TW202134437A

TW202134437A - 用於預防及治療組織疾病之基於ｍｉＲＮＡ之醫藥組成物及其用途

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Publication number: TW202134437A
Application number: TW109141732A
Authority: TW
Inventors: 丹尼斯迪弗朗
Original assignee: 比利時商諾瓦迪生物科學公司
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-09-16
Also published as: US20220409652A1; EP4041250A1; CN114929243A; WO2021105407A1

Abstract

本發明係有關一種醫藥組成物，其包含有效治療量之(i)選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少三種miRNA與(ii)醫藥上可接受之載劑。根據本發明之醫藥組成物可用於預防及/或治療組織疾病之用途，所述組織疾病包括，惟不限於，皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病。

Description

用於預防及治療組織疾病之基於miRNA之醫藥組成物及其用途

本發明乃有關組織疾病(包括皮膚疾病、骨骼疾病與軟骨疾病)之預防及治療。更具體而言，本發明乃有關包含具有組織再生及/或修復特性(包括骨原性及/或軟骨性)的RNA(特別是miRNA)混配物(cocktail)之醫藥組成物。

組織重建涵括骨骼與軟骨重建，也涵括皮膚(包括真皮和表皮)與肌肉重建。

骨骼缺損係身體區域缺少應正常存在骨骼之骨骼組織。骨骼缺損可經由各種外科手術方法治療。骨骼缺損重建之外科手術方法尤其包括剝除、切除與固定、疏鬆骨移植與伊里扎洛夫(Ilizarov)插入骨骼搬移方法。然而，時常有些削弱骨傷復原之因素，如糖尿病、免疫抑制療法、運動狀態不佳以及計畫手術時必須考慮的其他因素。此外，病患通常具有次最佳功能與美學結果之延長的活動功能障礙。

組織工程涉及經由使用活細胞之組織結構及/或功能的回復。一般過程包括細胞單離與增殖，隨後為使用框架材料之再植入程序。間葉幹細胞(MSC)提供來自成熟組織細胞之良好替代物，並具有作為用於組織再生(包括皮膚、骨骼及/或軟骨組織再生)細胞來源之許多優點。

根據定義，幹細胞之特徵在於其具有進行自我更新之能力與進行多元性分化且最後形成分化細胞之能力。理想情況下，用於再生醫學應用之幹細胞應符合下述一套準則：(i)應大量存在(數百萬至數十億個細胞)；(ii)可經由最小侵入式步驟收集及得到；(iii)可以可再生方式沿多重細胞譜系途徑分化；(iv)可安全且有效地移植至自體或同種異體宿主中。

研究已顯示，幹細胞具有分化成中胚葉、內胚葉與外胚層起源的細胞之能力。MSC之可塑性最常見係指保留在幹細胞內之固有能力，以跨越譜系障礙並接受特有於其他組織之細胞表現型、生化與功能特性。舉例而言，成體間葉幹細胞可單離自骨髓與脂肪組織。

脂肪組織衍生之幹細胞為多潛能且具深刻之再生能力。將骨原分化之ASC接種於各種框架如β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(HA)、第一型膠原蛋白、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)與褐藻酸時，顯示於多種臨床前模式中具有強大之癒合潛力。國際專利申請案WO2013/059089係有關包含幹細胞與磷酸鈣鹽類水泥混合物(如磷酸三鈣與羥基磷灰石)之骨糊。US2011/104230揭示一種含框架材料之骨補釘，該框架材料包含合成陶瓷材料、間葉幹細胞與訊息傳遞分子。

然而，儘管在小動物模式中已有令人鼓舞之結果，惟使用裝載在框架上之ASC之臨界尺寸之骨骼重建，仍然受到大尺寸骨骼缺損之限制，以及因此受工程植入物尺寸之限制。接種細胞之細胞移植物亦受到氧氣與營養物擴散不良之限制。此外，框架內之細胞位置係其活體外與活體內存活之主要限制。設計具有框架之流動灌注之生物反應器，以增進植入物內之細胞移動得到更均勻之細胞分佈，經由遞送氧氣與營養物至植入物核心之細胞存活，以及骨原細胞之分化(經由流體切變力)。儘管此等技術大有可為，惟在大動物模式之相關臨床前與臨床數據仍然不多。

最近，公開案WO2019/057862所揭示之生物材料具有包含骨原分化之脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)、陶瓷材料與細胞外基質之多維結構，其中該生物材料分泌破骨抑制因子(OPG)及包含類胰島素生長因子(IGF1)與基質細胞衍生因子1-α(SDF-1α)。

此外，公開案WO2020/058511敘述具有包含分化之脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)、細胞外基質與明膠之多維結構生物材料。其顯示該生物材料可用於治療組織缺損，例如骨骼、軟骨或皮膚缺損。

鑑於此類生物材料可適用於自體移植，然而另一方面，因為彼等可能引出免疫反應從而導致移植之排斥或彼等可能攜帶外來病原體導致該生物材料接受者之感染，以致不能進行同種異體或異種移植。

通常進行滅菌過程以減輕此等問題。然而，此等苛刻條件常使滅菌材料之生物特性劣化。

因此，於此項技藝中對用於組織重建及/或再生的組織工程材料仍有需求，該等材料係完全生物相容性且提供適當之機械特徵，儘管可用於廣範圍之組織上，仍可用於所指定之應用。

亦需要提供適用於同種組織移植或異種移植之用於組織重建及/或再生之生物材料。最後，尚需要提供相較於新鮮生物材料，即滅菌前之生物材料，能保持生物特性之無菌生物材料。

有需要提供用於治療組織疾病(包括骨骼或軟骨或皮膚疾病)之必要成分，其可安全給予且不會在接受者個體中引起顯著之免疫反應。

本發明之第一態樣係有關一種醫藥組成物，其包含(i)有效治療量之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少三種miRNA，及(ii)醫藥上可接受之載劑。

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-4485-3p及其組合之組群。於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-3687、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-664b-3p及其組合之組群。於若干具體實例中，該至少三種miRNA包含hsa-miR210-3p及/或hsa-miR-409-3p。於特定具體實例中，該組成物經乾燥及/或滅菌。

本發明之另一態樣係有關作為藥劑用之本揭示內容之醫藥組成物。於若干具體實例中，該醫藥組成物係用於預防及/或治療組織疾病。於特定具體實例中，該組織係選自包含骨骼組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、結締組織、神經組織與脂肪組織之組群。於若干具體實例中，該醫藥組成物係用於預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病。於特定具體實例中，該醫藥組成物係用於預防及/或治療皮膚疾病。於若干具體實例中，該組織疾病係選自包含先天性皮膚成形不全；燒傷；癌症，包括乳癌、皮膚癌與骨癌；腔室症候群(CS)；表皮分解性水皰症；巨大型先天性痣；下肢缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；輻射後病灶；與潰瘍，包括糖尿病性潰瘍、較佳為糖尿病性足部潰瘍；關節炎；骨折；骨脆弱；卡費氏(Caffey’s)症；先天性假關節；顱部變形；顱部畸形；癒合延遲；浸潤性骨骼疾病；骨肥大症；骨礦物質密度流失；代謝性骨質流失；成骨不全；骨質軟化症；骨壞死；骨質缺乏症；骨質疏鬆症；佩吉特氏(Paget’s)症；假關節；骨硬化病灶；脊柱裂；脊椎滑脫症；椎弓斷裂；軟骨發育不全；肋軟骨炎；內生軟骨瘤；拇趾僵硬；髖關節髖臼韌帶撕裂；剝離性骨軟骨炎；骨軟骨發育不良；多發性軟骨炎等之組群。於特定具體實例中，該醫藥組成物係用於組織重建。

於又另一態樣中，本發明係有關產生包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA的組成物之方法，該方法包括下述步驟：

1)培養包含(i)能進行組織分化之活細胞與(ii)顆粒性材料之組合以獲得含有由該細胞分泌的細胞外基質之多維結構，其中該細胞具有組織再生及/或組織修復性質，其中該細胞與顆粒性材料包埋於細胞外基質中，且其中該多維結構包含RNA內容物，該RNA內容物包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA：

2)抽取步驟1)中產生之RNA內容物，特別是miRNA內容物。

於若干具體實例中，miRNA內容物包括細胞miRNA及/或胞外體衍生之miRNA。

於特定具體實例中，該顆粒性材料係選自包含：

-有機材料，包括去礦質之骨骼基質、明膠、瓊脂/瓊脂糖、褐藻酸幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原蛋白、彈性蛋白或類彈性蛋白胜肽(ELP)、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維結合素、蛋白多醣、硫酸肝素蛋白多醣、玻尿酸、多醣、層連結蛋白、纖維素衍生物、或其組合；

-陶瓷材料，包括磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO₃)、硫酸鈣(CaSO₄)、或氫氧化鈣(Ca(OH)₂)等之顆粒、或其組合；

-聚合物，包括聚酸酐、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚環氧乙烷/聚乙二醇(PEO/PEG)、聚乙烯醇(PVA)、反丁烯二酸酯類聚合物舉例而言，例如，聚反丁烯二酸丙烯酯(PPF)或聚反丁烯二酸丙烯酯乙二醇共聚物(P(PF-co-EG))、寡(聚反丁烯二酸乙二醇酯)(OPF)、聚異丙基丙烯醯胺(PNIPPAAm)、聚(醛古洛糖醛酸酯)(PAG)、聚乙烯吡咯烷酮(PNVP)、或其組合；

-凝膠，包括自組裝寡肽凝膠、水凝膠材料、微凝膠、奈米凝膠、顆粒性凝膠、水凝膠材料、搖變減黏凝膠、乾凝膠、敏感凝膠、或其組合；

-奶精；

及其任何組合之組群。

於若干具體實例中，顆粒性材料為明膠或陶瓷材料。

本發明之另一態樣係有關一種組成物，其包含可用根據本發明方法製得之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA。

界定

除非另行界定，否則本文所用之所有技術與科學術語具有與一般熟習本發明所屬技藝者通常了解之相同意義。於抵觸之情形下，目前提供之本發明界定被視為真實。

於本發明中，以下術語具有下述意義：

-數值前之術語“約”意指該數值正負10%之值。應理解的是，術語“約”提及之值本身亦被明確且較佳地被揭示。

-術語“包含”意欲意指“含有”、“涵蓋”與“包括”。於若干具體實例中，術語“包含”亦涵蓋術語“由...組成”。

-術語“組織疾病”意欲意指組織生理功能之任何干擾、失衡。於組織疾病中觀察到的症狀之非限制性實例包括損傷、拉傷、感染、扭傷、外傷、裂縫、腫脹、發紅、水腫、疼痛、壓痛、酸痛、傷口、壞死、或其任何組合。本文所用之例如“組織疾病”、“組織疾患”、“組織醫療狀況”等術語旨在互相等同。

-術語“再生”或“組織再生”包括，惟不限於，以根據本發明的醫藥組成物治療之後，新細胞類型或組織之生長、產生、或重建。於一具體實例中，這些細胞類型或組織包括惟不限於骨原細胞(例如，骨胚細胞、骨細胞)、軟骨細胞、上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、角質細胞、心肌細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經細胞、與肌管。本文所用之術語“再生”被設想為於損傷、受傷、手術、先天性、退行性、外傷性或非外傷性症狀或狀況，或導致裂縫、裂口、凹陷、傷口等其他程序後，使用上述細胞類型進行之預防及/或治療。

-術語“修復”或“組織修復”包括惟不限於從罹病或功能失調組織重建健康組織之癒合過程。於一具體實例中，組織修復包括皮膚修復，舉例而言，例如，癒合、疤痕形成與細化(attenuation)。於一具體實例中，組織修復包括骨骼修復，舉例而言，例如，骨折復位(fracture reduction)。於一具體實例中，組織修復包括軟骨修復。於一具體實例中，組織修復包括填充、膨脹、支撐、擴大、延伸、或增加身體組織的尺寸或質量。

-術語“miRNA”或“miR”係指長度為約18至約25個核苷酸之非編碼RNA。這些miRNA可能來自多種來源，包括：編碼miRNA之各別基因、蛋白質編碼基因之內含子、或常編碼多個緊密相關的miRNA之多順反子轉錄本。於下述揭示內容中，係使用標準命名制度，其中未大寫的"mir-X"係指pre-miRNA(前驅體)，大寫的"miR-X"係指成熟型。當兩個成熟的miRNA源自相同pre-miRNA之相對臂時，將其以-3p或-5p後綴表示。於下述揭示內容中，除非另行指明，否則表達使用措辭miR-X係指包括-3p以及-5p兩種形式(若有的話)之成熟miR-X。於本發明之範圍內，microRNA、miRNA與miR等措辭表示相同的化合物。

-術語“胞外體”意欲意指於中間胞吞腔室，多囊泡體(MVB)與細胞膜融合後從細胞釋放之細胞外囊泡。換言之，胞外體相當於釋放到細胞外環境中的腔內囊泡。

-術語“分泌物”係指從其合成細胞中轉運出來的生理活性物質。於一具體實例中，該生理活性物質可為任何分子，特別是蛋白質(如生長因子或轉錄因子)或核酸(如miRNA)。本文所用之術語“分泌”包括主動與被動分泌。於本申請案中，術語“主動分泌”係指由活細胞，特別是間葉幹細胞及較佳為脂肪幹細胞，生理活性物質的分泌，於細胞外作為對刺激之反應，從而擴散至細胞之環境中，舉例而言，例如，細胞外基質。“活細胞”於本文中意指呈現至少下述特徵之一之細胞：生長與發育、生殖、體內恆穩狀態、對刺激之反應、消耗、代謝、排泄。於本申請案中，術語“被動分泌”係指由無生命細胞或其碎片或萃取物，於無刺激情況下，生理活性物質釋放自細胞或其碎片或萃取物，從而擴散至起源細胞或其碎片或萃取物之環境中，舉例而言，例如，細胞外基質。“無生命細胞”於本文中意指不呈現下述特徵之細胞：生長與發育、生殖、體內恆穩狀態、對刺激之反應、消耗、代謝、排泄(無生命細胞或其碎片或萃取物為，舉例而言，死細胞或細胞萃取物)。然後，主動或被動分泌之生理活性物質可能擴散至組織或器官，於其中給予包含此類細胞外基質之生物材料。

-術語“治療(treatment；treating)”或“緩解”係指其目的為預防或減緩(減輕)組織疾病包括皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病之治療處理。需要治療者包括已罹患該疾病者以及易於罹患該疾病者或需要預防包括皮膚、骨骼或軟骨缺損等組織疾病者。若接受治療量之根據本發明方法之組成物後，該個體顯示以下一或多個可觀察及/或可測量之減少或不存在：舉例而言，例如，皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病之組織疾病之減少及/或若干程度之緩解；與組織疾病，包括皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病相關症狀之一者或多者之減少；降低之罹病率與死亡率以及增進生活問題之品質，則受試者之組織疾病，包括皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病為成功地被治療。用於評估疾病之成功治療與改善之上述參數可經由醫師熟悉之例行程序容易地測量。

-術語“預防”係指預防或避免例如皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病等組織疾病症狀之發生。於本發明中，術語“預防”可指次級預防，即，預防症狀之再發生或例如皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病等組織疾病之復發。當疾患為癌症(如骨癌)時，其亦可指於腫瘤之治療及/或移除後發生之轉移。

-術語“有效量”係指足以促進有益或期望結果(包括臨床結果)之量。有效量可一或多次給藥給予。

-術語“醫藥上可接受之載劑”係指給予動物個體(較佳為人類個體)時，不產生任何不良、過敏性或其他有害反應之載劑。其包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌與抗真菌劑、等滲與吸收遲滯劑等。針對人類給藥，製劑應符合管理機關之規定，舉例而言，例如，美國食品藥物管理局(FDA)或歐洲聯盟歐洲藥品管理局(EMA)所要求之無菌性、熱原性、一般安全性、品質與純度標準。

-術語“個體”係指脊椎動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。個體之實例包括人類、非人類靈長類動物、狗、貓、小鼠、大鼠、馬、牛、羊與其基因轉殖物種。於一具體實例中，個體可為"病患"，即溫血動物，更佳為人類，其正等待接受醫療照護或正在接受醫療照護或曾經/現在/將要成為醫療程序之對象或被監測疾患之進展。於一具體實例中，該個體為成人(例如18歲以上之人類受試者)。於另一具體實例中，該個體係兒童(例如18歲以下之人類受試者)。於一具體實例中，該個體為男性。於另一具體實例中，該個體為女性。

其餘界定出現於整個本揭示內容上下文中。

詳細說明

公開案WO2019/057862中顯示，所揭示之生物材料可用於治療骨骼或軟骨疾病。公開案WO2020/058511亦敘述可用於治療組織疾病之生物材料。從該生物材料之進一步鑑定已顯露細胞內容物或所分泌之內容物對促進組織修復(包括骨骼修復與軟骨修復)至為重要。值得注意的是，已顯示生長因子、轉錄因子、與涉及組織形成(包括骨骼形成或軟骨形成)的因子以及各種microRNA(miRNA)，可代表用於組織修復及/或組織再生之活性劑。

microRNA(miRNA)為短的(大約18至25個核苷酸長)非編碼RNA，主要經由結合標靶mRNA之3’非轉譯區(3’UTR)，靜默轉錄後之基因表現。已知成熟的miRNA為數種細胞類型之正常分化與功能所必需。

此項技藝之狀態已揭示miRNA可用於治療。舉例而言，WO2014072468揭示，與包含miRNA的富含血小板血漿混合之活化血清製劑已被考慮用於軟骨再生之治療用途。WO2015052526揭示幹細胞微粒及自其單離之miRNA，以及彼等於治療包括纖維化、癌症、類風濕性關節炎、動脈粥狀硬化症等疾患之用途。WO2017163132揭示由臍帶血單核細胞分泌的包含miRNA之胞外體，其可用於治療傷口，特別是慢性傷口。

不希望受理論束縛下，發明人等鑑定miRNA之混配物，其可促進包括成骨生成及/或軟骨生成之組織再生，且於預防及/或治療包括皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病等組織疾病具治療價值。實際上，申請人等發現此miRNA混配物可從生物材料中萃取與純化，該等生物材料係經由使(i)具有組織再生及/或修復特性(例如能進行成骨及/或軟骨誘導)之適當分化細胞與(ii)微粒材料(較佳為明膠或陶瓷材料)於容許細胞增殖與分泌細胞外基質之培養基中接觸產生。該生物材料之特點在於其原始miRNA之內容物，其源自細胞本身及/或從該等細胞所分泌之胞外體或類胞外體囊泡。

下文具體實例之敘述包括該具體實例作為任何單一具體實例或與任何其他具體實例或其部分之組合，且所敘述具體實例可適用於下文所述之一或多種態樣。從詳細說明與申請專利範圍，本發明之其他特徵與優點將顯而易見。因此，於下文揭示內容中敘述在本發明範圍內的本發明其他態樣與具體實例。

本發明係有關一種醫藥組成物，其包含(i)有效治療量之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少一種miRNA，與(ii)醫藥上可接受之載劑。

本發明亦有關一種醫藥組成物，其包含(i)有效治療量之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少三種miRNA，與(ii)醫藥上可接受之載劑。

本文所用之措辭“有效治療量”意欲意指足以促進有其需要個體的生理效益之活性成分之量。

本文所用之術語“至少三種miRNA”包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多種miRNA。於若干具體實例中，根據本發明之至少三種miRNA之組合稱為miRNA之混配物。

miRNA之鑑定與命名準則與慣例已見述於Ambros et al.[A uniform system for microRNA annotation.RNA 2003 9(3)：277-279]中。miRNA之序列可從miRbase資料庫(http：//www.mirbase.org/)或miRDB資料庫(http：//www.mirdb.org/)中輕易檢索。

表1：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-411-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR- 145-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-5096、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-4449、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-7847-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR- 3653-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-664a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-1291、hsa-miR-146b-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-3609、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-4461、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-663b、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-409-3p及其組合之組群。

表2：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含或由下列所組成之組群：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-542-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-663a、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-3648、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa- miR-27a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-543、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-5787、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-6089、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-5096、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-4449、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3960、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-6087、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-655-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-1291、hsa-miR-125b-5p、hsa- miR-425-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-455-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-1271-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-4461、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-411-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-1237-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-99b-3p及其組合。

表3：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-5096、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-191-5p、 hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-7847-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-369-5p及其組合之組群。

表4：根據本發明之miRNA

於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含或由下列所組成之組群：hsa-let-7a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-6832-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-181b-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-320b、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa- miR-98-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-1237-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-2053、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-3648、hsa-miR-663a、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-5096、hsa-miR-1246、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-543、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-5787、hsa-miR-4454、hsa-miR-4449、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-6089、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-374b-5p、 hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3960、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-655-3p、hsa-miR-6087、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-130a-3p及其組合。

表5：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-664a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1291、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-103b、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR- 28-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-3609、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-4461、hsa-miR-196a-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-663b、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-454-3p及其組合之組群。

表6：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含或由下列所組成之組群：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-28-5p、 hsa-let-7b-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4461、hsa-miR-191-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-103b、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-1291、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-455-3p、 hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3184-3p及其組合。

表7：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-3687、hsa-miR-619-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-4449、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-4454、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-663a、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-6723-5p、hsa-miR-664a- 3p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3648、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-221-3p及其組合之組群。

表8：根據本發明之miRNA

於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含或由下列所組成之組群：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-219、hsa-miR-29b、hsa-miR-4454、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-299-5p、has-miR-140-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-302b、hsa-miR-31、hsa-miR-1246、hsa-miR-663a、has-miR-221、hsa-miR-30、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-30e、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-17、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-181a、hsa-miR-433、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-486-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-335、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-34a、hsa-miR-106a、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-378、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-4449、hsa-346、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-10a、let-7a-5p、hsa-miR-374b-5p、let-7a、hsa-125b、hsa-miR-10a、hsa-miR-3687、hsa-miR-199b、hsa-miR-322、hsa-miR-148-a、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-218、hsa-miR-21、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-148a、hsa-miR-96、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-135b、hsa-miR-22、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-203、hsa-miR-27、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-6723-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-154-5p及其組合。

表9：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-342-3p及其組合之組群。

表10：根據本發明之miRNA

於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含或由下列所組成之組群：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-219、hsa-miR-21、hsa-miR-4454、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-96、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-302b、hsa-miR-22、hsa-miR-1246、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-27、hsa-miR-222-3p、let-7a、hsa-miR-34a、hsa-miR-29b、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-199b、hsa-miR-378、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-218、hsa-346、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-148a、hsa-10a、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-135b、hsa-125b、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-203、hsa-miR-322及其組合。

表11：根據本發明之miRNA

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-3687、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-3648、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-3613- 3p、hsa-miR-6723-5p、hsa-miR-3687、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-221-3p及其組合之組群。

表12：根據本發明之miRNA

於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含或由下列所組成之組群：hsa-miR-3687、hsa-miR-19a-3p、has-miR-221、hsa-miR-17、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-155、hsa-miR-433、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-181a、hsa-miR-335、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-106a、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-485-5p、has-miR-140-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-31、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-4449、hsa-miR-30、hsa-let-7c-5p、hsa- miR-663a、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-30e、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-6723-5p及其組合。

於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-6723-5p及其組合之組群。

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-1246,hsa-miR-335-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let7e-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-663a,hsa-miR-25-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-3648,hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-3651,hsa-miR-3687、hsa-miR-664-5p、hsa-miR-664-3p及其組合之組群。

於特定具體實例中，至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-1246,hsa-miR-335-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let7e-5p、hsa-miR-23b-3p及其組合之組群。

於若干具體實例中，至少三種miRNA係選自包含miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-4449、hsa-miR-663a及其組合之組群。

於若干具體實例中，該至少三種miRNA係選自包含hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-4485-3p及其組合之組群。

於若干具體實例中，該至少三種miRNA係選自包含hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-3687、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-664b-3p及其組合之組群。

於特定具體實例中，該至少三種miRNA係選自包含hsa-miR210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-619-5p及其組合之組群。

於特定具體實例中，該至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-4485-3p及其組合之組群。

於若干具體實例中，該至少三種miRNA包含hsa-miR210-3p及/或hsa-miR-409-3p。

於特定具體實例中，該至少三種miRNA包含hsa-miR210-3p。於若干具體實例中，該至少三種miRNA包含hsa-miR-409-3p。

於另一具體實例中，本發明之醫藥組成物包含有效治療量之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20種miRNA。

於若干具體實例中，該組成物包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3607-5p之組合。

於特定具體實例中，該組成物包含hsa-miR210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p之組合。

於若干具體實例中，該組成物包含hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p、與hsa-miR-4485-3p之組合。

於若干較佳具體實例中，該組成物包含hsa-miR210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p與hsa-miR-382-5p之組合。於若干較佳具體實例中，該組成物至少包含hsa-miR210-3p。

於若干具體實例中，該至少三種miRNA為活性劑。於特定具體實例中，該至少三種miRNA係醫藥組成物中之唯一活性劑。本文所用之措辭“唯一活性劑”意指該至少三種miRNA代表用於預防及/或治療包括皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病的組織疾病之唯一或獨有之活性成分。於另一具體實例中，該組成物包含除本發明miRNA之外的一或多種其他活性劑。

於若干具體實例中，miRNA可經由適當細胞合成，較佳為已進行組織分化之細胞，更佳為具有組織再生及/或修復特性之分化細胞。本文所用之措辭“具有組織再生及/或修復特性之分化細胞”意欲意指具有促進組織再生及/或修復、及/或維持現存組織於健康生理狀態的能力之細胞族群。

於一具體實例中，該等細胞已進行骨原性、軟骨性、上皮性、內皮性、肌原性或脂肪生成性分化。於若干具體實例中，該等細胞已進行骨原性及/或軟骨性分化。於特定具體實例中，該等細胞已進行上皮性、內皮性、肌原性或脂肪生成性分化。

於若干具體實例中，該等經分化之細胞係選自包含初代細胞、幹細胞、基因改造細胞及其組合之組群。

於若干具體實例中，初代細胞可選自包含或由下列所組成之組群：骨細胞、成骨細胞、蝕骨細胞、軟骨胚細胞、軟骨細胞、角質細胞、皮膚纖維母細胞、纖維母細胞、上皮細胞、造血細胞、肝細胞、神經細胞、肌纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、結締細胞、脂肪細胞與其組合及其前驅體。

於特定具體實例中，該等細胞係選自包含初代細胞，特別是選自包含或由下列所組成之組群：骨細胞、成骨細胞、蝕骨細胞、軟骨胚細胞、軟骨細胞與其混合物；幹細胞，特別是選自包含或由下列所組成之組群：成骨祖細胞、胚胎幹細胞(ESC)、間葉幹細胞(MSC)、多潛能幹細胞(pSC)、誘導性多潛能幹細胞(ipSC)與其混合物；基因改造細胞；及其組合之組群。

於若干具體實例中，由該等細胞合成之miRNA可從細胞中萃取，及/或可從該等細胞分泌之胞外體或類胞外體囊泡中回收。

實際上，根據本發明的細胞之RNA含量可利用此項技藝中已知之任何適當方法或自其改寫之任何方法進行評估。例示性地，例如可經由市售套組(例如Qiagen®之miRNeasy套組)之方法萃取RNA；且例如經由高通量定序系統(例如Illumina®之NextSeq 500系統)進一步定序。例示性地，可使用Qiazol溶解試劑(Qiagen®,Hilden,Germany)與Precellys均質機(Bertin® instruments,Montigny-le-Bretonneux,France)。根據廠商指示，使用附加DNase消化分解管柱之Rneasy迷你套組(Qiagen®,Hilden,Germany)純化RNA。使用分光光度計(Spectramax 190,Molecular Devices®,California,USA)測定RNA之品質與數量。使用RT² RNA第一股套組(Qiagen®,Hilden,Germany)，以0.5μg總RNA合成cDNA，以得到經由客製化PCR陣列(客製化之人類骨原與血管新生RT² Profiler Assay-Qiagen®,Hilden,Germany)之基因表現圖譜。使用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems®)與SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen®,Hilden,Germany)檢測擴增產物。根據△△CT方法得到量化。將各個試樣之最終結果標準化至三種持家基因(例如，ACTB、B2M與GAPDH)之平均表現量。

實際上，可經由此項技藝說明中已知之任何適當方法或自其改寫的方法單離細胞之miRNA，即從細胞中回收。可參考，例如，Chapter 7：Extraction,Purification,and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells of Molecular Cloning：a laboratory manual(Russell and Sambrook；2001；Cold Spring Harbor Laboratory)。例示性地，可利用市售套組，舉例而言，例如，RNeasy迷你套組(Qiagen®)或MagMax mirVana總RNA單離套組(Applied Biosystems®)、miRNeasy套組Mastermix(Qiagen®,Hilden,Germany)，遵循廠商指示單離 miRNA。RNA濃度可利用Nanodrop(ThermoFisher®,Waltham,Massachusetts,USA)測定。

於若干具體實例中，miRNA可經由此項技藝中已知之任何適當方法或由其改編之方法重新合成。於若干具體實例中，miRNA係活體外及/或活體內合成。

於若干具體實例中，組成物係經乾燥及/或滅菌。

於特定具體實例中，該組成物係經乾燥。本文所用之術語“經乾燥”與“經脫水”意欲彼此相互替代。

於若干具體實例中，乾燥係利用冷凍乾燥得到。例示性地，冷凍乾燥(freeze-drying)可依照此項技藝之說明中揭示之任一實驗流程或從其改寫之實驗流程進行，否則稱為冷凍乾燥法(lyophilization)。於若干具體實例中，組成物之冷凍乾燥係於溫度約-80℃之真空下進行。

於特定具體實例中，較佳為以約7kGy至約45kGy之劑量，更佳為於室溫下，利用γ射線照射得到滅菌。

於本發明之範圍內，措辭“約7kGy至約45kGy”涵蓋7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44與45kGy。

於若干具體實例中，滅菌係以約10kGy至約40kGy之劑量，利用γ射線照射得到。

於本發明之範圍內，術語“室溫”意欲意指包含約18℃至約22℃之溫度，其涵蓋18℃、19℃、20℃、21℃與22℃。於若干具體實例中，室溫係溫度約20℃。

於若干具體實例中，γ射線照射可於約10℃以下之溫度，較佳為於冰上(約0℃)進行。於本發明之範圍內，約10℃以下之溫度涵蓋9.5℃、8℃、8.5℃、8℃、7.5℃、7℃、6.5℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃與-80℃。

實際上，γ射線照射可持續進行，其持續時間取決於欲滅菌成分之量(例如，以ng、μg、mg或g表示)及/或欲給予之劑量。於特定具體實例中，γ射線照射可進行約10秒至約24小時，較佳為約5分鐘(300秒)至約12小時，更佳為約10分鐘(600秒)至約3小時(10,800秒)。於本發明之範圍內，措辭“約10秒至約24小時”涵蓋10秒、12秒、14秒、16秒、18秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分鐘、1分30秒、2分鐘、2分30秒、3分鐘、3分30秒、4分鐘、4分30秒、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、12分鐘、14分鐘、16分鐘、18分鐘、20分鐘、22分鐘、24分鐘、26分鐘、28分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、1小時30分、2小時、2小時30分、3小時、3小時30分、4小時、4小時30分、5小時、5小時30分、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時與24小時。

本文所用之“醫藥上可接受之載劑”係指任何溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及/或抗真菌劑、等滲與吸收遲滯劑等。

於一具體實例中，醫藥組成物包含一或多種醫藥上可接受之載劑，如乳化劑、增黏劑、抗微生物劑、抗氧化劑、防腐劑、膠凝劑、滲透促進劑或安定劑。

實際上，醫藥上可接受之載劑可包含選自多肽、胺基酸、脂質與碳水化合物之添加劑組群中之一或多種成分。於碳水化合物中，可舉出糖類，包括單醣、雙醣、三醣、四醣與寡醣；衍生化糖類例如醛醣醇、醛醣酸、酯化糖等；及多醣或糖聚合物。

適當之醫藥上可接受載劑之實例可包括多肽舉例而言，例如，明膠、酪蛋白等。

本發明之另一態樣係有關包含根據本發明的醫藥組成物之醫療器材。

於若干具體實例中，該醫療器材係植入物。於若干具體實例中，該植入物可呈有機或無機框架之形式。於特定具體實例中，該植入物為可吸收。

本發明進一步係有關包含根據本揭示內容的醫藥組成物之植入物。於若干具體實例中，該植入物係同種異體的。於特定具體實例中，該植入物係自體的。於若干具體實例中，該植入物係異種的。於特定具體實例中，該植入物係經凍乾及經滅菌，較佳為經由γ射線照射滅菌。

於特定具體實例中，該醫療器材係用於局部施用之敷料。於若干具體實例中，該敷料可包含織物或非織物。

於若干具體實例中，該醫療器材利用或以根據本發明之組成物包衣。於特定具體實例中，該根據本發明之醫療器材係經配置以容許醫藥組成物之控制釋放。於若干具體實例中，該醫療器材係呈貼劑之形式。

根據本發明之用途與方法可於活體內或擬體內進行。

於一態樣中，本發明亦有關根據本發明之醫藥組成物作為藥劑之用途。

本發明進一步有關根據本發明之醫藥組成物於製備或製造藥劑之用途。

本發明之又一態樣係藥劑，其包含有效治療量之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少三種miRNA。於一具體實例中，該藥劑包含根據本發明之組成物。

於若干具體實例中，該醫藥組成物係用於預防及/或治療組織疾病。

於若干具體實例中，該組織係選自包含骨骼組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織與脂肪組織之組群。

於若干具體實例中，該醫藥組成物係用於預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病。

於若干具體實例中，該醫藥組成物係用於預防及/或治療皮膚疾病。

本發明之另一態樣係有關用於有其需要個體之預防及/或治療組織疾病之方法，其包含給予有效量之根據本發明之醫藥組成物。

於一具體實例中，術語“組織”包含骨骼、軟骨、皮膚、肌肉、上皮、內皮、結締、神經與脂肪組織或由其組成。因此，於一具體實例中，組織疾病包含骨骼、軟骨、皮膚、肌肉、內皮與脂肪組織等疾病或由其組成。

於特定具體實例中，該組織疾病係選自包含或由下列所組成之組群：先天性皮膚成形不全；燒傷；癌症，包括乳癌、皮膚癌與骨癌；腔室症候群(CS)；表皮分解性水皰症；巨大型先天性痣；下肢缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；輻射後病灶；與潰瘍，包括糖尿病性潰瘍、較佳為糖尿病性足部潰瘍；關節炎；骨折；骨脆弱；卡費氏症；先天性假關節；顱部變形；顱部畸形；癒合延遲；浸潤性骨骼疾病；骨肥大症；骨礦物質密度流失；代謝性骨質流失；成骨不全；骨質軟化症；骨壞死；骨質缺乏症；骨質疏鬆症；佩吉特氏症；假關節；骨硬化病灶；脊柱裂；脊椎滑脫症；椎弓斷裂；軟骨發育不全；肋軟骨炎；內生軟骨瘤；拇趾僵硬；髖關節髖臼韌帶撕裂；剝離性骨軟骨炎；骨軟骨發育不良；多發性軟骨炎等。

本文所用之術語“癌症”包括實體癌。於特定具體實例中，該實體癌係選自包含或由下列所組成之組群：骨癌、腦癌、皮膚癌、乳癌、中樞神經系統之癌症、子宮頸之癌症、上呼吸消化道之癌症、結腸直腸癌、子宮內膜癌、生殖細胞癌、膀胱癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、神經胚細胞瘤、食道癌、卵巢癌、胰臟癌、胸膜癌、攝護腺癌、視網膜胚細胞瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、胃癌、睾丸癌與甲狀腺癌。

於若干具體實例中，該組織疾病係軟組織疾病。本文所用之術語“軟組織”意欲意指不具有固體結構之組織，因此非經由骨化及/或鈣化之過程得到。

於特定具體實例中，該軟組織疾病係選自包含或由下列所組成之組群：先天性皮膚成形不全；燒傷；癌症，包括乳癌、皮膚癌；腔室症候群(CS)；表皮分解性水皰症；巨大型先天性痣；下肢缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；輻射後病灶；與潰瘍，包括糖尿病性潰瘍、較佳為糖尿病性足部潰瘍。

於一具體實例中，醫藥組成物係用於組織重建。

於若干具體實例中，組織重建係選自包含骨骼重建、軟骨重建、皮膚重建、肌肉或肌原性重建、上皮重建、內皮重建、結締重建、神經重建與脂肪生成性重建之組群。

骨骼與皮膚重建之實例包括，惟不限於，真皮及/或表皮重建、傷口癒合、糖尿病性潰瘍治療(如糖尿病性足部潰瘍)、燒傷後病灶重建、輻射後病灶重建、乳癌或乳房變形後重建。

軟骨重建之實例包括，惟不限於，膝軟骨整形、鼻或耳重建、肋骨或胸骨重建。

肌原性重建之實例包括，惟不限於，骨骼肌重建、腹壁破裂後重建、下肢缺血性肌肉損傷後重建、與腔室症候群(CS)相關之重建。

內皮重建之實例包括，惟不限於，用於血管吻合術如靜脈動脈硬化分流術之血管貼片再細胞化。

脂肪生成性重建之實例包括，惟不限於，整型手術、回春作用、脂肪填充重建。

於若干態樣中，本發明係有關根據本發明組成物或醫藥組成物用於皮膚重建，較佳為用於治療皮膚傷口之用途。

本發明亦有關用於有其需要個體之皮膚重建，較佳為用於治療皮膚傷口之方法，包括給予有效治療量之根據本發明之醫藥組成物。

於一具體實例中，本發明之醫藥組成物或醫療器材係用於治療皮膚組織疾病。於一具體實例中，本發明之醫藥組成物或醫療器材係用於皮膚重建，包括真皮及/或表皮重建。於一具體實例中，本發明之醫藥組成物或醫療器材係用於真皮及/或表皮重建、傷口癒合、糖尿病性潰瘍治療(例如糖尿病性足部潰瘍)、燒傷後病灶重建、輻射後病灶重建、乳癌或乳房變形後重建。於獨特具體實例中，本發明之醫藥組成物或醫療器材係為了用以或用於治療皮膚傷口，較佳為糖尿病皮膚傷口。於一具體實例中，本發明之醫藥組成物或醫療器材係用於促進傷口閉合。於一具體實例中，本發明之組成物、醫藥組成物或醫療器材係用於減少傷口厚度，特別是於傷口癒合期間。

於獨特具體實例中，本發明之醫藥組成物或醫療器材係為了用以或用於治療表皮分解性水皰症、巨大型先天性痣及/或先天性皮膚成形不全。

於又另一態樣中，本發明係有關本發明之醫藥組成物或醫療器材用於重建及/或整型手術之用途。

於一具體實例中，受試者已針對組織缺損進行治療。於另一具體實例中，受試者尚未針對組織疾病進行治療。於一具體實例中，受試者對組織疾病之至少一種其他治療無反應。於一具體實例中，受試者為糖尿病患。於一具體實例中，受試者受糖尿病傷口之苦。

本發明另一態樣亦有關根據本發明用於補償組織疾病初級治療(primary treatment)副作用之醫藥組成物。本發明進一步有關於有其需要的個體中用於補償組織疾病初級治療副作用之方法，包括給予有效治療量之根據本發明之醫藥組成物。於特定具體實例中，該初級治療可選自包含抗發炎治療、癌症治療等及其組合之組群。

於另一態樣中，本發明亦有關根據本發明用於增強組織疾病之初級治療之醫藥組成物。實際上，該根據本發明之醫藥組成物可於初級治療之前、治療期間或治療之後給予。

本發明之另一態樣亦有關使用根據本發明組成物補償已知對組織具有有害作用的治療性處理之副作用。於特定具體實例中，該治療性處理可選自包含抗發炎治療、癌症治療、抗生素治療、免疫療法、化學療法等及其組合之組群。

本發明之另一態樣係有關針對有其需要之個體預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病之方法，包括給予有效量之根據本發明之醫藥組成物。

於特定具體實例中，該骨骼疾病係選自包含關節炎、骨癌、骨折、骨脆弱、卡費氏症、先天性假關節、顱部變形、顱部畸形、癒合延遲、浸潤性骨骼疾病、骨肥大症、骨礦物質密度流失、代謝性骨質流失、成骨不全、骨質軟化症、骨壞死、骨質缺乏症、骨質疏鬆症、佩吉特氏症、假關節、骨硬化病灶、脊柱裂、脊椎滑脫症與椎弓斷裂之疾病組群。

於若干具體實例中，該軟骨疾病係選自包含關節炎、軟骨發育不全、肋軟骨炎、內生軟骨瘤、拇趾僵硬、髖關節髖臼韌帶撕裂、剝離性骨軟骨炎、骨軟骨發育不良與多發性軟骨炎之組群。

於特定具體實例中，該醫藥組成物係用於促進成骨生成。

本發明之另一態樣係有關在有其需要之個體用於促進成骨生成之方法，其包含給予有效量之根據本發明之醫藥組成物。

於若干具體實例中，該醫藥組成物係用於抑制及/或減少蝕骨細胞生成。

本發明之另一態樣係有關在有其需要之個體用於抑制及/或減少蝕骨細胞生成之方法，其包含給予有效量之根據本發明之醫藥組成物。

於特定具體實例中，該醫藥組成物係用於促進軟骨生成。

本發明另一態樣係有關在有其需要之個體用於促進軟骨生成之方法，其包含給予有效量之根據本發明之醫藥組成物。

於特定具體實例中，該醫藥組成物係用於促進血管生成。

於另一態樣中，本發明進一步係有關在有其需要之個體用於促進血管生成之方法，其包含給予有效量之根據本發明之醫藥組成物。

於若干具體實例中，有其需要之個體係具有或易患骨骼疾病之個體，該骨骼疾病係選自包含關節炎、骨癌、骨折、骨脆弱、卡費氏症、先天性假關節、顱部變形、顱部畸形、癒合延遲、浸潤性骨骼疾病、骨肥大症、骨礦物質密度流失、代謝性骨質流失、成骨不全、骨質軟化症、骨壞死、骨質缺乏症、骨質疏鬆症、佩吉特氏症、假關節、骨硬化病灶、脊柱裂、脊椎滑脫症與椎弓斷裂之組群。

於特定具體實例中，有其需要之個體係具有或易患軟骨疾病之個體，該軟骨疾病係選自包含關節炎、軟骨發育不全、肋軟骨炎、內生軟骨瘤、拇趾僵硬、髖關節髖臼韌帶撕裂、剝離性骨軟骨炎、骨軟骨發育不良與多發性軟骨炎之組群。

本發明另一態樣亦有關根據本發明之醫藥組成物用於補償骨骼疾病及/或軟骨疾病初級治療的副作用之用途。

本發明進一步係有關在有其需要的個體用於補償骨骼疾病及/或軟骨疾病初級治療的副作用之方法，包括給予有效治療量之根據本發明之醫藥組成物。

於特定具體實例中，該初級治療可選自包含抗發炎治療、癌症治療(特別是實體癌治療)等及其組合之組群。

於另一態樣中，本發明亦有關根據本發明用於增強骨骼疾病及/或軟骨疾病的初級治療之醫藥組成物。

實際上，根據本發明之醫藥組成物可於初級治療前、治療期間或治療後給予。

本發明之另一態樣亦有關根據本發明用於補償已知對骨骼及/或軟骨具有害作用的治療性處理之副作用之組成物。

於特定具體實例中，該治療性處理可選自包含抗發炎治療、癌症治療、抗生素治療、免疫療法、化學療法等及其組合之組群。

於若干具體實例中，根據本發明之醫藥組成物可調配為此項技藝現有技術所涵蓋之任何適當形式，例如呈可注射溶液或懸浮液、錠劑、包衣錠、膠囊、糖漿、栓劑、乳劑、軟膏、洗滌劑、凝膠等形式。

於若干具體實例中，醫藥組成物呈半固體形式。於若干具體實例中，醫藥組成物呈糊劑、軟膏、乳劑、硬膏劑或凝膠之形式。於若干具體實例中，醫藥組成物可呈可塑造之糊劑或可操縱與移植的膜之形式。

於一具體實例中，本發明醫藥組成物可與適當賦形劑一起加工成半固體形式，較佳為糊劑。適當賦形劑為，特別是，通常用以生產糊劑基底之彼等賦形劑。根據本發明特別適當者為通常用以生產凝膠樣糊劑基底之賦形劑，例如凝膠形成劑。凝膠形成劑為與分散劑(例如水)形成凝膠之物質。本發明之凝膠形成劑之實例為層狀矽酸鹽、鹿角菜苷、三仙膠、阿拉伯膠、褐藻酸鹽、褐藻酸、果膠、修飾纖維素或泊洛沙姆(poloxamer)。

於一具體實例中，半固體形式之醫藥組成物較佳為呈糊劑形式，現成可用。於另一具體實例中，半固體形式之醫藥組成物較佳為呈糊劑形式，必須即時生產。

於若干具體實例中，包含於本發明醫藥組成物中之miRNA被膠囊化，亦即被固定於囊泡系統中。於一具體實例中，該膠囊化係雙層膠囊化。於另一具體實例中，該膠囊化係單層膠囊化。於又另一具體實例中，該膠囊化係基質膠囊化。

於一具體實例中，該膠囊化miRNA之囊泡係由生物聚合物製成。於另一具體實例中，該膠囊化miRNA之囊泡係細胞外囊泡。於獨特具體實例中，該膠囊化miRNA之囊泡係胞外體。因此，於此具體實例中，本發明之醫藥組成物包含膠囊化miRNA之胞外體。於一特定具體實例中，該等胞外體係細胞所衍生之胞外體，較佳為miRNA由此衍生之胞外體。於另一特定具體實例中，該胞外體係經工程化之胞外體。

胞外體工程可經由於此項技藝之說明中已知或自其改寫之任何適當方法進行。可參考例如，“Exosome engineering：Current progress in cargo loading and targeted delivery”(Fu et al.,NanoImplant,2020,Volume 20,100261)。

於若干具體實例中，將有效量之該活性劑給予有其需要之該個體。於本發明範圍內，“有效量”係指單獨刺激期望結果，亦即減輕或根除組織疾病(包括皮膚疾病、骨骼疾病及/或軟骨疾病)症狀之該活性劑之量。

於本發明之範圍內，擬給予之活性劑有效量可由醫師或經認可的熟習此項技藝人士決定，並可於治療時間內適當調整。

於特定具體實例中，擬給予之有效量可取決於多種參數，包括所挑選用於給藥之材料是否呈單次或多次劑量給藥，以及包括性別、年齡、身體狀況、大小、體重、與疾病之嚴重度等個體參數。

於特定具體實例中，每劑量單位可包含約0.001mg至約3,000mg，較佳為每劑量單位約0.05mg至約100mg之有效量活性劑。

於本發明之範圍內，每劑量單位之約0.001mg至約3,000mg包括約0.001mg、0.002mg、0.003mg、0.004mg、0.005mg、0.006mg、0.007mg、0.008mg、0.009mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1,000mg、1,100mg、1,150mg、1,200mg、1,250mg、1,300mg、1,350mg、1,400mg、1,450mg、1,500mg、1,550mg、1,600mg、1,650mg、1,700mg、1,750mg、1,800mg、1,850mg、1,900mg、1,950mg、2,000mg、2,100mg、2,150mg、2,200mg、2,250mg、2,300mg、2,350mg、2,400mg、2,450mg、2,500mg、2,550mg、2,600mg、2,650mg、2,700mg、2,750mg、2,800mg、2,850mg、2,900mg、2,950mg與3,000mg。

於特定具體實例中，活性劑之劑量量級可為每天足以遞送約0.001mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約50mg/kg，較佳為約0.1mg/kg至約40mg/kg，較佳為約0.5mg/kg至約30mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.1mg/kg至約10mg/kg及更佳為約1mg/kg至約25mg/kg受試者體重。

於特定具體實例中，各個劑型單元可每天三次、每天兩次、每天一次、每隔一天、每隔三天、每週、每兩週、每三週或每四週給予。

於特定具體實例中，該治療處理涵蓋多種劑型單元之給藥，其包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多種給藥。

根據一具體實例，本發明之醫藥組成物、藥劑或醫療器材係經由任何適當途徑給予，包括經腸(例如，口服)、非經腸、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、脊髓腔內、皮下、心室內、經皮、皮內、直腸、陰道內、腹膜內、局部、黏膜、鼻、口頰、舌下；經由氣管內滴入、支氣管內滴入及/或吸入；及/或作為口腔噴液劑、鼻用噴液劑及/或氣霧劑。

於一具體實例中，該醫藥組成物、藥劑或醫療器材係於組織疾病之部位給予。於特定具體實例中，本發明之醫藥組成物、藥劑或醫療器材可於手術期間，特別是侵入性手術期間局部給予，例如經由注射。

根據一具體實例，本發明之醫藥組成物、藥劑或醫療器材係經由注射或經由手術植入局部給予。

於一具體實例中，該醫藥組成物、藥劑或醫療器材係於骨骼及/或軟骨疾病部位給予。

於若干具體實例中，本發明之醫藥組成物可於給藥前復水。例示性地，本發明醫藥組成物可用無菌鹽水組成物復水，特別是包含約0.75%至約1.25% NaCl之無菌鹽水組成物，更佳為包含約0.90% NaCl之無菌鹽水組成物。

本發明之一態樣係有關一種用於產生包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少三種miRNA的組成物之方法，該方法包含下述步驟：

1)培養包含(i)能進行分化之活細胞與(ii)顆粒性材料之組合以獲得含有由該細胞分泌的細胞外基質之多維結構，其中該細胞具有組織再生及/或組織修復性質，其中該細胞與顆粒性材料包埋於細胞外基質中，且其中該多維結構包含RNA內容物，該RNA內容物包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA：

2)抽取步驟1)中產生之RNA內容物，特別是miRNA內容物。

本文所用之措辭“能進行分化之活細胞”意欲意指可分化為屬於欲再生及/或修復組織之細胞或擁有組織再生及/或組織修復特性之細胞族群。

本發明之進一步態樣係有關用於產生包含選自表1、表3、表5、表7、表9或表11中之至少三種miRNA的組成物之方法，該方法包含下述步驟：

1)培養包含(i)能進行分化之活細胞與(ii)明膠之組合以獲得包含由該細胞分泌的細胞外基質之多維結構，其中該細胞具有組織再生及/或組織修復性質，其中該等細胞與明膠包埋於細胞外基質中，且其中該多維結構包含RNA內容物，該RNA內容物包含選自表1、表3、表5、表7、表9或表11之至少三種miRNA；

2)抽取步驟1)中產生之RNA內容物，特別是miRNA內容物。

本發明之一態樣係有關一種產生包含選自表2、表4、表6、表8、表10或表12中之至少三種miRNA的組成物之方法，該方法包含下述步驟：

1)培養包含(i)能進行骨原及/或軟骨分化之活細胞與(ii)顆粒性材料之組合俾使獲得含有由該細胞分泌的細胞外基質之多維結構，其中該細胞具有骨原及/或軟骨性質，其中該細胞與顆粒性材料包埋於細胞外基質中，且其中該多維結構包含RNA內容物，該RNA內容物包含選自表2、表4、表6、表8、表10或表12之至少三種miRNA；

2)抽取步驟1)中產生之RNA內容物，特別是miRNA內容物。

本文所用之措辭“能進行骨原及/或軟骨分化之活細胞”意欲意指可於具有骨原及/或軟骨性質之細胞中分化之細胞族群。

根據本發明細胞之存活率，可經由此項技藝之說明中已知或從其改寫之任何適當方法進行評估。可參考例如“Mammalian cell viability：Methods and Protocols”(2011；Editor：MJ Stoddart)。例示性地，可在乾燥組成物水合後回收細胞，然後於適宜培養條件下與適當培養基接觸。細胞之存活率可根據錐蟲藍染料排除染色進行評估。替代地，細胞之存活率可根據測量培養基中碳源(特別是葡萄糖)之消耗進行評估。

本文所用之術語“包埋”意欲意指“緊密地封閉”或“成為整體之部分”。換言之，經由“細胞與顆粒性材料包埋於細胞外基質中”可理解細胞、顆粒性材料與細胞外基質係彼此緊密連接，且該三種成分成為一獨特之結構。

於特定具體實例中，該細胞係選自包含初代細胞、幹細胞、基因改造細胞與其混合物之組群。

實際上，根據本發明之細胞可為動物細胞，較佳為哺乳動物細胞，更佳為人類細胞。

於若干具體實例中，初代細胞可選自包含或由下列所組成之組群：骨細胞、骨胚細胞、蝕骨細胞、軟骨胚細胞、軟骨細胞、角質細胞、皮膚纖維母細胞、纖維母細胞、造血細胞、肝細胞、上皮細胞、肌纖維母細胞、內皮細胞、結締細胞、神經細胞、脂肪細胞與其組合。於若干具體實例中，初代細胞可選自包含或由下列所組成之組群：骨細胞、骨胚細胞、蝕骨細胞、軟骨胚細胞、軟骨細胞與其組合。由於初代細胞係分化之細胞，因此彼等可培養於任何適當培養基中以用於維持或增殖之目的。於若干具體實例中，初代細胞可於適於容許該等細胞增殖或維持之培養基中培養。

於特定具體實例中，幹細胞可選自包含或由下列所組成之組群：成骨祖細胞、胚胎幹細胞(ESC)、間葉幹細胞(MSC)、多功能幹細胞(pSC)與誘導性多功能幹細胞(ipSC)。

本文所用之“胚胎幹細胞”(ESC)通常係指能分化成為三個胚胎胚層(即內胚層、外胚層或中胚層)中任一層之細胞，或能維持於未分化狀態之胚胎細胞。此類細胞可包含得自懷孕後胚胎植入前(即植入前胚細胞)所形成之胚胎組織(例如胚細胞)之細胞、得自植入後/原腸胚形成前階段之胚細胞之擴展胚細胞(EBC)(參見WO2006/040763)、得自懷孕期之任何時間(較佳為懷孕前10週)以及其他用未受精卵方法(如孤雌生殖方法或核轉移)之胎兒生殖組織之胚胎生殖(EG)細胞。

於特定具體實例中，根據本發明之ESC係動物ESC，較佳為哺乳動物ESC，更佳為人類ESC(hESC)。

實際上，適當之ESC可使用眾所周知之細胞培養方法得到。舉例而言，ESC可從胚細胞單離。胚細胞一般係得自活體內植入前之胚胎或活體外受精(IVF)之胚胎。替代地，可將單一細胞胚胎擴展至胚細胞階段。有關製備ESC方法之進一步細節可於美國專利案No.5,843,780中找到。

於若干具體實例中，如Chung et al.(2008)所述，hESC可有利地得到而不破壞胚胎。於若干具體實例中，hESC可從受精後14天內所收集或單離之胚胎中有利地得到。於若干具體實例中，該ESC非人類ESC。

本文所用之“間葉幹細胞”(MSC)通常係指來自特化組織(亦稱為分化組織)之基質細胞，能於生物體之生命期中自我更新(即產生自己本身完全相同之複製本)，且具有多潛能分化之潛力。

於若干具體實例中，根據本發明之MSC係動物MSC，較佳為哺乳動物MSC，更佳為人類MSC(hMSC)。實際上，適用於實施本發明之hMSC因此涵蓋使用任何適當單離方法從任何適當組織衍生之任何適當人類多潛能幹細胞。例示性地，hMSC涵蓋，惟不限於，成人多元性誘導性(MIAMI)細胞(D'Ippolito et al.；2004)、臍帶血衍生之幹細胞(Kögler et al.；2004)、中胚層血管母細胞(Sampaolesi et al.；2006；Dellavalle et al.；2007)、與羊膜幹細胞(De Coppi et al.；2007)。再者，臍帶血庫(例如法國的法國血站)提供用於移植之此類細胞安全且可容易得到之來源。於特定具體實例中，根據本發明之MSC係成骨前驅細胞或軟骨胚前驅細胞。

於若干具體實例中，間葉幹細胞係脂肪細胞衍生之幹細胞(ASC)。本文所用之下述術語被視為係指ASC：脂肪組織衍生之幹/基質細胞(ASC)；脂肪衍生之成體幹(ADAS)細胞、脂肪衍生之成體基質細胞、脂肪衍生之基質細胞(ADSC)、脂肪基質細胞(ASC)、脂肪間葉幹細胞(AdMSC)、脂母細胞、外被細胞、前脂肪細胞、處理過之脂肪組織抽吸物(PLA)細胞。

於一具體實例中，ASC組織為動物起源，較佳為哺乳動物起源，更佳為人類起源。因此，於一具體實例中，ASC係動物ASC，較佳為哺乳動物ASC，更佳為人類ASC。於一較佳具體實例中，ASC係人類ASC。

從脂肪組織中單離幹細胞之方法為此項技藝中已知，例如於Zuk et al.(Tissue Engineering.2001,7：211-228)中所揭示。於一具體實例中，ASC係經由抽脂手術從脂肪組織中單離。

作為說明，可經由穿刺生檢或抽脂手術抽吸收集脂肪組織。可經由首先以磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)[視需要，含有抗生素例如1%青黴素/鏈黴素(P/S)]廣泛洗滌該組織試樣，然後從脂肪組織中單離ASC。接著將該試樣與用於組織消化分解之膠原蛋白酶(例如，製備於含2% P/S之PBS中之膠原蛋白酶第I型)一起置入無菌組織培養盤或無菌試管中，並於水浴中37℃、5% CO₂下培育60分鐘，且每20分鐘用手搖動一次。膠原蛋白酶活性可經由添加培養基[例如含10%人類血小板裂解液(hPL)之DMEM]予以中和。於崩解後，將試樣轉移至試管中。含ASC之基質血管部份(SVF)可經由離心試樣(例如以2,000rpm離心5分鐘)得到。為了完全分開基質細胞與初代脂肪細胞，可激烈地搖動試樣以完全瓦解沈澱物並混合細胞。可再重複離心步驟。於旋轉並吸出膠原蛋白酶溶液後，將沈澱物再懸浮於溶解緩衝液中，於冰上培育(例如10分鐘)、洗滌(例如用PBS/2% P/S)並離心(例如以2,000rpm離心5分鐘)。然後可將上清液吸出，將細胞沈澱物再懸浮於培養基(例如，基質培養基，即補充20% FBS、1% L-麩胺醯胺與1% P/S之α-MEM)中，並過濾細胞懸浮液(例如，通過70μm細胞濾網)。最後，將含細胞之試樣平板培養於培養盤中，並在37℃、5% CO₂下培育。

於一具體實例中，本發明之ASC係從脂肪組織之基質血管部份中單離。於一具體實例中，該脂肪組織抽吸物可於室溫存放數小時，或於使用前在+4℃存放24至72小時，或於0℃以下(例如-18℃或-80℃)長期保存。

於一具體實例中，ASC可為新鮮或冷凍之ASC。新鮮之ASC係未進行冷凍處理之單離ASC。經冷凍之ASC係已進行冷凍處理之單離ASC。於一具體實例中，冷凍處理意指0℃以下之任何處理。於一具體實例中，冷凍處理可於約-18℃、-80℃或-180℃進行。於一特定具體實例中，冷凍處理可為冷凍保存。

作為冷凍處理之說明，ASC可於80至90%滿度時收穫。經培養皿洗滌與分離之步驟後，將細胞於20℃與冷凍保存培養基一起製成丸狀，並置於小瓶中。於一具體實例中，該冷凍保存培養基包含80%胎牛血清或人類血清、10%二甲亞碸(DMSO)與10% DMEM/Ham’s F-12。然後，小瓶可於-80℃貯存過夜。舉例而言，可將小瓶置於酒精冷凍盒中，其大約每分鐘1℃緩慢冷卻小瓶，直至達到-80℃。最後，可將冷凍小瓶轉移至液態氮容器中長期儲存。

於一具體實例中，ASC為分化之ASC。於一較佳具體實例中，ASC係骨原分化之ACS。換言之，於較佳具體實例中，ASC分化成為骨原細胞。於獨特具體實例中，ASC分化成為成骨細胞及/或骨細胞。本文所用之術語“分化之”當係指幹細胞，特別是ASC時，係意欲意指該細胞係處於成熟狀態並擁有在給定組織中所發現之生理上細胞特徵。該分化之細胞經歷分化過程，且分化之細胞族群可為部分或完全分化。

於另一具體實例中，ASC係軟骨形成分化之ASC。換言之，於一具體實例中，ASC分化成為軟骨形成細胞。於獨特具體實例中，ASC分化成為軟骨細胞。

本文所用之術語“多功能”係指具有產生細胞子代能力之細胞，且該細胞子代於適當條件下能進行分化成共同展現與來自三種胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之細胞譜系相關特徵之細胞類型。多功能幹細胞可促成出生前、出生後或成人生物體之組織。一標準本技藝所公認之測試，如於8至12週齡之SCID小鼠中形成畸胎瘤之能力，可用於建立細胞族群之多功能性。然而，各種多功能幹細胞特徵之鑑定亦可用於鑑定多功能細胞。於本發明之若干具體實例中，該多潛能幹細胞係動物多功能幹細胞，較佳為哺乳動物多功能幹細胞，更佳為人類多功能幹細胞。

本文所用之“誘導性多功能幹細胞”(iPSC)係指從非多功能細胞人為衍生之多功能幹細胞。非多功能細胞可為與多功能幹細胞比較時具有較小自我更新與分化能力(或潛力)之細胞。較小潛力之細胞可為，惟不限於，體幹細胞、組織特異性祖細胞、初代或繼代細胞。於若干具體實例中，該iPSC係人類iPSC(hiPSC)。

於若干具體實例中，該等細胞包含基因改造細胞。實際上，基因改造細胞係經工程處理，以便合成促進組織再生及/或組織修復特性之因子與核酸。

於本發明範圍內，措辭“基因改造”意欲意指細胞於其基因體中擁有一或多個核苷酸之置換、附加或缺失及/或包含一或多個編碼一或多種干擾細胞命運生理結果之因子之附加額外染色體核酸。於特定具體實例中，該基因改造細胞係動物起源，較佳為哺乳動物起源，更佳為人類起源。

相反地，由於幹細胞與基因改造細胞係未分化之細胞，彼等可進行分化，其包括惟不限於骨原及/或軟骨之分化過程。

於若干具體實例中，分化包含骨原分化、軟骨分化、角蛋白形成分化、上皮分化、內皮分化、成肌纖維分化、結締組織分化、神經分化、脂肪生成性分化等及其組合。

於一具體實例中，細胞，特別是ASC，係分化的。於一較佳具體實例中，細胞，特別是ASC，係骨原分化的。換言之，於一較佳具體實例中，細胞，特別是ASC，係分化成骨原細胞。於獨特具體實例中，細胞，特別是ASC，係分化成骨胚細胞及/或骨細胞或其前驅細胞。

控制與評估骨原分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明之細胞或組織之骨分化可經由骨鈣化素及/或磷酸鹽[例如用馮庫薩(von Kossa)染色法]之染色、磷酸鈣染色(例如用茜素紅)、核磁共振造影(MRI)、測量礦化基質之形成或測量鹼性磷酸酶之活性進行評估。

於一具體實例中，經由於骨原分化培養基(MD)中培養細胞，進行幹細胞或基因改造細胞(特別是ASC)之骨原分化。於一具體實例中，該骨原分化培養基包含人類血清。於獨特具體實例中，該骨原分化培養基包含人類血小板裂解液(hPL)。於一具體實例中，該骨原分化培養基不包含任何其他動物血清，較佳為除人類血清外不包含其他血清。

於一具體實例中，骨原分化培養基包含或由下列所組成：補充地塞米松(dexamethasone)、抗壞血酸與磷酸鈉之增殖培養基。於一具體實例中，該骨原分化培養基進一步包含抗生素，如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。於一具體實例中，所有培養基均不含動物性蛋白質。

於一具體實例中，增殖培養基可為設計以支持一般熟習此項技藝者悉知的細胞生長之任何培養基。本文所用之增殖培養基亦稱為“生長培養基”。生長培養基之實例包括惟不限於RPMI、MEM、DMEM、IMDM、RPMI 1640、FGM或FGM-2、199/109培養基、HamF10/HamF12或McCoy’s 5A。於一較佳具體實例中，該增殖培養基為DMEM。

於一具體實例中，該骨原分化培養基包含或由下列所組成：補充L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺(Ala-Gln，亦稱為‘Glutamax®’或‘Ultraglutamine®’)、hPL、地塞米松、抗壞血酸與磷酸鈉之DMEM。於一具體實例中，該骨原分化培養基包含或由下列所組成：補充L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL、地塞米松、抗壞血酸與磷酸鈉、及抗生素(較佳為青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B)之DMEM。

於一具體實例中，該骨原分化培養基包含或由下列所組成：補充L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)之DMEM。於一具體實例中，該骨原分化培養基包含或由下列所組成：補充L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)、青黴素(約100U/mL)與鏈黴素(約100μg/mL)之DMEM。於一具體實例中，該骨原分化培養基進一步包含兩性黴素B(約0.1%)。

於一具體實例中，該骨原分化培養基由下列所組成：補充L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25 mM)與磷酸鈉(約2.93mM)之DMEM。於一具體實例中，該骨原分化培養基包含或由下列所組成：補充L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)、青黴素(約100U/mL)、鏈黴素(約100μg/mL)與兩性黴素B(約0.1%)之DMEM。

於另一具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係軟骨分化的。換言之，於較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，分化成軟骨細胞。於獨特具體實例中，細胞，特別是ASC，分化成軟骨細胞或其前驅細胞。

控制與評估軟骨分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明細胞或組織之軟骨分化可經由測量軟骨細胞特異性基因例如蛋白聚醣聚合物、膠原蛋白II與SOX-9之表現量進行評估。該等方法包括，惟不限於，實時PCR或組織學分析[例如艾爾遜藍(Alcian Blue)染色]。

於一具體實例中，軟骨分化培養基包含或由下列所組成：補充丙酮酸鈉、抗壞血酸與地塞米松之增殖培養基。於一具體實例中，軟骨分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。於一具體實例中，軟骨分化培養基進一步包含生長因子，例如IGF與TGF-β。於一具體實例中，所有培養基均不含動物性蛋白質。

於一具體實例中，軟骨分化培養基包含或由下列所組成：補充hPL、地塞米松、抗壞血酸與丙酮酸鈉之DMEM。於一具體實例中，軟骨分化培養基可進一步包含脯胺酸及/或生長因子及/或抗生素。

於一具體實例中，經由於軟骨分化培養基中培養ASC進行軟骨分化。

於一具體實例中，軟骨分化培養基包含或由下列所組成：DMEM、hPL、丙酮酸鈉、ITS、脯胺酸、TGF-β1與地塞米松(dexamethazone)。於一具體實例中，軟骨分化培養基進一步包含抗生素，如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。

於一具體實例中，該軟骨分化培養基包含或由下列所組成：DMEM、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、丙酮酸鈉(約100μg/mL)、ITS(約1X)、脯胺酸(約40μg/mL)與TGF-β1(約10ng/mL)。

於另一具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係角蛋白生成分化的。換言之，於一較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，被分化成角蛋白細胞。再換言之，於一較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係於角蛋白培養基中被分化。於獨特具體實例中，該等細胞，特別是ASC，被分化成為角質細胞或其前驅細胞。

控制與評估角蛋白形成分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明細胞或組織之角蛋白形成分化可利用泛角蛋白(Pankeratin)或CD34之染色進行評估。

於一具體實例中，經由於角蛋白形成分化培養基中培養ASC進行分化成角質細胞。

於一具體實例中，角蛋白形成分化培養基包含或由下列所組成：DMEM、hPL、胰島素、KGF、hEGF、氫皮質酮與CaCl₂。於一具體實例中，角蛋白形成分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。

於一具體實例中，角蛋白形成分化培養基包含或由下列所組成：DMEM、hPL(約5%，v/v)、胰島素(約5μg/mL)、KGF(約10ng/mL)、hEGF(約10ng/mL)、氫皮質酮(約0.5μg/mL)與CaCl₂(約1.5mM)。

於另一具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係內皮分化的。

再換言之，於較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係於內皮培養基中分化。於獨特具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化成內皮細胞或其前驅細胞。

控制與評估內皮分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明細胞或組織之內皮分化可利用CD34之染色進行評估。

於一具體實例中，經由於內皮分化培養基中培養細胞(特別是ASC)進行分化成內皮細胞。

於一具體實例中，內皮分化培養基包含或由下列所組成：EBMTM-2培養基、hPL、hEGF、VEGF、R3-IGF-1、抗壞血酸、氫皮質酮與hFGFb。於一具體實例中，內皮分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。

於一具體實例中，內皮分化培養基包含或由下列所組成：EBMTM-2培養基、hPL(約5%，v/v)、hEGF(約0.5mL)、VEGF(約0.5mL)、R3-IGF-1(約0.5mL)、抗壞血酸(約0.5mL)、氫皮質酮(約0.2mL)與hFGFb(約2mL)、Clonetics^TM EGM^TM-2MV BulletKit^TM CC-3202(Lonza®)套組之試劑。

於另一具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係成肌纖維分化的。換言之，於較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，被分化為成肌纖維細胞。再換言之，於較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係於成肌纖維培養基中分化的。於獨特具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化為成肌纖維母細胞或其前驅細胞。

控制與評估成肌纖維分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明細胞或組織之成肌纖維分化可利用α-SMA之染色進行評估。

於一具體實例中，經由於成肌纖維分化培養基中培養細胞(特別是ASC)進行分化為成肌纖維細胞。

於一具體實例中，該成肌纖維分化培養基包含或由下列所組成：DMEM：F12、丙酮酸鈉、ITS、RPMI 1640維生素、TGF-β1、麩胱甘肽、MEM。於一具體實例中，該成肌纖維分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。

於一具體實例中，成肌纖維分化培養基包含或由下列所組成：DMEM：F12、丙酮酸鈉(約100μg/mL)、ITS(約1X)、RPMI 1640維生素(約1X)、TGF-β1(約1ng/mL)、麩胱甘肽(約1μg/mL)、MEM(約0.1mM)。

於另一具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係脂肪生成性分化的。換言之，於一較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化成脂肪生成性細胞。再換言之，於較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係於脂肪生成性培養基中分化。於獨特具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化成脂肪細胞或其前驅細胞。

控制與評估脂肪生成性分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明細胞或組織之脂肪生成性分化可利用油紅之染色進行評估。

於一具體實例中，經由於脂肪生成性分化培養基中培養ASC進行分化成為脂肪細胞。

於一具體實例中，脂肪生成性分化培養基包含或由下列所組成：DMEM、hPL、地塞米松、胰島素、吲哚美辛與IBMX。於一具體實例中，脂肪生成性分化培養基進一步包含抗生素，如青黴素、鏈黴素、見大黴素及/或兩性黴素B。

於一具體實例中，脂肪生成性分化培養基包含或由下列所組成：DMEM、hPL(約5%)、地塞米松(約1μM)、胰島素(約5μg/mL)、吲哚美辛(約50μM)與IBMX(約0.5mM)。

於另一具體實例中，細胞，特別是ASC，係神經分化的。換言之，於較佳具體實例中，該等細胞，特別是ASC，分化成神經細胞。於獨特具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化成神經細胞。於一特定具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化成神經元。於另一特定具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係分化成神經膠細胞。

於一具體實例中，經由於神經元或神經膠細胞分化培養基中培養細胞(特別是ASC)進行分化成神經細胞。

控制與評估神經分化之方法為此項技藝中已知。舉例而言，本發明細胞或組織之神經分化可根據形態學、生理學或總體基因表現模式進行評估。舉例而言，本發明細胞或組織之神經分化可經由細胞生長之長度、生長錐之發育、及/或神經外胚層幹細胞標記(包括NESTIN、PAX6與SOX2)之染色進行評估。控制與評估神經分化之另一方法為評估該分化細胞之電生理圖譜。

於一具體實例中，該等細胞，特別是ASC，係晚期繼代培養的脂肪組織衍生之幹細胞。本文所用之術語“晚期繼代培養”意指至少於繼代培養4之後分化的脂肪組織衍生之幹細胞。本文所用之繼代培養4係指第四次繼代培養，亦即，於細胞被再懸浮於新鮮培養基之前，經由從培養容器表面將其分離之第四次分裂細胞行動。於一具體實例中，晚期繼代培養之脂肪組織衍生的幹細胞係於繼代培養4、繼代培養5、繼代培養6或更多代之後分化。於一較佳具體實例中，細胞，特別是ASC，係於繼代培養4之後分化。

本文所用之術語“容器”意指任何細胞培養表面，舉例而言，例如，培養瓶或孔培養盤。

初代細胞之初始繼代培養稱為繼代培養0(P0)。根據本發明，繼代培養P0係指從沈澱的基質血管級份(SVF)之細胞懸浮液接種到培養容器。因此，繼代培養P4意指細胞從培養容器表面分離4次(於P1、P2、P3與P4時)(例如利用以胰蛋白酶消化分解)，然後再懸浮於新鮮培養基中。

於一具體實例中，本發明之細胞，特別是ASC，係於增殖培養基中培養至第四次繼代培養。於一具體實例中，本發明之細胞，特別是ASC，係於第四次繼代培養後培養於分化培養基中。因此，於一具體實例中，於繼代培養P1、P2與P3時，本發明之細胞，特別是ASC，係從培養容器表面分離，然後於增殖培養基中稀釋至適當細胞密度。仍根據此具體實例，於繼代培養P4時，細胞，特別是ASC，係從培養容器之表面分離，然後於分化培養基中稀釋至適當細胞密度。因此，根據此具體實例，於P4時，本發明細胞，特別是ASC，於分化前(即於分化培養基中培養之前)不再懸浮及培養於增殖培養基中直至達到滿度，而是於分化培養基中直接再懸浮及培養。

於一具體實例中，細胞係維持於分化培養基中至少至細胞達到滿度為止，較佳為於70%與100%間之滿度，更佳為於80%與95%間之滿度。於一具體實例中，細胞係維持於分化培養基中至少5天，較佳為至少10天，更佳為至少15天。於一具體實例中，細胞係維持於分化培養基中5天至30天，較佳為10天至25天，更佳為15天至20天。於一具體實例中，分化培養基係每2天替換。然而，如此項技藝中已知，從一捐贈者至另一捐贈者之細胞生長速率可能稍微不同。因此，分化持續時間以及培養基更換次數可能從一捐贈者至另一捐贈者彼此不同。

於一具體實例中，細胞至少維持於骨原分化培養基中直到形成類骨質，即於骨骼組織成熟前形成的骨骼基質之未礦化有機部分。於一具體實例中，細胞至少維持於軟骨分化培養基中，直到形成具有黏彈性質之未成熟或成熟軟骨。

於若干具體實例中，該組合包含基因改造細胞。實際上，基因改造細胞係經工程處理，俾使合成促進骨原及/或軟骨特性之因子與核酸。

於若干具體實例中，該基因改造細胞係經工程處理以容許涉及成骨生成及/或軟骨生成之一或多種生長因子、轉錄因子或RNA之合成。

於特定具體實例中，步驟1)之組合每克包含約10²至約10¹⁶個細胞，較佳為每克組合約10⁶至約10¹²個細胞。於本發明之範圍內，措辭“約10²至約10¹⁶個細胞”涵蓋10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、10⁹、5×10⁹、10¹⁰、5×10¹⁰、10¹¹、5×10¹¹、101²、5×10¹²、10¹³、5×10¹³、10¹⁴、5×10¹⁴、10¹⁵、5×10¹⁵與10¹⁶個細胞。

本文所用之“培養基”係指細胞生物學領域中普遍接受之定義，即，適於促進所關注細胞生長之任何培養基。

於若干具體實例中，適當之培養基可包括化學成分確定之培養基，即，只含特定成分，較佳為已知化學結構的成分之營養培養基。

於若干具體實例中，化學成分確定之培養基可為無血清及/或無餵養細胞之培養基。本文所用之“無血清”培養基係指不含添加的血清之培養基。本文所用之“無餵養細胞”培養基係指不含添加的餵養層細胞之培養基。

根據本發明使用之培養基可為水性培養基，其可包例如一或多種鹽類、碳源、胺基酸、維生素、礦物質、還原劑、緩衝劑、脂質、核苷、抗生素、細胞激素、與生長因子等物質之組合。

適當培養基之實例包括，惟不限於，RPMI培養基、William’s E培養基、Basal Medium Eagle(BME)、Eagle's Minimum Essential培養基(EMEM)、Minimum Essential培養基(MEM)、Dulbecco's Modified Eagles培養基(DMEM)、Ham’s F-10、Ham’s F-12培養基、Kaighn’s改良之Ham’s F-12培養基、DMEM/F-12培養基、與McCoy's 5A培養基，其等可進一步補充上述任何一種物質。

於若干具體實例中，根據本發明之培養基可為合成之培養基例如RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養基)或CMRL-1066(Connaught Medical Research Laboratory)。

實際上，兩種培養基皆可補充本領域中常用之其他添加劑。於若干具體實例中，追加之添加劑旨在促進成骨生成及/或軟骨生成。適當追加添加劑之非限制性實例涵蓋生長因子、轉錄因子、骨細胞活化劑、骨胚細胞活化劑、蝕骨細胞抑制劑、軟骨細胞活化劑等及其混合物。

實際上，例如溫度、pH、鹽度等培養參數、及O₂與CO₂之量級均根據此項技藝中建立的標準予以調節。例示性地，用於培養根據本發明細胞的溫度可為約30℃至約42℃，較佳為約35℃至約40℃，更佳為約36℃至約38 ℃。於本發明之範圍內，措辭“約30℃至約42℃”涵蓋30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃與42℃。

於若干具體實例中，培養過程期間，CO₂的量級維持恆定，範圍為約1%至約10%，較佳為約2.5%至約7.5%。於本發明之範圍內，措辭“約1%至約10%”涵蓋1、2、3、4、5、6、7、8、9與10%。

於一具體實例中，本發明之顆粒性材料呈顆粒形式。於一具體實例中，顆粒可為珠粒、粉末、球體、微球體等。

於若干具體實例中，本發明之顆粒性材料由為細胞生長與繁殖提供結構性支持的材料所形成。於一具體實例中，顆粒性材料為生物相容，且包括天然或合成材料或其化學衍生物。

於本發明之範圍內，“生物相容”係指對身體不具毒性或傷害性之品質。

於一具體實例中，本發明之顆粒性材料未構造為形成預定的3D形狀或框架，例如立方體。於一具體實例中，本發明之顆粒性材料不具預定的形狀或框架。於一具體實例中，本發明之顆粒性材料不具立方體之形式。於一具體實例中，該顆粒性材料不是3D框架。於一具體實例中，本發明之顆粒性材料為無框架。

於特定具體實例中，顆粒性材料係選自包含或由下列所組成之組群：

-有機材料，包括去礦質之骨骼基質(DBM)、明膠、瓊脂/瓊脂糖、褐藻酸幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原蛋白、彈性蛋白或類彈性蛋白胜肽(ELP)、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維結合素、蛋白多醣、硫酸肝素蛋白多醣、玻尿酸、多醣、層連結蛋白、纖維素衍生物、或其組合；

-陶瓷材料，包括磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO₃)、硫酸鈣(CaSO₄)、或氫氧化鈣(Ca(OH)₂)等顆粒、或其組合；

-凝膠，包括自組裝寡肽凝膠、水凝膠物質、微凝膠、奈米凝膠、顆粒性凝膠、水凝膠物質、搖變減黏凝膠、乾凝膠、敏感凝膠、或其組合；

-奶精；

及其任何組合之組群。

於若干具體實例中，顆粒性材料為明膠或陶瓷材料。

於一具體實例中，本發明之顆粒性材料為明膠。

於一具體實例中，本發明之明膠為動物明膠，較佳為哺乳動物明膠，更佳為豬明膠。本文所用之術語“豬明膠”可由“豬肉明膠”或“豬明膠”代替。於一具體實例中，明膠為豬皮膚明膠。

於特定具體實例中，該明膠係呈顆粒形式，較佳為平均直徑範圍從約50μm至約1,000μm之顆粒。於本發明之範圍內，措辭“約50μm至約 1,000μm”涵蓋50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm與1,000μm。

於一具體實例中，本發明之明膠呈顆粒形式、珠子、球體、微球體等。

於一具體實例中，本發明之明膠未構造為形成預定的3D形狀或框架，例如立方體。於一具體實例中，本發明之明膠不具預定的形狀或框架。於一具體實例中，本發明之明膠不具立方體之形式。於一具體實例中，明膠，較佳為豬明膠，不是3D框架。

於一具體實例中，本發明之明膠為大孔微載體。

豬明膠顆粒之實例包括，惟不限於，Cultispher® G、Cultispher® S、Spongostan與Cutanplast。於一具體實例中，本發明之明膠為Cultispher® G或Cultispher® S。

於一具體實例中，本發明之明膠，較佳為豬明膠，其平均直徑為至少約50μm，較佳為至少約75μm，更佳為至少約100μm，更佳為至少約130μm。於一具體實例中，本發明之明膠，較佳為豬明膠，具有最多約1,000μm，較佳為最多約750μm，更佳為最多約500μm之平均直徑。於另一具體實例中，本發明之明膠，較佳為豬明膠，具有最多約450μm，較佳為最多約400μm，更佳為至少最多約380μm之平均直徑。

於一具體實例中，本發明之明膠，較佳為豬明膠，具有範圍從約50μm至約1,000μm，較佳為從約75μm至約750μm，更佳為從約100μm至約 500μm之平均直徑。於另一具體實例中，本發明之明膠，較佳為豬明膠，具有範圍從約50μm至約500μm，較佳為從約75μm至約450μm，更佳為從約100μm至約400μm之平均直徑。於另一具體實例中，本發明之明膠，較佳為豬明膠，具有範圍從約130μm至約380μm之平均直徑。

評估根據本發明明膠顆粒的平均直徑之方法為此項技藝中已知。此類方法之實例包括，惟不限於，粒度測定法(特別是使用適當篩子)；沉澱法；離心技術；雷射繞射；與影像分析(特別是利用帶有遠心透鏡之高性能相機)等。

於一具體實例中，對150cm²的容器，以範圍從約0.1cm³至約5cm³，較佳為約從0.5cm³至約4cm³，更佳為從約0.75cm³至約3cm³的濃度添加明膠。於一具體實例中，對150cm²的容器，以範圍從約1cm³至約2cm³的濃度添加明膠。於一具體實例中，對150cm²的容器，以約1cm³、1.5cm³或2cm³的濃度添加明膠。在本發明之範圍內，措辭“0.1cm³至約5cm³”涵蓋0.1cm³、0.2cm³、0.3cm³、0.4cm³、0.5cm³、0.6cm³、0.7cm³、0.8cm³、0.9cm³、1.0cm³、1.5cm³、2.0cm³、2.5cm³、3.0cm³、3.5cm³、4.0cm³、4.5cm³與5.0cm³。

於一具體實例中，對150cm²的容器，以範圍從約0.1g至約5g，較佳為從約0.5g至約4g，更佳為從約0.75g至約3g的濃度添加明膠。於一具體實例中，對150cm²的容器，以範圍從約1g至約2g的濃度添加明膠。於一具體實例中，對150cm²的容器，以約1g、1.5g或2g的濃度添加明膠。於本發明之範圍內，措辭“0.1g至約5g”涵蓋0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7 g、0.8g、0.9g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g與5.0g。

於一具體實例中，細胞分化後，將本發明的明膠添加至培養基。一具體實例中，當細胞次滿度時，將本發明的明膠添加至培養基。一具體實例中，當細胞過滿度時，將本發明的明膠添加至培養基。一具體實例中，當細胞分化後已達到滿度時，將本發明的明膠添加至培養基。換言之，一具體實例中，當細胞於分化培養基中已達到滿度時，將本發明的明膠添加至培養基。一具體實例中，於P4之後至少5天，較佳為於P4之後10天，更佳為於P4之後15天，將本發明的明膠添加至培養基。一具體實例中，於P4之後5至30天，較佳為於P4之後10至25天，更佳為於P4之後15至20天，將本發明的明膠添加至培養基。

於另一具體實例中，本發明之顆粒性材料為陶瓷材料。

於一具體實例中，本發明之陶瓷材料為磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO₃)、硫酸鈣(CaSO₄)、或氫氧化鈣(Ca(OH)₂)等顆粒、或其組合。

磷酸鈣顆粒之實例包括，惟不限於，羥基磷灰石(HA，Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)、磷酸三鈣(TCP，Ca₃(PO₄)₂)、α-磷酸三鈣(α-TCP，(α-Ca₃(PO₄)₂)、β-磷酸三鈣(β-TCP，β-Ca₃(PO₄)₂)、四磷酸鈣(TTCP，Ca₄(PO₄)₂O)、八磷酸鈣(Ca₈H₂(PO₄)₆.5H₂O)、非晶質磷酸鈣(Ca₃(PO₄)₂)、羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、羥基磷灰石/四磷酸鈣(HA/TTCP)等。

於一具體實例中，本發明之陶瓷材料包含羥基磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、硫酸鈣(CaSO₄)或其組合或由其組成。於一具體實例中，本發明之陶瓷材料包含羥基磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-TCP)、硫酸鈣(CaSO₄)或其組合或由其組成。

於若干具體實例中，該顆粒性材料包含陶瓷材料，較佳為包含磷酸鈣，較佳為羥基磷灰石(HA)及/或β-磷酸三鈣(β-TCP)，更佳為磷酸鈣顆粒。

於特定具體實例中，該陶瓷材料包含磷酸鈣，較佳為羥基磷灰石(HA)及/或β-磷酸三鈣(β-TCP)，更佳為磷酸鈣顆粒。

於一具體實例中，本發明之陶瓷顆粒為羥基磷灰石(HA)顆粒。於另一具體實例中，本發明之陶瓷顆粒為β-磷酸三鈣(β-TCP)顆粒。於另一具體實例中，本發明之陶瓷顆粒為羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)顆粒。換言之，於一具體實例中，本發明之陶瓷顆粒為羥基磷灰石與β-磷酸三鈣顆粒之混合物(稱為HA/β-TCP顆粒)。於一具體實例中，本發明之陶瓷顆粒由羥基磷灰石顆粒與β-磷酸三鈣顆粒組成(稱為HA/β-TCP顆粒)。

於一具體實例中，顆粒性材料較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，係呈顆粒、粉末或珠粒之形式。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，係呈多孔顆粒、粉末或珠粒之形式。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，為多孔陶瓷材料。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，為粉末顆粒。於獨特具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，係呈多孔顆粒形式。於另一獨特具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，係呈粉末形式。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，未被構造為形成預定的3D形狀或框架，例如立方體。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，不是3D框架。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為陶瓷材料，不具預定的形狀或框架。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，不具立方體之形式。

於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，大於約50μm，較佳為大於約100μm。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑大於約50μm，較佳為大於約100μm。

於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑至少約50μm，較佳為至少約100μm，更佳為至少約150μm。於另一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑至少約200μm，較佳為至少約250μm，更佳為至少約300μm。

於另一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑最多約2,500μm，較佳為最多約2,000μm，更佳為最多約1,500μm。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑最多約1,000μm、900μm、800μm、700μm或600μm。

於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑範圍從約50μm至約1,500 μm，較佳為從約50μm至約1,250μm，更佳為從約100μm至約1,000μm。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑範圍從約100μm至約800μm，較佳為從約150μm至約700μm，更佳為約從200μm至約600μm。

於一具體實例中，HA/β-TCP顆粒具有平均直徑範圍從約50μm至約1,500μm，較佳為從約50μm至約1,250μm，更佳為約從100μm至約1,000μm。於一具體實例中，HA與β-TCP顆粒具有平均直徑範圍從約100μm至約800μm，較佳為從約150μm至約700μm，更佳為從約200μm至約600μm。

實際上，顆粒的平均大小與直徑之測量可利用此項技藝中已知之任何適當方法或由其調適之方法進行。此類方法之非限制性實例包括原子力顯微鏡術(AFM)、穿透式電子顯微鏡術(TEM)、掃描式電子顯微鏡術(SEM)、動態光散射(DLS)。

於一具體實例中，顆粒中HA與β-TCP間之比率(HA/β-TCP比率)範圍從約0/100至約100/0，較佳為從約10/90至約90/10，更佳為從約20/80至約80/20。於一具體實例中，顆粒中HA/β-TCP之比率範圍從約30/70至約70/30，從約35/65至約65/35，或從約40/60至約60/40。

於一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為0/100，即，該等顆粒為β-三磷酸鈣顆粒。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為100/0，即，該等顆粒為羥基磷灰石顆粒。於一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約10/90。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約90/10。於一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約20/80。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約80/20。於一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約30/70。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約70/30。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約35/65。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約65/35。於一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約40/60。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為約60/40。於另一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比為約50/50。

於一具體實例中，顆粒中之HA/β-TCP比率為100/0、99/1、98/2、97/3、96/4、95/5、94/6、93/7、92/8、91/9、90/10、89/11、88/12、87/13、86/14、85/15、84/16、83/17、82/18、81/19、80/20、79/21、78/22、77/23、76/24、75/25、74/26、73/27、72/28、71/29、70/30、69/31、68/32、67/33、66/34、65/35、64/36、63/37、62/38、61/39、60/40、59/41、58/42、57/43、56/44、55/45、54/46、53/47、52/48、51/49、50/50、49/51、48/52、47/53、46/54、45/55、44/56、43/57、42/58、41/59、40/60、39/61、38/62、37/63、36/64、35/65、34/66、33/67、32/68、31/69、30/70、29/71、28/72、27/73、26/74、25/75、24/76、23/77、22/78、21/79、20/80、19/81、18/82、17/83、16/84、15/85、14/86、13/87、12/88、11/89、10/90、9/91、8/92、7/93、6/94、5/95、4/96、3/97、2/98、1/99或0/100。

根據一具體實例，顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒之量，係最適於對生物材料提供3D結構。於一具體實例中，對150cm²的容器，以範圍從約0.1cm³至約5cm³，較佳為約0.5cm³至約3cm³，更佳為約1cm³至約3cm³的濃度添加顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒。於一較佳具體實例中，對150cm²的容器，以約1.5cm³至約3cm³的濃度添加顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒。

於一具體實例中，以每mL培養基範圍從約7.10^-3至7.10^-2cm³的濃度添加顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒。於一具體實例中，以每cm²容器範圍從約3.3.10^-3至3.3.10^-2cm³的濃度添加顆粒性材料，較佳為陶瓷顆粒，更佳為HA、β-TCP及/或HA/β-TCP顆粒。

於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，係於細胞分化後，添加至培養基中。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，係於細胞次滿度時添加。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，係於細胞過滿度時添加。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，係於細胞分化後已達到滿度時添加。換言之，於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料係於細胞在分化培養基中已達到滿度時添加。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，係於P4之後至少5天，較佳為於P4之後10天，更佳為於P4之後15天添加。於一具體實例中，顆粒性材料，較佳為本發明之陶瓷材料，係於P4之後5至30天，較佳為於P4之後10至25天，更佳為於P4之後15至20天添加。

於另一具體實例中，本發明之顆粒性材料為去礦質之骨骼基質(DBM)。

於一具體實例中，DBM為動物起源，較佳為哺乳動物起源，更佳為人類起源。於獨特具體實例中，人類DBM係經由研磨得自人類捐贈者的皮質骨獲得。

獲得DBM之方法為此項技藝中已知。例如，人類骨骼組織首先可於一夜之間以丙酮浴(例如，約99%)脫脂，然後在去礦質水中洗滌約2小時。去鈣可於室溫，攪動下，經由浸漬於HCL(例如，約0.6N)中約3小時(每克骨骼20mL溶液)進行。然後，去礦質之骨粉可於約2小時期間以去礦質水沖洗並控制pH值。若pH太酸，可於攪動下以磷酸鹽溶液(例如，約0.1M)緩衝DBM。最後，可將DBM乾燥並稱重。可遵循此領域中已知之技術，例如以約25kGray，通過伽馬射線輻照，對DBM進行滅菌。

於一具體實例中，DBM為同種異體。於一具體實例中，DBM為同質的。於另一具體實例中，DBM為異質。

於一具體實例中，DBM呈顆粒形式，於本文中稱為去礦質之骨骼基質顆粒或DBM顆粒。於一具體實例中，DBM顆粒具有平均直徑範圍從約50至約2,500μm，較佳為約50μm至約1500μm，更佳為約50μm至約1,000μm。於一具體實例中，DBM顆粒具有平均直徑範圍從約100μm至約1,500μm，更佳為約150μm至約1,000μm。於一具體實例中，DBM顆粒具有平均直徑範圍從約200至約1,000μm，較佳為約200μm至約800μm，更佳為約300μm至約700μm。

於一具體實例中，本發明之多維結構包含細胞外基質。於一具體實例中，本發明之細胞外基質衍生自分化之細胞，較佳為分化之ASC。於一具體實例中，本發明之細胞外基質係經由細胞產生的，較佳為ASC。於一具體實例中，術語“產生的”與“分泌的”旨在彼此替代。

本文所用之術語“細胞外基質”(ECM)意指非細胞之三維巨分子網絡。ECM之基質成分以及細胞黏著受體相互結合，從而形成細胞在組織或根據本發明之多維結構中駐留之複雜網絡。

於一具體實例中，本發明之細胞外基質包含膠原蛋白、蛋白多醣/醣胺聚醣、彈性蛋白、纖維結合素、層連結蛋白及/或其他醣蛋白。於獨特具體實例中，本發明之細胞外基質包含膠原蛋白。於另一獨特具體實例中，本發明之細胞外基質包含蛋白多醣。於另一獨特具體實例中，本發明之細胞外基質包含膠原蛋白與蛋白多醣。於一具體實例中，本發明之細胞外基質包含生長因子、蛋白多醣、分泌因子、細胞外基質調節因子與醣蛋白。

於一具體實例中，將本發明之細胞(較佳為ASC)與顆粒性材料(較佳為明膠、DBM或陶瓷材料)埋入細胞外基質中。

於特定具體實例中，步驟1)係於選自包含生長因子、轉錄因子、骨原因子、訊息傳遞路徑之活化劑及/或抑制劑及其混合物之組群之一或多種外源因子存在下進行。

本文所用之生長因子意欲意指調節細胞功能的許多態樣(包括存活、增殖、移動與分化)之多肽。於若干具體實例中，根據本發明之生長因子包括，惟不限於，BMP、EGF、FGF、HGF、IGF-1、OPG、SDF-1α、TGFB-1、TGFB-3、VEGFA與VEFGB。於特定具體實例中，根據本發明之生長因子包括，惟不限於，IGF-1、TGFB-1、TGFB-3、VEGFA與VEFGB。

本文所用之轉錄因子意欲意指控制是否將給定基因轉錄成其相應RNA之多肽。於若干具體實例中，根據本發明之轉錄因子包括，惟不限於AKT、ANG、ANGPT1、ANGPTL4、ANPEP、COL18A1、CTGF,CXCL1、 EDN1、EFNA1、EFNB2、ENG、EPHB4、F3、FGF1、FGF2、FN1、HIF1A、ID1、IL6、ITGAV、JAG1、LEP、MMP14、MMP2、NRP1、PTGS1、SERPINE1、SERPINF1、TGFB1、TGFBR1、THBS1、THBS2、TIMP1、TIMP2、TIMP3、VEGFA、VEGFB、VEGFC。

於特定具體實例中，根據本發明之轉錄因子包括，惟不限於，SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5。

本文所用之骨原因子意欲意指促進成骨生成及/或削弱骨破壞之多肽。於若干具體實例中，根據本發明之骨原因子涉及骨骼發育。根據本發明之骨原因子之非限制性實例包括OPG、SDF-1α、BMPR-1A、BMP-2、FGFR-1、FGFR-2、TWIST-1、CSF-1、IGFR、RUNX2、TGFBR-1。

實際上，於適當培養條件下，該等細胞分泌細胞外基質並合成促進組織再生及/或組織修復，特別是促進成骨生成及/或軟骨生成之多肽與核酸。該等多肽與核酸可視為是用於組織再生及/或組織修復，包括成骨生成及/或軟骨生成特性之生物標記，可經由上文中所述方法，於多肽水層級/或核酸進行監測。

實際上，根據本發明組成物呈多肽之因子之含量，可經由此項技藝中已知之任何適當方法或任何從其改寫之方法進行評估。例示性地，此等生物標記之表現或不表現(無表現)可於核酸量或多肽量監測。於核酸量監測生物標記的方法之非限制性實例涵蓋使用特異性引子對從培養細胞所抽取之RNA進行RT-PCR(qPCR)分析。於多肽量監測生物標記之方法之非限制性實例涵蓋使用標記特異性抗體之免疫螢光法分析，如西方墨漬法或ELISA；螢光激發細胞分選(FACS)與酵素分析。

於若干具體實例中，用於生產根據本發明組成物之方法進一步包含下述步驟：

3)純化於步驟2)所抽取之RNA；及視需要

4)冷凍乾燥步驟3)所得到之經純化之RNA。

於特定具體實例中，該miRNA內容物包括細胞miRNA及/或胞外體衍生之miRNA。

於若干具體實例中，至少部分miRNA係細胞的。實際上，可經由從此項技藝之說明中已知之任何適當方法或從其改寫之方法單離細胞之miRNA。可參考，例如，Chapter 7：Extraction,Purification,and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells of Molecular Cloning：a laboratory manual(Russell and Sambrook；2001；Cold Spring Harbor Laboratory)。例示性地，可經由市售套組，舉例而言，例如RNeasy迷你套組(Qiagen®)或MagMax mirVana Total RNA單離套組(Applied Biosystems®)單離miRNA。

於一具體實例中，該細胞miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-664a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1291、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-103b、hsa-miR-1273g-3p、 hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-3609、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-4461、hsa-miR-196a-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-663b、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-454-3p及其組合之組群。

於一具體實例中，該細胞miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-let-7d-5p、hsa- miR-199b-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-320a、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-1291、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-4461、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-3609、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-4485-3p及其混合物之組群。

於一態樣中，本發明係有關一種醫藥組成物，其包含於顆粒性材料存在下由分化細胞之培養物得到之細胞miRNA，其中該等細胞與顆粒性材料係埋於細胞外基質中。於若干具體實例中，該醫藥組成物包含於顆粒性材料存在下由骨原分化細胞之培養物得到之細胞miRNA，其中該等細胞與顆粒性材料係埋於細胞外基質中。於特定具體實例中，該醫藥組成物包含於顆粒性材料存在下由骨原分化MSC(特別是骨原分化之ASC)之培養物得到之細胞miRNA，其中該等細胞與顆粒性材料係埋於細胞外基質中。於若干具體實例中，該醫藥組成物包含於明膠存在下由骨原分化之ASC之培養物得到之細胞miRNA，其中該等細胞與明膠係埋於細胞外基質中。於特定具體實例中，該醫藥組成物包含於陶瓷材料存在下由骨原分化之ASC之培養物得到之細胞miRNA，其中該等細胞與陶瓷材料係埋於細胞外基質中。

於特定具體實例中，至少部分miRNA係由該等細胞所分泌，較佳為呈胞外體或類胞外體囊泡形式。於該等具體實例中，至少部分miRNA內容物係包含於胞外體或類胞外體囊泡中。於若干具體實例中，至少部分miRNA內容物係胞外體miRNA。

本文所用之術語“胞外體”係指由身體內幾乎所有細胞類型所分泌之胞吞所衍生之奈米囊泡。該等胞外體包含蛋白質、核酸(特別是miRNA)、與脂質。實際上，該等胞外體可根據此項技藝之說明中已知或從其改寫之任何適當方法單離及/或純化。例示性地，該胞外體區分可經由從培養基之差速離心；聚合物沈澱；高效液相層析法(HPLC)單離。從培養基差速離心法之非限制性實例可包括下述步驟：

-以約300×g至約500×g的速度離心10至20分鐘，以去除細胞；

-以約1,500×g至約3,000×g的速度離心10至20分鐘，以去除死細胞；

-以約7,500×g至約15,000×g的速度離心20至45分鐘，以去除細胞碎片；

-以約100,000×g至約200,000×g的速度進行一或多次超速離心30至120分鐘，使胞外體沉澱。

單離胞外體之替代方法可利用商業套組，舉例而言，例如，exoEasy Maxi Kit(Qiagen®)或Total Exosome Isolation Kit(ThermoFisher Scientific®)。

於若干具體實例中，該等胞外體或類胞外體囊泡具有平均直徑範圍從約25nm至約150nm，較佳為約30nm至120nm。於本發明之範圍內，措辭“約25nm至約150nm”包括25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145與150nm。

於一具體實例中，該等胞外體miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR- 210-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-5096、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-138-5p、 hsa-miR-223-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-7847-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-369-5p及其組合之組群。

於一具體實例中，該等胞外體miRNA係選自包含hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-5096、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-4668-5p、 hsa-miR-660-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-495-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-3648、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-1273a、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-655-3p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-1237-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-663a、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-5787、hsa-miR-6089、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-miR-3960、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-6087、hsa-miR-92a-1-5p及其混合物之組群。

於一態樣中，本發明係有關一種醫藥組成物，其包含於顆粒性材料存在下由分化細胞之培養物得到之胞外體，其中該等細胞與顆粒性材料係埋於細胞外基質中。於若干具體實例中，該醫藥組成物包含於顆粒性材料存在下由骨原分化細胞之培養物得到之胞外體，其中該等細胞與顆粒性材料係埋於細胞外基質中。於特定具體實例中，該醫藥組成物包含於顆粒性材料存在下由骨原分化MSC(特別是骨原分化之ASC)之培養物得到之胞外體，其中該等細胞與顆粒性材料係埋於細胞外基質中。於若干具體實例中，該醫藥組成物包含於明膠存在下由骨原分化ASC之培養物得到之胞外體，其中該等細胞與明膠係埋於細胞外基質中。於特定具體實例中，該醫藥組成物包含在陶瓷材料存在下由骨原分化ASC之培養物得到之胞外體，其中該等細胞與陶瓷材料係埋於細胞外基質中。

於另一態樣中，本發明亦有關一種作為藥劑用途之組成物，特別是用於預防及/或治療組織疾病。

於另一態樣中，本發明亦有關一種作為藥劑用途之組成物，特別是用於預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病。

本發明亦有關一種用於預防及/或治療組織疾病之套組，其包含根據本發明之醫藥組成物與給予該醫藥組成物之方式。

本發明亦有關一種用於預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病之套組，其包含根據本發明之醫藥組成物與給予該醫藥組成物之方式。

於若干具體實例中，給予根據本發明醫藥組成物之方式包括，惟不限於，注射器、導管、套管針、貼劑、敷料、藥鏟、杯子、噴霧器等。

於若干具體實例中，該套組進一步包含用於預防及/或治療組織疾病之一或多種附加活性成分。於若干具體實例中，該套組進一步包含用於預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病之一或多種附加活性成分。此等活性成分之非限制性實例可為生長因子、轉錄因子、骨原因子、抗癌劑、抗生素、免疫治療劑、化學治療劑等。

於若干具體實例中，該一或多種附加活性成分旨在於根據本發明醫藥組成物給藥之前、同時或之後給予。

圖1：顯示正常氧氣(21% O₂)下，不存在(曲線1)或存在2.5μg/ml(曲線2)與25μg/ml(曲線3)NVD002-胞外體之HDFa增殖圖[以存活率(DO)表示]。

圖2：顯示從圖1計算出之不存在(曲線1)或存在2.5μg/ml(曲線2)與25μg/ml(曲線3)NVD002-胞外體之HDFa進展速度之線性迴歸圖表。結果以於24小時與32小時之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。^oo：負對照組與2.5μg/ml間之統計差異。

圖3：顯示缺氧(1% O₂)下，不存在(曲線1)或存在2.5μg/ml(曲線2)與25μg/ml(曲線3)NVD002-胞外體之HDFa增殖圖[以存活率(DO)表示]。

圖4：顯示從圖3所計算之不存在(曲線1)或存在2.5μg/ml(曲線2)與25μg/ml(曲線3)NVD002-胞外體之HDFa進展速度之線性迴歸圖。結果以於32小時與48小時之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。***、****：負對照組與2.5μg/ml間之統計差異。

圖5：顯示胞外體對RANKL媒介的蝕骨細胞形成影響之圖。在補充1% FBS、25ng/mL人類MCSF、+/- 100ng/mL人類RANKL、與+/-胞外體之培養基中培養蝕骨細胞前驅體(CD14 19-10)；於D8進行TRAP染色。使用Mann Whitney檢定(Statview軟體)測定諸處理與Plus RANKL對照組間之統計顯著性差異。**：p<0.01；***：p<0.005。

圖6：顯示胞外體對蝕骨細胞存活率影響之圖。將成熟蝕骨細胞從CD14+細胞(CD14 19-10)分化出來，於補充1% FBS、25ng/mL人類MCSF、100ng/mL人類RANKL、+/-胞外體之培養基中培養48小時。於添加處理後48小時進行TRAP染色。使用曼懷特尼檢定(Statview軟體)測定處理及Plus RANKL對照組間之統計顯著性差異。

圖7A至圖7Q：顯示於不同培養條件下，骨原與血管新生基因之表現。(MD)代表分化培養基；(MD+SCL)為硬骨素存在下之分化培養基；(MD+SCL+胞外體)代表硬骨素和NVD003-衍生之胞外體存在下之分化培養基。

圖8A至圖8Q：顯示於不同培養條件下，亦即，於10μg/ml、25μg/ml或75μg/ml NVD003-衍生之胞外體存在下，骨原與血管新生基因之表現。水平線顯示細胞於增殖培養基中之基礎表現量。C+顯示細胞於骨分化培養基中之表現量。

圖9為不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體情況下，人類骨肉瘤細胞H143B增殖之圖。該增殖以相對於細胞與胞外體共培養時間之存活率(DO)表示。

圖10為人類骨肉瘤細胞H143B於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體情況下，增殖喪失之線性迴歸圖。結果以於各時間點之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。**：p<0.01；***：p<0.005；****：p<0.0001；-：無統計差異。

圖11為人類骨肉瘤細胞H143B於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體情況下增殖之圖。該增殖以相對於細胞與胞外體共培養時間之存活率(DO)表示。

圖12為人類骨肉瘤細胞H143B於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體情況下，增殖喪失之線性迴歸圖。結果以於各時間點之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。*：p<0.05；**：p<0.01；-：無統計差異。

圖13為人類黑色素瘤細胞A375於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體情況下增殖之圖。該增殖以相對於細胞與胞外體共培養時間之存活率(DO)表示。

圖14為人類黑色素瘤細胞A375於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體情況下，增殖喪失之線性迴歸圖。結果以於各時間點之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。*：p<0.05；**：p<0.01；****：p<0.0001；^oo：p<0.01；^oooo：p<0.0001；-：無統計差異。

圖15為人類黑色素瘤細胞A375於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體情況下增殖之圖。該增殖以相對於細胞與胞外體共培養時間之存活率(DO)表示。

圖16為人類黑色素瘤細胞A375於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體情況下，增殖喪失之線性迴歸圖。結果以於各時間點之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。***：p<0.005；****：p<0.0001；^oooo：p<0.0001；-：無統計差異。

圖17為人類神經膠母細胞瘤細胞U87於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體情況下增殖之圖。該增殖以相對於細胞與胞外體共培養時間之存活率(DO)表示。

圖18為人類神經膠母細胞瘤細胞U87於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體情況下，增殖喪失之線性迴歸圖。結果以於各時間點之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。*：p<0.05；****：p<0.0001；^oooo：p<0.0001；-：無統計差異。

圖19為人類神經膠母細胞瘤細胞U87於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體情況下增殖之圖。該增殖以相對於細胞與胞外體共培養時間之存活率(DO)表示。

圖20為人類神經膠母細胞瘤細胞U87於不存在(黑色曲線)或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)與25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體情況下，增殖喪失之線性迴歸圖。結果以於各時間點之活細胞vs負對照組(無胞外體)之百分比表示。***：p<0.005；****：p<0.0001；^oooo：p<0.0001；-：無統計差異。

實施例

茲參照下述實施例進一步說明本發明。

實施例1：根據本發明之胞外體miRNA(miRNA混配物)之生產

1.材料與方法

1.1 hASCs之單離

於知情同意書與血清學篩選後，遵循科爾曼(Coleman)技術經由抽脂術收集腹部中之人類皮下脂肪組織。

迅速從接踵而來的脂肪組織中單離人類脂肪組織衍生的幹細胞(hASCs)。可將脂肪組織抽吸物貯存於+4℃ 24至72小時或於-18℃更長時間。

首先，為了品質管制之目的，單離小部分脂肪組織抽吸物，並測量脂肪組織抽吸物之剩餘容量。然後，經由於HBSS中製備之膠原蛋白酶溶液(NB 1,Serva Electrophoresis® GmbH,Heidelberg,Germany)(最終濃度為~8U/mL)消化分解脂肪組織抽吸物。用於消化分解之酵素液容量為脂肪組織容量的兩倍。消化分解係於37℃±1℃進行50至70分鐘。於15至25分鐘後進行第一次間歇性搖動及於35至45分鐘後進行第二次。經由添加MP培養基(增殖培養基或生長培養基)終止消化分解。MP培養基包含補充5%人類血小板裂解液(hPL)(v/v)之DMEM培養基(4.5 g/L葡萄糖與4mM Ala-Gln；Sartorius Stedim Biotech®,Gottingen,Germany)。DMEM係標準培養基，含有鹽類、胺基酸、維生素、丙酮酸鹽與葡萄糖，並以碳酸鹽緩衝劑緩衝及具有生理pH(7.2至7.4)。所使用之DMEM含有Ala-Gln。人類血小板裂解液(hPL)為用於刺激間葉幹細胞(例如hASCs)活體外生長的生長因子之豐富來源。

將經消化分解的脂肪組織離心(500×g，10分鐘，20℃)並移除上清液。將沉澱的基質血管部份(SVF)再懸浮於MP培養基中，然後通過200至500μm之篩網過濾器。將經過濾之細胞懸浮液第二次離心(500×g，10分鐘，20℃)。使含hASCs之沉澱物再懸浮於MP培養基中。可保留一小部分細胞懸浮液用於細胞計數，並將全部剩餘之細胞懸浮液用於接種一個75cm²之T培養瓶(稱為繼代培養P0)。進行細胞計數(僅供報告)，俾使估計接種細胞之數量。

單離步驟後一天(第一天)，從75cm² T培養瓶中移除生長培養基。以磷酸鹽緩衝液潤洗細胞三次，然後將新鮮製備之MP培養基添加於培養瓶中。

1.2 人類脂肪組織衍生的幹細胞之生長與擴增

於增殖階段期間，將hASCs繼代培養4次(P1、P2、P3與P4)，俾使得到足夠量之細胞供隨後處理步驟用。

於P0與第四繼代培養(P4)間，將細胞培養於T培養瓶並提供新鮮MP培養基。當滿度達到

70%與

100%時，使細胞進行繼代培養(目標滿度：80至90%)。使來自批次1的所有細胞培養接受者同時進行繼代培養。於各次繼代培養中，以不含動物成分之重組細胞解離酵素TrypLE(Select 1X；75cm²培養瓶為9mL或150cm²培養瓶為12mL)將細胞從其培養容器中分離。於37℃±2℃進行TrypLe之消化分解5至15分鐘，並利用添加MP培養基予以終止。

然後，將細胞離心(500×g，5分鐘，20℃)，再懸浮於MP培養基中。匯集所收集之細胞，俾使保證同質之細胞懸浮液。於再懸浮後，進行細胞計數。

於P1、P2與P3繼代培養中，接著將剩餘細胞懸浮液於MP培養基中稀釋至適當細胞密度並接種於較大之組織培養表面。此等步驟中，以容量15mL之細胞懸浮液接種75cm²之培養瓶，而以容量30mL之細胞懸浮液接種150cm²之培養瓶。於每一繼代培養，接種0.5×10⁴與0.8×10⁴個細胞/cm²間之細胞。於不同繼代培養間，每3至4天更換一次培養基。從一捐贈者至另一捐贈者之細胞行為與生長速率可能稍微不同。因此，兩次繼代培養間之持續時間以及兩次繼代培養間培養基調換之次數可能從一捐贈者至另一捐贈者有所不同。

1.3 骨原性分化

於繼代培養P4(即，第四次繼代培養)，將細胞第二次離心並再懸浮於MD培養基(分化培養基)中。再懸浮後，第二次計數細胞，然後於MD培養基中稀釋至適當細胞密度，接種容量70mL之細胞懸浮液於150cm²培養瓶中，並供給骨原MD培養基。依照此方法，細胞係於第四次繼代培養後直接培養於骨原MD培養基中。因此，當細胞尚未達到滿度時，添加骨原MD培養基。

骨原MD培養基係由補充地塞米松(1μM)、抗壞血酸(0.25mM)與磷酸鈉(2.93mM)之增殖培養基(DMEM、Ala-Gln、hPL 5%)組成。

從一捐贈者至另一捐贈者之細胞行為與生長速率可能稍微不同。因此，骨原分化步驟之持續時間以及繼代培養間培養基調換之次數可能從一捐贈者至另一捐贈者有所不同。

1.4 細胞之多維誘導

觀察到培養瓶中細胞達到滿度及若出現形態變化以及至少一個骨樣小結(即，於骨骼組織成熟前形成之未礦化之骨骼基質有機部分)時，開始進行ASC之多維誘導。

a)明膠(NVD002生物材料)存在下之3D-誘導

暴露於骨原MD培養基後，於含融合單層黏附之骨原細胞之培養容器中，緩慢且均勻地撒上明膠顆粒(Cultispher®-S,Percell Biolytica®,Astorp,Sweden)，就150cm²容器而言，濃度為1.5cm³。

將細胞維持於MD培養基中。多維誘導期間，每3至4天進行規律之培養基調換。小心進行彼等培養基之調換，以防止明膠顆粒之移除及形成結構。相對應之生物材料稱為NVD002。

b)HA/β-TCP(NVD003生物材料)存在下之3D-誘導)

-暴露於骨原MD培養基後，於含融合單層黏附之骨原細胞之培養容器中，緩慢且均勻地撒上HA/β-TCP顆粒(比例為60/40)：就150cm²培養瓶(Biomatlante®,France)而言，為3cm³。

使細胞維持於MD培養基中。於多維誘導期間，每3至4天進行規律之培養基調換。小心地進行彼等培養基之調換，以防止陶瓷材料顆粒之移除與形成結構。相對應之生物材料稱為NVD003。從所得生物材料回收RNA之含量，特別是miRNA之含量，其構成miRNA混配物。

1.5 miRNA之內容物

a)RNA抽取

從生物檢體中進行mRNA單離。使用miRNeasy套組Mastermix(Qiagen®,Hilden,Germany)，遵循廠商實驗流程，抽取mRNA。以Nanodrop(ThermoFisher®,Waltham,Massachusetts,USA)測定RNA濃度。為了評估試樣品質，使用RNA微微晶片Agilent® Bioanalyzer(Agilent®,Santa Clara,CA,USA)分析2μL之RNA。每條件製備三個生物複製本。使用TruSeq® Stranded Total RNA Library Prep(RS-122-2001,Illumina®,San Diego,CA,USA)產生長鏈RNA資料庫，短鏈RNA資料庫係使用SMARTer® smRNA-Seq套組(635030,Takara Bio®,Kusatsu,Shiga,Japan)。

使用NextSeq® 500(75-bp單端讀取)(Illumina®,San Diego,CA,USA)進行定序，每個長鏈RNA資料庫產生大約2千6百萬個讀取。

b)定量RT-PCR(qRT-PCR)

為了量化miRNA表現，使用qScript miRNA cDNA合成套組(Quanta Biosciences®)，將50ng RNA反轉錄成為cDNA，然後使用Perfecta SYBR Green Super Mix(Quanta Biosciences®)三重複進行qRT-PCR。於Applied Biosystems 7900 HT檢測系統(Applied Biosystems®)進行熱循環。使用Delta-Delta Ct法將數據標準化為miR-16-5p與U6短鏈核RNA。

c)胞外體純化

藉由以很高速度(~100,000×g)將胞外體、小的細胞外囊泡及甚至蛋白質之聚集體沉澱前，可經由增加離心速度將較大之“污染物”首先沉澱排除，因此胞外體即可經由差速離心從培養基中單離。

簡言之，收集培養基並經由於4℃，400×g(5分鐘)，然後2,000×g(20分鐘)之離心，隨後於4℃，12,000×g離心45分鐘以排除死細胞與細胞碎片進行預澄清。然後，使上清液通過0.22-μm過濾器(Millipore®)。於4℃，以110,000×g使上清液超離心120分鐘，接著於4℃用磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)，以110,000×g洗滌胞外體沉澱物120分鐘(Optima XPN-80 Ultracentrifuge,Beckman Coulter®)。拋棄上清液，以Qiazol溶解胞外體沉澱物並貯存於-80℃供進一步分析。

2.結果

a)以明膠(NVD002)3D-誘導後所得miRNA之鑑定

表13：得自純化胞外體的miRNA之鑑定

表14：細胞miRNA之鑑定

表15：相較於2D培養之得自NVD002生物材料之胞外體miRNA量

表16：相較於2D培養之得自NVD002生物材料之細胞miRNA量

b)以HA/β-TCP(NVD003)3D-誘導後所得miRNA之鑑定

表17：得自純化胞外體的miRNA之鑑定

表18：細胞miRNA之鑑定

表19：相較於2D培養之NVD003生物材料之胞外體miRNA量

表20：相較於2D培養之NVD003生物材料之細胞miRNA量

實施例2：NVD002-衍生之胞外體之皮膚傷口重建特性

於一細胞株：HDFa(人類皮膚纖維母細胞)模式中研究NVD002-衍生的胞外體之活體外潛在功能性影響。

於96孔培養盤中，37℃、5% CO₂、正常氧(21% O₂)或缺氧(1% O₂)下，使2.5與25μg/ml得自3位捐贈者之NVD002-衍生之胞外體(如實施例1中，骨原分化與於明膠存在下3D-誘導之ASC)與HDFa細胞株，共培育長達72小時。共培育30分鐘至48小時後，於最少5個不同時間點，進行細胞存活率測試(CellTiter-Glo Cell viability Assay)，以評估HDFa之增殖。CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay係根據定量所呈現ATP之量，決定培養物中活細胞數量之均質檢測法，ATP量表示代謝活性細胞之存在。實驗以三重複進行。

經由配對t檢定及以龐費洛尼(Bonferroni)事後檢定之二因子變異數分析，測定組(具常態分佈)間之統計上之顯著性差異。非常態分佈之數據，使用克拉斯卡-瓦立斯(Kruskal-Wallis)檢定分析。使用Prism GraphPad 2(NIH)進行統計檢定。P值<0.05視為具顯著性。

正常氧下，與NVD002-衍生之胞外體培養之HDFa細胞之增殖曲線(圖1之曲線2與3)，顯示比不與胞外體培養之對照細胞(曲線1)稍微較高量級之存活率。此外，注意到使用最低劑量之胞外體(2.5μg/ml vs 25μg/ml)效果更為顯著(圖1)。

計算進展速度曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml胞外體培養之HDFa細胞皆具較高之進展速率。觀察到與2.5及2.5μg/ml之NVD002所衍生胞外體共培養24h及32h/48h時之HDFa細胞有顯著較高之存活率(p<0.01)(圖2)。

缺氧下，與NVD002所衍生胞外體培養之HDFa細胞之增殖曲線(圖3之曲線2與3)，顯示比不與胞外體培養之對照細胞(曲線1)較高之存活率。此外，注意到使用最低劑量之胞外體(2.5μg/ml vs 25μg/ml)效果更為顯著(圖3)。

計算進展速度曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml之胞外體培養之HDFa細胞皆有較高之增殖速率。可觀察到與25及2.5μg/ml之NVD002所衍生胞外體共培養24h及32h/48h時之HDFa細胞有顯著較高之存活率(p<0.01)(圖4)。

總之，NVD002所衍生之胞外體可加速活體外人類皮膚纖維母細胞細胞株之增殖。此等結果提示，可用NVD002所衍生之胞外體完成皮膚之修復，包括例如糖尿病傷口癒合。

實施例3：活體外評估蝕骨細胞生成之抑制作用

1. NVD003-衍生之胞外體(miRNA混配物)對蝕骨細胞成熟與活性抑制之影響

1.1 NVD003-衍生之胞外體對蝕骨細胞前驅體分化之影響

a)RANKL存在下之蝕骨細胞生成

使用來自人類單核細胞之活體外蝕骨細胞分化實驗流程。人類CD14+單核細胞係從健康自願者之末梢血液中單離，並與“法國血站(Etablissement Français du Sang)”協議取得。

經由Ficoll-Hypaque離心單離末梢血液之單核細胞後，分選單核細胞(CD14+細胞)(MACS®,MiltenyiBiotec)。於M-CSF與RANKL(RANKL培養基，“加RANKL”對照組)存在下，將新鮮單離之前驅體分化為蝕骨細胞。不含RANKL的培養基中之細胞作為負對照組(M-CSF培養基，“無RANKL”對照組)。分化時間為8天。於96孔培養盤中進行蝕骨細胞之生成。

於D0，將前驅體(CD14+)接種於補充1% FBS、25ng/mL人類MCSF +/- 100ng/mL人類RANKL之培養基中，並添加50與100μg/ml之胞外體之24孔培養盤中，然後培育2小時(為細胞貼壁之最少時間)。於第4天與第7天更換培養基。所有處理與對照均以三重複進行。

於第8天進行TRAP染色。決定各槽中含多於3個細胞核之TRAP陽性細胞數。

如圖5所示，於胞外體存在下，觀察到平均蝕骨細胞數之強烈劑量依賴性增加。經由得自該3位捐贈者之胞外體所誘導的平均增加百分比為50μg/mL時之280.70±31.10與100μg/mL時之486.93±18.44。

b)缺少RANKL +/-硬骨素之蝕骨細胞生成

人類CD14+單核細胞係從健康自願者之末梢血液中單離，並與“法國血站”協議取得。經由Ficoll-Hypaque離心單離末梢血液單核細胞後，分選單核細胞(CD14+細胞)(MACS®,Miltenyi Biotec)。將新鮮單離之前驅體(CD14+)培養於含或不含胞外體及/或硬骨素之M-CSF培養基(補充1% FBS與25ng/mL M-CSF之培養基)中。於RANKL培養基(補充1% FBS、25ng/mL M-CSF與100ng/mL RANKL之培養基)中之細胞作為正對照組。於96孔培養盤中進行蝕骨細胞生成。

於D0，將前驅體(CD14+)接種於50μL補充1% FBS、25ng/mL人類M-CSF +/- 100ng/mL人類RANKL之培養基中。然後，添加胞外體及/或硬骨素。

所有處理與對照均以二重複進行。第4天與第7天更換培養基(及處理)。於第8天進行TRAP染色。決定各孔中含多於3個細胞核的TRAP陽性細胞之數量。

缺少RANKL下，無蝕骨細胞形成。於10ng/mL或100ng/mL硬骨素存在下，無蝕骨細胞形成。缺少RANKL下，胞外體與硬骨素之組合不能更誘導蝕骨細胞之形成。

1.2 NVD003-衍生之胞外體對成熟蝕骨細胞之影響(細胞毒性)

人類CD14+單核細胞係從健康自願者之末梢血液中單離，並與“法國血站(Etablissement Français du Sang)”協議取得。從末梢血液中單離蝕骨細胞前驅細胞。經由Ficoll-Hypaque離心單離末梢血液單核細胞後，分選單核細胞(CD14+細胞)(MACS®,Miltenyi Biotec)。於M-CSF與RANKL(“加RANKL”對照組)存在下，將新鮮單離之前驅體分化5至6天(取決於捐贈者之CD14+細胞)成為蝕骨細胞。無RANKL培養基中之細胞作為負對照組(“無RANKL”對照組)。分化時間為8天。於96孔培養盤中進行蝕骨細胞之生成。

於D0，將前驅體(CD14+)接種於補充1% FBS、25ng/mL人類M-CSF +/- 100ng/mL人類RANKL之50μL培養基中，培育2小時(細胞貼壁之最少時間)。

在正對照組中觀察到多核細胞時，更新培養基。所有處理與對照均以三重複進行。

添加NVD003-衍生的胞外體48小時後，進行TRAP染色。測定各槽中含有3個細胞核以上的TRAP陽性細胞之數量。

如圖6所示，經以胞外體處理，每孔之平均蝕骨細胞數未顯著改變。使用50μg/mL與100μg/mL兩種測試濃度處理均顯示無效果(抑制百分比分別為3.34%與9.15%)。

2. NVD003-衍生之胞外體(miRNA混配物)對促進成骨生成之影響

2.1 NVD003-衍生之胞外體對ASC骨分化之影響

將第5繼代培養(P5)之脂肪組織衍生的幹細胞置於0.1mL增殖培養基(MP)(於5% hPL存在下)之96孔培養盤中約2天。然後，移除MP並以PBS潤洗細胞兩次。將細胞置於增殖培養基(MP)或骨分化培養基(MD)、MD+硬骨素(SCL)100ng/ml或MD+硬骨素(SCL)100ng/ml+NVD003-衍生之胞外體100μg/ml中10天，5天後更換培養基。此外，將細胞置於增殖培養基(MP)中，作為負對照組。

培養10天後，將細胞置於Qiazol溶解試劑(Qiagen®,Hilden,Germany)中，以供RNA單離，用於骨原基因之qRT-PCR。從細胞溶解物中抽取總RNA。根據廠商指示，使用附加DNase消化分解管柱之Rneasy迷你套組(Qiagen®,Hilden,Germany)純化RNA。使用分光光度計(Spectramax 190,Molecular Devices®,California,USA)確定RNA之品質與數量。使用RT² RNA第一股套組(Qiagen®,Hilden,Germany)，從0.5μg之總RNA合成cDNA，以用於骨原與血管新生基因之經由客製化PCR陣列(客製化人類骨原與血管新生RT² Profiler Assay-Qiagen®,Hilden,Germany)之表現趨勢。使用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems®)與SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen®,Hilden,Germany)檢測擴增產物。根據△△CT方法得到量化。將各個試樣之最終結果標準化至三種持家基因(ACTB、B2M與GAPDH)之平均表現量。實驗以三重複進行。

圖7A至圖7Q顯示ASC置於骨分化培養基(MD)、MD+100ng/ml SCL與MD+100ng/ml SCL+100μg/ml NVD003-衍生之胞外體中之骨原基因表現。結果呈平均值+/- SD顯示，為相較於增殖培養基之誘導倍數。

出乎意外地，於MD中培養ASC並未誘導所有測試骨原基因之表現。相較於增殖培養基中之ASC，發現骨原與血管新生基因MMP、ITGA1、HIF1a、FGF1、ANG、EDN1、TWIST1與ICAM1之過度表現。注意到SCL不影響骨原基因之表現。對照之下，胞外體之共培養顯示骨骼發育因子[例如RUNX2(圖7A)、TWIST1(圖7B)、BMPR1A(圖7C)]、生長因子FGF1(圖7E)、細胞細胞外基質黏著因子[如，ITGA1(圖7G)與ICAM1(圖7H)]、血管新生因子[如，MMP2(圖7I)、HIF1a(圖7J)、ANG(圖7K)、EDN1(圖7L)、EFNA1(圖7M)、THBS1(圖7N)]、及轉錄因子[SMAD4(圖7P)與SMAD5(圖7Q)]之過度表現。胞外體之共培養顯示骨骼發育因子TFGb2(圖7D)、生長因子VEGFA(圖7F)、及轉錄因子SMAD2(圖7O)未過度表現。

總之，相較於單獨骨分化培養基或骨分化培養基+硬骨素，濃度100μg/ml之NVD003-衍生之胞外體可增強ASC於骨分化培養基及含硬骨素(100ng/ml)之骨分化培養基中骨原與血管新生基因之表現。

2.2 NVD003-衍生之胞外體對成骨細胞前驅體(BM-MSCs)之影響

使用從人類間葉幹細胞之骨胚細胞生成之模式。根據供應商建議融化間葉幹細胞。接種細胞並培養於由供應商所建議培養基之培養瓶中以增殖細胞(RoosterBio®,KT-001)。

融化4天後，使用胰蛋白酶-EDTA將人類MSC分離並計數。以每槽3.5x10⁴個細胞接種，並於含補充1% FBS之DMEM培養基之96孔培養盤中單層培養4天(接種當天指定為第4天)。於DMEM培養基中培養4天後，將細胞置於基礎培養基[DMEM 1% FBS+抗壞血酸(50μg/mL)與b-甘油磷酸(10mM)]、分化培養基(正對照組)[DMEM 1% FBS+抗壞血酸(50μg/mL)與b-甘油磷酸(10 mM)、地塞米松(10-8M)與維生素D3(10-8M)]、或基礎培養基與NVD003-衍生之胞外體中(處理之第一天為“第0天”)。於第4天、第7天與第11天更換培養基及處理。

由於使用75μg/mL之胞外體處理需要對儲備溶液(濃度約200μg/mL)進行約1：3之稀釋，因此乃進行於分化培養基中用以1：3稀釋的PBS之對照組以及於基礎培養基中用以1：3稀釋的PBS之對照組。所有處理與對照均以二重複進行。

於第7天及第14天使用Qiazol溶解試劑(Qiagen®,Hilden,Germany)將細胞溶解。針對各種情況，將三重複匯集以提供1個細胞溶解物(總共於第7天與第14天收集13個細胞溶解物)。各個細胞溶解物之容量為250μL。以qRT-PCR分析該等細胞溶解物。

從細胞溶解物中抽取總RNA。根據廠商指示，使用附加DNase消化分解管柱之Rneasy迷你套組(Qiagen®,Hilden,Germany)純化RNA。使用分光光度計(Spectramax 190,Molecular Devices®,California,USA)測定RNA之品質與數量。使用RNA Clean & ConcentratorTM-5套組(ZYMO RESEARCH®,Irvine,USA)濃縮mRNA。使用RT² RNA第一股套組(Qiagen®,Hilden,Germany)，從0.5μg之總RNA合成cDNA，以用於骨原與血管新生基因之經由客製化骨原與血管新生RT²陣列(Qiagen®,Hilden,Germany)之表現趨勢。使用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems®)與SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen®,Hilden,Germany)檢測擴增產物。根據△△CT方法得到量化。將各試樣之最終結果標準化至三種持家基因(ACTB、B2M與GAPDH)之平均表現量。

圖8A至圖8Q顯示BM-MSC於增殖培養基中(水平線)、BM-MSC於骨分化培養基中7天(C+)及BM-MSC於增殖培養基+NVD003-衍生之胞外體(10、20與75μg/ml)中7天之血管新生與骨原基因之表現。可能由於所關注基因之功能而得到不同結論。

如於正對照組(骨分化培養基)中所觀察，若干基因在基礎情況下(增殖培養基)可明確地被誘導，例如骨骼發育因子RUNX2(圖8A)與TWIST-1(圖8B)及血管新生因子EDN1(圖8C)及EFNA1(圖8D)。如於正對照組中所發現，其他基因則似乎不受處理之影響，例如骨骼發育因子BMPR1a(圖8E)、EGFR(圖8F)、TGFβ1、TGFβ2、CSF1(未顯示)；生長因子FGF-1(圖8G)及，VEGFA(圖8H)；細胞-細胞外基質黏著因子，例如，ITGA1(圖8I)、ICAM-1(圖8J)、與ITGA3(未顯示)；血管新生因子HIF-1(圖8K)、THBS1(圖8L)、ENG(圖8M)、EFNB2(圖8N)、與MMP2(未顯示)；轉錄因子SMAD2(圖8O)、SMAD4(圖8P)、與SMAD5(未顯示)。

最後，胞外體處理後並未誘導瘦體素之表現，儘管其於骨分化後過度表現(參見圖8Q)。

總之，以範圍從10μg/ml至75μg/ml的濃度之NVD003-衍生之胞外體處理BM-MSC 7天，發現除了HIF1a以外，均顯示與BM-MSC於骨分化培養基中類似之骨原與血管新生表現。

實施例4：NVD002-衍生與NVD003-衍生之胞外體對癌症細胞之活體外效果

1.材料與方法

a)細胞與胞外體

H143B人類骨肉瘤細胞得自ATCC®(CRL-8303^TM)，A375人類黑色素瘤細胞得自ATCC®(CRL-1619^TM)及U87人類神經膠母細胞瘤細胞得自ATCC®(HTB-14^TM)。NVD002-衍生與NVD003-衍生之胞外體如實施例1中所揭示獲得。

b)增殖分析

於37℃、5% CO₂下，使2.5與25μg/ml得自3位捐贈者之NVD003-衍生及NVD002-衍生之胞外體，與上述三細胞株於96孔培養盤中共培育72小時。共培育30分鐘至48小時後，於最少5個不同時間點，進行細胞存活率測試(使用PROMEGA®之CellTiter-Glo® Cell viability Assay)，以評估標靶細胞之增殖。PROMEGA®之CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay係根據定量所呈現ATP之量，測定培養中之活細胞數量之均質檢測方法，ATP量表示代謝活性細胞之存在。實驗以三重複進行。

c)統計分析

經由配對t檢定及以龐費洛尼事後檢定之單因子變異數分析，測定諸組(具常態分佈)間統計上之顯著性差異。非常態分佈之數據使用克拉斯卡-瓦立斯檢定分析。使用Prism GraphPad 2(NIH)進行統計檢定。統計顯著性如下：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.005；****：p<0.0001。

2.結果

2.1 胞外體對人類骨肉瘤細胞(H143B)之活體外效果

a)NVD002-衍生的胞外體之效果

與NVD002-衍生之胞外體培養的H143B細胞之增殖曲線顯示比不與NVD002-衍生之胞外體培養的對照細胞稍微較低之存活率量。此外，注意到使用最高劑量之NVD002-衍生之胞外體(25μg/mlvs2.5μg/ml)有更為顯著之效果(圖9)。

計算增殖曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml之NVD002-衍生之胞外體培養之細胞皆具較低之增殖速率。顯著較低之存活率信號則發現於與胞外體之與2.5及25μg/ml在1、24與32小時之培育以及2.5μg/ml在1、6、24與32小時之培育共培養之細胞中(p<0.01)(圖10)。

儘管不與NVD002-衍生之胞外體一起培養之細胞有較高之斜率，惟其仍與較高存活率量相關。

b)NVD003-衍生之胞外體之效果

與NVD003-衍生之胞外體一起培養之H143B細胞之增殖曲線顯示比不與胞外體培養之對照細胞稍微較低之存活率量(圖11)。

計算增殖曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml二者之NVD003-衍生之胞外體培養之細胞皆有較低之增殖速率。顯著較低之存活率信號則發現於與NVD003-衍生之胞外體之與2.5μg/ml在6、24、32與48小時之培育以及25μg/ml僅在24與48小時之培育所共培養之細胞中(p<0.01)(圖12)。

儘管發現不與胞外體培養之細胞有較高之斜率，惟其仍與較高存活率量相關。

c)結論

總之，NVD002-衍生與NVD003-衍生之胞外體可活體外降低人類骨肉瘤細胞株之增殖，並觀察到劑量反應之效果。

2.2胞外體對人類黑色素瘤細胞(A375)之活體外效果

a)NVD002-衍生之胞外體之效果

儘管發現不與胞外體及與2.5μg/ml NVD002-衍生之胞外體培養之細胞間有類似之趨勢，惟與25μg/ml NVD002-衍生之胞外體培養之A375細胞之增殖曲線顯示比不與胞外體培養之對照細胞較低之存活率量(圖13)。

計算增殖曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml NVD002二者衍生之胞外體培養之細胞皆具較低之增殖速率。顯著較低之存活率信號則發現於與NVD002-衍生之胞外體以25μg/ml於1、24、32與48小時之培育共培養之細胞中(p<0.01)。此外，發現於以25μg/ml NVD002-衍生之胞外體處理之細胞中，24、32與48小時時，對2.5μg/ml顯著較低之存活率信號(p<0.01)(圖14)。

b)NVD003-衍生之胞外體之效果

與2.5及25μg/ml NVD003-衍生之胞外體培養之A375細胞之增殖曲線顯示比不與胞外體培養之對照細胞較低之存活率量。此效果在25μg/ml NVD003-衍生之胞外體比在2.5μg/ml更為顯著(圖15)。

計算增殖曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml之NVD003-衍生之胞外體培養之細胞皆有較低之增殖速率。顯著較低之存活率信號發現於與NVD003-衍生之胞外體之與25μg/ml在各時間點之培育所共培養之細胞中。顯著較低之存活率信號發現於與NVD003-衍生之胞外體之與2.5μg/ml在6、24、32與48小時所共培養之細胞中(p<0.05)。顯著較低之存活率信號則發現於與 NVD003-衍生之胞外體之與25μg/ml對2.5μg/ml NVD003-衍生之胞外體，在1、24、32、48小時所共培養之細胞中(p<0.05)(圖16)。

c)結論

總之，NVD002-衍生與NVD003-衍生之胞外體可活體外降低人類黑色素瘤細胞株之增殖，並觀察到劑量反應之效果。

2.3 胞外體對人類神經膠母細胞瘤細胞(U87)之活體外效果

a)NVD002-衍生的胞外體之效果

儘管發現無胞外體與2.5μg/ml胞外體培養之細胞間有類似之趨勢，惟與25μg/ml胞外體培養之U87細胞之增殖曲線顯示比不與胞外體培養之對照細胞較低之存活率量(圖17)。

計算增殖曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml之胞外體培養之細胞皆有較低之增殖速率，而25μg/ml之效果比2.5μg/ml更為顯著。顯著較低之存活率信號發現於與2.5μg/ml胞外體之僅於6與32小時(p<0.05)及25μg/ml胞外體之於各個培育時間點所共培養之細胞中(p<0.0001)。此外，發現與25μg/ml NVD002-Exo培養之U87對2.5μg/ml在各個測試時間點之顯著較低之存活率信號(p<0.0001)(圖18)。

b)NVD003胞外體之效果

與2.5及25μg/ml胞外體培養之U87細胞之增殖曲線顯示比不與胞外體培養之對照細胞較低之存活率量。此效果於25μg/ml胞外體比於2.5μg/ml更為顯著(圖19)。

計算增殖曲線之線性迴歸。發現與2.5及25μg/ml之胞外體培養之細胞皆有較低之增殖速率。顯著較低之存活率信號發現於與胞外體之與2.5μg/ml於6、24、32與48小時所共培養之細胞中(p<0.0001)。此外，發現與25μg/ml NVD003-Exo培養之U87對2.5μg/ml在各個測試時間點之顯著較低之存活率信號(p<0.0001)(圖20)。

c)Conclusion

總之，由NVD002-衍生及NVD003-衍生之胞外體可降低活體外人類神經膠母細胞瘤細胞株之增殖。

Claims

一種醫藥組成物，其包含(i)有效治療量之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12任一者中之至少三種miRNA，及(ii)醫藥上可接受之載劑。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該至少三種miRNA係選自包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-4485-3p及其組合之組群。
如請求項1所述之醫藥組成物，其中該至少三種miRNA係選自包含hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-3687、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-664b-3p及其組合之組群。
如請求項1至3中任一項所述之醫藥組成物，其中該至少三種miRNA包含hsa-miR210-3p及/或hsa-miR-409-3p。
如請求項1至4中任一項所述之醫藥組成物，其中該組成物經乾燥及/或經滅菌。
一種請求項1至5中任一項所述之醫藥組成物之用途，其係作為藥劑。
如請求項6所述之醫藥組成物之用途，其係用於預防及/或治療組織疾病。
如請求項7所述之醫藥組成物之用途，其中該組織係選自包含骨骼組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、結締組織、神經組織與脂肪組織之組群。
如請求項6至8中任一項所述之醫藥組成物之用途，其係用於預防及/或治療骨骼疾病及/或軟骨疾病。
如請求項6至8中任一項所述之醫藥組成物之用途，其係用於預防及/或治療皮膚疾病。
如請求項7所述之醫藥組成物之用途，其中該組織疾病係選自包含先天性皮膚成形不全；燒傷；癌症，包含乳癌、皮膚癌與骨癌；腔室症候群(CS)；表皮分解性水皰症；巨大型先天性痣；下肢之缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；輻射後病灶；及潰瘍，包含糖尿病性潰瘍，較佳為糖尿病性足部潰瘍；關節炎；骨折；骨脆弱；卡費氏症；先天性假關節；顱部變形；顱部畸形；癒合延遲；骨骼之浸潤性疾病；骨肥大症；骨礦物質密度流失；代謝性骨質流失；成骨不全；骨質軟化症；骨壞死；骨質缺乏症；骨質疏鬆症；佩吉特氏症；假關節；骨硬化病灶；脊柱裂；脊椎滑脫症；椎弓斷裂；軟骨發育不全；肋軟骨炎；內生軟骨瘤；拇趾僵硬；髖關節髖臼韌帶撕裂；剝離性骨軟骨炎；骨軟骨發育不良；多發性軟骨炎等之組群。
如請求項6至11中任一項所述之醫藥組成物之用途，其係用於組織重建。
一種用於產生包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA的組成物之方法，該方法包括下述步驟：

1)培養包含(i)能進行組織分化的活細胞與(ii)顆粒性材料之組合物以獲得含有由該細胞分泌的細胞外基質之多維結構，其中該細胞具有組織再生及/或組織修復性質，其中該等細胞與顆粒性材料包埋於細胞外基質中，且其中該多維結構包含RNA內容物，該RNA內容物包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA；

2)抽取步驟1)中產生之RNA內容物，特別是miRNA內容物。
如請求項13所述之方法，其中該miRNA內容物包括細胞miRNA及/或胞外體衍生之miRNA。
如請求項13或14所述之方法，其中該顆粒性材料係選自包含：

-有機材料，包括去礦質之骨骼基質、明膠、瓊脂/瓊脂糖、褐藻酸幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原蛋白、彈性蛋白或類彈性蛋白胜肽(ELP)、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維結合素、蛋白多醣、硫酸肝素蛋白多醣、玻尿酸、多醣、層連結蛋白、纖維素衍生物、或其組合；

-陶瓷材料，包括磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO₃)、硫酸鈣(CaSO₄)、或氫氧化鈣(Ca(OH)₂)等之顆粒、或其組合；

-聚合物，包括聚酸酐、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚環氧乙烷/聚乙二醇(PEO/PEG)、聚乙烯醇(PVA)、反丁烯二酸酯類聚合物舉例而言，例如，聚丙烯反丁烯二酸酯(PPF)或聚丙烯反丁烯二酸酯乙二醇共聚物(P(PF-co-EG))、寡(聚反丁烯二酸乙二醇酯)(OPF)、聚異丙基丙烯醯胺(PNIPPAAm)、聚(醛古洛糖醛酸酯)(PAG)、聚乙烯吡咯烷酮(PNVP)、或其組合；

-凝膠，包括自組裝寡肽凝膠、水凝膠材料、微凝膠、奈米凝膠、顆粒性凝膠、水凝膠材料、搖變減黏凝膠、乾凝膠、敏感凝膠、或其組合；

-奶精；

及其任何組合之組群。
如請求項15所述之方法，其中該顆粒性材料為明膠或陶瓷材料。
一種組成物，其包含可利用根據請求項13至16任一項之方法製得之選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12之至少三種miRNA。