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WO2024246303A1 - Composition pharmaceutique pour inhalation - Google Patents

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Publication number
WO2024246303A1
WO2024246303A1 PCT/EP2024/065061 EP2024065061W WO2024246303A1 WO 2024246303 A1 WO2024246303 A1 WO 2024246303A1 EP 2024065061 W EP2024065061 W EP 2024065061W WO 2024246303 A1 WO2024246303 A1 WO 2024246303A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipid
pharmaceutical composition
dendritic cells
cells according
activating macrophages
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2024/065061
Other languages
English (en)
Inventor
Rémi Rudy Brigitte Marie ROSIÈRE
Karim Amighi
Tamara Sylviane Andréa DAVENNE
Pauline PERCIER
Abdallah LADAYCIA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inhatarget Therapeutics
Original Assignee
Inhatarget Therapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inhatarget Therapeutics filed Critical Inhatarget Therapeutics
Publication of WO2024246303A1 publication Critical patent/WO2024246303A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a lipid composition protecting a pharmaceutical agent and intended to be administered into the respiratory tract to a patient.
  • Formulation such as lipid entrapment of pharmaceutical agents is well known.
  • lipids and in particular cationic lipids selected according to the nature of the pharmaceutical agent to be trapped and the type of vehicles to be obtained is known.
  • the size of the liposome, including the dispersion of sizes, the stability of the composition in biological media, its capacity to trap the pharmaceutical agent, or to release it at the desired location represent all factors that are difficult to optimize, especially jointly.
  • modifying the content of a compound is not simple because several physicochemical properties of the liposome must correspond to acceptable values for administration to a patient, such as size, size dispersion and electrical charge potential; while ensuring the stability of the formulation.
  • the enrichment in one component is done to the detriment of the others, which risks strongly affecting its balance: the inventors have noticed that this balance is a function of different concentration ratios, which can be strongly affected even following adaptations of concentrations that could have seemed marginal.
  • a first aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells
  • lipid vehicles formed from a series of lipids with at least one lipid having functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206), these lipid vehicles comprising a pharmaceutical agent selected from the group consisting of a nucleic acid, a STING protein agonist or a STING protein antagonist, a Toll-like receptor ligand, an immunomodulant, a peptide, or a mixture thereof.
  • this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells is administrable by inhalation, advantageously by nebulization and/or by pressurized inhalation and/or by dry powder inhalation and/or by gentle spray inhalation.
  • a related aspect of the present invention relates to this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells for the treatment of cancer, preferably metastatic cancer, preferably said metastasis being outside the lung or the central nervous system and the primary tumor being pulmonary or located at the level of the central nervous system, or said metastasis being pulmonary or located at the level of the central nervous system and the primary tumor being outside the lung or the central nervous system.
  • cancer preferably metastatic cancer
  • a related aspect of the present invention relates to this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells for the treatment of an infectious disease at the level of the respiratory and/or systemic tract, or of the central nervous system.
  • a related aspect of the present invention relates to this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells comprising a nucleic acid encoding one or more epitope(s), or a peptide comprising one or more epitopes, said pharmaceutical composition being for vaccination.
  • a related aspect of the present invention relates to a process for obtaining this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells comprising the steps of solubilizing the lipids in an organic solvent, evaporating the solvent so as to form a lipid film, rehydrating with a solution containing the pharmaceutical agent, homogenizing and/or extruding (optional)
  • lipids comprising a neutral lipid at pH 7.0 and positively charged at pH 5, and said rehydration step being carried out at pH less than 7.0.
  • the pharmaceutical agent is solubilized with the lipids in the organic solvent before evaporation, and no longer added during the rehydration step.
  • the pharmaceutical agent is of the non-nucleotide type, such as MSA-2.
  • Figure 1 compares the stability of different lipid structures.
  • Figure 2 compares the effect of functionalization on macrophage activation.
  • the inventors have succeeded in developing lipid-based formulations which allow significant trapping of one (or more) pharmaceutical agent(s), while retaining advantageous physicochemical properties compatible with clinical use.
  • a first aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells
  • lipid vehicles formed from a series of lipids with at least one lipid having a functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206) and the lipid vehicles comprise at least one pharmaceutical agent selected from the group consisting of at least one nucleic acid, at least one STING protein agonist or at least one STING protein antagonist, at least one Toll-like receptor ligand, an immunomodulant, a peptide, and mixtures thereof (except the STING agonist with the STING antagonist), this pharmaceutical composition preferably being for inhalation.
  • the lipid vehicles are advantageously chosen from the group consisting of liposomes, vesicles, micelles, lipoplexes, lipid emulsions, lipid nanocrystals, lipid microspheres, lipid nanoparticles, and mixtures thereof.
  • nasal administration e.g., to reach the nasal cavity, central nervous system and/or systemic circulation; e.g., treatment of a tumor, gene therapy, treatment of inflammation or infection
  • pulmonary administration e.g., to treat a disease therein, such as inflammation, infection or tumor
  • nasal administration to target both nasal and pulmonary deposition e.g., to target both nasal and pulmonary deposition.
  • peptide preferably means any chain of at least 2 amino acids linked by peptide bonds.
  • Advantageous peptides are a protein (including an enzyme), an antigen (an epitope), an antibody (or an antibody fragment, a nanobody).
  • the pharmaceutical agent comprises at least one nucleic acid selected from the group consisting of single-stranded DNA, double-stranded DNA (including cDNA), single-stranded RNA (including mRNA), double-stranded RNA, siRNA, shRNA, miRNA, oligonucleotide (DNA and/or RNA based), and mixtures thereof.
  • the nucleotides, sugars or phosphodiester bonds may advantageously be modified, for example uridine may be substituted or partially substituted by pseudouridine, for example when the nucleic acid is mRNA.
  • the adenosine or cytosine bases may advantageously be methylated, as may the sugars (e.g. in the 2' position).
  • Peptide nucleic acids, morpholino and/or phosphorothioate bonds may advantageously replace some or all of the phosphodiester bonds.
  • the nucleic acid is to stimulate an immune response and includes CpG motifs, the cytosine is advantageously not methylated.
  • the pharmaceutical agent comprises at least one STING protein agonist, preferably selected from the group consisting of cGAMP, 2'3'cGAMP, DMXAA, ADU-S100, MK-1454, MK-21 18, GSK-3745417, BMS-986301, SB-1 1285, IMSA-101, SYN-STING (SYNB1891), Bl-l 387446, TAK-676, E-7766 exoSTING, SNX281, HG- 381, DN-015089, PC7A, DiABZI, Di-guanosine monophosphate cyclic (cyclic di-GMP), MSA-2, ulevostinag, SB 1 1285, IMSA 101, Dazostinag, BMS-986301, Bl 1387446, advantageously the group also consists of cAlMP, cAIMP-di fluor, 3'-3'-cGAMP, c-di-AMP and SR-717 and mixtures thereof, preferably 2' STING
  • the pharmaceutical agent comprises at least one STING protein antagonist selected from the group consisting of C-176, H-151, lnh-54, RU.521, H-8, Al51, SA-1, GSK'932, SN-011 and mixtures thereof.
  • the series of lipids forming the lipid vehicles has a phase transition temperature (Tm) of between -30°C and 100°C, preferably between 1°C and 90°C, advantageously between 10°C and 80°C, 20°C and 70°C, for example between 20°C and 60°C.
  • Tm phase transition temperature
  • the series of lipids forming the lipid vehicles has a melting point of between -30°C and 180°C, preferably between 1°C and 160°C, advantageously between 10°C and 155°C, preferentially between 20°C and 150°C, for example between 20°C and 80°C.
  • lipid series improve the properties in the event of pulmonary administration, in particular by nebulization or by inhalation, and increase the release of the pharmaceutical agent in the targeted tissues and/or the cytoplasmic release of the pharmaceutical agent and/or its half-life and/or reduce the release of the pharmaceutical agent in non-targeted tissues.
  • Tm phase transition temperature
  • At least one lipid having a functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206) is a phospholipid with functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206),
  • At least one lipid is derivatized by polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • a PEG of size between 500 Da and 20 kDa is preferred, for example between 1 and 10 kDa, or even between 2 and 5 kDa.
  • a lipid preferably a phospholipid, derivatized by PEG, advantageously a DSPE-PEG, has a functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206).
  • the PEG-derivatized lipids are further functionalized with the mannose receptor ligand (CD206).
  • CD206 mannose receptor ligand
  • this object of the present invention can be achieved either on the basis of a single lipid, preferably a single phospholipid, derivatized by PEG, of which only a proportion would be functionalized, or on the basis of several lipids, preferably comprising at least one phospholipid, which would be derivatized with PEG, with some of these molecules derivatized with PEG which would not be functionalized.
  • PEG stabilizes lipid vehicles.
  • the ligand of the mannose receptor is selected from the group comprising a mannose, a fucose, an N-acetylglucosamine, an N-acetylgalactosamine, a glycoprotein, a galactocomannan, an aD-mannopyranoside (e.g.
  • a-D-Mannopyranose a-L-fucopyranose-(1-3)-2-acetamido-2-deoxy-[3-D-glucopyranose, Methyl aD- mannopyranoside, a-L-fucopyranose -(1-2)-[3-D-galactopyranose-(1-4)-
  • these ligands may be modified, for example N-acetylglucosamine may be deacetylated.
  • N-acetylglucosamine is incorporated as chitin or chitosan, preferably oligomers of chitin or chitosan (e.g. less than 50 monomers, less than 40 monomers, less than 30 monomers).
  • the lipid vehicles are lipid nanoparticles (LNPs), preferably liposomes or solid lipid nanoparticles (SLNs) or nanostructured lipid carriers (NLCs).
  • LNPs lipid nanoparticles
  • SSNs solid lipid nanoparticles
  • NLCs nanostructured lipid carriers
  • SSN preferably means colloidal particles (generally 50 to 500 nm in diameter) prepared from solid lipids (solid at room temperature and body temperature), surfactants and water by high speed or high pressure homogenization methods.
  • NLC is preferably understood to mean SLNs containing a liquid lipid (oil) fraction that causes structural imperfections of the solid lipids leading to a less ordered crystalline arrangement in order to improve the encapsulation of pharmaceutical agent. They are prepared by methods similar to SLNs.
  • liposomes preferably means spherical lipid vesicles (generally 50 to 500 nm in diameter) composed of one or more lipid bilayers. They result from the emulsification of natural or synthetic lipids in an aqueous medium by methods such as lipid film hydration, the ethanol injection method or by microfluidic methods.
  • the pharmaceutical agent has an overall negative charge.
  • the inventors have managed to incorporate large quantities of this type of agent, even in molar proportion of the cationic (or protonable, see below) lipid potentially present.
  • a cationic or protonatable lipid is incorporated when the pharmaceutical agent has an overall negative charge.
  • no cationic lipid when the pharmaceutical agent is uncharged, no cationic lipid is added or, then, in a content of less than 10% by mole (mole cationic lipid: total moles of incorporated lipids and cholesterol), preferably less than 5% by mole, preferably less than 4.3, 2 or 1% by mole.
  • the molar ratio between the cationic lipid possibly present and the uncharged pharmaceutical agent is less than 50% (mole cationic lipid(s): moles uncharged pharmaceutical agent), less than 40, 30, 20, 10, or even less than 5%.
  • the lipid series preferably comprises a first lipid selected from the group comprising a cationic lipid, a neutral lipid, an anionic lipid, a phospholipid, a triglyceride, a diglyceride, a glycerophospholipid, a sphingomyelin, a fatty acid, a fatty acid salt, and/or a second lipid selected from the group comprising a cationic lipid, a neutral lipid, an anionic lipid, a phospholipid, a triglyceride, a diglyceride, a glycerophospholipid, a sphingomyelin, a fatty acid, a fatty acid salt, and/or a third lipid selected from the group comprising a cationic lipid, a neutral lipid, an anionic lipid, a phospholipid, a triglyceride, a diglyceride, a glycerophospholipid, a s
  • the pharmaceutical composition comprises a first lipid being a cationic lipid having at least one quaternary ammonium group, and/or a lipid having at least one protonatable (secondary or tertiary) amine group (and free of negative charge at pH 7.0).
  • the lipid having at least one quaternary ammonium group is selected from the group consisting of DOTAP (18:1 TAP) as well as other TAP derivatives (such as 14:0 TAP, 16:0 TAP, 18:0 TAP), DOTMA, DDAB, DC-Chol, DODAP, MVL5, DOSPA, GL67, DOBAQ, EPC derivatives (12:0 EPC, 14:0 EPC, 16:0 EPC, 18:0 EPC, 18:1 EPC, 14:1 EPC, 16:0-18.1 EPC), DORI, DC-6-14, and mixtures thereof.
  • DOTAP is preferred.
  • protonatable (secondary or tertiary) amine it is preferably understood in the context of the present invention, an amine which is predominantly in neutral form at pH7.0, (e.g. more than 50%, preferably more than 75%, or even more than 90 or 99% in neutral form at pH7.0) and predominantly in protonated form at pH 5.0 (e.g. more than 50%, preferably more than 75%, or even more than 90 or 99% in protonated form at pH5.0).
  • DODMA 1,2-dioleyloxy-3-dimethylaminopropane
  • DMA Dimethylaminopropane
  • the second lipid is a sterol and is advantageously selected from the group consisting of cholesterol and its esters (cholesteryl esters), and its glycosylated derivatives (B-D-glucosyl cholesterol, Galactosyl Cholesterol, BbGL-1), ox-18:2 cholesterol, desmosterol, stigmasterol, lanosterol, 7-dehydrocholesterol, dihydrolanosterol, zymosterol, lathosterol, and mixtures thereof.
  • Cholesterol is highly preferred.
  • a composition comprising DOTAP and cholesterol is highly preferred, particularly when the pharmaceutical agent has an overall negative charge.
  • the phospholipid potentially present in this pharmaceutical composition is chosen from natural, purified or synthetic phospholipids, such as phospholipids extracted from egg or soy, phosphatidic acids, phosphatidylethanolamines (PE), lysophosphatidylethanolamines (LPE) or phosphatidylcholines (PC) or lysophosphatidylcholine (LPC) or phosphatidylserines (PS), or lysophosphatidylserines (LPS) or phosphatidylglycerol (PG) or lysophosphatidylglycerol (LPG) and mixtures thereof, preferably chosen from the group comprising DSPE, DSPE-PEG, DMPE, DPPC, DSPC, DMPC, DLPC
  • the fatty acid chains constituting the phospholipids can be saturated, unsaturated or polyunsaturated, provided that the parameters below of melting point and/or phase transition temperature (measured on all the lipids used) are within the ranges described.
  • the composition according to the invention can advantageously contain unsaturated fatty acids and saturated fatty acids.
  • the fatty acid chains constituting the above phospholipids have a size advantageously between 14 and 20 carbon atoms, such as 16 or 18 carbon atoms. Shorter or longer sizes are possible (in low contents, e.g. less than 20% by moles of all the lipids) provided that the parameters below of melting point and/or phase transition temperature (measured on all the lipids used) remain within the ranges described.
  • the anionic lipid when present, is chosen from phosphatidylinositol (Pis) and their phosphates (PIPs), phosphatidylserines (PS; e.g. DPPS), phosphatidic acid (PA; e.g. DPPA) and phosphatidylglycerols (e.g. DPPG or DSPG) and mixtures thereof.
  • the composition comprises a phosphatidylcholine, such as DPPC (1,2-dipalmitoylphosphatidylcholine).
  • DPPC 1,2-dipalmitoylphosphatidylcholine
  • the incorporation of phospholipids having long saturated chains e.g. between 14 and 22 carbons in size, preferably 16 or 18 carbons, i.e. palmitic acid or stearic acid) allows the increase in the rigidity of the particles, which improves their properties in the event of pulmonary administration, in particular by nebulization or by inhalation, including in the form of DPI.
  • this lipid having a polar head and two unsaturated hydrocarbon chains increases the rigidity of lipid structures and/or allows a reduction in the (relative) DOTAP content.
  • An incorporation of DPPC in a molar ratio of between 0.1 and 0.95, preferably between 0.2 and 0.90, preferably between 0.5 and 0.8, or between 0.6 and 0.7 (mole phosphatidylcholine, e.g. DPPC: total moles of lipids) relative to all lipids is preferred.
  • the lipid vehicles of the pharmaceutical composition have a molar ratio of the first lipid to the second lipid (or to the third lipid if the second lipid is absent) of between 0.3 and 20, preferably between 0.5 and 10, such as between 1 and 5.
  • the lipid vehicles of the pharmaceutical composition have a molar ratio of said at least one lipid having a functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206) to the total lipids of between 0.01 (or even 0.005 or 0.007 or 0.008 or 0.009) to 0.2, preferably between 0.02 and 0.1, preferably between 0.03 and 0.05.
  • CD206 mannose receptor
  • the molar proportion of said at least one pharmaceutical agent relative to said at least one lipid having functionalization by a ligand of the mannose receptor (CD206) is between 5 (or 10) and 150, preferably between 20 and 100, or even between 30 and 80.
  • the lipid vehicles have a molar proportion of said cationic and/or ionizable lipid relative to the pharmaceutical agent of between 30 and 0.1, preferably between 10 and 0.2, advantageously between 3 and 0.5, preferably between 2.5 and 0.8, preferentially between 2.4 and 1, particularly when the pharmaceutical agent has an overall negative charge.
  • the pharmaceutical composition has a loading rate of the pharmaceutical agent of between 0.1 and 80% relative to the mass of the lipid vehicles, preferably between 1 and 70%, preferably between 10 and 60%, preferably between 15 and 50%, such as between 20 and 40% or even between 25 and 30%.
  • the average size of the lipid vehicles is between 50 and 200 nm, preferably between 60 and 190 nm, advantageously between 70 and 180 nm, preferentially between 80 and 180 nm, preferably between 90 and 180 nm, more preferably between 100 and 180 nm, preferably between 110 and 180 nm, advantageously between 120 and 180 nm, preferentially between 120 and 170 nm, preferably between 120 and 160 nm.
  • the average size of the lipid vehicles is between 350 and 1500 nm (or even 2000 nm), preferably between 350 and 1400 nm, advantageously between 350 and 1300 nm, preferentially between 350 and 1200 nm, advantageously between 350 and 1100 nm, preferentially between 350 and 1000 nm, preferably between 350 and 900 nm, preferably between 350 and 800 nm, more particularly between 350 and 700 nm, advantageously between 350 and 600 nm, for example between 400 and 600 nm.
  • the average size of lipid vehicles is between 200 and 350 nm, preferably between 225 and 300 nm.
  • the (mean) size and mean diameter (Dh) of the lipid vehicles is (are) measured by dynamic light scattering (DLS).
  • DLS dynamic light scattering
  • the lipid vehicles have a polydispersity index of between 0.05 and 0.9, preferably of between 0.1 and 0.8, advantageously of between 0.2 and 0.75, preferentially of between 0.3 and 0.7, preferably of between 0.4 and 0.6; preferably the polydispersity index polydispersity being measured by dynamic light scattering (DLS).
  • DLS dynamic light scattering
  • a preferred instrument, both for the measurement of particle size, Pdi (see below) or zeta potential (see below; although other instruments are also used) is the Malvern Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments SA, Worcestershire, UK).
  • the polydispersity index is advantageously between 0.05 and 0.9, preferably between 0.05 and 0.8, advantageously between 0.05 and 0.7, more advantageously between 0.05 and 0.6, even more advantageously between 0.05 and 0.5, preferentially between 0.05 and 0.4, advantageously between 0.05 and 0.3, more particularly between 0.05 and 0.25, preferably between 0.05 and 0.2, for example between 0.06 and 0.2, preferentially between 0.07 and 0.2, advantageously between 0.08 and 0.2, measured by dynamic light scattering (DLS).
  • DLS dynamic light scattering
  • lipid vehicle particles of the same sizes are preferred, while for other applications, a bimodal or even multimodal distribution is preferred.
  • the lipid vehicles have a zeta potential of between -60 mV and 100 mV, preferably between -40 mV and 80 mV, advantageously between -20 mV and 60 mV, preferentially between -5 mV and 55 mV, preferably between 0 mV and 50 mV, preferably between 10 mV and 40 mV, advantageously between 10 mV and 30 mV, advantageously measured by “laser doppler electrophoresis”.
  • this measurement is carried out in an aqueous solution of NaCI at 0.009% (mass:volume).
  • said pharmaceutical agent is present in a mass proportion of between 0.1 and 80%, preferably between 1 and 70%, preferably between 5 and 60%, preferably between 10 and 50% or between 20 and 40%, relative to the mass of the lipid vehicles.
  • the composition contains at least one metal ion such as Mn 2+ , Co 2+ or Zn 2+ in order to potentiate the activity of the pharmaceutical agent.
  • this or these metal ions are incorporated in a content greater than 10 PPM (parts per million; content by weight; mass of the metal ion(s): total mass (dry) of the lipid composition), preferably at a content of between 100 PPM and 50% by mass (mass of the metal ion(s): total mass (dry) of the lipid composition), preferably between 300 PPM and 10%, preferably between 800 PPM and 1% (by mass).
  • a related aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells in liquid form such as a solution, dispersion or suspension, or in the form of a powder to be redissolved and redispersed before administration, or in the form of a dry powder for inhalation.
  • this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells in liquid form may be frozen to ensure good stability during storage or distribution of the drug.
  • This composition will then be thawed before administration and will allow the lipid vehicles to be reconstituted in an advantageous manner. This also ensures that the formulation retains maximum activity.
  • this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells comprises at least one excipient chosen from the group consisting of a buffer selected from the group comprising phosphate, sulfonate (MES, TES, HERES, MOPS, PIPES, TAPS, TAPSO), acetate, bicine buffers, and/or at least one salt selected from the group comprising inorganic salts and organic salts, and/or at least one surfactant selected from the group comprising cholic acids and their salts, phospholipids (e.g.
  • compositions for activating macrophages and/or dendritic cells are drying in the form of a powder to ensure good stability during storage, to be dissolved or redispersed for example just before administration to a patient (e.g. less than 1 hour).
  • This composition will then be redissolved or redispersed before administration in an aqueous solvent such as water or a physiological solution or buffer such as a 0.9% (mass:volume) NaCI solution or PBS, and will allow the lipid vehicles to be reconstituted in an advantageous manner. This also ensures that the formulation retains maximum activity.
  • the pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells according to the invention is in the form of a powder to ensure good stability during storage or distribution of the drug, to be dissolved or redispersed and comprises at least one bulking agent such as a polyol and/or a sugar alcohol such as sorbitol, mannitol, maltitol (sometimes considered a disaccharide) and xylitol, sugars (crystalline) including monosaccharides (glucose, arabinose), disaccharides (lactose, maltose, saccharose (sucrose), dextrose, trehalose), and polysaccharides (dextran, chitosan, starch, cellulose and its derivatives), or oligosaccharides (dextrins, cyclodextrins) and/or fatty acid salts (e.g.
  • a bulking agent such as a polyol and/or a sugar alcohol such as sorb
  • magnesium stearate or fatty acids or their derivatives.
  • esters such as lauric acid, palmitic acid, stearic acid, erucic acid, behenic acid, or a phospholipid (eg lecithin, phosphatidylcholine phosphatidylglycerol; preferably not incorporated in the lipid vehicle), triglycerides (preferably not incorporated in the lipid vehicle), sugar esters, and/or an amino acid (see above for the liquid composition) and mixtures thereof.
  • Dextran, trehalose, mannitol and lactose are preferred.
  • a bulking agent excipient will be used, such as lactose, trehalose, sucrose or mannitol.
  • the composition even in powder form, will advantageously comprise a buffer and in addition one or more of the compounds listed above, for example a surfactant.
  • the liquid form to be administered comprising the pharmaceutical composition according to the invention comprises from 50 to 99%, or even 99.9% (or 99.8%) of water (mass of water: total mass of the composition), preferably from 70 to 98% of water, or even from 80 to 95 (or 90%) % of water; in other words, the solution comprises from 1 to 50% of the pharmaceutical composition (sometimes even from 0.1 or 0.2 to 50%), preferably from 2 to 30%, or even from 5 or 10 to 20%.
  • the liquid form to be administered comprising the pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells further comprises at least one buffer selected from the group consisting of phosphate, sulfonate buffers (MES, TES, HERES, MOPS, PIPES, TAPS, TAPSO), acetate, bicine, and/or at least one salt selected from the group consisting of inorganic salts (sodium chloride, calcium carbonate, sodium or potassium phosphate), organic salts (e.g.
  • surfactant selected from the group consisting of cholic acids and their salts (taurocholate, glycocholate), phospholipids (not incorporated into the lipid vehicle), lipids (not incorporated into the lipid vehicle), sorbitan esters (e
  • compositions of activation of macrophages and/or dendritic cells are to be in the form of a dry powder for inhalation and/or intended to be administered using a dry powder inhaler.
  • This composition will have advantageous properties of dispersion and aerosolization of the powder in the air, allowing the delivery of adapted doses of powder into the patient's respiratory tract (inhalable powder). These properties include an aerodynamic size adapted to the route of administration.
  • This composition will allow the lipid vehicles to be reconstituted advantageously in physiological fluids once the powder has been deposited in the respiratory tract. This further ensures that the formulation retains maximum activity.
  • the geometric diameter (particle size) and/or the aerodynamic size for pulmonary administration is less than 5 ⁇ m, preferably between 0.5 ⁇ m and 5 ⁇ m, preferably between 1 ⁇ m and 3 ⁇ m.
  • the geometric diameter (particle size) and/or the aerodynamic size for nasal administration is greater than 5 pm, preferably between 5 pm and 120 pm, preferably between 10 pm and 60 pm, preferably between 20 and 40 pm, preferably between 20 and 30 pm.
  • a bimodal distribution of particle size and/or aerodynamic size of the pharmaceutical composition in the form of powder for inhalation is advantageous and allows nasal deposition and pulmonary deposition by nasal administration.
  • the term “aerodynamic size” is preferably understood to mean a parameter describing the aerodynamic behavior of the particles; thus, this parameter takes into account the geometric diameter (therefore the particle size), but also the density and shape of the particles.
  • the particle size (and geometric diameter) is advantageously determined by laser diffraction.
  • the aerodynamic size (and aerodynamic diameter) is advantageously determined using a impaction test (using cascade impactors) described in pharmacopoeias (such as the European Pharmacopoeia for example).
  • the pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells according to the invention is administered in the form of a dry powder and comprises at least one bulking agent such as a polyol and/or a sugar alcohol such as sorbitol, mannitol, maltitol (sometimes considered a disaccharide) and xylitol, sugars (crystalline) including monosaccharides (glucose, arabinose), disaccharides (lactose, saccharose (sucrose), maltose, dextrose, trehalose), and polysaccharides (dextran, chitosan, starch, cellulose and its derivatives), or oligosaccharides (dextrins, cyclodextrins) and/or fatty acid salts (e.g.
  • a bulking agent such as a polyol and/or a sugar alcohol such as sorbitol, mannitol, maltitol (sometimes considered
  • magnesium stearate or fatty acids or their derivatives (e.g. esters), such as lauric acid, palmitic acid, stearic acid, erucic acid, behenic acid, or a phospholipid (e.g. lecithin, phosphatidylcholine phosphatidylglycerol; preferably not incorporated in the lipid vehicle), triglycerides (preferably not incorporated in the lipid vehicle), sugar esters, and/or an amino acid (see above for the liquid composition) and mixtures thereof.
  • Dextran, saccharose (sucrose), trehalose, mannitol and lactose are preferred.
  • an excipient such as lactose, trehalose, saccharose (sucrose) or mannitol.
  • the above excipients comprise at least one lipid or fatty acid-based substance (e.g. magnesium stearate, phospholipid, sucroester). This promotes good mixing homogeneity and/or advantageous aerosolization of the solid particles. Another excipient is also advantageous for good aerodynamic properties, such as leucine.
  • some surfactants comprise fatty acids, or even phospholipids or triglycerides, which are also potential components of the lipid vehicles of the present invention. However, these surfactants are not incorporated within the structure of the lipid vehicles and are advantageously incorporated into a dry formulation of these lipid vehicles already formed.
  • the composition even in powder form, will advantageously comprise a buffer and in addition one or more of the compounds listed above, for example a surfactant.
  • drying methods are freeze-drying, spray-drying, spray-congealing or spray-chilling, spray-freeze-drying, supercritical fluid drying.
  • the inventors have obtained good results when saccharose (sucrose) is added as a protective agent, preferably in a content higher than that of the lipids, preferably in a mass ratio of at least 2:1, 3:1, 5:1, or even approximately 10:1 (weight of saccharose (sucrose): weight of all the lipids).
  • the protective agent (sucrose) is added during the lipid film hydration stage.
  • this pharmaceutical composition is administrable into the respiratory tract, preferably by nebulization and/or by pressurized inhalation and/or by dry powder inhalation and/or by gentle spray inhalation (for example carried out using the Respimat® SofMist system or an Aerogen nebulizer).
  • a related aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells present in the respiratory tract (as described above), being in a lung tumor or in a central nervous system tumor.
  • this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells is particularly advantageous in the case of metastatic cancer: either the primary tumor is located in the lung or the central nervous system and the composition according to the present invention stimulates the activity of the immune system at the level of metastases outside the lung or the central nervous system (abscopal effect), or the primary tumor is located outside the lung or the central nervous system and a metastasis is found at the level of the lung or the central nervous system: the macrophages are activated there, and the immune system is then stimulated to attack the primary tumor and/or metastases outside the lung or the central nervous system.
  • this pharmaceutical composition for activating macrophages and/or dendritic cells is particularly advantageous in combination with other therapies such as radiotherapy, chemotherapy, targeted therapies and immunotherapies, preferably inhibitors of immune brakes, preferably an anti-PDl, an anti-PD-Ll, an anti-CTLA-4 and their combinations, in cancer.
  • therapies such as radiotherapy, chemotherapy, targeted therapies and immunotherapies, preferably inhibitors of immune brakes, preferably an anti-PDl, an anti-PD-Ll, an anti-CTLA-4 and their combinations, in cancer.
  • Example 1 Lipid vehicles based on soy lecithin
  • the inventors first tested a lipid mixture of soy lecithin, cholesterol and DSPE-PEG, in a soy lecithin lipid: cholesterol: DSPE-PEG molar ratio of 8:1:0.05.
  • the lipids were first weighed in a container, then dissolved, here in a dichloromethane:methanol mixture (50:50; V:V) with stirring for 30 minutes.
  • solubilization is complete, the solvent is evaporated (rotovapor) at 30 ° C under a pressure of 16000 Pa for 1 hour, leading to the formation of the lipid film.
  • the film is then subjected to an air flow to remove traces of residual solvent.
  • aqueous solution water or buffer
  • the suspension is then extruded, here using the Liposofast LP-50 (4 extrusions through 3 filters - 1, 0.4 and 0.1 pm, at 600 psi; therefore about 4.1 10 6 Pa) to finally obtain the lipid vehicles.
  • the lipid vehicles obtained had a mean diameter (Dh) of the order of 110 to 150 nm and polydispersity indices (Pdl) of approximately 0.1 to 0.2; the zeta potential was neutral, to slightly negative, in the absence of DSPE-PEG and strongly negative in its presence (-20 to -35 mV).
  • Dh mean diameter
  • Pdl polydispersity indices
  • the sample was diluted in a 0.009% NaCl solution (mass/volume) so as to obtain attenuator and conductivity values suitable for a good measurement.
  • the inventors used a cationic lipid DOTAP (lipid 1 according to the present invention) with cholesterol (lipid 2) at a concentration of 3.9 mg/mL and 1.4 mg/mL respectively and by incorporating 100 g/mL of 2’3’-cGAMP (cGAMP). These vehicles were prepared in the absence (composition 1) or in the presence of DSPE-PEG at 0.05 mole equivalents (relative to cholesterol).
  • the inventors obtained EE% close to 100%.
  • In vitro tests of STING pathway activation in THPl-dual monocytes (THP 1 - DualTM Cells, invivogen #thpd-nfis) showed a 4-fold increased efficacy for both compositions, compared to the same concentration of free cGAMP.
  • the inventors verified in vitro that DOTAP/cholesterol-based formulations better protect cGAMP from enzymatic degradation by observing a better preservation of STING pathway activation in THPl-dual monocytes after in vitro incubation of lipid vehicles (vs free cGAMP) with recombinant human ENPP1 enzyme (#6136-EN-010, biotechne, USA).
  • composition 2 above is retained.
  • Other compositions (3-5) are developed with 0.1, 0.5 and 1 mole equivalent of DSPE-PEG.
  • the cGAMP loading rate is then reduced from 1.88% (composition 2), then 1.55%, then 0.94% and finally 0.60%.
  • Composition 3 shows properties (diameter, pdi, % encapsulation) very close to composition 2.
  • the particle diameter is reduced to 1 15 then 55 nm at compositions 4-5, while the pdi increases to about 0.26.
  • the zeta potential drops to almost 0 for composition 5.
  • EE% drops to about 89% then 62% at compositions 4-5.
  • Composition 3 still allows very good activation of the STING pathway in THPl-dual monocytes in vitro, reduced for 4, and the effect is almost completely lost for 5.
  • compositions 3 and 4 offer better protection of cGAMP against enzymatic degradation by observing a better preservation of the activation of the STING pathway in THPl-dual monocytes after in vitro incubation of lipid vehicles (vs free cGAMP) with the recombinant human ENPP1 enzyme.
  • compositions 2 and 4 (0.05 and 0.5 mole equivalents of DSPE-PEG) were used as a basis, with replacement of either all of the DSPE-PEG by DSPE-PEG-mannose (compositions 6 and 7), or half (compositions 8 and 9).
  • the diameter and the pdi index increase sharply for composition 7.
  • the pdi index also increases for composition 9.
  • the EE% remains close to 100% each time.
  • composition 6 shows a much higher activation than composition 2 on both types of macrophages (M2 and TAMs-like), as illustrated in Figure 2 for M2.
  • the inventors also observed that composition 6 administered endotracheally to healthy mice induced activation of alveolar macrophages and dendritic cells.
  • composition 10-16 In order to increase the cGAMP loading rate in the lipid vehicles, the amount of DOTAP was reduced to 1.5 mole equivalents relative to cholesterol and the amount of both lipids was reduced to 1/10 relative to composition 1 for compositions 10-16.
  • Different concentrations of cGAMP were tested from 100 (composition 10) to 150, 200, 250, 300, 360, and 720 g/mL.
  • the loading rate increased from 16.86 (composition 10) to 23.33; 28.86; 33.65; 37.83; 42.20, and 59.35%.
  • the DOTAP/cGAMP ratio decreased from 3.5/1 (composition 10) to 2.35/1; 1.76/1; 1.4/1; 1.2/1, 1/1 and 0.5/1.
  • the particle diameter increases slightly up to composition 12 (loading rate 28.86%), then strongly when the cGAMP concentration is increased.
  • the pdi is constant up to composition 12, then increases strongly.
  • the zeta potential falls beyond composition 12.
  • the EE% remains close to 100% up to this composition.
  • the activation of the STING pathway in THP1 dual monocytes remains significantly higher than for free cGAMP.
  • composition 12 the addition of DPPC to DOTAP (here, in a 2:1 molar ratio) is possible, but the cGAMP loading rate is reduced.
  • the activation of the STING pathway in dual THP1 monocytes remains significantly higher than for free cGAMP, but reduced by half at low cGAMP concentrations.
  • this kind of formulation is interesting because it is associated with increased rigidity (also reflected by an increased Tm of the lipid series), which is useful in certain modes of administration.
  • compositions 12, 13, 14, 15 and 16 100%; 59.48; 69.57; 47.83; 32.18%.
  • Example 7 use of an ionizable lipid
  • composition 14 the inventors replaced DOTAP with DODMA in the same molar proportions.
  • the protocol for preparing the lipid vehicles described above was adapted so that the rehydration buffer of the lipid film was a 0.01 M acetate buffer at pH 5.0 so as to ionize the DODMA and thus promote the trapping of cGAMP.
  • the EE% was similar to that obtained for condition 14.
  • Example 8 combining a composition with a standard treatment
  • a composition of the present invention was administered endotracheally in combination with an anti-PD1 monoclonal antibody (clone RPM1-14 #BP0146, BioXcell) to mice bearing lung tumors.
  • the treatment combination resulted in superior activity to the corresponding monotherapies.
  • Example 9 formulation with other STING agonists and other active ingredients
  • compositions (molar ratios):
  • the diameters remain within the acceptable ranges, and some compositions result in larger particles.
  • the EE% values remained high each time (at least 87%), almost always above 95% (or even 100%).
  • the inventors tested the encapsulation of rifampicin in a formulation DPPC/DOTAP/Chol/Rifampicin/DSPE-PEG-Mannose: 3/1.5/1 /0.48/0.05; The amount of entrapped rifampicin was measured by absorbance at 479 nm, leading to an EE% of 79%.
  • the values of diameter, Pdl and zeta potential were of the same order of magnitude as those previously described.
  • siRNA was encapsulated in the same type of liposome, with an EE% of 85% (measured at 260 nm) and size, Pdl and zeta potential values of the same order of magnitude as presented above.
  • the inventors have observed on macrophages (generated in vitro from murine bone marrow) that the formulations applied to immunosuppressive macrophages of type M2 induce a polarization into macrophages of type Ml, pro-inflammatory. This is the case both for 2’3’ cGAMP and for the other STING agonists of Example 9, and even that this polarization is dose-dependent, and more marked for the more powerful agonists, such as c-AlMP and, especially, c-AIMP difluor and ADU-S100.
  • the inventors then tested the activity of these encapsulated STING agonists with respect to the activation of the STING pathway in THP1-dual monocytes.
  • Encapsulated 3’3’ cGAMP, cAlMP, cAIMP-difluor and di-AMP resulted in strong to very strong activations. Only c-di-GMP resulted in very weak activation, barely higher than the unencapsulated 2’3’ cGAMP control.
  • Example 1 1 - T lymphocyte proliferation
  • T lymphocytes from freshly isolated spleen cells of Balb/c mice were stimulated using beads decorated with anti-CD3/anti-CD28 and IL-2 antibodies, with or without 2’3’cGAMP.
  • cGAMP strongly reduces CD3/CD28- and IL-2-induced T cell proliferation and this effect is dose-dependent (minor at 1.38 pM; major at 22 pM).
  • the inventors compared two compositions, one DOTAP/DPPC/Chol/cGAMP/DSPE-PEG-Man and the same one without DPPC, in nebulization tests using the Aerogen® solo and Ultra vibrating mesh nebulizers.
  • the first formulation allowed a high loading rate and biological activity, but not the second.
  • the particle diameter was not affected; here, about 140 nm, the pdi index did not increase, so to speak.
  • the second formulation was more affected with a diameter increasing from 130 to 170 nm and the pdi index from 0.12 to 0.42, clearly indicating a lack of stability of this formulation during nebulization.
  • the inventors have taken up the above formulations, with the exception of DOTAP, therefore composed of DPPC/Cholesterol/AgoSting/DSPE-PEG-Mannose.
  • Empty structures (i.e. without agonist) have a diameter of approximately 120 nm and a Zeta potential of -2.7 mV.
  • Structures incorporating MSA-2 had a slightly larger average diameter, 130 nm, and a polydispersity (pdi) of 0.2 to 0.3, depending on the experiments, for a zeta potential of -1 to -2 mV, depending on the experiments.
  • the structures incorporating SR-717 show a greater variability in size, with a diameter of either 100 nm or 160 nm and a polydispersity (pdi) of up to 0.38, for a zeta potential of -3.5 to -2.7, depending on the experiments.
  • the EE% ranged from 70 to almost 90% for MSA-2, and from 40 to 55% for SR-717.

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Abstract

Une composition pharmaceutique d'activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques comprenant des véhicules lipidiques comprenant un agent pharmaceutique, ses utilisations thérapeutiques et son procédé de fabrication.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE POUR INHALATION
Domaine technique
La présente invention concerne une composition lipidique protégeant un agent pharmaceutique et destinée à être administrée dans le tractus respiratoire à un patient.
L'art antérieur
La formulation telle que le piégeage lipidique d’agents pharmaceutiques est bien connue.
En particulier, l’utilisation à cette fin de lipides et notamment des lipides cationiques sélectionnés en fonction de la nature de l'agent pharmaceutique à piéger et du type de véhicules à obtenir est connue. Certains de ces lipides présentent, cependant, une toxicité clinique, ce qui limite les options (quantité, nature). En outre, la taille du liposome, en ce compris la dispersion des tailles, la stabilité de la composition dans les milieux biologiques, sa capacité à piéger l’agent pharmaceutique, ou à le relarguer à l’endroit voulu représentent autant de facteurs difficiles à optimiser, surtout conjointement.
Ji et al., 2023, décrivent l’utilisation de liposomes pour la potentialisation de l’activation de la voie STING (Stimulator of Interferon Genes) : cette approche a été conçue sur base de dinucléotides cycliques, qui sont protégés par la structure lipidique. Différentes formulations de liposomes ont été réalisées à base de DOTAP (l ,2,-dioléoyl-3-triméthylamonium-propane), de cholestérol et d’une phospho-éthanolamine dérivatisée par polyéthylène glycol. Des bons taux d’encapsulation ont été obtenus pour des rapports molaires DOTAP/agoniste compris entre 10 et 20 alors qu’à un ratio de 2,5, l’efficacité d’encapsulation est mauvaise, ce qui est attribué à une trop faible densité de charges positives. De même, à ces faibles ratios de concentration, la potentialisation de l’effet biologique par le liposome est perdue.
Malheureusement, le faible niveau d’encapsulation implique une administration massive de liposomes à un patient, ce qui présente des risques de toxicité, en particulier due aux grandes quantités des lipides cationiques, abondant dans les liposomes de cette étude.
D’autre part, la modification de la teneur en un composé n’est pas simple car plusieurs propriétés physico-chimiques du liposome doivent correspondre à des valeurs acceptables pour administration à un patient, telles que la taille, la dispersion de la taille et le potentiel de charge électrique ; tout en garantissant la stabilité de la formulation. En d’autres termes, dans une formulation, l’enrichissement en un composant se fait au détriment des autres, ce qui risque d’en affecter fortement l’équilibre : les inventeurs ont remarqué que cet équilibre est fonction de différents ratios de concentrations, qui peuvent être fortement affectés même suite à des adaptations des concentrations qui auraient pu sembler marginales.
Ainsi, les inventeurs ont remarqué qu’il persiste encore un besoin pour des formulations améliorées au bénéfice des patients.
Bref résumé de l'invention
Un premier aspect de la présente invention porte sur une composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques comprenant des véhicules lipidiques formés d’une série de lipides avec au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206), ces véhicules lipidiques comprenant un agent pharmaceutique choisi dans le groupe constitué de un acide nucléique, un agoniste de la protéine STING ou un antagoniste de la protéine STING, un ligand des récepteurs de type Toll, un immunomodulant, un peptide, ou un mélange de ceux-ci.
De préférence, cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques est administrable par inhalation, avantageusement par nébulisation et/ou par inhalation pressurisée et/ou par inhalation de poudre sèche et/ou par inhalation à pulvérisation douce.
Un aspect lié de la présente invention porte sur cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques pour le traitement d’un cancer, de préférence un cancer métastatique, de préférence ladite métastase étant en-dehors du poumon ou du système nerveux central et la tumeur primaire étant pulmonaire ou localisée au niveau du système nerveux central, ou ladite métastase étant pulmonaire ou localisée au niveau du système nerveux central et la tumeur primaire étant en-dehors du poumon ou du système nerveux central.
Un aspect lié de la présente invention porte sur cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques pour le traitement d’une maladie infectieuse au niveau du tractus respiratoire et / ou systémique, ou du système nerveux central.
Un aspect lié de la présente invention porte sur cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritique comprenant un acide nucléique encodant un ou plusieurs épitope(s), ou un peptide comprenant un ou plusieurs épitopes, ladite composition pharmaceutique étant pour la vaccination.
Un aspect lié de la présente invention porte sur un procédé pour l’obtention de cette composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques comprenant les étapes de solubilisation des lipides dans un solvant organique, d’évaporation du solvant de manière à former un film lipidique, de réhydratation avec une solution contenant l’agent pharmaceutique, d’homogénéisation et / ou d’extrusion (facultative)
- d’insertion d’un lipide dérivatisé avec un ligand du récepteur CD206,
- de préférence une seconde étape de mise en contact d’une solution contenant l’agent pharmaceutique avec les lipides extrudés. De préférence, lesdits lipides comprenant un lipide neutre à pH 7,0 et chargé positivement à pH 5, et ladite étape de réhydratation étant pratiquée à pH inférieur à 7,0.
Selon une variante, l’agent pharmaceutique est solubilisé avec les lipides dans le solvant organique avant l’évaporation, et non plus ajouté lors de l’étape de réhydratation. . En particulier lorsque l’agent pharmaceutique est de type non-nucléotidique, tel que MSA-2.
Brève description des dessins
La figure 1 compare la stabilité de structures lipidiques différentes.
La Figure 2 compare l’effet de la fonctionnalisation sur l’activation de macrophages.
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
Les inventeurs ont réussi à développer des formulations à base de lipides qui permettent un piégeage important d’un (ou de plusieurs) agent(s) pharmaceutique(s), tout en conservant des propriétés physico-chimiques avantageuses et compatibles avec un usage clinique.
Ainsi, un premier aspect de la présente invention porte sur une composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques comprenant des véhicules lipidiques formés d’une série de lipides avec au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) et les véhicules lipidiques comprennent au moins un agent pharmaceutique choisi dans le groupe constitué de au moins un acide nucléique, au moins un agoniste de la protéine STING ou au moins un antagoniste de la protéine STING, au moins un ligand des récepteurs de type Toll, un immunomodulant, un peptide, et leurs mélanges (sauf l’agoniste de STING avec l’antagoniste de STING), cette composition pharmaceutique étant de préférence pour inhalation.
Les véhicules lipidiques sont avantageusement choisis dans le groupe constitué des liposomes, des vésicules, des micelles, des lipoplexes, des émulsions lipidiques, des nanocristaux lipidiques, des microsphères lipidiques, des nanoparticules lipidiques, et de leurs mélanges.
Dans le contexte de la présente invention, la terminologie « par inhalation » a trait à la fois à une administration nasale (ex. pour atteindre la cavité nasale, le système nerveux central et / ou la circulation systémique ; ex. traitement d’une tumeur, thérapie génique, traitement d’une inflammation ou d’une infection) et à une administration pulmonaire (ex. pour y traiter une maladie, telle qu’une inflammation, une infection ou une tumeur), et une administration nasale pour cibler une déposition à la fois nasale et pulmonaire.
Dans le contexte de la présente invention, on entend, de préférence, par « peptide » toute chaîne d’au moins 2 acides aminés reliés par des liens peptidiques. Des peptides avantageux sont une protéine (y compris une enzyme), un antigène (un épitope), un anticorps, (ou un fragment d’anticorps, un nanobody).
Avantageusement, l’agent pharmaceutique comprend au moins un acide nucléique choisi dans le groupe constitué de l’ADN simple brin, l’ADN double brin (y compris, un ADNc), un ARN simple brin (y compris un ARNm), un ARN double brin, un siRNA, un shRNA, un miRNA, un oligonucléotide (à base d’ADN et/ou d’ARN), et leurs mélanges. Les nucléotides, les sucres ou les liens phosphodiesters peuvent avantageusement être modifiés, par exemple I’ uridine peut être substituée ou partiellement substituée par la pseudouridine, par exemple lorsque l’acide nucléique est un ARNm. Les bases adénosine ou cytosine peuvent avantageusement être méthylées, tout comme les sucres (ex. en position 2’). Des liens « peptide nucleic acids », morpholino et/ou phosphorothioate peuvent avantageusement remplacer une partie ou la totalité des liens phosphodiester. Alternativement, lorsque l’acide nucléique est pour stimuler une réponse immune et comprend des motifs CpG, la cytosine n’est avantageusement pas méthylée.
Avantageusement, l’agent pharmaceutique comprend au moins un agoniste de la protéine STING, de préférence choisi dans le groupe constitué du cGAMP, du 2’3’cGAMP, du DMXAA, du ADU-S100, du MK-1454, du MK-21 18, du GSK-3745417, du BMS-986301, du SB-1 1285, du IMSA-101 , du SYN-STING (SYNB1891 ), du Bl-l 387446, du TAK-676, du E-7766 exoSTING, du SNX281 , du HG- 381 , du DN-015089, du PC7A, du DiABZI, du Di-guanosine monophosphate cyclique (di-GMP cylique ; cyclic di-GMP), du MSA-2, du ulevostinag, du SB 1 1285, du IMSA 101 , du Dazostinag, du BMS-986301 , du Bl 1387446, avantageusement le groupe est également constitué du cAlMP, du cAIMP-di fluor, du 3’-3’-cGAMP, du c-di-AMP et du SR-717 et de leurs mélange, de préférence le 2’3’cGAMP.
Alternativement, l’agent pharmaceutique comprend au moins un antagoniste de la protéine STING choisi dans le groupe comprenant le C-l 76, le H-151 , le lnh-54, le RU.521, le H-8, le Al 51 , le SA-1 , le GSK’932, le SN-01 1 et leurs mélanges.
De préférence, la série de lipides formant les véhicules lipidiques présente une température de transition de phase (Tm) comprise entre -30°C et 100°C, de préférence entre 1 °C et 90°C, avantageusement entre 10°C et 80°C, 20°C et 70°C, par exemple entre 20°C et 60°C.
De préférence (alternativement, ou en outre), la série de lipides formant les véhicules lipidiques présente un point de fusion compris entre -30°C et 180°C, de préférence entre 1°C et 160°C, avantageusement entre 10°C et 155°C, préférentiellement entre 20°C et 150°C, par exemple entre 20°C et 80°C.
Ces propriétés physicochimiques de la série de lipides améliorent les propriétés en cas d’administration pulmonaire, notamment par nébulisation ou par inhalation, et augmentent le relargage de l’agent pharmaceutique dans les tissus ciblés et/ou le relargage cytoplasmique de l’agent pharmaceutique et/ou sa demi-vie et/ou réduisent le relargage de l’agent pharmaceutique dans les tissus non-ciblés. En particulier, les inventeurs ont noté qu’une température de transition de phase (Tm) élevée de la série de lipides, par exemple plus de 10°C, plus de 20°C, est associée à une rigidité accrue, ce qui est avantageux, au moins pour certaines formulations ou modes d’administration au patient.
Avantageusement, au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) est un phospholipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206),
Avantageusement (en outre) au moins un lipide, de préférence un phospholipide, est dérivatisé par le polyéthylène glycol (PEG).
Un PEG de taille comprise entre 500 Da et 20 kDa est préféré, par exemple entre 1 et 10 kDa, voire entre 2 et 5 kDa.
De préférence, un lipide, de préférence un phospholipide, dérivatisé par le PEG, avantageusement un DSPE-PEG, présente une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206).
Avantageusement, entre 10% et 100% (équivalent mole), de préférence entre 20 et 90%, de préférence entre 30 et 80%, voire entre 40 et 50% des lipides dérivatisés au PEG est en outre fonctionnalisé par le ligand du récepteur au mannose (CD206). Ainsi, une partie des lipides dérivatisés au PEG n’est pas nécessairement fonctionnalisée. Les inventeurs ont en effet noté que la double optimisation, la teneur en PEG et celle en ligand du récepteur CD206, était avantageusement réalisée de cette manière. Lorsque certains résidus PEG ne sont pas fonctionnalisés par le ligand du récepteur CD206, cet objet de la présente invention peut être réalisé soit sur base d’un seul lipide, de préférence un seul phospholipide, dérivatisé par le PEG, dont seule une proportion serait fonctionnalisée, soit sur base de plusieurs lipides, de préférence comprenant au moins un phospholipide, qui seraient dérivatisés au PEG, avec certaines de ces molécules dérivatisées au PEG qui ne seraient pas fonctionnalisées.
Ceci augmente la capacité au ligand de se fixer à son récepteur. En outre le PEG stabilise les véhicules lipidiques.
Avantageusement, le ligand du récepteur au mannose (CD206) est choisi dans le groupe comprenant un mannose, un fucose, une N- acétylglucosamine, une N-acétylgalactosamine, une glycoprotéine, un galactocomannane, un a-D-mannopyranoside (ex. I'a-D-Mannopyranose), l'a- L-fucopyranose-(l-3)-2-acetamido-2-deoxy-[3-D-glucopyranose, le Methyl a-D- mannopyranoside, l'a-L-fucopyranose -( 1 -2)-[3-D-galactopyranose-( 1 -4)-|3-D- glucopyranose, le Methyl 2-acetamido-2-deoxy-a-D-glucopyranoside, le (3-D- galactopyranose-(l-3)-(a-L-Fucopyranose-(l-4)) 2-acetamido-d-deoxy-[3-D- glyco pyranose, l’a-D-mannopyranose-(l-2)- a -D-mannopyranose, un polymannose (entre 4 et 50, de préférence entre 5 et 30, voire entre 6 et 20 résidus mannose) un anticorps anti-CD206, et leurs mélanges.
Dans le contexte de la présente invention, ces ligands peuvent être modifiés, par exemple la N-acétylglucosamine peut être déacétylée. Par exemple, la N-acétylglucosamine est incorporée sous forme de chitine ou de chitosan, de préférence des oligomères de chitine ou de chitosan (ex. moins de 50 monomères, moins de 40 monomères, moins de 30 monomères).
De préférence, les véhicules lipidiques sont des nanoparticules lipidiques (LNPs), de préférence des liposomes ou des nanoparticules lipidiques solides (SLN) ou des transporteurs lipidiques nanostructurés (NLC).
Dans le contexte de la présente invention, on entend de préférence par « SLN » des particules colloïdales (généralement de 50 à 500 nm de diamètre) préparées à partir de lipides solides (solides à température ambiante et à température corporelle), de tensioactifs et d'eau par des méthodes d'homogénéisation à haute vitesse ou haute pression.
Dans le contexte de la présente invention, on entend de préférence par« NLC » des SLNs contenant une fraction de lipides liquides (huile) qui provoque des imperfections structurelles des lipides solides conduisant à un arrangement cristallin moins ordonné afin d'améliorer l'encapsulation d'agent pharmaceutique. Elles sont préparées par des méthodes similaires aux SLNs.
Dans le contexte de la présente invention, on entend de préférence par « liposomes » des vésicules lipidiques sphériques (généralement de 50 à 500 nm de diamètre) composées d'une ou plusieurs bicouches lipidiques. Ils résultent de l'émulsification de lipides naturels ou synthétiques dans un milieu aqueux par des méthodes comme l'hydratation du film lipidique, la méthode d'injection d'éthanol ou par des méthodes microfluidiques.
De préférence, l’agent pharmaceutique présente une charge globale négative. En effet, les inventeurs ont réussi à incorporer de grandes quantités de ce type d’agent, même en proportion molaire du lipide cationique (ou protonable, voir ci-dessous) potentiellement présent.
Ainsi, de préférence, un lipide cationique ou protonable est incorporé lorsque l’agent pharmaceutique présente une charge globale négative.
Réciproquement, de préférence, lorsque l’agent pharmaceutique est non chargé, aucun lipide cationique n’est ajouté ou, alors en une teneur inférieure à 10% en mole (mole lipide cationique : moles totales des lipides incorporés et du cholestérol), de préférence moins de 5% en mole, de préférence moins de 4,3, 2 ou 1 % en mole.
Alternativement, le ratio molaire entre le lipide cationique éventuellement présent et l’agent pharmaceutique non chargé est inférieur à 50% (mole lipide cationique(s) : moles agent pharmaceutique non chargé), mois de 40, 30, 20, 10, voire moins de 5%.
Ainsi, la série de lipides comprend de préférence un premier lipide choisi dans le groupe comprenant un lipide cationique, un lipide neutre, un lipide anionique, un phospholipide, un triglycéride, un diglycéride, un glycérophospholipide, une sphingomyéline, un acide gras, un sel d’acide gras, et/ou un deuxième lipide choisi dans le groupe comprenant un lipide cationique , un lipide neutre, un lipide anionique, un phospholipide, un triglycéride, un diglycéride, un glycérophospholipide, une sphingomyéline, un acide gras, un sel d’acide gras, et/ou un troisième lipide choisi dans le groupe comprenant un lipide cationique, un lipide neutre, un lipide anionique, un phospholipide, un triglycéride, un diglycéride, un glycérophospholipide, une sphingomyéline, un acide gras, un sel d’acide gras.
De préférence, en particulier lorsque l’agent pharmaceutique a une charge globale négative, la composition pharmaceutique comprend un premier lipide étant un lipide cationique ayant au moins un groupement ammonium quaternaire, et/ou un lipide ayant au moins un groupement amine (secondaire ou tertiaire) protonable (et exempt de charge négative à pH 7,0). De préférence, le lipide ayant au moins un groupement ammonium quaternaire (et/ou premier lipide) est choisi dans le groupe constitué du DOTAP (le 18:1 TAP) ainsi que les autres dérivés TAP (tels que le 14:0 TAP, le 16:0 TAP, le 18:0 TAP), le DOTMA, le DDAB, le DC-Chol, le DODAP, le MVL5, le DOSPA, le GL67, le DOBAQ, les dérivés EPC (12:0 EPC, 14:0 EPC, 16:0 EPC, 18:0 EPC, 18:1 EPC, 14:1 EPC, 16:0-18.1 EPC), le DORI, le DC-6-14, et leurs mélanges. Le DOTAP est préféré.
Par amine (secondaire ou tertiaire) protonable, l’on entend de préférence dans le contexte de la présente invention, une amine qui est majoritairement sous forme neutre à pH7,0, (ex. plus de 50%, de préférence plus de 75%, voire plus de 90 ou 99% sous forme neutre à pH7,0) et majoritairement sous forme protonée à pH 5,0 (ex. plus de 50%, de préférence plus de 75%, voire plus de 90 ou 99% sous forme protonée à pH5,0).
Un exemple de lipide comprenant une amine protonable est le 1 ,2- dioleyloxy-3-dimethylaminopropane (DODMA). Il est entendu, dans le contexte de la présente invention, que d’autres chaînes lipidiques que l’acide oléique peuvent être substitués à celle-ci, par exemple l’acide palmitique ou l’acide stéarique tout en conservant les dérivés Diméthyleaminopropane (DMA ; tels que le 18:0 DMA, lel 6:0 DMA, le 14:0 DMA, le 18:1 DMA). Réciproquement (ou en addition) des substitutions au niveau du groupement aminopropane sont possibles, par exemple au niveau des groupements méthyle du DMA.
De préférence, le second lipide est un stérol et est avantageusement choisi dans le groupe constitué du cholestérol et ses esters (cholesteryl esters), et ses dérivés glycosylés (B-D-glucosyl cholesterol, Galactosyl Cholesterol, le BbGL-1 ), le ox-18:2 cholesterol, le desmosterol, le stigmasterol, le lanosterol, le 7-dehydrocholesterol, dihydrolanosterol, le zymosterol, le lathosterol, et leurs mélanges. Le cholestérol est très préféré.
Ainsi, une composition comprenant du DOTAP et du cholestérol est très préférée, en particulier lorsque l’agent pharmaceutique a une charge globale négative. De préférence, le phospholipide potentiellement présent dans cette composition pharmaceutique (second lipide en l’absence de stérol, troisième et/ou quatrième lipide) est choisi parmi les phospholipides naturels, purifiés ou synthétiques, comme les phospholipides extraits d’œuf ou de soja, les acides phosphatidiques, phosphatidyléthanolamines (PE), les lysophosphatidylethanolamines (LPE) ou les phosphatidylcholines (PC) ou les lysophosphatidylcholine (LPC) ou les phosphatidylsérines (PS), ou les lysophosphatidylsérines (LPS) ou les phosphatidylglycerol (PG) ou les lysophosphatidylglycerol (LPG) et leurs mélanges, de préférence choisi dans le groupe comprenant le DSPE, le DSPE-PEG, le DMPE, le DPPC, le DSPC, le DMPC, le DLPC, et leurs mélanges.
Dans le contexte de la présente invention, de préférence, les chaînes d’acide gras constitutives des phospholipides, mais également des lipides cationiques ou protonables peuvent être saturées, insaturées ou poly- insaturées, pour autant que les paramètres ci-dessous de point de fusion et/ou de température de transition de phase (mesurés sur l’ensemble des lipides utilisés) soient dans les plages décrites. Ainsi la composition selon l’invention peut avantageusement contenir des acides gras insaturés et des acides gras saturés.
Les chaînes d’acides gras constitutives des phospholipides ci- dessus ont une taille avantageusement comprise entre 14 et 20 atomes carbones, telle que de 16 ou 18 atomes de carbone. Des tailles plus courtes ou plus longues sont possibles (dans des faibles teneurs, ex. moins de 20% en moles de l’ensemble des lipides) pour autant que les paramètres ci-dessous de point de fusion et/ou de température de transition de phase (mesurés sur l’ensemble des lipides utilisés) restent comprises dans les plages décrites. Avantageusement, le lipide anionique, lorsqu’il est présent, est choisi parmi les phosphatidylinositole (Pis) et leurs phosphates (PIPs), les phosphatidylsérines (PS ; ex le DPPS), acide phosphatidique (PA ; ex. le DPPA) et les phosphatidylglycérols, (ex. le DPPG ou le DSPG) et les mélanges de ceux-ci.
De préférence, la composition comprend une phosphatidylcholine, tel que du DPPC (la 1 ,2-dipalmitoylphosphatidylcholine). L’incorporation de phospholipides ayant des chaînes saturées longues (ex. de taille comprise entre 14 et 22 carbones, de préférence 16 ou 18 carbones, soit l’acide palmitique ou l’acide stéarique) permet l’augmentation de la rigidité des particules, ce qui améliore leurs propriétés en cas d’administration pulmonaire, notamment par nébulisation ou par inhalation, y compris sous forme de DPI.
Les inventeurs ont remarqué que ce lipide possédant une tête polaire et deux chaînes hydrocarbonées insaturées (di-palmtoyl) augmentait la rigidité des structures lipidiques et/ou permettait une réduction de la teneur (relative) en DOTAP. Une incorporation du DPPC dans un ratio molaire compris entre 0,1 et 0,95, de préférence entre 0,2 et 0,90, de préférence entre 0,5 et 0,8, ou encore entre 0,6 et 0,7 (mole phosphatidylcholine, ex. DPPC : total des moles de lipides) par rapport à l’ensemble des lipides est préférée.
De préférence, les véhicules lipidiques de la composition pharmaceutique présentent un rapport molaire du premier lipide au deuxième lipide (ou au troisième lipide si le deuxième lipide est absent) compris entre 0,3 et 20, de préférence entre 0,5 et 10, tel qu’entre 1 et 5.
De préférence, les véhicules lipidiques de la composition pharmaceutique présentent un rapport molaire dudit au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) aux lipides totaux comprise entre 0,01 (voire même 0,005 ou 0,007 ou 0,008 ou 0,009) à 0,2, de préférence entre 0,02 et 0,1 , de préférence entre 0,03 et 0,05.
Avantageusement, la proportion molaire dudit au moins un agent pharmaceutique par rapport audit au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) est comprise entre 5 (ou 10) et 150, de préférence entre 20 et 100, voire entre 30 et 80.
Avantageusement, les véhicules lipidiques présentent une proportion molaire dudit lipide cationique et/ou ionisable par rapport à l’agent pharmaceutique comprise entre 30 et 0,1 , de préférence entre 10 et 0,2, avantageusement entre 3 et 0,5, de préférence entre 2,5 et 0,8, préférentiellement entre 2,4 et 1 , en particulier lorsque l’agent pharmaceutique a une charge globale négative.
De préférence, la composition pharmaceutique a un taux de charge de l’agent pharmaceutique compris entre 0,1 et 80% par rapport à la masse des véhicules lipidiques, de préférence entre 1 et 70%, de préférence entre 10 et 60%, de préférence entre 15 et 50%, tel qu’entre 20 et 40% ou encore entre 25 et 30%.
Avantageusement, la taille moyenne des véhicules lipidiques est comprise entre 50 et 200 nm, de préférence comprise entre 60 et 190 nm, avantageusement comprise entre 70 et 180 nm, préférentiellement comprise entre 80 et 180 nm, de manière préférée comprise entre 90 et 180 nm, de manière plus préférée comprise entre 100 et 180 nm, de préférence comprise entre 1 10 et 180 nm, avantageusement comprise entre 120 et 180 nm, préférentiellement comprise entre 120 et 170 nm, de manière préférée comprise entre 120 et 160 nm.
Alternativement la taille moyenne des véhicules lipidiques est comprise entre 350 et 1500 nm (voire 2000 nm), de préférence entre 350 et 1400 nm, avantageusement entre 350 et 1300 nm, préférentiellement entre 350 et 1200 nm, avantageusement entre 350 et 1 100 nm, préférentiellement entre 350 et 1000 nm, de préférence entre 350 et 900 nm, de manière préférée entre 350 et 800 nm, plus particulièrement entre 350 et 700 nm, de manière avantageuse entre 350 et 600 nm, par exemple entre 400 et 600 nm.
Alternativement la taille moyenne des véhicules lipidiques est comprise entre 200 et 350 nm, de préférence entre 225 et 300 nm.
De préférence la taille (moyenne) et le diamètre moyen (Dh) des véhicules lipidiques est mesurée (sont mesurés) par diffusion de la lumière dynamique (DLS).
Avantageusement, les véhicules lipidiques présentent un indice de polydispersité compris entre 0,05 et 0,9, de préférence compris entre 0,1 et 0,8, avantageusement compris entre 0,2 et 0,75, préférentiellement compris entre 0,3 et 0,7, de manière préférée comprise entre 0,4 et 0,6 ; de préférence l’indice de polydispersité étant mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Un appareillage préféré, tant pour la mesure de la taille des particules, que du Pdi (voir ci-dessous) ou du potentiel zêta (voir ci-dessous ; même si d’autres appareillages sont aussi utilisés) est le Malvern Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments SA, Worcestershire, UK).
Avantageusement, dans le contexte de la présente invention, l’indice de polydispersité est défini par la formule :
Figure imgf000016_0001
où = iots est la moyenne du diamètre des particules,
Figure imgf000016_0002
|a quantité de particules avec une taille Xi et xi étant le diamètre de la particule sphérique.
Alternativement, l’indice de polydispersité est avantageusement compris entre 0,05 et 0,9, de préférence compris entre 0,05 et 0,8, avantageusement compris entre 0,05 et 0,7, plus avantageusement compris entre 0,05 et 0,6, encore plus avantageusement compris entre 0,05 et 0,5, préférentiellement compris entre 0,05 et 0,4, avantageusement compris entre 0,05 et 0,3, plus particulièrement compris entre 0,05 et 0,25, de préférence compris entre 0,05 et 0,2, par exemple compris entre 0,06 et 0,2, préférentiellement compris entre 0,07 et 0,2, avantageusement compris entre 0,08 et 0,2, mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
En effet, selon les applications, des particules de véhicules lipidiques de mêmes tailles sont préférées, alors que pour d’autres applications, une distribution bimodale, voire multimodale est préférée.
De préférence, les véhicules lipidiques présentent un potentiel zêta compris entre -60 mV et 100 mV, de préférence entre -40 mV et 80mV, avantageusement entre -20mV et 60mV, préférentiellement entre -5 mV et 55 mV, de préférence entre 0 mV et 50mV, de préférence entre 10 mV et 40 mV, avantageusement entre 10 mV et 30 mV, mesuré avantageusement par « laser doppler electrophoresis ». De préférence, cette mesure est réalisée dans une solution aqueuse de NaCI à 0,009% (masse :volume).
Avantageusement, ledit agent pharmaceutique est présent dans une proportion massique comprise entre 0,1 et 80%, de préférence entre 1 et 70%, de préférence entre 5 et 60%, de préférence entre 10 et 50% ou entre 20 et 40%, par rapport à la masse des véhicules lipidiques.
Avantageusement, la composition contient au moins un ion métallique comme le Mn2+, le Co2+ ou le Zn2+ afin de potentialiser l’activité de l’agent pharmaceutique. De préférence ce ou ces ions métalliques sont incorporés dans une teneur supérieure à 10 PPM (partie par million ; teneur pondérale ; masse du ou des ions métalliques :masse totale (sèche) de la composition lipidique), de préférence à une teneur comprise entre 100 PPM et 50% en masse (masse du ou des ions métalliques :masse totale (sèche) de la composition lipidique), de préférence entre 300 PPM et 10%, de préférence entre 800 PPM et 1 % (en masse).
Un aspect lié de la présente invention porte sur une composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques sous forme liquide comme une solution, une dispersion ou une suspension, ou sous forme d’une poudre destinée à être redissoute et redispersée avant administration, ou sous forme de poudre sèche pour inhalation.
Avantageusement, cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques sous forme liquide pourra être congelée pour garantir une bonne stabilité lors du stockage ou de la distribution du médicament. Cette composition sera alors décongelée avant administration et permettra de reconstituer les véhicules lipidiques de manière avantageuse. Ceci assure en outre que la formulation conserve un maximum d’activité.
Avantageusement, cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques comprend au moins un excipient choisi dans le groupe constitué de un tampon choisi dans le groupe comprenant les tampons phosphate, sulfonate (MES, TES, HERES, MOPS, PIPES, TAPS, TAPSO), acétate, bicine, et/ou au moins un sel choisi dans le groupe des sels inorganiques et des sels organiques, et/ou au moins un surfactant choisi dans le groupe comprenant les acides choliques et leurs sels, les phospholipides (ex. les phosphatidylcholines ou lécithine, les phosphatidylglycerols), les lipides ou triglycérides, les esters de sorbitan, les sorbitan polyéthoxylés, les acides gras, de préférence l’acide laurique, palmitique, stéarique, érucique ou béhénique, des esters de ces acide gras, ou des dérivés de ces acides gras, tels que des sels, de préférence choisis parmi le stéarate de magnésium, le sodium stéaryl fumarate et le sodium stéaryl lactylate, sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, les composants naturel du surfactant pulmonaire comme des phospholipides ou du cholestérol; et les sucroesters (sugar esters, par exemple des esters entre le saccharose (sucrose) ou le glucose et des acide gras) et/ou au moins un acide aminé choisi dans le groupe constitué de l’histidine, de la leucine, l’isoleucine, la thréonine, la lysine, la valine, la methionine, la phenylalanine, leurs mélanges et leurs dérivés, tels que l’acésulfame K ou l’aspartame et/ou un sucre, de préférence choisi dans le groupe des monosaccharides (tels que le glucose ou l’arabinose), des disaccharides (tels que le lactose, le maltose, le saccharose (sucrose), le dextrose, le trehalose, le maltitol et leurs mélanges ou un agent de charge choisi parmi les polyols tels que le sorbitol, le mannitol et le xylitol), des polysaccharides (tels que le dextran, le chitosan, l’amidon, la cellulose, and ses dérivés), des oligosaccharides (tels que la cyclodextrine et les dextrines).
Une option avantageuse pour la composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques est le séchage sous forme d’une poudre pour garantir une bonne stabilité lors du stockage, à dissoudre ou redisperser par exemple juste avant l’administration à un patient (ex. moins de 1 heure). Cette composition sera alors redissoute ou redispersée avant administration dans un solvant aqueux tel que de l’eau ou une solution ou un tampon physiologique comme une solution de NaCI 0.9% (masse :volume) ou du PBS, et permettra de reconstituer les véhicules lipidiques de manière avantageuse. Ceci assure en outre que la formulation conserve un maximum d’activité.
Alternativement ou en outre, la composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’invention est sous forme d’une poudre pour garantir une bonne stabilité lors du stockage ou de la distribution du médicament, à dissoudre ou redisperser et comprend au moins un agent de charge tel qu’un polyol et/ou un alcool de sucre (« sugar alcohol » en anglais) tels que le sorbitol, le mannitol, le maltitol (parfois considéré comme un disaccharide) et le xylitol, des sucres (cristallins) en ce compris les monosaccharides (glucose, arabinose), les disaccharides (lactose, maltose, saccharose (sucrose), dextrose, tréhalose), et les polysaccharides (dextran, chitosan, amidon, cellulose et ses dérivés), ou encore les oligosaccharides (dextrines, cyclodextrines) et/ou des sels d’acide gras (ex. stéarate de magnésium) ou des acides gras ou leurs dérivés (ex. esters), tels que l’acide laurique, l’acide palmitique, l’acide stéarique, l’acide érucique, l’acide béhénique, ou un phospholipide (ex. lécitine, phosphatidylcholine phosphatidilglycérol ; de préférence non incorporé dans le véhicule lipidique), des triglycérides (de préférence non incorporées dans le véhicule lipidique), des esters de sucres, et/ou un acide aminé (cfr ci- dessus pour la composition liquide) et leurs mélanges. Le dextran, le tréhalose, le mannitol et le lactose sont préférés. Avantageusement, un excipient agent de charge sera utilisé, comme le lactose, le tréhalose, le saccharose (sucrose) ou le mannitol. Dans ce cas, la composition, même sous forme de poudre comprendra avantageusement un tampon et en plus un ou plusieurs des composés listés ci- dessus, par exemple un surfactant.
De préférence la forme liquide à administrer comprenant la composition pharmaceutique selon l’invention comprend de 50 à 99%, voire même à 99,9% (ou 99,8%) en eau (masse de l’eau : masse totale de la composition), de préférence de 70 à 98% d’eau, voire de 80 à 95 (ou 90%) % d’eau ; en d’autres termes, la solution comprend de 1 à 50% de la composition pharmaceutique (parfois même de 0,1 ou 0,2 à 50%), de préférence de 2 à 30%, voire de 5 ou 10 à 20%.
La forme liquide à administrer comprenant la composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques comprend en outre au moins un tampon choisi dans le groupe constitué des tampons phosphate, sulfonate (MES, TES, HERES, MOPS, PIPES, TAPS, TAPSO), acétate, bicine, et/ou au moins un sel choisi dans le groupe des sels inorganiques (chlorure de sodium, carbonate de calcium, phosphate de sodium ou de potassium), des sels organiques (ex. lactate de sodium, citrate de potassium), et/ou au moins un surfactant choisi dans le groupe constitué des acides choliques et leurs sels (taurocholate, glycocholate), des phospholipides (non incorporés dans le véhicule lipidique), des lipides (non incorporés dans le véhicule lipidique), des esters de sorbitan (ex. SPAN 85), le sorbitan polyéthoxylé (ex. Tween®80) et/ou au moins un acide aminé choisi dans le groupe de l’histidine, de la leucine, l’isoleucine, la thréonine, la lysine, la valine, la methionine, la phenylalanine, leurs mélanges et leurs dérivés, tels que l’acésulfame K ou l’aspartame et leurs mélanges.
Une autre option avantageuse pour la composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques est d’être sous forme d’une poudre sèche pour inhalation et/ou destinée à être administrée à l’aide d’un inhalateur à poudre sèche. Cette composition présentera des propriétés avantageuses de dispersion et d’aérosolisation de la poudre dans l’air, permettant la délivrance de doses adaptées de poudre dans le tractus respiratoire du patient (poudre inhalable). Ces propriétés sont notamment une taille aérodynamique adapté à la voie d’administration. Cette composition permettra de reconstituer les véhicules lipidiques de manière avantageuse dans les fluides physiologiques une fois la poudre déposée dans le tractus respiratoire. Ceci assure en outre que la formulation conserve un maximum d’activité.
De préférence le diamètre géométrique (granulométrie) et/ou la taille aérodynamique pour une administration pulmonaire est inférieur à 5 m, de préférence est compris entre 0,5 m et 5 pm, de préférence entre 1 pm et 3 pm.
De préférence le diamètre géométrique (granulométrie) et / ou la taille aérodynamique pour une administration nasale est supérieur à 5 pm, de préférence compris entre 5 pm et 120 pm, de préférence compris entre 10 pm et 60 pm, de préférence compris entre 20 et 40 pm, de préférence entre 20 et 30 pm.
Ainsi, une distribution bimodale de la granulométrie et/ou de taille aérodynamique de la composition pharmaceutique sous forme de poudre pour inhalation est avantageuse et permet une déposition nasale et une déposition pulmonaire par administration nasale.
Dans le contexte de la présente invention, l’on entend de préférence par « taille aérodynamique » un paramètre décrivant le comportement aérodynamique des particules ; ainsi, ce paramètre tient compte du diamètre géométrique (donc de la granulométrie), mais aussi de la densité et de la forme des particules.
La granulométrie (et le diamètre géométrique) est avantageusement déterminée par diffraction laser. La taille aérodynamique (et le diamètre aérodynamique) est avantageusement déterminée à l’aide d’un test d’impaction (à l’aide d’impacteurs en cascade) décrit dans les pharmacopées (comme la pharmacopée européenne par exemple).
Alternativement ou en outre, la composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’invention est administrée sous forme de poudre sèche et comprend au moins un agent de charge tel qu’un polyol et/ou un alcool de sucre (« sugar alcohol » en anglais) tels que le sorbitol, le mannitol, le maltitol (parfois considéré comme un disaccharide) et le xylitol, des sucres (cristallins) en ce compris les monosaccharides (glucose, arabinose), les disaccharides (lactose, saccharose (sucrose), maltose, dextrose, tréhalose), et les polysaccharides (dextran, chitosan, amidon, cellulose et ses dérivés), ou encore les oligosaccharides (dextrines, cyclodextrines) et/ou des sels d’acide gras (ex. stéarate de magnésium) ou des acides gras ou leurs dérivés (ex. esters), tels que l’acide laurique, l’acide palmitique, l’acide stéarique, l’acide érucique, l’acide béhénique, ou un phospholipide (ex. lécitine, phosphatidylcholine phosphatidilglycérol ; de préférence non incorporé dans le véhicule lipidique), des triglycérides (de préférence non incorporées dans le véhicule lipidique), des esters de sucres, et/ou un acide aminé (cfr ci- dessus pour la composition liquide) et leurs mélanges. Le dextran, le saccharose (sucrose), le tréhalose, le mannitol et le lactose sont préférés.
Avantageusement, un excipient (agent de charge) sera utilisé, comme le lactose, le tréhalose, le saccharose (sucrose) ou le mannitol.
Avantageusement, lorsque la composition pharmaceutique est destinée à une administration au patient sous forme de poudre sèche pour inhalation, les excipients ci-dessus comprennent au moins une substance lipidique ou à base d’acide gras (ex. stéarate de magnésium, phospholipide, sucroester). Ceci favorise une bonne homogénéité de mélange et / ou une aérosolisation avantageuse des particules solides. Un autre excipient est également avantageux pour de bonnes propriétés aérodynamiques, comme la leucine. Il est à noter que certains surfactants comprennent des acides gras, voire des phospholipides ou des triglycérides, qui sont aussi des composants potentiels des véhicules lipidiques de la présente invention. Cependant, ces surfactants ne sont pas incorporés au sein de la structure des véhicules lipidiques et sont avantageusement incorporés à une formulation sèche de ces véhicules lipidiques déjà formés. Dans ce cas, la composition, même sous forme de poudre, comprendra avantageusement un tampon et en plus un ou plusieurs des composés listés ci-dessus, par exemple un surfactant.
Des exemples de méthodes de séchage sont la lyophilisation (« freeze-drying »), l’atomisation par la chaleur (« spray-drying »), le spray- congealing ou spray-chilling, le spray-freeze-drying, le supercritical fluid drying.
Dans le cas de la lyophilisation avec les véhicules lipidiques selon l’invention, les inventeurs ont obtenu de bons résultats lorsque le saccharose (sucrose) est ajouté comme agent protecteur, de préférence en une teneur supérieure à celle des lipides, de préférence en un ratio massique d’au moins 2 :1 , 3 :1 , 5 :1 , voire d’environ 10 :1 (poids du saccharose (sucrose) : poids de l’ensemble des lipides).
Avantageusement l’agent protecteur (saccharose ; sucrose) est ajouté lors de l’étape de l’hydratation du film lipidique.
Avantageusement, cette composition pharmaceutique est administrable dans le tractus respiratoire, de préférence par nébulisation et/ou par inhalation pressurisée et/ou par inhalation de poudre sèche et/ou par inhalation à pulvérisation douce (par exemple réalisée au moyen du système Respimat® SofMist ou un nébuliseur Aerogen).
Un aspect associé de la présente invention est une composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques présents dans le tractus respiratoire (telle que décrite ci-dessus), étant dans une tumeur du poumon ou dans une tumeur du système nerveux central.
En outre, selon un autre aspect associé de la présente invention, cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques est particulièrement avantageuse dans le cas d’un cancer métastatique : soit la tumeur primaire est située dans le poumon ou le système nerveux central et la composition selon la présente invention stimule l’activité du système immunitaire au niveau des métastases en dehors du poumon ou du système nerveux central (effet abscopal), soit la tumeur primaire est située en dehors du poumon ou du système nerveux central et une métastase se retrouve au niveau du poumon ou du système nerveux central : les macrophages y sont activés, et le système immunitaire est ensuite stimulé pour attaquer la tumeur primaire et/ou des métastases en dehors du poumon ou du système nerveux central.
En outre, selon un autre aspect associé de la présente invention, cette composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques est particulièrement avantageuse en combinaison avec d’autres thérapies comme la radiothérapie, la chimiothérapie, les thérapies ciblées et les immunothérapies, de préférence les inhibiteurs des freins immunitaires, de préférence un anti-PDl , un anti-PD-Ll , un anti-CTLA-4 et leurs combinaisons, dans le cancer.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront tirés de la description non limitative qui suit, et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
Exe m pies. -
Il est bien entendu que la présente invention n’est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées. Exemple 1 - véhicules lipidiques à base de lécithine de soja
Les inventeurs ont tout d’abord testé un mélangé lipidique de lécithine de soja, le cholestérol et DSPE-PEG, dans un ratio molaire lipide lécithine de soja :cholestérol : DSPE-PEG de 8:1 :0.05. En résumé, les lipides ont tout d’abord été pesés dans un récipient, puis mis en solution, ici dans un mélange dichlorométhane :méthanol (50 :50 ; V :V) sous agitation pendant 30 minutes. Lorsque la solubilisation est complète, le solvant est évaporé (rotovapor) à 30°C sous une pression de 16000 Pa pendant 1 heure, menant à la formation du film lipidique. Le film est ensuite soumis à un flux d’air pour retirer les traces de solvant résiduel. Une solution aqueuse (eau ou tampon) est alors ajoutée au film et le mélange est placé sous agitation pendant environ 30 minutes à une température supérieure à la température de transition de phase la plus haute caractérisant les lipides du mélange. La suspension est ensuite extrudée, ici en utilisant le Liposofast LP-50 (4 extrusions à travers de 3 filtres - 1 , 0,4 et 0,1 pm, at 600 psi ; donc environ 4,1 106 Pa) pour obtenir enfin les véhicules lipidiques.
Les véhicules lipidiques obtenues avaient un diamètre moyen (Dh) de l’ordre de 1 10 à 150 nm et des indices de polydispersité (Pdl) d’environ 0,1 à 0,2 ; le potentiel zêta était neutre, à légèrement négatif, en absence de DSPE- PEG et fortement négatif en sa présence (-20 à -35 mV). Pour une mesure de potentiel zêta, l’échantillon a été dilué dans une solution de 0.009% NaCI (masse/volume) de manière à obtenir des valeurs d’atténuateur et de conductivité adaptées à une bonne mesure.
Cette formulation a été reprise pour le piégeage d’un agent pharmaceutique, ici, le 2’3’-cGAMP (cGAMP) avec des efficacités de piégeage (« entrapment efficiency, EE% » de 30 à 45% obtenues. Les meilleurs résultats ont été obtenus pour les compositions impliquant un ratio cGAMP / lipides plus élevé (0,08 mole/mole de lipide). Ces formulations, en plus de présenter des valeurs basses d’EE%, n’ont pas montré d’amélioration d’activation de la voie STING dans des monocytes THPl-dual (THPl-Dual™ Cells, invivogen #thpd-nfis) in vitro. Exemple 2 - véhicules lipidiques à base de DOTAP/cholestérol
Les inventeurs ont utilisé un lipide cationique DOTAP (lipide 1 selon la présente invention) avec le cholestérol (lipide 2) à une concentration de respectivement 3.9 mg/mL et 1 .4 mg/mL et en y incorporant 100 g/mL de 2’3’- cGAMP (cGAMP). Ces véhicules ont été préparés en absence (composition 1 ) ou en présence de DSPE-PEG à 0.05 équivalent moles (par rapport au cholestérol).
Les caractéristiques physiques sont reprises au Tableau ci-dessous :
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000026_0003
En outre, les inventeurs ont obtenu des EE% proche de 100%. Des tests in vitro d’activation de la voie STING dans des monocytes THPl-dual (THP 1 - Dual™ Cells, invivogen #thpd-nfis) ont montré une efficacité accrue de 4 fois pour les deux compositions, par rapport à la même concentration de cGAMP libre. De même, les inventeurs ont vérifié in vitro que les formulations à base de DOTAP/cholestérol protègent mieux le cGAMP de la dégradation enzymatique par l’observation d’une meilleure conservation de l’activation de la voie STING dans des monocytes THPl-dual après incubation in vitro des véhicules lipidiques (vs cGAMP libre) avec l’enzyme ENPP1 humaine recombinante (#6136-EN-010, biotechne, USA).
Bien que l’addition du DSPE-PEG ait affecté négativement l’indice de polydispersité pdi, les inventeurs notent que cette addition n’est pas trop problématique.
Exemple 3 - effet de l’addition du DSPE-PEG
Les inventeurs ont ensuite testé différentes proportions en DSPE-PEG (Figure 1 ). La composition 2 ci-dessus est conservée. D’autres compositions (3-5) sont développées avec 0,1 , 0,5 et 1 équivalent moles en DSPE-PEG. Le taux de charge en cGAMP est alors réduit à partir de 1 ,88% (composition 2), puis 1 ,55%, puis 0,94% et enfin 0,60%. La composition 3 montre des propriétés (diamètre, pdi, % encapsulation) très proches de la composition 2. Le diamètre des particules est réduit à 1 15 puis 55 nm aux compositions 4-5, alors que le pdi augmente à environ 0.26. Le potentiel zêta chute à presque 0 pour la composition 5. EE% chute à environ 89% puis 62% aux compositions 4-5. La composition 3 permet encore une très bonne activation de la voie STING dans des monocytes THPl-dual in vitro, réduite pour la 4, et l’effet est quasiment totalement perdu pour la 5.
Par contre, les compositions 3 et 4 offrent une meilleure protection du cGAMP face à la dégradation enzymatique par l’observation d’une meilleure conservation de l’activation de la voie STING dans des monocytes THPl-dual après incubation in vitro des véhicules lipidiques (vs cGAMP libre) avec l’enzyme ENPP1 humaine recombinante.
Exemple 4 - fonctionnalisation
Les compositions 2 et 4 (0,05 et 0,5 équivalent moles en DSPE-PEG) ont servi de base, avec remplacement soit de la totalité du DSPE-PEG par le DSPE-PEG-mannose (compositions 6 et 7), soit de la moitié (compositions 8 et 9).
Le diamètre et l’indice pdi augmentent fortement pour la composition 7. L’indice pdi augmente également pour la composition 9. L’EE% reste à chaque fois proche de 100%.
Les inventeurs ont ensuite réalisé un test d’activation de macrophages immunosuppresseurs (type M2, différencié avec de l’IL-10 et IL-4) ou des macrophages associés aux tumeurs (TAMs-like) différenciés à partir de surnageant de culture de cellules cancéreuses LLC1 (Lewis lung carcinoma, ATCC CRL1642) obtenus selon un protocole similaire à celui décrit dans Kwart et al. (Cell Reports 41 (2022) 1 1 1769), à partir de macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDMs). La composition 6 montre une activation bien supérieure à la composition 2 sur les deux types de macrophages (M2 et TAMs-like), comme l’illustre la Figure 2 pour les M2. Les inventeurs ont également observé que la composition 6 administrée par voie endotrachéale à des souris saines induisait une activation des macrophages alvéolaires et des cellules dendritiques. 16
Exemple 5 - augmentation du taux de charge
Afin d’augmenter le taux de charge en cGAMP dans les véhicules lipidiques, la quantité de DOTAP a été réduite à 1 .5 équivalent mole par rapport au cholestérol et de la quantité des 2 lipides a été réduite à 1 /10 par rapport à la composition 1 pour les compositions 10-16. Différentes concentrations de cGAMP ont été testées de 100 (composition 10) à 150, 200, 250, 300, 360, et 720 g/mL Le taux de charge augmente de 16,86 (composition 10) à 23,33 ; 28,86 ; 33,65 ; 37,83 ; 42,20 et 59,35%. Le ratio DOTAP/cGAMP diminue de 3,5/1 (composition 10) à 2,35/1 ; 1 ,76/1 ; 1 ,4/1 ; 1 ,2/1 , 1 /1 et 0,5/1. Le diamètre des particules augmente légèrement jusqu’à la composition 12 (taux charge 28,86%), puis fortement lorsque la concentration en cGAMP est augmentée. Le pdi est constant jusqu’à la composition 12, puis augmente fortement. Réciproquement, le potentiel zêta chute au-delà de la composition 12. L’EE% reste proche de 100% jusqu’à cette composition. L’activation de la voie STING dans des monocytes THP1 dual reste nettement plus élevée que pour le cGAMP libre.
Partant de la composition 12, l’addition de DPPC au DOTAP (ici, dans un ratio molaire 2 :1 ) est possible, mais le taux de charge en cGAMP est réduit. L’activation de la voie STING dans des monocytes THP1 dual reste nettement plus élevée que pour le cGAMP libre, mais réduite de moitié aux faibles concentrations en cGAMP. Cependant, ce genre de formulation est intéressante car elle est associée à une rigidité accrue (aussi reflétée par une Tm de la série de lipides accrue), ce qui est utile dans certains modes d’administration.
Exemple 6 - amélioration des propriétés de rigidité des formulations
Les inventeurs ont observé un relargage instantané du cGAMP piégé dans des compositions lorsque ces formulations étaient diluées dans un grand volume de PBS. Afin de surmonter cette limite, les inventeurs ont préparé des nouvelles formulations en rajoutant un excipient avec une Tm plus élevée (DPPC). Partant de la composition 12, le DPPC a été ajouté à 3, 5, 8 et 10 équivalent mole par rapport au cholestérol pour les compositions 13, 14, 15 et 16, respectivement. Les résultats ont démontré que l’augmentation de la quantité du DPPC diminue la fraction de cGAMP relargué instantanément après une dilution 200X dans du PBS. Compositions 12, 13, 14, 15 et 16 : 100% ; 59.48 ; 69.57 ; 47.83 ; 32.18%.
Exemple 7 - utilisation d’un lipide ionisable
Partant de la composition 14, les inventeurs ont remplacés le DOTAP par le DODMA dans les mêmes proportions molaires. Le protocole de préparation des véhicules lipidiques décrits plus hauts a été adapté de sorte que le tampon de réhydratation du film lipidique était un tampon acétate 0.01 M à pH 5.0 de manière à ioniser le DODMA et ainsi favoriser le piégeage du cGAMP. L’EE% était semblable à celui obtenu pour la condition 14.
Exemple 8 - combinaison d’une composition avec un traitement standard
Une composition de la présente invention a été administrée par voie endotrachéale en combinaison avec un anticorps monoclonal anti-PDl (clone RPM1-14 #BP0146, BioXcell) à des souris porteuses de tumeurs pulmonaires. La combinaison de traitement a mené à une activité supérieure aux monothérapies correspondantes.
Exemple 9 - formulation avec d’autres agonistes de STING et d’autres principes actifs
Les inventeurs ont réalisé plusieurs formulations selon les compositions suivantes (ratios molaires) :
DPPC/DOTAP/AgoSting/cholestérol/DSPE-PEG-Mannose.
Figure imgf000030_0001
Pour chacune des compositions, les diamètres restent dans les plages de valeurs acceptables, et certaines compositions aboutissent à des particules plus grosses.
Les valeurs d’EE% restaient à chaque fois élevées (au minimum 87%), presque à chaque fois supérieure à 95% (voire même de 100%).
En outre, les inventeurs ont testé l’encapsulation de la rifampicine dans une formulation DPPC/DOTAP/Chol/Rifampicine/DSPE-PEG-Mannose : 3/1 ,5/1 /0,48/0,05 ; La quantité de rifampicine piégée a été mesurée par absorbance à 479 nm, menant à un EE% de 79%. Les valeurs de diamètre, Pdl et potentiel zêta étaient du même ordre de grandeur que celles décrites précédemment.
De même un siRNA a été encapsulé dans le même type de liposome, avec un EE% de 85% (mesurée à 260 nm) et des valeurs de taille, Pdl et potentiel zêta du même ordre de grandeur que présentés ci-dessus. Exemple 10 - activité d’agonistes STING
Les inventeurs ont remarqué sur macrophages (générés in vitro à partir de moelle osseuse murine) que les formulations appliquées sur des macrophages immunosuppressifs de type M2 induisent une polarisation en macrophages de type Ml , pro-inflammatoires. Ceci tant pour le 2’3’ cGAMP que pour les autres agonistes de STING de l'Exemple 9, et même que cette polarisation est dépendante de la dose, et plus marquée pour les agonistes plus puissants, tel que le c-AlMP et, surtout, le c-AIMP difluor et l’ADU-S100. Cette polarisation des macrophages immunosuppressifs de type M2 en macrophages pro-inflammatoires de type Ml a également été observée dans les poumons de souris porteuses de tumeurs pulmonaires M109 suite à l’administration par voie pulmonaire d’une formulation de nanoparticule contenant le 2’3’cGAMP.
Les inventeurs ont ensuite testé l’activité de ces agonistes de STING encapsulés quant à l’activation de la voie STING dans des monocytes THP1 -dual.
Les 3’3’ CGAMP, cAlMP, cAIMP-difluor et le di-AMP, encapsulés, ont abouti à des activations fortes, voire très fortes. Seule le c-di-GMP n’a permis qu’une activation très faible, à peine supérieure au contrôle 2’3’cGAMP non enca psulé.
Exemple 1 1 - prolifération des lymphocytes T
Des lymphocytes T originaires de cellules de la rate fraîchement isolées de souris Balb/c ont été stimulés au moyen de billes décorées par des anticorps anti-CD3/anti CD28 et IL-2, avec ou sans le 2’3’cGAMP.
Le cGAMP réduit fortement la prolifération des lymphocytes T induite par le CD3/CD28 et l’ IL- 2 et cet effet est dépendant de la dose (mineur à 1 ,38 pM ; majeur à 22 pM).
Exemple 12 - Adaptation de la formulation.
Pour tenter de contrer l’effet délétère sur la prolifération des lymphocytes T, les inventeurs ont eu l’intuition, puis testé un développement: une taille plus grande, ici d’environ 250 nm (via adaptation de la porosité du filtre de l’extrusion, porosité de 0,4 pm. L’effet éventuel a été vérifié au niveau de la prolifération des lymphocytes CD4+ et des lymphocytes CD8+.
La formulation de plus grande taille a donné les meilleurs résultats avec environ la même viabilité que la condition non traitée aux concentrations en cGAMP testées, de 0,34 ; 1 ,38 et 5,5 M et 22 pM.
Exemple 13 - tests de nébulisation
Les inventeurs ont comparé deux compositions, une DOTAP/DPPC/Chol/cGAMP/DSPE-PEG-Man et la même sans DPPC, dans des tests de nébulisation en utilisant les nébuliseurs à tamis vibrant Aerogen® solo et Ultra. La première formulation a permis un haut taux de charge et une activité biologique, mais pas la seconde. Plus en détail, en présence de DPPC, le diamètre des particules n’était pas affecté ; ici, environ 140 nm, l’indice pdi n’a, pour ainsi dire, pas augmenté. La seconde formulation a été plus affectée avec un diamètre augmentant de 130 à 170 nm et l’indice pdi de 0,12 à 0,42, indiquant clairement un manque de stabilité de cette formulation lors de la nébulisation.
Ces tests de nébulisation ont monté que, dans ces conditions, où les structures sont préservées, les liposomes pourront être administrés de manière efficace dans les poumons profonds, avec des tailles de gouttelettes observées dans le range recherché (diamètre moyen D4,3 de 5-6 pm) et des profils de déposition dans l’impacteur à cascade type next generation impactor NGI) acceptables.
Exemple 14 - autres formulations
Les inventeurs ont repris les formulations ci-dessus, à l’exception du DOTAP, composées donc de DPPC/Cholesterol/AgoSting/DSPE-PEG-Mannose.
Deux agonistes de STING non nucléotidiques et de charge neutre ont été encapsulés, SR-717 et MSA-2.
Les structures vides (càd sans agoniste) ont un diamètre d’environ 120 nm et un potentiel Zêta de -2,7 mV. Les structures ayant incorporé MSA-2 avaient un diamètre moyen légèrement supérieur, 130 nm et une polydispersité (pdi) de 0,2 à 0,3, selon les expériences, pour un potentiel zêta de -1 à -2 mV, selon les expériences. Les structures ayant incorporé SR-717 montrent une variabilité plus grande de taille, avec un diamètre, soit de 100 nm, soit de 160 nm et une polydispersité (pdi) pouvant aller jusqu’à 0,38, pour un potentiel zêta de - 3,5 à -2,7, selon les expériences. L’EE% variait de 70 à presque 90% pour MSA-2, et de 40 à 55% pour SR-717.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques comprenant des véhicules lipidiques formés d’une série de lipides avec au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206), lesdits véhicules lipidiques étant choisis dans le groupe constitué des liposomes, des vésicules, des micelles, des lipoplexes, des émulsions lipidiques, des nanocristaux lipidiques, des microsphères lipidiques, des nanoparticules lipidiques, et de leurs mélanges, lesdits véhicules lipidiques comprenant un agent pharmaceutique choisi dans le groupe constitué de un acide nucléique, un agoniste de la protéine STING ou un antagoniste de la protéine STING, un ligand des récepteurs de type Toll, un immunomodulant, un peptide, ou un mélange de ceux-ci.
2. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon la revendication 1 , dans laquelle la série de lipides formant les véhicules lipidiques présente une température de transition de phase (Tm) comprise entre 10°C et 80°C, de préférence entre 20°C et 60°C.
3. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon la revendication 1 ou 2 étant pour inhalation.
4. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les véhicules lipidiques sont des nanoparticules lipidiques (LNPs), de préférence des liposomes ou des nanoparticules lipidiques solides (SLN) ou des transporteurs lipidiques nanostructurés (NLC).
5. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’agent pharmaceutique présente une charge globale négative.
6. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la série de lipides comprend un premier lipide étant cationique et/ou ionisable.
7. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon la revendication 6, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent une proportion molaire dudit lipide cationique et/ou ionisable par rapport à l’agent pharmaceutique comprise entre 30 et 0,1 , de préférence entre 10 et 0,2, avantageusement entre 3 et 0,5, de préférence entre 2,5 et 0,8, préférentiellement entre 2,4 et 1 .
8. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle la série de lipides comprend un second lipide choisi dans le groupe des stérols, un phospholipide, un triglycéride, un diglycéride, un glycérophospholipide et une sphingomyéline, de préférence un stérol ou un phospholipide, de manière très préférée un stérol.
9. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon la revendication 8, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent un rapport molaire du premier lipide au deuxième lipide compris entre 0,3 et 20, de préférence entre 0,5 et 10, de préférence entre 1 et 5 (moles du premier lipide : moles du second lipide), ledit second lipide étant de préférence un stérol, tel que le cholestérol et/ou un phospholipide comme le DPPC et/ou le DSPC.
10. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) est un phospholipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206), de préférence un phopholipide-PEG présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206), avantageusement un DSPE-PEG présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206).
1 1. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit ligand du récepteur au mannose (CD206) est choisi dans le groupe comprenant un mannose, un fucose, une N-acétylglucosamine, une N-acétylgalactosamine, une glycoprotéine, un galactocomannane, un a-D-mannopyranoside, un polymannose, un anticorps anti-CD206, et leurs mélanges.
12. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent une proportion molaire dudit au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) aux lipides totaux comprise entre 0,01 à 0,2, de préférence comprise entre 0,02 et 0,1 , de préférence entre 0,03 et 0,05.
13. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent une proportion molaire dudit au moins un agent pharmaceutique par rapport audit au moins un lipide présentant une fonctionnalisation par un ligand du récepteur au mannose (CD206) comprise entre 5 et 150.
14. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit agent pharmaceutique est présent dans un taux de charge compris entre 0,1 et 80% par rapport à la masse des véhicules lipidiques, de préférence entre 1 et 70%, de préférence entre 10 et 60%, de préférence entre 15 et 50%, tel qu’entre 20 et 40% ou encore entre 25 et
15. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent une taille moyenne, mesurée par diffusion de la lumière dynamique (DLS), comprise entre 50 et 200 nm, de préférence comprise entre 60 et 190 nm, avantageusement comprise entre 70 et 180 nm, préférentiellement comprise entre 80 et 180 nm, de manière préférée comprise entre 90 et 180 nm, de manière plus préférée comprise entre 100 et 180 nm, de préférence comprise entre 1 10 et 180 nm, avantageusement comprise entre 120 et 180 nm, préférentiellement comprise entre 120 et 170 nm, de manière préférée comprise entre 120 et 160 nm.
16. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes 1 à 14, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent une taille moyenne, mesurée par diffusion de la lumière dynamique (DLS), comprise entre 350 et 1500 nm, de préférence entre 350 et 1400 nm, avantageusement entre 350 et 1300 nm, préférentiellement entre 350 et 1200 nm, avantageusement entre 350 et 1 100 nm, préférentiellement entre 350 et 1000 nm, de préférence entre 350 et 900 nm, de manière préférée entre 350 et 800 nm, plus particulièrement entre 350 et 700 nm, de manière avantageuse entre 350 et 600 nm, par exemple entre 400 et 600 nm.
17. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes 1 à 14, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent une taille moyenne, mesurée par diffusion de la lumière dynamique (DLS), comprise entre 200 et 350 nm, de préférence entre 225 et 300 nm.
18. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un ion métallique, de préférence choisi parmi le Mn2+, le Co2+ ou le Zn2+, et/ou à une teneur d’au moins 10 PPM.
19. Composition pharmaceutique d’activation des macrophage et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent un indice de polydispersité compris entre 0,05 et 0,9, de préférence compris entre 0.1 et 0.8, avantageusement compris entre 0.2 et 0.75, préférentiellement compris entre 0.3 et 0.7, de manière préférée comprise entre 0.4 et 0.6 mesuré par diffusion de la lumière dynamique (DLS), de préférence cet indice de polydispersité étant défini par la formule :
Figure imgf000038_0001
où = J°LS est la moyenne du diamètre des particules,
Figure imgf000038_0002
la quantité de particules avec une taille Xi et xi étant le diamètre de la particule sphérique.
20. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les véhicules lipidiques présentent un potentiel zêta compris entre -60 mV et 100 mV, de préférence entre -40 mV et 80mV, avantageusement entre -20 mV et 60 mV, préférentiellement entre 0 mV et 50mV, de préférence entre 10 mV et 40 mV, avantageusement entre 10 mV et 30 mV, de préférence mesuré par laser doppler electrophoresis, de préférence dans une solution aqueuse de NaCI à 0,009% (masse :volume).
21. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes étant sous forme sèche, de préférence destinée à être dissoute ou redispersée dans un solvant aqueux physiologique, ou à être administrée à l’aide d’un inhalateur à poudre sèche.
22. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes 1 à 20 comprenant de 50 à 98% d’eau (masse de l’eau : masse totale de la composition), de préférence de 70 à 95% d’eau, voire de 80 à 90% d’eau.
23. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un tampon choisi dans le groupe comprenant les tampons phosphate, sulfonate (MES, TES, HERES, MOPS, PIPES, TAPS, TAPSO), acétate, bicine, et/ou au moins un sel choisi dans le groupe des sels inorganiques et des sels organiques, et/ou au moins un surfactant choisi dans le groupe constitué des acides choliques et leurs sels, phospholipides (ex. les phosphatidylcholines ou lécithine, les phosphatidylglycerols), lipides ou triglycérides, esters de sorbitan, les sorbitans polyéthoxylés, acides gras, de préférence l’acide laurique, palmitique, stéarique, érucique ou béhénique, des esters de ces acide gras, ou des dérivés de ces acides gras, tels que des sels, de préférence choisis parmi le stéarate de magnésium, le sodium stéaryl fumarate et le sodium stéaryl lactylate, sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, surfactants pulmonaires naturels ; et sucroesters (sugar esters, par exemple des esters entre le saccharose (sucrose) ou le glucose et des acide gras) et/ou un sucre, de préférence choisi dans le groupe des monosaccharides (tels que le glucose ou l’arabinose), des disaccharides (tels que le lactose, le maltose, le saccharose, le dextrose, le trehalose, le maltitol et leurs mélanges ou un agent de charge choisi parmi les polyols tels que le sorbitol, le mannitol et le xylitol), des polysaccharides (tels que le dextran, le chitosan, l’amidon, la cellulose, and ses dérivés), des oligosaccharides (tels que la cyclodextrine et les dextrines), et/ou au moins un acide aminé choisi dans le groupe constitué de l’histidine, de la leucine, l’isoleucine, la thréonine, la lysine, la valine, la methionine, la phenylalanine, leurs mélanges et leurs dérivés, tels que l’acésulfame K ou l’aspartame.
24. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes étant administrable par nébulisation et/ou par inhalation pressurisée et/ou par inhalation de poudre sèche et/ou par inhalation à pulvérisation douce.
25. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon l’une quelconque des revendications précédentes étant pour le traitement d’un cancer, de préférence un cancer métastatique, de préférence ladite métastase étant en- dehors du poumon ou du système nerveux central et la tumeur primaire étant pulmonaire ou localisée au niveau du système nerveux central, ou ladite métastase étant pulmonaire ou localisée au niveau du système nerveux central et la tumeur primaire étant en-dehors du poumon ou du système nerveux central.
26. Composition pharmaceutique d’activation de macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 24 étant pour le traitement d’une maladie infectieuse au niveau du tractus respiratoire et / ou systémique, ou du système nerveux central.
27. Composition pharmaceutique selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 24 comprenant un acide nucléique encodant un ou plusieurs épitope(s), ou un peptide comprenant un ou plusieurs épitopes, ladite composition pharmaceutique étant pour la vaccination.
28. Procédé pour l’obtention de la composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes comprenant les étapes de solubilisation des lipides dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques, d’évaporation du solvant de manière à former un film lipidique, de réhydratation avec une solution contenant l’agent pharmaceutique, d’extrusion et d’insertion d’un lipide dérivatisé avec un ligand du récepteur CD206, de préférence une seconde étape de mise en contact d’une solution contenant l’agent pharmaceutique avec les lipides extrudés, lesdits lipides comprenant un lipide neutre à pH 7,0 et chargé positivement à pH 5, et ladite étape de rehydratation étant pratiquée à pH inférieur à 7,0.
29. Procédé pour l’obtention de la composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 27 comprenant les étapes de solubilisation des lipides et de l’agent pharmaceutique dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques, d’injection du solvant organique (ou dans un mélange de solvants organiques) dans une solution aqueuse pouvant contenir un (mélange de) tensioactif(s), selon des vitesses d’injection et d’agitation définies, d’élimination du ou des solvants organiques, par évaporation ou dialyse par exemple, d’insertion d’un lipide dérivatisé avec un ligand du récepteur CD206,
30. Procédé pour l’obtention de la composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentesl à 27 par des technologies de microfluidique au cours duquel un solvant (ou mélange de solvants) contenant les lipides et l’agent pharmaceutique est mélangé, à vitesse contrôlée, à une solution aqueuse pouvant contenir un ou plusieurs tensio-actifs, à l’aide d’un dispositif présentant des microcanaux.
31. Procédé pour l’obtention de la composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 27 par méthode de congélation - décongélation de vésicule multi-lamellaires (MLV) ou vésicules monolamellaires (SUV).
32. Procédé pour l’obtention de la composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 27 par méthode de double centrifugation.
33. Procédé pour l’obtention de la composition pharmaceutique d’activation des macrophages et/ou de cellules dendritiques selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 27 par homogénéisation à haute pression de suspension de vésicule multi-lamellaires (MLV) obtenue après réhydrations de film lipidique.
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