BE1029149B1 - Protéine porteuse pour antigene peptidique - Google Patents
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Abstract
Composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de SEQ ID NO:1 à laquelle plusieurs épitopes peptidiques sont greffés de manière covalente, trousse comprenant les éléments pour la fabrication de ce peptide conjugué, procédé de synthèse et utilisation vaccinale.
Description
PROTÉINE PORTEUSE POUR ANTIGENE PEPTIDIQUE Domaine technique La présente invention concerne l'utilisation de la protéine CRM197 (SEQ ID NO:1) comme protéine porteuse (carrier) d'antigènes peptidiques.
L'art antérieur L'immunologie est un domaine clinique, biologique et même biochimique des plus complexes où une multiplicité de facteurs interviennent pour déclencher une réponse ou pour la contrôler.
Dans ce cadre, la vaccination représente un outil unique pour conditionner le système immunitaire avec la spécificité voulue.
Divers épitopes ont été, et sont toujours, développés et utilisés, en particulier des peptides.
Ces épitopes sont soit injectés en tant que polypeptide, par exemple la protéine qui les comporte, soit des épitopes peptidiques totalement synthétiques sont injectés.
Lorsque les épitopes choisis sont courts, ils sont habituellement couplés à une protéine porteuse (carrier protein en anglais), de manière à assurer leur reconnaissance par le système immunitaire.
Ces protéines porteuses (carriers) sont peu nombreuses.
En effet, chaque composition potentielle, donc chaque nouvelle protéine porteuse potentielle, doit être testée dans un modèle animal approprié, ce qui est compliqué et onéreux et qui, en outre,
soulève des questions éthiques, si bien que ce genre d'étude, si elle vise juste le screening de nouvelles protéines porteuses, n'est pas simple.
Enfin, les études, selon qu'elles ont été menées sur rongeurs ou sur d'autres animaux, aboutissent souvent à des résultats contradictoires.
Il existe donc le besoin pour de nouvelles protéines porteuses.
Parmi les candidats, l'on retrouve la protéine CRM197. Cette protéine est d'usage connu chez le rongeur et/ou lorsque l'épitope à y greffer est UN sucre ou Un glycolipide, mais son usage pour être conjugué par des peptides, en particulier par des peptides hydrophobes, n’a jamais été réalisé ou en tout cas pas administré à un patient humain.
Bref résumé de l'invention Un premier aspect de la présente invention est une composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de la SEQ ID NO:1 à laquelle plusieurs épitopes peptidiques, de préférence identiques, sont conjugués de manière covalente.
Avantageusement, au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire 10 épitopes peptidiques sont greffés à un peptide de la SEQ ID NO:1 (mole épitope pepiidique:mole SEQ ID NO:1) et/ou moins de 20, 19, 18, 17, 16, 15 épitopes peptidiques sont conjugués à Un peptide de la SEQ ID NO:1 (mole épitope peptidique:mole SEQ ID NO:1). De préférence, les épitopes peptidiques sont conjugués (chacun) au niveau d'un résidu -NH2 de la SEQ ID NO:1, avantageusement via Un agent de réticulation hétérobifonctionnel, de préférence le sulfo-GMBS.
Avantageusement un groupement -SH libre est ajouté à un épitope peptidique naturel, de préférence un acide aminé cystéine à l'extrémité N- ou C- terminale de l'épitope peptidique à greffer. Cette composition pharmaceutique est avantageuse pour son utilisation en vaccination, de préférence thérapeutique, d'un patient choisi dans le groupe constitué de l'homme, du chien, du cheval ou un camélidé, de préférence le patient est humain. De préférence, cette composition pharmaceutique comprend en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
Un aspect lié de la présente invention est une solution aqueuse à un pH déterminé comprenant cette composition pharmaceutique et un tampon (pH) assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:1 conjuguée.
Ce tampon pH est avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci-dessus sont de préférence + 0,2, de manière encore plus préférée + 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée. Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 et inférieur à 3,1.
Les tampons pH préférés sont choisis dans le groupe constitué de l'acétate pH 4,5, l'acide N-(2-acetamido)iminodiacetique pH6,5, le Bis-Tris pH 6,0, le CHES (l'acide 2-(N-Cyclohexylamino)éthane) pH 9,5, l'acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l'imidazole pH 8, la glycine pH 3,0, l'HEPES (l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) pH 7,5, le MES (l'acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N- morpholino) propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n'-Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 et le phosphate, pH 5,0. || est entendu que la molécule ci-dessus est parfois un sel, selon le pH, par exemple le tampon glycine pH3 signifie que la glycine est sous forme protonée, par exemple la glycine-HCI.
Un autre aspect lié de la présente invention est une trousse comprenant un épitope dérivé d'une protéine naturelle comprenant un groupement -SH libre; un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH, de préférence l'agent de couplage sulfo-GMBS ; et une protéine porteuse étant la SEQ ID NO:1.
De préférence, cette trousse comprend en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant Un ou plusieurs motifs CpG.
Un autre aspect lié de la présente invention est un procédé de couplage d'un épitope peptidique à une protéine porteuse comprenant les étapes d'identification d'un épitope peptidique comprenant un groupement -SH libre ou d'identification d'un épitope peptidique auquel on rajoute un groupement -SH libre; d'obtention de la protéine porteuse qui est la SEQ ID NO:1; d'activation de cette protéine porteuse via Un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH de manière à faire réagir une pluralité des groupement -NH2 de cette SEQ ID NO:1 avec cet agent de réticulation (hétéro)bifonctionnel; de séparation de la protéine porteuse activée de l'agent de réticulation non incorporé ; de mise en contact de la protéine porteuse activée avec l'épitope peptidique identifié de manière à faire réagir ce groupement -SH de l'épitope peptidique avec cette protéine porteuse activée par l'agent de réticulation ; de séparation de la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques des substrats n'ayant pas réagi et des sous-produits de réaction.
Dans ce procédé, de préférence, l'agent de réticulation hétérobifonctionnel est en excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:1 à activer.
De préférence, ce procédé comprend en outre une étape 5 de mise en solution de la protéine porteuse (SEQ ID NO:1) couplée à plusieurs des épitopes dans une solution aqueuse comprenant un tampon pH déterminé, assurant UN pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:1 conjuguée.
Ce pH déterminé est avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci-dessus sont de préférence + 0,2, de manière encore plus préférée + 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée.
Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 et inférieur à 3,1. Des tampons pH préférés sont choisis dans le groupe constitué de l'acétate pH 4,5, l'acide N-(2-acetamido)iminodiacetique pH6,5, le Bis-Tris PH 6,0, le CHES (l'acide 2-(N-Cyclohexylamino)éthane) pH 9,5, l'acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l'imidazole pH 8, la glycine pH 3,0, PHEPES (l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) pH 7,5, le MES (l'acide 2-(N-Mmorpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n'-Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 et le phosphate, pH 5,0, et/ou une étape (terminale) de lyophilisation de la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques.
Un autre aspect lié de la présente invention est une composition pharmaceutique comprenant le peptide conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus.
De préférence, cette composition comprend en outre un adjuvant de vaccination, de préférence choisi parmi une émulsion et un oligonucléotide comprenant UN OÙ plusieurs motifs CpG.
Description détaillée d'une réalisation de l'invention La protéine CRM197 (SEQ ID NO:1) est doublement particulière si l'on considère le couplage d'épitopes peptidiques du fait de sa forte teneur en résidus -NH2, 40 : 39 lysines, soit presque 10% de la séquence, et l'extrémité amino-terminale.
Outre une forte teneur en lysine, la SEQ ID NO:1 comporte de nombreux autres acide aminés chargés ou polaires, si bien que la protéine est naturellement hydrophile.
Cependant, lorsqu'elle est conjuguée à plusieurs épitopes peptidiques, les résidus -NH2, en particulier les résidus - NH2 les plus exposés, sont mobilisés, ce qui bouleverse fondamentalement son caractère hydrophile.
Cet effet est encore plus marqué lorsque l'épitope à greffer est hydrophobe, ou peu hydrophile.
Il est, certes, possible de surmonter un tel changement des propriétés physico-chimiques, par exemple par une sélection des solvants appropriés.
Cependant, les conditions doivent rester compatibles avec un Usage pharmaceutique.
Ainsi, (i) des solvants toxiques ou dénaturants, ou encore (ii) des conditions extrêmes ou trop proches de la limite de la solubilité de la SEQ ID NO:1 conjuguée à plusieurs peptides, ne sont pas acceptables.
En outre, il est commode, lors de la synthèse de peptides, de pratiquer une étape de lyophilisation de manière à concentrer les produits des réactions, voire à obtenir Un produit fini sous forme de poudre, stable et facile à transporter ; cependant, certains solvants organiques, tels que l'acétonitrie, ne peuvent pas être utilisés à de trop fortes concentrations dans ces conditions car cela présente des risques d'explosion.
Un premier aspect de la présente invention est donc une composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de SEQ ID NO:1 à laquelle plusieurs épitopes peptidiques sont greffés de manière covalente. Cette composition est, de préférence pour UN Usage pharmaceutique (vaccination). Dans le contexte de la présente invention, les termes « vaccin » OU «vaccination » s'entendent de préférence dans leur sens le plus large en ce qu'il signifie toute injection à un patient d'un épitope peptidique dans le but de déclencher une réponse spécifique du système immunitaire. Ainsi, les termes « vaccin» OU « vaccination », dans le contexte de la présente invention, englobent avantageusement toute immunisation d'un patient. Le but recherché peut être préventif ou thérapeutique. L'immunisation (vaccination) n'est pas limitée aux maladies infectieuses mais englobe également les maladies inflammatoires, auto-immunes et dégénératives, en ce compris le cancer. La réponse peut être humorale ou cellulaire, ou les deux. Il peut s'agir d'une activation (spécifique) du système immunitaire ou d'une répression (spécifique) du système immunitaire. Le type de cellule du système immunitaire ciblé n'est pas limité, ni la nature de la cellule présentatrice d'antigène.
De préférence, les épitopes peptidiques à greffer sur une molécule de SEQ ID NO:1 sont identiques, bien que le greffage de plusieurs épitopes différents pourrait très bien être pratiqué sur une molécule de la SEQ ID NO:1.
De manière avantageuse au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire 10 épitopes peptidiques, mais, de préférence, moins de 20, 19, 18, 17, 16, 15 épitopes peptidiques sont greffés à un peptide de la SEQ ID NO:1 (moles épitopes pepiidiques :moles SEQ ID NO:1).
Un nombre précis et/ou prévisible d'épitopes peptidiques par SEQ ID NO:1 permet de mieux réaliser Ia purification de la protéine greffée.
Un nombre élevé d'épitopes peptidiques par SEQ ID NO:1 est difficile à obtenir, en particulier pour des peptides hydrophobes, mais permet une séparation plus simple, et l'administration plus importante des épitopes peptidiques à un patient, ce qui est particulièrement avantageux en vaccination thérapeutique.
De manière avantageuse, les épitopes peptidiques sont greffés au niveau des résidus -NH2 de la SEQ ID NO:1, parfois via Un « spacer », tel que le reliquat de l'agent de couplage, selon l'agent de couplage utilisé (ex. le sulfo GMBS).
Même si le greffage (la conjugaison) transforme Un résidu chargé, très hydrophile et exposé, en un complexe hydrophobe, ce qui augmente fortement le caractère hydrophobe du complexe résultant surtout lorsque plusieurs épitopes ont été greffés, les inventeurs ont réussi à identifier des conditions dans lesquelles des épitopes peptidiques à greffer peuvent être peu hydrophiles, voire hydrophobes.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par « épitope peptidique » toute molécule formée essentiellement par des liens amides, tels que des peptides naturels composés d'acides aminés naturels. Cependant, les épitopes peptidiques peuvent comprendre des acides aminés modifiés : soit des modifications qui se retrouvent dans certaines situations pathologiques ou physiologiques (ex. au niveau de la proline, de la sérine, de l'asparagine, de la lysine, de l'arginine ou du tryptophane) ou d'autres modifications de type chimique, telles que le couplage d'un acide aminé par un résidu alkyle.
De préférence, dans le contexte de la présente invention, un épitope peptidique comprend au moins une chaine de 6 acides aminés liés par des liaisons peptidiques, de préférence au moins 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et/ ou de préférence moins de 40 acides aminés, moins de 35, moins de 30, voire moins de 20 acides aminés.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par « peptide peu hydrophile » ou « hydrophobe » un peptide qui comporte moins de 50%, de préférence moins de 40%, moins de 35%, voire moins de 30%, ou encore moins de 26% d'acide aminés choisis dans le groupe constitué de Varginine, la lysine (et/ou l'ornithine, la citrulline), l’histidine, l'acide glutamique, l'acide aspartique et/ou plus de 20%, 30%, 35%, voire 40% d'acide aminés choisis dans le groupe constitué de la valine, la leucine, l'isoleucine (et/ou la norleucine), la méthionine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane.
De préférence, un peptide hydrophobe comporte, dans le contexte de la présente invention, au moins 35% d'acides aminés choisis dans le groupe constitué de la valine, la leucine, l'isoleucine (et/ou la norleucine), la méthionine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane et moins de 35% d'acides aminés choisis dans le groupe constitué de l'arginine, la lysine (et/ou l'omithine, la citrulline), l’histidine, l'acide gluïamique et l'acide aspartique.
De manière plus générale, dans le contexte de la présente invention, de préférence, un peptide hydrophobe comporte davantage (ex. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, OU plus) d'acide aminés choisis dans le groupe constitué de la valine, la leucine, l'isoleucine (et/ou la norleucine), la méthionine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane que d'acides aminés choisis dans le groupe constitué de l'arginine, la lysine (et/ou l'ornithine, la citrulline), l'histidine, l'acide glutamique, l'acide aspartique et, potentiellement, la sérine.
D'autres acides aminés non naturels, en ce compris des modifications, naturelles ou artificielles, des chaines latérales des acides aminés ont également des propriétés hydrophiles ou hydrophobes.
Les conséquences quant au caractère hydrophobe du peptide résultant de leur éventuelle incorporation dans un épitope peptidique se fera, par exemple, en adaptant les valeurs numériques ci-dessus.
Alternativement, la terminologie de « peptide peu hydrophile » porte sur des peptides peu solubles dans l'eau ou dans des solutions aqueuses (sans détergent), par exemple à pH 7. Ceci peut se déterminer par leur répartition dans un système eau (pH 7; 25°C) — octanol: un peptide peu hydrophile se retrouvant majoritairement (ex. plus de 50%, plus de 60%, plus de 70%, plus de 80%, plus de 90%, voire plus de 95%) dans la phase organique (ex. octanol).
De préférence, les épitopes sont greffés via un agent de réticulation hétérobifonctionnel, de préférence réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH, manière encore plus préférée, le sulfo-GMBS.
AU cas où l'on utilise un agent de réticulation réactif pour un groupement -SH, un groupement -SH (accessible) est avantageusement ajouté à un épitope peptidique qui en serait naturellement dépourvu (ou dont les groupements -SH seraient inaccessibles). Une manière préférée est le couplage (greffage) d'un résidu cystéine à une extrémité, carboxy- ou amino-terminale) de l'épitope. Cette cystéine éventuellement ajoutée est de préférence incorporée dans le calcul ci-dessus pour l'estimation du caractère hydrophobe du peptide à greffer.
AU cas où l'épitope peptidique à coupler (greffer) contient naturelement une cystéine, de préférence, l'étape de couplage (greffage) comporte une étape préliminaire pour déterminer si cette cystéine est accessible pour le couplage (greffage) et, avantageusement, si le couplage (greffage) sur cette cystéine modifie le caractère immunogène de l'épitope peptidique. Ainsi, de préférence, au cas où l'épitope peptidique contient naturellement une cystéine (accessible ou pas, problématique si utilisée pour le couplage ou pas), cette cystéine peut être protégée, et un autre résidu cystéine peut être ajoutée à une des extrémités de l'épitope peptidique.
Cette composition pharmaceutique est avantageuse pour une utilisation en vaccination d'un patient choisi dans le groupe constitué de l'humain (Homo sapiens), du chien (Canis vulgaris), du cheval (Equus caballus) et un camélidé (Camelus sp.) de préférence le patient est humain. En effet, le grand nombre de peptides couplés sur la SEQ ID NO:1 permet l'administration massive des épitopes au patient, ce qui est particulièrement avantageux en vaccination thérapeutique.
Cette vaccination thérapeutique est utile pour le traitement des maladies infectieuses en particulier lorsque l'agent infectieux est intracellulaire, des maladies auto-immunes, des maladies inflammatoires, des maladies dégénératives et le cancer.
Avantageusement, la composition pharmaceutique est utilisée en présence, ou mise en présence, d'un adjuvent (de vaccination et/ou d'immunisation), tels que des émulsions (huile dans eau et eau dans huile), des oligonucléotides ayant les motifs CpG ou des sels d'aluminiums. Les adjuvants préférés sont les émulsions (huile dans eau et eau dans huile) et les oligonucléotides ayant les motifs CpG.
De préférence, la composition pharmaceutique est, ou sera en vue de son administration au patient, en solution aqueuse dans un tampon assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:1 conjuguée. Ce tampon pH esi avaniageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci- dessus sont de préférence + 0,2, de manière encore plus préférée + 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée. Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 et inférieur à 3,1.
Les tampons pH préférés sont choisis dans le groupe constitué de l'acétate pH 4,5, l'acide N-(2-acetamido)iminodiacetique pH6,5, le Bis-Tris pH 6,0, le CHES (l'acide 2-(N-Cyclohexylamino)éthane) pH 9,5, l'acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l'imidazole pH 8, la glycine pH 3,0 (i.e.
glycine-HCI), l'HEPES (l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) pH 7,5, le MES (l'acide 2-(N-Mmorpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n’-Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 et le phosphate, pH 5,0. De préférence, ces tampons pH sont utilisés à une concentration comprise entre 5 et 50 MM, de préférence entre 20 et 50 MM.
Les valeurs de pH sont de préférence comprises dans une plage + 0,2 ; ainsi « pH 5.0 » signifie de 4,8 à 5,2, même si un pH de strictement 5,0 est préféré (dans cet exemple explicatif de la plage de pH). Avantageusement un additif est combiné au tampon pH, de préférence choisi parmi l’arginine et la glutamine (50 MM chacun), Trimethylamine N-oxide (500 MM), Tween®20 (1% ; w :v), tréhalose (500 MM) et le glycérol (20% ; v :v). Un aspect associé de la présente invention est une trousse comprenant un (ou plusieurs) épitope(s) dérivé(s) d'une protéine naturelle comprenant un groupement -SH libre; un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH, de préférence l'agent de couplage sulfo-GMBS ; et la SEQ ID NO:1. Cette trousse contient les éléments essentiels pour le couplage d'un ou de plusieurs épitope(s) à la SEQ ID NO:1. De manière avantageuse, cette trousse comprend également l'adjuvent décrit ci-dessus et/ou le tampon pH décrit ci-dessus.
Un autre aspect associé de la présente invention est le procédé de couplage d'un épitope peptidique à une protéine porteuse comprenant les étapes de : - on identifie un épitope peptidique comprenant un groupement -SH libre ou on identifie un épitope peptidique auquel on rajoute un groupement -SH libre (ex. une cystéine à l'extrémité amino- terminale) ; - on obtient la protéine porteuse qui est SEQ ID NO:1; - on active la protéine porteuse via un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH de manière à faire réagir une pluralité des groupement -NH2 (de cette SEQ ID NO:1) avec agent de réticulation bifonctionnel: - on sépare la protéine porteuse activée de l'agent de réticulation non incorporé ; - on met en contact la protéine porteuse activée avec l'épitope peptidique identifié de manière à faire réagir le groupement -SH de l'épitope peptidique avec la protéine porteuse activée par l'agent de réticulation ; - optionnellement, on ajoute un excès de cystéine de manière à neutraliser les résidus réactifs de groupement -SH qui n'auraient pas réagi avec l'épitope ajouté (en excès) ; - on sépare la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques des substrats n'ayant pas réagi et des sous-produits de réaction ; - optionnellement, on met la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques dans une solution aqueuse comprenant un tampon pH déterminé, assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:1 conjuguée ; - optionnellement, on lyophilise la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques ; - optionnellement, on resolubilise la protéine porteuse dans une solution aqueuse comprenant le tampon pH décrit ci-dessus.
De préférence, comme pour les autres aspects de la présente invention, ces tampons pH sont utilisés à une concentration de 5 à 50 mM, de préférence de 20 à 50 MM.
Ce tampon pH est avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci-dessus sont de préférence + 0,2, de manière encore plus préférée + 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée.
Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 et inférieur à 3,1.Des tampons pH préférés sont choisi dans le groupe constitué de l'acétate pH 4,5, l'acide N-(2-acetamido)iminodiacetique pH6,5, le Bis-Tris PH 6,0, le CHES (l'acide 2-(N-Cyclohexylamino)éthane) pH 9,5, l'acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l'imidazole pH 8, la glycine pH 3,0 (glycine-HCI), VHEPES (l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) pH 7,5, le MES (l'acide 2-(N-Mmorpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n’-Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 et le phosphate, pH 5,0. Les valeurs de pH sont de préférence comprises dans une plage + 0,2; ainsi « pH 5.0 » signifie de 4,8 à 5,2, même si un pH de strictement 5,0 est préféré (dans cet exemple explicatif de la plage de pH). Avantageusement un additif est combiné au tampon pH, de préférence choisi parmi arginine et la glutamine (50 MM chacun), Trimethylamine N- oxide (500 MM), Tween®20 (1% ; w:v), tréhalose (500 MM) et le glycérol (20% ; vv). Les inventeurs ont remarqué que l'activation des groupements -NH2 de la SEQ ID NO:1, suivie, séquentiellement, du greffage des épitopes (ex. via un résidu -SH libre et/ou accessible), permet une charge plus importante et plus reproductible.
Une « valence » de 12 à 13 épitopes greffés (en moyenne) sur une molécule de la SEQ ID NO:1 a été obtenue de manière reproductible pour au moins deux épitopes différents, malgré leur hydrophobicité (un épitope très hydrophobe et un épitope moyennement hydrophobe). Les inventeurs ont remarqué qu'un mélange eau:acétonitrile 70:30 (v:v) permettait de solubiliser Ia SEQ ID NO:1 greffée, même lorsque plusieurs (2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, voire 13) épitopes hydrophobes étaient greffés sur une molécule de la SEQ ID NO:1. De même, l’incorporation du tampon pH décrit ci-dessus dans une solution aqueuse assure une bonne solubilité à la protéine porteuse conjuguée.De préférence, dans ce procédé, l'agent de réticulation hétérobifonctionnel est en excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:1 à activer, ce qui permet l'activation maximale des groupements -NH2 exposés. De préférence, également, l'épitope est en (léger ; ex. moins de 3 fois) excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:1; à nouveau, ceci permet d'assurer un greffage maximal, et constant.
De préférence, la SEQ ID NO:1 conjuguée est maintenue en solution en présence d'acétonitrile à une teneur inférieure à 40% (v:v), idéalement à environ 30% (v:v). Alternativement, l'incorporation du tampon pH décrit ci-dessus dans une solution aqueuse assure une bonne solubilité à la protéine porteuse (SEQ ID NO:1) conjuguée. Ceci permet de pratiquer une étape finale de lyophilisation du produit conjugué.
L'étape de lyophilisation est particulièrement avantageuse lorsque des solvants organiques (ex. l'acétonitrile) ont été utilisés, ceci à des concentrations permettant la yophilisation.
Alternativement, la SEQ ID NO:1 conjuguée peut être solubilisée en l'absence de solvants organiques, par exemple en utilisant le mélange tampon décrit ci-dessus. Dans ce cas, l'étape de lyophilisation n'est pas préférée, mais optionnelle.
Ces différentes étapes de finition sont utiles pour permettre une composition pharmaceutique comprenant ce peptide conjugué à la SEQ D NO:1. Cette composition (lyophilsée) est stable, facilement transportable et permet une conservation de longue durée.
Exemples. Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées. Exemple 1 : synthèse de la SEQ ID NO:1 et des peptides des SEQ ID NO:2-4 La SEQ ID NO:1 a été obtenue par fermentation d'une souche particulière d'Escherichia coli ; la séquence a été modifiée pour que la protéine (mature, SEQ ID NO:1) soir sécrétée dans l'espace périplasmique, par exemple, selon la méthode décrite dans la demande de brevet BE2021/5137 déposée le 26/02/2021. La protéine est récupérée et purifiée par filtration et par chromatographie, par exemple, selon la méthode décrite dans la demande de brevet BE2021/5138 déposée le 26/02/2021. Aucun des réactifs utilisés n'est d'origine animale et la teneur en endotoxines résiduelles est compatible avec un usage clinique.
Les peptides des SEQ ID NO:2, 3, 4 et 5 ont été obtenus par synthèse en phase solide. Toutefois d'autres méthodes de synthèse, voire de fermentation, sont possibles. En pratique, l'extrémité C-terminale du peptide est fixée à un support polymérique et la chaîne peptidique est constituée puis étendue jusqu'à l'extrémité N par la répétition de cycles de couplages ; l'extrémité carboxy de l'acide aminé à incorporer étant activée, puis couplée à l'extrémité amino du peptide fixé à la résine. Le groupement amino est protégé par le groupement Fmoc et les autres groupes fonctionnels potentiellement réactifs sont protégés par d'autres groupement.
Lorsque l’acide aminé est greffé au peptide à allonger, après le retrait des acides aminés en excès et les étapes de lavages, le groupement Fmoc est clivé par ajout de piperidine.
Le clivage de la résine et la déprotection des groupements fonctionnels des chaines latérales des acides aminés est réalisé par ajout d'acide trifluoroacétique (TFA). Dans certains cas, le résidu tryptophane de la SEQ ID NO:2 ou de la SEQ ID NO:4 est alkylé sur le groupement indole via l'ajout d'une amide-Tmob dans le TFA.
D'autres modifications sont d'ailleurs possibles.
Après clivage de la résine, déprotection, purification (ex.
HPLC en phase inverse) et filtration (0.45 um), les peptides ont été analysés par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) et par HPLC.
Les étapes d'HPLC sont à chaque fois pratiquées au moyen d'un mélange d'eau (0.1% TFA) avec un gradient en acétonitrile (0.1% TFA), et détection par UV (215 et 280 nm). La pureté doit être supérieure à 90%, voire 95%. En pratique, les inventeurs ont obtenu des peptides de pureté de 97%. Exemple 2: Couplage via EDC, par rapport au glutaraldéhyde.
Les inventeurs ont tout d'abord tenté d'effectuer le couplage en utilisant Ia méthode décrite dans le brevet EP2004217, mais appliquée sur les peptides des séquences SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:4 à coupler sur la SEQ ID NO:1 au lieu du KLH.
Ce type de couplage fonctionne, mais n'est pas satisfaisant en pratique.
En effet, les inventeurs ont observé que la molécule obtenue était difficile à purifier ou à stériliser par filtration et qu'il y avait un manque d'homogénéité de lot à lot.
Une des explications avancée par les inventeurs est que le caractère hydrophile de la protéine non-modifiée est transformé de manière trop forte lorsqu'un peptide y est greffé de multiples fois, ce qui rend inutilisable cette protéine porteuse pour les traitements en aval. Ainsi, la protéine de la SEQ ID NO:1, présente une utilité comme agent porteur, mais cette utilité n'est pas évidente dans le contexte du greffage d'épitopes peptidiques, en particulier d'épitopes peptidiques hydrophobes.
Cependant, les inventeurs ont néanmoins tenté de surmonter cette difficulté via le choix d'un autre agent de couplage, le 1-Ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride (EDC) ; disponible par exemple chez Pierce. || s'agit d'un agent permettant le couplage des groupements carboxyles aux amines primaires. L'EDC réagit avec le groupement carboxyle pour former un intermédiaire réactif O- acylisourea. Si cet intermédiaire ne réagit pas avec une amine, il s'hydrolyse pour régénérer le groupe carboxyle.
Pour ce faire, les inventeurs ont développé et comparé un procédé de couplage en une étape, et un procédé de couplage en deux étapes.
Dans le procédé en une étape, à l'instar du procédé basé sur le glutaraldéhyde, la protéine porteuse (SEQ ID NO:1), l'EDC et l'épitope de la SEQ ID NO:2 ou celui de la SEQ ID NO:4 sont rassemblés dans le même récipient sous agitation magnétique, puis le précipité est récupéré et purifié sur SephadexTM G50 avant lyophilisation.
Dans le procédé à deux étapes, la SEQ ID NO:1 est d'abord activée par mise en présence avec EDC, puis l'épitope de la SEQ ID NO:2 ou celui de la SEQ ID NO:4 sont ajoutés avant séparation, purification et Iyophilisation.
Par rapport au glutaraldéhyde, le produit de la réaction est utilisable, même s'il persiste des agrégats inutilisables, synonymes de pertes de rendement, et une partie significative de la SEQ ID NO:1 reste en solution, synonyme de protéine n'ayant pas réagi (ou trop peu), soit une seconde perte de rendement. De même, l'efficacité de couplage varie fortement d'un lot à l'autre, et la solubilité du conjugué est médiocre, voire insuffisante, ce qui, de plus, complique la stérilisation par filtration.
Le rendement était médiocre dans le cas du procédé à une étape : 12% pour le greffage de SEQ ID NO:2 et 30% pour le greffage de SEQ ID NO:4. Cependant, ce rendement augmente, par exemple à 60% lorsque le procédé de couplage est réalisé en deux étapes (SEQ ID NO:1 avec SEQ ID NO:4). Le ratio de répartition molaire SEQ ID NO:1 vs SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 est de moins de 2 pour le procédé de couplage en une étape, et est supérieur à 2 pour le procédé de couplage en 2 étapes.
Exemple 3. Couplage via GMBS de la protéine CRM197 avec un peptide.
Les inventeurs ont solubilisé 25 mg de protéine porteuse CRM197 (SEQ ID NO:1) dans 2,5 ml d'une solution aqueuse. La protéine porteuse est issue d'un lot compatible avec un usage clinique et a une teneur en endotoxines en-dessous de la limite de détection.
Les inventeurs ont pesé 19 mg de sulfo GMBS (Pierce ; référence 22324; N-y-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester), puis ajouté 2,5 ml d'un milieu de conjugaison (100 MM de « Phosphate- Buffered Saline » ; PBS et 10 MM d'Éthylène-diamine-tétraacétique ; EDTA) et les 2,5 ml de la solution de SEQ ID NO:1. Ce mélange est placé sous agitation magnétique pendant 1h à 4°C.
Les inventeurs ont purifié la SEQ ID NO:1 activée par passage sur colonne Sephadex"M G50 équiliorée avec le tampon PBS, pH 7,2, en suivant la récupération de la SEQ ID NO:1 à 280 nm.
Les inventeurs ont transféré la (les) fraction(s) contenant le pic d'absorption à 280 nm (la protéine CRM-GMBS) dans le flacon contenant SEQ ID NO:3 (25 mg, dissous dans le DMSO), puis mis sous agitation magnétique pendant 2h à 4°C. Le conjugué formé entre SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 précipite. Après centrifugation, le culot est dissous dans l'acétonitrile. Les inventeurs ont rajouté 1 ml de Cystéine IM et laissé sous agitation pendant 30 minutes. Les inventeurs ont transféré le milieu réactionnel dans un tube Falcon® de 50 ml; on centrifuge et le culot est séparé et repris dans un mélange eau:acétonitrile (70:30 ; w:w).
Les inventeurs ont purifié sur colonne SephadexM G50, à nouveau en suivant l'atosorption à 280 nm. Les inventeurs ont lyophilisé le conjugué purifié.
Toutes les étapes ci-dessus ont été réalisées en conditions compatibles avec un usage clinique ultérieur. Les études de stabilité en vue d'un usage clinique ont ensuite été pratiquées. La poudre conservée à une température de -20°C et de +5°C reste stable pendant plusieurs mois. Elle résiste à un vieillissement accéléré (stress à 25°C) pendant au moins 14 jours (mesures par SDS-PAGE, MALDI-TOF, électrophorèse capillaire inchangées et infrarouge (FTIR) pour évaluer des éventuelles dégradations de résidus chimiques ou de structure secondaire).
L'analyse révèle que la SEQ ID NO:1 a très majoritairement réagi avec le peptide de la SEQ ID NO:3 ; un rendement de 64% a été obtenu. Outre un bon rendement, le ratio molaire entre SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:3 est supérieur à 8. Des valeurs de 13 ont même été relevées et obtenues de manière reproductibles pour ce rendement de couplage.
Des ratios encore plus élevés ont même été obtenus, mais au prix d'un rendement de couplage moindre (ex. 36 et 47%). En pratique, la méthode de couplage avec agents hétéro- bifonctionnels, surtout lorsqu'elle est pratiquée en deux étapes, permet même Un taux de couplage de plus de 50 ug de peptide sur 100 ug de la SEQ ID NO:1. Le SEQ ID NO:1 ayant incorporé plusieurs peptides des SEQ ID NO:3 ou 5 (voir ci-dessous) est facilement différentiée (ex. par électrophorèse) puisque sa masse moléculaire passe de 58 kDa à -78 KDa si 10 peptides sont greffés sur une molécule de la SED ID NO :1, voire -90 kDa si davantage de peptides sont greffés sur une molécule de la SEQ ID NO:1 ; ex. 13 ou 14 peptides greffés sur une molécule.
Exemple 4 : Le même protocole est appliqué pour le peptide de la SEQ ID NO:5. Le rendement de couplage est également excellent, tout comme le nombre de peptides couplés à la SEQ ID NO:1.
Exemple 5 : Le peptide de l'exemple 3 (182 ug, soit un équivalent de 60 ug de la SEQ ID NO:3) est combiné au peptide de l'exemple 4 (182 ug, soit un équivalent de 60 ug de la SEQ ID NO:5). Un adjuvant est ajouté à ce mélange ou à un placebo. Le principe actif ou le placebo est injecté à une cohorte de patients humains souffrant de myasthénie grave (MG) en ‘double aveugle’. En pratique, 3 injections séquentielles sont pratiquées (semaine 1, 5 et 13). Ensuite, le même protocole est conçu pour une seconde cohorte de patients, mais avec encore plus de principe actif.
Finalement, l'étude se poursuit en ‘open’, de manière à évaluer la tolérabilité et l'efficacité à long terme du traitement. A chaque injection, le patient est suivi de près pour d'éventuels effets secondaires, d'abord à l'hôpital sous haute supervision puis, à domicile. Des échantillons sanguins sont prélevés pour des tests d'immunogénicité.
Les données générées permettent de conclure à une bonne tolérabilité (le principe actif ne cause pas plus d'effets secondaires que le placebo) et à une efficacité du traitement.
Ainsi, de manière surprenante, les inventeurs ont démontré que la SEQ ID NO:1 est une bonne protéine porteuse pour le couplage d'épitopes peptidiques en vue d'une utilisation thérapeutique.
Claims (21)
1. Une composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de la SEQ ID NO:1 à laquelle plusieurs épitopes peptidiques sont greffés de manière covalente, dans laquelle lesdits épitopes peptidiques comprennent une chaine de au moins 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques.
2. La composition pharmaceutique selon la revendication 1 dans laquelle les plusieurs épitopes peptidiques sont identiques, de préférence lesdits épitopes peptidiques sont hydrophobes.
3. La composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire 10 épitopes peptidiques sont greffés à un peptide de la SEQ ID NO:1 (Mole épitope peptidique:mole SEQ ID NO:1).
4. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 3 dans laquelle moins de 20, 19, 18, 17, 16, 15 épitopes peptidiques sont greffés à un peptide de la SEQ ID NO:1 (mole épitope peptidique:mole SEQ ID NO:1).
5. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 4, dans laquelle les épitopes peptidiques sont greffés chacun au niveau d'un résidu -NH2 de la SEQ ID NO:1.
6. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 5, dans laquelle les épitopes peptidiques sont greffés via un agent de réticulation hétérobifonctionnel.
7. La composition pharmaceutique selon la revendication 6, dans laquelle l'agent de réticulation hétérobifonctionnel est réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH, de préférence le sulfo-N-y- maleimidobutiyryl-oxysulfosuccinimide ester (Sulfo-GMBS).
8. La composition pharmaceutique selon la revendication 7, dans laquelle les épitopes peptidiques comprennent Un groupement -SH libre,
ou dans laquelle Un groupement -SH libre est ajouté à un épitope peptidique naturel.
9. La composition pharmaceutique selon la revendication 8, dans laquelle Un résidu cystéine est greffé à l'extrémité amino- ou carboxy- terminale de l'épitope peptidique.
10. Composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 9 étant pour l'immunisation d'un patient choisi dans le groupe constitué de l'homme, du chien, du cheval ou un camélidé, de préférence le patient est humain.
11. La composition pharmaceutique pour l'immunisation selon la revendication 10 dans laquelle l'immunisation est à visée thérapeutique, de préférence pour le traitement des maladies infectieuses, des maladies auto- immunes, des maladies inflammatoires, des maladies dégénératives et le cancer.
12. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 11, comprenant en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant UN OU plusieurs motifs CpG.
13. Solution aqueuse comprenant la composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes Ì à 12, ladite solution aqueuse comprenant un tampon de manière à assurer un pH déterminé à ladite solution aqueuse.
14. Une trousse comprenant : un épitope dérivé d'une protéine naturelle comprenant un groupement -SH libre ; - UN agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH, de préférence l'agent de couplage sulfo-GMBS ; -|a SEQ ID NO:1, dans laquelle ledit épitope dérivé d'une protéine naturelle comprend une chaine de au moins 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques.
15. La trousse selon la revendication 14 comprenant en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
16. Procédé de couplage d'un épitope peptidique à une protéine porteuse comprenant les étapes de : - on identifie un épitope peptidique comprenant un groupement -SH libre et/ou on identifie un épitope peptidique auquel on rajoute un groupement -SH libre ; - on obtient la protéine porteuse qui est SEQ ID NO:1; - on active ladite protéine porteuse via un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH de manière à faire réagir une pluralité des groupement -NH2 de ladite SEQ ID NO:1 avec ledit agent de réticulation hétérobifonctionnel; - on sépare la protéine porteuse activée de l'agent de réticulation non incorporé ; - on met en contact ladite protéine porteuse activée avec ledit épitope peptidique identifié de manière à faire réagir ledit groupement -SH dudit épitope peptidique avec ladite protéine porteuse activée par l'agent de réticulation ; - on sépare la protéine porteuse couplée à plusieurs desdits épitopes peptidiques des substrats n'ayant pas réagi et des sous-produits de réaction, dans lequel ledit épitope peptidique comprend une chaine de au moins 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques.
17. Le procédé selon la revendication 16 dans lequel l'agent de réticulation hétérobifonctionnel est en excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:1 à activer.
18. Le procédé selon la revendication 16 ou 17 comprenant en outre une étape de mise en solution de la protéine porteuse couplée à plusieurs des épitopes dans une solution aqueuse comprenant un tampon de manière à assurer un pH déterminé à ladite solution aqueuse.
19. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 16 à 18 comprenant en outre une étape de lyophilisation de la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques.
20. Une composition pharmaceutique comprenant le peptide conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé selon une quelconque des revendications 16 à 19.
21. La composition pharmaceutique selon la revendication 20 comprenant en outre un adjuvant de vaccination, de préférence choisi parmi une émulsion et Un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
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