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WO2023210798A1 - 微生物の集積方法および集積システム - Google Patents

微生物の集積方法および集積システム Download PDF

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Publication number
WO2023210798A1
WO2023210798A1 PCT/JP2023/016809 JP2023016809W WO2023210798A1 WO 2023210798 A1 WO2023210798 A1 WO 2023210798A1 JP 2023016809 W JP2023016809 W JP 2023016809W WO 2023210798 A1 WO2023210798 A1 WO 2023210798A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganisms
light
pores
magnitude
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/016809
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
志保 床波
琢也 飯田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Public Corporation Osaka
Original Assignee
University Public Corporation Osaka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Public Corporation Osaka filed Critical University Public Corporation Osaka
Priority to JP2024518065A priority Critical patent/JPWO2023210798A1/ja
Priority to EP23796533.0A priority patent/EP4517290A1/en
Priority to US18/860,310 priority patent/US20250283142A1/en
Publication of WO2023210798A1 publication Critical patent/WO2023210798A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D43/00—Separating particles from liquids, or liquids from solids, otherwise than by sedimentation or filtration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4022—Concentrating samples by thermal techniques; Phase changes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation

Definitions

  • the present disclosure relates to a method and system for collecting microorganisms, and more particularly, to a method and system for collecting multiple types of microorganisms suspended in a liquid sample.
  • microbiota a microbial flora also called "microbiota.”
  • the deep involvement of microbiota in human health is becoming clear through analyzes of the ⁇ microbiome,'' which is the totality of genomic information possessed by microorganisms.
  • Microorganisms that contribute to the health of human hosts are also called “probiotics.” Products using probiotics, such as supplements, yogurt, and creams, are widely commercialized.
  • Mixed culture is known as a method for preparing multiple types of microorganisms to be analyzed.
  • the microorganisms are generally suspended in the liquid sample and the microorganisms are separated from each other, so interactions between the microorganisms are difficult to occur. Therefore, it is possible to immobilize microorganisms at high density, or in other words, to accumulate them. By doing so, interactions between microorganisms become more likely to occur, which can be expected to improve analytical accuracy.
  • the microorganism collection device disclosed in International Publication No. 2017/195872 collects a plurality of microorganisms dispersed in a liquid sample.
  • the collection device includes a light source and a holding member configured to be able to hold a liquid sample.
  • a light-to-heat conversion region is formed in the holding member.
  • the photothermal conversion region generates thermal convection in the liquid sample by converting light from the light source into heat to heat the liquid sample. By utilizing this thermal convection, microorganisms can accumulate.
  • Patent Document 1 It is also possible to apply the device disclosed in Patent Document 1 to the accumulation of multiple types of microorganisms. However, as the liquid sample is heated, the microorganisms are also heated. Therefore, thermal damage may be applied to the microorganisms and the microorganisms may die. In this case, it may not be possible to suitably analyze interactions between multiple types of microorganisms.
  • the present disclosure has been made to solve the above problems, and its purpose is to provide a microorganism accumulation method and an accumulation system suitable for analyzing interactions between multiple types of microorganisms.
  • a method for collecting microorganisms collects multiple types of microorganisms contained in a liquid sample.
  • the method for accumulating microorganisms includes first to fourth steps.
  • the first step is to prepare a substrate provided with a plurality of pores. Each of the plurality of pores has an opening capable of trapping at least one of a plurality of types of microorganisms, and a depth extending in a direction including a vertically downward component.
  • the second step is to introduce a liquid sample onto the substrate.
  • the third step is a step of setting irradiation conditions for non-resonant light, which is light outside the wavelength range of electronic resonance of a plurality of types of microorganisms.
  • the fourth step is to irradiate a plurality of pores through the liquid sample with non-resonant light according to irradiation conditions.
  • the region of the plurality of pores that is irradiated with non-resonant light does not contain a photothermal conversion material that converts non-resonant light into heat.
  • the setting step is such that the magnitude of the vertically downward component of the photo-induced force due to non-resonant light irradiation on multiple types of microorganisms is greater than the magnitude of the vertically upward component of the buoyant force due to the liquid sample, and
  • the method includes the step of setting the intensity of the non-resonant light in the irradiation range of the non-resonant light so that it is larger than the vertical upward component of the force due to the Brownian motion of the molecules of the non-resonant light.
  • a microorganism collection system collects multiple types of microorganisms contained in a liquid sample.
  • the microorganism enrichment system includes a substrate provided with a plurality of pores. Each of the plurality of pores has an opening capable of trapping at least one of a plurality of types of microorganisms, and a depth extending in a direction including a vertically downward component.
  • the integrated system further includes a light source that irradiates the plurality of pores with non-resonant light, which is light outside the wavelength range of electronic resonance of the plurality of types of microorganisms, through the liquid sample while the liquid sample is placed on the substrate; and a control device that controls the light source.
  • the region of the plurality of pores that is irradiated with non-resonant light does not contain a photothermal conversion material that converts non-resonant light into heat.
  • the control device is configured to control multiple types of microorganisms so that the magnitude of the vertically downward component of the photo-induced force due to irradiation with non-resonant light is larger than the magnitude of the vertically upward component of the buoyant force due to the liquid sample, and
  • the intensity of the non-resonant light in the irradiation range of the non-resonant light is set so that it is larger than the vertically upward component of the force due to the Brownian motion of molecules.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a microorganism accumulation system according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is an exploded perspective view of the integrated kit.
  • FIG. 3A is a top view of the integrated kit.
  • FIG. 3B is a cross-sectional view of the integrated kit along line IIIB-IIIB in FIG. 3A.
  • FIG. 2 is an image diagram showing the accumulation of multiple types of microorganisms.
  • 3 is a flowchart showing the processing procedure of the method for manufacturing an integrated kit according to the present embodiment.
  • 6A to 6E are schematic process diagrams (FIGS. 1 to 5) of the method for manufacturing an integrated kit according to the present embodiment. It is a SEM image showing an example of a mold.
  • FIG. 3 is a diagram showing a top view of the integrated substrate.
  • FIG. 3 is a diagram showing a top view of the integrated substrate.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cross-sectional image of an integrated substrate.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the photo-induced force that acts on microorganisms due to laser light irradiation from a laser light source.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the accumulation mechanism of multiple types of microorganisms in the present embodiment. It is a flowchart which shows the processing procedure of microorganism accumulation processing.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the relationship between optical pressure and spot diameter. It is a SYTO9 image showing the results of microbial accumulation at different spot diameters. 15 is a diagram showing the relationship between the spot diameter and the area of the region where fluorescence is observed in the fluorescence image of FIG. 14.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the spot diameter and the area of the region where fluorescence is observed in the fluorescence image of FIG. 14.
  • SYTO9 image showing the results of microbial accumulation at different light irradiation times.
  • This is a PI image showing the results of microbial accumulation after 60 minutes of light irradiation. It is a figure showing the relationship between light irradiation time, survival rate, and fluorescence area.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between laser output, survival rate, and integration density.
  • This is a fluorescence observation image showing the result of bacterial accumulation in a high concentration sample.
  • This is a fluorescence observation image showing the result of bacterial accumulation in a low concentration sample.
  • FIG. 3 is an overall configuration diagram of a microorganism accumulation system according to a modification of the embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a mold for forming a microchannel substrate.
  • 28 is a diagram showing a microchannel substrate manufactured using the mold shown in FIG. 27.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an integrated substrate. This is an image of an integrated kit that was actually produced. It is a figure for explaining the accumulation mechanism of multiple types of microorganisms in a modified example.
  • the term “from submicrometer order to micrometer order” preferably means a range of several hundred nm to several hundred ⁇ m, and more preferably a range of 1 ⁇ m to several tens of ⁇ m.
  • microorganism means an organism having a size ranging from submicrometer order to micrometer order.
  • the shape of the microorganism is not particularly limited, and may be, for example, spherical, oval, or rod-shaped.
  • the microorganism is ellipsoidal, at least one of the length in the major axis direction and the length in the minor axis direction of the elliptical sphere may be in the range from submicrometer order to micrometer order.
  • the microorganism is rod-shaped, at least one of the width and length of the rod may be in the range from submicrometer order to micrometer order.
  • All single-celled organisms are microorganisms. Some multicellular organisms are also microorganisms. More specifically, living organisms are classified into bacteria, archaea, and eukaryotes. Most bacteria and archaea are unicellular organisms and are therefore microorganisms. Multicellular species of bacteria and archaea are also microorganisms. Most eukaryotes also exhibit unicellularity and are therefore microorganisms. Microorganisms may also include cells such as humans.
  • light-induced force is a general term for dissipative force, gradient force, and intermaterial light-induced force.
  • Dissipative force is a force generated when light momentum is imparted to a substance during a dissipative process such as light scattering or light absorption.
  • Gradient force is a force that moves a material with photoinduced polarization to a stable point of electromagnetic potential when it is placed in a nonuniform electromagnetic field.
  • the optically induced force between substances is the sum of the force due to the longitudinal electric field and the force due to the transverse electric field (radiation field) generated from induced polarization in a plurality of optically excited substances.
  • visible light means light in the wavelength range of 400 nm to 700 nm.
  • white light means light in a wavelength range ranging from ultraviolet to near-infrared regions (for example, a wavelength range of 200 nm to 1100 nm).
  • resonant light refers to light that causes large photo-induced polarization in microorganisms upon incidence on the microorganisms.
  • Photo-induced polarization is electric polarization that occurs when electrons inside a substance are excited by light.
  • the resonant light has a wavelength within the wavelength range of electronic resonance of the microorganism.
  • non-resonant light means light that causes small photo-induced polarization in microorganisms when it is incident on the microorganisms.
  • Non-resonant light has a wavelength outside the electronic resonance wavelength range of the microorganism.
  • chemotaxis refers to the property of a microorganism to exhibit a directional response to a concentration gradient of a specific chemical substance present in its surroundings. Microorganisms with chemotaxis respond by moving toward desirable chemicals and away from undesirable chemicals.
  • the x and y directions represent horizontal directions.
  • the x direction and the y direction are orthogonal to each other.
  • the z direction represents the vertical direction.
  • the direction of gravity is downward in the z direction.
  • the upward direction in the z direction (vertically upward) is abbreviated as “upward” or “upward”
  • the downward direction in the z direction is abbreviated as "downward” or “downward”.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a microorganism accumulation system according to an embodiment of the present disclosure.
  • the integrated system 100 includes an integrated kit 1, an XYZ axis stage 2, an adjustment mechanism 3, a laser light source 4, a dichroic mirror 5, an objective lens 6, an illumination light source 7, a camera 8, and a human-machine interface. (HMI: Human Machine Interface) 9 and a controller 10.
  • HMI Human Machine Interface
  • the collection kit 1 holds the sample.
  • a sample is a liquid sample containing multiple types of microorganisms to be collected.
  • the type of liquid is not particularly limited, but in this example, it is sterile water. Examples of the configuration of the integrated kit 1 will be explained with reference to FIGS. 2 to 9.
  • the XYZ axis stage 2 holds the integrated kit 1.
  • the XYZ-axis stage 2 is provided with a through hole (not shown) for transmitting white light (described later).
  • a plurality of integrated kits may be prepared. In that case, a plurality of accumulation kits 1 are placed in order on the XYZ-axis stage 2, and an accumulation process (see FIG. 12), which will be described later, is performed for each accumulation kit 1.
  • the adjustment mechanism 3 is a drive mechanism such as a servo motor or a focusing handle.
  • the adjustment mechanism 3 adjusts the horizontal position and vertical height of the XYZ-axis stage 2 according to commands from the controller 10. Thereby, the relative positional relationship between the integrated kit 1 and the objective lens 6 can be adjusted.
  • the laser light source 4 emits continuous wave (CW) laser light (indicated by L1) according to a command from the controller 10.
  • the output of the laser light (unit: W) can also be adjusted by commands from the controller 10.
  • the wavelength of the laser light is outside the wavelength range of electronic resonance of microorganisms. In this embodiment, the wavelength of the laser light is in the near-infrared region (specifically, 1064 nm).
  • Laser light emitted from the laser light source 4 is directed toward the dichroic mirror 5.
  • the dichroic mirror 5 is arranged between the laser light source 4 and the objective lens 6 and between the objective lens 6 and the camera 8.
  • the dichroic mirror 5 is configured to transmit visible light and reflect infrared light. Therefore, the near-infrared laser light is reflected by the dichroic mirror 5.
  • the objective lens 6 focuses the laser beam reflected by the dichroic mirror 5.
  • the laser beam focused by the objective lens 6 is irradiated onto the integrated kit 1.
  • the illumination light source 7 is an artificial light source such as a halogen lamp, a mercury lamp, an LED (Light Emitting Diode), or a fluorescent lamp.
  • the illumination light source 7 emits white light (indicated by L2) for photographing the sample on the integrated kit 1 according to a command from the controller 10.
  • the white light is irradiated onto the integrated kit 1 through a through hole provided in the XYZ-axis stage 2, and is transmitted through the integrated kit 1.
  • the white light that has passed through the integrated kit 1 heads to the dichroic mirror 5 via the objective lens 6.
  • White light which is visible light, passes through the dichroic mirror 5 and is captured by the camera 8.
  • the camera 8 includes an image sensor such as a CCD (Charge Coupled Device) image sensor or a CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) image sensor.
  • the camera 8 photographs the sample on the integrated kit 1 according to a command from the controller 10, and outputs a signal indicating the photographed image to the controller 10.
  • the image photographed by the camera 8 may be a still image or a moving image.
  • the HMI 9 includes, for example, input devices such as a switch, mouse, keyboard, and touch panel, and output devices such as a lamp, display, and speaker (none of which are shown).
  • the HMI 9 receives a user's operation and outputs a signal indicating the user's operation to the controller 10.
  • the user here is a person in charge of handling microorganisms, such as a developer, researcher, student, technician, or operator.
  • the controller 10 includes a processor 101 such as a CPU (Central Processing Unit), a memory 102 such as a ROM (Read Only Memory) and a RAM (Random Access Memory), and an input/output port 103 through which various signals are input and output.
  • the controller 10 controls each device (adjustment mechanism 3, laser light source 4, illumination light source 7, camera 8) within the integrated system 100. Further, the controller 10 is also capable of image analysis (fluorescence image analysis in the embodiment described later) for images taken by the camera 8.
  • the optical system shown in FIG. 1 is an example.
  • the optical system of the integrated system 100 may include other optical components (mirrors, half mirrors, beam splitters, filters, optical fibers, etc.) instead of or in addition to the dichroic mirror 5.
  • the optical system shown in FIG. 1 is configured such that white light from an illumination light source 7 is irradiated onto the sample from below to above, and an upper camera 8 photographs the sample below.
  • the optical system of the integrated system 100 may be configured such that the white light from the illumination light source 7 is irradiated onto the sample from below to above, and the lower camera 8 photographs the upper sample.
  • the laser light source 4 corresponds to a "light source” according to the present disclosure.
  • the laser light emitted from the laser light source 4 corresponds to "non-resonant light” according to the present disclosure.
  • the controller 10 corresponds to a “control device” according to the present disclosure.
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of the integrated kit 1.
  • FIG. 3A is a top view of the integrated kit 1.
  • FIG. 3B is a cross-sectional view of the integrated kit 1 taken along line IIIB-IIIB in FIG. 3A.
  • the integrated kit 1 includes a base material 11, a holding frame 12, an integrated substrate 13, and a cover glass 14.
  • the base material 11 is provided to ensure the mechanical strength of the integrated kit 1. Furthermore, the base material 11 is configured to transmit white light from the illumination light source 7. Specifically, the base material 11 is, for example, a glass substrate (slide glass). The base material 11 may be a silicone substrate, a PET (polyethylene terephthalate) film, or the like. Although the shape of the base material 11 is not particularly limited, in this example, it is a planar shape (rectangular parallelepiped shape).
  • the holding frame 12 holds a sample (indicated by SP).
  • the holding frame 12 is provided with a cylindrical through hole 121.
  • the through hole 121 functions as a "liquid reservoir" that stores a certain amount of sample.
  • the integrated substrate 13 is placed within the through hole 121 of the holding frame 12.
  • the accumulation substrate 13 is configured to accumulate a plurality of types of microorganisms upon irradiation with laser light. The manufacturing method and detailed structure of the integrated substrate 13 will be explained with reference to FIGS. 5 to 9.
  • the cover glass 14 covers the sample held in the through hole 121 of the holding frame 12 from above. As shown in FIG. 3B, it is desirable to fill the through hole 121 with the sample and seal the sample with the cover glass 14. The reason for this will be explained later.
  • FIG. 4 is an image diagram showing the accumulation of multiple types of microorganisms.
  • the integrated substrate 13 is provided with a plurality of pores 131 arranged in a honeycomb shape.
  • Each of the plurality of pores 131 has an opening capable of trapping at least one of a plurality of types of microorganisms, and a depth extending in a direction including a vertically downward component.
  • a plurality of types of microorganisms floating in the sample can be accumulated in the pores 131 of the accumulation substrate 13. This integration mechanism will also be explained with reference to FIGS. 10 and 11.
  • microorganisms are schematically illustrated in the samples of FIGS. 3A, 3B, and 4. However, the types of microorganisms are not limited to three types, but may be two or more types. Additionally, in reality, typical microorganisms are so small that they cannot be observed with the naked eye.
  • FIG. 5 is a flowchart showing the processing procedure of the method for manufacturing the integrated kit 1 according to the present embodiment.
  • 6A to 6E are schematic process diagrams of a method for manufacturing the integrated kit 1 according to the present embodiment. Hereinafter, step will be abbreviated as "S”.
  • a mold 901 for manufacturing integrated substrate 13 is prepared (see FIG. 6A).
  • the mold 901 can be manufactured by processing silicon using techniques such as electron beam lithography or dry etching.
  • FIG. 7 is a SEM (Scanning Electron Microscope) image showing an example of the mold 901.
  • the mold 901 has, for example, a plurality of cylindrical protrusions arranged in a honeycomb shape.
  • the diameter and height of the protrusion can be set to arbitrary values. In this example, the diameter of the protrusion was 14.0 ⁇ m, and the height of the protrusion was 12.1 ⁇ m.
  • polydimethylsiloxane which is a liquid silicone rubber, is used as the material for the integrated substrate 13.
  • a liquid mixture 902 of a PDMS prepolymer (PDMS before curing) and a curing agent is poured into a mold 901 (see FIG. 6B).
  • the PDMS is cured by baking the degassed mixture 902 of the PDMS prepolymer and curing agent under predetermined conditions (see FIG. 6C).
  • the hardened liquid mixture 902 is peeled off from the mold 901, thereby completing the integrated substrate 13 (see FIG. 6D).
  • the integrated substrate 13 is placed within the holding frame 12 (see FIG. 6E). As a result, the collection kit 1 before sample introduction is completed, and a series of processes are completed.
  • FIG. 8 is a diagram showing a top view of the integrated substrate 13.
  • FIG. 9 is a diagram showing a cross-sectional image of the integrated substrate 13.
  • the integrated substrate 13 is provided with a plurality of cylindrical pores 131 arranged in a honeycomb shape.
  • the diameter of the pores 131 was 14 ⁇ m, and the depth of the pores was 13 ⁇ m.
  • ⁇ Accumulation mechanism> Next, the accumulation mechanism of multiple types of microorganisms in this embodiment will be explained.
  • three types of bacteria were used as microorganisms to be collected, specifically, lactic acid bacteria (Lactobacillus casei), Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus.
  • Lactic acid bacteria are rod bacteria.
  • the length of the long axis (major axis) of a typical lactic acid bacterium is about 1 to 3 ⁇ m.
  • Pseudomonas aeruginosa is a rod fungus.
  • the typical long axis length of Pseudomonas aeruginosa is about 0.7 to 2 ⁇ m.
  • Staphylococcus aureus is a coccus.
  • the diameter of a typical Staphylococcus aureus is on the order of 0.8-1 ⁇ m.
  • Lactic acid bacteria and Pseudomonas aeruginosa are chemotactic. On the other hand, Staphylococcus aureus does not have chemotaxis.
  • intestinal bacteria are classified into good bacteria, bad bacteria, and opportunistic bacteria.
  • Lactic acid bacteria are good bacteria.
  • Pseudomonas aeruginosa is a bad bacteria.
  • Staphylococcus aureus is an opportunistic bacterium.
  • FIG. 10 is a diagram for explaining the photo-induced force that acts on bacteria due to laser light irradiation from the laser light source 4.
  • FIG. 10 exemplifies Pseudomonas aeruginosa (indicated by B), which has flagella and has strong chemotaxis (active motility).
  • the light-induced force includes an inter-material light-induced force, a gradient force, and a dissipation force.
  • the intermaterial photoinduced force and gradient force act particularly strongly on bacteria. This attracts bacteria in the direction of the beam waist. Moving away from the vicinity of the beam waist, the dissipative force becomes more prominent as a light-induced force acting on the bacteria.
  • the direction in which the dissipation force acts is the same direction as the laser beam irradiation direction. In this example, since the laser light is irradiated from above to below, a dissipation force from above to below acts on the bacteria.
  • the dissipation force includes a component due to light absorption (absorption force) and a component due to light scattering (scattering force).
  • the scattering power is proportional to the scattering cross section of the target object and the laser intensity.
  • non-resonant light laser light with a wavelength located outside the wavelength range of electronic resonance of a plurality of types of bacteria
  • the absorption force included in the dissipation force is negligibly small. Therefore, the dissipative force may be referred to as the scattering force.
  • each bacterium is approximately several ⁇ m. This is comparable to the wavelength of laser light, which is 1064 nm. Therefore, when bacteria are irradiated with laser light, Mie scattering occurs, and the scattering power is enhanced even under conditions that avoid the light absorption region by bacteria (electronically non-resonant conditions). More specifically, buoyant force acts upward on each bacterium in the liquid sample, and force due to Brownian motion (collision) of molecules in the sample acts on each bacterium. A downward scattering force that is larger than the size of the upward component of the force due to Brownian motion and larger than the size of the upward component of the force due to Brownian motion can be applied to each bacterium.
  • the magnitude of the downward component of the scattering force is larger than the sum of the buoyant force (the magnitude of the upward component) and the magnitude of the upward component of the force due to Brownian motion. This makes it possible to forcefully push each bacterium toward the pores.
  • the dissipation force or scattering force due to laser beam irradiation will also be referred to as "light pressure.”
  • FIG. 11 is a diagram for explaining the accumulation mechanism of multiple types of bacteria in this embodiment.
  • the chemotactic bacteria themselves can generate a propulsive force moving upward from below, as shown in FIG. 11.
  • the optical pressure acting downwardly on bacteria due to laser light irradiation is set to be greater than the upward propulsive force due to chemotaxis of bacteria.
  • the magnitude of the downward component of light pressure is greater than the buoyancy force (upward component), greater than the magnitude of the upward component of force due to Brownian motion, and the magnitude of the upward component of propulsive force due to chemotaxis. It's bigger than that. More preferably, the magnitude of the downward component of the optical pressure is greater than the sum of the magnitude of the upward component of buoyancy, the magnitude of the upward component of force due to Brownian motion, and the magnitude of the upward component of propulsive force due to chemotaxis. .
  • FIG. 12 is a flowchart showing the processing procedure for bacteria accumulation processing.
  • the processing shown in this flowchart is executed when a predetermined condition is satisfied (for example, when the user operates a start button (not shown) on the HMI 9).
  • a predetermined condition for example, when the user operates a start button (not shown) on the HMI 9.
  • Each step is basically realized by software processing by the controller 10 (processor 101), but part or all of it may be realized by hardware (electrical circuit) disposed within the controller 10.
  • the controller 10 installs the integrated kit 1 on the XYZ axis stage 2.
  • This process can be realized, for example, by a feeding mechanism (not shown) of the collection kit 1. Instead of automating this process, the user may manually install the collection kit 1.
  • the controller 10 introduces a sample containing multiple types of bacteria into the holding frame 12 of the collection kit 1.
  • This process can be achieved, for example, by a dispenser (not shown) capable of injecting the sample.
  • a user may manually introduce the sample into the collection kit 1.
  • the controller 10 seals the introduced sample with the cover glass 14. This process can also be automated using a feeding mechanism, but the cover glass 14 may also be placed manually by the user.
  • the controller 10 starts photographing the sample in the integrated kit 1. More specifically, the controller 10 controls the illumination light source 7 to start irradiating the integrated kit 1 with white light, and controls the camera 8 to take an image of the integrated kit 1 at the laser spot. .
  • the controller 10 performs horizontal position adjustment using the adjustment mechanism 3 so that the laser beam irradiation position (laser spot position) is on the integrated substrate 13.
  • the controller 10 can adjust the position of the laser spot on the integrated substrate 13 by extracting the integrated substrate 13 from the image taken by the camera 8, for example.
  • the controller 10 adjusts the height of the integrated kit 1 in the vertical direction using the adjustment mechanism 3 so that the optical pressure of the laser beam exceeds the propulsive force due to chemotaxis.
  • spot diameter The following relationship exists between the optical pressure and the diameter of the laser spot on the upper surface of the integrated substrate 13 (hereinafter abbreviated as "spot diameter").
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the relationship between optical pressure and spot diameter.
  • the height of the integrated kit 1 is adjusted so that the laser spot is located below the upper surface of the integrated substrate 13.
  • the distance between the laser spot and the top surface of the integrated substrate 13 is written as D.
  • the spot diameter becomes larger.
  • the output per unit area of the laser beam at the laser spot that is, the laser intensity (unit: W/m 2 ) decreases, and the optical pressure also decreases. become weak. In this way, there is a negative correlation between optical pressure and spot diameter.
  • the relationship between the distance D, the spot diameter, and the optical pressure per unit area can be calculated in advance. Thereby, by adjusting the vertical height of the integrated kit 1 (adjusting the distance D), the optical pressure can be set to a desired value that overcomes the propulsive force due to chemotaxis of bacteria.
  • the controller 10 sets the length of time (specified time) for irradiating the laser beam.
  • the controller 10 receives, for example, a user operation for setting a specified time from the HMI 9.
  • the prescribed time may be automatically set according to the optical pressure (spot diameter and/or vertical height of the integrated kit 1). The longer the optical pressure is, the shorter the prescribed time tends to be.
  • the controller 10 may have a map showing the relationship between the optical pressure and the specified time. The controller 10 can set the prescribed time corresponding to the optical pressure set in S206 by referring to the map.
  • the controller 10 controls the laser light source 4 to start (or continue) irradiating the integrated kit 1 with laser light. During irradiation with laser light, a plurality of types of bacteria are accumulated in the pores 131 according to the mechanism explained in FIGS. 10 and 11.
  • the controller 10 determines whether the elapsed time from the start of laser light irradiation has reached a specified time. If the elapsed time has not reached the specified time (NO in S209), the controller 10 returns the process to S208. Thereby, laser light irradiation is continued. When the elapsed time reaches the specified time (YES in S209), the controller 10 advances the process to S210 and controls the laser light source 4 to stop the laser light irradiation. Furthermore, the controller 10 finishes photographing the sample in the integrated kit 1 (S211). That is, the controller 10 stops the irradiation of white light from the illumination light source 7, and also stops the operation of the camera 8.
  • the controller 10 analyzes the photographed image of the sample (in the example described later, a fluorescence image).
  • the controller 10 can, for example, calculate the area where bacteria accumulate or calculate the survival rate of the accumulated bacteria. This completes the series of processing.
  • the integrated substrate 13 is not provided with a light-to-heat conversion material corresponding to the gold thin film of Patent Document 1.
  • bacteria are accumulated by an optical method in which bacteria are forced into pores using optical pressure set to a sufficiently large value to overcome the propulsive force due to chemotaxis. Therefore, according to this embodiment, a plurality of types of bacteria can be accumulated while suppressing thermal damage.
  • Patent Document 1 Laser output and spot diameter ⁇
  • laser light is focused so as to be able to irradiate partition walls separating pores of a honeycomb polymer membrane (see FIGS. 12 and 21 and paragraph [0103] of Patent Document 1). This is because it is advantageous to focus the laser beam as much as possible from the viewpoint of creating a large temperature gradient in the liquid sample. Another reason is that thermal damage to bacteria can be reduced by limiting the area where heat is generated due to laser light irradiation (and the area where the generated heat is transmitted to the surrounding area). To give specific numerical values, the laser beam is focused so that the spot diameter is approximately several ⁇ m. Further, Patent Document 1 describes that the laser output from the laser light source is set to 40 mW. In Patent Document 1, the laser output after passing through the objective lens (100x magnification, oil immersion) is calculated to be approximately 8 mW, which is approximately 20% of the laser output before passing through the objective lens (paragraph of Patent Document 1). [0081]).
  • the bacteria accumulation mechanism in this embodiment is to force the bacteria into the pores by applying the optical pressure of the laser beam directly to the bacteria.
  • the spot diameter is set within the range of 62.6 to 152.6 ⁇ m.
  • the output of the laser light from the laser light source 4 is set to 800 mW.
  • the laser output after passing through the objective lens (40x magnification, dry) is calculated to be about 320 mW, which is about 40% of the laser output before passing through the objective lens. This output value is so high that a person skilled in the art would not be able to imagine irradiating microorganisms according to conventional technical common sense.
  • the irradiation area of the laser beam is two orders of magnitude larger, and the laser light output (unit: W) is one to two orders of magnitude (approximately 40 times) larger. That is, in this embodiment, a wide range is irradiated with a laser beam of high intensity (unit: W/m 2 ). As a result, a strong optical pressure capable of overcoming the propulsive force due to chemotaxis of bacteria is applied over a wide range. Therefore, it becomes possible to accumulate a large amount of bacteria with high efficiency.
  • Pore size In the collection kit described in Patent Document 1, the diameter of the pore was about 5.0 ⁇ m, and the depth of the pore was about 3.0 ⁇ m (see FIG. 5 and paragraph [0051] of Patent Document 1). .
  • the long axis length of lactic acid bacteria, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus ranges from about 0.7 to 3 ⁇ m. For example, when the long axis length is 3 ⁇ m, only a few bacteria (at most 2 or 3) are captured in each pore provided in the collection kit described in Patent Document 1.
  • the diameter of the pores 131 was 14 ⁇ m, and the depth of the pores 131 was 13 ⁇ m. That is, the pores 131 provided in the integrated substrate 13 in this embodiment are significantly larger than the pores provided in the collection kit of Patent Document 1. Specifically, the opening area of the pores 131 is 7.8 times larger. The depth of the pores 131 is 4.3 times as deep. The volume of pore 131 is 34 times larger. In this way, by setting the size of each pore sufficiently large (setting it to a size that can capture or contain at least one of each type of bacteria), multiple types of bacteria can be accumulated in the same pore. . For example, it is possible to accumulate as many as 68 to 102 bacteria with a major axis length of 3 ⁇ m. Therefore, it becomes possible to suitably analyze interactions between multiple types of bacteria.
  • a honeycomb polymer membrane is formed by using a plurality of water droplets arranged in a honeycomb shape by self-assembly as a mold (see FIG. 4 of Patent Document 1).
  • each pore is approximately spherical due to the spherical shape of water droplets, so adjacent pores communicate with each other on the bottom side of the polymer membrane (see the figure in Patent Document 1). 5 and paragraph [0052]).
  • Adjacent pores communicate with each other, forming a "side hole" in the collection kit. Heat convection also flows in the direction in which these horizontal holes extend (in the direction of the horizontal holes). Thermal convection in the direction of the lateral holes serves to prevent bacteria once trapped within the pores from escaping from the pores.
  • the present embodiment uses light pressure to accumulate bacteria instead of buoyancy convection. Since the accumulation effect due to light pressure is not as strong as the accumulation effect due to buoyancy convection, Marangoni convection may hinder bacterial accumulation. Therefore, in this embodiment, the through hole 121 is filled with a sample, and the sample is sealed with a cover glass 14 (see FIGS. 3A and 3B). By forming a closed system in which the sample does not come into contact with the surrounding air in this way, it is possible to suppress evaporation of the dispersion medium from the sample surface and to suppress the occurrence of Marangoni convection that can hinder the accumulation of bacteria. Furthermore, by increasing the volume of the dispersion medium, a distance between the sample surface and the laser spot is ensured, so that the influence of Marangoni convection can be reduced.
  • FIG. 14 is a SYTO9 image showing the accumulation results of bacteria (both live and dead) at different spot diameters.
  • FIG. 15 is a diagram showing the relationship between the spot diameter and the area of the region where fluorescence is observed in the fluorescence image of FIG. 14 (fluorescence area).
  • the horizontal axis in FIG. 15 represents the spot diameter.
  • the laser output from the laser light source 4 was set to 800 mW.
  • the light irradiation time (specified time in FIG. 12) was set to 15 minutes.
  • the concentration of bacteria was 10 8 [CFU/mL] (CFU: Colony Forming Unit).
  • the spot diameter was 62.6 ⁇ m.
  • the spot diameter was 107.6 ⁇ m.
  • the spot diameter was 152.6 ⁇ m. As shown in FIG. 15, it was confirmed that as the distance D became longer and the spot diameter became larger accordingly, the area where bacteria accumulated increased.
  • FIG. 16 is a SYTO9 image showing the accumulation results of bacteria (both live and dead bacteria) at different light irradiation times.
  • FIG. 17 is a PI image showing the accumulation results of bacteria (dead bacteria only) during a light irradiation time of 60 minutes.
  • the light irradiation time was set at 15 minute intervals in the range from 15 minutes to 90 minutes.
  • the spot diameter was set to 107.6 ⁇ m.
  • the laser power was set at 800 mW.
  • the concentration of bacteria was 10 8 [CFU/mL].
  • the denominator on the right side of equation (1) is the number of bacteria observed in the SYTO9 image.
  • FIG. 18 is a diagram showing the relationship between light irradiation time, survival rate, and fluorescent area.
  • the horizontal axis represents the light irradiation time.
  • the vertical axis on the left represents the bacterial survival rate.
  • the vertical axis on the right represents the fluorescent area.
  • the fluorescent area increased as the light irradiation time became longer.
  • the fluorescent area was saturated. No significant difference was observed in the fluorescent area between the cases where the light irradiation time was 75 minutes and 90 minutes.
  • the survival rate monotonically decreased as the light irradiation time increased. However, even if the light irradiation time was 90 minutes, the survival rate remained high, exceeding 70%.
  • Patent Document 1 describes that bacteria are accumulated in a short light irradiation time of about 1 minute (see FIG. 12 and paragraph [0074] of Patent Document 1). In contrast, in the present embodiment, a longer light irradiation time of about ten minutes to several tens of minutes may be required. However, according to the present embodiment, bacteria can be accumulated while suppressing thermal damage in exchange for prolonging the light irradiation time.
  • FIG. 19 is a SYTO9 image showing bacterial accumulation results at different laser powers.
  • the laser output was set in four ways: 200 mW, 400 mW, 600 mW, and 800 mW.
  • the spot diameter was set at 62.6 ⁇ m.
  • the light irradiation time was set to 15 minutes.
  • the concentration of bacteria was 10 8 [CFU/mL]. Bacterial accumulation was observed when the laser output was 400 mW or more.
  • FIG. 20 is a diagram showing the relationship between laser output, survival rate, and integration density.
  • the horizontal axis represents laser output.
  • the left vertical axis represents the bacterial survival rate.
  • the vertical axis on the right represents the bacterial accumulation density. It was confirmed that when the laser output was 800 mW, bacteria were successfully accumulated at a high survival rate of over 90% and at a high density of 3.37 ⁇ 10 7 [cells/cm 2 ].
  • FIG. 21 is a fluorescence observation image showing the accumulation results of multiple types of bacteria stained in multiple colors. Multicolor staining was performed using Fluorescence in situ hybridization (FISH). The spot diameter was set to 107.6 ⁇ m. The laser power was set at 800 mW. The light irradiation time was set to 5 minutes.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • lactic acid bacteria were stained with a probe to which a green fluorescent dye (Alexa Flour (registered trademark) 488) was added.
  • the base sequence of the probe was 5'GGTATTAGCAYCTGTTTCCA3'.
  • Pseudomonas aeruginosa was stained with a probe to which a yellow fluorescent dye (Alexa Flour 555) was added.
  • the base sequence of the probe was 5'TCTGGAAAGTTCTCAGCA3'.
  • Staphylococcus aureus was stained with a probe to which a blue fluorescent dye (Alexa Flour 405) was added.
  • the base sequence of the probe was 5'GAAGCAAGCTTCTCGTCCGTTC3'.
  • FIG. 21 is a black and white image
  • fluorescence of the above three colors was observed. This confirmed that the three types of bacteria were successfully accumulated.
  • FIG. 22 is a fluorescence observation image showing the result of bacterial accumulation in a high concentration sample.
  • FIG. 23 is a fluorescence observation image showing the result of bacterial accumulation in a low concentration sample.
  • the SYTO9 image is shown on the left, and the PI image is shown on the right. It was clear that the high-concentration sample had a larger area of bacteria accumulation and a larger amount of bacteria than the low-concentration sample.
  • FIG. 24 is an enlarged optical image for observing accumulated bacteria. A high survival rate was expected, as many bacteria trapped within the pores were observed to be moving.
  • FIG. 25 is a diagram showing the bacterial accumulation area and survival rate.
  • the horizontal axis represents the light irradiation time.
  • the upper vertical axis represents the bacterial accumulation area, and the lower vertical axis represents the bacterial survival rate.
  • the rise (increase rate) of the accumulated area was faster in the high-concentration sample than in the low-concentration sample, especially at a light irradiation time of 15 to 30 minutes.
  • the accumulated area was wide at the same light irradiation time.
  • After 45 minutes of light irradiation a slight decrease in survival rate over time was observed in the low-concentration samples.
  • the high-concentration sample there was almost no decrease in survival rate, and the survival rate in the high-concentration sample was close to 100%.
  • the following two points can be considered from the results shown in FIGS. 22 to 25.
  • the bacterial accumulation range was comparable to that of the laser spot (see Figure 23), whereas in the high-concentration sample, the bacterial accumulation range was significantly wider than that of the laser spot (see Figure 22). ).
  • a high survival rate can be achieved by adjusting the sample concentration to a high concentration that allows bacteria to accumulate in a wider area than the laser spot.
  • the laser light irradiation conditions are set so that multiple types of bacteria can be optically accumulated without using the photothermal effect of a photothermal conversion material such as a thin gold film.
  • the irradiation range of the laser beam is set to include the entire openings of two or more pores (see FIG. 4).
  • the laser beam is adjusted so that the dissipative force (light-induced force) acting in the laser beam irradiation direction is larger than the buoyancy force, larger than the force due to Brownian motion, and preferably larger than the propulsive force due to chemotaxis.
  • each of the plurality of pores 131 has a depth extending in a direction including only a vertically downward component.
  • the integrated substrate 13 may be arranged inclined at a certain angle with respect to the horizontal direction. In other words, the depth of each of the plurality of pores 131 may extend in a direction including a horizontal component in addition to a vertically downward component.
  • the laser light from the laser light source 4 is irradiated perpendicularly to (the main surface of) the integrated substrate 13.
  • the propagation direction of the laser beam and the depth direction of the plurality of pores 131 coincide.
  • the laser light may be irradiated onto the integrated substrate 13 at an angle other than perpendicular (however, excluding parallel).
  • the propagation direction of the laser light does not need to completely match the depth direction of the plurality of pores 131, and may include a vertically downward component.
  • FIG. 26 is an overall configuration diagram of a microorganism accumulation system according to a modification of the embodiment of the present disclosure.
  • the accumulation system 200 differs from the accumulation system 100 according to the embodiment (see FIG. 1) in that it includes an accumulation kit 15 instead of the accumulation kit 1 and further includes a pump 16 and capillary tubes 17 and 18. .
  • the other configurations are the same.
  • the integrated kit 15 includes a microchannel substrate 15A (see FIG. 28).
  • the integrated kit 15 can be produced using a mold similarly to the embodiment. The configuration of the integrated kit 15 will be explained with reference to FIGS. 27 to 30.
  • the pump 16 is configured to pump out the sample by the action of pressure, centrifugal force, rotational force, or the like.
  • Pump 16 may be, for example, an electric syringe pump, a manual dispenser, or a micropipette.
  • the pump 16 is connected to a capillary tube 17 provided upstream of the collection kit 15. After the sample flows through the collection kit 15 via the capillary tube 17, it is discharged from the capillary tube 18 provided on the downstream side of the collection kit 15.
  • FIG. 27 is a diagram showing an example of a mold for forming a microchannel substrate.
  • Mold 903 is produced using, for example, a 3D printer.
  • FIG. 28 is a diagram showing a microchannel substrate produced using the mold 903 shown in FIG. 27.
  • the microchannel substrate 15A can be manufactured by pouring a PDMS solution into a mold 903 and heating and curing the PDMS solution.
  • the microchannel substrate 15A includes a non-branched channel including one inlet and one outlet.
  • the microchannel substrate may include multiple inlets and/or multiple outlets, or may be of a branched type.
  • FIG. 29 is a diagram showing an example of an integrated substrate.
  • An integrated substrate 15B as shown in FIG. 29 is bonded to the microchannel substrate 15A.
  • the integrated substrate 15B is common to the integrated substrate 13 in the embodiment (see FIGS. 8 and 9).
  • FIG. 30 is an image of the integrated kit 15 that was actually produced.
  • FIG. 31 is a diagram for explaining the accumulation mechanism of multiple types of microorganisms in a modified example.
  • a microorganism is a chemotactic bacterium, in addition to buoyancy, the force due to Brownian motion, and the propulsive force of the bacterium itself, a drag force from the fluid (pressure-driven flow) acts on the bacterium. do.
  • the optical pressure that acts downward on the bacteria due to laser light irradiation is set to be larger than the upward component of the drag force.
  • the downward component of the light pressure is larger than the buoyant force (upward component), larger than the upward component of the force due to Brownian motion, larger than the upward component of the propulsive force due to chemotaxis, and the drag force is larger than the upward component of.
  • the downward component of the optical pressure is greater than the sum of the upward component of buoyancy, the upward component of force due to Brownian motion, the upward component of propulsive force due to chemotaxis, and the upward component of drag.
  • active bacteria for example, bacteria with active cell division
  • the accumulation kit 15 by using the microchannel, active bacteria (for example, bacteria with active cell division) are constantly supplied to the accumulation kit 15. According to this modification, even if the sample has a low concentration, active bacteria can be accumulated with high efficiency. Furthermore, similar to the embodiment, a high survival rate can be achieved.
  • a microorganism accumulation method that accumulates multiple types of microorganisms contained in a liquid sample, the method comprising: the step of preparing a substrate provided with a plurality of pores, each of the plurality of pores having an opening capable of trapping at least one of each of the plurality of types of microorganisms, and a direction including a vertically downward component; and a depth extending to introducing the liquid sample onto the substrate; setting irradiation conditions for non-resonant light that is light outside the electronic resonance wavelength range of the plurality of types of microorganisms; irradiating the plurality of pores through the liquid sample with the non-resonant light according to the irradiation conditions, A region of the plurality of pores that is irradiated with the non-resonant light does not include a photothermal conversion material that converts the non-resonant light into heat,
  • the step of setting is such that, for the plurality of types of microorganisms, the magnitude of the vertically downward component of the light-induced force is the same as the magnitude of the vertically upward component of the buoyant force and the magnitude of the vertically upward component of the force due to Brownian motion.
  • the plurality of types of microorganisms include microorganisms having chemotaxis,
  • the step of setting is such that for the chemotactic microorganism, the magnitude of the vertically downward component of the light-induced force is larger than the magnitude of the vertically upwardly directed component of the propulsive force due to chemotaxis.
  • the step of setting is such that, for the chemotactic microorganism, the magnitude of the vertically downward component of the light-induced force is equal to the magnitude of the vertically upwardly directed component of the buoyant force and the vertically upwardly directed component of the force due to Brownian motion.
  • the method for accumulating microorganisms according to appendix 3, comprising the step of setting the intensity in the irradiation range so as to be larger than the sum of the size and the size of the vertically upward component of the propulsive force due to chemotaxis.
  • the step of introducing is a step of flowing the liquid sample over the substrate
  • the setting step includes adjusting the irradiation range so that the magnitude of the vertically downward component of the light-induced force is larger than the magnitude of the vertically upward component of the drag force due to the liquid sample with respect to the plurality of types of microorganisms.
  • the method for accumulating microorganisms according to any one of claims 1 to 5, comprising the step of setting the intensity in .
  • the vertically downward component of the light-induced force is equal to the magnitude of the vertically upward component of the buoyant force, the magnitude of the vertically upward component of the force due to Brownian motion, and the liquid 7.
  • the method for accumulating microorganisms according to claim 6, comprising the step of setting the intensity in the irradiation range to be larger than the sum of the magnitude of the vertically upward component of the drag force of the sample.
  • the setting step further includes the step of setting the irradiation range so as to include the entire opening of two or more of the plurality of pores. How to accumulate microorganisms.
  • Appendix 10 The method for accumulating microorganisms according to any one of appendix 9, wherein the step of introducing includes the step of forming a closed system in which the liquid sample does not come into contact with the gas surrounding the liquid sample.
  • step of introducing includes the step of adjusting the concentration of the plurality of types of microorganisms in the liquid sample to a high concentration such that the plurality of types of microorganisms are accumulated in a wider range than the irradiation range.
  • the method for accumulating microorganisms according to any one of the items.
  • a microorganism accumulation system that accumulates multiple types of microorganisms contained in a liquid sample, a substrate provided with a plurality of pores, each of the plurality of pores having an opening capable of trapping at least one of the plurality of types of microorganisms for each type, and a depth extending in a direction including a vertically downward component; has, and furthermore, a light source that irradiates non-resonant light, which is light outside the wavelength range of electronic resonance of the plurality of types of microorganisms, toward the plurality of pores through the liquid sample in a state where the liquid sample is placed on the substrate; and a control device that controls the light source, A region of the plurality of pores that is irradiated with the non-resonant light does not include a photothermal conversion material that converts the non-resonant light into heat,
  • the control device is configured such that, for the plurality of types of microorganisms, a vertically downward component of a photo-induced force
  • 1 Integration kit 11 Base material, 12 Holding frame, 121 Through hole, 13 Integration substrate, 131 Pore, 14 Cover glass, 15 Integration kit, 15A Microchannel substrate, 15B Integration substrate, 16 Pump, 17, 18 Capillary, 2 XYZ axis stage, 3 Adjustment mechanism, 4 Laser light source, 5 Dichroic mirror, 6 Objective lens, 7 Illumination light source, 8 Camera, 9 HMI, 10 Controller, 101 Processor, 102 Memory, 103 Input/output port, 100,200 integrated system , 901 Mold, 902 Mixed liquid, 903 Mold.

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Abstract

微生物の集積方法は、複数種類の微生物を集積するための第１～第３のステップを含む。第１のステップは、複数の細孔（１３１）が設けられた集積基板（１３）を準備するステップである。複数の細孔（１３１）の各々は、複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有する。第２のステップは、レーザ光の照射条件を設定するステップである。第３のステップは、照射条件に従ってレーザ光をサンプルを通じて複数の細孔（１３１）に照射するステップである。レーザ光が照射される領域は光熱変換材料を含まない。設定するステップは、非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、非共鳴光の照射範囲における非共鳴光の強度を設定するステップを含む。

Description

微生物の集積方法および集積システム
　本開示は、微生物の集積方法および集積システムに関し、より特定的には、液体試料中に浮遊した複数種類の微生物を集積するための方法およびシステムに関する。
　ヒトの腸内、口腔内、皮膚などには多くの種類の微生物が定着し、「マイクロバイオータ」とも呼ばれる微生物叢を形成している。マイクロバイオータがヒトの健康（疾患、生体反応など）に深く関与していることが、微生物が持つゲノム情報の総体である「マイクロバイオーム」の解析などにより明らかになりつつある。また、宿主であるヒトの健康に寄与する微生物は「プロバイオティクス」とも呼ばれる。プロバイオティクスを用いたサプリメント、ヨーグルト、クリームなどの製品が広く商品化されている。
国際公開第２０１７／１９５８７２号 国際公開第２０２１／０４００２１号
　上記のような複数種類の微生物は、代謝物のやり取りを介して相互に作用し合いながら共生している。近年、複数種類の微生物の共生機構の解明、複数種類の微生物に対する薬効評価などに向けた研究が進められている。そのため、複数種類の微生物間の相互作用を好適に分析可能な技術が求められている。
　分析対象となる複数種類の微生物を準備する手法として混合培養が知られている。しかし、混合培養では一般に、微生物が液体試料中に浮遊した状態にあり、かつ、微生物間の距離が離れているため、微生物間の相互作用が起こりにくい。そこで、微生物を高密度に固定する、言い換えれば集積することが考えられる。そうすることで微生物間の相互作用が起こりやすくなるので、分析精度の向上を期待できる。
　国際公開第２０１７／１９５８７２号（特許文献１）に開示された微生物の捕集装置は、液体試料中に分散した複数の微生物を捕集する。捕集装置は、光源と、液体試料を保持可能に構成された保持部材とを備える。保持部材には光熱変換領域が形成されている。光熱変換領域は、光源からの光を熱に変換して液体試料を加熱することによって液体試料中に熱対流を生じさせる。この熱対流を利用することで微生物を集積できる。
　特許文献１に開示された装置を複数種類の微生物の集積に適用することも考えられる。しかしながら、液体試料の加熱に伴って微生物も加熱される。したがって、熱的なダメージが微生物に与えられ、微生物が死滅する可能性がある。そうすると、複数種類の微生物間の相互作用を好適に分析できなくなり得る。
　本開示は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、複数種類の微生物間の相互作用の分析に適した微生物の集積方法および集積システムを提供することである。
　本開示の一態様において、微生物の集積方法は、液体試料に含まれる複数種類の微生物を集積する。微生物の集積方法は第１～第４のステップを含む。第１のステップは、複数の細孔が設けられた基板を準備するステップである。複数の細孔の各々は、複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有する。第２のステップは、液体試料を基板上に導入するステップである。第３のステップは、複数種類の微生物の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光の照射条件を設定するステップである。第４のステップは、照射条件に従って非共鳴光を液体試料を通じて複数の細孔に照射するステップである。複数の細孔のうち非共鳴光が照射される領域は、非共鳴光を熱に変換する光熱変換材料を含まない。設定するステップは、複数種類の微生物に対して、非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、非共鳴光の照射範囲における非共鳴光の強度を設定するステップを含む。
　本開示の他の一態様において、微生物の集積システムは、液体試料に含まれる複数種類の微生物を集積する。微生物の集積システムは、複数の細孔が設けられた基板を備える。複数の細孔の各々は、複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有する。集積システムは、さらに、液体試料が基板上に配置された状態において、複数種類の微生物の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を液体試料を通じて複数の細孔に照射する光源と、光源を制御する制御装置とを備える。複数の細孔のうち非共鳴光が照射される領域は、非共鳴光を熱に変換する光熱変換材料を含まない。制御装置は、複数種類の微生物に対して、非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、非共鳴光の照射範囲における非共鳴光の強度を設定する。
　本開示によれば、複数種類の微生物間の相互作用を好適に分析することが可能になる。
本開示の実施の形態に係る微生物の集積システムの全体構成図である。 集積キットの分解斜視図である。 図３Ａは、集積キットの上面図である。図３Ｂは、図３ＡのＩＩＩＢ－ＩＩＩＢ線に沿う集積キットの断面図である。 複数種類の微生物の集積の様子を示すイメージ図である。 本実施の形態に係る集積キットの製造方法の処理手順を示すフローチャートである。 図６Ａ～図６Ｅは、本実施の形態に係る集積キットの製造方法の概略工程図（第１図～第５図）である。 モールドの一例を示すＳＥＭ画像である。 集積基板の上面像を示す図である。 集積基板の断面像を示す図である。 レーザ光源からのレーザ光の照射により微生物に作用する光誘起力を説明するための図である。 本実施の形態における複数種類の微生物の集積メカニズムを説明するための図である。 微生物の集積処理の処理手順を示すフローチャートである。 光圧とスポット径との間の関係を説明するための図である。 異なるスポット径における微生物の集積結果を示すＳＹＴＯ９画像である。 スポット径と、図１４の蛍光像において蛍光が観察された領域の面積との間の関係を示す図である。 異なる光照射時間における微生物の集積結果を示すＳＹＴＯ９画像である。 光照射時間６０分間における微生物の集積結果を示すＰＩ画像である。 光照射時間と生存率と蛍光面積との間の関係を示す図である。 異なるレーザ出力における微生物の集積結果を示すＳＹＴＯ９画像である。 レーザ出力と生存率と集積密度との間の関係を示す図である。 多色染色された複数種類の微生物の集積結果を示す蛍光観察像である。 高濃度サンプルにおける細菌の集積結果を示す蛍光観察像である。 低濃度サンプルにおける細菌の集積結果を示す蛍光観察像である。 集積された細菌を観察するための拡大光学像である。 細菌の集積面積および生存率を示す図である。 本開示の実施の形態の変形例に係る微生物の集積システムの全体構成図である。 マイクロ流路基板を形成するためのモールドの一例を示す図である。 図２７に示すモールドを用いて作製されたマイクロ流路基板を示す図である。 集積基板の一例を示す図である。 実際に作製された集積キットの画像である。 変形例における複数種類の微生物の集積メカニズムを説明するための図である。
　＜用語の説明＞
　本開示およびその実施の形態において、「サブマイクロメートルオーダー」は、１００ｎｍ（＝０．１μｍ）から１０００ｎｍ（＝１μｍ）までの範囲を含む。「マイクロメートルオーダー」は、１μｍから１０００μｍ（＝１ｍｍ）までの範囲を含む。したがって、「サブマイクロメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまで」は、０．１μｍから１０００μｍまでの範囲を含む。「サブマイクロメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまで」との用語は、好ましくは数百ｎｍ～数百μｍの範囲を意味し、より好ましくは１μｍ～数十μｍの範囲を意味し得る。
　本開示およびその実施の形態において、「微生物」とは、サブマイクロメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内のサイズを有する生物を意味する。微生物の形状は特に限定されず、たとえば球形、楕円球形、ロッド形（棹形）である。微生物が楕円球形の場合、楕円球の長軸方向の長さおよび短軸方向の長さのうちの少なくとも一方がサブマイクロメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。微生物がロッド形の場合、ロッドの幅および長さのうちの少なくとも一方がサブマイクロメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。
　全ての単細胞生物は微生物である。一部の多細胞生物も微生物である。より具体的には、生物は、細菌、古細菌、真核生物に分類される。細菌および古細菌のほとんどは単細胞生物であるため、微生物である。細菌および古細菌のうち多細胞性を示す種も微生物である。真核生物の大部分も単細胞性を示すため、微生物である。微生物は、ヒトなどの細胞も含み得る。
　本開示およびその実施の形態において、「光誘起力」とは、散逸力、勾配力および物質間光誘起力の総称である。散逸力とは、光散乱または光吸収といった散逸的過程において、光の運動量が物質に与えられることによって発生する力である。勾配力とは、光誘起分極が生じた物質が不均一な電磁場の中に置かれた場合に、電磁気学的なポテンシャルの安定点に物質を移動させる力である。物質間光誘起力とは、光励起された複数の物質中の誘起分極から生じる縦電場による力と横電場（輻射場）による力との和である。
　本開示およびその実施の形態において、「可視光」とは、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長域の光を意味する。「赤外光」とは、７００ｎｍ～１０，０００μｍ（＝１ｍｍ）の波長域の光を意味し、好ましくは７００ｎｍ～２，５００ｎｍの波長域の光を意味し、より好ましくは７００ｎｍ～１，４００ｎｍの波長域の光を意味する。「白色光」とは、紫外域～近赤外域に亘る波長域（たとえば２００ｎｍ～１１００ｎｍの波長域）の光を意味する。
　本開示およびその実施の形態において、「共鳴光」とは、微生物への入射によって微生物に大きな光誘起分極を生じさせる光を意味する。光誘起分極とは、物質内部の電子が光によって励起されることにより生じる電気分極である。共鳴光は、微生物の電子的共鳴の波長域内の波長を有する。一方、「非共鳴光」とは、微生物への入射によって微生物に生じる光誘起分極が小さな光を意味する。非共鳴光は、微生物の電子的共鳴の波長域外の波長を有する。
　本開示およびその実施の形態において、「走化性」とは、微生物が、その周囲に存在する特定の化学物質の濃度勾配に対して方向性がある応答を示す性質を意味する。走化性を有する微生物は、好ましい化学物質には近寄り、好ましくない化学物質からは遠ざかる応答を示す。
　［実施の形態］
　以下、本開示の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。図中、同一または相当部分には同一符号を付して、その説明は繰り返さない。ｘ方向およびｙ方向は水平方向を表す。ｘ方向とｙ方向とは互いに直交する。ｚ方向は鉛直方向を表す。重力の向きはｚ方向下方である。ｚ方向上方（鉛直上向き）を「上方」または「上向き」と略し、ｚ方向下方（鉛直下向き）を「下方」または「下向き」と略す。
　＜システム全体構成＞
　図１は、本開示の実施の形態に係る微生物の集積システムの全体構成図である。集積システム１００は、集積キット１と、ＸＹＺ軸ステージ２と、調整機構３と、レーザ光源４と、ダイクロイックミラー５と、対物レンズ６と、照明光源７と、カメラ８と、ヒューマン・マシン・インターフェース（ＨＭＩ：Human　Machine　Interface）９と、コントローラ１０とを備える。
　集積キット１はサンプルを保持する。サンプルとは、集積対象である複数種類の微生物を含む液体試料である。液体（複数種類の微生物の分散媒）の種類は特に限定されるものではないが、この例では滅菌水である。集積キット１の構成例については図２～図９にて説明する。
　ＸＹＺ軸ステージ２は集積キット１を保持する。ＸＹＺ軸ステージ２には白色光（後述）を透過させるための貫通孔（図示せず）が設けられている。図示しないが、複数の集積キットが準備されていてもよい。その場合、複数の集積キット１が順番にＸＹＺ軸ステージ２上に設置され、集積キット１ごとに後述する集積処理（図１２参照）が実施される。
　調整機構３は、サーボモータ、焦準ハンドルなどの駆動機構である。調整機構３は、コントローラ１０からの指令に従って、ＸＹＺ軸ステージ２の水平方向の位置および鉛直方向の高さを調整する。これにより、集積キット１と対物レンズ６との間の相対的な位置関係を調整できる。
　レーザ光源４は、コントローラ１０からの指令に従って、連続波（ＣＷ：Continuous　Wave）のレーザ光（Ｌ１で示す）を発する。レーザ光の出力（単位：Ｗ）もコントローラ１０からの指令によって調整可能である。レーザ光の波長は、微生物の電子的共鳴の波長域外である。本実施の形態では、レーザ光の波長は、近赤外域の波長（具体的には１０６４ｎｍ）である。レーザ光源４から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー５に向かう。
　ダイクロイックミラー５は、レーザ光源４と対物レンズ６との間、かつ、対物レンズ６とカメラ８との間に配置されている。ダイクロイックミラー５は、可視光を透過する一方で、赤外光を反射すように構成されている。よって、近赤外光であるレーザ光は、ダイクロイックミラー５で反射される。
　対物レンズ６は、ダイクロイックミラー５で反射したレーザ光を集光する。対物レンズ６により集光されたレーザ光は、集積キット１に照射される。
　照明光源７は、ハロゲンランプ、水銀ランプ、ＬＥＤ（Light　Emitting　Diode）、蛍光灯などの人工光源である。照明光源７は、コントローラ１０からの指令に従って、集積キット１上のサンプルを撮影するための白色光（Ｌ２で示す）を発する。白色光は、ＸＹＺ軸ステージ２に設けられた貫通孔を通って集積キット１に照射され、集積キット１を透過する。集積キット１を透過した白色光は、対物レンズ６を経由してダイクロイックミラー５へと向かう。可視光である白色光は、ダイクロイックミラー５を透過してカメラ８に取り込まれる。
　カメラ８は、ＣＣＤ（Charge　Coupled　Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary　Metal　Oxide　Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子を含む。カメラ８は、コントローラ１０からの指令に従って、集積キット１上のサンプルを撮影し、撮影された画像を示す信号をコントローラ１０に出力する。カメラ８により撮影される画像は、静止画であっても動画であってもよい。
　ＨＭＩ９は、たとえば、スイッチ、マウス、キーボード、タッチパネルなどの入力機器と、ランプ、ディスプレイ、スピーカなどの出力機器（いずれも図示せず）とを含む。ＨＭＩ９は、ユーザの操作を受け付け、ユーザの操作を示す信号をコントローラ１０に出力する。なお、ここでのユーザとは、微生物を取り扱う担当者であり、開発者、研究者、学生、テクニシャン、オペレータなどである。
　コントローラ１０は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）などのプロセッサ１０１と、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）およびＲＡＭ（Random　Access　Memory）などのメモリ１０２と、各種信号が入出力される入出力ポート１０３とを含む。コントローラ１０は、集積システム１００内の各機器（調整機構３、レーザ光源４、照明光源７、カメラ８）を制御する。また、コントローラ１０は、カメラ８により撮影された画像に対する画像解析（後述する実施例では蛍光画像解析）も可能である。
　なお、図１に示された光学系は一例である。集積システム１００の光学系は、ダイクロイックミラー５に代えてまたは加えて他の光学部品（ミラー、ハーフミラー、ビームスプリッタ、フィルタ、光ファイバなど）を含んでもよい。図１に示された光学系は、照明光源７からの白色光が下方から上方に向けてサンプルに照射され、上方のカメラ８が下方のサンプルを撮影するように構成されている。しかし、集積システム１００の光学系は、照明光源７からの白色光が下方から上方に向けてサンプルに照射され、下方のカメラ８が上方のサンプルを撮影するように構成されていてもよい。
　レーザ光源４は、本開示に係る「光源」に相当する。レーザ光源４から発せられるレーザ光は、本開示に係る「非共鳴光」に相当する。コントローラ１０は、本開示に係る「制御装置」に相当する。
　＜集積キットの構成＞
　図２は、集積キット１の分解斜視図である。図３Ａは、集積キット１の上面図である。図３Ｂは、図３ＡのＩＩＩＢ－ＩＩＩＢ線に沿う集積キット１の断面図である。図２～図３Ｂを参照して、集積キット１は、基材１１と、保持枠１２と、集積基板１３と、カバーガラス１４とを含む。
　基材１１は、集積キット１の機械的強度を確保するために設けられている。さらに、基材１１は、照明光源７からの白色光を透過するように構成されている。具体的には、基材１１は、たとえばガラス基板（スライドガラス）である。基材１１は、シリコーン基板、ＰＥＴ（polyethylene　terephthalate）フィルムなどであってもよい。基材１１の形状は特に限定されないが、この例では平面形状（直方体形状）である。
　保持枠１２はサンプル（ＳＰで示す）を保持する。この例では、保持枠１２には円柱状の貫通孔１２１が設けられている。貫通孔１２１は、一定量のサンプルを蓄える「液ダメ」として機能する。
　集積基板１３は、保持枠１２の貫通孔１２１内に配置されている。集積基板１３は、レーザ光の照射に伴って複数種類の微生物を集積するように構成されている。集積基板１３の製造方法および詳細な構造については図５～図９にて説明する。
　カバーガラス１４は、保持枠１２の貫通孔１２１内に保持されたサンプルを上方から覆う。図３Ｂに示すように、貫通孔１２１内をサンプルで充填し、かつ、サンプルをカバーガラス１４で封止することが望ましい。この理由については後述する。
　図４は、複数種類の微生物の集積の様子を示すイメージ図である。集積基板１３には、ハニカム状に配列された複数の細孔１３１が設けられている。複数の細孔１３１の各々は、複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有する。本実施の形態によれば、レーザ光源４からのレーザ光をサンプルに照射することにより、サンプル中に浮遊した複数種類の微生物を集積基板１３の細孔１３１内に集積できる。この集積メカニズムについても図１０および図１１にて説明する。
　なお、図３Ａ、図３Ｂおよび図４のサンプル中には３種類の微生物が模式的に図示されている。しかし、微生物の種類は３種類に限定されず、２種類以上であればよい。また、実際には、典型的な微生物は肉眼で観察できないほど小さい。
　＜集積キットの製造フロー＞
　図５は、本実施の形態に係る集積キット１の製造方法の処理手順を示すフローチャートである。図６Ａ～図６Ｅは、本実施の形態に係る集積キット１の製造方法の概略工程図である。以下、ステップを「Ｓ」と略す。
　図５および図６Ａ～図６Ｅを参照して、Ｓ１０１において、集積基板１３を製造するためのモールド（鋳型）９０１が準備される（図６Ａ参照）。たとえば電子ビーム描画またはドライエッチングなどの技術を用いてシリコンを加工することによってモールド９０１を作製できる。
　図７は、モールド９０１の一例を示すＳＥＭ（Scanning　Electron　Microscope）画像である。モールド９０１は、たとえば、ハニカム状に配列された複数の円柱状の突起を有する。突起の直径および高さは任意の値に設定可能である。この例では、突起の直径は１４．０μｍであり、突起の高さは１２．１μｍであった。
　図５および図６Ａ～図６Ｅに戻り、本実施の形態では、液状シリコーンゴムであるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：dimethylpolysiloxane）が集積基板１３の材料として用いられる。Ｓ１０２において、ＰＤＭＳプレポリマー（硬化前のＰＤＭＳ）と硬化剤との混合液９０２がモールド９０１に流し込まれる（図６Ｂ参照）。
　Ｓ１０３において、脱気後のＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤との混合液９０２を所定条件下で焼成することにより、ＰＤＭＳを硬化させる（図６Ｃ参照）。
　Ｓ１０４において、硬化した混合液９０２をモールド９０１から剥離することによって、集積基板１３が完成する（図６Ｄ参照）。
　Ｓ１０５において、集積基板１３が保持枠１２内に配置される（図６Ｅ参照）。これにより、サンプル導入前の集積キット１が完成し、一連の処理が終了する。
　図８は、集積基板１３の上面像を示す図である。図９は、集積基板１３の断面像を示す図である。図８および図９に示すように、集積基板１３には、ハニカム状に配列された複数の円柱状の細孔１３１が設けられている。細孔１３１の直径は１４μｍであり、細孔の深さは１３μｍであった。
　＜集積メカニズム＞
　続いて、本実施の形態における複数種類の微生物の集積メカニズムについて説明する。後述する各実施例では、集積対象の微生物として３種類の細菌、具体的には乳酸菌（Lactobacillus　casei）と、緑膿菌（Pseudomonas　aeruginosa）と、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）とを用いた。
　乳酸菌は棹菌である。典型的な乳酸菌の長軸の長さ（長径）は１～３μｍ程度である。緑膿菌は棹菌である。典型的な緑膿菌の長軸の長さは０．７～２μｍ程度である。黄色ブドウ球菌は球菌である。典型的な黄色ブドウ球菌の直径は０．８～１μｍ程度である。乳酸菌および緑膿菌は走化性を有する。一方、黄色ブドウ球菌は走化性を有さない。
　なお、一般に、腸内細菌は、善玉菌、悪玉菌、日和見菌に分類される。乳酸菌は善玉菌である。緑膿菌は悪玉菌である。黄色ブドウ球菌は日和見菌である。乳酸菌と緑膿菌と黄色ブドウ球菌との含有比を調整することによって、善玉菌と悪玉菌と日和見菌との比率を所望の値に設定できる。たとえば、善玉菌：悪玉菌：日和見菌＝２：１：７との腸内細菌叢（腸内フローラ）の理想的なバランスを作り出すことができる。
　図１０は、レーザ光源４からのレーザ光の照射により細菌に作用する光誘起力を説明するための図である。図１０には、鞭毛を有し、強い走化性（活発な運動性）を有する緑膿菌（Ｂで示す）が例示されている。
　光誘起力は、物質間光誘起力と、勾配力と、散逸力とを含む。レーザ光のビームウエストの近傍においては、物質間光誘起力および勾配力が特に強く細菌に作用する。これにより、細菌は、ビームウエストの方向に引き付けられる。ビームウエストの近傍から離れると、細菌に作用する光誘起力としては散逸力が顕著になる。散逸力が作用する方向は、レーザ光の照射方向と同方向である。この例では、レーザ光が上方から下方に照射されるので、細菌には上方から下方への散逸力が作用する。
　なお、散逸力は、光の吸収による成分（吸収力）と、光の散乱による成分（散乱力）とを含む。吸収力は、対象物体の吸収断面積とレーザ強度（＝出力／照射面積）に比例する。散乱力は、対象物体の散乱断面積とレーザ強度とに比例する。本実施の形態では前述のように、非共鳴光（複数種類の細菌の電子的共鳴の波長域外に位置する波長のレーザ光）が採用されている。これは、レーザ光自体が細菌にダメージを与えないように細菌の光吸収域を避けたためである。したがって、散逸力に含まれる吸収力は無視できるほど小さい。よって、散逸力を散乱力と言い換えてもよい。
　各細菌のサイズは数μｍ程度である。これはレーザ光の波長１０６４ｎｍと同程度である。したがって、レーザ光を細菌に照射するとミー（Ｍｉｅ）散乱が起こり、細菌による光吸収域を避けた条件下（電子的に非共鳴の条件下）でも散乱力が増強される。より具体的には、液体試料中の各細菌には、浮力が上方に向けて作用するとともに、サンプル中の分子のブラウン運動（衝突）による力が作用するところ、本実施の形態では、浮力（の上向き成分の大きさ）よりも大きく、かつ、ブラウン運動による力の上向き成分の大きさよりも大きい、下向きの散乱力を各細菌に作用させることができる。より好ましくは、散乱力の下向き成分の大きさが、浮力（の上向き成分の大きさ）と、ブラウン運動による力の上向き成分の大きさとの和よりも大きい。これにより、各細菌を細孔に向けて強力に押し込むことが可能となる。以下では簡単のため、レーザ光の照射による散逸力または散乱力を「光圧」とも記載する。
　図１１は、本実施の形態における複数種類の細菌の集積メカニズムを説明するための図である。走化性を有する細菌には浮力とブラウン運動による力とが作用するのに加えて、図１１に示すように、走化性を有する細菌自身が下方から上方に向かう推進力を発生させ得る。この場合、細菌が集積基板１３から遠ざかる方向に移動することになるため、集積基板１３への細菌の集積が一層困難になり得る。そこで、本実施の形態においては、レーザ光の照射により細菌に下方に作用する光圧が、細菌の走化性による上方への推進力よりも大きくなるように設定される。つまり、光圧の下向き成分の大きさは、浮力（の上向き成分）よりも大きく、かつ、ブラウン運動による力の上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、走化性による推進力の上向き成分の大きさよりも大きい。より好ましくは、光圧の下向き成分の大きさは、浮力の上向き成分の大きさと、ブラウン運動による力の上向き成分の大きさと、走化性による推進力の上向き成分の大きさとの和よりも大きい。走化性による推進力に打ち勝つような十分に大きな値に光圧を設定することによって、走化性を有する細菌を含む複数種類の細菌の集積を実現できる。
　複数種類の細菌を含むサンプルに対してレーザ光を照射しなくても、非常に長い時間をかければ、ある程度は細菌を集積でき得る。しかし、複数種類の細菌間の相互作用の分析に適した態様で細菌を集積することができない。より詳細に説明すると、レーザ光を照射しない場合、まず、走化性を有さない黄色ブドウ球菌が細孔内に捕捉され、その後、乳酸菌および緑膿菌のうちの走化性が弱いものから順に細孔内に捕捉されていく。そうすると、複数種類の細菌が細孔内で不均等に分布することになる。この場合、複数種類の細菌間の相互作用に空間的なばらつきが生じるので、相互作用の分析に適しているとはいえない。これに対し、本実施の形態では、細孔内で均等に分布した状態で複数種類の細菌を集積できる。よって、本実施の形態によれば、複数種類の細菌間の相互作用を好適に分析可能である。
　＜細菌の集積フロー＞
　図１２は、細菌の集積処理の処理手順を示すフローチャートである。このフローチャートに示される処理は、所定条件の成立時（たとえばユーザがＨＭＩ９の開始ボタン（図示せず）を操作したとき）に実行される。各ステップは、基本的にはコントローラ１０（プロセッサ１０１）によるソフトウェア処理によって実現されるが、その一部または全部がコントローラ１０内に配置されたハードウェア（電気回路）によって実現されてもよい。
　Ｓ２０１において、コントローラ１０は、集積キット１をＸＹＺ軸ステージ２上に設置する。この処理は、たとえば集積キット１の送り機構（図示せず）により実現できる。この処理を自動化するのに代えて、ユーザが手作業で集積キット１を設置してもよい。
　Ｓ２０２において、コントローラ１０は、複数種類の細菌が含まれたサンプルを集積キット１の保持枠１２の内部に導入する。この処理は、たとえば、サンプルを注入可能なディスペンサ（図示せず）により実現できる。ユーザが手作業でサンプルを集積キット１に導入してもよい。
　Ｓ２０３において、コントローラ１０は、導入されたサンプルをカバーガラス１４により封止する。この処理も送り機構により自動化できるが、ユーザが手作業でカバーガラス１４を設置してもよい。
　Ｓ２０４において、コントローラ１０は、集積キット１内のサンプルの撮影を開始する。より具体的には、コントローラ１０は、集積キット１への白色光の照射を開始するように照明光源７を制御するとともに、レーザスポットにおける集積キット１の画像を撮影するようにカメラ８を制御する。
　Ｓ２０５において、コントローラ１０は、レーザ光の照射位置（レーザスポットの位置）が集積基板１３上になるように、調整機構３を用いた水平方向の位置調整を行う。コントローラ１０は、たとえば、カメラ８により撮影された画像から集積基板１３を抽出することによって、レーザスポットの位置を集積基板１３上に調整できる。
　Ｓ２０６において、コントローラ１０は、レーザ光の光圧が走化性による推進力を上回るように、調整機構３を用いた集積キット１の鉛直方向の高さ調整を行う。光圧には、集積基板１３の上面におけるレーザスポットの直径（以下、「スポット径」と略す）との間に以下に説明するような関係が存在する。
　図１３は、光圧とスポット径との間の関係を説明するための図である。本実施の形態では、レーザスポットが集積基板１３の上面よりも下方に位置するように、集積キット１の高さが調整される。レーザスポットと集積基板１３の上面との間の距離をＤと記載する。
　距離Ｄが長くなるに従ってスポット径が大きくなる。レーザ光の出力を固定した場合には、距離Ｄが長くなるに従って、レーザスポットにおけるレーザ光の単位面積当たりの出力、すなわちレーザ強度（単位：Ｗ／ｍ２）が低くなり、それにより光圧も弱くなる。このように、光圧とスポット径との間には負の相関関係が存在する。距離Ｄとスポット径と単位面積当たりの光圧との間の関係を事前計算により求めておくことができる。これにより、集積キット１の鉛直方向の高さ調整（距離Ｄの調整）によって、細菌の走化性による推進力に打ち勝つ所望の値に光圧を設定できる。
　図１２を再び参照して、Ｓ２０７において、コントローラ１０は、レーザ光を照射する時間の長さ（規定時間）を設定する。コントローラ１０は、たとえば、規定時間を設定するユーザ操作をＨＭＩ９から受け付ける。あるいは、規定時間が光圧（スポット径および／または集積キット１の鉛直方向の高さ）に応じて自動設定されてもよい。光圧が長いほど規定時間は短くて済む傾向がある。コントローラ１０は、光圧と規定時間との間の関係をマップとして有していてもよい。コントローラ１０は、当該マップを参照することで、Ｓ２０６にて設定された光圧に対応する規定時間を設定できる。
　Ｓ２０８において、コントローラ１０は、集積キット１へのレーザ光の照射を開始（または継続）するようにレーザ光源４を制御する。レーザ光の照射中には図１０および図１１にて説明したメカニズムに従って複数種類の細菌が細孔１３１内に集積される。
　Ｓ２０９において、コントローラ１０は、レーザ光の照射開始時からの経過時間が規定時間に達したか否かを判定する。コントローラ１０は、経過時間が規定時間に達していない場合（Ｓ２０９においてＮＯ）には処理をＳ２０８に戻す。これにより、レーザ光の照射が継続される。経過時間が規定時間に達すると（Ｓ２０９においてＹＥＳ）、コントローラ１０は、処理をＳ２１０に進め、レーザ光の照射を停止するようにレーザ光源４を制御する。さらに、コントローラ１０は、集積キット１内のサンプルの撮影を終了する（Ｓ２１１）。すなわち、コントローラ１０は、照明光源７からの白色光の照射を停止させるとともに、カメラ８の動作を停止させる。
　Ｓ２１２において、コントローラ１０は、撮影されたサンプルの画像（後述する実施例では蛍光画像）を解析する。コントローラ１０は、たとえば、細菌の集積面積を算出したり、集積された細菌の生存率を算出したりすることができる。これにより、一連の処理が終了する。
　＜先行技術との対比＞
　本実施の形態における複数種類の細菌の集積メカニズムの特徴について、特許文献１に記載のメカニズムと対比しながら詳細に説明する。
　≪１．レーザスポットの加熱≫
　特許文献１に記載された捕集キットでは、金薄膜がハニカム高分子膜上に形成されている。金薄膜にレーザ光を照射すると、金薄膜により光エネルギーが熱エネルギーに変換されてレーザ光の照射位置（レーザスポット）が局所的に加熱される（光発熱効果）。そうすると、レーザスポットに近いほど液体試料の温度が高くなる温度勾配に生じ、熱対流が発生する。この熱対流により細菌がレーザスポットに向けて運ばれることによって、細菌がレーザスポット近傍に集積される（特許文献１の段落［００６４］～［００７２］参照）。しかしながら、液体試料の加熱に伴って細菌も加熱される。そのため、熱的なダメージが細菌に与えられ、細菌が死滅する可能性がある。
　これに対し、本実施の形態において、集積基板１３には、特許文献１の金薄膜に相当する光熱変換材料は設けられていない。本実施の形態では、走化性による推進力に打ち勝つような十分に大きな値に設定された光圧により細菌を細孔内に押し込むという光学的な手法によって細菌が集積される。よって、本実施の形態によれば、熱的なダメージを抑制しつつ、複数種類の細菌を集積できる。
　≪２．レーザ出力およびスポット径≫
　特許文献１では、ハニカム高分子膜の細孔間を隔てる隔壁に照射可能なようにレーザ光が集光される（特許文献１の図１２、図２１および段落［０１０３］参照）。これは、液体試料中に大きな温度勾配を作り出す観点からはレーザ光を極力集光する方が有利だからである。また、レーザ光の照射に伴って熱が発生する領域（および発生した熱が周囲に伝わる領域）を制限することで細菌への熱的なダメージを低減できることも理由である。具体的な数値を挙げると、レーザ光は、スポット径が数μｍ程度になるように集光される。また、特許文献１には、レーザ光源からのレーザ出力が４０ｍＷに設定されたことが記載されている。特許文献１において対物レンズ（倍率１００×、油浸）を通過した後のレーザ出力は、対物レンズを通過する前のレーザ出力の約２０％である約８ｍＷと算出される（特許文献１の段落［００８１］参照）。
　本実施の形態における細菌の集積メカニズムは、レーザ光の光圧を細菌に直接的に作用させて細菌を細孔内に押し込むとものである。細菌の集積量を増加させるには、レーザ光のサンプルへの照射面積を大きくすることを要する。よって、本実施の形態ではレーザスポットを極端に絞ることはない。後述する実施例（図１５参照）ではスポット径が６２．６～１５２．６μｍの範囲内に設定される。また、後述する実施例（図１９および図２０）においては、レーザ光源４からのレーザ光の出力が８００ｍＷに設定される。このときの対物レンズ（倍率４０×、ドライ）通過後のレーザ出力は、対物レンズを通過する前のレーザ出力の約４０％である約３２０ｍＷと算出される。この出力値は、従来の技術常識に従えば、当業者が微生物に照射しようとは考え得ないほど高い値である。
　このように、本実施の形態では特許文献１と比べて、レーザ光の照射面積が２桁大きく、レーザ光の出力（単位：Ｗ）が１～２桁（約４０倍）大きい。つまり、本実施の形態では、高い強度（単位：Ｗ／ｍ２）のレーザ光が広い範囲に照射される。これにより、細菌の走化性による推進力に打ち勝つことが可能な強い光圧が広範囲に亘って印加される。したがって、多量の細菌を高効率に集積することが可能になる。
　≪３．細孔サイズ≫
　特許文献１に記載の捕集キットにおいて、細孔の直径は約５．０μｍであり、細孔の深さは約３．０μｍであった（特許文献１の図５および段落［００５１］参照）。前述のように、乳酸菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の長軸長さは約０．７～３μｍの範囲である。たとえば長軸長さが３μｍである場合、特許文献１に記載の捕集キットに設けられた各細孔には数個（高々２、３個）の細菌しか捕捉されない。
　これに対し、本実施の形態において、細孔１３１の直径は１４μｍであり、細孔１３１の深さは１３μｍであった。つまり、本実施の形態において集積基板１３に設けられた細孔１３１は、特許文献１の捕集キットに設けられた細孔と比べて、著しく大きい。具体的には、細孔１３１の開口面積は７．８倍である。細孔１３１の深さは４．３倍である。細孔１３１の容積は３４倍である。このように各細孔のサイズを十分に大きく設定する（細菌の種類毎に少なくとも１つずつ捕捉または収容可能なサイズに設定する）ことにより、複数種類の細菌を同一の細孔内に集積できる。たとえば長軸長さが３μｍの細菌を６８～１０２個も集積可能である。したがって、複数種類の細菌間の相互作用を好適に分析することが可能になる。
　≪４．細孔同士の連通≫
　特許文献１に記載の捕集キットでは、自己組織化によりハニカム状に配列した複数の水滴をモールドとすることでハニカム高分子膜が形成される（特許文献１の図４参照）。ハニカム高分子膜では、水滴が球形であることに起因して各細孔が略球形になるため、隣接する細孔同士が高分子膜の底面側で互いに連通している（特許文献１の図５および段落［００５２］参照）。隣接する細孔同士が連通することで、捕集キットには「横穴」が形成されている。これら横穴が延びる方向（横穴方向）にも熱対流が流れる。横穴方向の熱対流は、細孔内に一旦捕捉された細菌が細孔から脱出することを防止する役割を果たす。
　これに対し、本実施の形態では、図９の断面図から分かるとおり、隣接する細孔同士は互いに連通しておらず、「横穴」が存在しない。そのため、横穴方向に流れる熱対流が発生することもない。そこで、本実施の形態においては、レーザ光の照射停止後にも細菌が走化性により脱出しないように、細孔の深さが定められている。走化性を有するとはいえ、細菌は、化学物質（誘因物質／忌避物質）の濃度勾配が生じた方向に直進するだけである。細菌の走化性を考慮して細孔の深さを十分に深くすることで、細菌が化学物質の濃度勾配に応じて直進したとしても、その移動を細孔内に留めることができる。これにより、光照射により細孔内に捕捉された細菌を光照射停止後も細孔内に捕捉したままに維持できる。
　≪５．分散媒の蒸発≫
　特許文献１に記載の捕集キットでは、捕集キット上に保持された液滴状のサンプルが上方の空間に向けて開放されている（特許文献１の図３参照）。サンプルの分散媒が液滴表面から蒸発するのに伴い、サンプル内にマランゴニ対流が発生し得る。一方で、特許文献１では、レーザ光の照射に伴う浮力対流が細菌の集積に積極的に利用される。浮力対流の集積作用は強力であるため、浮力対流に加えてマランゴニ対流が発生しても細菌の集積の大きな妨げにはならない。
　これに対し、本実施の形態は、浮力対流に代えて光圧を細菌の集積に利用するものである。光圧による集積作用は浮力対流による集積作用ほど強力ではないため、マランゴニ対流が細菌の集積の妨げになり得る。そこで、本実施の形態においては、貫通孔１２１がサンプルで充填され、かつ、カバーガラス１４によりサンプルが封止されている（図３Ａおよび図３Ｂ参照）。このようにサンプルと周囲の空気とが接触しない閉鎖系を形成することによって、サンプル表面からの分散媒の蒸発を抑制し、細菌の集積を妨げ得るマランゴニ対流の発生を抑制できる。また、分散媒の体積を増やすことによって、サンプル表面とレーザスポットとの間の距離が確保されるため、マランゴニ対流の影響を低減できる。
　＜集積結果＞
　３種類の細菌（乳酸菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌）を含むサンプルにおける集積処理の結果について説明する。全ての細菌を蛍光染色した。蛍光色素としてはＳＹＴＯ９（登録商標）またはＰＩ（Propidium　Iodide）を用いた。ＳＹＴＯ９は、生存している細菌（生菌）と死滅した細菌（死菌）との両方を染色する。ＳＹＴＯ９を外部から励起すると、緑色の蛍光を発する。ＳＹＴＯ９の励起波長による蛍光観察像を「ＳＹＴＯ９画像」と記載する。一方、ＰＩは、死菌のみを染色する。ＰＩを外部から励起すると、赤色の蛍光を発する。ＰＩの励起波長による蛍光観察像を「ＰＩ画像」も記載する。
　≪１．スポット径依存性≫
　図１４は、異なるスポット径における細菌（生菌および死菌の両方）の集積結果を示すＳＹＴＯ９画像である。図１５は、スポット径と、図１４の蛍光像において蛍光が観察された領域の面積（蛍光面積）との間の関係を示す図である。図１５の横軸はスポット径を表す。縦軸は、蛍光面積（＝細菌の集積面積）を表す。レーザ光源４からのレーザ出力を８００ｍＷに設定した。光照射時間（図１２の規定時間）を１５分間に設定した。細菌の濃度は１０８［ＣＦＵ／ｍＬ］であった（ＣＦＵ：Colony　Forming　Unit）。
　レーザスポットと集積基板１３の上面との間の距離Ｄが４０μｍである場合、スポット径は６２．６μｍであった。距離Ｄが７０μｍである場合、スポット径は１０７．６μｍであった。距離Ｄが１００μｍである場合、スポット径は１５２．６μｍであった。図１５に示すように、距離Ｄが長くなり、それに伴いスポット径が大きくなるに従って、細菌の集積面積が増大することが確認された。
　≪２．光照射時間依存性≫
　図１６は、異なる光照射時間における細菌（生菌および死菌の両方）の集積結果を示すＳＹＴＯ９画像である。図１７は、光照射時間６０分間における細菌（死菌のみ）の集積結果を示すＰＩ画像である。光照射時間としては、１５分間から９０分間までの範囲で１５分間隔に設定した。スポット径を１０７．６μｍに設定した。レーザ出力を８００ｍＷに設定した。細菌の濃度は１０８［ＣＦＵ／ｍＬ］であった。
　図１６より、光照射時間が長くなるに従って、細菌全体の集積面積が増大することが分かる。図１７より、光照射時間が６０分間のように長くなると、一定程度の細菌が死滅し得ることが分かる。
　図１６および図１７に示したようなＳＹＴＯ９画像およびＰＩ画像を解析することによって、集積された細菌の生存率を算出できる。生存率とは、下記式（１）に示すように、集積された全細菌数に対する生菌数の比率を意味する。
　生存率＝生菌数／（生菌数＋死菌数）×１００　　　・・・（１）
　式（１）の右辺の分母は、ＳＹＴＯ９画像において観察される細菌数である。右辺の分子は、ＳＹＴＯ９画像において観察される細菌数（＝生菌数＋死菌数）から、ＰＩ画像において観察される細菌数（＝死菌数）を差し引くことで算出される。
　図１８は、光照射時間と生存率と蛍光面積との間の関係を示す図である。横軸は光照射時間を表す。左の縦軸は細菌の生存率を表す。右の縦軸は蛍光面積を表す。この例では、光照射時間が１５分間から７５分間までの範囲では、光照射時間が長くなるに従って蛍光面積が増大した。光照射時間が７５分間に達すると、蛍光面積が飽和した。光照射時間が７５分間の場合と９０分の場合との間で蛍光面積に有意な差は見られなかった。一方、生存率は、光照射時間が長くなるに従って単調に減少した。ただし、光照射時間が９０分であっても生存率は７０％を上回る高い値であった。
　図１８より、大きな蛍光面積と高い生存率とを両立可能な光照射時間が存在することが分かる。この例では、光照射時間を４５分間付近に設定することで、細菌の死滅を抑制しつつ、細菌を高効率に集積できる。
　特許文献１には、１分程度の短い光照射時間で細菌が集積されると記載されている（特許文献１の図１２および段落［００７４］参照）。これに対し、本実施の形態においては、十数分～数十分程度の、より長い光照射時間を要し得る。しかし、本実施の形態によれば、光照射時間の長期化と引き換えに熱的なダメージを抑制しつつ細菌を集積できる。
　≪３．レーザ出力依存性≫
　図１９は、異なるレーザ出力における細菌の集積結果を示すＳＹＴＯ９画像である。レーザ出力を２００ｍＷ、４００ｍＷ、６００ｍＷ、８００ｍＷの４通りに設定した。スポット径を６２．６μｍに設定した。光照射時間を１５分間に設定した。細菌の濃度は１０８［ＣＦＵ／ｍＬ］であった。レーザ出力が４００ｍＷ以上の場合に細菌の集積が観察された。
　図２０は、レーザ出力と生存率と集積密度との間の関係を示す図である。横軸はレーザ出力を表す。左の縦軸は細菌の生存率を表す。右の縦軸は細菌の集積密度を表す。レーザ出力が８００ｍＷである場合に、９０％超の高生存率、かつ、３．３７×１０７［個／ｃｍ２］の高密度での細菌の集積に成功したことが確認された。
　≪４．多色染色≫
　図２１は、多色染色された複数種類の細菌の集積結果を示す蛍光観察像である。蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：Fluorescence　in　situ　hybridization）法による多色染色を行った。スポット径を１０７．６μｍに設定した。レーザ出力を８００ｍＷに設定した。光照射時間を５分間に設定した。
　詳細には、乳酸菌に対しては緑色の蛍光色素（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ（登録商標）　４８８）が付加されたプローブによる染色を行った。当該プローブの塩基配列は５’ＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＹＣＴＧＴＴＴＣＣＡ３’であった。緑膿菌に対しては黄色の蛍光色素（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　５５５）が付加されたプローブによる染色を行った。当該プローブの塩基配列は５’ＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡ３’であった。黄色ブドウ球菌に対しては青色の蛍光色素（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　４０５）が付加されたプローブによる染色を行った。当該プローブの塩基配列は５’ＧＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣ３’であった。
　図２１は白黒画像であるため分かりにくいが、上記３色の蛍光が観察された。これにより、３種類の細菌の集積に成功したことが確認された。
　≪５．高濃度における集積≫
　高濃度／低濃度のサンプルにおける集積結果について説明する。具体的に、１０９［ＣＦＵ／ｍＬ］を高濃度とし、１０８［ＣＦＵ／ｍＬ］を低濃度とした。低濃度は図１４～図２０における濃度と同等の濃度であり、高濃度はその１０倍の濃度である。レーザ出力を８００ｍＷに設定した。スポット径を１５２．６μｍに設定した。
　図２２は、高濃度サンプルにおける細菌の集積結果を示す蛍光観察像である。図２３は、低濃度サンプルにおける細菌の集積結果を示す蛍光観察像である。左側にＳＹＴＯ９画像を示し、右側にＰＩ画像を示す。高濃度サンプルの方が低濃度サンプルと比べて、細菌の集積面積が広く、細菌の集積量が多いことが明瞭であった。
　図２４は、集積された細菌を観察するための拡大光学像である。細孔内に捕捉された多くの細菌が動いている様子が観察されたことから、高い生存率が期待された。
　図２５は、細菌の集積面積および生存率を示す図である。横軸は光照射時間を表す。上の縦軸は細菌の集積面積を表し、下の縦軸は細菌の生存率を表す。高濃度サンプルの方が低濃度サンプルと比べて、特に光照射時間１５～３０分における集積面積の立ち上がり（増加レート）が速かった。また、３０分以降も、同じ光照射時間における集積面積が広かった。光照射時間４５分以降、低濃度サンプルでは時間経過に伴う生存率の若干の低下が見られた。これに対し、高濃度サンプルでは生存率の低下がほとんど見られず、高濃度サンプルにおける生存率は１００％に近い値であった。図２２～図２５に示した結果から以下の２点が考察される。
　第１に、高濃度サンプルの場合、レーザ光の照射により多くの細菌が押し込まれて細孔内に早々に捕捉される。細孔内に捕捉された細菌にはレーザ光が直接的に当たりにくい。細孔内では細菌が立体的に重なり合う中で、下層の細菌へのレーザ光の到達が上層の細菌により遮られるためである。したがって、細孔内に捕捉された細菌のうちのかなりの割合がレーザ光によるダメージを受けずに済む。よって、サンプルを高濃度にして多くの細菌を短時間で捕捉することで細菌の生存率低下を抑制できると考えられる。
　第２に、低濃度サンプルでは細菌の集積範囲がレーザスポットと同等であったのに対し（図２３参照）、高濃度サンプルでは細菌の集積範囲がレーザスポットよりも顕著に広かった（図２２参照）。これは、高濃度サンプルでは、光照射を受けていない細菌も集積されることを意味している。その理由としては、光照射を受けた細菌が細孔に向けて押し込まれる際に、それらの細菌の移動に伴う流れがサンプル中に生じ、光照射を受けていない周囲の細菌が当該流れに巻き込まれて細孔内に捕捉されるためと考えられる。
　上記２つの考察を勘案すると、レーザスポットよりも広い範囲に細菌が集積されるような高濃度にサンプルの濃度を調製することによって、高い生存率を達成できることが分かる。
　以上のように、本実施の形態においては、金薄膜などの光熱変換材料による光発熱効果を用いることなく複数種類の細菌を光学的に集積可能なように、レーザ光の照射条件が設定される。より具体的には、２以上の細孔の開口全体を含むように、レーザ光の照射範囲が設定されることが好ましい（図４参照）。さらに、レーザ光の照射方向に作用する散逸力（光誘起力）が、浮力よりも大きく、かつ、ブラウン運動による力よりも大きく、好ましくは走化性による推進力よりも大きくなるように、レーザ強度（＝出力／照射面積）が設定される（図１１参照）。これにより、広範囲に亘って複数種類の細菌を生きたまま細孔内に集積することが可能になる。よって、本実施の形態によれば、走化性を有する少なくとも１種類の細菌を含む複数種類の細菌間の相互作用を好適に分析することが可能になる。
　なお、本実施の形態では、集積基板１３（の主面）が水平方向に配置される例について説明した。この場合、複数の細孔１３１の各々は、鉛直下向き成分のみを含む方向に延びる深さを有する。しかし、集積基板１３は、水平方向に対して、ある角度で傾けて配置されてもよい。言い換えると、複数の細孔１３１の各々の深さは、鉛直下向き成分に加えて水平成分を含む方向に延びてもよい。
　また、本実施の形態では、レーザ光源４からのレーザ光が集積基板１３（の主面）に対して垂直に照射される例について説明した。この場合、レーザ光の伝搬方向と複数の細孔１３１の深さ方向とが一致する。しかし、レーザ光は、集積基板１３に対して垂直以外の角度（ただし、平行は除く）で照射されてもよい。言い換えると、レーザ光の伝搬方向は、複数の細孔１３１の深さ方向と完全に一致していなくてもよく、鉛直下向き成分を含めばよい。
　［実施の形態の変形例］
　実施の形態では、静止サンプル中で細菌が集積される例について説明した。本変形例においては、マイクロ流路を流れるサンプル中における細菌の集積について説明する。
　図２６は、本開示の実施の形態の変形例に係る微生物の集積システムの全体構成図である。集積システム２００は、集積キット１に代えて集積キット１５を備える点、および、ポンプ１６と、毛細管１７，１８とをさらに備える点において、実施の形態に係る集積システム１００（図１参照）と異なる。それ以外の構成は共通である。
　集積キット１５はマイクロ流路基板１５Ａ（図２８参照）を含む。集積キット１５は、実施の形態と同様にモールドを用いて作製され得る。集積キット１５の構成については図２７～図３０にて説明する。
　ポンプ１６は、圧力、遠心力または回転力などの作用によりサンプルを送り出すように構成されている。ポンプ１６は、たとえば、電動式のシリンジポンプであってもよいし、手動式のディスペンサまたはマイクロピペットであってもよい。ポンプ１６は、集積キット１５の上流側に設けられた毛細管１７に接続されている。サンプルは、毛細管１７を介して集積キット１５を流通した後、集積キット１５の下流側に設けられた毛細管１８から排出される。
　図２７は、マイクロ流路基板を形成するためのモールドの一例を示す図である。モールド９０３は、たとえば３Ｄプリンタを用いて作製される。
　図２８は、図２７に示すモールド９０３を用いて作製されたマイクロ流路基板を示す図である。マイクロ流路基板１５Ａは、モールド９０３にＰＤＭＳ溶液を流し込み、ＰＤＭＳ溶液を加熱して硬化させることによって作製され得る。この例では、マイクロ流路基板１５Ａは、１つのインレットと１つのアウトレットとを含む非分岐型の流路を含む。しかし、マイクロ流路基板は、複数のインレットおよび／または複数のアウトレットを含んでもよいし、分岐型であってもよい。
　図２９は、集積基板の一例を示す図である。図２９に示すような集積基板１５Ｂがマイクロ流路基板１５Ａに接合される。集積基板１５Ｂは、実施の形態における集積基板１３（図８および図９参照）と共通である。図３０は、実際に作製された集積キット１５の画像である。
　図３１は、変形例における複数種類の微生物の集積メカニズムを説明するための図である。微生物が走化性を有する細菌である場合、当該細菌には、浮力と、ブラウン運動による力と、細菌自身の推進力とが作用するのに加えて、流体（圧力駆動流）による抗力が作用する。
　本変形例においては、レーザ光の照射により細菌に下方に作用する光圧が、抗力の上向き成分よりも大きくなるように設定される。つまり、光圧の下向き成分は、浮力（の上向き成分）よりも大きく、かつ、ブラウン運動による力の上向き成分よりも大きく、かつ、走化性による推進力の上向き成分よりも大きく、かつ、抗力の上向き成分よりも大きい。より好ましくは、光圧の下向き成分は、浮力の上向き成分と、ブラウン運動による力の上向き成分と、走化性による推進力の上向き成分と、抗力の上向き成分との和よりも大きい。このように十分に大きな値に光圧を設定することによって、流体中においても、走化性を有する細菌を含む複数種類の細菌の集積を実現できる。
　加えて、マイクロ流路を用いることにより、活発な細菌（たとえば細胞分裂が活発な細菌）が集積キット１５に常に供給される。本変形例によれば、たとえ低濃度のサンプルであっても、活発な細菌を高効率に集積可能である。また、実施の形態と同様に、高い生存率を達成できる。
　［付記］
　最後に本開示の諸態様を付記としてまとめて記載する。
　（付記１）
　液体試料に含まれる複数種類の微生物を集積する、微生物の集積方法であって、
　複数の細孔が設けられた基板を準備するステップを含み、前記複数の細孔の各々は、前記複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有し、さらに、
　前記液体試料を前記基板上に導入するステップと、
　前記複数種類の微生物の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光の照射条件を設定するステップと、
　前記照射条件に従って前記非共鳴光を前記液体試料を通じて前記複数の細孔に向けて照射するステップとを含み、
　前記複数の細孔のうち前記非共鳴光が照射される領域は、前記非共鳴光を熱に変換する光熱変換材料を含まず、
　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、前記液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、前記非共鳴光の照射範囲における前記非共鳴光の強度を設定するステップを含む、微生物の集積方法。
　（付記２）
　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記浮力の鉛直上向き成分の大きさと、前記ブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさとの和よりも大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、付記１に記載の微生物の集積方法。
　（付記３）
　前記複数種類の微生物は、走化性を有する微生物を含み、
　前記設定するステップは、前記走化性を有する微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、走化性による推進力の鉛直上向き成分の大きさよりもさらに大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、付記１または２に記載の微生物の集積方法。
　（付記４）
　前記設定するステップは、前記走化性を有する微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記浮力の鉛直上向き成分の大きさと、前記ブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさと、前記走化性による推進力の鉛直上向き成分の大きさとの和よりも大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、付記３に記載の微生物の集積方法。
　（付記５）
　前記複数の細孔の各々の深さは、各細孔内に捕捉された前記走化性を有する微生物が前記走化性による推進力により脱出しないように定められている、付記３または４に記載の微生物の集積方法。
　（付記６）
　前記導入するステップは、前記液体試料を前記基板上に流通させるステップであり、
　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記液体試料による抗力の鉛直上向き成分の大きさよりもさらに大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
　（付記７）
　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分が、前記浮力の鉛直上向き成分の大きさと、前記ブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさと、前記液体試料の抗力の鉛直上向き成分の大きさとの和よりも大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項６に記載の微生物の集積方法。
　（付記８）
　前記設定するステップは、前記複数の細孔のうちの２以上の細孔の開口全体を含むように、前記照射範囲を設定するステップをさらに含む、付記１～７のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
　（付記９）
　前記複数の細孔のうちの隣接する細孔同士は、互いに連通していない、付記１～８のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
　（付記１０）
　前記導入するステップは、前記液体試料と、前記液体試料の周囲の気体とが接触しない閉鎖系を形成するステップを含む、付記９のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
　（付記１１）
　前記導入するステップは、前記照射範囲よりも広範囲に前記複数種類の微生物が集積されるような高濃度に前記液体試料における前記複数種類の微生物の濃度を調製するステップを含む、付記１～１０のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
　（付記１２）
　液体試料に含まれる複数種類の微生物を集積する、微生物の集積システムであって、
　複数の細孔が設けられた基板を備え、前記複数の細孔の各々は、前記複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有し、さらに、
　前記液体試料が前記基板上に配置された状態において、前記複数種類の微生物の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を液体試料を通じて前記複数の細孔に向けて照射する光源と、
　前記光源を制御する制御装置とを備え、
　前記複数の細孔のうち前記非共鳴光が照射される領域は、前記非共鳴光を熱に変換する光熱変換材料を含まず、
　前記制御装置は、前記複数種類の微生物に対して、前記非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、前記液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、前記非共鳴光の照射範囲における前記非共鳴光の強度を設定する、微生物の集積システム。
　今回開示された実施の形態は、全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
　１　集積キット、１１　基材、１２　保持枠、１２１　貫通孔、１３　集積基板、１３１　細孔、１４　カバーガラス、１５　集積キット、１５Ａ　マイクロ流路基板、１５Ｂ　集積基板、１６　ポンプ、１７，１８　毛細管、２　ＸＹＺ軸ステージ、３　調整機構、４　レーザ光源、５　ダイクロイックミラー、６　対物レンズ、７　照明光源、８　カメラ、９　ＨＭＩ、１０　コントローラ、１０１　プロセッサ、１０２　メモリ、１０３　入出力ポート、１００，２００　集積システム、９０１　モールド、９０２　混合液、９０３　モールド。

Claims (12)

  1. 　液体試料に含まれる複数種類の微生物を集積する、微生物の集積方法であって、
    　複数の細孔が設けられた基板を準備するステップを含み、前記複数の細孔の各々は、前記複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有し、さらに、
    　前記液体試料を前記基板上に導入するステップと、
    　前記複数種類の微生物の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光の照射条件を設定するステップと、
    　前記照射条件に従って前記非共鳴光を前記液体試料を通じて前記複数の細孔に照射するステップとを含み、
    　前記複数の細孔のうち前記非共鳴光が照射される領域は、前記非共鳴光を熱に変換する光熱変換材料を含まず、
    　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、前記液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、前記非共鳴光の照射範囲における前記非共鳴光の強度を設定するステップを含む、微生物の集積方法。
  2. 　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記浮力の鉛直上向き成分の大きさと、前記ブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさとの和よりも大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項１に記載の微生物の集積方法。
  3. 　前記複数種類の微生物は、走化性を有する微生物を含み、
    　前記設定するステップは、前記走化性を有する微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、走化性による推進力の鉛直上向き成分の大きさよりもさらに大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項１に記載の微生物の集積方法。
  4. 　前記設定するステップは、前記走化性を有する微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記浮力の鉛直上向き成分の大きさと、前記ブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさと、前記走化性による推進力の鉛直上向き成分の大きさとの和よりも大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項３に記載の微生物の集積方法。
  5. 　前記複数の細孔の各々の深さは、各細孔内に捕捉された前記走化性を有する微生物が前記走化性による推進力により脱出しないように定められている、請求項３に記載の微生物の集積方法。
  6. 　前記導入するステップは、前記液体試料を前記基板上に流通させるステップであり、
    　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記液体試料による抗力の鉛直上向き成分の大きさよりもさらに大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項１に記載の微生物の集積方法。
  7. 　前記設定するステップは、前記複数種類の微生物に対して、前記光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記浮力の鉛直上向き成分の大きさと、前記ブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさと、前記液体試料の抗力の鉛直上向き成分の大きさとの和よりも大きくなるように、前記照射範囲における前記強度を設定するステップを含む、請求項６に記載の微生物の集積方法。
  8. 　前記設定するステップは、前記複数の細孔のうちの２以上の細孔の開口全体を含むように、前記照射範囲を設定するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
  9. 　前記複数の細孔のうちの隣接する細孔同士は、互いに連通していない、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
  10. 　前記導入するステップは、前記液体試料と、前記液体試料の周囲の気体とが接触しない閉鎖系を形成するステップを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
  11. 　前記導入するステップは、前記照射範囲よりも広範囲に前記複数種類の微生物が集積されるような高濃度に前記液体試料における前記複数種類の微生物の濃度を調製するステップを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物の集積方法。
  12. 　液体試料に含まれる複数種類の微生物を集積する、微生物の集積システムであって、
    　複数の細孔が設けられた基板を備え、前記複数の細孔の各々は、前記複数種類の微生物を種類毎に少なくとも１つずつ捕捉可能な開口と、鉛直下向き成分を含む方向に延びる深さとを有し、さらに、
    　前記液体試料が前記基板上に配置された状態において、前記複数種類の微生物の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を液体試料を通じて前記複数の細孔に放射する光源と、
    　前記光源を制御する制御装置とを備え、
    　前記複数の細孔のうち前記非共鳴光が照射される領域は、前記非共鳴光を熱に変換する光熱変換材料を含まず、
    　前記制御装置は、前記複数種類の微生物に対して、前記非共鳴光の照射による光誘起力の鉛直下向き成分の大きさが、前記液体試料による浮力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きく、かつ、前記液体試料中の分子のブラウン運動による力の鉛直上向き成分の大きさよりも大きくなるように、前記非共鳴光の照射範囲における前記非共鳴光の強度を設定する、微生物の集積システム。
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