[go: up one dir, main page]

WO2024208878A1 - Procédé de fonctionnalisation d'un support solide avec un conjugué peptidique - Google Patents

Procédé de fonctionnalisation d'un support solide avec un conjugué peptidique Download PDF

Info

Publication number
WO2024208878A1
WO2024208878A1 PCT/EP2024/059023 EP2024059023W WO2024208878A1 WO 2024208878 A1 WO2024208878 A1 WO 2024208878A1 EP 2024059023 W EP2024059023 W EP 2024059023W WO 2024208878 A1 WO2024208878 A1 WO 2024208878A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
solid support
group
acid
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2024/059023
Other languages
English (en)
Inventor
Saïd JEBORS
Karine PUGET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genepep
Original Assignee
Genepep
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genepep filed Critical Genepep
Priority to CN202480029273.0A priority Critical patent/CN121038606A/zh
Publication of WO2024208878A1 publication Critical patent/WO2024208878A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/34—Shaped forms, e.g. sheets, not provided for in any other sub-group of this main group

Definitions

  • the present invention relates to the field of functionalization of surfaces, such as textile or plastic surfaces, by peptides, in particular antimicrobial peptides.
  • biofilms have traditionally been treated with the use of antibiotics, but this massive use of antibiotics has contributed to the emergence of strains that have developed resistance to antibiotics. It is therefore necessary today to develop alternative methods to the use of disinfectants and antibiotics to eliminate biofilms and/or limit their appearance.
  • Antimicrobial coatings can be obtained by functionalizing the surfaces with molecules having antimicrobial properties.
  • Patent application WO20I41I8779 describes, for example, a method for functionalizing surfaces with bifunctional molecules comprising a catechol anchor and a peptide part comprising a difluorophenylalanine dipeptide.
  • the functionalization aims to confer antifouling properties to the surface, in particular preventing the formation of biofilms on the surface.
  • the catechol anchor allows grafting onto the surfaces by adsorption. Such grafting is less robust than covalent grafting.
  • peptide conjugates should advantageously be adaptive, so that they can be used in a wide range of applications and with a wide range of peptides.
  • functionalization methods with peptide conjugates in which the nature of the peptide, its distance from the anchoring head, and its position of attachment to the anchoring head in particular can be controlled and/or adapted.
  • peptide conjugates comprising a benzophenone-type anchoring head, a spacer arm and a peptide fragment that can be attached to the spacer arm by different locations of its structure.
  • This functionalization is particularly suitable for plastic and/or textile type supports.
  • the present invention relates to a method for functionalizing at least one surface of a solid support, comprising bringing at least said surface of said solid support into contact with at least one peptide conjugate of formula (I) in which L is a spacer arm, n is 0 or 1, preferably 1, and
  • A is a peptide fragment, under conditions suitable for obtaining the anchoring of at least one peptide conjugate of formula (I) to the surface of the support.
  • A is a peptide fragment comprising from 2 to 80 amino acids, preferably from 3 to 30 amino acids, in particular from 7 to 20 amino acids.
  • A is a peptide fragment selected from the group consisting of an antibiotic peptide, an antimicrobial peptide, an antifungal peptide, an anti-inflammatory peptide, a catalytic peptide, a biological receptor ligand peptide, an antibody and an enzyme inhibitory peptide, preferably an antimicrobial peptide, or a fragment thereof.
  • the peptide fragment is an antimicrobial peptide selected from the group consisting of peptides H-(RF)4-NH2 (SEQ ID NO:2), H-(RI)4-NH2 (SEQ ID NO:4) and H-(R) 2 -Palm.
  • L is a carbon aliphatic chain of formula (II) , in which m is an integer from 1 to 10, preferably from 4 to 6, in particular 5.
  • the solid support is selected from the group consisting of a plastic support and a textile support.
  • the functionalization method comprises the following steps: a. Contacting at least said surface of said solid support with a solution or suspension of at least one peptide conjugate of formula (I) as defined above in a solvent, the contacting preferably being carried out by dipping, spraying and/or incubation; b. Irradiation, in particular UV irradiation, of the surface in contact with the solution or suspension of the at least one peptide conjugate of formula (I), for a duration suitable for obtaining the grafting of all or part of the peptide conjugate of formula (I) onto the surface; and c. Rinsing all or part of the at least one surface of the solid support with a solvent.
  • the method further comprises at least one step chosen from the following steps: a step (i), before step (a) of contacting, of activating the at least one surface, preferably implemented by thermal activation, chemical activation and/or by irradiation;
  • step (i’) before step (a) of contacting, of cleaning the at least one surface
  • the present invention also relates to a solid support, at least one surface of which is coated with at least one peptide conjugate capable of being obtained, preferably obtained, by the functionalization method according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a solid support according to the invention for the manufacture of nanoparticles for diagnosis, for the functionalization of Elisa plates, for the manufacture of antifouling surfaces, for the manufacture of medical devices and/or for the manufacture of technical textiles.
  • Figure 1 shows the percentages of inhibition of the two bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus obtained by depositing peptide conjugates according to the invention on polycarbonate plates. Top left, conjugate Ia, top right, conjugate 1b, bottom left conjugate Ia and bottom right conjugate 1b.
  • Figure 2 is the photo showing the fluorescence of the 3 wells of the plate functionalized in example 3.
  • a “spacer arm” is a chemical group comprising at least one atom, preferably 1 to 10 atoms.
  • a “peptide fragment” is a chain of at least two amino acids linked together by peptide and/or pseudopeptide bonds.
  • the peptide fragment comprises from 2 to 80 amino acids, preferably from 2 to 40 amino acids, preferably from 3 to 40 amino acids, preferably from 3 to 30 amino acids, preferably from 4 to 30 amino acids, preferably from 4 to 20 amino acids, in particular from 7 to 20 amino acids.
  • amino acid is a molecule comprising at least one carboxylic acid function. (COOH) and an amine function, and at least one carbon atom connecting this carboxylic acid function and this amine function.
  • the amino acids used in the present invention may in particular be natural and/or synthetic amino acids.
  • Naturally occurring amino acids include, but are not limited to, the following amino acids: glycine (Gly, G), alanine (Ala, A), valine (Val, V), leucine (Leu, L), isoleucine (Ile, I), serine (Ser, S), threonine (Thr, T), phenylalanine (Phe, F), tyrosine (Tyr, Y), tryptophan (Trp, W), cysteine (Cys, C), methionine (Met, M), proline (Pro, P), aspartic acid (Asp, D), asparagine (Asn, N), glutamine (Gin, Q), glutamic acid (Glu, E), histidine (His, H), arginine (Arg, R), and lysine (Lys, K).
  • the preferred natural amino acids according to the present invention are the L-series amino acids.
  • Synthetic amino acids are any amino acids that are not naturally occurring. They include in particular the following amino acids: beta-alanine, allylglycine, tert-leucine, norleucine, 3-aminoadipic acid, 2-aminobenzoic acid, 3-aminobenzoic acid, 4-aminobenzoic acid, 2-aminobutanoic acid, 4-amino-1-carboxymethyl piperidine, 1-amino-1-cyclobutanecarboxylic acid, 4-aminocyclohexaneacetic acid, 1-amino-1-cyclohexanecarboxylic acid, (IR,2R)-2-aminocyclohexanecarboxylic acid, (IR,2S)-2-aminocyclohexanecarboxylic acid, (IS,2R)-2-aminocyclohexanecarboxylic acid, (IS,2S)-2-aminocyclohexanecarboxylic acid, 3-amino
  • side chain represents the moiety carried by the alpha carbon of an amino acid.
  • side chains of naturally occurring amino acids such as glycine, valine, alanine, and aspartic acid correspond to the hydrogen atom, isopropyl, methyl, and CH2COOH groups, respectively.
  • amino acid side chain may be included in the definition of an amino acid side chain, such as those of the following amino acids: 4-amino tetrahydropyran-4-carboxylic acid, allylglycine, diamino butyric acid, diamino propionic acid, aminoserine, aminobutyric acid, amino butylglycine, phenylglycine, 4-chloro-phenylalanine, 4-fluoro-phenylalanine, 4-nitro-phenylalanine, citrulline, cyclohexylalanine, thienylalanine, and the like.
  • amino acids such as those of the following amino acids: 4-amino tetrahydropyran-4-carboxylic acid, allylglycine, diamino butyric acid, diamino propionic acid, aminoserine, aminobutyric acid, amino butylglycine, phenylglycine, 4-chloro-phenylalanine, 4-fluor
  • the side chains of amino acids can be protected by protective groups (P) and more particularly N-protective, O-protective or S-protective when these chains contain the corresponding heteroatoms.
  • P protective groups
  • the protection of some of the reactive functions peptides is mandatory during the synthesis of said peptides.
  • Protective groups (P) are groups known to those skilled in the art. These protective groups and their use are described in works such as, for example, Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley, New York, 2007, 4th edition; Harrison et al. "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1 to 8 (J. Wiley & Sons, 1971 to 1996).
  • N-protecting groups N-protecting groups
  • S-protecting groups S-protecting groups
  • O-protecting groups O-protecting groups
  • a hydroxyl can be protected by a trityl group, or a carboxylic acid can be protected in the form of a tert-butyl ester.
  • a resin that serves as a protective group for the C-terminal carboxylic function.
  • the protection of the amino group (i.e. the "alpha amine") of the amino acid can be carried out, for example, by a tert-butyloxycarbonyl group (Boc-) or a 9-fluoro-renylmethyloxycarbonyl group (Fmoc-). The protection is carried out according to methods known in the art.
  • the amino acids obtained are synthetic until the protective group(s) are removed, thereby releasing the so-called natural amino acid.
  • the removal of the protective group(s) is also carried out according to methods known in the art.
  • a “solid support” or “substrate” is an object of which at least one surface is solid, and of which at least this surface can be functionalized by the invention.
  • plastic means a support or surface comprising a mixture containing a base material which is a polymer, or a mixture of polymers.
  • the plastic support or surface may have been obtained by molding, extrusion or shaping, preferably hot and under pressure, of said mixture comprising a polymer.
  • the term "textile” designates an assembly of threads or fibers, advantageously joined together or between them, forming a solid and insoluble entity.
  • the textile may be a fabric, advantageously obtained by weaving or knitting threads, or a nonwoven obtained by assembling fibers.
  • the textile material may be in particular a fabric, or a synthetic material such as a plastic material.
  • textile includes in particular textiles medical, civil textiles, technical textiles and filtration membranes.
  • “functionalization” or “anchoring” is meant the covalent or non-covalent attachment of at least one peptide conjugate to the surface of the solid support, preferably by means of the attachment, in particular the covalent attachment, of the benzophenone unit of the conjugate to said surface.
  • degree of functionalization is meant the quantity or density of peptide conjugate of formula (I) which is anchored to the surface of the solid support functionalized according to the invention.
  • the peptide conjugate used in the functionalization process according to the invention is a conjugate of formula (I) where L is a spacer arm, n is 0 or 1, and A is a peptide fragment.
  • the presence of this spacer arm can in particular make it possible to move the steric hindrance away from the surface when the peptide fragment is bulky, for example when it comprises side chains.
  • L is an aliphatic carbon chain of formula (II) in which m is an integer from 1 to 10, preferably 4 at 6, especially 5.
  • the ends of the spacer arm L which are respectively attached to the benzophenone and to the peptide fragment A are typically made up of functional groups allowing the attachment of the different entities by chemical reactions well known in the art, such as peptide bond formation reactions.
  • the linkage between the spacer arm L and the peptide fragment A is at the N-terminus of the peptide fragment A. In another embodiment, the linkage between the spacer arm L and the peptide fragment A is at the C-terminus of the peptide fragment A. In another embodiment, the linkage between the spacer arm L and the peptide fragment A is at a side chain of the peptide fragment A.
  • the peptide conjugate comprises a single peptide moiety and a single benzophenone head.
  • the peptide conjugate may comprise a single peptide moiety and multiple benzophenone heads, for example, 2, 3, 4, or 5 benzophenone heads preferably linked to different positions on the peptide moiety.
  • the peptide fragment may comprise from 2 to 80 amino acids, preferably from 2 to 40 amino acids, preferably from 3 to 40 amino acids, preferably from 3 to 30 amino acids, preferably from 4 to 30 amino acids, preferably from 4 to 20 amino acids, in particular from 7 to 20 amino acids.
  • the peptide fragment A is not the GRGDSP fragment (SEQ ID NO: 1).
  • the peptide fragment A is not the RGD fragment.
  • the peptide fragment A is neither the GRGDSP fragment (SEQ ID NO: 1) nor the RGD fragment.
  • peptide fragment A does not comprise any amino acid capable of reacting with benzophenone, such as methionine and/or tryptophan.
  • peptide fragment A is an unmodified peptide.
  • the peptide fragment is a modified peptide, for example, a peptide whose end(s) not linked to the spacer arm is (are) substituted and/or protected by a protecting group.
  • the COOH terminus of the peptide may be substituted by a fatty acid, such as palmitic acid.
  • peptide fragment A is selected from the group consisting of a linear natural peptide strand, a linear synthetic peptide strand, a linear protected natural peptide strand, a linear protected synthetic peptide strand, a linear natural pseudopeptide strand, a linear synthetic pseudopeptide strand, a linear pseudopeptide strand natural protected linear peptide strand, and a synthetic protected linear pseudopeptide strand.
  • peptide fragment A is selected from the group consisting of a cyclic natural peptide fragment, a cyclic synthetic peptide fragment, a cyclic protected natural peptide fragment, a cyclic protected synthetic peptide fragment, a cyclic natural pseudopeptide fragment, a cyclic synthetic pseudopeptide fragment, a cyclic protected natural pseudopeptide fragment, and a cyclic protected synthetic pseudopeptide fragment.
  • the peptide fragment A of the peptide conjugate of formula (I) may comprise one or more peptides, peptide strands and/or peptide fragments as described in the present description.
  • the peptide fragment A is selected from the group consisting of the peptides H-(RF) 4 -NH 2 (SEQ ID NO: 2), H-(RI) 4 -NH 2 (SEQ ID NO: 4) and H-(R) 2 -Palm, Palm designating a modification of the terminal arginine by a palmitic acid.
  • the peptide fragment A has a particular property, in particular a particular chemical or biological activity.
  • the peptide fragment A can be chosen from the group consisting of an antibiotic peptide, an antimicrobial peptide, an antifungal peptide, an anti-inflammatory peptide, a catalyst peptide, a biological receptor ligand peptide, an antibody and an enzyme inhibitor peptide.
  • the peptide fragment A is chosen from the group consisting of an antibiotic peptide, an antimicrobial peptide, an antifungal peptide, an anti-inflammatory peptide and a catalyst peptide.
  • the peptide fragment A is chosen from the group consisting of an antibiotic peptide, an antimicrobial peptide and an antifungal peptide.
  • peptide fragment A is an antimicrobial peptide, preferably a cationic antimicrobial peptide, with an overall positive charge and comprising at least one hydrophobic residue.
  • the particular property of the peptide fragment A is advantageously not affected by its grafting to the spacer arm and to the benzophenone head, this particular property is therefore also a particular property of the corresponding peptide conjugate.
  • the particular property of the peptide conjugate is advantageously not affected by its anchoring on the surface of the solid support, this particular property is therefore also a particular property of the functionalized surface of the corresponding solid support.
  • peptide fragment A is an antimicrobial peptide selected from the group consisting of peptides H-(RF) 4 -NH 2 (SEQ ID NO: 2), H-(RI) 4 -NH 2 (SEQ ID NO: 4) and H-(R)2-Palm, Palm denoting a modification of the terminal arginine by a palmitic acid.
  • the peptide conjugate is selected from the group consisting of the conjugate defined by SEQ ID No. 3 and the conjugate defined by SEQ ID No. 5.
  • the peptide conjugates according to the invention can be synthesized by any suitable technique known in the art, in particular by successive couplings of the spacer arm with the benzophenone and with the peptide fragment A.
  • the peptide conjugate and the peptide fragment A can in particular be synthesized by conventional peptide synthesis techniques.
  • Peptide synthesis is conventionally carried out by activating the carboxylic acid function of an amino acid, or of an amino acid chain, by using a coupling agent. This activated acid is placed in the presence of an amino acid, or of an amino acid chain, whose terminal amine is not protected, thus resulting in the formation of an amide bond, also called a peptide bond.
  • the coupling conditions as well as the coupling agents used are very well known to those skilled in the art and described for example in works such as Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 2007 4th edition; Harrison et al.
  • the functionalization method according to the invention applies to at least one surface of a solid support.
  • the surface functionalized by the method according to the invention is the total surface of the solid support. In another preferred embodiment, the surface functionalized by the method according to the invention is only a part of the total surface of the solid support.
  • the solid support may be any material benefiting from functionalization by the peptide conjugate of formula (I). It may in particular be a plastic support or a textile support, preferably a plastic support.
  • the functionalization of the at least one surface of the solid support makes it possible to confer the same property on at least one surface of the support.
  • the method is carried out with a single peptide conjugate of formula (I). In other embodiments, the method is carried out with at least two different peptide conjugates, either one after the other or as a mixture. For example, the method can be carried out with at least two peptide conjugates comprising two different peptide fragments, or with at least two peptide conjugates comprising the same peptide fragment but different spacer arms, in particular spacer arms of different lengths.
  • the contacting of the at least one surface with the at least one peptide conjugate of formula (I) can be carried out by any suitable technique.
  • the contacting can be carried out by dipping, spraying and/or incubation of the at least one surface with a solution or suspension of the peptide conjugate of formula (I) in a solvent.
  • the solvent can be an organic solvent, an inorganic solvent, or a mixture of such solvents.
  • the solvent can in particular be an alcohol, such as ethanol.
  • the peptide conjugate of formula (I) is soluble in the solvent used.
  • the techniques of spin-coating, dip-coating, casting, laminar flow deposition and aerospray deposition can be mentioned.
  • the duration of contact may correspond to the time required for the total evaporation of the solvent in which the conjugate is dissolved and/or suspended.
  • the functionalization process can make it possible to anchor on the surface of the solid support at least one layer, preferably a monolayer, of the peptide fragment(s) of the peptide conjugate(s) of formula (I).
  • the functionalization method according to the invention comprises the following steps, preferably in this order: a. Contacting at least said surface of said solid support with a solution or suspension of at least one peptide conjugate of formula (I) in a solvent, the contacting preferably being carried out by soaking, spraying and/or incubation; b. Irradiation of the surface in contact with the solution or suspension of at least one peptide conjugate of formula (I), for a duration suitable for obtaining the anchoring of all or part of the peptide conjugate of formula (I) on the surface; and c. Rinsing all or part of the at least one surface of the solid support with a solvent.
  • Step a. of contacting can be implemented as described above for the contacting step.
  • Irradiation step b. allows in particular the activation of the benzophenone head of the peptide conjugate of formula (I) and its anchoring on the surface of the solid support. Preferably, this involves irradiation with ultraviolet (UV).
  • UV ultraviolet
  • Irradiation step b. can be carried out either in the presence of the solvent of the solution or suspension brought into contact with the support in step a., or after evaporation or drying of all or part of the solvent, in particular after evaporation or drying of all the solvent.
  • Rinsing step c. makes it possible in particular to remove the excess peptide conjugate of formula (I) which has not anchored to the surface of the solid support at the end of irradiation step b.
  • the rinsing can be carried out with a solvent or with several solvents, either simultaneously or one after the other.
  • the solvent of rinsing step c. can be an organic solvent, an inorganic solvent or a mixture of such solvents.
  • the rinsing step can be carried out once or several times, in particular 2, 3, 4, 5 or 10 times, with the same solvent or with different solvents.
  • rinsing step c. makes it possible to remove all of the peptide conjugate of formula (I) which is not anchored to the surface at the end of step b.
  • the functionalization method further comprises, before step a. of contacting, a step (i) of activating the at least one surface.
  • This activation step makes it possible in particular to improve the subsequent anchoring of the peptide conjugate of formula (I) to the surface, for example by increasing the anchoring speed and/or by increasing the degree of functionalization.
  • the nature of the activation to be implemented depends on the nature of the surface of the solid support. This activation may in particular be a thermal activation, by exposure to a temperature above room temperature (15 to 25°C), a chemical activation, by contacting with a chemical agent allowing activation, and/or an activation by irradiation.
  • the functionalization method further comprises, before step a.
  • a step (i') of cleaning the at least one surface aims to remove any substance present on the surface and which could prevent or weaken the subsequent functionalization by the peptide conjugate(s).
  • the cleaning step (i') can be carried out for example using a solvent such as an alcohol, in particular ethanol or isopropanol.
  • the functionalization method further comprises, after the rinsing step c., a centrifugation step (ii), preferably also comprising the separation of the pellet and the centrifugation supernatant, the solid support being in the centrifugation pellet.
  • a centrifugation step (ii) preferably also comprising the separation of the pellet and the centrifugation supernatant, the solid support being in the centrifugation pellet.
  • the functionalization method further comprises, after the rinsing step c., and after the centrifugation step (ii) if present, an aging step (iii).
  • Step (iii) may in particular be a reduced pressure aging step (under vacuum) and/or a heating aging step at a temperature above room temperature.
  • step (iii) comprises reduced pressure aging followed by heating aging.
  • Another object of the present invention is a solid support of which at least one surface is coated with at least one peptide conjugate, capable of being obtained, preferably obtained, by the functionalization method according to the invention.
  • only one surface of the solid support is functionalized by a functionalization method according to the invention.
  • at least two surfaces of the solid support, preferably all surfaces of the solid support are functionalized by a functionalization method according to the invention.
  • only a portion of the surface of the solid support is functionalized by a functionalization method according to the invention.
  • 100% of the surface of the solid support is functionalized by a functionalization method according to the invention.
  • less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10% or less than 5% of the surface of the solid support is functionalized by a functionalization method according to the invention.
  • the solid support according to the invention and/or the solid support capable of being obtained, preferably obtained, by a functionalization process according to the invention, can be used in a wide variety of applications.
  • Possible uses include the manufacture of nanoparticles for diagnosis, the functionalization of Elisa plates, the manufacture of antifouling surfaces, the manufacture of medical devices and/or the manufacture of technical textiles.
  • a final object of the invention is the use of a solid support according to the invention, of a solid support obtained or capable of being obtained by a functionalization process according to the invention, and/or of a functionalization process according to the invention, for the manufacture of nanoparticles for diagnosis, for the functionalization of Elisa plates, for the manufacture of antifouling surfaces, for the manufacture of medical devices and/or for the manufacture of technical textiles.
  • Peptides are synthesized on solid support using a Symphony X peptide synthesizer (Protein Technologies, Inc., USA) in Fmoc/tert-butyl strategy using nitrogen bubbling as a stirring method for the coupling cycles and deprotection of Fmoc groups in the N-terminal position or in solution in Boc/Bzl strategy.
  • the syntheses were performed at a 0.25 mmol scale on Fmoc-Rink-Amide polystyrene resin (481 mg/0.52 mmol/g) or 2-chlorotrityl chloride (892 mg, 0.28 mmol/g).
  • the standard deprotection-coupling cycle for each residue consisted of six steps: Wash the resin with 5 mL of dimethylformamide DMF (3 x 30 sec). Deprotection of the Fmoc group with 5 mL of 20% piperidine in DMF (3 x 3 min). Wash the resin with 5 mL of DMF (3 x 30 sec).
  • Cleavage of the resin is performed 2 x 60 minutes in a cleavage cocktail (trifluoroacetic acid TFA/triisopropylsilane TIS/water H2O 95/2.5/2.5) for the deprotected sequences and 2 x 60 minutes in a cleavage cocktail (acetic acid AcOH/2,2,2-Trifluoroethanol TFE/dichloromethane DCM 10/20/70) for the protected sequences (2-chlorotrityl chloride resin).
  • a cleavage cocktail trifluoroacetic acid TFA/triisopropylsilane TIS/water H2O 95/2.5/2.5
  • a cleavage cocktail acetic acid AcOH/2,2,2-Trifluoroethanol TFE/dichloromethane DCM 10/20/70
  • the precipitated peptide is centrifuged (3500 RCF) and the supernatant is removed. (X3).
  • the peptide in the form of TFA salts is then solubilized in a water ftO/acetonitrile ACN mixture before being frozen and lyophilized.
  • Peptides are analyzed by UPLC chromatography and ESI-MS mass spectrometry, equipped with a BEH C18 column (WATERS), 150*2.1 mm (150 x 2.1 mm) (flow rate: 0.6 ml/min).
  • Solvents A and B are 0.1% TFA in water and 0.1% TFA in acetonitrile.
  • Peptide purification was performed on a WATERS HPLC 4000 equipped with a 486 UV detector and a Vydac Denali 10 pm C18 120 ⁇ column (310 x 25 mm) at a flow rate of 50 mL/min.
  • the solvents used were 0.1% TFA in water (buffer A) and 0.1% TFA in acetonitrile (buffer B).
  • Example 1a Peptide conjugate comprising the peptide H-4-NH2 (SEQ ID NO:2)
  • the antibacterial peptide H-(RF)4-NH2 (SEQ ID No. 2) was synthesized on a Rink Amide resin (loading 0.52 mmol/g, synthesis scale: 0.25 mmol) using the Fmoc/tBu strategy. Each coupling was followed by deprotection of the Fmoc group at the N-terminus. The peptide was then functionalized on a support after introduction of a spacer (or “linker”).
  • the Fmoc-Ahx-OH spacer (6-hexanoic amino acid protected by a Fmoc group) was introduced into DMF in the presence of 3 equivalents of HATU and 6 equivalents of DIEA, the resin was washed (3*DMF, 1*methanol MeOH and 1*dichloromethane DCM). 4-Benzoylbenzoic acid was coupled in DMF in the presence of 3 equivalents of HATU and 6 equivalents of DIEA, the resin was washed (3 * DMF, 1 * MeOH and 1 * DCM). The resin was then cleaved in a mixture of DCM / TFA / H2O 50/47.5/2.5 for 2X1 h.
  • the “cleavage” solution was concentrated under reduced pressure and then the antibacterial anchor peptide was precipitated in diethyl ether and finally purified by preparative HPLC (Vydac Denali 10 pm C18 120 ⁇ column (310 x 25 mm) using a gradient of 20 to 60% of buffer B in 40 min.).
  • Example lb Peptide conjugate comprising the peptide H-(RI)4-NH2 (SEQ IP No. 4)
  • the antibacterial peptide H-(RI)4-NH2 (SEQ ID No. 4) was synthesized on a Rink Amide resin (loading 0.52 mmol/g, synthesis scale: 0.25 mmol) using the Fmoc/tBu strategy. Each coupling was followed by deprotection of the N-terminal Fmoc group. The peptide was then functionalized on a support after introduction of a spacer (or "linker"). The Fmoc-Ahx-OH spacer was introduced into DMF in the presence of 3 equivalents of HATU and 6 equivalents of DIEA, the resin was washed (3*DMF, 1*MeOH and 1*DCM).
  • the antibacterial peptide H-(R)2-Palm was synthesized on a Rink resin (loading 0.52 mmol/g, synthesis scale: 0.25 mmol) previously functionalized by a benzotriazole in Fmoc/tBu strategy. Each coupling was followed by deprotection of the Fmoc group at the N-terminal.
  • the Rink-amide resin was pretreated with piperidine (20% in DMF) and washed (3*DMF, 1*MeOH and 1*DCM).
  • 4-Amino 3-nitrobenzoic acid was coupled in DMF in the presence of 3 equivalents of HATU and 6 equivalents of DIEA.
  • the reaction was left stirring for 2 h and then the resin was washed (3*DMF, 1*MeOH and 1*DCM), capped with acetic anhydride (15 ml of a 10% v/v solution in DCM) and then washed (2*DCM, 3*DMF, 1*MeOH and 1*DCM).
  • the reduction of the nitro group was carried out in a solution of 5 g of SnCh(2H2O) and 900 ⁇ L of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene DBU per 10 ml of DMF which was added to the resin under nitrogen bubbling for 10 minutes. The reaction was stirred for 15 h, syringe opened and washed (3*DMF, 3*DCM).
  • the introduction of the peptide sequence -(R)2- was carried out using the Fmoc/tBu strategy. Each coupling was followed by deprotection of the Fmoc group at the N-terminus. The peptide was then functionalized on a support after introduction of a spacer (or "linker").
  • the Fmoc-Ahx-OH spacer was introduced into DMF in the presence of 3 equivalents of HATU and 6 equivalents of DIEA, the resin was washed (3*DMF, 1*MeOH and 1*DCM).
  • the peptide was then deprotected in a DCM/TFA/H2O 50/47.5/2.5 mixture for 2x1 h.
  • the “deprotection” solution was concentrated under reduced pressure and the antibacterial peptide was precipitated in diethyl ether and finally purified by preparative HPLC (Vydac Denali 10 pm C18 120 ⁇ column (310 x 25 mm) using a gradient of 20 to 60% buffer B in 40 min).
  • the deposition of the three peptides obtained in example 1 was carried out by dip-coating, that is to say by dipping/removal at a constant speed of the substrate in a solution of the anchor peptide in an ethanolic solution.
  • Each peptide was solubilized in an ethanolic solution (95%).
  • Example 3 Grafting of benzophenone onto a support
  • the fluorescent dansyl-benzophenone block of formula below was synthesized by conventional techniques.
  • a 96-well polystyrene plate was previously rinsed with distilled water and ethyl alcohol, then dried.
  • a 0.1M solution of dansyl-benzophenone compound was deposited in the first three wells.
  • the plate was irradiated for 180 seconds under UV at a power of 120 mW/cm 2 .
  • the plate was then rinsed with distilled water.
  • Figure 2 shows a photo of the plate, which shows fluorescence of the 3 functionalized wells.
  • Example 4 Determination of the antibacterial activity of substrates treated with antimicrobial peptides according to the invention
  • Antibacterial activity according to ISO 22196:2011 is intended to assess the anti- microbial activity of plastic products or non-porous surfaces treated with antimicrobial agents.
  • the method used in this study focuses only on the evaluation of antibacterial activity.
  • This study is intended to evaluate the antibacterial activity of peptide-grafted polycarbonate materials compared to the reference without treatment according to the recommendations of the ISO 22196:20111 standard for a contact time of 24 hours.
  • Such a study ideally uses 5 cm x 5 cm samples on which a known concentration of the microorganism to be tested has been deposited. After incubation for 24 hours at 35°C, the quantity of viable microorganisms is assessed by the agar medium enumeration technique. Comparison of the bacterial concentrations obtained between the treated and untreated material makes it possible to define the antibacterial activity of the tested formulation.
  • Each conjugate 1a, 1b and 1c as synthesized in Example 1 was deposited on the surface of the polycarbonate plates by depositing a solution of 0.02 to 4 mg/mL.
  • Table 1 corresponds to Staphylococcus aureus
  • Table 2 corresponds to Escherichia coli.
  • PC denotes polycarbonate.
  • Peptide conjugates are designated by reference to the example in which their synthesis is described (1a, 1b and 1c).
  • Figure 1 illustrates these results.
  • a significant inhibition of the 2 types of bacteria was obtained (up to 99.87% reduction in growth for Staphylococcus aureus, and up to 97.0% reduction in growth for Escherichia coll) for the polycarbonate samples functionalized according to the invention compared to the non-functionalized polycarbonate samples.
  • the antibacterial activity of the peptide conjugates 1a, 1b and 1c is therefore efficiently transferred to the polycarbonate support on which they are grafted.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de fonctionnalisation d'un support solide avec un conjugué peptidique comportant une tête d'ancrage benzophénone, un bras espaceur et un fragment peptidique. Elle concerne également un support solide susceptible d'être obtenu par un procédé de fonctionnalisation selon l'invention, ainsi que l'utilisation du support solide selon l'invention.

Description

Procédé de fonctionnalisation d’un support solide avec un conjugué peptidique
Domaine technique
La présente invention concerne le domaine de la fonctionnalisation des surfaces, telles que des surfaces textiles ou plastiques, par des peptides, notamment des peptides antimicrobiens.
Arrière-plan technologique
L’industrie médicale est confrontée à de nombreux défis. Parmi les principaux, on peut citer le contrôle des infections et la réduction de la propagation des micro-organismes tels que les champignons, les bactéries et les virus. Certains de ces micro-organismes peuvent se fixer sur des surfaces et former des biofilms. Au-delà du domaine médical, les biofilms représentent également une menace dans l’industrie de transformation alimentaire. Les biofilms ont été classiquement traités avec l’utilisation d’antibiotiques, mais cette utilisation massive des antibiotiques a contribué à l’émergence de souches ayant développé une résistance aux antibiotiques. Il est donc nécessaire aujourd’hui de développer des méthodes alternatives à l’utilisation de désinfectants et d’antibiotiques pour éliminer les biofilms et/ou limiter leur apparition.
Pour éviter la formation de biofilms sur des surfaces, une des méthodes ayant prouvé son efficacité est l’utilisation de revêtements antimicrobiens sur ces surfaces. Les bactéries ne développent pas facilement de résistance à ces revêtements antimicrobiens qui ont une action mécanique et pas uniquement chimique. Les revêtements antimicrobiens peuvent être obtenus par la fonctionnalisation des surfaces avec des molécules présentant des propriétés antimicrobiennes. La demande de brevet WO20I41I8779 décrit par exemple une méthode de fonctionnalisation des surfaces avec des molécules bifonctionnelles comprenant une ancre catéchol, et une partie peptidique comprenant un dipeptide difluorophénylalanine. La fonctionnalisation a pour but de conférer des propriétés d’antisalissures (antifouling) à la surface, évitant notamment la formation de biofilms sur la surface. L’ancre catéchol permet un greffage sur les surfaces par adsorption. Un tel greffage est moins robuste qu’un greffage covalent.
Il serait intéressant de disposer de nouveaux procédés de fonctionnalisation de surfaces avec des conjugués peptidiques, lesdits procédés fournissant un ancrage efficace des conjugués peptidiques sur les surfaces. Les conjugués peptidiques devraient avantageusement être adaptatifs, de sorte à pouvoir être utilisés dans une large gamme d’applications et avec une large gamme de peptides. Ainsi, il serait intéressant de pouvoir mettre en œuvre des procédés de fonctionnalisation avec des conjugués peptidiques dans lesquels la nature du peptide, sa distance à la tête d’ancrage, et sa position de fixation à la tête d’ancrage notamment peuvent être contrôlées et/ou adaptées. Dans ce cadre, les inventeurs de la présente invention ont démontré qu’il est possible de fonctionnaliser de façon efficace des surfaces de supports solides avec des conjugués peptidiques comportant une tête d’ancrage de type benzophénone, un bras espaceur et un fragment peptidique qui peut être fixé au bras espaceur par différents endroits de sa structure. Cette fonction- nalisation est particulièrement adaptée aux supports de type plastique et/ou textile.
Résumé de l’invention
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide, comprenant la mise en contact d’au moins ladite surface dudit support solide avec au moins un conjugué peptidique de formule (I)
Figure imgf000003_0001
dans laquelle L est un bras espaceur, n est 0 ou 1, de préférence 1, et
A est un fragment peptidique, dans des conditions adaptées pour obtenir l’ancrage du au moins un conjugué peptidique de formule (I) à la surface du support.
Dans un mode de réalisation, A est un fragment peptidique comprenant de 2 à 80 acides aminés, de préférence de 3 à 30 acides aminés, en particulier de 7 à 20 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, A est un fragment peptidique choisi dans le groupe constitué par un peptide antibiotique, un peptide antimicrobien, un peptide antifongique, un peptide antiinflammatoire, un peptide catalyseur, un peptide ligand de récepteur biologique, un anticorps et un peptide inhibiteur d’enzyme, de préférence un peptide antimicrobien, ou un fragment de ceux-ci.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique est un peptide antimicrobien choisi dans le groupe constitué par les peptides H-(RF)4-NH2 (SEQ ID N°2), H-(RI)4-NH2 (SEQ ID N°4) et H-(R)2-Palm.
Dans un mode de réalisation, L est une chaîne hydrocarbonée aliphatique saturée ou insaturée comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, éventuellement interrompue ou terminée par au moins un parmi un hétéroatome, notamment O ou S, un groupe aryle, un groupe C=O, un groupe SO2, un groupe NRi, dans lequel Ri est choisi parmi un atome d’hydrogène, un radical hydrocarboné aliphatique comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, un radical benzyle et un radical phénéthyle, ladite chaîne pouvant être non substituée ou substituée. De préférence, L est une chaîne aliphatique carbonée de formule (II)
Figure imgf000004_0001
, dans laquelle m est un entier de 1 à 10, de préférence de 4 à 6, en particulier 5.
Dans un mode de réalisation, le support solide est choisi dans le groupe constitué par un support plastique et un support textile.
Dans un mode de réalisation, le procédé de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes : a. Mise en contact d’au moins ladite surface dudit support solide avec une solution ou une suspension d’au moins un conjugué peptidique de formule (I) tel que défini ci- avant dans un solvant, la mise en contact étant mise en œuvre de préférence par trempage, pulvérisation et/ou incubation ; b. Irradiation, notamment irradiation UV, de la surface en contact avec la solution ou la suspension du au moins un conjugué peptidique de formule (I), pendant une durée adaptée pour obtenir le greffage de tout ou partie du conjugué peptidique de formule (I) sur la surface ; et c. Rinçage de tout ou partie de la au moins une surface du support solide avec un solvant.
Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre au moins une étape choisie parmi les étapes suivantes : une étape (i), avant l’étape (a) de mise en contact, d’activation de la au moins une surface, de préférence mise en œuvre par activation thermique, activation chimique et/ou par irradiation ;
- une étape (i’), avant l’étape (a) de mise en contact, de nettoyage de la au moins une surface ;
- une étape (ii), après l’étape (c) de rinçage, de centrifugation ;
- une étape (iii), après l’étape (c) et, si elle est présente, après l’étape (ii) de centrifugation, de vieillissement, de préférence mise en œuvre par vieillissement sous vide et/ou par chauffage. La présente invention concerne également un support solide, dont au moins une surface est revêtue d’au moins un conjugué peptidique susceptible d’être obtenu, de préférence obtenu, par le procédé de fonctionnalisation selon l’invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un support solide selon l’invention pour la fabrication de nanoparticules pour le diagnostic, pour la fonctionnalisation de plaques Elisa, pour la fabrication de surfaces antifouling, pour la fabrication de dispositifs médicaux et/ou pour la fabrication de textiles techniques.
Brève description des dessins
La figure 1 représente les pourcentages d’inhibition des deux bactéries Escherichia coli et Staphylococcus aureus obtenus par dépôt de conjugués peptidiques selon l’invention sur des plaques de polycarbonate. En haut à gauche, conjugué la, en haut à droite, conjugué 1b, en bas à gauche conjugué la et en bas à droite conjugué 1b.
La figure 2 est la photo montrant la fluorescence des 3 puits de la plaque fonctionnalisés à l’exemple 3.
Description détaillée
Définitions
Selon la présente invention, un « bras espaceur » est un groupement chimique comprenant au moins un atome, de préférence 1 à 10 atomes. De préférence, un bras espaceur est une chaîne hydrocarbonée aliphatique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, éventuellement interrompue et/ou terminée par au moins un parmi un hétéroatome, notamment O ou S, un groupe aryle, un groupe C=O, un groupe SO2, un groupe NRi, dans lequel Ri peut notamment être choisi parmi un atome d’hydrogène, un radical hydrocarboné aliphatique comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, un radical benzyle et un radical phénéthyle, ladite chaîne pouvant être non substituée ou substituée par un ou plusieurs radicaux, lesdits radicaux pouvant notamment être choisis parmi les atomes d’halogène (F, Cl, Br ou I), le groupe hydroxyle, les chaînes hydrocarbonées aliphatiques saturées comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, les radicaux benzyles, les radicaux phénéthyles, les radicaux poly oxyde d’éthylène (PEG) et les radicaux polyalanine.
Un « fragment peptidique » est un enchaînement d’au moins deux acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques et/ou pseudopeptidiques. De préférence, le fragment peptidique comprend de de 2 à 80 acides aminés, de préférence de 2 à 40 acides aminés, de préférence de 3 à 40 acides aminés, de préférence de 3 à 30 acides aminés, de préférence de 4 à 30 acides aminés, de préférence de 4 à 20 acides aminés, en particulier de 7 à 20 acides aminés.
Un « acide aminé » est une molécule comprenant au moins une fonction acide carboxylique (COOH) et une fonction amine, et au moins un atome de carbone reliant cette fonction acide carboxylique et cette fonction amine. Les acides aminés utilisés dans la présente invention peuvent être notamment des acides aminés naturels et/ou synthétiques.
Les acides aminés naturels comprennent notamment les acides aminés suivants : la glycine (Gly, G), l’alanine (Ala, A), la valine (Val, V), la leucine (Leu, L), l’isoleucine (Ile, I), la sérine (Ser, S), la thréonine (Thr, T), la phénylalanine (Phe, F), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), la cystéine (Cys, C), la méthionine (Met, M), la proline (Pro, P), l’acide aspartique (Asp, D), l’asparagine (Asn, N), la glutamine (Gin, Q), l’acide glutamique (Glu, E), l’histidine (His, H), l’arginine (Arg, R) et la lysine (Lys, K). Les acides aminés naturels préférés selon la présente invention sont les acides aminés de la série L.
Les acides aminés synthétiques sont tous les acides aminés non naturels. Ils comprennent notamment les acides aminés suivants : la beta-alanine, 1’ allylglycine, la tert-leucine, la norleucine, l’acide 3-amino-adipique, l’acide 2-aminobenzoïque, l’acide 3-aminobenzoïque, l’acide 4-ami- nobenzoïque, l’acide 2-aminobutanoïque, la 4-amino-l-carboxyméthyl pipéridine, l’acide 1- amino-l-cyclobutanecarboxylique, l’acide 4-aminocy cl ohexaneacéti que, l’acide 1-amino-l-cy- clohexanecarboxylique, l’acide (IR,2R)-2-aminocyclohexanecarboxylique, l’acide (lR,2S)-2- aminocyclohexanecarboxylique, l’acide (lS,2R)-2-aminocyclohexanecarboxylique, l’acide (lS,2S)-2-aminocyclohexanecarboxylique, l’acide 3-aminocyclohexanecarboxylique, l’acide 4-aminocyclohexanecarboxylique, l’acide (lR,2R)-2-aminocyclopentanecarboxylique, l’acide (IR,2S)-2-aminocyclopentanecarboxylique, l’acide I-amino-l-cyclopentanecarboxylique, l’acide 1-amino-l-cyclopropanecarboxylique, l’acide 3-aminométhylbenzoïque, l’acide 4-ami- nométhylbenzoïque, l’acide 2-aminobutanoïque, l’acide 4-aminobutanoïque, l’acide 6-amino- hexanoïque, l’acide I-aminoindane-l-carboxylique, l’acide 2-aminoisobutyrique, l’acide 4- aminométhylphénylacétique, l’acide 4-aminophénylacétique, l’acide 3-amino-2-naphtoïque, l’acide 4-aminophénylbutanoïque, l’acide 4-amino-5-(3-indolyl)-pentanoïque, l’acide (4R,5S)- 4-amino-5-méthylheptanoïque, l’acide (R)-4-amino-5-méthylhexanoïque, l’acide (R)-4-amino- 6-méthylthiohexanoïque, l’acide (S)-4-amino-pentanoïque, l’acide (R)-4-amino-5-phénylpen- tanoïque, l’acide 4-aminophénylpropionique, l’acide (R)-4- aminopimérique, l’acide (4R,5R)- 4-amino-5-hyroxyhexanoïque, l’acide (R)-4-amino-5-hydroxypentanoïque, l’acide (R)-4- amino-5-(p-hydroxyphényl)- pentanoïque, l’acide 8-aminooctanoïque, l’acide (2S,4R)-4- amino-pyrrolidine-2-carboxylique, l’acide (2S,4S)-4-amino-pyrrolidine-2-carboxylique, l’acide azétidine-2- carboxylique, l’acide (2S,4R)-4-benzyl-pyrrolidine-2-carboxylique, l’acide (S)-4,8-diaminooctanoïque, la tert-butylglycine, le gamma-carboxyglutamate, la beta-cyclo- hexylalanine, la citrulline, l’acide 2,3-diamino propionique, l’acide hippurique, la homocyclohexylalanine, la moleucine, la homophénylalanine, la 4-hydroxyproline, l’acide indoline-2-car- boxylique, l’acide isonipécotique, la alpha-méthylalanine, la naphtyl -alanine, l’acide nicopé- tique, la norvaline, l’acide octahydroindole-2-carboxylique, 1’ ornithine, la pénicillamine, la phénylglycine, l’acide 4-phénylpyrrolidine-2-carboxylique, la propargylglycine, la 3-pyridiny- lalanine, la 4-pyridinylalanine, l’acide l-pyrrolidine-3-carboxylique, la sarcosine, les statines, l’acide tétrahydroisoquinoline- 1-carboxylique, l’acide l,2,3,4-tétrahydroisoquinoline-3-car- boxylique, l’acide tranexamique, la 4,4-difluoroproline, la 4-fluoroproline, l’alpha-(3,4-difluo- robenzyl)-proline, la gamma-(3,4-difluorobenzyl)-proline, l’alpha-(trifluorométhyl)phénylala- nine, l’hexafluoroleucine, la 5,5,5-trifluoroleucine, la 6,6,6- trifluoronorleucine, la 2-(trifluoro- méthyl)leucine, la 2-(trifluorométhyl)norleucine, la 4,4,4-trifluorovaline, la 4,4,4,4',4',4'-hexa- fluorovaline, la pentafluorophénylalanine, la 2,3-difluorophénylalanine, la 2,4-difluorophény- lalanine, la 2,5-difluorophénylalanine, la 2,6-difluorophénylalanine, la 3,4-difluorophénylala- nine, la 3,5-difluorophénylalanine, la 3,3-difluoro-3-(4-fluorophényl)alanine, la 2,3-difluoro- phénylglycine, la 2,4-difluorophénylglycine, la 2,5-difluorophénylglycine, la 3,4-difluorophé- nylglycine, la 4,4-difluoroéthylglycine, la 4,4,4-trifluoroéthylglycine, le 4-fluorotryptophane, le 5 -fluorotryptophane, le 6-fluorotryptophane, le 5-méthyltryptophane, la S-tritylcystéine, la sélénocystéine, la sélénométhionine, l’éthionine, la P-(2-thiényl)alanine, la beta-chloroalanine, la thiazolylalanine, la triazolalanine, la p-fluorophénylalanine, l’o-fluorophénylalanine, la m- fluorophénylalanine, la dihydroxyphénylalanine, la 2,5-dihydrophénylalanine, la thioproline, l’acide pipécolique, la canavanine, l’indospicine, la 3,4-déhydroproline, l’histidinol et l’hexa- fluoronorleucine, et leur semblables ou dérivés.
Le terme « chaîne latérale » représente le fragment porté par le carbone alpha d’un acide aminé. Par exemple, les chaînes latérales d’acides aminés naturels tels que la glycine, la valine, l’alanine et l’acide aspartique correspondent à l’atome d’hydrogène, aux groupes isopropyle, méthyle et CH2COOH respectivement. Les chaînes latérales d’autres acides aminés peuvent être incluses dans la définition de chaîne latérale d’un acide aminé, telles que celles des acides aminés suivants: acide 4-amino tétrahydropyran-4-carboxylique, allylglycine, acide diamino butyrique, acide diamino propionique, aminosérine, acide aminobutyrique, amino butylglycine, phénylglycine, 4-chloro-phénylalanine, 4-fluoro-phénylalanine, 4-nitro-phénylalanine, citrulline, cyclohexylalanine, thiénylalanine, et leurs semblables.
Les chaînes latérales des acides aminés peuvent être protégées par des groupements protecteurs (P) et plus particulièrement N-protecteurs, O-protecteurs ou S-protecteurs lorsque ces chaînes contiennent les hétéroatomes correspondants. La protection de certaines des fonctions réactives des peptides est obligatoire lors de la synthèse desdits peptides.
Les « groupements protecteurs (P) » sont des groupements connus de l’homme du métier. Ces groupements protecteurs et leur utilisation sont décrits dans des ouvrages tels que par exemple Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 20074e édition ; Harrison et al. "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1 à 8 (J. Wiley & sons, 1971 to 1996). En outre, des techniques de synthèse peptidique sont décrites dans Paul Lloyd- Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997 ou Houben-Weyl, "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Vol E 22a, Vol E 22b, Vol E 22c, Vol E 22d., M. Goodmann Ed., Georg Thieme Verlag, 2002. Les groupements protecteurs portés par un atome d’azote seront désignés en tant que groupements N-protecteurs ; les groupements protecteurs portés par un atome de soufre seront désignés en tant que groupements S -protecteurs, et les groupements protecteurs portés par un atome d’oxygène seront désignés en tant que groupements O-protec- teurs. Par exemple, un hydroxyle peut être protégé par un groupement trityle, ou un acide car- boxylique peut être protégé sous forme d’un ester tert-butylique. Dans le cas d’une synthèse sur support solide, c'est la résine qui sert de groupement protecteur à la fonction carboxylique C- terminale. La protection du groupe amino (c'est-à-dire « l’amine alpha ») de l’acide aminé peut être effectuée par exemple par un groupe tert-butyloxycarbonyle (Boc-) ou un groupe 9-fluo- rénylméthyloxycarbonyle (Fmoc-). La protection est effectuée selon les procédés connus dans l’art. Dans le cas de la protection des groupements fonctionnels d’acides aminés naturels, les acides aminés obtenus sont synthétiques jusqu’au retrait du/des groupements protecteurs, libérant ainsi l’acide aminé dit naturel. Le retrait du/des groupements protecteurs est également effectué selon les procédés connus dans l’art.
Un « support solide » ou « substrat » est un objet dont au moins une surface est solide, et dont au moins cette surface peut être fonctionnalisée par l’invention.
Le terme « plastique » désigne un support ou une surface comprenant un mélange contenant une matière de base qui est un polymère, ou un mélange de polymères. Le support ou la surface plastique a pu être obtenu(e) par moulage, extrusion ou façonnage, de préférence à chaud et sous pression, dudit mélange comprenant un polymère.
Le terme « textile » désigne un assemblage de fils ou de fibres, avantageusement solidarisés entre eux ou entre elles, formant une entité solide et insoluble. Ainsi et de manière appropriée, le textile peut être un tissu, avantageusement obtenu par tissage ou tricotage de fils, ou un non tissé obtenu par assemblage de fibres. Le matériau textile peut être notamment un tissu, ou un matériau synthétique tel qu’un matériau plastique. Le terme textile inclut notamment les textiles médicaux, les textiles civils, les textiles techniques et les membranes de filtration.
Par « fonctionnalisation » ou « ancrage », on désigne la fixation covalente ou non covalente d’au moins un conjugué peptidique sur la surface du support solide, de préférence par le biais de la fixation, notamment la fixation covalente, du motif benzophénone du conjugué à ladite surface.
Par « degré de fonctionnalisation », on désigne la quantité ou la densité de conjugué peptidique de formule (I) qui est ancré à la surface du support solide fonctionnalisée selon l’invention. Conjugué peptidique de formule (I)
Le conjugué peptidique utilisé dans le procédé de fonctionnalisation selon l’invention est un conjugué de formule (I)
Figure imgf000009_0001
dans laquelle L est un bras espaceur, n vaut 0 ou 1, et A est un fragment peptidique.
Dans la formule (I), le bras espaceur L est présent (n=l) ou absent (n=0), de préférence il est présent (n=l). La présence de ce bras espaceur peut permettre notamment d’éloigner de la surface l’encombrement stérique lorsque le fragment peptidique est encombrant, par exemple quand il comprend des chaînes latérales.
La nature du bras espaceur peut varier dans une large mesure. Dans certains modes de réalisation, L est une chaîne hydrocarbonée aliphatique saturée ou insaturée comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, éventuellement interrompue ou terminée par au moins un parmi un hétéroa- tome, notamment O ou S, un groupe aryle, un groupe C=O, un groupe SO2, un groupe NRi, dans lequel Ri est choisi parmi un atome d’hydrogène, un radical hydrocarboné aliphatique comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, un radical benzyle ou un radical phénéthyle, ladite chaîne pouvant être non substituée ou substituée.
Dans certains modes de réalisation, L est une chaîne aliphatique carbonée de formule (II)
Figure imgf000009_0002
dans laquelle m est un entier de 1 à 10, de préférence de 4 à 6, en particulier 5.
Les extrémités du bras espaceur L qui sont fixées respectivement à la benzophénone et au fragment peptidique A sont typiquement constituées de groupements fonctionnels permettant la fixation des différentes entités par des réactions chimiques bien connues dans l’art, telles que des réactions de formation de liaison peptidique.
Dans un mode de réalisation, la liaison entre le bras espaceur L et le fragment peptidique A est au niveau de l’extrémité N-terminale du fragment peptidique A. Dans un autre mode de réalisation, la liaison entre le bras espaceur L et le fragment peptidique A est au niveau de l’extrémité C -terminale du fragment peptidique A. Dans un autre mode de réalisation, la liaison entre le bras espaceur L et le fragment peptidique A est au niveau d’une chaîne latérale du fragment peptidique A.
Dans un mode de réalisation, le conjugué peptidique comprend un seul fragment peptidique et une seule tête benzophénone. Dans d’autres modes de réalisation, le conjugué peptidique peut comprendre un seul fragment peptidique et plusieurs têtes benzophénones, par exemple 2, 3, 4 ou 5 têtes benzophénones liées de préférence à des positions différentes sur le fragment peptidique.
Le fragment peptidique peut comprendre de 2 à 80 acides aminés, de préférence de 2 à 40 acides aminés, de préférence de 3 à 40 acides aminés, de préférence de 3 à 30 acides aminés, de préférence de 4 à 30 acides aminés, de préférence de 4 à 20 acides aminés, en particulier de 7 à 20 acides aminés. Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A n’est pas le fragment GRGDSP (SEQ ID N°l). Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A n’est pas le fragment RGD. Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A n’est ni le fragment GRGDSP (SEQ ID N°l), ni le fragment RGD.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A ne comprend pas d’acide aminé susceptible de réagir avec la benzophénone, tel que la méthionine et/ou le tryptophane.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A est un peptide non modifié. Dans un autre mode de réalisation, le fragment peptidique est un peptide modifié, par exemple un peptide dont la ou les extrémité(s) non liée(s) au bras espaceur est (sont) substituée(s) et/ou proté- gée(s) par un groupement protecteur. Par exemple, l’extrémité COOH du peptide peut être substituée par un acide gras, tel que l’acide palmitique.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A est choisi dans le groupe constitué par un brin peptidique naturel linéaire, un brin peptidique synthétique linéaire, un brin peptidique naturel protégé linéaire, un brin peptidique synthétique protégé linéaire, un brin pseudopeptidique naturel linéaire, un brin pseudopeptidique synthétique linéaire, un brin pseudopeptidique naturel protégé linéaire, et un brin pseudopeptidique synthétique protégé linéaire. Dans un autre mode de réalisation, le fragment peptidique A est choisi dans le groupe constitué par un fragment peptidique naturel cyclique, un fragment peptidique synthétique cyclique, un fragment peptidique naturel protégé cyclique, un fragment peptidique synthétique protégé cyclique, un fragment pseudopeptidique naturel cyclique, un fragment pseudopeptidique synthétique cyclique, un fragment pseudopeptidique naturel protégé cyclique et un fragment pseudopeptidique synthétique protégé cyclique.
Le fragment peptidique A du conjugué peptidique de formule (I) peut comprendre un ou plusieurs peptides, brins peptidiques et/ou fragments peptidiques tels que décrits dans la présente description.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A est choisi dans le groupe constitué par les peptides H-(RF)4-NH2 (SEQ ID N°2), H-(RI)4-NH2 (SEQ ID N°4) et H-(R)2-Palm, Palm désignant une modification de l’arginine terminale par un acide palmitique.
Avantageusement, le fragment peptidique A présente une propriété particulière, notamment une activité chimique ou biologique particulière. Ainsi, le fragment peptidique A peut être choisi dans le groupe constitué par un peptide antibiotique, un peptide antimicrobien, un peptide antifongique, un peptide anti-inflammatoire, un peptide catalyseur, un peptide ligand de récepteur biologique, un anticorps et un peptide inhibiteur d’enzyme. De préférence, le fragment peptidique A est choisi dans le groupe constitué par un peptide antibiotique, un peptide antimicrobien, un peptide antifongique, un peptide anti-inflammatoire et un peptide catalyseur. En particulier, le fragment peptidique A est choisi dans le groupe constitué par un peptide antibiotique, un peptide antimicrobien et un peptide antifongique.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A est un peptide antimicrobien, de préférence un peptide antimicrobien cationique, de charge globale positive et comportant au moins un résidu hydrophobe.
La propriété particulière du fragment peptidique A n’est avantageusement pas affectée par son greffage au bras espaceur et à la tête benzophénone, cette propriété particulière est donc également une propriété particulière du conjugué peptidique correspondant. De même, la propriété particulière du conjugué peptidique n’est avantageusement pas affectée par son ancrage sur la surface du support solide, cette propriété particulière est donc également une propriété particulière de la surface fonctionnalisée du support solide correspondante.
Dans un mode de réalisation, le fragment peptidique A est un peptide antimicrobien choisi dans le groupe constitué par les peptides H-(RF)4-NH2 (SEQ ID N°2), H-(RI)4-NH2 (SEQ ID N°4) et H-(R)2-Palm, Palm désignant une modification de l’arginine terminale par un acide palmitique.
Dans un mode de réalisation, le conjugué peptidique est choisi dans le groupe constitué par le conjugué défini par SEQ ID N°3 et le conjugué défini par SEQ ID N°5.
Les conjugués peptidiques selon l’invention peuvent être synthétisés par toute technique adaptée connue dans l’art, notamment par couplages successifs du bras espaceur avec la benzophé- none et avec le fragment peptidique A.
Le conjugué peptidique et le fragment peptidique A peuvent notamment être synthétisés par les techniques de synthèse peptidique classiques. La synthèse des peptides se fait classiquement par l’activation de la fonction acide carboxylique d’un acide aminé, ou d’une chaîne d’acides aminés, par l’utilisation d’un agent de couplage. Cet acide activé est mis en présence d’un acide aminé, ou d’une chaîne d’acides aminés, dont l’amine terminale n'est pas protégée, résultant ainsi en la formation d’une liaison amide, encore appelée liaison peptidique. Les conditions de couplage ainsi que les agents de couplage utilisés sont très bien connus de l’homme du métier et décrits par exemple dans des ouvrages tels que Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 2007 4e édition ; Harrison et al. "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1 à 8 (J. Wiley & sons, 1971 to 1996). En outre, des techniques de synthèse peptidique sont décrites dans Paul Lloyd- Williams, Fernando Alberi cio, Ernest Giralt, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997 ou Houben-Weyl, "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Vol E 22a, Vol E 22b, Vol E 22c, Vol E 22d., M. Goodmann Ed., Georg Thieme Verlag, 2002.
Procédé de fonctionnalisation
Le procédé de fonctionnalisation selon l’invention s’applique à au moins une surface d’un support solide. Dans un mode de réalisation, la surface fonctionnalisée par le procédé selon l’invention est la surface totale du support solide. Dans un autre mode de réalisation préféré, la surface fonctionnalisée par le procédé selon l’invention est seulement une partie de la surface totale du support solide.
Le support solide dont une surface est fonctionnalisée selon l’invention peut être de toute matière bénéficiant d’une fonctionnalisation par le conjugué peptidique de formule (I). Il peut notamment s’agir d’un support plastique ou d’un support textile, de préférence d’un support plastique.
Dans le cas où le fragment peptidique A du conjugué peptidique de formule (I) présente une propriété particulière, notamment une activité chimique ou biologique particulière, la fonctionnalisation de la au moins une surface du support solide permet de conférer la même propriété à la au moins une surface du support.
Dans un mode de réalisation, le procédé est mis en œuvre avec un conjugué peptidique de formule (I) unique. Dans d’autres modes de réalisation, le procédé est mis en œuvre avec au moins deux conjugués peptidiques différents, soit l’un après l’autre, soit en mélange. Par exemple, le procédé peut être mis en œuvre avec au moins deux conjugués peptidiques comportant deux fragments peptidiques différents, ou avec au moins deux conjugués peptidiques comportant le même fragment peptidique mais des bras espaceurs différents, en particulier des bras espaceurs de différentes longueurs.
La mise en contact de la au moins une surface avec le au moins un conjugué peptidique de formule (I) peut être mise en œuvre par toute technique adaptée. Notamment, la mise en contact peut être mise en œuvre par trempage, pulvérisation et/ou incubation de la au moins une surface avec une solution ou une suspension du conjugué peptidique de formule (I) dans un solvant. Le solvant peut être un solvant organique, un solvant inorganique, ou un mélange de tels solvants. Le solvant peut notamment être un alcool, tel que de l’éthanol. Dans un mode de réalisation, le conjugué peptidique de formule (I) est soluble dans le solvant utilisé. On peut citer en particulier les techniques de dépôt par centrifugation (« spin-coating »), de dépôt par trempage (« dip-coa- ting »), de dépôt par gouttes (« casting »), de dépôt par écoulement en flux laminaire et de dépôt par pulvérisation (« aerospray »).
L’homme du métier est à même de déterminer les paramètres tels que la durée et/ou la température de la mise en contact en fonction notamment de la nature de la surface du support solide, de la structure du conjugué peptidique de formule (I) et/ou du degré de fonctionnalisation souhaité. Par exemple, la durée de mise en contact peut correspondre à la durée nécessaire à l’évaporation totale du solvant dans lequel le conjugué est dissous et/ou suspendu.
Le procédé de fonctionnalisation peut permettre d’ancrer sur la surface du support solide au moins une couche, de préférence une monocouche, du ou des fragment(s) peptidique(s) du ou des conjugué(s) peptidique(s) de formule (I).
Dans un mode de réalisation, le procédé de fonctionnalisation selon l’invention comprend les étapes suivantes, de préférence dans cet ordre : a. Mise en contact d’au moins ladite surface dudit support solide avec une solution ou une suspension d’au moins un conjugué peptidique de formule (I) dans un solvant, la mise en contact étant mise en œuvre de préférence par trempage, pulvérisation et/ou incubation ; b. Irradiation de la surface en contact avec la solution ou la suspension du au moins un conjugué peptidique de formule (I), pendant une durée adaptée pour obtenir l’ancrage de tout ou partie du conjugué peptidique de formule (I) sur la surface ; et c. Rinçage de tout ou partie de la au moins une surface du support solide avec un solvant.
L’étape a. de mise en contact peut être mise en œuvre comme décrit ci-avant pour l’étape de mise en contact.
L’étape b. d’irradiation permet notamment l’activation de la tête benzophénone du conjugué peptidique de formule (I) et son ancrage sur la surface du support solide. De préférence, il s’agit d’une irradiation avec des ultraviolets (UV). L’homme du métier est à même d’ajuster les paramètres d’irradiation tels que la durée d’irradiation, l’intensité et/ou la longueur d’onde de l’irradiation en fonction notamment de la nature de la surface du support solide, de la structure du conjugué peptidique de formule (I) et/ou du degré de fonctionnalisation souhaité. L’étape b. d’irradiation peut être réalisée soit en présence du solvant de la solution ou la suspension mise en contact avec le support à l’étape a., soit après évaporation ou séchage de tout ou partie du solvant, notamment après évaporation ou séchage de tout le solvant.
L’étape c. de rinçage permet notamment d’éliminer l’excès de conjugué peptidique de formule (I) qui ne s’est pas ancré à la surface du support solide à l’issue de l’étape b. d’irradiation. Le rinçage peut être effectué avec un solvant ou avec plusieurs solvants, soit simultanément, soit l’un après l’autre. Le solvant de l’étape c. de rinçage peut être un solvant organique, un solvant inorganique ou un mélange de tels solvants. L’étape de rinçage peut être mise en œuvre une fois ou plusieurs fois, notamment 2, 3, 4, 5 ou 10 fois, avec le même solvant ou avec différents solvants. De préférence, l’étape c. de rinçage permet d’éliminer la totalité du conjugué peptidique de formule (I) qui n’est pas ancré à la surface à l’issue de l’étape b.
Dans un mode de réalisation, le procédé de fonctionnalisation comprend en outre, avant l’étape a. de mise en contact, une étape (i) d’activation de la au moins une surface. Cette étape d’activation permet notamment d’améliorer l’ancrage ultérieur du conjugué peptidique de formule (I) à la surface, par exemple en augmentant la vitesse d’ancrage et/ou en augmentant le degré de fonctionnalisation. La nature de l’activation à mettre en œuvre dépend de la nature de la surface du support solide. Cette activation peut être notamment une activation thermique, par exposition à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25°C), une activation chimique, par mise en contact avec un agent chimique permettant l’activation, et/ou une activation par irradiation. Dans un mode de réalisation, le procédé de fonctionnalisation comprend en outre, avant l’étape a. de mise en contact, une étape (i’) de nettoyage de la au moins une surface. Cette étape a pour but de retirer toute substance présente sur la surface et qui pourrait empêcher ou affaiblir la fonctionnalisation ultérieure par le(s) conjugué(s) peptidique(s). l’étape (i’) de nettoyage peut être mise en œuvre par exemple à l’aide d’un solvant tel qu’un alcool, notamment l’éthanol ou l’isopropanol.
Dans un mode de réalisation, le procédé de fonctionnalisation comprend en outre, après l’étape c. de rinçage, une étape (ii) de centrifugation, comprenant de préférence également la séparation du culot et du surnageant de centrifugation, le support solide étant dans le culot de centrifugation.
Dans un mode de réalisation, le procédé de fonctionnalisation comprend en outre, après l’étape c. de rinçage, et après l’étape (ii) de centrifugation si elle est présente, une étape (iii) de vieillissement. L’étape (iii) peut notamment être une étape de vieillissement à pression réduite (sous vide) et/ou une étape de vieillissement par chauffage à une température supérieure à la température ambiante. Dans un mode de réalisation, l’étape (iii) comprend un vieillissement à pression réduite puis un vieillissement par chauffage.
Support solide
Un autre objet de la présente invention est un support solide dont au moins une surface est revêtue d’au moins un conjugué peptidique, susceptible d’être obtenu, de préférence obtenu, par le procédé de fonctionnalisation selon l’invention.
Dans certains modes de réalisation, une seule surface du support solide est fonctionnalisée par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention. Dans d’autres modes de réalisation, au moins deux surfaces du support solide, de préférence toutes les surfaces du support solide, sont fonctionnalisées par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention.
Autrement dit, dans certains modes de réalisation, seule une partie de la surface du support solide est fonctionnalisée par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention. Ainsi, par exemple, 100% de la surface du support solide est fonctionnalisée par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention. Dans d’autres modes de réalisation, moins de 100%, moins de 90%, moins de 80%, moins de 70%, moins de 60%, moins de 50%, moins de 40%, moins de 30%, moins de 20%, moins de 10% ou moins de 5% de la surface du support solide est fonctionnalisée par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention.
Utilisation du support solide
Le support solide selon l’invention et/ou le support solide susceptible d’être obtenu, de préférence obtenu, par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention, peut être utilisé dans une large variété d’applications.
Parmi les utilisations envisageables, on peut mentionner la fabrication de nanoparticules pour le diagnostic, la fonctionnalisation de plaques Elisa, la fabrication de surfaces antifouling, la fabrication de dispositifs médicaux et/ou la fabrication de textiles techniques.
Ainsi, un dernier objet de l’invention est l’utilisation d’un support solide selon l’invention, d’un support solide obtenu ou susceptible d’être obtenu par un procédé de fonctionnalisation selon l’invention, et/ou d’un procédé de fonctionnalisation selon l’invention, pour la fabrication de nanoparticules pour le diagnostic, pour la fonctionnalisation de plaques Elisa, pour la fabrication de surfaces antifouling, pour la fabrication de dispositifs médicaux et/ou pour la fabrication de textiles techniques.
Les exemples suivants illustrent plus précisément l’invention, et doivent être considérés à titre illustratif et non limitatif de l’invention.
Exemples
Préparation des monomères substitués par un peptide
Les peptides sont synthétisés sur support solide en utilisant un synthétiseur de peptides de type Symphony X (Protein Technologies, Inc., USA) en stratégie Fmoc/tert-butyl utilisant le bullage d’azote comme méthode d’agitation pour les cycles de couplages et de déprotection des groupements Fmoc en position N-terminale ou en solution en stratégie Boc/Bzl.
Les synthèses sont réalisées à une échelle de 0,25 mmol sur de la résine Fmoc-Rink-Amide polystyrène (481 mg/ 0,52 mmol/g) ou chlorure de 2-chlorotrityle (892 mg, 0,28 mmol/g). Le cycle standard de déprotection-couplage pour chaque résidu comprend six étapes : Lavage de la résine avec 5 ml de diméthylformamide DMF (3 x 30 sec). Déprotection du groupement Fmoc avec 5 ml de pipéridine à 20% dans du DMF (3 x 3 min). Lavage de la résine avec 5 mL de DMF (3 x 30 sec). Couplage du résidu Fmoc- AA pendant 60 min en utilisant de l’HATU (1- [Bis(dimethylamino)methylene]-IH-l,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophos- phate) et de la N,N-diisopropyléthylamine DIEA comme agent de couplage. A la fin du cycle de couplage, une étape de capping est réalisée avec 5 mL d’anhydride acétique AC2O à 10% dans du DMF pendant 7 min, puis la résine est lavée 5 mL de DMF (3 x 30 sec).
Le clivage de la résine (Fmoc-Rink-Amide) est réalisé 2 x 60 minutes dans un cocktail de clivage (acide trifluoroacétique TFA/ triisopropylsilane TIS/eau H2O 95/2,5/2,5) pour les séquences déprotégées et 2 x 60 minutes dans un cocktail de clivage (acide acétique AcOH/ 2,2,2- Trifluoroethanol TFE/ dichl orométhane DCM 10/20/70) pour les séquences protégées (résine chlorure de 2-chlorotrityle). Une fois la résine filtrée, la solution est évaporée sous vide et le peptide est précipité dans l’éther diéthylique. Le peptide précipité est centrifugé (3500 RCF) et le surnageant est éliminé. (X3). Le peptide sous forme de sels de TFA est alors solubilisé dans un mélange eau ftO/acétonitrile ACN avant d’être congelé et lyophilisé.
Les peptides sont analysés par chromatographie UPLC et spectrométrie de masse ESI-MS, équipé d’une colonne BEH C18 (WATERS), 150*2,1 mm (150 x 2,1 mm) (débit : 0,6 ml/min). Les solvants A et B sont à 0,1 % de TFA dans l’eau et à 0,1 % de TFA dans l'acétonitrile.
La purification des peptides est effectuée sur un appareil WATERS HPLC 4000 équipé d’un détecteur UV 486 et d’une colonne Vydac Denali 10 pm C18 120 Â (310 x 25 mm) à un débit de 50 mL/min. Les solvants utilisés sont à 0,1 % de TFA dans l'eau (tampon A) et à 0,1 % de TFA dans l'acétonitrile (tampon B).
Exemple 1 : Synthèse de conjugués peptidiques selon l’invention
Exemple la. Conjugué peptidique comprenant le peptide H- 4-NH2 (SEQ ID N°2)
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
Le peptide antibactérien H-(RF)4-NH2 (SEQ ID N°2) a été synthétisé sur une résine Rink Amide (charge 0,52 mmol/g, échelle de synthèse : 0,25 mmol) en stratégie Fmoc/tBu. Chaque couplage était suivi d’une déprotection du groupement Fmoc en N-terminal. Le peptide a ensuite été fonctionnalisé sur support après introduction d’un espaceur (ou « linker »). L’espaceur Fmoc- Ahx-OH (acide amino 6-hexanoïque protégé par un groupement Fmoc) a été introduit dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et de 6 équivalents de DIEA, la résine a été lavée (3*DMF, 1 * méthanol MeOH et 1 * dichl orométhane DCM). L’acide 4-benzoylbenzoïque a été couplé dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et de 6 équivalents de DIEA, la résine a été lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). La résine a alors été clivée dans un mélange DCM/ TFA /H2O 50/47,5/2,5 pendant 2X1 h. La solution de « clivage » a été concentrée sous pression réduite puis le peptide ancre antibactérien a été précipité dans l’éther diéthylique et enfin purifié par HPLC préparative (Colonne Vydac Denali 10 pm C18 120 Â (310 x 25 mm) utilisant un gradient de 20 à 60% de tampon B en 40 min.).
Le conjugué obtenu est de formule telle que présentée ci-dessus, et correspond à SEQ ID N°3. E SI-MS (m/zy. [M+H]+ théorique C75H103N22O14: 1552,87, expérimental: 1552,98 HPLC (temps de rétention, min) : 3,73
Exemple lb : Conjugué peptidique comprenant le peptide H-(RI)4-NH2 (SEQ IP N°4)
Figure imgf000018_0001
Le peptide antibactérien H-(RI)4-NH2 (SEQ ID N°4) a été synthétisé sur une résine Rink Amide (charge 0,52 mmol/g, échelle de synthèse : 0,25 mmol) en stratégie Fmoc/tBu. Chaque couplage était suivi d’une déprotection du groupement Fmoc en N-terminal. Le peptide a ensuite été fonctionnalisé sur support après introduction d’un espaceur (ou « linker »). L’espaceur Fmoc- Ahx-OH a été introduit dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et de 6 équivalents de DIEA, la résine est lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). L’acide 4-benzoylbenzoïque a été couplé dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et de 6 équivalents de DIEA, la résine a été lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). La résine a alors été clivée dans un mélange DCM/ TFA /H2O 50/47,5/2,5 pendant 2X1 h. La solution de « clivage » a été concentrée sous pression réduite puis le peptide ancre antibactérien a été précipité dans l'éther diéthylique et enfin purifié par HPLC préparative (Colonne Vydac Denali 10 pm C18 120 Â (310 x 25 mm) utilisant un gradient de 20 à 60% de tampon B en 40 min.).
Le conjugué obtenu est de formule telle que présentée ci-dessus, et correspond à SEQ ID N°5. E SI-MS (m/zy. [M+H]+ théorique C75H103N22O14: 1416,80, expérimental: 1496,98 HPLC (temps de rétention, min) : 3,63
Exemple le : Conjugué peptidique comprenant le peptide H-(R)2-Palm
Figure imgf000018_0002
Le peptide antibactérien H-(R)2-Palm a été synthétisé sur une résine Rink (charge 0,52 mmol/g, échelle de synthèse : 0,25 mmol) préalablement fonctionnalisée par un benzotriazole en stratégie Fmoc/tBu. Chaque couplage était suivi d'une déprotection du groupement Fmoc en N-ter- minal.
La résine Rink-amide a été préalablement traitée à la pipéridine (20% dans le DMF) et lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). L’acide 4-amino 3-nitrobenzoïque a été couplé dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et 6 équivalents de DIEA. La réaction a été laissée sous agitation 2h puis la résine a été lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM), capée à l’anhydride acétique (15 ml d’une solution à 10% v/v dans le DCM) puis lavée (2*DCM, 3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). La réduction du groupe nitro a été réalisée dans une solution de 5g de SnCh (2H2O) et 900 pL de l,8-diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène DBU pour 10 ml de DMF qui a été ajoutée à la résine sous bullage à l’azote pour 10 minutes. La réaction a été agitée pendant 15h, seringue ouverte et lavée (3*DMF, 3* DCM).
L’introduction de la séquence peptidique -(R)2- a été réalisée en stratégie Fmoc/tBu. Chaque couplage était suivi d’une déprotection du groupement Fmoc en N-terminal. Le peptide a ensuite été fonctionnalisé sur support après introduction d’un espaceur (ou « linker »). L’espaceur Fmoc-Ahx-OH a été introduit dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et de 6 équivalents de DIEA, la résine a été lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). L’acide 4-benzoylben- zoïque a été couplé dans le DMF en présence de 3 équivalents d’HATU et de 6 équivalents de DIEA, la résine a été lavée (3*DMF, 1 *MeOH et 1 *DCM). La résine a alors été traitée par l’isoamyl nitrite (10 équivalents) pendant 90 minutes (lavage DCM x5). Le nucléophile (4 équivalents / dans ce cas l’hexadécylamine) en solution dans le DCM en présence de DIEA (8 équivalents) a été bullé à l’azote 20 minutes avant la fin de la cyclisation, puis a été introduit immédiatement sur la résine. La réaction a été agitée induisant le clivage du peptide de la résine.
Le peptide a alors été déprotégé dans un mélange DCM/ TFA/H2O 50/47,5/2,5 pendant 2x1 h. La solution de « déprotection » a été concentrée sous pression réduite puis le peptide antibactérien a été précipité dans l'éther diéthylique et enfin purifié par HPLC préparative (Colonne Vydac Denali 10 pm C18 120 Â (310 x 25 mm) utilisant un gradient de 20 à 60% de tampon B en 40 min).
ESI-MS (m/z): [M+H]+ théorique C43H75N10O8: 876,22 expérimental: 876,19
HPLC (temps de rétention, min) : 5,63 Exemple 2 : Dépôt des conjugués peptides selon l’invention sur un substrat
Le dépôt des trois peptides obtenus à l’exemple 1 a été réalisé par dip-coating, c'est-à-dire par trempage / retrait à une vitesse constante du substrat dans une solution du peptide ancre dans une solution éthanolique.
Chaque peptide a été solubilisé dans une solution éthanolique (95%).
Après quelques minutes d’agitation, une solution claire et stable a été obtenue. Cette solution a été déposée sur un substrat en polycarbonate propre par trempage. Les plaques de plastiques trempées ont ensuite été séchées, et irradiées sous UV pendant 15 minutes (360 nm, 250W). Après irradiation, les plaques ont été lavées sous sonication dans des bains d’eau et d’éthanol (4X10 minutes).
Exemple 3 : Greffage de la benzophénone sur un support
Le bloc fluorescent dansyl-benzophénone de formule ci-dessous a été synthétisé par des techniques classiques.
Figure imgf000020_0001
Une plaque 96 puits en polystyrène a été préalablement rincée à l’eau distillée et à l’alcool éthylique, puis séchée. Une solution à O,1M en composé dansyl-benzophénone a été déposée dans les trois premiers puits. La plaque a été irradiée 180 secondes sous UV à une puissance de 120 mW/cm2. La plaque a ensuite été rincée à l’eau distillée. La figure 2 présente une photo de la plaque, qui présente une fluorescence des 3 puits fonctionnalisés.
Ce résultat prouve que la tête benzophénone se greffe à la surface des puits de la plaque 96 puits.
Exemple 4 : Détermination de l’activité antibactérienne de substrats traités par des peptides antimicrobiens selon l’invention
L’activité antibactérienne selon la norme ISO 22196:2011 est destinée à évaluer l’activité anti- microbienne de produits plastiques ou de surfaces non poreuses traités par des agents antimicrobiens. La méthode employée dans cette étude se focalise uniquement sur l’évaluation de 1 ’ activité antib actéri enne .
Cette étude est destinée à évaluer l’activité antibactérienne de matériaux en polycarbonate greffés par des peptide vis-à-vis de la référence sans traitement selon les recommandations de la norme ISO 22196: 20111 pour un temps de contact de 24 heures.
Matériau Polycarbonate (rectangle de 6 cm x 5 cm)
Une telle étude utilise idéalement des échantillons de 5 cm x 5 cm sur lesquels une concentration connue du microorganisme à tester a été déposée. Après une incubation de 24 heures à 35°C, la quantité de microorganismes viables est évaluée par la technique de dénombrement sur milieu gélosé. La comparaison des concentrations bactériennes obtenues entre le matériau traité et le matériau non traité permet de définir l’activité antibactérienne de la formulation testée.
L’étude menée ici a été réalisée sur des échantillons sous forme de rectangles de 6 cm x 5 cm conformément à la norme. Les tests ont été menés vis-à-vis des souches bactériennes prescrites par la norme et très fréquemment impliquées dans des infections, Escherichia coli ATCC 8739 et Staphylococcus aureus ATCC 6538P.
Chaque conjugué la, 1b et le tel que synthétisé à l’exemple 1 a été déposé à la surface des plaques de polycarbonate par dépôt d’une solution de 0,02 à 4 mg/mL.
Les résultats ont pu montrer une inhibition significative avec une réduction de la croissance Staphylococcus aureus jusqu’ à 99,87% (Tableaux 1 et 2 et Figure 1). Le tableau 1 correspond à Staphylococcus aureus, le tableau 2 correspond à Escherichia coli.
Dans les tableaux 1 et 2, PC désigne le polycarbonate. Les conjugués peptidiques sont désignés par la référence à l’exemple dans lequel leur synthèse est décrite (la, 1b et le).
Tableau 1
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Tableau 2
Figure imgf000022_0002
La figure 1 illustre ces résultats. Une inhibition importante des 2 types de bactéries a été obtenue (jusqu’à 99,87% de réduction de la croissance pour Staphylococcus aureus, et jusqu’à 97,0% de réduction de la croissance pour Escherichia coll) pour les échantillons de polycarbonate fonctionnalisés selon l’invention par rapport aux échantillons de polycarbonate non fonctionnalisés.
L’activité antibactérienne des conjugués peptidiques la, 1b et le est donc efficacement transférée au support de polycarbonate sur lequel ils sont greffés.

Claims

Revendications
1. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide, comprenant la mise en contact d’au moins ladite surface dudit support solide avec au moins un conjugué peptidique de formule (I)
Figure imgf000023_0001
dans laquelle L est un bras espaceur, n est 0 ou 1, de préférence 1, et
A est un fragment peptidique, dans des conditions adaptées pour obtenir l’ancrage du au moins un conjugué peptidique de formule (I) à la surface du support.
2. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide selon la revendication 1, dans lequel A est un fragment peptidique comprenant de 2 à 80 acides aminés, de préférence de 3 à 30 acides aminés, en particulier de 7 à 20 acides aminés.
3. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel A est un fragment peptidique choisi dans le groupe constitué par un peptide antibiotique, un peptide antimicrobien, un peptide antifongique, un peptide anti-inflammatoire, un peptide catalyseur, un peptide ligand de récepteur biologique, un anticorps et un peptide inhibiteur d’enzyme, de préférence un peptide antimicrobien, ou un fragment de ceux-ci.
4. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le fragment peptidique est un peptide antimicrobien choisi dans le groupe constitué par les peptides H-(RF)4-NH2 (SEQ ID N°2), H-(RI)4-NH2 (SEQ ID N°4) et H-(R)2-Palm.
5. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel L est une chaîne hydrocarbonée aliphatique saturée ou insaturée comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, éventuellement interrompue ou terminée par au moins un parmi un hétéroatome, notamment O ou S, un groupe aryle, un groupe C=O, un groupe SO2, un groupe NRi, dans lequel Ri est choisi parmi un atome d’hydrogène, un radical hydrocarboné aliphatique comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, un radical benzyle ou un radical phénéthyle, ladite chaîne pouvant être non substituée ou substituée, de préférence L est une chaîne aliphatique carbonée de formule (II)
Figure imgf000024_0001
dans laquelle m est un entier de 1 à 10, de préférence de 4 à 6, en particulier 5.
6. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le support solide est choisi dans le groupe constitué par un support plastique et un support textile.
7. Procédé de fonctionnalisation d’au moins une surface d’un support solide selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant les étapes suivantes : a. Mise en contact d’au moins ladite surface dudit support solide avec une solution ou une suspension d’au moins un conjugué peptidique de formule (I) tel que défini à l’une des revendications 1 à 5 dans un solvant, la mise en contact étant mise en œuvre de préférence par trempage, pulvérisation et/ou incubation ; b. Irradiation, notamment irradiation UV, de la surface en contact avec la solution ou la suspension du au moins un conjugué peptidique de formule (I), pendant une durée adaptée pour obtenir le greffage de tout ou partie du conjugué peptidique de formule (I) sur la surface ; et c. Rinçage de tout ou partie de la au moins une surface du support solide avec un solvant.
8. Procédé selon la revendication 7, comprenant en outre au moins une étape choisie parmi les étapes suivantes :
- une étape (i), avant l’étape (a) de mise en contact, d’activation de la au moins une surface, de préférence mise en œuvre par activation thermique, activation chimique et/ou par irradiation ;
- une étape (i’), avant l’étape (a) de mise en contact, de nettoyage de la au moins une surface ;
- une étape (ii), après l’étape (c) de rinçage, de centrifugation ;
- une étape (iii), après l’étape (c) et, si elle est présente, après l’étape (ii) de centrifugation, de vieillissement, de préférence mise en œuvre par vieillissement sous vide et/ou par chauffage.
9. Support solide dont au moins une surface est revêtue d’au moins un peptide susceptible d’être obtenu, de préférence obtenu, par le procédé de fonctionnalisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Utilisation d’un support solide selon la revendication 9, pour la fabrication de nanoparticules pour le diagnostic, pour la fonctionnalisation de plaques Elisa, pour la fabrication de surfaces antifouling, pour la fabrication de dispositifs médicaux et/ou pour la fabrication de textiles techniques.
PCT/EP2024/059023 2023-04-04 2024-04-03 Procédé de fonctionnalisation d'un support solide avec un conjugué peptidique Pending WO2024208878A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202480029273.0A CN121038606A (zh) 2023-04-04 2024-04-03 用肽缀合物使固体基底官能化的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FRFR2303338 2023-04-04
FR2303338A FR3147567A1 (fr) 2023-04-04 2023-04-04 Procédé de fonctionnalisation d’un support solide avec un conjugué peptidique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024208878A1 true WO2024208878A1 (fr) 2024-10-10

Family

ID=87036927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2024/059023 Pending WO2024208878A1 (fr) 2023-04-04 2024-04-03 Procédé de fonctionnalisation d'un support solide avec un conjugué peptidique

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN121038606A (fr)
FR (1) FR3147567A1 (fr)
WO (1) WO2024208878A1 (fr)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014118779A1 (fr) 2013-01-31 2014-08-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Matériaux antisalissures

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014118779A1 (fr) 2013-01-31 2014-08-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Matériaux antisalissures

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDWARDS-GAYLE CHARLOTTE J. C. ET AL: "Selective Antibacterial Activity and Lipid Membrane Interactions of Arginine-Rich Amphiphilic Peptides", vol. 3, no. 2, 17 February 2020 (2020-02-17), US, pages 1165 - 1175, XP093083138, ISSN: 2576-6422, Retrieved from the Internet <URL:http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acsabm.9b00894> DOI: 10.1021/acsabm.9b00894 *
GREENE: "Protective Groups in Organic Synthesis", 2007, WILEY
HARRISON ET AL.: "Compendium of Synthetic Organic Methods", vol. 1-8, 1971, J. WILEY & SONS
HOUBEN-WEYL: "Methods of Organic Chemistry, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", vol. 22a,22b,22c,22d, 2002, GEORG THIEME VERLAG
MAO CANWEI ET AL: "UV mediated attachment of short Arginine-Tryptophan antimicrobial peptides on reverse osmosis membrane surfaces inhibitPseudomonas aeruginosabiofilm", DESALINATION, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 431, 20 December 2017 (2017-12-20), pages 73 - 79, XP085350554, ISSN: 0011-9164, DOI: 10.1016/J.DESAL.2017.12.027 *
PAUL LLOYD- WILLIAMSFERNANDO ALBERICIOERNEST GIRALT: "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", 1997, CRC PRESS

Also Published As

Publication number Publication date
FR3147567A1 (fr) 2024-10-11
CN121038606A (zh) 2025-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wong et al. Synthesis of constrained head-to-tail cyclic tetrapeptides by an imine-induced ring-closing/contraction strategy
JP5441693B2 (ja) 新規脂質ペプチド並びにヒドロゲル
US9175036B2 (en) Antimicrobial water treatment membranes and production thereof
US10676509B2 (en) Surface-immobilized antimicrobial peptoids
FR2465713A1 (fr) Nouveaux peptides biologiquement actifs et leur emploi comme medicaments
CN105143245B (zh) 防垢材料
Preuss et al. A bioinspired light induced avenue for the design of patterned functional interfaces
SK11242002A3 (sk) Zlúčenina, spôsob prípravy zlúčeniny, farmaceutický prostriedok a spôsob liečenia rakoviny
FR2992318A1 (fr) Materiaux hybrides peptide-silice
Bourne et al. The development and application of a novel safety-catch linker for BOC-based assembly of libraries of cyclic peptides
Carbajo et al. Optimized stepwise synthesis of the API Liraglutide using BAL resin and pseudoprolines
EP1297001A1 (fr) Peptides lineaires amphipathiques et les compositions les contenant
WO2024208878A1 (fr) Procédé de fonctionnalisation d&#39;un support solide avec un conjugué peptidique
FR2803594A1 (fr) Oligomeres de mimes contraints non peptidiques de dipeptides ou de tripeptides, et leurs utilisations
EP1328546B1 (fr) Cyclopeptides, leur procede de preparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de l&#39;angiogenese
WO2024186679A2 (fr) Dimères ondulés ss-croisés antiparallèles et matériaux, compositions et procédés associés
KR20250167674A (ko) 고체 기판을 펩티드 접합체로 관능화하는 방법
Greathouse et al. Optimized aminolysis conditions for cleavage of N‐protected hydrophobic peptides from solid‐phase resins
BE1029149B1 (fr) Protéine porteuse pour antigene peptidique
FR3090636A1 (fr) Procédé de synthèse de peptides
JP5208403B2 (ja) 基材表面修飾方法
Dalsin et al. Versatile mussel adhesive-inspired biomimetic antifouling polymers
FR3016880A1 (fr) Procede de preparation de benzotriazole n-acyles
BE885283A (fr) Nouveaux peptides biologiquement actifs et leur emploi comme medicaments
JPH083191A (ja) 抗血栓性ペプチドおよびこれを固定化した医療用具

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24718728

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 1020257036866

Country of ref document: KR

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-0-1-A10-A15-NAP-PA0105 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: KR1020257036866

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024718728

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024718728

Country of ref document: EP

Effective date: 20251104

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024718728

Country of ref document: EP

Effective date: 20251104

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024718728

Country of ref document: EP

Effective date: 20251104

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024718728

Country of ref document: EP

Effective date: 20251104

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024718728

Country of ref document: EP

Effective date: 20251104