FR3045608A1 - Dextrane carboxyle - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un dextrane ayant de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques α-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Di compris de 1,3 à 3, et dont tout ou partie des fonctions hydroxyles sont modifiées en groupements de formule (I) : -O-(CH2)n-(C6H4)m-COOX (I) dans laquelle : - n est un entier variant de 1 à 4, - m est égal à 0 ou 1, et X, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de l'atome d'hydrogène, des métaux alcalins, des cations organiques, et leurs mélanges, ledit dextrane possédant un degré de substitution DS en groupements de formule (I) de 0,01 à 3,0.
Description
La présente invention concerne des dérivés de dextranes de haute masse molaire modifiés. Elle concerne également une composition comprenant ces dérivés de dextranes et leurs applications.
Les dextranes et les dérivés de dextranes ont un nombre d’applications industrielles croissant.
Par exemple, les dextranes de masse molaire faible ou moyenne (allant généralement de 1 à 70 kDa) sont notamment utilisés pour des applications analytiques, par exemple comme supports versatiles de chromatographie, dans le domaine médical, par exemple en tant qu’extenseur du plasma sanguin grâce à leur faible caractère antigénique et leur faible viscosité en solution saline, transporteur de fer ou anticoagulant (après fonctionnalisation), dans la prévention des chocs post-opératoires, dans le traitement des brûlures ou dans la réduction de risques de thrombose ou d’embolies.
Pour leur part, les dextranes de masse molaire plus élevée sont particulièrement intéressants pour leur viscosité élevée.
Sauf indication contraire, on entend par « masse molaire » ou « masses molaires moyennes », dans la présente invention, la masse molaire moyenne en poids.
Un des modes de préparation de ces dextranes est la voie enzymatique utilisant les glucane-saccharases.
Les glucane-saccharases d’origine bactérienne sont des transglucosylases appartenant aux familles 13 et 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’a-glucanes formés d’unités glucosyle. Les glucane-saccharases présentent des spécificités de produits différentes, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées (a-1,2 ; a-1,3 ; a-1,4 ou a-1,6), que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés.
Parmi les glucane-saccharases, les dextrane-saccharases produisent du dextrane présentant de manière générale au moins 50 % de liaisons osidiques a-1,6 dans la chaîne principale, et des ramifications en a-1,2, a-1,3 et/ou a-1,4. Le taux de ramifications ainsi que leur arrangement spatial varient suivant l’enzyme productrice.
Il existe en particulier des glucane-saccharases permettant d’accéder à des dextranes de masse molaire très élevée, notamment supérieure à 105 kDa. Toutefois, les dextranes produits par les glucane-saccharases connues jusqu’à maintenant ne s’avèrent pas totalement satisfaisantes. Ils présentent des insuffisances, en particulier liés à des indices de dispersité élevés ou à des masses molaires moyennes qui ne dépassent pas 105 kDa, ainsi que des propriétés rhéologiques, notamment un pouvoir texturant, relativement limitées.
Il subsiste donc toujours un besoin pour des dextranes de haute masse molaire, de faible dispersité, et présentant des propriétés rhéologiques avantageuses.
Ainsi, la présente invention concerne des dérivés de dextranes ayant de telles propriétés avantageuses.
Plus précisément, les inventeurs ont constaté qu’il est possible d’accéder à de nouveaux dextranes dotés précisément des propriétés rhéologiques améliorées via la sélection d’une enzyme spécifique et la modification du dextrane ainsi obtenu. Dérivés de dextranes selon l’invention
Selon un premier de ses aspects, la présente invention concerne un dextrane ayant de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3, et dont tout ou partie des fonctions hydroxyles sont modifiées en groupements de formule (I) : -0-(CH2)n-(C6H4)m-C00X (I) dans laquelle : n est un entier variant de 1 à 4, m est égal à 0 ou 1, et X, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de : o l’atome d’hydrogène, o les métaux alcalins, de préférence Na, K, et Li, o les cations organiques, de préférence azotés, phosphorés ou soufrés, o et leurs mélanges, ledit dextrane possédant un degré de substitution DS en groupements de formule (I) de 0,01 à 3,0.
Dans les groupements de formule (I), chaque atome d’oxygène représenté par « -O- » est relié par une liaison covalente à un atome de carbone du squelette carboné polymère du dextrane, formant ainsi une liaison éther.
Un dérivé de dextrane selon l’invention est encore qualifié de « dextrane carboxylé », du fait de l’introduction de fonctions acide carboxylique ou carboxylate sur le dextrane.
Les groupements de formule (I) sont aussi appelés « groupements carboxyliques ».
En fonction du pH dans lequel les dextranes carboxylés sont mis en œuvre, les groupements carboxyliques de formule (I) peuvent être sous forme acide (acide carboxylique) ou sous forme salifiée (carboxylate). Une partie desdits groupements peut être sous forme acide tandis qu’une autre partie desdits groupements peut être sous forme salifiée.
Selon un mode de réalisation, m est égal à 0.
Les dextranes carboxylés selon ce mode sont également appelés dextranes carboxyalkylés.
Selon une variante préférée de ce mode de réalisation, n est égal à 1.
Les dextranes modifiés selon cette variante sont des dextranes carboxyméthylés.
Selon un autre mode de réalisation, m est égal à 1.
Le radical divalent -(C5H4)- désigne un radical phénylène, de préférence un radical de formule :
Selon une variante préférée de ce mode de réalisation, n est égal à 1.
Parmi les métaux alcalins, X désigne de préférence un cation Na+.
Parmi les cations organiques, X peut désigner l’ion ammonium NH4+ ou un analogue portant un ou plusieurs radicaux hydrocarbonés, saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés, éventuellement cycliques. X peut ainsi désigner par exemple un ion tétraméthylammonium, tétraéhylammonium, tétra(isobutyl)ammonium, tétra(hydroxyméthyl)ammonium, triméthylbenzylammonium, pyridinium, ou imidazolinium.
Parmi les cations organiques, X peut aussi désigner l’ion phosphonium ou un analogue portant un ou plusieurs radicaux hydrocarbonés, saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés. X peut ainsi désigner par exemple un ion tétraméthylphosphonium, tétraéthylphosphonium, tétra(isobutyl)phosphonium, tétra(hydroxyméthyl)phosphonium, ou triméthylbenzylphosphonium.
Parmi les cations organiques, X peut encore désigner l’ion sulfonium ou un analogue portant un ou plusieurs radicaux hydrocarbonés, saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés. X peut ainsi désigner par exemple un ion triméthylsulfonium, tetraéthylsulfonium, tri(isobutyl)sulfonium, tri(hydroxyméthyl)sulfonium, ou diméthylbenzylsulfonium.
Le degré de substitution (DS) en groupements carboxyliques d’un dextrane carboxylé selon l’invention va de 0,01 à 3,0, de préférence de 0,01 à 2,0, préférentiellement de 0,05 à 1,0, avantageusement de 0,05 à 0,5, plus particulièrement de 0,1 à 0,4.
Selon un mode de réalisation particulier, le degré de substitution (DS) va de 0,05 à 0,2.
Le degré de substitution est défini selon la présente invention comme étant le nombre moyen, par unité monosaccharidique du dextrane, de groupements hydroxyles substitués par un groupement carboxylique.
Une méthode de mesure du degré de substitution (DS) de dextranes carboxylés est notamment décrite dans Bohari Yaacob et al. Iranian Polymer Journal 20 (3), 2011, 195-204 et dans les publications citées.
Ces dextranes carboxylés dérivent de la fonctionnalisation de tout ou partie des fonctions hydroxyle d’un dextrane spécifique, à savoir possédant de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.
De préférence, ces dextranes spécifiques et les dextranes carboxylés selon l’invention présentent une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 1.106 kDa.
Typiquement, la masse molaire moyenne en poids Mw de ces dextranes est inférieure à 5.107 kDa, de préférence inférieure à 1.107 kDa, de préférence inférieure à 5.106 kDa.
Ils présentent ainsi l’avantage d’avoir une masse molaire extrêmement élevée et contrôlée, de l’ordre de 10 fois supérieure aux dextranes conventionnels.
En outre, ils présentent un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3, de préférence compris de 1,5 à 2,5. De préférence encore, l’indice de dispersité Dj est de 1,8 ± 0,3. Ainsi, bien que leur masse molaire soit très élevée, ces dextranes présentent également l’avantage d’avoir un indice de dispersité faible. En comparaison, un dextrane commercial de 2.103 kDa a un indice de dispersité de 3.49 (Rolland-Sabaté et al, Biomacromolecules, 2008, vol 9, 1719-1730).
Les dextranes spécifiques et les dextranes modifiés selon l’invention présentent en outre de manière avantageuse de 1 % à 5 %, de préférence de 2 % à 3 %, de préférence encore de 2 % à 2,5 %, de liaisons glucosidiques a-1,3. De manière particulièrement avantageuse, ces dextranes présentent 97,55 % de liaisons glucosidiques a-1,6 et 2,45 % de liaisons glucosidiques a-1,3. Les dextranes conformes à ce mode sont donc appelés « dextranes quasi-linéaires ».
Comme illustré dans l’exemple 3, les dextranes carboxylés conformes à l’invention sont particulièrement avantageux compte-tenu de leur viscosité et seuil d’écoulement, qui s’avèrent supérieurs aux dextranes spécifiques dont ils dérivent. Du fait de leur pouvoir viscosifiant supérieur, les dextranes carboxylés conformes à l’invention permettent donc d’accéder à des viscosités équivalentes à celles obtenues avec des dextranes non modifiés, mais en utilisant des quantités réduites de dextranes.
En outre, les groupements carboxyle de formule (I) peuvent avantageusement servir pour introduire des fonctions ester ou amide sur les dextranes.
Ces dextranes spécifiques peuvent être notamment synthétisés par une dextrane-saccharase spécifique, dont la séquence d’acides aminés est la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
Dans la suite de la description, la dextrane-saccharase ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1 est appelée DSR-OK.
La dextrane-saccharase DSR-OK est une dextrane-saccharase très spécifique de la polymérisation par liaisons osidiques de type a-1,6, et est une excellente polymérase.
Elle est composée de 1484 acides aminés, possédant la triade catalytique DED et les 4 motifs conservés décrits habituellement chez les enzymes de la famille 70 des glycoside-hydrolases. Les motifs protéiques conservés du cœur catalytique (I à IV) ont ainsi été identifiés de la position 936 à la position 942 pour le motif I, de la position 458 à la position 468 pour le motif II, de la position 495 à la position 505 pour le motif III et de la position 568 à la position 582 pour le motif IV. En comparaison avec la séquence protéique de la glucane-saccharase GTF-180, les cinq domaines structuraux classiquement décrits pour les glucane-saccharases (A, B, C, IV et V) (5) peuvent être identifiés dans la structure primaire de DSR-OK (Figure 1).
Procédé de carboxylation
Le procédé de préparation d’un dextrane carboxylé conforme à l’invention comprend ainsi au moins les étapes suivantes : a) mettre à disposition un dextrane présentant de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.10e kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3, et b) faire réagir ledit dextrane avec un agent de carboxylation en milieu aqueux basique.
Etape a)
Avantageusement, le dextrane spécifique précurseur du dextrane carboxylé selon l’invention est biosynthétisé par la dextrane-saccharase ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, appelée DSR-OK.
La dextrane-saccharase DSR-OK a une température optimale de fonctionnement d’environ 30°C et un pH optimal d’environ 5,75. A 30°C, cette dextrane-saccharase est stable et robuste, son temps de demi-vie étant d’environ 111 h lors d’une caractérisation en milieu brut, i.e. non purifié. Cette propriété est particulièrement intéressante et rare chez les glucane-saccharases. Ainsi, en comparaison, DSR-S Δ4Ν, autre glucane-saccharase recombinante, présente un temps de demi-vie de seulement 24h dans les mêmes conditions.
Par ailleurs, DSR-OK suit un mécanisme Michaelien, avec une inhibition par excès de substrat, et est un catalyseur très performant en comparaison à d’autres dextrane-saccharases similaires. Par exemple, DSR-OK a une constante d’affinité, Km, de 8.99 mM et une constante catalytique, Kcat, de 550 s"1. L’enzyme a donc une bonne affinité pour le substrat (Km), du même ordre de grandeur que la plupart des dextrane-saccharases caractérisées, et présente une constante catalytique (kcat) excellente, rarement observée chez les glucane-saccharases. L’enzyme DSR-ΟΚ est donc extrêmement efficace pour catalyser des réactions de polymérisation à partir de saccharose.
Les variants conservateurs de fonction peuvent également être mis en œuvre dans le procédé de l’invention.
On appelle « variant conservateur de fonction », un variant dans lequel un (ou plusieurs) résidu d’acide aminé donné dans une protéine a été modifié sans pour autant altérer la conformation globale et l’activité enzymatique de dextrane-saccharase permettant de synthétiser des dextranes conformes à l’invention. Typiquement, la modification peut concerner des parties non sensibles de l’enzyme, et ne concerne notamment pas la triade catalytique.
Typiquement, un tel variant conservateur de fonction est une dextrane-saccharase dont la séquence d’acides aminés a au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité sur les positions allant de 359 à 1038 sur la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1, ce qui correspond aux domaines A+B+C de l’enzyme, à condition que l’activité enzymatique de dextrane-saccharase, permettant de synthétiser des dextranes conformes à l’invention, soit maintenue.
Une dextrane-saccharase adaptée à la production de dextranes spécifiques selon l’invention peut donc aussi bien être l’enzyme de séquence SEQ ID NO : 1, telle que précédemment définie, qu’un variant de l’enzyme dextrane-saccharase de séquence SEQ ID NO : 1, à condition que ce variant soit conservateur de fonction de l’enzyme. L’activité enzymatique d’un variant de dextrane-saccharase peut être testée selon des techniques connues de l’homme du métier, par exemple par la méthode à l’acide dinitrosalicylique (DNS) de Sumner et Howell (Sumner & Howell, Journal of biological chemistry, 1935, vol 108, Issue 51) ou par analyse HPLC. D’une manière générale, la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ ou un variant conservateur de fonction est incubée dans un milieu de synthèse contenant du saccharose.
De manière avantageuse, la réaction est conduite à une température comprise de 20°C à 40°C, de préférence comprise de 25°C à 35°C, de préférence encore comprise de 30°C à 33°C. Typiquement, la réaction est conduite à une température d’environ 30°C.
Typiquement, la réaction est conduite pendant une durée comprise de 4 heures à 20 heures, de préférence comprise de 8 heures à 16 heures, de préférence pendant une durée d’environ 12 heures.
De plus, la concentration en saccharose est de préférence comprise de environ 50 à 200 g/kg, de préférence de environ 50 à 150 g/kg. Typiquement, la concentration en saccharose est d’environ 100 g/kg. De manière générale, il est connu que la masse molaire moyenne du dextrane synthétisé sera plus susceptible d’être élevée en utilisant une concentration initiale en saccharose faible.
De manière avantageuse, le pH lors de la réaction est compris de environ 5 à 6,5, de préférence de 5 à 6, de préférence encore de 5 à 5,8. Typiquement, le pH lors de la réaction est d’environ 5,75.
Selon un mode de réalisation particulier, l’incubation est effectuée dans un milieu de synthèse comprenant au moins 0,1 % en poids d’au moins un tensioactif, notamment choisi parmi les tensioactifs anioniques, les tensioactifs cationiques, les tensioactifs non-ioniques et les tensioactifs amphotères.
Selon un mode de réalisation particulier, l’incubation est effectuée dans un milieu de synthèse comprenant au moins 0,1 % en poids de NaCl, ledit milieu de synthèse comprenant par exemple de l’eau de mer, voire consistant en de l’eau de mer.
Bien entendu, la dextrane-saccharase, de préférence une dextrane-saccharase DSR-OK telle que précédemment décrite ou un variant conservateur de fonction, peut être exprimée à partir d’un vecteur d'expression approprié contenant la séquence nucléique adéquate et qui sera alors introduit dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote adéquat.
Le gène dsrok a été identifié au sein du génome d’Oenococcus kitaharae DSM 17330 (disponible dans la base de données NCBI sous le numéro de référence NZ_CM001398) par blast nucléotidique contre une base de données constituée de séquences nucléotidiques de glucane-saccharases répertoriées dans la famille des glycoside-hydrolases 70 selon CAZY (Carbohydrate Active enZYme database, www.cazy.org/GH70_all.html). Il a été traduit en séquence protéique grâce au logiciel disponible en ligne, Transeq d’EMBOSS (www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/). L’absence de peptide signal a été prédite par le logiciel SignalP server 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Des alignements protéiques multiples (avec le logiciel d’alignement global, ClustalW2, disponible en ligne, www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) avec d’autres glucane-saccharases caractérisées ont permis d’identifier les motifs conservés du cœur catalytique de DSR-OK, et de découper l’enzyme en différents domaines protéiques (A, B, C, IV et V).
La séquence protéique de l’enzyme DSR-OK est la séquence 1, dite SEQ ID NO : 1, telle que décrite ci-après : mmatgsnlitaqaddlnqegtaaqsvspstaaanqsessaqsteqsatqaatdgeastvstavttitphyvqqag kwlymgsdgefvkgpqtidgnlqffdeqgiqikgsfetvdgssyyfdsqsgnavtgfkiinndlhyfeedgketv nnyatdkqgnifyfdengqmatgvktiqgqsyyfdqdghmrkgysgvfdnqvlyfdkttgalantnvssikeglt aqnddftahnavystksesftnidgyltaeawyrpadilengtdwrasradefrpilttwwpdkqtevnylnymk tqgfitndqdfklsddqlllnhaaqsvqgeiekkisqqgstdwlktllqtfinqqpswngesedpgsdhlqggal tfvnspltpdsnsnfrllnrtptnqtgtpqydtdaslggfelllandvdnsnpvvqaeqlnwlyyllnfgsitad dpnanfdgiridavdnvdadllqiaaayfkdafksgsndqttnqhlsiledwshndpeymkaqgypqltmddymh tqliwsltkpdnirgtmqrfmdyylvnrandstnneavanysfvrahdsevqtviaqiisdlypnsgsglipttd qlqaafevynadmksdvkkytqynipsayamlltnkdtvprvyygdmytddgdymankspyfdaistllkarvky aaggqsmavdkndiltsvrfgqnamlasdsgdnqtrqegigvivsnnshlklaendqvvlhmgaahknqafrail ltiesglenfdtdlqapvkytdangdliftaaelagylnpevsgylsawvpvgaadnqdartaadsatstdgnvf hsnaaldsnvifegfsnfqsiptaeqhddftnvkiaenaglfkdwgitsfqlapqyrsstdstfldsiiqngyaf tdrydlgfdtptkygdvddlraaikalhanniqvmadwvpdqiynlqnpeiitvnrtdsygqpiagsdlqndlyl aytngggqyqtkfggafleklqqlypdlftktqistgqtidpsqkitewsakyfngsniqgrgayyvlrdsgtdq yfkvisndeneaflpkqltnqpgetgfsqddqgiiffstsgyqaknafvqgddgnyyyfdntghmvtgpqtingr hylffpngveaqnvfvqndrgetyyydqrgrqvanqyvtdtngnsfrfdengimlanqlaqvdghwqffkssgvq akdafilgsdgklryfesgngnmavnefkgsengryyyfgadgqavsglqtingrqlyfddhgqqmkdafytnqs gqrfyfnaltgdlvkgnfiytsasssftpdndssdsyqgdshlwyyadsqgqivtgfqtinghlqyfddisgqmi tnrfmrradgnwiyldengeavrgmrvingltnyfrddftqvkdgfaqdpnsgerhyfngtngamvtndyfspdq ihwyyaddsgqpvtgfqtikgqvqyfdqdgiqlkggsqtdpvtkqtyyfddkfgngqil.
Un vecteur d'expression est typiquement un plasmide, un cosmide, un épisome, un chromosome artificiel, un phage ou un vecteur viral.
Typiquement, l'expression des acides nucléiques de la présente invention peut être réalisée dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes. Comme exemple non limitatifs de souches de cellule hôte procaryotes, on peut citer des souches telles que Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou des souches du genre Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococcus. Comme exemple non limitatifs de souches de cellules hôtes eucaryotes, on peut citer des souches telles que des parasites Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia) Leishmania ou Trypanosoma, ou des cellules de levure telles que Saccharomyces comme Saccharomyces cerevisiae oupombe, Pichiapastoris etc.
De manière préférentielle, des cellules hôtes procaryotes sont utilisées. Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules utilisées pour l’expression des acides nucléiques de la présente invention sont Escherichia coli et de manière encore préférentielle, les souches sont choisies parmi TOPIO, BL21AI, BL21 Star DE3, Arctic Express DE3.
De manière avantageuse, la dextrane-saccharase peut comprendre en outre, à l’extrémité N-terminale, une séquence signal. Cette séquence signal peut être une des séquences signal connues de l'homme du métier, notamment afin que, lorsque la protéine est synthétisée dans une cellule hôte, la synthèse de dextrane puisse être effectuée de manière extracellulaire. En effet, la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ ne possède pas de peptide signal. La présence d’un peptide signal adapté permet ainsi la synthèse de dextrane de manière extracellulaire. De plus, des outils génétiques sont de plus en plus développés pour l’expression hétérologue chez des microorganismes GRAS (Generally Recognized As Safe) du genre Bacillus et Lactococcus. Ainsi, il existe à l’heure actuelle, plusieurs systèmes connus d’excrétion de protéines recombinantes chez ces bactéries, pouvant être utilisées dans le cas présent par l’homme du métier.
Comme mentionné à l’Exemple 1, la production recombinante de dextrane-saccharase chez Escherichia coli utilisant les conditions décrites dans l’Exemple 1 atteint environ 30 000 Unités d’activité enzymatique par litre de culture, ce qui permet son utilisation à faible coût dans des procédés de synthèse de dextranes.
Une dextrane-saccharase convenant à la biosynthèse du dextrane précurseur des dextranes carboxylés de l’invention peut ainsi être préparée par culture de cellules hôtes contenant une séquence d'acides nucléiques codant une dextrane-saccharase, de préférence une dextrane-saccharase DSR-OK telle que précédemment décrite ou un variant conservateur de fonction, dans des conditions permettant l’expression d’une dextrane-saccharase, et par isolement de ladite dextrane-saccharase du milieu de culture selon les techniques connues de l’homme du métier.
De telles dextrane-saccharases peuvent ensuite être purifiées par toute technique de purification connue de l’homme du métier, par exemple par précipitation, chromatographie par échange d’ions, chromatographie d’affinité, chromatographie d’échange hydrophobe, filtration sur gel, chromatographie HPLC en phase inverse, etc. Selon un mode de réalisation préférentiel, la dextrane-saccharase obtenue par culture de cellule hôte est purifiée par chromatographie d’affinité. Elles peuvent également être immobilisées par des techniques connues de l’homme du métier, notamment par exemple par adsorption, formation de liaison covalente entre le support et la protéine, inclusion ou encapsulation.
Selon un autre mode de réalisation, cette dextrane-saccharase peut être préparée directement par culture de la souche native Oenococcus kitaharae. La souche Oenococcus kitaharae ne possède en effet qu’un seul gène de dextrane-saccharase, codant pour DSR-OK.
Etape b)
Dans la deuxième étape du procédé de l’invention, le dextrane spécifique selon l’invention est mis à réagir avec un agent de carboxylation en milieu aqueux basique.
Comme décrit ci-dessus, cette réaction consiste à greffer des groupements carboxylique de formule (I) telle que décrite ci-dessus sur les fonctions alcools du dextrane, par formation de liaisons éther.
Ce type de réaction est connu en soi et a déjà été appliquée à la préparation de divers polysaccharides carboxylés, notamment des dextranes carboxylés, en particulier des dextranes carboxyalkylés comme par exemple des dextranes carboxyméthylés.
La réaction est de préférence effectuée à une température de 20°C à 80°C, de préférence de 40°C à 70°C, avantageusement de 55°C à 65°C.
La réaction est de préférence effectuée en solution aqueuse alcaline, ayant un pH de 8 à 14.
La réaction est de préférence effectuée en présence d’une base minérale, telle qu’un hydroxyde de métal alcalin ou alcalino-terreux, comme par exemple KOH, LiOH ou NaOH. L’agent de carboxylation mis en œuvre a typiquement pour formule (Γ) : X’-(CH2)„-(C6H4)m-COOX (Γ) dans laquelle n, m et X sont tels que définis dans la formule (I) et X’ est un halogène, de préférence un chlore ou un brome, préférentiellement un chlore. A titre d’agent de carboxyalkylation (cas où m est égal à 0), on peut utiliser un agent de carboxyméthylation (cas où n est égal à 1), apte à greffer des groupements carboxyméthyle de formule -CH2-COOX sur les fonctions alcools du dextrane. A titre d’agent de carboxyméthylation, on peut citer les haloacétates de métal alcalin, par exemple le monochloroacétate de sodium de formule ClCH2COONa. A titre d’agent de carboxylation, on peut aussi utiliser un réactif de formule (Γ) où m et n sont tous les deux égaux à 1. L’homme du métier sera en mesure d’ajuster la quantité en agent de carboxylation au vu de la concentration en dextrane dans le milieu aqueux et en fonction du degré de substitution qu’il souhait obtenir.
De manière préférée, le rapport massique de l’agent de carboxylation sur le dextrane est de 0,1 à 10, de préférence de 0,5 à 5, par exemple égal à 2.
Selon un mode de réalisation particulier, la deuxième étape du procédé de l’invention est effectuée dans un milieu comprenant au moins 0,1 % en poids d’au moins un tensioactif, notamment choisi parmi les tensioactifs anioniques, les tensioactifs cationiques, les tensioactifs non-ioniques et les tensioactifs amphotères.
Selon un mode de réalisation particulier, la deuxième étape du procédé de l’invention est effectuée dans un milieu comprenant au moins 0,1 % en poids de NaCl, ledit milieu de synthèse comprenant par exemple de l’eau de mer.
Composition
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition aqueuse comprenant un dextrane carboxylé, de préférence carboxyalkylé, préférentiellement carboxyméthylé, selon l’invention.
Cette composition peut être obtenue en mettant en œuvre le procédé de l’invention décrit ci-dessus.
La composition de l’invention peut ainsi comprendre en outre une dextrane-saccharase telle que définie ci-dessus, à savoir une dextrane-saccharase ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
Application
Les caractéristiques structurales particulières des dextranes selon l’invention leur confèrent des propriétés physico-chimiques particulièrement intéressantes, permettant leur utilisation dans de nombreuses applications, et notamment dans l’industrie pétrolière.
En ce qui concerne les propriétés rhéologiques, les dextranes conformes à l’invention ont une viscosité dynamique élevée pour de faibles vitesses de cisaillement et présentent un comportement de type rhéofluidifiant ou pseudo-plastique, leur viscosité dynamique diminuant avec l’augmentation du gradient de vitesse (ou vitesse de cisaillement).
Par ailleurs, la viscosité de ces dextranes est peu affectée par des contraintes de cisaillement constantes de longue durée, leur permettant d’être adaptés à des procédés industriels pour lesquels une agitation permanente est nécessaire.
En outre, ces dextranes présentent un seuil d’écoulement relativement élevé, en particulier compris de 25 à 40 Pa selon la quantité initiale de saccharose présente dans le milieu réactionnel.
Ils peuvent avantageusement posséder un comportement de type gel faible. Ceci est caractérisé par des mesures de rhéologie en conditions dynamiques, avec détection des modules élastique ou module de conservation G’ et le module visqueux ou module de perte G”. Pour un gel, G’ est supérieur à G” sur la gamme de fréquence étudiée.
Enfin, les dextranes selon l’invention présentent des températures de transition vitreuse de 95°C pour un teneur en eau de 6,6 %, et de 25°C pour une teneur en eau de 12,9 %. En d’autres termes, pour une teneur en eau d’environ 13 %, les dextranes selon l’invention présentent un état caoutchouteux, souple à des températures supérieures à 25 °C environ et sont considérés comme « cassant » en dessous de 25°C environ.
Au regard de ces propriétés, les dextranes et compositions de l’invention sont particulièrement adaptés à une utilisation dans fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole.
En effet, la récupération assistée du pétrole brut présent dans une formation rocheuse s'effectue généralement en plusieurs étapes. La première phase de production résulte de l'énergie naturelle du pétrole en place qui s'écoule librement. Cette récupération primaire représente en général de 5 % à 20 % de la quantité moyenne de pétrole présente dans la formation rocheuse. Lorsque la pression diminue et que l'extraction devient plus difficile, il devient nécessaire de mettre en œuvre d'autres phases de production, appelées méthodes de récupération secondaire et tertiaire. Ces méthodes consistent à injecter sous pression dans la formation souterraine un fluide d'injection via un puits d'injection. Du fait de ses propriétés d'immiscibilité avec le pétrole, le fluide d'injection pousse le pétrole vers les puits de production. Cette technique est appelée récupération assistée de pétrole (EOR pour Enhanced OU Recovery en anglais) et elle permet généralement de récupérer de 25 % à 75 % du pétrole en présence. Dans la récupération secondaire, on injecte un liquide aqueux tel que de la saumure ou de l'eau douce dans un puits, tandis que dans le cadre de la récupération tertiaire, des additifs ont été mélangés avec le fluide d'injection aqueux préalablement aux étapes d'injection.
Les dextranes carboxylés de rinvention, possédant une capacité viscosifiante élevée, sont particulièrement adaptés à répaississement de formulations aqueuses, et en particulier les fluides utilisés en EOR, les formulations cosmétiques, les formulations détergentes, les formulations agrochimiques.
Le fait qu’ils confèrent un seuil d’écoulement aux formulations aqueuses les rend tout particulièrement utiles dans les formulations contenant des dispersions ou émulsions dont on souhaite éviter la coalescence, l’agrégation, le crémage ou la décantation.
En particulier, les dextranes carboxylés de l’invention sont adaptés dans les fluides de forage pétrolier utilisés pour construire les puits et les fissures, dans lesquels il existe un besoin pour mettre en suspension et garder en suspension les débris de roche (fluides de forage pour la construction des puits), ou mettre en suspension et garder en suspension les proppants (fluides de fracturation).
Les dextranes carboxylés de l’invention sont également adaptés dans les fluides utilisés pour évacuer les déblais lors de la construction de tunnels ; dans les compositions cosmétiques notamment pour stabiliser les dispersions ou émulsions d’émollients, d’huiles, d’exfoliants, d’additifs anti-pelliculaires insolubles ; dans les compositions détergentes notamment pour stabiliser les dispersions ou émulsions de parfum ; dans les compositions aqueuses agro-chimiques notamment pour stabiliser les « slurries » ; ou encore dans les peintures aqueuses notamment pour stabiliser les pigments.
Figures
Figure 1 : Représentation schématique de la structure primaire de DSR-ΟΚ (basée sur l’alignement protéique avec l’enzyme GFT180 de Lactobacillus reuteri 180). Cinq domaines sont distincts : domaine V en rouge, domaine IV en jaune, domaine B en vert, domaine A en bleu et domaine C en violet. La triade catalytique est indiquée par les lettres blanches « D », « E » et « D ».
Figure 2 : Spectre obtenu par RMN du proton sur le dextrane synthétisé par DSR-OK recombinante. Les flèches correspondent aux liaisons a-1,3 et a-1,6.
Figure 3 : Profil d’élution obtenu par AF4-MALLS (Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation - Multi-Angle Laser Light Scattering) (DI = réponse réfractométrique, Dl-DL = diffusion de lumière) et distribution en masse molaire du dextrane produit par préparation de DSR-OK recombinante (DI Mw).
Figure 4 : Représentation du rayon de giration (en nm) en fonction de la masse molaire pour différents dextranes : gcnl produit par un mutant de DSR-S Δ4Ν, le dextrane produit par DSR-OK et un dextrane commercial T2000 (Pharmacosmos) de 2.103 kDa.
Figure 5: Propriétés rhéologiques (viscosité) de dextranes carboxyméthylés issus de la dextrane-saccharase DSR-OK.
Figure 6: Propriétés rhéologiques (viscosité) de gomme xanthane (O) et dextranes carboxyméthylés issus de la dextrane-saccharase DSR-OK ().
EXEMPLES
Exemple 1 - Synthèse de la dextrane-saccharase DSR-OK
Le gène dsrok a tout d’abord été amplifié par PCR, à partir de l’ADN génomique de la souche Oenococcus kitaharae DSM 17330, en utilisant les deux amorces présentés dans le Tableau 1.
Tableau 1 L’addition des 4 bases, CACC, en 5’ de l’amorce forward a permis l’insertion correcte du fragment PCR dans le vecteur d’entrée pENTR/D/TOPO (Life Technologies), afin de procéder par la suite à un clonage utilisant la technologie Gateway.
Un clone d’entrée positif (vecteur d’entrée contenant le fragment PCR dans le sens désiré) a été sélectionné et recombiné avec le vecteur de destination pET-53-DEST (Novagen) à l’aide de la LR clonase enzyme mix II (Life technologies). Les clones recombinants positifs ont été sélectionnés et analysés par restriction. L’absence de mutation au sein des plasmides a été confirmée par séquençage (GATC).
Pour la production de l’enzyme recombinante, des cellules A' Escherichia coli BL21 star DE3 ont été transformées avec le plasmide pET-53/DSR-OK construit comme indiqué précédemment. 300 pL du mix de transformation ont été ensemencés dans 30 mL de milieu LB (Lysogeny Broth), supplémenté avec 100 pg/mL d’ampicilline, et mis à incuber pendant la nuit à 37°C afin de préparer une préculture.
Des cultures d’IL en milieu ZYM5052 modifié (1 % glycérol, 0 % glucose, 1 % lactose, cf. Studier et al. Prot. Exp. Pur. 2005, 41, 207-234) ont ainsi été ensemencées à une densité optique DO600 nm initiale de 0,05 à partir de la pré-culture de la veille, puis mises à incuber 24 heures à 23°C et 150 rpm. En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés (15 min, 6500 rpm, 4°C) et les culots sont concentrés à une DO de 80 nm dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75.
Afin d’obtenir l’enzyme recombinante (produite par Escherichia coli de manière intracellulaire), les cellules sont cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30 % de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Le surnageant de sonication (contenant l’enzyme recombinante soluble) est ensuite récupéré après 30 minutes de centrifugation (10000 rpm, 10°C) et conservé à 4°C.
La production recombinante de dextrane-saccharase chez Escherichia coli utilisant les conditions décrites ici atteint environ 30 000 Unités d’activité enzymatique par litre de culture.
Exemple 2 - Caractérisation du dextrane produit par la dextrane-saccharase DSR-OK
Les synthèses de dextrane sont réalisées à partir de saccharose (généralement 100 g/kg), à 30°C dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75 et en utilisant 1 U/mL d’enzyme sur une durée de 15 h. Pour la plupart des analyses, le polymère a été purifié par deux précipitations à l’éthanol 50 %, suivi de deux lavages et d’une re-suspension dans de l’eau ultra-pure avant d’être lyophilisé.
Après lyophilisation, 20 mg de dextrane purifié sont dilués dans 0,5 mL d’eau deutérée et analysés par RMN du proton avec le spectromètre Bruker Avance (500 MHz). Les spectres sont ensuite traités et interprétés avec le logiciel TOPSPIN 3.0.
Il a ainsi été mis en évidence par les analyses RMN que le produit synthétisé à partir de 100 g/kg de saccharose, à 30°C, pH 5.75, est un polymère d’unités glucosyle liées à 97,6 % (± 0.2 %) en a-1,6, et 2,4 % en a-1,3, comme le montre la Figure 2.
La masse molaire moyenne en nombre et en poids, et la structure du dextrane synthétisé par DSR-OK, ont été analysées par AFFFF-MALLS (Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation - Multi-Angle Laser Light Scattering), à partir des milieux de synthèse bruts selon les conditions de production décrites dans l’Exemple 1.
Les échantillons ont été dilués 500 fois, dans de l’eau contenant 0,02 % d’azoture de sodium et filtrés sur membrane Durapore de 0,45 pm avant injection (rendement de filtration > 90 %). Le mode opératoire est le même que celui utilisé pour caractériser les dextranes de haute masse molaire synthétisés par des variants de DSR-S Δ4Ν (Irague et al, BioMacromolecules, 2012, vol 13, Issue 1, 187-195). Ainsi, les échantillons sont injectés à 0,2 mL/min sur une durée de 300s avec un flux croisé de 1 mL/min. Une fois l’injection terminée, un temps de relaxation de 60 secondes est imposé aux échantillons. L’élution est réalisée sous un flux d’entraînement de 0,84 mL/min, à un flux croisé constant de 0,1 mL/min pendant 3125 secondes, à température ambiante. Les valeurs des masses molaires (Mi) et celles des rayons de giration (RGi) sont déterminées avec le logiciel ASTRA version 5.3.2.13 (Wyatt Technology). A chaque intervalle de temps (i), la réponse réfractométrique permet de déterminer la concentration Ci. La masse molaire et le rayon de giration sont déterminés par extrapolation de la relation de la diffusion de la lumière à angle nul, à l’aide d’un diagramme de Berry selon :
où, K est la constante optique, Re, le rapport de Rayleigh, λ, la longueur d’onde du faisceau du laser incident, n l’indice de réfraction de la lumière et Θ, l’angle d’observation.
Le logiciel ASTRA calcule directement les masses molaires moyennes en poids (Mw) et en nombre (M„), ainsi que le rayon de giration moyen en z (Rgz) selon les relations suivantes :
Le rapport M„/M„ représente l’indice de dispersité, Di.
La densité (dcapp) est calculée à partir de l’équation suivante :
où Rgw représente le rayon de giration moyen en poids.
Le coefficient hydrodynamique, Ug, est déterminé à partir de la représentation graphique du rayon de giration (Rgî) en fonction de la masse molaire (Mi) et selon l’équation : où KG est une constante.
La valeur du paramètre de branchement gM est calculée selon la relation suivante :
où RGw(br) et RGw(iin) représentent les rayons de giration moyen en poids du polymère branché de son équivalent linéaire de même nature chimique et de même masse molaire.
Il a ainsi été mis en évidence par l’analyse des caractéristiques macromoléculaires que le dextrane présente une très haute masse molaire moyenne en poids Mw d’environ 1,01.106 kDa (± 0,3.106 kDa), comme visible à la Figure 3.
La masse molaire moyenne en nombre est également élevée, à savoir Mn = 5.5.105 kDa (± 1.6.105 kDa). L’indice de dispersité Dj du dextrane produit par DSR-ΟΚ est donc d’environ 1,8, ce qui représente un indice très faible par rapport aux dextranes produits jusqu’à présent.
Par exemple, en comparaison du dextrane produit par la souche historique L. mesenteroides NRRL B-512F, et du dextrane produit par l’enzyme recombinante DSR-S Δ4Ν, le dextrane produit par la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ est de taille plus élevée, et est nettement moins polydisperse que le dextrane natif produit par la souche L. mesenteroides NRRL B-512F.
Le rayon de giration du polymère est aussi extrêmement élevé, de l’ordre de 370 nm (Figure 4). Le coefficient hydrodynamique, soit la pente du graphique représentant le rayon de giration en fonction de la masse molaire (Figure 4) est de 0,48. Cette valeur montre qu’il s’agit d’un polymère quasi-linéaire, très peu branché.
Le Tableau 2 reprend les principales caractéristiques macromoléculaires du dextrane produit par DSR-ΟΚ recombinante.
Tableau 2
Exemple 3 - Carboxvméthvlation de dextranes
La production de dextranes a été effectuée en présence de 100 g/kg de saccharose et 1 U/ml d’enzyme DSR-ΟΚ à 30°C dans un tampon sodium acétate à 50 mM à pH 5,2.
Afin de séparer les dextranes des autres produits de réaction (glucose, fructose, isomères de saccharose et autres maltooligosaccharides), de l’éthanol (50 % v/v) à 4°C a été ajouté au milieu réactionnel. Le dextrane précipité a été isolé par centrifugation (10 min, 10 000 g) et resuspendu dans 1 volume d’eau mQ (2 fois). Le dextrane purifié a été resuspendu dans de l’eau mQ et lyophilisé.
La réaction de carboxyméthylation a été effectuée tel que décrit précédemment dans Huynh et al. Die Angewandte Makromolekulare Chemie, 1998,254, 61-65. 1 g de dextrane purifié a été solubilisé dans 45 ml d’eau mQ et incubé à température ambiante pendant 2 h. Puis, 5 ml de 0,5M NaOH ont été ajoutés lentement en agitant doucement pendant 30 minutes. Ensuite, 2 g de SMCA (monochloroacétate de sodium) ont été ajoutés sous agitation jusqu’à dissolution complète et homogénéisation du mélange. Le rapport massique SMCA/dextrane est égal à 2.
Le mélange réactionnel a été chauffé à 60°C pendant 90 minutes et refroidi à température ambiante avant neutralisation avec de l’acide acétique glacial.
Les produits ont été dialysés pendant 15 h (« over night ») sur eau mQ et précipités avec de l’éthanol (50 % v/v), centrifugés pendant 45 minutes à 11 000 g, lavés avec de l’éthanol (50 % v/v) et centrifugés pendant 20 minutes à 11 000 g. Le dextrane carboxyméthylé a été resuspendu dans de l’eau et lyophilisé.
Une réaction de contrôle a été effectuée en parallèle dans les mêmes conditions, sauf que le SMCA n’a pas été additionné.
Exemple 4 - Caractérisation des dextranes carboxyméthylés
1. HPSEC
La masse molaire des dextranes carboxyméthylés purifiés a été analysée par HPSEC.
Il a été observé que la masse molaire n’a pas été affectée par l’étape de carboxyméthylation, ce qui signifie que les dextranes n’ont pas été dépolymérisés. 2. Degré de substitution (DS)
Le degré de substitution des dextranes carboxyméthylés a été mesuré selon la procédure décrite dans in Bohari Yaacob et al. Iranian Polymer Journal 20 (3), 2011, 195-204.
Etape 1 : conversion en forme acide 0,25 g de dextrane carboxyméthylé 25 ml de solution acidifiée d’isopropylamine (IPA) (10 % HCl 12N, 90 % isopropylamine) Incubation pendant 2 h.
Lavages successifs avec 80 % IPA et 99 % IPA. Séchage pendant 15 h (« overnight ») à 50° C.
Etape 2: dosage 0,1 g de dextrane carboxyméthylé
0,8 ml de 99 % IPA 20 ml d’eau
0,8 ml de 0.5N NaOH
Agiter pendant 45-60 minutes.
Addition de 2-3 gouttes de phénolphthaléine Dosage par 0.1N HCl.
Etape 3 : calcul de DS
DS = 0.162*A/(1-0.058*A) A = milli-équivalents de functionalités acide par g d’échantillon
B = dosage du blanc en mL
V = dosage de l’échantillon en mL N = normalité de la solution de HCl W = masse de l’échantillon dosé en g A= (3,95-l,8)*0,l = 0,215/0,1= 2,15 DS = 0.162*2.15/(l-0.058*At = 0.39 3. Propriétés rhéologiques
Les propriétés rhéologiques des dextranes produits par l’enzyme DSR-ΟΚ ont été comparées avant et après carboxyméthylation.
Les échantillons purifiés ont été resuspendus à 2 %, 1 %, 0,5 % et 0,25 % (w/v) dans de l’eau et les propriétés rhéologiques ont été mesurées en utilisant un rhéomètre Thermo Scientific™ HAAKE™ MARS™ avec une géométrie cône-plan (diamètre=60 mm ; angle du cône=l° ; cône C60/l° TiL). Les mesures ont été effectuées à 20°C. Une pré-contrainte a été appliquée à l’échantillon pour homogénéisation (500 s"1 pendant 120 secondes). Après 5 minutes de repos, les mesures de viscosité (Pa s) ont été effectuées à des contraintes allant de 0.1 s'1 à 60 s"1.
La viscosité des dextranes est plus élevée après carboxyméthylation (Figure 5).
La viscosité du dextrane carboxyméthylé (0,25 %, w/v) est proche de celle de la gomme xanthane (0,5 % w/v) (Figure 6).
Claims (15)
- REVENDICATION S1. Dextrane ayant de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3, et dont tout ou partie des fonctions hydroxyles sont modifiées en groupements de formule (I) : -0-(CH2)n-(C6H4)m-C00X (I) dans laquelle : n est un entier variant de 1 à 4, m est égal à 0 ou 1, et X, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de l’atome d’hydrogène, des métaux alcalins, des cations organiques, et leurs mélanges, ledit dextrane possédant un degré de substitution DS en groupements de formule (I) de 0,01 à 3,0.
- 2. Dextrane carboxylé selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est égal à 1 et m est égal à 0.
- 3. Dextrane carboxylé selon la revendication 1 ou 2, ayant un degré de substitution DS de 0,01 à 2,0, préférentiellement de 0,05 à 1,0, avantageusement de 0,05 à 0,5, plus particulièrement de 0,1 à 0,4.
- 4. Procédé de préparation d’un dextrane carboxylé selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant au moins les étapes suivantes : a) mettre à disposition un dextrane présentant de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Di compris de 1,3 à 3, et b) faire réagir ledit dextrane avec un agent de carboxylation en milieu aqueux basique.
- 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’étape a) comprend l’incubation avec du saccharose d’une dextrane-saccharase ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
- 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel la réaction de l’étape b) est effectuée à une température de 20°C à 80°C, de préférence de 40°C à 70°C, avantageusement de 55°C à 65°C.
- 7. Procédé selon l’une des revendications 4 à 6, dans lequel la réaction de l’étape b) est effectuée dans un milieu aqueux ayant un pH de 8 à 14.
- 8. Procédé selon l’une des revendications 4 à 7, dans lequel la réaction de l’étape b) est effectuée en présence d’une base minérale, telle qu’un hydroxyde de métal alcalin ou alcalino-terreux, comme par exemple KOH, LiOH ou NaOH.
- 9. Procédé selon l’une des revendications 4 à 8, dans lequel l’agent de carboxylation est un agent de carboxyméthylation.
- 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l’agent de carboxyméthylation est un haloacétate de métal alcalin, par exemple du monochloroacétate de sodium.
- 11. Procédé selon l’une des revendications 4 à 10, dans lequel le rapport massique de l’agent de carboxylation sur le dextrane est de 0,1 à 10, de préférence de 0,5 à 5, par exemple égal à 2.
- 12. Composition aqueuse comprenant un dextrane carboxylé selon l’une des revendications 1 à 3.
- 13. Composition aqueuse selon la revendication 11, comprenant en outre une dextrane-saccharase telle que définie dans la revendication 4.
- 14. Utilisation d’une composition aqueuse selon la revendication 12 ou 13 dans un fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole.
- 15. Utilisation d’une composition aqueuse selon la revendication 12 ou 13 dans une composition cosmétique ou dans une composition détergente.
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