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WO2007052806A1 - Ｇａｂａ含有発酵物の製造方法 - Google Patents

Ｇａｂａ含有発酵物の製造方法 Download PDF

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WO2007052806A1
WO2007052806A1 PCT/JP2006/322184 JP2006322184W WO2007052806A1 WO 2007052806 A1 WO2007052806 A1 WO 2007052806A1 JP 2006322184 W JP2006322184 W JP 2006322184W WO 2007052806 A1 WO2007052806 A1 WO 2007052806A1
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WO
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gaba
juice
fermented product
fermented
glutamic acid
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Masanori Sugiyama
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Hiroshima University NUC
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Hiroshima University NUC
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    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B7/00—Preservation of fruit or vegetables; Chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by group A23B7/08 or A23B7/10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/127—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/175—Amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fermented product containing ⁇ -aminobutyric acid (hereinafter also referred to as “GABA”) using Enterococcus abium.
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • GABA is a kind of amino acid that exists widely in nature, and is contained in germinated brown rice, tea, vegetables, and grains. In mammals such as humans, it is an inhibitory neurotransmitter present in the brain and spine, and its physiological effects include blood pressure lowering action, mental stabilization action, anti-stress action, alcohol metabolism promotion action, brain metabolism Promoting action, obesity prevention action, etc. are known.
  • Patent Document 2 To produce glutamic acid, which is the starting material for GABA, and ferment it with lactic acid (Patent Document 2), to use kimchi strength isolated lactic acid bacteria (Patent Document 3), and to use lactic acid bacteria isolated from sushi Method (Patent Document 4), a method of achieving low sodium content by using glutamic acid and two or more lactic acid bacteria (Patent Document 5), and producing lactic acid bacteria having glutamate decarboxylase to produce soybeans with GABA added Methods (Patent Document 6) etc. have been reported.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-308457
  • Patent Document 2 JP 2001-120179 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-70462
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-102559
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-198578
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-187501
  • Non-Patent Document 1 Chemistry and Biology Vol33, No. 4, 1995
  • the present invention relates to providing a method for efficiently producing a fermented fruit or vegetable containing a higher concentration of GABA without impairing the flavor of the fruit or vegetable.
  • the present inventors have studied microorganisms and fermentation conditions suitable for plant fermentation that can efficiently produce GABA.
  • Enterococcus abyum glutamic acid or its juice is transformed into a plant or its juice.
  • GA when fermented in the presence of salt and sake lees
  • the present invention is characterized in that a plant or its juice is fermented using Enterococcus abium in the presence of glutamic acid or a salt thereof and sake lees or an extract thereof.
  • the present invention relates to a method for producing a fermented material containing aminoaminobutyric acid.
  • the present invention also relates to a fermented product produced by the above method.
  • the present invention also relates to a food or feed containing a fermented product produced by the above method.
  • a fermented plant or a juice thereof that contains a high concentration of GABA and does not impair the flavor of plants such as fruits and vegetables.
  • a food or feed having functions such as a blood pressure lowering action and a mental stability action can be produced.
  • the method for producing a GABA-containing fermented product of the present invention comprises fermenting a plant or juice thereof using Enterococcus abium in the presence of glutamic acid or a salt thereof and sake lees or an extract thereof.
  • the material used as a raw material in the method of the present invention is a plant such as a fruit such as mandarin orange, peach, grape, strawberry or pear, a vegetable such as carrot or tomato, or a juice thereof.
  • mandarin orange, peach, grape, strawberry, pear and carrot are preferable from the viewpoint of GABA production.
  • mandarin orange, peach, grape, strawberry, pear and carrot are not limited to their types, but examples of the mandarin orange include Citrus unshiu Markovich.
  • examples of the peach include white peach. , Yellow peach, Okubo, white birch, etc. Grapes include, for example, Campbell Early, Super Hamburg, Kyoho, Pione, Muscat of Alexandria, Neo Muscat, Muscat Berry A, Delaware, Koshu, Semillon, etc.
  • Examples of strawberry include Sachino or Toyo no Ito, Ibéri, Nyoho, etc.
  • pear include Hosui pear, twentieth century, etc.
  • Carrots (carrot: Daucus Carota L. var. SatiraDC.), Kintoki-jinjin, mini-carrot, 5-inch carrot, etc.
  • These juices mean fruit juices, vegetable juices, and the like obtained by grinding the above plants using a mixer or the like and further squeezing them as necessary.
  • Such juice may be concentrated as appropriate, and this concentrated solution can be used as it is, or the concentrated solution can be diluted to an appropriate concentration with distilled water or the like to obtain the fermentation raw material of the present invention.
  • Such plants or their juices can be used alone as raw materials for the fermented product of the present invention, but may be used in combination according to the purpose.
  • raw materials usually used in the production of fermented milk such as gelatin, agar, sugar, fragrance, and pulp
  • sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, sugar alcohols such as sorbitol, xylitol, erythritol, and reduced starch syrup
  • high-intensity sweeteners such as aspartame and acesulfame potassium
  • sucrose fatty acid esters Emulsifiers such as glycerin fatty acid ester and lecithin
  • thickeners such as carrageenan, xanthan gum and guar gum, citrate, lactic acid and malic acid
  • fruit juices such as lemon juice and orange juice
  • minerals such as vitamins, calcium, iron, manganese and zinc, as well as herbal medicines such as licorice, katsushi, ginger, and herbs It is possible to add.
  • Glutamic acid used in the fermentation of the present invention refers to L-glutamic acid which is a kind of amino acid chemically, and a salt thereof includes a sodium salt.
  • Such glutamic acid or a salt thereof may be used as a food additive having a use as a seasoning, such as glutamic acid, sodium glutamate, or glutamic acid obtained by hydrolyzing food protein with an acid or an enzyme. What! /
  • seasonings containing free glutamic acid, processed fishery products, and foodstuffs such as tomatoes can also be used as a source of glutamic acid or a salt thereof of the present invention.
  • the amount of glutamic acid or a salt thereof used is not particularly limited, but is preferably 30% by weight or less. 0.1 to: More preferably 1% to 5% by weight, more preferably LO% by weight.
  • the method of adding may be either the method of adding the whole amount at once or the method of adding in multiple times.
  • “sake lees” means “sake lees” or “shochu residue”. “Sake lees” refers to the residue left after squeezing sake from “Moromi”. “SACHu distillation residue” is the remaining residue obtained by subjecting cereals to alcohol fermentation and distilling it to obtain shochu. Sake lees can be used as is. The extract can also be used.
  • the drying means is not particularly limited, and may be performed by a known method such as a freeze drying method, a hot air drying method, a microwave drying method, a spray drying method, or a far infrared radiation drying method.
  • the dried sake lees obtained by the spray drying method may be expressed as “SD”.
  • An extract of sake lees can be obtained by extraction with a suitable solvent at room temperature or under heating.
  • the extract of the present invention includes various solvent extracts, diluted solutions thereof, concentrated solutions or dry powders.
  • the extraction solvent used to obtain the above extract either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used, or a mixture of these can be used.
  • water for example, water; alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; polyhydric alcohols such as propylene glycol and butylene glycol; esters such as ethyl acetate; hydrocarbons such as n-hexane; Halogenated hydrocarbons such as water, alcohols, water-alcohol mixtures are preferred, especially water, ethanol, water-ethanol mixtures, especially 15-75% water-ethanol mixtures (volZvol ) Is preferred.
  • alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol
  • polyhydric alcohols such as propylene glycol and butylene glycol
  • esters such as ethyl acetate
  • hydrocarbons such as n-hexane
  • Halogenated hydrocarbons such as water, alcohols, water-alcohol mixtures are preferred, especially water, ethanol, water-ethanol mixtures, especially 15-75% water-ethanol mixtures (volZvol ) Is preferred.
  • the extraction conditions vary depending on the solvent used. For example, when extracting with water, alcohols, water-alcohol mixture, ethyl acetate or the like, 1 to 10 parts per 1 part by weight of sake lees or pyrolysis distillation residue. It is preferable to extract for 1 to 5 days, in particular 1 day, at a temperature of 4 to 40 ° C., preferably 20 to 30 ° C., using parts by weight of solvent.
  • the above-described extract can be used as it is. After the extract is diluted, concentrated, or lyophilized, it can be used in the form of powder or paste as necessary.
  • the above extract power can also be used after removing inactive impurities, and if necessary, the power can also be used by performing a deodorizing or decoloring treatment by a known method!
  • the amount of sake lees or extract added is preferably 0.01% to 5.0% by weight, more preferably 0.05% to 3.0% by weight, particularly with respect to the fermentation raw material. 1.0% to 2.0% by weight
  • Glutamic acid or a salt thereof and sake lees or an extract thereof may be added to a brilliant plant or a juice thereof, or may be added during fermentation.
  • the yeast extract may be added to the extent that the flavor is not impaired.
  • Enterococcus avium used in the production method of the present invention is facultative anaerobic gram-positive cocci and is a resident bacteria present in the intestinal tract, oral cavity, etc. of humans. It is preferable to use Enterococcus avium G15 (hereinafter also referred to as “G15 strain”).
  • Enterococcus avium G15 was grown in a field with pesticide-free cultivation and was isolated for the first time by the present inventor. This strain was deposited with the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD) (NITE BP—14 2) on 22nd February, 292-0818, Kisarazu Kazusa, Chiba, Chiba Prefecture 2-5-8. Have the following mycological properties.
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation
  • the G15 strain of the present invention is a lactic acid bacterium that produces GABA from glutamic acid by the action of glutamic acid decarboxylase.
  • the G15 strain is useful for producing foods with weak acidity because it died at a weakly acidic pH of 4.7 due to a decrease in acidity accompanying lactic acid fermentation.
  • the number of Enterococcus avium used for fermentation is not particularly limited. However, if the number of bacteria to be acted is small, it takes time for the bacteria to grow, and contamination of bacteria tends to occur. It is time consuming and expensive. For this reason, it is preferable to add 0.5% to 5% of the pre-cultured Enterococcus avum culture solution as a starter. It is more preferable to add 1% to 3%, especially 1.5% to 2.5%. Is more preferable.
  • Fermentation may be carried out by a batch method in which aeration, agitation, standing, or a combination thereof is applied, or a continuous method in which lactic acid bacteria that have been subjected to fixed koji treatment are packed in a column or the like. .
  • the working temperature is preferably 20 to 45 ° C. From the viewpoint of GABA productivity, 25 to 40 ° C is more preferable, and 28 to 37 ° C is particularly preferable.
  • the culture time may be appropriately selected within the range of 1 hour to 10 days.
  • the pH may be adjusted with an organic acid such as sodium citrate or an alkali such as caustic soda against the change in pH that occurs. Measurement and adjustment of the pH may be performed according to conventional methods.
  • the fermented product thus obtained can be used as it is, but it may be used after further increasing the GABA content by usual processing steps such as column separation, filtration, concentration, and drying. .
  • the fermented product of the present invention has an increased GABA concentration and maintains the flavor of the material. Therefore, by adding the fermented product itself or the fermented product to various foods or feeds, blood pressure lowering effect, mental stabilizing effect, anti-stress effect, alcohol metabolism promoting effect, brain metabolism promoting effect, obesity prevention
  • It can be a food or feed having functions such as action. For example, it can be a functional food / beverage, a food / beverage for a sick person, a food for specified health use, a dietary supplement, etc., indicating that the function is performed.
  • the form of the food of the present invention is not particularly limited, but drinks such as fruit juice drinks, carbonated drinks, tea-based drinks, milk drinks, alcoholic drinks, soft drinks, jelly-like foods, and various snacks. , Baked goods, cakes, chocolate, jam, bread, gum, rice cakes, soups, pickles, boiled foods, etc.
  • Examples of the feed include pet feed, livestock feed, and cultured feed.
  • the fermented product of the present invention is added to a part of the yogurt raw material in an amount of 0.1 to 20% by weight, preferably 0.5 to 10% by weight, more preferably 1 to 5% by weight. Bare and mix. Prepare an aqueous solution so that the solid content of non-fat milk is 8.0% or more, and sterilize by heating at 65-130 ° C for 1 second to 30 minutes, and then 25-45 Cool to a temperature of ° C. Subsequently, 0.1 to 6% by weight of lactic acid bacteria is inoculated as a starter. After inoculation, ferment at 25-45 ° C for 3-72 hours until the amount of lactic acid bacteria reaches 10 million Zml or more, and cool to 10 ° C or less after the fermentation to obtain GABA-containing yogurt.
  • the fermented product of the present invention is added to the prepared pickles (pH 3.8, pH 5.0) at 0.5 to 100% by weight, preferably 2 to 50% by weight, more preferably 3 to 20% by weight.
  • seasonings as necessary and age at low temperature to make GABA-containing pickles.
  • Example 1 Isolation and identification of Enterococcus avium G15 Carrot leaves were cut and 0.5 g was placed in 0.5% sodium glutamate containing MRS liquid medium (lOmL in a 15 mL screw cap test tube). Then, it was screwed and cultured at 30 ° C and 37 ° C in a slightly anaerobic state.
  • a total of 15 colonies were collected from a 30 ° C 37 ° C culture plate, and 8 were high GABA-producing bacteria (6 at 30 ° C and 2 at 37 ° C). As a result of Gram staining, all eight high GABA producing bacteria were Gram positive streptococci.
  • the primer for 16S r—RNA (27f) 5 agagtttgatcctg gctcag—3 ′ IJ number 2> and (1525r) 5 ggaggtgatccagcc—3 ′ IJ number 3> About 1.5 kb was amplified by PCR. Subsequently, direct sequencing is performed using the primer (r2L) 5′—g actaccagggtatctaatc 3 and SEQ ID NO: 4>, Searched by the program FASTA from the homepage of DDBJ (DNA Data Bank of Japan). As a result, 99.2% high homology was confirmed with the corresponding part of 16S r-RNA of Enterococcus abum.
  • the base sequence is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1.
  • the results of using BD BBLCRYSTAL GP identification test reagent (Nippon Betaton 'Dickinson Co., Ltd.) also showed that it was Enterococcus abum.
  • the obtained strain was designated as Enterococcus abum, on September 22, 2005, at 292-0818, Kisarazu, Kisarazu, Chiba Prefecture 2-5-8, National Institute for Product Evaluation Technology, Japan Deposited as G15 (NITE BP-142).
  • MRS liquid medium MRS broth manufactured by Merck & Co., Inc.
  • MRS broth manufactured by Merck & Co., Inc.
  • sodium glutamate was supplemented with sodium glutamate to a concentration of 0.5%, sterilized at 121 ° C for 15 minutes, and cooled to 30 ° C.
  • a 2% G15 fermentation broth that had been cultured for 48 hours in the same medium was ingested and cultured at 30 ° C for 48 hours.
  • the change in the lactic acidity of the culture was 0.33 (0 hour) force, etc. 1.22 (48 ⁇ # ⁇ ) ⁇ GABAS ⁇ l l. 5 mg / l 00 ml (0 hour) force, etc. 270 mgZl00 ml (48 hours) .
  • SD solution A 1% sake lees (SD) solution was prepared by dissolving spray-dried lg in a 100 ml medium or purified water.
  • GABA amount (mg / lOOml)
  • carrot medium is 121 ° C for 15 minutes
  • mandarin medium is 105 ° C for 5 minutes
  • pear medium is Perform sterilization at 100 ° C for 50 minutes. After sterilization, cool to 30 ° C, and cultivate G1 strain 5 starter (100% reduced carrot juice + 1.5% sake lees (SD) solution + 0.5% glutamine 2% amount of acid) is added. After culturing for a predetermined time, GABA content was measured (Table 3).
  • GABA amount (mg / 100ml)
  • SD sake lees
  • SD sake lees
  • rosin (SD) solution 0.5% glutamic acid, 1% sodium citrate to reduced mandarin orange juice, sterilize at 100 ° C for 50 minutes, and cool to 30 ° C.
  • G15 starter prepared in 1) Inoculate 2% of the sample, incubate at 30 ° C for 48 hours, and cool to 10 ° C or lower. This is the GABA-containing tangerine fermentation broth. This tangerine fermentation broth contained 1.5 g ZlOOml GABA.

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Abstract

　果実や野菜がもつ風味を損なうことなく、より高濃度のＧＡＢＡを含有する発酵果実又は野菜を効率よく製造する方法を提供する。 　植物又はその汁液を、グルタミン酸又はその塩及び酒粕又はその抽出物の存在下、エンテロコッカス・アビウムを用いて発酵することを特徴とするγ－アミノ酪酸含有発酵物の製造方法。

Description

明 細 書
GABA含有発酵物の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、ェンテロコッカス'アビゥムを用いて γ—ァミノ酪酸（以下、「GABA」とも Vヽぅ）を含有する発酵物を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] GABAは、広く天然界に存在するアミノ酸の一種で、発芽玄米、茶、野菜類、穀類 に含まれている。人等の哺乳動物においては脳や脊椎に存在する抑制性の神経伝 達物質であり、その生理効果については、血圧降下作用、精神安定化作用、抗スト レス作用、アルコール代謝促進作用、脳代謝促進作用、肥満防止作用等が知られて いる。
[0003] 従って、高血圧症の改善や精神安定化作用を期待して、 GABA含有量を増加さ せた食品を摂取することが提唱されている。食品中の GABAの含有量を増加する方 法としては、例えば、市販されているギヤバロン茶のように、茶葉を嫌気的条件下で 処理することによって GABA含量を増加させる方法や米胚芽等を水に浸漬すること により GABA及び遊離アミノ酸を顕著に増加する方法が開発されている（非特許文 献 1)。し力しながらこれらの方法では、茶葉を湯で抽出する際に GABAが希釈され る、或いは、大量の胚芽を集める必要がある、といった問題が残されていた。
[0004] 一方、微生物発酵法を利用して GABAを富化した食品も開発され、例えば 2種の 乳酸菌を接種して高濃度の GABAを得る方法 (特許文献 1)、乳製品をプロテアーゼ で処理して GABAの出発原料であるグルタミン酸を生産し、乳酸発酵させる方法 (特 許文献 2)、キムチ力 単離された乳酸菌を用いる方法 (特許文献 3)、鮒寿司より単 離された乳酸菌を用いる方法 (特許文献 4)、グルタミン酸と 2種以上の乳酸菌を用い ることにより低ナトリウム含量を達成させる方法 (特許文献 5)、グルタミン酸デカルボキ シラーゼを有する乳酸菌を用いて GABAが付加された大豆を製造する方法 (特許文 献 6)等が報告されている。
特許文献 1：特開 2000— 308457号公報 特許文献 2 :特開 2001—120179号公報
特許文献 3：特開 2003 - 70462号公報
特許文献 4：特開 2005— 102559号公報
特許文献 5 :特開 2005— 198578号公報
特許文献 6：特開 2004 - 187501号公報
非特許文献 1 :化学と生物 Vol33, No. 4, 1995
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、果実や野菜がもつ風味を損なうことなぐより高濃度の GABAを含有す る発酵果実又は野菜を効率よく製造する方法を提供することに関する。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、斯かる実情に鑑み、 GABAを効率よく生産でき、植物の発酵に適す る微生物及び発酵条件を検討したところ、ェンテロコッカス アビゥムを用いて、植物 又はその汁液をグルタミン酸又はその塩及び酒粕の存在下で発酵した場合に、 GA
BAを高濃度含有する発酵物が得られることを見出した。
[0007] すなわち本発明は、植物又はその汁液を、グルタミン酸又はその塩及び酒粕又は その抽出物の存在下、ェンテロコッカス'アビゥムを用いて発酵することを特徴とする
Ύーァミノ酪酸含有発酵物の製造方法に係るものである。
[0008] また本発明は、上記方法により製造された発酵物に係るものである。
[0009] また本発明は、上記方法により製造された発酵物を含有する食品又は飼料に係る ものである。
発明の効果
[0010] 本発明によれば、高濃度の GABAを含有し、果実や野菜等の植物の風味を損なう ことのない発酵植物又はその汁液を製造することができる。そして当該発酵物を用い ることにより血圧降下作用、精神安定ィヒ作用等の機能を有する食品又は飼料を製造 することができる。
発明を実施するための最良の形態 [0011] 本発明の GABA含有発酵物の製造方法は、植物又はその汁液を、グルタミン酸又 はその塩及び酒粕又はその抽出物の存在下、ェンテロコッカス'アビゥムを用いて発 酵するものである。
[0012] 本発明の方法において原料として用いられる素材は、ミカン、モモ、ブドウ、イチゴ、 ナシ等の果実、ニンジン、トマト等の野菜、等の植物又はその汁液である。
このうち、 GABA産生量の点から、ミカン、モモ、ブドウ、イチゴ、ナシ及びニンジン が好ましい。
[0013] ミカン、モモ、ブドウ、イチゴ、ナシ及びニンジンは、その種類には限定されるもので はないが、ミカンとしては、例えばゥンシユウミカン（Citrus unshiu Markovich)が 挙げられ、モモとしては、例えば白桃、黄桃、大久保、白鳳等が挙げられ、ブドウとし ては、例えばキャンベルアーリー、スーパーハンブルグ、巨峰、ピオーネ、マスカット ォブァレキサンドリア、ネオマスカット、マスカットベリー A、デラウェア、甲州、セミヨン 等が挙げられ、イチゴとしては、例えばさちのか、とよの力、アイべリー、女峰等が挙 げられ、ナシとしては、例えば豊水梨、二十世紀等が挙げられ、ニンジンとしては、例 えばセリ科のニンジン（人参： Daucus Carota L. var. satiraDC. )、金時-ンジ ン、ミニキヤロット、五寸ニンジン等が挙げられる。
[0014] これらの汁液としては、上記植物をミキサー等を用いて摩砕し、必要に応じて更に 搾汁することにより得られる果汁、野菜汁等を意味する。斯カる汁液は、適宜濃縮し てもよく、この濃縮液をそのまま、或いは濃縮液を蒸留水等で適当な濃度に希釈して 本発明の発酵原料とすることができる。
[0015] 斯カる植物又はその液汁は、それぞれを単独で用いて本発明発酵物の原料とする ことができるが、 目的に応じてこれらを組み合わせて使用してもよい。
[0016] 尚、上記植物又はその液汁には、ゼラチン、寒天、糖類、香料、果肉等、通常発酵 乳の製造に使用される原料を添加することもできる。例えば、蔗糖、グルコース、フラ クトース、パラチノース、トレハロース等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリト ール、還元水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、アセスルフャムカリウム等の高 甘味度甘味料、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化 剤、カラギーナン、キサンタンガム、グァーガム等の増粘剤、クェン酸、乳酸、リンゴ酸 等の酸味料、レモン果汁、オレンジ果汁等の果汁類の他、ビタミン類やカルシウム、 鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類、更には甘草、桂枝、生姜のような生薬、或いは香 草等を添加することが可能である。
[0017] 本発明の発酵に用いられるグルタミン酸（「Glu」と記すことがある）は、化学的には アミノ酸の一種である L—グルタミン酸を指し、その塩としては、ナトリウム塩が挙げら れる。斯カるグルタミン酸又はその塩は、調味料としての用途を持つ食品添加物であ るグルタミン酸、グルタミン酸ナトリウムや、食品蛋白質を酸や酵素で加水分解して得 られるグルタミン酸の 、ずれを用いても構わな!/、。
また、遊離グルタミン酸等を含む調味料、水産加工品、トマト等の食材を、本発明の グルタミン酸又はその塩の供給源として用いることもできる。
[0018] グルタミン酸又はその塩の使用量は、特に制限はないが、 30重量％以下が好まし ぐ 0. 1〜： LO重量％がより好ましぐ特に 1重量％〜5重量％が好ましい。添加する方 法は一度に全量添加する方法、又は複数回に分けて添加する方法のどちらでもよい
[0019] 本発明において、「酒粕」とは、「酒粕」又は「焼酎蒸留残渣」を意味する。「酒粕」は 「もろみ」から清酒を搾り取った後の残りかすをいう。「焼酎蒸留残渣」とは、穀類等を アルコール発酵させ、これを蒸留して焼酎を得た残りの残渣である。酒粕はそのまま 使用することもできる力 その抽出物を使用することもできる。
発酵に際し、酒粕を共存させることにより、 GABAの生産性を上昇させることができ る。
[0020] 酒粕をそのまま用いる場合、多くの水分を含むことから腐敗を防止するためにも、充 分に乾燥させたものを使用するのが好ましい。乾燥手段は、特に限定されるものでは なぐ凍結乾燥法、熱風乾燥法、マイクロ波乾燥法、噴霧乾燥法、遠赤外線放射乾 燥法等の公知の方法によって行えばよい。なお、本明細書においては噴霧乾燥法 によって得た乾燥酒粕を「SD」と表記することもある。
[0021] 酒粕の抽出物は、常温下又は加温下で適当な溶剤で抽出することにより得ることが できる。なお、本発明の抽出物には、各種溶剤抽出液又はその希釈液、濃縮液もし くは乾燥末が包含される。 [0022] 上記抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤の いずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水;メタ ノーノレ、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコー ル、ブチレングリコール等の多価アルコール類；酢酸ェチル等のエステル類； n—へ キサン等の炭化水素類；クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられ、このう ち、水、アルコール類、水 アルコール混液が好ましぐ特に水、エタノール、水ーェ タノール混液、中でも 15〜75%の水—エタノール混液 (volZvol)を用いるのが好ま しい。
[0023] 抽出条件は、使用する溶媒によっても異なる力 例えば水、アルコール類、水ーァ ルコール混液又は酢酸ェチル等により抽出する場合、酒粕又は焼射蒸留残渣 1重 量部に対して 1〜10重量部の溶剤を用い、 4〜40°C、好ましくは 20〜30°Cの温度 で、 1〜5日間、特に 1日間抽出するのが好ましい。
[0024] 上記の抽出物は、そのまま用いることもできる力 当該抽出物を希釈、濃縮若しくは 凍結乾燥した後、必要に応じて粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。ま た、上記抽出物力も不活性な夾雑物を除去して用いることもでき、さらに必要により、 公知の方法で脱臭、脱色等の処理を施して力も用いてもよ!、。
[0025] 酒粕若しくは抽出物の添加量は、発酵原料に対して、 0. 01重量％〜5. 0重量％ とするのが好ましぐ更に 0. 05重量％〜3. 0重量％、特に 1. 0重量％〜2. 0重量
%であるのが好ましい。
[0026] グルタミン酸又はその塩及び酒粕又はその抽出物は、あら力じめ植物又はその液 汁に配合しておくことでも、また発酵時に添加することでもよい。尚、 GABAの生産量 を上げるために風味を損なわな 、程度に酵母抽出液を添加してもよ 、。
[0027] 本発明の製造方法に用いられるェンテロコッカス アビゥム（Enterococcus aviu m)は、通性嫌気性のグラム陽性球菌で、人の腸管、口腔などに存在する常在菌で ある力、以下に示すェンテロコッカス アビゥム（Enterococcus avium) G15 (以 下、「G15株」ともいう）を用いるのが好ましい。
「ェンテロコッカス アビゥム（Enterococcus avium) G15」は、無農薬栽培を行 つて 、る畑で育てて 、るニンジンの葉力 本発明者により始めて分離され、 2005年 9 月 22日、〒292— 0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8、独立行政法人製 品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター (NPMD)に寄託 (NITE BP— 14 2)した菌株であり、以下の菌学的性質を有する。
1)連鎖球菌、 2)グラム染色は陽性、 3)ランスフィールドの群抗原 Dを有する、 4)力 タラーゼ活性は陰性、 5)芽胞形成能は無い、 6)通性嫌気性
[0028] そして、後記実施例 2に示すように、 MRS液体培地で G 15株を培養した場合、 30 °C48時間の培養で、 270mgZl00mlの GABAを確認した。このことから、本発明の G15株はグルタミン酸デカルボキシラーゼの作用によりグルタミン酸から GABAを生 成する乳酸菌であると判断される。
また、当該 G15株は、乳酸発酵に伴う酸度の低下により弱酸性の pH4. 7で死滅す るため、酸味の弱い食品を製造するのに有用である。
[0029] 発酵に用いるェンテロコッカス アビゥムの菌数には特に制限はないが、作用させる 菌数が少ないと菌の増殖に時間を要するために雑菌汚染が起こりやすくなり、菌数 が多いと前培養に手間がかかり、要する費用も高くなる。このため、スターターとして 前培養したェンテロコッカス アビゥム培養液を 0. 5%〜5%加えるのが好ましぐ 1 %〜3%加えるのがより好ましぐ特に 1. 5%〜2. 5%加えるのがより好ましい。
[0030] 発酵は、通気、撹拌、静置若しくはこれらの組合せ等により作用させるバッチ法、又 は固定ィ匕処理を行った乳酸菌をカラム等に充填して作用させる連続法等により実施 すればよい。
作用温度は 20〜45°Cが好ましぐ GABA生産性の観点から 25〜40°Cがより好ま しぐ特に 28〜37°Cが好ましい。
また、培養時間は 1時間〜 10日間の範囲で適宜選択すればよい。
また、反応中は、生じる pHの変化に対し、クェン酸ナトリウム等の有機酸、又はカセ イソーダ等のアルカリで pH調整を行ってもよぐ pHの測定及び調整は常法に従って 行えばよい。
pH調整剤としてクェン酸 Naを用いる場合には、 0. 1重量％〜20重量％加えるの が好ましぐ更に 0. 5重量％〜10重量％、特に 1重量％〜5重量％であるのが好まし い。 [0031] 斯くして得られた発酵物は、そのまま使用することができるが、カラム分離、濾過、 濃縮、乾燥等の通常の処理工程によって GABAの含有量をさらに高めてから利用し てもよい。
[0032] 本発明の発酵物は、後記実施例 1に示すとおり、 GABA濃度が上昇しており、素材 の有する風味を維持している。従って、当該発酵物それ自体、或いは当該発酵物を 各種の食品又は飼料に配合することにより、血圧降下作用、精神安定化作用、抗スト レス作用、アルコール代謝促進作用、脳代謝促進作用、肥満防止作用等の機能を 有する食品又は飼料とすることができる。例えば、当該機能を発揮する旨を表示した 機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品、栄養補助食品等とすることができ る。
[0033] 本発明の食品の形態は特に限定されるものではないが、果汁飲料、炭酸飲料、茶 系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料や、ゼリー状食品や各種スナ ック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ジャム、パン、ガム、飴、スープ類、漬物、 佃煮等、あらゆる食品形態とすることができる。また、飼料としては、例えばペット飼料 、家畜飼料、養殖飼料等とすることができる。
[0034] 本発明の方法により得られた発酵物を配合したヨーグルト及び漬物の調製例を以 下に示す。
<ョーグノレト>
ヨーグルト原材料の一部に、本発明の発酵物を 0. 1重量％〜20重量％、好ましく は 0. 5重量％〜10重量％、更に好ましくは 1重量％〜5重量％となるようにカ卩えて混 合する。これを、無脂乳固形分が 8. 0%以上の濃度になるように水溶液を調製し、 6 5〜130°Cの温度で 1秒〜 30分の時間加熱殺菌を行い、その後 25〜45°Cの温度ま で冷却する。続いて、これに乳酸菌をスターターとして、 0. 1〜6重量％接種する。接 種後、 25〜45°Cの温度で 3〜72時間、乳酸菌量が 1000万個 Zml以上になるまで 発酵を行い、発酵終了後 10°C以下まで冷却し、 GABA含有ヨーグルトとする。
[0035] <漬物 >
通常の漬物製造に準じて塩漬けした大根、胡瓜、白菜、きやべつ、人参、茄子等の 野菜を準備する。必要があれば乳酸菌 *糖'酵母エキスを添加して醱酵を促進させ、 pH、風味等を調節しておく。調製した中漬け (pH3. 8 pH5. 0)に、本発明の発酵 物を 0. 5重量％〜100重量％、好ましくは 2重量％〜50重量％、更に好ましくは 3重 量％〜20重量％となるようにカ卩え、更に必要に応じて調味料等をカ卩え、低温で熟成 させ、 GABA含有漬物とする。
実施例
[0036] 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に よって何ら限定されるものではな!/、。
実施例 1 ェンテロコッカス アビゥム（Enterococcus avium) G15の分離と同定 ニンジンの葉を裁断し、その 0. 5gを 0. 5%グルタミン酸ナトリウム含有 MRS液体培 地（15mL容ねじ栓付試験管に lOmL)に入れ、ねじ栓をし、 30°C及び 37°Cで微嫌 気状態で培養した。
3曰目と 7曰目に 100 μ Lずつ抜き取り、 0. 5%グノレタミン酸ナトリウム含有 MRS液 体培地に植菌した。これを 3日培養した後、再び 0. 5%グルタミン酸ナトリウム含有 M RS液体培地に 100 L植菌した。 3日培養した後、 100倍希釈液を 100 レ 1%炭 酸カルシウム含有、 0. 5%グルタミン酸ナトリウム含有 MRS寒天培地に塗布し、ァネ 口パック嫌気を用いそれぞれの温度で嫌気培養を行った。
[0037] 周囲が透明なコロニーを 1つピックアップし、 MRS液体培地で懸濁した後、再び 1 %炭酸カルシウム含有、 0. 5%グルタミン酸ナトリウム含有 MRS寒天培地に塗布し た。この操作をもう一度繰り返し行った後、最終的に 0. 5%グルタミン酸ナトリウム含 有 MRS液体培地で培養し、 20%グリセロール含有 MRS液体培地と等量混ぜ合わ せ、グリセロールストックとし 70°Cで保存した。
[0038] 30°C 37°C培養プレートから計 15個のコロニーを採取し、 8個が GABA高生産菌 であった（30°Cで 6個、 37°Cで 2個）。グラム染色の結果、 8個の GABA高生産菌は 全てグラム陽'性連鎖球菌であった。
[0039] このうちの一株について、 16S r— RNA用プライマー（27f) 5 agagtttgatcctg gctcag— 3'く配歹 IJ番号 2>及び（1525r) 5 ggaggtgatccagcc— 3'く配歹 IJ 番号 3 >を用いて、約 1. 5kbを PCRにて増幅した。続いて、プライマー（r2L) 5'— g actaccagggtatctaatc 3，く配列番号 4 >を用いてダイレクトシークェンスを行!、、 DDBJ (DNA Data Bank of Japan)のホームページからプログラム FASTAに より検索した。その結果、ェンテロコッカス アビゥムの 16S r—RNAの相当箇所と 9 9. 2%の高い相同性を認めた。当該塩基配列を配列番号 1として配列表に示す。ま た、 BD BBLCRYSTAL GP同定検査試薬（日本べタトン 'ディッキンソン株式会 社)を使った結果もェンテロコッカス アビゥムであることを示した。
そこで、得られた菌株を、 2005年 9月 22日、〒 292— 0818 千葉県木更津巿力 ずさ鎌足 2— 5— 8、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センタ 一にェンテロコッカス アビゥム G15として寄託した（NITE BP— 142)。
[0040] 実施例 2 ェンテロコッカス アビゥム G15株の GABA生産性の確認
MRS液体培地 (メルク社製 MRSブロス）に 0. 5%濃度となるようグルタミン酸ナト リウムを添カ卩し、 121°Cで 15分間殺菌し、 30°Cまで冷却した。あら力じめ同培地で 48 時間培養済みの G15株発酵液を 2%量摂取し， 30°Cで 48時間培養した。培養液の 乳酸酸度の変化は、 0. 33 (0時間）力ら 1. 22 (48Β#ΓΗ ) ^ GABAS^l l. 5mg/l 00ml (0時間）力ら 270mgZl00ml (48時間）であった。
[0041] 実施例 3 果汁培地での GABA生産量の比較
表 1に示すそれぞれの果汁に対し、 0. 5%グルタミン酸 Na添加、 0. 5%グルタミン 酸 Na+ 1% 酒粕（SD)溶液添加の培地を作製し、 pHを 5. 8に調製した。これら培 地を 115°C、 20分間オートクレーブすることにより滅菌した。 MRS培地にて 24時間 前培養した G 15株をそれぞれの培地に 2%接種し、 37°C及び 28°Cで 20時間培養 後、 GABA量を酵素法にて定量した。結果を表 1に示す。
尚、 1% 酒粕（SD)溶液は、噴霧乾燥酒粕 lgを 100ml培地あるいは精製水に溶 力して調製した。
[0042] [表 1] GABA量 （mg/100ml)
Figure imgf000011_0001
条件 1 ： 0. 5%グルタミン酸 Na、
条件 2 ： 0. 5%グルタミン酸 Na+1%酒粕 （S D) 溶液
[0043] 表 1より、全ての培地において生育、増殖することが確認された。そして、全ての果 汁において、酒粕を加えた方が GABA量が上昇した。
[0044] 実施例 4 ミカン発酵液中における GABA濃度の経時的変化
ミカン果汁に対して、グルタミン酸を最終濃度 0. 5% (wZv)となるように加えたもの と加えていないものについて低温殺菌（60°C、 30 min)した後、 G15株を植菌し、 3 7°Cにて培養した時の GABA産生量の経時変化を調べた。その結果、グルタミン酸 をカ卩えたミカン果汁にぉレ、てのみ、 GABA産生量が上昇した (表 2)。
[0045] [表 2]
GABA量 （mg/lOOml)
Figure imgf000011_0002
Glu： グルタミン酸
[0046] 実施例 5 植物汁液での GABA生産量
還元ニンジン汁、還元ミカン果汁、還元梨果汁を表 3に示す各条件の添加物をカロ え調製後、ニンジン培地は 121°C、 15分、ミカン培地は 105°C、 5分、ナシ培地は 10 0°C、 50分の殺菌処理を行う。殺菌後、 30°Cまで冷却し、あら力じめ培養済みの G1 5株スターター（100%還元ニンジン汁 + 1. 5%酒粕（SD)溶液 +0. 5%グルタミン 酸)を 2%量添加する。所定の時間まで培養後、 GABA含有量を測定した (表 3)。
[0047] [表 3]
GABA量 （mg/ 100ml)
Figure imgf000012_0001
Glu：グルタミン酸
[0048] その結果、ミカン果汁に対して 3%グルタミン酸、 1%クェン酸 Na、 1. 5%酒粕（SD )溶液を添カ卩し、 30°Cで 24時間培養した場合、 GABA含有量は 1, 137mg/100 mlに達した。
同様に、 G15株を利用することにより、ニンジン果汁、ナシ果汁でも GABAを生産 できることが分力つた。
[0049] 実施例 6 GABA入り植物乳酸菌ヨーグルトの製造
1) G15株スターターの調製
ニンジン汁に 1. 5%酒粕（SD)溶液、 0. 5%グルタミン酸、 1%クェン酸 Naをカロえ て 100°C50分殺菌し、 30°Cに冷却する。これに G15株を 2%量接種し、 30°C24時 間培養後 10°C以下に冷却したものを G15株のスターターとする。
2)植物乳酸菌スターターの調製
脱脂粉乳の 13%水溶液に酒粕（SD)溶液を 1%量添加し、同様に処理したものを 植物乳酸菌のスターターとする。
3)ミカン発酵液の調製
還元ミカン果汁に 1. 5%酒粕（SD)溶液、 0. 5%グルタミン酸、 1%クェン酸 Naを 加えて 100°C50分殺菌し、 30°Cに冷却する。これに 1)で調製した G15株スターター を 2%量接種し、 30°C48時間培養後、 10°C以下に冷却する。これを GABA含有の ミカン発酵液とする。このミカン発酵液には 1. 5gZlOOmlの GABAを含んでいた。
4)ヨーグルト製造
ヨーグルト製造原液に 2%量の 3)で調製したミカン発酵液をカ卩え、 90°C10分で殺 菌した後、 2)で調製した植物乳酸菌スターターを 5%量接種して 38°C10時間培養し 、 10°C以下に冷却し、 GABA含有植物乳酸菌ヨーグルトを得た。

Claims

請求の範囲
[1] 植物又はその汁液を、グルタミン酸又はその塩及び酒粕又はその抽出物の存在下 、ェンテロコッカス'アビゥムを用いて発酵することを特徴とする Ύ—アミノ酪酸含有発 酵物の製造方法。
[2] 植物又はその汁液に対して、酒粕又はその抽出物を 0. 01重量％〜5. 0重量％の 範囲で用いる請求項 1記載の方法。
[3] ミカン、モモ、ブドウ、イチゴ、ナシ及びニンジン力も選ばれる 1種以上の植物又は その汁液を用いてなる請求項 1又は 2記載の製造方法。
[4] ェンテロコッカス'アビゥムがェンテロコッカス'アビゥム G15 (NITE BP- 142) である請求項 1〜3のいずれか 1項記載の製造方法。
[5] 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の方法により製造された発酵物。
[6] 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の方法により製造された発酵物を含有する食品 又は飼料。
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