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WO2023132337A1 - 蛍光染色方法 - Google Patents

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Publication number
WO2023132337A1
WO2023132337A1 PCT/JP2023/000031 JP2023000031W WO2023132337A1 WO 2023132337 A1 WO2023132337 A1 WO 2023132337A1 JP 2023000031 W JP2023000031 W JP 2023000031W WO 2023132337 A1 WO2023132337 A1 WO 2023132337A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
tissue
integer
staining
cell sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/000031
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
聡 野島
英一 森井
悠記 鈴木
逸史 箕浦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GORYO CHEMICAL Inc
University of Osaka NUC
Original Assignee
GORYO CHEMICAL Inc
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GORYO CHEMICAL Inc, Osaka University NUC filed Critical GORYO CHEMICAL Inc
Priority to EP23737288.3A priority Critical patent/EP4328586A1/en
Priority to JP2023572477A priority patent/JPWO2023132337A1/ja
Priority to CN202380012225.6A priority patent/CN117480390A/zh
Priority to US18/566,145 priority patent/US20240288345A1/en
Publication of WO2023132337A1 publication Critical patent/WO2023132337A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C07D311/90—Xanthenes with hydrocarbon radicals, substituted by amino radicals, directly attached in position 9
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
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    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/302—Stain compositions
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent staining method for specifically staining substances containing glycol groups in tissues or cells.
  • Histopathological diagnosis is a medical practice that microscopically diagnoses histological morphological changes in lesions, and is an important diagnostic technique that is fundamentally involved in determining the patient's treatment policy.
  • a histopathological diagnosis is made by a trained pathological diagnostician examining a slide glass prepared by staining a sliced tissue with hematoxylin-eosin staining (HE staining).
  • HE staining hematoxylin-eosin staining
  • observation using special staining methods such as PAS staining, PAM staining, and Alcian Blue staining, which stain specific structures in the tissue, is used in the definitive diagnosis of many diseases. becomes valid.
  • Patent Document 1 proposes a method of staining substances having aldehyde groups in cells in sliced tissue sections, but the method of Patent Document 1 makes it difficult to perform clear three-dimensional imaging of these.
  • One of the objects of the present invention is a fluorescent staining method compatible with PAS staining, which is a special staining method for staining substances containing a glycol group, such as structures containing a large amount of polysaccharides (mucus, basement membrane, etc.). To develop a fluorescence staining method that enables three-dimensional observation.
  • the present inventors focused on the excitation wavelength of the fluorescent probe used in the method of Patent Document 1, and because the excitation wavelength is short, the tissue penetration of the excitation light is low, and as a result, clear three-dimensional imaging Based on the prediction that (3D imaging) would be difficult, fluorescent staining was attempted using various compounds with longer excitation wavelengths. As a result, when using a compound with a fluorescein skeleton, special staining compatible with PAS staining is possible, and by combining with tissue clearing technology and 3D imaging technology, clear three-dimensional observation is possible. I found out to be
  • a method for fluorescently staining a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample comprising a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof and the tissue or contacting with a cell sample.
  • R 1 represents a carboxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group or a halogen atom
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group (OH group), a halogen atom or an optionally substituted linear or branched alkyl group
  • X represents a hydrazide group, a semicarbazide group, a thiosemicarbazide group, a hydrazino group, a hydroxylamino group, an amino group or an alkylamino group
  • Y is absent or represents an amide group, an ester group, a carbamide group, a thiourea group, a carbamate group, a carbonate group or an oxygen atom
  • L is - (linear or branched alkylene) n- (n is an integer of 1 to 10), - (linear or branche
  • a method for detecting a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample wherein the substance containing a glycol group in the tissue or cell sample is fluorescently stained by the fluorescent staining method. and measuring fluorescence from the compound.
  • a method for visualizing tissue or cells containing a substance containing a glycol group comprising fluorescently staining a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample by the fluorescent staining method. and measuring and imaging fluorescence from the compound.
  • a method for determining a tissue and/or lesion containing a large amount of a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample wherein A method is provided that includes fluorescently staining a substance containing a glycol group, and determining that the tissue and/or lesion is present at the stained site.
  • a method for screening therapeutic agents for diseases associated with tissue or cell lesions containing a substance containing a glycol group comprising administering a candidate therapeutic agent to an individual suffering from the disease.
  • a fluorescent staining composition containing a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof and used for visualizing a tissue or cell containing a substance containing a glycol group is provided.
  • a composition for diagnosing diseases associated with tissue or cell lesions which contains a substance containing a glycol group, which contains a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof. be.
  • the compound represented by the above general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as compound (I)) is used as a staining agent to specifically fluorescently stain a substance containing a glycol group. be able to.
  • the fluorescent staining method of the present invention with tissue clearing technology and 3D imaging technology, the substance existing deep in the tissue is stained, and the tissue, cell, or structure containing the substance is visualized in three dimensions. can be done.
  • 1 is a graph showing fluorescence spectra before and after addition of aldehyde to DAF-2 and compound 2 (A is DAF-2, B is compound 2).
  • 2 shows photographs of goblet cells of colonic epithelium stained with DAF-2 or Compound 2.
  • FIG. The upper part of the photograph shows the stain used.
  • the photographs show, in order from the top, the result of staining with each staining agent, the result of DAPI staining, and the result of merging them.
  • 2 shows photographs of the renal glomerular basement membrane stained with DAF-2 or compound 2.
  • FIG. The upper part of the photograph shows the stain used.
  • FIG. 3 shows the results of 3D imaging of colon mucosal epithelium using both DAF-2 staining and the CUBIC method.
  • FIG. 3 shows the results of 3D imaging of colon mucosal epithelium using both staining with compound 2 and the CUBIC method.
  • FIG. 3 shows the results of fluorescent staining of a frozen sliced specimen of human large intestine mucosal tissue.
  • FIG. 4 shows the results of clearing and fluorescently staining human large intestine mucosa tissue.
  • FIG. 3 shows the results of clearing human large intestine mucosa tissue and fluorescently staining it with FAM hydrazide.
  • FIG. 3 shows the results of clearing human large intestine mucosa tissue and fluorescently staining it with FAM hydrazide.
  • FIG. 3 shows the results of clearing human large intestine mucosa tissue and fluorescently staining it with FAM hydrazide.
  • FIG. 2 shows the results of clearing and fluorescent staining of human large intestine mucosal tissue using FAM hydrazide and Compound 1.
  • FIG. FIG. 3 shows the results of clearing and fluorescently staining colonic tissue specimens taken from humans with ulcerative colitis using FAM hydrazide.
  • FIG. 3 shows the results of clearing and fluorescently staining colonic tissue specimens taken from humans with ulcerative colitis using FAM hydrazide.
  • FIG. 3 shows the results of clearing and fluorescently staining colonic tissue specimens taken from humans with ulcerative colitis using FAM hydrazide.
  • FIG. 2 shows the results of clearing and fluorescently staining colon tissues using FAM hydrazide, HE staining, and PAS staining. It is a figure explaining the ellipticity and curvature of a crypt.
  • 7 is a graph showing the results of analyzing crypt torsion using volume, ellipticity, and curvature as parameters for all cases.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of analysis of crypt torsion using volume, ellipticity, and curvature as parameters for cases diagnosed as non-specific enteritis by a pathologist.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of three-dimensional morphological observation of crypt torsion.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of 3D tissue staining of human large intestine mucosal tissue.
  • FIG. 4 shows the results of 3D tissue staining of fungal hyphae.
  • a fluorescent staining method is a method for fluorescently staining a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample, wherein the compound (I) or a salt thereof is brought into contact with the tissue or cell sample. Including.
  • the fluorescent staining method of this embodiment may further comprise oxidizing glycol groups in the tissue or cell sample to generate aldehyde groups before contacting compound (I) or a salt thereof with the tissue or cell sample. .
  • the fluorescent staining method of this embodiment may further include clearing the tissue or cell sample by treating it with a clearing agent.
  • R 1 represents a carboxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group or a halogen atom
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group (OH group), a halogen atom or an optionally substituted linear or branched alkyl group
  • X represents a hydrazide group, a semicarbazide group, a thiosemicarbazide group, a hydrazino group, a hydroxylamino group, an amino group or an alkylamino group
  • Y is absent or represents an amide group, an ester group, a carbamide group, a thiourea group, a carbamate group, a carbonate group or an oxygen atom
  • L is - (linear or branched alkylene)
  • alkyl group or the “alkyl” portion in other groups means a linear or branched saturated hydrocarbon group, preferably a saturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. , for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, sec-butyl group, t-butyl group, isobutyl group, pentyl group, isopentyl group, 2,3-dimethylpropyl group , and hexyl groups, and more preferably C1-5 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, sec-butyl, t -butyl group, isobutyl group, pentyl group, isopentyl group, or 2,3-dimethylpropyl group.
  • C1-3 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl and i-propyl groups, most preferably methyl or ethyl groups.
  • An "alkylene group” is a divalent group obtained by removing one hydrogen atom from the above alkyl group.
  • alkoxy group refers to a group ((alkyl group)--O-- group) that binds to the aforementioned alkyl group via an oxygen atom, and the alkyl group moiety is as defined above. be.
  • an alkoxy group can have from 1 to 6 carbon atoms in the alkyl group portion.
  • Alkoxy groups include, for example, methoxy, ethoxy, 1-propyloxy, 2-propyloxy, 2-methyl-1-propyloxy, 2-methyl-2-propyloxy, 2,2-dimethyl -1-propyloxy group, 1-butyloxy group, 2-butyloxy group, 2-methyl-1-butyloxy group, 3-methyl-1-butyloxy group, 2-methyl-2-butyloxy group, 3-methyl-2- butyloxy group, 1-pentyloxy group, 2-pentyloxy group, 3-pentyloxy group, 2-methyl-1-pentyloxy group, 3-methyl-1-pentyloxy group, 2-methyl-2-pentyloxy group , 3-methyl-2-pentyloxy group, 1-hexyloxy group, 2-hexyloxy group, 3-hexyloxy group and the like.
  • the C1-6 alkoxy group is preferably a C1-5 alkoxy group, more preferably a methoxy group, ethoxy group, n-propyloxy group, i-propyloxy group, n-butyloxy group, sec-butyloxy group, t -butyloxy, isobutyloxy, pentyloxy, isopentyloxy, and 2,3-dimethylpropyloxy.
  • halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom and a bromine atom, more preferably a fluorine atom, or a chlorine atom.
  • substituents on alkyl groups or on the alkyl portion of other groups include halogen atoms, hydroxyl groups, dialkylamino groups, thiol groups, alkylthiol groups, sulfonyl groups, alkylsulfonyl groups, alkoxy groups, cyclic ethers, A carboxyl group, an alkylcarbonyl group, an alkoxycarbonyl group, an alkoxycarbonylamino group, an alkylcarbonyloxy group, an alkylaminocarbonyl group, an alkylcarbonylamino group, and a carbonylamino group can be mentioned.
  • the number of substituents is, for example, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1, 2, or It can be three.
  • R 1 is preferably a carboxyl group, an alkyl group or an alkoxy group, more preferably a carboxyl group, a methyl group or a methoxy group.
  • p is preferably an integer from 0 to 2, more preferably 1;
  • R2 is preferably a hydrogen atom.
  • R3 is preferably a hydrogen atom.
  • R4 is preferably a hydrogen atom or a fluorine atom.
  • R5 is preferably a hydrogen atom or a fluorine atom.
  • R6 is preferably a hydrogen atom.
  • R7 is preferably a hydrogen atom.
  • X is preferably a hydrazide group, a semicarbazide group, an amino group or an alkylamino group, more preferably a hydrazide group.
  • Y is preferably absent or an amide group.
  • L preferably represents a single bond or -(linear or branched alkylene) n - (n is an integer of 1 to 10).
  • the group represented by X-L-Y- may be a group selected from the following (wherein m is an integer of 1 to 6, n is 1 to 3 integer).
  • the partial structure represented by may be a structure represented by the following formula.
  • R 1 represents a carboxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group or a halogen atom
  • R 2 , R 3 , R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group (OH group), a halogen atom or an optionally substituted linear or branched alkyl group
  • R 4 and R 5 each represent a fluorine atom
  • X represents a hydrazide group, a semicarbazide group, a thiosemicarbazide group, a hydrazino group or a hydroxylamino group
  • Y is absent or represents an amide group, an ester group, a carbamide group, a thiourea group, a carbamate group, a carbonate group or an oxygen atom
  • L is - (linear or branched alkylene) n- (n is an integer of 1 to 10), - (linear or branched alkylene
  • R 1 represents an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group or a halogen atom
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group (OH group), a halogen atom or an optionally substituted linear or branched alkyl group
  • X represents an amino group or an alkylamino group
  • Y is absent
  • L represents a single bond
  • p represents an integer of 0 to 4, and when p is 2 or more, R 1 may be the same or different
  • q represents an integer of 1 to 2, when q is 2, the structures represented by (XLY) may be the same or different, and the sum of p and q is 5 or less is an integer.
  • compound (I) include the following compounds.
  • salts of compound (I) include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts, and the like.
  • Base addition salts include, for example, lithium salts, sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts and other metal salts; ammonium salts, methylamine salts, dimethylamine salts, dicyclohexylamine salts, tris(hydroxymethyl)aminomethane salts.
  • N,N-bis(hydroxyethyl)piperazine salts 2-amino-2-methyl-1-propanol salts, ethanolamine salts, N-methylglucamine salts, L-glucamine salts, triethylamine salts, piperidine salts, morpholine salts or salts with basic amino acids such as lysine, ⁇ -hydroxylysine and arginine.
  • Acid addition salts include, for example, mineral salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, and phosphates; , oxalate, acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, malate, succinate, benzoate, mandelate, cinnamate, lactate, glycolate , glucuronate, ascorbate, nicotinate, salicylate, and trifluoroacetate.
  • a glycine salt etc. can be illustrated as an amino acid salt.
  • the salts of the compounds of the present invention are not limited to these.
  • compound (I) may have one or more asymmetric carbon atoms, and may have stereoisomers such as optical isomers or diastereoisomers. All stereoisomers in pure form, any mixtures of stereoisomers, racemates, etc. are included within the scope of the present invention.
  • the compounds represented by formula (I) or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and any of these substances are included within the scope of the present invention.
  • the type of solvent that forms the solvate is not particularly limited, but solvents such as ethanol, acetone, and isopropanol can be exemplified.
  • references herein to "compound (I)” also refer to any mixture of isomers or specific stereoisomers of compound (I), even if not specified, unless it is clearly incompatible. forms, pharmacologically acceptable salts, hydrates and solvates of Compound (I), and hydrates or solvates of pharmacologically acceptable salts of Compound (I).
  • Compound (I) can be synthesized using the synthetic schemes described in Examples and synthetic methods known in the art.
  • tissue or cell sample is not particularly limited as long as it contains tissue or cells to be confirmed for the presence of a substance containing a glycol group.
  • tissue or cell sample is from a human or non-human mammal, and tissue or cells excised or excised from a human or non-human mammal can be used.
  • tissue may refer to an entire tissue or organ derived from a living organism, or a portion of a tissue or organ (eg, a tissue fragment), or may refer to an entire organism such as an experimental animal itself.
  • tissue or tissue contained in the cell sample herein does not need to have the function or structure of a generally recognized "tissue", and is therefore expected to be a specific tissue. It also includes cell clusters and cultured cells that have no structure or function. For example, it may be a tissue that may contain human cancer cells, a tissue fragment excised by cancer resection, or the like.
  • cell refers to all cells derived from living organisms. This refers to all cell specimens including cells isolated from body fluids or tissues of living organisms, and cells artificially produced by subjecting living organisms to specific experimental treatments. Such experimental treatments include formalin fixation, paraffin embedding and deparaffinization, and tissue clearing, as described below.
  • cell clusters formed by culture may be used, and such cell clusters may be stem cells and cell clusters obtained by subjecting stem cells to differentiation induction treatment.
  • a tissue or cell sample preferably has a three-dimensional structure.
  • "Three-dimensional structure” means a structure having a thickness in the three-dimensional direction. thin section) and its structure. Therefore, even if the tissue specimen has a plate-like or flattened structure, if it has a thickness that can be sufficiently distinguished from a thin section (for example, if it has a thickness of 50 ⁇ m or more, or, for example, a thickness of 500 ⁇ m or more). are contained in tissues that have a three-dimensional structure.
  • slicing a tissue may be referred to as a procedure performed using a microtome.
  • Tissues having a three-dimensional structure include not only tissue pieces and cell masses, but also organs themselves and individuals themselves.
  • the tissue or cell sample may be taken from the living body as it is, or may be pretreated.
  • a tissue or cell sample embedded in a paraffin block can be used in the method of the present invention by deparaffinizing it before staining (Satoshi Nojima et al., Scientific Reports (2017) 7:9269 reference).
  • the tissue or cell sample is treated to generate aldehyde groups by oxidizing glycol groups in the tissue or cell sample prior to contact with compound (I).
  • the fluorescent staining method according to an embodiment of the present invention may include oxidizing glycol groups in the tissue or cell sample to generate aldehyde groups before contacting compound (I) with the tissue or cell sample. good. This is because the compound (I) binds to the aldehyde group and dyes.
  • the oxidation treatment of glycol groups is already well known in the PAS dyeing method.
  • the oxidation treatment can typically be performed by treating a tissue or cell sample with an aqueous 0.5% to 1% periodic acid solution for 10 minutes or more, for example 10 minutes to 30 minutes.
  • the tissue or cell sample is a tissue or cell sample that has been cleared prior to contact with compound (I).
  • the fluorescent staining method according to embodiments of the present invention may further comprise clearing the tissue or cell sample by treating it with a clearing agent.
  • the order of clearing the tissue or cell sample and contacting Compound (I) with the tissue or cell sample is not limited, and these are performed at any appropriate timing according to the clearing treatment method and the like. can break
  • the compound (I) can be brought into contact with the tissue or cell sample before the clearing treatment, simultaneously with the clearing treatment, during the clearing treatment, or after the clearing treatment.
  • Compound (I) is capable of penetrating and staining the inside of a tissue or cell sample having a three-dimensional structure.
  • Clearing treatment can be performed by treating a tissue or cell sample with a hydrophilic or hydrophobic clearing agent, or by embedding it in hydrogel and then performing electrophoresis.
  • various methods are already widely known to those skilled in the art as methods for clearing tissue or cell samples using hydrophilic clearing agents.
  • a method known as the Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) method is preferred as the transparent treatment method in this specification (Susaki et al., (2014) Cell; 157: 726-739 Tainaka K et al., (2014) Cell; 159: 911-924.).
  • CUBIC-1 (reagent 1) is 25 wt% urea, 25 wt% N,N,N',N'-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine, and 15 wt% polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl
  • An ether/Triton X-100 mixture is prepared as an aqueous solution.
  • CUBIC-2 (reagent 2) is prepared as an aqueous solution from a mixture of 50 wt% sucrose, 25 wt% urea, and 10 wt% 2,2,'2''-nitrilotriethanol.
  • reagent 1 was mixed with distilled water 1/1 at room temperature with gentle shaking. Soak in the solution diluted to 2. It is then immersed in Reagent 1 for 3-7 days at room temperature with gentle shaking. During this period, the reagent 1 is replaced with a new one at intervals of 1 to 2 days.
  • the cells are immersed in 20-30% (w/v) sucrose-containing PBS.
  • a frozen block is prepared using an embedding agent for preparing a frozen tissue section (eg, Sakura Fine Tech Japan, Tissue Tech O.C.T. Compound), and in this state it can be stored in a ⁇ 80° C. freezer for a long period of time.
  • the cells are thoroughly washed with PBS, pretreated as necessary, and subjected to whole-mount staining using compound (I).
  • treatment using a linker is performed as necessary, and the solution is immersed in a solution obtained by diluting Reagent 2 to 1/2 with distilled water and gently shaken at room temperature. It is then immersed in Reagent 2 for 1-3 days at room temperature with gentle shaking. In this state, 3D imaging becomes possible using a fluorescence microscope.
  • CUBIC reagents in addition to CUBIC-1 and CUBIC-2 described above, various types of There are things, and they are used properly depending on the type of organ. All of these are included as CUBIC reagents applicable to the present invention.
  • the transparent processing method applicable to the present invention is not limited to the CUBIC method.
  • Other methods include using a hydrophobic clarifying agent, ⁇ BABB'' (Dodt HU et al., (2007) Nat Methods; 4:331-336. See), ⁇ 3DISCO'' (Erturk A et al., ( 2012) Nat Protocol; 7: 1983-1995.), "uDISCO” (Pan C et al., (2016) Nat Methods; 13: 859-867.) and their subtype methods, water-soluble transparent using an agent, "Scale” (Hama H et al., (2011) Nat Neurosci; 14: 1481-1488.
  • Contacting Compound (I) may be contacted with a tissue or cell sample under any appropriate conditions depending on the purpose. Typically, compound (I) is brought into contact with a tissue or cell sample by immersing the tissue or cell sample in a staining solution containing compound (I). Contact conditions such as the concentration of compound (I) in the staining solution, additives, diluent, washing solution, contact time, and contact temperature can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the reaction to form a benzimidazole structure from a diaminobenzene structure and an aldehyde is hydrogen peroxide solution (Synthesis, 2007, 4, 547-550) and ammonium chloride (Indian Journal of Chemistry, 2013, 52B, 1152-1156 , ), sodium sulfite (Chemical Papers, 2018, 72, 1265-1276) and heating conditions (Molecular Diversity, 2015, 19, 263-272).
  • the additive and dyeing conditions can be appropriately selected without being limited to the above example.
  • the tissue or cell sample can be washed by immersion in a washing solution such as PBS.
  • Substances Containing a Glycol Group are substances containing sugars.
  • Substances containing sugar include glycogen, starch, mucopolysaccharides, glyceroglycolipids, glycosphingolipids, and the like.
  • Glycol groups include, for example, ⁇ -glycol groups.
  • the fluorescence staining method according to the embodiment of the present invention can specifically stain a substance containing a glycol group, a tissue, lesion or structure containing the substance, preferably the substance (compared with other tissues or cells) and) can specifically stain abundant tissues, lesions or structures.
  • Tissues, lesions or structures containing many substances containing a glycol group include, for example, muscle (striated muscle tissue, smooth muscle tissue, myocardial tissue, etc.), mucus, mucosal epithelium, basement membrane (renal glomerular basement membrane, gastrointestinal tract mucosal basement membrane, etc.), intracytoplasmic carbohydrate granules, bacteria, fungi, parasites, and the like.
  • Examples of diseases for which fluorescent staining methods according to embodiments of the present invention are useful include inflammatory bowel disease, cancers of mucus-containing glands, glomerulonephritis, cardiomyopathy, infectious diseases, and the like. Therefore, in the present specification, the "method for fluorescent staining of a substance containing a glycol group” is appropriately referred to as the "method for fluorescent staining of a tissue and/or lesion containing a substance containing a glycol group more than other tissues or cells”. can be read as
  • inflammatory bowel disease includes, but is not limited to, ulcerative colitis, Crohn's disease, and the like.
  • cancer includes, but is not limited to, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, non-Hodgkin's lymphoma, adrenocortical carcinoma, AIDS-related cancer, AIDS-related lymphoma, pediatric Cerebellar astrocytoma, childhood cerebral astrocytoma, basal cell carcinoma, skin cancer (non-melanoma), biliary tract cancer, extrahepatic cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangiocarcinoma, bladder cancer, bone and joint cancer, osteosarcoma and malignancy fibrous histiocytoma, brain cancer, brain tumor, brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, glioma, cerebral astrocytoma/malignant glioma, ependymoma, medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumor, Visual pathway and hypothalamic gliom
  • cancers derived from glands containing mucus include non-small cell lung cancer (mucinous lung adenocarcinoma), skin cancer (extrasmammary Paget's disease), gastric cancer, small bowel cancer, colon cancer, colorectal cancer, rectal cancer cancer, breast cancer (Paget's disease of the breast), ovarian cancer, pancreatic cancer, liver cancer, gallbladder cancer and appendix cancer.
  • glomerulonephritis includes, but is not limited to, minimal change group, membranous nephropathy, mesangial proliferative nephritis, intravascular proliferative glomerulonephritis, membranous proliferative glomeruli nephritis, extravascular proliferative glomerulonephritis, sclerosing glomerulonephritis, lupus nephritis, IgA nephropathy, purpura nephritis (Henoch-schonlein purpura), anti-GBM glomerulonephritis (Goodpasture syndrome), etc. .
  • cardiomyopathy includes, but is not limited to, dilated cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, restrictive cardiomyopathy, and arrhythmogenic cardiomyopathy.
  • infectious diseases are not limited to these, but are assumed to be diseases caused by infection with the following bacteria, fungi, and parasites. That is, streptococci (group A ⁇ -hemolytic streptococci, pneumococci, etc.), Staphylococcus aureus (MSSA, MRSA), Staphylococcus epidermidis, enterococci, listeria, meningococci, gonococcus, pathogenic Escherichia coli (O157: H7, etc.), Klebsiella (Klebsiella pneumoniae), Proteus, Pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, Citrobacter, Acinetobacter, Enterobacter, Mycoplasma, Clostridium, Tuberculosis/Non-tuberculous mycobacteria, Cholera, Plague, Diphtheria, Shigella, Scarlet fever, Anthrax, syphilis,
  • a method for detecting a substance containing glycol groups in a tissue or cell sample comprising: A method is provided comprising fluorescently staining a substance and measuring fluorescence derived from compound (I).
  • the fluorescence derived from compound (I) is measured by, for example, using a fluorescence microscope, irradiating a fluorescently stained tissue or cell sample with compound (I) excitation light, and measuring the fluorescence intensity emitted by compound (I). can be done by It can be confirmed that a substance containing a glycol group exists in the site where fluorescence intensity stronger than that measured without excitation light is measured, and the abundance depends on the range and / or intensity. detectable.
  • Tissue or cell samples substances containing glycol groups, and methods for fluorescently staining such substances are as described in Section A.
  • a method for visualizing a tissue or cell containing a substance containing a glycol group wherein the substance containing a glycol group in a tissue or cell sample is visualized by the method according to section A.
  • a method is provided comprising fluorescently staining, and measuring and imaging fluorescence from compound (I).
  • Measurement and imaging of fluorescence derived from compound (I) can be performed by, for example, using a fluorescence microscope, irradiating a fluorescently-stained tissue or cell sample with excitation light of compound (I), and measuring the fluorescence intensity emitted by compound (I). and imaging the fluorescence intensity data obtained using image analysis software.
  • image analysis software known software such as Imaris, Imagej, and cellSens can be used.
  • the wavelength of the excitation light of compound (I) is within the range of about 400 nm to about 520 nm, and has excellent penetration into thick tissues or cell samples. Therefore, according to the visualization method according to the embodiment of the present invention, tissues or cells that contain a substance containing a glycol group and have a three-dimensional structure can be visualized favorably. The tissue or cells are preferably cleared.
  • Tissues or cells to which the visualization method according to the embodiment of the present invention is preferably applied include mucosal epithelium, basement membrane, and fungi.
  • mucosal epithelium e.g., small or large intestine mucosal epithelium
  • crypts tubular invaginations
  • the visualization method according to the embodiment of the present invention the morphology of individual crypts can be clearly visualized as a result of specific fluorescent staining of mucus-containing goblet cells.
  • Tissues or cells containing substances containing glycol groups and methods for fluorescently staining such substances are as described in Section A.
  • a method for determining a tissue and/or lesion containing a large amount of a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample comprising: A method is provided that includes fluorescently staining a substance containing a glycol group in a cell sample, and determining that the tissue and/or lesion is present at the stained site.
  • the present invention also provides a method for providing information for determining tissues and/or lesions in tissue or cell samples that contain a large amount of substances containing glycol groups, Provided is a method comprising fluorescently staining a substance containing a glycol group in a sample, and providing information for determining the presence of the tissue or lesion at the stained site.
  • the tissues and lesions containing many substances containing glycol groups are as described in Section A.
  • Determination of tissues and/or lesions that contain a large amount of substances containing glycol groups includes determination of whether or not the tissue or lesion exists, as well as determination of the amount, degree of symptoms, location and/or shape, etc. Any determination that can be made from two-dimensional or three-dimensional image data regarding the presence of a substance containing a group can be used.
  • Tissues and/or lesions containing a large amount of substances containing glycol groups can sometimes be determined simply from the presence or absence of staining. (location and intensity of detected fluorescence), tissue or cell sample origin, patient information, and general knowledge in the field of pathology regarding the presence pattern of substances containing glycol groups. can be done.
  • tissue or cell sample is a cancer resected tissue fragment of a cancer patient, and the lesion is cancer
  • a substance containing a glycol group that exhibits the accumulation of a substance containing a glycol group that is characteristic of cancer.
  • the presence of cancer in the tissue or cell sample can be determined by examining the position and amount of the presence of .
  • crypt torsion can be mentioned as a lesion characteristic of the disease.
  • the analysis using the method of the present invention by three-dimensionally observing the torsion of crypts, it was possible to identify a plurality of lesions specific to inflammatory bowel disease, particularly lesions characteristic to ulcerative colitis. A twist has been found in which the crypts are rolled up. Therefore, when the tissue or cell sample is colonic mucosal tissue from an individual with possible inflammatory bowel disease, the presence of the lesion can be determined by analyzing the shape of the crypts.
  • colonic mucosal tissue is subjected to the fluorescent staining method described in Section A to obtain a three-dimensional image of crypts through staining of mucus-containing goblet cells and basement membrane in the mucosal epithelium, and By three-dimensionally analyzing the shape based on the obtained three-dimensional image, it is possible to determine the presence of twisted crypts as a lesion characteristic of inflammatory bowel disease.
  • the three-dimensional analysis of the crypt shape can be performed, for example, by using image analysis software to determine the volume, ellipticity, or curvature from the three-dimensional image data of the crypt.
  • Crypt volume tends to be greater in ulcerative colitis than in non-specific colitis and Crohn's disease, and ellipticity is lower in ulcerative colitis and Crohn's disease than in non-specific colitis
  • the degree of tortuosity tends to be highest in ulcerative colitis, followed by Crohn's disease and non-specific colitis in that order.
  • the tortuosity is less than a predetermined criterion (e.g., the tortuosity in an individual with non-specific enteritis). degree reference range), it can be determined that twisted crypts are present as a lesion characteristic of inflammatory bowel disease.
  • the crypt volume, ellipticity and tortuosity as parameters the volume exceeds a predetermined standard (for example, the standard range of volume in nonspecific enteritis or Crohn's disease), and the ellipticity is a predetermined If a crypt is identified that is lower than a reference range (e.g., reference range in individuals with non-specific enteritis) and whose tortuosity is higher than a predetermined reference (e.g., reference range for tortuosity in Crohn's disease).
  • a reference range e.g., reference range in individuals with non-specific enteritis
  • a predetermined reference e.g., reference range for tortuosity in Crohn's disease
  • the score according to the degree (for example, the higher the volume, the higher the score, the lower the ellipticity, the higher the score, and the higher the curvature, the higher the score ), and if a predetermined number or more or a predetermined percentage of crypts with total scores exceeding a predetermined standard are confirmed, there is a possibility that the individual from whom the sample is derived is suffering from ulcerative colitis. It can be determined (diagnosed) that there is (or is high).
  • a method for determining the possibility that an individual has an inflammatory bowel disease comprising: Fluorescently staining a substance containing a glycol group in a colonic mucosa tissue sample derived from the individual, measuring and imaging fluorescence derived from compound (I) to obtain a three-dimensional image of crypts, and obtaining a three-dimensional image.
  • three-dimensionally analyzing the shape of the crypt based on. Three-dimensional analysis of crypt shape can be performed by quantifying or comprehensively evaluating crypt torsion using volume, ellipticity, and tortuosity as parameters, as described above.
  • a method for screening therapeutic agents for diseases associated with tissue or cell lesions containing a substance containing a glycol group wherein an individual suffering from the disease is given a therapeutic agent candidate.
  • collecting a tissue or cell sample that causes the lesion from the individual fluorescently staining a substance containing a glycol group in the tissue or cell sample by the method described in Section A; compound (I ) by measuring and imaging fluorescence derived from, and visualizing tissue or cells containing a substance containing a glycol group, and based on the image of the visualized tissue or cells containing a substance containing the glycol group, a therapeutic drug determining the candidate therapeutic efficacy.
  • Tissues or cells that cause lesions include muscle (striated muscle tissue, smooth muscle tissue, myocardial tissue, etc.), mucus, mucosal epithelium, basement membrane (renal glomerular basement membrane, gastrointestinal mucosal basement membrane, etc.), and cytoplasm.
  • Intrinsic sugar progenitor granules, bacteria, fungi, parasites and the like can be mentioned.
  • Individuals suffering from the above diseases are humans or mammals other than humans, such as experimental animals, including mice, rats, guinea pigs, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits, dogs, miniature pigs, and monkeys.
  • the dose and administration method of the therapeutic drug candidate can be appropriately set according to the therapeutic drug, individual condition, and the like.
  • a method for fluorescently staining a substance containing a glycol group in a tissue or cell sample and a method for measuring and imaging fluorescence derived from compound (I) to visualize a tissue or cell containing a substance containing a glycol group are described in A. Item and C Item.
  • the therapeutic effect of a therapeutic drug candidate is determined based on the visualized images of tissues or cells containing substances containing the glycol group. For example, in visualized images, when lesions (lesions of tissues or cells containing substances containing glycol groups) caused by the disease to be treated are alleviated or decreased compared to before administration of the therapeutic drug candidate. Alternatively, when the progression of a disease (lesion) is suppressed, it can be determined that the therapeutic drug candidate is likely (or highly likely) to have a therapeutic effect on the disease. Also, for example, if lesions associated with the disease to be treated remain unchanged or increase compared to before administration of the therapeutic drug candidate, the therapeutic drug candidate may not have a therapeutic effect on the disease. It can be determined that there is (or is high)
  • a fluorescent staining composition containing compound (I) or a salt thereof and used for visualizing tissue or cells containing a substance containing a glycol group.
  • compound (I) can specifically stain a substance containing a glycol group, and has excellent permeability into tissues or cells. Therefore, by contacting compound (I) with a tissue or cell that contains a substance containing a glycol group and is preferably cleared, the substance containing a glycol group is stained therein, and as a result, the substance Tissues or cells containing can be visualized.
  • the object to be visualized may be any tissue or cell containing a substance containing a glycol group, preferably a tissue or cell having a three-dimensional structure, more preferably a muscle (striated muscle tissue, smooth muscle tissue, myocardial tissue etc.), mucosal epithelium, basement membrane (renal glomerular basement membrane, gastrointestinal mucosal basement membrane, etc.), intracytoplasmic carbohydrate granules, bacteria, fungi, parasites, etc., and colonic mucosal epithelium (intestinal crypts) and fungi is more preferred.
  • a muscle striated muscle tissue, smooth muscle tissue, myocardial tissue etc.
  • mucosal epithelium striated muscle tissue, smooth muscle tissue, myocardial tissue etc.
  • basement membrane renal glomerular basement membrane, gastrointestinal mucosal basement membrane, etc.
  • intracytoplasmic carbohydrate granules bacteria, fungi, parasites, etc.
  • composition for fluorescent dyeing may further contain optional components such as a clarifying agent, a diluent, and a turbidity agent, if necessary.
  • the clarifying agent is preferably a hydrophilic clarifying agent.
  • composition for fluorescent staining may be in the form of a mixed liquid in which each component is mixed, or may be in the form (kit) in which each component or part of the components are individually packaged. According to the latter form, each component can be mixed by the user.
  • a diagnostic composition for diseases associated with lesions of tissues or cells containing a substance containing a glycol group including compound (I) or a salt thereof.
  • compound (I) can specifically stain a substance containing a glycol group, and has excellent permeability into tissues or cells. Therefore, by contacting compound (I) with tissue or cells that contain a substance containing a glycol group and are preferably cleared, the substance containing a glycol group is stained therein, and the tissue or cell is stained. be visualized.
  • the determination means described in D above to the visualized tissue or cell image, the presence or absence, number, incidence, etc.
  • the diagnostic composition according to the embodiment of the present invention information for diagnosing a disease accompanied by a lesion of a tissue or cell is provided through visualization of the tissue or cell containing a substance containing a glycol group.
  • AI artificial intelligence
  • diagnosis can be made by a doctor or by using artificial intelligence (AI).
  • Diagnosis by AI is performed using, for example, an image diagnosis support program that analyzes visualized tissue or cell images according to predetermined criteria and calculates the possibility of suffering from the disease based on the analysis results. obtain.
  • AI can be used to analyze visualized tissue or cell images according to predetermined criteria, and doctors can determine the possibility of suffering from the disease based on the analysis results.
  • Diseases to be diagnosed may be diseases accompanied by tissue or cell lesions containing substances containing glycol groups. Specific examples thereof include those described in Section E, preferably inflammatory bowel disease, more preferably ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • crypt tortuosity and/or degree of crypt tortuosity can be analytical criteria.
  • the diagnostic composition may further contain optional constituents such as clarifying agents, diluents, turbidity agents, etc., as necessary.
  • the clarifying agent is preferably a hydrophilic clarifying agent.
  • the diagnostic composition may be in the form of a mixed liquid in which each component is mixed, or may be in the form (kit) in which each component or part of the components are individually packaged. According to the latter form, each component can be mixed by the user.
  • p-Toluenesulfonyl chloride (30.0 g, 157 mmol) was added to a dichloromethane solution (150 mL) of compound 9 (8.01 g, 65.5 mmol) and pyridine (20 ml, 250 mmol) at 0°C, and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. .
  • the reaction solution was washed with 2M hydrochloric acid aqueous solution and distilled water, and the residue obtained by distillation under reduced pressure was recrystallized with ethanol to obtain compound 10 as white crystals (25.9 g, 92%).
  • Example 3 Fluorescence emission by DAF-2 When propionaldehyde was allowed to act on DAF-2 (product model number: SK1001-01, Goryo Kayaku), the following compound 16 was obtained. It was confirmed that compound 16 is fluorescent and the fluorescence intensity increases with the formation of the benzimidazole ring. The fluorescence of DAF-2 before reaction with aldehyde was quenched by the diaminobenzene structure, whereas the reaction product with aldehyde, compound 16, showed fluorescence (Table 1). Forming a covalent bond with an aldehyde enables detection by fluorescence emission.
  • Example 5 Staining with DAF-2 and Compound 2
  • a fluorescent probe containing a diaminobenzene structure such as DAF-2 or Compound 2
  • a frozen thin section of human colonic mucosal tissue was used as a positive control specimen, and goblet cell mucus
  • a formalin-fixed human large intestine mucosal tissue sample was thoroughly washed with PBS, immersed in 30% (w/v) sucrose-containing PBS, and then treated with Tissue Tech O.; C. T.
  • a frozen block was made using the compound. This frozen block was sliced to a thickness of 8 ⁇ m to prepare a frozen section. After washing the frozen sections with PBS, they were stained with a solution of DAF-2 (50 ⁇ M) or compound 2 (50 ⁇ M) diluted in PBS for 1 day at room temperature.
  • the cells were mounted using a water-soluble mounting medium and imaged using a confocal microscope.
  • the renal glomerular basement membrane could be clearly visualized by staining with DAF-2 and compound 2 (Fig. 3).
  • 3D imaging of the large intestine mucosal epithelium was possible by combining staining with DAF-2 or Compound 2 with the tissue clearing method using the CUBIC reagent.
  • the formalin-fixed human large intestine mucosal tissue sample was thoroughly washed with PBS, and then immersed in a solution obtained by diluting the CUBIC-L reagent to 1/2 with distilled water at 37° C. while gently shaking. After that, it was immersed in the CUBIC-L reagent and treated at 37° C. with gentle shaking, during which time the CUBIC-L was replaced with a new one every 1-2 days.
  • FIG. 4A shows a three-dimensional model of the obtained data using Bitplane's Imaris.
  • FIG. 4B shows a confocal microscope image and a three-dimensional modeled image when staining with compound 2 was similarly used in combination with the tissue clearing method using the CUBIC reagent.
  • Test Examples A to H The experimental procedures used in Test Examples A to H are described below.
  • Tissues to be stained were washed with phosphate-buffered saline (PBS), immersed in 30% (w/v) sucrose in PBS, O.D. C. T. It was frozen overnight at ⁇ 80° C. in compound (45833, Sakura Finetek). Frozen tissues were cut at a thickness of 10 ⁇ m by a cryostat (CM3050S, Leica Biosystems). The obtained cryosections were washed with PBS three times and pretreated with 0.5% periodic acid (HIO 4 ) solution (86171, MUTO PURE CHEMICALS) for 30 minutes at room temperature.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • HIO 4 0.5% periodic acid
  • Sections were washed three times with PBS and diluted in PBS FAM hydrazide 5-isomer (50 ⁇ M, 24170, BroadPharm, sometimes referred to herein as "FAM hydrazide”), Alexa Fluor 488 hydrazide (50 ⁇ M, A10436 , ThermoFisher Scientific), BDP FL hydrazide (50 ⁇ M, 11470, Lumiprobe) or fluorescein (50 ⁇ M, Wako) overnight at room temperature. Sections were then washed with PBS and images were acquired with a confocal microscope.
  • FAM hydrazide 5-isomer 50 ⁇ M, 24170, BroadPharm, sometimes referred to herein as "FAM hydrazide”
  • Alexa Fluor 488 hydrazide 50 ⁇ M, A10436 , ThermoFisher Scientific
  • BDP FL hydrazide 50 ⁇ M, 11470, Lumiprobe
  • CUBIC-L and CUBIC-R+ reagents T3740 and T3741, Tokyo Kasei Kogyo were used for tissue clearing.
  • the tissue removal procedure is briefly described below.
  • Formaldehyde-fixed tissue specimens were washed with PBS and then soaked overnight in 50% (v/v) CUBIC-L reagent (1:1 mixture of water:CUBIC-L). Furthermore, it was immersed in the CUBIC-L reagent at 37° C. for 5 or 6 days with gentle shaking. These specimens were then washed with PBS, soaked in 30% (w/v) sucrose in PBS, and O.D. C. T.
  • Staining was performed with hydrazide (50 ⁇ M), BDP FL hydrazide (50 ⁇ M) or fluorescein (50 ⁇ M) at room temperature for 2 or 3 days with gentle shaking.
  • PI propidium iodide
  • RedDot-2 (1:100, 40061-T, Biotium
  • specimens were washed with PBS and immersed in 50% (v/v) CUBIC-R+ reagent (1:1 mixture of water:CUBIC-R+) overnight with gentle shaking. It was immersed in the CUBIC-R+ reagent for 1 or 2 days.
  • the transparent tissue specimens thus obtained were subjected to 3D imaging with a confocal fluorescence microscope or a light sheet fluorescence microscope.
  • the excitation wavelength of FAM hydrazide, compound 1, Alexa Fluor 488 hydrazide, BDP FL hydrazide, and fluorescein were all applied at 488 nm, and the fluorescence detection wavelength range was all from 490 nm to 562 nm.
  • 3D images were acquired using a confocal microscope (Zeiss LSM880 Confocal/Multiphoton, Carl-Zeiss) or a light sheet fluorescence microscope (Zeiss Lightsheet 7, Carl-Zeiss). All raw image data were reconstructed and analyzed using Imaris software (version 9.2.1, Bitplane).
  • Compound 1 was able to obtain a clear staining image of neutrophils, similar to FAM hydrazide.
  • All of the staining agents (DAF-2, compound 2, compound 1, FAM hydrazide, Alexa Fluor 488 hydrazide, BDP FL hydrazide) used in the above examples and test examples have excitation wavelengths in the range of 400 nm to 520 nm. , produces green fluorescence.
  • Alexa Fluor 488 is usually the first choice due to its high fluorescence quantum yield and photostability. Dyeing was possible.
  • crypt distortion which is considered to be one of the findings of ulcerative colitis, can be three-dimensionally imaged, and is often seen in ulcerative colitis. was also confirmed in Crohn's disease.
  • the degree of tortuosity is determined by setting points a to f at the center of the crypt in optical slices at respective depths obtained by dividing the crypt into five, and the straight line distance connecting the upper end (point a) and the lower end (point f). Calculate the sum of (Da-f) and the distances between adjacent points (Da-b, Db-c, Dc-d, Dd-e, De-f) between points a to f, and based on these Calculated.
  • Test Example F 3D imaging of pathological findings of inflammatory bowel disease and pathological diagnosis 2 based on 3D imaging Regarding the 3D image obtained in Test Example E, a more detailed three-dimensional morphological observation of the torsion of the crypts revealed that in ulcerative colitis, a twisted structure in which multiple crypts were involved was observed. It was found to be present (Fig. 18a). In this structure, multiple crypts were all twisted in the same direction. Such three-dimensional findings in which two or more adjacent crypts were twisted in the same direction were defined as "spiral staircase-like crypts" (SSCs) (Fig. 18b), and the number of such findings was counted.
  • SSCs spiral staircase-like crypts
  • a substance having a three-dimensional structure and containing a glycol group in a cleared tissue or cell sample can be suitably detected. It can contribute to the confirmation of lesions in the morphological structures.

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Abstract

本発明は、グリコール基を含む物質、例えば多糖類を多く含む構造物（粘液、基底膜等）を染色する特殊染色であるＰＡＳ染色に互換の蛍光染色方法であって、明瞭な３次元的観察が可能な蛍光染色方法を開発する。本発明は、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色する方法であって、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と該組織又は細胞サンプルとを接触させることを含む、方法を提供する。

Description

蛍光染色方法
　本発明は、組織又は細胞中のグリコール基を含む物質を特異的に染色する蛍光染色方法に関する。
　病理組織診断は、病変部の組織学的形態変化を顕微鏡的に診断する医療行為のことで、患者の治療方針の決定の根幹に関わる重要な診断技術である。病理組織診断は、薄切した組織をヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）で染色し作製したスライドガラスを、訓練を積んだ病理診断医が検鏡することによってなされる。これらに加え、より正確な診断のために、特殊染色と呼ばれるＰＡＳ染色やＰＡＭ染色、Ａｌｃｉａｎ　Ｂｌｕｅ染色といった組織内の特定の構造物を染色する手法を併用した観察が、多くの疾患の確定診断において有効となる。
　一方で、基礎生命科学領域においては様々な最先端イメージング技術が近年目覚ましい発展を遂げている。特に、組織を透明化することではじめて達成される３次元イメージングの手法は近年大きな注目を集めている技術であり、ＣＵＢＩＣ（Ｃｌｅａｒ，　Ｕｎｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄ　Ｂｒａｉｎ／Ｂｏｄｙ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ）法は、その代表的なものの一つである。ＣＵＢＩＣ法を用いた３次元的観察においては、既存の蛍光プローブや標識化抗体との組み合わせにより、１細胞レベルの解像度で、組織の立体的構築の観察が可能であることが報告されている（非特許文献１）。
　このような最先端の３次元イメージング法においては、先端蛍光顕微鏡が技術的基盤となることから、蛍光プローブ又は蛍光標識抗体による組織のホールマウント染色（薄切を行わない、組織片をまるごと染色する手法）が必要となる。蛍光プローブについては核やアクチンといった一部の構造物に対応したものが存在するのみであり、臨床病理診断における特殊染色に十分に対応するという見地から開発された蛍光プローブは、現在までにほとんど存在していない。例えば、特許文献１では、薄切した組織切片における細胞中のアルデヒド基を有する物質を染色する方法が提案されているが、特許文献１の方法ではこれらの明瞭な３次元イメージングが困難である。
特開２０１８－１６２９８６号公報
Ｓａｔｏｓｈｉ　Ｎｏｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）７：９２６９
　本発明の目的の１つは、グリコール基を含む物質、例えば多糖類を多く含む構造物（粘液、基底膜等）を染色する特殊染色であるＰＡＳ染色に互換の蛍光染色方法であって、明瞭な３次元的観察が可能な蛍光染色方法を開発することである。
　本発明者らは、特許文献１の方法で用いられる蛍光プローブの励起波長に着目し、当該励起波長が短波長であることから励起光の組織浸透性が低く、結果として、明瞭な３次元イメージング（３Ｄイメージング）が困難になるとの予測に基づき、励起波長がより長波長である種々の化合物を用いて蛍光染色を試みた。その結果、フルオレセイン骨格を有する化合物を用いた場合に、ＰＡＳ染色に互換の特殊染色が可能であり、かつ、組織透明化技術及び３Ｄイメージング技術と組み合わせることにより、明瞭な３次元的観察が可能となることを見出した。
　すなわち、本発明の１つの局面によれば、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色する方法であって、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と該組織又は細胞サンプルとを接触させることを含む、方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［一般式（Ｉ）中、
　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）、－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
　本発明の別の局面によれば、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を検出する方法であって、上記蛍光染色方法により、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、上記化合物由来の蛍光を測定すること、を含む方法が提供される。
　本発明の別の局面によれば、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化する方法であって、上記蛍光染色方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、上記化合物由来の蛍光を測定及び画像化すること、を含む方法が提供される。
　本発明の別の局面によれば、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び／又は病変を判定する方法であって、上記蛍光染色方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、染色された部位に該組織及び／又は病変が存在すると判定すること、を含む方法が提供される。
　本発明の別の局面によれば、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患の治療薬をスクリーニングする方法であって、該疾患に罹患している個体に治療薬候補を投与すること、該個体から該病変が生じる組織又は細胞サンプルを採取すること、上記蛍光染色方法により、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、上記化合物由来の蛍光を測定及び画像化して、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化すること、及び、可視化された該グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の像に基づいて、治療薬候補の治療効果を判定すること、を含む、方法が提供される。
　本発明の別の局面によれば、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含み、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化するために用いられる、蛍光染色用組成物が提供される。
　本発明の別の局面によれば、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患の診断用組成物が提供される。
　本発明によれば、上記一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と称する場合がある）を染色剤として用いることにより、グリコール基を含む物質を特異的に蛍光染色することができる。また、本発明の蛍光染色方法を組織透明化技術及び３Ｄイメージング技術と組み合わせることにより、組織の深部に存在する当該物質を染色し、当該物質を含む組織、細胞又は構造を３次元で可視化することができる。
ＤＡＦ－２及び化合物２にアルデヒド添加前および添加後の蛍光スペクトルを示すグラフである（ＡがＤＡＦ－２、Ｂが化合物２）。 ＤＡＦ－２又は化合物２を用いて、大腸粘膜上皮の杯細胞を染色した写真を示す。写真上部は使用した染色剤を示す。写真は上段から順に、各染色剤による染色の結果、ＤＡＰＩ染色の結果、及びそれらをｍｅｒｇｅした結果を示す。 ＤＡＦ－２又は化合物２を用いて、腎糸球体の基底膜を染色した写真を示す。写真上部は使用した染色剤を示す。写真は上段から順に、各染色剤による染色の結果、ＤＡＰＩ染色（細胞の核を染色）の結果、及びそれらをｍｅｒｇｅした結果を示す。 ＤＡＦ－２による染色とＣＵＢＩＣ法とを併用した大腸粘膜上皮の３Ｄイメージングの結果を示す。 化合物２による染色とＣＵＢＩＣ法とを併用した大腸粘膜上皮の３Ｄイメージングの結果を示す。 ヒト大腸粘膜組織の凍結薄切標本を蛍光染色した結果を示す図である。 ヒト大腸粘膜組織を透明化及び蛍光染色した結果を示す図である。 ヒト大腸粘膜組織を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果を示す図である。 ヒト大腸粘膜組織を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果を示す図である。 ヒト大腸粘膜組織を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果を示す図である。 ＦＡＭヒドラジド及び化合物１を用いて、ヒト大腸粘膜組織を透明化及び蛍光染色した結果を示す図である。 潰瘍性大腸炎を罹患するヒトから採取した大腸組織検体を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果を示す図である。 潰瘍性大腸炎を罹患するヒトから採取した大腸組織検体を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果を示す図である。 潰瘍性大腸炎を罹患するヒトから採取した大腸組織検体を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果を示す図である。 大腸組織を透明化及びＦＡＭヒドラジドを用いて蛍光染色した結果、ＨＥ染色した結果及びＰＡＳ染色した結果を示す図である。 陰窩の楕円率と屈曲度を説明する図である。 すべての症例に関して、陰窩のねじれを体積、楕円率及び屈曲度をパラメータとして解析した結果を示すグラフである。 病理診断医が非特異的腸炎と診断した症例に関して、陰窩のねじれを体積、楕円率及び屈曲度をパラメータとして解析した結果を示すグラフである。 陰窩のねじれに関して、３次元的形態学的観察を行った結果を示す図である。 ヒト大腸粘膜組織を３Ｄ組織染色した結果を示す図である。 真菌菌糸を３Ｄ組織染色した結果を示す図である。
Ａ．蛍光染色方法
　本発明の実施形態による蛍光染色方法は、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色する方法であって、化合物（Ｉ）又はその塩と組織又は細胞サンプルとを接触させることを含む。本実施形態の蛍光染色方法は、化合物（Ｉ）又はその塩と組織又は細胞サンプルとを接触させる前に、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を酸化させてアルデヒド基を生成させることをさらに含み得る。また、本実施形態の蛍光染色方法は、組織又は細胞サンプルを透明化剤で処理することにより透明化することをさらに含み得る。
Ａ－１．化合物Ｉ
　化合物Ｉは、下記一般式（Ｉ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［一般式（Ｉ）中、
　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
　本明細書において，「アルキル基」又はその他の基における「アルキル」部分は、直鎖又は分岐の飽和炭化水素基を意味し、好ましくは、炭素数が１～６個の飽和炭化水素基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２，３－ジメチルプロピル基、及びヘキシル基等が挙げられ、より好ましくは、Ｃ１～５アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、又は２，３－ジメチルプロピル基が挙げられる。更に好ましくは、Ｃ１～３アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、及びｉ－プロピル基であり、最も好ましくは、メチル基又はエチル基である。また、「アルキレン基」は、前記アルキル基から水素原子を１個除くことにより得られる２価の基である。
　本明細書において、「アルコキシ基」は、前記アルキル基と酸素原子を介して結合する基（（アルキル基）－Ｏ－基）のことであり、該アルキル基部分は上述にて定義した通りである。例えば、アルコキシ基は、アルキル基部分の炭素原子数が１～６個であってもよい。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、１－プロピルオキシ基、２－プロピルオキシ基、２－メチル－１－プロピルオキシ基、２－メチル－２－プロピルオキシ基、２，２－ジメチル－１－プロピルオキシ基、１－ブチルオキシ基、２－ブチルオキシ基、２－メチル－１－ブチルオキシ基、３－メチル－１－ブチルオキシ基、２－メチル－２－ブチルオキシ基、３－メチル－２－ブチルオキシ基、１－ペンチルオキシ基、２－ペンチルオキシ基、３－ペンチルオキシ基、２－メチル－１－ペンチルオキシ基、３－メチル－１－ペンチルオキシ基、２－メチル－２－ペンチルオキシ基、３－メチル－２－ペンチルオキシ基、１－ヘキシルオキシ基、２－ヘキシルオキシ基、３－ヘキシルオキシ基等が挙げられる。Ｃ１～６アルコキシ基として、好ましくはＣ１～５アルコキシ基であり、より好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロピルオキシ基、ｉ－プロピルオキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、ｓｅｃ－ブチルオキシ基、ｔ－ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、及び２，３－ジメチルプロピルオキシ基である。
　本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を意味し、好ましくは、フッ素原子、塩素原子、及び臭素原子であり、より好ましくは、フッ素原子、又は塩素原子である。
　本明細書において、「カルボキシル基」とは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＨで表わされる基のことである。
　本明細書全体にわたって、アルキル基又はその他の基のアルキル部分における置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、ジアルキルアミノ基、チオール基、アルキルチオール基、スルホニル基、アルキルスルホニル基、アルコキシ基、環状エーテル、カルボキシル基、アルキルカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルコキシカルボニルアミノ基、アルキルカルボニルオキシ基、アルキルアミノカルボニル基、アルキルカルボニルアミノ基、カルボニルアミノ基を挙げることができる。アルキル基が置換されている場合、該置換基の数は、例えば、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個、２個、又は３個とすることができる。
　Ｒ１は、好ましくはカルボキシル基、アルキル基又はアルコキシ基であり、より好ましくはカルボキシル基、メチル基又はメトキシ基である。ｐは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは１である。
　Ｒ２は、好ましくは水素原子である。
　Ｒ３は、好ましくは水素原子である。
　Ｒ４は、好ましくは水素原子又はフッ素原子である。
　Ｒ５は、好ましくは水素原子又はフッ素原子である。
　Ｒ６は、好ましくは水素原子である。
　Ｒ７は、好ましくは水素原子である。
　Ｘは、好ましくはヒドラジド基、セミカルバジド基、アミノ基又はアルキルアミノ基であり、より好ましくは、ヒドラジド基である。
　Ｙは、好ましくは存在しないか、アミド基である。
　Ｌは、好ましくは単結合を示すか、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）である。
　例えば、上記式（Ｉ）において、Ｘ－Ｌ－Ｙ－で表される基は、以下から選択される基であってもよい（式中、ｍは１～６の整数、ｎは１～３の整数）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　また、例えば、上記式（Ｉ）において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される部分構造は、以下の式で表される構造であっても良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　１つの実施形態において、一般式（Ｉ）中、
　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
　Ｒ４及びＲ５は、それぞれフッ素原子を表し；
　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基又はヒドロキシルアミノ基を示し；
　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）、－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。
　１つの実施形態において、一般式（Ｉ）中、
　Ｒ１は、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
　Ｘは、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
　Ｙは、存在せず；
　Ｌは、単結合を示し；
　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。
　化合物（Ｉ）の具体例としては、例えば、以下の化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　化合物（Ｉ）の塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩等を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩、メチルアミン塩、ジメチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、Ｎ，Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン塩、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール塩、エタノールアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、Ｌ－グルカミン塩、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩等の有機アミン塩；又はリジン、δ－ヒドロキシリジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩；メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、ケイ皮酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、グルクロン酸塩、アスコルビン酸塩、ニコチン酸塩、サリチル酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩等を例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
　化合物（Ｉ）は、置換基の種類に応じて１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体等の立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体等はいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノール等の溶媒を例示することができる。本明細書において「化合物（Ｉ）」との言及は、それが明らかに不適合である場合を除き、明示されていない場合にも、化合物（Ｉ）の異性体の任意の混合物又は特定の立体異性体、化合物（Ｉ）の薬理学的に許容される塩、水和物及び溶媒和物、並びに化合物（Ｉ）の薬理学的に許容される塩の水和物又は溶媒和物をも含む。なお、化合物（Ｉ）は、実施例に記載の合成スキーム及び当該技術分野において公知の合成方法を用いて合成することができる。
Ａ－２．組織又は細胞サンプル
　組織又は細胞サンプルは、グリコール基を含む物質の存在を確認する対象の組織又は細胞を含有するサンプルであれば特に制限されるものではない。代表的には、組織又は細胞サンプルは、ヒト又はヒト以外の哺乳類由来であり、ヒト又はヒト以外の哺乳類から摘出又は切除した組織又は細胞が用いられ得る。
　ここで、「組織」とは、生体に由来する組織又は臓器全体でも組織又は臓器の一部（例えば、組織片）でもよく、あるいは、実験動物そのもの等の生物個体全体を意味していてもよい。また、本明細書における組織又は細胞サンプルが含有する組織は一般的に認識されている「組織」としての機能や構造を有することを必要とするものではなく、よって、特定の組織として期待される構造又は機能を持たない細胞塊や培養細胞をも含む。例えば、ヒトのがん細胞を含む可能性のある組織やがん切除により切除された組織片等であってもよい。
　ここで、「細胞」とは、生体に由来する細胞全般を指す。これは生体の体液又は組織中に存在していた細胞を単離したもの、生体に特定の実験的処理を行い人工的に作製した細胞を含むすべての細胞検体を指す。このような実験的処理としては、後述するような、ホルマリン固定、パラフィン包埋と脱パラフィン化処理、及び組織透明化処理等も含まれる。また、培養により形成された細胞塊であってもよく、このような細胞塊とは幹細胞及び幹細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞塊であってもよい。
　組織又は細胞サンプルは、好ましくは３次元立体構造を有する。「３次元立体構造」は、３次元方向に厚みを有する構造を意味し、病理組織診断を行う際に標準的に用いられるスライドガラスを作製する際に必須となる組織の薄切を経た検体（薄切切片）と、その構造を区別する目的で用いられる。よって、板状又は扁平状の構造を有している組織標本であったとしても、薄切切片と十分区別できる程度に厚みを有する場合（例えば５０μｍ以上、また例えば５００μｍ以上の厚みを有する場合）には、３次元立体構造を有する組織に含まれる。ここで組織の薄切とは、ミクロトームを用いて行われる手技と言い換えても良い。また、３次元立体構造を有する組織には、組織片や細胞塊の他、臓器そのものや、個体そのものも含まれる。
　組織又は細胞サンプルは、生体から採取されたそのままの状態であってもよく、前処理が施された状態であってもよい。例えば、パラフィンブロックに包埋された組織又は細胞サンプルを、染色前に脱パラフィン化処理することにより、本発明の方法に用いることができる（Ｓａｔｏｓｈｉ　Ｎｏｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１７）７：９２６９参照）。
　１つの実施形態において、組織又は細胞サンプルには、化合物（Ｉ）との接触前に、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を酸化させることによりアルデヒド基を生成させる処理が施されている。あるいは、本発明の実施形態による蛍光染色方法は、化合物（Ｉ）と組織又は細胞サンプルとを接触させる前に、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を酸化させてアルデヒド基を生成させることを含んでもよい。化合物（Ｉ）は、アルデヒド基と結合して染色するからである。
　グリコール基の酸化処理は、既にＰＡＳ染色法においてよく知られている。酸化処理は、代表的には、０．５％～１％過ヨウ素酸水溶液で組織又は細胞サンプルを１０分以上、例えば１０分～３０分間処理することにより行うことができる。
　１つの実施形態において、組織又は細胞サンプルは、化合物（Ｉ）との接触前に透明化処理された組織又は細胞サンプルである。あるいは、本発明の実施形態による蛍光染色方法は、組織又は細胞サンプルを透明化剤で処理することにより透明化することをさらに含んでもよい。このとき、組織又は細胞サンプルの透明化と、化合物（Ｉ）と組織又は細胞サンプルとの接触との順序は限定されず、これらは、透明化処理方法等に応じて任意の適切なタイミングで行われ得る。例えば、透明化処理の前、透明化処理と同時、透明化処理の途中または透明化処理の後に化合物（Ｉ）と組織又は細胞サンプルとを接触させることができる。化合物（Ｉ）は、３次元立体構造を有する組織又は細胞サンプルの内部まで浸透して染色可能である。よって、透明化した組織又は細胞サンプルの内部まで化合物（Ｉ）を浸透させてグリコール基を含む物質と結合させた後に、化合物（Ｉ）由来の蛍光を測定することにより、３次元立体構造を有する組織又は細胞サンプルの内部又は全体におけるグリコール基を含む物質の検出を行うことができる。
　透明化処理は、組織又は細胞サンプルを親水性又は疎水性透明化剤で処理すること、あるいは、ハイドロゲルに包埋した上で電気泳動法を行うことにより行われ得る。この中で、親水性透明化剤を用いた組織又は細胞サンプルの透明化処理法として、既に様々な方法が当業者に広く知られている。特に、本明細書における透明化処理法としては、Ｃｌｅａｒ，Ｕｎｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄ　Ｂｒａｉｎ／Ｂｏｄｙ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＵＢＩＣ）法として知られる方法が好ましい（Ｓｕｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１４）　Ｃｅｌｌ；　１５７：　７２６－７３９；Ｔａｉｎａｋａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１４）　Ｃｅｌｌ；　１５９　：　９１１－９２４．参照）。
　ＣＵＢＩＣ法に用いる試薬は市販されており、対象組織毎に推奨される当該試薬製造者が提供するプロトコルに従って透明化処理することができる（「動物透明化試薬ＣＵＢＩＣ」、東京化成工業株式会社、東京、日本）。典型的な方法としては、以下の方法を挙げることができる。ＣＵＢＩＣ－１（試薬１）は、２５重量％尿素、２５重量％のＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、及び１５重量％ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル／トリトンＸ－１００の混合物を水溶液として調製する。ＣＵＢＩＣ－２（試薬２）は、５０重量％スクロース、２５重量％尿素、及び１０重量％２，２，’２’’－ニトリロトリエタノールの混合物を水溶液として調製する。ＣＵＢＩＣ法による透明化処理を化合物（Ｉ）との接触と組み合わせて行う場合の手順としては、固定組織サンプルをＰＢＳでよく洗浄した後、緩やかに振盪しながら室温で試薬１を蒸留水で１／２に希釈した溶液に浸す。その後、緩やかに振盪しながら室温で試薬１に３～７日間浸す。この間、１～２日に一度の間隔で、試薬１を新しいものに交換する。その後、ＰＢＳでよく洗浄した後に、２０～３０％（ｗ／ｖ）スクロース含有ＰＢＳ中に浸す。その後、凍結組織切片作製用包埋剤（例えば、サクラファインテックジャパン、ティシュー・テック　Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド）を用いて凍結ブロックを作製し、この状態で－８０℃冷凍庫において長期保存できる。これらを溶解後、ＰＢＳでよく洗浄、必要に応じて前処理を行い、化合物（Ｉ）を用いてホールマウント染色を行う。その後、必要に応じてリンカーを用いた処理を行い、試薬２を蒸留水で１／２に希釈した溶液に浸し、室温で緩やかに振盪する。その後、緩やかに振盪しながら室温で試薬２に１～３日間浸す。この状態で蛍光顕微鏡を用いて３Ｄイメージングが可能となる。
　ＣＵＢＩＣ試薬については、上述のＣＵＢＩＣ－１及びＣＵＢＩＣ－２に加え、ＣＵＢＩＣ－Ｌ、ＣＵＢＩＣ－Ｒ＋、ＣＵＢＩＣ－Ｂ、ＣＵＢＩＣ－ＨＬ、ＣＵＢＩＣ－Ｐ、ＣＵＢＩＣ－Ｘ１、ＣＵＢＩＣ－Ｘ２を含むさまざまな種類のものが存在しており、臓器の種類によって使い分けられる。本発明に適用可能なＣＵＢＩＣ試薬として、これらのすべてが含まれる。
　また、本発明に適用可能な透明化処理法は、ＣＵＢＩＣ法に限定されない。その他の方法としては、疎水性透明化剤を用いる、「ＢＡＢＢ」（Ｄｏｄｔ　ＨＵ　ｅｔ　ａｌ．，（２００７）　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ；４：３３１－３３６．参照）、「３ＤＩＳＣＯ」（Ｅｒｔｕｒｋ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１２）　Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ；７：１９８３－１９９５．参照）、「ｕＤＩＳＣＯ」（Ｐａｎ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１６）　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ；１３：８５９－８６７．　参照）やそれらの亜型となる手法、水溶性透明化剤を用いる、「Ｓｃａｌｅ」（Ｈａｍａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１１）　Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；１４：１４８１－１４８８．参照）、「ＳｅｅＤＢ」（Ｋｅ　ＭＴ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１３）　Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；１６：１１５４－１１６１．参照）やそれらの亜型となる手法、電気泳動法によって光散乱体を除去するという原理に基づく、「ＣＬＡＲＩＴＹ」（Ｃｈｕｎｇ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１３）　Ｎａｔｕｒｅ；４９７：３３２－７．参照）、「ＰＡＣＴ」（Ｔｏｍｅｒ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１４）　Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ；９：１６８２－９７．参照）やそれらの亜型となる手法が含まれる。
Ａ－３．接触
　化合物（Ｉ）と組織又は細胞サンプルとの接触は、目的に応じて任意の適切な条件下で行われ得る。代表的には、化合物（Ｉ）を含む染色液中に組織又は細胞サンプルを浸漬することにより、化合物（Ｉ）と組織又は細胞サンプルとを接触させる。染色液における化合物（Ｉ）の濃度、添加剤、希釈液、洗浄液、接触時間、接触温度等の接触条件は当業者により適宜選択が可能である。
　例えば、化合物（Ｉ）がヒドラジド基、ヒドラジノ基又はヒドロキシルアミノ基を有する場合、該置換基とアルデヒドとの縮合反応はアニリン誘導体やインドリン誘導体により触媒され、対応するアシルヒドラゾン、ヒドラゾン、オキシムが効率良く形成される（Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０２０，２２，６０３５－６０４０）。さらには、ジアミノベンゼン構造とアルデヒドとからベンゾイミダゾール構造を形成する反応は、過酸化水素水（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００７，４，５４７－５５０）や塩化アンモニウム（Ｉｎｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，５２Ｂ，１１５２－１１５６，）、亜硫酸ナトリウム（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｐｅｒｓ，２０１８，７２，１２６５－１２７６）の使用や加熱条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１５，１９，２６３－２７２）によって、促進される。上記例に限らず、置換基Ｘとアルデヒドの反応効率を向上するには、適宜、添加剤や染色条件を選択することができる。
　化合物（Ｉ）と接触後、必要に応じて、ＰＢＳ等の洗浄液への浸漬により、組織又は細胞サンプルを洗浄することができる。
Ａ－４．グリコール基を含む物質
　「グリコール基を含む物質」の代表例は、糖を含む物質である。糖を含む物質としては、グリコーゲン、デンプン、ムコ多糖、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。グリコール基としては、例えばα－グリコール基が挙げられる。
Ａ－５．用途
　本発明の実施形態による蛍光染色方法は、グリコール基を含む物質を特異的に染色できることから、当該物質を含む組織、病変又は構造物、好ましくは当該物質を（他の組織や細胞と比較して）多く含む組織、病変又は構造物を特異的に染色することができる。グリコール基を含む物質を多く含む組織、病変又は構造物として、例えば、筋肉（横紋筋組織、平滑筋組織、心筋組織等）、粘液、粘膜上皮、基底膜（腎糸球体基底膜、消化管粘膜基底膜等）、細胞質内糖原顆粒、細菌、真菌、寄生虫等が挙げられる。本発明の実施形態による蛍光染色方法が有用である疾患の例としては、炎症性腸疾患、粘液を含む腺由来のがん、糸球体腎炎、心筋症、感染症等が想定される。よって、本明細書において、「グリコール基を含む物質の蛍光染色方法」は、適宜、「グリコール基を含む物質を他の組織や細胞と比較して多く含む組織及び／又は病変の蛍光染色方法」と読み替えてもよい。
　本明細書において、「炎症性腸疾患」としては、これらに限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎、クローン病等を挙げることができる。
　本明細書において、「がん」としては、これらに限定されるものではないが、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、エイズ関連リンパ腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）、胆道癌、肝外胆管がん、肝内胆管癌、膀胱癌、骨や関節の癌、骨肉腫と悪性線維組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、神経膠腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫、頭頸部癌、転移性扁平上皮頸部癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、神経系リンパ腫、中枢神経系の癌、中枢神経系リンパ腫、神経芽細胞腫、小児癌、Ｓｅｚｉａｒｙ症候群、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼の癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、口腔癌、口腔空洞癌、口腔咽頭癌、舌の癌、食道がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門直腸癌、肛門癌、胚細胞腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、咽頭癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、副鼻腔及び鼻腔癌、咽喉癌、膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、膵臓癌、副甲状腺癌、肝臓癌、胆嚢癌、虫垂癌、腎臓癌、尿道癌、腎盂と尿管の移行上皮癌及び他の泌尿器の癌、扁平上皮癌、陰茎癌、精巣癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、乳癌、子宮癌、子宮肉腫、子宮頸癌、子宮内膜がん、子宮体がん、膣がん、外陰癌、ウィルムス腫瘍、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（黒色腫）、褐色細胞腫、メルケル細胞皮膚癌、中皮腫、悪性中皮腫、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、松果体芽腫及び下垂体腫瘍、形質細胞腫、胸膜肺芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、ユーイング腫瘍、軟組織肉腫、軟組織肉腫、菌状息肉腫、カポジ肉腫等を挙げることができる。これらの中で、粘液を含む腺由来のがんとしては、非小細胞肺癌（粘液性肺腺癌）、皮膚癌（乳房外パジェット病）、胃癌、小腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、乳癌（乳房パジェット病）、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌及び虫垂癌が挙げられる。
　本明細書において、「糸球体腎炎」としては、これらに限定されるものではないが、微小変化群、膜性腎症、メサンギウム増殖性腎炎、管内増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、管外増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、紫斑病性腎炎（Ｈｅｎｏｃｈ－ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病）、抗ＧＢＭ糸球体腎炎（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群）等を挙げることができる。
　本明細書において、「心筋症」としては、これらに限定されるものではないが、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原性心筋症を挙げることができる。
　本明細書において、「感染症」としては、これらに限定されるものではないが、以下の細菌、真菌、寄生虫に感染することによる疾患を想定する。すなわち、レンサ球菌（Ａ群β溶連菌、肺炎球菌等）、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎菌、淋菌、病原性大腸菌（Ｏ１５７：Ｈ７等）、クレブシエラ（肺炎桿菌）、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クロストリジウム、結核・非結核性抗酸菌、コレラ、ペスト、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、梅毒、破傷風、ハンセン病、レジオネラ肺炎（在郷軍人病）、レプトスピラ症、ライム病、野兎病、Ｑ熱、リケッチア、クラミジア、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、白癬菌症、ヒストプラズマ症、ニューモシスチス肺炎、アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム、エキノコックス症、日本住血吸虫症、フィラリア症、回虫症、広節裂頭条虫症等である。
Ｂ．検出方法
　本発明の別の局面によれば、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を検出する方法であって、Ａ項に記載の方法により、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、化合物（Ｉ）由来の蛍光を測定すること、を含む方法が提供される。
　化合物（Ｉ）由来の蛍光の測定は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて、蛍光染色された組織又は細胞サンプルに化合物（Ｉ）の励起光を照射し、化合物（Ｉ）が発する蛍光強度を測定することによって行われ得る。励起光を照射しない場合に測定される蛍光強度よりも強い強度の蛍光が測定された部位に、グリコール基を含む物質が存在することが確認でき、その範囲及び／又は強度に応じて存在量が検出できる。
　組織又は細胞サンプル、グリコール基を含む物質及び当該物質を蛍光染色する方法については、Ａ項に記載の通りである。
Ｃ．可視化方法
　本発明の別の局面によれば、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化する方法であって、Ａ項に記載の方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、化合物（Ｉ）由来の蛍光を測定及び画像化すること、を含む方法が提供される。
　化合物（Ｉ）由来の蛍光の測定及び画像化は、例えば、蛍光顕微鏡を用い、蛍光染色された組織又は細胞サンプルに化合物（Ｉ）の励起光を照射して、化合物（Ｉ）が発する蛍光強度を測定し、画像解析ソフトウェアを用いて得られた蛍光強度データを画像化することにより行われ得る。目的に応じて、２次元画像又は３次元画像のいずれを作成してもよい。画像解析ソフトウェアとしては、Ｉｍａｒｉｓ、Ｉｍａｇｅｊ、ｃｅｌｌＳｅｎｓ等の公知のソフトウェアを用いることができる。
　化合物（Ｉ）の励起光の波長は、約４００ｎｍ～約５２０ｎｍの範囲内であり、厚みを有する組織又は細胞サンプル内部への浸透性に優れる。よって、本発明の実施形態による可視化方法によれば、グリコール基を含む物質を含み、３次元立体構造を有する組織又は細胞を好適に可視化することができる。当該組織又は細胞は、好ましくは透明化処理されている。
　本発明の実施形態による可視化方法が好ましく適用される組織又は細胞としては、粘膜上皮、基底膜又は真菌が挙げられる。例えば、哺乳類の粘膜上皮（例えば、小腸又は大腸粘膜上皮）には無数の管状の陥入部（陰窩）が存在し、各陰窩は粘液を産生する杯細胞を含む数種類の細胞から構成される。本発明の実施形態による可視化方法によれば、粘液を含む杯細胞が特異的に蛍光染色される結果、個々の陰窩の形状を明瞭に可視化することができる。
　グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞及び当該物質を蛍光染色する方法については、Ａ項に記載の通りである。
Ｄ．判定方法
　本発明の別の局面によれば、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び／又は病変を判定する方法であって、Ａ項に記載の方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、染色された部位に該組織及び／又は病変が存在すると判定すること、を含む方法が提供される。本発明はまた、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び／又は病変を判定するための情報を提供する方法であって、Ａ項に記載の方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び、染色された部位に該組織又は病変が存在すると判定するための情報を提供すること、を含む方法を提供する。なお、グリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び病変については、Ａ項で記載した通りである。
　グリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び／又は病変の判定は、当該組織や病変が存在するか否かの判定の他、その量、症状の程度、位置及び／又は形状の判定等、グリコール基を含む物質の存在に関する２次元又は３次元画像データから可能な判定であれば、いかなる判定であってもよい。
　グリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び／又は病変の判定は、単純に染色の有無から行うことができる場合もあるが、必要に応じて、グリコール基を含む物質が検出された位置や量（蛍光が検出された位置や強度）、組織又は細胞サンプルの由来する部位、患者に関する情報、グリコール基が含まれる物質の存在パターンに関する病理学の分野において一般的な知見等を総合して行うことができる。
　例えば、組織又は細胞サンプルが癌患者のがん切除組織片であり、病変としては、がんを対象とする場合、がんに特徴的なグリコール基を含む物質の集積を示すグリコール基を含む物質の存在する位置や量を調べることにより、当該組織又は細胞サンプル中のがんの存在を判定することができる。
　また例えば、炎症性腸疾患においては、当該疾患に特徴的な病変として、陰窩のねじれが挙げられる。本発明の手法を用いた解析によれば、陰窩のねじれを３次元的に観察することによって、炎症性腸疾患に特異的な病変、特に潰瘍性大腸炎に特徴的な病変として、複数の陰窩が巻き込まれる形のねじれが見出されている。よって、組織又は細胞サンプルが炎症性腸疾患の可能性がある個体由来の大腸粘膜組織である場合、陰窩の形状を解析することにより、当該病変の存在を判定することができる。
　具体的には、大腸粘膜組織をＡ項に記載の蛍光染色方法に供し、粘膜上皮中の粘液を含む杯細胞及び基底膜の染色を介して陰窩の３次元画像を得ること、及び、得られた３次元画像に基づいてその形状を３次元的に解析することにより、炎症性腸疾患に特徴的な病変としての陰窩のねじれの存在を判定することができる。
　陰窩の形状の３次元的解析は、例えば、画像解析ソフトウェアを用いて、陰窩の３次元画像データから体積、楕円率又は屈曲度を求めることによって行われ得る。陰窩の体積は、潰瘍性大腸炎において、非特異的腸炎及びクローン病よりも増大した値を示す傾向にあり、楕円率は、潰瘍性大腸炎及びクローン病において非特異的腸炎よりも低い値を示す傾向にあり、屈曲度は、潰瘍性大腸炎が最も高く、次いで、クローン病及び非特異的腸炎の順に高い値を示す傾向がある。よって、楕円率が所定の基準（例えば、非特異的腸炎を罹患する個体における楕円率の基準範囲）よりも低い場合、屈曲度が所定の基準（例えば、非特異的腸炎を罹患する個体における屈曲度の基準範囲）よりも高い場合等において、炎症性腸疾患に特徴的な病変として、陰窩のねじれが存在すると判定することができる。
　また、陰窩のねじれを定量化又は総合的に評価することにより、サンプルが由来する個体が炎症性腸疾患に罹患している可能性を評価することができる。具体例としては、陰窩の体積、楕円率及び屈曲度をパラメータとして、体積が所定の基準（例えば、非特異的腸炎又はクローン病における体積の基準範囲）を超えており、楕円率が所定の基準（例えば、非特異的腸炎を罹患する個体における基準範囲）よりも低く、屈曲度が所定の基準（例えば、クローン病における屈曲度の基準範囲）よりも高い陰窩が確認された場合に、サンプルが由来する個体が潰瘍性大腸炎に罹患している可能性がある（又は高い）と判定（診断）することができる。別の具体例としては、体積、楕円率及び屈曲度のそれぞれに対して、程度に応じた点数（例えば、体積が大きいほど高い点数、楕円率が低いほど高い点数、屈曲度が高いほど高い点数）を設定し、点数の合計が所定の基準を超える陰窩が所定の数以上又は所定の割合以上確認された場合に、サンプルが由来する個体が潰瘍性大腸炎に罹患している可能性がある（又は高い）と判定（診断）することができる。
　すなわち、本発明の別の局面によれば、個体が潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患に罹患している可能性を判定する方法であって、Ａ項に記載の方法により、該個体由来の大腸粘膜組織サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、化合物（Ｉ）由来の蛍光を測定及び画像化して陰窩の３次元画像を得ること、得られた３次元画像に基づいて陰窩の形状を三次元的に解析すること、を含む、方法が提供される。陰窩の形状の三次元的解析は、上述の通り、体積、楕円率及び屈曲度をパラメータとして陰窩のねじれを定量化又は総合的に評価することにより行われ得る。
Ｅ．スクリーニング方法
　本発明の別の局面によれば、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患の治療薬をスクリーニングする方法であって、該疾患に罹患している個体に治療薬候補を投与すること、該個体から該病変が生じる組織又は細胞サンプルを採取すること、Ａ項に記載の方法により、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、化合物（Ｉ）由来の蛍光を測定及び画像化して、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化すること、及び、可視化された該グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の像に基づいて、治療薬候補の治療効果を判定すること、を含む、方法が提供される。
　グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患としては、炎症性腸疾患、粘液を含む腺由来のがん、糸球体腎炎、心筋症、感染症等が挙げられる。また、病変が生じる組織又は細胞としては、筋肉（横紋筋組織、平滑筋組織、心筋組織等）、粘液、粘膜上皮、基底膜（腎糸球体基底膜、消化管粘膜基底膜等）、細胞質内糖原顆粒、細菌、真菌、寄生虫等が挙げられる。
　上記疾患を罹患した個体は、ヒト又はヒト以外の哺乳類、例えば実験動物であり、マウス、ラット、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ、イヌ、ミニブタ、サル等が挙げられる。治療薬候補の投与量及び投与方法は、治療薬、個体の状態等に応じて適切に設定され得る。
　組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色する方法及び化合物（Ｉ）由来の蛍光を測定及び画像化して、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化する方法についてはそれぞれ、Ａ項及びＣ項に記載の通りである。
　治療薬候補の治療効果の判定は、可視化された該グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の像に基づいて行われる。例えば、可視化された像において、治療対象の疾患に伴って生じる病変（グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変）が、治療薬候補の投与前と比較して軽減又は減少している場合あるいは疾患（病変）の進行が抑制されている場合、治療薬候補は当該疾患に対して治療効果を有する可能性がある（又は高い）と判定することができる。また例えば、治療対象の疾患に伴って生じる病変が、治療薬候補の投与前と比較して変化がない又は増大している場合、治療薬候補は当該疾患に対して治療効果を有さない可能性がある（又は高い）と判定することができる。
Ｆ．蛍光染色用組成物
　本発明の別の局面によれば、化合物（Ｉ）又はその塩を含み、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化するために用いられる、蛍光染色用組成物が提供される。上述の通り、化合物（Ｉ）は、グリコール基を含む物質を特異的に染色することができ、また、組織又は細胞内部への浸透性に優れる。よって、グリコール基を含む物質を含み、好ましくは透明化処理されている組織又は細胞と化合物（Ｉ）とを接触させることにより、その内部でグリコール基を含む物質が染色され、結果として、当該物質を含む組織又は細胞が可視化され得る。
　可視化対象としては、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞であればよく、好ましくは３次元立体構造を有する組織又は細胞であり、より好ましくは筋肉（横紋筋組織、平滑筋組織、心筋組織等）、粘膜上皮、基底膜（腎糸球体基底膜、消化管粘膜基底膜等）、細胞質内糖原顆粒、細菌、真菌、寄生虫等が挙げられ、大腸粘膜上皮（腸陰窩）及び真菌がより好ましい。
　蛍光染色用組成物は、必要に応じて、透明化剤、希釈剤、濁液剤等の任意の構成成分をさらに含み得る。透明化剤は、好ましくは親水性透明化剤である。
　蛍光染色用組成物は、各構成成分が混合された混合液の形態であってもよく、各々の構成成分又は一部の構成成分が個別に包装された形態（キット）であってもよい。後者の形態によれば、使用者によって各構成成分が混合され得る。
Ｇ．診断用組成物
　本発明の別の局面によれば、化合物（Ｉ）又はその塩を含む、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患の診断用組成物が提供される。上述の通り、化合物（Ｉ）は、グリコール基を含む物質を特異的に染色することができ、また、組織又は細胞内部への浸透性に優れる。よって、化合物（Ｉ）を、グリコール基を含む物質を含み、好ましくは透明化処理されている組織又は細胞と接触させることにより、その内部でグリコール基を含む物質が染色され、当該組織又は細胞が可視化される。可視化された組織又は細胞の像に上記Ｄ項に記載されるような判定手段を適用することにより、病変の有無、数、発生率等を判定することができ、その判定に基づいて当該病変を伴う疾患に罹患している可能性を判断することができる。すなわち、本発明の実施形態による診断用組成物によれば、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の可視化を介して、当該組織又は細胞の病変を伴う疾患の診断をするための情報が提供され得る。
　上記疾患に罹患している可能性の判断（すなわち、診断）は、医者によって行われる他、人工知能（ＡＩ）を用いて行われ得る。ＡＩによる診断は、例えば、可視化された組織又は細胞の像を所定の基準に従って解析し、該解析結果に基づいて上記疾患に罹患している可能性を算出する画像診断支援プログラムを用いて行われ得る。あるいは、ＡＩを用いて、可視化された組織又は細胞の像を所定の基準に従って解析し、該解析結果に基づいて医者が上記疾患に罹患している可能性を判断することもできる。
　診断対象の疾患としては、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患であればよい。その具体例としては、Ｅ項に記載ものが同様に例示でき、なかでも、好ましくは炎症性腸疾患、より好ましくは潰瘍性大腸炎又はクローン病が挙げられる。炎症性腸疾患の診断に関しては、例えば、陰窩のねじれ及び／又は陰窩のねじれの程度を解析基準にすることができる。
　診断用組成物は、必要に応じて、透明化剤、希釈剤、濁液剤等の任意の構成成分をさらに含み得る。透明化剤は、好ましくは親水性透明化剤である。
　診断用組成物は、各構成成分が混合された混合液の形態であってもよく、各々の構成成分又は一部の構成成分が個別に包装された形態（キット）であってもよい。後者の形態によれば、使用者によって各構成成分が混合され得る。
　以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本願明細書全体を通じて引用する文献は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
［実施例１］化合物１の合成
　以下のスキームに記載のステップにより、化合物１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　化合物３（３６４ｍｇ，１．３２　ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１３ｍＬ）溶液に、－１５℃で２Ｍ　ｉＰｒＭｇＣｌ／ＴＨＦ（２．６ｍＬ，５．２７ｍｍｏｌ）を滴下した。１．５時間撹拌後、ＤＭＦ（０．５ｍｌ，６．５９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。１Ｍ　ＨＣｌを加え、１時間撹拌後、反応溶液をヘキサン－酢酸エチル＝３：１の混合溶液で抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、粗精製の化合物４を無色油状として得た。さらなる精製はせずに、すぐに次の反応に使用した。
　上記得られた化合物４と４－Ｆｌｕｏｒｏｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ（３２０ｍｇ，２．５０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２－Ｅｔ２Ｏ＝１：１の混合溶液（１３ｍｌ）に室温でメタンスルホン酸（１．３ｍｌ）を加え、１８．５時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウムを注意深く加え、中和した後、濃塩酸にてｐＨがおよそ３付近となるように調整した。酢酸エチルにて抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝２０→１５）で精製し、化合物５を得た（３８２ｍｇ，７０％（２ｓｔｅｐｓ））。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ―ｄ６）　δ９．５６（２Ｈ，ｓ），９．１７（２Ｈ，ｓ），７．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ），６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．１９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｓ），３．８１（３Ｈ，ｓ），２．１５（３Ｈ，ｓ）
　化合物５（５．５ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２６４ｍｌ）にＰＴＳ・Ｈ２Ｏ（２５．１ｇ，１３２ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で２４時間撹拌した。反応溶液を室温に冷却し、２Ｍ水酸化カリウム水溶液（１００ｍＬ）を加え、５時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテルで洗浄し、濃塩酸でｐＨをおよそ３に調整した。酢酸エチルにて抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ（１％Ｅｔ３Ｎ）／ＣＨ３ＣＮ＝９０：１０）で精製後、トリエチルアミンを塩酸で除去して、化合物７を得た（４１２ｍｇ，８．２％（２ｓｔｅｐｓ））。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）　δ８．０５（１Ｈ，ｓ），７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７８（２Ｈ，ｂｒ－ｓ），６．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），２．０９（３Ｈ，ｓ）
　化合物７（３４．１ｍｇ，８９．１ｍｍｏｌ）及びＮ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（１５．３ｍｇ，１３４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７ｍｌ）溶液にＤＣＣ（２３．９ｍｇ，１１６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍｌ）溶液を滴下した。反応溶液を室温で５時間撹拌し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝５０→１０）で精製し、化合物８をオレンジ色固体として得た（３７．０ｍｇ，８６％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）　δ８．２９（１Ｈ，ｓ），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５４－７．４９（１Ｈ，ｍ），６．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．８０－６．７４（２Ｈ，ｍ），２．９５（４Ｈ，ｓ），２．１９（３Ｈ，ｓ）
　化合物８（１３．４ｍｇ，２８．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（０．５６ｍｌ）にヒドラジン一水和物（０．０１３６ｍＬ，０．２８０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取した。析出した固体を２Ｍ塩酸に溶解し、逆相シリカゲルカラムにて精製し、化合物１を得た（１２．０ｍｇ，９９％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０２（１Ｈ，ｓ）、７．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ）、７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、６．８７（２Ｈ，ｂｒ－ｓ）、６．６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、２．１１（３Ｈ，ｓ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，３９７．０９９４；ｆｏｕｎｄ，３９７．０９７３（－２．１ｍｍｕ）
［実施例２］化合物２の合成
　以下のスキームに記載のステップにより、化合物２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　化合物９（８．０１ｇ，６５．５ｍｍｏｌ）とピリジン（２０ｍｌ，２５０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１５０ｍＬ）に０℃にてｐ－トルエンスルホニルクロリド（３０．０ｇ，１５７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応溶液を２Ｍ塩酸水溶液、蒸留水で洗浄し、減圧留去して得られた残渣をエタノールで再結晶し、化合物１０を白色結晶として得た（２５．９ｇ，９２％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）　δ７．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｂｒ－ｓ），６．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．０Ｈｚ），６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．４４（１Ｈ，ｂｒ－ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．１９（３Ｈ，ｓ）
　化合物１０（２５．９ｇ，６０．２ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（８．８９ｇ，１０８ｍｍｏｌ）の酢酸溶液（２００ｍＬ）に０℃にて臭素（４．０ｍＬ，７８．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した。反応溶液を室温に戻した後、蒸留水を加え、生じた析出物をろ過した。得られた粗体をエタノールで再結晶し、化合物１１を白色結晶として得た（２０．４ｇ，６７％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）　δ７．５８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．６Ｈｚ），７．５５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．６Ｈｚ），７．２９－７．２０（４Ｈ，ｍ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），６．９３（１Ｈ，ｂｒ－ｓ），６．８６（１Ｈ，ｂｒ－ｓ），６．５０（１Ｈ，ｂｒ－ｓ），２．４０（６Ｈ，ｓ），２．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）
　化合物１１（１０．２ｇ，７．９１ｍｍｏｌ）に濃硫酸（１０ｍＬ）を加え、１００℃で３０分間加熱攪拌した。反応溶液を氷浴し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０に調整後、ジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して、化合物１２を淡黄色固体として得た（２．２２ｇ，５５％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）　δ６．６６（１Ｈ，ｓ），６．４３（１Ｈ，ｓ），４．５０（４Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，ｓ）
　化合物１２（１５３ｍｇ，０．７６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍＬ）に炭酸ナトリウム（９６８ｍｇ，９．１３ｍｍｏｌ）と臭化ベンジル（０．５４ｍＬ，４．５７ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１６時間攪拌した。反応溶液を室温に戻した後、蒸留水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）で精製し、化合物１３を白色固体として得た（３４５ｍｇ，８１％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）　δ７．２９－７．１９（１２Ｈ，ｍ），７．１６－７．０７（８Ｈ，ｍ），６．９４（１Ｈ，ｓ），６．６３（１Ｈ，ｓ），４．３７（４Ｈ，ｓ），４．３５（４Ｈ，ｓ），２．２３（３Ｈ，ｓ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，５６１．１９００；ｆｏｕｎｄ，５６１．１８３６（－６．４ｍｍｕ）
　化合物１４は文献に記載の方法で合成した（Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５）１２７：４８８８）。
　化合物１３（２１９ｍｇ，０．５０１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４ｍＬ）に窒素雰囲気下－７８℃にてｓｅｃ－ＢｕＬｉ（０．４８ｍＬ，０．５０１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。反応溶液に化合物１４（２０９ｍｇ，０．４５８ｍｍｏｌ）を加え、室温に昇温後２０分間攪拌した。反応溶液に２Ｍ塩酸水溶液を加え、室温で３０分間攪拌後、ジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝９８／２）で精製し、化合物１５を橙色固体として得た（１４０ｍｇ，４４％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）　δ７．３２－７．２３（６Ｈ，ｍ），７．２１－７．１０（１０Ｈ，ｍ），７．０７－７．０１（４Ｈ，ｍ），６．８７（２Ｈ，ｓ），６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），６．７９（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．４Ｈｚ），６．７６（１Ｈ，ｓ），６．４３（１Ｈ，ｓ），４．５２（４Ｈ，ｓ），４．３３（４Ｈ，ｓ），１．８２（３Ｈ，ｓ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，６９３．３１１２；ｆｏｕｎｄ，６９３．３０９９（－１．３ｍｍｕ）
　化合物１５（７２．９ｍｇ，０．１０５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ－ＴＨＦ＝１：１混合溶液（３ｍＬ）にＰｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下で室温にて２日間攪拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧留去した。残渣をジクロロメタン－ＭｅＯＨ＝４：１の混合溶液（１ｍＬ）に溶解し、クロラニル（５１．６ｍｇ，０．２１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌後、反応溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝９８／２）で精製し、橙色固体として化合物２を得た（５．３ｍｇ，１２％）。
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）　δ７．１７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．７１（１Ｈ，ｓ），６．５０－６．６０（４Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），１．８３（３Ｈ，ｓ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋，３３３．１２３４；ｆｏｕｎｄ，３３３．１２２３（－１．１ｍｍｕ）
［実施例３］ＤＡＦ－２による蛍光発光
　ＤＡＦ－２（製品型番：ＳＫ１００１－０１、五稜化薬）に対して、プロピオンアルデヒドを作用させると、以下の化合物１６が得られた。化合物１６は蛍光性であり、ベンゾイミダゾール環の形成に伴い、蛍光強度が増大することを確認した。アルデヒドとの反応前のＤＡＦ－２はジアミノベンゼン構造により蛍光が消光されているが、アルデヒドとの反応生成物である化合物１６は蛍光性を示した（表１）。アルデヒドと共有結合を形成することで、蛍光発光による検出が可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［実施例４］ＤＡＦ－２及び化合物２の光特性の変化
　各０．０２ｍｍｏｌ／ＬのＤＡＦ－２及び化合物２の１０ｍｍｏｌ／Ｌナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にプロピオンアルデヒドを終濃度が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、室温で４日間攪拌した。アルデヒド添加前と添加後の各溶液の吸収・蛍光スペクトルを測定した。その結果、図１に示す通り、アルデヒド添加後（ピークが大きいスペクトル）において、添加前（ピークが小さいスペクトル）よりも蛍光強度の増加が見られた。
［実施例５］ＤＡＦ－２及び化合物２による染色
　ＤＡＦ－２や化合物２のようなジアミノベンゼン構造を含む蛍光プローブについて、ヒト大腸粘膜組織の凍結薄切切片を陽性対照検体として、杯細胞の粘液における染色性を検討した。具体的にはホルマリン固定後の大腸粘膜組織から薄切凍結切片を切り出し、これを候補の蛍光プローブ群を用いて染色、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮像した。
　ＤＡＦ－２及び化合物２を用いて染色することにより、大腸粘膜・杯細胞の粘液を明瞭に染色することができた（図２）。具体的には、ホルマリン固定後のヒト大腸粘膜組織サンプルをＰＢＳでよく洗浄した後、３０％（ｗ／ｖ）スクロース含有ＰＢＳ中に浸し、その後、ティシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドを用いて凍結ブロックを作製した。この凍結ブロックを８μｍ厚に薄切し、凍結切片を作製した。凍結切片をＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＦ－２（５０μＭ）又は化合物２（５０μＭ）をＰＢＳで希釈した溶液を用いて室温で１日間染色した。その後、ＰＢＳでよく洗浄した後に水溶性の封入剤を用いて封入し、共焦点顕微鏡を用いて撮像を行った。同様に、腎糸球体の基底膜についても、ＤＡＦ－２及び化合物２を用いて染色することにより明瞭な描出が可能であった（図３）。
　また、ＤＡＦ－２又は化合物２による染色をＣＵＢＩＣ試薬による組織透明化法と併用することにより、大腸粘膜上皮の３Ｄイメージングも可能であった。具体的には、ホルマリン固定後のヒト大腸粘膜組織サンプルをＰＢＳでよく洗浄した後、緩やかに振盪しながら３７℃でＣＵＢＩＣ－Ｌ試薬を蒸留水で１／２に希釈した溶液に浸した。その後、ＣＵＢＩＣ－Ｌ試薬に浸し緩やかに振盪しながら３７℃で処理、この間１～２日に一度の間隔で、ＣＵＢＩＣ－Ｌを新しいものに交換した。その後、ＰＢＳでよく洗浄した後に、３０％（ｗ／ｖ）スクロース含有ＰＢＳ中に浸し、その後、ティシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドを用いて凍結ブロックを作製した。これを溶解の後、ＰＢＳでよく洗浄、１％過ヨウ素酸水溶液にて前処理を行った後に、ＤＡＦ－２（５０μＭ）をＰＢＳで希釈した溶液を用いて室温で３日間染色した。その後、ＰＢＳでよく洗浄した後に、ＣＵＢＩＣ－Ｒ＋試薬を蒸留水で１／２に希釈した溶液に浸し、室温で緩やかに振盪した。その後、緩やかに振盪しながら室温でＣＵＢＩＣ－Ｒ＋試薬に１日間浸し、共焦点顕微鏡を用いて撮像を行った。得られたデータをＢｉｔｐｌａｎｅ社　Ｉｍａｒｉｓを用いて３次元モデル化したものを図４Ａに示す。化合物２による染色についても同様にＣＵＢＩＣ試薬による組織透明化法と併用した場合の共焦点顕微鏡画像及び３次元モデル化した画像を図４Ｂに示す。
　以下、試験例Ａ～Ｈで用いた実験手順を説明する。
≪組織切片の蛍光染色≫
　染色対象の組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の３０％（ｗ／ｖ）スクロースに浸し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（４５８３３、Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ）中で－８０°Ｃで一晩凍結した。凍結組織を、クリオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ、Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって１０μｍの厚さに切断した。得られた凍結切片をＰＢＳで３回洗浄し、０．５％過ヨウ素酸（ＨＩＯ４）溶液（８６１７１、ＭＵＴＯ　ＰＵＲＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）で室温で３０分間前処理した。切片をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで希釈されたＦＡＭヒドラジド　５－アイソマー（５０μＭ、２４１７０、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、本明細書中、「ＦＡＭヒドラジド」と称する場合がある）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド（５０μＭ、Ａ１０４３６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジド（５０μＭ、１１４７０、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）又はフルオレセイン（５０μＭ、和光）中、室温で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、共焦点顕微鏡で画像を取得した。
≪ホールマウント３Ｄ組織染色（組織透明化と蛍光染色との併用）≫
　組織透明化には、ＣＵＢＩＣ－Ｌ及びＣＵＢＩＣ－Ｒ＋試薬（Ｔ３７４０及びＴ３７４１、東京化成工業）を使用した。組織除去手順を以下に簡単に説明する。
　ホルムアルデヒド固定組織標本をＰＢＳで洗浄し、続いて５０％（ｖ／ｖ）ＣＵＢＩＣ－Ｌ試薬（水：ＣＵＢＩＣ－Ｌの１：１混合物）に一晩浸漬した。さらに、穏やかに振とうしながらＣＵＢＩＣ－Ｌ試薬に３７°Ｃで５日間又は６日間浸漬した。次に、これらの標本をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の３０％（ｗ／ｖ）スクロースに浸し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド中で－８０°Ｃで一晩凍結した。次に、凍結した標本を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、０．５％過ヨウ素酸（ＨＩＯ４）溶液（８６１７１、ＭＵＴＯ　ＰＵＲＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）に室温で３０分間浸漬した。ＰＢＳで洗浄した後、標本を０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（１２９６７、ナカライテスク）を含むＰＢＳ中のＦＡＭヒドラジド５－アイソマー（５０μＭ）、化合物１（５０μＭ）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド（５０μＭ）、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジド（５０μＭ）又はフルオレセイン（５０μＭ）と共に室温で２日間又は３日間穏やかに振とうして、染色した。核の対比染色を行う場合は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１０μｇ／ｍＬ、Ｐ２１４９３、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＲｅｄＤｏｔ－２（１：１００、４００６１－Ｔ、Ｂｉｏｔｉｕｍ）も染色液に添加した。この染色ステップの後、標本をＰＢＳで洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）ＣＵＢＩＣ－Ｒ＋試薬（水：ＣＵＢＩＣ－Ｒ＋の１：１混合物）に一晩浸漬し、さらに、穏やかに振とうしながらＣＵＢＩＣ－Ｒ＋試薬に１日又は２日間浸漬した。これにより得られた透明組織標本は、共焦点蛍光顕微鏡又はライトシート蛍光顕微鏡による３Ｄイメージングに供した。ＦＡＭヒドラジド、化合物１、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジド、及びフルオレセインの励起波長としては、すべて４８８ｎｍを適用し、蛍光検出波長範囲はすべて４９０ｎｍ～５６２ｎｍであった。
≪顕微鏡観察及び画像解析≫
　３Ｄ画像は、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ８８０　Ｃｏｎｆｏｃａｌ／Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ、Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ）又はライトシート蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　Ｌｉｇｈｔｓｈｅｅｔ　７、Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ）を用いて取得した。すべての生画像データは、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（バージョン９．２．１、Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて再構築及び分析した。
≪統計解析≫
　２セットのデータの正規性は、０．０５の有意水準でコルモゴロフ－スミルノフ検定によって評価した。群中で正規性が確認された場合、分散の均一性を有意水準０．０５でＦ検定によってテストした。２つの群が等分散性を有して正規分布に従う場合はスチューデントのｔ検定を適用し、等分散性を有さずに正規分布に従う場合はウェルチのｔ検定を適用した。群中で正規性が確認されなかった場合には、マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。
［試験例Ａ］ヒト大腸粘膜凍結薄切標本の蛍光染色
　結腸直腸癌の外科標本の非腫瘍領域からサンプリングしたヒト結腸直腸粘膜組織切片に対して、ＦＡＭヒドラジド、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジド又は蛍光骨格であるフルオレセインを染色剤として用いて蛍光染色を行った。結果を図５に示す。
　図５に示される通り、ＦＡＭヒドラジド及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジドにおいて、杯細胞粘液における明瞭な陽性像が得られた。これらのシグナルは、ＨＩＯ４による酸化処理を行わなかった場合には得られなかったことから、アルデヒド基と、ＦＡＭヒドラジド及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジドのＮＨ２基とを介した反応が染色原理であると考えられた。また、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジドでは得られるシグナルが弱く、また、フルオレセインでは蛍光が観察されなかった。
［試験例Ｂ］ヒト大腸粘膜組織の透明化及び蛍光染色
　約４ｍｍ大四方に切除したホルマリン固定後ヒト大腸粘膜組織に対して、透明化処理、及び、ＦＡＭヒドラジド、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジド又はフルオレセインを染色剤として用いたホールマウント３Ｄ組織染色を行った。結果を図６～９に示す。
　図６に示される通り、３Ｄイメージングにおいて、ＦＡＭヒドラジドでは明瞭な立体像が得られた一方で、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド及びＢＤＰ　ＦＬヒドラジドでは得られるシグナルが弱く、また、フルオレセインでは蛍光が観察されなかった。
　一方、ＦＡＭヒドラジドを用いた場合には、大腸粘膜の陰窩における杯細胞及び基底膜が明瞭に染色され、これにより陰窩の立体的構造をきわめて明瞭にイメージングすることができた（図７）。また、３次元的画像解析を併用することにより、１陰窩レベルでのイメージングを行うことができた（図８ａ）。この観察から、正常な大腸陰窩では、杯細胞の含有する粘液は均一であり、規則正しく配列していることが分かる。好中球もまた、ＰＡＳ染色陽性の細胞のひとつであるが、ＦＡＭヒドラジドを用いた３Ｄ組織染色においても明瞭に染色され、このことは抗ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）抗体を用いた免疫組織染色によって確認された（図８ｂ、図中、「ＰＡＦｈｙ」はＦＡＭヒドラジドを表す）。また、ＨＩＯ４を用いた酸化処理を行わなかった場合には陽性シグナルが認められず、ＣＵＢＩＣを用いた３Ｄイメージング法においても、酸化により生じたアルデヒド基にＦＡＭヒドラジドのＮＨ２基が結合することが染色原理であると考えられた（図９）。
［試験例Ｃ］病理組織検体の３Ｄイメージング
　潰瘍性大腸炎を罹患する個体から採取した大腸組織検体に対して、透明化処理、及び、ＦＡＭヒドラジド又は化合物１を染色剤として用いたホールマウント３Ｄ組織染色を行った。結果を図１０に示す。
　図１０に示される通り、３Ｄイメージングにおいて、化合物１はＦＡＭヒドラジドと同様に好中球の明瞭な染色像を得ることができた。
　上述の実施例及び試験例で用いた染色剤（ＤＡＦ－２、化合物２、化合物１、ＦＡＭヒドラジド、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ヒドラジド、ＢＤＰ　ＦＬヒドラジド）はいずれも、励起波長が４００ｎｍ～５２０ｎｍの範囲内であり、緑色の蛍光を生じる。緑色の蛍光色素としては、蛍光量子収率及び光安定性の高さから、通常は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８が第一選択肢であり、実際に、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８を用いることにより、薄切切片の明瞭な染色が可能であった。その一方で、透明化処理後の厚みを有するサンプルの染色に関しては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８及びＢＤＰ　ＦＬヒドラジドを用いた場合には染色性が不十分であり、フルオレセイン骨格を有する化合物（ＤＡＦ－２、化合物２、化合物１、ＦＡＭヒドラジド）の染色性が際立って優れることが分かった。このような効果が奏される理由は定かではないが、これらの化合物は組織浸透性に優れること、透明化剤による影響を受け難いこと等が推測される。
［試験例Ｄ］病理組織検体の３Ｄイメージング
　潰瘍性大腸炎を罹患する個体から採取した大腸組織検体に対して、透明化処理、及び、ＦＡＭヒドラジドを染色剤として用いたホールマウント３Ｄ組織染色を行った。また、これらの処理を行う検体に連続した組織から古典的ＨＥ染色及びＰＡＳ染色スライドガラスを併せて作製した。結果を図１１～１３に示す。
　図１１に示される通り、高度の炎症細胞浸潤を伴う１例において、陰窩炎の所見、すなわち陰窩内に浸潤する好中球（▲で示す）と、炎症により杯細胞の粘液が減少している所見（Ｇｏｂｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）が明瞭にイメージングされた。次に、潰瘍性大腸炎に特徴的な、陰窩膿瘍の所見に着目したところ、同じ症例において陰窩膿瘍の所見が確認された（図１２）。この所見において、底部に微小膿瘍が形成され、これらの膿瘍は陰窩斜め下方より浸潤した好中球（▲で示す）により形成され、陰窩管腔を伝って上方にも好中球が分布していることが分かった。また、他の陰窩膿瘍のイメージングにおいても、膿瘍部分は陰窩底部優位であり、陰窩がほぼ完全に破壊され周囲との境界が不明瞭化した所見が見られた（図１３）。以上より、ＦＡＭヒドラジドを用いた３Ｄイメージング法は、潰瘍性大腸炎の病的陰窩構造の３次元的観察を可能とし、２次元的には評価の不可能な好中球の立体的分布パターンを可能とすることが分かった。
［試験例Ｅ］炎症性腸疾患の病理所見の３Ｄイメージング及び３Ｄイメージングに基づく病理診断１
　潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）及び非特異的腸炎（Ｎｏｎ－ＩＢＤ：大腸癌検体における非腫瘍部）の手術材料より組織小片を切り出し、その半分を用いて、透明化処理、及び、ＦＡＭヒドラジドを染色剤として用いたホールマウント３Ｄ組織染色を行った。また、残りの半分を用いて、古典的ＨＥ染色及びＰＡＳ染色のスライドガラスを作製した。
　図１４に示される通り、３Ｄ組織染色によれば、潰瘍性大腸炎の所見の１つとされる陰窩のねじれ（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ）が３次元的にイメージングでき、潰瘍性大腸炎において多く見られだけでなく、クローン病でも確認された。
　次に、２次元画像による診断が難しい炎症性腸疾患に関して、陰窩の３次元的構造を基準に診断する可能性を検討した。具体的には、陰窩のねじれの程度に着目し、これらをより定量的に評価するため、陰窩の３次元的解析において、体積（Ｖｏｌｕｍｅ）、楕円率（Ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ（ｐｒｏｌａｔｅ））、屈曲度（Ｔｏｒｔｕｏｓｉｔｙ）の３つのパラメータを定義し、潰瘍性大腸炎、クローン病及び非特異的腸炎の検体についてこれらの集学的観察及び定量化を行った。体積は、陰窩の３Ｄ画像を画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｒｉｓ）によって処理することによって求めた。楕円率は、陰窩の３Ｄ画像を楕円近似し、図１５に示す式から算出した。また、屈曲度は、陰窩を５分割したそれぞれの深さにおける光学スライスにおいて陰窩の中心部に点ａ～ｆを設定し、上端（点ａ）と下端（点ｆ）を結んだ直線距離（Ｄａ－ｆ）と、点ａ～ｆ間の隣り合うもの同士の距離（Ｄａ－ｂ、Ｄｂ－ｃ、Ｄｃ－ｄ、Ｄｄ－ｅ、Ｄｅ－ｆ）の総和を計算し、これらに基づいて算出した。
　すべての症例を用いて解析を行った結果、体積、楕円率及び屈曲度のいずれのパラメータにおいても、統計学的有意差が得られた（図１６）。具体的には、体積については潰瘍性大腸炎で他に２者に比べて増加しており、楕円率については潰瘍性大腸炎及びクローン病で非特異的腸炎に比べて値の低下が認められた。屈曲度については潰瘍性大腸炎、クローン病、非特異的腸炎の順に高い、値の差が認められた。また、病理診断医が非特異的腸炎と診断した症例のみで解析を行った場合でも、ほぼ同様の結果であり、３つのパラメータにおいて統計学的有意差が認められた（図１７）。このことから、陰窩のねじれを基準とした３次元的定量値により、２次元的な古典的病理診断法では難しい炎症性腸疾患の診断が可能となることが示唆される。
　従来の潰瘍性大腸炎、クローン病等の疾患の病理組織診断においては、一般に、陰窩膿瘍や類上皮肉芽腫といった特徴的所見の有無が有用な手がかりとなる。しかしながら、治療修飾等により炎症が著明でない症例においてはこのような所見が得られない場合があり、その場合には、病理組織学的には非特異的腸炎としか言えず、臨床情報を加味しない病理組織診断のみからは確定診断が難しいことが実際である。事実、潰瘍性大腸炎、クローン病、非特異的腸炎のＨＥ染色、ＰＡＳ染色スライドガラスを病理診断医が診断したところ、潰瘍性大腸炎の５８．６％、クローン病の６３．１％は非特異的腸炎と診断され、潰瘍性大腸炎の３１．０％、クローン病の２６．３％についても病理医間で診断が一致しなかった。なお、これらの組織検体は異なる色調の部位より採取されており、その炎症の程度については有意な差はなかった。
［試験例Ｆ］炎症性腸疾患の病理所見の３Ｄイメージング及び３Ｄイメージングに基づく病理診断２
　試験例Ｅで得た３Ｄ画像に関して、陰窩のねじれについて、より詳細な３次元的形態学的観察を行ったところ、潰瘍性大腸炎において、複数の陰窩が巻き込まれる形でねじれた構造が存在することが分かった（図１８ａ）。この構造において、複数の陰窩はいずれも同じ方向にねじれていた。このような隣接した２本以上の陰窩が同じ方向にねじれた３次元的所見を「Ｓｐｉｒａｌ　ｓｔａｉｒｃａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｃｒｙｐｔｓ」（ＳＳＣｓ）と定義し（図１８ｂ）、その所見の数を集計した。
　その結果、潰瘍性大腸炎の４６．４％にこの所見が見られ、その頻度はクローン病の２２．２％に比して多かった（図１８ｃ、ｄ）。また、非特異的腸炎には見られなかった。これらの結果は、炎症性腸疾患に特有の所見の有無により、２次元的な古典的病理診断法では難しい炎症性腸疾患の診断が可能となることを示唆したものである。なお、この所見は、隣接する複数の陰窩が巻き込まれた同一領域ごと、おそらく炎症や線維化により圧力の差により、ねじれたことが成立要因と推定された（図１８ｅ）。
［試験例Ｇ］ヒト大腸粘膜組織の３Ｄイメージング
　ヒト大腸腺腫ポリープ全体を、ＦＡＭヒドラジド及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を染色剤として用いて３Ｄ組織染色し、ライトシート顕微鏡で観察及び３Ｄイメージングした。結果をＨＥ染色及びＰＡＳ染色画像と併せて図１９に示す。
　図１９に示すように、ヒト大腸腺腫ポリープ表層の入り組んだ隆起性の構造が観察できた。
［試験例Ｈ］真菌菌糸の３Ｄイメージング
　肺アスペルギルス症組織における真菌菌糸を、ＦＡＭヒドラジド及びＲｅｄＤｏｔ（Ｒ）２を染色剤として用いて３Ｄ組織染色し、共焦点顕微鏡で観察及び３Ｄイメージングした。結果をＨＥ染色及びＰＡＳ染色画像と併せて図２０に示す。
　図２０に示すように、真菌菌糸の構造を明瞭に描出することができた。
　本発明の蛍光染色方法によれば、３次元立体構造をもち、透明化処理された組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を好適に検出することができることから、例えば、腸陰窩の立体的構造における病変の確認に寄与し得る。

 

Claims (21)

  1. 　組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色する方法であって、
    　以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と該組織又は細胞サンプルとを接触させることを含む、方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［一般式（Ｉ）中、
    　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
    　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
    　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
    　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
    　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）、－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
    　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
    　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
  2. 　前記化合物又はその塩と前記組織又は細胞サンプルとを接触させる前に、前記組織又は細胞サンプル中のグリコール基を酸化させてアルデヒド基を生成させることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記組織又は細胞サンプルが、３次元立体構造を有する、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記組織又は細胞サンプルが、透明化処理された組織又は細胞サンプルである、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記組織又は細胞サンプルを親水性透明化剤で処理することにより透明化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を検出する方法であって、
    　請求項１から５のいずれか１項に記載の方法により、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び
    　前記化合物由来の蛍光を測定すること、を含む方法。
  7. 　グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化する方法であって、
    　請求項１から５のいずれか１項に記載の方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び
    　前記化合物由来の蛍光を測定及び画像化すること、を含む方法。
  8. 　前記グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞が、粘膜上皮、基底膜又は真菌である、請求項７に記載の方法。
  9. 　陰窩を可視化する方法である、請求項７に記載の方法。
  10. 　組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質が多く含まれる組織及び／又は病変を判定する方法であって、
    　請求項１から５のいずれか１項に記載の方法により、組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、及び
    　染色された部位に該組織及び／又は病変が存在すると判定すること、を含む方法。
  11. 　前記病変が、陰窩のねじれである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患の治療薬をスクリーニングする方法であって、
    　該疾患に罹患している個体に治療薬候補を投与すること、
    　該個体から該病変が生じる組織又は細胞サンプルを採取すること、
    　請求項１から５のいずれか１項に記載の方法により、該組織又は細胞サンプル中のグリコール基を含む物質を蛍光染色すること、
    　前記化合物由来の蛍光を測定及び画像化して、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化すること、及び
    　可視化された該グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の像に基づいて、治療薬候補の治療効果を判定すること、を含む、方法。
  13. 　前記疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含み、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞を可視化するために用いられる、蛍光染色用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［一般式（Ｉ）中、
    　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
    　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
    　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
    　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
    　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）、－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
    　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
    　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
  15. 　陰窩を可視化するために用いられる、請求項１４に記載の蛍光染色用組成物。
  16. 　親水性透明化剤をさらに含む、請求項１４に記載の蛍光染色用組成物。
  17. 　下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、グリコール基を含む物質を含む組織又は細胞の病変を伴う疾患の診断用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［一般式（Ｉ）中、
    　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
    　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
    　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基、ヒドロキシルアミノ基、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
    　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
    　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）、－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
    　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
    　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
  18. 　前記疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１７に記載の診断用組成物。
  19. 　親水性透明化剤をさらに含む、請求項１７に記載の診断用組成物。
  20. 　下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［一般式（Ｉ）中、
    　Ｒ１は、カルボキシル基、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
    　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれフッ素原子を表し；
    　Ｘは、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、ヒドラジノ基又はヒドロキシルアミノ基を示し；
    　Ｙは、存在しないか、アミド基、エステル基、カルバミド基、チオウレア基、カルバメート基、カーボネート基又は酸素原子を示し；
    　Ｌは、－（直鎖若しくは分岐アルキレン）ｎ－（ｎは１～１０の整数）、－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（ｎは１～１０の整数）又は－（直鎖若しくは分岐アルキレン－Ｏ－）ｎ－（直鎖アルキレン）ｍ－（ｎ及びｍは、それぞれ独立に１～１０の整数）を示すか、あるいは、単結合を示し；
    　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
    　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
  21. 　下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［一般式（Ｉ）中、
    　Ｒ１は、置換されても良いアルキル基、置換されても良いアルコキシ基又はハロゲン原子を示し；
    　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基（ＯＨ基）、ハロゲン原子又は置換されても良い直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
    　Ｘは、アミノ基又はアルキルアミノ基を示し；
    　Ｙは、存在せず；
    　Ｌは、単結合を示し；
    　ｐは、０～４の整数を示し、ｐが２以上である場合は、Ｒ１は同一であっても異なっていてもよく；
    　ｑは、１～２の整数を示し、ｑが２の場合は、（Ｘ－Ｌ－Ｙ）で示される構造は同一であっても異なっていてもよく、ｐとｑの和は５以下の整数である。］
     

     
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