WO2023222986A1

WO2023222986A1 - Procédé de préparation de glycolipides, glycolipides et leurs utilisations

Info

Publication number: WO2023222986A1
Application number: PCT/FR2023/050717
Authority: WO
Inventors: Etienne Severac; Magali Remaud-Simeon; David GUIEYSSE; Claire Moulis; Didier Pintori; Vanessa KOMOROWSKI; Chrystel Faure; Fernando Leal Calderon
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA; Universite de Bordeaux; Institut Polytechnique de Bordeaux; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA; Universite de Bordeaux; Institut Polytechnique de Bordeaux; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2023-05-17
Publication date: 2023-11-23
Anticipated expiration: 2024-11-18
Also published as: EP4526316A1; CA3253702A1; AU2023272330A1; US20250305017A1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'au moins un glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) [Glc]n représentant un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles-ci sont liées entre elles par des liaisons osidiques de type α; R représentant un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, -xOy- symbolisant le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d'un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l'atome du résidu glucosyle sur lequel s'effectue la liaison, Cx représentant l'atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l'extrémité oméga de celle-ci; ledit procédé comprenant une étape de glucosylation d'un acide gras hydroxylé de formule (II) : R-yOH (II) -yOH représentant un groupe hydroxyle rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci-dessus; ladite étape comprenant la mise en contact de l'acide gras hydroxylé de formule (II) avec au moins une α-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d'un analogue de saccharose.

Description

PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE GLYCOLIPIDES, GLYCOLIPIDES ET LEURS UTILISATIONS

La présente invention se rapporte au domaine de la préparation par voie enzymatique de glycolipides. La présente invention se rapporte également à des glycolipides et à leurs utilisations.

Les glycolipides sont des composés comprenant une partie osidique et une partie lipidique. Les glycolipides peuvent être d’origine naturelle ou biosynthétique. Les glycolipides présentent une certaine attractivité de par leur caractère amphiphile et de par leurs propriétés de solubilité.

Les glycolipides naturels sont majoritairement des sophorolipides, constitués d’une entité sophorose (disaccharide de glucose à liaison 0-1 ,2) et d’une chaîne d’acide gras C16 ou C18 avec une insaturation. Une autre catégorie de glycolipides naturels est représentée par celles des rhamnolipides constitués d’une ou deux unités rhamnosyle liées à une queue grasse d'acide 3-(hydroxyalcanoyloxy)-alcanoïque (acides gras en C10 essentiellement).

Les glycolipides synthétiques sont majoritairement des esters de carbohydrates (glucose, saccharose, maltose) encore appelés sucroesters, dans lesquels la partie osidique et la partie lipidique sont reliées par une liaison ester, ou bien des alkyl-(poly-)glucosides encore appelés polyglucosides d’alkyle, dans lesquels la partie osidique et la partie lipidique sont reliées par une liaison éther.

Actuellement, les glycolipides sont classiquement synthétisés via des voies chimiques. Par exemple, les procédures les plus communes de synthèse d’alkyl-(poly-)glycosides incluent la méthode de Fischer, de Koenig-Knorr ou celle de Schmidt.

La méthode de Fischer est la plus largement utilisée en industrie. Elle permet la production d’alkyl-polyglucosides de courte chaine en une seule étape. Le carbohydrate est solubilisé dans un excès d’alcool en présence d’un catalyseur acide (acide sulfonique, acide chlorhydrique) et à température élevée (von Rybinski et Hill, Angew. Chem. Int. Ed. 37, 1328-1345,1998). L’obtention d’APGs de plus grandes tailles nécessite une étape supplémentaire dans laquelle un alkyle de petite taille (en général butyl) est échangé avec un alcool de degré supérieur permettant ainsi de contourner les problèmes de solubilité des réactifs. Cette méthode de synthèse est efficace mais les catalyseurs acides sont difficiles à recycler. De plus, elle est difficilement applicable à l’obtention de dérivés di- ou tri- glycosylés en raison d’une réaction compétitive d’alcoolyse des liaisons interglycosidiques (Koto et al., Simple preparations of alkyl and cycloalkyl a-glycosides of maltose, cellobiose and lactose, Carbohydr. Res. 339, 2415-2424, 2004).

La synthèse chimique de glycolipides du type alkyl-polyglucosides implique donc une multitude d’étapes de réaction incluant des étapes de protection/déprotection des carbohydrates ; l’utilisation de catalyseurs acides, alcalins ou métalliques et de grandes quantités de solvants à recycler ; des risques de réactions secondaires du fait de la réactivité des catalyseurs et des conditions drastiques de synthèse ; la formation des deux anomères dans les produits de glycosylation qui sont difficiles à séparer.

La biosynthèse de glycolipides à liaison éther est possible par voie enzymatique. Les enzymes les plus étudiées dans cette optique sont celles de la famille des p-glycosidases. Ces dernières sont des enzymes sans co-facteur qui hydrolysent naturellement des liaisons osidiques présentes dans les polysaccharides pour produire des mono- ou des oligosaccharides. In vitro, ces enzymes sont capables d’utiliser un donneur de glycosylé et de catalyser le transfert du glycosylé sur un hydroxyle libre d’une molécule acceptrice et ainsi catalyser la formation d’une liaison éther entre la molécule acceptrice et le résidu glycosylé. La synthèse des alkyl-polyglucosides catalysée par les p-glycosidases conserve en général une liaison de configuration p entre les sucres et la partie alkyle (P-alkyl- polyglucosides).

Cette synthèse est possible soit par réversion d’hydrolyse soit par transglycosylation.

Dans l’approche par réversion d’hydrolyse, les donneurs de glycosylé sont des polysaccharides ou des carbohydrates tels que l’amidon, la cellulose, le saccharose ou le glucose. Dans ce cas, l’équilibre thermodynamique est plutôt favorable à l’hydrolyse, les rendements de production d’alkyl-polyglucosides sont donc en général très modestes. Par exemple, plusieurs équipes travaillant sur la p-glucosidase d’amande ont obtenu des rendements de production inférieurs à 62% avec des alcools de courtes chaînes (i.e. méthylglucoside/xyloside ou éthylglucoside/xyloside). Les rendements avec des alcools de plus longues chaînes (nombre de carbone supérieur à 6) sont encore plus faibles et compris entre 1 et 13 % (Drouet et al., Biotechnol. Bioeng. 43, 1075-1080, 1994 ; Vie et al., Enzyme Microb. Technol. 20, 597-603, 1997 ; Yan et Liau, Biotechnol. Lett. 20, 653-657, 1998).

D’autres familles d’enzymes ont permis l’obtention d’alkyl-polyglycosides.

Bousquet et al. ont montré la possibilité d’obtenir des a-alkyl-polyglucosides en utilisant l’a- transglucosidase d'Aspergillus niger (Bousquet et al., Bucke, C. (Ed.), Carbohydrate Biotechnology Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 291-296, 1999) ou de Talaromyces dupont! (Bousquet et al., Enzyme Microb. Technol. 23, 83-90, 1998). Ainsi de l’a-butyl- glucoside a été obtenu par réaction de transfert d’unités glucosyle issues de maltodextrines sur du butanol dans un milieu biphasique.

Dahiya et collaborateurs ont réussi à produire des 1-O-alkylyl-a-D-mono, di- et tri- glucopyranosides (a-alkyl-polyglycosides) à partir d’hexanol ou d’octanol et de saccharose en utilisant une souche de Microbacterium paraoxydans présentant une activité de transglycosylation membranaire de type amylosaccharase avec un rendement maximum de 14,8 % (Dahiya et al., Biotechnol. Lett. 37, 1431-1437, 2015).

Ochs et collaborateur, 2011 , ont montré la possibilité de produire des pentyl- et octyl- polyxylosides (alkyl-polyxylosides) par réaction de transglycosylation entre le pentanol ou l’octanol et des xylanes issus du bois de bouleau catalysée par différentes xylanases dont celle de Thermobacillus xylanaticus (Ochs et al., Green Chem. 13, 2380-2388, 2011 ; Rémond et al., FR2967164, 2012).

Quelques Glucane-Saccharases (GS) des familles 13 et 70 des Glycosides Hydrolases (GH13 et GH70) ont été utilisées dans des réactions d’accepteurs dans le but d’allonger la partie glucidique d’alkyl monoglucosides à groupe alkyle court (1 à 8 atomes de carbone) à partir de saccharose.

Des GS des GH70 ont également été utilisées dans des réactions de glucosylation directe d’alcools. En effet, Seibel et collaborateur ont montré la capacité de la dextrane saccharase de Streptococcus oralis GTFR à glucosyler des alcools allant du (chloro-) méthanol au (4- chloro)-1 -butanol (Seibel et al., ChemBioChem 7, 310-320, 2006). Par ailleurs, Kim et collaborateurs ont montré, lors d’essai de glucosylation d’alcools courts de 1 à 4 atomes de carbone, une préférence de la dextrane saccharase de L. mesenteroides B-1299CB pour les alcools primaires par rapport aux alcools secondaires, les alcools tertiaires n’ayant pu être convertis (Kim et al., Biotechnol. Lett. 31 , 1433-1438, 2009).

Toutefois, la plupart des procédés enzymatiques connus sont limités car ils permettent rarement l’obtention de glycolipides ayant des chaînes carbonées comprenant plus de 8 atomes de carbone.

Il existe donc un besoin pour un procédé économique et simple à mettre en oeuvre à l’échelle industrielle, qui permette de préparer des glycolipides ayant de nouvelles architectures moléculaires particulières, en particulier des glycolipides à structure bolaamphiphiles, qui sont susceptibles de trouver des applications dans des domaines tels que la pharmacie, la cosmétique, la chimie fine, le biocontrôle, le phytosanitaire, la dépollution ou encore l’agroalimentaire.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

[Fig.1 ] représente le criblage d’a-transglucosylases de la famille GH70 pour leur capacité à glucosyler l’Acide 11-[(2-Hydroxy-Ethyl) Sulfanyl)]-llndécanoique (AHESU). Détermination du taux de conversion de l’accepteur lipidique dans les conditions testées : [AHESU] = 10 mM, [saccharose] = 292 mM, DMSO = 10% v/v ; Tampon Acétate de sodium 50 mM pH=5,75, Activité enzymatique = 1 U.mL'¹, T = 30°C.

[Fig. 2] représente le criblage d’a-transglucosylases de la famille GH70 pour leur capacité à glucosyler l’Acide 11-HydroxyUnDecanoique (AHUD). Détermination du taux de conversion de l’accepteur lipidique dans les conditions testées : [AHUD] = 10 mM ; [Saccharose] = 292 mM ; DMSO = 10% v/v ; Tampon Acétate de sodium 50 mM pH=5,75, Activité enzymatique = 1 U.mL'¹, T = 30°C.

[Fig. 3] représente le criblage d’a-transglucosylases de la famille GH70 pour leur capacité à glucosyler l’Acide Erythro-Aleuritique (AEA). Détermination du taux de conversion des accepteurs lipidiques dans les conditions testées : [AEA] = 10mM ; [saccharose] = 292 mM ; DMSO = 10% v/v ; tampon acétate de sodium 50 mM pH=5,75, Activité enzymatique = 1 U.mL'¹, T = 30°C. [Fig. 4] illustre une comparaison des profils de produits de glucosylation de l’acide 11 -[(2- hydroxy-ethyl) sulfanyl)]-undécanoïque (AHESll) par les enzymes de branchement BRS- A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E et GBD-CD2 AN 123. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AHESU, 10% v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les chiffres 1 à 6 représentent les produits de glucosylation majeurs. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1 ).

[Fig. 5] illustre une comparaison des profils de produits de glucosylation de l’acide 11- hydroxy-undécanoïque (AHUD) synthétisés par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AHUD, 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de synthèse de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1.

[Fig.6] représente une comparaison des profils de produits de glucosylation de l’acide érythro-aleuritique (AEA) synthétisés par les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AEA, 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les chiffres 1 à 16 représentent les pics de produits de glucosylation majeurs. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de synthèse de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD- CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1.

[Fig. 7] représente le taux de conversion de l’acide 11-[(2-hydroxy-ethyl) sulfanyl)]- undécanoïque (AHESU) obtenus lors de sa glucosylation par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 en fonction de la concentration initiale de saccharose. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de concentrations croissantes de saccharose ; 10 mM d’acide 11-[(2-hydroxy- ethyl) sulfanyl)]-undécanoïque ; 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. [Fig. 8] représente le taux de conversion de l’AHUD obtenus lors de sa glucosylation par les enzymes de branchements BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD- CD2 AN 123 en fonction de la concentration initiale de saccharose. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de concentrations croissantes de saccharose ; 10 mM d’AHUD ; 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75.

[Fig. 9] représente le taux de conversion de l’acide érythro-aleuritique (AEA) obtenus lors de sa glucosylation par les enzymes de branchements BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 en fonction de la concentration initiale de saccharose. Réactions réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de concentrations croissantes de saccharose ; 10 mM d’AEA ; 10% v/v de DMSO, 1 II. mL'¹ d’activité enzymatique en réaction et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75.

[Fig. 10] représente un chromatogramme des produits de glucosylation de l’acide 11-[(2- hydroxy-ethyl) sulfanyl)]-undécanoïque (AHESll) obtenus avec l’enzyme BRS-A après élimination des sucres libres par chromatographie sur résine Purasorb PAD910.

[Fig. 11] représente un chromatogramme des produits de glucosylation de l’acide 11- hydroxyundécanoïque (AHIID) après élimination des sucres libres par flash chromatographie et analyse en spectrométrie de masse des produits purifiés correspondants aux pics 1 et 2 (produits de glucosylation n°1 et n°2).

[Fig. 12] représente un chromatogramme des produits de glucosylation de l’acide érythro- aleuritique (AEA) après pré-purification (élimination des sucres libres) par chromatographie flash et analyse en spectrométrie de masse des produits purifiés.

[Fig.13A] [Fig. 13B] [Fig.13C] représentent le profil de glucosylation de l’acide 12- hydroxydodécanoïque (AHDD) ([Fig.13A]), de l’acide 15-hydroxypentadécanoïque(AHPD) ([Fig. 13B]) et de l’acide 16-hydroxy-hexadécanoïque (AHHD) ([Fig.13C]) par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123.

[Fig. 14A] [Fig. 14B] représentent le profil de glucosylation de l’acide 9, 10 dihydroxyoctanoïque (ADHO) (Figure 14A) et de l’acide 9, 10, 12 trihydroxyoctadécanoïque (ATHO) (Figure 14B) par les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123. Réactions réalisées à 37°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 877 mM de saccharose, 5 mM d’acide gras, une activité enzymatique de 1 U.mL'¹, 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75. Les enzymes sont regroupées en fonction de leur spécificité de synthèse de liaison osidique sur les dextranes i.e. a-1 ,2 pour BRS-A, BRS-D A1 , GBD- CD2 AN123 ou a-1 ,3 pour BRS-B A1 , BRS-C, BRS-E A1.

[Fig. 15] illustre la caractérisation à JO des émulsions constituées d’une solution aqueuse à 2 % de Glc-AHESU et de 20 % massique de dodécane, aux différents pH étudiés. Le D(4,3) représente le diamètre moyen en volume et P la polydispersité.

[Fig. 16] illustre le suivi de stabilité sur 14 jours d’émulsions dont la phase aqueuse comprend 2 % en poids de Glc-AHESU (H/E 20/80). La taille des gouttes est déterminée par granulométrie et confirmée par microscopie optique.

[Fig. 17] : Etude de la déstabilisation de l’émulsion (2% Glc-AHESU dans eau/dodécane 80/20). A gauche, l’émulsion est fabriquée et maintenue à pH=6. A droite, l’émulsion est fabriquée à pH=6 puis ajustée à pH=2 à l’aide d’une solution d’HCI à 0,1 M.

[Fig.18] illustre la caractérisation à J0 des émulsions constituées d’une solution aqueuse à 2 % de Glc-AHUD et de 20 % massique de dodécane, aux différents pH étudiés. Le D(4,3) représente le diamètre moyen en volume et P la polydispersité.

[Fig. 19] : Suivi de stabilité sur plusieurs semaines des émulsions contenant 2 % de tensio- actif (H/E 20/80). La taille des gouttes est déterminée par granulométrie et confirmée par microscopie optique.

[Fig. 20] illustre la déstabilisation de l’émulsion (2 % GAH dans eau/Dodécane 80/20). A gauche, l’émulsion est fabriquée et maintenue à pH=6. A droite, l’émulsion est fabriquée à pH=6 puis ajustée à pH=2 à l’aide d’une solution d’HCI à 0,1 M. GAH = forme glucosylée de l’AHED

[Fig. 21] représente l’influence de l’hydrophobicité du support, de la nature de l’huile, l’évaporation, la taille et la concentration des gouttes sur l’intensité des phénomènes observés lors du dépôt d’une goutte d’émulsion sur un support solide. [Fig. 22] montre l’aspect macroscopique de l’émulsion primaire (a), l’aspect macroscopique de l'émulsion sèche (poudre) (b), l’observation microscopique de l’émulsion avant séchage (c), l’observation microscopique de l’émulsion après séchage et redispersion dans l’eau (d) ; la mesure de la distribution de la taille des gouttelettes avant séchage et après séchage puis redispersion dans l’eau (e).

[Fig. 23] représente le suivi de cultures d’E. coli K12 (DO 600 nm) en présence de concentration de 0 % w/v (O), 0.5 % w/v (□), 1 % w/v (A), 2 % w/v (X) et 2.5 % w/v (*) de produits de glucosylation (A) de l’AHUD et de l’AEA (B) en phase aqueuse.

BREVE DESCRIPTION SELON L’INVENTION

Un but de la présente invention est de pallier les inconvénients de l’art antérieur et de fournir un procédé de préparation d’un glycolipide de formule (I) par catalyse enzymatique.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des a-transglucosylases sont capable de glucosyler des acides gras hydroxylés.

Un avantage du procédé selon l’invention est qu’il utilise des substrats renouvelables et bon marché, à savoir le saccharose ou l’un de ses analogues et des acides gras hydroxylés biosourcés.

Le procédé a également pour avantage qu’il permet d’obtenir des glycolipides ayant une structure de type bolaamphiphile (i.e. constitués de deux parties polaires séparées par une partie hydrophobe) ce qui laisse présager de propriétés tensio-actives et biologiques intéressantes. Les glycolipides selon l’invention se distinguent cependant des sophorolipides en ce que leur motif osidique peut comprendre une seule unité glucosyle ou bien plusieurs unités glucosyle reliées par des liaisons a dont on peut moduler la nature (a-1 ,2 et/ou a-1 ,3 et/ou a-1 ,4 et/ou a-1 ,6) en fonction de l’a-transglucosylase utilisée.

De manière importante, le procédé selon l’invention permet de préparer des glycolipides bolaamphiphile dont la partie hydrophobe comprend une chaine carbonée de taille importante, typiquement supérieure à 8 atomes de carbone, pouvant être interrompue par au moins un groupe sulfanyle, et substituée par exemple par au moins un groupe hydroxyle. Le procédé selon l’invention permet donc d’obtenir une grande diversité de glycolipides en termes de taille de leur partie hydrophobe et de structure de leur partie glucosidique.

Cette diversité est très avantageuse pour produire de nouveaux glycolipides d'intérêt utiles dans des domaines tel que la pharmacie, la cosmétique, la chimie fine, le biocontrôle, le phytosanitaire, la dépollution ou encore l’agroalimentaire.

Un autre but selon l’invention est de fournir des glycolipides, en particulier des glycolipides bolaamphiphiles d’une grande diversité d’architecture moléculaire, et pouvant être utiles à titre d’agent tensioactif ou d’agent antimicrobien, notamment d’agent antibactérien.

Ces buts sont atteints par l’invention qui va être décrite ci-après.

Ainsi, un objet selon l’invention a pour objet un procédé de préparation d’au moins un glycolipide répondant à la formule (I) :

[Glc]_n-xOy-R (I) dans laquelle

[Glc]_n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles-ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ;

R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol,

-xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Gy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci ; ledit procédé comprenant une étape de glucosylation d’un acide gras hydroxylé de formule (II) :

R-yOH (II) dans laquelle

R est un radical acide gras tel que défini dans la formule (I),

-yOH représente un groupe hydroxylé rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci-dessus ; ladite étape comprenant la mise en contact de l’acide gras hydroxylé de formule (II) avec au moins une a-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d’un analogue de saccharose.

Un autre objet selon l’invention concerne un glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]_n-xOy-R (I) dans laquelle

R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxylé, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol,

-xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxylé, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxylé, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci.

Un autre objet selon l’invention concerne l’utilisation d’un glycolipide selon l’invention, à titre d’agent tensioactif. Un autre objet selon l’invention concerne l’utilisation d’un glycolipide selon l’invention tel que défini ci-dessus, à titre de d’agent antimicrobien.

Un autre objet selon l’invention concerne une émulsion huile-dans-eau comprenant une phase huileuse dispersée dans une phase aqueuse et au moins un glycolipide de formule (I) selon l’invention, caractérisée en ce que l’émulsion est cinétiquement stable lorsque le pH de la phase aqueuse est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pH_s avantageusement compris entre 2 et 5.

Un autre objet concerne utilisation d’une émulsion selon l’invention pour le nettoyage de surfaces.

DESCRIPTION DETAILLEE SELON L’INVENTION

Procédé de préparation d’au moins un glycolipide selon l’invention

Dans le cadre de la présente invention, les expressions « glycolipide de formule (I) », « glycolipide », « glycolipide selon l’invention » peuvent être utilisées de manière interchangeable. Dans le présent document, les termes « glycolipide » et « glucolipide » peuvent être utilisés de manière interchangeable.

Dans le cadre de la présente invention, les expressions « acide gras hydroxylé de formule (II) », « acide gras hydroxylé » et « acide gras hydroxylé selon l’invention » peuvent être utilisées de manière interchangeable.

Motif osidique

Selon l’invention, l’expression « motif osidique », désigne un polymère linéaire ou ramifié constitué d’unités glucosyle liées entre elles par des liaisons osidiques.

Selon l’invention, les termes « liaison osidique » ou « liaison glucosidique » peuvent être utilisés indifféremment et désignent un lien covalent qui lie un glucosyle à un autre glucosyle adjacent au sein du motif osidique. Le motif osidique [Glc]_n correspond aux n unités glucosyle greffées lors de l’étape de glucosylation au niveau du carbone Cy de l’acide gras hydroxylé selon l’invention par l’a- transglucosylase de la famille GH70. n représente le nombre d'unités glucosyle dans le motif osidique [Glc]_n du glycolipide selon l’invention, n est avantageusement compris entre 1 et 7, de préférence est compris entre 1 et 4. De manière préférée, n est égal à 1 ou 2.

Dans un mode de réalisation particulier, le glycolipide selon l’invention est un glycolipide dont le motif osidique comporte plusieurs unités glucosyle. Avantageusement, le glycolipide selon l’invention est tel que n est compris entre 2 et 7, de préférence entre 2 et 4.

Liaisons au sein du motif osidique

Selon l’invention, l’expression « liaison a » désigne un lien covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle dans sa configuration a ; l’expression « liaison 0 » désigne un lien covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle dans sa configuration 0.

Lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle, celles-ci sont liées entre elles par une liaison osidique a. De manière avantageuse, le choix du type a- transglucosylase de la famille GH70 permet de moduler le type de liaison au sein du motif osidique.

La ou les liaison(s) osidique(s) au sein du motif osidique sont avantageusement choisie(s) parmi une liaison osidique a-1 ,2, une liaison a-1 ,3, une liaison a-1 ,4 ou une liaison a-1 ,6, ou un mélange de celles-ci ; de préférence encore choisie(s) parmi une liaison a-1 ,2, une liaison a-1 ,3, une liaison a-1 ,4, une liaison a-1 ,6 ou un mélange de celles-ci.

Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,3 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone 03 d’une autre unité glucosyle adjacente. Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,2 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone 01 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi- acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone C2 d’une autre unité glucosyle adjacente. Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,4 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone C4 d’une autre unité glucosyle adjacente. Selon l’invention, le terme « liaison a-1 ,6 » désigne le lien éther covalent qui lie l’atome de carbone C1 d’une unité glucosyle anciennement porteur de la fonction hémi-acétal dans sa configuration a et l’hydroxyle porté par le carbone C6 d’une autre unité glucosyle adjacente.

Les unités a-glucosyle sont de préférence des unités a-D-glucosyle.

L’analyse des liaisons osidiques peut être réalisée par des méthodes connues de l’homme du métier.

Par exemple, les liaisons osidiques au sein du motif osidique peuvent être analysées par résonance magnétique nucléaire (RMN) ou par spectrométrie de masse (MS).

Liaison entre le motif osidique et le radical acide gras

-xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hémiacétal, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci.

Au sens de la présente invention, la position des atomes de carbone d’une unité glucosyle est numérotée de sorte à ce que l'atome de carbone C1 d’une unité glucosyle soit l’atome de carbone qui porte la fonction aldéhyde -CHO sous la forme ouverte de cette unité glucosyle.

Au sens de la présente invention, la position des atomes de carbone du radical acide gras est numérotée de sorte à ce que C’1 représente l’atome de carbone de la fonction acide carboxylique du radical acide gras. Au sens de la présente invention, l’extrémité oméga du radical acide gras est l’extrémité terminée par un carbone dit carbone oméga dont la position est opposée au carbone portant le groupe acide carboxylique du radical acide gras.

Au sein du glycolipide selon l’invention, l’unité glucosyle adjacente au radical acide gras est avantageusement liée au radical acide gras par une liaison a.

En d’autres termes, dans le glycolipide de formule (I), l’unité glucosyle adjacente au radical acide gras est de préférence en configuration a.

L’analyse de la liaison entre le motif osidique et le radical acide gras peut être réalisée grâce à n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, par exemple par résonance magnétique nucléaire (RMN).

Radical Acide gras

Avantageusement, le radical acide gras comprend au moins 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 atomes de carbone. Avantageusement, le radical acide gras comprend au plus 24 atomes de carbone. Avantageusement, le radical acide gras comprend entre 6 et 24 atomes de carbone, entre 7 et 24 atomes de carbone, entre 8 et 24 atomes de carbone, entre 9 et 24 atomes de carbone, entre 10 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 20 atomes de carbone.

Selon un mode de réalisation particulier, le radical R peut être représenté par la formule générale suivante :

dans laquelle o la ligne ondulée*^ représente le point d’attachement à -xOy- o C_y est tel que défini ci-dessus et o R^a représente H ou une chaine carbonée comprenant entre 1 et 22 atomes de carbone, ladite chaine étant linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, o R^b représente une chaine carbonée comprenant entre 1 et 22 atomes de carbone, ladite chaine étant linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, o étant entendu que la somme des atomes de carbone compris dans les deux radicaux R^a et R^b est comprise entre 2 et 22, et de préférence entre 4 et 22.

De préférence, R^a représente H (cas où Cy est le carbone à l’extrémité omega du radical acide gras) ou une chaine carbonée linéaire, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol (cas où Cy est un carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras) et R^b représente une chaine carbonée linéaire, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol.

Selon un mode de réalisation particulier, la chaine carbonée du radical acide gras est linéaire, c’est-à-dire que Cy est le carbone à l’extrémité omega du radical acide gras. Dans ce mode de réalisation, R^a représente H et R^b représente une chaine carbonée linéaire comprenant entre 2 et 22 atomes de carbone et de préférence entre 4 et 22 atomes de carbone, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol.

Selon un mode de réalisation préféré, lorsque le radical acide gras comprend un substituant amine (groupe NH ou NH2), ce groupe amine ne se situe pas en position a par rapport à la fonction carboxyle. De préférence, le(s) éventuel(s) substituant(s) de la chaîne carbonée est(sont) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle ou le groupe thiol, de manière encore préférée parmi le groupe hydroxyle ou thiol.

Typiquement, la chaîne carbonée (ou radical) R comprend optionnellement au plus trois groupes hydroxyles, de préférence au plus trois substituants choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, de préférence choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants. Plus spécifiquement : lorsque la chaîne carbonée comprend entre 4 et 11 atomes de carbone (de préférence entre 6 et 11 atomes de carbone), ladite chaîne carbonée comprend au plus un groupe hydroxyle, de préférence au plus un substituant choisi parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus un substituant ; lorsque la chaîne carbonée comprend entre 12 et 16 atomes de carbone, ladite chaîne carbonée comprend au plus deux groupes hydroxyles, de préférence au plus deux substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus deux substituants ; lorsque la chaîne carbonée comprend entre 17 et 24 atomes de carbone ladite chaîne carbonée comprend au plus trois groupes hydroxyles, de préférence au plus trois substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants.

De manière particulièrement avantageuse : i) le radical R peut être représenté par la formule générale suivante :

dans laquelle la ligne ondulée

, Cy, R^a et R^b sont tels que définis ci-dessus (l’un quelconque des modes de réalisation décrits ci-dessus) ; et ii) R^aet R^b comprennent à eux deux optionnellement au plus trois groupes hydroxyles (autrement dit, au plus trois groupes hydroxyles sont répartis sur R_a et Rb), de préférence au plus trois substituants choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, de préférence choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants ; et iii) lorsque R^a ou R^b comprend un substituant amine (groupe NH ou NH2), ce groupe amine ne se situe pas en position a par rapport à la fonction carboxyle.

Dans ce mode de réalisation particulièrement préféré, la caractéristique ii) est de préférence telle que : o lorsque R^a et R^b comprennent à eux deux entre 2 et 9 atomes de carbone (de préférence entre 4 et 9 atomes de carbone), R^a et R^b comprennent à eux deux au plus un groupe hydroxyle, de préférence au plus un substituant choisi parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus un substituant ; o lorsque R^aet R^b comprennent à eux deux entre 10 et 14 atomes de carbone, R^a et R^b comprennent à eux deux au plus deux groupes hydroxyles, de préférence au plus deux substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus deux substituants ; o lorsque R^a et R^b comprennent à eux deux entre 15 et 22 atomes de carbone R^a et R^b comprennent à eux deux au plus trois groupes hydroxyles, de préférence au plus trois substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, et le groupe thiol, de préférence au plus trois substituants.

Mélange de glycolipides

Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention permet la préparation d’un mélange de glycolipides selon l’invention. Avantageusement, le mélange contient des glycolipides selon l’invention qui ne diffèrent que par le nombre d’unités glucosyle de leur motif osidique et éventuellement de la nature du lien osidique.

De préférence, le mélange est essentiellement constitué de glycolipides dans lesquels n est compris entre 1 et 7, de préférence n est compris entre 1 et 4, de préférence dans lesquels n égal à 1 , 2 ou 3, de préférence encore dans lesquels n est égal à 1 ou 2. De préférence, le mélange de glycolipides selon l’invention comprend de 70 % à 100 %, de préférence de 90% à 100% en poids de glycolipides selon l’invention dans lesquels n est compris entre 1 et 7, de préférence n est compris entre 1 et 4, de préférence dans lesquels n égal à 1 , 2 ou 3, de préférence encore dans lesquels n est égal à 1 ou 2, en % en poids relativement au poids total de glycolipides du mélange.

Acides gras hydroxylés

Le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras hydroxylé de formule (II) R-yOH (H) dans laquelle

R est un radical acide gras tel que défini dans la formule (I),

-yOH- représente un groupe hydroxylé rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci-dessus.

Le procédé peut notamment être mis en oeuvre avec trois catégories d’acides gras hydroxylés.

1 ère variante : acide gras hydroxylé sulfanylé

Selon une première variante, le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras hydroxylé sulfanylé.

Dans ce mode de réalisation, l’acide gras hydroxylé répond avantageusement à la formule (HA) :

HO-(CH₂)b-S-(CH₂)_a-COOH (HA) dans lequel a est compris entre 9 et 14, b est supérieur ou égal à 2, et avec la somme de a et b inférieure à 23.

L’acide gras hydroxylé de formule (HB) est par exemple l’acide 11-[(2- hydroxyéthyl)sulfanyl]-undécanoique OH-(CH₂)₂-S-(CH₂)IO-COOH.

2ème variante : acide gras hydroxylé en position oméga

Selon une seconde variante, le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras hydroxylé en position oméga. Dans un mode de réalisation, l’acide gras hydroxylé répond à la formule (I IB) :

OH-(CH₂)_a-COOH (IIB) dans lequel a est compris entre 3 et 23, de préférence entre 10 et 15.

Avantageusement, a est compris entre 11 et 15.

L’acide gras hydroxylé de formule (IIB) est par exemple l’acide 11-hydroxy-undécanoique OH-(CH₂)IO-COOH.

3ème variante : Acide gras poly-hydroxylé

Selon une 3ème variante, le procédé selon l’invention est mis en oeuvre avec un acide gras poly-hydroxylé, de préférence choisi parmi un acide gras di-hydroxylé et un acide gras tri- hydroxylé.

De préférence, l’acide gras di-hydroxylé est : un acide gras di-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par deux groupes hydroxylé positionnés le long de la chaine carbonée, par exemple l’acide 9, 10- dihydroxy-octadécanoique, ou un acide gras di-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par un groupe hydroxylé positionné le long de la chaine et par un groupe hydroxylé positionné en extrémité oméga de celle-ci.

Avantageusement, l’acide gras tri-hydroxylé est : un acide gras tri-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par deux groupes hydroxylé positionnés le long de la chaine carbonée et par un groupe hydroxylé en position oméga de celle-ci, par exemple l’acide érythro-aleuritique, ou un acide gras tri-hydroxylé dont la chaine carbonée est substituée par trois groupes positionnés le long de la chaine carbonée, par exemple l’acide 9, 10, 12-trihydroxy- octadécanoique ou l’acide 9,10,12-trihydroxystéarique. g-transglucosylase

Les inventeurs ont, pour la première fois, montré que les a-transglucosylases de la famille GH70 sont capables de catalyser la glucosylation d’acides gras hydroxylés à partir de saccharose. Les inventeurs ont en outre montré que, de manière inattendue, cette glucosylation est particulièrement efficace lorsque les a-transglucosylase de la famille GH70 mises en oeuvre sont des saccharases de branchement de la famille GH70.

Selon l’invention, le terme « a-transglucosylase » désigne une enzyme capable de polymériser des unités glucosyle selon des liaisons a, en catalysant le transfert d'une unité glucosyle depuis un sucre donneur de glucosyle vers un composé accepteur hydroxylé.

Selon l’invention, l’expression « de la famille GH70 », relatif à l’a-transglucosylase, signifie que l’a-transglucosylase selon l’invention appartient à la famille 70 des glycosidehydrolases selon la classification Q Z (www.cazy.org). CAZy, de l'anglais « Carbohydrate-Active enZYmes » (abrégé « CKZ\/ »), est une base de données bioinformatique de classification des enzymes actives sur les sucres i.e. capables de catalyser leur dissociation ou leur synthèse selon des homologies de séquences ou de structure, en particulier de leurs modules catalytiques et de liaison aux glucides. Dans la classification CAZy, le groupe des glycoside-hydrolases (GH) compte 173 familles composées d’enzymes actives sur les sucres capables de catalyser des réactions d’hydrolyse de liaisons glycosidique ou de transglucosylation.

Les a-transglucosylases de la famille GH70 sont typiquement produites de façon naturelle par des bactéries lactiques des genres Streptococcus, Leuconostoc (abrégé « L. »), Weisella, Oenococcus ou Lactobacillus (abrégé « Lb. »).

Les a-transglucosylases de la famille GH70 selon l’invention sont actives sur le saccharose, ce qui signifie que les a-transglucosylases selon l’invention utilisent spécifiquement le saccharose ou un de ses analogues comme donneur de glucosyle.

Avantageusement, les analogues de saccharose sont des composés de formule (I) : X-a-D-glucopyranosyl (I) dans laquelle X représente soit un groupe partant LG ou une unité osidique activée en particulier choisie parmi le O-p-D-galactopyranosyl-(1 — >4)-p-D-fructofuranosyl-(2— >1 ) et a- L-sorbofuranoside.

Selon la présente invention, le groupe LG représente un groupement chimique qui peut être facilement déplacé par un nucléophile lors d’une réaction de substitution nucléophile, le nucléophile étant plus particulièrement un groupement issu de l’a-transglucosylase de la famille GH70. Un tel groupe partant peut être plus particulièrement un atome d’halogène tel qu’un atome de chlore, de brome ou de fluor, un groupe tosylate (-OS(O)2-(p-Me-CeH4)), ou un groupe aromatique éventuellement substitué, notamment un groupe -O-C6H5-NO2

(de préférence p-nitrophenyl ou o-nitrophenyl), un groupe 4-Méthylumbelliféryle

groupe résorufine (groupe phénoxazine 3-one substitué en position 7) ou un groupe

Au sens de la présente invention, un groupe « aromatique » s’entend d’un groupe aryle ou hétéroaryle optionnellement substitué, de préférence par 1 à 2 substituants, notamment choisis parmi un groupe nitro (-NO2), un halogène, un groupement alkyle en C1-C4 ou un aryle optionnellement substitué.

Par « aryle », on entend, au sens de la présente invention, un groupement hydrocarboné aromatique, comportant de préférence de 6 à 14 atomes de carbone, et comprenant un ou plusieurs cycles accolés, par exemple un groupement phényle ou naphtyle. Avantageusement, il s’agit du phényle.

Par « hétéroaryle » ou « hétéroaromatique », on entend, au sens de la présente invention, un groupe aromatique comprenant 5 à 14 atomes cycliques dont un ou plusieurs hétéroatomes, avantageusement 1 à 4 et encore plus avantageusement 1 ou 2, tels que par exemple des atomes d’azote ou d’oxygène, les autres atomes cycliques étant des atomes de carbone. Des exemples de groupes hétéroaryle sont les groupes indyle, umbelliféryle ou résorufine.

Par « halogène », on entend, au sens de la présente invention, les atomes de fluor, de chlore, de brome et d’iode. De préférence, il s’agit d’un atome de chlore ou de fluor. Par groupement « alkyle en (C1-C4) », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée monovalente saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 4 atomes de carbone, et de préférence un méthyle.

Un aryle est préférentiellement substitué par un ou deux substituants de préférence choisis parmi un groupe nitro (-NO2), un halogène, un groupement alkyle en C1-C4 et/ou un groupe -C(O)-hétéroaryle, tel qu’un groupe 2-acyl-N-méthylpyrrole.

Ainsi, les analogues de saccharose peuvent notamment être choisis dans le groupe comprenant le fluorure d’a D-glucopyranosyle (en anglais « a-D-glucopyranosyl fluoride »), le O-p-D-galactopyranosyl-(1 — >-4)-p-D-fructofuranosyl-(2— >1 )-a-D-glucopyranoside (en anglais « Lactulosucrose »), le p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside, le a-D-glucopyranosyl a-L-sorbofuranoside, le 4-Méthylumbelliferyl a-D-glucosaminide (ou 4-méthylumbelliferyl 2-Amino-2-déoxy-a-D-glucopyranoside, n° CAS [137687-00-4]), le résorufin a-D- glucopyranoside (n° CAS : [136565-96-3]), I’ Aldol® 484 alpha-D-glucopyranoside (n° CAS : [2484872-56-0]) et leurs mélanges. Les analogues de saccharose peuvent en particulier être choisis dans le groupe comprenant le fluorure d’a D-glucopyranosyle (en anglais « a-D-glucopyranosyl fluoride »), le O-p-D-galactopyranosyl-(1 ^4)-p-D- fructofuranosyl-(2— >1 )-a-D-glucopyranoside (en anglais « Lactulosucrose »), le p- nitrophenyl a-D-glucopyranoside, le a-D-glucopyranosyl a-L-sorbofuranoside et leurs mélanges.

Le saccharose est préféré car ce substrat est biosourcé et bon marché.

Avantageusement, l’a-transglucosylase de la famille GH70 est une saccharase de branchement de la famille GH70, une glucane-saccharase de la famille GH70, ou un mélange de celles-ci.

Dans le présent document, les termes « saccharase de branchement de la famille GH70 » (en anglais « branching sucrase », parfois abrégé BRS) ou « a-transglucosylase de la famille GH70 à activité de branchement » ou « enzyme de branchement de la famille GH70 » sont utilisées indifféremment et se réfèrent à une a-transglucosylase de la famille GH70 capable de catalyser l’ajout d’unités glucosyle dans la chaine principale d’un glucane de type dextrane pré-existant formant des branchements (ou autrement dit des ramifications). La nature de la liaison de branchement (liaisons a-1 ,2 ; a-1 ,3 ; a-1 ,4 ou a- 1 ,6) et la longueur des chaînes d’unités glucosyle constituant les branchements varient selon la spécificité de la saccharase de branchement considérée.

De préférence, la saccharase de branchement de la famille GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant GBD-CD2 AN123 (SEQ ID NO : 1 ), BRS-A (SEQ ID NO : 2), BRS-B A1 (SEQ ID NO : 3), BRS-C (SEQ ID NO : 4), BRS-D A1 (SEQ ID NO : 5), BRS-E A1 (SEQ ID NO : 6) , ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’identité de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6.

Les inventeurs ont en outre montré que des mutants de GBD-CD2AN123 (SEQ ID NO : 1 ) étaient particulièrement efficaces pour la glucosylation d’acides gras hydroxylés. De manière préférée, la saccharase de branchement de la famille GH70 est un mutant de GBD-CD2AN123 (SEQ ID NO :1 ) ayant une séquence d’acides aminés choisie parmi GBD- CD2 AN123 W2135L F2136L (SEQ ID NO :7), GBD-CD2 AN123 W2135L (SEQ ID NO : 8), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136Y (SEQ ID NO: 9), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136C (SEQ ID NO : 10), GBD-CD2 AN123 W2135V (SEQ ID NO : 11 ) , ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’identité de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 7 à SEQ ID NO : 11.

Dans le présent document, l’expression « glucane-saccharase de la famille GH70 » parfois abrégée « GS » se réfère à une a-transglucosylase de la famille GH70 capable de catalyser la synthèse d’a-glucanes i.e. de polysaccharides composés exclusivement d’unités glucosyle liées entre elles par des liaisons a. Parmi les glucane-saccharases, on peut citer les dextrane-saccharases (parfois abrégé DSR), qui synthétisent des dextranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés majoritairement en a- 1 ,6 ; les reuterane-saccharases, qui synthétisent des reuteranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés en a-1 ,4 et a1 ,6 ; les mutane-saccharases, qui synthétisent des mutanes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés majoritairement en a-1 ,3 ; des alternane-saccharase, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés alternativement en a-1 ,3 et a-1 ,6. De préférence, la glucane-saccharase de la famille GH70 a pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant DSR-OK (SEQ ID NO : 12), DSR-M DP (SEQ ID NO : 13), DRS-S vardelA4N (SEQ ID NO : 14), ASR Cdelbis-Athio (SEQ ID NO : 15), GTF-SI (SEQ ID NO : 16), GTF-J (SEQ ID NO : 17), DSR-M A1 (SEQ ID NO : 18), ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’identité de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 12 à SEQ ID NO : 18.

Tel qu'utilisé ici, le terme « identité de séquence » ou « identité » se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Néedleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 ) ou l'algorithme d'AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast. ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme « Protein BLAST » (ou Blastp) dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut (seuil attendu (en anglais « Expect threshold ») : 10, Taille de mot (en anglais « Word size » : 6, Matrice (en anglais « Matrix ») = BLOSUM62, Coûts d’écarts (en anglais « Gap Costs ») : Existence = 11 , Extension = 1 , Ajustement conditionnel de la matrice des scores de composition (en anglais « Conditional compositional score matrix adjustment »). Mise en œuyre du procédé

Dans un mode de réalisation, l’étape i) est effectuée en solution à un pH contrôlé, en particulier par l’emploi d’une solution tampon.

Avantageusement, l’étape i) est conduite à une valeur de pH comprise entre 5 et 8.

L’étape i) est avantageusement conduite avec une concentration initiale de saccharose ou d’un analogue de saccharose comprise entre 100 et 650 g.L'¹.

L’étape i) est de préférence réalisée avec un rapport molaire saccharose ou analogue de saccharose : acide gras hydroxylé de formule (II) compris entre 1 et 100, de préférence entre 10 et 100.

De préférence, l’étape i) est mise en œuvre à une température comprise entre 10°C et 80°C.

Avantageusement, l’étape i) est conduite avec une a-transglucosylase de la famille GH70 en solution, en suspension ou immobilisée.

Lorsqu’un mélange de glycolipide est obtenu à l’issue de l’étape (i), le procédé peut en outre comprendre une étape ii) de purification d’un ou plusieurs glycolipide(s) de formule (I).

Glycolipide

Un deuxième objet selon l’invention concerne un glycolipide de formule (I) tel que défini au premier objet selon l’invention.

Les glycolipides selon l’invention présentent l’avantage d’être biodégradables.

Avantageusement, le glycolipide du deuxième objet selon l’invention est un glycolipide dans lequel n est supérieur ou égal à 2, de préférence est compris entre 2 et 7, de préférence encore est compris entre 2 et 4. Avantageusement, le glycolipide du deuxième objet selon l’invention est un glycolipide dans lequel le radical acide gras comprend au moins 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 atomes de carbone. Avantageusement, le radical acide gras comprend entre 10 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 24 atomes de carbone, de préférence entre 11 et 20 atomes de carbone.

1ère variante : glycolipide comprenant une chaîne carbonée sulfanylée

Selon une première variante, le glycolipide comprend une chaîne carbonée sulfanylée. Dans ce mode de réalisation, le glycolipide répond avantageusement à la formule (IA) : [Glc]_n-xOy-(CH₂)b-S-(CH₂)a-COOH dans lequel a est compris entre 9 et 14 b est supérieur ou égal à 2 la somme de a et b est inférieure à 23.

Avantageusement, le glycolipide de formule (IA) répond à la formule [Glc]_n-xOy-(CH₂)₂-S-(CH₂)io-COOH

2ème variante : Glycolipide comprenant une chaîne carbonée de type alkyl

Dans une seconde variante selon l’invention, le glycolipide de formule (I) comprend une chaîne carbonée de type alkyl, avantageusement de type alkyl linéaire.

Dans ce mode de réalisation, le glycolipide de formule (I) répond avantageusement à la formule (IB) :

[Glc]n-xOy-(CH₂)_a-COOH (IB) dans lequel a est compris entre 3 et 23, de préférence entre 10 et 15.

Avantageusement, le glycolipide de formule (IB) répond à la formule [Glc]_n-xOy-(CH₂)io- COOH.

3ème variante : Glycolipide comprenant une chaîne carbonée hydroxylée

Dans une troisième variante selon l’invention, le radical acide gras est substitué par un ou deux groupes hydroxyle. Dans ce mode de réalisation, le glycolipide de formule (I) est de préférence un glycolipide dans lequel : l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné à l’extrémité oméga, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par un ou deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée, ou l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par deux groupes hydroxyle, avec un groupe hydroxyle positionné le long de la chaine carbonée et un groupe hydroxyle positionné en position oméga de celle-ci, ou avec deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée.

Utilisation du glycolipide à titre d’agent antimicrobien

Les inventeurs ont découvert que le glycolipide selon l’invention présente des propriétés antimicrobiennes, en particulier des propriétés antibactériennes.

L’invention a donc également pour objet l’utilisation du glycolipide tel que défini ci-dessus à titre d’agent antimicrobien, notamment à titre d’agent antibactérien.

Au sens selon l’invention, le terme « agent antimicrobien » désigne un composé apte à détruire des microbes (i.e. un agent microbiocide) ou à ralentir leur croissance (i.e. agent microbiostatique). Par « microbe », on entend des virus ou des micro-organismes unicellulaires ou pluricellulaires.

A titre d’exemple, le glycolipide selon l’invention peut être utilisé en tant qu’agent conservateur qui inhibent le développement des micro-organismes et permettent d'accroître la durée de conservation de produits, en particulier dans le domaine cosmétique, pharmaceutique, ou alimentaire.

Utilisation du glycolipide à titre d’agent tensioactif

Les inventeurs ont également découvert que le glycolipide selon l’invention peut également être utilisé à titre d’agent tensioactif, en particulier à titre d’agent émulsifiant. L’invention a donc également pour objet l’utilisation du glycolipide tel que défini ci-dessus à titre d’agent tensioactif, notamment à titre d’agent émulsifiant.

Au sens selon l’invention, un agent tensioactif est une substance modifiant la tension superficielle entre deux surfaces ; un agent émulsifiant est un agent tensioactif qui facilite la formation d'une émulsion, ou améliore sa stabilité en diminuant son taux d'agrégation et/ou de coalescence.

En particulier, le glycolipide selon l’invention peut être utilisé en tant qu’émulsifiant pour la préparation d’une émulsion huile-dans-eau.

Au sens selon l’invention, une émulsion huile-dans-eau comprend une phase huileuse dispersée au sein d'une phase aqueuse, et une émulsion eau-dans-huile comprend une phase aqueuse dispersée au sein d'une phase huileuse.

Les inventeurs ont découvert que, de manière étonnante, lorsqu’un glycolipide selon l’invention est utilisé comme agent émulsifiant pour la préparation d’une émulsion huile- dans-eau, cette émulsion est sensible au pH, plus particulièrement que celle-ci est cinétiquement stable tant que le pH de la phase aqueuse de l’émulsion est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pH_s, et qu’elle se déstabilise lorsque ce pH est ajusté de manière à être inférieur au pH_s.

Emulsion sensible au pH

Un autre objet selon l’invention est donc une émulsion huile-dans-eau comprenant une phase huileuse dispersée dans une phase aqueuse et au moins un glycolipide de formule (I), caractérisée en ce que l’émulsion est stable lorsque le pH de la phase aqueuse est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pH_s.

Dans la présente invention, l’expression « cinétiquement stable tant que le pH de la phase aqueuse de l’émulsion est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pH_s » signifie que le pH de la phase aqueuse de l’émulsion doit être supérieur à pH_s pour que l’émulsion soit stable. Avantageusement, le pH_s correspond au pKa du glycolipide selon l’invention utilisé comme émulsifiant. Dans le cas où l’émulsion comprend un mélange de glycolipides selon l’invention, pH_s correspond avantageusement au pKa du mélange de glycolipides selon l’invention.

De préférence, le potentiel hydrogène seuil pH_s va de 2 à 5, et de préférence de 2 à 4, et de préférence encore est de 4 environ.

Lorsque le pH de la phase aqueuse de l’émulsion est inférieur au pH_s tel que décrit ci- dessus, l’émulsion se déstabilise en quelques minutes, typiquement de 5 à 20 minutes, et est complètement détruite en quelques heures, typiquement de 2 à 24h.

Dans un mode de réalisation, l’émulsion comprend un mélange de glycolipides selon l’invention tel que décrit-ci-dessus.

Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs pensent que l’instabilité des émulsions observée pour des pH faibles traduit l’existence d’une composante électrostatique forte dans la stabilisation des émulsions par les glycolipides selon l’invention.

Nature et quantité des phases huileuse et aqueuse

De préférence, la phase aqueuse représente avantageusement au moins 50 % en poids de l'émulsion, par rapport au poids total de l'émulsion. De préférence, l'émulsion selon l'invention comprend au moins 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, ou 85 % en poids de phase aqueuse, relativement au poids total de l'émulsion.

La quantité de phase aqueuse dans l'émulsion selon l'invention est comprise notamment entre 50 à 80 % en poids, de préférence entre 50 à 70 % en poids, et plus préférentiellement entre 50 à 60 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion.

Avantageusement, la phase aqueuse représente entre 50 et 70 % en poids de l'émulsion. La phase aqueuse de l'émulsion selon l'invention comprend principalement de l'eau, un glycolipide ou un mélange de glycolipides selon l’invention et éventuellement un ou plusieurs composés miscibles à l'eau.

De préférence, la phase aqueuse comprend, en % en poids de phase aqueuse, de 0,5 à 5 %, de préférence de 0,5 à 3 %, de préférence encore de 1 à 3 % d’un glycolipide ou d’un mélange de glycolipides selon l’invention.

La phase aqueuse peut comprendre aussi des espèces ioniques, des régulateurs de pH, des principes actifs, des conservateurs, ou encore des colorants, lesdits principes actifs, conservateurs et colorants sont hydrosolubles ou hydrodispersibles.

La phase huileuse de l'émulsion selon l'invention est une phase grasse comprenant au moins un corps gras choisi parmi les corps gras liquides à température ambiante (20-25°C) ou huiles, volatiles ou non, d'origine végétale, minérale ou synthétique, et leurs mélanges. On entend par « huile » un corps gras liquide à la température ambiante (25°C). La phase huileuse peut comprendre aussi tout additif liposoluble ou lipodispersible.

Pour une application dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique, ces huiles sont choisies parmi des huiles physiologiquement acceptables.

Comme huiles utilisables dans l’émulsion selon l’invention, on peut citer par exemple les huiles hydrocarbonées d'origine animale ; les huiles hydrocarbonées d'origine végétale ; les esters et les éthers de synthèse, notamment d'acides gras ; les hydrocarbures linéaires ou ramifiés, d'origine minérale ou synthétique, tels que les huiles de paraffine, volatiles ou non, et leurs dérivés ; les huiles fluorées partiellement hydrocarbonées et/ou siliconées ; les huiles de silicone ; et leurs mélanges.

Parmi les hydrocarbures de formule brute C_nH_m avec n et m étant deux chiffres entiers, les hydrocarbures linéaires, aromatiques et cycliques peuvent être utilisés, et ce quel que soit leur point d'ébullition. On citera plus particulièrement comme hydrocarbure pouvant être présent dans la phase huileuse selon l’invention le cyclopentane (C5H10), l'hexane (C6H14), le méthylcyclohexane (C7H14), l'heptane (C7H16), le décane (C10H22), le dodécane (C12H26), l’hexadécane (C16H34), et le toluène (C7H8). La phase huileuse dans l'émulsion selon l'invention pourra être composée d'une seule huile, en particulier d'un seul hydrocarbure, ou pourra également être constituée d'un mélange de deux, trois voire quatre huiles différentes.

Dans l’émulsion, la phase huileuse se présente typiquement sous la forme de gouttes de phase huileuse en suspension dans la phase aqueuse.

Les gouttes de phase huileuse sont de préférence monodisperses.

La distribution granulométrique des gouttes de phase huileuse peut être caractérisée en termes de diamètre moyen des gouttes en volume, D(4,3), et de polydispersité en taille, P, définis par :

où Ni est le nombre de gouttes de diamètre Di, et D_m est le diamètre médian (diamètre qui divise la distribution en deux parties d'aires égales).

La mesure du diamètre médian des gouttes peut s'effectuer à partir d'un histogramme de taille obtenu par mesure des diamètres individuels d'une assemblée de gouttes (minimum 500) sur un ou plusieurs clichés pris en microscopie optique ou bien par mesure de diffusion statique de la lumière.

Les gouttes de phase huileuse présentent avantageusement un diamètre moyen en volume de l’ordre de quelques micromètres. Ainsi, les gouttelettes présentent généralement un diamètre moyen en volume compris entre 2 et 10 pm, de préférence entre 3 et 6 pm, de préférence encore entre 4 et 5 pm. Emulsion sèche

Les inventeurs ont également montré que l’émulsion selon l'invention peut être soumise à un traitement pour réaliser une émulsion sèche, le traitement consistant à éliminer la majorité ou la totalité de la phase aqueuse de l’émulsion selon l’invention par séchage ou lyophilisation.

Un objet selon l’invention concerne donc une émulsion selon l’invention sous la forme d’une émulsion sèche.

Au sens selon l’invention, une émulsion sèche se présente sous la forme d’une poudre constituée de particules huileuses capables de redonner une émulsion huile-dans-eau après réhydratation, c’est-à-dire après dispersion de l’émulsion sèche dans une phase aqueuse. Les expressions « émulsion sous la forme d’une émulsion sèche » et « émulsion sèche » sont utilisées de manière interchangeable.

De préférence, l’émulsion sèche comprend des gouttes de phase huileuse, un glycolipide selon l’invention et moins de 20 %, de préférence moins de 10 % en poids de phase aqueuse, relativement au poids total de l'émulsion sèche. Avantageusement, l’émulsion sèche comprend au plus 1 , ou 2 % en poids de phase aqueuse, relativement au poids total de l'émulsion sèche. Avantageusement encore, l’émulsion sèche est dépourvue de phase aqueuse.

Les gouttes de phase huileuses ont une taille moyenne de l’ordre de 4 pm.

Selon un mode préférentiel, les émulsions sèches selon l’invention contiennent un composé saccharidique protecteur, notamment choisi dans le groupe constitué du saccharose, du lactose, du fructose, du tréhalose, des dextrines, des maltodextrines, des dextrines jaunes, des sucres invertis, du sorbitol, du polydextrose, du sirop d'amidon, du sirop de glucose et de leurs mélanges. De préférence, le composé saccharidique protecteur est le lactose.

L’émulsion sèche est avantageusement obtenue en congelant une émulsion selon l’invention, typiquement à une température comprise entre -50°C et -100°C et en la lyophilisant. Procédé de préparation d'une émulsion

L’invention concerne également la préparation d’une émulsion selon l’invention, comprenant : a) préparation d’une phase aqueuse et d’une phase huileuse, dans lequel la phase huileuse et/ou la phase aqueuse comprend le glycolipide selon l’invention ; b) combinaison de la phase aqueuse et de la phase huileuse et agitation jusqu’à obtenir une émulsion.

De préférence, la phase huileuse et/ou la phase aqueuse comprend le glycolipide selon l’invention selon un ratio massique phase aqueuse/glycolipide compris entre 60 et 10.

De préférence, la phase aqueuse de l’étape a) comprend, en % en poids de phase aqueuse, de 0,5 à 5 %, de préférence de 0,5 à 3 %, de préférence encore de 1 à 3 % en glycolipide selon l’invention. Dans un mode de réalisation, la phase huileuse ne comprend pas de glycolipide selon l’invention.

Lors de l’étape a), le pH de la phase aqueuse est de préférence ajusté de sorte à être supérieur au pKa du glycolipide selon l’invention.

La combinaison de la phase huileuse et de la phase aqueuse se fait dans l'ordre le plus approprié, comme cela est connu par l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) est menée en ajoutant la phase huileuse à la phase aqueuse tout en agitant la combinaison obtenue.

Utilisation de l’émulsion pour le nettoyage de surfaces

Un autre objet selon l’invention concerne l’utilisation d’une émulsion selon l’invention pour le nettoyage de surfaces.

En effet, de manière étonnante, les inventeurs ont découvert que lorsqu’une goutte d’émulsion selon l’invention est déposée sur un substrat solide, tel qu’une lame de verre, ou un support plastique, celle-ci se déplace, s’étale et se contracte de façon spasmodique et quasi-périodique sur le support. Ceci confère à l’émulsion d’être auto-étalable ou bien encore auto-agitée, ce qui présente un intérêt dans le domaine du nettoyage des surfaces. Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs attribuent ces propriétés à des phénomènes convectifs se déroulant au sein de la goutte d’émulsion.

EXEMPLES

Enzymes étudiées, organismes d’origine et spécificité

Les enzymes utilisées dans les Exemples sont listées dans le Tableau 1.

Tableau 1 : a-transglucosylases GH70, spécificité de liaisons lors de la synthèse du polymère naturel. P : polymérase i.e. glucane-saccharase GH70 ; B : saccharase de branchement GH70 (« Branching sucrase » en anglais) ; nd= non déterminé L’origine des enzymes du Tableau 1 sont listées dans le Tableau 2.

Tableau 2 : Organismes d’origine des a-transglucosylases GH70

Expression hétérologue des enzymes chez Escherichia Coli

Les gènes codant pour les enzymes citées ci-dessus sont clonés dans des vecteurs permettant l’expression recombinante chez E. coli (voir Tableau 3).

Les enzymes recombinantes sont produites à partir des cellules d’E. coli BL21 Star DE3 (SEQ ID NO 18, 13, 1 , 3, 4, 5, 6, 16 et 17), BL21 Al DE3 (SEQ ID NO 12, 14, et 2) ou Top 10 (SEQ ID NO : 15) transformées avec le plasmide contenant le gène des enzymes ciblées (voir Tableau 3).

Tableau 3 : Plasmides des enzymes utilisées et systèmes d’expression adaptés aux différentes enzymes. (Gly : Glycérol ; Glu : Glucose ; a-Lac : a-Lactose ; L-Ara : L- Arabinose)

Trois cents microlitres du mélange de transformation permettent d’ensemencer un volume de 30 mL de LB (Lysogeny Broth), supplémenté avec 100 pg.mL'¹ d’ampiciline. Le milieu est mis à incuber sur la nuit à 37°C afin de préparer une préculture. Des cultures d’1 L en milieu ZYM5052 modifié (Studier, 2005) dont les caractéristiques sont présentées dans le Tableau 3 sont ensemencées à une DOx=6oonm initiale de 0,05 à partir de la préculture de la veille, puis mises à incuber 26 heures à 21 °C et à 150 rpm. En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés (15 min, 6500 rpm, 4°C) et les culots sont concentrés à une DOx=6oonm de 80 dans du tampon d’activité (voir Tableau 3). Les cellules sont alors cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30 % de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Les surnageants de sonication contenant les enzymes d’intérêt solubles sont ensuite récupérés après 30 minutes de centrifugation (10 000 rpm, 10°C) et conservés à 4°C.

Détermination de l’activité des enzymes par dosage des sucres réducteurs au DNS.

L’activité enzymatique est déterminée en mesurant la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS) (Miller, 1959).

Une unité enzymatique représente la quantité d’enzyme qui libère une pmole de fructose par minute, à 30 °C, à partir de 100 g.L'¹ de saccharose dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75. L’activité est déterminée par mesure de la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS).

Au cours d’une cinétique, 100 pL de milieu réactionnel sont prélevés et la réaction est stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons sont ensuite chauffés 5 min à 95°C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance est lue à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g.L'¹ de fructose permet d’établir le lien entre valeur d’absorbance et concentration en sucres réducteurs.

Exemple 1 : Criblage des enzymes en réaction d’accepteur avec différents acides gras hydroxy lés

1.1. Matériel et méthodes

Conditions réactionnelles

Les réactions d’accepteurs sont réalisées en microtubes coniques, dans un volume de 1 mL. Le criblage des enzymes de la famille 70 des GH a été réalisé dans les conditions suivantes :

- [saccharose]o = 292 mM (100 g.L'¹)

- [acide gras hydroxylé]o = 10 mM, - 10% v/v de DMSO

- tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75

- activité enzymatique : 1 U.mL'¹

- température : 30°C

- agitation : 800 rpm

L’acide gras hydroxylé est initialement dissous dans 100% DMSO.

Les acides gras hydroxylés (ci-après AGH) testés sont respectivement : un acide gras hydroxylé sulfanylé : acide 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]- undécanoique (ci-après AHESll) un acide gras co-hydroxylé : acide 11 hydroxyundécanoique (ci-après AHIID) un acide gras poly-hydroxylé : l’acide érythro-aleuritique (ci-après AEA)

La concentration finale en DMSO dans le milieu réactionnel est de 10 % (v/v). La réaction est initiée par l’addition d’un volume de lysat cellulaire suffisant pour obtenir une activité enzymatique en réaction de 1 U.mL'¹. Les réactions sont incubées à 30°C et agitées à 800 rpm grâce à un Eppendorf ThermoMixer C. Au bout de 24h, les enzymes ont été dénaturées à 95°C pendant 5 min.

Techniques analytiques

En vue de leurs analyses par CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. Cette dilution permet entre autres l’élimination par précipitation des potentiels polymères de haute masse moléculaire.

La séparation des accepteurs lipidiques et de leurs formes glucosylées, est effectuée en phase inverse avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). Cette colonne est maintenue à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre maintenu à 3,2 secondes.

La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) contenant chacun 0,05% (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min'¹ selon le gradient suivant : Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution à 0% (v/v) de la voie B permet l’élimination des sucres simples résiduels (fructose, glucose, leucrose, et saccharose résiduels ou éventuels oligosaccharides courts),

Une seconde phase d’élution isocratique à un pourcentage de 35% de la voie B est réalisée pendant 25 minutes pour séparer les différents composés lipidiques glucosylés,

Une dernière phase de 10 minutes à 75 % de la voie B permet la régénération de la colonne.

Taux de conversion de l’accepteur

La capacité des enzymes à glucosyler un accepteur, ici AHESU, AHUD ou AEA, est déterminée grâce à la mesure du taux de conversion de l’accepteur entre le début et la fin de la réaction. Le taux de conversion est calculé comme suit :

[Math. 1]

où Accepteur est le taux de conversion de l’accepteur, [Accepteur^ sa concentration initiale et [Accepteur^ sa concentration finale.

1.2. Résultats

Glucosylation de l’AHESU

La Figure 1 illustre la capacité des enzymes à glucosyler l’AHESU dans les conditions énoncées ci-dessus.

Les enzymes de la famille 70 des GH testées se sont révélées actives sur AHESU.

Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-B, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 se sont révélées particulièrement actives. En effet, des taux de conversion allant de 20 % à des taux supérieurs à 80% dans les conditions de crible testées ont été obtenus avec ces enzymes. Glucosylation de AHIID

La Figure 2 illustre la capacité des enzymes à glucosyler l’AHUD dans les conditions énoncées ci-dessus.

Toutes les enzymes de la famille 70 des GH se sont révélées actives sur AHIID.

Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-B, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 se sont révélées particulièrement actives. En effet, des taux de conversion allant de 18 % à des taux supérieurs à 60 % dans les conditions de crible testées ont été obtenus avec ces enzymes.

Glucosylation de IAEA

La Figure 3 illustre la capacité des enzymes à glucosyler l’AEA dans les conditions énoncées ci-dessus.

Toutes les enzymes de la famille 70 des GH se sont révélées actives sur AEA.

Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-B A1 , BRS-B, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 se sont révélées particulièrement actives. En effet, des taux de conversion allant de 20 % à des taux supérieurs à 60 % dans les conditions de crible testées ont été obtenus avec ces enzymes.

Exemple 2 : Comparaison des profils de produits de glucosylation de AHESU, AHUD et AEA par les enzymes de branchement BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS-C ; BRS-D A1, BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123

2.1. Matériel et méthodes

Les réactions sont réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 438,5 mM de saccharose, 10 mM d’AGH (AHESU, AHUD ou AEA), 10% v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75 et BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS-C ; BRS-D A1 , BRS-E A1 ou GBD-CD2 AN123 (activité enzymatique de 1 U.mL'¹). 2.2. Résultats

2.2.1 . Profils de produits de qlucosylation de AHESll

La Figure 4 illustre la diversité des produits de glucosylation obtenus dans les conditions énoncées ci-dessus.

Les produits de glucosylation sont élués entre 10 et 16 minutes de l’analyse CLHP. Le produit détecté à 26,5 minutes correspondant à l’acide AHESU résiduel.

Pour chaque enzyme testée, les profils chromatographiques présentent de nombreux pics de glucosylation. Par exemple, six produits majeurs sont obtenus quand BRS-A catalyse la réaction.

Le profil des produits de glucosylation est dépendant de l’enzyme considérée.

Les produits de glucosylation majoritaires semblent plus nombreux avec les enzymes de branchement BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN123 spécifique de la liaison a-1 ,2, notamment dans les produits élués dans les premiers temps de l’analyse. En effet, trois à quatre pics de forte intensité sont observables avec ces enzymes.

A contrario, seuls deux produits principaux sont obtenus avec BRS-B A1 , BRS-C et BRS- EA1.

A l’exception des enzymes BRS-C et BRS-E A1 , l’efficacité de glucosylation est très élevée avec l’AHESU comme accepteur, en particulier pour BRS-A, BRS-B A1 , BRS-D A1 , et GBD-CD2 AN123. En effet, les taux de conversion de l’AHESU obtenus avec 438,5 mM (150 g.L'¹) de saccharose sont de 94%, 84% et 75% pour BRS-A, BRS-D A1 , et GBD-CD2 AN 123 respectivement (BRS spécifiques de la liaison a-1 ,2) et 89%, 26%, 22% pour BRS- B A1 , BRS-C et BRS-E A1 (BRS spécifiques de la liaison a-1 ,3).

2.2.2. Profils de produits de glucosylation de AHUD

La Figure 5 illustre la diversité des produits de glucosylation obtenus dans les conditions énoncées ci-dessus. Les produits de glucosylation obtenus sont élués entre 10 et 25 minutes. Le produit détecté à 49 minutes correspondant à l’acide 11-hydroxyundécanoïque (AHUD) résiduel. Les profils de produits obtenus sont complexes avec de nombreux pics de glucosylation détectés (une douzaine de produits différents pour BRS-A par exemple).

Le profil des produits de glucosylation est également dépendant de l’enzyme considérée. Les produits majoritaires n°1 et 2 sont, par exemple, en proportions variables selon les enzymes : une forte production de produit de glucosylation n°1 est observée avec GBD- CD2 AN 123 ; au contraire, une production du même ordre de grandeur des deux produits (1 et 2) de glucosylation est obtenue avec BRS-E A1 .

Les produits élués dans les premiers instants de l’analyse (entre 10 et 15 minutes) apparaissent en quantité supérieure dans les réactions catalysées par les enzymes spécifiques de la liaison a-1 ,2 ie. BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123.

L’efficacité de glucosylation est également dépendante de l’enzyme considérée.

En effet, les taux de conversion de l’AHUD obtenus sont de 78 %, 40 %, 17 %, 54 %, 32 % et 67 % pour BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 respectivement dans les conditions illustrées dans la Figure 5.

2.2.3. Profils de produits de glucosylation de AEA

La Figure 6 illustre la diversité des produits de glucosylation obtenus dans les conditions énoncées ci-dessus.

Les produits de glucosylation obtenus sont élués entre 10 et 30 minutes de l’analyse CLHP, le produit détecté à 43 minutes correspondant à l’AEA résiduel. Les profils de produits de glucosylation apparaissent complexes, de nombreux pics de glucosylation étant détectés (plus de 16 produits majeurs pour BRS-A par exemple).

Le profil des produits de glucosylation est très dépendant de l’enzyme considérée. En effet, si le pic 4 est commun à toutes les enzymes, le pic 5 est caractéristique de l’enzyme BRS- B A1 . Le pic 10 est lui essentiellement présent dans les produits obtenus avec les enzymes BRS-A et BRS-D A1 deux enzymes spécifiques de la liaison a-1 ,2. Les produits de glucosylation 1 à 3 sont, eux, essentiellement produits par BRS-B A1 et BRS-E A1 deux enzymes spécifiques de la liaison a-1 ,3.

L’efficacité de glucosylation est également dépendante de l’enzyme considérée. En effet, les taux de conversion de l’AEA obtenus sont de 63 %, 74 %, 30 %, 60 %, 65 % et 74 % pour BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 respectivement dans les conditions illustrées dans la Figure 6.

Exemple 3 : Effet de la concentration initiale de saccharose sur le profil des produits de glucosylation de AHESU, AHUD et AEA obtenus avec BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS- C ; BRS-D A1 , BRS-E A1 ou GBD-CD2 AN123.

3.1. Matériel et méthodes

Profil des produits de glucosylation

Les réactions sont réalisées à 30°C sous 800 rpm d’agitation en présence de 146 mM, 292 mM, 439 mM, 585 mM ou 731 mM de saccharose ; 10 mM d’AGH (AHESU, AHUD ou AEA) ; 10 % v/v de DMSO et un tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75 en présence BRS-A ; BRS-B A1 ; BRS-C ; BRS-D A1 , BRS-E A1 ou GBD-CD2 AN123 (Activité enzymatique 1 U.mL'¹, T=30°C)

3.2. Résultats

3.2.1 . Effet de la concentration initiale de saccharose sur le taux de conversion et le profil des produits de glucosylation de l’AHESU

L’augmentation de la concentration initiale en saccharose a pour effet d’optimiser le taux de conversion de l’AHESU (Figure 7). Cet effet est particulièrement marqué pour les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-D A1 et GBD-CD2 AN123. En effet, le taux de conversion compris entre 25 % et 55 %, obtenu à une concentration initiale de 146 mM augmente jusqu’à un taux supérieur à 85 % (jusqu’à 98 % pour BRS-A).

Les concentrations initiales croissantes en saccharose ont également un effet sur les profils des produits de glucosylation (non représenté). Par exemple, pour les quatre enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-D A1 et GBD-CD2 AN123, les produits de glucosylation élués dans les premiers instants de l’analyse (certainement des produits de degré de glucosylation plus élevé) sont nettement favorisés par l’augmentation de la concentration initiale en saccharose.

3.2.2. Effet de la concentration initiale de saccharose sur le taux de conversion et le profil des produits de glucosylation de l’AHUD

L’augmentation de la concentration initiale en saccharose a pour effet d’optimiser le taux de conversion de l’AHUD (Figure 8).

Cet effet est principalement marqué pour les enzymes de spécificité a-1 ,2. En effet, le taux de conversion compris entre 25 % et 55 %, obtenu à une concentration initiale de 146 mM avec BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123 augmente jusqu’à un taux compris entre 60 % et 85 % pour une concentration supérieure à 146 mM. Cet effet de la concentration initiale de saccharose est moins marqué pour BSR-B A1 , BSR-C et BSR-E A1 .

En comparaison le taux de conversion obtenu avec les enzymes de spécificité a-1 ,3 ne dépassent pas 40 % pour une concentration initiale en saccharose de 730 mM.

Les concentrations initiales croissantes en saccharose ont également un effet sur le profil global des produits de glucosylation (non représenté). Par exemple, pour les trois enzymes de branchement BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123, les produits de glucosylation élués dans les premiers instants de l’analyse sont nettement favorisés par l’augmentation de la concentration initiale de saccharose. Ces produits sont certainement des produits de degré de glucosylation plus élevé. Dans le cas des enzymes de branchement a-1 ,3, cet effet est beaucoup moins marqué.

3.2.3. Effet de la concentration initiale de saccharose sur le taux de conversion et le profil des produits de glucosylation de l’AEA

L’augmentation de la concentration initiale en saccharose a pour effet de diminuer le pic d’AEA résiduel. La conversion de l’accepteur est donc optimisée. En effet, le taux de conversion compris entre 37 et 50 % obtenu à une concentration initiale de 146 mM augmente jusqu’à un taux compris entre 76 % et 85 % selon les enzymes considérées (BRS-B A1 , BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123). Cet effet de la concentration initiale de saccharose est moins marqué pour l’enzyme BRS-C. Cette optimisation de la conversion de l’AEA est illustrée dans la Figure 9.

Les concentrations initiales croissantes en saccharose ont également un effet sur le profil global des produits de glucosylation (non représenté). Par exemple, pour les deux enzymes de branchement BRS-A et BRS-D A1 (qui glucosylent le dextrane en a-1 ,2), les produits de glucosylation élués dans les premiers instants de l’analyse sont nettement favorisés avec l’augmentation de la concentration initiale de saccharose. Ces produits sont certainement des produits de degrés de glucosylation plus élevés.

Dans le cas des enzymes de branchement a-1 ,3, la synthèse du produit de glucosylation n°4 est défavorisée au profit de celle des autres produits de glucosylation, spécialement le produit de glucosylation n°5 dans le cas de l’enzyme BRS-B.

Exemple 4 : Caractérisation structurale des principaux produits de glucosylation de AHESU par BRS-A, de AHUD par BSR-B A1 et de AEA par BSR-B A1

4.1. Production et caractérisation structurale des produits de glucosylation de l’AHESU

4.1.1. Production d’un lot de glycolipides de l’AHESU à l’échelle du gramme

La glucosylation de l’AHESU est catalysée par l’enzyme BRS-A sur 500 mg d’AHESU. Les conditions réactionnelles sont les suivantes :

- [saccharose]o = 438,5 mM

- [AHESU]o = 10 mM (initialement dissoute dans le DMSO à 100 mM)

- tampon acétate de sodium à 50mM et à pH = 5,75

- eau ultra-pure qsp 200mL

- activité de BRS-A en réaction : 1 U.mL'¹

La réaction est menée à 37°C sous agitation magnétique. Après 24 heures, la réaction est arrêtée par incubation à 95°C pendant 10 minutes. Le mélange est conservé à -20°C avant purification.

Une étape de prépurification des hydroxy-lipides glucosylés issus de AHESU est réalisée par chromatographie flash grâce à une colonne contenant 250 mL de phase stationnaire Purosorb PAD910, Purolite, USA. Les produits de glucosylation sont ainsi séparés des sucres libres résiduels grâce aux étapes d’élution suivantes :

- 4 volumes de colonne (VC) d’eau ultra-pure jusqu’à élution complète des sucres résiduels

- Elution des produits de glycosylation grâce à 4 VC d’un mélange l- O/Ethanol 35% / 65% v/v.

- Retour à 100% H2O ultra pure en 5 VC.

Les produits de glucosylation sont recueillis et concentrés par évaporation rotative sous vide puis analysés par chromatographie. Le chromatogramme obtenu à cette étape de prépurification est présenté dans la Figure 10. Y figurent au minimum 6 produits de glucosylation principaux notés dans l’ordre inverse de leur polarité. Le produit n°1 correspond à celui élué au plus proche de l’AHESU, accepteur lipidique n’ayant pas complètement réagi.

Les formes glucosylées majoritaire de l’AHESU (produits de glucosylation n°1 à 3) sont isolées grâce à un système semi-préparatif constitué d’une chaine CLHP Agilent 1260 Infinite couplée à un collecteur de fraction « Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector ». La séparation est assurée par une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée de manière isocratique avec un mélange H2O/Acétonitrile 65% / 35% v/v à un débit de 1 mL.min'¹.

4.1.2. Caractérisation des produits de glucosylation de l’AHESU a) Spectre de masse haute résolution (LTQ Orbitrap) des produits de glucosylation de l’AHESU

Dans le but de déterminer les masses exactes des produits de glucosylation purifiés, le système CLHP Thermo U3000 a été couplé à un spectromètre haute résolution de type LTQ Orbitrap Vélos (ThermoScientific, USA). L’ionisation est réalisée en mode électrospray négatif (H ESI II -) avec un delta de masse de +/- 5 ppm. Les spectres de masse haute résolution des produits de glucosylation n°1 à 3 sont obtenus (Figure 10). L’analyse LC-MS haute résolution du produit de glucosylation de l’AHESU n°1 dont le temps de rétention est 7,8 min conduit à l’identification d’un ion majoritaire à m/z 423,20492 pour [M-H]' correspondant à une forme mono-glucosylée de l’AHESU.

Un ion majoritaire obtenu avec le produit de glucosylation n°2 (temps d’élution = 6,5 minutes) à m/z 585,25716 pour [M-H]' correspond à une forme diglucosylée de l’AHESU.

De façon surprenante le produit de glucosylation n°3 (pic n°3 à 5,92 min) donne un ion principal à m/z 585,2571 pour ([M-H]'). Le composé n°3 est donc également une forme diglucosylée de l’AHESU mais avec une liaison osidique différente de celle du produit n°2. b) Analyse par RMN des produits de glucosylation n°1 à 3 de l’AHESU

La caractérisation des produits de glucosylation de l’AHESU n°1 (AHESU monoglucosylé), n°2 et 3 (AHESU diglucosylés) est réalisée par RMN. Les spectres ¹H, ¹³C, JMod, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298K avec une sonde BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.

Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°1 de l’AHESU

Un spectre ¹H et un spectre ¹³C du produit de glucosylation n°1 de l’AHESU sont réalisés.

Les spectres ¹H et ¹³C obtenus avec le produit de glucosylation n°1 sont en accord avec une monoglucosylation de l’AHESU.

Le pic n°1 des chromatogrammes présentés en Figure 10 correspond à l’acide 11-[(2-O- g-D-glucopyranosyl-éthyl)-sulfanyl]-undécanoïque.

Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°2 de l’AHESU

Un spectre ¹H et un spectre ¹³C du produit de glucosylation n°2 de l’AHESU sont réalisés. La présence de deux protons anomériques aux déplacements chimiques 4,84 et 5,13 ppm et de deux carbones négatifs aux déplacements chimiques 100,54 ppm et 101 ,94 ppm (carbones anomériques) sont en accord avec une forme diglucosylée de l’accepteur lipidique.

Un spectre 2D HSQC du produit de glucosylation n°2 de l’AHESU permet l’attribution des protons et carbones anomériques pour chaque unité osidique.

Un spectre RMN 2D HMBC du produit de glycosylation n°2 de l’AHESU montre une liaison osidique du type a-1 ,3 entre les deux unités glucosyle.

Le pic n°2 des chromatogrammes présentés en Figure 10 correspond donc à l’acide 11- [(2-O-a-D-glucopyranosyl-(1 ,3)-a-D-glucopyranosyl-éthyl) sulfanyl]-undécanoïque.

Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°3 de l’AHESU

Un spectre ¹H et un spectre ¹³C du produit de glucosylation n°3 de l’AHESU sont réalisés. La présence de deux protons anomériques aux déplacements chimiques 4,99 et 5,05 ppm et de deux carbones négatifs aux déplacements chimiques 97,56 ppm et 98,28 ppm (carbones anomériques) sont en accord avec une deuxième forme diglucosylée de l’accepteur lipidique.

Un spectre 2D HSQC du produit de glucosylation n°3 de l’AHESU permet l’attribution des protons et carbones anomériques pour chaque unité osidique. Un spectre 2D HMBC du produit de glucosylation n°3 montre une liaison osidique du type a-1 ,2 entre les deux unités glucosyle.

Le pic n°3 du chromatogramme présenté en Figure 10 correspond donc à l’acide 11-[(2- O-a-D-glucopyranosyl-(1 ,2)-a-D-glucopyranosyl-éthyl) sulfanyl]-undécanoïque.

4.2. Production et caractérisation structurale de produits de glucosylation de AHUD

4.2.1 . Production d’un lot de glycolipides AHUD à l’échelle du gramme.

La production de produits de glucosylation est réalisée par l’enzyme BRS-B sur 1 g d’AHUD. Les conditions réactionnelles sont les suivantes :

- concentration finale en saccharose : 438,5 mM

- concentration finale en AHUD : 10 mM (initialement dissout dans le DMSO à 100 mM)

- tampon acétate de sodium à 50mM et à pH = 5,75 - eau ultra-pure qsp 500 ml_

- activité de BRS-B en réaction : 1 U.mL'¹

La réaction est réalisée à 30°C sous agitation magnétique. Après 24 heures, la réaction est arrêtée par incubation à 95°C pendant 10 minutes. Le mélange est conservé à -20°C avant purification.

4.2.2. Purification des glycolipides de l’AHUD produits par l’enzyme BRS-B.

Une étape de prépurification des glycolipides issus de l’AHUD est réalisée par chromatographie flash grâce à un système REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) équipé d’une colonne contenant 80 g de phase stationnaire silice- C18. Les produits de glucosylation sont séparés des sucres libres résiduels dans les conditions suivantes :

- débit de 60 ml. min^-1

- 3 volumes de colonne (VC) à 100 % H2O

- gradient passant de 100 % H2O ultra pure à 100 % acétonitrile en 2 VC

- 1 VC à 100 % acétonitrile

- retour à 100 % H2O ultra pure en 0,5 VC

- équilbration à 100 % H2O ultra pure pendant 1 ,5 VC

Le pic correspondant aux produits de glucosylation est recueilli lors du gradient en acétonitrile. Le chromatogramme obtenu lors de cette étape de pré-purification par chromatographie flash est présenté Figure 11.

L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation de l’AHUD n°1 (temps de rétention de 15,34 min) donne deux ions majoritaires à m/z 363,2 pour [M-H]' correspondant à la forme mono-glucosylé et m/z 725,3 pour [2M-3H]' correspondant à un dimère.

L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation de l’AHUD n°2 (temps de rétention de 14,12 min) donne un ion majoritaire à m/z 525,3 pour [M-H]' correspondant à la forme di-glucosylée.

Les différentes formes glucosylées de l’AHUD sont ensuite purifiées sur un système semi- préparatif constitué d’une chaine CHLP Agilent 1260 Infinite couplée à un collecteur de fraction Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector. La séparation est assurée par une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée de manière isocratique avec un mélange FW/Acétonitrile 75 % / 25 % v/v à un débit de 1 mL.min'¹.

4.2.3. Analyse RMN des glycolipides de AHUD purifiés.

La caractérisation des produits de glucosylation de l’AHUD n°1 (AHUD monoglucosylé) et n°2 (AHUD diglucosylé) est réalisée par RMN. Les spectres 1 H, 13C, JMod, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298 K avec une sonde BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.

Caractérisation RMN du produit de glucosylation n°1 de l’AHUD

Un spectre ¹H et un spectre ¹³C du produit de glucosylation n°1 de AHUD sont réalisés.

Les spectres ¹H et ¹³C obtenus avec le produit de glucosylation n°1 de l’AHUD sont en accord avec une monoglucosylation de l’AHUD.

Le pic n°1 du chromatogramme présenté en Figure 11 correspond à l’acide 11-O-(a-D- glucopyranosyl)-undécanoïque.

4.3. Production et caractérisation structurale de produits de glucosylation de l’AEA par BRS-B A1

4.3.1. Production de lots de dérivés glycosylés de l’acide érythro-aleuritigue à l’échelle du gramme.

La production des produits de glucosylation de l’AEA est réalisée par l’enzyme BRS-B A1 sur 1 ,5 g d’AEA. Les conditions réactionnelles sont les suivantes :

- Concentration finale en saccharose : 584,7 mM

- Concentration finale en AEA : 10 mM (initialement dissoute dans le DMSO à 100 mM)

- Tampon acétate de sodium à 50mM et à pH = 5,75

- Eau ultra-pure qsp 500 mL

- Activité de BRS-B en réaction : 1 U.mL'¹ La réaction est menée à 30°C sous agitation magnétique. Après 24 heures, la réaction est arrêtée par incubation à 95°C pendant 10 minutes. Le mélange est conservé à -20°C avant purification.

4.3.2. Purification des glycolipides issus de AEA produits par l’enzyme BRS-B A1 .

Une étape de prépurification des glycolipides issus de l’AEA est réalisée par chromatographie flash grâce à un système REVELERIS® X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) équipé d’une colonne contenant 80 g de phase stationnaire Silice- Ci 8. Les produits de glucosylation sont séparés des sucres libres résiduels grâce aux étapes d’élution suivantes à un débit de 60 ml. min^-1 :

- 3 volumes de colonne (VC) d’F O ultra pure 100 %.

- Gradient passant de 100 % H2O ultra pure à 100 % acétonitrile en 2 VC.

- 1 VC à 100 % acétonitrile.

- Retour à 100 % H2O ultra pure en 0,5 VC

- Ré-équilibration à 100 % H2O ultra pure pendant 1 ,5 VC

Les produits de glucosylation sont recueillis lors du gradient en acétonitrile.

La Figure 12 illustre le chromatogramme obtenu au cours de cette étape de pré-purification par chromatographie flash.

L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation de l’AEA n°4 dont le temps de rétention est 16,16 min conduit à deux ions majoritaires à m/z 465,4 [M- H]’ et m/z 579,3 [M+TFA-H]'. Ces ions confirment l’obtention d’une forme mono-glucosylée de l’AEA.

L’analyse LC-MS en mode électrospray négatif du produit de glucosylation l’AEA n°5 dont le temps de rétention est 14,12 min conduit à deux ions majoritaires à m/z 627,4 [M-H]' et m/z 741 ,4 [M+TFA-H]'). Ces deux ions à + 162 uma par rapport au pic 4 (m/z 465,4), confirment l’obtention d’une forme di-glucosylée de l’AEA.

Ces deux principales formes glucosylées de l’acide éryhtro-aleuritique sont alors purifiées sur un système semi-préparatif constitué d’une chaine CLHP Agilent 1260 Infinite couplée à un collecteur de fraction « Dionex Ultimate 3000 automated fraction collector ». La séparation est assurée par une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée de manière isocratique avec un mélange FW/Acétonitrile 78 %/22 % v/v à un débit de 1 mL.min'¹.

4.3.3. Analyse RMN des produits du qlucosylation de l’AEA purifiés.

La caractérisation des produits de glucosylation de l’AEA n°4 (AEA monoglucosylé) et n°5 (AEA diglucosylé) est réalisée par RMN. Les spectres 1 H, 13C, HSQC et HMBC ont été enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500 MHz à 298K avec une sonde BBI probe H-BB-D Z-Grd 5mm. Les données ont été acquises et traitées grâce au logiciel TopSpin 3.

Caractérisation du produit de glycosylation n°4 de l’AEA (AEA monoglucosylé)

Un spectre ¹ H et un spectre ¹³C du produit de glucosylation n°4 de AEA sont réalisés.

Les spectres ¹H et ¹³C obtenus avec le produit de glucosylation n°4 de AEA sont en accord avec une monoglucosylation de l’AEA.

Le spectre ¹H met en évidence un proton anomérique à un déplacement chimique de 4,77 ppm. Le spectre ¹³C met en évidence la présence des pics négatifs carbone C9 et C10 superposés à un déplacement chimique de 75,38 ppm, ce qui prouve l’absence de glucosylation sur les deux hydroxyles secondaires. La glucosylation se trouve donc au niveau du carbone positif n°16 déblindé à 69,21 ppm.

Le pic n°4 du chromatogramme présenté en Figure 12 correspond à l’acide-16-O-(a-D- glucopyranosyl)-9,10-dihydroxy-hexadécanoïque.

Caractérisation du produit de glucosylation n°5 de l’AEA (AEA diglucosylé)

Un spectre ¹ H et un spectre ¹³C du produit de glucosylation n°5 de l’AEA sont réalisés.

Les spectres ¹H et ¹³C obtenus avec le produit de glucosylation n°4 de l’AEA sont en accord avec une diglucosylation de l’AEA.

Le spectre ¹H met en évidence deux protons anomériques à un déplacement chimique de 4,79 ppm et 5,14 ppm et des deux carbones anomériques à 100,34 ppm et 101 ,89 ppm. Comme la forme monoglucosylée, les pics carbones négatifs C9 et C10 sont toujours présents à 75,41 ppm, ce qui démontre une diglucosylation en position C16.

Le spectre 2D HMBC de l’AEA montre une liaison osidique du type a-1 ,3 entre les deux unités glucosyle.

Le pic n°5 du chromatogramme présenté en Figure 12 correspond à un AEA diglucosylé de type acide-16-O-(a-D-glucopyranosyl)-(1 ,3)-a-D-glucopyranosyl)-9,10-dihydroxy- hexadécanoïque.

Exemple 5 : Glucosylation d’acides gras oméga-hydroxylés ayant une chaine hydrocarbonée comportant un nombre de carbone supérieur à 11

Les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 dites de branchement ont été testées pour glucosyler les Acides 12-HydroxyDoDécanoïque (AHDD), 15-HydroxyPentaDecanoïque (AHPD) et 16-HydroxyHexaHecanoïque (AHHD) comprenant respectivement 12, 15 et 16 atomes de carbone.

La Figure 13 montre les produits de glucosylation obtenus à 37°C sous 800 rpm d’agitation dans les conditions de synthèse suivantes :

- Concentration initiale de saccharose : 877 mM

- Concentration initiale d’acide oméga-hydroxylé : [AHDD]=10mM ; [AHPD]=1 mM et [AHHD]= 0,5 mM,

- 10% v/v de DMSO

- Tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75

- Activité enzymatique : 1 U.mL'¹

En vue de leur analyse par CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. La séparation est réalisée avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 pm, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre maintenu à 3,2 secondes. La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) contenant 0,05% (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min'¹ selon le gradient suivant :

- Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution à 0% (v/v) de la voie B.

- Une phase de gradient passant de 0% de la voie B à 100% de la voie B en 35 minutes.

L’analyse des deux chromatogrammes présentés en Figure 14 prouve la possibilité de glucosyler des acides gras longues chaînes porteurs d’hydroxyle primaire en position œ (jusqu'à C16 au moins).

En effet, la comparaison des temps initiaux (témoin) et finaux des réactions montre l’apparition de nombreux produits de glucosylation entre les temps d’élution 17 minutes et 22 minutes pour l’AHDD, entre 19 minutes et 25 minutes pour l’AHPD et entre 21 minutes et 27 minutes pour l’AHPD.

L’efficacité de glucosylation est dépendante de la taille de chaîne des accepteurs co- hydroxylés considérés. La glucosylation des accepteurs de longueur de chaîne plus élevée est obtenue uniquement en diminuant les concentrations de travail (de 10 mM pour le AHDD à 0,5 mM pour le AHHD par exemple).

Glucosylation de l’acide 12-hvdroxydodécanoïque (AHDD)

Les enzymes de branchements BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 (spécifiques de la liaison a-1 ,2) et l’enzyme BRS-E (spécifique de la liaison a-1 ,3) semblent dans ce cas encore être les enzymes les plus efficaces.

En effet, les taux de conversion sont pour l’AHDD, de 60% ; 40% et 42% pour les enzymes. BRS-A, BRS-D A1 et GBD-CD2 AN 123 respectivement et seulement de 18% ; 11% et 17% pour les enzymes BRS-B A1 , BRS-C et BRS-E A1 respectivement.

Les chromatogrammes obtenus montrent des profils de multi-glucosylation avec de nombreux pics dont deux majoritaires élués à 21 et 22 minutes. Glucosylation de l’acide 15-hydroxypentadécanoïque (AHPD) et l’acide 16- hydroxyhexadécanoïque (AHHD)

La glucosylation des accepteurs de plus longues chaînes est plus efficace avec les deux enzymes de branchement BRS-A (a-1 ,2 spécifique) et BRS-B (a-1 ,3 spécifique). En effet, les taux de conversion obtenus avec ces accepteurs sont :

- pour le AHPD, de 70 % pour BRS-A et de 33 % pour BRS-C. Les rendements de transformation du AHPD sont uniquement de 5,0 %, 22 %, 13 %, 29 % pour BRS-C, BRS- D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 respectivement.

Pour le AHHD, de 38 % pour BRS-A et de 21 % pour BRS-C. Les rendements de transformation du AHHD sont uniquement de 5 %, 12 %, 6 % et 12 % pour BRS-C, BRS- D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123 respectivement.

Exemple 6 : Glucosylation des acides 9,10-dihydroxyoctadécanoïque et 9, 10, 12- trihydroxyoctadécanoïque par les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN 123

Les enzymes BRS-A, BRS-B A1 , BRS-C, BRS-D A1 , BRS-E A1 et GBD-CD2 AN123 (a- transglucosylase de branchement) ont été testées pour glucosyler les acides 9, 10- dihydroxyoctadécanoïque (ADHO) et 9, 10, 12-trihydroxyoctadécanoïque (ATHO).

La Figure 14 montre les produits de glucosylation obtenus à 37°C sous 800 rpm d’agitation dans les conditions de synthèse suivantes :

- Concentration initiale de saccharose : 877 mM

- Concentration initiale d’acide gras poly-hydroxylé (ADHO et ATHO) : 5 mM, - 10% v/v de DMSO

- Tampon acétate de sodium 50 mM à pH=5,75

- Activité enzymatique : 1 U.mL'¹

En vue de leur analyse par CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de l’éthanol absolu. La séparation est réalisée avec une colonne Synergi™ Fusion-RP (porosité de 80 Â, granulométrie de 4 m, greffage C18 avec terminaison polaire, Phenomenex, USA). L’élution est réalisée à 30°C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à un détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA). La température de nébulisation est fixée à 50°C et le filtre maintenu à 3,2 secondes. La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité CLHP (solvant B) contenant 0,05 % (v/v) d’acide formique. L’élution est réalisée à un débit de 1 mL.min'¹ selon le gradient suivant :

- Entre 0 min et 5 min, une première phase d’élution à 0 % (v/v) de la voie B.

- Une phase de gradient passant de 0 % de la voie B à 100 % de la voie B en 30 minutes.

L’analyse des deux chromatogrammes présentés en Figure 14A et Figure 14B prouve la possibilité de glucosyler des acides gras porteurs d’hydroxyle secondaire présent au sein même de la chaine carbonée uniquement.

En effet, la comparaison des temps initiaux (témoin) et finaux des réactions montre l’apparition de nombreux produits de glucosylation entre les temps d’élution 21 minutes et 26 minutes pour l’ADHO et 19 minutes et 23 minutes pour l’ATHO. La formation de ces produits de glucosylation parait beaucoup plus efficace avec l’acide gras trihydroxylé (ATHO) qu’avec la forme dihydroxylée ADHO, l’intensité des pics observés étant nettement plus importante dans le premier cas (ATHO).

De même, les taux de conversion varient entre 2 % et 30 % pour l’ATHO et entre 1% et 11 % pour l’ADHO selon les enzymes de branchement considérées.

Les enzymes de branchement BRS-A, BRS-D A1 , GBD-CD2 AN123 (spécifiques de la liaison a-1 ,2) et l’enzyme BRS-E (spécifique de la liaison a-1 ,3) semblent être les enzymes les plus efficaces dans les deux cas.

Exemple 7 : Glucosylation d’acides gras hydroxylés par des mutants de l’enzyme GBD CD2 AN123

Des mutants de l’enzyme GBD CD2 AN 123 ont été testés pour glucosyler les acides gras hydroxylés suivants : acide 11-[2-[hydroxy-alkyl)-sulfanyl]-undécanoïque (AHESU), acide 11-hydroxyundécanoïque (AHUD) acide 12-hydroxydodécanoïque (AHDD), acide 15-hydroxypentanoïque (AHPD), acide érythro-aleuritique (AEA), acide 9,10,12-trihydroxy octadécanoïque (ATHO). Les résultats montrent que ces mutants sont très performants dans la mesure où ils présentent des taux de conversion très supérieurs. Des taux de conversion des acides gras hydroxylés suivants sont obtenus :

Taux de conversion obtenus avec des mutants de GBD CD2 AN 123.

Les mutants de GBD-CD2 AN 123 permettent également d’obtenir des produits de glucosylation ayant des motifs osidiques de taille plus élevée.

Exemple 8 : Etude des propriétés émulsifiantes des produits de glucosylation de l’AHESU par BRS-A et de AHUD par BRS-B A1

8.1. Préparation des émulsions

Les propriétés émulsifiantes des produits de glucosylation de l’AHESU par l’enzyme BRS- A (ci-après désigné Glc-AHESU) et de l’AHUD par BRS-B A1 (ci-après Glc-AHUD) ont été évaluées. Phase aqueuse

Une solution aqueuse comprenant 2 % massique de Glc-AHESU est préparée.

Le pH de la solution aqueuse est ajusté à l’aide d’une solution de NaOH à 1 M (les pH étudiés sont de 4, 5, 6 et 10,5).

Ces différents pH permettent de balayer les différents états d’ionisation de la fonction carboxyle des composés qu’ils se situent en dessous, à proximité et au-dessus du pKa (pKa moyen de Glc-AHESU = 4,88 ; pKa moyen de Glc-AHUD = 5, déterminés par dosage acido-basique).

Phase huileuse

Le dodécane est utilisé comme huile modèle.

Emulsification

L’huile est ajoutée lentement à la solution aqueuse tout en homogénéisant à l’aide d’un Ultra Turrax T25 (Janke & kunkel, IKA) réglé à 3000 rpm.

Le pourcentage final en huile est de 20 % massique.

La préparation est ensuite mise sous agitation pendant 10 minutes en augmentant la vitesse de l’Ultra Turrax à 9 000 rpm.

L’évolution cinétique des émulsions ainsi formées est suivie dans le temps par granulométrie laser (diffusion statique de la lumière) (Mastersizer 2000, Malvern Instruments), microscope optique et observation macroscopique.

La distribution granulométrique des émulsions est caractérisée en termes du diamètre moyen des gouttes en volume, D(4,3), et de polydispersité, P, définis ci-dessus ([Chem 1] et [Chem 2]). 8.2. Emulsions obtenues avec Glc-AHESU

8.2.1. Caractérisation des émulsions obtenues avec Glc-AHESU

La Figure 15 montre les caractéristiques des émulsions le jour de leur préparation (JO) aux différents pH étudiés.

Les émulsions formées sont d’un aspect blanc laiteux. Les granulométries initiales sont globalement assez proches quel que soit le pH : le diamètre moyen est de l’ordre de 4- 5 pm et la polydispersité est comprise entre 0,27 et 0,49. L’émulsion à pH=10,5 est plus polydisperse que les autres avec un élargissement vers les faibles diamètres.

L’émulsion à pH=4 se déstabilise par coalescence (fusion entre gouttes) dans les heures qui suivent sa fabrication et est détruite au bout de 3 jours (séparation macroscopique de l’huile et de la phase aqueuse) (Figure 16). Les émulsions au pH=5, 6 et 10,5 sont cinétiquement stables dans le temps sur au moins 6 mois. La taille des gouttes reste quasi inchangée comme le montre le suivi du diamètre des gouttes D(4,3) en fonction du temps (Figure 16).

On peut également noter un phénomène de crémage (Figure 16), qui consiste en la concentration des gouttes d’huile à la surface de l’émulsion sous l’effet de la gravité, les gouttes ayant une densité inférieure à celle de la phase aqueuse.

Le produit de glucosylation Glc-AHESU permet donc de stabiliser les émulsions dont la phase aqueuse présente un pH supérieur au pKa. L’instabilité observée à faible pH traduit l’existence d’une composante électrostatique forte dans la stabilisation des émulsions. La répulsion électrostatique qui empêche la coalescence (recombinaison) des gouttes résulte des molécules de tensioactifs chargées adsorbées aux interfaces.

8.2.2 Etude de la déstabilisation d’une émulsion obtenue avec Glc-AHESU par modulation de pH

Du fait de la présence d’une fonction acide sur Glc-AHESU et de la dépendance en pH de la stabilité des émulsions décrites ci-dessus (coalescence observée rapidement à pH=4), on peut envisager l’obtention d’émulsions pH-stimulables i.e. stables dans une gamme de pH et se déstabilisant à un pH donné, « à la demande ».

Des essais ont été réalisés dans ce but (Figure 17).

L’émulsion initiale est préparée à pH=6, pH où l’émulsion est stable dans le temps comme montré précédemment. Une solution d’HCI (0,1 M) est alors ajoutée pour faire chuter le pH à 2. L’émulsion est complètement détruite après 24h.

Les émulsions sont également stimulables par ajout de sel. En effet, une émulsion à pH 10,5 préparée avec 0,1 M de NaCI se déstabilise au bout de cinq jours alors qu’elle est toujours stable au bout de 6 mois en absence de sel. Ceci conforte l’hypothèse selon laquelle la stabilisation est d’origine électrostatique dans la mesure où il est connu que l’ajout de sel écrante la répulsion électrostatique.

8.3. Propriétés des émulsions obtenues avec Glc-AHUD

8.3.1. Caractérisation des émulsions obtenues avec Glc-AHUD

La Figure 18 montre les caractéristiques des émulsions le jour de leur préparation (JO) aux différents pH étudiés.

Les émulsions formées sont d’un aspect blanc laiteux. Les granulométries initiales sont globalement assez proches pour les pH supérieurs à 5 : le diamètre moyen est de l’ordre de 4-5 pm et la polydispersité est comprise entre 0,30 et 0,34. On notera qu’à pH=4 le diamètre moyen des gouttes est plus important (8,51 pm), avec une polydispersité de 0,39.

L’émulsion à pH= 3,6 est détruite au bout de 1 jour (Figure 19). Les émulsions au pH=5 ; 6,1 et 10,5 sont cinétiquement stables dans le temps pendant au moins 14 jours.

La taille des gouttes reste quasi inchangée jusqu’à 14 jours comme le montre le suivi du diamètre des gouttes D(4,3) en fonction du temps (Figure 19). On observe sur les émulsions à pH 5 et pH 6,1 l’apparition d’une fine couche d’huile entre 14 et 30 jours, traduisant une déstabilisation de l’émulsion par coalescence. Les mesures granulométriques sont interrompues dès lors que cette couche devient visuellement perceptible. Pour le pH 10,5, une augmentation progressive de la taille des gouttes sans que l’aspect macroscopique ne soit impacté à ce stade est observée. Le suivi à 6 mois montre l’apparition d’une fine couche d’huile. Pour toutes les émulsions, on note un phénomène de crémage qui consiste en la concentration des gouttes d’huile à la surface de l’émulsion sous l’effet de la gravité, les gouttes ayant une densité inférieure à celle de la phase aqueuse. Ce phénomène peut être limité en ajoutant un épaississant dans la phase aqueuse.

Glc-AHUD agit donc comme un agent tensio-actif stabilisant des émulsions aux valeurs de pH supérieures au pKa et plus particulièrement à pH fortement basique (stabilité plus importante à pH 10,5 qu’à pH 6). L’instabilité observée à faible pH traduit l’existence d’une composante électrostatique forte dans la stabilisation des émulsions. La répulsion électrostatique qui empêche la coalescence des gouttes résulte des molécules de tensioactifs chargées adsorbées aux interfaces.

8.3.2. Etude de la déstabilisation d’une émulsion obtenue avec Glc-AHUD par modulation de pH

Glc-AHU permet de fabriquer des émulsions pH-stimulables c’est-à-dire stables dans une gamme de pH et qui se déstabilisent à un pH donné, « à la demande ».

Des essais préliminaires ont été réalisés dans ce but (Figure 20). L’émulsion initiale est préparée à pH 6, pH où l’émulsion est stable dans le temps comme montré précédemment. Une solution d’HCI (0,1 M) est alors ajoutée pour faire chuter le pH à 2. L’émulsion est totalement déstabilisée après deux heures.

8.4. Propriétés d’auto-motilité des émulsions préparées avec Glc-AHESU et Glc-AHUD

Un phénomène d’auto-motilité a été observé avec une émulsion préparée avec Glc- AHESU et Glc-AHUD.

En effet, lorsque qu’une goutte d’émulsion (environ 20 pL) est déposée sur un substrat solide (lame de verre, support plastique, support modifié afin de modifier l’hydrophobicité), on observe que celle-ci est soumise à des phénomènes convectifs très intenses. La goutte non seulement se déplace mais s’étale et se contracte de façon spasmodique et périodique sur son support.

Un phénomène consistant en l’apparition/disparition subite de zones transparentes au voisinage de la surface de l’émulsion a en outre été observé avec les émulsion préparées avec Glc-AHESU et Glc-AHUD.

En effet, dans certains cas, des zones transparentes (non laiteuses) et donc déplétées en gouttes, se forment de façon spontanée à proximité de la surface de la goutte et disparaissent aussitôt (phénomène semblable à un phénomène d'ébullition sans toutefois que des bulles ne se forment). Là encore, le phénomène semble se produire avec une certaine périodicité de l’ordre de quelques secondes à quelques minutes selon la composition des systèmes.

Ces phénomènes dépendent de nombreux facteurs : évaporation, nature du support, taille des gouttes de phase dispersée et concentration, nature de l’huile comme le montre la Figure 21 qui récapitule l’influence de ces paramètres sur l’intensité de ces phénomènes.

Ces phénomènes sont vraisemblablement la manifestation de l’effet Marangoni, sous différentes formes (R. T. van Gaalen, C.Diddens, H.M.A. Wijshoff, J. G. M. Kuerten (2021 ). Marangoni circulation in evaporating droplets in the presence of soluble surfactants, Journal of Colloid and Interface Science, Volume 584, Pages 622-633). Celui-ci se traduit par la convection de matière à grande échelle, consécutivement à l’apparition d’un gradient de tension interfaciale.

De telles émulsions présentent l’avantage d’être « auto-étalables » et « auto-agitées », ce qui permet d’entrevoir différentes applications dans le domaine du nettoyage des surfaces.

Exemple 9 : Etude de la préparation d’émulsions sèches à l’aide de glycolipides selon l’invention

Selon un autre mode de réalisation, la composition se présente sous forme de poudre sèche, ladite poudre sèche étant avantageusement redispersable dans l’eau. La forme sèche redispersable présente de nombreux avantages : facilité de transport, durée de conservation prolongée du fait de l’absence de développement bactériologique. Généralement, les émulsions stabilisées par des tensioactifs se déstabilisent lors du séchage (exsudation d’huile). Avantageusement, les émulsions à base des glycolipides synthétisés dans la présente invention peuvent être séchées sans se déstabiliser et sont redispersables dans l’eau.

9.1. Matériel et méthodes

9.1.1. Préparation d’une émulsion primaire

Phase aqueuse

Une solution aqueuse comprenant 2 % massique de Glc-AHESU et 10 % de lactose est préparée. Le lactose est ajouté dans la phase aqueuse comme agent cryoprotecteur.

Le pH de la solution aqueuse est ajusté à pH=6 à l’aide d’une solution de NaOH.

Phase huileuse

Le dodécane est utilisé comme huile modèle.

Emulsification

L’huile est ajoutée lentement à la solution aqueuse tout en homogénéisant à l’aide d’un Ultra Turrax T25 (Janke & Kunkel, I KA) réglé à 3000 rpm.

Le pourcentage en huile est de 20 % massique.

La préparation est ensuite mise sous agitation pendant 10 minutes en augmentant la vitesse de l’Ultra Turrax à 9 500 rpm.

Une émulsion primaire est obtenue. Son diamètre moyen est de 4,94 pm (P = 0.27) (Figure 22). 9.2.2. Préparation de l’émulsion sèche

Une émulsion sèche est obtenue en lyophilisant l’émulsion primaire préalablement congelée à -80°C.

9.2.3. Redispersion de l’émulsion sèche

L’émulsion sèche est redispersée en rajoutant de l’eau pure en quantité équivalente à celle évaporer lors du séchage.

9.3. Résultats

Les résultats montrent qu’une émulsion primaire préparée avec Glc-AHESU peut être mise sous forme d’émulsion sèche et redispersée sous faible agitation. Aucune exsudation d’huile n’est observée à l’issue du séchage et le diamètre moyen de l’émulsion redispersée est inférieur à 10 pm (Figure 22)

Exemple 10 : Etude des propriétés antimicrobiennes des produits de glucosylation

10.1. Matériel et méthodes

Des souches d’E. Coli K12 sont cultivées en présence de concentration de 0 % w/v, 0,5 % w/v, 1 % w/v, 2 % w/v et 2,5 % w/v de produits de glucosylation de AHUD ou AEA en phase aqueuse.

L’absorbance des cultures en présence des produits de glucosylation de AHUD ou AEA est suivie à une densité optique de 600 nm.

10.2. Résultats

Les résultats (Figure 23) montrent que les produits de glucosylation de l’AHUD et de l’AEA sont bactériostatiques pour des teneurs de 1 % w/v.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d’au moins un glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) dans laquelle

[Glc]_n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles- ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ;

R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, -xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Gy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci ; ledit procédé comprenant une étape de glucosylation d’un acide gras hydroxylé de formule (II) :

R-yOH (ll) dans laquelle R est un radical acide gras tel que défini dans la formule (I), -yOH représente un groupe hydroxyle rattaché à un atome de carbone Cy tel que défini ci- dessus ; ladite étape comprenant la mise en contact de l’acide gras hydroxylé de formule (II) avec au moins une a-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou d’un analogue de saccharose.

2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’a-transglucosylase de la famille GH70 est une saccharase de branchement de la famille GH70, une glucane- saccharase de la famille GH70, ou un mélange de celles-ci.

3. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la saccharase de branchement de la famille GH70 pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant GBD-CD2 AN123 (SEQ ID NO : 1 ), BRS-A (SEQ ID NO : 2), BRS-B A1 (SEQ ID NO : 3), BRS-C (SEQ ID NO : 4), BRS-D A1 (SEQ ID NO : 5), BRS-E A1 (SEQ ID NO : 6), ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’homologie de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 6.

4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la saccharase de branchement de la famille GH70 pour séquence d’acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant GBD-CD2 AN123 W2135L F2136L (SEQ ID NO :7), GBD-CD2 AN123 W2135L (SEQ ID NO : 8), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136Y (SEQ ID NO: 9), GBD-CD2 AN123 W2135I F2136C (SEQ ID NO :10), GBD-CD2 AN123 W2135V (SEQ ID NO : 11 ) ), ou une séquence d’acides aminés présentant au moins 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % d’homologie de séquence avec au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 7 à SEQ ID NO : 11 .

5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape i) est de préférence réalisée avec un rapport molaire saccharose ou analogue de saccharose : acide gras hydroxylé de formule (II) compris entre 1 et 100, de préférence entre 10 et 100.

6. Glycolipide répondant à la formule (I) : [Glc]n-xOy-R (I) dans laquelle [Glc]n représente un motif osidique linéaire ou ramifié comprenant n unités glucosyle, avec n compris entre 1 et 7, avec la condition que lorsque le motif osidique comprend plusieurs unités glucosyle celles- ci sont liées entre elles par des liaisons osidique de type a ; R représente un radical acide gras comprenant entre 4 et 24 atomes de carbone, dont la chaine carbonée est linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, optionnellement interrompue par un ou plusieurs atomes de soufre, optionnellement encore pouvant comprendre un ou plusieurs substituants choisis parmi le groupe hydroxyle, le groupe carbonyle, le groupe méthoxyle, le groupe amine, le groupe nitrosyle, et le groupe thiol, -xOy- symbolise le rattachement du radical acide gras au motif osidique par une liaison éther reliant un atome de carbone Cx d’un résidu glucosyle du motif osidique, antérieurement portant un groupe hydroxyle, à un atome de carbone Cy du radical acide gras, antérieurement portant un groupe hydroxyle, avec Cx la position de l’atome du résidu glucosyle sur lequel s’effectue la liaison, Cx représentant l’atome de carbone C1 du résidu glucosyle, Cy étant un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée du radical acide gras ou à l’extrémité oméga de celle-ci.

7. Glycolipide selon la revendication 6, dans lequel l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné à l’extrémité oméga du radical acide gras.

8. Glycolipide selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel le glycolipide répond à la formule (la) :

[Glc]_n-xOy-(CH₂)b-S-(CH₂)a-COOH dans lequel a est compris entre 9 et 14, b est supérieur ou égal à 2, et la somme de a et b est inférieure à 23.

9. Glycolipide selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 dans lequel le glycolipide répond à la formule (Ib) :

[Glc]n-xOy-(CH₂)_a-COOH (Ib) dans lequel a est compris entre 3 et 23, de préférence est compris entre 10 et 15.

10. Glycolipide selon la revendication 6, dans lequel le radical acide gras est substitué par un ou deux groupes hydroxyle, et de préférence dans lequel : l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné à l’extrémité oméga, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par un ou deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée, ou l’atome de carbone Cy est un atome de carbone positionné le long de la chaine carbonée, et la chaine carbonée du radical acide gras est substituée par deux groupes hydroxyle, avec un groupe hydroxyle positionné le long de la chaine carbonée et un groupe hydroxyle positionné en position oméga de celle-ci, ou avec deux groupes hydroxyle positionnés le long de la chaine carbonée.

11. Utilisation d’un glycolipide de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 6 à 10, à titre d’agent antimicrobien.

12. Utilisation d’un glycolipide de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 6 à 10, à titre d’agent tensioactif.

13. Emulsion huile-dans-eau comprenant une phase huileuse dispersée dans une phase aqueuse et au moins un glycolipide de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que l’émulsion est cinétiquement stable lorsque le pH de la phase aqueuse est supérieur à un potentiel hydrogène seuil pHs avantageusement compris entre 2 et 5.

14. Emulsion selon la revendication 13 sous la forme d’une émulsion sèche.

15. Utilisation d’une émulsion selon la revendication 14 pour le nettoyage de surfaces.