JP6475620B2 - グルカンポリマー生成のためのグルコシルトランスフェラーゼ酵素 - Google Patents

Description

本出願は、それぞれ２０１２年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／７０５，１７７号明細書；米国仮特許出願第６１／７０５，１７８号明細書；米国仮特許出願第６１／７０５，１７９号明細書；米国仮特許出願第６１／７０５，１８０号明細書；および米国仮特許出願第６１／７０５，１８１号明細書の優先権を主張する。これらの先行出願は、全てその内容全体を参照によって本明細書に援用する。

本発明は、酵素触媒作用の分野にある。具体的には、本発明は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用して、高分子量不溶性ポリα−１，３−グルカンを生成することに関する。

酵素的合成、微生物または植物宿主の遺伝子操作を使用して、新しい構造多糖類を発見するという願望によって動かされ、研究者らは、生分解性であり、再生可能原材料から経済的に製造し得る多糖類を発見している。このような多糖類の１つは、α−１，３−グリコシド結合を有することで特徴付けられるグルカンポリマーである、ポリα−１，３−グルカンである。このポリマーは、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素に、スクロース水溶液を接触させることにより、単離されている（非特許文献１）。ポリα−１，３−グルカンから調製されるフィルムは、最高１５０℃の温度に耐えて、β−１，４−結合多糖類から得られるポリマーに優る利点を提供する（非特許文献２）。

特許文献１は、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素を使用する多糖類繊維の調製を開示した。この繊維のポリマー内の少なくとも５０％のヘキソース単位は、α−１，３−グリコシド結合によって結合した。Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素は、最終産物としてポリα−１，３−グルカンおよびフルクトースを生成する重合反応の基質として、スクロースを利用する（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。開示されるポリマーは、溶剤中にまたは溶剤を含んでなる混合物中に、臨界濃度を超えて溶解すると、液晶溶液を形成した。紡績およびテキスタイル用途で使用し得る、連続する強力な綿様繊維が、この溶液から得られた。

全てのグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、繊維の紡績で使用するのに適した分子量とα−１，３グリコシド結合百分率とがある、グルカンを生成し得るとは限らない。例えばほとんどのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度を有するグルカンを生成しない。

米国特許第７，０００，０００号明細書

Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１４５１−１４６０，１９９５ Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４７：３５３−３６２，１９８０

したがって、スクロースを高いα−１，３グリコシド結合百分率と高分子量とを有するグルカンポリマーに転換し得る、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定することが望ましい。

一実施形態では、本発明は、水、スクロース、およびポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含んでなる、反応溶液に関する。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。

第２の実施形態では、反応溶液中のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する。第３の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼは、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する。第４の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも２５０の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する。

第５の実施形態では、反応溶液は、プライマーを含んでなる。第６の実施形態では、このプライマーは、デキストランまたは加水分解グルカンであり得る。

第７の実施形態では、本発明は、少なくとも水、スクロース、およびポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させるステップを含んでなる、ポリα−１，３−グルカンを生成する方法に関する。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。この方法で生成されるポリα−１，３−グルカンは、任意選択的に単離し得る。

第８の実施形態では、方法で使用されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する。第９の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する。第１０の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも２５０の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する。

第１１の実施形態では、本方法の接触させるステップは、プライマーと、水、スクロース、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを接触させるステップをさらに含んでなる。第１２の実施形態では、このプライマーは、デキストランまたは加水分解グルカンであり得る。

配列の簡単な説明

全ての引用された特許および非特許文献の開示は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。

本明細書の用法では、「発明」または「開示される発明」という用語は、制限を意図するものでなく、特許請求の範囲で定義され、または本明細書に記載される発明のいずれかに、一般に当てはまる。これらの用語は、本明細書で同義的に使用される。

「ポリα−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカンポリマー」、および「グルカンポリマー」という用語は、本明細書で同義的に使用される。ポリα−１，３−グルカンは、少なくとも約５０％がα−１，３−グリコシド結合であるグリコシド結合によって、共に結合するグルコース単量体単位を含んでなる、ポリマーである。ポリα−１，３−グルカンは、多糖類の一種である。ポリα−１，３−グルカンの構造は、以下のように図示され得る。

「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ）」および「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）」という用語は、本明細書で同義的に使用され、炭水化物（糖）分子を別の炭水化物などの別のグループに連結する共有結合のタイプを指す。「α−１，３−グリコシド結合」という用語は、本明細書の用法では、隣接するα−Ｄ−グルコース環上の炭素１および３を通じてα−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する、共有結合のタイプを指す。この結合は、上に提供されるポリα−１，３−グルカン構造内に図示される。本明細書において、「α−Ｄ−グルコース」は、「グルコース」と称される。

「スクロース」という用語は、本明細書では、α−１，２−グリコシド結合によって結合する、α−Ｄ−グルコース分子とβ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元二糖類を指す。スクロースは、通常、砂糖として知られている。

本明細書のポリα−１，３−グルカンの「分子量」は、数平均分子量（Ｍ_ｎ）として、または重量平均分子量（Ｍ_ｗ）として表し得る。代案としては、分子量は、ダルトン、グラム／モル、ＤＰ_Ｗ（重量平均重合度）、またはＤＰ_ｎ（数平均重合度）として表し得る。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、またはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などの、これらの分子量測定値を計算するための様々な手段が、当該技術分野で公知である。

「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ｇｔｆ酵素」、「ｇｔｆ酵素触媒」、「ｇｔｆ」、および「グルカンスクラーゼ」という用語は、本明細書で同義的に使用される。本明細書において、ｇｔｆ酵素活性は、基質スクロースの反応を触媒して、ポリα−１，３−グルカンおよびフルクトース産物を生成する。ｇｔｆ反応のその他の産物（副産物）としては、グルコース（グルコースがグルコシル−ｇｔｆ酵素中間複合体から加水分解される）、様々な可溶性オリゴ糖類（ＤＰ２−ＤＰ７）、およびロイクロース（グルコシル−ｇｔｆ酵素中間複合体のグルコースがフルクトースに結合される）が挙げられる。ロイクロースは、α−１，５結合によって結合するグルコースとフルクトースとから構成される、二糖類である。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の野性型形態は、一般に、（Ｎ末端からＣ末端方向で）シグナルペプチド、可変領域、触媒領域、およびグルカン結合領域を含有する。本明細書において、ｇｔｆは、ＣＡＺｙ（炭水化物−活性酵素）データベースに準拠して、グリコシドヒドロラーゼ系統群７０（ＧＨ７０）に分類される（Ｃａｎｔａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）。

「反応」および「酵素反応」という用語は、本明細書で同義的に使用され、グルコシルトランスフェラーゼ酵素によって遂行される反応を指す。「反応溶液」は、本明細書の用法では、一般に、スクロースおよび水と、任意選択的にその他の成分とを含んでなる溶液中に、少なくとも１つの活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素を含んでなる溶液を指す。それは、水、スクロース、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させるステップがその中で実施される、反応溶液中にある。「適切な反応条件下」という用語は、本明細書の用法では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を通じたスクロースからポリα−１，３−グルカンへの転換をサポートする、反応条件を指す。反応は、本明細書では、自然発生しない。

「容量基準パーセント」、「容量パーセント」、「ｖｏｌ％」および「ｖ／ｖ％」という用語は、本明細書で同義的に使用される。溶液中の溶質の容量基準パーセントは、式、［（溶質容量）／（溶液容量）］×１００％を使用して求め得る。

「重量基準パーセント」、「重量百分率（ｗｔ％）」、および「重量−重量百分率（％ｗ／ｗ）」という用語は、本明細書で同義的に使用される。重量基準パーセントは、組成物、混合物、または溶液中に含まれる物質の質量を基準にした、百分率を指す。

「増大した」、「強化された」、および「改善された」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらの用語は、元の量または活性よりもわずかにより大きな量または活性、または元の量または活性を大幅に超える量または活性、そしてその間を含む全ての量または活性など、より大きな量または活性を指す。代案としては、これらの用語は、増大した量または活性が、比較される量または活性を、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％上回る量または活性を指してもよい。

「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「核酸配列」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであってもよい。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ断片、またはその混合物を含んでなってもよい。

「遺伝子」という用語は、本明細書の用法では、タンパク質を発現するポリヌクレオチド配列を指し、コード領域のみを指してもよく、またはコード領域上流および／または下流の制御配列を含んでもよい（例えばコード領域の転写開始部位上流の５’非翻訳領域）。「天然」または「内在性」の遺伝子は、それ自身の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指し；この遺伝子は、生物のゲノム内のその自然な位置に位置する。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。「外来性」または「異種」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物内に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。本明細書で開示される特定の実施形態のポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するように、そのコドン使用頻度がデザインされている遺伝子である。

天然アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が自然に存在するのに対し、非天然アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、自然界に存在しない。

「コード配列」は、本明細書の用法では、特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」は、本明細書の用法では、コーディング配列の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列である５’非翻訳領域と、３’非コード領域とを指し、それは結合するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与えてもよい。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、および遺伝子発現調節に関与するその他の要素が挙げられる。

「組み換え」という用語は、本明細書の用法では、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ分離している２つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。「組み換え」、「遺伝子組み換え」、「形質転換」、「遺伝子操作」または「外来性遺伝子発現のための改変」という用語は、本明細書で同義的に使用される。

「形質転換」という用語は、特定の実施形態における用法では、核酸分子の宿主生物への転移を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物または「形質転換体」と称される。

「組み換え」または「異種」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ分離している２つの配列セグメントの人為的組み合わせを指す。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して本明細書で使用される、「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大対応関係で整列させると同一である、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって「配列同一性の百分率」または「パーセント同一性」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適整列配列を比較することで判定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列との比較で、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列中で同一核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定し、整合位置数を得て、整合位置数を比較ウィンドウ中の位置総数で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。

例えば国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトにおいてオンラインで利用できる、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して、本明細書で開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間のパーセント同一性を測定してもよい。代案としては、配列間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えばＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を使用して、遂行されてもよい。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を使用する多重アラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当してもよい。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列のパーセント同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であってもよい。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４であってもよい。さらに代案としては、配列間のパーセント同一性は、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えばＢＬＯＳＵＭ６２）を使用して、ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５などのパラメータで、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えばｎｅｅｄｌｅ）を使用して遂行してもよい。

開示される発明の特定の実施形態の特徴として、様々なポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、本明細書で開示される。本明細書で開示される配列と、少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、または９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変種を、使用し得る。代案としては、変種アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書で開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し得る。変種アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示される配列と同一の機能／活性を有し、または開示される配列の少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の機能／活性を有する。

「単離された」という用語は、特定の実施形態における用法では、その天然原料から完全にまたは部分的に精製されている、あらゆる細胞成分を指す（例えば単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子）。場合によっては、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きな組成物、緩衝系または試薬混合物の一部である。例えば単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞または生物内に異種様式で含まれ得る。別の実施例は、単離されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素である。

開示される発明の実施形態は、水、スクロース、およびポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含んでなる、反応溶液に関する。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。顕著なことに、これらのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成し得る。このようなグルカンは、繊維の紡績およびその他の産業用途で使用するのに適する。

本明細書でグルコシルトランスフェラーゼ酵素によって生成されるポリα−１，３−グルカンの分子量は、ＤＰ_ｎ（数平均重合度）として測定し得る。代案としては、ポリα−１，３−グルカンの分子量は、ダルトン、グラム／モルとして、またはＤＰ_Ｗ（重量平均重合度）として測定し得る。ポリα−１，３−グルカンは、本発明の特定の実施形態では、少なくとも約１００のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗの分子量を有し得る。代案としては、ポリα−１，３−グルカンの分子量は、少なくとも約２５０ＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗであり得る。さらに代案としては、ポリα−１，３−グルカンのＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗは、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００（または１００〜１０００のあらゆる整数）であり得る。

本明細書においてポリα−１，３−グルカンの分子量は、当該技術分野で公知のいくつかの手段のいずれかを使用して、測定し得る。例えばグルカンポリマー分子量は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、またはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して測定し得る。

本明細書においてポリα−１，３−グルカンは、好ましくは直鎖／非分枝である。ポリα−１，３−グルカンのグルコースモノマー単位間のα−１，３グリコシド結合の百分率は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。したがってこのような実施形態では、ポリα−１，３−グルカンは、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％未満の非α−１，３グリコシド結合を有する。

ポリα−１，３−グルカン中に存在するα−１，３−グリコシド結合の百分率が高いほど、ポリマー中で分岐点を形成する特定グリコシド結合の発生頻度がより小さくなるため、ポリα−１，３−グルカンが直鎖である確率が、より高くなるものと理解される。特定の実施形態では、ポリα−１，３−グルカンには分岐点がなく、またはポリマー中のグリコシド結合のパーセントとして、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の分岐点を有する。分岐点の例としては、変異ポリマー中に存在するようなα−１，６分岐点が挙げられる。

ポリα−１，３−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して、判定し得る。例えば結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば^１３ＣＮＭＲまたは^１ＨＮＭＲ）を利用する方法を使用して、判定し得る。使用し得るこれらのおよびその他の方法は、参照によって本明細書に援用する、Ｆｏｏｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ ＬＬＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）で開示される。

本明細書においてポリα−１，３−グルカンは、前述のα−１，３結合百分率と分子量との任意の組み合わせによって、特徴付けられてもよい。例えば本明細書において、反応溶液中で生成されるポリα−１，３−グルカンは、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗを有し得る。別の実施例では、ポリα−１，３−グルカンは、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗを有し得る。なおも別の実施例では、ポリα−１，３−グルカンは、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも２５０のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗを有し得る。

本発明の特定の実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種またはラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来してもよい。グルコシルトランスフェラーゼがそれに由来してもよい、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリナス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンティロセッチ（Ｓ．ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、およびＳ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。グルコシルトランスフェラーゼがそれに由来してもよいロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の例としては、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（Ｌ．ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンティナム（Ｌ．ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カーノサム（Ｌ．ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）およびＬ．フルクトーサム（Ｌ．ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。グルコシルトランスフェラーゼがそれに由来してもよいラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｌ．アシドフィラス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブレッキ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カルバータス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、およびＬ．ロイテリー（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。

本明細書においてグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その中でグルコシルトランスフェラーゼ酵素が活性を有する、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４で提供されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなり得て、またはそれからなる。代案としては、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その中でグルコシルトランスフェラーゼ酵素が活性を有する、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなり得て、またはそれからなる。

本明細書で開示される、グルコシルトランスフェラーゼ酵素配列の各アミノ酸位置におけるアミノ酸残基は、全て例である。特定のアミノ酸が、互いに同様の構造および／または電荷特性を共有する（すなわち保存的である）ことを考えると、グルコシルトランスフェラーゼ酵素配列内の各位置におけるアミノ酸は、開示される配列に記載されるようであり、または次のように保存的アミノ酸残基で置換され得る（保存的アミノ酸置換）。
１．以下の小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基は、互いに置換され得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．以下の極性の負に帯電した残基およびそれらのアミドは、互いに置換され得る：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．以下の極性の正に帯電した残基は、互いに置換され得る：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．以下の脂肪族の非極性残基は、互いに置換され得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、ｌｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；および
５．以下の大型芳香族残基は、互いに置換され得る：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。

グルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、本明細書で開示されるアミノ酸配列のいずれであってもよく、Ｎ末端および／またはＣ末端上に、１〜３００（またはその間のあらゆる整数）個の残基をさらに含むものであってもよい。このような追加的な残基は、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素がそれに由来する対応する野性型配列に由来してもよく、または（ＮまたはＣ末端のいずれかにある）エピトープタグなどの別の配列であってもよく、または（Ｎ末端の）異種シグナルペプチドであってもよい。したがってグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例としては、それぞれ配列番号３０、４、２８、および２０がそれに由来する野性型配列に相当する、配列番号６１、６２、６３、および６４が挙げられる。

グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３３で提供される配列によってコードされる、ポリヌクレオチドであり得る。代案としては、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、または配列番号３３と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、ポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。

特定の実施形態のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その中で構成グリコシド結合の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または５０％と１００％の間のあらゆる整数）がα−１，３結合である、ポリα−１，３−グルカンを合成する。したがってこのような実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のグリコシド結合が非α−１，３である、ポリα−１，３−グルカンを合成する。

その他の態様では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、分岐点がない、または分岐点がポリマー中のグリコシド結合のパーセントとして、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である、ポリα−１，３−グルカンを合成する。分岐点の例としては、変異ポリマー中に存在するようなα−１，６分岐点が挙げられる。

グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約１００のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗの分子量を有する、ポリα−１，３−グルカンを合成し得る。代案としては、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約４００のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗの分子量を有する、ポリα−１，３−グルカンを合成し得る。さらに代案としては、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００（または１００と１０００の間のあらゆる整数）のＤＰ_ｎまたはＤＰ_Ｗの分子量を有する、ポリα−１，３−グルカンを合成し得る。

１つまたは複数の異なるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、開示される発明で使用されてもよい。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、好ましくは、デキストラスクラーゼ、ロイテランスクラーゼ、またはアルテルナンスクラーゼ活性を有さず、または非常にわずか（１％未満）しか有しない。グルコシルトランスフェラーゼは、特定の実施形態では、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号４７５２７（配列番号６０）の下に同定されるグルコシルトランスフェラーゼに由来する、配列番号８のアミノ酸残基２〜１４７７、または配列番号８のアミノ酸残基１３８〜１４７７を含まない。

本明細書においてグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、プライマー非依存性またはプライマー依存性であり得る。プライマー非依存性グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グルカン合成を遂行するのに、プライマーの存在を必要としない。プライマー依存性グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グルカンポリマー合成において酵素のためのプライマーとして作用する、反応溶液中の開始分子の存在を必要とする。「プライマー」という用語は、本明細書の用法では、グルコシルトランスフェラーゼ酵素のイニシエータとして作用し得る、あらゆる分子を指す。例えばオリゴ糖類および多糖類が、本明細書においてプライマーとして作用し得る。特定の実施形態で使用し得るプライマーとしては、例えばデキストランや、加水分解グルカンなどのその他の炭水化物ベースのプライマーが挙げられる。加水分解グルカンは、ポリα−グルカンなどのグルカンの酸加水分解によって調製され得る。参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１３／０３６９１８号パンフレットは、出発原料としてポリα−１，３−グルカンを使用する、このような加水分解グルカンの調製を開示する。本明細書でプライマーとして使用されるデキストランは、デキストランＴ１０（すなわち１０ｋＤの分子量を有するデキストラン）であり得る。代案としては、デキストランは、例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２５ｋＤの分子量を有し得る。

本明細書で使用されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、当該技術分野で公知の任意の手段（例えば参照によって本明細書に援用する米国特許第７００００００号明細書）によって生成されてもよい。例えばグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、あらゆる細菌（例えばＴＯＰ１０などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）、または真核生物（例えばピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種などの酵母）の異種遺伝子発現系中で、組み換え的に生成されてもよい。例えば上に列挙した核酸配列のいずれかを、この目的で使用し得る。

本明細書で使用されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その使用前に精製および／または単離されてもよく、または例えば細胞溶解産物の形態で使用されてもよい。細胞溶解産物または抽出物は、酵素を異種性に発現するのに使用される細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））から調製されてもよい。例えば細菌は、フレンチ圧力セル（フレンチプレス）を使用して、破壊されてもよい。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、これらのタイプの調製物中で可溶性である。溶解産物または抽出物は、スクロースからポリα−１，３−グルカンを生成するための反応溶液中に、約０．１５〜０．３％（ｖ／ｖ）で使用してもよい。特定の実施形態では、最初に、遠心分離または濾過などの手段によって、細菌細胞溶解産物から不溶性物質を除去する。

特定の実施形態では、異種遺伝子発現系は、タンパク質分泌のためにデザインされたものであってもよい。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、このような実施形態では、シグナルペプチド（シグナル配列）を含んでなる。シグナルペプチドは、その天然シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドのどちらであってもよい。

グルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して判定し得る。例えばグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性は、２２〜２５℃に２４〜３０時間維持される、スクロース（５０ｇ／Ｌ）、デキストランＴ１０（１ｍｇ／ｍＬ）、およびカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）を含有する反応溶液中において、還元糖（フルクトースおよびグルコース）の生成を測定することで判定し得る。還元糖は、１ＮのＮａＯＨと０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウムを含有する混合物に０．０１ｍＬの反応溶液を添加して、次にＯＤ_{４８０ｎｍ}における吸光度増大を５分間モニターすることで測定し得る。

本明細書において反応溶液の温度は、所望ならば制御し得る。特定の実施形態では、溶液は、約５℃〜約５０℃の温度を有する。特定のその他の実施形態では、溶液の温度は、約２０℃〜約４０℃である。代案としては、溶液の温度は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０℃であってもよい。

反応溶液の温度は、当該技術分野で公知の様々な手段を使用して維持されてもよい。例えば反応溶液の温度は、所望の温度に設定された空気または水浴インキュベーター内に反応溶液を含有する容器を入れることで、維持し得る。

溶液中のスクロースの初期濃度は、例えば約２０ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌであり得る。代案としては、スクロースの初期濃度は、約７５ｇ／Ｌ〜約１７５ｇ／Ｌ、または約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌであり得る。さらに代案としては、スクロースの初期濃度は、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または１６０ｇ／Ｌ（または４０〜１６０ｇ／Ｌの間のあらゆる整数）であり得る。「スクロースの初期濃度」は、全ての反応溶液成分（水、スクロース、ｇｔｆ酵素）を添加した直後における、溶液中のスクロース濃度を指す。

反応溶液中で使用されるスクロースは、高度に純粋（≧９９．５％）であり得て、またはあらゆるその他の純度または等級であり得る。例えばスクロースは、少なくとも９９．０％の純度を有し得て、または試薬等級スクロースであり得る。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、サトウモロコシ、またはトウモロコシなどのあらゆる再生可能な糖原料に由来してもよい。スクロースは、結晶形態または非結晶形態（例えばシロップまたはサトウキビジュース）などのあらゆる形態で提供され得る。

本明細書において、反応溶液のｐＨは、約４．０〜約８．０であり得る。代案としては、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０であり得る。特定の実施形態では、水およびスクロースを含有する溶液のｐＨは、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を添加する前に設定されてもよい。反応溶液のｐＨは、限定するものではないが、リン酸、トリス、クエン酸塩、またはそれらの組み合わせをはじめとする、適切な緩衝液の添加または組み込みによって、調節または制御し得る。緩衝液の濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０、２０、または５０ｍＭであり得る。適当量のＤＴＴ（例えば約１．０ｍＭのジチオスレイトール）を任意選択的に反応溶液に添加し得る。

開示される発明は、少なくとも水、スクロース、およびポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させるステップを含んでなる、ポリα−１，３−グルカンを生成する方法にも関する。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなり得る。この方法で生成されるポリα−１，３−グルカンは、任意選択的に単離し得る。

水、スクロース、および本明細書に記載されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を反応溶液中で接触させる。したがって方法は、水、スクロース、および本明細書に記載されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含んでなる反応溶液を提供するステップを含んでなり得る。反応の濁りによって示されるように、不溶性ポリα−１，３−グルカンが溶液から沈降することを考えると、グルコシルトランスフェラーゼ酵素がポリα−１，３−グルカンを合成するにしたがって、反応溶液は反応混合物になるものと理解される。開示される方法の接触させるステップは、いくつものやり方で実施し得る。例えば所望の量のスクロースを最初に水に溶解し得て（この調製段階で、任意選択的に緩衝液成分などのその他の成分もまた添加してもよい）、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の添加がそれに続く。溶液は、静置してもよく、または例えば撹拌または軌道振盪によってかき混ぜてもよい。反応は、無細胞であり得て、典型的に無細胞である。

グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、最初に反応溶液を調製する際に、塩または緩衝液を含有しない、水または水溶液（例えばスクロース水溶液）に、任意選択的に添加し得る。次にこのような調製物のｐＨを要望通りに、例えばｐＨ５〜６などに改変し得る。反応は、所望ならば、いかなる追加的緩衝液もなしに、完了するまで実施し得る。

特定の実施形態では、反応完了は、視覚的に判定し得て（沈殿ポリα−１，３−グルカンのさらなる蓄積なし）、および／または溶液中に残るスクロース量（残留スクロース）を測定することで判定し得て、約９０％を上回るスクロース消費パーセントは、反応完了を示唆し得る。典型的に、開示される方法の反応は、反応で使用されるスクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素の量などの特定のパラメータ次第で、完了するまでに約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、または９６時間かかる。

開示される方法の特定の実施形態では、反応のスクロース消費パーセントは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。代案としては、スクロース消費パーセントは、＞９０％または＞９５％であってもよい。

開示される発明で生成されるポリα−１，３−グルカンの収率は、反応溶液で使用されるスクロースの重量を基準として、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％であり得る。

開示される方法で生成されるポリα−１，３−グルカンは、任意選択的に単離されてもよい。例えば不溶性ポリα−１，３−グルカンは、遠心分離または濾過によって分離されてもよい。その際に、ポリα−１，３−グルカンは、水、フルクトース、および特定の副産物（例えばロイクロース、可溶性オリゴ糖類ＤＰ２−ＤＰ７）を含んでなってもよい反応溶液の残りから、分離される。この溶液は、残留スクロースおよびグルコースモノマーもまた含んでなってもよい。

ポリα−１，３グルカンは、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用して、スクロースを含有する再生可能資源から酵素的に生成され得る、潜在的に低コストのポリマーである。このポリマーを特定条件下で溶剤に溶解すると、ポリマーは規則正しい液晶溶液を形成し得ることが示されている（米国特許第７，０００，０００号明細書）。このような溶液は、連続する高強度の綿様繊維に紡績し得る。開示される発明を使用して生成されるポリα−１，３−グルカンは、同等の有用性を有する。

開示される発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の特定の好ましい態様を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。

略語
本明細書中で使用される略語のいくつかの意味は、次のとおりである：「ｇ」はグラムを意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりポンドを意味し、「ｗｔ％」は重量百分率を意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「℃」は摂氏度を意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｍｏｌ％」はモルパーセントを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＭＰａ」はメガパスカルを意味する。

一般方法
グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素の粗抽出物の調製
ｇｔｆ酵素は、次のようにして調製した。特定のｇｔｆをコードするＤＮＡ配列を含有するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）ベースのコンストラクトで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（登録商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を形質転換した。各配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でｇｔｆ酵素を発現するように、コドン最適化した。特定のｇｔｆ酵素を発現する個々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）添加ＬＢ（ルリアブロス）培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で３７℃で振盪しながら、ＯＤ_６００＝０．４〜０．５まで培養し、その時点でＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、カタログ番号Ｉ６７５８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を０．５ｍＭの最終濃度に添加した。ＩＰＴＧ誘導に続いて、培養物を３７℃で２〜４時間培養した。細胞を５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって収集し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、１．０ｍＭ）添加５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞をフレンチ圧力セル（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に２回通過させて、＞９５％の細胞溶解を確実にした。溶解した細胞を４℃、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。得られた上清をＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ｇｔｆ酵素の発現を確認して、上清を−２０℃で保存した。

ｇｔｆ酵素活性の判定
ｇｔｆ酵素活性は、ｇｔｆ反応溶液中の還元糖（フルクトースおよびグルコース）の生成を測定することで確認した。スクロース（５０または１５０ｇ／Ｌ）、カリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）、および任意選択的にデキストラン（１ｍｇ／ｍＬ、デキストランＴ１０、カタログ番号Ｄ９２６０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する混合物に、ｇｔｆ抽出物（上記のように調製された）を添加して反応溶液を調製し、ｇｔｆ抽出物は容量基準で２．５％〜５％に添加した。次に反応溶液を２２〜２５℃で２４〜３０時間培養し、その後、遠心分離した。１ＮのＮａＯＨおよび０．１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する混合物に、上清（０．０１ｍＬ）を添加した。混合物を５分間インキュベートして、その後、ＵＬＴＲＯＳＰＥＣ分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用してそのＯＤ_{４８０ｎｍ}を測定し、還元糖フルクトースおよびグルコースの存在を判断した。

グリコシド結合の判定
ｇｔｆ酵素によって合成されたグルカン産物のグリコシド結合は、^１３ＣＮＭＲ（核磁気共鳴）によって判定した。３重量％のＬｉＣｌを含有する１ｍｌの重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、乾燥グルカンポリマー（２５〜３０ｍｇ）を５０℃で撹拌して溶解した。ガラスピペットを使用して、０．８ｍＬの溶液を５ｍｍのＮＭＲ管に移し入れた。２６０４１．７Ｈｚのスペクトルウィンドウを使用して、１２５．７６ＭＨｚのスペクトル周波数で、ＣＰＤＵＬクライオプローブを装着したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００−ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、定量的^１３ＣＮＭＲスペクトルを得た。ｗａｌｔｚデカップリングを使用する逆ゲート付きデカップリングパルス配列を、０．６２９秒間の捕捉時間時間、５秒間のパルス間遅延、および６０００パルスで使用した。２．０Ｈｚの指数関数的増幅を使用して、時間ドメインデータを転換した。

数平均重合度（ＤＰ_ｎ）の判定
ｇｔｆ酵素によって合成されたグルカン産物のＤＰ_ｎは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって判定した。乾燥グルカンポリマーは、Ν，Ν−ジメチル−アセトアミド（ＤＭＡｃ）および５％ＬｉＣｌ中に、１００℃で一晩振盪して５ｍｇ／ｍＬに溶解した。使用したＳＥＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓからの示差屈折計２４１０、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）からのマルチアングル光散乱光度計Ｈｅｌｅｏｓ（商標）８＋、およびＷｙａｔｔからの示差細管粘度計ＶｉｓｃｏＳｔａｒ（商標）の３つの直結検出器が連動する、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）からのＡｌｌｉａｎｃｅ（商標）２６９５分離モジュールであった。ＳＥＣのために使用したカラムは、Ｓｈｏｄｅｘ（日本）からの４本のスチレン−ジビニルベンゼンカラム、およびポリマー分布の低分子量領域の分解能を改善するための２本のリニアＫＤ−８０６Ｍ、ＫＤ−８０２、およびＫＤ−８０１カラムであった。移動相は、０．１１％のＬｉＣｌを添加したＤＭＡｃであった。使用したクロマトグラフィー条件は、カラムおよび検出器コンパートメント内で５０℃、サンプルおよび注入器コンパートメントで４０℃、０．５ｍＬ／分の流速、および１００μＬの注入容積であった。データ処理のために使用したソフトウェアパッケージは、ＷａｔｅｒｓからのＥｍｐｏｗｅｒ（商標）バージョン３（ブロードグルカンポリマー標準物質により較正）、およびＷｙａｔｔからのＡｓｔｒａ（登録商標）バージョン６であった（カラム較正を伴う三重検出法）。

実施例１
ｇｔｆ酵素０８７４（配列番号２）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号４５０８７４の下に同定される、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号２；配列番号１によってコードされる；本明細書で「０８７４」と称される）。

ｇｔｆ ０８７４をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ０８７４（配列番号２）をコードする核酸産物（配列番号１）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）にサブクローニングして、ｐＭＰ５７と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ５７と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ０８７４の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ０８７４の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例２
ｇｔｆ酵素６８５５（配列番号４）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号２２８４７６８５５の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号４；配列番号３によってコードされる；本明細書で「６８５５」と称される）。

ｇｔｆ ６８５５をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ６８５５（配列番号４）をコードする核酸産物（配列番号３）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ５３と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ５３と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ６８５５の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ６８５５の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例３
ｇｔｆ酵素２３７９（配列番号６）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号６６２３７９の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号６；配列番号５によってコードされる；本明細書で「２３７９」と称される）。

ｇｔｆ ２３７９をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ２３７９（配列番号６）をコードする核酸産物（配列番号５）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ６６と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ６６と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ２３７９の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ２３７９の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例４
Ｇｔｆ酵素７５２７（ＧｔｆＪ、配列番号８）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号４７５２７の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号８；配列番号７によってコードされる；本明細書で「７５２７」または「ＧｔｆＪ」と称される）。

ｇｔｆ ７５２７をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ７５２７（配列番号８）をコードする核酸産物（配列番号７）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ６５と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ６５と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ７５２７の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ７５２７の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例５
ｇｔｆ酵素１７２４（配列番号１０）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号１２１７２４の下に同定される、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号１０；配列番号９によってコードされる；本明細書で「１７２４」と称される）。

ｇｔｆ １７２４をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ １７２４（配列番号１０）をコードする核酸産物（配列番号９）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ５２と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ５２と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ １７２４の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ １７２４の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例６
ｇｔｆ酵素０５４４（配列番号１２）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号２９０５８０５４４の下に同定される、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号１２；配列番号１１によってコードされる；本明細書で「０５４４」と称される）。

ｇｔｆ ０５４４をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ０５４４（配列番号１２）をコードする核酸産物（配列番号１１）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ５５と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ５５と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ０５４４の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ０５４４の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例７
ｇｔｆ酵素５９２６（配列番号１４）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号１６７７３５９２６の下に同定される、ストレプトコッカス・デンティロセッチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号１４；配列番号１３によってコードされる；本明細書で「５９２６」と称される）。

ｇｔｆ ５９２６をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ５９２６（配列番号１４）をコードする核酸産物（配列番号１３）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ６７と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ６７と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ５９２６の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ５９２６の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例８
ｇｔｆ酵素４２９７（配列番号１６）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号７６８４２９７の下に同定される、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号１６；配列番号１５によってコードされる；本明細書で「４２９７」と称される）。

ｇｔｆ ４２９７をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ４２９７（配列番号１６）をコードする核酸産物（配列番号１５）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ６２と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ６２と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ４２９７の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ４２９７の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例９
ｇｔｆ酵素５６１８（配列番号１８）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号３２８９４５６１８の下に同定される、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号１８；配列番号１７によってコードされる；本明細書で「５６１８」と称される）。

ｇｔｆ ５６１８をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ５６１８（配列番号１８）をコードする核酸産物（配列番号１７）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ５６と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ５６と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ５６１８の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ５６１８の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１０
ｇｔｆ酵素２７６５（配列番号２０）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号３２２３７２７６５の下に同定される、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号２０；配列番号１９によってコードされる；本明細書で「２７６５」と称される）。

ｇｔｆ ２７６５をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ２７６５（配列番号２０）をコードする核酸産物（配列番号１９）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ７３と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ７３と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ２７６５の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ２７６５の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１１
ｇｔｆ酵素４７００（配列番号２２）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号２１６５４７００の下に同定される、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号２２；配列番号２１によってコードされる；本明細書で「４７００」と称される）。

ｇｔｆ ２７６５をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ４７００（配列番号２２）をコードする核酸産物（配列番号２１）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ８３と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ８３と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ４７００の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ４７００の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１２
ｇｔｆ酵素１３６６（配列番号２４）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号１４６７４１３６６の下に同定される、ストレプトコッカス・クリセティ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｉ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号２４；配列番号２３によってコードされる；本明細書で「１３６６」と称される）。

ｇｔｆ １３６６をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ １３６６（配列番号２４）をコードする核酸産物（配列番号２３）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ８６と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ８６と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ １３６６の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ １３６６の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１３
ｇｔｆ酵素０４２７（配列番号２６）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号９４０４２７の下に同定される、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号２６；配列番号２５によってコードされる；本明細書で「０４２７」と称される）。

ｇｔｆ ０４２７をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ０４２７（配列番号２６）をコードする核酸産物（配列番号２５）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ８７と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ８７と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ０４２７の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ０４２７の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１４
ｇｔｆ酵素２９１９（配列番号２８）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号３８３２８２９１９の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号２８；配列番号２７によってコードされる；本明細書で「２９１９」と称される）。

ｇｔｆ ２９１９をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ２９１９（配列番号２８）をコードする核酸産物（配列番号２７）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ８８と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ８８と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ２９１９の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ２９１９の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１５
ｇｔｆ酵素２６７８（配列番号３０）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号４００１８２６７８の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号３０；配列番号２９によってコードされる；本明細書で「２６７８」と称される）。

ｇｔｆ ２６７８をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ２６７８（配列番号３０）をコードする核酸産物（配列番号２９）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ８９と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ８９と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ２６７８の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ２６７８の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１６
ｇｔｆ酵素２３８１（配列番号３２）の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号６６２３８１の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号３２；配列番号３１によってコードされる；本明細書で「２３８１」と称される）。

ｇｔｆ ２３８１をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ２３８１（配列番号３２）をコードする核酸産物（配列番号３１）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ９６と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ９６と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ２３８１の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ２３８１の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１７
ｇｔｆ酵素３９２９（配列番号３４）および追加的なｇｔｆ酵素の生成
本実施例は、ＧＥＮＢＡＮＫでＧｌ番号３８７７８３９２９の下に同定される、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ酵素のＮ末端切断型の調製を記載する（配列番号３４；配列番号３３によってコードされる；本明細書で「３９２９」と称される）。

ｇｔｆ ３９２９をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）中におけるタンパク質発現のためのコドン最適化を使用して合成した。ｇｔｆ ３９２９（配列番号３４）をコードする核酸産物（配列番号３３）をｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）にサブクローニングして、ｐＭＰ９７と同定されるプラスミドコンストラクトを作成した。このプラスミドコンストラクトを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、ＴＯＰ１０／ｐＭＰ９７と同定される株を作成した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、細菌発現によるｇｔｆ ３９２９の生成およびその酵素活性の判定を実施した。ｇｔｆ ３９２９の酵素活性は、表２に示される（下の実施例１８を参照されたい）。

追加的なｇｔｆ酵素を同様にして生成した。簡単に述べると、ＧＥＮＢＡＮＫで、Ｇｌ番号２２８４７６９０７（ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ、配列番号３６、本明細書で「６９０７」と称される）、２２８４７６６６１（ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ、配列番号３８、本明細書で「６６６１」と称される）、３３４２８０３３９（ストレプトコッカス・ガロリティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ｇｔｆ、配列番号４０、本明細書で「０３３９」と称される）、３１３００８８（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ｇｔｆ、配列番号４２、本明細書で「００８８」と称される）、２４３７９３５８（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ｇｔｆ、配列番号４４、本明細書で「９３５８」と称される）、３２５９７８２４２（ストレプトコッカス・ガロリティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ｇｔｆ、配列番号４６、本明細書で「８２４２」と称される）、３２４９９３４４２（ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）ｇｔｆ、配列番号４８、本明細書で「３４４２」と称される）、４７５２８（ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ、配列番号５０、本明細書で「７５２８」と称される）、３２２３７３２７９（ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ｇｔｆ、配列番号５２、本明細書で「３２７９」と称される）、１７００１６４９１（ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）ｇｔｆ、配列番号５４、本明細書で「６４９１」と称される）、２２８４７６８８９（ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆ、配列番号５６、本明細書で「６８８９」と称される）、５１５７４１５４（ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ｇｔｆ、配列番号５８、本明細書で「４１５４」と称される）、および３２２３７３２９８（ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ｇｔｆ、配列番号５９、本明細書で「３２９８」と称される）の下に同定される酵素のＮ末端切断型の調製をして、酵素活性について試験した（表２、下の実施例１８を参照されたい）。

実施例１８
ｇｔｆ酵素を用いた不溶性グルカンポリマーの生成
本実施例は、上の実施例で調製されたｇｔｆ酵素を使用した、グルカンポリマーの合成を説明する。

反応は、一般方法セクションで開示される手順に従って、上の各ｇｔｆ酵素を用いて実施した。簡単に述べると、スクロース（５０ｇ／Ｌ）、カリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）、およびｇｔｆ酵素（２．５容量％の抽出物）を含んでなるｇｔｆ反応溶液を調製した。２２〜２５℃で２４〜３０時間後に、不溶性グルカンポリマー産物を遠心分離によって収集し、水で３回洗浄し、エタノールで１回洗浄して、５０℃で２４〜３０時間乾燥した。

一般方法セクションで開示される手順に従って、各反応からの不溶性グルカンポリマー産物中のグリコシド結合を^１３ＣＮＭＲによって判定し、各産物のＤＰ_ｎをＳＥＣによって判定した。これらの分析結果は、表２に示される。

いくつかのｇｔｆ酵素が、不溶性グルカン産物を生成した（表２）。しかし、ｇｔｆ酵素６８５５（配列番号４）、７５２７（ｇｔｆＪ、配列番号８）、１７２４（配列番号１０）、０５４４（配列番号１２）、５９２６（配列番号１４）、２７６５（配列番号２０）、０４２７（配列番号２６）、２９１９（配列番号２８）、２６７８（配列番号３０）、および３９２９（配列番号３４）のみが、少なくとも５０％のα−１，３結合を含んでなり少なくとも１００のＤＰ_ｎを有するグルカンを生成した。したがってこれらの酵素は、繊維用途のためのグルカンポリマーの生成に適する。

ｇｔｆ６８５５（配列番号４）、７５２７（ｇｔｆＪ、配列番号８）、１７２４（配列番号１０）、５９２６（配列番号１４）、２７６５（配列番号２０）、０４２７（配列番号２６）、２９１９（配列番号２８）、２６７８（配列番号３０）、および３９２９（配列番号３４）のみが、１００％のα−１，３結合を含んでなり少なくとも１００のＤＰ_ｎを有するグルカンポリマーを生成した。３０個のｇｔｆ中、９個のみが、１００％のα−１，３結合と少なくとも１００のＤＰ_ｎがあるグルカンを生成できたという、これらの結果は、全てのｇｔｆ酵素が、高レベルのα−１，３結合がある高分子量の不溶性グルカンを生成できるとは限らないことを示唆する。より少数のｇｔｆ酵素は、１００％のα−１，３結合を含んでなり少なくとも２５０のＤＰ_ｎを有するグルカンポリマーを生成できた。
したがって１００％のα−１，３結合と少なくとも１００のＤＰ_ｎを含んでなるグルカンポリマーを生成できるｇｔｆ酵素が、同定された。これらの酵素を使用して、繊維の生産に適するグルカンを生成し得る。

以上、本発明を要約すると下記のとおりです。
１．水、スクロース、およびポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、反応溶液。
２．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、上記１に記載の反応溶液。
３．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、上
記２に記載の反応溶液。
４．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも２５０の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、上記３に記載の反応溶液。
５．プライマーをさらに含む、上記１に記載の反応溶液。
６．前記プライマーがデキストランである、上記５に記載の反応溶液。
７．前記プライマーが加水分解グルカンである、上記５に記載の反応溶液。
８．ａ）少なくとも水、スクロース、およびポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させるステップと、
ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）で生成されるポリα−１，３−グルカンを単離するステップと
を含んでなり、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、または配列番号３４と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；それによってポリα−１，３−グルカンが生成される、ポリα−１，３−グルカンを生成する方法。
９．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも５０％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、上記８に記載の方法。
１０．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも１００の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、上記９に記載の方法。
１１．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、１００％のα−１，３グリコシド結合と少なくとも２５０の数平均重合度とを有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、上記１０に記載の方法。
１２．ステップ（ａ）が、プライマーと、前記水、スクロース、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを接触させるステップをさらに含む、上記８に記載の方法。
１３．前記プライマーが、デキストランである、上記１２に記載の方法。
１４．前記プライマーが、加水分解グルカンである、上記１２に記載の方法。

Claims (13)

1. 水、スクロース、および少なくとも１００の数平均重合度を有するポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、前記ポリα−１，３−グルカンの少なくとも９５％のグリコシド結合がα−１，３グリコシド結合であり、そして前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号４と、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、反応溶液。
2. 前記ポリα−１，３−グルカンの少なくとも９８％のグリコシド結合がα−１，３グリコシド結合である、請求項１に記載の反応溶液。
3. 前記ポリα−１，３−グルカンの１００％のグリコシド結合がα−１，３グリコシド結合である、請求項２に記載の反応溶液。
4. 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも２５０の数平均重合度を有する、ポリα−１，３−グルカンを合成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応溶液。
5. プライマーをさらに含む、請求項１に記載の反応溶液。
6. 前記プライマーがデキストランである、請求項５に記載の反応溶液。
7. 前記プライマーが加水分解グルカンである、請求項５に記載の反応溶液。
8. 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の反応溶液。
9. ａ）少なくとも水、スクロース、および少なくとも１００の数平均重合度を有するポリα−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させ；それによってポリα−１，３−グルカンが生成されるステップと、
   ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）で生成されるポリα−１，３−グルカンを単離する
   ステップと
   を含んでなり、前記ポリα−１，３−グルカンの少なくとも９５％のグリコシド結合がα−１，３グリコシド結合であり、そして前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号４と、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリα−１，３−グルカンを生成する方法。
10. 前記ポリα−１，３−グルカンの少なくとも９８％のグリコシド結合がα−１，３グリコシド結合である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ポリα−１，３−グルカンの１００％のグリコシド結合がα−１，３グリコシド結合である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ステップ（ａ）で生成されたポリα−１，３−グルカンを単離することを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。