分として酵母エキス等の核酸系調味料が広く使用されている。酵母エキスのうま味は、当該エキス中に含有される５’－グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）に主に依拠することが知られている。
　うま味を強める目的において酵母エキスに含まれるＧＭＰの量を増加させる手段として、酵母中の核酸にホスホジエステラーゼを作用させることにより、ＧＭＰを生成させる方法が一般的に用いられる。かかるホスホジエステラーゼとしてはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌に由来するものが広く用いられている（特許文献１）。
　ホスホジエステラーゼを含む多くの酵素は、基質がある一定の限界値を超えて存在すると、酵素の活性部位に基質が過剰に結合して適切な反応が行われず、その結果、酵素活性が低下するとの現象（「基質阻害（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」）が知られている。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼも同様であり、基質となる核酸が過剰に存在すると活性が低下する傾向にあり、従って酵母エキスの製造において核酸濃度の高い酵母を原材料として用いる場合、ＧＭＰを多量に含む酵母エキスを効率よく製造することは難しかった。
特開２０２２－１１９９１０号公報
　かかる背景に鑑み、本発明の課題は、高基質濃度条件下でもＧＭＰを高産生し得る新規ホスホジエステラーゼを提供すること、及び、該酵素を用いて、効率よく酵母エキス等のＧＭＰ含有組成物を製造する方法を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼが、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼと比較して、高基質濃度条件下であっても極めて優れたＧＭＰ生成能を有することを見出し、当該知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［１］
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と６０％以上同一のアミノ酸配列を含む、高濃度の核酸存在下でも高いＧＭＰ生成能を有するＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼ。
［２］
　Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌が、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍである、［１］記載のホスホジエステラーゼ。
［３］
　以下の条件で酵素反応を行った場合に、ＧＭＰ生成量が２０ｍｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、［１］又は［２］記載のホスホジエステラーゼ：
＜条件＞
・リボ核酸濃度：４０ｍｇ／ｍｌ
・反応温度：７０℃
・反応時間：１８０分
・反応液のｐＨ：５．５
・基質ＲＮＡ１ｍｇに対するホスホジエステラーゼ添加量：６０．８Ｕ／ｍｇ
［４］
　［１］～［３］のいずれか記載のホスホジエステラーゼを含む、核酸高含有組成物の分解用酵素剤。
［５］
　核酸高含有組成物中の核酸の濃度が３５ｍｇ／ｍＬ以上である、［４］記載の酵素剤。
［６］
　［１］～［３］のいずれか記載のホスホジエステラーゼを含む、５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物の製造用酵素剤。
［７］
　５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物が酵母エキスである、［６］記載の酵素剤。
［８］
　［１］～［３］のいずれか記載のホスホジエステラーゼ、又は［４］～［７］のいずれか記載の酵素剤を、核酸を含有する組成物と接触させることを含む、５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物の製造方法。
［９］
　組成物中の核酸量とホスホジエステラーゼの活性の割合が、核酸１ｍｇに対して０．００１Ｕ～１０００Ｕであることを特徴とする、［８］記載の製造方法。
［１０］
　組成物中の核酸の濃度が３５ｍｇ／ｍＬ以上である、［９］記載の製造方法。
［１１］
　５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物が酵母エキスである、［８］～［１０］のいずれか記載の製造方法。
［１２］
　［１］～［３］のいずれか記載のホスホジエステラーゼ、又は［４］～［７］のいずれか記載の酵素剤を核酸に作用させることによって製造されたＧＭＰ含有組成物。
［１３］
　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３または４で表される核酸、又は該核酸と６０％以上の配列同一性を有する核酸。
［１４］
　［１３］記載の核酸を含むベクター。
［１５］
　［１４］記載のベクターを含む細胞。
　本発明によれば、高基質濃度条件下でも効率よく核酸からＧＭＰを生成させることができる。また、本発明によれば、従前の酵素を用いた場合には採用し得なかった反応条件において、酵母エキスを始めとしたＧＭＰを含有する組成物を製造することができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．ホスホジエステラーゼ
　本発明は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と６０％以上同一のアミノ酸配列を含む、高濃度の核酸存在下でも高いＧＭＰ生成能を有するＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼ（以下、「本発明のホスホジエステラーゼ」と称することがある）を提供する。
　ホスホジエステラーゼは、リン酸ジエステル結合の一方の結合を加水分解する酵素である。本発明のホスホジエステラーゼは、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼであり、その基質の核酸が高濃度に存在する状況下でも基質阻害が起こりにくく、高いホスホジエステラーゼ活性（本発明においては特にＧＭＰ生成活性）を有することを特徴とする。
　本発明のホスホジエステラーゼが由来するＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属の多くの種は、木材や植物の健康に影響を及ぼすことがあり、林業や植物保護の分野で注目されている。Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌としては、例えば、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｔｅｒｅｂｒａｎｔｉｓ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｗｉｎｇｆｉｅｌｄｉｉ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ａｂｉｅｔｉｎｕｍ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｓｅｒｐｅｎｓ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｌｕｎｄｂｅｒｇｉｉ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｗａｇｅｎｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｌｏｎｇｉｃｌａｖａｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｓｉｎｅｎｓｅ、及びＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｍｕｒｒａｙｉ等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一態様において、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌は、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍであり得る。また、より好ましくは、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍ　ＮＢＲＣ１１０１７８株であり得る。尚、当該株は、製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）から入手可能である。
　本発明のホスホジエステラーゼは、基質阻害に対しての高い耐性を有することを特徴とする。本発明のホスホジエステラーゼがその特性を発揮し得る、基質（即ち、核酸）とホスホジエステラーゼの割合としては、所望の効果が奏される限り特に限定されないが、核酸１ｍｇに対して、通常１０００Ｕ以下であり、好ましくは、９００Ｕ以下、８００Ｕ以下、７００Ｕ以下、６００Ｕ以下、５００Ｕ以下、４００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、９０Ｕ以下、８０Ｕ以下、７０Ｕ以下、６０Ｕ以下、５０Ｕ以下、４５Ｕ以下、４０Ｕ以下、３５Ｕ以下、３０Ｕ以下、又は２５Ｕ以下であり、より好ましくは２０Ｕ以下、１５Ｕ以下、１３．５Ｕ以下、１０Ｕ以下、又は５Ｕ以下であり得る。また、下限値は、所望の効果が奏される限り特に限定されないが、核酸１ｍｇに対して、通常０．０１Ｕ以上、好ましくは、０．１Ｕ以上、１Ｕ以上、又は５Ｕ以上であり得る。一態様において、基質（核酸）：ホスホジエステラーゼの割合は、核酸１ｍｇに対して、通常０．０１～１０００Ｕ、好ましくは０．１～５００Ｕ、１～３００Ｕ、５～１００Ｕ、１０～９０Ｕ、１０～６０Ｕ、１０～４０Ｕ、又は１０～２０Ｕであるがこれらに限定されない。
　尚、本明細書において、ホスホジエステラーゼ活性（特に、リボヌクレアーゼ活性）は、３’－ＡＭＰを基質としてホスホジエステラーゼ（特に、リボヌクレアーゼ）を作用させた際に、１分間に１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義する。
　本発明のホスホジエステラーゼの５’－グアノシン一リン酸（本明細書において「ＧＭＰ」と称することがある）の生成能は、高基質濃度下において、既存のホスホジエステラーゼよりも高い。一態様において、本発明のホスホジエステラーゼは、以下のように、高基質濃度下におけるＧＭＰ生成能を用いて定義することもできる。
＜条件１＞
・リボ核酸濃度：４０ｍｇ／ｍｌ
・反応温度：７０℃
・反応時間：１８０分
・反応液のｐＨ：５．５
・基質ＲＮＡ１ｍｇ当たりのホスホジエステラーゼ添加量：６０．８Ｕ
・生成されるＧＭＰ量が１５ｍｇ／ｍＬ以上（好ましくは１６ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１７ｍｇ／ｍＬ以上）
＜条件２＞
・リボ核酸濃度：６０ｍｇ／ｍｌ
・反応温度：７０℃
・反応時間：１８０分
・反応液のｐＨ：５．５
・基質ＲＮＡ１ｍｇに対するホスホジエステラーゼ添加量：４０．５Ｕ
・生成されるＧＭＰ量が２０ｍｇ／ｍＬ以上（好ましくは２１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２２ｍｇ／ｍＬ以上）
　また、別の一態様において、本発明のホスホジエステラーゼは、以下のように定義され得る。
＜条件３＞
・リボ核酸濃度：１２０ｍｇ／ｍｌ
・反応温度：７０℃
・反応時間：１８０分
・反応液のｐＨ：５．５
・基質ＲＮＡ１ｍｇ当たりのホスホジエステラーゼ添加量：２０．３Ｕ
・生成されるＧＭＰ量が１９ｍｇ／ｍＬ以上（好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２１ｍｇ／ｍＬ以上）
　また、別の一態様において、本発明のホスホジエステラーゼは、以下のように定義され得る。
＜条件４＞
・リボ核酸濃度：１８０ｍｇ／ｍｌ
・反応温度：７０℃
・反応時間：１８０分
・反応液のｐＨ：５．５
・基質ＲＮＡ１ｍｇ当たりのホスホジエステラーゼ添加量：１３．５Ｕ
・生成されるＧＭＰ量が１３ｍｇ／ｍＬ以上（好ましくは１４ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上）
　また、別の一態様において、以下の条件において、本発明のホスホジエステラーゼは、対照ホスホジエステラーゼよりも、少なくとも２．６倍のＧＭＰ生成能を有する。
＜条件５＞
・リボ核酸濃度：２４０ｍｇ／ｍｌ
・反応温度：７０℃
・反応時間：１８０分
・反応液のｐＨ：５．５
・基質ＲＮＡ１ｍｇに対するホスホジエステラーゼ添加量：１０．１Ｕ
・生成されるＧＭＰ量が８ｍｇ／ｍＬ以上（好ましくは９ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上）
　また、本発明のホスホジエステラーゼは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、又は９０％以上（より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）同一のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、又は９０％以上（より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）同一のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるホスホジエステラーゼは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列からなるホスホジエステラーゼと同等又はそれ以上のＧＭＰ生成能を有するホスホジエステラーゼであってもよい。尚、アミノ酸配列の同一性（％）は、自体公知の方法で決定すればよく、例えば、Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）等の配列比較ソフトを用いて算出し、決定することができる。
　なお、以下の実施例において示す通り、本発明のホスホジエステラーゼの活性中心は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸の４５位～５１位に位置する７アミノ酸（ＤＳＹＲＡＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）、ＤとＲが結合部位）である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２における６５位～７１位に相当）。従って、本発明のホスホジエステラーゼは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列のうち、４５位～５１位のアミノ酸は置換されておらず、それ以外の位置においてアミノ酸が置換されたものであってもよい。
　本発明のＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来ホスホジエステラーゼは、自体公知の方法で調製することができる。Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来ホスホジエステラーゼは、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌の培養液から分離することにより調製することができる。また、遺伝子組み換え技術やゲノム編集技術を用いて、本発明のホスホジエステラーゼをコードする核酸をタンパク質発現用の微生物に導入し、これを培養することで、本発明のホスホジエステラーゼを調製することもできる。調製方法の一例としては、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌の培養液又は菌体より目的のホスホジエステラーゼを回収する方法が挙げられる。菌体からホスホジエステラーゼが分泌される場合は、必要に応じてろ過や遠心処理を用いて培養液から菌体を除去し、当該菌体が除去された培養液からホスホジエステラーゼを分離及び／又は精製することができる。また、菌体からホスホジエステラーゼが分泌されない場合は、培養液から菌体を回収し、回収した菌体を加圧処理や超音波処理に供して破砕し、その後ホスホジエステラーゼを分離及び／又は精製することができる。ホスホジエステラーゼの分離及び／又は精製法としては、自体公知のタンパク質の分離及び／又は精製法を用いればよい。かかる方法としては、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、及び、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられるが、これらに限定されない。
　尚、本発明のホスホジエステラーゼが微生物を用いて調製される場合、本発明のホスホジエステラーゼは当該微生物から単離及び／又は精製されていてもよいし、されていなくてもよい。本発明のホスホジエステラーゼが精製される場合、精製されたホスホジエステラーゼの純度は特に限定されない。
　本発明の一態様において、本発明のホスホジエステラーゼは、ヌクレアーゼであり得、或いは、リボヌクレアーゼであり得る。
２．核酸高含有組成物の分解用酵素剤
　本発明はまた、本発明のホスホジエステラーゼを含む、核酸高含有組成物の分解用酵素剤（以下、「本発明の分解用酵素剤」と称することがある）を提供する。
　上述した通り、本発明のホスホジエステラーゼは、高基質濃度下において、既存のホスホジエステラーゼよりもＧＭＰ生成能が高いとの特徴を有する。従って、本発明のホスホジエステラーゼのこの側面を利用することにより、既存のホスホジエステラーゼと比較して、高濃度の核酸を含有する組成物において、当該核酸を効率的に分解することができる。
　本発明の分解用酵素剤における、本発明のホスホジエステラーゼの配合量は特に限定されない。ホスホジエステラーゼの配合量は、本発明の酵素剤の重量に対して、通常、０．０００１～１００重量％であり、好ましくは０．００１～１００重量％であり得る。
　本発明の分解用酵素剤は、本発明のホスホジエステラーゼ以外の成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、安定剤、緩衝剤、保存剤、賦形剤、懸濁剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、生理食塩水等の添加物が挙げられるが、これらに限定されない。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられるが、これらに限定されない。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられるが、これらに限定されない。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ調整剤としては、酢酸バッファー、リン酸バッファー、ＭＥＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓバッファー、ＭＯＰＳバッファー等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　本発明の分解用酵素剤の形状は、本発明のホスホジエステラーゼの生物的活性が維持される限り特に限定されず、固体状、半固体状、粉末状、スラリー状又は液体状のいずれであってもよい。
　本発明の分解用酵素剤が適用される核酸高含有組成物とは、基質阻害により既存のホスホジエステラーゼ（例、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼ）のＧＭＰ生成能を低下させる程度に核酸が多量に含まれた組成物を意味する。核酸高含有組成物は、内在的に核酸を多数含む組成物（例、高核酸型酵母）であってもよく、或いは、外部から核酸が添加され、核酸濃度が高められた組成物であってもよい。
　核酸高含有組成物に含まれる核酸濃度としては、既存のホスホジエステラーゼの活性低下を引き起こす程度であれば特に限定されないが、通常、３５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上、４５ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上、５５ｍｇ／ｍＬ以上、６０ｍｇ／ｍＬ以上、６５ｍｇ／ｍＬ以上、７０ｍｇ／ｍＬ以上、７５ｍｇ／ｍＬ以上、８０ｍｇ／ｍＬ以上、８５ｍｇ／ｍＬ以上、９０ｍｇ／ｍＬ以上、９５ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１１０ｍｇ／ｍＬ以上、１２０ｍｇ／ｍＬ以上、１３０ｍｇ／ｍＬ以上、１４０ｍｇ／ｍＬ以上、１５０ｍｇ／ｍＬ以上、１６０ｍｇ／ｍＬ以上、１７０ｍｇ／ｍＬ以上、１８０ｍｇ／ｍＬ以上、１９０ｍｇ／ｍＬ以上、２００ｍｇ／ｍＬ以上、２１０ｍｇ／ｍＬ以上、２２０ｍｇ／ｍＬ以上、２３０ｍｇ／ｍＬ以上、２４０ｍｇ／ｍＬ以上、２５０ｍｇ／ｍＬ以上、２６０ｍｇ／ｍＬ以上、２７０ｍｇ／ｍＬ以上、２８０ｍｇ／ｍＬ以上、２９０ｍｇ／ｍＬ以上、３００ｍｇ／ｍＬ以上、３５０ｍｇ／ｍＬ以上、４００ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以上、６００ｍｇ／ｍＬ以上、７００ｍｇ／ｍＬ以上、８００ｍｇ／ｍＬ以上、９００ｍｇ／ｍＬ以上、１０００ｍｇ／ｍＬ以上、１１００ｍｇ／ｍＬ以上、又は、１２００ｍｇ／ｍＬ以上であり得るがこれらに限定されない。また、核酸濃度の上限値は特に限定されないが、通常、１００００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは９０００ｍｇ／ｍＬ以下、８０００ｍｇ／ｍＬ以下、７０００ｍｇ／ｍＬ以下、６０００ｍｇ／ｍＬ以下、５０００ｍｇ／ｍＬ以下、４０００ｍｇ／ｍＬ以下、３５００ｍｇ／ｍＬ以下、３４００ｍｇ／ｍＬ以下、３３００ｍｇ／ｍＬ以下、３２００ｍｇ／ｍＬ以下、３１００ｍｇ／ｍＬ以下、３０００ｍｇ／ｍＬ以下、２９００ｍｇ／ｍＬ以下、２８００ｍｇ／ｍＬ以下、２７００ｍｇ／ｍＬ以下、２６００ｍｇ／ｍＬ以下、２５００ｍｇ／ｍＬ以下、２４００ｍｇ／ｍＬ以下、２３００ｍｇ／ｍＬ以下、２２００ｍｇ／ｍＬ以下、２１００ｍｇ／ｍＬ以下、２０００ｍｇ／ｍＬ以下、１９００ｍｇ／ｍＬ以下、１８００ｍｇ／ｍＬ以下、１７００ｍｇ／ｍＬ以下、１６００ｍｇ／ｍＬ以下、１５００ｍｇ／ｍＬ以下、１４００ｍｇ／ｍＬ以下、１３００ｍｇ／ｍＬ以下、１２００ｍｇ／ｍＬ以下、１１００ｍｇ／ｍＬ以下、１０００ｍｇ／ｍＬ以下、９００ｍｇ／ｍＬ以下、８００ｍｇ／ｍＬ以下、７００ｍｇ／ｍＬ以下、６００ｍｇ／ｍＬ以下、５００ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下、３００ｍｇ／ｍＬ以下、２５０ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１９０ｍｇ／ｍＬ以下、１８０ｍｇ／ｍＬ以下、１７０ｍｇ／ｍＬ以下、１６０ｍｇ／ｍＬ以下、１５０ｍｇ／ｍＬ以下、１４０ｍｇ／ｍＬ以下、１３０ｍｇ／ｍＬ以下、１２０ｍｇ／ｍＬ以下、１１０ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、８０ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、９ｍｇ／ｍＬ以下、８ｍｇ／ｍＬ以下、７ｍｇ／ｍＬ以下、６ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下、４ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、又は１ｍｇ／ｍＬ以下であり得るが、これらに限定されない。
　本発明の分解用酵素剤の核酸高含有組成物への添加量は、本発明の分解用酵素剤に配合される本発明のホスホジエステラーゼの量や、酵素の反応条件等に基づき異なり得るが、自体公知の方法を用いて適宜決定すればよい。
３．ＧＭＰを含有する組成物の製造用酵素剤
　本発明はまた、本発明のホスホジエステラーゼを含む、ＧＭＰを含有する組成物の製造用酵素剤（以下、「本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤」と称することがある）を提供する。
　本発明のホスホジエステラーゼは、核酸を基質として、特に高基質濃度の条件下においてＧＭＰを効率よく生成させることができる。この特性を利用することにより、本発明のホスホジエステラーゼは、酵母エキスを始めとしたＧＭＰを含有する組成物の製造に好適に用いることができる。また、上述の通り、本発明のホスホジエステラーゼは、高基質濃度条件下でも基質阻害が生じにくいため、結果としてＧＭＰ含有量の高い組成物を製造することが可能となる。
　本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤における本発明のホスホジエステラーゼの配合量、ホスホジエステラーゼ以外の成分、形状等は、本発明の分解用酵素剤において説明したものと同様である。
　本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤の添加量は、本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤における本発明のホスホジエステラーゼの配合量や反応条件等に基づき異なり得るが、自体公知の方法を用いて適宜決定すればよい。
　本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤が適用される対象もまた特に限定されないが、本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤に含まれる本発明のホスホジエステラーゼは、核酸を基質とし、ＧＭＰを生成させることを目的とするものであることから、本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤が適用される対象は核酸を含んでいることが必須である。尚、核酸は当該対象由来のものであってもよいし、外部から添加したものであってもよい。かかる対象の一例としては、酵母エキスが挙げられる。以下、本発明のＧＭＰ含有組成物製造用酵素剤を用いて酵母エキスを製造するプロセスを、本発明の酵素剤の実施形態の一例として説明する。
　常法を用いて増殖させた酵母を回収し、ホモジナイザーや超音波処理等を用いて回収した酵母を破砕し、細胞内成分を溶媒とともに抽出する。得られた抽出液をろ過して固形分を取り除き、次いで、得られた液体を蒸発濃縮や遠心分離に供することで濃縮し、酵母エキスを調製する。調製した酵母エキスに本発明のホスホジエステラーゼを添加し、５０～９０℃、ｐＨ４．０～７．０の条件下で１～２４時間反応させることにより、酵母エキス中に含まれる核酸（特に、ＲＮＡ）をＧＭＰに変換させることができる。尚、本発明のホスホジエステラーゼの酵母又は酵母エキスへ作用させるタイミングは、所望の効果を得られる限り特に限定されず、酵母の破砕の工程、細胞内成分を溶媒とともに抽出する工程、抽出液をろ過して固形分を取り除く工程、又は、濃縮工程のいずれの工程であってもよい。本発明の一態様において、原料として用いられる酵母は、核酸を多量に含有する特徴を有する酵母であり得る。この側面は、本発明のホスホジエステラーゼを酵母又は酵母エキスに作用させる工程を含む、高濃度のＧＭＰを含有する酵母エキスの製造方法（以下、「本発明の酵母エキスの製造方法」と称することがある）と解釈され得る。尚、かかる酵母エキスのＧＭＰ含有量は、通常１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、３ｍｇ／ｍＬ以上、４ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以上、６ｍｇ／ｍＬ以上、７ｍｇ／ｍＬ以上、８ｍｇ／ｍＬ以上、又は９ｍｇ／ｍＬ以上であり得るが、これらに限定されない。また、上限も特に限定されないが、通常、１０００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは９００ｍｇ／ｍＬ以下、８００ｍｇ／ｍＬ以下、７００ｍｇ／ｍＬ以下、６００ｍｇ／ｍＬ以下、５００ｍｇ／ｍＬ以下、４５０ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下又は３５０ｍｇ／ｍＬ以下、３００ｍｇ／ｍＬ以下、２５０ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１９０ｍｇ／ｍＬ以下、１８０ｍｇ／ｍＬ以下、１７０ｍｇ／ｍＬ以下、１６０ｍｇ／ｍＬ以下、１５０ｍｇ／ｍＬ以下、１４０ｍｇ／ｍＬ以下、１３０ｍｇ／ｍＬ以下、１２０ｍｇ／ｍＬ以下、１１０ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、８０ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、９ｍｇ／ｍＬ以下、８ｍｇ／ｍＬ以下、７ｍｇ／ｍＬ以下、６ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下、４ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、又は１ｍｇ／ｍＬ以下であり得るが、これらに限定されない。
　本発明の酵母エキスの製造方法の具体的な一実施形態は、以下の通りである：
　以下の工程を含む、酵母エキスの製造法：
　核酸を含む組成物を準備する第１工程、
・第１工程で準備した核酸を含む組成物に本発明のホスホジエステラーゼを作用させる第２工程
・第２工程により調製されたＧＭＰを含む組成物を回収する工程。
　本実施形態において用いられる核酸は、化学的に合成されたものであってもよく、生物由来のものであってもよい。なお、核酸が由来する生物種は特に限定されないが、好ましくは酵母であり得る。
　また、別の一態様において、第１工程で準備される核酸を含む組成物の核酸濃度は、高濃度であることが好ましい。かかる核酸濃度としては、既存のホスホジエステラーゼの活性低下を引き起こす程度であれば特に限定されないが、通常、３５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上、４５ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以上、５５ｍｇ／ｍＬ以上、６０ｍｇ／ｍＬ以上、６５ｍｇ／ｍＬ以上、７０ｍｇ／ｍＬ以上、７５ｍｇ／ｍＬ以上、８０ｍｇ／ｍＬ以上、８５ｍｇ／ｍＬ以上、９０ｍｇ／ｍＬ以上、９５ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１１０ｍｇ／ｍＬ以上、１２０ｍｇ／ｍＬ以上、１３０ｍｇ／ｍＬ以上、１４０ｍｇ／ｍＬ以上、１５０ｍｇ／ｍＬ以上、１６０ｍｇ／ｍＬ以上、１７０ｍｇ／ｍＬ以上、１８０ｍｇ／ｍＬ以上、１９０ｍｇ／ｍＬ以上、２００ｍｇ／ｍＬ以上、２１０ｍｇ／ｍＬ以上、２２０ｍｇ／ｍＬ以上、２３０ｍｇ／ｍＬ以上、２４０ｍｇ／ｍＬ以上、２５０ｍｇ／ｍＬ以上、２６０ｍｇ／ｍＬ以上、２７０ｍｇ／ｍＬ以上、２８０ｍｇ／ｍＬ以上、２９０ｍｇ／ｍＬ以上、３００ｍｇ／ｍＬ以上、３５０ｍｇ／ｍＬ以上、４００ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以上、６００ｍｇ／ｍＬ以上、７００ｍｇ／ｍＬ以上、８００ｍｇ／ｍＬ以上、９００ｍｇ／ｍＬ以上、１０００ｍｇ／ｍＬ以上、１１００ｍｇ／ｍＬ以上、又は、１２００ｍｇ／ｍＬ以上であり得るがこれらに限定されない。また、核酸濃度の上限値は特に限定されないが、通常、１００００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは９０００ｍｇ／ｍＬ以下、８０００ｍｇ／ｍＬ以下、７０００ｍｇ／ｍＬ以下、６０００ｍｇ／ｍＬ以下、５０００ｍｇ／ｍＬ以下、４０００ｍｇ／ｍＬ以下、３５００ｍｇ／ｍＬ以下、３４００ｍｇ／ｍＬ以下、３３００ｍｇ／ｍＬ以下、３２００ｍｇ／ｍＬ以下、３１００ｍｇ／ｍＬ以下、３０００ｍｇ／ｍＬ以下、２９００ｍｇ／ｍＬ以下、２８００ｍｇ／ｍＬ以下、２７００ｍｇ／ｍＬ以下、２６００ｍｇ／ｍＬ以下、２５００ｍｇ／ｍＬ以下、２４００ｍｇ／ｍＬ以下、２３００ｍｇ／ｍＬ以下、２２００ｍｇ／ｍＬ以下、２１００ｍｇ／ｍＬ以下、２０００ｍｇ／ｍＬ以下、１９００ｍｇ／ｍＬ以下、１８００ｍｇ／ｍＬ以下、１７００ｍｇ／ｍＬ以下、１６００ｍｇ／ｍＬ以下、１５００ｍｇ／ｍＬ以下、１４００ｍｇ／ｍＬ以下、１３００ｍｇ／ｍＬ以下、１２００ｍｇ／ｍＬ以下、１１００ｍｇ／ｍＬ以下、１０００ｍｇ／ｍＬ以下、９００ｍｇ／ｍＬ以下、８００ｍｇ／ｍＬ以下、７００ｍｇ／ｍＬ以下、６００ｍｇ／ｍＬ以下、５００ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下、３００ｍｇ／ｍＬ以下、２５０ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１９０ｍｇ／ｍＬ以下、１８０ｍｇ／ｍＬ以下、１７０ｍｇ／ｍＬ以下、１６０ｍｇ／ｍＬ以下、１５０ｍｇ／ｍＬ以下、１４０ｍｇ／ｍＬ以下、１３０ｍｇ／ｍＬ以下、１２０ｍｇ／ｍＬ以下、１１０ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、８０ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、４０ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、９ｍｇ／ｍＬ以下、８ｍｇ／ｍＬ以下、７ｍｇ／ｍＬ以下、６ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下、４ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、又は１ｍｇ／ｍＬ以下であり得るが、これらに限定されない。
　本発明の酵母エキスの製造方法によれば、液体又は固体（典型的には、粉末状、顆粒状など）の酵母エキスを得ることができる。本発明の酵母エキスの製造方法で得られる酵母エキスは各種食品・飲料の呈味増強や呈味調整に用いることができる。適用可能な食品・飲料の例を挙げれば、水産加工品（ちくわ、かまぼこ、はんぺん、さきいか、干物、塩辛、魚肉ソーセージ、佃煮、缶詰等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、ソーセージ、ジャーキー、コンビーフ、成形肉等）、野菜加工品（野菜缶・瓶詰、トマト加工品、きのこ類加工品、野菜漬物、乾燥野菜、野菜つくだ煮等）、めん・パン類（各種めん、食パン、菓子パン等）、穀類加工品（シリアル、オートミール、ミューズリー、米加工品、麩、麦茶等）、酪農製品（牛乳、加工乳、乳飲料、濃縮乳、粉乳、練乳、はっ酵乳、乳酸菌飲料、バター、チーズ、アイスクリーム等）、果実加工品（果実缶・瓶詰、ジャム、マーマレード、ドライフルーツ等）、菓子・デザート類（ビスケット類、焼き菓子、米菓、油菓子、和生菓子、洋生菓子、半生菓子、和干菓子、キャンデー類、チョコレート類、チューインガム、スナック菓子、冷菓等）、飲料等（清涼飲料水、炭酸飲料、果汁飲料、珈琲飲料、野菜汁飲料、茶系飲料、ノンアルコール飲料、アルコール飲料等）、調味料（たれ、つゆ、ドレッシング、ソースなど）、スープ類、ルウ（カレールウ、シチュールウ等）、栄養補助食品・飲料（プロテインパウダー、プロテイン飲料、サプリメント、栄養ドリンク等）、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品である。
４．核酸、ベクター、および細胞
　本発明はまた、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３または４で表される核酸、又は該核酸と６０％以上の配列同一性を有する核酸（以下、「本発明の核酸」と称することがある）、該核酸を含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）、または、該ベクターを含む細胞（以下、「本発明の細胞」と称することがある）を提供する。
　本発明の核酸は、上述した本発明のホスホジエステラーゼをコードする核酸である。本発明のホスホジエステラーゼのアミノ酸配列は上述した通りである。アミノ酸配列が既知である場合、当業者は、当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を自体公知の方法を用いて決定することができる。なお、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３は本発明のホスホジエステラーゼ（シグナル配列なし）をコードする核酸であり、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４は本発明のホスホジエステラーゼ（シグナル配列あり）をコードする核酸である。
　本発明の核酸は、本発明のホスホジエステラーゼをコードしているものである限り、コドンが縮重コドンで置換されているものであってもよい。換言すれば、本発明の核酸は、本発明のホスホジエステラーゼをコードしている限り、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４そのものでなくともよい。
　別の一態様において、本発明の核酸は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３または４で表される核酸、又は該核酸と６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、又は９０％以上（より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）同一の核酸を含むか、又はそれからなる。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３または４で表される核酸と６０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上、又は９０％以上（より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）同一の核酸を含むか、又はそれからなる核酸は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１または２で表されるアミノ酸配列からなるホスホジエステラーゼと同等又はそれ以上のＧＭＰ生成能を有するホスホジエステラーゼをコードする核酸であってもよい。尚、核酸配列の同一性（％）は、自体公知の方法で決定すればよい。
　一態様において、本発明の核酸は、本発明のホスホジエステラーゼの活性中心のアミノ酸をコードする核酸（即ち、ＧＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３における１３３～１５３位またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の１９３～２１３位に相当））は改変されておらず、それ以外の位置において改変されたものであってもよい。
　また、別の一態様において、本発明の核酸は、本発明のホスホジエステラーゼの活性中心のアミノ酸配列（即ち、ＤＳＹＲＡＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５））が維持される限り、活性中心のアミノ酸をコードする核酸がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６から改変されたものであってもよい。
　本発明のベクターは、本発明の核酸を含むベクターである限り、如何なるものであってもよい。ベクターとしては、クローニングベクターや発現ベクターであってよい。クローニングベクターや発現ベクターは、宿主細胞に応じて適宜選択すればよい。一例としては、例えば大腸菌が宿主細胞である場合、クローニングベクターは、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ－Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴおよびｐＴ７等が挙げられるが、これらに限定されない。また、発現ベクターは、ｐＧＥＸやｐＥＴ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の細胞は、本発明のベクターを増幅することができる細胞や、本発明のベクターを導入することで、本発明のホスホジエステラーゼを発現することができる細胞であれば特に限定されない。かかる細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞等が例示されるが、これらに限定されない。
　以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、それらは単なる例示であって、本発明はそれらに限定されない。
［ホスホジエステラーゼの調製］
　Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍ　ＮＢＲＣ１１０１７８株（製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）より入手）をＰＤＡ培地（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）中で培養した後加水し、浸液を得た。浸液をろ紙を用いてろ過した後、限外ろ過して不溶成分や夾雑物を除き、ホスホジエステラーゼを濃縮し、酵素溶液を得た。
　比較例として、市販のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌由来ホスホジエステラーゼ（天野エンザイム株式会社製）を用いた。
　第９版食品添加物公定書のホスホジエステラーゼ活性試験法を基にして、各ホスホジエステラーゼの活性を測定した。
　２０ｍｇアデノシン－３’－モノホスフェートを、１０ｍＬバルビタールナトリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かし、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）を用いてろ過することで基質溶液を調製した。アミドール試液は２，４－ジアミノフェノール二塩酸塩０．５０ｇ及び亜硫酸水素ナトリウム１０．０ｇを秤量し、水を加えて溶かし５０ｍＬとした後、ろ過した。用時調製した０．４ｍＬ基質溶液を７０±０．５℃で正確に５分間放置し、０．１ｍＬ酵素溶液を添加し、７０±０．５℃で正確に１５分間放置した。４ｍＬの６％過塩素酸試液、０．４ｍＬのアミドール試液、０．２ｍＬの七モリブデン酸六アンモニウム四水和物溶液（８．３→１００）を混合した。流水中で１５分間放置し、水を対照として７５０ｎｍの吸光度を測定した。
［試験例１］酵素活性の測定
　表１に示す種々の基質濃度及び基質あたりの酵素活性となるように、リボ核酸（酵母由来；富士フイルム和光純薬製）と実施例１で得たホスホジエステラーゼ又は比較例のホスホジエステラーゼとを添加した溶液を調製し、７０℃で１８０分間反応させた。反応終了後、１００℃で５分間煮沸することで酵素を失活させた。各反応溶液を、親水性混合セルロースエステル（ＭＣＥ）０．４５μｍのメンブレンフィルターにてろ過した後、Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＷＡＸ－１（ＳＨＩＭＡＺＵ製：４．０ｍｍＩ．Ｄ．，×５０ｍｍＬ　３μｍ、Ｐ／Ｎ：２２８－１６２２５－９１）にて、ＧＭＰを分画し定量した。さらに、市販品（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属由来ホスホジエステラーゼ）によるＧＭＰ生成量を１とした場合の本発明の酵素（Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属由来ホスホジエステラーゼ）によるＧＭＰ生成量（ＧＭＰ生成比率）を算出した。結果を表１に示す。
　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属由来ヌクレアーゼと比較して、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属由来のヌクレアーゼは高基質濃度においても高いＧＭＰ生成を示した。本発明によれば、４０ｍｇ／ｍｌ以上の高基質濃度においても、高い生成量のＧＭＰを得ることができることが実証された。
［試験例２］ホスホジエステラーゼのアミノ酸配列の決定
　本実施例において用いられたＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍ由来のホスホジエステラーゼのアミノ酸配列を公知の方法を用いて決定した。簡潔には、先ず、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍ　ＮＢＲＣ１１０１７８株を培養して増殖させた後、菌体を回収した。次いで、常法を用いてゲノムを抽出し、次世代シーケンサーを用いて当該微生物が有するホスホジエステラーゼに対応する塩基配列を決定した。決定した塩基配列から、ホスホジエステラーゼのアミノ酸配列を決定した。
　決定された各配列は次の通りである：
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：本実施例で用いられたホスホジエステラーゼのアミノ酸配列（シグナル配列なし）
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：本実施例で用いられたホスホジエステラーゼのアミノ酸配列（シグナル配列あり（インタクト配列））
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：本実施例で用いられたホスホジエステラーゼのアミノ酸配列（シグナル配列なし）をコードする塩基配列
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：本実施例で用いられたホスホジエステラーゼのアミノ酸配列（シグナル配列あり）をコードする塩基配列
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：本実施例で用いられたホスホジエステラーゼの活性中心のアミノ酸配列
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：本実施例で用いられたホスホジエステラーゼの活性中心のアミノ酸配列をコードする塩基配列
　本発明によれば、高基質濃度条件下でも効率よく核酸からＧＭＰを生成させることができる。また、本発明によれば、従前の酵素を用いた場合には採用し得なかった反応条件において、酵母エキスを始めとしたＧＭＰを含有する組成物を製造することができる。従って、本発明は、例えば、食品製造分野において極めて有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０２３－１４４８０２（出願日：２０２３年９月６日）および特願２０２３－１９４２２５（出願日：２０２３年１１月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (15)

  1. 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と６０％以上同一のアミノ酸配列を含む、高濃度の核酸存在下でも高いＧＭＰ生成能を有するＬｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌由来のホスホジエステラーゼ。
  2. 　Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ属菌が、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍ　ｐｒｏｃｅｒｕｍである、請求項１記載のホスホジエステラーゼ。
  3. 　以下の条件で酵素反応を行った場合に、ＧＭＰ生成量が２０ｍｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１又は２記載のホスホジエステラーゼ：
    ＜条件＞
    ・リボ核酸濃度：４０ｍｇ／ｍｌ
    ・反応温度：７０℃
    ・反応時間：１８０分
    ・反応液のｐＨ：５．５
    ・基質ＲＮＡ１ｍｇに対するホスホジエステラーゼ添加量：６０．８Ｕ／ｍｇ
  4. 　請求項１記載のホスホジエステラーゼを含む、核酸高含有組成物の分解用酵素剤。
  5. 　核酸高含有組成物中の核酸の濃度が３５ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項４記載の酵素剤。
  6. 　請求項１記載のホスホジエステラーゼを含む、５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物の製造用酵素剤。
  7. 　５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物が酵母エキスである、請求項６記載の酵素剤。
  8. 　請求項１又は２記載のホスホジエステラーゼ、又は請求項４～７のいずれか一項記載の酵素剤を、核酸を含有する組成物と接触させることを含む、５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物の製造方法。
  9. 　組成物中の核酸量とホスホジエステラーゼの活性の割合が、核酸１ｍｇに対して０．００１Ｕ～１０００Ｕであることを特徴とする、請求項８記載の製造方法。
  10. 　組成物中の核酸の濃度が３５ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項９記載の製造方法。
  11. 　５’－グアノシン一リン酸を含有する組成物が酵母エキスである、請求項８記載の製造方法。
  12. 　請求項１又は２記載のホスホジエステラーゼ、又は請求項４～７のいずれか一項記載の酵素剤を核酸に作用させることによって製造されたＧＭＰ含有組成物。
  13. 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３または４で表される核酸、又は該核酸と６０％以上の配列同一性を有する核酸。
  14. 　請求項１３記載の核酸を含むベクター。
  15. 　請求項１４記載のベクターを含む細胞。
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