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WO2024167324A1 - 미토콘드리아 특이적 펩타이드를 포함하는 신장 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

미토콘드리아 특이적 펩타이드를 포함하는 신장 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2024167324A1
WO2024167324A1 PCT/KR2024/001861 KR2024001861W WO2024167324A1 WO 2024167324 A1 WO2024167324 A1 WO 2024167324A1 KR 2024001861 W KR2024001861 W KR 2024001861W WO 2024167324 A1 WO2024167324 A1 WO 2024167324A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
cmp3013
mitochondrial
pharmaceutical composition
peptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2024/001861
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
유재훈
양승희
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SNU R&DB Foundation
CAMP Therapeutics Inc
Original Assignee
Seoul National University R&DB Foundation
CAMP Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seoul National University R&DB Foundation, CAMP Therapeutics Inc filed Critical Seoul National University R&DB Foundation
Publication of WO2024167324A1 publication Critical patent/WO2024167324A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • sequence listing This application includes a sequence listing, which sequence listing has been submitted electronically in XML format and is incorporated by reference herein in its entirety. A copy of said sequence listing, created on February 6, 2024, is titled KC24013-SEQ.xml and is 50.8 kilobytes in size.
  • the present invention relates to a use of a peptide or a dimer thereof having both cell penetrating ability and strong mitochondrial targeting ability for the prevention or treatment of renal disease or liver disease.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of renal disease or liver disease, comprising as an active ingredient a peptide or a dimer thereof having excellent cell penetrating ability and mitochondrial targeting ability by arranging hydrophobic amino acids and hydrophilic amino acids at specific positions of the peptide.
  • Mitochondria are important organelles that produce most of the ATP essential for cell survival. Mitochondrial dysfunction caused by damage to mitochondrial DNA or environmental and external influences causes various intrinsic mitochondrial diseases as well as almost all degenerative diseases.
  • One of the major causes of mitochondrial dysfunction is depletion of the cristae structure, which is promoted by the deficiency or oxidation of cardiolipin (CL), a phospholipid containing polyunsaturated fatty acids and distributed in high density ( ⁇ 20%) in the inner membrane of mitochondria.
  • CL which contains two phosphate groups, plays an essential role in ATP production by providing multiple charge-charge interactions with functional proteins in the membrane. Substances that specifically bind to CL and other phospholipids in the inner membrane of mitochondria (IMM) can prevent oxidation of CL, thereby protecting mitochondria from destruction of the cristae structure and maintaining normal mitochondrial function.
  • Triphenylphosphonium (TPP; Ph3P + -R) is a representative mitochondrial-specific molecule, and these target the negative charge of phospholipids present in the inner membrane.
  • TPP Triphenylphosphonium
  • molecules with these properties have problems with cell penetration at low concentrations and can be delivered into cells only at high concentrations. If these molecules are delivered into cells at high concentrations, there is a high possibility that they will easily bind to other molecules in the cell and exhibit toxicity.
  • these mitochondrial-specific molecules have weak binding affinity to CL, a representative phospholipid present in the inner membrane (IMM), so they cannot remain in the CL-rich inner membrane, but continue to penetrate into the inner membrane. Therefore, most mitochondrial targeting molecules (peptides) developed to date have been used only for the purpose of killing mitochondria by targeting DNA present within the mitochondrial membrane, and conversely, only a very small number of molecules have the function of increasing or restoring mitochondrial activity.
  • a representative example of a substance specific to the above CL is a mitochondrial-specific SS (Szeto-Schiller) peptide composed of two hydrophilic amino acids and two hydrophobic amino acids arranged alternately (Fig. 1).
  • This peptide has two positively charged amines and two aromatic functional groups, which interact hydrophilically and hydrophobicly with each phosphate and fatty acid component of the CL.
  • the affinity of the SS peptide for the CL is relatively weak (requiring micromolar concentrations).
  • the sequence of these SS peptides is extended to six amino acids, the mitochondrial penetration ability and specificity for the mitochondria are slightly improved, but there is a problem of causing serious toxicity.
  • kidney disease such as acute kidney injury
  • liver disease such as acute liver injury
  • the present invention aims to solve all of the problems described above.
  • the present invention aims to provide a use for preventing or treating kidney disease or liver disease, comprising an intracellularly transmissible mitochondrial-specific peptide or a dimer thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating kidney disease or liver disease, comprising a mitochondrial-specific peptide or a dimer thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating kidney disease or liver disease, comprising a mitochondrial-specific peptide or a dimer thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for restoring renal function or liver function, which comprises administering to a subject in need of restoration of renal function or liver function a composition comprising a mitochondrial-specific peptide or a dimer thereof as an active ingredient.
  • a representative configuration of the present invention to achieve the above purpose is as follows.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating kidney disease or liver disease which comprises as an active ingredient a peptide or a dimer thereof comprising a unit represented by the following formula 1:
  • X 1 , X 4 , X 5 , and X 8 are each independently hydrophobic amino acids
  • X 3 , X 6 , X 7 , and X 10 are each independently hydrophilic amino acids
  • X 2 and X 9 are each independently amino acids which form a bond so that each unit can be linked to each other at at least one position among X 2 and X 9 to form a dimeric peptide
  • X 1 is the N-terminus
  • X 10 is the C-terminus.
  • the kidney disease can be selected from the group consisting of acute kidney injury, chronic kidney disease, diabetic nephropathy, glomerulitis, interstitial nephritis, and ischemia-reperfusion renal injury.
  • the liver disease can be selected from the group consisting of acute liver failure, acute liver injury, chronic liver failure, chronic liver injury, liver cirrhosis, alcoholic liver disease, hepatic steatosis, hepatic fibrosis and hepatitis.
  • the pharmaceutical composition disclosed herein may be administered in combination with another active ingredient for the prevention or treatment of kidney disease or liver disease.
  • other active ingredients that may be co-administered may be one or more selected from the group consisting of enalapril, fosinopril, lisinopril, perindopril, irbesartan, losartan, olmesartan, telmisartan, and dapagliflozin.
  • the pharmaceutical composition disclosed herein can be co-administered with one or more drugs that cause nephrotoxicity or hepatotoxicity.
  • the drugs that may be co-administered may be one or more selected from the group consisting of antibiotics, anticancer agents, antifungal agents, antiviral agents, and immunosuppressants.
  • the one or more drugs causing nephrotoxicity or hepatotoxicity can be selected from the group consisting of colistin, doxycycline, gentamicin, vancomycin, cisplatin, gemcitabine, ifosfamide, methotrexate, nitrosoureas, amphotericin B, zalcitabine, didanosine, stavudine, zidovudine, aristolochic acid, and carboxy-atractyloside.
  • the pharmaceutical composition disclosed herein can be administered before or after the kidney disease or liver disease is induced.
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can each independently be leucine (L), isoleucine (I), phenylalanine (F), tyrosine (Y), valine (V), norvaline (norV), tryptophan (W), pentylglycine (pg), neopentylglycine (Npg), alanine (A), or cyclohexylalanine (Cha).
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can each independently be leucine (L), phenylalanine (F), tyrosine (Y) or cyclohexylalanine (Cha).
  • one or more of X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can each independently be cyclohexylalanine (Cha).
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 can each independently be arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR), histidine (H), ornithine (O), diaminobutanoic acid (Dab) or diaminopropanoic acid (Dap).
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 can each independently be arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR), or histidine (H).
  • X 2 and X 9 are each independently cysteine (C), homocysteine (Hcy), penicillamine (Pen), selenocysteine (U), or leucine (L), provided that X 2 and X 9 cannot both be leucine (L).
  • X 2 and X 9 can each independently be cysteine (C), homocysteine (Hcy), or penicillamine (Pen).
  • the dimer disclosed herein may be a peptide comprising a unit represented by formula 1 linked in an anti-parallel direction to each other.
  • X 2 and X 9 are each independently cysteine (C), homocysteine (Hcy), or penicillamine (Pen), and the linkage may be by a disulfide bond.
  • the unit represented by formula 1 may be a peptide consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19.
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide in nanomolar concentration is provided.
  • the peptide or dimer thereof disclosed herein may interact with cardiolipin of the mitochondrial membrane.
  • a method for preventing or treating a kidney disease or a liver disease comprising the step of administering a peptide or a dimer thereof disclosed herein to a subject in need thereof.
  • the peptide having a double-sided ⁇ -helical structure of the present invention or a dimer peptide thereof exhibits very high cell penetration ability and damaged mitochondria-targeting ability even at low concentrations, and by such ability, has the effect of maintaining/recovering normal cell and tissue functions by preventing mitochondrial damage or restoring the function of damaged mitochondria.
  • the peptide of the present invention or a dimer thereof has the effect of restoring the function of damaged kidney cells and liver cells, and thus can be used for the prevention or treatment of kidney disease or liver disease.
  • FIG 1 illustrates the chemical structures of examples of conventional mitochondrial targeting molecules, namely, triphenylphosphonium (TPP) ion, which is a lipophilic cation, SS-31, and mitochondrial penetrating peptide (MPP) of the Kelly group, respectively.
  • TPP triphenylphosphonium
  • MPP mitochondrial penetrating peptide
  • Figure 2 illustrates an ⁇ -helix structure and a ⁇ -sheet structure.
  • the length between one side chain and its adjacent side chain (approximately 4.5 ⁇ ) and the diameter of the helix including the side chain (10-12 ⁇ ) are indicated
  • the length between one side chain and its adjacent side chain (approximately 7 ⁇ ) and the distance between the side chains on one side of the sheet and the side chains on the opposite side (approximately 7-8 ⁇ ) are indicated.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the role of peptides or small molecules in activating biological membranes.
  • Figures 4a to 4c illustrate schematic structures of monomeric and dimeric ⁇ -helical peptides according to one embodiment.
  • Figure 4a shows an ⁇ -helical peptide model drawn using Discovery Studio 2020 (Dassault Systemes BIOVIA, USA). The monomers of the peptide library were based on the sequence AcNH-LCRLLRRLCR-C(O)NH2, and the distance between two carbon atoms in the side chains of leucine (L) at position 5 and arginine (R) at position 7 was calculated using a distance monitor.
  • Figure 4b illustrates a wheel diagram of a monomeric ⁇ -helical peptide.
  • Black circles represent hydrophobic residues
  • white circles represent hydrophilic residues
  • white squares represent amino acid residues forming bonds.
  • Figure 4c shows a wheel diagram of the dimeric bundle peptide. The structure shown is antiparallel bound.
  • Figure 5 shows HPLC peaks before and after adjusting the equivalents of the four Fmoc-amino acids to generate peptides with the same coupling ratio.
  • Figure 6 illustrates an HPLC chromatogram for the L1X sub-library, one of the 16 monomeric peptide sub-libraries.
  • the red arrows indicate the range of consecutive retention times (RT) from the first peak to the last peak in the HPLC chromatogram.
  • Figures 7a to 7d are graphs comparing the fluorescence intensities measured to evaluate the ROS production inhibition ability for 16 monomer peptide sub-libraries.
  • Figure 7a shows the results of measuring ROS levels in HeLa cells when treated with four monomer peptide sub-libraries in which the 1st position of the hydrophobic moiety is cyclohexylalanine (Cha), leucine (L), tyrosine (Y), or phenylalanine (F), respectively.
  • Figure 7b shows the results of measuring ROS levels in HeLa cells when treated with four monomer peptide sub-libraries in which the 4th position of the hydrophobic moiety is cyclohexylalanine (Cha), leucine (L), tyrosine (Y), or phenylalanine (F), respectively.
  • Figure 7c shows the results of measuring ROS levels in HeLa cells when treated with four monomeric peptide sub-libraries in which the 5-position of the hydrophobic moiety is cyclohexylalanine (Cha), leucine (L), tyrosine (Y), or phenylalanine (F), respectively.
  • Figure 7d shows the results of measuring ROS levels in HeLa cells when treated with four monomeric peptide sub-libraries in which the 8-position of the hydrophobic moiety is cyclohexylalanine (Cha), leucine (L), tyrosine (Y), or phenylalanine (F), respectively.
  • Figures 8a to 8c illustrate the results of confirming the dimeric peptide bond direction (parallel or antiparallel) synthesized by air-oxidation or an air-oxidation method using a protecting group.
  • Figure 8a illustrates a chromatogram of a dimeric peptide obtained by air-oxidation (denoted as CMP3013 air-oxidation) and a dimeric peptide obtained by an air-oxidation method using a protecting group (denoted as CMP3013 antiparallel).
  • Figure 8b illustrates a schematic diagram (left of the arrow) showing the structure of a monomer peptide dimerized by air-oxidation and a chromatogram (right of the arrow) of the reaction product obtained by the above method.
  • Figure 8c shows a schematic diagram (left of the arrow) showing the structure of a peptide having an ACM protecting group attached thereto that is dimerized by an air oxidation method using a protecting group, and a chromatogram (right of the arrow) of the reaction product obtained by the method.
  • Figures 9a and 9b illustrate the cell penetration ability of fluorescently labeled dimeric bundle peptides FL-CMP3001 to FL-CMP3015 and FL-CMP3029 to FL-CMP3032, respectively.
  • Figure 9a is a graph showing the cell penetration rate as a function of the concentration of FL-CMP3001 to FL-CMP3015, respectively (the legend is sorted in ascending order of the EC 50 values of the peptides).
  • Figure 9b is a graph showing the cell penetration rate as a function of the concentration of FL-CMP3029 to FL-CMP3032, respectively.
  • Figure 10 is a graph showing the correlation between the cell penetration ability of each of FL-CMP3001 to FL-CMP3015 and the oligomerization tendency between dimeric peptides.
  • Figure 11 shows a graph comparing the cytotoxicity of FL-CMP3001 to FL-CMP3015, respectively.
  • Figure 12 is a graph showing the results of WST-1 analysis performed 24 hours after treating HeLa cells with CMP3013 at various concentrations.
  • Figure 13 shows the fractionation results of HeLa cells treated with FL-CMP3001 to FL-CMP3015 at EC 50 concentrations for 3 hours, respectively.
  • the fluorescence intensities of the cytosol (C) and mitochondrial (M) fractions were expressed, and the values were expressed as relative values compared to the values for the entire cell (Total, T).
  • Figures 14a and 14b illustrate the results of measuring the ROS production inhibition ability of dimeric bundle peptides according to one embodiment.
  • Figure 14a illustrates the ROS production inhibition ability of each of FL-CMP3001 to FL-CMP3015 peptides against ROS generated by 0.5 mM H 2 O 2 treatment in HeLa cells. Each peptide was treated for 3 hours at an EC 50 concentration, and after 0.5 mM H 2 O 2 treatment, the cells were imaged using a confocal microscope, and the fluorescence intensity of the cells was calculated using an image analysis program. Each dot corresponds to the fluorescence intensity obtained from one image.
  • Figures 15a to 15e illustrate microscopic images confirming the effect of FL-CMP3013, FL-CMP3029, FL-CMP3030, FL-CMP3031, and/or FL-CMP3032 to preferentially translocate to or bind to damaged mitochondria.
  • the graph shown in the right panel shows the correlation between green (NAO) and red (CMP3013) fluorescence signals in the area indicated by the arrows in the image.
  • the lower panel shows the results of Western blotting to determine the extent of ectopic expression of Drp1(+, Drp1-eGFP transduction) under the same conditions.
  • Fig. 15d is a confocal microscopy image obtained by transfecting HeLa cells with the Drp1-eGFP plasmid to induce mitochondrial fragmentation, and treating them with FL-CMP3013, FL-CMP3029, FL-CMP3030, FL-CMP3031, or FL-CMP3032 the next day.
  • Figures 17a to 17i illustrate the results of experiments confirming the maintenance/recovery of mitochondrial function and the protective effect of cristae on the inner mitochondrial membrane by FL-CMP3013 in oxidatively damaged cells.
  • Figure 17a illustrates the results of measuring the levels of total ROS (left graph) and mitochondrial ROS (right graph) in HeLa cells pretreated with FL-CMP3013 (10 or 30 nM) for 3 hours, followed by treatment with 0.5 mM H 2 O 2 for 30 minutes.
  • Figure 17b illustrates the results of measuring the levels of mitochondrial ROS in HeLa cells pretreated with FL-CMP3013 (2.5, 5, or 10 nM) for 3 hours, followed by treatment with 5 ⁇ M antimycin A (AA) as a mitochondrial damaging agent for 90 minutes.
  • AA antimycin A
  • Figure 17c shows the results of measuring the level of mitochondrial ROS after treating HeLa cells pretreated with FL-CMP3013 (5, 10, or 20 nM) for 3 hours and then treated with 10 ⁇ M CCCP as a mitochondrial damaging agent for 90 minutes.
  • Figure 17d shows the results of measuring the level of ATP after treating HeLa cells pretreated with FL-CMP3013 (10 or 30 nM) for 3 hours and then treated with 1 mM H 2 O 2 for 1 hour.
  • Figure 17e shows the results of measuring the level of ATP after treating HeLa cells pretreated with FL-CMP3013 (10 or 20 nM) for 3 hours and then treated with 1 ⁇ M antimycin A as a mitochondrial damaging agent for 3 hours.
  • Figure 17f shows the results of measuring the level of ATP after treating HeLa cells with 10 ⁇ M CCCP as a mitochondrial damaging agent for 1 hour, which were pretreated with FL-CMP3013 (5, 10, or 20 nM) for 3 hours.
  • Figure 17g shows the results of measuring the mitochondrial membrane potential ( ⁇ ) after treating HeLa cells with FL-CMP3013 (10 or 30 nM) for 3 hours and then with 1 mM H 2 O 2 for 1 hour.
  • Figure 17h shows the results of measuring the relative change in mitochondrial membrane potential after treating SH-SY5Y cells with cyclosporin A (CsA), FL-CMP3012, FL-CMP3013, or FL-CMP3015 in which a decrease in membrane potential was induced by antimycin A, as measured by JC-1 fluorescence ratio.
  • Figure 17i is a transmission electron microscope (TEM) image of HeLa cells obtained under different treatment conditions of FL-CMP3013 and H 2 O 2 .
  • TEM transmission electron microscope
  • Figures 18a to 18d illustrate the experimental results confirming the endocytosis mechanism of FL-CMP3013 and its final fate in cells.
  • Figure 18a illustrates the results of FACS analysis of HeLa cells pretreated with various inhibitory conditions for 30 min (pre-cooling to 4°C, treatment with EIPA [5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride], treatment with methyl- ⁇ -cyclodextrin (M ⁇ CD), treatment with sodium chlorate (NaClO 3 ), or treatment with chlorpromazine (CPZ)) and then incubated with 100 nM FL-CMP3013 for 3 h.
  • EIPA 5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride
  • M ⁇ CD methyl- ⁇ -cyclodextrin
  • NaClO 3 sodium chlorate
  • CPZ chlorpromazine
  • Figure 18d is a graph comparing the Pearson r values in the microscope images of Figure 18c, where the blue bar on the left represents the correlation coefficient of CMP3013-Lysotracker, and the green bar on the right represents the correlation coefficient of CMP3013-NAO. Five independent fluorescence images (magnification x 63) were analyzed for each condition.
  • Figures 19a to 19d show that CMP3013m (monomeric peptide) strongly interacts with cardiolipin (CL)-containing membranes fabricated by liposomes.
  • Figure 19a shows the HPLC chromatogram of monomeric peptide NBD-CMP3013 with NBD (> 95% purity).
  • Figure 19c is a graph showing the fluorescence intensity according to the concentration of CMP3013m after adding liposomes to 1 ⁇ M NBD-3013m and treating with an excess of CMP3013 monomer (CMP3013m).
  • Figure 20 is a schematic diagram illustrating the mechanism of action of CMP3013 according to one embodiment of the present invention.
  • Figures 21a and 21b illustrate the cell penetration ability and mitochondrial targeting ability of CMP3013, SS-31, LR10, and MMP1a.
  • Figure 21a is a graph showing the cell penetration rate according to the concentration of CMP3013, SS-31, LR10, and MMP1a.
  • Figure 21b illustrates the fractionation results of HeLa cells treated with CMP3013, SS-31, LR10, and MMP1a at their EC 50 concentrations, respectively.
  • the fluorescence intensities of the cytosol (C) and mitochondrial (M) fractions were expressed, and the values were expressed as relative values compared to the values for the entire cell (Total, T) (M/C ratio, relative fluorescence intensity of the cytosolic fraction/relative fluorescence intensity of the mitochondrial fraction).
  • Figures 22a and 22b illustrate the results comparing the ability of NBD-CMP3013m and NBD-SS-31 to interact with cardiolipin (CL)-containing membranes fabricated by liposomes.
  • the relative affinity of the peptides is indicated as the ⁇ F.I.max/EC 50 value.
  • Figures 23a to 23d illustrate the results comparing the ROS production inhibition abilities of SS-31 and CMP3013.
  • Figure 23a is a graph showing the relative fluorescence intensity of cells pretreated with SS-31 (100 nM or 1 ⁇ M) or CMP3013 (10 nM or 100 nM) and then treated with CCCP to induce mitochondrial damage.
  • Figure 23b is a graph showing the relative fluorescence intensity of cells pretreated with SS-31 (100 nM or 1 ⁇ M) or CMP3013 (10 nM or 100 nM) and then treated with Rotenone to induce mitochondrial damage.
  • Figure 23c is a graph showing the relative fluorescence intensity of cells after pretreatment with SS-31 (100 nM or 1 ⁇ M) or CMP3013 (10 nM or 100 nM) and then treatment with Antimycin A to induce mitochondrial damage.
  • Figure 23d is a graph showing the relative fluorescence intensity of cells after pretreatment with SS-31 (100 nM or 1 ⁇ M) or CMP3013 (10 nM or 100 nM) and then treatment with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) to induce mitochondrial damage.
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • Figures 24a and 24b illustrate the results comparing the ATP production promoting abilities of SS-31 and CMP3013.
  • Figure 24a illustrates the results of measuring the level of ATP in HeLa cells pretreated with CMP3013 (10 or 30 nM) or SS-31 (10 or 30 nM) and treated with 1 ⁇ M antimycin A for 3 hours.
  • Figure 24b illustrates the results of measuring the level of ATP in HeLa cells pretreated with CMP3013 (10 or 30 nM) or SS-31 (10 or 30 nM) and treated with 1 mM H 2 O 2 for 1 hour.
  • Figure 25 shows the results of measuring the relative change in mitochondrial membrane potential by JC-1 fluorescence ratio after treatment with CMP3013 (10 or 30 nM) or SS-31 (10 or 30 nM) in cells in which a decrease in membrane potential was induced by H 2 O 2 .
  • Figure 26 shows the in vivo distribution of CMP3013 as IVIS images of organs excised 24 hours after intravenous injection of 3 mg/kg of CMP3013 peptide (Cy5.5-3013) labeled with cyanine 5.5 into male C57BL/6 mice (LV, liver; KD, kidney; SP, spleen; LN, lung).
  • Figure 27 shows microscopic images confirming the effect of TAMRA-CMP3013 on preferential translocation or binding to damaged mitochondria in hTEC cells.
  • White represents NAO signal and red represents CMP3013 (scale bar: 10 ⁇ m).
  • Figures 28a to 28c illustrate the results of confirming the effect of CMP3013 on improving damaged mitochondria in hTEC cells:
  • Figures 28a and 28b are graphs showing the results of measuring ROS levels and membrane potential in hTEC cells treated with 20 nM or 60 nM CMP3013 peptide and then treated with 1 mM H 2 O 2 for 30 minutes to create conditions for cell membrane damage.
  • Figure 28c is a graph showing the results of measuring ATP levels in hTEC cells treated with 10 nM or 20 nM CMP3013 peptide and then treated with 0.5 mM H 2 O 2 for 1 hour to create conditions for cell membrane damage.
  • Figures 29a to 29c illustrate the results of confirming the effect of CMP3013 on the recovery of damaged mitochondrial respiration in hTEC cells.
  • CMP3013 10 nM or 50 nM
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • Figure 29a, OCR oxygen consumption rate
  • Figure 29b, ECAR extracellular acidification rate
  • Figure 29c, PER proton efflux rate
  • Figure 30 is a schematic diagram showing an experimental plan to confirm the nephrotoxicity mitigating effect of CMP3013 or CMP3029 in an animal model of colistin-induced nephrotoxicity.
  • Figures 31a to 31e illustrate the results of confirming the effect of alleviating nephrotoxicity after intraperitoneal administration of 1 mg/kg CMP3013 every other day to mice in which nephrotoxicity was induced by daily subcutaneous administration of 20 mg/kg colistin:
  • Figure 31d is a microscopic image confirming the expression of MT (Masson's trichome; magnification ⁇ 100) and renal damage-related proteins in renal tissue by immunohistochemistry (scale bar: 100 ⁇ m).
  • Figure 31e is a drawing showing the mitochondrial cristae structure by photographing a kidney section using a transmission electron microscope (TEM) (scale bar: 1 ⁇ m).
  • TEM transmission electron microscope
  • Figure 33 shows the bilateral renal arteries of SD rats clamped with seraphine clips to create an ischemia-reperfusion renal injury (IRI) model.
  • IRI ischemia-reperfusion renal injury
  • Figures 34a and 34b illustrate the results comparing the acute renal injury treatment effects of CMP3013 and SS-31 in an ischemia-reperfusion renal injury (IRI)-induced model.
  • the results of measuring BUN ( Figure 34a) and CRE ( Figure 34b) in the blood of rats that were induced to ischemia-reperfusion renal injury (IRI) 24 hours after intravenous administration of 1 mg/kg of CMP3013 or intraperitoneal administration of 2 mg/kg of SS-31 are graphically represented.
  • Figure 35 is a schematic diagram showing the experimental plan for creating a mouse model of ischemia-reperfusion renal injury (IRI).
  • IRI ischemia-reperfusion renal injury
  • Figures 36a to 36i illustrate the results of confirming the therapeutic effect on acute renal injury in an ischemia-reperfusion renal injury (IRI) model in which acute renal injury was induced 1 hour after intravenous administration of 1 mg/kg or 5 mg/kg of CMP3013.
  • Figures 36a and 36b illustrate graphically the results of measuring BUN ( Figure 36a) and CRE (Figure 36b) in mouse serum 24 hours after IRI induction.
  • Figure 36c illustrates the results of confirming the kidney tissue of mice induced with acute renal injury by immunohistochemical analysis (scale bar: 100 ⁇ m).
  • Figure 36d illustrates the results of performing Western blot to confirm the expression level of NGAL in kidney tissue.
  • Figure 36e is a graph quantitatively representing the Western blot results of NGAL.
  • Figures 36f to 36i illustrate the results of quantitative analysis of antioxidant mRNA profiles (Figure 36f, NQO-1; Figure 36g, SOD-1; Figure 36h, IL-10; and Figure 36i, ATP6).
  • Figure 37 is a schematic diagram for confirming the post-administration therapeutic effect of CMP3013 using an ischemia-reperfusion renal injury (IRI)-induced mouse model.
  • IRI ischemia-reperfusion renal injury
  • Figures 38a and 38b graphically represent the results of measuring BUN ( Figure 38a) and CRE ( Figure 38b) 23 hours after intravenous injection of 1 mg/kg CMP3013 1 hour after induction of acute renal injury (IRI mouse model).
  • Figure 39 is a diagram showing the administration schedule for evaluating the efficacy of CMP3013 or CMP3029 using an acute liver injury mouse model.
  • the blue arrows indicate the days of three intravenous or intraperitoneal administrations of CMP3013 or CMP3029 (DAY 0, 2, 4), and the red arrows indicate the days of intraperitoneal administration of TAA.
  • Figures 40a to 40j illustrate the results of confirming the acute liver damage treatment effect of CMP3013 or CMP3029.
  • Figures 40a to 40c are graphs showing the results of measuring blood AST ( Figure 40a), ALT ( Figure 40b), and ALP ( Figure 40c) in mice in which acute liver damage was induced by intravenous administration of 1 mg/kg of CMP3013 three times every other day (Day 0, 2, 4) and intraperitoneal administration of 100 mg/kg of TAA on the fifth day (Day 5).
  • Figures 40d to 40g show additional experiments to confirm the efficacy of CMP3013 in mice that were intravenously administered 1 mg/kg of CMP3013 three times every other day (Day 0, 2, 4) and then intraperitoneally administered 100 mg/kg of TAA on the fifth day (Day 5) to induce acute liver damage.
  • the results include the results of blood AST and ALT ( Figure 40d), the results of an autopsy examining the condition of the liver after removing it ( Figure 40e), and the results of staining liver tissue cells with a cell senescence marker (Figure 40f, SA- ⁇ -gal marker; and Figure 40g, p21 marker).
  • Figures 40h to 40j are graphs showing the results of measuring blood AST ( Figure 40h), ALT ( Figure 40i), and ALP (Figure 40j) in mice that were intravenously administered 1, 5, or 10 mg/kg of CMP3029 three times every other day (Day 0, 2, 4) and then intraperitoneally administered 100 mg/kg of TAA on the fifth day (Day 5) to induce acute liver damage (G1, TAA alone; G2, TAA + 1 mg/kg CMP3029; G3, TAA + 5 mg/kg CMP3029; G4, TAA + 10 mg/kg CMP3029).
  • unit or "peptide unit” as used herein means the smallest unit constituting a monomeric peptide or a dimeric peptide, and the unit is composed of 10 amino acids. The unit constitutes part or all of the monomeric peptide.
  • peptide refers to an amino acid polymer, which may include as components not only natural amino acids but also unnatural amino acids (e.g., isomers such as ⁇ -amino acids and D-amino acids).
  • leucine L
  • leucine (L) is used to mean not only L-leucine in the form of a natural ⁇ -amino acid, but also its positional isomer ⁇ -leucine and its mirror image isomer D-leucine.
  • amino acids described herein e.g., isoleucine (I), phenylalanine (F), tyrosine (Y), valine (V), tryptophan (W), arginine (R), lysine (K), histidine (H), etc.
  • isoleucine (I) phenylalanine (F), tyrosine (Y), valine (V), tryptophan (W), arginine (R), lysine (K), histidine (H), etc.
  • I isoleucine
  • F phenylalanine
  • Y tyrosine
  • V valine
  • W tryptophan
  • W arginine
  • K lysine
  • H histidine
  • hydrophilic amino acid can mean a polar amino acid, and thus has been used to encompass amino acids that have an affinity for water, a polar solvent, i.e., can be mixed with water.
  • hydrophobic amino acid can mean an amino acid with no or significantly low polarity, and thus has been used to encompass amino acids that have no affinity for water, a polar solvent, i.e., do not mix with water.
  • amphipathic peptide may be used interchangeably with “amphiphilic peptide” and refers to a peptide that is structurally amphipathic, i.e., has both hydrophobic and hydrophilic properties.
  • One side or moiety of an amphipathic peptide may be hydrophilic and the other side or moiety may be hydrophobic.
  • treatment generally means obtaining a desired pharmacological effect and/or physiological effect. Such effect is therapeutic in that it partially or completely cures a disease and/or a harmful effect caused by such disease. Desirable therapeutic effects include, but are not limited to, preventing the occurrence or recurrence of a disease, ameliorating symptoms, reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, ameliorating or alleviating the disease state, and remission or improved prognosis.
  • treatment may mean medical intervention for an already manifested disease or disorder.
  • prevention means obtaining the desired prophylactic pharmacological and/or physiological effect with a view to partially or completely preventing a disease or its symptoms.
  • administration means providing a substance (e.g., a peptide comprising a unit represented by Formula 1 of the present invention or a dimer thereof, or a composition comprising one or more of them as an active ingredient) to a subject for achieving a preventive or therapeutic purpose (e.g., preventing or treating kidney disease or liver disease).
  • a preventive or therapeutic purpose e.g., preventing or treating kidney disease or liver disease.
  • an effective amount refers to an amount of a compound, composition or drug sufficient to treat a specified disease, condition or disorder, such as by improving a specified function, e.g., enhancing or increasing a desired and/or beneficial function, reducing or diminishing an undesirable function, or ameliorating, palliating, attenuating and/or delaying one or more of the symptoms.
  • an effective amount includes an amount sufficient to delay or reverse kidney disease or liver disease.
  • subject is used interchangeably with “patient” or “subject” and can be a mammal, such as a primate (e.g., a human), a companion animal (e.g., a dog, a cat, etc.), a livestock animal (e.g., a cow, a pig, a horse, a sheep, a goat, etc.), and a laboratory animal (e.g., a rat, a mouse, a guinea pig, etc.) in need of prevention or treatment of a kidney disease or a liver disease.
  • the subject is a human.
  • the present invention is based, at least in part, on the surprising discovery that administration of a mitochondrial-specific peptide or a dimer thereof exhibits a significant preventive or therapeutic effect on renal disease or liver disease in a subject (or individual) suffering from renal disease or liver disease. Accordingly, according to one aspect of the present invention, there is provided a use of a mitochondrial-specific peptide represented by the following formula 1 or a dimer thereof for the prevention or treatment of renal disease or liver disease:
  • X 1 , X 4 , X 5 , and X 8 are each independently hydrophobic amino acids; X 3 , X 6 , X 7 , and X 10 are each independently hydrophilic amino acids; X 2 and X 9 are each independently amino acids which form a bond such that each unit can be linked to each other at at least one position among X 2 and X 9 to form a dimeric peptide; X 1 is the N-terminus and X 10 is the C-terminus.
  • the mitochondrial-specific peptide or dimer thereof disclosed herein has the effect of preserving/recovering the structure of the cristae and thus restoring mitochondrial dysfunction by specifically binding to exposed cardiolipin of damaged mitochondria.
  • mitochondrial cardiolipin is oxidized by various factors or its structure is abnormal, the curvature of the cristae disappears and various types of proteins responsible for the function of the electron transport chain physically move away from each other, thereby gradually losing their function.
  • the peptide or dimer thereof disclosed herein can normalize the function of mitochondria by binding to cardiolipin, restoring the curvature of the cristae, and enabling the protein complex of the electron transport chain to resume its normal function.
  • the ability of the mitochondrial-specific peptide or its dimer to restore mitochondrial dysfunction was demonstrated by the effect of inhibiting ROS production, the effect of promoting ATP production, the effect of restoring mitochondrial membrane potential, etc. (see Examples 9 to 11, etc.).
  • the mitochondrial-specific peptide or its dimer can be provided for the purpose of preventing or treating kidney disease or liver disease by specifically binding to mitochondria present in damaged kidney or liver, specifically, damaged or exposed cardiolipin, and improving the function of mitochondria.
  • kidney disease refers to a disturbance in the normal physiology and function of the kidney. Kidney disease can result from a wide range of acute and chronic diseases and events, including physical, chemical or biological insults, stroke, trauma or diseases, such as, for example, nephrectomy, chemotherapy, hypertension, diabetes, congestive heart failure, lupus, sickle cell anemia and various inflammatory, infectious and autoimmune diseases, HIV-related nephropathy, etc.
  • kidney disease can result from the administration of one or more drugs that cause nephrotoxicity, such as antibiotics, anticancer agents, antifungal agents, antiviral agents, immunosuppressants, etc.
  • the kidney disease can be selected from the group consisting of, but is not limited to, acute kidney injury, chronic kidney disease, diabetic nephropathy, glomerulitis, interstitial nephritis, and ischemia-reperfusion renal injury.
  • the kidney disease may be characterized by mitochondrial dysfunction.
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention or a dimer thereof exhibited an excellent therapeutic effect on damaged renal cells (see Example 14, etc.).
  • the peptide of the present invention specifically bound to cardiolipin of damaged mitochondria in renal cells and exhibited the ability to inhibit ROS production, promote ATP production, and restore membrane potential.
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention or a dimer thereof exhibits an excellent therapeutic effect against nephrotoxicity caused by a nephrotoxic substance (see Example 15, etc.).
  • a drug exhibiting nephrotoxicity such as colistin
  • co-administration of a low dose of the peptide of the present invention can effectively prevent kidney damage.
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention or a dimer thereof has a therapeutic effect on acute kidney injury (see Example 16, etc.).
  • a low dose (1 mg/kg) of the peptide was administered, indicators of kidney injury (BUN and CRE) were significantly reduced.
  • the therapeutic effect on acute kidney injury was more excellent even though the dosage was only half that of the conventional SS-31 peptide.
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention or a dimer thereof was administered in a concentration-dependent manner, indicators related to acute kidney injury were restored to a normal level, and even when it was administered before inducing acute kidney injury, it showed the efficacy of restoring kidney function.
  • the composition of the present invention can suppress kidney injury even with only a low dose administered before or after inducing acute kidney injury, and has a superior effect than the conventional technology.
  • liver disease refers to a disease resulting from damage to liver cells or liver tissue and/or abnormality (impairment) of liver function due to causes such as viruses, alcohol, drugs, immune disorders, metabolic diseases, or other environmental factors.
  • the liver disease can be selected from the group consisting of, but is not limited to, acute liver failure, acute liver injury, chronic liver failure, chronic liver injury, liver cirrhosis, alcoholic liver disease, hepatic steatosis, hepatic fibrosis, and hepatitis.
  • the liver disease may be characterized by mitochondrial dysfunction.
  • the composition of the present invention was confirmed to exhibit an excellent therapeutic effect on acute liver injury (see Example 17, etc.).
  • liver damage indicators blood AST, ALT, and ALP
  • the composition of the present invention can inhibit liver damage even at a low dose (1 mg/kg), and furthermore, can provide an even more enhanced liver damage inhibition effect at a high dose (10 mg/kg).
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention has excellent cell penetrability and mitochondrial targeting ability by arranging hydrophobic amino acids and hydrophilic amino acids at specific positions of the peptide, and without being bound by theory, can exhibit a therapeutic effect on kidney disease and liver disease by restoring damaged mitochondria through the above cell penetrability and mitochondrial targeting ability.
  • the peptide unit is composed of a total of 10 amino acids and can contain hydrophobic amino acids and hydrophilic amino acids at an appropriate ratio, for example, 1:1, specifically 4 each, and each unit can be linked to each other through a bond at 1 or 2 positions to form a dimeric peptide.
  • the peptide unit can form an ⁇ -helical amphipathic (dimeric) dimeric bundle peptide.
  • the above peptide units have increased ⁇ -helix degree, which increases intracellular penetration rate, and the ⁇ -helix can be removed inside the cell, thereby reducing the toxicity of the peptide. Since the cell penetration ability of the dimer is more than 100 times superior to that of a single-stranded ⁇ -helical peptide, once the dimer bundle is formed, it can be easily delivered into cells even at nanomolar concentrations. The disulfide bond of the dimer bundle peptide delivered into cells at nanomolar concentrations can be easily reduced to monomers in the intracellular environment and target mitochondria. It was experimentally confirmed that the peptide delivered in this way specifically binds to abnormal mitochondria to prevent further damage to the mitochondria or to restore the function of the damaged mitochondria.
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention may comprise or consist of a unit represented by the following formula 1:
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 are each independently a hydrophobic amino acid
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 are each independently a hydrophilic amino acid
  • X 2 and X 9 are each independently an amino acid forming a bond such that each unit can be linked to each other at at least one position among X 2 and X 9 to form a dimeric peptide;
  • X1 is the N-terminus and X10 is the C-terminus.
  • each amino acid constituting the peptide is not limited in type as long as it exhibits amphipathicity and can maintain an ⁇ -helical structure, and hydrophobic amino acids or hydrophilic amino acids widely known in the technical field to which the present invention pertains can be appropriately selected and used.
  • the present inventors have revealed through previous studies that a peptide with increased ⁇ -helix degree can increase intracellular penetration rate and reduce the toxicity of the peptide by removing the ⁇ -helix inside the cell (WO 2015/057009).
  • the hydrophobic amino acid can be selected from the group consisting of leucine (L), isoleucine (I), phenylalanine (F), tyrosine (Y), valine (V), norvaline (norV), tryptophan (W), pentylglycine (pg), neopentylglycine (Npg), alanine (A), and cyclohexylalanine (Cha).
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can each independently be leucine (L), isoleucine (I), phenylalanine (F), tyrosine (Y), valine (V), norvaline (norV), tryptophan (W), pentylglycine (pg), neopentylglycine (Npg), alanine (A) or cyclohexylalanine (Cha).
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can each independently be leucine (L), phenylalanine (F), tyrosine (Y) or cyclohexylalanine (Cha), more preferably, leucine (L), phenylalanine (F) or cyclohexylalanine (Cha), but are not limited thereto.
  • one or more (i.e., one, two, three or four) of X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can be cyclohexylalanine (Cha).
  • the remainder of X 1 , X 4 , X 5 and X 8 can each be independently selected from the group consisting of leucine (L), phenylalanine (F) and tyrosine (Y).
  • the hydrophilic amino acid can be a hydrophilic amino acid having a positively charged side chain.
  • the hydrophilic amino acid can be selected from the group consisting of arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR), histidine (H), ornithine (O), diaminobutanoic acid (Dab), and diaminopropanoic acid (Dap).
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 can each independently be arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR), histidine (H), ornithine (O), diaminobutanoic acid (Dab), or diaminopropanoic acid (Dap).
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 can each independently be arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR) or histidine (H), more preferably, arginine (R), homoarginine (hR) or norarginine (norR), but are not limited thereto.
  • X 2 and X 9 can each independently be cysteine (C), homocysteine (Hcy), penicillamine (Pen), selenocysteine (U) or leucine (L) (provided that X 2 and X 9 are not both leucine (L)).
  • X 2 and X 9 can each independently be cysteine (C), homocysteine (Hcy) or penicillamine (Pen), and more preferably, they can each independently be cysteine (C) or homocysteine (Hcy).
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 are each independently leucine (L), phenylalanine (F), tyrosine (Y) or cyclohexylalanine (Cha);
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 are each independently a hydrophilic amino acid
  • X 2 and X 9 are each independently an amino acid forming a bond such that each unit can be linked to each other at at least one position among X 2 and X 9 to form a dimeric peptide
  • X 1 is the N-terminus and X 10 is the C-terminus.
  • X 1 , X 4 , X 5 and X 8 are each independently a hydrophobic amino acid selected from the group consisting of leucine (L), phenylalanine (F), tyrosine (Y) and cyclohexylalanine (Cha);
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 are each independently a hydrophilic amino acid selected from the group consisting of arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR), histidine (H), ornithine (O), diaminobutanoic acid (Dab) and diaminopropanoic acid (Dap);
  • X 2 and X 9 are each independently an amino acid forming a bond such that each unit can be linked to each other at at least one position among X 2 and X 9 to form a dimeric peptide;
  • X 1 is the N-terminus and
  • X 10 is the C
  • At least one of X 1 , X 4 , X 5 and X 8 is independently cyclohexylalanine (Cha), and the others can be independently selected from the group consisting of leucine (L), phenylalanine (F) and tyrosine (Y).
  • X 3 , X 6 , X 7 and X 10 can preferably each independently be arginine (R), lysine (K), homoarginine (hR), norarginine (norR) or histidine (H), and more preferably can be arginine (R), homoarginine (hR) or norarginine (norR).
  • X 2 and X 9 can each independently be cysteine (C), homocysteine (Hcy) or penicillamine (Pen), and more preferably can each independently be cysteine (C) or homocysteine (Hcy).
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention can comprise or consist of the amino acid sequence of Hfa-Cys-Arg-Hfa-Hfa-Arg-Arg-Hfa-Cys-Arg, wherein Hfa is a peptide or can comprise a hydrophobic amino acid selected from the group consisting of leucine (L), phenylalanine (F), tyrosine (Y) and cyclohexylalanine (Cha). In one embodiment, one or more of the Hfa can independently be cyclohexylalanine (Cha).
  • the mitochondrial-specific peptide of the present invention may comprise or consist of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19 set forth in Table 1 below, but is not limited to the amino acid sequences as long as the amphipathicity and ⁇ -helical structure of the monomeric peptide can be maintained.
  • the peptide disclosed herein can be delivered into cells and interact with mitochondrial membranes, particularly cardiolipin of the mitochondrial membrane.
  • the peptide disclosed herein inhibits the production of ROS when treated to cells in which oxidative stress is induced (see Example 2.2.2, etc.).
  • a dimeric peptide comprising a peptide disclosed herein as a unit is provided.
  • the dimeric peptide of the present invention can be formed by binding of monomer peptides to each other.
  • the position of the bond may be either one or both of X 2 and X 9 .
  • X 2 and X 9 may each independently be selected from any amino acid that forms a bond so that each monomer peptide can be linked to each other at at least one position of X 2 and X 9 to form a dimeric peptide, for example, X 2 and X 9 are each independently cysteine (C), homocysteine (Hcy), penicillamine (Pen), selenocysteine (U), or leucine (L), provided that X 2 and X 9 are not both leucine (L).
  • the bond formed between each monomer peptide may include any form of bond that connects the peptides so as to exhibit the properties desired by the present invention, and may include, for example, a covalent bond.
  • the covalent bond is not particularly limited as long as it is a covalent bond that can improve the ⁇ -helix degree without inhibiting the function of the peptide.
  • it may be one or more bonds selected from the group consisting of a disulfide bond between cysteines, a diselenide bond, an ester bond, a maleimide bond, a thioester bond, a thioether bond, and a bond formed by a click reaction.
  • the covalent bond may be at least one selected from the group consisting of a disulfide bond between cysteine (C), homocysteine (Hcy) or penicillamine (Pen), a diselenide bond between selenocysteine (U), an ester bond, a maleimide bond using a thiol functional group capable of participating in a reaction, a thioester bond, a thioether bond, and a bond by a click reaction when the unnatural amino acid includes a triple bond or an azide group capable of inducing a click reaction.
  • a disulfide bond between cysteine (C), homocysteine (Hcy) or penicillamine (Pen) a diselenide bond between selenocysteine (U), an ester bond, a maleimide bond using a thiol functional group capable of participating in a reaction, a thioester bond, a thioether bond, and a bond by a click reaction
  • cysteine (C) when a disulfide bond (disulfide bond) is generated between two monomers forming a dipeptide, if cysteine (C) is used in the monomer, there are four atoms (CSSC; C, carbon; S, sulfur) between the two monomer peptide backbones.
  • CSSC cysteine
  • Hcy homocysteine
  • the bond distance between the two monomer peptide backbones can be adjusted to 5 (CCSSC or CSSCC) or 6 (CCSSCC).
  • a dimer in which one cysteine and one homocysteine are linked by oxidation can be used.
  • selenocysteine (U) or penicillamine (Pen) can be used instead of cysteine to form a disulfide bond of diselenide, hybridization or ester with cysteine or penicillamine.
  • the dimeric peptide may be connected in a parallel direction with all peptides (monomer peptides) comprising each monomer maintaining the N-terminus to C-terminus direction, or two peptides, one of which may be connected in an N-terminus to C-terminus direction and the other in a C-terminus to N-terminus direction, i.e., in an antiparallel direction.
  • the peptides (monomer peptides) comprising each monomer may be connected in an antiparallel direction to each other. In this case, the sequences of each monomer may be the same or different from each other.
  • the dimeric peptide may be lipidated at the N-terminus with a fatty acid.
  • the dimeric peptide may have a C 6 to C 16 fatty acid bound to it at position X 1 . Such fatty acid binding may further enhance cell penetration ability.
  • the dimeric peptide of the present invention was confirmed to move into cells and target mitochondria even at a concentration of less than 100 nM, and to exhibit a recovery effect on mitochondrial dysfunction even at a nanomolar concentration, in contrast to the conventional mitochondrial-specific peptides which exhibit a recovery effect on mitochondrial dysfunction at a micromolar concentration (see Example 4, Comparative Examples 1 to 5, etc.). Therefore, the pharmaceutical composition can contain the peptide at a nanomolar concentration, and exhibits an excellent therapeutic effect even at such a low concentration at the nanomolar level.
  • the dimeric peptide of the present invention has little or no cytotoxicity at the concentration at which it is effective, and exhibits the effect of restoring various mitochondrial dysfunctions by specifically targeting mitochondria (particularly, cardiolipin present in the inner mitochondrial membrane).
  • the dimeric peptide exhibits cytotoxicity only at a concentration of micromolar or higher, and it was confirmed that the concentration at which 50% of cultured cells were killed was 10 micromolar (see Example 6, etc.).
  • the dimeric peptide was confirmed to exist at a remarkably high ratio in the mitochondrial fraction when treated to cells, and furthermore, it was found that it was preferentially targeted to damaged mitochondria (see Examples 7 and 9, etc.).
  • the dimeric peptide has the effect of restoring mitochondrial function and increasing cell survival rate by selectively binding to cardiolipin exposed in damaged mitochondrial inner membrane, and it was confirmed that it can suppress ROS production, promote ATP production, and restore membrane potential by protecting or restoring the cristae structure of the mitochondrial inner membrane (see Examples 10 to 12, etc.).
  • the effect of the dimeric peptide of the present invention is significantly improved compared to the prior art. Specifically, compared to the SS-31 peptide known to bind to cardiolipin, the dimeric peptide of the present invention was confirmed to be significantly improved in all aspects, including cell penetration ability, cardiolipin binding ability, ROS production inhibition ability, ATP production promotion ability, and membrane potential recovery ability (see Comparative Examples 1 to 5, etc.).
  • a dimeric peptide may be a homodimer (including a dimer of two peptides having different sequences) in which peptides composed of the units of formula 1 consisting of 10 amino acids are linked to each other, but may also be a heterodimer in which another monomer peptide having a different amino acid length or a different sequence characteristic from formula 1 is linked to the unit of formula 1 as long as it maintains the unique ⁇ -helical structure of the present invention.
  • the other monomer peptide having a different amino acid length may be a monomer peptide in which one or more amino acids are added to one or both ends of the monomer peptide of formula 1 to make it longer.
  • the dimeric peptide can form an oligomer by self-assembly through interaction (see Example 5, etc.).
  • the dimeric peptide is oligomerized to a certain level, the cell penetration ability can be further increased.
  • the peptide or dimer thereof disclosed herein can be prepared into a pharmaceutical composition by mixing it with a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient in a prophylactically or therapeutically effective amount.
  • the pharmaceutical composition can be prepared in the form of a lyophilized preparation or an aqueous solution. See, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).
  • Acceptable carriers and/or excipients are nontoxic to the subject at the dosages and concentrations employed and include, but are not limited to, buffers (e.g., phosphate, citrate, or other organic acids); antioxidants (e.g., ascorbic acid or methionine); preservatives (e.g., octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohesanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (about 10 residues or less) polypeptides; proteins (e.g., serum albumin, gelatin, or immunoglobulins); hydrophilic polymers (e.g., polyvinyl
  • composition of the present invention can be formulated into a suitable form known in the art depending on the route of administration.
  • preventive or therapeutically effective amount refers to an amount of an effective ingredient of a composition that is effective in preventing or treating kidney disease or liver disease in a subject, and is sufficient to prevent or treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and does not cause side effects.
  • the level of the effective amount may be determined based on factors including the patient's health condition, the type and severity of the disease, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the method of administration, the time of administration, the route of administration and the excretion rate, the duration of treatment, the drugs used in combination or simultaneously, and other factors well known in the medical field. At this time, it is important to take all of the above factors into consideration and administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount of side effects or without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, weight, type and degree of disease, form of drug, route and period of administration, etc. of the subject (patient), and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the daily dosage may be 0.001 to 100 mg/kg, specifically 0.01 to 10 mg/kg, and more specifically 0.1 to 10 mg/kg.
  • Administration may be once a day or divided into several times, and administration may be performed for a long period of time or over a long period of time by implanting an infusion pump, etc.
  • parenteral administration can be, for example, parenteral administration means administration via injection (e.g., bolus injection) or infusion.
  • Parenteral administration includes subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraarterial injection, intraperitoneal injection, intracerebral injection, intrathecal injection or intracerebroventricular injection.
  • the composition according to the present invention is administered subcutaneous injection, intravenous injection or intraperitoneal injection.
  • a method for preventing or treating a kidney disease or a liver disease comprising the step of administering a peptide or a dimer thereof disclosed herein to a subject in need thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a monomeric peptide or a dimeric peptide thereof disclosed herein may be administered alone or in combination with one or more other effective ingredients.
  • the disease targeted by the one or more other effective ingredients may be the same as or different from the disease targeted by the pharmaceutical composition of the present invention for prevention or treatment.
  • the additional therapeutic or preventive agent may exhibit a primary effect, an auxiliary effect, or a complementary effect in preventing or treating the kidney or liver dysfunction (disorder).
  • the other active ingredient for kidney disease can be one or more selected from the group consisting of, but not limited to, enalapril, fosinopril, lisinopril, perindopril, irbesartan, losartan, olmesartan, telmisartan, and dapagliflozin.
  • the effect of improving, preventing or treating kidney or liver function abnormality (disorder) that occurs as a side effect when the other effective ingredient is used to prevent or treat the disease that is aimed can be obtained by the pharmaceutical composition.
  • kidney damage can be suppressed by co-administering it with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • liver damage can be suppressed by co-administering it with the peptide or pharmaceutical composition of the present invention.
  • the peptide or pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with one or more drugs that induce nephrotoxicity.
  • the one or more drugs that induce nephrotoxicity may include, but are not limited to, an antibiotic, an anticancer agent, an antifungal agent, an antiviral agent, or an immunosuppressant.
  • the one or more drugs causing nephrotoxicity may be one or more selected from the group consisting of colistin, doxycycline, gentamicin, vancomycin, cisplatin, gemcitabine, ifosfamide, methotrexate, nitrosoureas, amphotericin B, zalcitabine, didanosine, stavudine, zidovudine, aristolochic acid, and carboxy-atractyloside, but are not limited thereto.
  • the peptide of the present invention or a dimer thereof exhibits an excellent therapeutic effect on nephrotoxicity (see Example 15, etc.).
  • the peptide of the present invention CMP3013 or CMP3029
  • indicators of renal damage blood BUN, CRE, and renal tissue cytochrome C, NGAL, etc.
  • the composition of the present invention can effectively prevent renal damage when administered together with various types of drugs (antibiotics, anticancer agents, etc.) that exhibit nephrotoxicity, such as colistin.
  • the peptide or pharmaceutical composition of the present invention may be co-administered with one or more drugs that induce hepatotoxicity.
  • the pharmaceutical composition disclosed herein can be administered before or after the kidney disease or liver disease is induced.
  • the combination administration can be administered simultaneously, sequentially, or concurrently.
  • the peptide or pharmaceutical composition of the present invention may be administered in single or multiple doses as needed.
  • the present inventors designed an ⁇ -helical peptide consisting of 10 amino acids.
  • the amphipathic ⁇ -helical structure of the peptide according to the present invention can cause much stronger hydrophobic interactions with the fatty acid side chains of cardiolipin because it has a longer distance (about 11.3 ⁇ ) between the hydrophilic and hydrophobic amino acid side chains (Fig. 4a).
  • the ⁇ -helical peptide contains four or more positively charged sites in the helical structure, it has binding affinity for multiple cardiolipin molecules.
  • leucine (L) the reference amino acid in the hydrophobic moiety of the peptide (amino acids at positions 1, 4, 5, and 8 in the peptide schematic of Figure 4b), was substituted with several types of hydrophobic amino acids to evaluate the mitochondrial targeting ability, etc.
  • C cysteine
  • R is arginine
  • X 1 , X 4 , X 5 , and X 8 are each independently leucine (L) or cyclohexylalanine (Cha, X).
  • Monomeric peptides were prepared in two types, acetyl-capped or fluorescently labeled.
  • the acetyl-capped monomer peptides were designated as CMP3001m to CMP3015m, respectively.
  • Their amino acid sequences, calculated masses, and observed masses are shown in Table 2 below.
  • Monomeric peptides labeled with TAMRA at the N-terminus were also synthesized in the same manner as the acetyl-capped monomer peptides, and were designated as FL-CMP3001m to FL-CMP3015m, respectively.
  • Their amino acid sequences and mass spectrometry results are shown in Table 3 below.
  • Hdf means cyclohexylalanine (Cha), phenylalanine (F), leucine (L), and/or tyrosine (Y), thereby increasing the diversity of hydrophobic amino acids.
  • the deconvolution peptide library (16 sub-libraries) was synthesized using the Fmoc solid-phase peptide synthesis method as described in Experimental Example 1.1. Specifically, 0.51 mmole/g of rink amide MBHA resin (Sigma, USA) was used as the solid-phase resin, and 20% piperidine (Sigma) was used for deprotection. After deprotection, the mixture was washed three times with DMF, five times with DCM, and three times with DMF again, and coupled using 6 equivalents each of amino acids with Fmoc protection group, DIPEA, and PyBOP.
  • the total volume of the reaction solution was 5 ml, and 1.5 equivalents each of four amino acids (Y, L, F, and Cha) were used to explore the initial reaction conditions.
  • the mixture was washed three times with DMF, three times with DCM, and three times with DMF again.
  • the cleavage cocktail (95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% DW) was used for reaction for 2 hours and then precipitated with cold ether. After evaporating the solvent using nitrogen gas, the product was dissolved in DMSO and subjected to HPLC.
  • a Phenomenex C18 column (3 ⁇ m, 4.6 ⁇ 150 mm) was used as a stationary phase in an HPLC instrument (Infinity 1260, Agilent, USA), and 0.1% (v/v) TFA water was used as the mobile phase as buffer A and 0.1% (v/v) TFA ACN was used as the buffer B.
  • the gradient condition was a linear gradient from 0% buffer B at 0 min to 100% buffer B thereafter for 60 min.
  • the wavelength of the UV detector was checked using 209 and 220 nm.
  • the equivalent of each amino acid was determined by decreasing the equivalent ratio of the amino acid with a higher coupling rate and increasing the equivalent ratio of the amino acid with a relatively lower coupling rate while maintaining a total of 6 equivalents. Specifically, the same molar number of the four amino acids was injected into HPLC to derive the molar extinction coefficient ratio, and then the molar ratio of the four amino acids included in the reaction product was calculated using the area under the HPLC peak.
  • the purity of the 16 sub-libraries was confirmed using an HPLC instrument (Infinity 1260, Agilent). Specifically, a Phenomenex C18 column (3 ⁇ m, 4.6 ⁇ 150 mm) was used as the stationary phase of HPLC, and 0.1% (v/v) TFA water and 0.1% (v/v) TFA ACN were used as the mobile phases as buffer A and buffer B, respectively.
  • the gradient condition was maintained at 5% buffer B for 0-5 min, then changed to a linear gradient of 5-70% buffer B for 5-30 min, and a linear gradient of 70-100% buffer B for 30-40 min.
  • the wavelength of the UV detector was checked using 220 and 280 nm.
  • the 16 synthesized sub-libraries were purified under HPLC conditions, and chromatograms for each sub-library were obtained.
  • Fig. 6 A representative example of the obtained chromatograms is shown in Fig. 6 for the L1X sub-library, and the HPLC chromatogram results for all 16 sub-libraries are presented in Table 5 below as a range of continuous retention times (RT) from the first peak to the last peak.
  • RT continuous retention times
  • Example 2.2.2 Analysis of the ability of monomeric peptide sub-library to inhibit ROS production
  • ROS levels were performed according to the method described in Experimental Example 6 below. Specifically, HeLa cells (96-well plate, 2 ⁇ 10 4 cells/well) were cultured for 1 day and then treated with 100 nM of the monomeric peptide sub-library for 3 h. The peptide-treated cells were washed with PBS and stained with 25 ⁇ M DCFDA for 30 min. Then, the cells were treated with 0.5 mM H 2 O 2 to induce oxidative stress. The production of ROS was read as fluorescence intensity using a microplate reader (TECAN) at 37°C for 30 min.
  • TECAN microplate reader
  • cyclohexylalanine (Cha) or leucine (L) was selected for the preferred amino acid because the CMP3013 peptide has leucine (L) at this position.
  • Example 2.2 four kinds of monomer peptides were synthesized by combining the selected hydrophobic amino acids, and were designated as CMP3029m to CMP3032m, respectively. The amino acid sequences and mass spectrometry results of these monomer peptides are shown in Table 7 below. Monomer peptides labeled with TAMRA were also synthesized by the same method, and were designated as FL-CMP3029m to FL-CMP3032m, respectively. The amino acid sequences and mass spectrometry results of these monomer peptides are shown in Table 8 below.
  • Example 2.1 In order to make the monomer peptides synthesized in Example 2.1 into a dimer bundle, air oxidation was used to form a disulfide bond between the two monomer peptides.
  • the monomer peptides without fluorescent labeling were dissolved in 0.1 M ammonium bicarbonate buffer at a concentration of 5 to 10 mg/ml, and dimerization was performed according to the method described in Experimental Example 1.2.
  • the dimer peptides purified by HPLC were named CMP3001 to CMP3015, respectively, and their masses were analyzed using MALDI-TOF.
  • Dimeric bundle peptides were synthesized using the monomeric peptides CMP3029m to CMP3032m synthesized in Example 2.3. Dimerization was performed according to the method described in Experimental Example 1.2 in the same manner as the synthetic method used in Example 3.1, and two types of dimers, non-fluorescently labeled and fluorescently labeled, were synthesized and named CMP3029 to CMP3032 and FL-CMP3029 to FL-CMP3032, respectively. The amino acid sequences, HPLC purity analysis results, and mass spectrometry results for these dimeric peptides are shown in Tables 11 and 12, respectively.
  • the dimer peptide having only one disulfide bond was dissolved in triple-distilled water containing 10% acetic acid, and a methanol solution containing iodine was added dropwise thereto, thereby reacting for 50 minutes under strong oxidizing conditions so that the Acm protecting group is removed and a new disulfide bond is formed.
  • CMP3013 dimeric peptide was synthesized by air oxidation reaction, and the retention time of the CMP3013 antiparallel dimeric peptide synthesized using the protecting group above and HPLC was measured (Fig. 8a). The purification of the peptide was performed by HPLC, and the stationary phase was a Zorbax C18 column (3.5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 150 mm).
  • Buffer A [3-distilled water containing 0.1% (v/v) TFA] and buffer B [ACN containing 0.1% (v/v) TFA] were used as the mobile phases in a binary solvent system.
  • the gradient method was as follows: linear gradient of 5% buffer B for 5 min and 5-70% buffer B for 30 min from 5 min; 70-100% buffer B for 30-40 min.
  • the flow rate of the mobile phase was set to 1.0 ml/min.
  • the cell penetration ability was evaluated using a fluorescently labeled version of the dimeric bundle peptide synthesized in Example 3, and the EC 50 value was measured according to the method described in Experimental Example 3. Specifically, HeLa cells were treated with various concentrations of TAMRA-labeled dimeric bundle peptide for 3 hours, and the EC 50 value was measured.
  • the EC 50 is the concentration of the peptide at which half of the cells exhibit fluorescence due to peptide penetration.
  • the retention time on the HPLC column for each peptide was observed according to the change in temperature, and the tendency of self-assembly was identified through the change in the above value.
  • 10 ⁇ l of each peptide solution of 0.2 mM was injected into the HPLC, and the time (RT) at which the peptide was detected was measured at 40°C and 5°C, respectively.
  • the stationary phase conditions and mobile phase conditions of HPLC used well-known methods. Normally, the better the oligomer is formed, the longer the detection time at a relatively higher temperature of 40°C, and therefore the difference ⁇ RT from the value measured at 5°C increases.
  • the ⁇ RT values measured in CMP3001 to CMP3015 are shown in Table 14 below.
  • oligomerization had a positive correlation with cell penetration ability (data not shown), but in the case of dimeric bundle peptides containing cyclohexylalanine (Cha), there was no significant correlation between the degree of oligomerization between dimeric bundle peptides and cell penetration ability (Fig. 10).
  • the solubility in water can change depending on the ratio of cyclohexylalanine (Cha) contained in the peptide, and excessive oligomerization can cause a decrease in solubility. In other words, although cell penetration ability is generally increased by oligomerization, oligomerization exceeding a certain critical point can actually decrease cell penetration ability.
  • the relative cytotoxicity of the dimeric bundle peptides according to the present invention was comparatively analyzed. To this end, 1 ⁇ 10 5 HeLa cells were treated with each peptide at 100 nM for 3 hours, washed three times with PBS, and then PBS was added again. After 30 minutes, five random images of each sample were taken using an optical microscope, and the number of cells normally attached to the cell culture dish was measured.
  • Fig. 11 The measurement results are shown in Fig. 11.
  • cytotoxicity of the peptide containing two cyclohexylalanines (Cha), an unnatural amino acid was higher than that of the peptide containing only one cyclohexylalanine (Cha) based on the monomer (subunit).
  • CMP3011 to CMP3014 a difference in toxicity was shown depending on the position of the amino acid. That is, CMP3011 showed a lower cell penetration ability compared to CMP3012 and CMP3013, but showed greater cytotoxicity than these two.
  • CMP3011 cyclohexylalanine
  • CMP3013 cyclohexylalanine
  • Fig. 12 Cytotoxicity was performed by WST-1 assay. Specifically, 1 ⁇ 10 4 HeLa cells were seeded in a 96-well plate. After 24 hours, the CMP3013 peptides at various concentrations indicated in Fig. 12 were treated and cultured for one day. After the culture was completed, the culture medium was replaced with fresh medium, 10 ⁇ L of EZ-Cytox (DoGEN, Korea) was treated per well, cultured for 30 minutes, and then the absorbance was measured at 450 nm. As a result, it was confirmed that the cytotoxicity of CMP3013 appeared only at concentrations above micromolar level, and the concentration at which 50% of the cultured cells were killed was 10 micromolar (Fig. 12).
  • mitochondrial fractionation was performed according to the method described in Experimental Example 4. Specifically, HeLa cells were treated with FL-CMP3001 to FL-CMP3015, respectively, at the EC 50 concentration (see Table 13) for 3 hours, and then the cells were harvested and fractionation was performed.
  • CMP3013 was found in the highest proportion in the mitochondrial fraction, followed by CMP3010 and CMP3004, which were found to have high proportions in the mitochondrial fraction. Furthermore, it was confirmed that almost all types of peptides were significantly more fractionated in mitochondria than in the cytoplasm.
  • CMP3013, CMP3029, CMP3030, CMP3031, and CMP3032 were selected as therapeutic agent candidates by comprehensively considering the cell penetration ability, cytotoxicity, and ROS generation inhibition ability of each peptide evaluated through the above examples, and additional analysis was performed on these peptides.
  • MitoTrackerTM was stained on HeLa cells treated with 100 nM FL-CMP3013 for 3 hours according to the method described in Experimental Example 5, and fluorescence analysis was performed. Carbonyl cyanide m -chlorophenyl hydrazone (CCCP) to damage mitochondria was treated at a concentration of 20 ⁇ M for 30 minutes. The analysis results confirmed that FL-CMP3013 penetrated into mitochondria at a high rate, but the correlation factor between FL-CMP3013 and MitoTracker was unexpectedly low in the extended morphology of mitochondria (Fig. 15a).
  • CCCP Carbonyl cyanide m -chlorophenyl hydrazone
  • the round shape of mitochondria is known to be a dynamic phenomenon that occurs when their function is impaired and they cannot function normally
  • the observed properties of FL-CMP3013 suggest that this peptide can specifically bind to abnormal mitochondria with dysfunction or abnormalities, and further that FL-CMP3013 interacts with cardiolipin present in the inner mitochondrial membrane.
  • Drp1 a fluorescently labeled fission initiation protein, Dynamin-related protein 1 (Drp1), and confirmed that it colocalized with CMP3013.
  • Drp1-GFP was performed according to the method described in Experimental Example 10. As a result, consistent with the above observed results, it was confirmed that FL-CMP3013 perfectly colocalized with Drp1 (Fig. 15c). The same experiment was performed for CMP3029, CMP3030, CMP3031, and CMP3032 as for CMP3013, and it was confirmed that these peptides also overlapped with Drp1 (Fig. 15d). In particular, among the peptides, CMP3029 overlapped with Drp1 the most (Fig. 15d). Drp1 is known to be the first protein recruited from the cytoplasm for fission when mitochondria are damaged, and thus the above experimental results show that the CMP3013 peptide preferentially traffics to (or penetrates into) damaged mitochondria in need of fission.
  • Example 9 since it was confirmed that the peptide according to the present invention was preferentially targeted to damaged mitochondria, in order to confirm whether the effect of this original peptide directly affects the cell survival rate, HeLa cells damaged by CCCP were treated with FL-CMP3013 and the cell survival was observed for 4 hours. As a result, cells treated with CCCP and FL-CMP3013 survived even after 4 hours, but cells treated with CCCP alone did not (Fig. 16). That is, cells treated with FL-CMP3013 showed a much higher cell survival rate than cells treated with FL-CMP3013 alone.
  • Example 11 Ability to restore mitochondrial function and protect cristae
  • CsA Cyclosporin A
  • FL-CMP3012 FL-CMP3013
  • FL-CMP3015 a positive controls
  • 3 X 10 6 SH-SY5Y cells were stained with JC-1 dye, dispensed into each well of a 96-well plate (1 X 10 5 cells), and treated with 20 ⁇ M antimycin A to induce a decrease in mitochondrial membrane potential.
  • CsA or the peptide according to the present invention (1 ⁇ M) was treated to each sample for the recovery of mitochondrial membrane potential.
  • the fluorescence ratio (red/green) of JC-1 in the presence of CsA or the peptide was measured.
  • the relative membrane potential change was measured 15 minutes after antimycin A treatment compared to that of normal cells, which were set as 1.
  • the mitochondrial membrane potential recovery effect was observed at a similar level in FL-CMP3013 as well as in FL-CMP3012 and FL-CMP3015, and this effect was comparable to cyclosporin A (Fig. 17h).
  • TEM transmission electron microscopy
  • Example 11.1 These series of experimental results are consistent with the results of Example 11.1, which confirmed that almost all mitochondrial functions were restored even when the peptide of the present invention including CMP3013 was treated at a low concentration of 10 to 30 nM, and ultimately, it was found that the recovery of mitochondrial function was associated with the structural preservation of cristae.
  • the concentration of the peptide of the present invention that can effectively restore mitochondrial functional damage is approximately 10 to 30 nM, and the therapeutic index in the above concentration range is calculated to be approximately 300 to 1,000.
  • Such indices show that the peptides of the present invention, including CMP3013, are very safe for the human body.
  • HeLa cells were pretreated with various inhibitory conditions as follows: cooling to 4°C (inhibition of ATP-dependent pathway); 5-( N -ethyl- N -isopropyl)amiloride (EIPA) treatment (inhibition of macropinocytosis); methyl- ⁇ -cyclodextrin (M ⁇ CD) treatment (cholesterol depletion); sodium chlorate (NaClO 3 ) treatment (inhibition of proteoglycan-dependent pathway); chlorpromazine (CPZ) treatment (inhibition of clathrin-mediated endocytosis).
  • EIPA N -ethyl- N -isopropyl)amiloride
  • M ⁇ CD methyl- ⁇ -cyclodextrin
  • NaClO 3 sodium chlorate
  • CPZ chlorpromazine
  • CMP3013 targets cardiolipin in the inner membrane exposed by mitochondrial damage.
  • the peptide according to the present invention penetrates into cells by endocytosis, escapes from endosomes, and preferentially moves to damaged mitochondria.
  • CMP3013 for cardiolipin-rich membranes identified in Example 9 two model systems mimicking the inner mitochondrial membrane were constructed using 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE) according to the method described in Experimental Example 12, and cardiolipin binding assays were performed using NBD-labeled CMP3013 monomer (NBD-CMP3013m).
  • POPC 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • POPE 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • NBD-labeled CMP3013 monomer peptide was first synthesized, the sequence and mass spectrometry data of which are shown in Table 15 below, and the HPLC chromatogram is shown in Figure 19a, respectively.
  • the binding affinity of the peptide to liposomes was confirmed using the surface plasmon resonance (SPR) technique. Specifically, the L1 sensor chip was inserted into the BiacoreTM T200 SPR system (Cytiva, USA), and then liposomes were injected to bind the liposomes to the sensor chip. Afterwards, 1 ⁇ M of NBD-CMP3013m peptide was injected to confirm the increased signal intensity due to the binding of liposomes to CMP3013.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the peptides of the present invention elicited about 50% higher response units (RU) for POPC/POPE membranes containing 10% cardiolipin compared to POPC/POPE membranes alone (see upper graph in Figure 22a). Furthermore, dissociation of the peptides from cardiolipin-containing membranes could not be observed under all dissociation conditions attempted because the membrane itself was destroyed. These findings suggest that the dissociation of the peptides according to the present invention from cardiolipin is very slow and, consequently, that CMP3013 interacts very strongly with cardiolipin-containing membranes (data not shown).
  • pathogenic cardiolipin remodeling means a decrease in cardiolipin content or an increase in oxidized mono-lyso cardiolipin (MLCL) and oxidized di-lyso cardiolipin (DLCL) in the mitochondrial inner membrane.
  • MLCL mono-lyso cardiolipin
  • DLCL oxidized di-lyso cardiolipin
  • cardiolipin (CL) induces the curvature necessary for functional proteins such as proteins constituting the electron transport chain to function properly.
  • pathogenic cardiolipin remodeling destroys the curvature of this inner membrane, causing mitochondrial dysfunction (Fig. 20).
  • Amphipathic ⁇ -helical peptides penetrate cells and regenerate the curvature of the mitochondrial inner membrane by binding to multiple cardiolipins.
  • the peptide according to the present invention specifically and strongly binds to cardiolipin or pathogenic remodeled cardiolipin-containing membranes, thereby gathering functional proteins of mitochondria, thereby correcting mitochondrial dysfunction (Fig. 20).
  • CMP3013 This function of CMP3013 is consistent with the results of confocal microscopy analysis of the colocalization of CMP3013 and CL-specific molecule NAO in Example 9 (Fig. 15b), which provides strong evidence that CMP3013 (or its monomer) strongly binds to the inner membrane of damaged mitochondria, i.e., the inner membrane rich in CL, and also stays there to protect the structure of the membrane or cristae.
  • the present inventors showed that the CMP3013 (or its reduced monomer) peptide preferentially binds to damaged mitochondria, and can promote the recovery and maintenance of the cristae structure destroyed by hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or other damaging agents.
  • CMP3013 has four or more positive charges and four hydrophobic moieties, it preferentially and more tightly binds to several cardiolipin molecules than to other components of the inner mitochondrial membrane (IMM).
  • IMM inner mitochondrial membrane
  • SS (Szeto-Schiller) peptides are representative peptides known to exhibit therapeutic effects by targeting mitochondria, and are composed of amino acids containing relatively hydrophobic benzene rings and positively charged amino acids cross-linked to exhibit a ⁇ -sheet conformation (Fig. 2).
  • SS-31 has been reported to bind to cardiolipin and improve mitochondrial function.
  • SS-31 has an excellent therapeutic effect by improving mitochondrial function, and animal and clinical trials are underway for various diseases related to mitochondrial dysfunction.
  • the phase 3 clinical trial for mitochondrial myopathy of SS-31 which was conducted for three years (2017-2020), failed.
  • SS-31 is a ⁇ -sheet type peptide with low cell penetration rate. Therefore, in order to exhibit therapeutic effects, it is necessary to administer a high concentration of SS-31 peptide. However, in this case, there is a problem of increased cytotoxicity. Therefore, in order to use a low concentration of peptide, it is necessary to improve cell penetration rate, and furthermore, in order to exhibit therapeutic effects even with a low concentration of peptide, it is necessary to increase the number of cardiolipins interacting per peptide molecule.
  • the present invention has been designed to solve the technical challenges faced by the existing mitochondrial targeting peptides as described above, and significantly improves cell permeability, thereby enabling use at a low concentration, and maximizing the therapeutic effect by allowing one molecule to interact more with cardiolipin.
  • the cell permeability, cardiolipin binding ability, ROS production inhibition ability related to mitochondrial function, ATP production promotion ability, membrane potential recovery ability, etc. of the existing mitochondrial targeting peptide SS-31 and the CMP3013 peptide according to an embodiment of the present invention are compared and analyzed, thereby proving that the peptide of the present invention has a remarkable effect compared to the existing technology.
  • the cell penetrating ability was performed according to the method described in Experimental Example 3, and the mitochondrial targeting ability was evaluated by mitochondrial fractionation according to the method described in Experimental Example 4.
  • a mitochondrial penetrating peptide MPP1a; see the literature [Horton, Kristin L et al. "Mitochondria-penetrating peptides.” Chemistry & biology vol. 15,4 (2008): 375-82.]
  • MPP1a mitochondrial penetrating peptide
  • the amino acid sequence of MPP1a is as follows: X(dR)XKX(dR)XK (wherein, X is cyclohexylalanine, dR is D-arginine, and K is lysine.)
  • LR10 which is included in the L1L, L4L, L5L and L8L sub-libraries as a peptide according to one embodiment of the present invention in addition to CMP3013, was used as an additional comparison group.
  • the amino acid sequence of LR10 is as follows: AcNH-RCRLLRRLCR-C(O)NH 2
  • CMP3013 and LR10 showed a cell penetration rate that was improved by about 100 times compared to the existing SS-31 (Fig. 21a).
  • CMP3013 was evaluated to have the best cell penetration ability as it showed the lowest EC 50 value, and LR10 also had an EC 50 value determined at the nanomolar level similar to CMP3013.
  • MPP1a and SS-31 had EC 50 values determined at the micromolar level, and it was confirmed that their cell penetration abilities were significantly lower than that of CMP3013 (Fig. 21a).
  • the peptides according to the present invention have significantly improved cell penetration ability and mitochondrial targeting ability compared to the existing SS-31 and MPP1a peptides, and thus can have the effect of delivering a therapeutically effective amount of the peptide even at a low concentration.
  • NBD-labeled CMP3013 monomer NBD-labeled CMP3013 monomer
  • NBD-labeled SS-31 NBD-SS-3
  • CMP3013m induced about 50% higher response units (RU) for the POPC/POPE membrane containing 10% cardiolipin (POPC:POPE:CL) than for the POPC/POPE membrane alone (POPC:POPE) (upper graph in FIG. 22a).
  • SS-31 showed no difference in binding affinity for the two types of membranes (lower graph in FIG. 22a).
  • CMP3013m had very strong binding affinity and did not dissociate from the membrane containing cardiolipin.
  • cardiolipin induces curvature of the inner membrane of mitochondria, which enables normal functioning of mitochondria.
  • Both CMP3013 and SS-31 have a common mechanism of action in which they specifically bind to cardiolipin present in the inner membrane of mitochondria, thereby providing curvature to the inner membrane, thereby enabling the maintenance of the cristae structure. Since the CMP3013 of the present invention has a binding affinity for cardiolipin that is about 100 times stronger than that of SS-31, it is expected to overcome the problem of little therapeutic effect at low concentrations, which was present in existing mitochondria-specific peptides such as SS-31.
  • ROS production inhibition abilities of SS-31 and CMP3013 were tested.
  • the relative ROS levels in cells were compared by fluorescence intensity according to the method described in Experimental Example 6, and SH-SY5Y cells were treated with four different mitochondrial damaging agents (200 ⁇ M CCCP, 50 ⁇ M rotenone, 10 ⁇ M antimycin A, or 50 ⁇ M H 2 O 2 ) to induce ROS production due to mitochondrial damage.
  • Comparative Examples 3 to 5 demonstrated that the ⁇ -helical peptide of the present invention exhibited a significantly higher mitochondrial function recovery effect at a much lower concentration compared to existing mitochondrial targeting peptides including SS-31.
  • the CMP3013 peptide labeled with cyanine 5.5 was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to normal male C57BL/6 mice, and the organs were removed 24 hours later and IVIS imaging analysis was performed. As a result, it was confirmed that CMP3013 was mainly distributed in the liver, lungs, spleen, and kidneys (Fig. 26).
  • Example 14 Improvement effect on damaged mitochondria in hTEC cells
  • hTEC cells pretreated with CMP3013 at various concentrations for 3 hours mitochondrial damaging conditions were created using H 2 O 2 as a mitochondrial damaging agent, and the levels of ROS and ATP were analyzed according to the methods described in Experimental Examples 7 and 8, respectively.
  • ROS levels and membrane potential were measured by treating 20 nM or 60 nM CMP3013 peptides, followed by 1 mM H 2 O 2 for 30 minutes to create cell membrane damaging conditions.
  • ATP levels were measured by treating 10 nM or 20 nM CMP3013 peptides, followed by 0.5 mM H 2 O 2 for 1 hour to create cell membrane damaging conditions.
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR extracellular acidification rate
  • PER proton efflux rate
  • the oxygen consumption rate by mitochondrial respiration per minute decreased in the H 2 O 2 treatment group compared to the control group (CTL-hTEC), but the oxygen consumption rate increased again in the CMP3013 administration group (results between 40 and 60 minutes in Fig. 29a).
  • the increased oxygen consumption rates were similar at two concentrations (10 nM and 50 nM) of CMP3013.
  • the extracellular acidification rate (ECAR), which represents the glycolytic fluxes by mitochondrial respiration per minute, and the proton efflux rate (PER), which represents ATP production, were significantly reduced in the H 2 O 2 treatment group, and a significant synergistic effect was observed upon administration of CMP3013 (Fig. 29b, ECAR; and Fig. 29c, PER). In particular, a more significant synergistic effect was observed at a low concentration of 10 nM CMP3013.
  • Example 15.1 Preparation of an animal model of colistin-induced nephrotoxicity (CIN) and confirmation of renal damage
  • mice Seven-week-old male C57BL/6 mice were acclimatized for 3 days under free-feeding conditions and then randomly divided into the following three groups: control group (Sham), CIN model (colistin administration group), and CIN model + peptide (CMP3013 or CMP3029) administration group.
  • Colistin Sigma-Aldrich, USA
  • CMP3013 and CMP3029 were injected intraperitoneally every other day (Day 0, 2, 4, and 6) to colistin-treated mice.
  • CMP3013 was injected at a dose of 1 mg/kg (Table 16), and CMP3029 was injected intraperitoneally at a dose of 0.3 mg/kg or 1 mg/kg (Table 17).
  • BUN was measured on Day 7 from the first administration of colistin using an autoanalyzer (Wako Chemical Industries, Japan).
  • creatinine was measured by the modified Jaffe reaction using an autoanalyzer (Hitachi Chemical Industries, Ltd., Japan).
  • the experimental plan of the colistin-induced nephrotoxicity animal model is shown in Fig. 30.
  • mice that exhibited nephrotoxicity by daily subcutaneous administration of colistin were injected intraperitoneally with 1 mg/kg of CMP3013 every other day starting from day 1, and on day 7, blood BUN and creatinine levels and the expression of proteins related to renal damage were confirmed according to the method described in Experimental Example 14.
  • CMP3013 was shown to reduce BUN and creatinine increased by nephrotoxicity by about 50% (Fig. 31a and Fig. 31b), and the survival rate of the group administered 1 mg/kg of CMP3013 was similar to the control group (survival rate 100%) and showed a much longer survival rate than the CIN mice (Fig. 31c).
  • NGAL renal damage indicator
  • P-21 cell cycle arrest and apoptosis indicator
  • 8-OHdG biomarker for oxidative DNA lesions
  • cytochrome C mitochondrial apoptosis indicator
  • co-administration of the peptides of the present invention can effectively prevent kidney damage.
  • iv means intravenous administration
  • ip means intraperitoneal administration.
  • rats 3 animals were used for each group, and in the case of mice, 10 animals were used for each group.
  • Example 16.1 it was confirmed whether renal damage was inhibited by peptide administration in a renal damage model induced by IRI after pre-administration of peptide (CMP3013 or SS-31) to rats.
  • CMP3013 or SS-311 peptide
  • the levels of BUN and CRE in the CMP3013-administered group were reduced by about 40 to 50% compared to the IRI control group (Fig. 34a and Fig. 34b).
  • the CMP3013 administration group showed an excellent therapeutic effect on acute renal injury even though the administration dose was only half that of SS-31.
  • SS-31 has the ability to restore mitochondrial function by binding to cardiolipin in the mitochondrial inner membrane, but has a problem in that its cell penetration efficiency is poor due to its ⁇ -sheet type structure.
  • high-concentration administration can be considered, but it has been raised as a problem that high-concentration administration can cause cytotoxicity.
  • the possibility of solving the above-mentioned problem was confirmed through data proving that low-concentration administration (1 mg/kg) of CMP3013 has a better acute renal injury treatment effect than SS-31.
  • Example 16.1 whether renal damage was inhibited in a renal injury model induced by IRI after pre-administration of CMP3013 (1 mg/kg or 5 mg/kg) in mice was examined (Fig. 35).
  • BUN and creatinine (CRE) in the serum of IRI mice were significantly increased compared to the control group, and the serum BUN and creatinine levels were decreased by CMP3013 administration (1 mg/kg or 5 mg/kg administration group) (Figs. 36a and 36b).
  • the results of immunohistochemical analysis of damaged renal tissues showed that the CMP3013 administration group showed less tubular damage, cast formation, and inflammatory cell infiltration compared to the IRI model at both concentrations (Fig. 36c).
  • the experiment was conducted by changing the order of CMP3013 administration and renal damage induction (IRI model production). Specifically, 7-week-old male C57BL/6 mice were acclimatized for 3 days in an ad libitum condition, and then acute renal damage was induced according to the IRI model production method of Example 16.1. 1 mg/kg of CMP3013 was post-administrated by intravenous injection 1 hour after induction of acute renal damage, and BUN and serum creatinine were measured 23 hours later (Fig. 37).
  • the results of BUN and creatinine measurements are shown in Figures 38a and 38b.
  • CMP3013 was administered to an animal model of renal damage to confirm its efficacy in restoring renal function confirms that CMP3013 can be used as a treatment for actual renal damage.
  • CMP3013 was administered before inducing acute renal damage (Examples 16.2 and 16.3) or after inducing acute renal damage (Example 16.4), an inhibitory effect on renal damage was confirmed, and through this, it was confirmed that the mitochondrial-specific peptide of the present invention can provide an excellent effect in preventing and treating renal damage.
  • CMP3013 or CMP3029 7-week-old female C57BL/6 mice were acclimatized for 3 days on free-feeding, and then intravenously administered CMP3013 or CMP3029 at 2-day intervals for a total of 3 times (Day 0, 2, 4) (Tables 20 and 21). Then, on Day 5, 100 mg/kg of thioacetamide (TAA; Sartorius, Germany) was intraperitoneally administered to induce acute liver damage.
  • Administration information (administration route, administration dose, etc.) of CMP3013 and CMP3029 is summarized in Table 20 (CMP3013, intravenous administration) and Table 21 (CMP3029, intravenous administration).
  • iv means intravenous administration and ip means intraperitoneal administration.
  • CMP3013 and CMP3029 On Day 7 of administration of CMP3013 and CMP3029, serum samples were obtained from blood collected from the heart, and the samples were analyzed using a blood analyzer (Hitachi Chemical Industries, Ltd., Japan). As indicators of liver damage, blood AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), and ALP (alkaline phosphatase) were measured and evaluated.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • ALP alkaline phosphatase
  • the mitochondria-specific peptide (monomer or dimer thereof) of the present invention has the characteristics of having hydrophobic amino acids at positions 1, 4, 5, and 8 and hydrophilic amino acids at positions 3, 6, 7, and 10, thereby exhibiting amphipathic properties and an ⁇ -helical structure, and has several important advantages that suggest high potential for use as a therapeutic agent.
  • the peptides of the present invention preferentially enter mitochondria (about 80%), which means that the amount present in the cytoplasm that causes side effects is not large.
  • the peptides of the present invention preferentially bind to cardiolipin, a specific phospholipid of the inner mitochondrial membrane, thereby protecting the cristae structure and providing a rigid membrane for the proper functioning of functional proteins.
  • the peptides of the present invention have strong binding affinity for multiple (or multiple) cardiolipin molecules, resulting in much stronger interactions than would be expected from a typical 1:1 complex. As a result, the dissociation of the peptides of the present invention from the cardiolipin-containing layer is very slow, making their effects even more potent.
  • the peptides of the present invention have a very low correlation with expanded mitochondria, while they are more highly correlated with donut-shaped or bulged mitochondria (Fig. 15a). That is, as mentioned above, this finding suggests that the peptides of the present invention are selectively localized to damaged mitochondria where a protective cristae organizing system is not present. For this reason, it is expected that only small amounts of the peptides according to the present invention are required to effectively block the formation of damaged cardiolipin (or cristae) and maintain functional cristae without affecting functional mitochondria. That is, the nanomolar therapeutic concentrations required for the peptides of the present invention to minimize cytotoxicity should be sufficient to protect mitochondrial functions, including ATP production and increased mitochondrial membrane potential.
  • the ⁇ -helical amphipathic peptides of the present disclosure were shown to preferentially bind to abnormal and damaged mitochondria and promote the restoration and/or maintenance of the cristae structure destroyed by treatment with H2O2 or other damaging agents. It is very encouraging that the therapeutic effect is promoted by very low concentrations of the present peptides in both in vitro cell-based experiments and in vivo animal model studies. Mitochondrial homeostasis, including biogenesis and mitophagy, allows cells to rapidly replace dysfunctional mitochondria with intact organelles. Therefore, it is expected that the therapeutic agent does not need to repair all defective mitochondria, and that a portion of the damaged mitochondria repaired by the present peptides will be sufficient to restore normal tissue function.
  • CMP3013 showed a recovery effect on mitochondrial-related indicators even with a small dose in renal injury cells
  • CMP3013 and CMP3029 peptides of the present invention showed a recovery effect on renal injury even with a low dose in a colistin-induced nephrotoxicity animal model (CIN)
  • CIN colistin-induced nephrotoxicity animal model
  • the ⁇ -helical amphipathic peptide of the present invention, CMP3013 showed a superior recovery effect on renal injury even with a half dose of SS-31 in an acute renal injury animal model, that it showed a renal injury-improving effect both when administered before or after inducing acute renal injury
  • CMP3013 and CMP3029 showed an effect on inhibiting liver cell damage or recovering damaged liver cells even with a low dose in an acute liver injury animal model.
  • Peptides were synthesized using a standard 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) solid-phase peptide synthesis (SPPS) method on an SPS microwave peptide synthesizer (Discover, CEM, USA).
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
  • SPPS solid-phase peptide synthesis
  • the rink amide MBHA resin was deprotected using 20% (v/v) piperidine in N , N -dimethylformamide (DMF), and the Fmoc-protected amino acids were coupled in the presence of N, N -diisopropylethylamine (DIPEA) and (benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).
  • DIPEA N -diisopropylethylamine
  • PyBOP (benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
  • the resin was washed several times with DMF and dichloromethane (DCM) with gentle shaking. Deprotection and coupling were repeated until the peptide of the desired sequence was synthesized. After the addition of the last amino acid, the N-terminus of the peptide was acetylated. Acetylation was
  • 5-carboxytetramethylrhodamine 5-TAMRA was conjugated to the peptide in the presence of O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), HOBt, and DIPEA in DMF.
  • HCTU O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • C6-NBD 6-(7-nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid
  • TSA trifluoroacetic acid
  • EDT ethanedithiol
  • TIS triisopropylsilane
  • the purification of the peptide was performed using high-performance liquid chromatography (HPLC).
  • the mobile phase consisted of water (buffer A) containing 0.1% (v/v) TFA and acetonitrile (ACN) (buffer B) containing 0.1% (v/v) TFA, and the stationary phase was a Zorbax C18 column (3.5 ⁇ m, 4.6 mm ⁇ 150 mm).
  • the purified peptide was lyophilized and dissolved in an appropriate solvent.
  • the molecular weight of the peptide was determined using a MALDI-TOF mass spectrometer (Bruker, USA).
  • dimer peptides For the preparation of dimer peptides, the lyophilized peptides were dissolved in 0.1 M ammonium bicarbonate. In some cases, ACN was added up to 40% (v/v) to increase the solubility of the peptides. The prepared peptide solution was stirred and oxidized under air using a shaker. After oxidation, the dimerized peptides were purified and lyophilized.
  • HeLa cells were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; Cytiva, SH30243.01, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, 16000-044, USA) and antibiotics (Gibco, 15240-062, USA).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Gibco, 15240-062, USA antibiotics
  • TAMRA-labeled peptides were added to 6 ⁇ 10 6 HeLa cells or 2 ⁇ 10 6 hTEC cells at an EC 50 concentration, and the cells were cultured for 3 h.
  • the cells were harvested, washed with cold PBS, and suspended in cold IB (30 mM Tris-HCl, pH 7.4; 225 mM mannitol; 75 mM sucrose; and 0.1 mM EGTA). Homogenization was performed using a pre-chilled Dounce homogenizer until 80–90% of the cells were disrupted. The lysed cells were monitored under a light microscope.
  • HeLa cells or hTEC cells were grown in glass-bottom dishes (SPL, 200350, Republic of Korea). Cells were then treated with peptides for 3 h and stained with MitoTrackerTM (Thermo Fisher Scientific, M7514, USA; 20 ⁇ M, 20 min), nonyl acridine orange (NAO; Thermo Fisher Scientific, A1372; 100 nM, 1 h), hoechst 33342 (1 ⁇ g/mL, 20 min), CellLightTM early endosomes-GFP (Thermo fisher Scientific, C10586; 2 ⁇ L/10,000 cells, 16 h), and/or LysoTrackerTM (Thermo Fisher Scientific, L7525; 50 nM, 30 min).
  • MitoTrackerTM Thermo Fisher Scientific, M7514, USA; 20 ⁇ M, 20 min
  • NAO nonyl acridine orange
  • hoechst 33342 1 ⁇ g/mL, 20 min
  • Intracellular ROS levels were measured using two methods.
  • the first method was performed as follows. First, cells cultured on glass-bottom dishes were treated with TAMRA-labeled peptides at EC 50 concentrations for 3 h. Then, cells were stained with 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (H 2 DCFDA; Sigma, 287810, USA; 25 ⁇ M, 30 min) and washed twice with PBS. Cells were treated with 500 ⁇ M H 2 O 2 in HBSS for 10 min. DCF signals of cells were detected by confocal microscopy, and images were captured. Green signal intensity of each image was calculated using ZEN Blue software.
  • H 2 DCFDA 2',7'-dichlorofluorescin diacetate
  • Cellular ATP levels were assessed using an ATP detection kit (Abcam, ab113849, USA) according to the manufacturer's instructions. Fluorescence was measured using a microplate reader (Promega, Glomax 96 microplate luminometer, USA).
  • HeLa cells were fixed with modified Karnovsky fixative (2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde in 0.05 M sodium cacodylate buffer) for 3 h at 4°C.
  • the samples were washed three times for 10 min each with 0.05 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, at 4°C, and then postfixed with 1% osmium tetroxide in 0.05 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, at 4°C for 2 h.
  • the samples were then washed briefly twice with distilled water.
  • the specimens were then stained en bloc with 0.5% uranyl acetate overnight at 4°C.
  • the stained samples were dehydrated in increasing concentrations of ethanol (once each in 30%, 50%, 70%, 80%, and 90% ethanol and three times in 100% ethanol, each for 10 min), followed by a transition step of twice treating with 100% propylene oxide for 15 min.
  • the samples were infiltrated with a series of propylene oxide and Spurr's resins (1:1 for 1.5 h, 1:2 for 1.5 h, Spurr's resin alone overnight, and then once again for 4 h), embedded in Spurr's resin, and polymerized overnight at 70°C.
  • the fully polymerized samples were sectioned using an ultramicrotome (MT-X, RMC, USA). The obtained sections were stained with 2% uranyl acetate and Reynolds' lead citrate for 7 minutes each. Observation and imaging of the samples were performed using a JEM-ARM200F TEM.
  • Wild-type Drp1 cDNA (provided by Dr. Seon-Yong Jeong, Ajou University College of Medicine) was amplified by polymerase chain reaction and inserted into the N-terminus of the eGFP gene of pcDNA3.1 plasmid. Transfection of the plasmid was performed using LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, L3000001) according to the manufacturer's instructions.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% IGEPAL CA-630; 0.25% sodium deoxycholate; 0.1% SDS; and protease inhibitors (Gendepot, P3100-001, USA)
  • Cells were disrupted by sonification, and 20–40 ⁇ g of protein were transferred to nitrocellulose membranes by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Subsequently, the membranes were blocked with 5% nonfat milk and sequentially treated with primary and secondary antibodies.
  • Antibodies used were anti-COX4 (Abclonal, A6564), anti- ⁇ -tubulin (Abclonal, AC012), anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH; Genetex, GTX100118), anti-Drp1 (BD biosciences, 611112), NGAL (Santa Cruz sc-515876), and Pp65 (Santa Cruz sc-136548), respectively.
  • Bands were visualized using ImageQuant Las 4000 mini (Amersham PLC, Amersham, UK) under optimal exposure conditions, and band intensities were measured using ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
  • NBD-labeled peptides or C6-NBD 6-(7-Nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid
  • NBD-labeled peptide dissolved in PBS was prepared in a black 96-well plate.
  • NBD-labeled peptide or C6-NBD dissolved in PBS was prepared in a black 96-well plate.
  • NBD-labeled peptide dissolved in PBS was prepared in a black 96-well plate.
  • Unlabeled peptide acetylated peptide
  • Kidney sections were fixed in 10% formalin and embedded in paraffin overnight. First, 4- ⁇ m-wide kidney sections were deparaffinized with xylene and dehydrated through graded alcohols. Antigen retrieval was performed by microwave treatment for 40 min using 0.1 M sodium citrate. Next, endogenous peroxidase in paraffin-embedded tissues was inactivated using 3% H 2 O 2 dissolved in methanol. Then, the sections were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and blocked with 10% normal goat serum (NGS), 5% bovine serum albumin (BSA), and 0.3% Triton X-100 dissolved in PBS for 1 h.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • NGS normal goat serum
  • BSA bovine serum albumin
  • the slides were stained with cytochrome C (MA5-11674, Invitrogen, USA), 8-OHdG (ab48508, Abcam, UK), P-21 (sc-6246, Santa Cruz, USA), NGAL (SC-515876, USA), F4/80 (70076S, Cell Signaling Technology, USA), and SOD-1 (OABB00304, Aviva Systems Biology, USA) diluted with antibody diluent (ZUC025, ZYTOMED, Germany). Finally, the slides were washed with PBS and incubated with HRP-labeled polymer-conjugated anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies (DAKO EnVisionTM+ System, K4001 or K4003, Denmark) for 1 h.
  • cytochrome C MA5-11674, Invitrogen, USA
  • 8-OHdG ab48508, Abcam, UK
  • P-21 sc-6246, Santa Cruz, USA
  • NGAL SC-515876, USA
  • F4/80 70076S
  • Mayer's hematoxylin (S3309, DAKO) was used for counterstaining of cell nuclei. Renal fibrosis and tubular necrosis were assessed by Masson's trichrome staining. Histological damage score calculation and image analysis were also performed by immunocytochemistry. Immunocytochemistry was performed according to the above-mentioned method, except for cytoplasmic extraction and methanol fixation. For immunofluorescence, pp16 (SAB4504720, Millipore Sigma, USA) and pp21 (sc-377569, Santa Cruz, USA) primary antibodies were used. Images of stained slides were captured with a Leica inverted microscope (Leica, Germany), and the positive area (%) was quantified using the LAS-4000 program (Leica).
  • hTEC cells For apoptosis and necrosis analysis, 1 ⁇ 10 5 hTEC cells were seeded in 6-well plates. After 1 h, hTEC cells were exposed to H 2 O 2 (0.5 mM) to induce cell damage, and then CMP3013 was added to the cells. Anti-apoptosis was analyzed using the Annexin-propidium iodide (PI) experiment as follows. Apoptosis and necrosis rates were visualized and measured using the Annexin V/PI fluorescein isothiocyanate (FITC) cell death kit (BD Biosciences).
  • FITC Annexin V/PI fluorescein isothiocyanate
  • hTECs were resuspended in 100 ⁇ L of binding buffer, and 4.5 ⁇ L of FITC-conjugated annexin V (10 mg/mL) and 3.5 ⁇ L of PI (50 mg/mL) were added. Cells were incubated at room temperature in the dark for 15 min. Measurements were collected using BD FACSDiva software (version 8.0; BD Biosciences).
  • hTEC cells were cultured at 37°C in Seahorse XF96 cell culture microplates. After 24 h of culture, OCR and ECAR were measured using a Seahorse XFe 96 extracellular flux analyzer (Agilent, CA). To measure the maximum respiration rate, 2 ⁇ M oligomycin, 1 ⁇ M carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenyl hydrazone, and 0.5 ⁇ M rotenone + antimycin A were sequentially injected, and then OCR was measured. Subsequently, 10 mM glucose, 1 ⁇ M oligomycin, and 50 mM 2-DG were sequentially injected, and then ECAR was measured. PER was measured and calculated using Wave Pro software and Wave Desktop software (Agilent, CA).
  • IL-10 forward primer: GTCAGTCATTCTCGTCCGTCGTA (SEQ ID NO: 20); reverse primer: CGTCCTAAATTCCCAATGAACCC (SEQ ID NO: 21)), SOD-1 (forward primer: CTCAGGAGAGCATTCCATCATT (SEQ ID NO: 22); reverse primer: CTCCCAGCATTTCCAGTCTT (SEQ ID NO: 23)), GAPDH (forward primer: TATGTCGTGGAGTCTACTGGT (SEQ ID NO: 24); reverse primer: GAGTTGTCATATTTCTCGT (SEQ ID NO: 25)), ATP6a1 (forward primer: CTGTTATCCTCGGCATCATCCAC (SEQ ID NO: 26); reverse primer: CAGGTAGCCAAACAACGAGGAC (SEQ ID NO: 27)), IL1 ⁇ (forward primer: TCGCTCAGGGTCACAAGAAA (SEQ ID NO: 28); reverse primer: CATCAGAGGCAAGGAGGAAAAC (SEQ ID NO: 29)),

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Abstract

본 발명은 저농도에서 세포 투과 능력과 강력한 미토콘드리아 표적성을 동시에 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 등에 관한 것이다. 상기 조성물은 손상된 신장 세포 및 간 세포의 기능을 정상 수준으로 회복시키는 효과가 있으므로, 신장 질환 또는 간 질환에 대한 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

미토콘드리아 특이적 펩타이드를 포함하는 신장 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2023년 2월 7일자로 출원된 한국특허출원 제-10-2023-0016448호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록
본 출원은 서열목록을 포함하며, 이러한 서열목록은 XML 형식으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다. 2024년 2월 6일에 작성된 상기 서열목록의 사본은 명칭이 KC24013-SEQ.xml이고 크기가 50.8 킬로바이트이다.
본 발명은 세포 투과 능력과 강력한 미토콘드리아 표적성을 동시에 가지는 펩타이드 또는 이의 이합체의 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 펩타이드의 특정 위치에 배열됨으로써 뛰어난 세포 투과능 및 미토콘드리아 표적화 능력을 갖는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
미토콘드리아는 세포 생존에 필수적인 ATP의 대부분을 생성하는 중요한 세포소기관이다. 미토콘드리아의 DNA가 손상되거나 환경적, 외부적 영향 등에 의해 발생하는 미토콘드리아 기능 장애(Mitochondria dysfunction)는 다양한 내재적 미토콘드리아 질환뿐만 아니라 거의 모든 퇴행성 질환을 유발한다. 미토콘드리아 기능 장애의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아의 내막에 높은 밀도(~20%)로 분포하며 다중 불포화 지방산을 함유하는 인지질인 카디오리핀(cardiolipin, CL)의 결핍 또는 산화에 의해 촉진되는 크리스테(cristae) 구조의 고갈이다. 2개의 인산염 그룹을 포함하는 CL은 막의 기능 단백질과 다중 전하-전하 상호작용을 제공함으로써 ATP 생산에 필수적인 역할을 한다. 미토콘드리아 내막(inner membrane of mitochondria, IMM)에서 CL 및 기타 인지질에 특이적으로 결합하는 물질은 CL의 산화를 방지할 수 있으며, 따라서 그러한 물질은 크리스테 구조의 파괴로부터 미토콘드리아를 보호하고 정상적인 미토콘드리아 기능을 유지할 수 있도록 한다.
분자에서 미토콘드리아에 대한 특이성은 소수성을 가지면서 양전하를 갖는 작용기에 의해 나타날 수 있다. 트리페닐포스포늄 양이온(triphenylphosphonium, TPP; Ph3P+-R) 등이 대표적인 미토콘드리아 특이적 분자이며, 이들은 내막에 존재하는 인지질의 음전하를 표적으로 한다. 그러나 이러한 물성을 갖는 분자들은 낮은 농도에서 세포 투과 능력에 문제가 있으며 고농도에서만 세포 내 전달이 가능한데, 이들 분자가 고농도로 세포 내에 전달되는 경우 세포 내 다른 분자에도 쉽게 결합하여 독성을 나타낼 가능성이 크다. 또한, 이들 미토콘드리아 특이적 분자들은 내막(IMM)에 존재하는 대표적 인지질인 CL에 대한 결합력이 약하여 CL이 풍부한 내막에 머물지 못하고, 계속해서 막의 안쪽으로 침투한다. 따라서 현재까지 개발된 대부분의 미토콘드리아 표적 분자(펩타이드)들은 미토콘드리아 막 내부에 존재하는 DNA를 표적하여 미토콘드리아를 죽이는 용도로만 이용되어 왔으며, 반대로 미토콘드리아의 활성을 상승시키거나 회복시키는 작용을 하는 분자는 극소수였다.
위 CL에 특이적인 물질의 대표적인 예로서 2개의 친수성 아미노산과 2개의 소수성 아미노산이 교대로 배열되어 구성된 미토콘드리아 특이적 SS(Szeto-Schiller) 펩타이드를 들 수 있다(도 1). 이 펩타이드는 2개의 양전하 아민과 2개의 방향족 작용기를 가지며, 이들은 CL의 각 인산염 및 지방산 성분과 친수성 및 소수성 상호작용을 한다. 그러나 CL에 대한 SS 펩타이드의 친화도(affinity)는 상대적으로 약하다(마이크로몰 수준의 농도 요구). 더욱이, 이들 SS 펩타이드의 서열을 6개 아미노산으로 확장하는 경우 미토콘드리아 침투력 및 미토콘드리아에 대한 특이성이 약간 향상되기는 하지만 심각한 독성을 유발하는 문제가 있다.
한편, 신장 질환, 예를 들어 급성 신손상의 치료법은 장기 이식 또는 대체 요법(예컨대, 혈액 투석)으로 한정적이며, 간 질환, 예를 들어 급성 간 손상의 치료법은 장기 이식이 유일하다. 따라서, 신장 질환 또는 간 질환의 근본적인 치료법이 필요한 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 세포 내 전달 가능한 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 신장 기능 또는 간 기능 회복이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 신장 기능 또는 간 기능을 회복시키는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다:
<식 1>
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10
상기 식 1에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고, X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고, X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고, X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
일 구현예에서, 신장 질환은 급성 신손상(acute kidney injury), 만성 콩팥병(chronic kidney disease), 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 사구체신염(glomerulitis), 간질성신염(interstitial nephritis) 및 허혈-재관류 신손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 간 질환은 급성 간 부전(acute liver failure), 급성 간 손상(acute liver injury), 만성 간 부전(chronic liver failure), 만성 간 손상(chronic liver injury), 간경변증(liver cirrhosis), 알코올성 간 질환(alcoholic liver disease), 지방간(hepatic steatosis), 간 섬유증(hepatic fibrosis) 및 간염(hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 약학 조성물은 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료를 위한 다른 유효 성분과 병용 투여되는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 병용 투여될 수 있는 다른 유효 성분은 에날라프릴(enalapril), 포시노프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 페린도프릴(perindopril), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 올메사르탄(olmesartan), 텔미사르탄(telmisartan) 및 다파글리플로진(dapagliflozin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 약학 조성물은 신독성 또는 간독성을 유발하는 1종 이상의 약물과 병용 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 병용 투여될 수 있는 약물은 항생제, 항암제, 항진균제, 항바이러스제 및 면역억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 신독성 또는 간독성을 유발하는 1종 이상의 약물은 콜리스틴(colistin), 독시사이클린(doxycycline), 겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 나이트로소우레아(nitrosourea), 암포테리신 B(amphotericin B), 잘시타빈(zalcitabine), 디다노신(didanosine), 스타부딘(stavudine), 지도부딘(zidovudine), 아리스토로크산(aristolochic acid) 및 카르복시-아트락틸로시드(carboxy-atractyloside)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 약학 조성물은 신장 질환 또는 간 질환이 유발되기 전 또는 후에 투여되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.
다른 구현예에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.
또 다른 구현예에서, X1, X4, X5 및 X8 중 하나 이상은 각각 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.
일 구현예에서, X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)일 수 있다.
다른 구현예에서, X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)일 수 있다.
일 구현예에서, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)이며, 단 X2 및 X9가 동시에 루신(L)은 아닐 수 있다.
다른 구현예에서, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 이합체는 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 서로 역평행(anti-parallel) 방향으로 연결된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)이고, 연결은 이황화 결합에 의한 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 식 1로 표시되는 단위체는 서열번호 1 내지 서열번호 19로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 펩타이드를 나노 몰 농도로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 펩타이드 또는 이의 이합체는 미토콘드리아 막의 카디오리핀(cardiolipin)과 상호작용하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시되는 펩타이드 또는 이의 이합체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 양면성 α-나선 구조의 펩타이드 또는 이의 이합체 펩타이드는 낮은 농도에서도 매우 높은 세포 투과 능력 및 손상된 미토콘드리아 표적 능력을 나타내며, 이러한 능력에 의해 미토콘드리아의 손상을 방지하거나 손상된 미토콘드리아의 기능을 복구시킴으로써 세포 및 조직의 기능을 정상적으로 유지/회복시키는 효과가 있다. 특히, 본원의 펩타이드 또는 이의 이합체는 손상된 신장 세포 및 간 세포의 기능을 회복시키는 효과가 있으므로 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 종래 미토콘드리아 표적화 분자의 예시를 나타내는 것으로서, 각각 친유성 양이온(lipophilic cation)인 TPP(triphenylphosphonium) 이온, SS-31 및 켈리 그룹의 MPP(mitochondria penetrating peptide)의 화학 구조를 도시한다.
도 2는 α-나선 구조 및 β-시트 구조를 도시한다. α-나선 구조에는 한 측쇄와 이에 인접한 측쇄 사이의 길이(약 4.5Å), 측쇄를 포함한 나선의 직경(10-12Å)이 표시되어 있고, β-시트 구조에는 한 측쇄와 이에 인접한 측쇄 사이의 길이(약 7Å) 및 시트의 일측면 측쇄와 반대면 측쇄의 거리(약 7-8Å)가 표시되어 있다.
도 3은 생체 막 활성화를 위한 펩타이드 또는 저분자의 역할을 나타낸 모식도이다.
도 4a 내지 도 4c는 일 실시예에 따른 단량체 및 이합체 α-나선 펩타이드의 도식 구조를 나타낸다. 도 4a는 디스커버리 스튜디오 2020(Dassault Systemes BIOVIA, 미국)을 사용하여 도시된 α-나선 펩타이드 모델을 나타낸다. 펩타이드 라이브러리의 단량체는 AcNH-LCRLLRRLCR-C(O)NH2 서열을 기반으로 하였으며, 5번 위치의 루신(L)과 7번 위치의 아르지닌(R)의 측쇄에 존재하는 두 탄소 원자 사이의 거리를 거리 모니터를 사용하여 계산하였다. 도 4b는 단량체 α-나선 펩타이드의 휠 다이어그램을 도시한다. 검은색 원(1, 4, 5 및 8번 아미노산)은 소수성 잔기, 흰색 원(3, 6, 7 및 10번 아미노산)은 친수성 잔기, 흰색 사각형은 결합을 형성하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 도 4c는 이합체 번들 펩티드의 휠 다이어그램을 도시한다. 도시된 구조는 역평행으로 결합되어 있다.
도 5는 4종의 Fmoc-아미노산이 동일한 커플링 비율로 펩타이드를 생성하도록 당량을 조절하기 전과 후의 HPLC 피크를 도시한다.
도 6은 16개의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리 중 하나인 L1X 서브-라이브러리에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한다. 붉은색 화살표는 HPLC 크로마토그램의 첫 번째 피크(peak)부터 마지막 피크를 포함하는 연속적인 머무름 시간(Retention Time, RT)의 범위를 표시한다.
도 7a 내지 도 7d는 16개의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리에 대한 ROS 생성 억제 능력을 평가하기 위해 측정된 형광 강도를 비교 도시한 그래프이다. 도 7a는 소수성 모이어티의 1번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다. 도 7b는 소수성 모이어티의 4번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다. 도 7c는 소수성 모이어티의 5번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다. 도 7d는 소수성 모이어티의 8번 위치가 각각 사이클로헥실알라닌(Cha), 루신(L), 티로신(Y) 또는 페닐알라닌(F)인 4종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 처리하였을 때 HeLa 세포에서 ROS 수준을 측정한 결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 공기 산화(air-oxidation) 또는 보호기를 사용한 공기 산화 방법에 의해 합성된 이합체 펩타이드 결합 방향(평행 또는 역평행)을 확인한 결과를 도시한다. 도 8a는 공기 산화에 의해 수득한 이합체 펩타이드(CMP3013 airoxidation(공기산화)으로 표기) 및 보호기를 사용한 공기 산화 방법에 의해 수득한 이합체 펩타이드(CMP3013 antiparallel(역평행)으로 표기)의 크로마토그램을 도시한다. 도 8b는 공기 산화에 의해 이합체화되는 단량체 펩타이드의 구조를 나타내는 모식도(화살표 좌측) 및 상기 방법에 의해 수득한 반응 생성물의 크로마토그램(화살표 우측)을 도시한다. 반응 생성물은 파란색으로, 주요 생성물은 밑줄 및 볼드체로 표시하였다. 도 8c는 보호기를 사용한 공기 산화 방법에 의해 이합체화되는 ACM 보호기가 부착된 펩타이드의 구조를 나타내는 모식도(화살표 좌측) 및 상기 방법에 의해 수득한 반응 생성물의 크로마토그램(화살표 우측)을 도시한다.
도 9a 및 도 9b는 형광으로 표지된 이합체 번들 펩타이드 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 및 FL-CMP3029 내지 FL-CMP3032 각각의 세포 투과 능력을 도시한다. 도 9a는 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 각각의 농도에 따른 세포 투과율을 그래프로 나타낸 것이다(범례는 펩타이드의 EC50 값을 오름차순 정렬). 도 9b는 FL-CMP3029 내지 FL-CMP3032 각각의 농도에 따른 세포 투과율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 각각의 세포 투과 능력과 이합체 펩타이드 간의 올리고머화 경향성의 상관관계를 도시한 그래프이다.
도 11은 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 각각의 세포 독성을 비교한 그래프를 도시한다.
도 12는 HeLa 세포에 CMP3013을 농도별로 처리하고 24시간 경과 후 WST-1 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015를 각각 EC50 농도로 3시간 동안 처리한 HeLa 세포의 분획화 결과를 도시한다. 세포질(Cytosol, C)과 미토콘드리아(Mitochondria, M) 분획의 형광 강도로 표시하였으며, 세포 전체(Total, T)에 대한 값 대비 상대 수치로 나타내었다.
도 14a 및 도 14b는 일 실시예에 따른 이합체 번들 펩타이드의 ROS 생성 억제 능력을 측정한 결과를 도시한다. 도 14a는 HeLa 세포에서 0.5 mM H2O2 처리에 의해 발생된 ROS에 대한 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 펩타이드 각각의 ROS 생성 억제 능력을 도시한다. 각 펩타이드는 EC50 농도로 3시간 동안 처리되었으며, 0.5 mM의 H2O2 처리 후 공초점 현미경으로 이미징한 후 세포들의 형광 강도를 이미지 분석 프로그램으로 계산하였다. 각각의 점(dot)은 한 장의 이미지로부터 얻은 형광 강도에 대응한다. 도 14b는 HeLa 세포에서 35 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리하여 H2DCFDA로 염색한 후 500 μM의 H2O2를 30분 동안 처리하여 산화 스트레스를 유발한 뒤 얻은 공초점 현미경 이미지이다(Scale bar = 50 μm).
도 15a 내지 도 15e는 FL-CMP3013, FL-CMP3029, FL-CMP3030, FL-CMP3031 및/또는 FL-CMP3032가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 이동하거나 결합하는 효과를 확인한 현미경 이미지를 도시한다. 도 15a는 100 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리하고 마이토트래커로 염색한 후 20 μM의 CCCP를 30분 동안 처리하여 미토콘드리아를 손상시킨 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지이다. 피어슨 r 값은 빨간색(FL-CMP3013)과 녹색(MitoTracker) 형광 신호의 상관관계를 의미한다(Scale bar = 20 μm). 도 15b는 100 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리한 HeLa 세포를 NAO로 염색하여 카디오리핀을 표지하고, 20 μM의 CCCP를 30분 동안 처리하여 미토콘드리아를 손상시킨 뒤 얻은 초고해상도 공초점 현미경 이미지이다(Scale bar = 5 μm). 오른쪽 패널에 도시된 그래프는 이미지에서 화살표로 표시된 부분의 녹색(NAO) 및 빨간색(CMP3013) 형광 신호의 상관관계를 보여준다. 도 15c의 상단 패널은 미토콘드리아의 분열을 유도하기 위해 Drp1-eGFP 플라스미드를 HeLa 세포에 형질도입시키고, 다음날 100 nM의 FL-CMP3013을 3시간 동안 처리하여 촬영한 공초점 현미경 이미지이다(Scale bar = 20 μm). 하단 패널은 동일 조건에서 Drp1(+, Drp1-eGFP 형질도입)의 전위성(ectopic) 발현 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 도시한다. 도 15d는 미토콘드리아의 분열을 유도하기 위해 Drp1-eGFP 플라스미드를 HeLa 세포에 형질도입시키고, 다음날 FL-CMP3013, FL-CMP3029, FL-CMP3030, FL-CMP3031 또는 FL-CMP3032를 각각 처리하여 촬영한 공초점 현미경 이미지이다. 도 15e는 HeLa 세포를 FL-CMP3013(100 nM, 3시간) 및 마이토트래커로 처리하고, 공초점 현미경으로 세포를 이미징하는 동안 20 μM의 CCCP를 처리하여 미토콘드리아 손상을 유도하여 얻은 타임-랩스 이미지이다(Scale bar = 10 μm).
도 16은 20 μM의 CCCP에 의해 사멸이 유도된 HeLa 세포에 FL-CMP3013(붉은색)을 처리하거나 처리하지 않은 세포의 생존율을 비교하여 도시한 현미경 이미지이다(Scale bar = 20 μm).
도 17a 내지 도 17i는 산화 손상 세포에서 FL-CMP3013에 의한 미토콘드리아의 기능 유지/회복 및 미토콘드리아 내막의 크리스테 보호 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 17a는 FL-CMP3013(10 또는 30 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 0.5 mM의 H2O2를 30분 동안 처리한 후 총 ROS(좌측 그래프) 및 미토콘드리아 ROS(우측 그래프)의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 17b는 FL-CMP3013(2.5, 5 또는 10 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 5 μM의 안티마이신 A(antimycin A, AA)를 90분 동안 처리한 후 미토콘드리아 ROS의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 17c는 FL-CMP3013(5, 10 또는 20 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 10 μM의 CCCP를 90분 동안 처리한 후 미토콘드리아 ROS의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 17d는 FL-CMP3013(10 또는 30 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 1 mM의 H2O2를 1시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 17e는 FL-CMP3013(10 또는 20 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 1 μM의 안티마이신 A를 3시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 17f는 FL-CMP3013(5, 10 또는 20 nM)을 3시간 동안 전처리한 HeLa 세포에 미토콘드리아 손상제로서 10 μM의 CCCP를 1시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 17g는 HeLa 세포에 FL-CMP3013(10 또는 30 nM)을 3시간 동안 처리한 다음 1 mM의 H2O2로 1시간 동안 처리하여 미토콘드리아 막 전위(ψ)를 측정한 결과를 도시한다. 도 17h는 안티마이신 A에 의해 막 전위 감소가 유도된 SH-SY5Y세포에서 사이클로스포린 A(CsA), FL-CMP3012, FL-CMP3013 또는 FL-CMP3015를 처리한 후 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 JC-1 형광 비율로 측정한 결과를 도시한다. 도 17i는 FL-CMP3013 및 H2O2의 처리 조건에 따라 얻은 HeLa 세포의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다. (a) 음성대조군(mock), (b) 0.5 mM H2O2 처리, (c) 50 nM의 CMP3013 또는 (d) 100 nM의 CMP3013을 2시간 동안 처리한 후 0.5 mM H2O2를 추가로 2시간 동안 처리(Scale bar = 1 μm). 그래프는 최소 50개의 독립적인 미토콘드리아 이미지로부터 0.5 μm 이상의 크리스테를 계수하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 18a 내지 도 18d는 FL-CMP3013의 세포내 이입 메커니즘과 세포에서의 최종 운명을 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 18a는 HeLa 세포를 30분 동안 다양한 억제 조건으로 전처리(4℃로 사전 냉각, EIPA[5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride] 처리, MβCD(methyl-β-cyclodextrin) 처리, 염소산나트륨(NaClO3) 처리 또는 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ) 처리)한 후 100 nM의 FL-CMP3013과 함께 3시간 동안 배양하여 FACS로 분석한 결과를 도시한다. 도 18b는 셀라이트 초기 엔도솜-GFP(CellLight™ early endosomes-GFP) 마커를 발현하는 HeLa 세포를 FL-CMP3013(100 nM, 3시간) 및 라이소트래커(LysoTracker™; 50 nM, 1시간)로 처리한 후 촬영한 공초점 현미경 이미지이다(r, 피어슨 상관계수; Scale bar = 20 μm). 도 18c는 CCCP의 부재(-) 또는 존재(+, 20 μM, 30분)에 따른 FL-CMP3013(100 nM, 3시간)의 카디오리핀 특이적 표적화(100 nM NAO 사용, 1시간)를 확인한 공초첨 현미경 이미지이다(Scale bar = 20 μm). 도 18d는 도 18c의 현미경 이미지에서 피어슨 r 값을 비교한 그래프로서, 좌측 파란색 막대는 CMP3013-라이소트래커의 상관계수를, 우측 녹색 막대는 CMP3013-NAO의 상관계수를 나타낸다. 각 조건당 5개의 독립적인 형광 이미지(배율 x 63)를 분석하였다.
도 19a 내지 도 19d는 CMP3013m(단량체 펩타이드)가 리포솜에 의해 제작된 카디오리핀(CL) 함유 막과 강하게 상호작용하는 것을 보여준다. 도 19a는 NBD로 단량체 펩타이드 NBD-CMP3013의 HPLC 크로마토그램을 도시한다(> 95% 순도). 도 19b는 세 가지 유형의 리포솜(POPC:POPE = 2:1, 검정색 그래프; POPC:POPE = 2:1, 10% CL, 파란색 그래프; POPC:POPE = 2:1, 10% DLCL, 붉은색 그래프)을 1 μM의 NBD 표지된 CMP3013 단량체(NBD-CMP3013m)에 첨가하고 형광 강도의 변화(ΔF.I.)를 리포솜의 농도별로 표시한 그래프이다. 도 19c는 1 μM의 NBD-3013m에 리포솜을 첨가한 후, 과량의 CMP3013 단량체(CMP3013m)를 처리하여 CMP3013m의 농도별로 형광 광도를 측정한 그래프이다. 도 19d는 다양한 비율(0 ~ 20%)의 카디오리핀을 함유하는 리포솜을 NBD-CMP3013m 또는 NBD 염료와 함께 배양하여 형광 강도의 변화(ΔF.I.)를 카디오리핀의 함량에 따라 표시한 그래프이다(6-NBD, 6-(7-nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid; n = 3).
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMP3013의 작용 메커니즘을 설명하는 모식도이다.
도 21a 및 도 21b는 CMP3013, SS-31, LR10 및 MMP1a의 세포 투과 능력 및 미토콘드리아 표적화 능력을 도시한다. 도 21a는 CMP3013, SS-31, LR10 및 MMP1a의 농도에 따른 세포 투과율을 그래프로 나타낸 것이다. 도 21b는 CMP3013, SS-31, LR10 및 MMP1a를 각각 EC50 농도로 처리한 HeLa 세포의 분획화 결과를 도시한다. 세포질(Cytosol, C)과 미토콘드리아(Mitochondria, M) 분획의 형광 강도로 표시하였으며, 세포 전체(Total, T)에 대한 값 대비 상대 수치로 나타내었다(M/C ratio, 세포질 분획의 상대적 형광 강도/미토콘드리아 분획의 상대적 형광 강도).
도 22a 및 도 22b는 NBD-CMP3013m 및 NBD-SS-31이 리포솜에 의해 제작된 카디오리핀(CL) 함유 막과 상호작용하는 능력을 비교한 결과를 도시한다. 도 22a는 표면 플라스몬 공명 기법을 사용하여 센서 칩 상에 생성된 각 내막 모델(POPC:POPE = 2:1; 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀)에 각각 1 μM의 CMP3013 또는 SS-31을 처리하여 반응 단위(RU)를 측정한 결과를 보여준다. 도 22b는 세 가지 유형의 리포솜(POPC:POPE = 2:1; POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀; 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% DLCL)을 1 μM의 NBD-CMP3013m 또는 NBD-SS-31에 첨가하고 형광 강도의 변화(ΔF.I.)를 리포솜의 농도별로 표시한 그래프이다. 각 그래프의 하단에는 펩타이드의 상대적 친화력을 ΔF.I.max/EC50 값으로 표시하였다.
도 23a 내지 도 23d는 SS-31과 CMP3013의 ROS 생성 억제 능력을 비교한 결과를 도시한다. 도 23a는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 CCCP를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다. 도 23b는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 로테논(Rotenone)을 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다. 도 23c는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 안티마이신 A(Antimycin A)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다. 도 23d는 세포에 SS-31(100 nM 또는 1 μM) 또는 CMP3013(10 nM 또는 100 nM)을 전처리한 후 과산화수소(H2O2)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 세포의 상대적인 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24a 및 도 24b는 SS-31과 CMP3013의 ATP 생성 촉진 능력을 비교한 결과를 도시한다. 도 24a는 CMP3013(10 또는 30 nM) 또는 SS-31(10 또는 30 nM)을 전처리한 HeLa 세포에 1 μM의 안티마이신 A를 3시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다. 도 24b는 CMP3013(10 또는 30 nM) 또는 SS-31(10 또는 30 nM)을 전처리한 HeLa 세포에 1 mM의 H2O2를 1시간 동안 처리한 후 ATP의 수준을 측정한 결과를 도시한다.
도 25는 H2O2에 의해 막 전위 감소가 유도된 세포에서 CMP3013(10 또는 30 nM) 또는 SS-31(10 또는 30 nM)를 처리한 후 미토콘드리아 막 전위의 상대적 변화를 JC-1 형광 비율로 측정한 결과를 도시한다.
도 26은 수컷 C57BL/6 마우스에 시아닌 5.5로 표지된 CMP3013 펩타이드(Cy5.5-3013)를 3 mg/kg의 용량으로 정맥 주사하고 24시간이 경과한 뒤 적출된 장기의 IVIS 이미지로서, CMP3013의 생체 내 분포를 도시한다(LV, 간; KD, 신장; SP, 비장; LN, 폐).
도 27은 TAMRA-CMP3013이 hTEC 세포내 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 이동하거나 결합하는 효과를 확인한 현미경 이미지를 도시한다. 흰색은 NAO 시그널을 나타내며, 적색은 CMP3013을 나타낸다(scale bar: 10 μm).
도 28a 내지 도 28c는 CMP3013의 hTEC 세포내 손상된 미토콘드리아의 개선 효과를 확인한 결과를 도시한다: 도 28a 및 도 28b는 20 nM 또는 60 nM 농도의 CMP3013 펩타이드 처리한 후, 1 mM의 H2O2를 30분 동안 처리하여 세포막 손상 조건을 만든 hTEC 세포에서의 ROS 수준 및 막 전위를 측정한 결과 그래프이다. 도 28c는 10 nM 또는 20 nM 농도의 CMP3013 펩타이드 처리한 후, 0.5 mM의 H2O2를 1시간 동안 처리하여 세포막 손상 조건을 만든 hTEC 세포에서의ATP 수준을 측정한 결과 그래프이다.
도 29a 내지 도 29c는 CMP3013의 hTEC 세포내 손상된 미토콘드리아 세포호흡 회복 효과를 확인한 결과를 도시한다. hTEC 세포에 CMP3013(10 nM 또는 50 nM)을 전처리한 후 과산화수소(H2O2)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤 산소 소비율(도 29a, OCR), 세포외 산성화율 (도 29b, ECAR) 및 양성자 유출률(도 29c, PER)을 그래프로 나타내었다.
도 30은 콜리스틴 유발 신독성 동물 모델에서 CMP3013 또는 CMP3029의 신독성 완화 효과를 확인하기 위한 실험 계획을 나타낸 개략도이다.
도 31a 내지 도 31e는 20 mg/kg의 콜리스틴을 매일 피하 투여하여 신독성이 유도된 마우스에 1 mg/kg의 CMP3013을 격일로 복강내 투여한 후 신독성 완화 효과를 확인한 결과를 도시한다: 도 31a 내지 도 31c는 혈중 BUN(도 31a) 및 크레아티닌(CRE, 도 31b) 수준을 측정한 결과 및 마우스의 생존율(도 31c)을 나타낸 그래프이다(대조군, n = 5; CIN 모델(콜리스틴 투여군), n = 10; 및 CIN 모델+펩타이드 투여군, n = 10). 도 31d는 신장 조직에서 MT(Masson's trichome; 배율 Х100) 및 신장 손상 관련 단백질의 발현을 면역조직화학으로 확인한 현미경 이미지이다(scale bar: 100 μm). 도 31e는 신장 절편을 투과전자현미경(TEM)으로 촬영하여 미토콘드리아의 크리스테 구조를 확인한 도면이다(scale bar: 1 μm).
도 32a 내지 도 32c는 20 mg/kg의 콜리스틴을 매일 피하 투여하여 신독성이 유도된 마우스에 0.3 mg/kg 또는 1 mg/kg의 CMP3029를 격일로 복강내 투여한 후 혈중 BUN(도 32a) 및 크레아티닌(CRE, 도 32b) 수준을 측정한 결과 및 마우스의 생존율(도 32c)을 나타낸 그래프이다(n = 3).
도 33은 허혈-재관류 신손상(IRI) 유발 모델을 제작하기 위하여 SD 렛트의 양측 신동맥을 세라핀 클립으로 클램핑한 모습을 나타낸다.
도 34a 및 도 34b는 허혈-재관류 신손상(IRI) 유발 모델에서 CMP3013 및 SS-31의 급성 신손상 치료 효과를 비교한 결과를 도시한다. 1 mg/kg의 CMP3013을 정맥 투여하거나 2 mg/kg의 SS-31을 복강내 투여한 후 24시간 후에 허혈-재관류 신손상(IRI)을 유발한 렛트의 혈액에서 BUN(도 34a) 및 CRE(도 34b)를 측정한 결과를 그래프로 나타내었다.
도 35는 허혈-재관류 신손상(IRI) 유발 마우스 모델을 제작하기 위한 실험 계획을 나타낸 개략도이다.
도 36a 내지 도 36i는 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 CMP3013을 정맥 투여하고 1시간 후에 급성 신손상을 유발한 허혈-재관류 신손상(IRI) 유발 모델에서 급성 신손상의 치료 효과를 확인한 결과를 도시한다. 도 36a 및 도 36b는 IRI 유발 24시간 후에 마우스 혈청에서 BUN(도 36a) 및 CRE(도 36b)를 측정한 결과를 그래프로 나타내었다. 도 36c는 급성 신손상이 유발된 마우스의 신장 조직을 면역조직화학 분석으로 확인한 결과를 도시한다(scale bar: 100 μm). 도 36d는 신장 조직에서 NGAL의 발현량을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 도시한다. 도 36e는 NGAL의 웨스턴 블롯 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다. 도 36f 내지 도 36i는 항산화 mRNA 프로파일의 정량 분석 결과를 도시한다(도 36f, NQO-1; 도 36g, SOD-1; 도 36h, IL-10; 및 도 36i, ATP6).
도 37은 허혈-재관류 신손상(IRI) 유발 마우스 모델을 이용하여 CMP3013의 후 투여(post-administration) 치료 효과를 확인하기 위한 모식도이다.
도 38a 및 도 38b는 급성 신손상 유발(IRI 마우스 모델) 1시간 후에 1 mg/kg의 CMP3013을 정맥 주사로 후 투여하고 23시간이 지난 후 BUN(도 38a) 및 CRE(도 38b)를 측정한 결과를 그래프로 나타내었다.
도 39는 급성 간손상 마우스 모델을 이용한 CMP3013 또는 CMP3029의 효력 평가를 위한 투여 일정을 나타내는 도면이다. 파란색 화살표는 CMP3013 또는 CMP3029의 세 차례의 정맥 투여 또는 복강내 투여 일자(DAY 0, 2, 4)를 나타내며, 빨간색 화살표는 TAA의 복강내 투여 일자를 나타낸다.
도 40a 내지 도 40j는 CMP3013 또는 CMP3029의 급성 간손상 치료 효과를 확인한 결과를 도시한다. 도 40a 내지 도 40c는 1 mg/kg의 CMP3013을 격일로 3회(Day 0, 2, 4) 정맥 투여한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg의 TAA를 복강내 투여하여 급성 간손상을 유발한 마우스에서 각각 혈중 AST(도 40a), ALT(도 40b) 및 ALP(도 40c)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 40d 내지 도 40g는 1 mg/kg의 CMP3013을 격일로 3회(Day 0, 2, 4) 정맥 투여한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg의 TAA를 복강내 투여하여 급성 간손상을 유발한 마우스의 CMP3013의 효능을 확인한 추가실험으로, 혈중 AST 및 ALT 결과(도 40d), 간을 적출하여 조직의 상태를 검시한 결과(도 40e), 및 간 조직 세포를 세포 노화 마커로 염색하여 확인한 결과(도 40f, SA-β-gal 마커; 및 도 40g, p21 마커)를 나타낸다. 도 40h 내지 도 40j는 1, 5 또는 10 mg/kg의 CMP3029를 격일로 3회(Day 0, 2, 4) 정맥 투여한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg의 TAA를 복강내 투여하여 급성 간손상을 유발한 마우스에서 각각 혈중 AST(도 40h), ALT(도 40i) 및 ALP(도 40j)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(G1, TAA 단독; G2, TAA + 1 mg/kg CMP3029; G3, TAA + 5 mg/kg CMP3029; G4, TAA + 10 mg/kg CMP3029).
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "단위체" 또는 "펩타이드 단위체"는 단량체 펩타이드 또는 이합체 펩타이드를 구성하는 최소 단위를 의미하며, 단위체는 10개의 아미노산으로 이루어진다. 단위체는 단량체 펩타이드의 일부 또는 전부를 구성한다.
용어 "펩타이드"는 아미노산 중합체로서, 천연 아미노산뿐 아니라 비천연 아미노산(예를 들어, β-아미노산, D-아미노산 등의 이성질체)도 구성요소로 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드를 구성하는 소수성 아미노산 중 하나가 루신(L)으로 정의되는 경우, 상기 용어 "루신(L)"은 천연형인 α-아미노산 형태의 L-루신 뿐만 아니라, 이의 위치 이성질체인 β-루신 및 거울상 이성질체인 D-루신을 모두 포함하는 의미로 사용되었다. 본 명세서에 기재된 다른 아미노산들(예를 들어, 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 트립토판(W), 아르지닌(R), 라이신(K), 히스티딘(H) 등)도 위와 마찬가지로 이들의 이성질체를 포함하는 의미로 사용되었다.
용어 "친수성 아미노산"은 극성을 띄는 아미노산을 의미할 수 있으며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력을 가지는, 즉 물과 혼합될 수 있는 아미노산을 포괄하는 의미로 사용되었다.
용어 "소수성 아미노산"은 극성이 없거나 현저히 낮은 아미노산을 의미할 수 있으며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력이 없는 성질, 즉 물과 혼합되지 않는 성질을 가지는 아미노산을 포괄하는 의미로 사용되었다.
용어 "양친매성(amphipathic) 펩타이드"는 "양면성 펩타이드"와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 구조적으로 양면성, 즉 소수성과 친수성을 모두 갖는 펩타이드를 의미한다. 양친매성 펩타이드의 일 측면 또는 모이어티가 친수성을 띄고 타 측면 또는 모이어티가 소수성을 띌 수 있다.
용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질병 및/또는 이러한 질병으로 인한 유해 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.
용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.
용어 "투여"는 개체에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대, 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 물질(예컨대, 본 발명의 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체, 또는 이들 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물)을 제공하는 것을 의미한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 명시된 기능을 향상시키거나, 예컨대, 원하는 및/또는 유익한 기능을 향상 또는 증가시키고, 원하지 않은 기능을 감소 또는 저하시키거나; 증상 중 하나 이상을 호전, 일시적 완화, 약화 및/또는 지연시키는 것과 같이 명시된 질환, 병태 또는 질환을 치료하기에 충분한 화합물, 조성물 또는 약물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 신장 질환 또는 간 질환과 관련하여, 유효량은 신장 질환 또는 간 질환을 지연시키거나 회복시키기에 충분한 양을 포함한다.
용어 "개체"는 "환자" 또는 "대상"과 상호교환적으로 사용되고, 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어, 영장류(예: 인간), 반려 동물(예: 개, 고양이 등), 가축 동물(예: 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예: 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 개체는 인간이다.
본 명세서 사용되는 용어 "약"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 조건, 조성, 양 등을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로 "약" 이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.
미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체의 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 용도
본 발명은 적어도 부분적으로 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체의 투여가 신장 질환 또는 간 질환을 앓고 있는 대상(또는 개체)의 신장 질환 또는 간 질환에 대한 현저한 예방 또는 치료 효과를 나타낸다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 일 태양에 따르면, 하기 식 1로 표시되는 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체의 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 용도가 제공된다:
<식 1>
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10
상기 식 1에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고; X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고; X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고; X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
본 명세서에 개시되는 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체는 손상된 미토콘드리아의 노출된 카디오리핀에 특이적으로 결합함으로써 크리스테의 구조를 보존/회복시키고 이에 따라 미토콘드리아의 기능 장애를 회복시키는 효과가 있다. 미토콘드리아의 카디오리핀이 여러 요인에 의해 산화되거나 그 구조에 이상이 발생하는 경우 크리스테의 만곡이 사라지면서 전자전달계의 기능을 담당하는 다양한 종류의 단백질들이 서로 물리적으로 멀어지게 되어 그 기능을 점차 잃게 된다. 본 명세서에 개시되는 펩타이드 또는 이의 이합체는 카디오리핀에 결합하여 크리스테의 만곡을 회복시키고 전자전달계의 단백질 복합체가 정상적인 기능을 재개할 수 있도록 만듦으로써 미토콘드리아의 기능을 정상화시킬 수 있다. 일 실시예에서, 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체의 미토콘드리아 기능 장애 회복 능력은 ROS 생성 억제 효과, ATP 생성 촉진 효과, 미토콘드리아 막 전위 회복 효과 등에 의해 입증되었다(실시예 9 내지 실시예 11 등 참조). 이를 통해, 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체는 손상된 신장 또는 간에 존재하는 미토콘드리아, 구체적으로 손상되거나 노출된 카디오리핀에 특이적으로 결합하여 미토콘드리아의 기능을 개선함으로써 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 용도로 제공될 수 있다.
용어 "신장 질환"은 신장의 정상적 생리학 및 기능의 변형을 의미한다. 신장 질환은 예를 들면, 신적출술, 화학요법, 고혈압, 당뇨병, 울혈성심부전, 루프스, 겸상 세포 빈혈 및 다양한 염증성, 전염성 및 자가면역 질환, HIV-관련 신증 등와 같은 물리적, 화학적 또는 생물학적 손상, 발작, 외상 또는 질환을 포함하는 넓은 범위의 급성 및 만성 질병 및 이벤트로부터 발생할 수 있다. 또한, 신장 질환은 신독성을 유발하는 1종 이상의 약물, 예컨대, 항생제, 항암제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제 등의 투여로 인해 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 신장 질환은 급성 신손상(acute kidney injury), 만성 콩팥병(chronic kidney disease), 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 사구체신염(glomerulitis), 간질성신염(interstitial nephritis) 및 허혈-재관류 신손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 신장 질환은 미토콘드리아 기능 이상을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체는 손상된 신장 세포에 대한 우수한 치료 효과를 나타냄이 확인되었다(실시예 14 등 참조). 특히, 본 발명의 펩타이드는 신장 세포 내의 손상된 미토콘드리아의 카디오리핀에 특이적으로 결합하여 ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력 및 막 전위 회복 능력을 나타내었다.
일 실시예에서, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체는 신독성 유발 물질에 의한 신독성에 대한 우수한 치료 효과를 나타냄이 확인되었다(실시예 15 등 참조). 특히, 콜리스틴과 같이 신독성을 나타내는 약제를 사용함에 있어서, 본 발명의 저용량의 펩타이드를 병용 투여하면 신장의 손상을 효과적으로 예방할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체는 급성 신손상(acute kidney injury)에 대한 치료 효과가 있다(실시예 16 등 참조). 특히, 저용량(1 mg/kg)의 펩타이드 투여 시 신손상의 지표(BUN 및 CRE)가 현저하게 감소함을 확인하였다. 또한, 종래 기술인 SS-31 펩타이드 대비 투여량이 1/2 수준에 불과함에도 급성 신손상에 대한 치료 효과는 더 뛰어난 것으로 나타났다. 그에 더하여, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드 또는 이의 이합체를 농도 의존적으로 투여한 경우에 급성 신손상 관련 지표를 정상과 유사하게 회복시켰으며, 급성 신손상 유발 전에 이를 투여한 경우에도 신장 기능 회복 효능을 나타내었다. 이를 통해, 본 발명의 조성물은 급성 신손상 유발 전 또는 후에 낮은 용량의 투여만으로도 신손상을 억제할 수 있으며, 종래 기술보다 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
용어 "간 질환"은 바이러스, 알코올, 약물, 면역 이상, 대사 질환 또는 기타 환경적 요인 등의 원인으로 인한 간 세포 또는 간 조직의 손상 및/또는 간 기능의 이상(장애)의 결과 나타나는 질환을 의미한다.
일 구현예에서, 간 질환은 급성 간 부전(acute liver failure), 급성 간 손상(acute liver injury), 만성 간 부전(chronic liver failure), 만성 간 손상(chronic liver injury), 간경변증(liver cirrhosis), 알코올성 간 질환(alcoholic liver disease), 지방간(hepatic steatosis), 간 섬유증(hepatic fibrosis) 및 간염(hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 간 질환은 미토콘드리아 기능 이상을 특징으로 할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 급성 간손상(acute liver injury)에 대한 우수한 치료 효과를 나타냄이 확인되었다(실시예 17 등 참조). 예를 들어, 두 종류의 펩타이드(CMP3013 및 CMP3029)를 농도별로 투여한 결과에서 투여량에 의존적으로 간손상 지표(혈중 AST, ALT 및 ALP)가 감소함을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 조성물은 낮은 용량(1 mg/kg)에서도 간 손상을 억제할 수 있으며, 나아가 고용량(10 mg/kg)에서는 더욱 향상된 간 손상 억제 효과를 제공할 수 있음이 입증되었다.
미토콘드리아 특이적 펩타이드 단위체
본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드는 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 펩타이드의 특정 위치에 배열됨으로써 뛰어난 세포 투과능 및 미토콘드리아 표적화 능력을 가지며, 이론에 얽매임 없이, 위와 같은 세포 투과능 및 미토콘드리아 표적화 능력을 통해 손상된 미토콘드리아를 회복시킴으로써 신장 질환 및 간 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 상기 펩타이드 단위체는 총 10개의 아미노산으로 이루어지고 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산을 적정한 비율, 예컨대 1:1, 구체적으로 각 4개씩 포함할 수 있으며, 각 단위체는 1개 또는 2개의 위치에서 서로 결합을 통해 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드 단위체는 α-나선형의 양친매성(양면성) 이합체 번들 펩타이드를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드 단위체는 증가된 α-나선도를 가져서 세포 내 투과율이 증가되고, 세포 내에서는 α-나선이 제거되어 펩타이드가 가진 독성이 감소될 수 있다. 이합체의 세포 투과 능력은 단일 가닥의 α-나선 펩타이드에 비해 100배 이상 우수하기 때문에, 이합체 번들이 형성되면 나노 몰 농도에서도 쉽게 세포 내로 전달될 수 있다. 나노 몰 농도로 세포 내 전달된 이합체 번들 펩타이드의 이황화 결합은 세포 내 환경에서 쉽게 단량체로 환원되고 미토콘드리아를 표적화할 수 있다. 이렇게 전달된 펩타이드는 비정상적인 미토콘드리아에 특이적으로 결합하여 미토콘드리아가 더 이상 손상되지 않도록 하거나 손상된 미토콘드리아의 기능을 회복시킴이 실험적으로 확인되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드는 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
<식 1>
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10
상기 식 1에서,
X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고;
X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고;
X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고;
X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
일 구현예에서, 펩타이드를 구성하는 각각의 아미노산은 양친매성(amphipathic)을 나타내면서 α-나선 구조를 유지할 수 있도록 하는 것이라면 그 종류가 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 소수성 아미노산 또는 친수성 아미노산을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명자들은 이전 연구를 통해 α-나선도가 증가된 펩타이드는 세포내 투과율이 증가되고, 세포 내에서는 알파나선이 제거되어 펩타이드가 가진 독성을 감소시킬 수 있었음을 밝힌 바 있다(WO 2015/057009).
다른 구현예에서, 소수성 아미노산은 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 식 1에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다. 바람직하게는, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있고, 보다 바람직하게는 루신(L), 페닐알라닌(F) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 따르면, 식 1에서, X1, X4, X5 및 X8 중 하나 이상(즉, 하나, 둘, 셋 또는 넷)은 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다. 이 경우에, X1, X4, X5 및 X8 중 나머지는 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 친수성 아미노산은 양전하 측쇄를 갖는 친수성 아미노산일 수 있다. 예컨대, 친수성 아미노산은 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 및 디아미노프로판산(Dap)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 식 1에서, X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)일 수 있다. 바람직하게는, X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)일 수 있고, 보다 바람직하게는 아르지닌(R), 호모아르지닌(hR) 또는 노르아르지닌(norR)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에 따르면, 식 1에서, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)일 수 있다(단, X2 및 X9가 동시에 루신(L)은 아님). 바람직하게는, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)일 수 있고, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 시스테인(C) 또는 호모시스테인(Hcy)일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 식 1에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)이고; X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고, X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고, X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
다른 구현예에 따르면, 식 1에서, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)로 이루어진 군에서 선택된 소수성 아미노산이고; X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 및 디아미노프로판산(Dap)으로 이루어진 군에서 선택된 친수성 아미노산이고; X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고; X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
바람직하게는, X1, X4, X5 및 X8 중 하나 이상은 서로 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)이고, 나머지는 서로 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이 경우에, X3, X6, X7 및 X10은 바람직하게는 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)일 수 있고, 보다 바람직하게는 아르지닌(R), 호모아르지닌(hR) 또는 노르아르지닌(norR)일 수 있다. 또한, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)일 수 있고, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 시스테인(C) 또는 호모시스테인(Hcy)일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드는 Hfa-Cys-Arg-Hfa-Hfa-Arg-Arg-Hfa-Cys-Arg의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 여기서 Hfa는 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 사이클로헥실알라닌(Cha)로 이루어진 군에서 선택된 소수성 아미노산인 펩타이드이거나 이를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, Hfa 중 하나 이상은 서로 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드는 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 서열번호 19중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으나, 단위체 펩타이드의 양친매성 및 α-나선 구조가 유지될 수 있는 한 상기 아미노산 서열에 제한되는 것은 아니다.
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본 명세서에 개시되는 펩타이드는 세포 내에 전달되어 미토콘드리아 막, 특히 미토콘드리아 막의 카디오리핀과 상호작용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시되는 펩타이드는 산화 스트레스가 유도된 세포에 처리해 주는 경우 ROS의 생성이 억제된다(실시예 2.2.2 등 참조).
미토콘드리아 특이적 펩타이드 이합체
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시되는 펩타이드를 단위체로 포함하는 이합체 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 이합체 펩타이드는 단위체 펩타이드가 서로 결합을 통해 형성될 수 있다. 이 때 결합의 위치는 X2 및 X9 중 어느 하나 또는 둘 다의 위치일 수 있다. 구체적으로, X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단량체 펩타이드가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 임의의 아미노산으로부터 선택될 수 있는데, 예를 들어, X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)이며, 단 X2 및 X9가 동시에 루신(L)은 아닌 것일 수 있다.
각 단량체 펩타이드 사이에 형성되는 결합은 본 발명이 목적하는 특성을 나타내도록 펩타이드 사이를 연결시키는 어떠한 형태의 결합도 포함될 수 있으며, 예를 들어 공유결합을 포함할 수 있다. 상기 공유결합은 펩타이드의 기능을 저해하지 않으면서, α-나선도를 향상시킬 수 있는 형태의 공유결합이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 시스테인 사이의 이황화 결합, 디셀레나이드 결합, 에스테르 결합, 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응(click reaction)에 의한 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결합일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 공유결합은 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen) 사이의 이황화 결합, 셀레노시스테인(U) 사이의 디셀레나이드 결합, 에스테르 결합, 반응에 참여할 수 있는 티올 기능기를 이용한 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 티오에테르 결합, 및 클릭 반응을 유발할 수 있는 삼중결합이나 아지드 그룹을 가지는 비천연 아미노산을 포함하는 경우 클릭 반응에 의한 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
이합체 펩타이드를 이루는 두 단량체 사이에 이황화 결합(다이설파이드 결합)이 생성되는 경우, 단량체에서 시스테인(C)을 사용할 경우 두 단위체 펩타이드 골격 사이에는 4개의 원자(CSSC; C, 탄소; S, 황)가 존재한다. 이 때 시스테인(C) 대신 호모시스테인(Hcy)을 사용하는 경우, 두 단위체 펩타이드 골격 사이를 5개의 결합 거리(CCSSC 또는 CSSCC) 또는 6개의 결합 거리(CCSSCC)로 조절할 수 있다. 일 구현예에서, 한 개의 시스테인과 한 개의 호모시스테인이 산화작용으로 연결된 이합체를 사용할 수 있다. 또한, 셀레노시스테인(U)이나, 페니실아민(Pen)을 시스테인 대신 사용하여 디셀레나이드(diselenide), 시스테인 또는 페니실아민과의 혼성 또는 에스테르의 다이설파이드 결합을 이룰 수 있다.
일 구현예에서, 이합체 펩타이드는 각 단위체를 포함하는 펩타이드(단량체 펩타이드)가 모두 N-말단에서 C-말단 방향을 유지하며 평행(parallel) 방향으로 연결되거나, 또는 2개의 펩타이드 중 하나는 N-말단에서 C-말단 방향, 다른 하나는 C-말단에서 N-말단 방향으로, 즉, 역평행(antiparallel) 방향으로 연결될 수 있다. 다른 구현예에서, 각 단위체를 포함하는 펩타이드(단량체 펩타이드)는 서로 역평행 방향으로 연결될 수 있다. 이 때, 각 단위체의 서열은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
이합체 펩타이드는 N-말단이 지방산으로 지방화(lipidation)될 수 있다. 구체적으로, 상기 이합체 펩타이드는 X1의 위치에서 C6 내지 C16 지방산이 결합되어 있을 수 있다. 이러한 지방산 결합을 통해 세포 투과능을 추가로 향상시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 이합체 펩타이드는 100 nM 미만의 농도에서도 세포 내로 이동하여 미토콘드리아에 표적화되며, 종래의 미토콘드리아 특이적 펩타이드가 마이크로몰 수준의 농도에서 미토콘드리아 기능 이상의 회복 효과를 나타내는 것과 대조적으로 나노몰 수준의 농도에서도 미토콘드리아 기능 이상의 회복 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4, 비교예 1 내지 5 등 참조). 따라서, 상기 약학 조성물은 펩타이드를 나노 몰 농도로 포함할 수 있으며, 이와 같은 나노몰 수준의 저농도에서도 우수한 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 이합체 펩타이드는 효과가 발휘되는 농도에서 세포 독성이 없거나 거의 없으며, 미토콘드리아(특히, 미토콘드리아 내막에 존재하는 카디오리핀)를 특이적으로 표적함으로써 다양한 미토콘드리아 기능 장애를 회복시키는 효과를 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에서, 이합체 펩타이드는 마이크로몰 수준의 농도 이상에서만 세포 독성이 나타나며, 배양된 세포의 50%가 사멸되는 농도는 10 마이크로몰에 이르는 것으로 확인되었다(실시예 6 등 참조). 본 발명의 다른 실시예에서, 이합체 펩타이드는 세포에 처리되는 경우 미토콘드리아 분획에 현저하게 높은 비율로 존재하는 것이 확인되었으며, 나아가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 표적화됨을 발견하였다(실시예 7 및 실시예 9 등 참조). 본 발명의 또 다른 실시예에서, 이합체 펩타이드는 손상된 미토콘드리아 내막에서 노출된 카디오리핀에 선택적으로 결합함으로써 미토콘드리아의 기능을 회복시키고 세포의 생존율을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 미토콘드리아 내막의 크리스테 구조를 보호하거나 회복시킴으로써 ROS 생성을 억제하고 ATP의 생성을 촉진하며 막 전위를 회복시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 10 내지 실시예 12 등 참조).
본 발명의 이합체 펩타이드의 효과는 종래 기술과 비교하여 현저하게 향상된 것이다. 구체적으로, 기존에 카디오리핀에 결합한다고 알려진 SS-31 펩타이드와 비교하여 본원의 이합체 펩타이드는 세포 투과 능력, 카디오리핀 결합 능력, ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력, 막 전위 회복 능력 등 모든 면에서 현저하게 향상되는 것으로 확인되었다(비교예 1 내지 5 등 참조).
이합체 펩타이드는 10개 아미노산으로 구성되는 식 1의 단위체로 이루어진 펩타이드가 서로 연결된 동종 이합체(homodimer)(상이한 서열을 갖는 두 펩타이드의 이합체 포함)일 수 있으나, 본 발명의 특유의 α-나선 구조를 유지하는 한, 식 1의 단위체에 아미노산 길이가 상이하거나 식 1과는 다른 서열상 특징을 갖는 다른 단량체 펩타이드가 연결된 이종 이합체(heterodimer)일 수 있다. 예컨대, 상기 아미노산의 길이가 상이한 다른 단량체 펩타이드는 식 1의 단위체 펩타이드의 어느 한 말단 또는 양 말단에 하나 이상의 아미노산이 추가되어 길이가 더 길어진 단량체 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 이합체 펩타이드는 상호작용에 의한 자가조립에 의해 올리고머를 형성할 수 있다(실시예 5 등 참조). 이합체 펩타이드가 일정 수준으로 올리고머화되는 경우에는 세포 투과 능력이 더 증대될 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시되는 펩타이드 또는 이의 이합체는 예방적 또는 치료적 유효량으로 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제와 혼합되어 약학 조성물로 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 약학 조성물은 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다.
허용되는 담체 및/또는 부형제(안정화제 포함)는 사용되는 용량 및 농도에서 개체에게 무독성이고, 버퍼(예를 들어 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기산); 항산화제(예를 들어 아스코르브산 또는 메티오닌); 방부제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헤사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 이하의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질(예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린); 친수성 중합체(예를 들어 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르지닌, 또는 라이신); 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제(예를 들어 EDTA); 당(예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨); 염 형성 반대 이온(예를 들어 나트륨); 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제(예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 그 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 적합한 형태로 제제화될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방적 또는 치료적 유효량" 또는 "유효량"은 개체에서 신장 질환 또는 간 질환을 예방 또는 치료하는 데 유효한 조성물의 유효 성분의 양으로서, 의학적 처치에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 상기 질환을 예방 또는 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류 및 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 이때, 상기한 요소들을 모두 고려하여 최소한의 부작용 또는 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에서 유효 성분의 유효량은 개체(환자)의 나이, 성별, 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간 등에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니지만, 1일 투여량이 0.001 내지 100 mg/kg, 구체적으로는 0.01 내지 10 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 주입용 펌프 등을 이식하여 장시간 또는 장기간에 걸쳐 투여할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 대상에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데 예를 들면, 비경구 투여일 수 있으며, 비경구 투여는 주사(예컨대, 볼러스 주사) 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여(subcutaneous injection), 정맥내 투여 (intravenous injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 동맥내 투여(intraarterial injection), 복강내 투여(intraperitoneal injection), 뇌내 투여(intracerebral injection), 척추강내 투여(intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)가 포함된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 피하 투여(subcutaneous injection), 정맥내 투여(intravenous injection) 또는 복강내 투여(intraperitoneal injection)된다.
예방 또는 치료 방법 및 병용 요법
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시되는 펩타이드 또는 이의 이합체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시되는 단량체 펩타이드 또는 이의 이합체 펩타이드를 유효량 포함하는 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 하나 이상의 다른 유효 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 유효 성분이 목적하는 질병은 본 발명의 약학 조성물이 예방 또는 치료를 목적으로 하는 질병과 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물이 예방 또는 치료를 목적으로 하는 질병(예컨대, 신장 질환 또는 간 질환)과 상기 다른 유효 성분의 치료 또는 예방 목적이 서로 동일한 경우, 상기 추가적인 치료제 또는 예방제는 신장 또는 간 기능 이상(장애)을 예방 또는 치료하는데 있어서 주된 효과를 나타내거나, 보조적인 효과를 나타내거나, 또는 상호 보완적인 효과를 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 신장 질환에 대한 다른 유효 성분은 에날라프릴(enalapril), 포시노프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 페린도프릴(perindopril), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 올메사르탄(olmesartan), 텔미사르탄(telmisartan) 및 다파글리플로진(dapagliflozin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물이 예방 또는 치료를 목적으로 하는 질병(예컨대, 신장 질환 또는 간 질환)과 상기 다른 유효 성분의 치료 목적이 서로 상이한 경우, 다른 유효 성분이 목적으로 하는 질환의 예방 또는 치료에 사용되었을 때에 그 부작용으로 발생하는 신장 또는 간 기능 이상(장애)을 상기 약학 조성물에 의해 개선, 예방 또는 치료하는 효과를 얻을 수 있다. 예컨대, 다른 유효 성분의 부작용으로 인해 신독성이 유발될 경우, 본 발명의 약학 조성물과 병용 투여함으로써 신장의 손상을 억제할 수 있다. 또는, 상기 유효 성분의 부작용으로 인해 간독성이 유발될 경우, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물과 병용 투여함으로써 간의 손상을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 신독성을 유발하는 1 종 이상의 약물과 병용 투여되는 것일 수 있다. 신독성을 유발하는 1종 이상의 약물은 항생제, 항암제, 항진균제, 항바이러스제 또는 면역억제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 신독성을 유발하는 1종 이상의 약물은 콜리스틴(colistin), 독시사이클린(doxycycline), 겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 나이트로소우레아(nitrosourea), 암포테리신B(amphotericin B), 잘시타빈(zalcitabine), 디다노신(didanosine), 스타부딘(stavudine), 지도부딘(zidovudine), 아리스토로크산(aristolochic acid) 및 카르복시-아트락틸로시드(carboxy-atractyloside)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명의 펩타이드 또는 이의 이합체는 신독성(nephrotoxicity)에 대한 우수한 치료 효과를 나타냄이 확인되었다(실시예 15 등 참조). 특히, 본 발명의 펩타이드(CMP3013 또는 CMP3029) 투여 시 신손상의 지표(혈중 BUN, CRE 및 신장조직의 시토크롬 C, NGAL 등)가 현저하게 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 조성물은 콜리스틴과 같이 신독성을 나타내는 다양한 종류의 약제(항생제, 항암제 등)의 사용시 병용 투여하면 신장의 손상을 효과적으로 예방할 수 있음을 시사한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 간독성을 유발하는 1 종 이상의 약물과 병용 투여되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 약학 조성물은 신장 질환 또는 간 질환이 유발되기 전 또는 후에 투여되는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 병용 투여는 동시에, 순차적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
I. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 설계, 합성 및 선택
실시예 1. 미토콘드리아를 표적으로 하는 펩타이드 라이브러리의 설계
기존의 미토콘드리아 특이적 SS-펩타이드는 매우 짧은 아미노산 서열에 양친매성(amphipathic)을 제공하는 β-시트 형태의 2차 구조를 가지고 있다. 그러나 이와 같은 SS-펩타이드는 친수성 모이어티와 소수성 모이어티 사이의 거리가 상대적으로 짧기 때문에(약 7Å; 도 1 및 2), 일단 카디오리핀과 같은 인지질의 인산기와 펩타이드의 친수성 모이어티 사이에서 전하 상호작용이 발생하면 인지질의 지질 모이어티와 소수성 상호작용을 생성하기에 충분하지 않다. 또한, SS-펩타이드의 대표격인 SS-31에는 카디오리핀과 1:1 상호작용에 참여하는 두 개의 하전 부위만 존재할 뿐이다.
본 발명자들은 짧은 길이의 β-시트 구조를 갖는 SS-펩타이드의 카디오리핀 결합과 관련된 단점을 극복하기 위해 10개의 아미노산으로 구성된 α-나선형 펩타이드를 설계하였다. 특히, 본 발명에 따른 펩타이드의 양친매성 α-나선 구조는 친수성과 소수성 아미노산 측쇄 사이에 더 긴 거리(약 11.3Å)를 갖기 때문에 카디오리핀의 지방산 측쇄와 훨씬 더 강한 소수성 상호작용이 일어날 수 있다(도 4a). 또한, α-나선형 펩타이드는 나선 구조에 4개 이상의 양전하 부위를 포함하므로, 복수의 카디오리핀 분자에 대한 결합력을 가진다.
한편, 표적 카디오리핀에서 펩타이드와 지방산 측쇄와의 더 강한 소수성 상호작용을 유도하기 위해 펩타이드의 소수성 모이어티(도 4b의 펩타이드 모식도에서 1, 4, 5 및 8번으로 표시된 위치의 아미노산)의 기준 아미노산인 루신(L)을 다른 여러 종류의 소수성 아미노산으로 치환하여 미토콘드리아 표적화 능력 등을 평가하였다.
실시예 2. 단량체 펩타이드의 합성
실시예 2.1. CMP3001m 내지 CMP3015m의 합성
하기 실험예 1.1에 기술된 바와 같이, 고체상 펩타이드 합성법에 의해 하기 식 2의 아미노산 서열을 갖는 단량체 펩타이드를 합성하였다.
<식 2> X1-C-R-X4-X5-R-R-X8-C-R
(여기서, C는 시스테인이고, R은 아르지닌이고, X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha, X)이다.)
단량체 펩타이드는 아세틸 캡핑 또는 형광 표지된 형태의 2종을 준비하였다. 아세틸 캡핑된 단량체 펩타이드는 각각 CMP3001m 내지 CMP3015m으로 명명되었다. 이들의 아미노산 서열, 계산된 질량(calculated mass) 및 관찰된 질량(observed mass)을 하기 표 2에 나타내었다. N-말단에 TAMRA로 표지된 단량체 펩타이드 또한 아세틸 캡핑된 단량체 펩타이드와 동일한 방법으로 합성하였으며, 각각 FL-CMP3001m 내지 FL-CMP3015m으로 명명하였다. 이들의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000002
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000003
실시예 2.2. 디콘볼루션 펩타이드 라이브러리의 합성 및 선택
실시예 2.2.1. 16종의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리 합성
소수성 모이어티의 기준 아미노산인 루신(L)을 다른 여러 종류의 소수성 아미노산으로 치환하여 미토콘드리아 표적화 능력 등을 평가하기 위해, 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 조합의 디콘볼루션(deconvolution) 펩타이드 라이브러리(16종의 서브 라이브러리)를 합성하였다. 표 4에서, Hdf는 사이클로헥실알라닌(Cha), 페닐알라닌(F), 루신(L) 및/또는 티로신(Y)을 의미하며, 이로써 소수성 아미노산의 다양성을 증가시켰다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000004
디콘볼루션 펩타이드 라이브러리(16개의 서브-라이브러리)는 실험예 1.1에 기술한 바와 같이 Fmoc 고체상 펩타이드 합성법을 사용하여 합성하였다. 구체적으로, 고체상 수지는 0.51 mmole/g의 링크 아마이드 MBHA 수지(Sigma, 미국)를 사용하였으며, 탈보호는 20% 피페리딘(Sigma)을 사용하였다. 탈보호 후 DMF로 3회, DCM으로 5회, 다시 DMF로 3회 세척하고, Fmoc 보호기가 부착된 아미노산, DIPEA 및 PyBOP을 각각 6당량씩 사용하여 커플링하였다. 반응 용액의 총 부피는 5 ml로 하여 4종의 아미노산(Y, L, F 및 Cha)을 각각 1.5당량씩 사용하여 최초 반응 조건을 탐색하였다. 반응 후 DMF로 3회, DCM으로 3회, 다시 DMF로 3회 세척하였다. 이어서 절단 혼합체(cleavage cocktail; 95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% DW)를 사용하여 2시간 동안 반응시킨 뒤 차가운 에테르로 침전시켰다. 질소 기체를 사용하여 용매를 날려준 후 DMSO에 용해시켜 HPLC를 수행하였다. HPLC 기기(Infinity 1260, Agilent, 미국)에서 고정상으로 Phenomenex C18 컬럼(3 μm, 4.6 Х 150 mm)을 사용하였으며, 이동상으로 버퍼 A는 0.1%(v/v) TFA 워터를, 버퍼 B로는 0.1%(v/v) TFA ACN을 사용하였다. 구배 조건은 0분에 0% 버퍼 B를 이후에는 60분까지 100% 버퍼 B를 선형 구배로 변화시켰다. UV 검출기의 파장은 209, 220 nm를 사용하여 확인하였다.
4종의 아미노산을 균등한 비율로 결합시키기 위해, 총 6당량을 유지하면서 커플링이 더 많이 일어난 아미노산의 당량 비율을 줄이고, 커플링이 상대적으로 적게 일어난 아미노산의 당량 비율은 늘리는 방식으로 각 아미노산의 당량을 결정하였다. 구체적으로, 동일한 몰수의 아미노산 4종을 HPLC에 주입하여 몰 흡광 계수 비를 도출한 뒤 반응 산물에 포함된 4종 아미노산의 몰수 비를 HPLC 피크 아래 면적을 이용하여 계산하였다. 최종적으로 찾아낸 Y, L, F 및 Cha의 몰수 비는 각각 1.26, 1.33, 1.48 및 1.93 당량이었으며, 상기 조건에서의 커플링 비율은 Y:L:F:Cha = 1.06:0.97:0.99:0.99로 관찰되었다(도 5).
16개의 서브-라이브러리에 대한 순도(purity)는 HPLC 기기(Infinity 1260, Agilent)를 사용하여 확인하였다. 구체적으로, HPLC의 고정상으로는 Phenomenex C18 컬럼(3 μm, 4.6 Х 150 mm)을 사용하였고, 이동상으로 버퍼 A는 0.1%(v/v) TFA 워터를, 버퍼 B로 0.1%(v/v) TFA ACN을 사용하였다. 구배 조건은 5% 버퍼 B를 0-5분까지 유지하였으며, 이후 5-30분 동안 5-70%의 버퍼 B를 선형 구배로 변화시켰으며, 30-40분 동안 70-100%의 버퍼 B로 선형 구배를 적용하였다. UV 검출기의 파장은 220, 280 nm를 사용하여 확인하였다. 합성한 16개의 서브-라이브러리를 HPLC조건에서 정제하고, 각각의 서브-라이브러리에 대한 크로마토그램을 수득하였다.
수득한 크로마토그램 중 L1X 서브-라이브러리에 대한 크로마토그램을 대표예로서 도 6에 나타냈으며, 16개의 모든 서브-라이브러리에 대한 HPLC 크로마토그램 결과는 첫 번째 피크(peak)부터 마지막 피크를 포함하는 연속적인 머무름 시간(Retention Time, RT)의 범위로서 하기 표 5에 제시되어 있다.
16개 서브-라이브러리에 포함된 단량체 펩타이드의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000005
실시예 2.2.2. 단량체 펩타이드 서브-라이브러리의 ROS 생성 억제 능력 분석
실시예 2.2.1에서 합성한 16개의 펩타이드 서브-라이브러리를 사용하여 소수성 모이어티의 1, 4, 5 및 8번 위치에 어떤 종류의 소수성 아미노산이 위치할 때 ROS(reactive oxygen species)의 생성 억제 능력이 가장 우수한지 평가하였다.
세포의 ROS 수준 분석은 하기 실험예 6에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 구체적으로, HeLa 세포(96-웰 플레이트, 2 x 104 개 세포/웰)를 1일 동안 배양한 후 100 nM의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리를 3시간 동안 처리하였다. 펩타이드가 처리된 세포를 PBS로 세척하고 25 μM DCFDA로 30분 동안 염색하였다. 그런 다음 세포를 0.5 mM H2O2로 처리하여 산화 스트레스를 유도하였다. ROS의 생성은 37℃에서 30분 동안 마이크로플레이트 리더(TECAN)을 사용하여 형광 강도로 판독하였다.
각 실험을 10회 반복하여 측정 값의 평균을 도 7a 내지 도 7d에 나타내었다. 상기 ROS 생성 억제 효과에 의해 소수성 모이어티의 각 위치에서 가장 선호되는 아미노산이 결정되었고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000006
4번 아미노산의 경우에는 CMP3013 펩타이드가 이 위치에 루신(L)을 갖기 때문에, 선호하는 아미노산에 대해 사이클로헥실알라닌(Cha) 또는 루신(L)이 선택되었다.
실시예 2.3. CMP3029m 내지 CMP3032m의 합성
실시예 2.2에서 선택된 소수성 아미노산을 조합하여 4종의 단량체 펩타이드를 합성하고, 이를 각각 CMP3029m 내지 CMP3032m으로 명명하였다. 이들 단량체 펩타이드의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 7에 나타내었다. TAMRA로 표지된 단량체 펩타이드 또한 동일한 방법으로 합성하고, 각각 FL-CMP3029m 내지 FL-CMP3032m로 명명하였다. 이들 단량체 펩타이드의 아미노산 서열 및 질량 분석 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000007
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000008
실시예 3. 이합체 번들 펩타이드의 합성
실시예 3.1. CMP3001 내지 CMP3015의 합성
실시예 2.1에서 합성한 단량체 펩타이드를 이합체 번들로 만들기 위해 공기 산화(air oxidation)를 이용하여 두 단량체 펩타이드 사이에 이황화 결합이 형성되도록 하였다. 먼저, 형광이 표지되지 않은 단량체 펩타이드를 5~10 mg/ml 농도로 0.1 M 중탄산암모늄 버퍼에 용해하고, 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 이합체화를 수행하였다. HPLC로 정제된 이합체 펩타이드는 각각 CMP3001 내지 CMP3015로 명명하고, MALDI-TOF를 사용하여 질량을 분석하였다. 이들 이합체 펩타이드에 대한 아미노산 서열 및 순도 분석, 질량 분석 결과는 하기 표 9에 나타내었다(표 9에서 두 시스테인 사이의 선은 이황화 결합을 나타내며, 이하 표 10 내지 표 12에서 모두 동일함). 형광이 표지된 이합체 번들 펩타이드의 합성은 형광이 표지되지 않은 단량체 펩타이드와 TAMRA로 표지된 단량체 펩타이드를 1:1 비율로 혼합하고 상기 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 이합체화를 수행하였다. 반응물을 HPLC로 정제한 뒤 MALDI-TOF로 질량을 확인하였으며, 각각의 펩타이드는 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015로 명명하였다. 형광이 표지된 이합체 번들 펩타이드 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015의 아미노산 서열, HPLC에 의한 순도 분석 및 질량 분석 결과는 하기 표 10에 나타내었다. 정제된 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015은 모두 > 95% 순도를 나타내었다(표 10).
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이합체 펩타이드의 수득율은 사이클로헥실알라닌(Cha)의 위치 및 개수에 따라 차이를 나타냈으나, 특별히 합성이 잘 되지 않는 이합체는 없었다. 다만, 4개의 사이클로헥실알라닌(Cha)으로 구성된 펩타이드는 예상된 바와 같이 물에 대한 용해도가 상대적으로 떨어졌다. 그러나, 사이클로헥실알라닌(Cha)을 3개 이하로 포함하는 펩타이드의 경우에는 예상 외로 물에 대한 용해도가 높은 특성을 보여주었다.
실시예 3.2. CMP3029 내지 CMP3032의 합성
실시예 2.3에서 합성한 단량체 펩타이드 CMP3029m 내지 CMP3032m을 사용하여 이합체 번들 펩타이드를 합성하였다. 이합체화는 상기 실시예 3.1에서 사용한 합성 방법과 동일하게 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 수행하였으며, 형광이 표지되지 않은 이합체와 형광이 표지된 이합체 두 종류를 합성하고, 각각 CMP3029 내지 CMP3032 및 FL-CMP3029 내지 FL-CMP3032로 명명하였다. 이들 이합체 펩타이드에 대한 아미노산 서열, HPLC에 의한 순도 분석 결과 및 질량 분석 결과는 하기 표 11 및 표 12에 각각 나타내었다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000011
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000012
실시예 3.3. 이합체 펩타이드에서 각 단위체의 서열 방향성 확인
실험예 1.2에 기재된 공기 산화에 의한 단량체 펩타이드의 이합체화 방법에 따라 형성된 이합체 펩타이드에서 각 단위체가 평행(parallel) 방향으로 결합하는지, 아니면 역평행(antiparallel) 방향으로 결합하는지 규명하기 위해 단량체에 포함된 2개의 시스테인(C)에 서로 다른 보호기인 Trt(triphenyl methyl) 및 Acm(acetamidomethyl)을 사용한 실험을 수행하였다. Trt 보호기는 산성 조건에서 티올(thiol)로부터 분리되기 때문에 TFA가 포함된 절단 혼합체(cleavage cocktail)를 처리하였을 때 시스테인은 티올 형태로 남아있게 된다. 이에 반해, Acm 보호기는 강한 산화 조건에서만 떨어지기 때문에 TFA가 포함된 절단 혼합제를 처리해 주더라도 보호기는 티올에 그대로 붙어있게 된다.
먼저, CMP3013m에 포함된 2개의 다른 시스테인 위치(X2, X9)에 시스테인-Trt 및 시스테인-Acm이 각각 1개씩 들어간 2종의 단량체 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성법에 의해 제조하였다. 이어서, 공기 산화 조건으로 서로 다른 2개의 상기 단량체 펩타이드 사이에 이황화 결합을 형성시킨 뒤 한 개의 이황화 결합만 형성된 이합체 펩타이드를 HPLC로 정제하였다. 이후 10% 아세트산이 포함된 3차 증류수에 한 개의 이황화 결합만 포함하는 이합체 펩타이드를 용해시키고, 아이오딘(iodine)이 함유된 메탄올 용액을 한 방울씩 첨가함으로써 조성된 강한 산화 조건에서 50분 동안 반응시켜 Acm 보호기가 떨어지는 동시에 새로운 이황화 결합이 생기도록 하였다. 또한, 공기 산화 반응으로 CMP3013 이합체 펩타이드를 합성하고, 위에서 보호기를 사용하여 합성한 CMP3013 역평행 이합체 펩타이드와 HPLC에서 머무름 시간을 측정하였다(도 8a). 펩타이드의 정제는 HPLC에 의해 수행되었으며, 고정상은 Zorbax C18 컬럼(3.5 μm, 4.6 Х 150 mm)을 사용하였다. 버퍼 A[0.1%(v/v) TFA를 포함하는 3차 증류수] 및 버퍼 B[0.1%(v/v) TFA를 포함하는 ACN]를 이동상으로서 이원 용매 시스템에 사용하였다. 구배 방법은 다음과 같다: 5분 동안 5% 버퍼 B 및 5분에서 30분 동안 5-70% 버퍼 B의 선형 구배; 70-100% 버퍼 B 30-40분. 이동상의 유속은 1.0 ml/min으로 설정하였다.
공기 산화에 의한 이합체 펩타이드(CMP3013 airoxidation)와 역평행 이합체 펩타이드(CMP3013 antiparallel)의 HPLC 크로마토그램은 도 8a에 나타내었으며, 개별적인 반응 생성물(antiparallel dimer)에 대한 크로마토그램은 도 8b 및 도 8c에 각각 나타내었다. 도시된 결과를 통해, 공기 산화에 의해 형성된 CMP3013 이합체 번들 펩타이드는 역평행의 구조임을 확인하였다.
Ⅱ. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 특성 및 효능 분석
실시예 4. 세포 투과(Cell-penetrating) 능력 평가
세포 투과 능력은 실시예 3에서 합성한 형광이 표지된 버전의 이합체 번들 펩타이드를 사용하여 평가하였으며, 실험예 3에 기재된 방법에 따라 EC50 값으로 측정하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 다양한 농도의 TAMRA 표지 이합체 번들 펩타이드를 3시간 동안 처리하여 EC50 값을 측정하였다. EC50은 세포의 절반이 펩타이드 침투에 의해 형광을 나타낼 때의 해당 펩타이드의 농도이다.
형광 강도의 분석 결과, 모든 이합체 번들 펩타이드는 100 nM 미만의 농도에서 세포 내로 이동함이 확인되었다(하기 표 13 및 도 9a, 도 9b 참조). EC50 농도가 낮을수록 세포 투과 능력이 높다고 볼 수 있는데, 표 13에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포 투과 능력이 가장 좋지 않다고 평가할 수 있는 펩타이드 조차도 EC50 농도는 100 나노몰 수준에 불과하였다.
특히, FL-CMP3013은 1, 5 및 8번 위치에서 루신(L) 대신 3개의 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하며, 역평행 구조로 인해 다른 펩타이드들보다 비교적 높은 세포 투과 능력을 나타냈다(EC50 = 35 nM; 표 13 및 도 9a). FL-CMP3029 및 FL-CMP3030 또한 FL-CMP3013과 필적하는 최상의 세포 투과 능력을 보여주었다(EC50 = 34-35 nM; 표 13 및 도 9b).
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000013
실시예 5. 올리고머화 경향성(Oligomerization tendency) 평가
본 발명에 따른 이합체 번들 펩타이드가 상호작용에 의한 자가조립(self-association) 특성을 나타내는지 확인하기 위해, 각각의 펩타이드에 대해 HPLC 컬럼에서의 머무름 시간을 온도의 변화에 따라 관찰하여 위 값의 변화를 통해 자가조립의 경향성을 파악하였다. 구체적으로, 0.2 mM의 각 펩타이드 용액 10 μl를 HPLC에 주입하고 펩타이드가 검출되는 시간(RT)을 40℃와 5℃에서 각각 측정하였다. 이때 HPLC의 고정상 조건 및 이동상 조건은 기존에 잘 알려진 방법을 사용하였다. 통상적으로 올리고머가 잘 형성될수록 상대적으로 더 높은 온도인 40℃에서의 검출시간이 길어지므로 5℃에서 측정한 값의 차이인 ΔΔRT가 커진다. CMP3001 내지 CMP3015에서 측정한 ΔΔRT 값을 하기 표 14에 나타내었다.
Figure PCTKR2024001861-appb-img-000014
결과는 예상된 바와 같이 펩타이드에 사이클로헥실알라닌(Cha)의 개수가 많아질수록 펩타이드 사이의 올리고머화는 증가하는 경향을 보였다. 다만, 이러한 경향성은 단량체를 기준으로 사이클로헥실알라닌(Cha)이 1개 또는 2개를 포함한 펩타이드에서 사이클로헥실알라닌(Cha)의 위치 특이적으로 나타나지는 않았다. 즉, 사이클로헥실알라닌(Cha)이 2개 이하로 존재하는 경우에는 이 아미노산이 1, 4, 5 또는 8번 중 어느 위치에 존재하는지 여부와 관계없이 비슷한 수준의 올리고머화 경향성을 나타냈다. 이와 달리, 사이클로헥실알라닌(Cha)이 3개 이상 포함된 펩타이드에서는 위 아미노산이 1, 4, 5 또는 8번 중 어느 위치에 존재하는지에 따라 올리고머화 경향성에서 차이를 나타냈다. 한편, 4개의 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 펩타이드의 올리고머화도 비교적 잘 일어남을 확인하였다.
올리고머화 경향성과 세포 투과 능력의 관련성을 확인해본 결과, 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하지 않는 이합체 번들 펩타이드의 경우 올리고머화는 세포 투과 능력과 양의 상관관계가 있었지만(데이터 미제시), 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 이합체 번들 펩타이드의 경우에는 이합체 번들 펩타이드 상호간에 어느 정도 올리고머화가 일어나는지와 세포 투과 능력 사이에 큰 상관관계가 보이지 않았다(도 10). 펩타이드가 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 비율에 따라 물에 대한 용해도가 변할 수 있으며, 지나친 올리고머화는 용해도의 감소를 초래할 수 있다. 즉, 일반적으로는 올리고머화에 의해 세포 투과 능력이 증대되기는 하지만, 특정 임계점을 초과하는 올리고머화는 오히려 세포 투과 능력을 감소시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 6. 세포 독성 비교 분석
본 발명에 따른 이합체 번들 펩타이드의 상대적인 세포 독성을 비교 분석하였다. 이를 위해, 1 Х 105 개의 HeLa 세포에 각 펩타이드를 100 nM로 3시간 동안 처리한 후, PBS로 3회 세척하고 다시 PBS를 넣어준 다음 30분 뒤에 광학현미경으로 각각의 시료를 무작위로 5장씩 촬영하여 세포배양접시에 정상적으로 부착되어 있는 세포 수를 측정하였다.
측정 결과는 도 11에 나타내었다. 대체로 단량체(단위체)를 기준으로 비천연 아미노산인 사이클로헥실알라닌(Cha)을 1개만 포함하는 펩타이드보다 2개를 포함하는 펩타이드의 세포 독성이 더 높은 것으로 나타났다. 한편, 세 개의 사이클로헥실알라닌(Cha)을 포함하는 펩타이드(CMP3011 내지 CMP3014)의 경우에는 상기 아미노산에 대한 위치 특이적으로 독성의 차이가 나타났다. 즉, CMP3011은 CMP3012 및 CMP3013과 비교하여 세포 투과 능력이 떨어지면서도 이 둘보다는 더 큰 세포 독성을 보였다. CMP3011 내지 CMP3014의 번들 펩타이드는 사이클로헥실알라닌(Cha)의 위치만 상이한 이성질체임에도 상대적으로 세포 독성이 가장 높은 것(CMP3011)과 가장 낮은 것(CMP3013)이 이들 중에 모두 존재하였다. 이러한 세포 독성의 차이는 세포 투과 능력과는 상관관계가 없었기 때문에, 상대적으로 저독성의 펩타이드를 선별하여 다른 테스트에 우선적으로 사용하였다.
한편, 농도별로 CMP3013의 세포 독성을 관찰한 결과는 도 12에 나타내었다. 세포 독성은 WST-1 분석에 의해 수행되었다. 구체적으로, 1 Х 104 개의 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 경과 후, 도 12에 표기된 여러 농도의 CMP3013 펩타이드를 처리하고 하루 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 새 배양액으로 교체하고 EZ-Cytox(DoGEN, 대한민국)를 웰당 10 μL씩 처리하여 30분 동안 배양한 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, CMP3013의 세포 독성은 마이크로몰 수준의 농도 이상에서만 나타나며, 배양된 세포의 50%가 사멸되는 농도는 10 마이크로몰에 이르는 것을 확인하였다(도 12).
실시예 7. 미토콘드리아 표적화 능력 평가
본 발명에 따른 이합체 번들 펩타이드가 미토콘드리아에 어느 정도의 비율로 표적화되는지 확인하기 위해 실험예 4에 기술된 방법에 따라 미토콘드리아 분획화를 수행하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015를 각각 EC50 농도(표 13 참조)로 3시간 동안 처리한 후 세포를 수확하여 분획화(fractionation)을 수행하였다.
그 결과, 이합체 번들 펩타이드의 53-80%가 미토콘드리아를 표적으로 하는 것으로 나타났다(도 13). 이들 중 CMP3013이 미토콘드리아 분획에서 가장 높은 비율로 발견되었으며, 이어서 CMP3010 및 CMP3004 순으로 미토콘드리아 분획에 존재하는 비율이 높은 것으로 나타났다. 더욱이, 거의 모든 종류의 펩타이드가 세포질보다는 미토콘드리아에 유의하게 더 많이 분획됨을 확인하였다.
실시예 8. 세포에서 ROS 생성 억제 능력 확인
통상적으로 과산화수소수(H2O2)를 처리하면 ROS의 생성이 증가하여 미토콘드리아 기능이 저하된다. 이에, FL-CMP3001 내지 FL-CMP3015 펩타이드의 손상된 미토콘드리아에 대한 기능 회복 능력을 비교하기 위해 각 펩타이드의 ROS 생성 억제 능력을 평가하였다. ROS 수준은 실험예 6에 기재된 방법에 따라 세포 수준에서 분석을 수행하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 각각의 펩타이드를 EC50 농도로 3시간 동안 처리한 후, DCFDA로 세포를 염색하였다. 이어서, 0.5 mM의 H2O2를 처리한 후 공초점 현미경으로 형광을 검출하고 이미징하였다. 세포들의 형광 강도는 이미지 분석 프로그램(ZEN blue)으로 계산하였다.
그 결과, 처리된 펩타이드의 종류에 따라 ROS의 생성 억제 능력에 차이가 나타나긴 하였으나, 대체로 모든 종류의 펩타이드에서 ROS 생성 억제 효과가 관찰되었다(도 14a). 특히 EC50 농도(35 nM)의 FL-CMP3013 펩타이드가 처리된 세포에서 가장 큰 ROS 생성 억제 효과가 나타났으며, H2O2에 의해 증가된 녹색 형광이 FL-CMP3013에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 14a 및 도 14b).
한편, 상기 실시예 2.2.1에서 합성된 총 256종의 펩타이드를 포함하는 16개의 단량체 펩타이드 서브-라이브러리(각 서브-라이브러리는 64종의 펩타이드 포함)에 대한 ROS 생성 억제 능력 분석 결과에서도 모든 서브-라이브러리에서 ROS 생성 억제 효과가 관찰되었으며, 특히 펩타이드에서 1번 위치의 아미노산이 페닐알라닌(F)이고, 4번 및 8번 위치의 아미노산이 사이클로헥실알라닌(Cha) 또는 루신(L)이고, 5번 위치의 아미노산이 사이클로헥실알라닌(Cha)인 펩타이드들의 ROS 생성 억제 능력이 가장 우수한 것으로 나타났다(실시예 2.2.2 및 도 7a 내지 7d 참조).
Ⅲ. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 미토콘드리아 기능 장애 회복 효과
실시예 9. 손상된 미토콘드리아에 대한 우선적 결합 효과 확인
본 발명에 따른 다양한 종류의 펩타이드 중에서 상기 실시예들을 통해 평가된 펩타이드 각각의 세포 투과 능력, 세포 독성 및 ROS 생성 억제 능력 등을 종합적으로 고려하여 CMP3013, CMP3029, CMP3030, CMP3031 및 CMP3032를 치료제 후보로서 선별하였고, 이들 펩타이드 대한 추가적 분석을 실시하였다.
먼저, 실험예 5에 기술된 방법에 따라 100 nM의 FL-CMP3013를 3시간 동안 처리한 HeLa 세포에 마이토트래커(MitoTracker™)를 염색하고 형광 분석을 수행하였다. 미토콘드리아를 손상시키기 위한 CCCP(Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)는 20 μM의 농도로 30분 동안 처리되었다. 분석 결과, FL-CMP3013은 높은 비율로 미토콘드리아에 침투하는 것이 확인되었지만, FL-CMP3013과 마이토트래커의 상관 계수(correlation factor)는 확장된(extended) 형태의 미토콘드리아에서는 예상 밖으로 낮았다(도 15a).
다음으로, 위와 같은 현상을 보다 구체적으로 연구하기 위해 실험예 5에 기술된 방법에 따라 FL-CMP3013와 CCCP를 처리하고 카디오리핀을 표지하기 위해 NAO(nonyl acridine orange)로 염색하여 초고해상도 이미지를 생성하였다. 그 결과는 놀랍게도 FL-CMP3013이 CCCP를 처리하지 않은 확장된 형태의 미토콘드리아보다 CCCP 처리에 의해 손상이 유도된 도넛형(donut-shaped) 또는 벌지형(bulge-shaped) 미토콘드리아와 더 많이 공위치화(co-localization)되는 것이 확인되었다(도 15b). 통상 둥근 모양의 미토콘드리아는 이의 기능에 장애가 발생하여 정상적인 기능을 하지 못할 때 발생하는 동역학적 현상으로 알려져 있음을 고려하면, 관찰된 바와 같은 FL-CMP3013의 특성은 이 펩타이드가 기능 장애 또는 이상이 있는 비정상적인 미토콘드리아에 특이적으로 결합할 수 있으며, 나아가 FL-CMP3013이 미토콘드리아 내막에 존재하는 카디오리핀과 상호작용함을 시사하는 것이다.
이와 같은 흥미로운 결과를 교차 검증하기 위해, 형광이 표지된 분열(fission) 개시 단백질 Drp1(Dynamin-related protein 1)을 발현시키고, 이것이 CMP3013과 함께 위치화(localization)되는지 확인하였다. Drp1-GFP의 발현은 실험예 10에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 상기 관찰된 결과와 일치되게 FL-CMP3013은 Drp1과 완벽하게 공위치화되는 것이 확인되었다(도 15c). CMP3029, CMP3030, CMP3031 및 CMP3032에 대해서도 위 CMP3013과 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 이들 펩타이드 역시 Drp1과 중첩되는 것이 확인되었다(도 15d). 특히, 상기 펩타이드 중 CMP3029가 Drp1과 가장 많이 중첩되었다(도 15d). Drp1은 미토콘드리아가 손상되었을 때 분열을 위해 세포질에서 모집되는 첫 번째 단백질로 알려져 있으며, 따라서 위와 같은 실험 결과는 CMP3013 펩타이드가 분열이 필요한 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 이동(또는 침투)함을 보여준다.
또한, CMP3013이 손상된 미토콘드리아로 이동하는지 관찰하기 위해, HeLa 세포를 FL-CMP3013(100 nM, 3시간) 및 마이토트래커로 처리하고 공초점 현미경으로 세포를 이미징하는 동안 CCCP에 의해 미토콘드리아 손상을 유도하였다. 이를 통해 얻은 타임-랩스(time-lapse) 이미지는 CCCP에 의해 미토콘드리아가 손상된 HeLa 세포에서 CMP3013과 마이토트래커의 상관관계(r 값으로 표시)가 시간이 경과함에 따라 증가함을 보여주며, 따라서 CMP3013이 손상된 미토콘드리아로 이동함을 확인하였다(도 15e).
상기 실험 결과는 CMP3013, CMP3029, CMP3030, CMP3031 및 CMP3032 펩타이드가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 표적화되며, 특히 미토콘드리아 내막의 카디오리핀에 결합함을 보여준다.
실시예 10. CCCP 유도 세포 사멸 방지 효과 확인
실시예 9에서 본 발명에 따른 펩타이드가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 표적화되는 것을 확인하였기 때문에 이러한 본원 펩타이드의 효과가 세포의 생존율에 직접적인 영향을 미치는지 확인해 보기 위해, CCCP에 의해 손상이 유도된 HeLa 세포에 FL-CMP3013을 처리하고 4시간 동안 세포의 생존 여부를 관찰하였다. 그 결과, CCCP 및 FL-CMP3013을 처리한 세포는 4시간 후에도 생존하였지만, CCCP 단독 처리된 세포는 그렇지 않았다(도 16). 즉, FL-CMP3013으로 처리된 세포는 FL-CMP3013을 처리한 세포보다 훨씬 더 높은 세포 생존율을 나타냈다.
본 실험 결과와 더불어 실시예 9의 도 15a 내지 도 15e의 결과를 종합하면, FL-CMP3013은 미토콘드리아 내막에서 카디오리핀에 특이적으로 결합하는데, 정상적인 미토콘드리아에서는 이 카디오리핀이 크리스테 조직화 시스템의 많은 단백질이나 내막의 기능단백질에 의해 보호된다고 알려져 있으므로, 내막 등 미토콘드리아의 손상에 의해 노출된 카디오리핀에 우선적으로 결합하는 것으로 생각된다. 즉, 단백질들이 미토콘드리아 내막의 표면을 완전히 보호하고 있었다면 CMP3013은 카디오리핀에 결합하지 않았을 것이다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드는 손상된 미토콘드리아 내막에서 노출된 카디오리핀에 선택적으로 결합함으로써 미토콘드리아의 기능을 회복시키고 나아가 세포의 생존율을 증가시키는 효과가 나타나는 것으로 볼 수 있다.
실시예 11. 미토콘드리아의 기능 회복 능력 및 크리스테 보호 능력
실시예 11.1. ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력 및 막 전위 회복 능력 확인
미토콘드리아의 기능 회복 능력을 알아보기 위해 세포 기반 분석을 사용하여 미토콘드리아의 ROS, ATP 수준 및 막 전위에 대한 본 발명의 α-나선형 펩타이드의 효과를 시험하였다.
먼저, FL-CMP3013을 3시간 동안 농도별로 전처리한 세포에서 미토콘드리아 손상제로 H2O2, 안티마이신 A(antimycin A) 또는 CCCP를 사용하여 다양한 손상 조건을 만들고, ROS의 수준 및 ATP 수준을 실험예 7 및 8에 각각 기재된 방법에 따라 분석하였다. 그 결과, α-나선형 펩타이드 FL-CMP3013은 미토콘드리아의 손상 조건과 무관하게 펩타이드의 용량 의존적 방식으로 망가진 미토콘드리아의 기능을 회복시키는 것으로 나타났다. 구체적으로, H2O2, 안티마이신 A 또는 CCCP에 의해 증가된 ROS의 생성 및 감소된 ATP의 생성이 FL-CMP3013에 의해 각각 ROS는 생성이 억제되고 ATP는 다시 생산이 재개됨을 확인하였다(도 17a 내지 도 17c, ROS 생성 억제 관련; 도 17d 내지 도 17f, ATP 생성 증가 관련).
다음으로, FL-CMP3013을 두 가지 농도(10 또는 30 nM)로 3시간 동안 처리한 다음 1 mM의 H2O2로 1시간 동안 처리하고, 실험예 7에 기재된 방법에 따라 미토콘드리아의 막 전위를 측정하였다. 그 결과, H2O2에 의해 감소된 미토콘드리아의 막 전위는 FL-CMP3013 처리에 의해 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였다(도 17g).
또한, 다른 종류의 세포와 손상 조건 하에 양성 대조군으로서 사이클로스포린 A(Cyclosporin A, CsA), FL-CMP3012, FL-CMP3013 및 FL-CMP3015를 각각 처리하여 미토콘드리아 막 전위의 회복 능력을 테스트하였다. 구체적으로, 3 Х 106 개의 SH-SY5Y 세포를 JC-1 염료로 염색하여 96-웰 플레이트에 각 웰당 1 Х 105 개씩 분주하고, 20 μM의 안티마이신 A를 처리하여 미토콘드리아 막 전위의 감소를 유도하였다. 동시에 미토콘드리아 막 전위 회복을 위해 CsA 또는 본 발명에 따른 펩타이드(1 μM)를 각각의 샘플에 처리하였다. CsA 또는 펩타이드의 존재 하에 JC-1의 형광 비율(red/green)을 측정하였다. 미토콘드리아 막 전위 변화는 안티마이신 A 처리 후 15분이 경과한 시점에서 정상 세포를 1로 하였을 때와 비교한 상대적 막 전위 변화를 측정하였다. 그 결과, 미토콘드리아 막 전위 회복 효과는 FL-CMP3013뿐만 아니라 FL-CMP3012 및 FL-CMP3015에서도 유사한 수준으로 나타났으며, 이러한 효과는 사이클로스포린 A에 필적하였다(도 17h).
실시예 11.2. 크리스테 보호 능력 확인
본 발명에 따른 펩타이드의 작용 방식을 확인하기 위해, 미토콘드리아 내 크리스테 숫자의 경감을 H2O2 처리에 의한 미토콘드리아의 기능 저해와 연관해서 살펴보았다. 즉, CMP3013에 의한 정상적인 미토콘드리아 기능의 촉진이 크리스테 구조의 보존과 관련이 있는지 알아보았다. 이러한 보호 효과를 평가하기 위해, 투과전자현미경(TEM) 이미지를 사용하여 CMP3013의 존재 또는 부재 하에 손상된 HeLa 세포에서 크리스테의 모양과 수의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 펩타이드가 존재하는 경우에는 길고 확장된 형태의 크리스테가 아무런 처리를 하지 않은 그룹과 일치하는 수로 존재하지만, H2O2 손상 세포에서는 긴 형태의 크리스테가 거의 존재하지 않음을 확인하였다(도 17i의 (b)). 즉, H2O2 처리에 의해 미토콘드리아 내 크리스테 구조가 대부분 파괴되며, 이와 같이 크리스테 구조가 파괴되는 조건에서도 CMP3013 처리에 의해 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 같은 숫자의 정상적인 크리스테 구조가 관찰되었다(도 17i의 (c)와 (d)).
이러한 일련의 실험 결과는 CMP3013을 포함하는 본 발명의 펩타이드를 10 내지 30 nM의 저농도로 처리한 경우에도 거의 모든 미토콘드리아의 기능이 회복됨을 확인한 실시예 11.1의 결과와 일치하는 것이며, 결국 미토콘드리아의 기능 회복은 크리스테의 구조적 보존과 연관성이 있음을 알 수 있었다.
한편, 상기 실시예 6의 세포 독성 실험 결과를 고려하면, 미토콘드리아의 기능 손상을 효율적으로 회복시킬 수 있는 본원의 펩타이드 농도는 10 내지 30 nM 정도이며, 상기 농도 범위에서의 치료지수(Therapeutic index)는 300 내지 1,000 정도로 산출된다. 이와 같은 지표는 CMP3013을 비롯한 본원의 펩타이드들이 인체에 대한 안전성이 매우 높음을 보여준다.
실시예 12. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 작용 메커니즘 확인
실시예 12.1. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 세포 투과 메커니즘
본원의 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 세포 침투 및 최종 운명에 대한 메커니즘 정보를 얻기 위한 연구를 수행하였다.
먼저, 내포작용의 메커니즘을 연구하기 위해, HeLa 세포를 다음과 같이 다양한 억제 조건으로 전처리하였다: 4℃로 냉각(ATP 의존성 경로 억제); EIPA(5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride) 처리(거대음세포작용 억제); MβCD(methyl-β-cyclodextrin) 처리(콜레스테롤 고갈); 염소산나트륨(NaClO3) 처리(프로테오글리칸 의존성 경로 억제); 클로르프로마진(chlorpromazine, CPZ) 처리(클라트린 매개 내포작용 억제). 그런 다음, 세포를 100 nM의 FL-CMP3013과 함께 3시간 동안 배양한 후 실험예 3에 기재된 방법에 따라 FACS 분석을 수행하였다. 도 18a에 나타난 결과에 따르면, CMP3013은 다양한 내포작용 메커니즘, 특히 콜레스테롤 매개 경로를 사용하여 세포에 침투할 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다.
또한, 실험예 5에 기재된 방법에 따라 엔도솜 마커(CellLight™)를 발현하는 HeLa 세포에 FL-CMP3013 및 라이소트래커로 처리하여 얻은 현미경 이미지를 통해 엔도솜 마커가 20% 미만으로 공위치화(co-localization)되는 것을 확인하였다(도 18b). 이러한 관찰은 세포질 내 대부분의 펩타이드가 엔도솜 탈출(endosomal escape)에 의해 생성됨을 시사한다. 또한, CMP3013의 일부는 리소좀에 위치하고 있으며, 이는 펩타이드 모두가 세포질로 빠져나가는 것이 아님을 시사한다(도 18b).
다음으로, 미토콘드리아 손상이 리소좀에 존재하는 펩타이드의 양에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, CCCP의 존재 또는 부재 하에 NAO를 사용하여 카디오리핀 특이적 표적화를 조사하였다. 그 결과, CCCP의 존재 또는 부재 하에 리소좀에 존재하는 펩타이드의 비율은 동일하게 유지됨을 확인하였다(각각 0.29 및 0.30; 도 18c 및 도 18d). 이러한 관찰은 CMP3013이 그 자체로 기능 장애 미토콘드리아를 제거하는 또 다른 중요한 경로인 미토파지(mitophage)를 촉진하지는 않음을 시사한다.
대조적으로, 세포질에 존재하는 CMP3013의 비율은 CCCP를 처리하지 않은 경우(0.08; 도 18c 및 도 18d)에 비해 CCCP를 처리한 경우(0.43; 도 18c 및 도 18d) 현저하게 증가하는 현상이 확인되었다.
이와 같은 결과들은 CMP3013이 미토콘드리아 손상에 의해 노출된 내막의 카디오리핀을 표적화함을 지지하는 것이다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 내포작용(endocytosis)에 의해 세포 내로 침투하여 엔도솜에서 빠져나와 손상된 미토콘드리아로 우선적으로 이동한다는 사실이 입증되었다.
실시예 12.2. 카디오리핀 특이적 결합의 확인
실시예 9에서 확인한 CMP3013의 카디오리핀-풍부 막에 대한 특이성을 추가로 검증하기 위해, 실험예 12에 기재된 방법에 따라 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)를 사용하여 미토콘드리아 내막을 모방하는 두 가지 모델 시스템을 구축하고, NBD가 표지된 CMP3013 단량체(NBD-CMP3013m)를 사용하여 카디오리핀 결합 분석을 수행하였다.
이를 위해, 먼저 NBD가 표지된 CMP3013 단량체 펩타이드를 합성하였으며, 이의 서열 및 질량 분석 데이터는 하기 표 15에, HPLC 크로마토그램은 도 19a에 각각 나타내었다.
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표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 기법을 사용하여 리포솜(liposome)에 대한 펩타이드의 결합력을 확인하였다. 구체적으로, Biacore™ T200 SPR 시스템(Cytiva, 미국)에 L1 센서칩을 삽입한 다음 리포솜을 주입하여 센서칩에 리포솜을 결합시켰다. 이후, 1 μM의 NBD-CMP3013m 펩타이드를 주입하여 리포솜과 CMP3013의 결합에 의해 증가하는 신호의 강도를 확인하였다.
센서칩 상에 생성된 내막 모델 시스템에서 본 발명의 펩타이드는 POPC/POPE 막 단독에 비해 10% 카디오리핀을 함유한 POPC/POPE 막에 대하여 약 50% 더 큰 반응 단위(response unit, RU)를 이끌어냈다(도 22a의 상단 그래프 참조). 게다가, 카디오리핀 함유 막으로부터 펩타이드의 해리는 시도된 모든 해리 조건하에서 막 자체가 파괴되었기 때문에 이를 관찰할 수 없었다. 이러한 발견은 카디오리핀에서 본 발명에 따른 펩타이드의 해리가 매우 느리며, 결과적으로 CMP3013은 카디오리핀 함유 막과 상호작용이 매우 강함을 시사한다(데이터 미표시).
또한, 리포솜 기법으로 제작된 다른 내막 모델을 사용한 실험에서 형광 표지된 CMP3013m이 POPC/POPE 리포솜 단독에 비해 10% 카디오리핀(CL) 함유 POPC/POPE 리포솜에 거의 10배 더 빠르게 결합하고, 2배 더 큰 최종 형광 강도를 나타냄을 확인하였다(도 19b). 비표지 펩타이드와의 경쟁 분석을 사용하여 측정한 카디오리핀(CL) 함유 막 표면으로부터 펩타이드의 해리는 카디오리핀이 없는 막에서의 해리보다 약 10배 느린 것으로 관찰되었다. 즉, 내막에 카디오리핀이 존재하면 CMP3013m의 해리 속도는 10배 감소하였다(도 19b 및 도 19c). CMP3013의 양으로 하전된 그룹과 카디오리핀의 음으로 하전된 인산염 모이어티 사이에서 발생하는 상호작용은 빠른 결합에 영향을 미칠 수 있는 반면, 두 물질의 친수성 부분과 지질 부분 간의 소수성 상호작용은 그들의 상호작용을 향상시키는 데 크게 기여할 수 있다(도 19b 및 도 19c).
한편, 병원성 카디오리핀 리모델링(pathogenic cardiolipin remodeling)은 미토콘드리아 내막에서 카디오리핀 함량의 감소 또는 산화된 모노-리소 카디오리핀(mono-lyso cardiolipin, MLCL) 및 산화된 디-리소 카디오리핀(di-lyso cardiolipin, DLCL)의 증가가 발생함을 의미하는데, CMP3013이 병원성으로 변화된 미토콘드리아 내막에 결합할 수 있는지 여부를 관찰하기 위해 두 종류의 추가 인공 막을 제조하였다. 하나는 다양한 비율(0 ~ 20%)로 카디오리핀을 갖는 POPC:POPE(2:1) 리포솜으로 구성되며(도 19d), 다른 하나는 10% DLCL과 함께 동일한 리포솜을 포함한다(도 19b). 실험 결과, CMP3013의 단량체 형태는 20% 카디오리핀 함유 막에 비해 카디오리핀 함량이 5 ~ 10%인 두 리포솜과 10% DLCL을 포함하는 동일한 리포솜에 결합함을 확인하였다(도 19b 및 도 19d). 이러한 결과는 CMP3013m이 카디오리핀-손상 막에 결합하고, 미토콘드리아 내막에서 이러한 병원성 변화를 극복할 수 있음을 시사한다.
미토콘드리아에서 화학적으로 중요한 사건(또는 반응)은 내막에서 발생하며, 여기에서 카디오리핀(CL)은 전자전달계를 구성하는 단백질 등과 같은 기능단백질이 제대로 기능하는데 필요한 곡률을 유발한다. 그러나 병원성 카디오리핀 리모델링은 이러한 내막의 곡률을 파괴하여 미토콘드리아 기능 장애를 일으킨다(도 20). 양친매성 α-나선 펩타이드는 세포에 침투하여 여러 개의 카디오리핀에 결합함으로써 미토콘드리아 내막의 곡률을 재생한다. 요컨대, 본 발명에 따른 펩타이드는 카디오리핀 또는 병원성 리모델링된 카디오리핀 함유 막에 특이적이며 강력하게 결합하여 미토콘드리아의 기능단백질을 모이게 함으로써 미토콘드리아 기능 장애를 교정하는 것이다(도 20). 이러한 CMP3013의 기능은 실시예 9에서 CMP3013과 CL-특이적 분자인 NAO의 공위치화를 공초점 현미경으로 분석한 결과(도 15b)와 일치하는 것으로서, CMP3013(또는 이의 단량체)는 손상된 미토콘드리아의 내막 즉, CL이 풍부한 내막에 강력하게 결합하고, 또한 그곳에 머물면서 막 또는 크리스테의 구조를 보호한다는 강력한 증거이다.
상기 실시예 9 내지 12를 통해, 본 발명자들은 CMP3013(또는 이의 환원된 단량체) 펩타이드가 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 결합하며, 과산화수소(H2O2) 또는 기타 손상제(damaging agent)에 의해 파괴된 크리스테 구조의 회복 및 유지를 촉진할 수 있음을 보여주었다. 특히, CMP3013은 4개 이상의 양전하와 4개의 소수성 부분을 가지고 있기 때문에 미토콘드리아 내막(IMM)의 다른 구성 요소보다 여러 카디오리핀 분자에 우선적으로 더 단단히 결합한다. 결과적으로, CMP3013은 크리스테의 구조를 보호하여 ROS 억제 능력 및 ATP 생산 능력의 향상, 미토콘드리아 막 전위의 증가를 유도함으로써 정상적인 미토콘드리아 기능을 촉진할 수 있음을 확인하였다.
Ⅳ. 종래 기술과의 비교 분석
SS(Szeto-Schiller) 펩타이드는 미토콘드리아를 표적화함으로써 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 대표적인 펩타이드로서 비교적 소수성인 벤젠 고리를 함유한 아미노산과 양전하를 갖는 아미노산이 교차로 결합되어 β-시트 형태를 나타낸다(도 2). SS 펩타이드로는 두 종류가 잘 알려져 있는데, 그 중 SS-31로 명명된 펩타이드는 카디오리핀에 결합하여 미토콘드리아의 기능을 향상시키는 것으로 보고된바 있다. 또한, SS-31은 미토콘드리아 기능 향상에 의한 치료 효과가 뛰어나 미토콘드리아 기능 이상과 관련된 다양한 종류의 질환을 대상으로 동물실험 및 임상실험이 진행 중이다. 그러나, 3년(2017-2020년) 동안 진행된 SS-31의 미토콘드리아성 근육병증(mitochondrial myopathy)에 대한 임상 3상은 실패하였다. SS-31은 β-시트 형태의 펩타이드로서 세포 투과율이 낮으며, 따라서 치료 효과가 나타나도록 하기 위해서는 고농도의 SS-31 펩타이드를 투여할 필요가 있는데 이 경우 세포 독성이 높아지는 문제가 있다. 따라서 저농도의 펩타이드를 사용하기 위해서는 세포 투과율을 향상시킬 필요가 있으며, 나아가 저농도의 펩타이드로도 치료 효과를 나타내기 위해서는 펩타이드 한 분자당 상호작용하는 카디오리핀의 수를 증가시킬 필요성이 있다.
본 발명은 상술한 바와 같은 기존의 미토콘드리아 표적화 펩타이드들이 직면한 기술적 과제를 해결하기 위해 고안된 것으로서, 세포 투과성을 현저하게 향상시킴으로써 저농도로 사용이 가능하고, 1개의 분자가 카디오리핀과 더 많은 상호작용을 하여 치료 효과를 극대화하였다. 하기 비교예 1 내지 5에서는 종래의 미토콘드리아 표적화 펩타이드 SS-31와 본 발명의 일 실시예에 따른 CMP3013 펩타이드의 세포 투과 능력, 카디오리핀 결합 능력을 비롯하여 미토콘드리아 기능과 관련된 ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력, 막 전위 회복 능력 등을 비교 분석함으로써 본 발명의 펩타이드가 기존 기술 대비 현저한 효과를 가짐을 입증한다.
하기 비교예들에서 사용된 SS-31은 실험예 1.1에 기술된 고체상 펩타이드 합성법과 동일한 방법으로 합성 및 정제하여 사용하였다(SS-31의 화학 구조는 도 1 참조).
비교예 1. SS-31과 CMP3013의 세포 투과 및 미토콘드리아 표적화 능력 비교
세포 투과 능력은 실험예 3에 기술된 방법에 따라 수행하였으며, 미토콘드리아 표적화 능력은 실험예 4에 기술된 방법에 따라 미토콘드리아 분획화에 의해 평가되었다. 종래 펩타이드로서 SS-31 외에 켈리(Kelley) 그룹의 미토콘드리아 투과 펩타이드(MPP1a; 문헌[Horton, Kristin L et al. "Mitochondria-penetrating peptides." Chemistry & biology vol. 15,4 (2008): 375-82.] 참조)를 추가 비교군으로 사용하였다. MPP1a의 아미노산 서열은 다음과 같다: X(dR)XKX(dR)XK (여기서, X는 사이클로헥실알리닌, dR은 D-아르기닌, K는 라이신이다.)
또한, CMP3013 외에 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드로서 L1L, L4L, L5L 및 L8L 서브-라이브러리에 포함되어 있는 LR10을 추가 비교군으로 사용하였다. LR10의 아미노산 서열은 다음과 같다: AcNH-RCRLLRRLCR-C(O)NH2
먼저, 세포 투과 능력을 비교하여 본 결과 CMP3013 및 LR10은 기존의 SS-31과 비교하여 약 100배 이상 향상된 세포 투과율을 나타냈다(도 21a). CMP3013이 가장 낮은 EC50 값을 보여주어 세포 투과 능력이 가장 좋은 것으로 평가되었으며, LR10 또한 CMP3013과 유사한 나노몰 수준에서 EC50 값이 결정되었다. 이에 반해, MPP1a 및 SS-31은 마이크로몰 수준에서 EC50 값이 결정되었으며, CMP3013에 비해 세포 투과 능력이 현저하게 떨어지는 것을 확인하였다(도 21a).
다음으로, 위 4종의 펩타이드가 미토콘드리아에 어느 정도 비율로 표적화되는지 알아보기 위해 세포에 각각의 펩타이드를 위에서 결정된 EC50 농도로 처리하고, 세포를 분획화하였다. 그 결과, 다른 펩타이드와 비교하여 CMP3013이 가장 높은 미토콘드리아/세포질 존재비(M/C Ratio, 4.1)를 보여주었다(도 21b).
상기 비교 실험 결과를 통해, CMP3013, LR10 등의 본 발명에 따른 펩타이드는 기존의 SS-31, MPP1a 펩타이드와 비교하여 현저하게 향상된 세포 투과 능력 및 미토콘드리아 표적화능을 가지며, 따라서 낮은 농도로도 치료학적으로 유효한 양의 펩타이드가 전달되는 효과를 가질 수 있다.
비교예 2. SS-31과 CMP3013의 카디오리핀 결합 능력 비교
실험예 12에 기재된 방법에 따라 POPC 및 POPE를 사용하여 미토콘드리아 내막을 모방하는 두 종류의 모델 시스템을 구축하고, NBD가 표지된 CMP3013 단량체(NBD-CMP3013m) 및 NBD가 표지된 SS-31(NBD-SS-31)을 사용하여 카디오리핀 결합 능력을 비교 분석하였다.
실시예 12.2에서 기술한 바와 같이, 표면 플라스몬 공명(SPR; Biacore) 기법을 사용하여 센서 칩 상에 생성된 내막 모델 시스템에서 CMP3013m은 POPC/POPE 막 단독(POPC:POPE)에 비해 10% 카디오리핀을 함유한 POPC/POPE 막(POPC:POPE:CL)에 대하여 약 50% 더 큰 반응 단위(RU)를 이끌어냈다(도 22a 상단 그래프). 이에 반해, SS-31은 두 종류의 막에 대해 결합력의 차이를 나타내지 않았다(도 22a 하단 그래프). 더욱이, CMP3013m은 결합력이 매우 강하여 카디오리핀이 함유된 막에서 해리되지 않았다.
또한, 리포솜 기법으로 제작된 다른 내막 모델을 사용한 실험에서도 모든 종류의 막(카디오리핀 또는 디-리소 카디오리핀을 갖는 리포솜)에서 SS-31보다 우수한 결합력을 제공한다(도 22b). SS-31은 카디오리핀 함유 막에 대해 선택적 결합력을 나타내긴 하였지만 이는 CMP3013m과 비교하여 현저하게 약했다.
실시예 12 및 도 20에서 살펴본 바와 같이, 카디오리핀은 미토콘드리아가 정상적으로 기능할 수 있도록 하는 내막의 곡률을 유발한다. CMP3013과 SS-31은 모두 미토콘드리아 내막에 존재하는 카디오리핀에 특이적으로 결합함으로써 내막에 곡률을 제공하고, 이로써 크리스테 구조가 유지될 수 있도록 하는 공통된 작용 메커니즘을 가진다. 본원의 CMP3013은 SS-31에 비해 카디오리핀에 대한 결합력이 약 100배 이상 강하므로, 기존의 SS-31과 같은 미토콘드리아 특이적 펩타이드가 가졌던 저농도에서의 치료 효과가 거의 없다는 문제점을 극복할 수 있을 것으로 기대된다.
비교예 3. SS-31과 CMP3013의 ROS 생성 억제 능력 비교
두 펩타이드의 미토콘드리아의 기능 회복 효과를 비교하기 위해, SS-31과 CMP3013의 ROS 생성 억제 능력을 시험하였다. 실험예 6에 기술된 방법에 따라 세포의 상대적 ROS 수준을 형광 강도에 의해 비교하였으며, 4가지의 서로 다른 미토콘드리아 손상제(200 μM CCCP, 50 μM 로테논, 10 μM 안티마이신 A 또는 50 μM H2O2)를 SH-SY5Y 세포에 처리하여 미토콘드리아 손상에 의한 ROS의 생성을 유도하였다.
그 결과, 도 23a 내지 도 23d에 나타난 바와 같이, 나노몰 수준의 SS-31은 모든 손상 조건에서 유의한 ROS 생성 억제 효과를 나타내지 않았다. 이와는 대조적으로 CMP3013은 손상 조건과 관계없이 SS-31 농도의 1/10배 미만의 저농도에서도 SS-31과 동등하거나 더 향상된 ROS의 생성 억제 능력을 나타내었다.
비교예 4. SS-31과 CMP3013의 ATP 생성 촉진 능력 비교
두 펩타이드의 미토콘드리아의 기능 회복 효과를 비교하기 위해, SS-31과 CMP3013의 ATP 생성 촉진 능력을 시험하였다. 실험예 8에 기술된 방법에 따라 세포의 상대적 ATP 수준을 형광 강도에 의해 비교하였으며, 2가지의 서로 다른 미토콘드리아 손상제(1 μM의 안티마이신 A 또는 1 mM의 H2O2)를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도하였다.
그 결과, 도 24a 및 도 24b에 나타난 바와 같이, SS-31은 모든 손상 조건 및 모든 농도에서 ATP의 생성을 촉진하는데 실패하였다. 이에 반해, 본원의 CMP3013은 10 nM의 저농도로 처리된 경우에도 ATP의 생성을 재개하도록 촉진하는 효과가 나타났다.
비교예 5. SS-31과 CMP3013의 막 전위 회복 능력 비교
두 펩타이드의 미토콘드리아의 기능 회복 효과를 비교하기 위해, 막 전위에 대한 SS-31과 CMP3013의 영향을 시험하였다. 실험예 7에 기술된 방법에 따라 미토콘드리아의 막 전위 변화를 JC-1의 형광 비율로 측정하였으며, 미토콘드리아 손상제로는 1 mM의 H2O2를 사용하였다.
그 결과, H2O2의 처리에 의해 미토콘드리아가 손상되어 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)가 낮아지며, CMP3013은 10 nM 미만의 농도에서 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)를 증가시키는 반면, SS-31은 30 nM 이상의 농도에서도 미토콘드리아 막 전위 증가 효과를 나타내지 못하였다(도 25).
비교예 3 내지 5의 실험 결과를 통해 본 발명의 α-나선형 펩타이드는 SS-31을 비롯한 기존의 미토콘드리아 표적화 펩타이드들과 비교하여 훨씬 더 낮은 농도에서 현저하게 높은 미토콘드리아 기능 회복 효과를 나타냄을 입증하였다.
Ⅴ. 미토콘드리아 특이적 펩타이드의 질병 치료 효과
실시예 13. 펩타이드의 장기(organ)에서의 분포
본 발명에 따른 α-나선형 펩타이드가 정맥 주사에 의해 전신 투여되는 경우의 생체 내 분포를 파악하기 위해, 시아닌(cyanine) 5.5가 표지된 CMP3013 펩타이드를 정상 수컷 C57BL/6 마우스에 3 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하고 24시간 뒤 장기를 적출하여 IVIS 이미징 분석을 수행하였다. 그 결과, CMP3013은 주로 간, 폐, 비장 및 신장에 분포하는 것으로 확인되었다(도 26).
실시예 14. hTEC 세포내 손상된 미토콘드리아의 개선 효과
실시예 14.1. 미토콘드리아 표적화 능력 평가
인간 신장 상피세포에서의 CMP3013의 효과를 검증하기 위하여, 인간 세뇨관 세포(human kidney tubular epithelial cells, hTECs)에 대한 CMP3013의 세포 투과성 및 미토콘드리아에 대한 선택적 표적화를 확인하였다. 실험예 5에 기술된 방법에 따라 100 nM의 TAMRA-CMP3013를 3시간 동안 처리하고 NAO로 염색한 후 20 μM의 CCCP를 30분 동안 처리하여 미토콘드리아 손상을 유도하였다. 초고해상도 이미지를 생성하여 카디오리핀을 확인한 결과, HeLa 세포에서 확인한 결과와 마찬가지로 CMP3013은 확장된 형태와 비교하여 돌출 모양의 미토콘드리아에서 공위치화 패턴을 나타내었다(도 27). 이는, FL-CMP3013 펩타이드가 기능 장애 또는 이상이 있는 인간 신장 세뇨관 세포의 비정상적인 미토콘드리아에 특이적으로 결합할 수 있음을 시사한다.
실시예 14.2. ROS 생성 억제 능력, ATP 생성 촉진 능력 및 막 전위 회복 능력 확인
CMP3013을 3시간 동안 농도별로 전처리한 hTEC 세포에서 미토콘드리아 손상제로 H2O2를 사용하여 손상 조건을 만들고, ROS의 수준 및 ATP 수준을 실험예 7 및 8에 각각 기재된 방법에 따라 분석하였다. ROS 수준 및 막 전위 측정은 20 nM 또는 60 nM 농도의 CMP3013 펩타이드 처리한 후, 1 mM의 H2O2를 30분 동안 처리하여 세포막 손상 조건을 만들었다. ATP 수준 측정은 10 nM 또는 20 nM 농도의 CMP3013 펩타이드 처리한 후, 0.5 mM의 H2O2를 1시간 동안 처리하여 세포막 손상 조건을 만들었다.
그 결과, ROS 생성은 저농도의 CMP3013(20 nM 또는 60 nM)을 처리한 세포에서 효과적으로 억제되는 것으로 나타났으며(도 28a), 막 전위는 통계적으로 유의한 개선 효과는 없었으나 CMP3013을 처리하지 않은 세포에 비해 CMP3013를 처리한 세포에서 농도 의존적으로 증가하였다(도 28b). 또한, CMP3013은 미토콘드리아 손상제에 노출된 후 ATP 생산을 농도 의존적으로 복원하였다(도 28c).
실시예 14.3. 미토콘드리아 호흡 측정을 통한 신장 세포의 치료 효과 확인
hTEC 세포에 CMP3013(10 nM 또는 50 nM)을 전처리한 후 H2O2를 처리하여 미토콘드리아의 손상을 유도한 뒤, 실험예 16에 기술된 방법에 따라 세포의 호흡률인 산소 소비율(Oxygen Consumption Rate, OCR), 세포외 산성화율(Extracellular Acidification Rate, ECAR) 및 양성자 유출률(Proton Efflux Rate, PER)을 측정하였다.
산소 소비율 측정 결과, 대조군(CTL-hTEC)에 비하여 H2O2 처리군에서는 분당 미토콘드리아 호흡에 의한 산소 소비율이 감소하였으나, CMP3013 투여군에서는 산소 소비율이 다시 상승하였다(도 29a의 40분 내지 60분 사이의 결과). 특히, 두 가지 농도(10 nM 및 50 nM)의 CMP3013에서 상승된 산소 소비율이 유사하였다.
또한, 대조군(CTL-hTEC)에 비하여 H2O2 처리군에서는 분당 미토콘드리아 호흡에 의한 해당 유량(glycolytic fluxes)을 나타내는 세포외 산성화율(ECAR) 및 ATP 생산을 나타내는 양성자 유출률(PER)이 현저하게 감소하였으며, CMP3013의 투여에 의하여 유의한 상승효과를 보였다(도 29b, ECAR; 및 도 29c, PER). 특히, 저농도인 CMP3013 10 nM 농도에서 보다 유의한 상승 효과를 나타냈다.
실시예 15. 신독성(nephrotoxicity) 완화 효과
실시예 15.1. 콜리스틴 유발 신독성(colistin-induced nephrotoxicity, CIN) 동물 모델의 제조 및 신장 손상 확인
7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 자유급이 상태로 3일 동안 순화시킨 후 무작위로 선택하여 다음의 세개의 군으로 나누었다: 대조군(Sham), CIN 모델(콜리스틴 투여군), CIN 모델 + 펩타이드(CMP3013 또는 CMP3029) 투여군. 콜리스틴(Sigma-Aldrich, 미국)은 20 mg/kg의 용량으로 최대 7일까지 매일 피하 주사하여 신독성을 유발하였으며, 펩타이드(CMP3013 및 CMP3029)는 콜리스틴 투여 마우스에 격일(Day 0, 2, 4 및 6)로 복강내 주사하였다. 구체적으로, CMP3013의 경우 1 mg/kg 용량을 주사하였고(표 16), CMP3029는 0.3 mg/kg 또는 1 mg/kg의 용량을 복강내 주사하였다(표 17). 다음, 콜리스틴을 처음 투여한 일자로부터 7일째(Day 7)에 자동분석기(autoanalyzer; Wako Chemical Industries, 일본)를 사용하여 BUN을 측정하였다. 또한, 자동분석기(autoanalyzer; Hitachi Chemical Industries, Ltd., 일본)를 사용하여 변형된 야페 반응(modified Jaffe reaction)에 의해 크레아티닌을 측정하였다. 콜리스틴 유발 신독성 동물 모델의 실험 계획은 도 30에 도시되어 있다.
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실시예 15.2. CMP3013의 신독성 완화 효과 확인
실시예 15.1에 기술된 방법에 따라 매일 피하로 콜리스틴이 투여되어 신독성을 나타내는 마우스에 1 mg/kg의 CMP3013을 1일째(day 1)부터 격일로 복강내 주사하고, 7일째 되는 날 혈중 BUN, 크레아티닌 수준 및 실험예 14에 기술된 방법에 따라 신장 손상과 관련된 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, CMP3013은 신독성에 의해 증가된 BUN과 크레아티닌을 약 50%까지 감소시키는 것으로 나타났으며(도 31a 및 도 31b), CMP3013을 1 mg/kg 투여한 군의 생존율은 대조군과 유사하고(생존율 100%) CIN 마우스보다 훨씬 긴 생존율을 나타냈다(도 31c). 신장 손상과 관련된 단백질의 발현을 측정한 결과, NGAL(신장 손상 지표), P-21(세포 주기 정지 및 세포사멸 지표), 8-OHdG(산화성 DNA 병변에 대한 바이오마커) 및 시토크롬 C(미토콘드리아 세포사멸 지표)의 발현은 CIN 마우스에 비해 CMP3013 투여 마우스에서 현저하게 감소하였다. 반면, CIN 마우스와 비교하여 CMP3013 투여 마우스에서는 SOD-1(항산화 효소)의 발현이 증가했다(도 31d). 또한, CMP3013 투여 마우스는 급성세뇨관괴사(acute tubular necrosis), 세뇨관 내 캐스트 형성(intratubular cast formation) 및 세뇨관 확장(tubular dilation)이 더 적었고, 신장 섬유증(renal fibrosis)도 검출되지 않았다(도 31d, MT 이미지). 특히, 신장 절편을 조사한 결과, CMP3013은 미토콘드리아의 크리스테 구조를 보존하고 크리스테를 촘촘하게 유지하여 콜리스틴에 의한 손상으로부터 보호하는 것으로 나타났다(도 31e). 이러한 결과는 낮은 용량(1 mg/kg)의 CMP3013이 신장에서 콜리스틴으로 인한 부담(독성)을 구제하기에 충분한 수준의 효능을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 15.3. CMP3029의 신독성 완화 효과 확인
실시예 15.2와 동일한 방법으로, CMP3013과는 다른 종류의 소수성 아미노산을 갖는 CMP3029를 복강내 투여하여 콜리스틴에 의한 신독성이 완화될 수 있는지 여부를 확인하였다(도 32a 내지 도 32c).
그 결과, CMP3029를 0.3 mg/kg 투여한 군에서는 CIN 마우스에 비해 BUN과 크레아티닌의 수준이 감소하였으며(도 32a 및 도 32b, 3번째 컬럼), CMP3029를 1 mg/kg 투여한 군에서도 증가한 BUN과 크레아티닌의 수준이 감소하였다(도 32a 및 도 32b, 4번째 컬럼). 또한, 콜리스틴으로 유도된 신독성에 의한 마우스 모델의 생존율을 확인한 결과, CMP3029를 0.3 mg/kg 투여한 군에서의 생존율은 CIN 모델(콜리스틴 투여군)보다 상승하였으며, CMP3029를 1 mg/kg 투여한 군에서는 대조군(Sham)과 동일하게 모든 개체가 사망하지 않았다(도 32c).
따라서 콜리스틴과 같이 신독성을 나타내는 다양한 종류의 약제(항생제, 항암제 등)를 사용함에 있어서 CMP3013, CMP3029를 비롯한 본 발명의 펩타이드를 병용 투여하면 신장의 손상을 효과적으로 예방할 수 있다.
실시예 16. 급성 신손상(acute kidney injury)에 대한 치료 효과
실시예 16.1. 급성 신손상 동물 모델의 제조
급성 신손상의 초기 신손상 기전 연구에 주로 사용되는 허혈-재관류 신손상(bilateral renal ischemia-reperfusion injury, IRI) 모델을 이용하여 사전에 투여한 CMP3013과 SS-31의 효력 차이(표 18 참조, 렛트 모델)를 비교하고, CMP3013의 농도에 따른 허혈성 신손상 예방 효과(표 19 참조, 마우스 모델)를 확인하였다. 먼저, 7주령 수컷 SD 렛트 또는 C57BL/6 마우스를 자유 급이 상태로 3일 동안 순화시킨 후, CMP3013을 정맥 투여 또는 SS-31을 복강내 투여하였다. 대조군 및 IRI 모델에는 동량의 식염수를 투여하였다. CMP3013 또는 SS-31 투여 후(렛트, 24시간 후; 마우스, 1시간 후), 이소플루레인(Isoflurane)을 이용하여 동물 모델을 흡입 마취하였다. 다음, 도 33에 도시된 바와 같이, 신장이 위치한 옆구리 부분을 삭모한 뒤 피부를 소독하고, 블런트 다이섹션을 통해서 삭모한 부분의 피부와 근육을 잘라내고 신장 동맥을 드러내어 마이크로 세라핀 클립(Roboz Surgical Instrument, Gaithersburg, MD)을 사용하여 동물 모델의 양쪽 신장 동맥을 클램핑 하였다(렛트, 40분; 마우스, 30분). 클램핑을 제거하고 근육 및 피부를 봉합하였다. 수술 후 혈청을 채취하여(렛트, 수술 6시간 후; 마우스, 수술 24시간 후) 신손상 관련 지표를 측정하여 평가하였다.
표에서, i.v.는 정맥 투여, i.p.는 복강내 투여를 의미한다. 렛트의 경우 모든 군은 3수의 동물이 사용되었으며, 마우스의 경우 모든 군은 10수의 동물이 사용되었다.
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실시예 16.2. SS-31과 CMP3013의 급성 신손상 치료 효과 비교
실시예 16.1에 기술된 방법에 따라 렛트에 펩타이드(CMP3013 또는 SS-31)를 사전 투여한 후 IRI를 유발한 신손상 모델에서 펩타이드 투여에 의하여 신손상이 억제되는지 여부를 확인하였다. 분석 결과, CMP3013 투여군의 BUN 및 CRE의 수치는 IRI 대조군에 비해 약 40 내지 50% 정도 감소하였다(도 34a 및 도 34b). 이와 같은 결과는 IRI 유발로 급격하게 증가된 BUN 및 CRE을 단 한 번의 CMP3013 투여만으로도 감소시킬 수 있어 급성 신손상에 대한 현저한 예방 및 치료 효과가 있음을 시사한다.
또한, SS-31의 투여군과 비교하였을 때 CMP3013 투여군은 SS-31 대비 투여량이 1/2 수준에 불과함에도 급성 신손상에 대한 우수한 치료 효과를 나타내었다. SS-31은 미토콘드리아 내막의 카디오리핀에 결합하여 미토콘드리아 기능을 회복시키는 능력이 있지만, β-시트 형태 구조로 세포 투과 효율이 좋지 않다는 문제가 있다. 이를 해결하기 위하여 고농도의 투여를 고려할 수 있지만, 고농도의 투여는 세포 독성 문제를 야기할 수 있음이 문제로 제기되었다. CMP3013의 저농도 투여(1 mg/kg)가 SS-31보다 더 우수한 급성 신손상 치료 효과가 있음을 입증한 데이터를 통하여 상술한 문제를 해결 가능성을 확인하였다.
실시예 16.3. CMP3013의 농도에 따른 급성 신손상 치료 효과 확인
실시예 16.1에 기술된 방법에 따라 마우스에 CMP3013(1 mg/kg 또는 5 mg/kg)을 사전 투여한 후 IRI를 유발한 신손상 모델에서 신손상이 억제되는지 여부를 확인하였다(도 35). 먼저, IRI 마우스 혈청의 BUN 및 크레아티닌(CRE)은 대조군에 비해 현저하게 상승하였고, CMP3013 투여(1 mg/kg 또는 5 mg/kg 투여군)에 의하여 혈청 BUN 및 크레아티닌 수치가 감소하였다(도 36a 및 도 36b). 다음, 손상된 신장 조직의 면역조직화학 분석 결과, CMP3013 투여군은 두 농도 모두에서 IRI 모델에 비해 세뇨관 손상, 캐스트 형성 및 염증 세포 침윤이 덜한 것으로 나타났다(도 36c). 또한 CMP3013 투여군에서는 SOD-1(항산화 효소) 발현은 증가하고, NGAL(신장 손상 지표)과 시토크롬 C(미토콘드리아 세포사멸 지표) 수준은 감소하였다(도 36c 내지 도 36e). 실험예 17에 기술된 방법에 따라 신장 손상 관련 지표의 mRNA 수준을 확인한 결과, CMP3013 투여에 의하여 미토콘드리아 항산화 효소인 NQO-1 및 SOD-1 mRNA의 발현이 상향조절되었다(도 36f 및 도 36g). 또한, CMP3013 투여에 의하여 미토콘드리아 전자 수송 복합체 채널 5의 기능과 관련된 항산화 및 항염증 사이토카인인 IL-10 및 ATP6의 mRNA 발현이 증가하였다(도 36h 및 도 36i).
실시예 16.4. CMP3013의 후 투여(Post- administration) 따른 급성 신손상 치료 효과 확인
손상된 신장에 대한 CMP3013의 개선 효과를 확인하기 위해 CMP3013 투여와 신손상 유발(IRI 모델 제작)의 순서를 바꿔 실험을 진행하였다. 구체적으로, 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 자유 급이 상태로 3일 동안 순화시킨 후, 실시예 16.1의 IRI 모델 제작 방법에 따라 급성 신손상을 유발하였다. 급성 신손상 유발 1시간 후에 1 mg/kg의 CMP3013을 정맥 주사로 후 투여(post-administration)하고 23시간이 지난 후 BUN 및 혈청 크레아티닌을 측정하였다(도 37).
그 결과, IRI 모델의 BUN 수준은 대조군 대비 약 8배 증가하였고(대조군, 20.32 ± 0.73; IRI 모델, 168.5 ± 5.1), 증가한 BUN 수준은 1 mg/kg의 CMP3013 투여에 의하여 IRI 모델 대비 약 1.2배 유의하게 감소하였다(IRI 모델, 168.5 ± 5.1; CMP3013 투여군, 143.7±7.22; *p-value = 0.0230). 또한, IRI 모델의 혈청 크레아티닌 수준은 대조군 대비 약 8배 증가하였고(대조군, 0.248 ± 0.02; IRI 모델, 1.97 ± 0.08), 증가한 크레아티닌 수준은 1 mg/kg의 CMP3013 투여에 의하여 IRI 모델 대비 약 1.3배 유의하게 감소하였다(IRI 모델, 1.97 ± 0.08; CMP3013 투여군, 1.516 ± 0.09; **p-value = 0.0060). BUN 및 크레아티닌 측정 결과는 도 38a 및 도 38b에 도시하였다.
신손상이 일어난 동물 모델에 CMP3013을 후 투여하여 신장 기능 회복 효능을 확인한 것은 CMP3013이 실제 신손상의 치료제로서 사용될 수 있음을 확인한 결과이다. 급성 신손상을 유발하기 전에 CMP3013을 투여하거나(실시예 16.2 및 실시예 16.3) 급성 신손상을 유발한 후에 CMP3013을 투여한 경우(실시예 16.4) 모두에서 신손상 억제 효과를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 본 발명의 미토콘드리아 특이적 펩타이드는 탁월한 신손상 예방 및 치료 효과를 제공할 수 있음을 확인하였다.
실시예 17. 급성 간손상(acute liver injury)에 대한 치료 효과
실시예 17.1. 급성 간손상 동물 모델의 제조 및 혈액 분석
7 주령 암컷 C57BL/6 마우스를 자유급이 상태로 3일 동안 순화시킨 후, CMP3013 또는 CMP3029를 2일 간격으로 총 3회(Day 0, 2, 4) 정맥 투여(표 20 및 표 21) 한 후 5일째 되는 날(Day 5) 100 mg/kg 용량의 티오아세트아미드(thioacetamide, TAA; Sartorius, 독일)를 복강내 투여하여 급성 간손상을 유도하였다. CMP3013 및 CMP3029의 투여 정보(투여 경로, 투여 용량 등)는 표 20(CMP3013, 정맥 투여) 및 표 21(CMP3029, 정맥 투여)에 요약하였다.
[규칙 제91조에 의한 정정 27.02.2024]
Figure WO-DOC-FIGURE-tt20
[규칙 제91조에 의한 정정 27.02.2024]
Figure WO-DOC-FIGURE-tt21
표에서, i.v.는 정맥 투여, i.p.는 복강내 투여를 의미한다.
CMP3013 및 CMP3029의 투여 7일째(Day 7)에 심장에서 채취한 혈액으로부터 혈청 샘플을 수득하고, 샘플을 혈액분석기(Hitachi Chemical Industries, Ltd., 일본)를 사용하여 분석하였다. 간손상 지표로서 혈중 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase) 및 ALP(alkaline phosphatase)를 측정하여 평가하였다. 급성 간손상 마우스 모델을 이용한 CMP3013 및 CMP3029 효력 시험 계획은 도 39를 참조한다.
모든 실험 동물에서 CMP3013 또는 CMP3029의 3회 투여 후 이상 증상은 발생하지 않았으며, 사망한 개체 또한 없었다. 또한, CMP3013 또는 CMP3029 및/또는 TAA 투여에 의한 체중 감소도 나타나지 않았다.
실시예 17.2. CMP3013의 간 손상 억제 효과 확인
실시예 17.1에 기술된 방법에 따라 CMP3013을 사전에 주사한 마우스에서 TAA에 의한 간 손상 억제되는지 여부를 확인하였다.
분석 결과, 간 손상 지표인 혈중 AST, ALT 및 ALP는 모두 CMP3013을 투여한 군에서 현저하게 감소되는 것이 확인되었다(도 40a 내지 도 40c). 구체적으로, CMP3013 1 mg/kg 정맥 투여 시험(표 20)에서 정상 대조군(G1) 대비 TAA 투여군(G2)의 AST는 6.0 배, ALT는 3.1 배 및 ALP는 2.8 배로 급격하게 증가하였으나, 정상 대조군(G1) 대비 CMP3013 투여군(G3)의 AST는 3.6 배, ALT는 2.6 배 및 ALP는 0.4 배로 약간 증가하였다(도 40a, AST; 도 40b, ALT; 및 도 40c, ALP). 이를 통하여, 급성 간손상 모델에 CMP3013를 투여한 경우 AST, ALT, 및 ALP의 수치가 각각 37%, 12%, 및 35% 정도 감소하는 것을 확인하였다.
표 20과 동일 조건으로 추가 실험을 진행한 결과에서도, 정상 대조군(G1) 대비 TAA 투여군(G2)에서는 AST 및 ALT가 급격히 증가하였으며, CMP3013 1 mg/kg 투여군(G3)의 AST 및 ALT는 TAA 투여군보다 감소하였다(도 40d). TAA 투여군과 CMP3013 투여군의 간을 적출하여 조직의 상태를 검시한 결과에서도 CMP3013을 투여하지 않은 TAA 투여군에서는 간 세포 및 형태의 손상이 육안으로 확인된 반면, CMP3013을 투여한 그룹에서는 세포의 손상이 거의 관찰되지 않았으며, 형태 또한 잘 보존되어 있음이 확인되었다(도 40e). 또한, 정상 대조군, TAA 투여군 및 CMP3013 투여군의 간 조직을 세포 노화의 지표인 SA-β-gal 마커 및 p21 마커로 염색하여 확인한 결과, TAA 투여군에서 SA-β-gal 양성 및 p21 양성으로 염색된 세포들이 CMP3013 투여군에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 40f, SA-β-gal; 및 도 40g, p21). 이를 통해, CMP3013의 투여가 간 손상 지표의 감소뿐만 아니라 간 조직의 세포 노화 회복에도 현저한 효과를 나타냄을 시사한다.
실시예 17.3. CMP3029의 간 손상 억제 효과 확인
실시예 17.1에 기술된 방법에 따라 CMP3029를 사전에 주사한 마우스에서 TAA에 의한 간손상 억제되는지 여부를 확인하였다.
분석 결과, CMP3029 정맥 투여 시험(표 21)에서 TAA 투여군(G1)과 대비하여 CMP3029의 투여량에 의존적으로 AST, ALT 및 ALP의 수치가 감소하는 것을 확인하였다(도 40h, AST; 도 40i, ALT; 및 도 40j, ALP).
이와 같은 결과는 낮은 용량(1.0 mg/kg)의 CMP3013 및 CMP3029가 간손상을 억제하며, 나아가 고용량(10 mg/kg)의 CMP3013 및 CMP3029는 더욱 향상된 간손상 억제 효과를 제공할 수 있음을 시사한다.
Ⅵ. 결론 및 고찰
본원의 미토콘드리아 특이적 펩타이드(단량체 또는 이의 이합체)는 1, 4, 5 및 8번 아미노산을 소수성으로 구성하고, 3, 6, 7 및 10번 아미노산을 친수성으로 구성함으로써 양친매성 특성 및 α-나선형 구조를 나타낸다는 특징이 있으며, 치료제로서 높은 사용 가능성을 시사하는 몇 가지 중요한 이점을 가지고 있다. 첫째로, CMP3013, CMP3029를 위시한 본원의 펩타이드는 세포 투과성이 매우 높기 때문에 나노몰 수준의 낮은 농도(EC50 = 35 nM)에서도 세포 내로 쉽게 위치한다. 둘째로, 본원의 펩타이드는 미토콘드리아에 우선적으로 들어가며(약 80%), 이는 부작용을 유발하는 세포질에 존재하는 양이 많지 않음을 의미한다. 셋째로, 본원의 펩타이드는 미토콘드리아 내막의 특정 인지질인 카디오리핀에 우선적으로 결합하여 크리스테 구조를 보호하고, 이로써 기능단백질이 제대로 작동할 수 있도록 하는 견고한 막을 제공한다. 넷째로, 가장 중요하게는 본원의 펩타이드는 여러(또는 복수의) 카디오리핀 분자에 대해 강한 결합력을 가지고 있어 통상적인 1:1 복합체에서 예상되는 것보다 훨씬 더 강한 상호작용을 초래한다. 결과적으로, 카디오리핀 함유 층으로부터 본원 펩타이드의 해리는 매우 느려서 그 효과를 더욱 강력하게 만든다.
또한, 본 발명의 펩타이드가 확장된 형태의 미토콘드리아와 매우 낮은 상관관계를 갖는 반면, 도넛형 또는 벌지형 미토콘드리아와 더 높은 상관관계가 있다는 발견도 치료제로서의 사용 가능성에 있어서 동등하게 중요할 것이다(도 15a). 즉, 위에서 언급한 바와 같이 이러한 발견은 본원의 펩타이드가 보호적 크리스테 조직 시스템(cristae organizing system)이 존재하지 않는 손상된 미토콘드리아에 선택적으로 위치함을 시사한다. 이러한 이유로 손상된 카디오리핀(또는 크리스테)의 형성을 효과적으로 차단하고 기능적 미토콘드리아에 영향을 미치지 않으면서 기능적 크리스테를 유지하기 위해서는 단지 소량의 본원에 따른 펩타이드만이 필요할 것으로 예상된다. 즉, 본원의 펩타이드에 있어서 세포 독성을 최소화하는 데 요구되는 나노몰 수준의 치료적 농도는 ATP 생성 및 미토콘드리아 막 전위 증가를 포함하여 미토콘드리아 기능을 보호하기에 충분해야 한다.
상술한 실시예들에서, 본원의 α-나선형 양친매성 펩타이드인 CMP3013, CMP3029 등은 비정상적이고 손상된 미토콘드리아에 우선적으로 결합하고, H2O2 또는 기타 손상제의 처리에 의해 파괴된 크리스테 구조의 회복 및/또는 유지를 촉진한다는 것을 보여주었다. 시험관 내 세포 기반 실험과 생체 내 동물 모델 연구 모두에서 치료적 효과가 매우 낮은 농도의 본원 펩타이드에 의해 촉진됨은 매우 고무적인 결과이다. 생합성 및 미토파지를 포함하는 미토콘드리아 항상성은 세포가 기능 장애 미토콘드리아를 손상되지 않은 세포 소기관으로 신속하게 대체할 수 있도록 한다. 따라서 치료제는 결함이 있는 모든 미토콘드리아를 복구할 필요는 없으며, 본원의 펩타이드에 의해 복구된 손상된 미토콘드리아의 일부는 정상적인 조직의 기능을 회복하기에 충분할 것으로 예상된다.
이러한 예상은 신손상 세포에서 CMP3013이 적은 투여만으로도 미토콘드리아 관련 지표의 회복 효과를 보였다는 사실, 콜리스틴에 의한 신독성 동물 모델(CIN)에서 본 발명의 CMP3013 및 CMP3029 펩타이드가 저용량의 투여로도 신손상 회복 효과를 보였다는 사실, 급성 신손상 동물 모델에서 본원의 α-나선형 양친매성 펩타이드인 CMP3013이 SS-31의 1/2 투여량으로도 더 우수한 신손상 회복 효과를 보였다는 사실, 급성 신손상을 유발하기 전 또는 유발한 후에 투여한 경우 모두에서 신손상 개선 효과를 보였다는 사실 및 급성 간손상 동물 모델에서 CMP3013 및 CMP3029가 저용량의 투여로도 간 세포의 손상을 억제하거나 손상된 간 세포를 회복시키는 효과를 보였다는 사실에 의하여도 뒷받침된다.
Ⅶ. 재료 및 방법
실험예 1. 펩타이드의 제조
실험예 1.1. 펩타이드의 합성, 분리 및 정제
펩타이드는 SPS 마이크로웨이브 펩타이드 합성기(Discover, CEM, 미국)에서 표준 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 고체상 펩타이드 합성(solid-phase peptide synthesis, SPPS) 방법을 사용하여 합성하였다.
구체적으로, 링크 아마이드(rink amide) MBHA 수지는 N,N-디메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide, DMF) 중의 20 %(v/v) 피페리딘을 사용하여 탈보호되었고, Fmoc으로 보호된 아미노산은 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA) 및 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트((benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, PyBOP)의 존재 하에 커플링되었다. 수지는 DMF 및 디클로로메탄(dichloromethane, DCM)으로 가볍게 흔들면서 여러 번 세척하였다. 목적하는 서열의 펩타이드가 합성될 때까지 탈보호 및 커플링을 반복하였다. 마지막 아미노산을 첨가한 후, 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하였다. 아세틸화는 아세트산 무수물 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물(1-hydroxybenzotriazole hydrate, HOBt)을 첨가하여 수행하였다.
형광 표지를 위해, 5-카르복시테트라메틸로다민(5-carboxytetramethylrhodamine, 5-TAMRA)을 O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), HOBt 및 DIPEA의 존재 하에 DMF를 이용하여 펩타이드에 접합시켰다. 6-(7-니트로벤조푸라잔-4-일아미노)헥산산(6-(7-nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid, C6-NBD)은 DMF에서 PyBOP 및 DIPEA를 사용하여 표지하였다.
수지 상에 합성된 펩타이드는 절단 혼합제[트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)/1,2-에탄디티올(1,2-ethanedithiol, EDT)/증류수/트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS) = 94:2.5/2.5/1, v/v]를 사용하여 절단하였다. 침전을 위해, n-헥산(n-hexane) 및 디에틸에테르(diethyl ether)의 1:1(v/v) 혼합물을 절단된 펩타이드에 첨가하였다. 침전된 펩타이드는 5000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 펩타이드 펠릿을 DMSO에 용해시켰다.
펩타이드의 정제는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행되었다. 이동상은 0.1%(v/v) TFA가 포함된 물(버퍼 A)과 0.1%(v/v) TFA가 포함된 아세토니트릴(ACN)(버퍼 B)로 구성되었으며, 고정상은 Zorbax C18 컬럼(3.5 μm, 4.6 mm Х 150 mm)을 사용하였다. 정제된 펩타이드를 동결건조하고 적절한 용매에 용해시켰다. 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF 질량 분석기(Bruker, 미국)를 사용하여 결정하였다.
실험예 1.2. 펩타이드의 이합체화(dimerization)
이합체 펩타이드의 제조를 위해, 동결건조된 펩타이드를 0.1 M 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate)에 용해하였다. 경우에 따라, ACN을 40%(v/v)까지 첨가하여 펩타이드의 용해도를 높였다. 제조된 펩타이드 용액을 셰이커를 이용하여 대기하에서 교반 산화시켰다. 산화 후, 이합체화된 펩타이드를 정제하고 동결건조하였다.
실험예 2. 세포 배양
HeLa 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, 16000-044, 미국) 및 항생제(Gibco, 15240-062, 미국)가 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Cytiva, SH30243.01, 미국)에서 배양하였다. 인간 세뇨관 세포(Primary cultured human tubular epithelial cell, hTEC)는 신장 세포 암종으로 진단된 환자로부터 신장 생검 샘플을 수득하여 확립된 프로토콜에 따라 분류했다. 인간을 대상으로 한 모든 실험은 서울대학교병원 임상시험심사위원회의 승인을 받았으며, 모든 환자는 등록 전에 사전 동의를 받았다. 세포는 37℃의 5% CO2 및 가습 인큐베이터에서 배양하였다.
실험예 3. 유세포분석(flow cytometry)
1 Х 105 개의 HeLa 세포 또는 5 Х 104 개의 hTEC 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 경과 후, 펩타이드를 세포에 첨가하고 3시간 동안 추가 배양하였다. 배양한 세포를 수확하고 PBS로 세척한 다음, PBS에 현탁하여 형광표지세포분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS; BD Accuri, 미국) 분석을 수행하였다. 펩타이드 미처리 세포의 최대 형광 강도를 초과하는 세포는 형광 양성 세포로 분류하였다. EC50(Half maximal effective concentration) 값은 형광으로 표지된 해당 펩타이드 이합체가 배양된 세포의 절반에 들어가는 이합체 펩타이드의 농도로 정의하였다.
실험예 4. 미토콘드리아 분획화(fractionation)
미토콘드리아 분리(isolation) 방법을 사용하여 펩타이드의 세포내 분포를 검출하였다. TAMRA로 표지된 펩타이드를 EC50 농도로 6 Х 106 개의 HeLa 세포 또는 2 Х 106 개의 hTEC 세포에 첨가하고, 이 세포를 3시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하여 차가운 PBS로 세척한 다음, 차가운 IB(30 mM Tris-HCl, pH 7.4; 225 mM 만니톨; 75 mM 수크로스; 및 0.1 mM EGTA)에 현탁하였다. 미리 냉각된 다운스 균질화기(Dounce homogenizer)를 사용하여 세포의 80 ~ 90%가 파괴될 때까지 균질화를 수행하였다. 용해된 세포는 광학 현미경으로 모니터링하였다. 파쇄액(homogenate)을 e-튜브로 옮기고 4℃, 600 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 수집하고 다시 한번 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 4℃, 7000g에서 10분간 원심분리하였다. 여기서 얻은 상층액(세포질 분획)은 새로운 e-튜브에 옮겨 담고, 펠릿(미토콘드리아 분획)은 동일한 부피의 차가운 IB에 재현탁하였다. 각 분획의 형광 강도는 마이크로플레이트 리더(TECAN, 스위스; 여기(Ex)/방출(Em) = 510/570 nm)로 측정하였다.
실험예 5. 공초점 현미경 및 초고해상도 현미경 관찰
현미경 관찰을 위해, HeLa 세포 또는 hTEC 세포는 유리바닥접시(glass-bottom dish)에서 성장시켰다(SPL, 200350, 대한민국). 이어서, 세포를 펩타이드로 3시간 동안 처리하고 마이토트래커(MitoTracker™; Thermo Fisher Scientific, M7514, 미국; 20 μM, 20분), 노닐 아크리딘 오렌지(nonyl acridine orange, NAO; Thermo Fisher Scientific, A1372; 100 nM, 1시간), hoechst 33342(1 μg/mL, 20분), 셀라이트 초기 엔도솜-GFP(CellLight™ early endosomes-GFP; Thermo fisher Scientific, C10586; 2 μL/10,000개 세포, 16시간) 및/또는 라이소트래커(LysoTracker™, Thermo Fisher Scientific, L7525; 50 nM, 30분)로 염색하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 헹구고 HBSS를 첨가하였다. 염색된 세포의 이미지는 현미경(Zeiss LSM 880 및 ELYRA PS.1)을 사용하여 얻었다. 초고해상도 이미지를 생성하기 위해, ZEN 블랙 소프트웨어로 구조적 조명(structured illumination) 프로세스를 수행하였다. 피어슨 r 값은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
실험예 6. 세포의 ROS 수준 분석
세포내 ROS 수준은 두 가지 방법을 사용하여 측정하였다.
첫 번째 방법은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 유리바닥접시 상에 배양된 세포를 EC50 농도의 TAMRA 표지된 펩타이드로 3시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 세포를 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescin diacetate, H2DCFDA; Sigma, 287810, 미국; 25 μM, 30분)로 염색하고 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 HBSS에서 500 μM H2O2로 10분 동안 처리하였다. 세포의 DCF 신호는 공초점 현미경으로 검출하였고 이미지를 촬영하였다. ZEN 블루 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 녹색 신호 강도를 계산하였다.
두 번째 방법은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 2 Х 104 개의 HeLa 세포 또는 7 Х 103 개의 hTEC 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 세포를 펩타이드와 함께 3시간 동안 배양한 다음 H2DCFDA 염색(25 μM, 30분)을 수행하였다. PBS로 2회 세척한 후, HBSS 중의 세포를 ROS 수준 분석에 사용하였다. 각 웰의 DCF 신호는 37℃에서 마이크로플레이트 리더(TECAN)를 사용하여 수득하였다(Ex/Em = 485/535 nm).
실험예 7. 미토콘드리아 ROS 및 막 전위 측정
2 Х 104 개의 HeLa 세포 1 Х 104 개의 hTEC 세포를 실험 24시간 전 96-웰 플레이트에 접종하였다. 그런 다음, 세포를 마이토삭스(MitoSOX™; Thermo Fisher Scientific, M36008; 5 μM, 10분) 또는 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE; Sigma, 87917; 600 nM, 15분)로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 세포에 HBSS를 첨가하였다. 세포의 형광 신호는 37℃에서 마이크로플레이트 리더(TECAN)로 측정하였다(마이토삭스, Ex/Em = 510/580 nm; TMRE, Ex/Em = 525/575 nm).
실험예 8. ATP 수준 측정
세포 ATP의 수준은 ATP 검출 키트(Abcam, ab113849, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 평가하였다. 형광 발광은 마이크로플레이트 리더(Promega, Glomax 96 microplate luminometer, 미국)로 측정하였다.
실험예 9. 투과전자현미경법(Transmission electron microscopy)
1.8 Х 107 개의 HeLa 세포를 변형된 카르노프스키 고정액[modified Karnovsky fixative; 0.05 M 카코딜산나트륨(sodium cacodylate) 버퍼에 용해된 2% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드]으로 4℃에서 3시간 동안 고정하였다. 샘플을 0.05 M 카코딜산나트륨 버퍼(pH 7.2)로 4℃에서 10분간 3회 세척한 후, 다시 0.05 M 카코딜산나트륨 버퍼(pH 7.2)에 용해된 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 4℃에서 2시간 동안 후고정시켰다. 그 다음, 샘플을 증류수로 짧게 2회 세척하였다. 이어서, 표본을 4℃에서 0.5% 아세트산우라닐(uranyl acetate)로 밤새 일괄 염색하였다. 염색된 샘플은 에탄올 농도를 증가시키면서 탈수한 다음(30%, 50%, 70%, 80% 및 90% 에탄올에서 각각 1회 및 100% 에탄올에서 3회, 각 회당 10분씩), 15분 동안 100% 프로필렌옥사이드(propylene oxide)를 2회 처리하는 전환(transition) 단계를 수행하였다. 샘플을 일련의 프로필렌옥사이드와 스퍼 수지(Spurr's resin; 1:1 비율로 1.5시간, 1:2 비율로 1.5시간, 스퍼 수지만 단독으로 밤새 처리 후 다시 한번 4시간 동안 처리)로 침윤시키고 스퍼 수지에 포매하여 밤새 70℃에서 중합시켰다. 완전히 중합된 샘플은 울트라마이크로톰(ultramicrotome; MT-X, RMC, 미국)을 사용하여 절편화하였다. 수득한 절편은 2% 아세트산우라닐 및 레이놀즈 시트르산납(Reynolds' lead citrate)으로 각각 7분 동안 염색하였다. 샘플의 관찰 및 이미징은 JEM-ARM200F TEM을 사용하여 수행하였다.
실험예 10. 플라스미드의 구축 및 형질도입
야생형 Drp1 cDNA(아주대학교 의과대학 정선용 박사 제공)를 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭하여 pcDNA3.1-플라스미드의 eGFP 유전자 N-말단에 삽입하였다. 플라스미드의 형질도입은 리포펙타민™ 3000(Thermo Fisher Scientific, L3000001)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다.
실험예 11. 웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯팅을 위해, 세포를 수확하여 라이시스 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% IGEPAL CA-630; 0.25% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate); 0.1% SDS; 및 프로테아제 억제제(Gendepot, P3100-001, 미국))에 현탁시켰다. 음파처리(sonification)에 의해 세포를 파괴하고 20 내지 40 μg의 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)하여 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막으로 트랜스퍼하였다. 이어서, 5% 무지방 우유로 블로킹한 후 1차 항체 및 2차 항체를 순차적으로 처리하였다. 항체는 각각 항-COX4(Abclonal, A6564), 항-α-튜불린(Abclonal, AC012), 항-글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH; Genetex, GTX100118), 항-Drp1(BD biosciences, 611112), NGAL(Santa Cruz sc-515876) 및 Pp65(Santa Cruz sc-136548) 항체를 사용하였다. 밴드는 최적의 노출 조건에서 ImageQuant Las 4000 mini(Amersham PLC, Amersham, UK)를 사용하여 시각화하였으며, ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다.
실험예 12. 카디오리핀 결합 분석
NBD로 표지된 펩타이드 또는 C6-NBD(6-(7-Nitrobenzofurazan-4-ylamino)hexanoic acid)와 리포솜의 상호작용을 검출하기 위해 NBD의 형광 강도의 변화를 측정하였다.
결합 실험을 위해, PBS에 용해한 1 μM의 NBD 표지 펩타이드를 검은색 96-웰 플레이트에 준비하였다. 원하는 농도가 달성될 때까지 리포솜(POPC:POPE = 2:1 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀을 함유)을 펩타이드에 첨가하였다. NBD-펩타이드와 리포솜의 혼합물을 피펫팅에 의해 잘 섞어준 후 샘플의 형광 방출을 모니터링하였다(λex = 467 nm, λem = 536 nm).
카디오리핀 비율에 따른 결합 실험을 위해, PBS에 용해한 1 μM의 NBD 표지 펩타이드 또는 C6-NBD를 검은색 96-웰 플레이트에 준비하였다. 원하는 농도(5 μM)가 달성될 때까지 리포솜(POPC:POPE = 2:1, 0 ~ 20% 카디오리핀 함유)을 펩타이드에 첨가하였다. 이 혼합물을 피펫팅에 의해 잘 섞어준 후 샘플의 형광 방출을 모니터링하였다(λex = 467 nm, λem = 536 nm).
해리 실험에서는 PBS에 용해한 1 μM의 NBD 표지 펩타이드를 검은색 96-웰 플레이트에 준비하였다. 원하는 농도(100 μM)가 달성될 때까지 리포솜(POPC:POPE = 2:1 또는 POPC:POPE = 2:1, 10% 카디오리핀을 함유)을 펩타이드에 첨가하였다. NBD-펩타이드와 리포솜의 혼합물을 피펫팅에 의해 잘 섞어준 후 혼합물의 형광 강도를 측정하였다(λex = 467 nm, λem = 536 nm). 이어서, 표지되지 않은 펩타이드(아세틸화 펩타이드)를 혼합물에 첨가하고 피펫팅으로 잘 섞어주었다. 암실에서 10분 동안 배양한 후 형광 강도의 변화를 모니터링하였다. 아세틸화 펩타이드의 농도가 40 μM에 도달할 때까지 펩타이드의 첨가 및 형광 측정을 반복하였다.
실험예 13. 동물 실험
IRI 동물 모델 실험은 사전에 오리엔트바이오 동물실험윤리위원회의 심의 및 승인 하에 전미연구평의회(U.S.)의 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침에 따라 수행되었다. CIN 동물 모델은 서울대학교병원 임상연구소 동물관리 및 이용위원회의 승인을 받아 국립연구회 실험동물 관리 및 이용 지침(승인번호:210243S1A0)에 따라 수행되었다.
실험예 14. 면역조직화학(Immunohistochemistry) 및 면역세포화학(Immunocytochemistry)
신장 절편을 10% 포르말린으로 고정하고 밤 동안 파라핀에 포매하였다. 먼저, 4 μm 너비의 신장 영역을 자일렌(xylene)으로 탈파라핀화하고 단계적 알코올(graded alcohol)을 통해 탈수하였다. 항원성 회복(antigen retrieval)은 0.1 M 시트르산나트륨(sodium citrate)을 사용하여 40분 동안 마이크로웨이브를 처리하였다. 다음으로, 파라핀 포매 조직의 내인성 과산화효소를 메탄올에 용해된 3% H2O2를 이용하여 비활성화되도록 하였다. 그리고 절편을 PBS로 세척한 다음 PBS에 용해된 10% NGS(normal goat serum), 5% BSA(bovine serum albumin) 및 0.3% 트리톤 X-100으로 1시간 동안 블로킹하였다. 그 후, 슬라이드를 항체 희석제(ZUC025, ZYTOMED, 독일)로 희석한 시토크롬 C(MA5-11674, Invitrogen, 미국), 8-OHdG(ab48508, Abcam, 영국), P-21(sc-6246, Santa Cruz, 미국), NGAL(SC-515876, 미국), F4/80(70076S, Cell Signaling Technology, 미국) 및 SOD-1(OABB00304, Aviva Systems Biology, 미국)로 염색하였다. 마지막으로, 슬라이드를 PBS로 세척하고 HRP로 표지된 폴리머 접합 항-마우스 또는 항-레빗 2차 항체(DAKO EnVision™+ System, K4001 또는 K4003, 덴마크)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포핵의 대조염색에는 마이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin; S3309, DAKO)을 사용하였다. 신장 섬유증과 세뇨관 괴사는 마손 삼색 염색법(Masson's trichrome staining)에 의해 평가하였다. 또한, 조직학적 손상 점수 계산 및 이미지 분석은 면역세포화학법으로 진행하였다. 세포질 추출과 메탄올 고정을 제외하고 상술한 방법에 따라 면역세포화학을 수행하였다. 면역형광을 위해 pp16(SAB4504720, Millipore Sigma, 미국) 및 pp21(sc-377569, Santa Cruz, 미국) 1차 항체를 사용하였다. 염색된 슬라이드의 이미지는 라이카 도립현미경(Leica, 독일)으로 캡처하였고, 양성 영역(%)의 정량은 LAS-4000 프로그램(Leica)를 사용하였다.
실험예 15. 세포사멸 및 괴사 분석
세포사멸 및 괴사 분석을 위해, 1 Х 105 개의 hTEC 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다. 1시간 후, hTEC 세포를 H2O2(0.5 mM)에 노출시켜 세포 손상을 유도한 후, CMP3013을 세포에 첨가하였다. 아넥신-프로피듐 요오드화물(Annexin-propidium iodide, PI) 실험을 통해 다음과 같이 항세포사멸(anti-apoptosis)을 분석하였다. 아넥신 V/PI 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC) 세포사멸 키트(BD Biosciences)를 사용하여 세포사멸 및 괴사 비율을 시각화하고 측정하였다. hTEC를 100 μL의 결합 완충액에 재현탁시키고, 4.5 μL의 FITC-결합 아넥신 V(10 mg/mL) 및 3.5 μL의 PI(50 mg/mL)를 첨가하였다. 세포를 암실의 실온에서 15분 동안 배양하였다. BD FACSDiva 소프트웨어(버전 8.0; BD Biosciences)를 사용하여 측정값을 수집하였다.
실험예 16. 실시간 세포 대사 분석(Seahorse assay)
실시간 세포 대사 분석을 위하여, hTEC 세포는 씨홀스(Seahorse) XF96 세포 배양 마이크로플레이트에서 37℃ 조건으로 배양하였다. 배양 24시간 후, 씨홀스 XFe 96 세포외 플럭스 분석기(Agilent, CA)를 사용하여 OCR 및 ECAR을 측정하였다. 최대 호흡률을 측정하기 위해 2 μM 올리고마이신, 1 μM 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시) 페닐 히드라존(carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenyl hydrazone), 0.5 μM 로테논 + 항마이신 A를 순차적으로 주입한 후 OCR을 측정하였다. 이어서, 10 mM 글루코스, 1 μM 올리고마이신 및 50 mM 2-DG를 순차적으로 주입한 후 ECAR을 측정하였다. PER은 Wave Pro 소프트웨어와 Wave Desktop 소프트웨어(Agilent, CA)를 사용하여 측정 및 계산하였다.
실험예 17. 정량적 PCR 분석
TRIzol 시약을 사용하여 마우스 신장에서 RNA를 추출하였다. AMV Reverse Transcriptase(Promega) 및 C1000 터치 열 순환기를 사용하여 RNA를 역전사하였다. SYBR green은 7500rpm 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 PCR 산물을 정량화하였다. Thermocycler 조건은 프라이머에 대한 QC 데이터시트를 기반으로 설정하였다. PCR에 사용된 프라이머는 마우스 특이적 IL-10 (정방향 프라이머: GTCAGTCATTCTCGTCCGTCGTA(서열번호 20); 역방향 프라이머: CGTCCTAAATTCCCAATGAACCC(서열번호 21)), SOD-1 (정방향 프라이머: CTCAGGAGAGCATTCCATCATT(서열번호 22); 역방향 프라이머: CTCCCAGCATTTCCAGTCTT(서열번호 23)), GAPDH (정방향 프라이머: TATGTCGTGGAGTCTACTGGT(서열번호 24); 역방향 프라이머: GAGTTGTCATATTTCTCGT(서열번호 25)), ATP6a1(정방향 프라이머: CTGTTATCCTCGGCATCATCCAC(서열번호 26); 역방향 프라이머: CAGGTAGCCAAACAACGAGGAC(서열번호 27)), IL1β(정방향 프라이머: TCGCTCAGGGTCACAAGAAA(서열번호 28); 역방향 프라이머: CATCAGAGGCAAGGAGGAAAAC(서열번호 29)), IL-18(정방향 프라이머: ACTGTACAACCGCAGTAATACGG(서열번호 30); 역방향 프라이머: GAGTGAACATTACAGATTTATCCC(서열번호 31)), p16(정방향 프라이머: GAGGATACCCTGATGGAGTATTTG(서열번호 32); 역방향 프라이머: GCTATTAGGTCTGCCCTTTCTC(서열번호 33)), p21(정방향 프라이머: GCAGACCAGCCTGACAGATTTC(서열번호 34); 역방향 프라이머: TTCAGGGTTTTCTCTTGCAGAAG(서열번호 35)), 및 NQO-1(정방향 프라이머: GCCGAACACAAGAAGCTGGAAG(서열번호 36); 역방향 프라이머: GGCAAATCCTGCTACGAGCACT(서열번호 37))를 사용하였다. 모든 프라이머는 5' 말단 방향에서 3' 말단 방향으로 나타내었다. 상대적인 mRNA 발현은 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 발현을 정규화한 후 비교 Ct 방법을 사용하여 결정하였다.
실험예 18. 통계 분석
모든 unpaired Student's t-test는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 데이터는 평균을 나타내고 에러바는 표준 편차를 나타낸다. 통계적 유의성은 0.05 미만의 p 값(ns, p ＞ 0.05; *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001)으로 평가되었다.

Claims (21)

  1. 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 유효성분으로 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    <식 1>
    X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10
    상기 식 1에서,
    X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고,
    X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고,
    X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고,
    X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신장 질환은 급성 신손상(acute kidney injury), 만성 콩팥병(chronic kidney disease), 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 사구체신염(glomerulitis), 간질성신염(interstitial nephritis) 및 허혈-재관류 신손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는
    약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 신장 질환의 예방 또는 치료를 위한 다른 유효 성분과 병용 투여되는 것인
    약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 다른 유효 성분은 에날라프릴(enalapril), 포시노프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 페린도프릴(perindopril), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan), 올메사르탄(olmesartan), 텔미사르탄(telmisartan) 및 다파글리플로진(dapagliflozin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인
    약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 신독성을 유발하는 1종 이상의 약물과 병용 투여되는 것인
    약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약물은 항생제, 항암제, 항진균제, 항바이러스제 및 면역억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인
    약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 신독성을 유발하는 1종 이상의 약물은 콜리스틴(colistin), 독시사이클린(doxycycline), 겐타마이신(gentamicin), 반코마이신(vancomycin), 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 나이트로소우레아(nitrosourea), 암포테리신 B(amphotericin B), 잘시타빈(zalcitabine), 디다노신(didanosine), 스타부딘(stavudine), 지도부딘(zidovudine), 아리스토로크산(aristolochic acid) 및 카르복시-아트락틸로시드(carboxy-atractyloside)로 이루어진 군에서 선택되는
    약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 신장질환이 유발되기 전 또는 후에 투여되는 것인
    약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 이소루신(I), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 발린(V), 노르발린(norV), 트립토판(W), 펜틸글리신(pg), 네오펜틸글리신(Npg), 알라닌(A) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)인
    약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 루신(L), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 또는 사이클로헥실알라닌(Cha)인
    약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 X1, X4, X5 및 X8 중 하나 이상은 각각 독립적으로 사이클로헥실알라닌(Cha)인
    약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR), 히스티딘(H), 오르니틴(O), 디아미노부탄산(Dab) 또는 디아미노프로판산(Dap)인
    약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 아르지닌(R), 라이신(K), 호모아르지닌(hR), 노르아르지닌(norR) 또는 히스티딘(H)인
    약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy), 페니실아민(Pen), 셀레노시스테인(U) 또는 루신(L)이며, 단 X2 및 X9가 동시에 루신(L)은 아닌
    약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)인
    약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이합체는 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드가 서로 역평행(anti-parallel) 방향으로 연결된 것인
    약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 X2 및 X9는 각각 독립적으로 시스테인(C), 호모시스테인(Hcy) 또는 페니실아민(Pen)이고, 연결은 이황화 결합에 의한 것인
    약학 조성물.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식 1로 표시되는 단위체가 서열번호 1 내지 서열번호 19중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인
    약학 조성물.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩타이드를 나노 몰 농도로 포함하는
    약학 조성물.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 또는 이의 이합체는 미토콘드리아 막의 카디오리핀(cardiolipin)과 상호작용하는 것인
    약학 조성물.
  21. 하기 식 1로 표시되는 단위체를 포함하는 펩타이드 또는 이의 이합체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신장 질환 또는 간 질환의 예방 또는 치료 방법:
    <식 1>
    X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10
    X1, X4, X5 및 X8은 각각 독립적으로 소수성 아미노산이고,
    X3, X6, X7 및 X10은 각각 독립적으로 친수성 아미노산이고,
    X2 및 X9는 각각 독립적으로 각 단위체가 X2 및 X9 중 적어도 하나의 위치에서 서로 연결되어 이합체 펩타이드를 형성할 수 있도록 결합을 형성하는 아미노산이고,
    X1은 N-말단이고 X10은 C-말단이다.
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