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EP4297775A1 - Protéine porteuse pour antigene peptidique - Google Patents

Protéine porteuse pour antigene peptidique

Info

Publication number
EP4297775A1
EP4297775A1 EP22711188.7A EP22711188A EP4297775A1 EP 4297775 A1 EP4297775 A1 EP 4297775A1 EP 22711188 A EP22711188 A EP 22711188A EP 4297775 A1 EP4297775 A1 EP 4297775A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
seq
group
pharmaceutical composition
carrier protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22711188.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Havelange
Stéphane HUBERTY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Curavac Europe
Original Assignee
Curavac Europe
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Curavac Europe filed Critical Curavac Europe
Publication of EP4297775A1 publication Critical patent/EP4297775A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Definitions

  • the present invention relates to the use of the CRM197 protein (SEQ ID NO: 1) as carrier protein (carrier) of peptide antigens.
  • Immunology is a highly complex clinical, biological and even biochemical field in which a multiplicity of factors intervene to trigger a response or to control it.
  • vaccination represents a unique tool to condition the immune system with the desired specificity.
  • epitopes have been, and still are, developed and used, in particular peptides. These epitopes are ⁇ themselves ⁇ injected as a fan ⁇ of a polypeptide, for example the protein which comprises them, thirst for totally synthetic peptide epitopes are ⁇ injected.
  • the chosen epitopes are ⁇ short, they are ⁇ usually coupled to a carrier protein (carrier profein in English), so as to ensure their recognition by the immune system.
  • carrier protein carrier profein in English
  • This ⁇ e protein is ⁇ known to be used in rodents and/or when the epitope to be grafted thereto is ⁇ a sugar or a glycolipid, but its use to be conjugated by peptides, in particular by hydrophobic peptides, n has ever been performed or at least not administered to a human patient.
  • Patent application WO 2016/184963 describes the grafting of short hydrophilic hexapeptides derived from the gp41 glycoproptein of the AIDS virus to the CRM-197 protein or to KLH, in the hope of generating an effective vaccine against this disease.
  • the crosslinking is ⁇ carried out directly or by means of a heterobifunctional agent.
  • Patent application EP2659906 describes an epitope of alpha-synuclein e ⁇ also suggests carrier protein CRM-197 or KLH, but does not describe a coupling of peptide epitopes on CRM-197.
  • a first aspect of the present invention is ⁇ a pharmaceutical composition comprising a peptide conjugate consisting of SEQ ID NO:1 to which several, preferably identical, peptide epitopes are covalently conjugated.
  • At least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or even 10 peptide epitopes are ⁇ grafted to a peptide of SEQ ID NO:1 (mole peptide epitope:mole SEQ ID NO:1) and/ or less than 20, 19, 18, 17, 16, 15 peptide epitopes are conjugated to a peptide of SEQ ID NO:1 (mole peptide epitope:mole SEQ ID NO:1).
  • the peptide epitopes are conjugated (each) at a -NH2 residue of SEQ ID NO:1, advantageously via a heterobifunctional crosslinking agent, preferably sulfo-GMBS.
  • a free -SH group is ⁇ added to a natural peptide epitope, preferably a cysteine amino acid at the N- or C-terminal end of the peptide epitope to be grafted.
  • This pharmaceutical composition is advantageous for its use in vaccination, preferably therapeutic, of a patient chosen from the group consisting of humans, dogs, horses or a camelid, preferably the patient is human.
  • this pharmaceutical composition further comprises a vaccination adjuvant, preferably an emulsion or an oligonucleotide comprising one or more CpG units.
  • a vaccination adjuvant preferably an emulsion or an oligonucleotide comprising one or more CpG units.
  • a related aspect of the present invention is an aqueous solution at a determined pH comprising this pharmaceutical composition and a buffer (pH) providing a desired pH to the solution comprising the conjugated SEQ ID NO:1.
  • This pH buffer is advantageously 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 , 7.5, 8.0 or even 8.5.
  • the above values are ⁇ preferably ⁇ 0.2, even more preferred ⁇ 0.1, or even closer to the target value.
  • a pH of 3.0 preferably means a pH greater than 2.9 and less than 3.1.
  • Preferred pH buffers are ⁇ selected from the group consisting of acetate pH 4.5, N-(2-acefamido)iminodiacefic acid pH6.5, Bis-Tris pH 6.0, CHES 2-(N-Cyclohexylamino)efhane) pH 9.5, citric acid pH 3.2 (or 4.0 or 5.5), imidazole pH 8, glycine pH 3.0, HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazine ethane sulfonic acid) pH 7.5, MES (2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid) pH 6.2, MOPS (3-( N- morpholino)propanesulfonic acid) pH 7.0, PIPPS (Piperazine-N, n'-Bis (3-Propanesulfonic acid) pH 3.7 and phosphate, pH 5.0. It is understood that the above molecule is sometimes a salt, depending on the pH, eg glycine buffer
  • kits comprising an epitope derived from a naturally occurring protein comprising a free -SH moiety; a heterobifunctional crosslinking agent reactive for an -NH2 group and an -SH group, preferably the sulfo-GMBS coupling agent; and a carrier protein being SEQ ID NO:1.
  • this kit also comprises a vaccination adjuvant, preferably an emulsion or an oligonucleotide comprising one or more CpG units.
  • a vaccination adjuvant preferably an emulsion or an oligonucleotide comprising one or more CpG units.
  • Another related aspect of the present invention is a method of coupling a peptide epitope to a carrier protein comprising the steps of identifying a peptide epitope comprising a free -SH moiety or identifying a peptide epitope to which adds a free -SH group; obtaining the carrier protein which is SEQ ID NO:1; activation of this carrier protein via a heterobifunctional crosslinking agent reactive for an -NH2 group and an -SH group so as to react a plurality of -NH2 groups of this SEQ ID NO:1 with this bifunctional (hetero) crosslinking agent; separating the activated carrier protein from the unincorporated cross-linking agent; bringing the activated carrier protein into contact with the identified peptide epitope so as to cause this -SH group of the peptide epitope to react with this carrier protein activated by the crosslinking agent; separation of carrier protein coupled to multiple peptide epitopes from unreacted substrates and reaction by-products.
  • the heferobifuncfional crosslinking agent is in excess relative to the number of -NH2 residues of SEQ ID NO:1 to be activated.
  • this method further comprises a step of dissolving the carrier protein (SEQ ID NO: 1) coupled to several of the epitopes in an aqueous solution comprising a determined pH buffer, ensuring a desired pH for the solution comprising SEQ ID NO:l conjugate.
  • SEQ ID NO: 1 carrier protein
  • This determined pH is ⁇ advantageously 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 , 7.5, 8.0 or even 8.5.
  • the above values are ⁇ preferably ⁇ 0.2, even more preferably ⁇ 0.1, or even even closer to the target value.
  • a pH of 3.0 preferably means a pH greater than 2.9 and ⁇ less than 3.1.
  • Preferred pH buffers are ⁇ selected from the group consisting of acetate pH 4.5, N-(2-ace ⁇ amido)iminodiace ⁇ ic acid pH6.5, Bis-Tris pH6.0, CHES (2-(N-Cyclohexylamino)ethane acid) pH
  • the dissolution step can advantageously be carried out, alternatively, or in synergy with the pH buffer described above, in a solution comprising acetonitrile, for example preferably said aqueous solution comprises acetonitrile, preferably between 10% and 50% (acefonifrile: water; v:v), for example, less than 40% (by volume), such as about 30:70 (acefonifrile: water; v:v).
  • aqueous solution comprises acetonitrile, preferably between 10% and 50% (acefonifrile: water; v:v), for example, less than 40% (by volume), such as about 30:70 (acefonifrile: water; v:v).
  • This can ⁇ be coupled with a (terminal) step of lyophilization of the carrier protein coupled to several peptide epitopes.
  • compositions comprising the conjugated peptide obtainable by the above method.
  • this composition also comprises a vaccination adjuvant, preferably chosen from an emulsion and an oligonucleotide comprising one or more CpG units.
  • the CRM197 protein (SEQ ID NO:1) is doubly special if we consider the coupling of peptide epitopes of the fai ⁇ of its high content of -NH2 residues, 40: 39 lysines, so ⁇ almost 10% of the sequence , e ⁇ the amino terminus.
  • SEQ ID NO:1 contains many other charged or polar amino acids, so that the protein is naturally hydrophilic.
  • the -NH2 residues in particular the most exposed -NH2 residues, are ⁇ mobilized, which fundamentally upsets its hydrophilic character. This effect is even more marked when the epitope to be grafted is ⁇ hydrophobic, or not very hydrophilic.
  • a first aspect of the present invention is therefore a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a conjugated peptide consisting of SEQ ID NO:1 to which several peptide epitopes are covalently grafted.
  • This composition is preferably for pharmaceutical use (vaccination).
  • the terms “vaccine” or “vaccination” are preferably understood in their broadest sense in that it means any injection into a patient of a peptide epitope in the bu ⁇ to trigger a specific immune system response.
  • the terms “vaccine” or “vaccination”, in the context of the present invention advantageously encompass any immunization of a patient.
  • the desired bu ⁇ can be preventive or therapeutic.
  • Immunization is not limited to infectious diseases but also includes inflammatory, autoimmune and degenerative diseases, including cancer.
  • the response can be humoral or cellular, or both. It can be a (specific) activation of the immune system or a (specific) suppression of the immune system.
  • the type of immune system cell targeted is not limited, nor the nature of the antigen-presenting cell.
  • the peptide epitopes to be grafted onto a molecule of SEQ ID NO:1 are identical, although the grafting of several different epitopes could very well be performed on a molecule of SEQ ID NO:1.
  • at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or even 10 peptide epitopes, but preferably less than 20, 19, 18, 17, 16, 15 peptide epitopes are ⁇ grafted to a peptide of SEQ ID NO:1 (mole peptide epitopes:mole SEQ ID NO:1).
  • a precise and/or predictable number of peptide epitopes per SEQ ID NO:1 allows for better purification of the grafted protein.
  • a high number of peptide epitopes per SEQ ID NO:1 is difficult to obtain, especially for hydrophobic peptides, but allows easier separation, and greater delivery of peptide epitopes to a patient, which is ⁇ particularly advantageous in therapeutic vaccination.
  • the peptide epitopes are ⁇ grafted at the -NH2 residues of SEQ ID NO:1, sometimes via a "spacer", such as the remainder of the coupling agent, depending on the coupling agent used ( sulfo GMBS).
  • a "spacer" such as the remainder of the coupling agent, depending on the coupling agent used ( sulfo GMBS).
  • peptide epitope means any molecule formed essentially by amide bonds, such as natural peptides composed of natural amino acids.
  • the peptide epitopes can include modified amino acids: craving for modifications that are found in certain pathological or physiological situations (e.g. at the level of proline, serine, asparagine, lysine, arginine or frypfophane) or other chemical type modifications, such as the coupling of an amino acid by an alkyl residue.
  • a peptide epitope comprises at least one chain of 7 amino acids linked by peptide bonds, preferably at least 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and/or preferably less than 40 amino acids, less than 35, less than 30, or even less than 20 amino acids.
  • peptide epitopes are therefore covalently grafted to SEQ ID NO: 1, in practice several peptide epitopes are grafted therein.
  • These peptide epitopes are ⁇ also incorporated into the kit comprising the heterobifunctional crosslinking agent reactive for an -NH2 group and ⁇ an -SH group, and ⁇ are ⁇ used in the corresponding coupling process, and are therefore incorporated into the pharmaceutical composition obtainable by this process.
  • the term “poorly hydrophilic peptide” or “hydrophobic” means a peptide which comprises less than 50%, preferably less than 40%, less than 35%, even less than 30%, or even less 26% of amino acids chosen from the group consisting of arginine, lysine (and/or ornithine, citrulline), histidine, acid glutamic, aspartic acid and/or more than 20%, 30%, 35%, or even 40% of amino acids chosen from the group consisting of valine, leucine, isoleucine (and/or norleucine), methionine, proline, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.
  • a hydrophobic peptide comprises, in the context of the present invention, at least 35% of amino acids chosen from the group consisting of valine, leucine, isoleucine (and/or norleucine), methionine, proline, phenylalanine, tyrosine and ⁇ tryptophan and ⁇ less than 35% amino acids selected from the group consisting of arginine, lysine (and/or ornithine, citrulline), hisfidin, glutamic acid and ⁇ aspartic acid.
  • amino acids chosen from the group consisting of valine, leucine, isoleucine (and/or norleucine), methionine, proline, phenylalanine, tyrosine and ⁇ tryptophan and ⁇ less than 35% amino acids selected from the group consisting of arginine, lysine (and/or ornithine, citrulline), hisfidin, glutamic acid and ⁇ aspartic acid.
  • a hydrophobic peptide comprises more (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more) amino acids chosen from the group consisting of valine, leucine, isoleucine (ef/or norleucine), methionine, proline, phenylalanine, tyrosine and ⁇ tryptophan than amino acids selected from the group consisting of arginine, lysine (ef/or ornifhine, citrulline), hisfidin, glutamic acid, aspartic acid and ⁇ potentially serine.
  • Other unnatural amino acids, including natural or artificial modifications of amino acid side chains also have hydrophilic or hydrophobic properties.
  • hydrophobic character of the peptide resulting from their possible incorporation into a peptide epitope will occur, for example, by adapting the numerical values above.
  • the terminology of "poorly hydrophilic peptide” relates to peptides which are poorly soluble in water or in aqueous solutions (without detergent), for example at pH 7. This can ⁇ be determined by their distribution in a water system (pH 7; 25°C) - octanol: a slightly hydrophilic peptide found mainly (e.g. more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, even more than 95%) in the organic phase (eg octanol).
  • the present invention therefore advantageously allows the grafting of peptides (peptide epifopes), even hydrophobic peptides, in large quantities onto CRM-197.
  • the grafting of hydrophobic (or slightly hydrophilic) peptides is therefore possible and even advantageous.
  • the epitopes are ⁇ grafted via a heterobifunctional crosslinking agent, preferably reactive for an —NH2 group and ⁇ for an —SH group, even more preferably, sulfo-GMBS.
  • a reactive crosslinking agent for an -SH group is used, an -SH group (accessible) is advantageously added to a peptide epitope which will be naturally lacking (or whose -SH groups would be inaccessible) .
  • a preferred way is ⁇ the coupling (grafting) of a cysteine residue to one end, carboxy- or amino-terminus) of the epitope. This ⁇ e cysteine optionally added is ⁇ preferably incorporated in the calculation above for the estimation of the hydrophobic character of the peptide to be grafted.
  • the coupling (grafting) step includes a preliminary step to determine whether this cysteine is accessible for coupling (grafting) and ⁇ , advantageously, if the coupling (grafting) on this cysteine modifies the immunogenic character of the peptide epitope.
  • this cysteine can be protected, and another cysteine residue can be added to one end of the peptide epitope.
  • This pharmaceutical composition is advantageous for use in vaccination of a patient chosen from the group consisting of humans (Homo sapiens), dogs (Canis vulgaris), horses (Equus caballus) and camelids (Camelus sp. .) preferably the patient is ⁇ human.
  • a patient chosen from the group consisting of humans (Homo sapiens), dogs (Canis vulgaris), horses (Equus caballus) and camelids (Camelus sp. .) preferably the patient is ⁇ human.
  • the large number of peptides coupled to SEQ ID NO:1 allows the massive administration of epitopes to the patient, which is particularly advantageous in therapeutic vaccination.
  • This therapeutic vaccination is useful for the treatment of infectious diseases, particularly when the infectious agent is intracellular, autoimmune diseases, inflammatory diseases, degenerative diseases and cancer.
  • the pharmaceutical composition is ⁇ used in the presence, or brought into the presence, of an adjuvant ⁇ (for vaccination and/or immunization), such as emulsions (oil in water and ⁇ water in oil), oligonucleotides having CpG units or aluminum salts.
  • an adjuvant ⁇ for vaccination and/or immunization
  • emulsions oil in water and ⁇ water in oil
  • Preferred adjuvants are emulsions (oil in water and water in oil) and oligonucleotides having CpG motifs.
  • the pharmaceutical composition is ⁇ , or will be for the purpose of its administration to the patient, in aqueous solution in a buffer ensuring a desired pH for the solution comprising the conjugated SEQ ID NO:1.
  • This pH buffer is advantageously 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 , 7.5, 8.0 or even 8.5.
  • the above values are ⁇ preferably ⁇ 0.2, even more preferably ⁇ 0.1, or even even closer to the target value.
  • a pH of 3.0 preferably means a pH greater than 2.9 and ⁇ less than 3.1.
  • Preferred pH buffers are ⁇ selected from the group consisting of acetate pH 4.5, N-(2-ace ⁇ amido)iminodiace ⁇ ic acid pH6.5, Bis-Tris pH6.0, CHES (2-(N-Cyclohexylamino)ethane acid) pH 9.5, citric acid pH 3.2 (or 4.0 or 5.5), imidazole pH 8, glycine pH 3.0 ( ie glycine-HCl), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazine ethane sulfonic acid) pH 7.5, MES (2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid) pH 6, 2, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) pH 7.0, PIPPS (Piperazine-N,n'-Bis(3-Propanesulfonic acid) pH 3.7 and phosphate, pH 5.0
  • these pH buffers are ⁇ used at a concentration comprised between 5
  • 5.0 means from 4.8 to 5.2, even if a pH of strictly 5.0 is ⁇ preferred (in this explanatory example of the pH range).
  • an additive is ⁇ combined with the pH buffer, preferably chosen among arginine and ⁇ glutamine (50 mM each), Trimethylamine N-oxide (500 mM), Tween®20 (1%; w:v), trehalose (500 mM) and ⁇ glycerol (20%; v: v).
  • a related aspect of the present invention is a kit comprising one (or more) epitope(s) derived from a natural protein comprising a free -SH group; a heterobifunctional crosslinking agent reactive for an -NH2 group and a -SH group, preferably the sulfo-GMBS coupling agent; and SEQ ID NO:1.
  • Ceffe frousse entrusts the essential elements for the coupling of one or more epifope(s) to SEQ ID NO:1.
  • this jitter also comprises the adjuvant described above and/or the pH buffer described above.
  • Another related aspect of the present invention is ⁇ the method of coupling a peptide epitope to a carrier protein comprising the steps of:
  • a peptide epitope comprising a free -SH group is identified or a peptide epitope is identified to which a free -SH group (eg a cysteine at the amino terminus);
  • the carrier protein is activated via a heterobifunctional crosslinking agent reactive for a -NH2 group and ⁇ a -SH group so as to cause a plurality of -NH2 groups (of ceffe SEQ ID NO:1) to react with the crosslinking agent bifunctional;
  • the activated carrier protein is brought into contact with the identified peptide epitope so as to cause the -SH group of the peptide epitope to react with the carrier protein activated by the cross-linking agent; - optionally ⁇ , an excess of cysteine is added so as to neutralize the reactive residues of the -SH group which have not reacted ⁇ with the added epitope (in excess);
  • the carrier protein coupled to several peptide epitopes is placed in an aqueous solution comprising a determined pH buffer, ensuring a desired pH for the solution comprising the conjugated SEQ ID NO:1; - optionally ⁇ , the carrier protein coupled to several peptide epitopes is freeze-dried;
  • the carrier protein is resolubilized in an aqueous solution comprising the pH buffer described above.
  • these pH buffers are used at a concentration of 5 to 50 mM, from preferably 20 to 50 mM.
  • This pH buffer is advantageously 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 , 7.5, 8.0 or even 8.5.
  • the above values are preferably ⁇ 0.2, even more preferably ⁇ 0.1, or even even closer to the targeted value.
  • a pH of 3.0 preferably means a pH greater than 2.9 and less than 3.1.
  • Preferred pH buffers are ⁇ selected from the group consisting of acefafe pH 4.5, N-(2-acefamido)iminodiacefic acid pH6.5, Bis-Tris pH 6.0, CHES 2-(N-Cyclohexylamino)efhane) pH 9.5, citric acid pH 3.2 (or 4.0 or 5.5), imidazole pH 8, glycine pH 3.0 (glycine-HCl) , HEPES (4-(2-hydroxyehyl)-l-piperazine ehanesulfonic acid) pH 7.5, MES (2-(N-morpholino)ehane sulfonic acid) pH 6.2, MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) pH 7.0, PIPPS (Piperazine-N,n'-Bis (3-Propanesulfonic acid) pH 3.7 and phosphate, pH 5.0.
  • acefafe pH 4.5 N-(2-
  • pH values are preferably within a range ⁇ 0.2; thus “pH 5.0” means from 4.8 to 5.2, even if a pH of strictly 5.0 is preferred (in this explanatory example of the pH range).
  • an additive is combined with the pH buffer, preferably chosen from arginine and glutamine (50 mM each), Trimethylamine N-oxide (500 mM), Tween®20 (1%; w:v), trehalose (500 mM ) and glycerol (20% ; v:v).
  • the inventors have noticed that the activation of the -NH2 groups of SEQ ID NO:1, followed, sequentially, by the grafting of the epitopes (eg via a free and/or accessible -SH residue), allows a greater load and more reproducible.
  • a "valence" of 12 to 13 grafted epitopes (on average) on a molecule of SEQ ID NO:1 was obtained in a reproducible way for at least two different epitopes, despite their hydrophobicity (a very hydrophobic epitope and a moderately hydrophobic epitope) .
  • the incorporation of the pH buffer described above in an aqueous solution ensures good solubility to the conjugated carrier protein.
  • the heterobifunctional crosslinking agent is in excess relative to the number of -NH2 residues of SEQ ID NO:1 to be activated, which allows maximum activation of the exposed -NH2 groups.
  • the epitope is in (slight; e.g. less than 3 times) excess with respect to the number of -NH2 residues of SEQ ID NO:1; again, this ensures maximum and constant grafting.
  • the conjugated SEQ ID NO:1 is maintained in solution in the presence of acetonitrile at a content of less than 40% (v:v), ideally at about 30% (v:v).
  • the incorporation of the pH buffer described above in an aqueous solution ensures good solubility of the conjugated carrier protein (SEQ ID NO:1). This makes it possible to carry out a final step of lyophilization of the conjugate product.
  • the freeze-drying step is particularly advantageous when organic solvents (eg acetonitrile) have been used, this at concentrations allowing freeze-drying.
  • the conjugated SEQ ID NO:1 can be solubilized in the absence of organic solvents, for example using the buffer mixture described above.
  • the freeze-drying step is not preferred, but optional.
  • Example 1 synthesis of SEQ ID NO:1 and ⁇ of the peptides of SEQ ID NO:2-4
  • SEQ ID NO:1 was obtained by fermentation of a particular strain of Escherichia coli; the sequence has been modified so that the protein (mature, SEQ ID NO: 1) is secreted into the periplasmic space, for example, according to the method described in patent application BE2021/5137 filed on 02/26/2021.
  • the protein is ⁇ recovered and ⁇ purified by filtration and ⁇ by chromatography, for example, according to the method described in patent application BE2021/5138 filed on 02/26/2021. None of the reagents used are ⁇ of animal origin and the residual endotoxin content is ⁇ compatible with clinical use.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 2, 3, 4 and 5 were obtained by solid phase synthesis. However, other methods of synthesis, or even fermentation, are possible.
  • the C- ⁇ terminal end of the peptide is ⁇ fixed to a polymeric support and the peptide chain is ⁇ formed then extended to the N end by repeating coupling cycles; the carboxy terminus of the amino acid to be incorporated being activated, then coupled to the amino terminus of the resin-bound peptide.
  • the amino group is ⁇ protected by the Fmoc group and ⁇ the other potentially reactive functional groups are ⁇ protected by other group.
  • the Fmoc group is cleaved by adding piperidine. The cleavage of the resin and the deprotection of the functional groups of the side chains of the amino acids are carried out by adding trifluoroacetic acid (TFA).
  • the tryptophan residue of SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4 is ⁇ alkylated on the indole group via the addition of an amide-Tmob in the TFA.
  • Other modifications are also possible.
  • Example 2 Coupling via EDC, relative to glutaraldehyde.
  • the inventors first attempted to perform the coupling using the method described in patent EP2004217, but applied to the peptides of the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 to be coupled to SEQ ID NO:l instead of KLH.
  • EDC 1-Et hy 1-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride
  • the inventors have developed and compared a one-step coupling process and a two-step coupling process.
  • the carrier protein SEQ ID NO:1
  • EDC e the epitope of SEQ ID NO:2 or that of SEQ ID NO:4 son ⁇ collected in the same container under magnetic stirring
  • the precipitate is ⁇ recovered and ⁇ purified on SephadexTM G50 before freeze-drying.
  • SEQ ID NO:1 is first activated by bringing together G EDC, then the epitope of SEQ ID NO:2 or that of SEQ ID NO:4 is ⁇ added. before separation, purification and freeze-drying.
  • the reaction product is usable, even if unusable aggregates persist, synonymous with yield losses, and a significant part of SEQ ID NO:1 remains in solution, synonymous with unreacted (or too little) protein, i.e. a second loss of yield.
  • the coupling efficiency varies greatly from one lof to another, and the solubility of the conjugate is mediocre, or even insufficient, which, moreover, complicates sterilization by filtration.
  • the yield was mediocre in the case of the one-step process: 12% for the grafting of SEQ ID NO:2 and 30% for the grafting of SEQ ID NO:4. However, this yield increases, for example to 60% when the coupling process is carried out in two stages (SEQ ID NO:1 with SEQ ID NO:4).
  • the molar distribution ratio SEQ ID NO:1 vs SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4 is ⁇ less than 2 for the one-step coupling process, e ⁇ is ⁇ greater than 2 for the single-step coupling process. 2 steps.
  • Example 3 Coupling via GMBS of the CRM197 protein with a peptide.
  • the inventors dissolved 25 mg of CRM197 carrier protein (SEQ ID NO: 1) in 2.5 ml of an aqueous solution.
  • the carrier protein is ⁇ from a batch compatible with clinical use and ⁇ has an endotoxin content below the detection limit.
  • the inventors weighed 19 mg of sulfo GMBS (Pierce; reference 22324; N-g-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester), then added 2.5 ml of a conjugation medium (100 mM of "Phosphate-Buffered Saline”; PBS e ⁇ 10 mM of Ethylene-diamine-tetraacetic; EDTA) e ⁇ the 2.5 ml of the solution of SEQ ID NO:1. This mixture is placed under magnetic stirring for 1 hour at 4°C.
  • the inventors purified the activated SEQ ID NO:1 by passage through a SephadexTM G50 column equilibrated with PBS buffer, pH 7.2, following the recovery of SEQ ID NO:1 at 280 nm.
  • the inventors transferred the fraction(s) containing the absorption peak at 280 nm (the CRM-GMBS protein) into the vial containing SEQ ID NO:3 (25 mg, dissolved in DMSO), then placed under magnetic stirring for 2 hours at 4°C.
  • the conjugate formed between SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:3 precipitates. After centrifugation, the pellet is ⁇ dissolved in acetonitrile.
  • the inventors have added 1 ml of Cysteine I M e ⁇ left under stirring for 30 minutes.
  • the inventors transferred the reaction medium to a 50 ml Falcon® tube; the separated culo ⁇ is centrifuged e ⁇ and taken up in a water:acetonitrile (70:30:w:w) mixture.
  • the inventors purified on a SephadexTM G50 column, again following the absorption at 280 nm.
  • the inventors have freeze-dried the purified conjugate. All of the above steps were performed under conditions compatible with subsequent clinical use. Stability studies for clinical use were then performed.
  • the powder stored at a temperature of -20°C and +5°C remains stable for several months. It resists accelerated aging (stress at 25°C) for at least 14 days (measurements by SDS-PAGE, MALDI-TOF, unchanged capillary electrophoresis and infrared (FTIR) to assess possible degradation of chemical residues or secondary structure ).
  • the method of coupling with heterobifunctional agents especially when performed in two steps, even allows a coupling rate of more than 50 g of peptide on 100 g of SEQ ID NO:1.
  • SEQ ID NO:1 having incorporated several peptides from SEQ ID NO:3 or 5 is ⁇ easily differentiated (eg by electrophoresis) since its molecular mass goes from 58 kDa to ⁇ 78 KDa if 10 peptides are present.
  • Example 4 The same protocol is ⁇ applied for the peptide of SEQ ID NO:
  • the coupling yield is also excellent, as is the number of peptides coupled to SEQ ID NO:1.
  • Example 5 Peptide from Example 3 (182g, equal to 60g equivalent of SEQ ID NO:3) is combined with peptide from Example 4 (182g, equal to 60g equivalent of SEQ ID NO:5).
  • An adjuvant is ⁇ added to this mixture or to a placebo.
  • the active ingredient or the placebo is ⁇ injected into a 'double-blind' cohort of human patients suffering from myasthenia gravis (MG).
  • MG myasthenia gravis
  • 3 sequential injections are performed (weeks 1, 5 and 13).
  • the same protocol is designed for a second cohort of patients, but with even more active ingredient.
  • the study continues in 'open', so as to assess the tolerability and the long-term efficacy of the treatment.
  • the patient is closely monitored for possible side effects, first in the hospital under high supervision and then at home. Blood samples are ⁇ collected for immunogenicity testing.
  • the data generated makes it possible to conclude that the tolerability is good (the active ingredient does not cause more side effects than the placebo) and that the treatment is effective.
  • SEQ ID NO:1 is a good carrier protein for coupling peptide epitopes for therapeutic use.

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Abstract

Composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de SEQ ID NO:1 à laquelle plusieurs épitopes peptidiques sont greffés de manière covalente, trousse comprenant les éléments pour la fabrication de ce peptide conjugué, procédé de synthèse et utilisation vaccinale.

Description

PROTÉINE PORTEUSE POUR ANTIGENE PEPTIDIQUE
Domaine technique
La présente invention concerne l’utilisation de la protéine CRM197 (SEQ ID NO:l ) comme protéine porteuse (carrier) d’antigènes peptidiques.
L'art antérieur
L’immunologie es† un domaine clinique, biologique e† même biochimique des plus complexes où une multiplicité de facteurs interviennent pour déclencher une réponse ou pour la contrôler.
Dans ce cadre, la vaccination représente un outil unique pour conditionner le système immunitaire avec la spécificité voulue.
Divers épitopes on† été, e† son† toujours, développés et utilisés, en particulier des peptides. Ces épitopes son† soi† injectés en fan† que polypeptide, par exemple la protéine qui les comporte, soif des épitopes peptidiques totalement synthétiques son† injectés.
Lorsque les épitopes choisis son† courts, ils son† habituellement couplés à une protéine porteuse (carrier profein en anglais), de manière à assurer leur reconnaissance par le système immunitaire. Ces protéines porteuses (carriers) son† peu nombreuses.
En effet, chaque composition potentielle, donc chaque nouvelle protéine porteuse potentielle, doit être testée dans un modèle animal approprié, ce qui es† compliqué e† onéreux e† qui, en outre, soulève des questions éthiques, si bien que ce genre d’étude, si elle vise juste le screening de nouvelles protéines porteuses, n’est pas simple. Enfin, les études, selon qu’elles on† été menées sur rongeurs ou sur d’autres animaux, aboutissent souvent à des résultats contradictoires. II existe donc le besoin pour de nouvelles protéines porteuses.
Parmi les candidats, l’on retrouve la protéine CRM197. Ce††e protéine es† d’usage connu chez le rongeur et/ou lorsque l’épitope à y greffer es† un sucre ou un glycolipide, mais son usage pour être conjugué par des peptides, en particulier par des peptides hydrophobes, n’a jamais été réalisé ou en tou† cas pas administré à un patient humain.
La demande de brevet WO 2016/184963 décrit le greffage de courts hexapeptides hydrophiles dérivés de la glycoproptéine gp41 du virus du SIDA à la protéine CRM-197 ou au KLH, dans l’espoir de générer un vaccin efficace contre ce††e maladie. La réticulation es† réalisée directement ou au moyen d’un agent hétérobifonctionnel. Bien que plusieurs ratios théoriques pep†ide/CRM-l 97 soient mentionnés, aucun exemple complet ne décrit une telle réalisation, surtout pour des peptides plus complexes ou moins hydrophiles.
La demande de brevet EP2659906 décrit un épitope de alpha-synucléine e† également suggère la protéine porteuse CRM-197 ou le KLH, mais ne décrit pas un couplage d’épitopes peptidiques sur CRM- 197.
Bref résumé de l'invention
Un premier aspect de la présente invention es† une composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de la SEQ ID NO:l à laquelle plusieurs épitopes peptidiques, de préférence identiques, son† conjugués de manière covalente.
Avantageusement, au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire 10 épitopes peptidiques son† greffés à un peptide de la SEQ ID NO:l (mole épitope pep†idique:mole SEQ ID NO:l ) et/ou moins de 20, 19, 18, 17, 16, 15 épitopes peptidiques son† conjugués à un peptide de la SEQ ID NO:l (mole épitope pep†idique:mole SEQ ID NO:l ).
De préférence, les épitopes peptidiques son† conjugués (chacun) au niveau d’un résidu -NH2 de la SEQ ID NO:l , avantageusement via un agent de réticulation hétérobifonctionnel, de préférence le sulfo-GMBS.
Avantageusement un groupement -SH libre es† ajouté à un épitope peptidique naturel, de préférence un acide aminé cystéine à l’extrémité N- ou C- terminale de l’épitope peptidique à greffer. Ce††e composition pharmaceutique es† avantageuse pour son utilisation en vaccination, de préférence thérapeutique, d’un patient choisi dans le groupe constitué de l’homme, du chien, du cheval ou un camélidé, de préférence le patient es† humain.
De préférence, ce††e composition pharmaceutique comprend en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
Un aspect lié de la présente invention es† une solution aqueuse à un pH déterminé comprenant ce††e composition pharmaceutique e† un tampon (pH) assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:l conjuguée.
Ce tampon pH es† avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci-dessus son† de préférence ± 0,2, de manière encore plus préférée ± 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée. Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 ef inférieur à 3,1. Les tampons pH préférés son† choisis dans le groupe constitué de l'acétate pH 4,5, l’acide N-(2-acefamido)iminodiacefique pH6,5, le Bis-Tris pH 6,0, le CHES (l’acide 2-(N-Cyclohexylamino)éfhane) pH 9,5, l’acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l’imidazole pH 8, la glycine pH 3,0, l’HEPES (l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-l -pipérazine éthane sulfonique) pH 7,5, le MES (l’acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N- morpholino)propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n’-Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 et le phosphate, pH 5,0. Il est entendu que la molécule ci-dessus est parfois un sel, selon le pH, par exemple le tampon glycine pH3 signifie que la glycine est sous forme protonée, par exemple la glycine-HCI.
Un autre aspect lié de la présente invention est une trousse comprenant un épitope dérivé d’une protéine naturelle comprenant un groupement -SH libre; un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH, de préférence l’agent de couplage sulfo-GMBS ; et une protéine porteuse étant la SEQ ID NO:l .
De préférence, cette trousse comprend en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
Un autre aspect lié de la présente invention est un procédé de couplage d’un épitope peptidique à une protéine porteuse comprenant les étapes d’identification d’un épitope peptidique comprenant un groupement -SH libre ou d’identification d’un épitope peptidique auquel on rajoute un groupement -SH libre; d’obtention de la protéine porteuse qui est la SEQ ID NO:l; d’activation de cette protéine porteuse via un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 et un groupement -SH de manière à faire réagir une pluralité des groupement -NH2 de cette SEQ ID NO:l avec cet agent de réticulation (hétéro) bifonctionnel; de séparation de la protéine porteuse activée de l’agent de réticulation non incorporé ; de mise en contact de la protéine porteuse activée avec l’épitope peptidique identifié de manière à faire réagir ce groupement -SH de l’épitope peptidique avec ceffe protéine porteuse activée par l’agent de réticulation ; de séparation de la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques des substrats n’ayan† pas réagi e† des sous-produifs de réaction.
Dans ce procédé, de préférence, l’agent de réticulation héférobifoncfionnel es† en excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:l à activer.
De préférence, ce procédé comprend en outre une étape de mise en solution de la protéine porteuse (SEQ ID NO:l) couplée à plusieurs des épitopes dans une solution aqueuse comprenant un tampon pH déterminé, assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:l conjuguée.
Ce pH déterminé es† avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci-dessus son† de préférence ± 0,2, de manière encore plus préférée ± 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée. Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 e† inférieur à 3,1.
Des tampons pH préférés son† choisis dans le groupe constitué de l’acétate pH 4,5, l’acide N-(2-ace†amido)iminodiace†ique pH6,5, le Bis-Tris pH 6,0, le CHES (l’acide 2-(N-Cyclohexylamino)éthane) pH
9.5, l’acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l’imidazole pH 8, la glycine pH 3,0, l’HEPES (l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-l -pipérazine éthane sulfonique) pH
7.5, le MES (l’acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n’-Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 e† le phosphate, pH 5,0.
L’étape de mise en solution peut avantageusement se faire, alternativement, ou en synergie avec le tampon pH décrit ci-dessus, dans une solution comprenant de l’acétonitrile, par exemple de préférence ladite solution aqueuse comprend de l’acétonitrile, de préférence entre 10% et 50% (acéfonifrile : eau ; v:v), par exemple, mois de 40% (en volume), tel qu’environ 30:70 (acéfonifrile : eau ; v:v). Ceci peu† être couplé avec une étape (terminale) de lyophilisation de la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques.
Un autre aspect lié de la présente invention es† une composition pharmaceutique comprenant le peptide conjugué susceptible d’être obtenu par le procédé ci-dessus. De préférence, ce††e composition comprend en outre un adjuvant de vaccination, de préférence choisi parmi une émulsion e† un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
La protéine CRM197 (SEQ ID NO:l ) es† doublement particulière si l’on considère le couplage d’épitopes peptidiques du fai† de sa forte teneur en résidus -NH2, 40 : 39 lysines, soi† presque 10% de la séquence, e† l’extrémité amino-terminale.
Outre une forte teneur en lysine, la SEQ ID NO:l comporte de nombreux autres acide aminés chargés ou polaires, si bien que la protéine es† naturellement hydrophile. Cependant, lorsqu’elle es† conjuguée à plusieurs épitopes peptidiques, les résidus -NH2, en particulier les résidus - NH2 les plus exposés, son† mobilisés, ce qui bouleverse fondamentalement son caractère hydrophile. Cet effet est encore plus marqué lorsque l’épitope à greffer es† hydrophobe, ou peu hydrophile.
Il es†, certes, possible de surmonter un tel changement des propriétés physico-chimiques, par exemple par une sélection des solvants appropriés. Cependant, les conditions doivent rester compatibles avec un usage pharmaceutique. Ainsi, (i) des solvants toxiques ou dénaturants, ou encore (ii) des conditions extrêmes ou trop proches de la limite de la solubilité de la SEQ ID NO:l conjuguée à plusieurs peptides, ne son† pas acceptables. En outre, il es† commode, lors de la synthèse de peptides, de pratiquer une étape de lyophilisation de manière à concentrer les produits des réactions, voire à obtenir un produit fini sous forme de poudre, stable e† facile à transporter ; cependant, certains solvants organiques, tels que l’acétonitrile, ne peuvent pas être utilisés à de trop fortes concentrations dans ces conditions car cela présente des risques d’explosion.
Un premier aspect de la présente invention es† donc une composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de SEQ ID NO:l à laquelle plusieurs épitopes peptidiques son† greffés de manière covalente. Ce††e composition es†, de préférence pour un usage pharmaceutique (vaccination).
Dans le contexte de la présente invention, les termes « vaccin » ou « vaccination » s’entendent de préférence dans leur sens le plus large en ce qu’il signifie toute injection à un patient d’un épitope peptidique dans le bu† de déclencher une réponse spécifique du système immunitaire. Ainsi, les termes « vaccin » ou « vaccination », dans le contexte de la présente invention, englobent avantageusement toute immunisation d’un patient. Le bu† recherché peu† être préventif ou thérapeutique. L’immunisation (vaccination) n’es† pas limitée aux maladies infectieuses mais englobe également les maladies inflammatoires, auto-immunes e† dégénératives, en ce compris le cancer. La réponse peut être humorale ou cellulaire, ou les deux. Il peut s’agir d’une activation (spécifique) du système immunitaire ou d’une répression (spécifique) du système immunitaire. Le type de cellule du système immunitaire ciblé n’es† pas limité, ni la nature de la cellule présentatrice d’antigène.
De préférence, les épitopes peptidiques à greffer sur une molécule de SEQ ID NO:l son† identiques, bien que le greffage de plusieurs épitopes différents pourrai† très bien être pratiqué sur une molécule de la SEQ ID NO:l . De manière avantageuse au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire 10 épitopes peptidiques, mais, de préférence, moins de 20, 19, 18, 17, 16, 15 épitopes peptidiques son† greffés à un peptide de la SEQ ID NO:l (moles épitopes peptidiques :moles SEQ ID NO:l ).
Un nombre précis et/ou prévisible d’épitopes peptidiques par SEQ ID NO:l permet de mieux réaliser la purification de la protéine greffée.
Un nombre élevé d’épitopes peptidiques par SEQ ID NO:l es† difficile à obtenir, en particulier pour des peptides hydrophobes, mais permet une séparation plus simple, e† l’administration plus importante des épitopes peptidiques à un patient, ce qui es† particulièrement avantageux en vaccination thérapeutique.
De manière avantageuse, les épitopes peptidiques son† greffés au niveau des résidus -NH2 de la SEQ ID NO:l, parfois via un « spacer», tel que le reliquat de l'agent de couplage, selon l'agent de couplage utilisé (ex. le sulfo GMBS). Même si le greffage (la conjugaison) transforme un résidu chargé, très hydrophile e† exposé, en un complexe hydrophobe, ce qui augmente fortement le caractère hydrophobe du complexe résultant surtout lorsque plusieurs épitopes on† été greffés, les inventeurs on† réussi à identifier des conditions dans lesquelles des épitopes peptidiques à greffer peuvent être peu hydrophiles, voire hydrophobes.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par« épitope peptidique » foute molécule formée essentiellement par des liens amides, tels que des peptides naturels composés d’acides aminés naturels. Cependant, les épitopes peptidiques peuvent comprendre des acides aminés modifiés : soif des modifications qui se retrouvent dans certaines situations pathologiques ou physiologiques (ex. au niveau de la proline, de la sérine, de l’asparagine, de la lysine, de l’arginine ou du frypfophane) ou d’autres modifications de type chimique, telles que le couplage d’un acide aminé par un résidu alkyle.
De préférence, dans le contexte de la présente invention, un épitope peptidique comprend au moins une chaîne de 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques, de préférence au moins 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 et/ ou de préférence moins de 40 acides aminés, moins de 35, moins de 30, voire moins de 20 acides aminés.
Ces épitopes peptidiques son† donc greffés de manière covalente à la SEQ ID NO :l , en pratique plusieurs épitopes peptidiques y son† greffés. Ces épitopes peptidiques son† également incorporés dans la trousse comprenant l’agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH, e† son† utilisés dans le procédé de couplage correspondant, e† son† donc incorporés dans la composition pharmaceutique susceptible d’être obtenue par ce procédé. Dans le contexte de la présente invention, on entend par« peptide peu hydrophile » ou « hydrophobe » un peptide qui comporte moins de 50%, de préférence moins de 40%, moins de 35%, voire moins de 30%, ou encore moins de 26% d’acide aminés choisis dans le groupe constitué de l’arginine, la lysine (et/ou l’ornithine, la citrulline), l’histidine, l’acide glutamique, l’acide aspartique et/ou plus de 20%, 30%, 35%, voire 40% d’acide aminés choisis dans le groupe constitué de la valine, la leucine, l’isoleucine (et/ou la norleucine), la méthionine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. De préférence, un peptide hydrophobe comporte, dans le contexte de la présente invention, au moins 35% d’acides aminés choisis dans le groupe constitué de la valine, la leucine, l’isoleucine (et/ou la norleucine), la méthionine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine e† le tryptophane e† moins de 35% d’acides aminés choisis dans le groupe constitué de l’arginine, la lysine (et/ou l’ornithine, la citrulline), l’hisfidine, l’acide glutamique e† l’acide aspartique. De manière plus générale, dans le contexte de la présente invention, de préférence, un peptide hydrophobe comporte davantage (ex. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou plus) d’acide aminés choisis dans le groupe constitué de la valine, la leucine, l’isoleucine (ef/ou la norleucine), la méthionine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine e† le tryptophane que d’acides aminés choisis dans le groupe constitué de l’arginine, la lysine (ef/ou l’ornifhine, la citrulline), l’hisfidine, l’acide glutamique, l’acide aspartique e†, potentiellement, la sérine. D’autres acides aminés non naturels, en ce compris des modifications, naturelles ou artificielles, des chaînes latérales des acides aminés on† également des propriétés hydrophiles ou hydrophobes. Les conséquences quan† au caractère hydrophobe du peptide résultant de leur éventuelle incorporation dans un épitope peptidique se fera, par exemple, en adaptant les valeurs numériques ci-dessus. Alternativement, la terminologie de « peptide peu hydrophile » porte sur des peptides peu solubles dans l’eau ou dans des solutions aqueuses (sans détergent), par exemple à pH 7. Ceci peu† se déterminer par leur répartition dans un système eau (pH 7 ; 25°C) - octanol : un peptide peu hydrophile se retrouvant majoritairement (ex. plus de 50%, plus de 60%, plus de 70%, plus de 80%, plus de 90%, voire plus de 95%) dans la phase organique (ex. octanol).
La présente invention permet donc avantageusement le greffage de peptides (d’épifopes peptidiques), mêmes de peptides hydrophobes, en grande quantité sur CRM-197. Le greffage de peptides hydrophobes (ou peu hydrophile) es† adonc possible e† même avantageux.
De préférence, les épitopes son† greffés via un agent de réticulation hétérobifonctionnel, de préférence réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH, manière encore plus préférée, le sulfo-GMBS. Au cas où l’on utilise un agent de réticulation réactif pour un groupement -SH, un groupement -SH (accessible) es† avantageusement ajouté à un épitope peptidique qui en serai† naturellement dépourvu (ou don† les groupements -SH seraient inaccessibles). Une manière préférée es† le couplage (greffage) d’un résidu cystéine à une extrémité, carboxy- ou amino-terminale) de l’épitope. Ce††e cystéine éventuellement ajoutée es† de préférence incorporée dans le calcul ci-dessus pour l’estimation du caractère hydrophobe du peptide à greffer.
Au cas où l’épitope peptidique à coupler (greffer) contient naturellement une cystéine, de préférence, l’étape de couplage (greffage) comporte une étape préliminaire pour déterminer si ce††e cystéine es† accessible pour le couplage (greffage) e†, avantageusement, si le couplage (greffage) sur ce††e cystéine modifie le caractère immunogène de l’épitope peptidique. Ainsi, de préférence, au cas où l’épitope peptidique contient naturellement une cystéine (accessible ou pas, problématique si utilisée pour le couplage ou pas), ce††e cystéine peu† être protégée, e† un autre résidu cystéine peu† être ajouté à une des extrémités de l’épitope peptidique. Ce††e composition pharmaceutique est avantageuse pour une utilisation en vaccination d’un patient choisi dans le groupe constitué de l’humain ( Homo sapiens ), du chien ( Canis vulgaris), du cheval ( Equus caballus) et un camélidé ( Camelus sp.) de préférence le patient es† humain. En effet, le grand nombre de peptides couplés sur la SEQ ID NO:l permet l’administration massive des épitopes au patient, ce qui es† particulièrement avantageux en vaccination thérapeutique.
Ce††e vaccination thérapeutique es† utile pour le traitement des maladies infectieuses en particulier lorsque l’ agent infectieux es† intracellulaire, des maladies auto-immunes, des maladies inflammatoires, des maladies dégénératives e† le cancer.
Avantageusement, la composition pharmaceutique es† utilisée en présence, ou mise en présence, d’un adjuven† (de vaccination et/ou d’immunisation), tels que des émulsions (huile dans eau e† eau dans huile), des oligonucléotides ayant les motifs CpG ou des sels d’aluminiums. Les adjuvants préférés son† les émulsions (huile dans eau e† eau dans huile) e† les oligonucléotides ayant les motifs CpG.
De préférence, la composition pharmaceutique es†, ou sera en vue de son administration au patient, en solution aqueuse dans un tampon assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:l conjuguée. Ce tampon pH es† avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci- dessus son† de préférence ± 0,2, de manière encore plus préférée ± 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée. Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 e† inférieur à 3,1 .
Les tampons pH préférés son† choisis dans le groupe constitué de l’acétate pH 4,5, l’acide N-(2-ace†amido)iminodiace†ique pH6,5, le Bis-Tris pH 6,0, le CHES (l’acide 2-(N-Cyclohexylamino)éthane) pH 9,5, l’acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l’imidazole pH 8, la glycine pH 3,0 (i.e. glycine-HCI), l’HEPES (l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-l -pipérazine éthane sulfonique) pH 7,5, le MES (l’acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n ’ -Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 e† le phosphate, pH 5,0. De préférence, ces tampons pH son† utilisés à une concentration comprise entre 5 e† 50 mM, de préférence entre 20 e† 50 mM. Les valeurs de pH son† de préférence comprises dans une plage ± 0,2 ; ainsi « pH 5.0 » signifie de 4,8 à 5,2, même si un pH de strictement 5,0 es† préféré (dans ce† exemple explicatif de la plage de pH). Avantageusement un additif es† combiné au tampon pH, de préférence choisi parmi l’arginine e† la glutamine (50 mM chacun), Trimethylamine N-oxide (500 mM), Tween®20 (1 % ; w :v), tréhalose (500 mM) e† le glycérol (20% ; v :v).
Un aspect associé de la présente invention est une trousse comprenant un (ou plusieurs) épitope(s) dérivé(s) d’une protéine naturelle comprenant un groupement -SH libre ; un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH, de préférence l’agent de couplage sulfo-GMBS ; et la SEQ ID NO:l . Ceffe frousse confient les éléments essentiels pour le couplage d’un ou de plusieurs épifope(s) à la SEQ ID NO:l .
De manière avantageuse, ceffe frousse comprend également l’adjuvenf décrit ci-dessus et /ou le tampon pH décrit ci-dessus.
Un autre aspect associé de la présente invention es† le procédé de couplage d’un épitope peptidique à une protéine porteuse comprenant les étapes de :
- on identifie un épitope peptidique comprenant un groupement -SH libre ou on identifie un épitope peptidique auquel on rajoute un groupement -SH libre (ex. une cystéine à l’extrémité amino terminale) ;
- on obtient la protéine porteuse qui est SEQ ID NO:l ;
- on active la protéine porteuse via un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH de manière à faire réagir une pluralité des groupement -NH2 (de ceffe SEQ ID NO:l ) avec l’agent de réticulation bifonctionnel;
- on sépare la protéine porteuse activée de l’agent de réticulation non incorporé ;
- on me† en contact la protéine porteuse activée avec l’épitope peptidique identifié de manière à faire réagir le groupement -SH de l’épitope peptidique avec la protéine porteuse activée par l’ agent de réticulation ; - optionnellemen†, on ajoute un excès de cystéine de manière à neutraliser les résidus réactifs de groupement -SH qui n’auraien† pas réagi avec l’épitope ajouté (en excès) ;
- on sépare la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques des substrats n’ ayant pas réagi e† des sous-produits de réaction ;
- optionnellemen†, on me† la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques dans une solution aqueuse comprenant un tampon pH déterminé, assurant un pH voulu à la solution comprenant la SEQ ID NO:l conjuguée ; - optionnellemen†, on lyophilise la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques ;
- optionnellemen†, on resolubilise la protéine porteuse dans une solution aqueuse comprenant le tampon pH décrit ci-dessus.
De préférence, comme pour les autres aspects de la présente invention, ces tampons pH son† utilisés à une concentration de 5 à 50 mM, de préférence de 20 à 50 mM. Ce tampon pH es† avantageusement de 3,0, de 3,5, de 4,0, de 4,5, de 5,0, de 5,5, de 6,0, de 6,5, de 7,0, de 7,5, de 8,0 voire de 8,5. Les valeurs ci-dessus sont de préférence ± 0,2, de manière encore plus préférée ± 0,1, voire même encore plus proche de la valeur ciblée. Ainsi un pH de 3,0, signifie de préférence un pH supérieur à 2,9 ef inférieur à 3,1. Des tampons pH préférés son† choisi dans le groupe constitué de l’acéfafe pH 4,5, l’acide N-(2-acefamido)iminodiacefique pH6,5, le Bis-Tris pH 6,0, le CHES (l’acide 2-(N-Cyclohexylamino)éfhane) pH 9,5, l’acide citrique pH 3,2 (ou 4,0 ou 5,5), l’imidazole pH 8, la glycine pH 3,0 (glycine-HCI), l’HEPES (l’acide 4-(2-hydroxyéfhyl)-l-pipérazine éfhane sulfonique) pH 7,5, le MES (l’acide 2-(N-morpholino)éfhane sulfonique) pH 6,2, le MOPS (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique) pH 7,0, le PIPPS (Piperazine-N, n ’ -Bis acide (3-Propanesulfonique) pH 3,7 ef le phosphate, pH 5,0. Les valeurs de pH sont de préférence comprises dans une plage ± 0,2 ; ainsi « pH 5.0 » signifie de 4,8 à 5,2, même si un pH de strictement 5,0 est préféré (dans cet exemple explicatif de la plage de pH). Avantageusement un additif est combiné au tampon pH, de préférence choisi parmi l’arginine et la glutamine (50 mM chacun), Trimethylamine N- oxide (500 mM), Tween®20 (1% ; w:v), tréhalose (500 mM) et le glycérol (20% ; v:v).
Les inventeurs ont remarqué que l’activation des groupements -NH2 de la SEQ ID NO:l, suivie, séquentiellement, du greffage des épitopes (ex. via un résidu -SH libre et/ou accessible), permet une charge plus importante et plus reproductible. Une «valence» de 12 à 13 épitopes greffés (en moyenne) sur une molécule de la SEQ ID NO:l a été obtenue de manière reproductible pour au moins deux épitopes différents, malgré leur hydrophobicité (un épitope très hydrophobe et un épitope moyennement hydrophobe).
Les inventeurs ont remarqué qu’un mélange eau:acétonitrile 70:30 (v:v) permettait de solubiliser la SEQ ID NO:l greffée, même lorsque plusieurs (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, voire 13) épitopes hydrophobes étaient greffés sur une molécule de la SEQ ID NO:l . De même, l’incorporation du tampon pH décrit ci-dessus dans une solution aqueuse assure une bonne solubilité à la protéine porteuse conjuguée. De préférence, dans ce procédé, l’agent de réticulation hétérobifonctionnel est en excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:l à activer, ce qui permet l’activation maximale des groupements -NH2 exposés.
De préférence, également, l’épitope est en (léger; ex. moins de 3 fois) excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:l ; à nouveau, ceci permet d’assurer un greffage maximal, et constant.
De préférence, la SEQ ID NO:l conjuguée est maintenue en solution en présence d’acétonitrile à une teneur inférieure à 40% (v:v), idéalement à environ 30% (v:v). Alternativement, l’incorporation du tampon pH décrit ci-dessus dans une solution aqueuse assure une bonne solubilité à la protéine porteuse (SEQ ID NO:l) conjuguée. Ceci permet de pratiquer une étape finale de lyophilisation du produit conjugué.
L’étape de lyophilisation est particulièrement avantageuse lorsque des solvants organiques (ex. l’acétonitrile) ont été utilisés, ceci à des concentrations permettant la lyophilisation. Alternativement, la SEQ ID NO:l conjuguée peut être solubilisée en l’absence de solvants organiques, par exemple en utilisant le mélange tampon décrit ci-dessus. Dans ce cas, l’étape de lyophilisation n’est pas préférée, mais optionnelle. Ces différentes étapes de finition son† utiles pour permettre une composition pharmaceutique comprenant ce peptide conjugué à la SEQ ID NO:l . Cette composition (lyophilisée) est stable, facilement transportable et permet une conservation de longue durée. Exemples.
Il es† bien entendu que la présente invention n’es† en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Exemple 1 : synthèse de la SEQ ID NO:l e† des peptides des SEQ ID NO:2-4
La SEQ ID NO:l a été obtenue par fermentation d’une souche particulière d ’Escherichia coli ; la séquence a été modifiée pour que la protéine (mature, SEQ ID NO:l ) soir sécrétée dans l’espace périplasmique, par exemple, selon la méthode décrite dans la demande de brevet BE2021 /5137 déposée le 26/02/2021 . La protéine es† récupérée e† purifiée par filtration e† par chromatographie, par exemple, selon la méthode décrite dans la demande de brevet BE2021 /5138 déposée le 26/02/2021 . Aucun des réactifs utilisés n’es† d’origine animale e† la teneur en endotoxines résiduelles es† compatible avec un usage clinique. Les peptides des SEQ ID NO:2, 3, 4 e† 5 on† été obtenus par synthèse en phase solide. Toutefois d’autres méthodes de synthèse, voire de fermentation, son† possibles. En pratique, l’extrémité C-†erminale du peptide es† fixée à un support polymérique e† la chaîne peptidique es† constituée puis étendue jusqu’à l’extrémité N par la répétition de cycles de couplages ; l’extrémité carboxy de l’acide aminé à incorporer étant activée, puis couplée à l’extrémité amino du peptide fixé à la résine. Le groupement amino es† protégé par le groupement Fmoc e† les autres groupes fonctionnels potentiellement réactifs son† protégés par d’autres groupement. Lorsque l’acide aminé est greffé au peptide à allonger, après le retrait des acides aminés en excès et les étapes de lavages, le groupement Fmoc es† clivé par ajout de piperidine. Le clivage de la résine e† la déprotection des groupements fonctionnels des chaînes latérales des acides aminés es† réalisé par ajout d’acide trifluoroacétique (TFA).
Dans certains cas, le résidu tryptophane de la SEQ ID NO:2 ou de la SEQ ID NO:4 es† alkylé sur le groupement indole via l’ajout d’une amide-Tmob dans le TFA. D’autres modifications son† d’ailleurs possibles.
Après clivage de la résine, déprotection, purification (ex. FIPLC en phase inverse) e† filtration (0.45 miti), les peptides on† été analysés par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) e† par FIPLC. Les étapes d’ FIPLC son† à chaque fois pratiquées au moyen d’un mélange d’eau (0.1% TFA) avec un gradient en acétonitrile (0.1% TFA), e† détection par UV (215 e† 280 nm). La pureté doit être supérieure à 90%, voire 95%. En pratique, les inventeurs on† obtenu des peptides de pureté de 97%.
Exemple 2 : Couplage via EDC, par rapport au glutaraldéhyde.
Les inventeurs on† fou† d’abord tenté d’effectuer le couplage en utilisant la méthode décrite dans le brevet EP2004217, mais appliquée sur les peptides des séquences SEQ ID NO:2 e† SEQ ID NO:4 à coupler sur la SEQ ID NO:l au lieu du KLH.
Ce type de couplage fonctionne, mais n’es† pas satisfaisant en pratique. En effet, les inventeurs on† observé que la molécule obtenue était difficile à purifier ou à stériliser par filtration e† qu’il y avait un manque d’homogénéité de lot à lot. Une des explications avancée par les inventeurs es† que le caractère hydrophile de la protéine non-modifiée es† transformé de manière trop forte lorsqu’un peptide y es† greffé de multiples fois, ce qui rend inutilisable cette protéine porteuse pour les traitements en aval. Ainsi, la protéine de la SEQ ID NO:l, présente une utilité comme agent porteur, mais cette utilité n’es† pas évidente dans le contexte du greffage d’épitopes peptidiques, en particulier d’épitopes peptidiques hydrophobes.
Cependant, les inventeurs on† néanmoins tenté de surmonter ce††e difficulté via le choix d’un autre agent de couplage, le 1 -Et hy 1-3- [3- dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride (EDC) ; disponible par exemple chez Pierce. Il s’agi† d’un agent permettant le couplage des groupements carboxyles aux amines primaires. L’EDC réagi† avec le groupement carboxyle pour former un intermédiaire réactif O- acylisourea. Si ce† intermédiaire ne réagi† pas avec une amine, il s’ hydrolyse pour régénérer le groupe carboxyle.
Pour ce faire, les inventeurs on† développé e† comparé un procédé de couplage en une étape, e† un procédé de couplage en deux étapes.
Dans le procédé en une étape, à l’instar du procédé basé sur le glutaraldéhyde, la protéine porteuse (SEQ ID NO:l ), l’EDC e† l’épitope de la SEQ ID NO:2 ou celui de la SEQ ID NO:4 son† rassemblés dans le même récipient sous agitation magnétique, puis le précipité es† récupéré e† purifié sur Sephadex™ G50 avant lyophilisation.
Dans le procédé à deux étapes, la SEQ ID NO:l es† d’abord activée par mise en présence avec G EDC, puis l’épitope de la SEQ ID NO:2 ou celui de la SEQ ID NO:4 son† ajoutés avant séparation, purification e† lyophilisation.
Par rapport au glutaraldéhyde, le produit de la réaction es† utilisable, même s’il persiste des agrégats inutilisables, synonymes de pertes de rendement, e† une partie significative de la SEQ ID NO:l reste en solution, synonyme de protéine n’ayant pas réagi (ou trop peu), soit une seconde perte de rendement. De même, l’efficacité de couplage varie fortement d’un lof à l’autre, et la solubilité du conjugué es† médiocre, voire insuffisante, ce qui, de plus, complique la stérilisation par filtration.
Le rendement était médiocre dans le cas du procédé à une étape : 12% pour le greffage de SEQ ID NO:2 e† 30% pour le greffage de SEQ ID NO:4. Cependant, ce rendement augmente, par exemple à 60% lorsque le procédé de couplage es† réalisé en deux étapes (SEQ ID NO:l avec SEQ ID NO:4). Le ratio de répartition molaire SEQ ID NO:l vs SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 es† de moins de 2 pour le procédé de couplage en une étape, e† es† supérieur à 2 pour le procédé de couplage en 2 étapes.
Exemple 3. Couplage via GMBS de la protéine CRM197 avec un peptide.
Les inventeurs on† solubilisé 25 mg de protéine porteuse CRM197 (SEQ ID NO:l ) dans 2,5 ml d’une solution aqueuse. La protéine porteuse es† issue d’un lot compatible avec un usage clinique e† a une teneur en endotoxines en-dessous de la limite de détection. Les inventeurs on† pesé 19 mg de sulfo GMBS (Pierce ; référence 22324 ; N-g-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester), puis ajouté 2,5 ml d’un milieu de conjugaison (100 mM de « Phosphate- Buffered Saline » ; PBS e† 10 mM d’ Éthylène-diamine-tétraacétique ; EDTA) e† les 2,5 ml de la solution de SEQ ID NO:l . Ce mélange es† placé sous agitation magnétique pendant 1 h à 4°C.
Les inventeurs on† purifié la SEQ ID NO:l activée par passage sur colonne Sephadex™ G50 équilibrée avec le tampon PBS, pH 7,2, en suivant la récupération de la SEQ ID NO:l à 280 nm. Les inventeurs ont transféré la (les) fraction (s) contenant le pic d’absorption à 280 nm (la protéine CRM-GMBS) dans le flacon contenant SEQ ID NO:3 (25 mg, dissous dans le DMSO), puis mis sous agitation magnétique pendant 2h à 4°C. Le conjugué formé entre SEQ ID NO:l et SEQ ID NO:3 précipite. Après centrifugation, le culot es† dissous dans l’acétonitrile.
Les inventeurs on† rajouté 1 ml de Cystéine I M e† laissé sous agitation pendant 30 minutes.
Les inventeurs on† transféré le milieu réactionnel dans un tube Falcon® de 50 ml ; on centrifuge e† le culo† es† séparé e† repris dans un mélange eau:acétonitrile (70:30 : w:w).
Les inventeurs on† purifié sur colonne Sephadex™ G50, à nouveau en suivant l’absorption à 280 nm.
Les inventeurs on† lyophilisé le conjugué purifié. Toutes les étapes ci-dessus on† été réalisées en conditions compatibles avec un usage clinique ultérieur. Les études de stabilité en vue d’un usage clinique on† ensuite été pratiquées. La poudre conservée à une température de -20°C e† de +5°C reste stable pendant plusieurs mois. Elle résiste à un vieillissement accéléré (stress à 25°C) pendant au moins 14 jours (mesures par SDS-PAGE, MALDI-TOF, électrophorèse capillaire inchangées e† infrarouge (FTIR) pour évaluer des éventuelles dégradations de résidus chimiques ou de structure secondaire).
L’analyse révèle que la SEQ ID NO:l a très majoritairement réagi avec le peptide de la SEQ ID NO:3 : un rendement de 64% a été obtenu. Outre un bon rendement, le ratio molaire entre SEQ ID NO:l e† SEQ ID NO:3 es† supérieur à 8. Des valeurs de 13 on† même été relevées e† obtenues de manière reproductibles pour ce rendement de couplage. Des ratios encore plus élevés ont même été obtenus, mais au prix d’un rendement de couplage moindre (ex. 36 et 47%).
En pratique, la méthode de couplage avec agents hétéro- bifonctionnels, surtout lorsqu’elle es† pratiquée en deux étapes, permet même un taux de couplage de plus de 50 g de peptide sur 100 g de la SEQ ID NO:l .
Le SEQ ID NO:l ayant incorporé plusieurs peptides des SEQ ID NO:3 ou 5 (voir ci-dessous) es† facilement différenfiée (ex. par électrophorèse) puisque sa masse moléculaire passe de 58 kDa à ~78 KDa si 10 peptides son† greffés sur une molécule de la SED ID NO :1, voire ~90 kDa si davantage de peptides son† greffés sur une molécule de la SEQ ID NO:l ; ex. 13 ou 14 peptides greffés sur une molécule.
Exemple 4 : Le même protocole es† appliqué pour le peptide de la SEQ ID
NO:5. Le rendement de couplage es† également excellent, tou† comme le nombre de peptides couplés à la SEQ ID NO:l .
Exemple 5 : Le peptide de l’exemple 3 (182 g, soi† un équivalent de 60 g de la SEQ ID NO:3) es† combiné au peptide de l’exemple 4 (182 g, soif un équivalent de 60 g de la SEQ ID NO:5). Un adjuvant es† ajouté à ce mélange ou à un placebo. Le principe actif ou le placebo es† injecté à une cohorte de patients humains souffrant de myasthénie grave (MG) en ‘double aveugle’. En pratique, 3 injections séquentielles son† pratiquées (semaine 1, 5 et 13). Ensuite, le même protocole es† conçu pour une seconde cohorte de patients, mais avec encore plus de principe actif. Finalement, l’étude se poursuit en ‘open’, de manière à évaluer la tolérabilité et l’efficacité à long ferme du traitement. A chaque injection, le patient es† suivi de près pour d’éventuels effets secondaires, d’abord à G hôpital sous haute supervision puis, à domicile. Des échantillons sanguins son† prélevés pour des tests d’immunogénicité.
Les données générées permettent de conclure à une bonne tolérabilité (le principe actif ne cause pas plus d’effets secondaires que le placebo) e† à une efficacité du traitement.
Ainsi, de manière surprenante, les inventeurs on† démontré que la SEQ ID NO:l es† une bonne protéine porteuse pour le couplage d’épitopes peptidiques en vue d’une utilisation thérapeutique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Une composition pharmaceutique comprenant un peptide conjugué constitué de la SEQ ID NO:l à laquelle plusieurs épitopes peptidiques sont greffés de manière covalente, dans laquelle lesdifs épitopes peptidiques comprennent une chaîne de au moins 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques.
2. La composition pharmaceutique selon la revendication 1 dans laquelle les plusieurs épitopes peptidiques son† identiques, de préférence lesdits épitopes peptidiques son† hydrophobes.
3. La composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire 10 épitopes peptidiques son† greffés à un peptide de la SEQ ID NO:l (mole épitope pep†idique:mole SEQ ID NO:l ).
4. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 3 dans laquelle moins de 20, 19, 18, 17, 16, 15 épitopes peptidiques son† greffés à un peptide de la SEQ ID NO:l (mole épitope pep†idique:mole SEQ ID NO:l ).
5. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 4, dans laquelle les épitopes peptidiques son† greffés chacun au niveau d’un résidu -NH2 de la SEQ ID NO:l .
6. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 5, dans laquelle les épitopes peptidiques son† greffés via un agent de réticulation hétérobifonctionnel.
7. La composition pharmaceutique selon la revendication 6, dans laquelle l'agent de réticulation hétérobifonctionnel es† réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH, de préférence le sulfo-N-Y-maleimidobufyryl-oxysulfosuccinimide ester (Sulfo- GMBS).
8. La composition pharmaceutique selon la revendication 7, dans laquelle les épitopes peptidiques comprennent un groupement -SH libre, ou dans laquelle un groupement -SH libre est ajouté à un épitope peptidique naturel.
9. La composition pharmaceutique selon la revendication 8, dans laquelle un résidu cystéine est greffé à l’extrémité amino- ou carboxy-terminale de l’épitope peptidique.
10. Composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 9 étant pour l’immunisation d’un patient choisi dans le groupe constitué de l’homme, du chien, du cheval ou un camélidé, de préférence le patient est humain.
1 1. La composition pharmaceutique pour l’immunisation selon la revendication 10 dans laquelle l’immunisation est à visée thérapeutique, de préférence pour le traitement des maladies infectieuses, des maladies auto-immunes, des maladies inflammatoires, des maladies dégénératives et le cancer.
12. La composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 1 1 , comprenant en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
13. Solution aqueuse comprenant la composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 12, ladite solution aqueuse comprenant un tampon de manière à assurer un pH déterminé à ladite solution aqueuse.
14. Une trousse comprenant :
-un épitope dérivé d’une protéine naturelle comprenant un groupement -SH libre ; - un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH, de préférence l’agent de couplage sulfo-GMBS ;
- la SEQ ID NO:l , dans laquelle ledit épitope dérivé d’une protéine naturelle comprend une chaîne de au moins 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques.
15. La frousse selon la revendication 14 comprenant en outre un adjuvant de vaccination, de préférence une émulsion ou un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
16. Procédé de couplage d’un épitope peptidique à une protéine porteuse comprenant les étapes de :
- on identifie un épitope peptidique comprenant un groupement -SH libre ef/ou on identifie un épitope peptidique auquel on rajoute un groupement -SH libre ;
- on obtient la protéine porteuse qui es† SEQ ID NO:l ;
- on active ladite protéine porteuse via un agent de réticulation hétérobifonctionnel réactif pour un groupement -NH2 e† un groupement -SH de manière à faire réagir une pluralité des groupement -NH2 de ladite SEQ ID NO:l avec ledit agent de réticulation hétérobifonctionnel;
- on sépare la protéine porteuse activée de l'agent de réticulation non incorporé ;
- on me† en contact ladite protéine porteuse activée avec ledit épitope peptidique identifié de manière à faire réagir ledit groupement -SH dudi† épitope peptidique avec ladite protéine porteuse activée par l’ agent de réticulation ;
- on sépare la protéine porteuse couplée à plusieurs desdits épitopes peptidiques des substrats n’ ayant pas réagi e† des sous-produits de réaction, - dans lequel ledit épitope peptidique comprend une chaîne de au moins 7 acides aminés liés par des liaisons peptidiques.
17. Le procédé selon la revendication 16 dans lequel l’agent de réticulation hétérobifonctionnel est en excès par rapport au nombre de résidus -NH2 de la SEQ ID NO:l à activer.
18. Le procédé selon la revendication 16 ou 17 comprenant en outre une étape de mise en solution de la protéine porteuse couplée à plusieurs des épitopes dans une solution aqueuse comprenant un tampon de manière à assurer un pH déterminé à ladite solution aqueuse, de préférence ladite solution aqueuse comprend de l’acétonitrile, de préférence entre 10% e† 50% (acéfonifrile : eau ; v:v), par exemple, mois de 40% (en volume), tel qu’environ 30:70 (acéfonifrile : eau ; v:v).
19. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 16 à 18 comprenant en outre une étape de lyophilisation de la protéine porteuse couplée à plusieurs épitopes peptidiques.
20. Une composition pharmaceutique comprenant le peptide conjugué susceptible d’être obtenu par le procédé selon une quelconque des revendications 16 à 19.
21 . La composition pharmaceutique selon la revendication 20 comprenant en outre un adjuvant de vaccination, de préférence choisi parmi une émulsion e† un oligonucléotide comprenant un ou plusieurs motifs CpG.
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