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WO2021201654A1 - Glp-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Glp-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2021201654A1
WO2021201654A1 PCT/KR2021/004162 KR2021004162W WO2021201654A1 WO 2021201654 A1 WO2021201654 A1 WO 2021201654A1 KR 2021004162 W KR2021004162 W KR 2021004162W WO 2021201654 A1 WO2021201654 A1 WO 2021201654A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glp
derivative
pharmaceutical composition
chemotherapy
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/004162
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이진봉
최재혁
박은진
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CA3173353A priority patent/CA3173353A1/en
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Priority to IL296669A priority patent/IL296669A/en
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Priority to AU2021248766A priority patent/AU2021248766A1/en
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to the prophylactic or therapeutic use of GLP-2 derivatives and long-acting conjugates thereof for mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof.
  • Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) is a peptide hormone composed of 33 amino acids produced by L-cells in the small intestine in response to ingested nutrients. GLP-2 induces mucosal growth in the small and large intestine, promotes growth of intestinal cells and crypt cells, and inhibits apoptosis. GLP-2 also increases the absorption of nutrients in the small intestine and decreases intestinal permeability. In addition, GLP-2 inhibits gastric emptying and gastric acid secretion, increases intestinal blood flow rate, and relaxes intestinal smooth muscle.
  • GLP-2 has shown promising potential as a therapeutic agent in experimental models of various intestinal diseases and intestinal damage due to its features such as energy absorption and protection and activation of intestinal cell functions.
  • GLP-2 As a hormone that regulates nutrient absorption, GLP-2 has potential as a treatment for short bowel syndrome (SBS).
  • SBS short bowel syndrome
  • SBS is caused by congenital or acquired causes such as bowel resection surgery and causes nutritional deficiencies due to a decrease in the absorption area of the small intestine. It was confirmed that GLP-2 enhances nutrient absorption and digestive tract absorption in a rodent experimental model with SBS (Ljungmann K et al., Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 2001, 281(3):G779-85). ).
  • the mucous membrane which is an organ with rapid cell growth, is also damaged, resulting in side effects such as mucositis. Accordingly, there is a need to develop a drug capable of preventing or treating mucositis induced by radiation therapy and/or chemotherapy.
  • One object of the present invention is mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof, including a glucagon-like peptide-2 (GLP-2) derivative and/or a long-acting conjugate thereof.
  • GLP-2 glucagon-like peptide-2
  • Another object of the present invention is a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or a composition comprising the same to a subject in need thereof, which is induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof.
  • Another object of the present invention is the use of a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or a composition comprising the same in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof is to provide
  • One embodiment embodying the present invention is induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof, including a glucagon-like peptide-2 (GLP-2) derivative and/or a long-acting conjugate thereof. It is a composition for the prevention, treatment, or improvement of mucositis.
  • GLP-2 glucagon-like peptide-2
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, comprising a GLP-2 derivative and/or a long-acting conjugate thereof. do.
  • the present invention is a food composition for preventing or improving mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, comprising a GLP-2 derivative and/or a long-acting conjugate thereof. do.
  • the present invention includes a pharmaceutically acceptable excipient; and a GLP-2 derivative in a pharmaceutically effective amount, wherein the GLP-2 derivative contains an amino acid sequence represented by the following general formula 1, for preventing or treating mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof It is characterized in that it is a pharmaceutical composition for:
  • X 1 is histidine, imidazoacetyldeshistidine, desaminohistidine, ⁇ -hydroxyimidazopropionyldeshistidine, N -dimethylhistidine, or ⁇ -carboxyimidazopropionyldeshistidine;
  • X 2 is alanine, glycine, or Aib (2-aminoisobutyric acid);
  • X 30 is lysine or arginine
  • X 34 is one or more optional amino acids or one or more optional amino acids to which a modification has occurred;
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the GLP-2 derivative comprises an amino acid sequence represented by the following general formula 2:
  • X 1 is histidine, imidazoacetyldeshistidine, desaminohistidine, ⁇ -hydroxyimidazopropionyldeshistidine, N -dimethylhistidine, or ⁇ -carboxyimidazopropionyldeshistidine;
  • X 2 is alanine, glycine, or Aib (2-aminoisobutyric acid);
  • X 30 is lysine or arginine
  • X 34 is absent or is lysine, arginine, glutamine, histidine, 6-azidolysine, or cysteine;
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the GLP-2 derivative comprises
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is lysine
  • X 34 is cysteine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is lysine
  • X 34 is lysine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is arginine
  • X 34 is lysine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is lysine
  • X 34 is 6-azidolysine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is arginine
  • X 34 is cysteine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is Aib
  • X 30 is lysine
  • X 34 is cysteine
  • X 1 is histidine
  • X 2 is Aib
  • X 30 is lysine
  • X 34 is cysteine.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the GLP-2 derivative comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 8.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the chemotherapy is chemotherapy using an anticancer agent wherein the chemotherapy is chemotherapy using an anticancer agent.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the anticancer agent is a cytotoxic anticancer agent, a targeted anticancer agent, an immune anticancer agent, or a combination thereof.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the cytotoxic anticancer agent is a nucleoside analog, folate antagonist, antimetabolite, topoisomerase I inhibitor, anthracycline, podophyllotoxin , a taxane, a vinca alkaloid, an alkylating agent, a platinum compound, or a combination thereof.
  • the cytotoxic anticancer agent is a nucleoside analog, folate antagonist, antimetabolite, topoisomerase I inhibitor, anthracycline, podophyllotoxin , a taxane, a vinca alkaloid, an alkylating agent, a platinum compound, or a combination thereof.
  • the anticancer agent is 5-fluorouracil (5-FU), cyclophosphamide (CPA), docetaxel (Docetaxel), doxorubicin (Doxorubicin), bean Vincristine, Prednisone, Etoposide, Ifosfamide, Methotrexate, Paclitaxel, Gemcitabine, Glemcitabine, Vinorelbine, Leucovorelbine Leucovorin), irinotecan (Irinotecan), oxaliplatin (Oxaliplatin), or a combination thereof is characterized.
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • CPA cyclophosphamide
  • Docetaxel docetaxel
  • doxorubicin Doxorubicin
  • bean Vincristine Prednisone
  • Etoposide Ifosfamide
  • Methotrexate Paclitaxel
  • Gemcitabine Glemcitabine
  • Vinorelbine Leucovorelbine
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the composition is administered within 1 day prior to radiotherapy or chemotherapy; Or it is characterized in that it is administered within 1 day after radiotherapy or chemotherapy.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the composition suppresses one or more of an increase in the weight of the small intestine, a decrease in the level of decrease in the weight of the small intestine, inhibition of inflammation, inhibition of differentiation of monocytes into macrophages, and inhibition of migration of monocytes in the administered subject. characterized by causing
  • X is a GLP-2 derivative
  • L is a linker containing an ethylene glycol repeating unit
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other;
  • F is an immunoglobulin Fc region
  • the "-" is a covalent bond.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the immunoglobulin Fc region is non-glycosylated.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region.
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein L is polyethylene glycol.
  • Another aspect of the present invention is a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or a composition comprising the same to an individual in need thereof.
  • Another aspect of the present invention is the use of a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, or a composition comprising the same for the prevention, improvement or treatment of mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof, wherein the GLP- 2 is a use, wherein the derivative contains the amino acid sequence represented by the general formula 1 (with the exception of the sequence identical to SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of the general formula 1).
  • Another aspect of the present invention is the use of a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, or a pharmaceutical composition comprising the same in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof , wherein the GLP-2 derivative contains the amino acid sequence represented by Formula 1 (however, the amino acid sequence of Formula 1 excludes the same sequence as SEQ ID NO: 1).
  • the GLP-2 derivative of the present invention can be applied to the prevention, treatment and improvement of mucositis induced by radiotherapy and/or chemotherapy.
  • Figure 2 is a GLP-2 derivative (Teduglutide, Teduglutide) and a long-acting conjugate of GLP-2 derivatives concurrently administered with chemotherapy induction in a model rat induced by chemotherapy (TC) (A); and the results of comparative analysis of changes in the weight of the small intestine after administration of the GLP-2 derivative long-acting conjugate (B) one day before chemotherapy induction.
  • TC model rat induced by chemotherapy
  • 3 is a result confirming the effect of the long-acting conjugate of a GLP-2 derivative on M1 polarization inhibition (A), macrophage differentiation inhibition (B) and monocyte migration inhibition (C) in THP-1 cells (Monocytes).
  • One aspect for implementing the present invention is prevention, treatment of mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, including a glucagon-like peptide-2 (GLP-2) derivative , or a composition for improvement.
  • the composition may be a pharmaceutical composition for preventing or treating mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof.
  • a pharmaceutically acceptable excipient As a specific example of the present invention, a pharmaceutically acceptable excipient; and a pharmaceutical composition for preventing or treating mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, including a GLP-2 derivative in a pharmaceutically effective amount, but is not limited thereto.
  • the term “mucositis” refers to inflammation and/or ulceration of the mucous membrane of the oral cavity and/or summoning duct, and is caused by "radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof.
  • the term “mucositis” refers to mucositis that occurs as a side effect as a result of radiotherapy or chemotherapy alone or as a result of radiotherapy and chemotherapy in combination in any order and number of times, specifically, oral mucositis, gastrointestinal mucositis, or their It may be a combination, but is not limited thereto.
  • the gastrointestinal mucositis may be an intestinal inflammatory disease and/or an intestinal ulcer disease, but is not limited thereto.
  • Gastrointestinal mucositis can include diarrhea, anal ulcers, rectal ulcers, rectal bleeding, abdominal pain, dysphagia, vomiting, bloating, or villi length and swelling of the small intestine ( As the depth of the crypt) decreases, symptoms such as nutrient deficiency or weight loss may occur due to decreased nutrient absorption.
  • the radiation therapy refers to the prevention or treatment of diseases using radiation, and all radiation therapy that induces mucositis alone or in combination with chemotherapy is included herein.
  • the chemotherapy refers to the prevention or treatment of diseases using chemical drugs, and all chemotherapy inducing mucositis, either alone or in combination with radiation therapy, are included herein.
  • the radiotherapy and chemotherapy may be for the prevention or treatment of cancer
  • the cancer is lung cancer (eg, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma), mesothelioma, pancreatic cancer (eg, pancreatic duct cancer).
  • pancreatic endocrine tumor pharyngeal cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, gastric cancer (eg papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma), duodenal cancer, small intestine cancer, colorectal cancer (eg colon cancer, rectal cancer, anal cancer, familial) Colorectal cancer, hereditary nasal polyposis colorectal cancer, gastrointestinal stromal tumor), breast cancer (eg invasive ductal cancer, non-invasive ductal cancer, inflammatory breast cancer), ovarian cancer (eg epithelial ovarian carcinoma, extratesticular germ cell tumor, ovarian embryo) Cell tumors, ovarian low-grade tumors), testicular tumors, prostate cancer (eg hormone-dependent prostate cancer, hormone-independent prostate cancer), liver cancer (eg hepatocellular carcinoma, primary liver cancer, extrahepatic bile duct cancer), thyroid cancer
  • renal cell carcinoma transitional epithelial carcinoma of the renal pelvis and ureter
  • uterine cancer e.g. cervical cancer, body cancer, uterine sarcoma
  • brain tumor e.g. medulloblastoma, glioma, pineal cell tumor
  • cytostatic astrocytoma diffuse astrocytoma, degenerative astrocytoma, pituitary adenoma
  • retinoblastoma skin cancer (eg basal cell carcinoma, malignant melanoma), sarcoma (eg rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, soft tissue sarcoma)
  • malignant bone tumor eg, bladder cancer, hematologic cancer (eg, multiple myeloma, leukemia, malignant lymphoma, Hodgkin's disease, chronic myeloproliferative disease), primary unknown cancer, and the like.
  • hematologic cancer eg, multiple mye
  • Chemotherapy for the prevention or treatment of cancer may be chemotherapy using an anticancer agent, and mucositis may be induced as a side effect thereof.
  • the "use of an anticancer agent” includes using an anticancer agent alone or in combination, and administering other substances (eg, drugs other than anticancer agents, anticancer drug side effects suppressing drugs, etc.) together, sequentially, or in reverse order with the anticancer agent to treat mucositis It also includes triggering.
  • the anticancer agent capable of inducing mucositis may be a cytotoxic anticancer agent, a targeted anticancer agent, an immune anticancer agent, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the cytotoxic anticancer agent is a drug that attacks rapidly differentiated cells, specifically, nucleoside analogs [Azacitidine, Capecitabine, Carmofur, Claridin, Clofarabine, Cytarabine, Decitabine, Floxuridine, Fludarabine, Fluorouracil, Gemcitabine, Mercaptofugin (Mercaptopurine, Nelarabine, Pentostatin, Tegafur, Tioguanine, etc.], Antifolate (Methotrexate, Pemetrexed, Ralti) Trexed (Raltitrexed, etc.), antimetabolites (Hydroxycarbamide, etc.), Topoisomerase I inhibitors (Irinotecan, Topotecan, etc.), anthracyclines [ Daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, etc.], podophyllotoxin (etoposide, teniposide, etc.), taxanes [ Caba
  • a targeted anticancer agent is a drug that selectively attacks cancer cells with a specific part by targeting a specific part of the cancer cell that is different from other cells (eg, normal cells), specifically, monoclonal antibody [eg : Alemtuzumab, Bevacizumab, Cetuximab, Denosumab, Gemtuzumab ozogamicin, Ibritumomab tiuxetan, Ipilimumab, Nivolumab, Ofatumumab, Panitumumab, Pembrolizumab, Pertuzumab, Rituximab, Tositumab ( Tositumomab, Trastuzumab, etc.], tyrosine kinase inhibitors such as Afatinib, Aflibercept, Axitinib (Axitinib), Bosutinib, Crizotinib ), Erlotinib, Gefitini
  • retinoids [Alitretinoin, Bexarotene, Isotretinoin, Tamibarotene, Tretinoin, etc.], Immunomodulators [Lenalidomide, Pomalidomide] (Pomalidomide, Thalidomide, etc.], histone deaeration Cetylase inhibitors (such as Panobinostat, Romidepsin, Valproate, Vorinostat), or other drugs (Anagrelide, arsenic trioxide ( Arsenic trioxide), asparaginase, BCG vaccine, Denileukin diftitox, Vemurafenib, etc.], but is not limited thereto.
  • immunotherapy is a drug that attacks cancer cells by using the body's immune system, specifically, it may be a drug that prevents cancer cells from evading the body's immune system or makes immune cells better recognize and attack cancer cells.
  • immune checkpoint inhibitors [Atezolizumab, Ipilimumab, Avelumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Durvalumab, etc. ]
  • immune cell enhancement agents blindatumomab, etc.] or other drugs [Alemtuzumab, Ofatumumab, Elotuzumab, etc.], but is not limited thereto. .
  • one drug may be a target anticancer agent and an immune anticancer agent.
  • the anticancer agent that can cause mucositis is 5-fluorouracil (5-FU), cyclophosphamide (CPA), docetaxel (Docetaxel), doxorubicin (Doxorubicin), Vincristine, Prednisone, Etoposide, Ifosfamide, Methotrexate, Paclitaxel, Gemcitabine, Glemcitabine, Vinorelbine, Leucovorelbine (Leucovorin), irinotecan (Irinotecan), oxaliplatin (Oxaliplatin), or may be a combination thereof, but is not limited thereto.
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • CPA cyclophosphamide
  • Docetaxel docetaxel
  • doxorubicin Doxorubicin
  • Vincristine Prednisone
  • Etoposide Etoposide
  • Ifosfamide Methotrexate
  • Paclitaxel Gemcitabine
  • the composition of the present invention in the administered subject increases the small intestine weight, suppresses the decrease in the small intestine weight (ie, lowers the level of decrease in the small intestine weight), suppresses inflammation, suppresses the differentiation of monocytes into macrophages, and the migration of monocytes.
  • Prevention or treatment of mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof by causing one or more of inhibition is not limited thereto.
  • glucagon-like peptide-2 or "GLP-2 (Glucagon-like peptide-2) is an agonist of a glucagon-like peptide-2 receptor, which may increase the half-life of a polypeptide form or its in vivo half-life. It may be in the form of a long-acting conjugate to which a biocompatible material is bound, but is not limited thereto.
  • GLP-2 includes not only native (eg, human) GLP-2, but also derivatives thereof, and conjugates thereof.
  • the GLP-2 is an active ingredient included in the pharmaceutical composition of the present invention, and may be included in the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount.
  • GLP-2 receptor agonist refers to a substance that binds to a human glucagon-like peptide-2 receptor in vivo or isolated and produces physiological activity equivalent to or similar to that of native GLP-2.
  • a GLP-2 agonist may include native GLP-2 or a GLP-2 derivative.
  • the amino acid sequence of native GLP-2 is as follows.
  • HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (SEQ ID NO: 1)
  • the "GLP-2 derivative” has a function of preventing, treating, or ameliorating mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, and has one or more differences in amino acid sequence compared to native GLP-2. peptides with, peptides modified through modification of the native GLP-2 sequence; and/or mimics of native GLP-2 having a function of preventing, treating and/or ameliorating mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, such as native GLP-2.
  • the GLP-2 derivative of the present invention is selected from the group consisting of substitution, addition, deletion, modification, and combinations thereof to at least one amino acid in native GLP-2. Deformation may have occurred, but is not limited thereto.
  • the added amino acid may be a non-natural amino acid (eg, D-type amino acid), and it is also possible to substitute a non-natural amino acid in addition to the natural amino acid.
  • the added amino acid sequence may be derived from native GLP-2, but is not limited thereto.
  • the modification of an amino acid may be combined with substitution, addition, deletion, or a combination thereof of at least one amino acid; Or independently, it means that some groups of amino acid residues are chemically substituted (eg, alpha-methylation, alpha-hydroxylation, or azido group), removed (eg, deamination) and/or modified (eg, N-methylation) can, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative of the present invention is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more identical to native GLP-2 in amino acid sequence.
  • the GLP-2 derivative may have, but is not limited to, the N-terminal amino group may be substituted, removed, or modified.
  • a method for synthesizing a terminal amino group by substituting a hydroxyl group or a carboxyl group, imidazo-acetyl by removing the alpha carbon of the N-terminal histidine and the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon It can be prepared through a method of leaving only a functional group, a method of modifying an N-terminal amino group with two methyl groups, and the like.
  • the GLP-2 derivative is imidazoacetyl-deshistidyl-GLP-2 (imidazoacetyl-deshistidyl-GLP-2, in which the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon and the alpha carbon of the histidine residue, which is the first amino acid at the N-terminus has been removed.
  • CA-GLP-2 the N-terminal amino group of GLP-2 is removed, and desaminohistidyl GLP-2 (desaminohistidyl GLP-2, DA-GLP-2), and the N-terminal amino group of GLP-2 is a hydroxyl group.
  • Beta-hydroxyimidazopropionyldeshistidyl GLP-2 ( ⁇ -hydroxyimidazopropionyldeshistidyl GLP-2, HY-GLP-2) substituted with Histidyl GLP-2 (N-dimethylhistidyl GLP-2, DM-GLP-2), or beta-carboxyimidazopropionyldeshistidyl-GLP-2 in which the N-terminal amino group of GLP-2 is substituted with a carboxyl group ( ⁇ -carboxyimidazopropionyl-deshistidyl GLP-2, CX-GLP-2) may be a derivative, but is not limited thereto.
  • the material structure used for the preparation of the GLP-2 derivative is as follows.
  • the GLP-2 derivative may include, but is not limited to, a modification in at least one of amino acids 1, 2, 30 and 33 in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid modification in the present invention may be a modification selected from the group consisting of substitution, addition, deletion, modification, and combinations of at least one amino acid, in which case the added amino acid is a non-natural amino acid (eg, D amino acid) is also possible, and substitution of non-natural amino acids in addition to natural amino acids is also possible.
  • the added amino acid sequence may be derived from native GLP-2, but is not limited thereto.
  • the modification of an amino acid is combined with substitution, addition, deletion, or a combination thereof of at least one amino acid; Or independently, it means that some groups of amino acid residues are chemically substituted (eg, alpha-methylation, alpha-hydroxylation, azido group), removed (eg, deamination) and/or modified (eg, N-methylation) can, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative may comprise, but is not limited to, the amino acid sequence of Formula 1 below:
  • X 1 is histidine, imidazoacetyldeshistidine, desaminohistidine, ⁇ -hydroxyimidazopropionyldeshistidine, N -dimethylhistidine, or ⁇ -carboxyimidazopropionyldeshistidine;
  • X 2 is alanine, glycine, or Aib (2-aminoisobutyric acid);
  • X 30 is lysine or arginine
  • X 34 is one or more optional amino acids or one or more optional amino acids to which a modification has occurred;
  • the amino acid may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, and the modifications are as described above.
  • the GLP-2 derivative may comprise, but is not limited to, the amino acid sequence of Formula 2:
  • X 1 is histidine, imidazoacetyldeshistidine, desaminohistidine, ⁇ -hydroxyimidazopropionyldeshistidine, N-dimethylhistidine, or ⁇ -carboxyimidazopropionyldeshistidine;
  • X 2 is alanine, glycine, or Aib (2-aminoisobutyric acid);
  • X 30 is lysine or arginine
  • X 34 is absent or lysine, arginine, glutamine, histidine, 6-azidolysine, or cysteine;
  • the GLP-2 derivative of the present invention is the second amino acid of native GLP-2, alanine, with glycine or Aib (2-aminoisobutyric acid), lysine, the 30th amino acid, with arginine, or these It may have a combination of, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative is a thiol group (eg, cysteine), an amino group (eg, lysine, arginine, glutamine or histidine) at the C-terminus (eg, the 33rd amino acid), or an azide group ( For example, 6-azidolysine) may be introduced, but is not limited thereto.
  • a GLP-2 conjugate with a selectively controlled binding site can be prepared using this.
  • one end of the non-peptide linker is bound to a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or an azide group of the GLP-2 derivative, and a substance capable of increasing the half-life in vivo to the other end of the non-peptide linker (for example, an immunoglobulin Fc region) may be bound.
  • the thiol group, amino group, or azide group may be introduced by adding an amino acid to GLP-2, but is not limited thereto.
  • the thiol group is introduced by adding cysteine (C) to GLP-2; Amino groups are introduced by adding lysine (K), arginine (R), glutamine (Q) or histidine (H); The azide group may be introduced by adding 6-azidolysine ( AZ K), but is not limited thereto.
  • At least one residue may be cysteine, lysine, arginine, glutamine, histidine or 6-azidolysine, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative of the present invention includes substitution of alanine, the second amino acid of native GLP-2, with glycine, and introduction of a thiol group (eg, cysteine) at the C-terminus, more specifically N - May include imidazoacetyl deshistidine in which the alpha carbon of the histidine residue, which is the first amino acid at the terminal, and the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon are removed, for example, it may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto does not
  • the GLP-2 derivative of the present invention includes substitution of alanine, which is the second amino acid of native GLP-2, with glycine and introduction of an amino group (eg, lysine) at the C-terminus, more specifically N - May include imidazoacetyl deshistidine in which the alpha carbon of the histidine residue, which is the first amino acid at the terminal, and the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon are removed, for example, it may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto. does not
  • the GLP-2 derivative of the present invention contains alanine as the second amino acid of native GLP-2 and glycine, lysine at the 30th amino acid of native GLP-2 with arginine, and C-terminal It may include the introduction of an amino group (eg, lysine), more specifically imidazoacetyldeshistidine in which the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon and the alpha carbon of the histidine residue, which is the first N-terminal amino acid, has been removed. and, for example, may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative of the present invention includes substitution of alanine, which is the second amino acid of native GLP-2, with glycine, and introduction of an azide group (eg, 6-azidolysine) at the C-terminus, , more specifically, may include imidazoacetyl deshistidine in which the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon and the alpha carbon of the histidine residue, which is the first amino acid at the N-terminus has been removed, for example, it may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 However, it is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative of the present invention contains alanine as the second amino acid of native GLP-2 and glycine, lysine at the 30th amino acid of native GLP-2 with arginine, and C-terminal It may include introduction of a thiol group (eg, cysteine), more specifically imidazoacetyldeshistidine in which the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon and the alpha carbon of the histidine residue, which is the first N-terminal amino acid, has been removed. and, for example, may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • a thiol group eg, cysteine
  • imidazoacetyldeshistidine more specifically imidazoacetyldeshistidine in which the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon and the alpha carbon of the histidine residue, which is the first N-terminal amino acid, has been removed.
  • SEQ ID NO: 6 but is not limited
  • the GLP-2 derivative of the present invention comprises substitution of alanine, the second amino acid of native GLP-2, with 2-aminoisobutyric acid, and introduction of a thiol group (eg, cysteine) at the C-terminus,
  • a thiol group eg, cysteine
  • it may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and more specifically, may include imidazoacetyl deshistidine in which the N-terminal amino group bonded to the alpha carbon and the alpha carbon of the histidine residue, which is the first N-terminal amino acid, has been removed.
  • the GLP-2 derivatives of SEQ ID Nos: 2 to 8 are shown in Table 1 below.
  • ca H is substituted with imidazoacetyl deshistidine instead of histidine
  • Aib is 2-aminoisobutyric acid
  • AZ K is 6-azido-L-lysine (6-azido- L-lysyine).
  • the GLP-2 derivative according to the present invention may be a peptide comprising the specific sequence described above or a peptide (essentially) composed of the specific sequence described above, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative is (1) X 2 is glycine or Aib, (2) X 30 is lysine or arginine, or (3) X 2 is glycine or Aib, and X 30 may be lysine or arginine, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative is represented by Formula 1 or Formula 2
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is lysine
  • X 34 is cysteine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is lysine
  • X 34 is lysine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is arginine
  • X 34 is lysine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is lysine
  • X 34 is 6-azidolysine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is glycine
  • X 30 is arginine
  • X 34 is cysteine
  • X 1 is imidazoacetyldeshistidine
  • X 2 is Aib
  • X 30 is lysine
  • X 34 is cysteine
  • X 1 may be histidine
  • X 2 may be Aib
  • X 30 may be lysine
  • X 34 may be cysteine, but is not limited thereto.
  • modifications for the preparation of agonists, fragments, variants and derivatives of native GLP-2 include modifications using L-form or D-form amino acids, and/or non-natural amino acids; and/or modifying the native sequence by modification or post-translational modification (eg, methylation, acylation, ubiquitination, intramolecular covalent bonding, etc.).
  • the GLP-2 derivative is protected from proteolytic enzymes in vivo and its N-terminus and/or C-terminus is chemically modified or protected with an organic group, or GLP-2 It may be in a modified form by adding amino acids to the end of the derivative.
  • the N-terminus is acetylated and/or the C-terminus is amidated to remove these charges.
  • the GLP-2 derivative may have its C-terminus unmodified or amidated, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative of the present invention can be synthesized through a solid phase synthesis method, can be produced by a recombinant method, and can be produced by requesting commercially.
  • the GLP-2 derivative may be in the form of a long-acting conjugate to which a biocompatible material capable of increasing its in vivo half-life is bound, but is not limited thereto.
  • the long-acting conjugate may exhibit increased potency persistence compared to a GLP-2 derivative to which a biocompatible substance (eg, immunoglobulin Fc region) is not bound, and in the present invention, a biocompatible substance is bound to the GLP-2 derivative
  • a conjugate containing a GLP-2 derivative, which has an increased half-life due to this, is referred to as a “GLP-2 derivative long-acting conjugate” or “a long-acting conjugate of a GLP-2 derivative”.
  • the long-acting binder is used interchangeably with the binder.
  • connection between the GLP-2 derivative and the biocompatible material may be a physical or chemical bond, non-covalent or covalent bond, and specifically, a covalent bond. can, but is not limited thereto.
  • the method for linking the GLP-2 derivative and the biocompatible material (eg, immunoglobulin Fc region) in the GLP-2 derivative long-acting conjugate is not particularly limited, but the GLP-2 derivative and the biocompatible material (eg, , immunoglobulin Fc region) may be linked to each other.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2019-0037181 relating to a GLP-2 derivative long-acting conjugate is incorporated herein by reference.
  • the long-acting conjugate of the GLP-2 derivative of the present invention may have the structure of Formula 1 below, but is not limited thereto.
  • X is a GLP-2 derivative described herein;
  • L is a linker (eg, a linker containing ethylene glycol repeat units);
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other;
  • F is a biocompatible substance capable of increasing the in vivo half-life of X (eg, an immunoglobulin Fc region);
  • the "-" may be a chemical bond (eg, a covalent bond).
  • X and L, and L and F may be connected to each other by a covalent bond, and in this case, the conjugate may be a conjugate in which X, L, and F are each connected through a covalent bond in the order of Formula 1 .
  • F may be directly connected to X (ie, a is 0 in Formula 1) or connected through a linker (L).
  • F is X, that is, a substance capable of increasing the half-life of the GLP-2 derivative according to the present invention, and corresponds to one component of a moiety constituting the conjugate of the present invention.
  • the F may be bonded to each other through a covalent chemical bond or a non-covalent chemical bond with X, and F and X may be bonded to each other through L through a covalent chemical bond, a non-covalent chemical bond, or a combination thereof.
  • the F is a material capable of increasing the half-life of X is a biocompatible material, for example, a high molecular weight polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and fragments thereof, an albumin binding material, a polymer of a repeating unit of a specific amino acid sequence, an antibody, an antibody It may be selected from the group consisting of fragments, FcRn binding materials, in vivo connective tissue, nucleotides, fibronectin, transferrin, saccharides, heparin, and elastin, but is not particularly limited thereto.
  • the elastin may be human tropoelastin, a water-soluble precursor, and may be a polymer of some sequences or some repeating units, for example, all of the cases of elastin-like polypeptides, but is not particularly limited thereto. .
  • polymer polymer examples include polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide (eg, dextran), polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer , a high molecular polymer selected from the group consisting of lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotides, and combinations thereof, and the polysaccharide may include dextran, but is not particularly limited thereto.
  • PEG polyethylene glycol
  • polypropylene glycol ethylene glycol-propylene glycol copolymer
  • polyoxyethylated polyol polyvinyl alcohol
  • polysaccharide eg, dextran
  • polyvinyl ethyl ether polyvinyl ethyl ether
  • biodegradable polymer a high molecular polymer
  • the polyethylene glycol is a term encompassing all forms of ethylene glycol homopolymer, PEG copolymer, or monomethyl-substituted PEG polymer (mPEG), but is not particularly limited thereto.
  • biocompatible material includes, but is not limited to, poly-amino acids such as poly-lysine, poly-aspartic acid and poly-glutamic acid.
  • the fatty acid may have a binding force with albumin in vivo, but is not particularly limited thereto.
  • the F may be an FcRn-binding material, and specifically, the FcRn-binding material may be an immunoglobulin Fc region, more specifically an IgG Fc region, more specifically an aglycosylated IgG4 Fc area, but is not particularly limited thereto.
  • the F eg, immunoglobulin Fc region
  • the F is a dimer consisting of two polypeptide chains, and one end of L is linked to only one of the two polypeptide chains. may have, but is not limited thereto.
  • L may be a peptidic linker or a non-peptidyl linker (eg, a linker containing ethylene glycol repeating units).
  • L is a peptidic linker
  • it may include one or more amino acids, for example, it may include 1 to 1000 amino acids, but is not particularly limited thereto.
  • various known peptide linkers may be used in the present invention, examples of which include a [GS]x linker, a [GGGS]x linker, and a [GGGGS]x linker, where x is It may be 1 or more natural numbers. However, it is not limited to the above example.
  • non-peptidyl linker includes a biocompatible polymer in which two or more repeating units are bonded. The repeating units are linked to each other through any covalent bond other than a peptide bond.
  • the non-peptidyl linker may include a reactive group at the end thereof to form a conjugate through reaction with other components constituting the conjugate.
  • the non-peptidyl linker may be one component constituting a moiety of the conjugate of the present invention.
  • non-peptidyl linker that can be used in the present invention may be used without limitation as long as it is a non-peptidyl polymer resistant to protease in vivo.
  • the non-peptidyl linker may be used in combination with the non-peptidyl polymer.
  • non-peptidyl linker may be selected from the group consisting of fatty acids, saccharides, high molecular weight polymers, low molecular weight compounds, nucleotides, and combinations thereof.
  • the polymer is polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, oligonucleotide and combinations thereof, and the polysaccharide may be dextran, but is not limited thereto.
  • the high molecular weight polymer may be in the range of greater than 0 to about 100 kDa, specifically from about 1 to about 100 kDa, and more specifically from about 1 to about 20 kDa, but is limited thereto. doesn't happen
  • the non-peptidyl linker may include polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides (eg, dextran, etc.), polyvinyl ethyl It may be selected from the group consisting of ethers, biodegradable polymers such as polylactic acid (PLA) and polylactic-glycolic acid (PLGA), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid, oligonucleotides, and combinations thereof.
  • PLA polylactic acid
  • PLGA polylactic-glycolic acid
  • non-peptidyl linker may be a linker containing an ethylene glycol repeating unit, for example, polyethylene glycol, and also derivatives thereof known in the art and easily at the level of skill in the art. Derivatives that can be prepared are also included in the scope of the present invention.
  • the repeating unit of the non-peptidyl linker may be an ethylene glycol repeating unit, and specifically, the non-peptidyl linker may include an ethylene glycol repeating unit and a functional group used in the preparation of the conjugate at the terminal thereof.
  • the long-acting conjugate according to the present invention may be in a form in which X and F are linked through the functional group, but is not limited thereto.
  • the non-peptidyl linker may include two, or three or more functional groups, and each functional group may be the same or different from each other, but is not limited thereto.
  • the linker may be polyethylene glycol (PEG) represented by the following formula (2), but is not limited thereto:
  • the PEG moiety in the long-acting conjugate may include not only the -(CH 2 CH 2 O) n -structure, but also an oxygen atom intervening between the linking element and the -(CH 2 CH 2 O) n -, but this It is not limited.
  • the conjugate may have a structure in which GLP-2 and the immunoglobulin Fc region (F) are covalently linked through a linker containing an ethylene glycol repeating unit, but is not limited thereto.
  • the polyethylene glycol is a term that encompasses all forms of ethylene glycol homopolymer, PEG copolymer, or monomethyl-substituted PEG polymer (mPEG), but is not particularly limited thereto.
  • the non-peptidyl linker that can be used in the present invention may be used without limitation as long as it is a polymer resistant to protease in vivo.
  • the molecular weight of the non-peptidyl polymer is in the range of more than 0 to 200 kDa, specifically, about 1 to 100 kDa. range, more specifically in the range of about 1 to 50 kDa, even more specifically in the range of about 1 to 20 kDa, even more specifically in the range of about 3.4 kDa to 10 kDa, even more specifically in the range of about 3.4 kDa doesn't happen
  • the term "about” includes all ranges including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all values in a range equal to or similar to the value following the term about, but not limited
  • non-peptidyl linker of the present invention to be coupled to the immunoglobulin Fc region, not only one type of polymer but also a combination of different types of polymers may be used.
  • both ends of the non-peptidyl linker may bind to a thiol group, an amino group, a hydroxyl group of the immunoglobulin Fc region, and a thiol group, an amino group, an azide group, or a hydroxyl group of GLP-2. , but not limited thereto.
  • the non-peptidyl linker has a reactive group capable of binding to immunoglobulin Fc and GLP-2 or a derivative thereof, respectively, at both ends, specifically, a thiol group of a cysteine in the immunoglobulin Fc region; an amino group located at the N-terminus, lysine, arginine, glutamine and/or histidine; and/or a thiol group of a cysteine of GLP-2 bonded to a hydroxyl group located at the C-terminus; amino groups of lysine, arginine, glutamine and/or histidine; azide group of azidolysine; and/or a reactive group capable of bonding to a hydroxyl group, but is not limited thereto.
  • the reactive group of the non-peptidyl polymer may be at least one selected from the group consisting of an aldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative, but is not limited thereto.
  • a propion aldehyde group or a butyl aldehyde group may be exemplified as the aldehyde group, but the present invention is not limited thereto.
  • succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinimidyl propionate, N -Hydroxysuccinimide, hydroxy succinimidyl or succinimidyl carbonate may be used, but not limited thereto.
  • the non-peptidyl linker may be linked to the immunoglobulin Fc and GLP-2 derivatives through the above-described reactive groups, and converted into a non-peptidyl polymer linkage.
  • the final product resulting from reductive alkylation with aldehyde bonds is much more stable than those linked with amide bonds.
  • the aldehyde reactive group selectively reacts with the N-terminus at a low pH, and can form a covalent bond with a lysine residue at a high pH, for example, pH 9.0.
  • the terminal reactive groups of the non-peptidyl linker of the present invention may be the same as or different from each other.
  • the non-peptidyl linker may have an aldehyde group reactive group at the terminal, and the non-peptidyl linker may have an aldehyde group and a maleimide reactive group at the terminal, respectively, or have an aldehyde group and a succinimide reactive group at the terminal, respectively can, but is not limited thereto.
  • it may have a maleimide group at one end and an aldehyde group, propionaldehyde group or butyraldehyde group at the other end.
  • it may have a succinimidyl group at one end and a propionaldehyde group or a butyl aldehyde group at the other end.
  • the hydroxyl group can be activated into the various reactive groups by a known chemical reaction, or a commercially available polyethylene glycol having a modified reactive group is used. It can be used to prepare the conjugate of the present invention.
  • the reactive group of the non-peptidyl linker may be linked to a cysteine residue of GLP-2, more specifically, a -SH group of cysteine, but is not limited thereto.
  • maleimide-PEG-aldehyde is used, the maleimide group is linked to the -SH group of the GLP-2 derivative by a thioether bond, and the aldehyde group is linked to the -NH2 group of the immunoglobulin Fc through a reductive alkylation reaction.
  • the maleimide group is linked to the -SH group of the GLP-2 derivative by a thioether bond, and the aldehyde group is linked to the -NH2 group of the immunoglobulin Fc through a reductive alkylation reaction.
  • a reductive alkylation reaction may be, but is not limited thereto, and this corresponds to one example.
  • the N-terminal amino group of the immunoglobulin Fc region is linked to an oxygen atom located at one end of PEG through a linker functional group having a structure of -CH2CH2CH2-, -PEG-O-CH2CH2CH2NH-immunoglobulin It can form a structure such as Fc, and a structure in which one end of PEG is linked to a sulfur atom located at the cysteine of GLP-2 through a thioether bond can be formed.
  • the above-mentioned thioether bond is may include the structure of
  • the reactive group of the non-peptidyl linker may be linked to -NH2 located at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region, but this corresponds to one example.
  • the GLP-2 derivative may be linked to a non-peptidyl linker having a reactive group through the C-terminus, but this corresponds to one example.
  • C-terminus refers to the carboxy terminus of a peptide, and refers to a position capable of binding to a non-peptide polymer for the purpose of the present invention.
  • it may include all amino acid residues around the C-terminus as well as the most terminal amino acid residue at the C-terminus, and specifically includes the first to 20th amino acid residues from the most terminal.
  • the long-acting conjugate of the present invention may be one in which a GLP-2 derivative and an immunoglobulin Fc region are linked, but is not limited thereto.
  • immunoglobulin Fc region refers to a region including heavy chain constant region 2 (CH2) and/or heavy chain constant region 3 (CH3), excluding the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin.
  • the immunoglobulin Fc region may be one component constituting a moiety of the conjugate of the present invention. Specifically, it corresponds to F in Formula 1 above.
  • the Fc region not only the native sequence obtained from papain digestion of immunoglobulin, but also derivatives thereof, such as one or more amino acid residues in the native sequence, are converted by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, resulting in a native natural sequence. It encompasses and includes sequences that differ from the type.
  • the F eg, immunoglobulin Fc region
  • the F is a structure in which two polypeptide chains are linked by a disulfide bond, and may be a structure in which only one of the two chains is linked through a nitrogen atom, but is limited thereto doesn't happen
  • the linkage through the nitrogen atom may be connected through reductive amination to the epsilon amino atom or the N-terminal amino group of lysine.
  • Reductive amination reaction means a reaction in which an amine group or an amino group of a reactant reacts with an aldehyde (i.e., a functional group capable of reductive amination) of another reactant to form an amine, and then forms an amine bond by a reduction reaction, It is an organic synthesis reaction well known in the art.
  • aldehyde i.e., a functional group capable of reductive amination
  • the long-acting conjugate may be one in which the immunoglobulin Fc region is linked to a linker through its N-terminal nitrogen atom.
  • the immunoglobulin Fc region may include a hinge region in the heavy chain constant region, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may include a specific hinge sequence at the N-terminus.
  • flankinge sequence refers to a region that is located on a heavy chain and forms a dimer of an immunoglobulin Fc region through an inter disulfide bond.
  • the hinge sequence may be mutated to have only one cysteine residue by deleting a portion of the hinge sequence having the following amino acid sequence, but is not limited thereto:
  • the hinge sequence may include only one cysteine residue by deleting the 8th or 11th cysteine residue in the hinge sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the hinge sequence of the present invention may be composed of 3 to 12 amino acids, including only one cysteine residue, but is not limited thereto.
  • the hinge sequence of the present invention may have the following sequence: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 12), Glu-Ser- Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 13), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 14), Glu- Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro (SEQ ID NO: 15), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 16), Glu-Ser-Lys- Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 17), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 18),
  • the hinge sequence may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (Pro-Ser-Cys-Pro) or SEQ ID NO: 30 (Ser-Cys-Pro), but is not limited thereto.
  • the N-terminus of the immunoglobulin Fc region in the conjugate is proline, and in this conjugate, the Fc region is linked to a linker through a nitrogen atom of the proline.
  • the immunoglobulin Fc region has a hinge sequence so that two chains of the immunoglobulin Fc region form a homodimer or a heterodimer.
  • the conjugate of Formula 1 of the present invention may be in a form in which one end of the linker is linked to one chain of the immunoglobulin Fc region of the dimer, but is not limited thereto.
  • N-terminus refers to the amino terminus of a protein or polypeptide, and 1, 2, 3, 4, 5, 6, It may include up to 7, 8, 9, or 10 or more amino acids.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may include a hinge sequence at the N-terminus, but is not limited thereto.
  • part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or light chain constant region except for only the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin 1 (CL1) may be an extended Fc region. It may also be a region in which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and/or CH3 have been removed.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention comprises 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, 2) a CH1 domain and a CH2 domain, 3) a CH1 domain and a CH3 domain, 4) a CH2 domain and a CH3 domain, 5) a combination of one or two or more domains of a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or part of a hinge region), or 6) heavy chain constant region each domain and a light chain constant region may be a dimer
  • the present invention is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be in a dimeric form, and one molecule of X may be covalently linked to one Fc region in the dimeric form, in which case the immunoglobulin Fc and X may be linked to each other by a non-peptidyl polymer.
  • two molecules of X it is also possible for two molecules of X to bind symmetrically to one Fc region in the form of a dimer. In this case, the immunoglobulin Fc and X may be linked to each other by a non-peptide linker.
  • a non-peptide linker it is not limited to the examples described above.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention includes a native amino acid sequence as well as a sequence derivative thereof.
  • An amino acid sequence derivative means that one or more amino acid residues in a native amino acid sequence have a different sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322, or 327 to 331 known to be important for binding may be used as suitable sites for modification.
  • various types of derivatives are possible, such as a site capable of forming a disulfide bond is removed, some amino acids at the N-terminus of native Fc are removed, or a methionine residue may be added to the N-terminus of native Fc do.
  • the complement binding site eg, the C1q binding site
  • the ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • the above-described Fc derivative may exhibit biological activity equivalent to that of the Fc region of the present invention, and may have increased structural stability against heat, pH, etc. of the Fc region.
  • the Fc region may be obtained from a native type isolated in vivo from animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or obtained from transformed animal cells or microorganisms. It may be recombinant or a derivative thereof.
  • the method of obtaining from the native type may be a method of obtaining whole immunoglobulins by treatment with proteolytic enzymes after isolating whole immunoglobulins from a living body of a human or animal. When treated with papain, it is cleaved into Fab and Fc, and when treated with pepsin, it is cleaved into pF'c and F(ab)2.
  • Fc or pF'c may be separated using size-exclusion chromatography or the like.
  • a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a human-derived Fc region from a microorganism.
  • the immunoglobulin Fc region may have a native sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a decreased sugar chain compared to the native type, or a form in which the sugar chain is removed.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms may be used for the increase or decrease or removal of such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region from which the sugar chain is removed from the Fc has significantly reduced binding to complement (c1q) and reduced or eliminated antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, so that unnecessary immune responses in vivo are not induced. does not In this regard, a form more suitable for the original purpose as a drug carrier will be an immunoglobulin Fc region in which sugar chains are removed or non-glycosylated.
  • deglycosylation refers to an Fc region from which sugars are removed by an enzyme
  • aglycosylation refers to an Fc region that is not glycosylated by production in prokaryotes, in a more specific embodiment, in E. coli. .
  • the immunoglobulin Fc region may be of human or animal origin, such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, and in a more specific embodiment, human origin.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, or IgM, a combination thereof, or a hybrid thereof. In a more specific embodiment, it is derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood, and in a more specific embodiment is derived from IgG, which is known to enhance the half-life of ligand binding proteins. In an even more specific embodiment, the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region, and in the most specific embodiment, the immunoglobulin Fc region is a non-glycosylated Fc region derived from human IgG4, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region is a fragment of human IgG4 Fc, and is a homodimer in which two monomers are linked through a disulfide bond (inter-chain form) between cysteine, the 3rd amino acid of each monomer. ), wherein the homodimer has a disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and between cysteines at positions 141 and 199 in each monomer, i.e., two disulfide bonds (in intra-chain form),
  • the number of amino acids of each monomer may be 221, but is not limited thereto.
  • the number of amino acids of each monomer may consist of 221 amino acids, and the amino acids forming a homodimer may consist of a total of 442 amino acids, but is not limited thereto.
  • two monomers having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 (consisting of 221 amino acids) form a homodimer through a disulfide bond between cysteine, the 3rd amino acid of each monomer, and the monomer of the homodimer may each independently form an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199, but is not limited thereto.
  • dimers or multimers can be prepared from two or more fragments selected from the group consisting of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE Fc fragments.
  • hybrid is a term that means that sequences corresponding to immunoglobulin Fc fragments of two or more different origins exist in a single-chain immunoglobulin constant region.
  • various types of hybrids are possible. That is, a hybrid of domains consisting of 1 to 4 domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and may include a hinge.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and in the present invention, a combination thereof or hybridization thereof is also possible. Specifically, they are subclasses of IgG2 and IgG4, and most specifically, the Fc region of IgG4, which has little effector function such as complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the above-described conjugate may have an increased duration of effect compared to native GLP-2 or compared to unmodified X, and this conjugate is not only in the above-described form, but also in the form encapsulated in biodegradable nanoparticles. including, but not limited to, the like.
  • GLP-2 derivatives and long-acting conjugates thereof include peptides and compounds themselves, salts thereof (eg, pharmaceutically acceptable salts of the peptides), or solvates thereof.
  • peptide, compound, GLP-2 derivative or long-acting conjugate thereof may be in any pharmaceutically acceptable form.
  • the type of the salt is not particularly limited. However, it is preferably in a form that is safe and effective for an individual, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable means a material that can be effectively used for a desired purpose without causing excessive toxicity, irritation, or allergic reaction within the scope of medical judgment.
  • salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • solvate refers to a compound in which the peptide, compound, or salt thereof according to the present invention forms a complex with a solvent molecule.
  • the GLP-2 derivative, the long-acting conjugate, and a composition comprising the same may be used for prevention, improvement or treatment of mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof.
  • prevention refers to completely preventing the onset of mucositis caused by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof by administration of a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate of a GLP-2 derivative, and/or a composition comprising the same.
  • Treatment means any action that completely or partially improves or benefits the symptoms of mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, This includes reducing or ameliorating symptoms of mucositis, alleviating the pain of those symptoms, reducing the incidence of mucositis, or other changes in the patient that increase the outcome of treatment.
  • the term "administration" means introducing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the route of administration of the composition is not particularly limited thereto, but any general route through which the composition can reach an in vivo target It can be administered via, for example, oral or skin, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, pulmonary, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, gastrointestinal, topical , but may be administered by parenteral routes of administration including, but not limited to, sublingual, vaginal or rectal routes.
  • the composition for oral use be formulated to be coated with the active agent or to be protected from degradation in the stomach.
  • the composition in the present invention may be administered in the form of an injection.
  • the composition in the present invention may be administered by any device capable of moving the active ingredient to the target cell.
  • compositions of the present invention may be administered in conjunction with, sequentially, or in reverse order with radiotherapy and/or chemotherapy.
  • the composition of the present invention is administered prior to radiotherapy and/or chemotherapy (eg, within 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, or 6 days prior to radiotherapy and/or chemotherapy). ; or within 1 week or 1 month), but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention is administered after radiotherapy and/or chemotherapy (eg, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, or 6 days after radiotherapy and/or chemotherapy). within 1 week or 1 month; or 1 day (24 hours)), but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier excipient or diluent.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents may be non-naturally occurring.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a sufficient amount to exhibit a therapeutic effect and does not cause side effects, and the type of disease, the patient's age, weight, health, sex, and the patient's sensitivity to the drug , administration route, administration method, frequency of administration, treatment period, combination or drugs used at the same time can be easily determined by those skilled in the art according to factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is not particularly limited thereto, but in the case of oral administration, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a color, a fragrance, etc. may be used, and in the case of an injection, a buffer, A preservative, an analgesic agent, a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer, etc. can be mixed and used, and in the case of topical administration, a base, excipient, lubricant, preservative, etc. can be used.
  • the formulation of the composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutically acceptable carrier in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, and in the case of injections, it may be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses.
  • it can be formulated as a solution, suspension, tablet, pill, capsule, sustained-release preparation, and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • it may further include a filler, an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, freeze-dried preparations and suppositories may have the form of
  • composition is formulated in a dosage form suitable for administration in a patient's body according to a conventional method in the pharmaceutical field, specifically, a formulation useful for administration of a protein drug, and administration commonly used in the art. It may be administered using a method, but is not limited thereto.
  • the GLP-2 derivative or long-acting conjugate thereof can be used by mixing with various pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and glucose, sucrose or dextran to increase stability or absorption.
  • pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and glucose, sucrose or dextran to increase stability or absorption.
  • Carbohydrates such as carbohydrates, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers may be used as pharmaceuticals.
  • the dosage and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as the active ingredient, along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease.
  • the composition of the present invention may include a GLP-2 derivative or a long-acting conjugate thereof in a pharmaceutically effective amount, but is not limited thereto.
  • a GLP-2 derivative or a long-acting conjugate thereof when included in a pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount, it means the degree to which a desired pharmacological activity can be obtained due to the GLP-2 derivative or a long-acting conjugate thereof, In addition, toxicity or side effects do not occur in the administered subject or may mean a pharmaceutically acceptable level as a minor level, but is not limited thereto. Such a pharmaceutically effective amount may be determined by comprehensively considering the number of administration, patient, formulation, and the like.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient as a single dose, or may be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the severity of the disease.
  • the preferred total dose of the GLP-2 derivative of the present invention or the long-acting conjugate thereof is about 0.0001 mg to 500 mg, about 0.001 mg to 100 mg, and more preferably about 0.01 mg to 10 mg/kg of patient body weight per day. mg may be, but is not limited thereto.
  • the dose of the GLP-2 derivative or its long-acting conjugate is determined by considering various factors such as the age, weight, health status, sex, severity of disease, diet and excretion rate of the patient, as well as the administration route and number of treatments of the pharmaceutical composition. Since the effective dosage for the patient is determined, those of ordinary skill in the art will be able to determine an appropriate effective dosage according to the specific use of the composition of the present invention in consideration of this point.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has excellent in vivo persistence and potency, and can significantly reduce the number and frequency of administration of the pharmaceutical preparation of the present invention.
  • Another aspect embodying the present invention provides a food composition for preventing or improving mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, comprising a GLP-2 derivative and/or a long-acting conjugate thereof.
  • the GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, or mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof is the same as described above.
  • the food composition may be used as a health functional food.
  • the peptide peptide itself or its long-acting conjugate
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • health functional food in the present invention refers to a food manufactured and processed by extracting, concentrating, refining, mixing, etc., a specific ingredient as a raw material or a specific ingredient contained in a food raw material for the purpose of health supplementation, It refers to food designed and processed to sufficiently exert biological control functions such as biological defense, regulation of biological rhythm, prevention and recovery of disease, etc., by the above ingredients, and the composition for health food is used for prevention of diseases and prevention of diseases. It can perform functions related to recovery, etc.
  • Another aspect for implementing the present invention is radiotherapy, chemotherapy, or these comprising administering the GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or a composition comprising the same to an individual in need thereof. It provides a method for preventing, improving or treating mucositis caused by a combination of
  • the GLP-2 derivative, its long-acting conjugate, composition, or mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof is as described above.
  • the GLP-2 derivative may include the amino acid sequence represented by Formula 1 (however, the amino acid sequence of Formula 1 excludes the same sequence as SEQ ID NO: 1), but is not limited thereto.
  • the subject is a subject suspected of mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, and may be a mammal, including mice, livestock, etc. including humans, which has or may develop the disease, Subjects that can be treated with the GLP-2 derivative of the present invention, a long-acting conjugate thereof, and/or a pharmaceutical composition comprising the same are included without limitation. In addition, humans may be excluded from the subject of the present invention, but is not limited thereto.
  • the method of the present invention may include administering a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or a composition comprising the same in a pharmaceutically effective amount.
  • a suitable total daily amount may be determined by the treating physician within the scope of sound medical judgment, and may be administered once or divided into several doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient depends on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the specific composition, the patient's age, weight, general health, It is preferable to apply differently depending on various factors including sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used together or concurrently with a specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • Another aspect for implementing the present invention is a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or a composition comprising the same for the prevention, improvement or treatment of mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof. provide use.
  • the GLP-2, a long-acting conjugate thereof, a composition, or mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof, etc. are as described above.
  • the GLP-2 derivative may include the amino acid sequence represented by Formula 1 (however, the amino acid sequence of Formula 1 excludes the same sequence as SEQ ID NO: 1), but is not limited thereto.
  • Another aspect for implementing the present invention includes a GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, and/or the same in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of mucositis induced by radiotherapy, chemotherapy, or a combination thereof. It provides the use of a pharmaceutical composition comprising:
  • the GLP-2 derivative, a long-acting conjugate thereof, or mucositis induced by radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof is the same as described above.
  • the GLP-2 derivative may include the amino acid sequence represented by Formula 1 (however, the amino acid sequence of Formula 1 excludes the same sequence as SEQ ID NO: 1), but is not limited thereto.
  • GLP-2 derivative CA GLP-2 RK of SEQ ID NO: 4 in Table 1 is modified polyethylene glycol ALD(2) PEG (hydrogens at both ends are substituted with propylaldehyde groups (3-oxopropyl groups), and ethylene glycol repeating unit sites For pegylation with modified polyethylene glycol having a formula weight of (moiety) of 3.4 kDa, NOF, Japan), the molar ratio of the GLP-2 derivative and the ALD(2) PEG was 1:5 to 1:20, and the GLP-2 derivative The concentration was 5 to 10 mg/ml, and the reaction was carried out at 2 to 8°C for 4 to 16 hours.
  • reaction was carried out in 20 mM HEPES (HEPES) pH 7.5 and ethanol, and 20 mM sodium cyanoborohydride as a reducing agent was added to the reaction.
  • the reaction solution was a mono-pegylated GLP-2 derivative using a Source 15S (GE, USA) column using a sodium citrate pH 2.0, ethanol-containing buffer solution and potassium chloride concentration gradient.
  • the molar ratio of the purified mono-pegylated GLP-2 derivative and the immunoglobulin Fc fragment of SEQ ID NO: 32 is 1:2 to 1:6, and the total protein concentration is 30 to 35 mg/mL, It was made to react at 2-8 degreeC for 12-20 hours. At this time, the reaction solution was 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and isopropanol, and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • the reaction solution was applied to a Source15Q (GE, USA) column using a bis-Tris pH 6.5 buffer and a sodium chloride concentration gradient, and a concentration gradient of ammonium sulfate and sodium citrate pH 5.0 to 5.2 was applied.
  • Source 15 ISO GE, USA
  • a long-acting conjugate of the GLP-2 derivative was purified, which is a conjugate in which the GLP-2 derivative is covalently linked to the immunoglobulin Fc fragment by a polyethylene glycol linker.
  • Example 2 Confirmation of increase in small intestine weight in gastrointestinal mucositis model rats induced by chemotherapy following administration of a GLP-2 derivative long-acting conjugate
  • gastrointestinal mucositis was induced by administration of 36 mg/kg of Docetaxel and 300 mg/kg of Cyclophosphamide to G2 and G3 (D0).
  • D1 vehicle or GLP-2 derivative long-acting conjugate was administered subcutaneously to each group alone, and then the weight of the small intestine was measured at D2, D3, and D4.
  • GLP-2 derivative long-acting conjugate of the present invention can be effective in the prevention and treatment of chemotherapy-induced gastrointestinal mucositis through rapid recovery of the small intestine.
  • Example 3 Confirmation of changes in small intestine weight in chemotherapy-induced gastrointestinal mucositis model rats following administration of a GLP-2 derivative and a GLP-2 derivative long-acting conjugate
  • the weight loss of the small intestine due to chemotherapy-induced gastrointestinal mucositis was significantly less in the group administered with the GLP-2 derivative long-acting conjugate (G4) than the group administered with the GLP-2 derivative (G3), and the It was confirmed that the increase in the weight of the small intestine was significantly large (Fig. 2, A).
  • Example 4 Confirmation of effects of GLP-2 derivative long-acting conjugate to inhibit M1 polarization in THP-1 cells (Monocyte), inhibit macrophage differentiation, and inhibit monocyte migration
  • THP-1 cells were treated with the GLP-2 derivative long-acting conjugate (10 ⁇ M) prepared in Example 1 for 4 hours. And after treatment with 1 ⁇ g/mL of lipopolysaccharides (LPS) for 2 hours to induce inflammation, RNA was extracted and pro-inflammatory cytokines (M1 polarization) TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL- The mRNA expression level of 6 was measured by qPCR.
  • LPS lipopolysaccharides
  • THP-1 cells were treated with the GLP-2 derivative long-acting conjugate (10 ⁇ M) prepared in Example 1 for 48 hours. And after transferring the drug-treated THP-1 cells to the upper chamber of the Boyden chamber, 50 ng/mL of CCL-2 that can induce movement to the lower chamber is added. Incubated for 4 hours. And the degree of migration was measured using a migration assay kit (abcam).
  • the GLP-2 derivative long-acting conjugate of the present invention can inhibit inflammation, inhibit the differentiation of monocytes into macrophages that induce inflammation, and inhibit the migration of monocytes to the inflammatory site, and thus the gastrointestinal tract. It suggests that it may be effective in the prevention and treatment of mucositis.

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Abstract

본 발명은 GLP-2 및 이의 지속형 결합체의 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염에 대한 예방적 또는 치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 GLP-2, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물은 방사선요법, 및/또는 화학요법으로 유발된 점막염의 예방, 치료 및 개선에 적용될 수 있다.

Description

GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 GLP-2 유도체 및 이의 지속형 결합체의 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염에 대한 예방적 또는 치료적 용도에 관한 것이다.
글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2)는 섭취된 영양분에 반응하여 소장의 L-세포에서 생성되는 33개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. GLP-2는 소장 및 대장에서 점막 성장을 유도하고, 장 세포와 움(crypt) 세포의 성장 촉진 및 세포사멸(apoptosis)을 억제한다. 또한 GLP-2는 소장에서 영양분의 흡수를 증가시키고, 장 투과성을 감소시킨다. 또한, GLP-2는 위 배출(gastric emptying) 및 위산 분비를 억제하고, 장 혈류 속도를 증가시키고, 장평활근을 이완시킨다.
GLP-2는 에너지의 흡수 및 보호, 장 세포 기능의 활성화 등의 특징으로 다양한 장 질환과 장손상의 실험모델에서 치료제로서 유망한 가능성을 보여왔다. 영양 흡수를 조절하는 호르몬으로서 GLP-2는 단장증후군(short bowel syndrome, SBS)의 치료제로서 잠재력을 지니고 있다. SBS는 선천적 또는 장 절제 수술과 같은 후천적 원인으로 발생하며 소장의 흡수면적 감소로 인하여 영양결핍증을 초래하게 된다. GLP-2는 SBS를 갖는 설치류 실험모델에서 영양 흡수 및 소화관 흡수를 증진시키는 것이 확인되었다(Ljungmann K et al., Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 2001, 281(3):G779-85).
한편, 방사선요법 및/또는 화학요법 시, 목적하는 세포(예를 들어, 암 세포) 이외에 세포 성장이 빠른 기관인 점막 등이 같이 손상을 받아 점막염 등의 부작용이 발생하고 있다. 이에, 방사선요법 및/또는 화학요법에 의해 유발되는 점막염을 예방 또는 치료할 수 있는 약물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 글루카곤 유사 펩타이드-2(Glucagon-like peptide-2, GLP-2) 유도체 및/또는 이의 지속형 결합체를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 및/또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 및/또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 글루카곤 유사 펩타이드-2(Glucagon-like peptide-2, GLP-2) 유도체 및/또는 이의 지속형 결합체를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물이다.
하나의 구체예로서, 본 발명은 GLP-2 유도체 및/또는 이의 지속형 결합체를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 GLP-2 유도체 및/또는 이의 지속형 결합체를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 부형제; 및 GLP-2 유도체를 약학적 유효량으로 포함하고, 상기 GLP-2 유도체가 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다:
[일반식 1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34 (서열번호 10)
여기서,
X1은 히스티딘, 이미다조아세틸데스히스티딘, 데스아미노히스티딘, β-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딘, N-디메틸히스티딘, 또는 β-카복시이미다조프로피온일데스히스티딘이고;
X2는 알라닌, 글라이신, 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)이며;
X30은 라이신 또는 아르지닌이고;
X34는 하나 이상의 임의의 아미노산 또는 변형이 일어난 하나 이상의 임의의 아미노산이고;
다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 변형은적어도 하나의 아미노산에서 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 또는 이들의 조합이 일어난 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 GLP-2 유도체는 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다:
[일반식 2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34 (서열번호 9)
여기서,
X1은 히스티딘, 이미다조아세틸데스히스티딘, 데스아미노히스티딘, β-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딘, N-디메틸히스티딘, 또는 β-카복시이미다조프로피온일데스히스티딘이고;
X2는 알라닌, 글라이신, 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)이며;
X30은 라이신 또는 아르지닌이고;
X34는 부존재하거나, 라이신, 아르지닌, 글루타민, 히스티딘, 6-아지도라이신, 또는 시스테인이고;
다만, 일반식 2의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 GLP-2 유도체는
(1) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인이거나,
(2) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 라이신이거나,
(3) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 아르지닌이고, X34가 라이신이거나,
(4) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 6-아지도라이신이거나,
(5) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 아르지닌이고, X34가 시스테인이거나,
(6) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 Aib이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인이거나, 또는
(7) X1이 히스티딘이고, X2가 Aib이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 GLP-2 유도체는 서열번호 2 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 GLP-2 유도체는 이의 C-말단이 변형되지 않았거나 아미드화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 점막염은 구강 점막염, 위장관 점막염, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 화학요법은 항암제를 이용한 화학요법인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 항암제는 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 세포독성 항암제는 뉴클레오시드 아날로그, 엽산길항제(antifolate), 대사길항제(antimetabolite), 토포이소머라아제 I(Topoisomerase I) 저해제, 안트라사이클린, 포도필로톡신, 탁산, 빈카 알카로이드, 알킬화제, 백금 화합물 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 항암제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, CPA), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 프리드니손(Prednisone), 에토포시드(Etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 젬시타빈Glemcitabine), 비노렐빈(Vinorelbine), 류코보린(Leucovorin), 이리노테칸(Irinotecan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 방사선요법 또는 화학요법 실시 전 1일 이내에; 또는 방사선요법 또는 화학요법 실시 후 1일 이내에 투여되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 투여된 개체에서 소장 무게 증가, 소장 무게 감소 수준의 저하, 염증 억제, 단핵구의 대식세포로의 분화 억제, 및 단핵구의 이동 억제 중 하나 이상을 야기하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 GLP-2 유도체는 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질이 결합된, 지속형 결합체의 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서,
X는 GLP-2 유도체이고;
L은, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며;
a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는, 면역글로불린 Fc 영역이며;
상기 "-"는 공유결합임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체이며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩타이드 사슬에만 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 L은 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 L 내의 에틸렌글리콜 반복 단위 부위(moiety)의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태는 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 및/또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료 방법으로서, 상기 GLP-2 유도체가 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열(다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외함)을 포함하는, 방법이다.
본 발명의 다른 양태는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 GLP-2 유도체가 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열(다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외함)을 포함하는, 용도이다.
본 발명의 다른 양태는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 용도로서, 상기 GLP-2 유도체가 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열(다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외함)을 포함하는, 용도이다.
본 발명의 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물은 방사선요법, 및/또는 화학요법으로 유발된 점막염 예방, 치료 및 개선에 적용될 수 있다.
도 1은 화학요법(Docetaxel과 Cyclophosphamide, TC)에 의해 점막염이 유도된 모델 랫드에서 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 투여한 후 소장의 무게 변화를 비교 분석한 결과이다.
도 2는 화학요법(TC)에 의해 점막염이 유도된 모델 랫드에서 GLP-2 유도체 (테두글루타이드, Teduglutide) 및 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 화학요법 유도와 동시 투여(A); 및 화학요법 유도 하루 전 GLP-2 유도체 지속형 결합체 투여(B) 후 소장의 무게 변화를 비교 분석한 결과이다.
도 3은 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 THP-1 세포(Monocyte)에서의 M1 분극화 억제(A), 대식세포 분화 억제(B) 및 단핵구 이동 억제(C) 효과를 확인한 결과이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(2-aminoisobutyric acid), AZK(6-azidolysine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르지닌 Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글라이신 Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 라이신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 글루카곤 유사 펩타이드-2(Glucagon-like peptide-2, GLP-2) 유도체를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물이다. 구체적으로 상기 조성물은 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 한 구체적인 예로, 약학적으로 허용되는 부형제; 및 GLP-2 유도체를 약학적 유효량으로 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "점막염(mucositis)"은 구강 및/또는 소환관의 점막에 염증 및/또는 궤양이 생기는 것을 말하며, "방사선요법(Radiotherapy), 화학요법(Chemotherapy), 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염"은 방사선요법 또는 화학요법을 단독으로 수행하거나, 방사선요법과 화학요법을 순서 및 횟수에 상관없이 조합하여 수행한 결과 부작용으로서 발생한 점막염을 말하고, 구체적으로, 구강 점막염, 위장관 점막염, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 위장관 점막염은 장 염증 질환 및/또는 장 궤양 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 위장관 점막염은 설사, 항문 궤양(anal ulcer), 직장 궤양(rectal ulcer), 직장 출혈(rectal bleeding), 복통, 연하 장애(dysphagia), 구토, 복부팽만(bloating), 또는 소장의 융모 길이와 움(crypt)의 깊이의 감소로 영양분 흡수 감소에 따른 영양분 부족 또는 체중 감소 등의 증상이 나타날 수 있다.
상기 방사선요법은 방사선을 이용한 질병의 예방 또는 치료법을 말하며, 단독으로 또는 화학요법과 병행하여 점막염을 유발하는 모든 방사선요법이 본원에 포함된다. 또한, 상기 화학요법은 화학약품을 이용한 질병의 예방 또는 치료법을 말하며, 의약품 단독으로 또는 방사선요법과 병행하여 점막염을 유발하는 모든 화학요법이 본원에 포함된다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 방사선요법 및 화학요법은 암의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있고, 상기 암은 폐암(예, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암(예, 췌관암, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위암(예, 유두 선암, 점액성 선암, 선편평상피암종), 십이지장암, 소장암, 대장암(예, 결장암, 직장암, 항문암, 가족성 대장암, 유전성 비용종증 대장암, 소화관 간질 종양), 유방암(예, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암), 난소암(예, 상피성 난소암종, 고환외 배세포 종양, 난소성 배세포 종양, 난소 저악성도 종양), 고환 종양, 전립선암 (예, 호르몬-의존성 전립선암, 호르몬-비의존성 전립선암), 간암(예, 간세포암, 원발성간암, 간외 담관암), 갑상선암(예, 갑상선 수질암종), 신장암(예, 신세포암종, 신우와 요관의 이행 상피암종), 자궁암(예, 자궁경부암, 자궁체암, 자궁 육종), 뇌종양(예, 수모세포종, 신경교종, 송과체 성세포종양, 모양세포성 성세포종, 미만성 성세포종, 퇴형성성 성세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암(예, 기저세포암, 악성 흑색종), 육종(예, 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수 증식 질환), 원발 미상 암 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 암의 예방 또는 치료를 위한 화학요법은 항암제를 이용한 화학요법일 수 있으며, 이의 부작용으로서 점막염이 유발될 수 있다. 상기"항암제의 이용"은 항암제를 단독 또는 복합으로 이용하는 것을 포함하며, 항암제와 함께 다른 물질(예: 항암제 이외의 약물, 항암제 부작용 억제 약물 등)을 함께, 순차적으로, 또는 역순으로 투여하여 점막염을 유발하는 것도 포함한다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 점막염을 유발할 수 있는 항암제는 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포독성 항암제는 빠르게 분화하는 세포를 공격하는 약물로서, 구체적으로, 뉴클레오시드 아날로그[아자시티딘(Azacitidine), 카페시타빈(Capecitabine), 카르모푸르(Carmofur), 클라리딘(Cladribine), 클로파라빈(Clofarabine), 시타리빈(Cytarabine), 데시타빈(Decitabine), 플로스우리딘(Floxuridine), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 메르캅토퓨진(Mercaptopurine), 넬라라빈(Nelarabine), 펜토스타틴(Pentostatin), 테가푸르(Tegafur), 티오구아닌(Tioguanine) 등], 엽산길항제(antifolate)[메토트렉세이트(Methotrexate), 페메트렉시드(Pemetrexed), 랄티트렉시드(Raltitrexed) 등], 대사길항제(antimetabolite)[히드록시우레아(Hydroxycarbamide) 등], 토포이소머라아제 I(Topoisomerase I) 저해제[이리노테칸(Irinotecan), 토포테칸(Topotecan) 등], 안트라사이클린[다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 이다르비신(Idarubicin) 등], 포도필로톡신[에토포시드(Etoposide), 테니포시드(Teniposide) 등], 탁산[카바지탁셀(Cabazitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 파클리탁셀(Paclitaxel) 등], 빈카 알카로이드[빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 빈플루닌(Vinflunine), 비노렐빈(Vinorelbine) 등], 알킬화제[벤다무스틴(Bendamustine), 부설판(Busulfan), 카무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 클로메틴(Chlormethine), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 다카바진(Dacarbazine), 포테무스틴(Fotemustine), 이포스파미드(Ifosfamide), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 스트렙토조토신(Streptozotocin), 테모졸로미드(Temozolomide) 등], 백금 화합물[카보플라틴(Carboplatin), 시스플라틴(Cisplatin), 네자플라틴(Nedaplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 등] 또는 기타 약물[알트레타민 (Altretamine), 블레오마이신(Bleomycin), 보르테조밉(Bortezomib), 닥티노마이신(Dactinomycin), 에스트라무스틴(Estramustine), 익사베필론(Ixabepilone), 미토마이신(Mitomycin), 프로카바진(Procarbazine) 등] 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 표적 항암제는 다른 세포(예를 들어, 정상 세포)와 차이가 나는 암 세포의 특정 부분을 표적으로 하여 특정 부분을 가진 암 세포를 선택적으로 공격하는 약물로서, 구체적으로, 단일클론항체[예: 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 데노수맙(Denosumab), 젬투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 이브리투모맙 튜세탄(Ibritumomab tiuxetan), 이필리무맙(Ipilimumab), 니볼루맙(Nivolumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 펨브로리주맙(Pembrolizumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투맙(Tositumomab), 트라스투주맙(Trastuzumab) 등], 타이로신 키나제 억제제[예: 아파티닙(Afatinib), 애플리버셉트(Aflibercept), Axitinib(액시티닙), 보수티닙(Bosutinib), 크리조티닙(Crizotinib), 엘로티닙(Erlotinib), 제피티닙(Gefitinib), 이매티닙(Imatinib), 라파티닙(Lapatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 파조티닙(Pazopanib), 포나티닙(Ponatinib), 레고라티닙(Regorafenib), 록소리티닙(Ruxolitinib), 소라페닙(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib), 반데타닙(Vandetanib) 등], mTOR 저해제[예: 에베로리무스(Everolimus), 템시로리무스(Temsirolimus) 등], 레티노이드[알리트레티노인(Alitretinoin), 벡사로텐(Bexarotene), 이소트레티노인(Isotretinoin), 타미바로텐(Tamibarotene), 트레티노인(Tretinoin) 등], 면역조절제[레날리도마이드(Lenalidomide), 포말리도마이드(Pomalidomide), 탈리도마이드(Thalidomide) 등], 히스톤 탈아세틸화효소 저해제[파노비노스탓(Panobinostat), 로미뎀신(Romidepsin), 발프로에이트(Valproate), 보리노스탓(Vorinostat) 등], 또는 기타 약물[아나그렐리드(Anagrelide), 삼산화비소(Arsenic trioxide), 아스파라기나제(Asparaginase), BCG 백신, 데닐류킨 디피톡스(Denileukin diftitox), 베무라페닙(Vemurafenib) 등] 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 면역 항암제는 체내 면역체계를 활용해 암 세포를 공격하는 약물로서, 구체적으로, 암 세포가 체내 면역체계를 회피하지 못하도록 하거나 면역 세포가 암 세포를 더 잘 인식하여 공격하도록 하는 약물일 수 있고, 더욱 구체적으로, 면역체크포인트억제제[아테졸리주맙(Atezolizumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 아벨루맙(Avelumab), 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 등], 면역세포작용강화제[블리나투모맙(blinatumomab) 등] 또는 기타 약물[알렘투주맙(Alemtuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab) 등] 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 하나의 약물이 표적 항암제이자 면역 항암제일 수 있다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 점막염을 유발할 수 있는 항암제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, CPA), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 프리드니손(Prednisone), 에토포시드(Etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 젬시타빈Glemcitabine), 비노렐빈(Vinorelbine), 류코보린(Leucovorin), 이리노테칸(Irinotecan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 본 발명의 조성물은 투여된 개체에서 소장 무게 증가, 소장 무게 감소 억제(즉, 소장 무게 감소 수준의 저하), 염증 억제, 단핵구의 대식세포로의 분화 억제, 및 단핵구의 이동 억제 중 하나 이상을 야기하여 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염을 예방 또는 치료할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "글루카곤 유사 펩타이드-2" 또는 "GLP-2(Glucagon-like peptide-2)"는 글루카곤 유사 펩타이드-2 수용체의 작용제(agonist)로서, 폴리펩타이드 형태 또는 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, GLP-2에는 천연형(예를 들어, 사람) GLP-2뿐만 아니라, 이의 유도체도 포함되며, 이들의 결합체도 포함된다. 상기 GLP-2는 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 유효성분으로서, 약학적 조성물에 약학적 유효량으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 "GLP-2 수용체 작용제"는 생체 내 또는 분리된 사람 글루카곤 유사 펩타이드-2 수용체와 결합하여 천연형 GLP-2와 동등한 혹은 유사한 생리활성을 일으키는 물질을 말한다. 예를 들어, GLP-2 작용제에는 천연형 GLP-2 또는 GLP-2 유도체가 포함될 수 있다.
천연형 GLP-2의 아미노산 서열은 아래와 같다.
GLP-2(1-33)
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (서열번호 1)
본 발명에서 "GLP-2 유도체"는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 치료, 또는 개선 기능을 가지면서, 천연형 GLP-2와 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 GLP-2 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드; 및/또는 천연형 GLP-2와 같이 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 치료 및/또는 개선 기능을 가진 천연형 GLP-2의 모방체를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2에서 적어도 하나의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 때 추가된 아미노산은 비 천연형 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능하며, 천연형 아미노산 이외에 비 천연형 아미노산의 치환도 가능하다. 상기 추가되는 아미노산 서열은 천연형 GLP-2에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 아미노산의 변형은, 적어도 하나의 아미노산의 치환, 추가, 제거, 또는 이들의 조합과 함께; 또는 이와 독립적으로, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation, azido 기로 치환), 제거(예; deamination) 및/또는 수식(예; N-methylation)된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2와 아미노산 서열에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상동성(또는 동일성)을 보이는 것일 수 있고/있거나, GLP-2 유도체의 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation, azido 기로 치환), 제거(예; deamination) 및/또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, GLP-2 유도체는 N-말단 아미노기가 치환, 제거, 또는 수식될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 GLP-2 유도체는 지속성 결합체 제조 시 GLP-2 유도체의 생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단에 결합이 일어나는 것을 방지하기 위해, N-말단 히스티딘의 알파 아미노기를 제거하는 방법, N-말단 아미노기를 하이드록실(hydroxyl)기 또는 카복실(carboxyl)기로 치환하여 합성하는 방법, N-말단 히스티딘의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기를 제거하여 이미다조-아세틸(imidazo-acetyl) 작용기만을 남겨두는 방법, N-말단 아미노기를 2개의 메틸기로 수식하는 방법 등을 통해 제조될 수 있다.
구체적으로, GLP-2 유도체는 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딜 GLP-2(imidazoacetyl-deshistidyl-GLP-2, CA-GLP-2), GLP-2의 N-말단 아미노기가 제거된 데스아미노히스티딜 GLP-2(desaminohistidyl GLP-2, DA-GLP-2), GLP-2의 N-말단 아미노기가 하이드록실기로 치환된 베타-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딜 GLP-2(β-hydroxyimidazopropionyldeshistidyl GLP-2, HY-GLP-2), GLP-2의 N-말단 아미노기가 2개의 메틸기로 수식된 N-디메틸히스티딜 GLP-2(N-dimethylhistidyl GLP-2, DM-GLP-2), 또는 GLP-2의 N-말단 아미노기가 카복실기로 치환된 베타-카복시이미다조프로피온일데스히스티딜-GLP-2(β-carboxyimidazopropionyl-deshistidyl GLP-2, CX-GLP-2) 유도체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 비제한적 예시로서 GLP-2 유도체의 제조에 사용된 물질 구조는 아래와 같다.
Figure PCTKR2021004162-appb-I000001
하나의 구체적인 실시 형태에서, GLP-2 유도체는 서열번호 1에서 1번, 2번, 30번 및 33번의 아미노산 중 적어도 하나의 아미노산에서의 변형을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에서 아미노산의 변형은 적어도 하나의 아미노산의 치환, 추가, 제거, 수식 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형일 수 있으며, 이 때 추가되는 아미노산은 비 천연형 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능하고, 천연형 아미노산 이외에 비 천연형 아미노산의 치환도 가능하다. 상기 추가되는 아미노산 서열은 천연형 GLP-2에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 아미노산의 변형은, 적어도 하나의 아미노산의 치환, 추가, 제거, 또는 이들의 조합과 함께; 또는 이와 독립적으로, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation, azido 기로 치환), 제거(예; deamination) 및/또는 수식(예; N-methylation)된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, GLP-2 유도체는 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[일반식 1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34 (서열번호 10)
여기서,
X1은 히스티딘, 이미다조아세틸데스히스티딘, 데스아미노히스티딘, β-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딘, N-디메틸히스티딘, 또는 β-카복시이미다조프로피온일데스히스티딘이고;
X2는 알라닌, 글라이신, 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)이며;
X30은 라이신 또는 아르지닌이고;
X34는 하나 이상의 임의의 아미노산 또는 변형이 일어난 하나 이상의 임의의 아미노산이고;
다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외한다.
구체적으로, 상기 아미노산은 천연형 아미노산 또는 비 천연형 아미노산일 수 있으며, 상기 변형은 전술한 바와 같다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, GLP-2 유도체는 하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[일반식 2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34 (서열번호 9)
여기서,
X1은 히스티딘, 이미다조아세틸데스히스티딘, 데스아미노히스티딘, β-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딘, N-디메틸히스티딘, 또는 β-카복시이미다조프로피온일데스히스티딘이고;
X2는 알라닌, 글라이신, 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)이며;
X30은 라이신 또는 아르지닌이고;
X34는 부존재하거나, 라이신, 아르지닌, 글루타민, 히스티딘, 6-아지도라이신, 또는 시스테이고;
다만, 일반식 2의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외한다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 글라이신 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)으로의 치환, 30번째 아미노산인 라이신의 아르지닌으로의 치환, 또는 이들의 조합을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 GLP-2 유도체는 C-말단(예들 들어, 33번째 아미노산)에 티올기(예들 들어, 시스테인), 아미노기(예를 들어, 라이신, 아르지닌, 글루타민 또는 히스티딘), 또는 아지드기(예들 들어, 6-아지도라이신)이 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
GLP-2 유도체의 지속형 결합체 제조 시 상기 도입된 그룹에서 결합이 일어나므로, 이를 이용하여 결합 위치가 선택적으로 조절된 GLP-2 결합체를 제조할 수 있다. 구체적으로, GLP-2 유도체의 하이드록실기, 티올기, 아미노기 또는 아지드기에 비펩타이드성 링커의 한 쪽 말단이 결합되고, 비펩타이드성 링커의 다른 말단에 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)이 결합될 수 있다. 상기 티올기, 아미노기 또는 아지드기는 GLP-2에 아미노산을 추가하여 도입시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 티올기는 GLP-2에 시스테인(C)을 추가시켜 도입되고; 아미노기는 라이신(K), 아르지닌(R), 글루타민(Q) 또는 히스티딘(H)을 추가시켜 도입되고; 아지드기는 6-아지도라이신(6-azidolysine, AZK)을 추가시켜 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, GLP-2 유도체는 적어도 하나의 잔기가 시스테인, 라이신, 아르지닌, 글루타민, 히스티딘 또는 6-아지도라이신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 글라이신으로의 치환 및 C-말단에 티올기(예들 들어, 시스테인)의 도입을 포함하며, 더욱 구체적으로 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딘을 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 글라이신으로의 치환 및 C-말단에 아미노기(예를 들어, 라이신)의 도입을 포함하며, 더욱 구체적으로 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딘을 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 글라이신으로의 치환, 천연형 GLP-2의 30번째 아미노산인 라이신의 아르지닌으로의 치환 및 C-말단에 아미노기(예를 들어, 라이신)의 도입을 포함하며, 더욱 구체적으로 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딘을 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 글라이신으로의 치환 및 C-말단에 아지드기(예들 들어, 6-아지도라이신)의 도입을 포함하며, 더욱 구체적으로 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딘을 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 글라이신으로의 치환, 천연형 GLP-2의 30번째 아미노산인 라이신의 아르지닌으로의 치환 및 C-말단에 티올기(예들 들어, 시스테인)의 도입을 포함하며, 더욱 구체적으로 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딘을 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체는 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌의 2-아미노이소부티르산으로의 치환 및 C-말단에 티올기(예들 들어, 시스테인)의 도입을 포함하며, 그 예로 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 더욱 구체적으로 N-말단 첫번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아미노기가 제거된 이미다조아세틸데스히스티딘을 포함할 수 있으며, 그 예로 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 2 내지 8의 GLP-2 유도체를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2021004162-appb-T000001
상기 표 1에서 caH는 히스티딘 대신 이미다조아세틸데스히스티딘으로 치환된 것을, Aib는 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid)을, AZK는 6-아지도-L-라이신(6-azido-L-lysyine)을 가리킨다.
본 발명에 따른 GLP-2 유도체는 상기 기술된 특정 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 기술된 특정 서열로 (필수적으로) 구성된 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본원에서 '특정 서열번호로 구성되는(이루어진)' 펩타이드 또는 GLP-2 유도체라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 GLP-2 유도체와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
구체적으로, GLP-2 유도체는 일반식 1 또는 2에서 (1) X2가 글라이신 또는 Aib이거나, (2) X30이 라이신 또는 아르지닌이거나, 또는 (3) X2가 글라이신 또는 Aib이고, X30이 라이신 또는 아르지닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, GLP-2 유도체는 일반식 1 또는 일반식 2에서
(1) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인이거나,
(2) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 라이신이거나,
(3) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 아르지닌이고, X34가 라이신이거나,
(4) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 6-아지도라이신이거나,
(5) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 아르지닌이고, X34가 시스테인이거나,
(6) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 Aib이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인이거나, 또는
(7) X1이 히스티딘이고, X2가 Aib이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 천연형 GLP-2의 작용제, 단편, 변이체 및 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질 혹은 번역 후 변형(예, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합 등) 함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
본 발명에서, 상기 GLP-2 유도체는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 GLP-2 유도체 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화(amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 본 발명에서, GLP-2 유도체는 이의 C-말단이 변형되지 않았거나 아미드화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 GLP-2 유도체는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 재조합 방법으로도 생산 가능하고, 상업적으로 의뢰하여 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 GLP-2 유도체는 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 지속형 결합체는 생체적합성물질(예로서, 면역글로불린 Fc 영역)이 결합되지 않은 GLP-2 유도체에 비하여 증가된 효력의 지속성을 나타낼 수 있으며, 본 발명에서는 GLP-2 유도체에 생체적합성 물질이 결합하여 반감기가 증가된, GLP-2 유도체를 포함하는 결합체를 "GLP-2 유도체 지속형 결합체" 또는 "GLP-2 유도체의 지속형 결합체"로 지칭한다. 본 발명에서 지속형 결합체는 결합체와 혼용된다.
한편, 이러한 결합체는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
또한, GLP-2 유도체 지속형 결합체에 있어서 GLP-2 유도체와 생체적합성물질(예로서, 면역글로불린 Fc 영역)의 연결은 물리 또는 화학 결합이거나, 비공유 또는 공유 결합일 수 있으며, 구체적으로 공유 결합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, GLP-2 유도체 지속형 결합체에서 GLP-2 유도체와 생체적합성물질(예로서, 면역글로불린 Fc 영역)의 연결 방법은 특별히 제한되지 않으나, 링커를 통해 GLP-2 유도체와 생체적합성물질(예로서, 면역글로불린 Fc 영역)이 서로 연결된 것일 수 있다.
또한, GLP-2 유도체 지속형 결합체에 관한 한국 공개특허 제10-2019-0037181호는 참조로 본원에 포함된다
하나의 구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 GLP-2 유도체의 지속형 결합체는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
X - La - F
여기서,
X는 본원에 기재된 GLP-2 유도체이고;
L은 링커(예를 들어, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커)이고;
a는 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)이며;
상기 "-"는 화학적 결합(예를 들어, 공유결합)일 수 있다.
보다 구체적으로, X와 L, 및 L과 F는 공유결합으로 서로 연결되는 것일 수 있으며, 이때 상기 결합체는 화학식 1의 순서로, X, L, 및 F가 공유결합을 통하여 각각 연결된 결합체일 수 있다.
또한, 상기 F는 X와 직접적으로 연결되거나 (즉, 상기 화학식 1에서 a가 0이거나), 또는 링커 (L)를 통해 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 결합체에서 F는 X, 즉 본 발명에 따른 GLP-2 유도체의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성에 해당한다.
상기 F는 X와 공유 화학결합 또는 비공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.
상기 F는 X의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질은 생체적합성 물질로서, 예를 들어, 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 엘라스틴의 경우 수용성 전구체인 인간 트로포엘라스틴 (tropoelastin) 일 수 있으며, 이들 중 일부 서열 혹은 일부 반복단위의 중합체일 수 있으며, 예컨대, 엘라스틴 유사 폴리펩타이드인 경우를 모두 포함하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고분자 중합체의 예로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류(예, 덱스트란), 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자 중합체를 들 수 있고, 상기 다당류로는 덱스트란이 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리에틸렌 글리콜은, 에틸렌 글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체 (mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 생체적합성 물질은 폴리-리신, 폴리-아스파르트산 및 폴리-글루탐산과 같은 폴리-아미노산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 지방산은 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 F의 한 예로서, 상기 F는 FcRn 결합 물질일 수 있고, 구체적으로, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으며, 보다 구체적으로 IgG Fc 영역, 더 구체적으로는 비당쇄화된 IgG4 Fc 영역일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 한 예로, 상기 F(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체이며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, L은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커(예를 들어, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커)일 수 있다.
상기 L이 펩타이드성 링커일 때, 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 F와 X를 연결하기 위하여 공지의 다양한 펩타이드 링커가 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로 [GS]x 링커, [GGGS]x 링커 및 [GGGGS]x 링커 등을 포함하며, 여기서 x는 1 이상의 자연수일 수 있다. 그러나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 비펩타이드성 링커는 말단에 반응기를 포함하여, 결합체를 구성하는 다른 구성 요소와 반응을 통해 결합체를 형성할 수 있다. 상기 비펩타이드성 링커는 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 비펩타이드성 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 비펩타이드성 링커는 비펩타이드성 중합체와 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 지방산, 사카라이드 (saccharide), 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 다당류는 덱스트란일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명에서 상기 고분자 중합체는 0 초과 약 100 kDa 범위, 구체적으로 약 1 내지 약 100 kDa 범위, 보다 더 구체적으로 약 1 내지 약 20 kDa 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류(예, 덱스트란 등), 폴리비닐 에틸에테르, PLA(polylactic acid) 및 PLGA(polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비펩타이드성 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜일 수 있고, 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 비펩타이드성 링커의 반복 단위는 에틸렌글리콜 반복 단위일 수 있고, 구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함하면서, 결합체의 제조에 이용되는 작용기를 말단에 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 결합체는 상기 작용기를 통해 X와 F가 연결된 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 비펩타이드성 링커는 2개, 또는 3개 이상의 작용기를 포함할 수 있고, 각 작용기는 동일하거나, 서로 상이할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 2로 표시되는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2021004162-appb-I000002
여기서, n = 10 내지 2400, n = 10 내지 480, 또는 n = 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지속형 결합체에서 PEG 모이어티는, -(CH2CH2O)n-구조 뿐만 아니라 연결 요소와 이 -(CH2CH2O)n- 사이에 개재하는 산소 원자도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 GLP-2와 면역글로불린 Fc 영역(F)이 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커를 통해 공유 결합으로 연결된 구조 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌 글리콜은, 에틸렌 글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체(mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있으나, 구체적으로 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 200 kDa 범위, 구체적으로, 약 1 내지 100 kDa 범위, 보다 구체적으로, 약 1 내지 50 kDa 범위, 보다 더 구체적으로, 약 1 내지 20kDa 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa 내지 10 kDa, 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 링커의 양 말단은 면역글로불린 Fc 영역의 티올기, 아미노기, 하이드록실기 및 GLP-2의 티올기, 아미노기, 아지드기, 하이드록실기에 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 양쪽 말단에 각각 면역글로불린 Fc 및 GLP-2 또는 이의 유도체와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 시스테인의 티올기; N-말단, 라이신, 아르지닌, 글루타민 및/또는 히스티딘에 위치한 아미노기; 및/또는 C-말단에 위치한 하이드록실기와 결합되고, GLP-2의 시스테인의 티올기; 라이신, 아르지닌, 글루타민 및/또는 히스티딘의 아미노기; 아지도라이신의 아지드기; 및/또는 하이드록실기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드 그룹으로 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 카르복시메틸, 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비펩타이드성 링커는 상기와 같은 반응기를 통해 면역글로불린 Fc 및 GLP-2 유도체에 연결되어, 비펩타이드성 중합체 연결부로 전환될 수 있다.
또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 링커의 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 상기 비펩타이드성 링커는 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것일 수 있고, 또한 상기 비펩타이드성 링커는 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 가질 수 있거나, 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 또 한 가지 예로, 한쪽 말단에는 석시니미딜 그룹을, 다른 쪽 말단에는 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다.
프로피온쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 링커로 이용하는 경우에는, 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 결합체를 제조할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 링커의 반응기가 GLP-2의 시스테인 잔기, 보다 구체적으로 시스테인의 -SH 기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
만약, 말레이미드-PEG-알데히드를 사용하는 경우, 말레이미드 기는 GLP-2 유도체의 -SH 기와 티오에테르(thioether) 결합으로 연결하고, 알데히드기는 면역글로불린 Fc의 -NH2 기와 환원적 알킬화 반응을 통해 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이는 하나의 일례에 해당한다.
이와 같은 환원적 알킬화를 통하여 PEG의 한쪽 말단에 위치한 산소 원자에 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 아미노기가 -CH2CH2CH2-의 구조를 가지는 링커 작용기를 통해 서로 연결되어, -PEG-O-CH2CH2CH2NH-면역글로불린 Fc와 같은 구조를 형성할 수 있고, 티오에테르 결합을 통하여 PEG의 한쪽 말단이 GLP-2의 시스테인에 위치한 황 원자에 연결된 구조를 형성할 수 있다. 상술한 티오에테르 결합은
Figure PCTKR2021004162-appb-I000003
의 구조를 포함할 수 있다.
그러나, 상술한 예에 특별히 제한되는 것은 아니며, 이는 하나의 일례에 해당한다.
또한, 상기 결합체에서, 비펩타이드성 링커의 반응기가 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치한 -NH2와 연결된 것일 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.
또한, 상기 결합체에서, GLP-2 유도체는 반응기를 갖는 비펩타이드성 링커와 C-말단을 통해 연결될 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.
본 발명에서 "C-말단"은, 펩타이드의 카르복시 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 비펩타이드성 중합체와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, C-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 지속형 결합체는 GLP-2 유도체와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F에 해당한다.
본 명세서에서 Fc 영역이라고 하면 면역글로불린의 파파인 소화에서 얻는 천연형 서열뿐 아니라 그 유도체, 예컨대 천연 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 변환되어 천연형과 상이하게 된 서열까지 망라하여 포함된다.
상기 F(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)는, 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결되어 있는 구조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소 원자를 통한 연결은 라이신의 입실론 아미노 원자나 N-말단 아미노기에 환원적 아민화를 통하여 연결될 수 있다.
환원적 아민화 반응이란 반응물의 아민기 또는 아미노기가 다른 반응물의 알데히드(즉, 환원적 아민화가 가능한 작용기)와 반응하여 아민을 생성한 다음, 환원 반응에 의해 아민 결합을 형성시키는 반응을 의미하여, 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 유기합성 반응이다.
본 발명의 GLP-2 지속형 결합체의 하나의 구체예로서, 상기 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 그 N-말단 질소 원자를 통하여 링커에 연결된 것일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "힌지 서열"은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 11).
상기 힌지 서열은 서열번호 11의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 12), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(서열번호 13), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 14), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(서열번호 15), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 16), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 17), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 18), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 19), Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 20), Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 21), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 22), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 23), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 24), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 25), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(서열번호 26), Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 27), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 28), Glu-Pro-Ser-Cys(서열번호 29), Ser-Cys-Pro(서열번호 30).
더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 21(Pro-Ser-Cys-Pro)또는 서열번호 30(Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 한 더욱 구체적인 형태에서, 상기 결합체내 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단은 프롤린이고, 이 결합체는 상기 프롤린의 질소 원자를 통하여 Fc 영역이 링커에 연결된 것이다.
본 발명의 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 한 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열이 존재함으로써 면역글로불린 Fc 영역의 사슬 두 개가 동종이합체(homodimer)나 이종이합체(heterodimer)를 형성한 이합체 형태일 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 결합체는 링커의 일 말단이 이합체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 또는 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이량체 형태 (dimeric form)일 수 있으며, 이량체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 공유결합적으로 연결될 수 있으며, 이때 상기 면역글로불린 Fc와 X는 비펩타이드성 중합체에 의해 서로 연결될 수 있다. 한편, 이량체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc와 X는 비펩타이드성 링커에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체예로서, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc의 단편으로서, 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합(inter-chain 형태)을 통해 2개의 단량체가 연결된 동종이량체(homodimer)일 수 있으며, 이 때 동종이량체는 각 단량체에서 35번 및 95번의 시스테인 사이 및 141번 및 199번의 시스테인 사이에 이황화 결합, 즉 2개의 이황화 결합(intra-chain 형태)을 가지거나/가지고, 각 단량체의 아미노산 수는 221개일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
각 단량체의 아미노산 수는 221개의 아미노산으로 구성될 수 있므며, 동종이합체를 형성하는 아미노산은 전체 442개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열(221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이합체를 형성하고, 상기 동종이합체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 천연형 GLP-2에 비해, 또는 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함하나 이에 제한되지 않는다.
한편, GLP-2 유도체 및 이의 지속형 결합체는 펩타이드 및 화합물 그 자체, 이의 염(예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다.
또한, 펩타이드, 화합물, GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산， 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드, 화합물 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
상기 GLP-2 유도체, 지속형 결합체, 및 이를 포함하는 조성물은, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료용일 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 GLP-2 유도체, GLP-2 유도체의 지속형 결합체, 및/또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발되는 점막염의 발병을 완전하게 또는 부분적으로 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 증세가 완전하게 또는 부분적으로 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미하고, 점막염 증상의 감소, 개선, 그 증상의 고통 경감, 점막염 발생율 감소 또는 치료결과를 증가시키는 환자의 기타 변화 등을 포함한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한편, 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에서 조성물은 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에서 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 본 발명의 조성물은 방사선요법 및/또는 화학요법과 함께, 순차적으로, 또는 역순으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 방사선요법 및/또는 화학요법 실시 전(예를 들어, 방사선요법 및/또는 화학요법 실시 전 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일 이내; 또는 1주 또는 한 달 이내)에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 구체적으로 본 발명의 조성물은 방사선요법 및/또는 화학요법 실시 후(예를 들어, 방사선요법 및/또는 화학요법 실시 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일 이내; 1주 또는 한 달 이내; 또는 1일(24시간) 째)에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체가 약학적 조성물에 약학적 유효량으로 포함된다는 것은, GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체로 인해 목적하는 약리 활성을 얻을 수 있는 정도를 의미하고, 또한 투여되는 개체에서 독성 또는 부작용이 일어나지 않거나 미미한 수준으로서 약학적으로 허용되는 수준을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 약학적 유효량은 투여 횟수, 환자, 제형 등을 종합적으로 고려하여 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여(single dose)로 환자에게 투여될 수도 있으며, 다중 투여(multiple dose)로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg, 약 0.001 mg 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 약 0.01 mg 내지 10 mg일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
그러나 상기 GLP-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하여, 본 발명의 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 GLP-2 유도체 및/또는 이의 지속형 결합체를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 또는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 식품조성물은 건강기능식품으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 보조첨가제로 사용할 경우, 상기 펩타이드 (펩타이드 자체 혹은 이의 지속형 결합체)를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "건강기능식품"이란, 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체 및/또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 조성물, 또는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 GLP-2 유도체는 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열(다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외함)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 개체는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발되는 점막염이 의심되는 개체로서, 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물일 수 있으나, 본 발명의 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체 및/또는 이를 포함하는 약학 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다. 또한, 본 발명의 개체에서 인간은 제외될 수 있으나, 이에 제한되지 않느다.
본 발명의 방법은 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체 및/또는 이를 포함하는 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체 및/또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 GLP-2, 이의 지속형 결합체, 조성물, 또는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 GLP-2 유도체는 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열(다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외함)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체 및/또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
상기 GLP-2 유도체, 이의 지속형 결합체, 또는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 GLP-2 유도체는 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열(다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외함)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GLP-2 유도체 지속형 결합체의 제조
표 1의 서열번호 4의 GLP-2 유도체 CA GLP-2 RK를 개질 폴리에틸렌글리콜인 ALD(2) PEG(양 말단의 수소가 프로필알데히드기(3-옥소프로필기)로 치환되고, 에틸렌글리콜 반복단위 부위(moiety)의 화학식량이 3.4 kDa인 개질 폴리에틸렌글리콜, 일본 NOF사)로 페길화시키기 위하여, GLP-2 유도체와 ALD(2) PEG의 몰비를 1:5~1:20으로, GLP-2 유도체 농도를 5~10 mg/ml로 하여, 2~8℃에서 4~16시간 반응시켰다. 이 때 반응은 20 mM 헤페스(HEPES) pH 7.5와 에탄올에서 이루어 졌으며 환원제인 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 구연산나트륨 pH 2.0, 에탄올이 포함된 완충 용액과 염화칼륨 농도 구배를 이용한 Source 15S(GE, 미국) 컬럼을 사용하여 모노 페길화된 GLP-2 유도체를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노 페길화된 GLP-2 유도체와 서열번호 32의 면역 글로불린 Fc 단편의 몰비가 1:2~1:6이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 30~35 mg/mL로 하여, 2~8℃에서 12~20시간 반응시켰다. 이때 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)과 아이소프로판올에 환원제로서 20mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
반응이 종결된 후 반응액은 비스-트리스(bis-Tris) pH 6.5 버퍼와 염화나트륨 농도 구배를 이용하여 Source15Q(GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산 암모늄과 구연산 나트륨 pH 5.0~5.2의 농도 구배를 이용하여 Source 15ISO(GE, 미국)에 적용하여, 면역글로불린 Fc 단편에 GLP-2 유도체가 폴리에틸렌글리콜 링커에 의해 공유결합으로 연결된 결합체인, GLP-2 유도체의 지속형 결합체를 정제하였다.
실시예 2: GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여에 따른 화학요법으로 유발된 위장관 점막염 모델 랫드의 소장 무게 증가 확인
상기 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여에 따른 in vivo 소장(Small intestine) 개선 효력을 측정하기 위하여, 화학요법(Docetaxel + Cyclophosphamide, TC)으로 위장관 점막염(gastrointestinal mucositis)이 유도된 랫드를 이용하였다.
구체적으로, 7주령의 수컷 랫드(SD rat)를 군당 3 마리씩, 정상 대조군(화학요법을 실시하지 않은 군, G1, (SHarm) Vehicle), 화학요법으로 유발된 위장관 점막염을 가진 대조군(G2, (TC) vehicle), 화학요법으로 위장관 점막염을 유발한 후 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체(3.1 mg/kg/QW(0.5 mg/kg/QM HED))를 투여한 군(G3, (TC) GLP-2 유도체의 지속형 결합체)으로 나누었다(본원에서 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여량으로 나타낸 수치는, 사용된 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 전체 질량에서 폴리에틸렌글리콜 링커 부위의 질량을 제외한 값, 즉 폴리펩타이드 부위들만의 질량을 합산한 값을 기준으로 표시한 수치이다). 그리고, G2와 G3에 Docetaxel 36 mg/kg과 Cyclophosphamide 300 mg/kg을 투여하여 위장관 점막염을 유발하였다(D0). 다음날(D1), 각 군에 vehicle 또는 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 피하로 단독 투여한 후 소장 무게를 D2, D3, 및 D4에 측정하였다.
그 결과 화학요법으로 유발된 위장관 점막염을 가진 대조군에 비해 GLP-2 유도체의 지속형 결합체를 투여한 군에서 짧은 시간 내 유의적으로 소장의 무게가 회복되는 것을 확인하였다(도 1).
이와 같은 결과는, 본 발명의 GLP-2 유도체 지속형 결합체가 소장의 빠른 회복을 통해 화학요법으로 유발된 위장관 점막염의 예방 및 치료에 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 3: GLP-2 유도체 및 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여에 따른 화학 요법으로 유발된 위장관 점막염 모델 랫드의 소장 무게 변화 확인
GLP-2 유도체 및 상기 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여에 따른 in vivo 소장 개선 효력을 측정하기 위하여, 화학 요법(Docetaxel + Cyclophosphamide, TC)으로 위장관 점막염이 유도된 랫드를 이용하였다. 상기 GLP-2 유도체의 대표예로 테두글루타이드(Teduglutide)를 선택하여 실험을 수행하였다.
구체적으로, 7주령의 수컷 랫드(SD rats)를 군당 5 마리씩, 정상 대조군(화학 요법을 실시하지 않은 군, G1, Vehicle), 화학요법으로 유발된 위장관 점막염을 가진 대조군(G2, (TC) vehicle), 화학요법으로 위장관 점막염의 유발(D0)과 동시에 GLP-2 유도체(Teduglutide 0.1 mg/kg/BID, Emax)를 투여한 군(G3, (TC) Teduglutide (D0)), 화학요법으로 위장관 점막염의 유발(D0)과 동시에 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체(3.1 mg/kg/QW(0.5 mg/kg/QM HED))를 투여한 군(G4, (TC) GLP-2 유도체 지속형 결합체 (D0)), 화학요법으로 위장관 점막염을 유발하기 하루 전(D-1)에 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체(3.1 mg/kg/QW (0.5 mg/kg/QM HED))를 투여한 군(G5, (TC) GLP-2 유도체 지속형 결합체 (D-1))로 나누었다. 그리고 화학요법으로 위장관 점막염을 유발한 군들은 Docetaxel 36 mg/kg과 Cyclophosphamide 300 mg/kg을 투여하여 위장관 점막염을 유발하였다.
그 결과 GLP-2 유도체를 투여한 군(G3)보다 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 투여한 군(G4)에서 화학요법으로 유발된 위장관 점막염에 의한 소장의 무게 감소가 유의적으로 적고, 회복에 따른 소장의 무게 증가가 유의적으로 크다는 것을 확인하였다(도 2, A). 그리고 화학요법으로 위장관 점막염을 유도하기 하루 전(D-1)에 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 투여군(G5, (TC) GLP-2 유도체의 지속형 결합체 (D-1))와 화학요법으로 위장관 점막염의 유발(D0)과 동시에 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 투여한 군(G4, (TC) GLP-2 유도체 지속형 결합체 (D0))을 비교하였을 때, 화학요법으로 위장관 점막염을 유도하기 하루 전에 GLP-2 유도체 지속형 결합체를 투여하는 것이 화학요법에 의한 소장의 무게 감소가 유의적으로 적은 것을 확인하였다 (도 2, B).
이와 같은 결과는, 본 발명의 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여가 GLP-2 유도체 투여보다 소장의 손상 예방과 빠른 회복을 통해 화학 요법에 의한 위장관 점막염에 우수한 예방적 또는 치료적 효력을 나타낼 수 있음을 시사하고, GLP-2 유도체 지속형 결합체의 투여가 화학요법 하루 전에 이루어 지면 더 높은 예방 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 4: GLP-2 유도체 지속형 결합체의 THP-1 세포(Monocyte)에서의 M1 분극화 억제, 대식세포 분화 억제, 단핵구 이동 억제 효과 확인
상기 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체의 THP-1 세포(Monocyte)에서의 M1 분극화(M1 polarization) 억제, 대식세포 분화(Macrophage differentiation) 억제, 단핵구 이동(monocyte migration) 억제 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 in vitro 실험을 진행하였다.
[M1 분극화 억제 확인 실험]
THP-1 세포에 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체(10 μM)를 4시간 동안 처리하였다. 그리고 염증을 유도하기 위해 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharides, LPS) 1 μg/mL을 2시간 동안 처리한 후 RNA를 추출하여 pro-inflammatory cytokine(M1 분극화)인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 mRNA 발현양을 qPCR을 통해 측정하였다.
[대식세포 분화 억제 확인 실험]
THP-1 세포에 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체(10 μM)와 함께 THP-1 분화를 유도하기 위한 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 48시간 동안 처리하였다. 그리고 대식세포로 분화된 세포인 부착 세포(adherent cell)을 계수하였다.
[단핵구 이동 억제 실험]
THP-1 세포에 실시예 1에서 제조된 GLP-2 유도체 지속형 결합체(10 μM)를 48시간 동안 처리하였다. 그리고 약물이 처리된 THP-1 세포를 보이든 챔버(Boyden chamber)의 위쪽 챔버(upper chamber)에 옮긴 후 아래 쪽 챔버(bottom chamber)로의 이동을 유도할 수 있는 CCL-2 50 ng/mL을 넣고 4시간 동안 배양하였다. 그리고 migration assay kit(abcam)를 사용하여 이동의 정도를 측정하였다.
상기 실험을 통하여 GLP-2 유도체 지속형 결합체 각각의 M1 분극화 억제(도 3, A), 대식세포 분화 억제(도 3, B), 단핵구 이동 억제(도3, C) 효과를 확인하였다.
이와 같은 결과는, 본 발명의 GLP-2 유도체 지속형 결합체가 염증을 억제하고, 단핵구가 염증을 유발하는 대식세포로 분화하는 것을 억제하고, 단핵구가 염증 부위로 이동하는 것을 억제할 수 있어, 위장관 점막염의 예방 및 치료에 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    약학적으로 허용되는 부형제; 와
    글루카곤 유사 펩타이드-2(Glucagon-like peptide-2, GLP-2) 유도체를 약학적 유효량으로 포함하고, 상기 GLP-2 유도체는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물:
    [일반식 1]
    X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34 (서열번호 10)
    여기서,
    X1은 히스티딘, 이미다조아세틸데스히스티딘, 데스아미노히스티딘, β-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딘, N-디메틸히스티딘, 또는 β-카복시이미다조프로피온일데스히스티딘이고;
    X2는 알라닌, 글라이신, 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)이며;
    X30은 라이신 또는 아르지닌이고;
    X34는 하나 이상의 임의의 아미노산 또는 변형이 일어난 하나 이상의 임의의 아미노산이고;
    다만, 일반식 1의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물:
    [일반식 2]
    X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34 (서열번호 9)
    여기서,
    X1은 히스티딘, 이미다조아세틸데스히스티딘, 데스아미노히스티딘, β-히드록시이미다조프로피온일데스히스티딘, N-디메틸히스티딘, 또는 β-카복시이미다조프로피온일데스히스티딘이고;
    X2는 알라닌, 글라이신, 또는 Aib(2-aminoisobutyric acid)이며;
    X30은 라이신 또는 아르지닌이고;
    X34는 부존재하거나, 라이신, 아르지닌, 글루타민, 히스티딘, 6-아지도라이신, 또는 시스테인이고;
    다만, 일반식 2의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1과 동일한 서열은 제외한다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는
    (1) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인이거나,
    (2) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 라이신이거나,
    (3) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 아르지닌이고, X34가 라이신이거나,
    (4) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 라이신이고, X34가 6-아지도라이신이거나,
    (5) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 글라이신이고, X30이 아르지닌이고, X34가 시스테인이거나,
    (6) X1이 이미다조아세틸데스히스티딘이고, X2가 Aib이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인이거나, 또는
    (7) X1이 히스티딘이고, X2가 Aib이고, X30이 라이신이고, X34가 시스테인인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 서열번호 2 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 이의 C-말단이 변형되지 않았거나 아미드화된, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 점막염은 구강 점막염, 위장관 점막염, 또는 이들의 조합인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화학요법은 항암제를 이용한 화학요법인, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항암제는 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제, 또는 이들의 조합인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포독성 항암제는 뉴클레오시드 아날로그, 엽산길항제(antifolate), 대사길항제(antimetabolite), 토포이소머라아제 I (Topoisomerase I) 저해제, 안트라사이클린, 포도필로톡신, 탁산, 빈카 알카로이드, 알킬화제, 백금 화합물 또는 이들의 조합인, 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항암제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, CPA), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 프리드니손(Prednisone), 에토포시드(Etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 젬시타빈Glemcitabine), 비노렐빈(Vinorelbine), 류코보린(Leucovorin), 이리노테칸(Irinotecan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 또는 이들의 조합인, 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선요법 또는 화학요법 실시 전 1일 이내에; 또는 방사선요법 또는 화학요법 실시 후 1일 이내에 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 투여된 개체에서 소장 무게 증가, 소장 무게 감소 수준의 저하, 염증 억제, 단핵구의 대식세포로의 분화 억제, 및 단핵구의 이동 억제 중 하나 이상을 야기하는 것인, 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLP-2 유도체는 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질이 결합된, 지속형 결합체의 형태인, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는, 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    X - La - F
    여기서,
    X는 GLP-2 유도체이고;
    L은, 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며;
    a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
    F는, 면역글로불린 Fc 영역이며;
    상기 "-"는 공유결합임.
  15. 제14항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 IgG4 Fc 영역인, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이합체이며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩타이드 사슬에만 연결되어 있는, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 L은 폴리에틸렌 글리콜인, 약학적 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 L 내의 에틸렌글리콜 반복 단위 부위의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는, 약학적 조성물.
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