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WO2023248362A1 - 歯髄幹細胞の培養上清の治療効果マーカー及び歯髄幹細胞の培養上清の判定方法および製造方法 - Google Patents

歯髄幹細胞の培養上清の治療効果マーカー及び歯髄幹細胞の培養上清の判定方法および製造方法 Download PDF

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WO2023248362A1
WO2023248362A1 PCT/JP2022/024776 JP2022024776W WO2023248362A1 WO 2023248362 A1 WO2023248362 A1 WO 2023248362A1 JP 2022024776 W JP2022024776 W JP 2022024776W WO 2023248362 A1 WO2023248362 A1 WO 2023248362A1
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WO
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mir
culture supernatant
stem cells
dental pulp
shed
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宇静 舒
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U Factor Co Ltd
Original Assignee
U Factor
U Factor Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic effect marker of the culture supernatant of dental pulp stem cells (SHED), a method for determining the culture supernatant of dental pulp stem cells (SHED), and a method for producing the same.
  • MSC Mesenchymal stem cells
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSCs bone marrow-derived Mesenchymal stem cells
  • WJ-MSCs umbilical Wharton's jelly mesenchymal stem cells
  • DPSCs wisdom tooth-derived permanent tooth pulp mesenchymal stem cells
  • human deciduous baby teeth examples include mesenchymal stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED).
  • Mesenchymal stem cells exhibit the ability to repair and regenerate target tissues and cells, as well as immunoregulatory abilities such as anti-inflammation, and as a result, are thought to exhibit therapeutic effects on various diseases.
  • dental pulp stem cells have been identified as stem cells that can differentiate into neural cells, odontogenic cells, and adipocytes.
  • AD-MSCs, BM-MSCs, WJ-MSCs, and dental pulp stem cells (DPSCs or SHEDs) due to the invasiveness to donors and ethical considerations associated with cell collection, as shown in Patent Document 1, culturing of dental pulp stem cells is All eyes are on Kiyoshi.
  • culture supernatant is defined as a culture solution that does not contain dental pulp stem cells.
  • SHED culture supernatant of dental pulp stem cells
  • Regeneration treatment in this embodiment is a treatment method that promotes regeneration using cells and physiologically active substances that act directly and indirectly on tissues to be regenerated.
  • it is a substance that can have some effect on cells existing in the body.
  • the composition for regenerative therapy is a composition that is effective in promoting cell proliferation.
  • composition for regenerative treatment is used as a therapeutic composition including a so-called "composition for treating damaged areas.”
  • “Damaged area” means a part of a tissue where a physical or physiological defect has occurred in the tissue and the tissue is no longer able to perform its original function. It is also used as a concept that includes the injured area, disordered area, or diseased area.
  • treatment means that some or all of the tissue functions lost due to the disease are maintained or restored compared to the tissue functions before the disease occurred. , broadly encompasses not only recovery of tissue function but also regeneration as a functional tissue. The maintenance or recovery of function may be evaluated based on assays commonly used to evaluate the appearance and degree of the target function, although this differs depending on the tissue in which the disease occurs.
  • Dental pulp stem cells from deciduous teeth and dental pulp stem cells from permanent teeth (DPSCs) have been identified as novel stem cell populations that have both self-propagation and multipotency.
  • dental pulp stem cells can be, for example, deciduous teeth that have been shed or extracted from humans.
  • a culture supernatant of dental pulp stem cells (SHED) obtained by culturing them is used as an active ingredient of a regenerative treatment composition.
  • SHED dental pulp stem cells
  • the culture supernatant of SHED can be used not only for damaged areas but also for regenerative treatments that promote cell proliferation.
  • AD-MSC asdipose-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • WJ-MSC umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells
  • SHED human deciduous tooth pulp-derived mesenchymal stem cells
  • MSCs contain various miRNAs (microRNAs), which are a type of low-molecular-weight nucleic acids, and miRNAs are thought to contribute to regenerative treatments using these MSCs.
  • BM-MSC, AT-MSC, WJ-MSC, and SHED each have miRNAs that are common and highly expressed.
  • miRNAs common to these MSCs include miR-199a-3p, miR-24-3p, miR-29a-3p, miR-23a-3p, miR-638, miR-125b-5p, miR-630, miR- 21-5p etc.
  • each MSC has a specific miRNA that is highly expressed only in MSC.
  • SHED has 29 miRNAs as specific miRNAs that BM-MSC, AT-MSC, and WJ-MSC do not have.
  • SHED includes miR-136-5p, miR-30d-5p, miR-574-3p, miR-630, miR-5703, miR-6758-5p, miR-199b-5p, miR-6846- 5p, miR-4793-5p, miR-4659a-3p, miR-455-3p, miR-3132, miR-212-3p, miR-3605-5p, miR-93-5p, miR-1249-3p, miR- 654-3p, miR-30e-5p, miR-718, miR-4313, miR-487b-3p, miR-331-3p, miR-583, miR-5787, miR-3907, miR-6820-5p, miR- The 29 specific miRNAs include 130
  • the miRNAs associated with BM-MSC, AT-MSC, WJ-MSC and SHED were identified in the paper title: Distinct Mirna Expression Patterns of Extracellular Vesicles Derived From 4 Types of Mesenchymal Stem Cells (January 2018, Journal of Stem Cell Research & Therapy 08( 03)).
  • the inventors selected the following 13 miRNAs that are particularly specific to SHED. Specifically, miR-136-5p, miR-30d-5p, miR-574-3p, miR-630, miR-199b-5p, miR-212-3p, miR-93-5p, miR-30e-5p Thirteen specific miRNAs were selected: , miR-718, miR-4313, miR-331-3p, miR-5787, and miR-130a-3p.
  • ⁇ Easy to detect SHED-specific miRNA> The inventor performed real-time PCR measurements on these miRNAs. As a result, as shown in Table 1, miRNAs that were easily detected quickly at high concentrations were identified. The two miRNAs that were easily detected rapidly at high concentrations were miR-199b-5p and miR-130a-3p. Furthermore, in order to be able to confirm quickly at a high concentration, a supernatant containing 10,000 copies/ ⁇ L or more of miRNA-130-3p and 100 copies/ ⁇ L or more of miRNA-199b-5p is preferable.
  • Table 2 also shows the sequences of miR-574-3p, miR-199b-5p, and miR-130a-3p (Mature miRNA sequences) used to identify miRNAs.
  • SHED miRNA contributing to cell proliferation In order to confirm which miRNA among the 3 specific miRNAs of SHED is effective in regenerative therapy, we cultured SHED with inhibitors of miR-199b-5p and miR-130a-3p. The exosomes contained in the obtained SHED culture supernatant were introduced (transfected).
  • exosomes are separated from the SHED culture supernatant.
  • exosomes are separated from the SHED culture supernatant using SBI's ExoQuick (registered trademark), ExoQuick-TC (registered trademark), or ultracentrifugation.
  • Exo-Fect (trademark) siRNA/miRNA Transfection Kit
  • inhibitors for each of two specific miRNAs sterile 1x PBS, isolated exosomes, and transfection reaction were performed.
  • the liquid is placed in a container such as a tube and incubated. This results in exosomes transfected with the inhibitor.
  • non-target miRNAs were not inhibited.
  • the inhibitors of miR-574-3p, miR-199b-5p and miR-130a-3p are Has-miR-574 miRNA inhibitor, Has-miR-199 miRNA inhibitor and Has-miR-130 miR, respectively. It is an RNA inhibitor.
  • the ⁇ in the column for each target miRNA expression indicates that the target miRNA was inhibited and the miRNA was not expressed. ⁇ indicates that miRNA was expressed without being inhibited.
  • Cell proliferation column indicates ⁇ Good proliferation, ⁇ Proliferation, ⁇ Proliferation but weak, ⁇ No proliferation. Column for influence on proliferation : ⁇ Great influence, ⁇ Affected, ⁇ No influence.
  • miR-574-3p is not expressed in the culture supernatant of SHED in which miR-574-3p is inhibited.
  • the culture supernatant of SHED has cell proliferation. In other words, since cells proliferate even in the absence of miR-574-3p, it is understood that miR-574-3p does not contribute to cell proliferation.
  • miR-199b-5p is not expressed and there is no cell proliferation. Therefore, miR-199b-5p is understood to contribute to cell proliferation.
  • miR-130a-3p is not expressed and there is no cell proliferation. Therefore, miR-130a-3p is understood to contribute to cell proliferation.
  • the culture supernatant of SHED is evaluated using real-time RNA, and if the culture supernatant of SHED contains at least one of miR-199b-5p or miR-130a-3p, the culture supernatant of SHED is evaluated. It can be determined that the culture supernatant has a paracrine effect on surrounding cells. Therefore, miR-199b-5p or miR-130a-3p can be used as a marker (indicator) for evaluating the culture supernatant of SHED.
  • An optimal dental pulp-derived stem cell culture supernatant can be produced using the following method.
  • Dental pulp-derived stem cells were selected as adherent cells from dental pulp cells collected from deciduous or extracted human baby teeth. After the collected baby teeth were disinfected with chlorhexidine or povidone-iodine solution (isodine (registered trademark) solution), the crowns of the teeth were divided and the pulp tissue was collected using a dental reamer.
  • Enzyme treatment The dental pulp tissue separated and collected in (i) was suspended in a basic medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% bovine serum and antibiotics, etc.) and treated with 2 mg/ml collagenase and dispase at 37°C. , the processing time was set to 1 hour. Then, the enzyme-treated dental pulp tissue and dental pulp cells were collected by centrifugation at 777 ⁇ g for 5 minutes.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • (iii) Cell culture After the above treatment, the collected tissues and cells were treated with 4 cc of 5% to 15% bovine serum containing 10,000 units/ml of penicillin, 10,000 ⁇ g/ml of streptomycin, and 25 ⁇ g/ml of amphotericin B. The cells were suspended in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and seeded in a 6-well dish for adherent cell culture.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the cells were cultured in an incubator adjusted to 37° C. in a 5% by volume CO2 atmosphere.
  • the cells When the cells reach subconfluence (a state in which the cells occupy about 70% of the surface area of the culture vessel) or confluence, the cells are treated with 0.05% trypsin/EDTA for 5 minutes at 37°C. Then, the dental pulp-derived stem cells detached from the dish were seeded in a 10 cm diameter adherent cell culture dish, and expanded culture was performed. In addition. Cell culture was subcultured three times to proliferate to the required number of cells (approximately 1 ⁇ 10 7 cells/ml).
  • (1-2) Production of dental pulp-derived stem cell culture supernatant The dental pulp-derived stem cells obtained in (1-1) were treated in a basic medium and a medium (such as the above-mentioned DMEM) to which 10% by volume of animal serum such as FBS was added as serum in a 5% by volume CO2 atmosphere. The cells were cultured for 48 hours at 37°C. The dental pulp-derived stem cells used for the dental pulp-derived stem cell culture supernatant were subcultured up to 8 times.
  • DMEM fetal bovine serum
  • the medium was replaced with serum-free DMEM and cultured for an additional 48 hours (this was used as the dental pulp-derived stem cell culture supernatant before treatment).
  • a treatment is performed to pass through a separation membrane that does not allow dental pulp-derived stem cells (dental pulp-derived stem cells themselves) to pass through, and the pulp-derived stem cells are removed, resulting in processed dental pulp that does not contain dental pulp-derived stem cells (dental pulp-derived stem cells themselves).
  • the derived stem cell culture supernatant was obtained.
  • miR-199b-5p contained in the culture supernatant of dental pulp stem cells should be 100 copies/ ⁇ L or more, and miR-130a-3p should be 10,000 copies/ ⁇ L. It is preferable that the supernatant liquid contains the above. That is, the amounts of miR-199b-5p and miR-130a-3p are measured as markers, and the treated dental pulp-derived stem cell culture supernatant is diluted or concentrated as necessary. These dilutions and concentrations were performed in the following manner.
  • dilution method For example, dilution was performed using the DMEM stock solution used to produce the composition for regenerative therapy so that miR-199b-5p was around 120 copies/ ⁇ L and miR-130a-3p was around 12,000 copies/ ⁇ L. Even if miR-199b-5p is, for example, 200 copies/ ⁇ L and miR-130a-3p is 20,000 copies/ ⁇ L or more, the dental pulp-derived stem cell culture supernatant will have a paracrine effect, but from the viewpoint of manufacturing costs etc. , it doesn't have to be a very high value.

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Abstract

【課題】　細胞再生などの治療効果が認められる歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清を確認するためのマーカー（指標）を提供する。 【解決手段】　歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清の治療効果と正に相関する歯髄幹細胞の培養上清の評価のためのマーカーとして、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐを使用する。

Description

歯髄幹細胞の培養上清の治療効果マーカー及び歯髄幹細胞の培養上清の判定方法および製造方法
　本発明は、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清の治療効果マーカー、及び歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清の判定方法及びその製造方法に関する。
　間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell、以下ＭＳＣと言う。）は、多分化能及び自己複製能を有する幹細胞であり、例えば脂肪由来間葉系幹細胞(adipose-derived  MSC:ＡＤ－ＭＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞（bone marrow-derived MSC：ＢＭ－ＭＳＣ）、臍帯Wharton's jelly間葉系幹細胞（ＷＪ－ＭＳＣ）、智歯由来の永久歯歯髄間葉系幹細胞（dental pulp stem cells;ＤＰＳＣ）及びヒト脱落乳歯歯髄由来間葉系幹細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth；ＳＨＥＤ）などがある。なお本明細書では、智歯由来の永久歯歯髄間葉系幹細胞（ＤＰＳＣ）及びヒト脱落乳歯歯髄由来間葉系幹細胞（ＳＨＥＤ）を、まとめて歯髄幹細胞と総称する。
　間葉系幹細胞は、標的組織や細胞の修復・再生能、及び抗炎症等の免疫制御能を発揮し、その結果、様々な疾患への治療効果を示すと考えられている。特に、歯髄幹細胞は、神経細胞、歯原性細胞、および脂肪細胞に分化することができる幹細胞として識別されている。ＡＤ－ＭＳＣ、ＢＭ－ＭＳＣ、ＷＪ－ＭＳＣ及び歯髄幹細胞（ＤＰＳＣもしくはＳＨＥＤ）のうち、細胞採取に伴うドナーへの侵襲及び倫理的配慮から、特許文献１に示されるように、歯髄幹細胞の培養上清に注目が集まっている。本明細書において、「培養上清」は歯髄幹細胞を含まない培養液と定義される。
特開２０１６－２１０７３０号公報
　しかしながら、歯髄幹細胞の培養上清は、製造方法の違い又は採取した個人により分泌されるサイトカイン量が一定でないことから、歯髄幹細胞の培養上清液を使用した治療であっても、治療効果が確認されない場合がある。このため、細胞再生などの治療効果が認められる歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清を確認するためのマーカー（指標）、及び歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清の治療効果を高めることを意図した処理への適応性があるか否かを判定する判定方法を提供することを目的とする。
　発明者は、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ又はｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの少なくとも一方が、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清がパラクライン効果をもたらす評価のために使用されるマーカーであることを発見した。
　また歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清がパラクライン効果をもたらす評価のためのマーカーとして、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ又はｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの少なくとも一方を使用することができる。
　また、発明者は、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清に含まれる上記マーカーは、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐは１００copies／μＬ以上、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐは１０，０００copies／μＬ以上含まれている上清液となるように調製する歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清に関する製造方法を提供する。
　本実施形態の開示によれば、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清の治療効果が高いか否かを容易に判定できる効果を有する。
　本実施形態における「再生治療」とは、再生対象となる組織へ直接的及び間接的に作用する細胞並びに生理活性物質により再生を促進する治療方法である。再生治療を実施するにあたっては、体内に現存する細胞に対して何らかの影響を及ぼすことができる物質である。また、再生治療を実現するにあたっては、かかる物質によって細胞が増殖することが好ましいため、再生治療用組成物は、細胞の増殖を促進するような効果のある組成物である。
　再生治療用組成物は、いわゆる「損傷部治療用組成物」を包含する治療組成物として使用される。「損傷部」とは、組織に物理的または生理的に欠陥が生じて、本来の機能を発揮できなくなった組織上の部位を意味し、外傷のみならず、組織の物理的または生理的欠陥に起因した傷害部、障害部または疾患部も包含する概念として用いられる。
　本実施形態において、「治療」とは、疾患によって失われた組織の機能の一部又は全部が、当該疾患の生じる前における当該組織の機能と比較して維持又は回復していることを意味し、組織の機能が回復することのみならず、機能的な組織として再生することも広く包含する。機能が維持又は回復していることの評価については、疾患が生じている組織において異なるが、外観、対象となる機能の程度を評価するために通常用いられるアッセイ等に基づいて行えばよい。
　自己増殖能と多分化能を併せ持つ新規な幹細胞集団として、乳歯の歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）や、永久歯の歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）が同定されている。本実施形態では、歯髄幹細胞は、例えば、ヒトから脱落あるいは抜去された乳歯を用いることができる。
　本実施形態によれば、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）を培養して得られた歯髄幹細胞の培養上清を再生治療用組成物の有効成分として用いる。かかるＳＨＥＤの培養上清は、例えば、損傷部に適用されると、損傷部における細胞を再生、増殖させ、その結果、損傷部を有する組織を修復することができる。また、ＳＨＥＤの培養上清は、損傷部だけでなく、細胞の増殖を促進するような、再生治療に用いることができる。
＜ＭＳＣに関連するｍｉＲＮＡ＞
　ＡＤ－ＭＳＣ（脂肪由来間葉系幹細胞）、ＢＭ－ＭＳＣ（骨髄由来間葉系幹細胞）、ＷＪ－ＭＳＣ（臍帯Wharton's jelly間葉系幹細胞）、及びＳＨＥＤ（ヒト脱落乳歯歯髄由来間葉系幹細胞）は、標的組織や細胞の修復・再生能、及び抗炎症等の免疫制御能などの再生治療に使用されている。これらＭＳＣは、低分子核酸の一種であるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を各種含んでおり、これらＭＳＣを使用する再生治療においては、ｍｉＲＮＡが寄与していると考えられている。
　ＢＭ－ＭＳＣ、ＡＴ－ＭＳＣ、ＷＪ－ＭＳＣおよびＳＨＥＤでは、それぞれで共通し且つ高度に発現するｍｉＲＮＡが存在する。例えば、これらＭＳＣに共通するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６３８、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－６３０、ｍｉＲ－２１－５ｐなどがある。
　一方で、それぞれのＭＳＣにのみ高度に発現する特異的なｍｉＲＮＡを有している。例えば、ＳＨＥＤは、特異的ｍｉＲＮＡとして、ＢＭ－ＭＳＣ、ＡＴ－ＭＳＣ、ＷＪ－ＭＳＣが有してない、２９のｍｉＲＮＡを有している。具体的には、ＳＨＥＤは、ｍｉＲ－１３６－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－６３０、ｍｉＲ－５７０３、ｍｉＲ－６７５８－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－６８４６－５ｐ、ｍｉＲ－４７９３－５ｐ、ｍｉＲ－４６５９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１３２、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－３６０５－５ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９－３ｐ、ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－４３１３、ｍｉＲ－４８７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３３１－３ｐ、ｍｉＲ－５８３、ｍｉＲ－５７８７、ｍｉＲ－３９０７、ｍｉＲ－６８２０－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３４－５ｐ、及びｍｉＲ－３７６ａ－３ｐの２９の特異的ｍｉＲＮＡが挙げられる。
　ＢＭ－ＭＳＣ、ＡＴ－ＭＳＣ、ＷＪ－ＭＳＣおよびＳＨＥＤに関連するｍｉＲＮＡは、論文タイトル：Distinct Mirna Expression Patterns of Extracellular Vesicles Derived From 4 Types of Mesenchymal Stem Cells（January 2018、Journal of Stem Cell Research & Therapy 08(03)）に開示されている。
　ＳＨＥＤの２９の特異的ｍｉＲＮＡの中から、発明者は、特にＳＨＥＤに特異的なｍｉＲＮＡを以下の１３のｍｉＲＮＡを選択した。具体的には、ｍｉＲ－１３６－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－６３０、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－４３１３、ｍｉＲ－３３１－３ｐ、ｍｉＲ－５７８７、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの１３の特異的ｍｉＲＮＡが選択された。
＜検出し易いＳＨＥＤに特異的なｍｉＲＮＡ＞
　発明者はこれらｍｉＲＮＡに対してリアルタイムＰＣＲ測定を行った。この結果、表１に示されるように、高濃度で迅速に検出し易いｍｉＲＮＡが特定された。高濃度で迅速に検出し易いｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの２つのｍｉＲＮＡであった。また、高濃度で迅速に確認できるためには、ｍｉＲＮＡ－１３０－３ｐが１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上、及びｍｉＲＮＡ－１９９ｂ－５ｐが１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上含まれている上清液が好ましい。治療効果が認められる歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清であるか否かを確認するには、高濃度で迅速に確認できた方が好ましいからである。表１は、高濃度で迅速に確認できるかを実験した結果である。
　また表２は、ｍｉＲＮＡを同定するために用いた、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの配列（Ｍａｔｕｒｅ　ｍｉＲＮＡシーケンス）を示す。
＜細胞増殖に寄与するＳＨＥＤのｍｉＲＮＡ＞
　ＳＨＥＤの３の特異的ｍｉＲＮＡのうち、いずれのｍｉＲＮＡが、再生治療に効果が認められるかを確認するために、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの阻害剤を、ＳＨＥＤを培養して得られたＳＨＥＤの培養上清に含まれるエクソソームに導入（トランスフェクション）した。
　［エクソソームに阻害剤をトランスフェクション］
　まずＳＨＥＤの培養上清から高純度かつ高収量のエクソソームが分離される。例えばＳＢＩ社のＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）、ＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ（登録商標）又は超遠心法で、ＳＨＥＤの培養上清からエクソソームが分離される。
　ＳＢＩ社のＥｘｏ－Ｆｅｃｔ（商標）ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて、Ｅｘｏ－Ｆｅｃｔ溶液、２つの特異的ｍｉＲＮＡのそれぞれの阻害剤、減菌済みの１×ＰＢＳ、分離されたエクソソーム、トランスフェクション反応液が、チューブ等の容器に入れられ、インキュベートされる。これにより阻害剤でトランスフェクションされたエクソソームが得られる。なお、トランスフェクションされたエクソソームにおいて目的のｍｉＲＮＡが阻害されているかをリアルタイムＰＣＲにて確認した。また、目的外のｍｉＲＮＡが阻害されていないこともリアルタイムＰＣＲにて確認した。
　ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの阻害剤は、それぞれＨａｓ－ｍｉＲ－５７４　ｍｉＲＮＡ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｈａｓ－ｍｉＲ－１９９　ｍｉＲＮＡ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＨａｓ－ｍｉＲ－１３０　ｍｉＲＮＡ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒである。
　１ウェル当たり約５×１０３のＳＨＥＤが９６ウェルプレートに入れられ、１ウェルに１００μｌのトランスフェクションされたエクソソームが加えられる。そして、ＳＨＥＤが２４～９６時間、例えば３７度Ｃでインキュベートされる。インキュベートされた細胞増殖度合いは、タカラバイオ社のＰｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ－１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを使って、確認された。具体的には、２４～９６時間インキュベートされたＳＨＥＤにＰｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１が１ウェルあたり１０μｌずつ加えられ、０．５～４時間インキュベートされる。その後、マイクロプレートリーダーを用いて、Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１が加えられたＳＨＥＤの吸光度が測定される。吸光度に応じてＳＨＥＤの細胞増殖度合いが判断される。細胞増殖度合いは表３に示される。
細胞増殖結果
［注釈］
　各対象ｍｉＲＮＡ発現（阻害確認）の欄
　×は、対象ｍｉＲＮＡが阻害され、そのｍｉＲＮＡの発現がされなかったことを示す。
〇は、阻害されず、ｍｉＲＮＡの発現がされていたことを示す。
　細胞増殖の欄
　◎よく増殖した、〇増殖した、△増殖したが弱い、×増殖なし、を示す。
　増殖に与える影響の欄
　◎影響が大きい、〇影響あり、×影響なし、を示す。
　表３に示されるように、ｍｉＲ－５７４－３ｐが阻害されているＳＨＥＤの培養上清には、ｍｉＲ－５７４－３ｐは発現されていない。しかしながら、ＳＨＥＤの培養上清は細胞増殖している。つまり、ｍｉＲ－５７４－３ｐが無くても細胞増殖しているため、ｍｉＲ－５７４－３ｐは細胞増殖に寄与しないことが理解される。ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐが阻害されているＳＨＥＤの培養上清には、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐは発現されておらず、細胞増殖もしていない。このため、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐは細胞増殖に寄与すると理解される。ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが阻害されているＳＨＥＤの培養上清には、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐは発現されておらず、細胞増殖もしていない。このため、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐは細胞増殖に寄与すると理解される。
　ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが阻害されているＳＨＥＤの培養上清も、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐは発現されておらず、細胞増殖もしていない。このため、前述したとおり、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐもｍｉＲ－１３０ａ－３ｐも歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清が周囲の細胞等にパラクライン効果をもたらすと理解される。
　確認のため、ｍｉＲＮＡが阻害されていないＳＨＥＤの培養上清は、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが発現し、細胞増殖している。陽性対照としてＦＢＳ培地でのＳＨＥＤの培養上清は、細胞増殖していることが確認され、陰性対照として培地のみでのＳＨＥＤの培養上清は、細胞増殖していないことが確認された。
　ＳＨＥＤの培養上清の評価のため、培養上清がリアルタイムＲＮＡで評価されて、ＳＨＥＤの培養上清にｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ又はｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの少なくとも一方が含まれていれば、ＳＨＥＤの培養上清が周囲の細胞等にパラクライン効果をもたらすと判定することができる。このため、ＳＨＥＤの培養上清の評価のため、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ又はｍｉＲ－１３０ａ－３ｐはマーカー（指標）として使用することができる。
＜パラクライン効果をもたらす歯髄由来幹細胞培養上清の製造方法＞
　以下の方法を用いて最適な歯髄由来幹細胞培養上清の製造を行うことができる。
（１－１）歯髄由来幹細胞の製造：
　下記（ｉ）～（ｉｖ）の方法を用いて、歯髄由来幹細胞を製造した。
（ｉ）歯髄の採取：
　脱落または抜去したヒトの乳歯から採取した歯髄細胞から、歯髄由来幹細胞を付着性細胞として選別した。採取した乳歯の歯牙をクロロヘキシジンやポビドンヨード液（イソジン（登録商標）液）で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収するようにした。
（ｉｉ）酵素処理：
　（ｉ）で分離・回収して採取した歯髄組織を基本培地（１０％ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）等。）に懸濁し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ及びディスパーゼで３７℃、１時間処理するようにした。そして、５分間の７７７×ｇの遠心操作により、酵素処理後の歯髄組織、歯髄細胞を回収した。
（ｉｉｉ）細胞培養：
　前記した処理を行い、回収した組織及び細胞を４ｃｃの５体積％～１５体積％のウシ血清を含有した１００００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、付着性細胞培養用ディッシュ、６ウェルへ播種した。
　５体積％のＣＯ２雰囲気下、３７℃に調整したインキュベーターで培養した。サブコンフルエント（培養容器の表面の約７０面積％を細胞が占める状態）またはコンフルエントに達したときに細胞を０．０５体積％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理する。そして、ディッシュから剥離した歯髄由来幹細胞を直径１０ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行った。なお。細胞培養は、継代培養を３回行い、必要な細胞数（約１×107 個／ｍｌ）まで増殖させた。
（ｉｖ）細胞の回収：
トリプシン処理等で培養容器から（ｉｉｉ）で培養した細胞を剥離した後、７７７×ｇで遠心処理を施すことによって、細胞（付着性細胞）を採取して、歯髄由来幹細胞を回収した。
（１－２）歯髄由来幹細胞培養上清の製造：
（１－１）で得られた歯髄由来幹細胞を、基本培地、血清として１０体積％のＦＢＳ等の動物血清を加えた培地（前記したＤＭＥＭ等。）を用いて、５体積％ＣＯ２雰囲気下、３７℃の条件下に、４８時間培養するようにした。なお、歯髄由来幹細胞培養上清に用いる歯髄由来幹細胞の継代培養は、８回までとした。
　前記の培養の後、血清を含まないＤＭＥＭへ置換して、さらに４８時間培養を行うようにした（処理前の歯髄由来幹細胞培養上清とした。）。
　４８時間経過後、歯髄由来幹細胞（歯髄由来幹細胞自体）を通過させない分離膜を通過させる処理を行い、歯髄由来幹細胞を取り除いて、歯髄由来幹細胞（歯髄由来幹細胞自体）を含まない、処理済みの歯髄由来幹細胞培養上清を得た。
　パラクライン効果をもたらす歯髄由来幹細胞培養上清とするため、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清に含まれるｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐは１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上、及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐは１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上含まれている上清液とすることが好ましい。つまりマーカーとしてｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの量を計測して、処理済みの歯髄由来幹細胞培養上清を必要に応じて希釈や濃縮させる。これらの希釈及び濃縮は下記の方法で行った。
（希釈方法）
　例えば、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐが１２０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ前後、及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐは１２，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ前後になるように、再生治療用組成物製造に用いたＤＭＥＭ原液を用いて希釈を行った。ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐが例えば２００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ、及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが２０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上であっても、歯髄由来幹細胞培養上清はパラクライン効果をもたらすが、製造コスト等との観点から、非常に高い値にする必要はない。
（濃縮方法）
　下記のスピンカラム法にて、目的とする濃度まで濃縮を行った。
（ｉ）　歯髄由来幹細胞培養上清（最大１５ｍｌ）をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ－１０Ｋへ投入し、４０００×ｇで約６０分間遠心し、２００μｌまで濃縮するようにした。
（ｉｉ）　前記したＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ－１０Ｋへ培養上清と同量の滅菌したＰＢＳを投入し、再度４０００×ｇで約６０分間遠心し、ベース溶液をＰＢＳへ置換した。
（ｉｉｉ）　得られた溶液２００μｌをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮した歯髄由来幹細胞培養上清とした。
（ｉｖ）　ｉＲ－１９９ｂ－５ｐが１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、もしくはｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満であった場合には、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐが１００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上、及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ以上に達するまで前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の操作を繰り返した。

Claims (3)

  1. 　ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが、歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清が周囲の細胞等にパラクライン効果をもたらす培養上清の評価のために使用されるマーカー。
  2. 　歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清が周囲の細胞等にパラクライン効果をもたらす歯髄幹細胞の培養上清の評価のためのマーカーとしての、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ及びｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのｍｉＲＮＡの使用。
  3. 　ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐが１００copies／μＬ以上、且つｍｉＲ－１３０ａ－３ｐが１０，０００copies／μＬ以上含まれている上清液となるように調製する歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）の培養上清に関する製造方法。
     
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