[go: up one dir, main page]

WO2023195516A1 - ペプチド化合物の製造方法 - Google Patents

ペプチド化合物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023195516A1
WO2023195516A1 PCT/JP2023/014205 JP2023014205W WO2023195516A1 WO 2023195516 A1 WO2023195516 A1 WO 2023195516A1 JP 2023014205 W JP2023014205 W JP 2023014205W WO 2023195516 A1 WO2023195516 A1 WO 2023195516A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
amino acid
membrane
group
fmoc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/014205
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正次郎 篠原
雄也 森田
効彦 中野
岳 江村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority to KR1020247036206A priority Critical patent/KR20240169679A/ko
Priority to US18/854,568 priority patent/US20250276995A1/en
Priority to JP2024514310A priority patent/JPWO2023195516A1/ja
Priority to EP23784800.7A priority patent/EP4488283A1/en
Priority to CN202380022408.6A priority patent/CN118715234A/zh
Publication of WO2023195516A1 publication Critical patent/WO2023195516A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C267/00—Carbodiimides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a peptide compound.
  • Peptides are molecules made up of many amino acids linked together, and play an essential role in the life activities of organisms. With the development of biology and chemistry, the understanding of peptides has deepened, and the use of natural peptides with the aim of creating new medicines, as well as research and development of functional peptides by artificially designing peptides, are actively being carried out. Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 3
  • Non-Patent Document 4 a liquid phase method and a solid phase method
  • the solid phase method is a method in which a target peptide is synthesized by sequentially bonding amino acids using a polymer resin (resin for solid phase synthesis) as a stationary phase
  • Non-Patent Document 5 a polymer resin (resin for solid phase synthesis) as a stationary phase
  • Non-Patent Document 6 peptide array technology using membranes such as cellulose as a stationary phase has evolved, and is attracting attention as a technology for rapidly and automatically synthesizing peptides for many samples in small amounts
  • Non-Patent Document 6 peptide array technology that uses a membrane such as cellulose as a stationary phase
  • drug-like peptides contain a large amount of N-alkyl amino acids, making the amidation reaction difficult to synthesize.
  • Non-Patent Document 7 when the reaction conditions described in Non-Patent Document 7 were used in the amidation reaction between N-methylphenylalanine bound to the membrane solid phase and Fmoc-norleucine, the reaction conversion rate was 3 to 4%. there were.
  • the conditions described in the method for synthesizing peptides containing N-substituted amino acids (Patent Document 2) using diisopropylcarbodiimide (DIC) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) were used as reference.
  • the reaction conversion rate was 50-64%.
  • One aspect of the present invention is to improve the reaction conversion rate in a peptide synthesis method, particularly in the condensation reaction step.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for efficiently producing a highly pure peptide compound using amidation conditions that avoid crystal precipitation and enable application to automated synthesis. do.
  • the method of the present invention is not limited to peptide array technology using a membrane as a stationary phase, but is also applicable to solid phase synthesis using a polymer resin (resin for solid phase synthesis) as a stationary phase.
  • [A1] A method for producing a peptide compound by a solid phase method, comprising: a preparatory step of preparing a first amino acid having an amino group or a first peptide having an amino group supported on a solid phase; and a first amino acid or a first peptide and a protected amino group and/or a protected hydroxyl group; group, and a second amino acid having a carboxy group, or a second peptide having a protected amino group and/or a protected hydroxy group, and a carboxy group, at least one carbodiimide represented by the following general formula (A).
  • [A2] The method according to [A1], wherein R A is C 4 -C 10 secondary alkyl.
  • [A2-1] The method according to [A1], wherein R A is C 4 -C 8 secondary alkyl.
  • [A2-2] The method according to [A1], wherein R A is C 4 to C 8 secondary or tertiary alkyl having an asymmetric carbon.
  • [A2-3] The method according to [A1], wherein R A is C 4 -C 8 secondary alkyl having an asymmetric carbon.
  • [A2-4] The method according to [A1], wherein R A is C 4 -C 6 secondary alkyl having an asymmetric carbon.
  • [A2-5] The method according to [A1], wherein R A is 1-methylheptyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl or sec-butyl.
  • [A2-6] The method according to [A1], wherein R A is sec-butyl.
  • R B is C 3 -C 10 secondary or tertiary alkyl, C 6 -C 10 aryl or C 7 -C 14 arylalkyl, and each group in R B is halogen, C 1 -C according to [ A1] or [A2], optionally substituted by one or more groups independently selected from 6-alkoxy, di-C 1 -C 6- alkylamino, or 4- to 8-membered cyclic amino Method.
  • [A3-1] The method according to [A1] or [A2], wherein R B is C 3 to C 10 secondary or tertiary alkyl.
  • [A3-2] The method according to [A1] or [A2], wherein R B is C 3 to C 10 secondary or tertiary alkyl, or C 7 to C 14 arylalkyl.
  • [A3-3] The method according to [A1] or [A2], wherein R B is C 3 to C 10 secondary alkyl or C 7 to C 10 arylalkyl.
  • [A3-4] The method according to [A1] or [A2], wherein R B is C 3 -C 6 secondary alkyl.
  • [A3-5] The method according to [A1] or [A2], wherein R B is 1-methylbenzyl, 1-methylheptyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl or sec-butyl.
  • [A3-6] The method according to [A1] or [A2], wherein R B is sec-butyl.
  • R A is C 4 -C 8 secondary or tertiary alkyl
  • R B is C 4 -C 10 secondary or tertiary alkyl, or C 7 -C 14 arylalkyl, The method described in [A1].
  • R A is C 4 - C 8 secondary alkyl
  • R B is C 4 - C 10 secondary alkyl, or C 7 - C 14 arylalkyl, according to [A1] Method.
  • R A is C 4 - C 6 secondary alkyl
  • R B is C 4 - C 8 secondary alkyl, or C 7 - C 10 arylalkyl, according to [A1] Method.
  • R A is a C 4 to C 8 secondary or tertiary alkyl having an asymmetric carbon
  • R B is a C 3 to C 10 secondary or tertiary alkyl, [A1] Method described.
  • R A is C 4 -C 8 secondary alkyl having an asymmetric carbon
  • R B is C 4 -C 10 secondary alkyl, or C 7 -C 14 arylalkyl, [ A1].
  • R A is C 4 -C 8 secondary alkyl having an asymmetric carbon
  • R B is C 4 -C 10 secondary alkyl, or C 7 -C 10 arylalkyl, [ A1].
  • R A is C 4 -C 6 secondary alkyl having an asymmetric carbon
  • R B is C 4 -C 8 secondary alkyl, or C 7 -C 10 arylalkyl, [ A1].
  • the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'-(1 -Methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine (SS29), and N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30), the method according to any one of [A1] to [A5].
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-
  • the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'- (1-Methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), or N'-(1-ethylpropyl)-N-(1 -Methylbutyl)methanediimine (SS30).
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • SS27 N'- (1-Methylheptyl)-N-sec-butyl-me
  • the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'- (1-Methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), or N'-(1-ethylpropyl)-N-(1 -Methylbutyl)methanediimine (SS30), the method according to any one of [A1] to [A5].
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • SS27 N'- (1-Methy
  • [A6-3] The method according to any one of [A1] to [A5], wherein the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC).
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • [A6-4] The method according to any one of [A1] to [A5], wherein the carbodiimide condensing agent is N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26).
  • [A6-5] The method according to any one of [A1] to [A5], wherein the carbodiimide condensing agent is N'-(1-methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27).
  • the additive is 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzo From triazine (HOOBt), ethyl cyano(hydroxyimino)acetate (Oxyma), and 5-(hydroxyimino)-1,3-dimethylpyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione (Oxyma B) The method according to any one of [A1] to [A6], which is at least one selected from the group consisting of: [A8] The method according to any one of [A1] to [A6], wherein the additive is at least one selected from the group consisting of HOAt, HOOBt, and Oxyma.
  • the condensation step is performed in a solvent, and the concentration of the carbodiimide condensing agent in the solvent is 4.0 mol/L or less, 3.0 mol/L or less, 2.0 mol/L or less, or 1.0 mol/L.
  • the condensation step is performed in a solvent, and the concentration of the carbodiimide condensing agent in the solvent is 0.4 to 4.0 mol/L, 0.5 to 3.0 mol/L, 0.6 to 2.0 mol. /L, or 0.7 to 1.0 mol/L, the manufacturing method according to any one of [A1] to [A11].
  • [A13] The production method according to any one of [A1] to [A11], wherein the condensation step is performed in a solvent, and the concentration of the carbodiimide condensing agent in the solvent is 0.7 to 1.0 mol/L. .
  • [A14] The production method according to any one of [A1] to [A13], wherein the solid phase is a membrane or a resin for solid phase synthesis.
  • [A15] The production method according to any one of [A1] to [A13], wherein the solid phase is a membrane.
  • [A16] The method according to [A15], wherein the membrane is a cellulose membrane, a polypropylene membrane, or a polyaminoethylmethacrylamide membrane.
  • the method described in. [A21-1] The method according to any one of [A1] to [A20], wherein the solid phase and the first amino acid or the first peptide are bonded via a photocleavable site.
  • [A21-3] The method according to any one of [A1] to [A20], wherein the solid phase and the first amino acid or the first peptide are bonded via an acid-labile site.
  • [A22] The method according to [A21-1], wherein the photocleavable site has a nitroberatryloxycarbonyl residue or a coumarin residue.
  • [A22-1] The method according to [A21-1], wherein the photocleavable site is a nitroberatryloxycarbonyl residue.
  • the acid labile site is a trityl ester structure, a chlorotrityl ester structure, an alkoxybenzyl ether structure, a trialkoxybenzylaminocarbonyl structure, a dialkoxyphenyl-alkoxyphenylmethylaminocarbonyl structure, or an alkoxyxanthene-9-ylaminocarbonyl structure
  • the method according to [A21-3] having the structure.
  • [A23-1] The method according to [A21-3], wherein the acid-labile site has a chlorotrityl ester structure.
  • [A24] In the condensation step, 1.0 equivalent or more, 1.1 equivalent or more, or 1.2 equivalent or more of a carbodiimide condensing agent is used with respect to the second amino acid or second peptide, [A1] The method according to any one of ⁇ [A23]. [A25] In the condensation step, 5.0 equivalents or less, 4.0 equivalents or less, 3.0 equivalents or less, 2.0 equivalents or less, or 1.5 equivalents with respect to the second amino acid or second peptide The method according to any one of [A1] to [A24], using the following carbodiimide condensing agent. [A26] In the condensation step, 1.0 to 5.0 equivalents, 1.1 to 4.0 equivalents, 1.1 to 3.0 equivalents, 1.
  • [A31] The method according to any one of [A1] to [A29], wherein in the condensation step, 0.3 to 0.7 equivalents of the additive are used with respect to the second amino acid or the second peptide.
  • [A32] The method according to any one of [A1] to [A31], wherein the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is a non-natural amino acid.
  • the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is an ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acid, a ⁇ -branched amino acid, or an N-alkylamino acid (however, the alkyl in the N-alkylamino acid is a C 3 -C6 cycloalkyl, C2 - C6 alkenyl, C2 - C6 alkynyl, or C6 - C10 aryl) , [A1] to [A32].
  • the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is an N-alkyl amino acid in which the alkyl has 1 to 8 carbon atoms (however, the alkyl is halogen, cyano, C 3 to C 6 cyclo [A1] optionally substituted by one or more groups independently selected from alkyl, C 2 -C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, or C 6 -C 10 aryl), The method according to any one of ⁇ [A32].
  • the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is an N-alkylamino acid, an N-alkylamino acid whose alkyl has 1 to 8 carbon atoms, and an alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • [A36] The method according to any one of [A1] to [A32], wherein the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is an N-methyl amino acid.
  • [A37] The method according to any one of [A1] to [A36], wherein the second amino acid or the C-terminal amino acid of the second peptide is a non-natural amino acid.
  • [A38] Any of [A1] to [A37], wherein the second amino acid or the C-terminal amino acid of the second peptide is an ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acid, a ⁇ -branched amino acid, or an N-alkyl amino acid. Method described in Crab.
  • [A39] The method according to any one of [A1] to [A38], wherein the protecting group in the protected amino group is a group represented by the following formula (1); (wherein R 1 -R 8 are independently selected from the group consisting of hydrogen, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 fluoroalkyl, halogen, sulfo, and trimethylsilyl, and R 9 -R 10 are independently hydrogen or methyl).
  • the protecting group in the protected amino group is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, Fmoc (2,7tb) group, Fmoc (1Me) group, Fmoc (2F) group, Fmoc (2,7Br) group group, mio-Fmoc group, dio-Fmoc group, tdf-Fmoc group, Fmoc (2TMS) group, Fmoc (2so3h) group, sm-Fmoc group, or rm-Fmoc group, [A1] to [A38] Any method described.
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
  • [A41] The method according to any one of [A1] to [A38], wherein the protecting group in the protected amino group is an Fmoc group.
  • [A42] The method according to any one of [A1] to [A41], wherein the condensation step is performed in a solvent.
  • the solvent includes at least one selected from the group consisting of an amide solvent, a urea solvent, an ether solvent, a halogen solvent, a nitrile solvent, and a benzene solvent. .
  • the solvent is an amide solvent.
  • Amide solvents include N,N-dimethylformamide (DMF), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), dimethylacetamide (DMA), N-ethyl-2-pyrrolidone (NEP), and N-butyl-
  • the method according to [A44] which is selected from the group consisting of 2-pyrrolidone (NBP) and formamide.
  • NBP 2-pyrrolidone
  • the method according to [A43], wherein the solvent is a urea solvent.
  • the urea solvent is selected from the group consisting of 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI) and N,N'-dimethylpropylene urea (DMPU). .
  • the ether solvent is selected from the group consisting of tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, and 4-methyltetrahydropyran.
  • the solvent is a halogen solvent.
  • the halogenated solvent is selected from the group consisting of dichloromethane and 1,2-dichloroethane.
  • the method according to [A43], wherein the solvent is a nitrile solvent.
  • the condensation step is performed at 0°C to 100°C, 10°C to 80°C, 10°C to 60°C, 10°C to 50°C, 10°C to 40°C, 10°C to 35°C, 15°C to 60°C, 20°C
  • [A58] The method according to any one of [A1] to [A57], wherein the condensation step is repeated two or more times.
  • [A59] The method according to any one of [A1] to [A57], wherein the condensation step is repeated twice.
  • [A60] After the condensation step, [A1 ] to [A59].
  • [A61] The method according to [A60], further comprising a washing step of washing the solid phase between the condensation step and the deprotection step.
  • [A62] Repeat the condensation step and deprotection step multiple times (however, the multiple second amino acids and/or second peptides used in the multiple condensation steps may be the same or different, respectively) ), [A60] or the method described in [A61].
  • [A63] Use of the carbodiimide condensing agent represented by the above formula (A) in the method according to any one of [A1] to [A62].
  • [A64] Use of DsBC in the method according to any one of [A1] to [A62].
  • R A and R B in the above general formula (A) it becomes possible to maintain a high concentration of active ester in the reaction system for a long time, and it is possible to further improve the reaction conversion rate in the condensation reaction process.
  • [A4] to [A4-2] are preferred from the viewpoint of possible amidation, and [A5] is preferred from the viewpoint of efficient amidation even in automatic synthesis by avoiding precipitation of urea derived from carbodiimide to a high degree even at high concentrations. ] to [A5-3] are preferred.
  • [A1] to [A64] methods for producing peptide compounds using solid phase methods have been described, but these production methods can also be applied to liquid phase methods. That is, one aspect of the present invention provides the following [A1'].
  • [A1′] may include features other than the solid phase among [A2] to [A64].
  • [A1′] A method for producing a peptide compound by a liquid phase method, comprising: A preparation step of preparing a first amino acid having an amino group or a first peptide having an amino group; and a first amino acid or a first peptide having a protected amino group and/or a protected hydroxy group, and a carboxy group.
  • a second amino acid, a protected amino group and/or a protected hydroxyl group, and a second peptide having a carboxy group are combined with at least one carbodiimide condensing agent represented by the above general formula (A) and an additive.
  • the method comprises a condensation step of condensing in the presence of According to this method, the desired peptide compound can be obtained at a high reaction conversion rate.
  • the present invention also provides the following [B1] to [B63].
  • [B1] A method for producing a peptide compound by a solid phase method, comprising: a preparatory step of providing a first amino acid having an N-alkylamino group or a first peptide having an N-alkylamino group at the N-terminus supported on a solid phase; and a first amino acid or a first peptide.
  • R A' is C 3 -C 10 alkyl, C 6 -C 10 aryl or C 7 -C 14 arylalkyl
  • R B' is C 1 -C 10 alkyl, C 6 -C 10 aryl or C 7 -C 14 arylalkyl
  • each group in R A' and R B' is independently from halogen, C 1 -C 6 alkoxy, diC 1 -C 6 alkylamino, or 4- to 8-membered cyclic amino.
  • R A' may be substituted with one or more groups selected as follows.However, the total number of carbon atoms in R A' is 4 or more.)
  • R A' is C 4 -C 10 alkyl, C 4 -C 6 alkyl, or C 4 alkyl.
  • [B3] The method according to [B1] or [B2], wherein R B' is C 1 -C 10 alkyl, C 6 -C 10 aryl or C 7 -C 14 arylalkyl.
  • [B3-1] The method according to [B1] or [B2], wherein R B' is C 1 to C 10 alkyl.
  • [B3-2] The method according to [B1] or [B2], wherein R B' is C 2 to C 6 alkyl.
  • [B3-3] The method according to [B1] or [B2], wherein R B' is C 4 alkyl.
  • the carbodiimide condensing agent is DsBC, 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide (tBEC), di-tert-butylcarbodiimide (DtBC), 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDCI).
  • N,N'-di-sec-butylcarbodiimide DsBC
  • N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine SS26
  • N'-(1-methylheptyl)-N -sec-butyl-methanediimine SS27
  • N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine SS28
  • N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine SS29
  • N'-(1- ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine SS30
  • the carbodiimide condensing agent is DsBC, 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide (tBEC), di-tert-butylcarbodiimide (DtBC), and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl
  • tBEC 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide
  • DtBC di-tert-butylcarbodiimide
  • EDCI 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl
  • the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'-(1 -Methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine (SS29), and N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30), the method according to any one of [B1] to [B3].
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-
  • the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'- (1-Methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), or N'-(1-ethylpropyl)-N-(1 -Methylbutyl)methanediimine (SS30), the method according to any one of [B1] to [B3].
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • SS27 N'- (1-Methy
  • the carbodiimide condensing agent is N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'- (1-Methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), or N'-(1-ethylpropyl)-N-(1 -Methylbutyl)methanediimine (SS30), the method according to any one of [B1] to [B3].
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • SS27 N'- (1-Methy
  • [B5-3] The method according to any one of [B1] to [B3], wherein the carbodiimide condensing agent is DsBC.
  • [B5-4] The method according to any one of [B1] to [B3], wherein the carbodiimide condensing agent is N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26).
  • [B5-5] The method according to any one of [B1] to [B3], wherein the carbodiimide condensing agent is N'-(1-methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27).
  • [B6] The method according to any one of [B1] to [B5], wherein the additive is at least one selected from the group consisting of HOAt, HOBt, HOOBt, and Oxyma.
  • the additive is at least one selected from the group consisting of HOAt, HOOBt, and Oxyma.
  • [B8] The method according to any one of [B1] to [B5], wherein the additive is HOAt, HOOBt, or Oxyma.
  • the concentration of the carbodiimide condensing agent in the solvent is 0.5 to 3.0 mol/L, 0.6 to 2.0 mol/L, or 0.7 to 1.0 mol/L. , [B1] to [B10].
  • the solid phase is a membrane or a resin for solid phase synthesis.
  • [B14] The production method according to any one of [B1] to [B12], wherein the solid phase is a membrane.
  • the membrane is a cellulose membrane, a polypropylene membrane, or a polyaminoethylmethacrylamide membrane.
  • the membrane is a cellulose membrane.
  • the solid phase is a resin for solid phase synthesis.
  • [B20-1] The method according to any one of [B1] to [B19], wherein the solid phase and the first amino acid or the first peptide are supported via a photocleavable site.
  • [B20-2] The method according to any one of [B1] to [B19], wherein the solid phase and the first amino acid or the first peptide are bonded via a disulfide bond.
  • [B20-3] The method according to any one of [B1] to [B19], wherein the solid phase and the first amino acid or the first peptide are bonded via an acid-labile site.
  • [B21] The method according to [B20-1], wherein the photocleavable site has a nitroberatryloxycarbonyl residue or a coumarin residue.
  • the acid labile moiety is a trityl ester structure, a chlorotrityl ester structure, an alkoxybenzyl ether structure, a trialkoxybenzylaminocarbonyl structure, a dialkoxyphenyl-alkoxyphenylmethylaminocarbonyl structure, or an alkoxyxanthene-9-ylaminocarbonyl structure.
  • the method according to [B20-3] having the structure.
  • [B22-1] The method according to [B20-3], wherein the acid-labile site has a chlorotrityl ester structure.
  • [B23] In the condensation step, 1.0 equivalent or more, 1.1 equivalent or more, or 1.2 equivalent or more of a carbodiimide condensing agent is used with respect to the second amino acid or second peptide, [B1] The method according to any one of ⁇ [B22]. [B24] In the condensation step, 5.0 equivalents or less, 4.0 equivalents or less, 3.0 equivalents or less, 2.0 equivalents or less, or 1.5 equivalents with respect to the second amino acid or second peptide The method according to any one of [B1] to [B23], using the following carbodiimide condensing agent. [B25] In the condensation step, 1.0 to 5.0 equivalents, 1.1 to 4.0 equivalents, 1.1 to 3.0 equivalents, 1.
  • [B31] The method according to any one of [B1] to [B30], wherein the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is a non-natural amino acid.
  • the alkyl in the N-alkylamino group of the first amino acid, or the alkyl in the N-alkylamino group of the N-terminal amino acid of the first peptide is C 1 to C 10 alkyl, C 1 to C 6 alkyl, or C 1 -C 3 alkyl, where alkyl is halogen, cyano, C 1 -C 6 alkoxy, C 3 -C 6 cycloalkyl, C 2 -C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, or optionally substituted with one or more groups independently selected from C 6 -C 10 aryl), the method according to any one of [B1] to [B31].
  • the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is an N-alkyl amino acid in which the alkyl has 1 to 8 carbon atoms (however, the alkyl is halogen, cyano, C 1 to C 6 alkoxy , C3 - C6 cycloalkyl, C2 - C6 alkenyl, C2 - C6 alkynyl, or C6 - C10 aryl. ), the method according to any one of [B1] to [B32].
  • the first amino acid or the N-terminal amino acid of the first peptide is an N-alkylamino acid, an N-alkylamino acid whose alkyl has 1 to 8 carbon atoms, an N-alkylamino acid whose alkyl has 1 to 6 carbon atoms,
  • [B38] The method according to any one of [B1] to [B37], wherein the protecting group in the protected amino group is a group represented by the following formula (1); (wherein R 1 -R 8 are independently selected from the group consisting of hydrogen, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 fluoroalkyl, halogen, sulfo, and trimethylsilyl, and R 9 -R 10 are independently hydrogen or methyl).
  • the protecting group in the protected amino group is Fmoc group, Fmoc (2,7tb) group, Fmoc (1Me) group, Fmoc (2F) group, Fmoc (2,7Br) group, mio-Fmoc group, dio-Fmoc group. group, tdf-Fmoc group, Fmoc (2TMS) group, Fmoc (2so3h) group, sm-Fmoc group, or rm-Fmoc group, the method according to any one of [B1] to [B37]. [B40] The method according to any one of [B1] to [B37], wherein the protecting group in the protected amino group is an Fmoc group.
  • [B41] The method according to any one of [B1] to [B40], wherein the condensation step is performed in a solvent.
  • the solvent includes at least one selected from the group consisting of an amide solvent, a urea solvent, an ether solvent, a halogen solvent, a nitrile solvent, and a benzene solvent.
  • the solvent is an amide solvent.
  • the amide solvent is selected from the group consisting of DMF, NMP, DMA, NEP, NBP, and formamide.
  • the solvent is a nitrile solvent.
  • the nitrile solvent is acetonitrile.
  • the solvent is a benzene-based solvent.
  • the benzene-based solvent is selected from the group consisting of benzene, toluene, and xylene.
  • the condensation step is performed at 0°C to 100°C, 10°C to 80°C, 10°C to 60°C, 10°C to 50°C, 10°C to 40°C, 10°C to 35°C, 15°C to 60°C, 20°C
  • [B58] The method according to any one of [B1] to [B56], wherein the condensation step is repeated twice. [B59] After the condensation step, [B1 ] to [B58]. [B60] The method according to [B59], further comprising a washing step of washing the solid phase between the condensation step and the deprotection step. [B61] Repeat the condensation step and deprotection step multiple times (however, the multiple second amino acids and/or second peptides used in the multiple condensation steps may be the same or different, respectively) ), [B59] or the method described in [B60]. [B62] Use of a carbodiimide condensing agent represented by formula (A') in the method according to any one of [B1] to [B61].
  • [B63] Use of DsBC in the method according to any one of [B1] to [B61].
  • [B1] to [B63] methods for producing peptide compounds using solid phase methods have been described, but these production methods can also be applied to liquid phase methods. That is, one aspect of the present invention provides the following [B1'].
  • [B1'] may include features other than the solid phase among [B2] to [B63].
  • a method for producing a peptide compound by a liquid phase method comprising: a preparatory step of providing a first amino acid having an N-alkylamino group or a first peptide having an N-alkylamino group at the N-terminus; and a first amino acid or a first peptide with a protected amino group and/or or a second amino acid having a protected hydroxy group and a carboxyl group, or a second peptide having a protected amino group and/or a protected hydroxy group and a carboxyl group, at least
  • the method described above comprising a condensation step in which condensation is performed in a solvent in the presence of one type of carbodiimide condensing agent and an additive, and the concentration of the carbodiimide condensing agent in the solvent is 0.4 to 4.0 mol/L. .
  • the desired peptide compound can be obtained at a high reaction conversion rate.
  • the present invention also provides the following [C1] to [C16].
  • [C1] A method for producing a peptide compound supported on a membrane, comprising the method according to any one of [A1] to [A64] or [B1] to [B63].
  • [C2] The method according to [C1], wherein the peptide compound supported on the membrane has two or more constituent units derived from N-alkylamino acids.
  • [C3] The method according to [C1] or [C2], wherein the peptide compound supported on the membrane has 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, or 7 or more constituent units derived from N-alkyl amino acids.
  • [C4] The method according to any one of [C1] to [C3], wherein the peptide compound supported on the membrane has 7 or more constituent units derived from N-alkylamino acids.
  • [C5] The method according to any one of [C1] to [C4], wherein the peptide compound supported on the membrane has a total of 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more constitutional units derived from amino acids.
  • [C6] The method according to any one of [C1] to [C5], wherein the peptide compound has a total of 10 or more constitutional units derived from amino acids.
  • the method described in. [C8] The method according to any one of [C1] to [C7], wherein the peptide compound has a total of 15 or less constitutional units derived from amino acids.
  • [C9] A method for producing a peptide library supported on a membrane, the method comprising the step of obtaining 10 or more types of peptide compounds supported on a membrane by the method according to any one of [C1] to [C8].
  • a method for producing a peptide library supported on a membrane comprising the step of obtaining a compound.
  • [C11] A method for producing a peptide library supported on a membrane, the method comprising the step of obtaining 384 or more types of peptide compounds supported on a membrane by the method according to any one of [C1] to [C8].
  • [C13] The method according to any one of [C1] to [C12], further comprising the step of cutting out the peptide compound from the peptide compound supported on the membrane.
  • [C14] The method according to [C13], wherein the peptide compound is excised by light irradiation.
  • [C15] A method for producing a cyclic peptide or a cyclic peptide library, comprising the step of cyclizing a peptide compound excised by the method described in [C13] or [C14].
  • [C16] The method according to [C15], which uses an automatic synthesizer.
  • the present invention also provides the following [D1] to [D6].
  • [D1] A peptide compound bonded to a membrane via a linker, the peptide compound having two or more constituent units derived from N-alkyl amino acids.
  • [D2] The peptide compound according to [D1], wherein the peptide compound has 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, or 7 or more constitutional units derived from N-alkyl amino acids.
  • [D3] The peptide compound according to [D1] or [D2], wherein the peptide compound has a total of 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more constitutional units derived from amino acids.
  • [D5] A peptide library comprising 10 or more types of peptide compounds bound to a membrane via a linker, according to any one of [D1] to [D4].
  • the present invention also provides the following [E1] to [E3].
  • [E1] A method for screening compounds that bind to a target molecule, comprising: (1) Synthesizing a peptide library or a cyclic peptide library by the method described in any one of [C9] to [C16]; (2) contacting the peptide library or cyclic peptide library with a target molecule; (3) The method described above, comprising selecting a peptide compound that binds to the target molecule.
  • [E2] The method according to [E1], wherein the target molecule is a protein, nucleic acid, polypeptide, or sugar chain.
  • the present invention also provides the following [F1] to [F5].
  • [F1] A precipitation inhibitor in peptide synthesis, including DsBC.
  • [F2] A precipitation inhibitor in peptide synthesis, containing N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26).
  • [F3] A precipitation inhibitor in peptide synthesis, containing N'-(1-methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27).
  • [F4] A precipitation inhibitor in peptide synthesis, containing N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28).
  • [F5] A precipitation inhibitor in peptide synthesis, containing N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30).
  • the present invention also provides the following [G1] to [G4].
  • G4 N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30)
  • the present invention also provides the following [H1] to [H7].
  • [H1] N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'-(1-methylheptyl)- N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine (SS29), or N'-(1 -Ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30) as a condensing agent to form an amide bond.
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • SS26 N'-(1-phenyleth
  • [H2] A method for producing a compound, comprising a step of forming an amide bond using N,N'-di-sec-butylcarbodiimide (DsBC) as a condensing agent.
  • DsBC N,N'-di-sec-butylcarbodiimide
  • [H3] A method for producing a compound, comprising a step of forming an amide bond using N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26) as a condensing agent.
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • SS27 N'-(1-methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • [H5] A method for producing a compound, comprising a step of forming an amide bond using N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28) as a condensing agent.
  • SS28 N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine
  • SS30 N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine
  • amide A method for producing a compound, comprising the step of forming a bond.
  • [H7] A method for producing a compound, comprising a step of forming an amide bond using N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30) as a condensing agent.
  • SS30 N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine
  • [H8] The production method according to any one of [H1] to [H7], wherein the step of forming the amide bond is performed in a solid phase or a liquid phase.
  • the numbers cited in the dependent claims include branch numbers of the numbers unless otherwise stated.
  • [A2] cited in a dependent claim indicates that it includes [A2] and its branch numbers [A2-1] to [A2-6]. The same applies to other numbering.
  • the reaction conversion rate can be improved in the peptide solid phase synthesis method, particularly in the condensation reaction step.
  • high-purity peptides can be used as amidation conditions to avoid crystal precipitation in the peptide solid-phase synthesis method, particularly in the condensation reaction step, thereby enabling application to automatic synthesis.
  • a method for efficiently producing a compound can be provided.
  • one or more means a number of one or more.
  • substituents of a group the term means one up to the maximum number of substituents allowed by the group.
  • One or more specifically includes, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and/or a larger number.
  • ⁇ indicating a numerical range includes values at both ends thereof; for example, "A to B” means a numerical range that is greater than or equal to A and less than or equal to B.
  • lower limit includes both “more than” and “more than”
  • upper limit includes both “less than” and “less than”.
  • the term "about" when used in conjunction with a numerical value means a value range of +10% and -10% of that numerical value.
  • A, B, and/or C includes the following seven variations; (i) A, (ii) B, (iii) C, (iv) A and B, (v) A and C, (vi) B and C, (vii) A, B, and C.
  • room temperature means a temperature of about 20°C to about 25°C.
  • halogen examples include F, Cl, Br, or I.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and has a heteroatom (atom other than carbon and hydrogen atoms) in the skeleton. ) or have a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures that do not contain unsaturated carbon-carbon bonds and contain hydrogen and carbon atoms.
  • Alkyl includes not only linear ones but also branched ones. Specifically, the alkyl is an alkyl having 1 to 20 carbon atoms (C 1 to C 20 , hereinafter "C p to C q " means the number of carbon atoms is p to q), Preferably C 1 -C 10 alkyl, more preferably C 1 -C 6 alkyl.
  • alkyl examples include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, isobutyl (2-methylpropyl), n-pentyl, s-pentyl (1- methylbutyl), t-pentyl (1,1-dimethylpropyl), neopentyl (2,2-dimethylpropyl), isopentyl (3-methylbutyl), 3-pentyl (1-ethylpropyl), 1,2-dimethylpropyl, 2 -Methylbutyl, n-hexyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl , 1,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,
  • C 3 - C 10 secondary alkyl examples include i-propyl, s-butyl, s-pentyl, 3-pentyl, 1,2-dimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1 , 2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl and the like.
  • Specific examples of "C 4 to C 10 secondary alkyl having an asymmetric carbon” include s-butyl, s-pentyl, 1,2-dimethylpropyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl , 1-ethylbutyl and the like.
  • C 4 - C 10 tertiary alkyl examples include t-butyl, t-pentyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1- Examples include dimethylbutyl, 1-ethyl-1-methylbutyl, and the like.
  • Specific examples of "C 4 -C 10 tertiary alkyl having an asymmetric carbon” include 1-ethyl-1-methylbutyl and the like.
  • alkenyl is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP2 carbon atoms). Depending on the configuration of the double bond and substituents (if present), the geometry of the double bond can be Entadel (E) or Entumble (Z), cis or trans configuration. Alkenyl includes not only straight-chained alkenyl but also branched alkenyl. Preferred alkenyls include C 2 -C 10 alkenyl, more preferably C 2 -C 6 alkenyl.
  • vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl, etc. can be mentioned.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms). Alkynyl includes not only straight chain but also branched chain. Preferred alkynyl is C 2 -C 10 alkynyl, more preferably C 2 -C 6 alkynyl.
  • ethynyl 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl-2-propynyl, 3-(2'-fluorophenyl)-2-propynyl, 2-hydroxy-2 -propynyl, 3-(3-fluorophenyl)-2-propynyl, 3-methyl-(5-phenyl)-4-pentynyl, and the like.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • Preferred examples of cycloalkyl include C 3 -C 8 cycloalkyl. Specific examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo[2.2.1]heptyl, spiro[3.3]heptyl, and the like.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring and an aromatic hydrocarbon ring group.
  • Preferred examples of aryl include C 6 to C 10 aryl. Specific examples include phenyl, naphthyl (eg, 1-naphthyl, 2-naphthyl), and the like.
  • heteroaryl means an aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to carbon atoms, and an aromatic heterocyclic group.
  • the ring may be a monocyclic ring, a fused ring with another ring, or a partially saturated ring.
  • the number of atoms constituting the ring of heteroaryl is preferably 5 to 10 (5 to 10 membered heteroaryl), more preferably 5 to 7 (5 to 7 membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridazinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzothienyl.
  • benzothiadiazolyl benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzoxadiazolyl, benzimidazolyl, benzotriazolyl, indolyl, isoindolyl, indazolyl, azaindolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, benzodioxolyl, indolizinyl, Examples include imidazopyridyl, pyrazolopyridyl, imidazopyridyl, triazolopyridyl, pyrrolopyrazinyl, furopyridyl, and the like.
  • arylalkyl (aralkyl) means a group in which at least one hydrogen atom of "alkyl” defined above is substituted with “aryl” defined above.
  • arylalkyl C 7 -C 14 arylalkyl is preferred, and C 7 -C 10 arylalkyl is more preferred.
  • Specific examples of arylalkyl include benzyl, phenethyl, and 3-phenylpropyl.
  • alkoxy means an oxy group to which "alkyl” as defined above is bonded.
  • Preferred examples of alkoxy include C 1 to C 6 alkoxy.
  • Specific examples of alkoxy include methoxy, ethoxy, 1-propoxy, 2-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, pentyloxy, and 3-methylbutoxy.
  • amino means -NH2 in a narrow sense and -NRR' in a broad sense, where R and R' are independently hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R' together with the nitrogen atom to which they are attached form a ring.
  • R and R' are independently hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R' together with the nitrogen atom to which they are attached form a ring.
  • Preferred examples of amino include -NH 2 , mono-C 1 -C 6 alkylamino, di-C 1 -C 6 alkylamino, and 4- to 8-membered cyclic amino.
  • monoalkylamino means a group in which R is hydrogen and R' is “alkyl” as defined above among “amino” defined above.
  • Preferable examples of monoalkylamino include mono-C 1 -C 6 alkylamino.
  • Specific examples of monoalkylamino include methylamino, ethylamino, n-propylamino, i-propylamino, n-butylamino, s-butylamino, and t-butylamino.
  • dialkylamino refers to a group of “amino” defined above, in which R and R' are independently “alkyl” defined above.
  • dialkylamino includes di-C 1 -C 6 alkylamino.
  • Specific examples of dialkylamino include dimethylamino and diethylamino.
  • cyclic amino refers to a group in which R and R' form a ring together with the nitrogen atom to which they are bonded in "amino" defined above.
  • Preferred examples of the cyclic amino include 4- to 8-membered cyclic aminos.
  • Specific examples of the cyclic amino include 1-azetidyl, 1-pyrrolidyl, 1-piperidyl, 1-piperazyl, 4-morpholinyl, 3-oxazolidyl, 1,1-dioxidethiomorpholinyl-4-yl, 3 -oxa-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl and the like.
  • the compound in the manufacturing methods described herein, if a defined group undergoes an undesired chemical transformation under the conditions of the performed method, the compound can be can be manufactured.
  • the selection of the protecting group and the desorption operation can be carried out, for example, by the method described in “Greene's, “Protective Groups in Organic Synthesis” (5th edition, John Wiley & Sons 2014), and these can be carried out under the reaction conditions. It may be used as appropriate.
  • the order of reaction steps such as substituent introduction can be changed as necessary.
  • amino group protecting group includes carbamate type protecting group, amide type protecting group, arylsulfonamide type protecting group, alkylamine type protecting group, imide type protecting group, etc. .
  • examples include methylidene.
  • protected amino group means an amino group protected with any protecting group.
  • the protected amino group includes, for example, an amino group protected with the above-mentioned amino protecting group.
  • hydroxy group protecting group includes alkyl ether type protecting groups, aralkyl ether type protecting groups, silyl ether type protecting groups, carbonate type protecting groups, and the like.
  • Specific examples of hydroxy protecting groups include methoxymethyl, benzyloxymethyl, tetrahydropyranyl, t-butyl, allyl, 2,2,2-trichloroethyl, benzyl, 4-methoxybenzyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, and triisopropyl.
  • Examples include silyl, t-butyldimethylsilyl, t-butyldiphenylsilyl, methoxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl, and 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl.
  • protected hydroxy group means a hydroxy group protected with any protecting group.
  • the protected hydroxy group includes, for example, a hydroxy group protected with the above-mentioned hydroxy protecting group.
  • the "carboxy group protecting group” includes an alkyl ester type protecting group, a benzyl ester type protecting group, a substituted alkyl ester type protecting group, and the like.
  • Specific examples of carboxyl protecting groups include methyl, ethyl, t-butyl, benzyl, trityl, cumyl, methoxytrityl, 2-(trimethylsilyl)ethyl, 2,2,2-trichloroethyl, allyl, etc. .
  • protected carboxy group means a carboxy group protected with any protecting group.
  • the protected carboxy group includes, for example, a carboxy group protected with the above-mentioned carboxyl protecting group.
  • the "peptide” in this specification is not particularly limited as long as it is a peptide formed by amide bonding or ester bonding of natural amino acids and/or unnatural amino acids.
  • the peptide preferably has 5 to 30 residues, more preferably 7 to 15 residues, and even more preferably 9 to 13 residues.
  • Peptides may be linear or cyclic peptides.
  • the "peptide compound” as used herein is not particularly limited as long as it is a peptide compound in which natural amino acids and/or unnatural amino acids are linked by an amide bond and some ester bonds, but preferably 5 to 30 residues, more preferably 5 to 30 residues, and more.
  • a peptide compound preferably has 8 to 15 residues, more preferably 9 to 13 residues.
  • the peptide compound synthesized in this embodiment preferably contains at least three N-substituted amino acids in one peptide, and more preferably contains at least five or more N-substituted amino acids. These N-substituted amino acids may be present continuously or discontinuously in the peptide compound.
  • the peptide compound in this embodiment may be linear or cyclic, and cyclic peptide compounds are preferred.
  • the peptide compound preferably has 5 to 30 residues, more preferably 8 to 15 residues, and even more preferably 9 to 13 residues.
  • one peptide compound preferably contains at least three N-substituted amino acids, and more preferably contains at least five or more N-substituted amino acids. These N-substituted amino acids may be present continuously or discontinuously in the peptide compound.
  • the peptide compound in this embodiment may be linear or cyclic, and cyclic peptide compounds are preferred.
  • cyclic peptide compound is a cyclic peptide compound that can be obtained by bonding arbitrary groups of a linear peptide compound and cyclizing the compound.
  • cyclization of cyclic peptide compounds include cyclization through carbon-nitrogen bonds such as amide bonds, cyclization through carbon-oxygen bonds such as ester bonds and ether bonds, and cyclization through carbon-sulfur bonds such as thioether bonds. It may be in any form, such as cyclization by carbon-carbon bond, or cyclization by constructing a heterocyclic ring. Among these, cyclization via covalent bonds such as amide bonds, carbon-sulfur bonds or carbon-carbon bonds is preferred.
  • Cyclization using an amide bond is particularly preferred, and the position of the carboxy group or amino group used for cyclization may be on the main chain or on the side chain. More preferred is cyclization via an amide bond between a carboxy group on the side chain and an amino group on the main chain at the N-terminus.
  • Cyclization of a peptidic compound means forming a cyclic portion containing four or more amino acid residues.
  • the number of amino acids contained in the cyclic portion of the cyclic peptide compound herein is not particularly limited, but examples thereof include 4 to 20 residues, 5 to 15 residues, and 6 to 13 residues.
  • Comprehensive Organic Transformations A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (written by R. C. Larock), or March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition. , (authored by M. B. Smith, J. March), etc., by performing a bond-forming reaction within the molecule.
  • a functional group conversion reaction can also be performed after the bond forming reaction.
  • Bond formation reactions include C(O)-N bonds formed from carboxylic acids and amines, C-O-C bonds using oxygen atoms, C(O)-O bonds, C(S)-O bonds, and sulfur.
  • C--C bond forming reactions using transition metals as catalysts such as Suzuki reaction, Heck reaction, and Sonogashira reaction.
  • An oxidation reaction or a reduction reaction is exemplified as a functional group conversion reaction that is further performed after the bond-forming reaction.
  • a reaction in which a sulfur atom is oxidized and converted into a sulfoxide group or a sulfone group is exemplified.
  • a reduction reaction in which a triple bond or a double bond among carbon-carbon bonds is reduced and converted into a double bond or a single bond.
  • a closed ring structure is formed by a peptide bond, but a covalent bond between the two amino acids is formed by the bond between the side chains of the two amino acids or between the side chain and the main chain. may be done.
  • membrane is not particularly limited as long as it can be used to synthesize a peptide compound by a solid phase method.
  • Specific examples of such membranes include cellulose membranes, polypropylene membranes, and polyaminoethylmethacrylamide membranes, with cellulose membranes being preferred.
  • amino group-modified membrane refers to, for example, a cellulose membrane or a polypropylene membrane that has been chemically modified to have an amino group on its surface, and can be used for the synthesis of peptide compounds by a solid phase method.
  • cellulose can be prepared using a known method (Preparation of a Cellulose Membrane for Spot Synthesis) described in Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174. It can be prepared by attaching a carboxy group of ⁇ -alanine or the like to an ester bond to the hydroxyl group of the membrane.
  • membranes that have already been modified with amino groups include Amino-PEG500-UC540 Sheets, and CelluSpots 384 frame with acid stable discs that have been further processed into a disc shape and attached to a frame by CEM (formerly Intavis). It can be obtained as a commercial product from companies such as Co., Ltd. Note that in this specification, “membrane disk” may also be referred to as “membrane.”
  • the amount and rate of support on a solid phase including a membrane are not particularly limited as long as it can be used for synthesis of a peptide compound by a solid phase method. In some embodiments, it is possible to reduce loading and loading ratio when extending amino acids. There are no particular limitations on the method for appropriately reducing the amount and rate of support, such as mixing Fmoc-Photo-Linker and 4-phenoxybutyric acid in any ratio and elongating the mixture, and any method may be used.
  • the "resin for solid phase synthesis” is not particularly limited as long as it can be used for the synthesis of peptide compounds by solid phase method.
  • Specific examples of such resins for solid phase synthesis include CTC resin, NovaSyn TGT resin (TGT resin), Wang resin, SASRIN resin, trityl chloride resin (Trt resin), and 4-methyltrityl chloride resin (Mtt resin). resin) and 4-methoxytrityl chloride resin (Mmt resin), which can be removed under acidic conditions.
  • the resin can be appropriately selected depending on the functional group of the amino acid used.
  • a carboxy group main chain carboxy group or side chain carboxy group typified by Asp or Glu
  • a hydroxy group on an aromatic ring phenol group typified by Tyr
  • trityl chloride resin Trt resin
  • CTC resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • an aliphatic hydroxy group an aliphatic alcohol group represented by Ser or Thr
  • Trt resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • Mtt resin 4-methyltrityl chloride resin
  • resin may be described as resin.
  • the type of polymer constituting the resin is also not particularly limited. In the case of a resin composed of polystyrene, either 100 to 200 mesh or 200 to 400 mesh may be used.
  • the crosslinking rate is also not particularly limited, but 1% DVB (divinylbenzene) crosslinking is preferred.
  • examples of the type of polymer constituting the resin include TentaGel (registered trademark) and ChemMatrix (registered trademark).
  • the compounds described herein can be salts thereof or solvates thereof.
  • Salts of compounds include, for example, hydrochlorides; hydrobromides; hydroiodides; phosphates; phosphonates; sulfates; sulfonates such as methanesulfonates and p-toluenesulfonates.
  • Metal salts include ammonium salts such as ammonium salts, alkylammonium salts, dialkylammonium salts, trialkylammonium salts, and tetraalkylammonium salts. These salts are produced, for example, by contacting the compound with an acid or base.
  • a solvate of a compound refers to a compound in which the compound forms one molecular group together with a solvent, and is not particularly limited as long as it is a solvate formed by a solvent.
  • examples include hydrates, alcoholates (ethanolates, methanolates, 1-propanolates, 2-propanolates, etc.), and solvates with a single solvent such as dimethyl sulfoxide. , one in which a solvate is formed with a plurality of solvents for one molecule of the compound, or one in which a solvate is formed with a plurality of types of solvents in one molecule of the compound.
  • the solvent is water, it is called a hydrate.
  • hydrates are preferable, and specific examples of such hydrates include 1 to 10 hydrates, preferably 1 to 5 hydrates, and more preferably 1 to 3 hydrates. Examples include hydrates.
  • amino acid as used herein includes natural amino acids and unnatural amino acids (sometimes referred to as amino acid derivatives). Moreover, in this specification, “amino acid” may mean an amino acid residue. "Natural amino acids” as used herein include glycine (Gly), alanine (Ala), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), and phenylalanine (Phe).
  • tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), histidine (His), glutamic acid (Glu), aspartic acid (Asp), glutamine (Gln), asparagine (Asn), cysteine (Cys), methionine (Met), lysine (Lys) ), arginine (Arg), and proline (Pro).
  • Unnatural amino acids are not particularly limited, but examples include ⁇ -amino acids, D-type amino acids, N-substituted amino acids, ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, amino acids whose side chains differ from those of natural amino acids, hydroxycarboxylic acids, etc. .
  • any steric configuration is acceptable for the amino acids herein.
  • side chains of amino acids include alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, aryl groups, heteroaryl groups, aralkyl groups, heteroaralkyl groups, cycloalkyl groups, and spiro bonds.
  • cycloalkyl groups Each may be provided with a substituent, and these substituents are not limited, for example, any substituent containing a halogen atom, an O atom, an S atom, a N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • One or more may be independently selected from the following.
  • the amino acid herein may be a compound having a carboxy group and an amino group in the same molecule (even in this case, imino acids such as proline and hydroxyproline are also included in the amino acid). included).
  • the main chain amino group of the amino acid may be unsubstituted (-NH 2 ) or substituted (i.e., -NHR), where R is an optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , heteroaryl, aralkyl, and cycloalkyl, and the carbon chain bonded to the N atom and the carbon atom at the ⁇ -position may form a ring as in proline).
  • N-substituted amino acids preferably includes N-alkyl amino acid, N-C 1 -C 6 alkyl amino acid, N-C 1 -C 4 alkyl amino acid, N-methylamino acid, N-C 2 - Examples include, but are not limited to, C 6 alkenyl amino acids, N-allyl amino acids, N-C 7 -C 14 aralkyl amino acids, N-benzylamino acids, and N-phenethylamino acids.
  • ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids specifically include, for example, Aib, (Me)Abu, (Me)Leu, (Me)Algly, (Me)Phe, (Me)Phe(3 -I), 1-ACPrC, cVal, cLeu, cHex, Athpc, etc.
  • the " ⁇ -branched amino acid” herein specifically includes, for example, MeVal, D-MeVal, Val, He, MeIle, MeChg, Chg, MeGly (cPent), Gly (cPent), MeGly (cBu), Examples include Gly (cBu), MeGly (cPr), Gly (cPr), MeThr (tBu), and Thr (tBu).
  • MeVal-OH is an amino acid having the following structure obtained by removing the Fmoc group from Fmoc-MeVal-OH shown in the table below, and the amino acid residue thereof is The structure of MeVal is also obvious to those skilled in the art.
  • amino acid as used herein includes all its corresponding isotopes.
  • Isotopes of “amino acids” are atoms in which at least one atom has the same atomic number (number of protons) but a different mass number (sum of the number of protons and neutrons), and has an abundance ratio different from the natural abundance ratio. It has been replaced.
  • isotopes included in "amino acid” in this specification include hydrogen atom, carbon atom, nitrogen atom, oxygen atom, phosphorus atom, sulfur atom, fluorine atom, chlorine atom, etc., and 2 H, 3 Included are H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, and the like.
  • Compounds herein containing all proportions of radioactive or non-radioactive isotopes are included within the scope of the invention.
  • the method for producing a peptide compound by the solid phase method of the present embodiment includes a preparatory step of preparing a first amino acid or a first peptide supported on a solid phase; or a second peptide in the presence of a condensing agent and an additive.
  • the peptide compound obtained by the production method of the present embodiment may be an intermediate or a final product of an amino acid or peptide elongation step using a solid phase method.
  • the elongation step can be performed multiple times depending on the length of the amino acid sequence of the desired peptide compound, and the condensation step according to this embodiment is included at least once during such elongation step, and may be included multiple times. .
  • methods known in the art can be used for condensation steps other than the condensation step according to this embodiment.
  • the condensate obtained by the condensation step of this embodiment can become a peptide compound having a desired sequence.
  • the condensate obtained by the condensation step of this embodiment is It is included in it as a substructure.
  • a first amino acid or a first peptide supported on a solid phase is prepared.
  • the solid phase include membranes and resins for solid phase synthesis.
  • the cleavage site in the step of cutting out a peptide from a solid phase including a membrane, is cleaved as follows: cleavage of a photocleavable site by UV irradiation, cleavage of a disulfide bond by reducing conditions, acid instability by weak acid conditions. It may be in any form, such as cutting a part.
  • the solid phase and the first amino acid or the first peptide may be bonded via a photocleavable site.
  • a photocleavable site is a site that is cleaved by absorbing light.
  • the absorption wavelength at which the photocleavable moiety undergoes cleavage may be 300 nm or more, 320 nm or more, 340 nm or more, or 350 nm or more, and may be 500 nm or less, 450 nm or less, 400 nm or less, 380 nm or less, or 370 nm or less.
  • the absorption wavelength at which the photocleavable site causes cleavage may be 300 nm or more and 500 nm or less, and may be 350 nm or more and 370 nm or less.
  • the wavelength of the irradiated light may be in the UV-A region from the viewpoint of better handling properties.
  • the wavelength in the UV-A region refers to light with a wavelength of 320 to 400 nm.
  • the photocleavable site may have a nitroberatryloxycarbonyl residue or a coumarin residue.
  • the solid phase and the first amino acid or the first peptide may be bonded via a disulfide bond.
  • the target peptide can be excised from the solid phase by cleaving the disulfide bond under reductive conditions such as a water/DMF solution containing tris(2-carboxyethyl)phosphine.
  • the solid phase and the first amino acid or the first peptide may be bonded via an acid-labile site.
  • the acid-labile site is decomposed by acidic conditions such as a TFA/DCM solution or a TFE/DCM solution containing DIPEA, and the target peptide can be excised from the solid phase.
  • the acid-labile moiety has a trityl ester structure, a chlorotrityl ester structure, an alkoxybenzyl ether structure, a trialkoxybenzylaminocarbonyl structure, a dialkoxyphenyl-alkoxyphenylmethylaminocarbonyl structure, or an alkoxyxanthen-9-ylaminocarbonyl structure. It's okay to do so.
  • the solid phase and the first amino acid or the first peptide may be bonded by a group that allows the peptide to be excised with an acid.
  • examples of the solid phase having a group from which a peptide can be excised with an acid include CTC resin, NovaSyn TGT resin (TGT resin), Wang resin, SASRIN resin, trityl chloride resin (Trt resin), and 4-methyl Examples include resins for solid phase synthesis such as trityl chloride resin (Mtt resin) and 4-methoxytrityl chloride resin (Mmt resin).
  • an arbitrary amount is used as the amount of the first amino acid or first peptide supported on the membrane, for example, an amount of 5 nmol/cm 2 or more and 500 nmol/cm 2 or less based on the Fmoc quantitative method.
  • the reaction can proceed efficiently even with a high supported amount of 20 nmol/cm 2 or more, 50 nmol/cm 2 or more, 100 nmol/cm 2 or more, and even 200 nmol/cm 2 or more.
  • the amount of the first amino acid or the first peptide supported on the resin for solid phase synthesis is an arbitrary amount, for example, 0.1 mmol/g based on the Fmoc quantitative method. As mentioned above, an amount of 0.8 mmol/g or less can be used, and the reaction can proceed efficiently even with a high supported amount of 0.2 mmol/g or more, 0.3 mmol/g or more, and even 0.4 mmol/g or more. be able to.
  • the second amino acid or second peptide is used in an equivalent or excess amount relative to the first amino acid or first peptide.
  • the molar ratio of the second amino acid or second peptide to the first amino acid or first peptide has a lower limit selected from the group consisting of 1, 2, 3, 5, 7, and 10; and an upper limit selected from the group consisting of 3, 5, 7, 10, 15, 25, 50, 100, 300, 500, and 700.
  • the molar ratio of the second amino acid or second peptide to the first amino acid or first peptide is preferably 1.5 or more, more preferably 2 or more.
  • the molar ratio of the second amino acid or second peptide to the first amino acid or first peptide is preferably 50 or less, more preferably 15 or less. Most preferably, the molar ratio of second amino acid or second peptide to first amino acid or first peptide is between 7 and 15.
  • Examples of the additives used in the condensation step of this embodiment include Oxyma, HOBt, HOOBt, or HOAt.
  • the additive is used in a smaller number of moles than the number of moles of the second amino acid or second peptide.
  • the molar ratio of additive to second amino acid or second peptide is less than 1.
  • the molar ratio is preferably 0.8 or less, for example 0.1 to 0.8.
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or the second peptide is, for example, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.
  • the range can be specified by combining the upper limit selected from the group consisting of: More preferably, the molar ratio of the additive to the second amino acid or second peptide is 0.3 to 0.7.
  • the condensing agent used in the condensation step of this embodiment includes at least one carbodiimide condensing agent represented by the following general formula (A).
  • Specific examples of the carbodiimide condensing agent represented by the general formula (A) include DsBC, tBEC, and DtBC.
  • the condensing agent used in the condensation step of the present embodiment may include at least one carbodiimide condensing agent represented by the following general formula (A').
  • R A' is 4 or more.
  • Specific examples of the carbodiimide condensing agent represented by the general formula (A') include DsBC, tBEC, DtBC, and EDCI.
  • the condensing agent is used in an amount equal to or greater than the number of moles of the second amino acid or second peptide.
  • the molar ratio of the condensing agent to the second amino acid or the second peptide is in the range of 1 or more, in the range of 2 or more, in the range of 3 or more, or in the range of 4 or more. can do. More specifically, the molar ratio of condensing agent to second amino acid or second peptide is 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 2.0, 3.0, and 4.
  • the preferred range of the molar ratio of the condensing agent to the second amino acid or second peptide is 1.0 to 5.0, 1.1 to 4.0, 1.1 to 3.0, 1.2 to 2 .0, 1.2 to 1.5.
  • the molar ratio of the condensing agent and additive to the second amino acid or second peptide is as follows:
  • the molar ratio of condensing agent to second amino acid or second peptide is selected from values consisting of 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 2.0, 3.0, and 4.0.
  • the range can be specified by a combination of a lower limit selected from a value of 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, and 5.0
  • the molar ratio of additive to second amino acid or second peptide was 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 and 0.
  • a lower limit selected from values consisting of .7 and values consisting of 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 and 1.0.
  • the range can be specified by combining with the upper limit selected from the range.
  • the condensation step of the present embodiment can be carried out at a reaction temperature of 0 to 100°C, preferably 10 to 60°C, more preferably 20 to 50°C.
  • the condensation step of the present embodiment can be carried out for a reaction time of 10 minutes to 2 days, preferably 10 minutes to 6 hours, more preferably 30 minutes to 60 minutes. Moreover, it can also be repeated two or more times.
  • the additive is HOAt, HOOBt, or Oxyma
  • the condensation agent is DsBC.
  • the condensation reaction of this embodiment can be performed in a suitable solvent.
  • an aprotic solvent can be used, and examples thereof include amide solvents, ester solvents, ether solvents, alkylnitrile solvents, and urea solvents.
  • amide solvents include DMF, DMA, and NMP.
  • ester solvents include ethyl acetate and dimethyl carbonate.
  • ether solvents include tetrahydrofuran and 2-methyltetrahydrofuran.
  • alkylnitrile solvents include acetonitrile and the like.
  • urea-based solvents include DMI and TMU.
  • the condensation step of this embodiment can be performed by bringing the first amino acid or first peptide supported on a solid phase into contact with the second amino acid or second peptide, the condensing agent, and the additive. .
  • the order in which the first amino acid or first peptide is contacted with the second amino acid or second peptide, the condensing agent, and the additive is arbitrary; The two amino acids or the second peptide, the condensing agent, and the additive may be contacted simultaneously or sequentially.
  • the first amino acid or the first peptide may be contacted with a mixture of the second amino acid or the second peptide, the condensing agent, and/or any or all of the additives in advance.
  • a mixture of these with an appropriate solvent may be used.
  • the method of this embodiment may be performed using a solid phase synthesis apparatus.
  • the method of this embodiment includes mixing a first amino acid or a first peptide supported on a solid phase with a second amino acid or a second peptide, a condensing agent, and an additive in a suitable solvent. This can be done by
  • the solid phase is a resin for solid phase synthesis
  • the resin for solid phase synthesis is swollen by contact with an appropriate solvent. By doing so, the desired condensation reaction can proceed efficiently.
  • the amount of solvent used in this pretreatment can be any amount as long as the swollen resin is immersed in the solvent.
  • v/w to 15 v/w preferably from 4 v/w to 10 v/w, more preferably from 4 v/w to 8 v/w.
  • amount of solvent is described as 4 v/w, it means that the amount of solvent is 4 mL per 1 g of resin weight.
  • a target peptide compound bound to a resin for solid phase synthesis can be obtained.
  • solvents suitable for washing and/or swelling membranes or solid-phase synthesis resins include amide-based and alcohol-based solvents, with DMF, ethanol, or 2-propanol being preferred. These solvents may be used multiple times or alternately.
  • the swollen resin for solid-phase synthesis can be contracted if necessary by washing with an alcohol-based solvent or an ether-based solvent.
  • the alcohol solvent is preferably methanol
  • the ether solvent is preferably methyl t-butyl ether (MTBE).
  • a mixture of the second amino acid or the second peptide, the condensing agent, and the additives in a solvent may be prepared in advance and used in the condensation reaction.
  • the mixing time is not particularly limited, but is preferably 0 minutes to 2 hours, more preferably 0 minutes to 1 hour, and even more preferably about 15 minutes.
  • Stirring or shaking the resin using automatic synthesis equipment can be important in ensuring that the resin fully penetrates the reaction solution and allowing the reaction to proceed as desired.
  • the stirring speed, shaking speed, and their frequency are not particularly limited, but since excessive stirring may cause physical damage to the resin, for example, stirring at 60 rpm is performed for about 2 minutes every hour. Further, stirring and shaking are not necessarily required if penetration is sufficient.
  • the method of the present embodiment may further include the step of removing the membrane and solid-phase synthesis resin, and methods known in the art can be used for this.
  • the peptide compound extended to the desired sequence can be detached from the membrane and resin and isolated.
  • the method of the present embodiment may further include the step of removing the protecting group, and methods known in the art can be used for this.
  • the method described in “Greene's, “Protective Groups in Organic Synthesis” (5th edition, John Wiley & Sons 2014)" can be mentioned, and these may be used as appropriate depending on the reaction conditions.
  • removing the protecting group will prevent the next condensation. Ready for reaction.
  • the protecting group may be removed simultaneously with the condensation reaction or separately from the condensation reaction.
  • the present embodiments provide linear peptide compounds obtained using the methods of the present embodiments and then using Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (by R. C. Larock), or March's
  • the N-terminal group and the C-terminal group are cyclized using the known method described in Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition (authored by M. B. Smith, J. March).
  • the present invention also relates to a method for producing a cyclic peptide compound.
  • analysis conditions such as LCMS are as shown in Tables 1 and 2 below.
  • Fmoc protected amino acids listed in Table 3 were purchased from commercial suppliers.
  • the Fmoc-protected amino acids listed in Table 4 were synthesized according to the method described in WO2018/225864.
  • the Fmoc-protected amino acids listed in Table 5 were synthesized by the method described in Example 1-1.
  • the LCMS (ESI) m/z value may vary within a range of about ⁇ 0.2 and the retention time may vary within a range of about ⁇ 0.07 minutes.
  • Example 1 Preparation of Fmoc-protected amino acids, urea, membrane-supported peptides, etc. used in this example Membrane discs were CelluSpots 384 frame with acid stable discs or Refill of membrane discs purchased from Intavis (currently CEM). Two frames, 384 acid stable discs (amino group modified membrane) were used.
  • Example 1-1 Compound SS01, (2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]-4-(1-methyl-1-phenyl-ethoxy)-4-oxo-butane Synthesis of acid (Fmoc-MeAsp(OPis)-OH) (2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]-4-(1-methyl-1-phenyl-ethoxy)-4-oxo-butanoic acid (Fmoc-MeAsp) according to the above scheme. (OPis)-OH, SS01) was synthesized.
  • Example 1-1-1 Synthesis of O4-allyl O1-methyl (2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]butanedioate (compound SS01a) (S)-2-((((9H-fluoren-9-yl-)methoxy)carbonyl)(methyl)amino)-4-(allyloxy)-4- synthesized by the method described in WO2018/124162 under a nitrogen atmosphere DCM (1.15 L) was added to oxobutanoic acid (compound pd04) (100.0 g, 244.2 mmol), and EDCI/HCl (60.87 g, 317.5 mmol) and HOAt (43.22 g, 317.5 mmol) were added at room temperature and stirred for 30 minutes.
  • compound pd04 oxobutanoic acid
  • EDCI/HCl 60.87 g, 317.5 mmol
  • HOAt 43.22
  • Example 1-1-2 Synthesis of (3S)-3-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]-4-oxo-butanoic acid (compound SS01b) DCM (350 mL) was added to the crude product of compound SS01a (100.0 g, purity 76%, 179.5 mmol) under a nitrogen atmosphere, and tetrakistriphenylphosphine palladium (2.07 g, 1.795 mmol) and phenylsilane ( 13.60 g, 125.7 mmol) was added and stirred for 3 hours. Thereafter, TBME was added to dilute the mixture, and the mixture was extracted with a saturated aqueous sodium carbonate solution.
  • Example 1-1-3 O1-methyl O4-(1-methyl-1-phenyl-ethyl)(2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]butanedioate (compound Synthesis of SS01c) 2-phenylpropan-2-yl 2,2,2-trichloroacetimidate was synthesized by adding DCM (100 mL) to compound SS01b (50.00 g, 130.4 mmol) under a nitrogen atmosphere and using the method described in WO2018/124162.
  • Example 1-1-4 (2S)-2-[9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl(methyl)amino]-4-(1-methyl-1-phenyl-ethoxy)-4-oxo-butanoic acid Synthesis of (compound SS01, Fmoc-MeAsp(OPis)-OH) Calcium chloride (248.9 g, 2243 mmol) and lithium hydroxide monohydrate (25.10 g, 588.1 mmol) were dissolved in a mixed solvent of 2-propanol (3 L) and H 2 O (750 mL) and incubated in an ice bath. Cooled to 0°C.
  • Example 1-2 Preparation of amino acids, peptides, etc. supported on the membrane used in this example
  • the membrane or resin site is indicated with a circle.
  • the chemical structure of the reaction site may be indicated by connecting it to a circle.
  • the amino group of the amino group-modified membrane forms an amide bond with the carboxylic acid of the Photo-Linker.
  • the solution obtained after the peptide excision reaction from the membrane using the membrane obtained after the elongation was measured by LCMS. Show specific steps.
  • the UV irradiation equipment used was a UV-LED irradiation box MUB-031 commissioned by MLC, or a separate UV-LED irradiation device manufactured by Shodensha Co., Ltd., and the reaction vessel was placed on ice or at room temperature.
  • the stretched and dried membrane disk was irradiated with UV light at a wavelength of 365 nm and an illuminance of 380 to 600 mW/cm 2 for 2 minutes and 30 seconds. Thereafter, 100 ⁇ L of DMSO was added to the membrane, and the membrane was allowed to stand for 15 minutes or more to dissolve the peptide.
  • the solution was analyzed by LCMS.
  • Example 1-2-1 Compound SS02 (Fmoc-MePhe-Photo-Linker-Membrane), Compound SS03 (Fmoc-Pro-Photo-Linker-Membrane), Compound SS24 (Fmoc-MeAla-Photo-Linker-Me mbrane), Synthesis of compound SS25 (Fmoc-MeSer (THP)-Photo-Linker-Membrane)
  • Compounds SS02, SS03, SS24, and SS25 used in this example were prepared by the Fmoc method using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis). For detailed operating procedures, the manual included with the synthesizer was followed.
  • reaction conditions were prepared by referring to WO2018/225851 and using the following procedure 1 or 2.
  • Fmoc-Photo-Linker and Fmoc-MePhe-OH were added in this order
  • Fmoc-Photo-Linker and Fmoc-Pro-OH were added in this order
  • compound SS24 was added.
  • Fmoc-Photo-Linker and Fmoc-MeSer(THP)-OH were added in this order, respectively, and Fmoc-protected. It was used as an amino acid.
  • Solution 1 was prepared by dissolving Fmoc-protected amino acids (0.6 mol/L) constituting the target peptide and HOAt, Oxyma, or HOOBt (0.375 mol/L) as a carboxylic acid activator in NMP.
  • Solution 2 was prepared by mixing N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) (0.71 mol/L) and N,N-dimethylformamide (DMF).
  • DIC N,N'-diisopropylcarbodiimide
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • CelluSpots 384 frame with acid stable discs (amino group-modified membrane manufactured by Intavis; hereinafter also referred to as "membrane disc" was set in a peptide synthesizer.
  • Solution 1 and Solution 2 were set in a peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • Extension process Solution 1 and solution 2 were mixed at a ratio of 5:6 in a mixing vial of a synthesizer, left to stand for 15 minutes, and then added to each membrane disk at 1.2 ⁇ L and reacted at room temperature for 40 minutes. After performing a condensation reaction between the amino group on the membrane disk and the Fmoc-protected amino acid, the solution was discharged. This condensation reaction was repeated one more time. Subsequently, 4.0 ⁇ L of a DMF solution (4% v/v) of acetic anhydride (Ac 2 O) was added per membrane disk, and unreacted amine was capped with acetyl at room temperature. After reacting for 5 minutes, the solution was drained.
  • a DMF solution 4% v/v
  • acetic anhydride Ac 2 O
  • Extension process solution 1 and solution 2 were mixed in a mixing vial of a synthesizer at a ratio of 11.29:0.72 and allowed to stand for 15 minutes, then 1.2 ⁇ L per membrane disk was added and incubated at room temperature for 40 minutes. After the reaction caused a condensation reaction between the amino group on the membrane disk and the Fmoc-protected amino acid, the solution was discharged. This condensation reaction was repeated one more time. Thereafter, the same method as the elongation step in [Operation 1] was performed.
  • Example 1-2-2 Excision and analysis of Fmoc-MePhe or Fmoc-Pro supported on a membrane
  • the peptide was excised by the method described in 2, and the production of the target peptides (compounds SS02*, SS03*, SS24* and SS25*) was confirmed.
  • a compound number is marked with *, it indicates a compound that was confirmed by cutting out a peptide from a membrane disk to confirm the reaction.
  • Example 1-2-3 Confirmation of the amount of Fmoc-amino acid supported on the membrane
  • the amount of Fmoc-amino acid supported on the membrane was confirmed by the following method.
  • Compounds SS02, SS03, SS24, and SS25 (one membrane disk each) prepared by the method in Step 1 or Step 2 were placed in a reaction container, and a solution of DBU in DMF (2% v/v) was added at a rate of 4.5 mm per membrane disk. After adding 0 ⁇ L and reacting at room temperature for 5 minutes, 4.0 ⁇ L was added again and reacting at room temperature for 10 minutes to deprotect the Fmoc group.
  • Fmoc-Gly-OH (3.51 mg, 0.012 mmol) was dissolved in a DBU DMF solution (1.5 mL, 0.201 mmol) and reacted at room temperature for 15 minutes to deprotect the Fmoc group. . Thereafter, DMF (148.5 mL) was added to the reaction mixture to dilute it. The obtained diluted solution was analyzed by LC/MS (analysis conditions SQDFA05_1, injection volume: 5 ⁇ L). The UV area value of dibenzofulvene at a wavelength of 304 nm was 8903.11, and the UV area value (wavelength 304 nm) per 1 nmol was calculated from this value.
  • the supported amounts of compound SS02 and compound SS03 were calculated from the following formula.
  • Supported amount (nmol) (UV area value of compound SS04 (wavelength 304 nm)) / (UV area value per 1 nmol of dibenzofulvene (wavelength 304 nm))
  • the supported amounts of compounds SS02, SS03, SS24, and SS25 were calculated to be 57.9 nmol/membrane disk, 55.9 nmol/membrane disk, 66.4 nmol/membrane disk, and 64.7 nmol/membrane disk, respectively.
  • different lots synthesized in the same manner but with different supported amounts were also used for peptide synthesis and investigation.
  • Example 1-3 Synthesis of carbodiimide-derived urea used in this example
  • Example 1-3-1 Synthesis of 1,3-diisopropylurea (DIC urea, compound SS05)
  • DIC urea compound SS05
  • acetic acid 1.178 mL, 20.60 mmol
  • the resulting precipitate was then collected by filtration, and the resulting solid was washed with TBME and dried under reduced pressure to obtain 1,3-diisopropylurea (DIC urea, compound SS05) (909.1 mg, 80 %) was obtained.
  • Example 1-3-2 Synthesis of 1,3-di-sec-butyl urea (DsBC urea, compound SS06) After adding TBME (7.73 mL) to DsBC (0.356 ⁇ L, 1.945 mmol) at room temperature, acetic acid (0.289 ⁇ L, 5.06 mmol) was added dropwise over 5 minutes and the reaction mixture was incubated at room temperature for 15 minutes. Stirred. Thereafter, water (70.1 ⁇ L, 3.89 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2.5 hours. Thereafter, it was concentrated by blowing with nitrogen, and water was added.
  • DsBC urea 1,3-di-sec-butyl urea
  • Example 1-3-3 Synthesis of 1-(tert-butyl)-3-ethyl urea (tBEC urea, compound SS07) After adding TBME (15.7 mL) to tBEC (0.614 ⁇ L, 3.96 mmol) at room temperature, acetic acid (0.589 ⁇ L, 10.30 mmol) was added dropwise over 5 minutes and the reaction mixture was incubated at room temperature for 2 hours. Half stirred. It was then concentrated by blowing with nitrogen and a 1:2 mixture of MeCN and water was added. The resulting precipitate was collected by filtration and the resulting solid was washed with a 1:2 mixture of MeCN and water. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and water was added.
  • tBEC urea compound SS07
  • Example 1-4 Synthesis of carbodiimide used in this example According to the above scheme, N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26), N'-(1-methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27), N,N '-Bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28), N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine (SS29), and N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine ( SS30) was synthesized.
  • SS26 N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine
  • SS27 N,N '-Bis(1-methylbutyl)methanediimine
  • SS28 N,N
  • Example 1-4-1 Synthesis of 1-(1-phenylethyl)-3-sec-butyl-thiourea (compound SS26a) 2-isothiocyanatobutane (500 ⁇ L, 4.08 mmol) and 1-phenylethanamine (567 ⁇ L, 4.49 mmol) were added to DCM (20.4 mL) at room temperature and stirred at room temperature for 17 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified twice by normal phase silica gel column chromatography (ethyl acetate/n-hexane) to obtain 874.6 mg (yield 91%) of compound SS26a as a diastereomer mixture.
  • Ta. LCMS (ESI) m/z 237.1 [M+H] + Retention time: 0.77 minutes (Analysis conditions SQDFA05_1)
  • Example 1-4-2 Synthesis of N'-(1-phenylethyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS26)
  • SS26a Compound SS26a (149.6 mg, 0.633 mmol) was added to DCM (6.329 mL), and triethylamine (265 ⁇ L, 1.899 mmol), 4-dimethylaminopyridine (77 mg, 0.633 mmol) and ethane were added under ice cooling.
  • Sulfonyl chloride 120 ⁇ L, 1.266 mmol was added. After stirring for 5 minutes under ice-cooling, the mixture was heated to room temperature and stirred at room temperature for 1 hour.
  • Example 1-4-3 Synthesis of 1-(1-methylheptyl)-3-sec-butyl-thiourea (compound SS27a) 2-isothiocyanatobutane (300 ⁇ L, 2.45 mmol) and 2-octanamine (452 ⁇ L, 2.69 mmol) were added to DCM (12.2 mL) at room temperature and stirred at room temperature for 17 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified twice by normal phase silica gel column chromatography (ethyl acetate/n-hexane) to obtain 552.0 mg (yield 92%) of compound SS27a as a diastereomer mixture.
  • Ta. LCMS (ESI) m/z 245.2 [M+H] + Retention time: 0.94 minutes (Analysis conditions SQDFA05_1)
  • Example 1-4-4 Synthesis of N'-(1-methylheptyl)-N-sec-butyl-methanediimine (SS27)
  • SS27a 150 mg, 0.614 mmol
  • DCM 6.136 mL
  • DIPEA 315 ⁇ L, 1.841 mmol
  • 4-dimethylaminopyridine 75 mg, 0.614 mmol
  • ethanesulfonyl chloride were added under ice cooling. (116 ⁇ L, 1.227 mmol) was added. After stirring for 5 minutes under ice-cooling, the mixture was heated to room temperature and stirred at room temperature for 1 hour.
  • Example 1-4-5 Synthesis of 1,3-bis(1-methylbutyl)thiourea (compound SS28a) 2-isothiocyanatopentane (300 ⁇ L, 2.16 mmol) and 2-pentanamine (280 ⁇ L, 2.38 mmol) were added to DCM (10.8 mL) at room temperature and stirred at room temperature for 20 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified by normal phase silica gel column chromatography (ethyl acetate/n-hexane) to obtain 426.8 mg (yield 91%) of compound SS28a as a diastereomer mixture.
  • LCMS (ESI) m/z 217.2 [M+H] + Retention time: 0.82 minutes (Analysis conditions SQDFA05_1)
  • Example 1-4-6 Synthesis of N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine (SS28) Compound SS28a (199.8 mg, 0.923 mmol) was added to DCM (9.233 mL), and triethylamine (386 ⁇ L, 2.77 mmol), 4-dimethylaminopyridine (113 mg, 0.923 mmol) and ethane were added under ice cooling. Sulfonyl chloride (175 ⁇ L, 1.847 mmol) was added. After stirring for 5 minutes under ice-cooling, the mixture was heated to room temperature and stirred at room temperature for 1 hour.
  • SS28a N,N'-bis(1-methylbutyl)methanediimine
  • Example 1-4-8 Synthesis of N,N'-bis(1-ethylpropyl)methanediimine (SS29)
  • SS29a 200.8 mg, 0.928 mmol
  • DCM 9.280 mL
  • triethylamine 388 ⁇ L, 2.78 mmol
  • 4-dimethylaminopyridine 113 mg, 0.928 mmol
  • ethane ethanediimine
  • Sulfonyl chloride (175 ⁇ L, 1.856 mmol) was added. After stirring for 5 minutes under ice-cooling, the mixture was heated to room temperature and stirred at room temperature for 0.5 hour.
  • Example 1-4-9 Synthesis of 1-(1-ethylpropyl)-3-(1-methylbutyl)thiourea (compound SS30a) 2-isothiocyanatopentane (300 ⁇ L, 2.16 mmol) and 3-pentanamine (276 ⁇ L, 2.37 mmol) were added to DCM (10.8 mL) at room temperature and stirred at room temperature for 20 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified by normal phase silica gel column chromatography (ethyl acetate/n-hexane) to obtain 418.3 mg (yield 90%) of compound SS30a as a diastereomer mixture.
  • LCMS (ESI) m/z 217.2 [M+H] + Retention time: 0.80 minutes (Analysis conditions SQDFA05_1)
  • Example 1-4-10 Synthesis of N'-(1-ethylpropyl)-N-(1-methylbutyl)methanediimine (SS30)
  • SS30a 201.1 mg, 0.929 mmol
  • DCM 9.294 mL
  • triethylamine 389 ⁇ L, 2.79 mmol
  • 4-dimethylaminopyridine 114 mg, 0.929 mmol
  • ethane were added under ice cooling.
  • Sulfonyl chloride (176 ⁇ L, 1.859 mmol) was added. After stirring for 5 minutes under ice-cooling, the mixture was heated to room temperature and stirred at room temperature for 0.5 hour.
  • Example 2 Experiment in which the types of reagents and reaction conditions were examined for the elongation step in peptide synthesis on a membrane
  • amino acid elongation is performed after de-Fmoc and membrane washing.
  • a peptide sequence (compound SS02) supported on the membrane
  • changed the reaction conditions such as the reagent and equivalence ratio of the amino acid elongation process, and compared the reaction efficiency of the desired elongation reaction.
  • glycine capping was performed to confirm the residual rate of the starting material.
  • the elongation reaction of Fmoc-Gly-OH was subsequently carried out to react with the unreacted amine. Thereafter, it was cut out from the membrane using the method described in Example 1-2, and the extension efficiency of the target amino acid was calculated by comparing the UV area values of the peptide with the target amino acid extended and the peptide with Fmoc-Gly-OH extended. .
  • Reference Example 2-1 Peptide synthesis experiment on membrane under the reaction conditions described in Methods Mol . Biol., 2009, 570, 157 - 174
  • Reference Example 2-1-1 Removal of Fmoc group on MePhe supported on membrane
  • DMF 100 ⁇ L per membrane disk
  • ethanol 100 ⁇ L per membrane disk
  • the mixture was mixed at a ratio of 3.0 ⁇ L after being allowed to stand for 10 to 15 minutes and added to the membrane in the reaction container. After the membrane was covered with a lid and allowed to stand at room temperature for 25 to 60 minutes, the solution was discharged from the membrane, and the above-described extension reaction of Fmoc-Gly-OH was performed again. After draining the solution, the membranes were washed 3-4 times with DMF (100 ⁇ L per membrane disk) and 3 times with ethanol (100 ⁇ L per membrane disk) and air-dried.
  • Reference Example 2-1-3 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide from the membrane obtained in Reference Example 2-1-2 by the method described in Example 1-2 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed.
  • LCMS (ESI) m/z 514.5 [M+H] + Retention time: 3.64 minutes (Analysis conditions SQDAA05long)
  • LCMS (ESI) m/z 458.3 [M+H] + Retention time: 3.20 minutes (Analysis conditions SQDAA05long)
  • Extension efficiency (%) (UV area value of SS09*) / (sum value of UV area value of SS09* and UV area value of SS10*) x 100
  • Reference Example 2-2 Peptide synthesis experiment on membrane under reaction conditions described in WO2018/225851
  • Reference Example 2-2-1 Extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe supported on the membrane Using the membrane (compound SS08) obtained in Reference Example 2-1-1, containing an N-substituted amino acid Reaction conditions were set with reference to the peptide synthesis method (WO2018/225851), and an extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe on the membrane was performed.
  • Reference Example 2-2-2 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide from the membrane obtained in Reference Example 2-2-1 by the method described in Example 1-2 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed. The extension efficiency was calculated according to the formula described in Reference Example 2-1. The conditions and results of Reference Example 2-2 are shown in Table 7 below.
  • Reference Example 2-3 Peptide synthesis experiment on membrane under high reagent concentration conditions
  • Reference Example 2-3-1 Extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe supported on the membrane Using the membrane (compound SS08) obtained in Reference Example 2-1-1, in order to increase the extension efficiency.
  • Ratio (%) of UV area value of active ester (UV area value of active ester) / (UV area value of Fmoc-Nle-OH + UV area value of active ester + UV area value of peak 1 + UV of peak 2 Area value) x 100
  • peak 1 has a retention time of 1.07 minutes and is estimated to be a product consisting of Fmoc-Nle-OH and DIC
  • peak 2 has a retention time of 1.22 minutes and is a product of Fmoc-Nle-OH. It is estimated to be a mass.
  • the subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Reference Example 2-3-2 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide using the method described in Example 1-2 from the membrane obtained in Reference Example 2-3-1 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed.
  • the extension efficiency was calculated according to the formula described in Reference Example 2-1. As shown in Table 9 below, the elongation efficiency under conditions of high reagent concentration using DIC as a condensing agent was as high as 83% to 96%. However, under all conditions, precipitates were generated, making it difficult to apply these conditions to automatic synthesis.
  • Example 2-4 Peptide synthesis experiment on membrane under reaction conditions in which DsBC was used instead of DIC
  • Example 2-4-1 Extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe supported on the membrane
  • the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (compound SS08) was used, and DIC was changed to DsBC.
  • the extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe on the membrane was carried out under the reaction conditions.
  • Dissolve Fmoc-Nle-OH (0.63 mol/L) and HOAt (0.198 mol/L or 0.397 mol/L) in a solution of NMP/DMF 5/6 or 6.68/4.34, or in DMF.
  • Ratio (%) of UV area value of active ester (UV area value of active ester) / (UV area value of Fmoc-Nle-OH + UV area value of active ester + UV area value of peak 2 + UV of peak 3 Area value) x 100
  • peak 3 is a peak with a retention time of 1.15 minutes and is estimated to be a product consisting of Fmoc-Nle-OH and DsBC
  • peak 2 is a peak with a retention time of 1.22 minutes and is a product of Fmoc-Nle-OH. It is estimated to be a mass.
  • the subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Example 2-4-2 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide from the membrane obtained in Example 2-4-1 by the method described in Example 1-2 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed.
  • the extension efficiency was calculated according to the formula described in Reference Example 2-1.
  • the conditions and results of Reference Example 2-3 and Example 2-4 are shown in Tables 8 and 9 below. Using DsBC as a condensing agent, condensation was investigated under conditions of high reagent concentration, and as shown in Table 9, the elongation efficiency was as high as 90% to 98%. Since no precipitate is generated under these conditions, it can be applied to automatic synthesis.
  • Example 2-5 Experiment comparing the effects of using DsBC and DIC in on-membrane peptide synthesis using other Fmoc-protected amino acids and various activators
  • Example 2-5-1 Extension reaction of Fmoc-MeSer(THP)-OH to MePhe supported on membrane under DsBC usage conditions Using the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (compound SS08), the extension reaction of Fmoc-MeSer(THP)-OH to MePhe on the membrane was carried out with reference to the reaction conditions of Example 2-4-1. went.
  • Reference Example 2-5-2 Extension reaction of Fmoc-MeSer(THP)-OH to MePhe supported on the membrane under DIC usage conditions Using the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (compound SS08) Then, an elongation reaction of Fmoc-MeSer(THP)-OH to MePhe on the membrane was performed with reference to the reaction conditions of Reference Example 2-3-1.
  • Example 2-5-3 Extension reaction of Fmoc-MeAsp(OPis)-OH to MeAla supported on membrane under DsBC usage conditions Using the peptide-supported membrane disk (compound SS24) already prepared in Example 1-2-1, the Fmoc group was removed according to the method described in Reference Example 2-1-1 to obtain compound SS31. Using the obtained membrane (compound SS31), an extension reaction of Fmoc-MeAsp(OPis)-OH to MeAla on the membrane was performed with reference to the reaction conditions of Example 2-4-1.
  • Reference Example 2-5-4 Extension reaction of Fmoc-MeAsp(OPis)-OH to MeAla supported on the membrane under DIC conditions using the membrane obtained in Example 2-5-3 (compound SS31) Then, an elongation reaction of Fmoc-MeAsp(OPis)-OH to MeAla on the membrane was performed with reference to the reaction conditions of Reference Example 2-3-1.
  • a solution of Fmoc-MeAsp(OPis)-OH (0.62 mol/L) and Oxyma (0.193 mol/L) dissolved in DMF and DIC (stock solution) were mixed at a ratio of 10:1.353, and then mixed for 15 minutes. After standing still, 1.2 ⁇ L of the solution was added to the membrane (compound SS31) and left standing at room temperature for 30 minutes. The subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Example 2-5-5 Extension reaction of Fmoc-MePhe-OH to MeSer (THP) supported on a membrane under DsBC usage conditions Using the peptide-supported membrane disk (compound SS25) already prepared in Example 1-2-1, the Fmoc group was removed according to the method described in Reference Example 2-1-1 to obtain compound SS33. Using the obtained membrane (compound SS33), an extension reaction of Fmoc-MePhe-OH to MeSer (THP) on the membrane was performed with reference to the reaction conditions of Example 2-4-1.
  • Reference Example 2-5-6 Extension reaction of Fmoc-MePhe-OH to MeSer (THP) supported on the membrane under DIC usage conditions Using the membrane obtained in Example 2-5-5 (compound SS33) Then, an elongation reaction of Fmoc-MePhe-OH to MeSer (THP) on the membrane was performed with reference to the reaction conditions of Reference Example 2-3-1. A solution in which Fmoc-MePhe-OH (0.62 mol/L) and HOAt (0.193 mol/L) were dissolved in DMF and DIC (undiluted solution) were mixed at a ratio of 10:1.353 and allowed to stand for 15 minutes. Thereafter, 1.2 ⁇ L of the solution was added to the membrane (compound SS33) and left at room temperature for 30 minutes. The subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Example 2-5-7 Excision and analysis of various peptides supported on membrane Examples (reference examples)
  • the membranes obtained in 2-5-1 to 2-5-6 were subjected to Peptides were excised according to the method described, and target peptides (compounds SS12*, SS32* and SS34*) and peptides with Fmoc-Gly-OH extended in place of the desired Fmoc-protected amino acids (compounds SS10*, SS35* and SS36 *) (these are sometimes referred to as Glycine capping bodies) was confirmed to be produced.
  • target peptides compounds SS12*, SS32* and SS34*
  • peptides with Fmoc-Gly-OH extended in place of the desired Fmoc-protected amino acids compounds SS10*, SS35* and SS36 *
  • Extension efficiency (%) (UV area value of target peptide) / (total value of UV area value of target peptide and UV area value of glycine capping body) x 100
  • Table 10 The conditions and results of Examples (Reference Examples) 2-5-1 to 2-5-6 are shown in Table 10 below. Under the conditions in which DIC was used as a condensing agent, precipitates were generated in all cases, making it difficult to apply to automatic synthesis.
  • Example 2-6 Urea solubility verification experiment
  • Example 2-6-1 Experiment to confirm the solubility of DIC urea, DsBC urea, and tBEC urea in DMF The concentration of carbodiimide is 0.77 mol/L.
  • precipitates were confirmed in DIC in Reference Example 2-3 and in Examples 2-4 and 2-5.
  • urea derived from DsBC which was not present, its solubility in NMP and DMF was confirmed according to the following procedure.
  • DIC urea (compound SS05) and DsBC urea (compound SS06) synthesized in Example 1-3 were weighed as shown in Table 11 into a 1.5 mL screw cap vial, and NMP or DMF was added to each concentration. . The mixture was stirred at room temperature for 5 minutes or more, and then allowed to stand to check whether or not urea had dissolved. As a result, the solids of compound SS05, which is a DIC urea, were not completely dissolved at concentrations of 0.34 M or higher in NMP and 0.17 M or higher in DMF, whereas the solids of compound SS06, which is a DsBC urea, were not completely dissolved in both NMP and DMF. It was completely dissolved at .77M and no reprecipitation was observed even after 24 hours or more.
  • Example 2-6-2 Experiment to confirm the solubility of tBEC urea in DMF An experiment similar to Example 2-6-1 was conducted using tBEC having a different alkyl group from DIC and DsBC. 10.18 mg and 10.19 mg of tBEC urea (compound SS07) synthesized in Example 1-3 were weighed into a 1.5 mL screw cap vial, and NMP or DMF was added to each at a concentration of 0.77 mol/L. . The mixture was stirred at room temperature for 5 minutes or more, and then allowed to stand to check whether or not urea had dissolved. As a result, tBEC urea was completely dissolved as well as DsBC urea, and no reprecipitation was observed even after 24 hours or more had passed.
  • Example 2-7 Peptide synthesis experiment on membrane under high concentration conditions using other carbodiimides
  • Example 2-7-1 Extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe supported on a membrane using tBEC Using the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (compound SS08), Example Referring to the reaction conditions of 2-4-1, the elongation reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe on the membrane was carried out using tBEC, in which good solubility of urea in DMF was confirmed in Example 2-6. .
  • Example 2-7-2 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide from the membrane obtained in Example 2-7-1 by the method described in Example 1-2 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed. The extension efficiency was calculated according to the formula described in Reference Example 2-1. The results of Examples 2-7 are shown in Table 12 below.
  • Example 2-7-3 Extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe supported on the membrane using various condensing agents
  • the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (compound SS08) was used.
  • the extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe on the membrane was carried out using various carbodiimides synthesized in Example 1-4 with reference to the reaction conditions of Example 2-4-1.
  • Table 13 a solution of Fmoc-Nle-OH and HOAt in DMF was mixed with carbodiimide (undiluted solution), and after standing for 15 minutes, the solution was mixed with the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 ( 1.2 ⁇ L was added to Compound SS08) and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Example 2-7-4 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide from the membrane obtained in Example 2-7-3 by the method described in Example 1-2 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed.
  • the extension efficiency was calculated according to the formula described in Reference Example 2-1. The results are shown in Table 14 below.
  • the elongation efficiency was as high as 97% to 99%. Furthermore, in the condensation reaction using compounds SS26, SS27, SS28, and SS30, no precipitate was generated and it was possible to elongate the Fmoc-protected amino acid, and the conditions were applicable to automatic synthesis.
  • Example 2-8 Peptide synthesis experiments on membranes at various reaction temperatures, reaction solvents, and equivalent amounts of reagents
  • Example 2-8-1 Extension reaction of Fmoc-Nle-OH on MePhe supported on the membrane at various reaction temperatures and equivalent ratios of reaction solvents and reagents Membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (Compound SS08), the extension reaction of Fmoc-Nle-OH to MePhe on the membrane was performed by changing the reaction temperature, reaction solvent, and equivalent amount of reagent based on the reaction conditions of Example 2-4-1. Ta.
  • Example 2-8-2 Excision and analysis of Fmoc-Nle-MePhe supported on membrane Excision of peptide from the membrane obtained in Example 2-8-1 by the method described in Example 1-2 The production of a target peptide (compound SS09*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of Fmoc-Nle-OH was confirmed.
  • the extension efficiency was calculated according to the formula described in Reference Example 2-1. The results are shown in Table 16 below.
  • Example 2-5 the present reaction conditions can be applied even when the amino acids and activators are different, and the production of the desired peptide was confirmed without any precipitation of urea.
  • Example 2-6 it was confirmed that even if all DsBC was converted to urea, the risk of precipitation was extremely low. Furthermore, it was confirmed that the risk of urea precipitation is similarly extremely low in tBEC, which has a different alkyl group from DsBC. Furthermore, in the condensation reaction using compounds SS26, SS27, SS28, and SS30, no precipitate was observed in the preactivation solution as in Example 2-7, and extension of the Fmoc-protected amino acid was possible.
  • the reaction conditions using DsBC which can produce the desired peptide without precipitation of urea
  • elevated temperature conditions such as 40°C and 60°C
  • various reaction solvents such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 19, 20, 21, 22, 20, 21, 22, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 30, 31, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 35, 36, 39, 40, 40, 40, 40°C and 60°C, various reaction solvents, and equivalent ratios of reagents.
  • some reaction conditions including the type of carbodiimide that can suppress the precipitation of urea derived from carbodiimide while improving the elongation efficiency in the elongation step of peptide synthesis on a membrane were identified.
  • Example 3 Expansion of the applicable range of substrates, application experiment to automated synthesis using a peptide synthesizer
  • this experiment using the preferred reaction conditions for peptide synthesis on membranes specified in Example 2, we performed elongation reactions of other amino acids. was carried out. The amino acid elongation efficiency was evaluated in the same manner as in Example 2. We also applied these conditions to a peptide synthesizer.
  • Example 3-1 Peptide synthesis experiment on membrane using various amino acids and activators
  • Example 3-1-1 Removal of Fmoc group on Pro supported on membrane Using the peptide-supported membrane disk (compound SS03) already prepared in Example 1-2-1, the Fmoc group was removed according to the method described in Reference Example 2-1-1 to obtain compound SS13. .
  • Example 3-1-2 Extension reaction of Fmoc-protected amino acids to Pro supported on membrane Using the membrane (compound SS13) obtained in Example 3-1-1, an extension reaction of Fmoc-Asp(OPis)-OH to Pro on the membrane was performed under reaction conditions in which DIC was changed to tBEC.
  • a solution of Fmoc-Asp(OPis)-OH (0.62 mol/L) and an activator (0.194 mol/L or 0.387 mol/L) dissolved in DMF and tBEC (stock solution) were mixed at 10:1.355.
  • Example 3-1-3 Excision and analysis of various peptides supported on membrane The membrane obtained in Example 3-1-2 was subjected to peptide excision using the method described in Example 1-2. The production of a target peptide (compound SS14*) and a peptide (compound SS15*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of the desired Fmoc-protected amino acid was confirmed.
  • Reference Example 3-1-4 Extension reaction of Fmoc-protected amino acid to MePhe supported on membrane under DIC usage conditions
  • the membrane obtained in Reference Example 2-1-1 (compound SS08) was used to perform the reaction in Reference Example 2-3-1.
  • the extension reaction of Fmoc-Asp(OPis)-OH to MePhe on the membrane was performed with reference to the conditions.
  • Table 18 a solution of Fmoc-Asp(OPis)-OH and Oxyma dissolved in DMF and DIC (undiluted solution) were mixed, and after standing for 15 minutes, the solution was obtained in Reference Example 2-1-1.
  • 1.2 ⁇ L was added to the prepared membrane (compound SS08), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Example 3-1-5 Extension reaction of Fmoc-protected amino acid to MePhe supported on membrane Using the membrane (compound SS08) obtained in Reference Example 2-1-1, the reaction of Example 2-7-3 was carried out.
  • the extension reaction of Fmoc-Asp(OPis)-OH to MePhe on the membrane was carried out using various carbodiimides synthesized in Example 1-4 with reference to the reaction conditions. According to Table 18 below, a solution of Fmoc-Asp(OPis)-OH and Oxyma dissolved in DMF and various carbodiimides (undiluted solution) were mixed, and after standing for 15 minutes, the solution was obtained in Reference Example 2-1-1. 1.2 ⁇ L was added to the prepared membrane (compound SS08) and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The subsequent steps were carried out in the same manner as in Reference Example 2-1.
  • Example 3-1-6 Excision and analysis of various peptides supported on membrane The membranes obtained in Reference Example 3-1-4 and Example 3-1-5 were subjected to the procedures described in Example 1-2. The peptide was excised using the method, and the production of a target peptide (compound SS37*) and a peptide (compound SS10*) in which Fmoc-Gly-OH was extended instead of the desired Fmoc-protected amino acid was confirmed.
  • LCMS (ESI) m/z 648.5 [M+H] + Retention time: 3.80 minutes (Analysis conditions SQDAA05long)
  • the extension efficiency was calculated according to the formula described in Example 2-5. The results are shown in Table 19 below.
  • Example 3-2 Peptide synthesis experiment on membrane using peptide synthesizer
  • the preferred reaction conditions for on-membrane peptide synthesis identified in Example 2 were applied to synthesis on an automatic synthesizer.
  • the Fmoc method was used using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis).
  • the detailed operation procedure was carried out in the following manner according to the manual attached to the synthesizer.
  • double coupling was performed using an automatic synthesizer. For example, if the elongation efficiency is about 90% with single coupling, it is expected that the elongation efficiency will be about 99% by performing double coupling.
  • Solution 1 was prepared by dissolving the extending Fmoc-protected amino acid (0.63 mol/L) and HOAt, Oxyma, or HOOBt (0.198 mol/L or 0.397 mol/L) in DMF. DsBC was used as solution 2 as it was.
  • solution 3 was prepared by dissolving Fmoc-Gly-OH (0.6 mol/L) and HOAt (0.375 mol/L) in NMP.
  • Solution 4 was prepared by mixing DIC (0.71 mol/L) and DMF.
  • Example 1-2-1 Compound SS02
  • CelluSpots 384 frame with acid stable discs manufactured by Intavis
  • Solutions 1 to 4 were set in the peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • Glycine capping process Next, solutions 3 and 4 were mixed at a ratio of 5:6 in the mixing vial of the synthesizer, left to stand for 15 minutes, and then 3.0 ⁇ L was added to each membrane disk and reacted for 40 minutes at room temperature. After performing glycine capping by doing this, the solution was discharged. Thereafter, the above elongation reaction of Fmoc-Gly-OH was performed again. It was then washed seven times with DMF (25 ⁇ L per membrane disk) and dried under vacuum for 10 minutes.
  • Example 3-2 The results of Example 3-2 are shown in Table 20 below. No precipitation of DsBC-derived urea was observed in any of the substrates, and automatic synthesis using a peptide synthesizer was possible.
  • Example 3-3 Experiment for synthesizing cyclic peptides on a membrane using a peptide synthesizer The preferred reaction conditions for peptide synthesis on a membrane identified in Example 2 were applied to synthesis using an automatic synthesizer, and cyclic peptides were synthesized in parallel. Synthesis was performed.
  • Example 3-3-1 Peptide extension on membrane using a peptide synthesizer Referring to the reaction conditions of Examples 1-2 and 3-2, peptide extension was carried out using an automatic synthesizer to obtain the sequences listed in Table 21 below. was extended.
  • the Fmoc method was used using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis). The detailed operation procedure was carried out in the following manner according to the manual attached to the synthesizer. In addition, in order to obtain stable and high elongation efficiency even if the type of Fmoc-protected amino acid was different, double coupling was performed using an automatic synthesizer. In order to adjust the number of reaction points on the membrane during the elongation of the first residue, Fmoc-Photo-Linker (0.072 mol/L), 4-phenoxybutyric acid (0.22 mol/L) and HOBt (0.181 mol) were added. /L) was dissolved in DMF to prepare solution 1.
  • DIC was used as solution 2 as it was.
  • Solution 3 was prepared in this manner. The combinations are listed in Table 22 below.
  • DsBC was used as solution 4 as it was.
  • CelluSpots 384 frame with acid stable discs (manufactured by Intavis) was set in a peptide synthesizer. Solutions 1 to 4 were set in the peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • De-Fmoc step [1st residue] This operation was omitted since no Fmoc group was present at the N-terminus on the membrane.
  • a DMF solution (2% v/v) of DBU was added at 6.0 ⁇ L per membrane disk, and the Fmoc group was deprotected at room temperature. After adding 6.0 ⁇ L, the reaction was carried out for 15 minutes, and then the solution was discharged. Subsequently, it was washed 7 times with DMF (37.5 ⁇ L per membrane disk) and 6 times with ethanol (37.5 ⁇ L per membrane disk), and dried under vacuum for 15 minutes.
  • condensation reaction was carried out one more time for 30 minutes, and then washed 7 times with DMF (37.5 ⁇ L per membrane disk) and 5 times with ethanol (37.5 ⁇ L per membrane disk) for 15 minutes under vacuum. Dry.
  • Example 3-3-2 Deprotection, cyclization, excision, and analysis of various peptides on the membrane Using the membrane obtained in Example 3-3-1 (compounds SS38 to SS46), deprotection reaction, cyclization, and analysis of various peptides were performed. The reaction, excision from the membrane, and analysis were performed, and the production of the target peptides (compounds SS47 to SS55) listed in Table 23 below was confirmed.
  • each membrane disk was washed twice with 100 ⁇ L of NMP, and then 100 ⁇ L of DIPEA in NMP solution (60 mM) was added and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. The solution was drained and subsequently washed once with 100 ⁇ L of NMP and three times with DCM and air dried.
  • the purity of the target peptide was calculated from the following formula.
  • Purity (%) (UV area value of target peptide) / (sum of UV area values of all peaks excluding background and peaks derived from impurities contained in Fmoc-PEG6-OH) x 100 Note that the impurities contained in Fmoc-PEG6-OH are presumed to be compounds in which the Fmoc group is oxidized and is no longer deprotected.
  • Example 3-3 The results of Example 3-3 are shown in Table 24 below.
  • Example 4 Experiment to examine the range of applicable carriers In this experiment, the reaction conditions according to the method for synthesizing peptides containing N-substituted amino acids (WO2018/225851) and the peptide synthesis on the membrane specified in Example 2 were used. On-resin peptide synthesis experiments were performed using preferred reaction conditions.
  • Cl-Trt (2-Cl) resin (1.25-1.60 mmol/g, 100-200 mesh, 1% DVB) was purchased from Watanabe Chemical Industry Co., Ltd. or SUNRESIN.
  • Example 4-1 Synthesis of Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2
  • Example 4-1-1 Synthesis of (3S)-4-(dimethylamino)-3-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxobutanoic acid (Fmoc-Asp-NMe2, SS18)
  • (3S)-4-(dimethylamino)-3-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxobutanoic acid was synthesized according to the above scheme.
  • Example 4-1-2 (3S)-2-methylpropan-2-yl-4-(dimethylamino)-3-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxobutanoate (Fmoc- Synthesis of Asp(OtBu)-NMe2, compound SS18a) The synthesis was carried out starting with Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.0 g, 60.8 mmol) purchased from a commercial supplier.
  • Example 4-1-3 Synthesis of (3S)-4-(dimethylamino)-3-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxobutanoic acid (Fmoc-Asp-NMe2, compound SS18)
  • the crude product of compound SS18a (29.8 g) and TFE (270 mL) were added to a reaction vessel, and then a 4 mol/L hydrochloric acid dioxane solution (15.2 mL, 60.8 mmol) was added dropwise, and the reaction solution was diluted at room temperature for 1 hour. Stir for hours.
  • reaction solution was diluted with TBME (500 mL) and then extracted with 5% aqueous sodium carbonate solution (600 mL).
  • An 85% aqueous phosphoric acid solution (40-50 mL) was added to the resulting aqueous layer to make it acidic to around pH 2-3, and the aqueous layer was extracted with TBME (400 mL).
  • TBME 400 mL
  • the organic layer was dried over sodium sulfate. After removing the drying material by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 21.4 g (yield: 92%) of compound SS18.
  • LCMS (ESI) m/z 383.2 [M+H] + Retention time: 0.66 minutes (analysis conditions analysis conditions SQDFA05_2)
  • Example 4-1-4 (3S)-4-(dimethylamino)-3-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxobutanoate-2-chlorotrityl resin (Fmoc-Asp(O -Trt(2-Cl)-resin)-NMe2, synthesis of compound SS19) 2-chlorotrityl chloride resin (1.44 mmol/g, 39.0 g, 56.2 mmol) and DCM (390 mL) were placed in a reaction vessel equipped with a filter, and the mixture was shaken at room temperature for 20 minutes.
  • 2-chlorotrityl chloride resin (1.44 mmol/g, 39.0 g, 56.2 mmol) and DCM (390 mL) were placed in a reaction vessel equipped with a filter, and the mixture was shaken at room temperature for 20 minutes.
  • the obtained compound SS19 (10.48 mg) was placed in a reaction container, DMF (4.0 mL) was added, and the mixture was shaken at room temperature for 30 minutes. Thereafter, DBU (40 ⁇ L) was added and shaken at 30° C. for 15 minutes. Thereafter, DMF was added so that the reaction mixture became 10.0 mL, and 80 ⁇ L of the solution was diluted with DMF (920 ⁇ L).
  • the obtained diluted solution was analyzed by LC/MS (analysis conditions SQDFA05_1, injection volume: 5 ⁇ L), and from the UVarea value of dibenzofulvene (UVarea value at 294 nm: 4929.82, UVarea value at 304 nm: 4428.76), the compound The amount of SS19 supported was calculated to be 0.469 mmol/g.
  • Example 4-2 Peptide synthesis experiment under different reaction conditions on resin
  • Example 4-2-1 Preparation of compound SS20 (MeVal-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-NMe2)
  • Compound SS20 was prepared by the Fmoc method using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis) according to the method for synthesizing peptides containing N-substituted amino acids (WO2018/225851). For detailed operating procedures, the manual included with the synthesizer was followed.
  • Multipep RS manufactured by Intavis
  • Solution 1 was prepared by dissolving Fmoc-MeVal-OH (0.6 mol/L) constituting the target peptide and HOAt (0.375 mol/L) as a carboxylic acid activator in NMP.
  • Solution 2 was prepared by mixing DIC (0.71 mol/L) and DMF.
  • Solution 1 and Solution 2 were set in a peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • the solution was drained from the frit and the resin was subsequently washed twice with DMF (0.7 mL per column).
  • Extension process solution 1 (0.3 mL) and solution 2 (0.36 mL) were mixed in the mixing vial of the synthesizer, then added to the resin, the solid phase reaction vessel was heated to 40 °C, and the reaction was carried out for 2.5 hours. After performing a condensation reaction between the amino group on the resin and the Fmoc-protected amino acid, the solution was discharged from the frit. The resin was then washed three times with DMF (0.7 mL per column).
  • Example 4-2-2 Extension reaction of Fmoc-MeVal-OH to MeVal supported on resin under various reaction conditions The elongation reaction of Fmoc-MeVal-OH to MeVal supported on the resin was performed under the reaction conditions according to the method for synthesizing peptides containing N-substituted amino acids (WO2018/225851) or the peptide synthesis on the membrane specified in Example 2. Compound SS21 was synthesized using the reaction conditions preferred in .
  • Solution 1 was prepared by dissolving Fmoc-MeVal-OH (0.6 mol/L) and HOAt (0.375 mol/L) in NMP.
  • Solution 2 was prepared by mixing DIC (0.71 mol/L) and DMF.
  • Solution 1 and Solution 2 were set in a peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started. After mixing solution 1 (0.3 mL) and solution 2 (0.36 mL) in the mixing vial of the synthesizer, add them to the resin, heat the solid phase reaction container to 40 ° C., and react for 2.5 hours. After performing a condensation reaction between the amino groups on the resin and the Fmoc-protected amino acid, the solution was discharged from the frit. The resin was then washed three times with DMF (0.7 mL per column).
  • Example 4-2-2b Extension reaction of Fmoc-MeVal-OH to MeVal supported on resin under high reagent concentration reaction conditions using DsBC MeVal- Asp(O -Trt(2-Cl)-resin)-NMe2 (compound SS20, 100 mg per column), and by increasing the reagent concentration using DsBC with reference to the reaction conditions of Example 2-4, Example 2
  • the extension reaction of Fmoc-MeVal-OH with respect to MeVal on the resin was carried out under the reaction conditions described in No. 2 to No. 5 of Section 4.
  • Solution 1 (601 ⁇ L) prepared by dissolving Fmoc-MeVal-OH (0.63 mol/L) and HOAt (0.198 mol/L or 0.397 mol/L) in DMF and DsBC (undiluted solution) (98.7 ⁇ L) After mixing, 660 ⁇ L of the mixed solution was added to the resin, the solid phase reaction vessel was heated to 40°C or 50°C, and the reaction was carried out for 2.5 hours, resulting in a condensation reaction between the amino groups on the resin and the Fmoc-protected amino acid. I did it. The solution was then drained from the frit. The resin was then washed three times with DMF (0.7 mL per column).
  • Example 4-2-3 Preparation of compound SS22 Using the compound SS21 obtained in Reference Example 4-2-2a or Example 4-2-2b and following the method for synthesizing peptides containing N-substituted amino acids (WO2018/225851), Fmoc-Gly for MeVal on the resin was used. -OH extension reaction was performed. This example was carried out by the Fmoc method using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis). For detailed operating procedures, the manual included with the synthesizer was followed.
  • a peptide synthesizer Multipep RS; manufactured by Intavis
  • Solution 1 was prepared by dissolving Fmoc-Gly-OH (0.6 mol/L) constituting the target peptide and HOAt (0.375 mol/L) as a carboxylic acid activator in NMP.
  • Solution 2 was prepared by mixing DIC (0.71 mol/L) and DMF.
  • Compound SS21 (100 mg per column) prepared in Reference Example 4-2-2a or Example 4-2-2b was added to a solid phase reaction vessel, and the vessel was set in a peptide synthesizer.
  • Solution 1 and Solution 2 were set in a peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • Extension process solution 1 (0.3 mL) and solution 2 (0.36 mL) were mixed in the mixing vial of the synthesizer, then added to the resin, the solid phase reaction vessel was heated to 40 °C, and the reaction was carried out for 2.5 hours. After performing a condensation reaction between the amino group on the resin and the Fmoc-protected amino acid, the solution was discharged from the frit. The resin was then washed three times with DMF (0.7 mL per column). The column was further washed four times with DCM (1.0 mL per column), dried, and then used for subsequent studies.
  • the peptide was excised from a portion of the obtained resin using a TFE/DCM solution (1/1 (v/v)) containing DIPEA (0.042 mol/L).
  • the excised solution was analyzed by LCMS, the production of the target peptide (compound SS22*) was confirmed.
  • the production of a compound SS23* lacking one MeVal in addition to the target peptide was also confirmed.
  • Example 4 The results of Example 4 are shown in Table 25 below.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

固相法によるペプチド化合物の製造方法であって、　固相に担持された、アミノ基を有する第一のアミノ酸またはアミノ基を有する第一のペプチドを準備する準備工程；および　第一のアミノ酸または第一のペプチドと、保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のアミノ酸、または保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のペプチドとを、所定のカルボジイミド系縮合剤および添加剤の存在下で縮合させる縮合工程 を含む、前記方法。

Description

ペプチド化合物の製造方法
　本発明は、ペプチド化合物の製造方法に関する。
　ペプチドはアミノ酸が多数連結した分子であり、生物が生命活動を営む上で不可欠な役割を果たしている。生物学、化学の発展に伴いペプチドの理解が深まるとともに、新規医薬の創出を志向した天然ペプチドの利活用や、ペプチドの人工デザインによる機能性ペプチドの研究、開発が盛んに行われている（非特許文献１）。とりわけ、ペプチドの環化や、構成アミノ酸のＮ－アルキル化、特にＮ－メチル化が、膜透過性や代謝安定性向上に寄与することや（非特許文献２、非特許文献３）、細胞内移行や経口剤の開発の鍵となるドラッグライクな環状ペプチド構造の知見や考察が報告され、ペプチド創薬における該構造の重要性の認知度が高まりつつある（特許文献１）。
　ペプチドの合成は、アミド結合の形成により、望みの配列へと伸長することで達成される。より具体的な方法として、液相法と固相法が挙げられる（非特許文献４）。このうち固相法は、ポリマー樹脂（固相合成用樹脂）を固定相として、逐次的にアミノ酸を結合させることにより目的のペプチドを合成する方法である（非特許文献５）。さらに近年は、セルロース等のメンブランを固定相とするペプチドアレイ技術が進化し、少量多検体のペプチドを迅速に自動合成する技術として注目されている（非特許文献６）。
ＷＯ２０１３／１００１３２ ＷＯ２０１８／２２５８５１
Future Med. Chem., 2009, 1, 1289-1310. Acc Chem. Res., 2008, 41, 1331-1342. Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 254-269. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Volume 3, 2011. Solid phase peptide synthesis (Bachem社発行) [2022年1月18日検索]、インターネット <URL: https://www.bachem.com/wp-admin/admin-ajax.php?juwpfisadmin=false&action=wpfd&task=file.download&wpfd_category_id=180&wpfd_file_id=213490&token=&preview=1> Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, 21, 119-127. Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174. Org. Lett. 2021, 23, 6900-6904.
　ペプチド固相合成において、セルロース等のメンブランを固定相とするペプチドアレイ技術が進化し、少量多検体のペプチドを迅速に自動合成する技術として注目されている（非特許文献６）。そこで本発明者らは、ドラッグライクなペプチドを合成するために、メンブランを固定相とするペプチドアレイ技術への適用を試みた。しかしながら、ドラッグライクなペプチドはＮ－アルキルアミノ酸を多く含むためにアミド化反応の合成難易度が高く、ペプチドアレイを用いた合成において既存のアミド化条件を適用したところいずれも低収率となり、十分に満足するアミド化の条件は存在しないことが判明した。例えば、メンブラン固相に結合するＮ－メチルフェニルアラニンと、続くＦｍｏｃ－ノルロイシンとのアミド化反応において、非特許文献７に記載の反応条件を用いたところ、反応変換率は３～４％という結果であった。また、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法（特許文献２）に記載がある、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）と１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を用いた条件を参考に実施したところ、反応変換率が５０～６４％という結果であった。
　反応の詳細を精査したところ、反応系中における活性エステルの失活が確認された。反応変換率の向上を目的として試薬濃度を２倍にして検討したところ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルウレアの結晶が析出した。ペプチドアレイ技術では送液を自動化することで迅速化および効率化が図られるが、結晶が析出することにより目詰まりおよび／または洗浄不足に伴う不純物の増加を引き起こすため、既存条件のまま高い試薬濃度の条件を適用することは困難であった。
　一局面において本発明は、ペプチド合成法の、とくに縮合反応の工程において、反応変換率を向上させることを課題とする。また、一局面において本発明は、結晶析出を回避することにより自動合成への適用を可能とするアミド化条件を用いて、高純度のペプチド化合物を効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
　上記事情に鑑み、本発明者らは鋭意検討の結果、本発明を完成するに至った。本発明の方法は、メンブランを固定相とするペプチドアレイ技術に限定されることなく、ポリマー樹脂（固相合成用樹脂）を固定相とする固相合成にも適用可能な方法である。
　例えば、本発明は、以下の［Ａ１］～［Ａ６４］を提供する。
［Ａ１］　固相法によるペプチド化合物の製造方法であって、
　固相に担持された、アミノ基を有する第一のアミノ酸またはアミノ基を有する第一のペプチドを準備する準備工程；および
　第一のアミノ酸または第一のペプチドと、保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のアミノ酸、または保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のペプチドとを、下記一般式（Ａ）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤、
ＲＡ－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－ＲＢ　・・・（Ａ）
（式中、ＲＡはＣ４～Ｃ１０第２級または第３級アルキルであり、ＲＢはＣ２～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＡおよびＲＢにおける各基は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、または４～８員環状アミノより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい。）
　および添加剤の存在下で縮合させる縮合工程
を含む、前記方法。
［Ａ２］　ＲＡはＣ４～Ｃ１０第２級アルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ２－１］　ＲＡはＣ４～Ｃ８第２級アルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ２－２］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ８第２級または第３級アルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ２－３］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ８第２級アルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ２－４］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ６第２級アルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ２－５］　ＲＡは１－メチルヘプチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピルまたはｓｅｃ－ブチルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ２－６］　ＲＡはｓｅｃ－ブチルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ３］　ＲＢはＣ３～Ｃ１０第２級または第３級アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＢにおける各基は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、または４～８員環状アミノより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ３－１］　ＲＢはＣ３～Ｃ１０第２級または第３級アルキルである、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ３－２］　ＲＢはＣ３～Ｃ１０第２級もしくは第３級アルキル、またはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルである、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ３－３］　ＲＢはＣ３～Ｃ１０第２級アルキル、またはＣ７～Ｃ１０アリールアルキルである、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ３－４］　ＲＢはＣ３～Ｃ６第２級アルキルである、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ３－５］　ＲＢは１－メチルベンジル、１－メチルヘプチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピルまたはｓｅｃ－ブチルである、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ３－６］　ＲＢはｓｅｃ－ブチルである、［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ４］　ＲＡはＣ４～Ｃ８第２級または第３級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ１０第２級または第３級アルキル、またはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ４－１］　ＲＡはＣ４～Ｃ８第２級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ１０第２級アルキル、またはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ４－２］　ＲＡはＣ４～Ｃ６第２級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ８第２級アルキル、またはＣ７～Ｃ１０アリールアルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ５］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ８第２級または第３級アルキルであり、ＲＢはＣ３～Ｃ１０第２級または第３級アルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ５－１］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ８第２級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ１０第２級アルキル、またはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ５－２］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ８第２級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ１０第２級アルキル、またはＣ７～Ｃ１０アリールアルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ５－３］　ＲＡは不斉炭素を有するＣ４～Ｃ６第２級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ８第２級アルキル、またはＣ７～Ｃ１０アリールアルキルである、［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ６］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）、およびＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－１］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、またはＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－２］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、またはＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－３］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－４］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－５］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－６］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－７］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６－８］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）である、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ７］　添加剤が、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）、および５－（ヒドロキシイミノ）－１，３－ジメチルピリミジン－２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）－トリオン（Ｏｘｙｍａ　Ｂ）からなる群より選択される少なくとも１種である、［Ａ１］～［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ８］　添加剤が、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、およびＯｘｙｍａからなる群より選択される少なくとも１種である、［Ａ１］～［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ９］　添加剤が、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、またはＯｘｙｍａである、［Ａ１］～［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１０］　縮合工程が溶媒中で行われ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．４ｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、０．６ｍｏｌ／Ｌ以上、または０．７ｍｏｌ／Ｌ以上である、［Ａ１］～［Ａ９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１１］　縮合工程が溶媒中で行われ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、４．０ｍｏｌ／Ｌ以下、３．０ｍｏｌ／Ｌ以下、２．０ｍｏｌ／Ｌ以下、または１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、［Ａ１］～［Ａ１０］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ１２］　縮合工程が溶媒中で行われ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．４～４．０ｍｏｌ／Ｌ、０．５～３．０ｍｏｌ／Ｌ、０．６～２．０ｍｏｌ／Ｌ、または０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌである、［Ａ１］～［Ａ１１］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ１３]　縮合工程が溶媒中で行われ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌである、［Ａ１］～［Ａ１１］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ１４］　固相がメンブランまたは固相合成用樹脂である、［Ａ１］～［Ａ１３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ１５］　固相がメンブランである、［Ａ１］～［Ａ１３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ１６］　メンブランがセルロースメンブラン、ポリプロピレンメンブラン、またはポリアミノエチルメタクリルアミドメンブランである、［Ａ１５］に記載の方法。
［Ａ１７］　メンブランがセルロースメンブランである、［Ａ１５］に記載の方法。
［Ａ１８］　固相が固相合成用樹脂である、［Ａ１］～［Ａ１３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ａ１９］　固相合成用樹脂が、クロロトリチル（ＣＴＣ）レジン、トリチル（Ｔｒｔ）レジン、ＳＡＳＲＩＮレジン、Ｒｉｎｋアミドレジン、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄレジン、またはＷａｎｇレジンである、［Ａ１８］に記載の方法。
［Ａ２０］　固相合成用樹脂が、クロロトリチル(ＣＴＣ)レジンである、［Ａ１８］に記載の方法。
［Ａ２１］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、光開裂性部位、ジスルフィド結合、または酸不安定部位を介して結合されている、［Ａ１］～［Ａ２０］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２１－１］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、光開裂性部位を介して結合されている、［Ａ１］～［Ａ２０］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２１－２］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、ジズルフィド結合を介して結合されている、［Ａ１］～［Ａ２０］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２１－３］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、酸不安定部位を介して結合されている、［Ａ１］～［Ａ２０］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２２］　光開裂性部位がニトロベラトリルオキシカルボニル残基、またはクマリン残基を有する、［Ａ２１－１］に記載の方法。
［Ａ２２－１］　光開裂性部位がニトロベラトリルオキシカルボニル残基である、［Ａ２１－１］に記載の方法。
［Ａ２３］　酸不安定部位が、トリチルエステル構造、クロロトリチルエステル構造、アルコキシベンジルエーテル構造、トリアルコキシベンジルアミノカルボニル構造、ジアルコキシフェニル－アルコキシフェニルメチルアミノカルボニル構造、またはアルコキシキサンテン－９－イルアミノカルボニル構造を有する、［Ａ２１－３］に記載の方法。
［Ａ２３－１］　酸不安定部位が、クロロトリチルエステル構造を有する、［Ａ２１－３］に記載の方法。
［Ａ２４］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．０当量以上、１．１当量以上、または１．２当量以上のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２３］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２５］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、５．０当量以下、４．０当量以下、３．０当量以下、２．０当量以下、または１．５当量以下のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２４］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２６］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．０～５．０当量、１．１～４．０当量、１．１～３．０当量、１．２～２．０当量、または１．２～１．５当量のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２７］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．２～１．５当量のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２８］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、０．０１当量、０．０５当量、０．１当量、０．２当量以上、または０．３当量以上の添加剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２７］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２９］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．０当量以下、０．９当量以下、０．８当量以下、または０．７当量以下の添加剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３０］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、０．０５～１．０当量、０．１～０．９当量、０．２～０．８当量、または０．３～０．７当量の添加剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３１］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、０．３～０．７当量の添加剤を用いる、［Ａ１］～［Ａ２９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３２］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である、［Ａ１］～［Ａ３１］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３３］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、α，α－ジ置換アミノ酸、β－分岐アミノ酸、またはＮ－アルキルアミノ酸（ただし、Ｎ－アルキルアミノ酸におけるアルキルはＣ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、またはＣ６～Ｃ１０アリールより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい）である、［Ａ１］～［Ａ３２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３４］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、アルキルの炭素数が１～８であるＮ－アルキルアミノ酸（ただし、アルキルは、ハロゲン、シアノ、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、またはＣ６～Ｃ１０アリールより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい）である、［Ａ１］～［Ａ３２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３５］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、Ｎ－アルキルアミノ酸、アルキルの炭素数が１～８であるＮ－アルキルアミノ酸、アルキルの炭素数が１～６であるＮ－アルキルアミノ酸、アルキルの炭素数が１～３であるＮ－アルキルアミノ酸、またはＮ－メチルアミノ酸である、［Ａ１］～［Ａ３２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３６］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、Ｎ－メチルアミノ酸である、［Ａ１］～［Ａ３２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３７］　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのＣ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である、［Ａ１］～［Ａ３６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３８］　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのＣ末端のアミノ酸が、α，α－ジ置換アミノ酸、β－分岐アミノ酸、またはＮ－アルキルアミノ酸である、［Ａ１］～［Ａ３７］のいずれかに記載の方法。
［Ａ３９］　保護アミノ基における保護基が、下記式（１）で表される基である、［Ａ１］～［Ａ３８］のいずれかに記載の方法；
（式中、Ｒ１～Ｒ８は、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ８アルキル、Ｃ１－Ｃ８フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、Ｒ９～Ｒ１０は、独立して、水素またはメチルである）。
［Ａ４０］　保護アミノ基における保護基が、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、Ｆｍｏｃ（２，７ｔｂ）基、Ｆｍｏｃ（１Ｍｅ）基、Ｆｍｏｃ（２Ｆ）基、Ｆｍｏｃ（２，７Ｂｒ）基、ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ基、ｄｉｏ－Ｆｍｏｃ基、ｔｄｆ－Ｆｍｏｃ基、Ｆｍｏｃ（２ＴＭＳ）基、Ｆｍｏｃ（２ｓｏ３ｈ）基、ｓｍ－Ｆｍｏｃ基、またはｒｍ－Ｆｍｏｃ基である、［Ａ１］～［Ａ３８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ４１］　保護アミノ基における保護基が、Ｆｍｏｃ基である、［Ａ１］～［Ａ３８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ４２］　縮合工程が溶媒中で行われる、［Ａ１］～［Ａ４１］のいずれかに記載の方法。
［Ａ４３］　溶媒は、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、エーテル系溶媒、ハロゲン系溶媒、ニトリル系溶媒、およびベンゼン系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［Ａ４２］に記載の方法。
［Ａ４４］　溶媒がアミド系溶媒である、［Ａ４３］に記載の方法。
［Ａ４５］　アミド系溶媒は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチル－２－ピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチル－２－ピロリドン（ＮＢＰ）、およびホルムアミドからなる群より選択される、［Ａ４４］に記載の方法。
［Ａ４６］　溶媒がウレア系溶媒である、［Ａ４３］に記載の方法。
［Ａ４７］　ウレア系溶媒は、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、およびＮ，Ｎ’－ジメチルプロピレン尿素（ＤＭＰＵ）からなる群より選択される、［Ａ４６］に記載の方法。
［Ａ４８］　溶媒がエーテル系溶媒である、［Ａ４３］に記載の方法。
［Ａ４９］　エーテル系溶媒は、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、４－メチルテトラヒドロピランからなる群より選択される、［Ａ４８］に記載の方法。
［Ａ５０］　溶媒がハロゲン系溶媒である、［Ａ４３］に記載の方法。
［Ａ５１］　ハロゲン系溶媒は、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタンからなる群より選択される、［Ａ５０］に記載の方法。
［Ａ５２］　溶媒がニトリル系溶媒である、［Ａ４３］に記載の方法。
［Ａ５３］　ニトリル系溶媒は、アセトニトリルである、［Ａ５２］に記載の方法。
［Ａ５４］　溶媒がベンゼン系溶媒である、［Ａ４３］に記載の方法。
［Ａ５５］　ベンゼン系溶媒は、ベンゼン、トルエン、キシレンからなる群より選択される、［Ａ５４］に記載の方法。
［Ａ５６］　縮合工程が、０℃～１００℃、１０℃～８０℃、１０℃～６０℃、１０℃～５０℃、１０℃～４０℃、１０℃～３５℃、１５℃～６０℃、２０℃～６０℃、２０℃～４０℃、または２５℃～４０℃で行われる、［Ａ１］～［Ａ５５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ５７］　縮合工程が、２０℃～６０℃で行われる、［Ａ１］～［Ａ５５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ５８］　縮合工程を、２回以上繰り返す、［Ａ１］～［Ａ５７］のいずれかに記載の方法。
［Ａ５９］　縮合工程を、２回繰り返す、［Ａ１］～［Ａ５７］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６０］　縮合工程の後に、固相に担持された、第二のアミノ酸もしくは第二のペプチドにおける保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基の保護基を脱保護する脱保護工程を更に含む、［Ａ１］～［Ａ５９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６１］　縮合工程と脱保護工程との間に、固相を洗浄する洗浄工程を更に含む、［Ａ６０］に記載の方法。
［Ａ６２］　縮合工程と脱保護工程を複数回繰り返す（ただし、複数回の縮合工程で用いられる複数の第二のアミノ酸および／または第二のペプチドは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい）、［Ａ６０］または［Ａ６１］に記載の方法。
［Ａ６３］　［Ａ１］～［Ａ６２］のいずれかに記載の方法における、上記式（Ａ）で表されるカルボジイミド系縮合剤の使用。
［Ａ６４］　［Ａ１］～［Ａ６２］のいずれかに記載の方法における、ＤｓＢＣの使用。
　上記一般式（Ａ）におけるＲＡおよびＲＢの組み合わせに関して、反応系中に活性エステルが長時間高濃度を維持することが可能となり、縮合反応の工程において、反応変換率をより向上させることができる観点からは、［Ａ４］～［Ａ４－２］が好ましく、高濃度においてもカルボジイミド由来のウレアの析出を高度に回避することにより、自動合成においても効率良くアミド化できる観点からは、［Ａ５］～［Ａ５－３］が好ましい。
　［Ａ１］～［Ａ６４］においては、固相法によるペプチド化合物の製造方法について説明したが、これらの製造方法は、液相法にも適用することができる。すなわち、本発明の一局面は、以下の［Ａ１’］を提供する。［Ａ１’］は、［Ａ２］～［Ａ６４］のうち固相以外に関する特徴を含むものであってもよい。
［Ａ１’］　液相法によるペプチド化合物の製造方法であって、
　アミノ基を有する第一のアミノ酸またはアミノ基を有する第一のペプチドを準備する準備工程；および
　第一のアミノ酸または第一のペプチドと、保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のアミノ酸、または保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のペプチドとを、上記一般式（Ａ）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤および添加剤の存在下で縮合させる縮合工程
を含む、前記方法。
　かかる方法によれば、高反応変換率で、目的のペプチド化合物を得ることができる。
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｂ１］～［Ｂ６３］を提供する。
［Ｂ１］　固相法によるペプチド化合物の製造方法であって、
　固相に担持された、Ｎ－アルキルアミノ基を有する第一のアミノ酸、またはＮ末端にＮ－アルキルアミノ基を有する第一のペプチドを準備する準備工程；および
　第一のアミノ酸または第一のペプチドと、保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のアミノ酸、または保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のペプチドとを、下記一般式（Ａ’）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤、および
ＲＡ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－ＲＢ’　・・・（Ａ’）
（式中、ＲＡ’はＣ３～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＢ’はＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＡ’およびＲＢ’における各基は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、または４～８員環状アミノより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい。ただし、ＲＡ’における総炭素数は４以上である。）
　添加剤の存在下、溶媒中で縮合させ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．４～４．０ｍｏｌ／Ｌである縮合工程
を含む、前記方法。
［Ｂ２］　ＲＡ’はＣ４～Ｃ１０アルキル、Ｃ４～Ｃ６アルキル、またはＣ４アルキルである、［Ｂ１］に記載の方法。
［Ｂ３］　ＲＢ’はＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルである、［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ３―１］　ＲＢ’はＣ１～Ｃ１０アルキルである、［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ３―２］　ＲＢ’はＣ２～Ｃ６アルキルである、［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ３―３］　ＲＢ’はＣ４アルキルである、［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］　カルボジイミド系縮合剤が、ＤｓＢＣ、１－ｔｅｒｔ－ブチル－３－エチルカルボジイミド（ｔＢＥＣ）、ジｔｅｒｔ－ブチルカルボジイミド（ＤｔＢＣ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）、およびＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）からなる群より選択される少なくとも１種である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ４－１］　カルボジイミド系縮合剤が、ＤｓＢＣ、１－ｔｅｒｔ－ブチル－３－エチルカルボジイミド（ｔＢＥＣ）、ジｔｅｒｔ－ブチルカルボジイミド（ＤｔＢＣ）、および１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）からなる群より選択される少なくとも１種である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）、およびＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－１］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、またはＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－２］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、またはＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－３］　カルボジイミド系縮合剤が、ＤｓＢＣである、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－４］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－５］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－６］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－７］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５－８］　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）である、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ６］　添加剤が、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔおよびＯｘｙｍａからなる群より選択される少なくとも１種である、［Ｂ１］～［Ｂ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ７］　添加剤が、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、およびＯｘｙｍａからなる群より選択される少なくとも１種である、［Ｂ１］～［Ｂ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ８］　添加剤が、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、またはＯｘｙｍａである、［Ｂ１］～［Ｂ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ９］　溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、０．６ｍｏｌ／Ｌ以上、または０．７ｍｏｌ／Ｌ以上である、［Ｂ１］～［Ｂ８］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１０］　縮合工程において、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、３．０ｍｏｌ／Ｌ以下、２．０ｍｏｌ／Ｌ以下、または１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、［Ｂ１］～［Ｂ９］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｂ１１］　縮合工程において、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．５～３．０ｍｏｌ／Ｌ、０．６～２．０ｍｏｌ／Ｌ、または０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌである、［Ｂ１］～［Ｂ１０］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｂ１２］　縮合工程において、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌである、［Ｂ１］～［Ｂ１０］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｂ１３］　固相がメンブランまたは固相合成用樹脂である、［Ｂ１］～［Ｂ１２］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｂ１４］　固相がメンブランである、［Ｂ１］～［Ｂ１２］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｂ１５］　メンブランがセルロースメンブラン、ポリプロピレンメンブラン、またはポリアミノエチルメタクリルアミドメンブランである、［Ｂ１４］に記載の方法。
［Ｂ１６］　メンブランがセルロースメンブランである、［Ｂ１４］に記載の方法。
［Ｂ１７］　固相が固相合成用樹脂である、［Ｂ１］～［Ｂ１２］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｂ１８］　固相合成用樹脂が、クロロトリチル（ＣＴＣ）レジン、トリチル（Ｔｒｔ）レジン、ＳＡＳＲＩＮレジン、Ｒｉｎｋアミドレジン、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄレジン、またはＷａｎｇレジンである、［Ｂ１７］に記載の方法。
［Ｂ１９］　固相合成用樹脂が、クロロトリチル（ＣＴＣ）レジンである、［Ｂ１７］に記載の方法。
［Ｂ２０］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、光開裂性部位、ジスルフィド結合、または酸不安定部位を介して結合されている、［Ｂ１］～［Ｂ１９］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２０－１］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、光開裂性部位を介して担持されている、［Ｂ１］～［Ｂ１９］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２０－２］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、ジスルフィド結合を介して結合されている、［Ｂ１］～［Ｂ１９］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２０－３］　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、酸不安定部位を介して結合されている、［Ｂ１］～［Ｂ１９］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２１］　光開裂性部位がニトロベラトリルオキシカルボニル残基、またはクマリン残基を有する、［Ｂ２０－１］に記載の方法。
［Ｂ２１－１］　光開裂性部位がニトロベラトリルオキシカルボニル残基である、［Ｂ２０－１］に記載の方法。
［Ｂ２２］　酸不安定部位が、トリチルエステル構造、クロロトリチルエステル構造、アルコキシベンジルエーテル構造、トリアルコキシベンジルアミノカルボニル構造、ジアルコキシフェニル－アルコキシフェニルメチルアミノカルボニル構造、またはアルコキシキサンテン－９－イルアミノカルボニル構造を有する、［Ｂ２０－３］に記載の方法。
［Ｂ２２－１］　酸不安定部位が、クロロトリチルエステル構造を有する、［Ｂ２０－３］に記載の方法。
［Ｂ２３］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．０当量以上、１．１当量以上、または１．２当量以上のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２２］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２４］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、５．０当量以下、４．０当量以下、３．０当量以下、２．０当量以下、または１．５当量以下のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２５］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．０～５．０当量、１．１～４．０当量、１．１～３．０当量、１．２～２．０当量、または１．２～１．５当量のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２４］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２６］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．２～１．５当量のカルボジイミド系縮合剤を用いる、［Ｂ２５］に記載の方法。
［Ｂ２７］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、０．０１当量以上、０．０５当量以上、０．１当量以上、０．２当量以上、または０．３当量以上の添加剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２６］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２８］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、１．０当量以下、０．９当量以下、０．８当量以下、または０．７当量以下の添加剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２７］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ２９］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、０．０５～１．０当量、０．１～０．９当量、０．２～０．８当量、または０．３～０．７当量の添加剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２８］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３０］　縮合工程において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドに対して、０．３～０．７当量の添加剤を用いる、［Ｂ１］～［Ｂ２８］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３１］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である、［Ｂ１］～［Ｂ３０］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３２］　第一のアミノ酸のＮ－アルキルアミノ基におけるアルキル、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸のＮ－アルキルアミノ基におけるアルキルが、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、またはＣ１～Ｃ３アルキルである（ここでのアルキルは、ハロゲン、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、またはＣ６～Ｃ１０アリールより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい）、［Ｂ１］～［Ｂ３１］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３３］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、アルキルの炭素数が１～８であるＮ－アルキルアミノ酸（ただし、アルキルは、ハロゲン、シアノ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、またはＣ６～Ｃ１０アリールより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい）である、［Ｂ１］～［Ｂ３２］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３４］　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、Ｎ－アルキルアミノ酸、アルキルの炭素数が１～８であるＮ－アルキルアミノ酸、１～６であるＮ－アルキルアミノ酸、アルキルの炭素数が１～３であるＮ－アルキルアミノ酸、またはＮ－メチルアミノ酸である、［Ｂ１］～［Ｂ３２］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３５］　第一のアミノ酸のＮ－アルキルアミノ基におけるアルキル、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸のＮ－アルキルアミノ基におけるアルキルが、メチル基である、［Ｂ１］～［Ｂ３４］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３６］　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのＣ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である、［Ｂ１］～［Ｂ３５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３７］　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのＣ末端のアミノ酸が、α，α－ジ置換アミノ酸、β－分岐アミノ酸、またはＮ－アルキルアミノ酸である、［Ｂ１］～［Ｂ３６］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ３８］　保護アミノ基における保護基が、下記式（１）で表される基である、［Ｂ１］～［Ｂ３７］のいずれかに記載の方法；
（式中、Ｒ１～Ｒ８は、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ８アルキル、Ｃ１－Ｃ８フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、Ｒ９～Ｒ１０は、独立して、水素またはメチルである）。
［Ｂ３９］　保護アミノ基における保護基が、Ｆｍｏｃ基、Ｆｍｏｃ（２，７ｔｂ）基、Ｆｍｏｃ（１Ｍｅ）基、Ｆｍｏｃ（２Ｆ）基、Ｆｍｏｃ（２，７Ｂｒ）基、ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ基、ｄｉｏ－Ｆｍｏｃ基、ｔｄｆ－Ｆｍｏｃ基、Ｆｍｏｃ（２ＴＭＳ）基、Ｆｍｏｃ（２ｓｏ３ｈ）基、ｓｍ－Ｆｍｏｃ基、またはｒｍ－Ｆｍｏｃ基である、［Ｂ１］～［Ｂ３７］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ４０］　保護アミノ基における保護基が、Ｆｍｏｃ基である、［Ｂ１］～［Ｂ３７］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ４１］　縮合工程が溶媒中で行われる、［Ｂ１］～［Ｂ４０］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ４２］　溶媒は、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、エーテル系溶媒、ハロゲン系溶媒、ニトリル系溶媒、およびベンゼン系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［Ｂ４１］に記載の方法。
［Ｂ４３］　溶媒がアミド系溶媒である、［Ｂ４２］に記載の方法。
［Ｂ４４］　アミド系溶媒は、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＮＥＰ、ＮＢＰ、およびホルムアミドからなる群より選択される、［Ｂ４３］に記載の方法。
［Ｂ４５］　溶媒がウレア系溶媒である、［Ｂ４２］に記載の方法。
［Ｂ４６］　ウレア系溶媒は、ＤＭＩ、およびＤＭＰＵからなる群より選択される、［Ｂ４５］に記載の方法。
［Ｂ４７］　溶媒がエーテル系溶媒である、［Ｂ４２］に記載の方法。
［Ｂ４８］　エーテル系溶媒は、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、４－メチルテトラヒドロピランからなる群より選択される、［Ｂ４７］に記載の方法。
［Ｂ４９］　溶媒がハロゲン系溶媒である、［Ｂ４２］に記載の方法。
［Ｂ５０］　ハロゲン系溶媒は、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタンからなる群より選択される、［Ｂ４９］に記載の方法。
［Ｂ５１］　溶媒がニトリル系溶媒である、［Ｂ４２］に記載の方法。
［Ｂ５２］　ニトリル系溶媒は、アセトニトリルである、［Ｂ５１］に記載の方法。
［Ｂ５３］　溶媒がベンゼン系溶媒である、［Ｂ４２］に記載の方法。
［Ｂ５４］　ベンゼン系溶媒は、ベンゼン、トルエン、キシレンからなる群より選択される、［Ｂ５３］に記載の方法。
［Ｂ５５］　縮合工程が、０℃～１００℃、１０℃～８０℃、１０℃～６０℃、１０℃～５０℃、１０℃～４０℃、１０℃～３５℃、１５℃～６０℃、２０℃～６０℃、２０℃～４０℃、または２５℃～４０℃で行われる、［Ｂ１］～［Ｂ５４］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５６］　縮合工程が、２０℃～６０℃で行われる、［Ｂ１］～［Ｂ５４］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５７］　縮合工程を、２回以上繰り返す、［Ｂ１］～［Ｂ５６］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５８］　縮合工程を、２回繰り返す、［Ｂ１］～［Ｂ５６］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５９］　縮合工程の後に、固相に担持された、第二のアミノ酸もしくは第二のペプチドにおける保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基の保護基を脱保護する脱保護工程を更に含む、［Ｂ１］～［Ｂ５８］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ６０］　縮合工程と脱保護工程との間に、固相を洗浄する洗浄工程を更に含む、［Ｂ５９］に記載の方法。
［Ｂ６１］　縮合工程と脱保護工程を複数回繰り返す（ただし、複数回の縮合工程で用いられる複数の第二のアミノ酸および／または第二のペプチドは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）、［Ｂ５９］または［Ｂ６０］に記載の方法。
［Ｂ６２］　［Ｂ１］～［Ｂ６１］のいずれかに記載の方法における、式（Ａ’）で表されるカルボジイミド系縮合剤の使用。
［Ｂ６３］　［Ｂ１］～［Ｂ６１］のいずれかに記載の方法における、ＤｓＢＣの使用。
［Ｂ６３－１］　［Ｂ１］～［Ｂ６１］のいずれかに記載の方法における、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）の使用。
［Ｂ６３－２］　［Ｂ１］～［Ｂ６１］のいずれかに記載の方法における、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）の使用。
［Ｂ６３－３］　［Ｂ１］～［Ｂ６１］のいずれかに記載の方法における、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）の使用。
［Ｂ６３－４］　［Ｂ１］～［Ｂ６１］のいずれかに記載の方法における、Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）の使用。
　［Ｂ１］～［Ｂ６３］においては、固相法によるペプチド化合物の製造方法について説明したが、これらの製造方法は、液相法にも適用することができる。すなわち、本発明の一局面は、以下の［Ｂ１’］を提供する。［Ｂ１’］は、［Ｂ２］～［Ｂ６３］のうち固相以外に関する特徴を含むものであってもよい。
［Ｂ１’］　液相法によるペプチド化合物の製造方法であって、
　Ｎ－アルキルアミノ基を有する第一のアミノ酸、またはＮ末端にＮ－アルキルアミノ基を有する第一のペプチドを準備する準備工程；および
　第一のアミノ酸または第一のペプチドと、保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のアミノ酸、または保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のペプチドとを、上記一般式（Ａ’）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤、および添加剤の存在下、溶媒中で縮合させ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．４～４．０ｍｏｌ／Ｌである縮合工程
を含む、前記方法。
　かかる方法によれば、高反応変換率で、目的のペプチド化合物を得ることができる。
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｃ１］～［Ｃ１６］を提供する。
［Ｃ１］　［Ａ１］～［Ａ６４］または［Ｂ１］～［Ｂ６３］のいずれかに記載の方法を含む、メンブランに担持されたペプチド化合物の製造方法。
［Ｃ２］　メンブランに担持されたペプチド化合物が、Ｎ－アルキルアミノ酸由来の構成単位を２以上有する、［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］　メンブランに担持されたペプチド化合物が、Ｎ－アルキルアミノ酸由来の構成単位を３以上、４以上、５以上、６以上、または７以上有する、［Ｃ１］または［Ｃ２］に記載の方法。
［Ｃ４］　メンブランに担持されたペプチド化合物が、Ｎ－アルキルアミノ酸由来の構成単位を７以上有する、［Ｃ１］～［Ｃ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ５］　メンブランに担持されたペプチド化合物が、アミノ酸由来の構成単位を、合計で、７以上、８以上、９以上、または１０以上有する、［Ｃ１］～［Ｃ４］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ６］　ペプチド化合物が、アミノ酸由来の構成単位を、合計で、１０以上有する、［Ｃ１］～［Ｃ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ７］　ペプチド化合物が、アミノ酸由来の構成単位を、合計で、３０以下、２５以下、２０以下、１８以下、１７以下、１６以下、または１５以下有する、［Ｃ１］～［Ｃ６］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ８］　ペプチド化合物が、アミノ酸由来の構成単位を、合計で、１５以下有する、［Ｃ１］～［Ｃ７］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ９］　［Ｃ１］～［Ｃ８］のいずれかに記載の方法によって、メンブランに担持された１０種類以上のペプチド化合物を得る工程を含む、メンブランに担持されたペプチドライブラリの製造方法。
［Ｃ１０］　［Ｃ１］～［Ｃ８］のいずれかに記載の方法によって、メンブランに担持された２０種類以上、４０種類以上、８０種類以上、１００種類以上、２００種類以上、または３８４種類以上のペプチド化合物を得る工程を含む、メンブランに担持されたペプチドライブラリの製造方法。
［Ｃ１１］　［Ｃ１］～［Ｃ８］のいずれかに記載の方法によって、メンブランに担持された３８４種類以上のペプチド化合物を得る工程を含む、メンブランに担持されたペプチドライブラリの製造方法。
［Ｃ１２］　自動合成機を用いる、［Ｃ１］～［Ｃ１１］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ１３］　メンブランに担持されたペプチド化合物からペプチド化合物を切り出す工程を更に含む、［Ｃ１］～［Ｃ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ｃ１４］　光照射によりペプチド化合物を切り出す、［Ｃ１３］に記載の方法。
［Ｃ１５］　［Ｃ１３］または［Ｃ１４］に記載の方法によって切り出したペプチド化合物を環化する工程を含む、環状ペプチドまたは環状ペプチドライブラリの製造方法。
［Ｃ１６］　自動合成機を用いる、［Ｃ１５］に記載の方法。
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｄ１］～［Ｄ６］を提供する。
［Ｄ１］　メンブランにリンカーを介して結合したペプチド化合物であって、Ｎ－アルキルアミノ酸由来の構成単位を２以上有する、前記ペプチド化合物。
［Ｄ２］　ペプチド化合物が、Ｎ－アルキルアミノ酸由来の構成単位を３以上、４以上、５以上、６以上、または７以上有する、［Ｄ１］に記載のペプチド化合物。
［Ｄ３］　ペプチド化合物が、アミノ酸由来の構成単位を、合計で、７以上、８以上、９以上、１０以上、または１１以上有する、［Ｄ１］または［Ｄ２］に記載のペプチド化合物。
［Ｄ４］　ペプチド化合物が、アミノ酸由来の構成単位を、合計で、３０以下、２５以下、２０以下、１８以下、１７以下、１６以下、または１５以下有する、［Ｄ１］～［Ｄ３］のいずれかに記載のペプチド。
［Ｄ５］　［Ｄ１］～［Ｄ４］のいずれかに記載の、メンブランにリンカーを介して結合したペプチド化合物を１０種類以上含む、ペプチドライブラリ。
［Ｄ６］　メンブランにリンカーを介して結合したペプチド化合物を、２０種類以上、４０種類以上、８０種類以上、１００種類以上、２００種類以上、または３８４種類以上含む、［Ｄ５］に記載のペプチドライブラリ。
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｅ１］～［Ｅ３］を提供する。
［Ｅ１］　標的分子に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
　（１）［Ｃ９］～［Ｃ１６］のいずれかに記載の方法によりペプチドライブラリ、または環状ペプチドライブラリを合成すること；
　（２）該ペプチドライブラリ、または環状ペプチドライブラリを標的分子と接触させること；
　（３）標的分子に結合するペプチド化合物を選択すること
を含む、前記方法。
［Ｅ２］　標的分子がタンパク質、核酸、ポリペプチド、または糖鎖である、［Ｅ１］に記載の方法。
［Ｅ３］　標的分子に結合する化合物の選択が、表面プラズモン共鳴（Surface plasmon resonance)またはアルファスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）により実施される、［Ｅ１］または［Ｅ２］に記載の方法。
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｆ１］～［Ｆ５］を提供する。
［Ｆ１］　ＤｓＢＣを含む、ペプチド合成における析出抑制剤。
［Ｆ２］　Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）を含む、ペプチド合成における析出抑制剤。
［Ｆ３］　Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）を含む、ペプチド合成における析出抑制剤。
［Ｆ４］　Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）を含む、ペプチド合成における析出抑制剤。
［Ｆ５］　Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）を含む、ペプチド合成における析出抑制剤。
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｇ１］～［Ｇ４］を提供する。
［Ｇ１］　Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）
［Ｇ２］　Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）
［Ｇ３］　Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）
［Ｇ４］　Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）
　例えば、本発明はまた、以下の［Ｈ１］～［Ｈ７］を提供する。
［Ｈ１］　Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）、またはＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ２］　Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ３］　Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ４］　Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ５］　Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ６］　Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）、又はＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ７］　Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）を縮合剤として用いて、アミド結合を形成する工程を含む、化合物の製造方法。
［Ｈ８］　前記アミド結合を形成する工程が、固相又は液相で行われる、［Ｈ１］～［Ｈ７］のいずれかに記載の製造方法。
　上記番号付けにおいて、従属項が引用する番号は、特に言及がない限りその番号の枝番を含む。例えば、従属項において引用する［Ａ２］は、［Ａ２］とともに、その枝番である［Ａ２－１］～〔Ａ２－６〕を含むことを示す。他の番号付けにおいても同様である。
　本発明の一局面によれば、ペプチド固相合成法の、とくに縮合反応の工程において、反応変換率を向上させることができる。また、本発明の一局面によれば、ペプチド固相合成法の、とくに縮合反応の工程において、結晶析出を回避することにより自動合成への適用を可能とするアミド化条件として、高純度のペプチド化合物を効率良く製造する方法を提供することができる。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
（用語の定義等）
　本明細書において「１つまたは複数の」とは、１つまたは２つ以上の数を意味する。「１つまたは複数の」が、ある基の置換基に関連する文脈で用いられる場合、この用語は、１つからその基が許容する置換基の最大数までの数を意味する。「１つまたは複数の」として具体的には、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および／またはそれより大きい数が挙げられる。
　本明細書において、数値範囲を示す「～」とはその両端の値を含み、例えば、「Ａ～Ｂ」は、Ａ以上であり、かつＢ以下である数値範囲を意味する。
　本明細書において、「下限」とは「以上」および「より多い」の両方の意味を含み、「上限」とは、「以下」および「より少ない」の両方の意味を含む。
　本明細書において、「約」という用語は、数値と組み合わせて使用される場合、その数値の＋１０％および－１０％の値範囲を意味する。
　本明細書において、「および／または」との用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」には、以下の７通りのバリエーションが含まれる；
（ｉ）　Ａ、（ｉｉ）　Ｂ、（ｉｉｉ）　Ｃ、（ｉｖ）　ＡおよびＢ、（ｖ）　ＡおよびＣ、（ｖｉ）　ＢおよびＣ、（ｖｉｉ）　Ａ、Ｂ、およびＣ。
　本明細書において、「室温」とは約２０℃～約２５℃の温度を意味する。
　本明細書における「ハロゲン」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが例示される。
　本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素および水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数１～２０（Ｃ１～Ｃ２０、以下「Ｃｐ～Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはＣ１～Ｃ１０アルキル、より好ましくはＣ１～Ｃ６アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル（２－メチルプロピル）、ｎ－ペンチル、ｓ－ペンチル（１－メチルブチル）、ｔ－ペンチル（１，１－ジメチルプロピル）、ネオペンチル（２，２－ジメチルプロピル）、イソペンチル（３－メチルブチル）、３－ペンチル（１－エチルプロピル）、１，２－ジメチルプロピル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、１－エチル－１－メチルブチル等が挙げられる。
　「Ｃ３～Ｃ１０第２級アルキル」の具体例としては、ｉ－プロピル、ｓ－ブチル、ｓ－ペンチル、３－ペンチル、１，２－ジメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル等が挙げられる。「不斉炭素を有するＣ４～Ｃ１０第２級アルキル」の具体例としては、ｓ－ブチル、ｓ－ペンチル、１，２－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル等が挙げられる。
　「Ｃ４～Ｃ１０第３級アルキル」の具体例としては、ｔ－ブチル、ｔ－ペンチル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１－エチル－１－メチルブチル等が挙げられる。「不斉炭素を有するＣ４～Ｃ１０第３級アルキル」の具体例としては、１－エチル－１－メチルブチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはＣ２～Ｃ１０アルケニル、より好ましくはＣ２～Ｃ６アルケニルが挙げられる。具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、３－メチル－２－ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはＣ２～Ｃ１０アルキニル、より好ましくはＣ２～Ｃ６アルキニルが挙げられる。具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２’－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはＣ３～Ｃ８シクロアルキルが挙げられる。具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［３．３］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環、および芳香族炭化水素環基を意味する。アリールとして好ましくはＣ６～Ｃ１０アリールが挙げられる。具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の１価の基、および芳香族複素環基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。ヘテロアリールの環を構成する原子の数は好ましくは５～１０（５～１０員ヘテロアリール）であり、より好ましくは５～７（５～７員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、アザインドリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジル、ピラゾロピリジル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、ピロロピラジニル、フロピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味する。アリールアルキルとして、Ｃ７～Ｃ１４アリールアルキルが好ましく、Ｃ７～Ｃ１０アリールアルキルがより好ましい。アリールアルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、３－フェニルプロピルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味する。アルコキシとして、好ましくはＣ１～Ｃ６アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、３－メチルブトキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ２、モノＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。
　本明細書において「モノアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、Ｒが水素であり、かつＲ’が前記定義の「アルキル」である基を意味する。モノアルキルアミノとして、好ましくは、モノＣ１～Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。モノアルキルアミノとして具体的には、たとえば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、ｉ－プロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、ｓ－ブチルアミノ、ｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「ジアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’が独立して前記定義の「アルキル」である基を意味する。ジアルキルアミノとして、好ましくは、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。ジアルキルアミノとして具体的には、たとえば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「環状アミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する基を意味する。環状アミノとして、好ましくは、４～８員環状アミノが挙げられる。環状アミノとして具体的には、たとえば、１－アゼチジル、１－ピロリジル、１－ピペリジル、１－ピペラジル、４－モルホリニル、３－オキサゾリジル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル－４－イル、３－オキサ－８－アザビシクロ［３．２．１］オクタン－８－イルなどが挙げられる。
　本明細書に記載の製造方法において、定義した基が実施方法の条件下で望まない化学的変換を受けてしまう場合、例えば、官能基の保護、脱保護等の手段を用いることにより、該化合物を製造することができる。ここで保護基の選択および脱着操作は、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第5版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　本明細書における「アミノ基の保護基」には、カルバメート型の保護基、アミド型の保護基、アリールスルホンアミド型の保護基、アルキルアミン型の保護基、イミド型の保護基などが挙げられる。具体的には、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ｃｂｚ、Ｔｅｏｃ、トリフルオロアセチル、ペンタフルオロプロピオニル、フタロイル、ベンゼンスルホニル、トシル、ノシル、ジニトロノシル、ｔ－ブチル、トリチル、クミル、ベンジリデン、４－メトキシベンジリデン、ジフェニルメチリデンなどが例示される。
　本明細書において「保護アミノ基」とは、任意の保護基で保護されたアミノ基を意味する。保護アミノ基として具体的には、例えば、上述のアミノ基の保護基で保護されたアミノ基が挙げられる。
　本明細書において「ヒドロキシ基の保護基」には、アルキルエーテル型の保護基、アラルキルエーテル型の保護基、シリルエーテル型、炭酸エステル型の保護基などが挙げられる。ヒドロキシの保護基として具体的には、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、テトラヒドロピラニル、ｔ－ブチル、アリル、２，２，２－トリクロロエチル、ベンジル、４－メトキシベンジル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、メトキシカルボニル、９－フルオレニルメトキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルなどが例示される。
　本明細書において、「保護ヒドロキシ基」とは、任意の保護基で保護されたヒドロキシ基を意味する。保護ヒドロキシ基として具体的には、例えば、上述のヒドロキシ基の保護基で保護されたヒドロキシ基が挙げられる。
　本明細書において「カルボキシ基の保護基」には、アルキルエステル型の保護基、ベンジルエステル型の保護基、置換されたアルキルエステル型の保護基などが挙げられる。カルボキシ基の保護基として具体的には、メチル、エチル、ｔ－ブチル、ベンジル、トリチル、クミル、メトキシトリチル、２－（トリメチルシリル）エチル、２，２，２－トリクロロエチル、アリルなどが例示される。
　本明細書において、「保護カルボキシ基」とは、任意の保護基で保護されたカルボキシ基を意味する。保護カルボキシ基として具体的には、例えば、上述のカルボキシ基の保護基で保護されたカルボキシ基が挙げられる。
　本明細書における「ペプチド」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合して形成されるペプチドであれば特に限定されない。ペプチドとして、好ましくは５～３０残基、より好ましくは７～１５残基、さらに好ましくは９～１３残基のペプチドである。ペプチドは、直鎖ペプチドでも環状ペプチドでもよい。
　本明細書における「ペプチド化合物」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合および一部がエステル結合によって連結されるペプチド化合物であれば特に限定されないが、好ましくは５～３０残基、より好ましくは８～１５残基、さらに好ましくは９～１３残基のペプチド化合物である。本実施形態において合成されるペプチド化合物は、１つのペプチド中に少なくとも３つのＮ置換アミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも５つ以上のＮ置換アミノ酸を含むことがより好ましい。これらのＮ置換アミノ酸は、ペプチド化合物中に連続して存在していても、不連続に存在していてもよい。本実施形態におけるペプチド化合物は、直鎖状でも環状でもよく、環状ペプチド化合物が好ましい。ペプチド化合物として、好ましくは５～３０残基、より好ましくは８～１５残基、さらに好ましくは９～１３残基のペプチド化合物である。また、ペプチド化合物として、１つのペプチド化合物に少なくとも３つのＮ置換アミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも５つ以上のＮ置換アミノ酸を含むことがより好ましい。これらのＮ置換アミノ酸は、ペプチド化合物中に連続して存在していても、不連続に存在していてもよい。本実施形態におけるペプチド化合物は、直鎖状でも環状でもよく、環状ペプチド化合物が好ましい。
　本明細書における「環状ペプチド化合物」は、直鎖ペプチド化合物の任意の基同士を結合させて環化することにより得ることができる環状のペプチド化合物である。環状ペプチド化合物の環化の態様として、アミド結合のような炭素－窒素結合による環化、エステル結合やエーテル結合のような炭素－酸素結合による環化、チオエーテル結合のような炭素－硫黄結合による環化、炭素－炭素結合による環化、あるいは複素環構築による環化など、どのような形態であってもよい。これらのうちでは、アミド結合、炭素－硫黄結合または炭素－炭素結合などの共有結合を介した環化が好ましい。アミド結合による環化が特に好ましく、環化に用いられるカルボキシ基やアミノ基の位置は、主鎖上のものでも側鎖上のものでもよい。より好ましくは、側鎖のカルボキシ基とＮ末端の主鎖のアミノ基によるアミド結合を介した環化である。
　ペプチド化合物の「環化」とは、４以上のアミノ酸残基を含む環状部を形成することを意味する。本明細書における環状ペプチド化合物の環状部に含まれるアミノ酸の数は特に限定されないが、４～２０残基、５～１５残基、６～１３残基が例示される。直鎖状のペプチド化合物を環状ペプチド化合物に変換する方法は、Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition(R. C. Larock著）、またはMarch's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition、(M. B. Smith, J. March著）などに記載の方法により、分子内で結合形成反応を行うことにより実施することができる。結合形成反応の後に、さらに官能基変換反応を行うこともできる。結合形成反応は、カルボン酸とアミンから形成されるＣ（Ｏ）－Ｎ結合、酸素原子を利用したＣ－Ｏ－Ｃ結合、Ｃ（Ｏ）－Ｏ結合、Ｃ（Ｓ）－Ｏ結合、硫黄原子を利用したＣ（Ｏ）－Ｓ結合、Ｃ（Ｓ）－Ｓ結合、Ｃ－Ｓ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｓ（Ｏ）－Ｃ結合、Ｃ－Ｓ（Ｏ２）－Ｃ結合、窒素原子を利用した、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ結合、Ｎ－Ｃ（Ｓ）Ｎ結合、Ｃ（Ｓ）－Ｎ結合などが例示される。さらに、鈴木反応、Heck反応、Sonogashira反応等の遷移金属を触媒としたＣ－Ｃ結合の形成反応などが挙げられる。結合形成反応の後に、さらに行う官能基変換反応として、酸化反応または還元反応が例示される。具体的には硫黄原子を酸化して、スルホキシド基やスルホン基に変換する反応が例示される。また、炭素－炭素結合のうち、三重結合や二重結合を還元して、二重結合または単結合に変換する還元反応が例示される。２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合すると、ペプチド結合により閉環構造が形成されるが、２つのアミノ酸の側鎖同士、側鎖と主鎖の結合等により、２つのアミノ酸間の共有結合が形成されてもよい。
　本明細書において「メンブラン」は、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。このようなメンブランとして、具体的には、例えば、セルロースメンブラン、ポリプロピレンメンブラン、またはポリアミノエチルメタクリルアミドメンブランなどが挙げられ、セルロースメンブランが好ましい。
　本明細書において「アミノ基修飾メンブラン」とは、例えばセルロースメンブランやポリプロピレンメンブランの表面にアミノ基を有するような化学修飾がなされたものを示し、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。このようなアミノ基修飾メンブランとして、具体的には、例えばMethods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174なに記載された公知の手法（Preparation of a Cellulose Membrane for Spot Synthesis）などにより、セルロースメンブランの有する水酸基に、β―アラニンのカルボキシ基などをエステル結合させて、調製することができる。また、すでにアミノ基修飾されたメンブランとして、具体的には、例えばAmino-PEG500-UC540 Sheets、さらにdisc状に加工されframeに装着されたものとしてCelluSpots 384 frame with acid stable discsをＣＥＭ社（旧Ｉｎｔａｖｉｓ社）などから市販品として入手することができる。なお、本明細書中にて、「メンブランディスク」を「メンブラン」と記載する場合もある。
　本明細書において、メンブランを含む固相への担持量および担持率は、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。幾つかの態様において、アミノ酸を伸長する際に担持量および担持率を低減することが可能である。例えばＦｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒと４－フェノキシ酪酸を任意の割合で混合させて伸長させるなど、担持量および担持率を適切に低減させる方法は特に限定されず、どのような方法であってもよい。
　本明細書において「固相合成用樹脂」は、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。このような固相合成用樹脂として、具体的には、例えば、ＣＴＣレジン、ＮｏｖａＳｙｎ　ＴＧＴレジン（ＴＧＴレジン）、Ｗａｎｇレジン、ＳＡＳＲＩＮレジン、トリチルクロリドレジン（Ｔｒｔレジン）、４－メチルトリチルクロリドレジン（Ｍｔｔレジン）、４－メトキシトリチルクロリドレジン（Ｍｍｔレジン）などの酸性条件で除去可能なものが挙げられる。樹脂は、用いられるアミノ酸の官能基に合わせて適宜選択することができる。例えば、アミノ酸の官能基としてカルボキシ基（主鎖カルボキシ基、もしくは、ＡｓｐやＧｌｕに代表される側鎖カルボキシ基）、または、芳香環上のヒドロキシ基（Ｔｙｒに代表されるフェノール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリドレジン（Ｔｒｔレジン）もしくは２－クロロトリチルクロリドレジン（ＣＴＣレジン）を用いることが好ましい。アミノ酸の官能基として脂肪族ヒドロキシ基（ＳｅｒやＴｈｒに代表される脂肪族アルコール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリドレジン（Ｔｒｔレジン）、２－クロロトリチルクロリドレジン（ＣＴＣレジン）もしくは４－メチルトリチルクロリドレジン（Ｍｔｔレジン）を用いることが好ましい。なお、本明細書中にて、樹脂をレジンと記載する場合もある。
　樹脂を構成するポリマーの種類についても特に限定されない。ポリスチレンで構成される樹脂の場合には、１００～２００ｍｅｓｈもしくは２００～４００ｍｅｓｈのいずれを用いてもよい。また、架橋率についても特に限定されないが、１％ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）架橋のものが好ましい。また、樹脂を構成するポリマーの種類として、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、またはＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）が挙げられる。
　本明細書に記載の化合物は、その塩またはそれらの溶媒和物であることができる。化合物の塩には、例えば、塩酸塩；臭化水素酸塩；ヨウ化水素酸塩；リン酸塩；ホスホン酸塩；硫酸塩；メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩；または、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが含まれる。これらの塩は、例えば、化合物と、酸または塩基とを接触させることにより製造される。化合物の溶媒和物とは、化合物が溶媒とともに、一つの分子集団を形成したものをさし、溶媒により形成された溶媒和物であれば特に限定されない。その例としては、水和物、アルコール和物（エタノール和物、メタノール和物、１－プロパノール和物、２－プロノール和物など）、ジメチルスルホキシドなどの単独の溶媒との溶媒和物だけでなく、化合物１分子に対して複数個の溶媒と溶媒和物を形成したもの、または化合物１分子に対して複数種類の溶媒と溶媒和物を形成したものなどが挙げられる。溶媒が水であれば水和物と言う。本発明の化合物の溶媒和物としては、水和物が好ましく、そのような水和物として具体的には１～１０水和物、好ましくは１～５水和物、さらに好ましくは１～３水和物が挙げられる。
　本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、および非天然アミノ酸（アミノ酸誘導体ということがある）が含まれる。また本明細書において「アミノ酸」はアミノ酸残基を意味することがある。本明細書における「天然アミノ酸」とは、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）を指す。非天然アミノ酸（アミノ酸誘導体）は特に限定されないが、β－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、α，α－ジ置換アミノ酸、側鎖が天然アミノ酸と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、ヘテロアラルキル基、シクロアルキル基、スピロ結合したシクロアルキル基から自由に選択される。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の置換基の中から独立して１つまたは２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基など、または、オキソ、アミノカルボニル、ハロゲン原子などが例示される。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシ基とアミノ基を有する化合物であってよい（この場合であっても、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ酸もアミノ酸に含まれる）。
　アミノ酸の主鎖アミノ基は、非置換（－ＮＨ２）でも、置換されていてもよい（即ち、－ＮＨＲ。ここで、Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。）。このような主鎖アミノ基が置換されているアミノ酸を、本明細書において「Ｎ置換アミノ酸」と称する場合がある。本明細書における「Ｎ－置換アミノ酸」としては、好ましくはＮ－アルキルアミノ酸、Ｎ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ酸、Ｎ－Ｃ１－Ｃ４アルキルアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、Ｎ－Ｃ２－Ｃ６アルケニルアミノ酸、Ｎ－アリルアミノ酸、Ｎ－Ｃ７－Ｃ１４アラルキルアミノ酸、Ｎ－ベンジルアミノ酸、Ｎ－フェネチルアミノ酸が例示されるが、これらに限定されるものではない。
　本明細書における「α，α－ジ置換アミノ酸」は、具体的には、例えば、Ａｉｂ、（Ｍｅ）Ａｂｕ、（Ｍｅ）Ｌｅｕ、（Ｍｅ）Ａｌｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｐｈｅ、（Ｍｅ）Ｐｈｅ（３－Ｉ）、１－ＡＣＰｒＣ、ｃＶａｌ、ｃＬｅｕ、ｃＨｅｘ、Ａｔｈｐｃなどが挙げられる。
　本明細書における「β－分岐アミノ酸」は、具体的には、例えば、ＭｅＶａｌ、Ｄ－ＭｅＶａｌ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＣｈｇ、Ｃｈｇ、ＭｅＧｌｙ（ｃＰｅｎｔ）、Ｇｌｙ（ｃＰｅｎｔ）、ＭｅＧｌｙ（ｃＢｕ）、Ｇｌｙ（ｃＢｕ）、ＭｅＧｌｙ（ｃＰｒ）、Ｇｌｙ（ｃＰｒ）、ＭｅＴｈｒ（ｔＢｕ）、およびＴｈｒ（ｔＢｕ）などが挙げられる。
　本明細書において例示されるα，α－ジ置換アミノ酸、β－分岐アミノ酸の略称とその構造との関係を以下に示す。なお、以下の表では各アミノ酸はＦｍｏｃ基でアミノ基が保護された形で列挙されているが、Ｆｍｏｃ基が除去されて遊離のアミノ基を有する各アミノ酸やその残基の略称とそれらの構造との関係も以下の表から把握できる。具体的には、例えば、ＭｅＶａｌ－ＯＨが、下記表のＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨからＦｍｏｃ基が除去された以下の構造を有するアミノ酸であることは当業者に自明であり、そのアミノ酸残基であるＭｅＶａｌの構造も当業者に自明である。
あ
　本明細書における「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも１つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで、質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で、天然の存在比とは異なる存在比で置換されたものである。本明細書の「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。全ての割合の放射性または非放射性の同位元素を含有する本明細書の化合物は、本発明の範囲に包含される。
（製造方法）
　本実施形態の固相法によるペプチド化合物の製造方法は、固相に担持された第一のアミノ酸または第一のペプチドを準備する準備工程；および第一のアミノ酸または第一のペプチドと、第二のアミノ酸または第二のペプチドとを、縮合剤および添加剤の存在下で縮合させる縮合工程を含む。
　ある態様において、本実施形態の製造方法により得られるペプチド化合物は、固相法によるアミノ酸ないしはペプチドの伸長工程の中間体でも最終産物でもよい。伸長工程は、所望のペプチド化合物のアミノ酸配列の長さに応じて複数回行うことができ、本実施形態による縮合工程は、かかる伸長工程中に少なくとも１回含まれ、複数回含まれてもよい。伸長工程中、本実施形態による縮合工程以外の縮合工程には本技術分野に公知の方法を用いることができる。
　ある態様において、本実施形態の縮合工程が、伸長工程の最終工程に用いられる場合、本実施形態の縮合工程により得られた縮合体が、所望の配列を有するペプチド化合物となり得る。一方、本実施形態の縮合工程に加えて公知の方法によりさらなる伸長が行われ、所望の配列を有するペプチド化合物が得られる場合、本実施形態の縮合工程により得られた縮合体は、ペプチド化合物の部分構造としてその中に含まれる。
　本実施形態の準備工程では、固相に担持された第一のアミノ酸または第一のペプチドを準備する。固相としては、具体的には、例えば、メンブランまたは固相合成用樹脂が挙げられる。
　本明細書における、メンブランを含む固相からのペプチドの切り出し工程において、開裂部位の切断の態様として、ＵＶ照射による光開裂性部位の切断、還元条件によるジスルフィド結合の切断、弱酸条件による酸不安定性部位の切断など、どのような形態であってもよい。
　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとは、光開裂性部位を介して結合されていてもよい。光開裂性部位は、光を吸収することで開裂する部位である。光開裂性部位が開裂を起こす吸収波長は３００ｎｍ以上、３２０ｎｍ以上、３４０ｎｍ以上、または３５０ｎｍ以上であってよく、５００ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３８０ｎｍ以下、または３７０ｎｍ以下であってよい。光開裂性部位が開裂を起こす吸収波長は、３００ｎｍ以上５００ｎｍ以下であってよく、３５０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下であってよい。照射する光の波長は、取扱性により優れる観点から、ＵＶ－Ａ領域の波長であってよい。ＵＶ－Ａ領域の波長とは、３２０～４００ｎｍの波長の光をいう。
　光開裂性部位は、ニトロベラトリルオキシカルボニル残基、またはクマリン残基を有していてよい。
　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとは、ジスルフィド結合を介して結合されていてもよい。ジスルフィド結合は、例えば（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを含む水／ＤＭＦ溶液などの還元的条件で切断することにより、固相から目的とするペプチドを切り出すことができる。
　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとは、酸不安定性部位を介して結合されていてもよい。酸不安定性部位は、例えばＴＦＡ／ＤＣＭ溶液やＤＩＰＥＡを含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液などの酸性条件により分解され、固相から目的とするペプチドを切り出すことができる。
　酸不安定性部位は、トリチルエステル構造、クロロトリチルエステル構造、アルコキシベンジルエーテル構造、トリアルコキシベンジルアミノカルボニル構造、ジアルコキシフェニル-アルコキシフェニルメチルアミノカルボニル構造、またはアルコキシキサンテン-9-イルアミノカルボニル構造を有していてよい。
　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとは、酸によるペプチドの切り出しが可能な基によって結合されていてもよい。酸によるペプチドの切り出しが可能な基を有する固相として、具体的には、例えば、ＣＴＣレジン、ＮｏｖａＳｙｎ　ＴＧＴレジン（ＴＧＴレジン）、Ｗａｎｇレジン、ＳＡＳＲＩＮレジン、トリチルクロリドレジン（Ｔｒｔレジン）、４－メチルトリチルクロリドレジン（Ｍｔｔレジン）、４－メトキシトリチルクロリドレジン（Ｍｍｔレジン）などの固相合成用樹脂が挙げられる。
　固相がメンブランである場合、第一のアミノ酸または第一のペプチドのメンブランに対する担持量として、任意の量、例えばＦｍｏｃ定量法に基づき、５ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上、５００ｎｍｏｌ／ｃｍ２以下の量を用いることができ、２０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上、５０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上、１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上、さらには２００ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上の高い担持量でも反応を効率的に進行させることができる。また、固相が固相合成用樹脂である場合、第一のアミノ酸または第一のペプチドの固相合成用樹脂に対する担持量として、任意の量、例えばＦｍｏｃ定量法に基づき、０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上、０．８ｍｍｏｌ／ｇ以下の量を用いることができ、０．２ｍｍｏｌ／ｇ以上、０．３ｍｍｏｌ／ｇ以上、さらには０．４ｍｍｏｌ／ｇ以上の高い担持量でも反応を効率的に進行させることができる。
　本実施形態の縮合工程（縮合反応）において、第二のアミノ酸または第二のペプチドは、第一のアミノ酸または第一のペプチドに対して等量もしくは過剰量で用いられる。具体的には、第一のアミノ酸または第一のペプチドに対する第二のアミノ酸または第二のペプチドのモル比は、１、２、３、５、７、および１０からなる群より選択される下限、および、３、５、７、１０、１５、２５、５０、１００、３００、５００および７００からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。第一のアミノ酸または第一のペプチドに対する、第二のアミノ酸または第二のペプチドのモル比は、１．５以上であることが好ましく、２以上であることがより好ましい。また、第一のアミノ酸または第一のペプチドに対する、第二のアミノ酸または第二のペプチドのモル比は、５０以下であることが好ましく、１５以下であることがより好ましい。第一のアミノ酸または第一のペプチドに対する第二のアミノ酸または第二のペプチドのモル比は、７～１５であることが最も好ましい。
　本実施形態の縮合工程に用いられる添加剤としては、Ｏｘｙｍａ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、またはＨＯＡｔなどが挙げられる。
　本実施形態の縮合工程において、添加剤は、第二のアミノ酸または第二のペプチドのモル数よりも少ないモル数で用いられる。言い換えると、第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する添加剤のモル比は１未満である。該モル比は、０．８以下、例えば０．１～０．８であることが好ましい。この場合、該モル比としては、例えば、第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する添加剤のモル比は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６および０．７からなる群より選択される下限、並びに０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７および０．８からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する添加剤のモル比は、０．３～０．７であることがより好ましい。
　本実施形態の縮合工程に用いられる縮合剤は、下記一般式（Ａ）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤を含む。
ＲＡ－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－ＲＢ　・・・（Ａ）
　式中、ＲＡはＣ４～Ｃ１０第２級または第３級アルキルであり、ＲＢはＣ２～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＡおよびＲＢにおける各基は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、または４～８員環状アミノより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい。一般式（Ａ）で表されるカルボジイミド系縮合剤は、具体的には、例えば、ＤｓＢＣ、ｔＢＥＣ、ＤｔＢＣなどが挙げられる。
　本実施形態の縮合工程に用いられる縮合剤は、下記一般式（Ａ’）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤を含んでいてもよい。
ＲＡ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－ＲＢ’　・・・（Ａ’）
　式中、ＲＡ’はＣ３～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＢ’はＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＡ’およびＲＢ’における各基は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、または４～８員環状アミノより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい。ただし、ＲＡ’における総炭素数は４以上である。一般式（Ａ’）で表されるカルボジイミド系縮合剤は、具体的には、例えば、ＤｓＢＣ、ｔＢＥＣ、ＤｔＢＣ、ＥＤＣＩなどが挙げられる。
　本実施形態の縮合工程において、縮合剤は、第二のアミノ酸または第二のペプチドのモル数と等量であるか、それよりも多いモル数で用いられる。具体的には、本実施形態の縮合工程において、第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する縮合剤のモル比は、１以上の範囲、２以上の範囲、３以上の範囲または４以上の範囲とすることができる。より具体的には、第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する縮合剤のモル比は、１．０、１．１、１．２、１．５、２．０、３．０、および４．０からなる群より選択される下限、並びに１．５、２．０、３．０、４．０、および５．０からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する縮合剤のモル比の好ましい範囲としては、１．０～５．０、１．１～４．０、１．１～３．０、１．２～２．０、１．２～１．５が挙げられる。
　本実施形態の縮合工程においては、第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する縮合剤および添加剤のモル比は、
　第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する縮合剤のモル比を、１．０、１．１、１．２、１．５、２．０、３．０、および４．０からなる値より選択される下限、並びに１．５、２．０、３．０、４．０、および５．０からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができ、
　第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する添加剤のモル比を、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６および０．７からなる値より選択される下限、並びに０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９および１．０からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。
　第二のアミノ酸または第二のペプチドに対する縮合剤および添加剤のモル比として、好ましくは、第二のアミノ酸または第二のペプチド：縮合剤：添加剤＝約２：約２．４～３．２：約０．４～１．４である。
　本実施形態の縮合工程は、０～１００℃、好ましくは１０～６０℃、より好ましくは２０～５０℃の反応温度で行うことができる。
　本実施形態の縮合工程は、１０分～２日間、好ましくは１０分～６時間、より好ましくは３０分～６０分の反応時間で行うことができる。また、２回以上繰り返すこともできる。
　本実施形態の縮合工程において、添加剤がＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、またはＯｘｙｍａであり、かつ縮合剤がＤｓＢＣであることが好ましい。
　本実施形態の縮合反応は、適当な溶媒中で行うことができる。溶媒は、非プロトン性溶媒を用いることができ、アミド系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、アルキルニトリル系溶媒、および尿素系溶媒などが挙げられる。アミド系溶媒として、ＤＭＦ、ＤＭＡ、およびＮＭＰが挙げられる。エステル系溶媒として、酢酸エチル、およびジメチルカーボネートなどが挙げられる。エーテル系溶媒として、テトラヒドロフラン、および２－メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。アルキルニトリル系溶媒として、アセトニトリルなどが挙げられる。尿素系溶媒として、ＤＭＩ、およびＴＭＵなどが挙げられる。
　本実施形態の縮合工程は、固相に担持された第一のアミノ酸または第一のペプチドに、第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤、および添加剤を接触させることにより行うことができる。第一のアミノ酸または第一のペプチドに、第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤、および添加剤を接触させる順番は、任意であり、第一のアミノ酸または第一のペプチドに対し、第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤、および添加剤を同時に接触させても、順次接触させてもよい。第一のアミノ酸または第一のペプチドに、第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤、および添加剤の全て、あるいはいずれかを事前に混合させたものを接触させてもよい。第一のアミノ酸または第一のペプチドに、第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤、および添加剤を接触させる際に、これらを適当な溶媒と混合させたものを用いてもよい。
　本実施形態の方法は、固相合成装置を用いて行ってもよい。ある態様において、本実施形態の方法は、固相に担持された第一のアミノ酸または第一のペプチドに、第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤および添加剤を適当な溶媒中で混合することによって行うことができる。固相が固相合成用樹脂である場合、固相合成用樹脂とこれらの試薬類とを混合する際には、その前処理として、適当な溶媒との接触により、固相合成用樹脂を膨潤させることで、目的の縮合反応を効率よく進行させることができる。この前処理で用いられる溶媒の量は、膨潤したレジンが溶媒に浸ってさえすれば任意の量を用いることができ、例えば、溶媒としてＤＭＦを用いた場合には、３ｖ／ｗ～１５ｖ／ｗ、好ましくは、４ｖ／ｗ～１０ｖ／ｗ、より好ましくは４ｖ／ｗ～８ｖ／ｗの量を用いることができる。溶媒量が４ｖ／ｗと記載されているものは、樹脂重量１ｇに対する溶媒量が４ｍＬであることを表す。
　反応終了後は、メンブランまたは固相合成装置から反応液を排出し、残留したメンブランまたは固相合成用樹脂を適当な溶媒で洗浄することで、過剰な試薬や副生成物を排出して、メンブランまたは固相合成用樹脂に結合している目的のペプチド化合物を取得することができる。メンブランまたは固相合成用樹脂を洗浄、および／または膨潤させるために適した溶媒としては、アミド系や溶媒アルコール系溶媒が例示され、ＤＭＦまたはエタノールあるいは２－プロパノールが好ましい。これらの溶媒は、複数回使用しても、交互に使用してもよい。膨潤した固相合成用樹脂は、必要に応じで収縮させることができ、それにはアルコール系溶媒、またはエーテル系の溶媒による洗浄が用いられる。アルコール系溶媒としては、メタノールが好ましく、エーテル系の溶媒としてはメチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）が好ましい。
　ある態様において、縮合反応を行う前に第二のアミノ酸または第二のペプチド、縮合剤、および添加剤を溶媒中で事前に混合した混合物を予め調製し、縮合反応に用いてもよい。混合時間は特に限定されないが、好ましくは０分～２時間であり、より好ましくは０分～１時間であり、さらに好ましくは約１５分である。
　自動合成装置を用いた樹脂の撹拌や振盪は、樹脂を反応溶液に十分浸透させて、望みどおりに反応を進行させる上で重要であり得る。撹拌速度、振盪速度、それらの頻度は特に限定されないが、過度の撹拌は樹脂の物理的損傷を引き起こすおそれがあるため、例えば６０ｒｐｍの撹拌を１時間毎に２分間程度実施する例があげられる。また、浸透が十分であれば撹拌や振盪は必ずしも行う必要はない。
　ある態様において、本実施形態の方法は、メンブランおよび固相合成用樹脂を除去する工程をさらに含んでもよく、これには本技術分野に公知の方法を用いることができる。所望の配列まで伸長させたペプチド化合物をメンブランおよび樹脂から脱離させ、単離することができる。
　ある態様において、本実施形態の方法は、保護基を除去する工程をさらに含んでもよく、これには本技術分野に公知の方法を用いることができる。例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第5版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。具体的には、第二のアミノ酸のアミノ基、または第二のペプチドのN末端のアミノ酸のアミノ基が保護基で保護されている場合には、該保護基を除去することで、次の縮合反応に備えることができる。保護基は縮合反応と同時に除去されても、縮合反応とは別個に除去されてもよい。
　ある態様において、本実施形態は、本実施形態の方法を用いて直鎖ペプチド化合物を得、次いで、Comprehensive Organic Transformations、A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (R. C. Larock著)、またはMarch's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure、7th Edition (M. B. Smith, J. March著)などに記載された公知の手法によりそのN末端側の基とC末端側の基とを環化することにより、環状ペプチド化合物を製造する方法にも関する。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。なお、実施例中では以下の略号を使用した。
Ａｃ　：　アセチル
ＤＢＵ：　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＥ：　１，２－ジクロロエタン
ＤＣＭ：　ジクロロメタン
ＤＧＤＥ：　ジエチレングリコールジエチルエーテル
ＤＩＣ：　Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：　Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：　ジメチルスルホキシド
ＤｓＢＣ：　Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド
ｔＢＥＣ：　１－ｔｅｒｔ－ブチル－３－エチルカルボジイミド
ＥＤＣＩ・ＨＣｌ：　１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＦＡ：　ギ酸
Ｆｍｏｃ：　９－フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＦＩＰ：　１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロピルアルコール
ＨＯＡｔ：　１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ：　１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＯＢｔ：　３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン
ＭｅＣＮ：　アセトニトリル
ＮＭＰ：　Ｎ－メチル－２－ピロリドン
Ｏｘｙｍａ：　シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル
Ｏｘｙｍａ　Ｂ：　５－（ヒドロキシイミノ）－１，３－ジメチルピリミジン－２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）－トリオン
ＰｙＯｘｉｍ：　［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＴＢＭＥ：　ｔ－ブチルメチルエーテル
ＴＦＡ：　トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ：　２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＨＦ：　テトラヒドロフラン
ＴＨＰ：　テトラヒドロピラニル
ＴＩＰＳ：　トリイソプロピルシラン
　また、ＬＣＭＳ等の分析条件は、下記の表１および表２のとおりである。
　本明細書内に記載するペプチド合成において、表３～５に記載するＦｍｏｃ保護アミノ酸を用いた。
　表３記載のＦｍｏｃ保護アミノ酸は商業的供給業者から購入した。
　表４記載のＦｍｏｃ保護アミノ酸はＷＯ２０１８／２２５８６４記載の方法に従って合成した。
　表５記載のＦｍｏｃ保護アミノ酸は実施例１－１記載の方法で合成した。
　本明細書において、同じ化合物であってもＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚの値±０．２程度、保持時間±０．０７分程度の範囲でぶれることがある。
実施例１：本実施例中で使用するＦｍｏｃ保護アミノ酸、ウレアおよびメンブランに担持されたペプチド等の調製
　メンブランディスクとしてはＩｎｔａｖｉｓ社（現ＣＥＭ社）から購入したCelluSpots 384 frame with acid stable discsもしくはRefill of two frames, 384 acid stable discs（アミノ基修飾メンブラン）を用いた。
実施例１－１：化合物ＳＳ０１、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－４－（１－メチル－１－フェニル－エトキシ）－４－オキソ－ブタン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨ）の合成
　上記のスキームに従い（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－４－（１－メチル－１－フェニル－エトキシ）－４－オキソ－ブタン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨ、ＳＳ０１）を合成した。
実施例１－１－１：Ｏ４－アリル Ｏ１－メチル （２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］ブタンジオアート（化合物ＳＳ０１ａ）の合成
　窒素雰囲気下、ＷＯ２０１８／１２４１６２記載の方法で合成した（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル－）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－（アリルオキシ）－４－オキソブタン酸（化合物ｐｄ０４）（100.0 g, 244.2 mmol）にＤＣＭ（1.15 L）を添加し、室温にてＥＤＣＩ・ＨＣｌ（60.87 g, 317.5 mmol）およびＨＯＡｔ（43.22 g, 317.5 mmol）を加え３０分間攪拌した。その溶液にメタノール（8.61 g, 268.7 mmol）およびＤＩＰＥＡ（41.04 g, 317.5 mmol）を室温にて加え、３時間攪拌した。その後ＤＣＭを加えて希釈し、有機層を塩化アンモニウム水溶液および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥材を濾去後、濾液を減圧濃縮し、化合物ＳＳ０１ａを粗生成物として９３ g（収率９０%）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４２４．１［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ＿１）
実施例１－１－２：（３Ｓ）－３－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（化合物ＳＳ０１ｂ）の合成
　窒素雰囲気下、化合物ＳＳ０１ａの粗生成物（100.0 g, 純度76%, 179.5 mmol）にＤＣＭ（350 mL）を添加し、室温にてテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（2.07 g, 1.795 mmol）およびフェニルシラン（13.60 g, 125.7 mmol）を加え３時間攪拌した。その後ＴＢＭＥを加えて希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で抽出した。得られた水層をＴＢＭＥで洗浄後、０．１Ｍリン酸水溶液を加えて酸性とし、水層を酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥材を濾去後、濾液を減圧濃縮し、化合物ＳＳ０１ｂを８２ g（収率１１０%）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３８４．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ＿２）
実施例１－１－３：Ｏ１－メチル Ｏ４－（１－メチル－１－フェニル－エチル）（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］ブタンジオアート（化合物ＳＳ０１ｃ）の合成
　窒素雰囲気下、化合物ＳＳ０１ｂ（50.00 g, 130.4 mmol）にＤＣＭ（100 mL）を添加し、ＷＯ２０１８／１２４１６２記載の方法で合成した２，２，２－トリクロロアセトイミド酸２－フェニルプロパン－２－イル（化合物ａａ０９）（148.0 g, 527.5 mmol）のシクロヘキサン（400 mL）溶液を室温にて滴下し４０時間攪拌した。混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、化合物ＳＳ０１ｃを６８ｇ（収率１０１％）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５２４．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
保持時間：１．２２分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ＿１）
実施例１－１－４：（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－４－（１－メチル－１－フェニル－エトキシ）－４－オキソ－ブタン酸（化合物ＳＳ０１、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨ）の合成
　塩化カルシウム（248.9 g, 2243 mmol）および水酸化リチウム一水和物（25.10 g, 588.1 mmol）を２－プロパノール（3 L）およびＨ２Ｏ（750 mL）の混合溶媒に溶解し、氷浴で０℃に冷却した。その溶液に化合物ＳＳ０１ｃ（75.00 g, 149.5 mmol）のＴＨＦ（750 mL）溶液を滴下し、室温にて４８時間攪拌した。その後混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮し揮発性有機化合物を除去した。得られた溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｍリン酸水溶液および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥材を濾去後、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣をＴＢＭＥおよびヘキサンの混合溶媒（１：１）に溶解した。その溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出し、その水層を酢酸エチルで２回抽出した。得られた有機層を０．１Ｍリン酸水溶液および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥材を濾去後、濾液を減圧濃縮し、化合物ＳＳ０１を６０ g（収率８２%）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５１０．５［Ｍ＋Ｎａ］＋
保持時間：１．９５分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ＿３）
実施例１－２：本実施例中で使用するメンブランに担持されたアミノ酸およびペプチド等の調製
　本明細書では、メンブランやレジンと化合物が結合した場合、メンブランやレジン部位を〇にて表記する場合がある。また、メンブラン部位の反応点を明確にさせる目的で、〇に接続させて反応部位の化学構造を表記させる場合がある。例えば、下記の構造（Ｆｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｍｅｍｂｒａｎｅ（化合物ＳＳ０２））では、アミノ基修飾メンブランのアミノ基がＰｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒのカルボン酸とアミド結合を形成している。
　本明細書では、アミノ酸の伸長反応の生成物を確認する目的で、伸長後に得られたメンブランを用いた、メンブランからのペプチド切り出し反応後の溶液をＬＣＭＳで測定した。具体的な手順を示す。ＵＶ照射機器はエム・エル・シー社委託作製のＵＶ－ＬＥＤ照射ボックスＭＵＢ－０３１もしくは株式会社松電舎製の分離型ＵＶ－ＬＥＤ照射装置」を使用し、氷上あるいは室温下に置いた反応容器中の伸長後乾燥させたメンブランディスクに対しＵＶ波長３６５ｎｍ、照度３８０～６００ｍＷ／ｃｍ２で２分３０秒間光照射した。その後メンブランに対し１００μＬのＤＭＳＯを添加し、１５分以上静置しペプチドを溶解させた。その溶液をＬＣＭＳにて分析した。
実施例１－２－１：化合物ＳＳ０２（Ｆｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｍｅｍｂｒａｎｅ）、化合物ＳＳ０３（Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｍｅｍｂｒａｎｅ）、化合物ＳＳ２４（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｍｅｍｂｒａｎｅ）、化合物ＳＳ２５（Ｆｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ－Ｍｅｍｂｒａｎｅ）の合成
　本実施例中にて使用する化合物ＳＳ０２、ＳＳ０３、ＳＳ２４およびＳＳ２５の調製は、ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。反応条件についてはＷＯ２０１８／２２５８５１を参考にし、以下の操作１または操作２の方法で調製した。なお、化合物ＳＳ０２の調製においては、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－ＬｉｎｋｅｒおよびＦｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨをこの順で、化合物ＳＳ０３の調製においては、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－ＬｉｎｋｅｒおよびＦｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨをこの順で、化合物ＳＳ２４の調製においては、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－ＬｉｎｋｅｒおよびＦｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨをこの順で、化合物ＳＳ２５の調製においては、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－ＬｉｎｋｅｒおよびＦｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨをこの順で、それぞれＦｍｏｃ保護アミノ酸として用いた。
［操作１］
　目的とするペプチドを構成するＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とカルボン酸の活性化剤としてＨＯＡｔもしくはＯｘｙｍａもしくはＨＯＯＢｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液１を調製した。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を混合し、溶液２を調製した。
　CelluSpots 384 frame with acid stable discs（Ｉｎｔａｖｉｓ社製アミノ基修飾メンブラン；以下、「メンブランディスク」ともいう。）をペプチド合成機にセットした。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）を、メンブランディスク１枚あたり２．０μＬおよび４．０μＬ添加し、室温にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。１残基目の伸長前においては脱保護は必要とせず、１残基目伸長以降の脱保護においては２．０μＬ添加後に５分間反応させた後、一度溶液を排出し、４．０μＬ添加しさらに１０分間反応させ、その後溶液を排出した。続いてＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で７回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。
伸長工程
　溶液１と溶液２を５：６の比率で合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合し１５分間静置した後に、メンブランディスクに１枚あたり１．２μL添加し、室温にて４０分間反応することでメンブランディスク上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液を排出した。この縮合反応を更にもう１回繰り返して行った。続いて無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）のＤＭＦ溶液（４％ｖ／ｖ）を、メンブランディスク１枚あたり４．０μＬ添加し、室温にて未反応アミンのアセチルキャッピングを行った。５分間反応させた後、溶液を排出した。次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で７回洗浄し、引圧で１０分間乾燥した。
　このＦｍｏｃ基の脱保護反応に次ぐＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応、アセチルキャッピングを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでメンブランディスク表面上にペプチドを伸長させた。最後のアミノ酸の伸長後は脱Ｆｍｏｃ工程を行わずに、さらにＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で７回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回または３回洗浄し、引圧で１０～１５分間乾燥した後、以後の検討に用いた。
［操作２］
　目的とするペプチドを構成するＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．２９ｍｏｌ／Ｌ）とカルボン酸の活性化剤としてＨＯＡｔもしくはＯｘｙｍａもしくはＨＯＯＢｔ（０．１８１ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰ／ＤＭＦ＝６．６８／４．３４もしくは５／６の溶液に溶解させて溶液１を調製した。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）は原液のまま溶液２として用いた。
　CelluSpots 384 frame with acid stable discs（Ｉｎｔａｖｉｓ社製）をペプチド合成機にセットした。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　［操作１］の脱Ｆｍｏｃ工程と同様の方法で行った。
伸長工程
　溶液１と溶液２を１１．２９：０．７２の比率で合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合し１５分間静置した後に、メンブランディスクに１枚あたり１．２μL添加し、室温にて４０分間反応することでメンブランディスク上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液を排出した。この縮合反応を更にもう１回繰り返して行った。その後は［操作１］の伸長工程と同様の方法で行った。
実施例１－２－２：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－ＭｅＰｈｅあるいはＦｍｏｃ－Ｐｒｏの切り出しおよび分析
　操作１または操作２の方法で調製した化合物ＳＳ０２、ＳＳ０３、ＳＳ２４およびＳＳ２５を用いて実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０２＊、ＳＳ０３＊、ＳＳ２４＊およびＳＳ２５＊）の生成を確認した。なお、本実施例において、化合物番号に＊を付した場合には、反応の確認のためにメンブランディスクからペプチドを切り出して確認した化合物を示す。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４０１．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．３３分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３３７．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：２．７４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３２５．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：２．７６分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４２５．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．１７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
実施例１－２－３：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－アミノ酸の担持量確認
　担持したＦｍｏｃアミノ酸のメンブランに対する担持量の確認を以下の方法で行った。
　操作１または操作２の方法で調製した化合物ＳＳ０２、ＳＳ０３、ＳＳ２４、ＳＳ２５（各メンブランディスク１枚）を反応容器に入れ、ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）をメンブランディスク１枚あたり４．０μＬ添加し、室温にて５分間反応させた後、再度４．０μＬ添加し室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。その後ＤＭＦをメンブランディスク１枚あたり３９２μＬ添加して溶出させ、得られた溶液をＬＣ／ＭＳにて分析した（injection volume：５μＬ）。
保持時間：１．０２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
化合物ＳＳ０２由来の化合物ＳＳ０４の波長３０４ｎｍにおけるＵＶエリア値：１６３５９．８８
化合物ＳＳ０３由来の化合物ＳＳ０４の波長３０４ｎｍにおけるＵＶエリア値：１５７９３．１１
化合物ＳＳ２４由来の化合物ＳＳ０４の波長３０４ｎｍにおけるＵＶエリア値：１８７８２．３０
化合物ＳＳ２５由来の化合物ＳＳ０４の波長３０４ｎｍにおけるＵＶエリア値：１８３００．７３
　また、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（３．５１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をＤＢＵのＤＭＦ溶液（１．５ｍＬ、０．２０１ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温にて１５分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。その後、反応混合液にＤＭＦ（１４８．５ｍＬ）を加えて希釈した。得られた希釈溶液をＬＣ／ＭＳにて分析した（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１、injection volume:５μＬ）。ジベンゾフルベンの波長３０４ｎｍにおけるＵＶエリア値は８９０３．１１であり、この値より１ｎｍｏｌあたりのＵＶエリア値（波長３０４ｎｍ）を算出した。これらの値を用いて、以下の式から化合物ＳＳ０２および化合物ＳＳ０３の担持量を算出した。
担持量（ｎｍｏｌ）＝（化合物ＳＳ０４のＵＶエリア値（波長３０４ｎｍ））／（ジベンゾフルベン１ｎｍｏｌあたりのＵＶエリア値（波長３０４ｎｍ））
　その結果、化合物ＳＳ０２、ＳＳ０３、ＳＳ２４、およびＳＳ２５の担持量をそれぞれ５７．９ｎｍｏｌ／メンブランディスク、５５．９ｎｍｏｌ／メンブランディスク、６６．４ｎｍｏｌ／メンブランディスク、および６４．７ｎｍｏｌ／メンブランディスクと算出した。
　なお、同様に合成した担持量が異なる別ロットについてもペプチド合成や検討等に使用した。
実施例１－３：本実施例中で使用するカルボジイミド由来のウレアの合成
実施例１－３－１：１，３－ジイソプロピルウレア（ＤＩＣウレア、化合物ＳＳ０５）の合成
　ＤＩＣ（１．２２ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ）に室温にてＴＢＭＥ（３１．５ｍＬ）を添加した後、５分以上かけて酢酸（１．１７８ｍＬ、２０．６０ｍｍｏｌ）を滴下し反応混合物を室温で１時間半攪拌した。その後生じた沈殿物をろ過により回収し、ＴＢＭＥを用いて得られた固体を洗浄し、減圧下にて乾燥することで１，３－ジイソプロピルウレア（ＤＩＣウレア、化合物ＳＳ０５）（９０９．１ｍｇ、８０％）を得た。
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 5.48 (2H, d, J = 7.2 Hz), 3.69-3.57 (2H, m), 1.00 (12H, d, J = 6.8 Hz)
実施例１－３－２：１，３－ジ－ｓｅｃ－ブチルウレア（ＤｓＢＣウレア、化合物ＳＳ０６）の合成
　ＤｓＢＣ（０．３５６μＬ、１．９４５ｍｍｏｌ）に室温にてＴＢＭＥ（７．７３ｍＬ）を添加した後、５分以上かけて酢酸（０．２８９μＬ、５．０６ｍｍｏｌ）を滴下し反応混合物を室温で１５分間攪拌した。その後水（７０．１μＬ、３．８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間半攪拌した。その後窒素を吹き付けて濃縮し、水を加えた。生じた沈殿物をろ過により回収し、水を用いて得られた固体を洗浄し、減圧下にて乾燥することで１，３－ジ－ｓｅｃ－ブチルウレア（ＤｓＢＣウレア、化合物ＳＳ０６）（２１０．７ｍｇ、６３％）を得た。
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 5.46 (2H, d, J = 8.0 Hz), 3.50-3.43 (2H, m), 1.32 (4H, dq, J = 7.2, 7.2 Hz), 0.97 (6H, d, J  = 6.8 Hz), 0.81 (6H, t, J  = 7.2 Hz)
実施例１－３－３：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－３－エチルウレア（ｔＢＥＣウレア、化合物ＳＳ０７）の合成
　ｔＢＥＣ（０．６１４μＬ、３．９６ｍｍｏｌ）に室温にてＴＢＭＥ（１５．７ｍＬ）を添加した後、５分以上かけて酢酸（０．５８９μＬ、１０．３０ｍｍｏｌ）を滴下し反応混合物を室温で２時間半攪拌した。その後窒素を吹き付けて濃縮し、ＭｅＣＮと水の１：２の混合物を加えた。生じた沈殿物をろ過により回収し、ＭｅＣＮと水の１：２の混合物を用いて得られた固体を洗浄した。濾液を減圧濃縮し、水を加えた。生じた沈殿物をろ過により回収し、水を用いて得られた固体を洗浄した。２つの得られた固体をＭｅＣＮに溶解させた後に混合し、減圧濃縮することで１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－３－エチルウレア（ｔＢＥＣウレア、化合物ＳＳ０７）（１６９．２ｍｇ、３０％）を得た。
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 5.53 (2H, br), 2.98-2.91 (2H, m), 1.20 (9H, s), 0.95 (3H, t, J = 7.2 Hz)
実施例１－４：本実施例中で使用するカルボジイミドの合成
　上記のスキームに従いＮ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）、およびＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）を合成した。
実施例１－４－１：１－（１－フェニルエチル）－３－ｓｅｃ－ブチル－チオウレア（化合物ＳＳ２６ａ）の合成
　２－イソチオシアナトブタン（５００μＬ、４．０８ｍｍｏｌ）および１－フェニルエタンアミン（５６７μＬ、４．４９ｍｍｏｌ）を室温にてＤＣＭ（２０．４ｍＬ）へ添加し、室温で１７時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）にて２回精製し、化合物ＳＳ２６ａをジアステレオマー混合物として８７４．６ｍｇ（収率９１％）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２３７．１［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
実施例１－４－２：Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２６）の合成
　化合物ＳＳ２６ａ（１４９．６ｍｇ、０．６３３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６．３２９ｍＬ）へ添加し、氷冷下にてトリエチルアミン（２６５μＬ、１．８９９ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（７７ｍｇ、０．６３３ｍｍｏｌ）およびエタンスルホニルクロリド（１２０μＬ、１．２６６ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷下で５分撹拌後室温へ昇温し室温にて１時間攪拌した。混合物にＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＨＭ－Ｎ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を加えて減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサンおよびＤＣＭ）にて複数回精製し、化合物ＳＳ２６をジアステレオマー混合物として３５．２１ｍｇ（収率２８％）得た。
ＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２０３．２［Ｍ＋Ｈ］＋（分析条件ＬＴＱ ｍｅｔｈｏｄ＿１）
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 7.38-7.25 (5H, m), 4.62 (1H, q, J = 6.4 Hz), 3.31-3.22 (1H, m), 1.45 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.42-1.25 (2H, m), 1.06 (3H, d and d, J = 6.4 Hz), 0.81 (3H, t and t, J = 7.6 Hz)
実施例１－４－３：１－（１－メチルへプチル）－３－ｓｅｃ－ブチル－チオウレア（化合物ＳＳ２７ａ）の合成
　２－イソチオシアナトブタン（３００μＬ、２．４５ｍｍｏｌ）および２－オクタンアミン（４５２μＬ、２．６９ｍｍｏｌ）を室温にてＤＣＭ（１２．２ｍＬ）へ添加し、室温で１７時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）にて２回精製し、化合物ＳＳ２７ａをジアステレオマー混合物として５５２．０ｍｇ（収率９２％）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２４５．２［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．９４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
実施例１－４－４：Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン（ＳＳ２７）の合成
　化合物ＳＳ２７ａ（１５０ｍｇ、０．６１４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６．１３６ｍＬ）へ添加し、氷冷下にてＤＩＰＥＡ（３１５μＬ、１．８４１ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（７５ｍｇ、０．６１４ｍｍｏｌ）およびエタンスルホニルクロリド（１１６μＬ、１．２２７ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷下で５分撹拌後室温へ昇温し室温にて１時間攪拌した。混合物にＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標） ＨＭ－Ｎ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を加えて減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサンおよびＤＣＭ）にて数回精製し、化合物ＳＳ２７をジアステレオマー混合物として２２．８３ｍｇ（収率１８％）得た。
ＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋（分析条件ＬＴＱ ｍｅｔｈｏｄ＿１）
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 3.38-3.24 (2H, m), 1.48-1.25 (12H, m), 1.14 (6H, d, J = 6.4 Hz), 0.88 (3H, t, J = 7.6 Hz), 0.86 (3H, t, J = 7.6 Hz)
実施例１－４－５：１，３－ビス（１－メチルブチル）チオウレア（化合物ＳＳ２８ａ）の合成
　２－イソチオシアナトペンタン（３００μＬ、２．１６ｍｍｏｌ）および２－ペンタンアミン（２８０μＬ、２．３８ｍｍｏｌ）を室温にてＤＣＭ（１０．８ｍＬ）へ添加し、室温で２０時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）にて精製し、化合物ＳＳ２８ａをジアステレオマー混合物として４２６．８ｍｇ（収率９１％）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２１７．２［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．８２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
実施例１－４－６：Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ２８）の合成
　化合物ＳＳ２８ａ（１９９．８ｍｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（９．２３３ｍＬ）へ添加し、氷冷下にてトリエチルアミン（３８６μＬ、２．７７ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（１１３ｍｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）およびエタンスルホニルクロリド（１７５μＬ、１．８４７ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷下で５分撹拌後室温へ昇温し室温にて１時間攪拌した。混合物にＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標） ＨＭ－Ｎ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を加えて減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサンおよびＤＣＭ）にて数回精製し、化合物ＳＳ２８をジアステレオマー混合物として３６．３０ｍｇ（収率２２％）得た。
ＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１８３．２［Ｍ＋Ｈ］＋（分析条件ＬＴＱ ｍｅｔｈｏｄ＿１）
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 3.39-3.33 (2H, m), 1.42-1.23 (8H, m), 1.14 (6H, d, J = 6.4 Hz), 0.91-0.83 (6H, m)
実施例１－４－７：１，３－ビス（１－エチルプロピル）チオウレア（化合物ＳＳ２９ａ）の合成
　３－イソチオシアナトペンタン（３００μＬ、２．１８ｍｍｏｌ）および３－ペンタンアミン（２７９μＬ、２．４０ｍｍｏｌ）を室温にてＤＣＭ（１０．９ｍＬ）へ添加し、室温で２０時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）にて精製し、化合物ＳＳ２９ａを４０１．４ｍｇ（収率８５％）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２１７．２［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
実施例１－４－８：Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン（ＳＳ２９）の合成
　化合物ＳＳ２９ａ（２００．８ｍｇ、０．９２８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（９．２８０ｍＬ）へ添加し、氷冷下にてトリエチルアミン（３８８μＬ、２．７８ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（１１３ｍｇ、０．９２８ｍｍｏｌ）およびエタンスルホニルクロリド（１７５μＬ、１．８５６ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷下で５分撹拌後室温へ昇温し室温にて０．５時間攪拌した。混合物にＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標） ＨＭ－Ｎ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を加えて減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサンおよびＤＣＭ）にて数回精製し、化合物ＳＳ２９を３７．５９ｍｇ（収率２２％）得た。
ＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１８３．２［Ｍ＋Ｈ］＋（分析条件ＬＴＱ ｍｅｔｈｏｄ＿１）
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 3.08 (2H, tt, J = 4.8 Hz, 8.0 Hz), 1.56-1.30 (8H, m), 0.89 (12H, t, J = 7.2 Hz)
実施例１－４－９：１－（１－エチルプロピル）－３－（１－メチルブチル）チオウレア（化合物ＳＳ３０ａ）の合成
　２－イソチオシアナトペンタン（３００μＬ、２．１６ｍｍｏｌ）および３－ペンタンアミン（２７６μＬ、２．３７ｍｍｏｌ）を室温にてＤＣＭ（１０．８ｍＬ）へ添加し、室温で２０時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）にて精製し、化合物ＳＳ３０ａをジアステレオマー混合物として４１８．３ｍｇ（収率９０％）得た。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝２１７．２［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
実施例１－４－１０：Ｎ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミン（ＳＳ３０）の合成
　化合物ＳＳ３０ａ（２０１．１ｍｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（９．２９４ｍＬ）へ添加し、氷冷下にてトリエチルアミン（３８９μＬ、２．７９ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（１１４ｍｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）およびエタンスルホニルクロリド（１７６μＬ、１．８５９ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷下で５分撹拌後室温へ昇温し室温にて０．５時間攪拌した。混合物にＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標） ＨＭ－Ｎ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を加えて減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ－ヘキサンおよびＤＣＭ）にて数回精製し、化合物ＳＳ３０をジアステレオマー混合物として４６．８８ｍｇ（収率２８％）得た。
ＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１８３．２［Ｍ＋Ｈ］＋（分析条件ＬＴＱ ｍｅｔｈｏｄ＿１）
1H-NMR (BRUKER Ascend 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ 3.40-3.33 (1H, m), 3.11-3.05 (1H, m), 1.55-1.27 (8H, m), 1.14 (3H, d and d, J = 6.4 Hz), 0.91-0.85 (9H, m)
実施例２：メンブラン上のペプチド合成において、伸長工程について試薬の種類および反応条件の検討をした実験
　ペプチドの固相合成においては、脱Ｆｍｏｃ、メンブラン洗浄を経て、続くアミノ酸の伸長を行う。本実験では、メンブランに担持されたペプチド配列（化合物ＳＳ０２）を用い、アミノ酸の伸長工程の試薬や当量比などの反応条件を変更し、目的の伸長反応の反応効率の程度を比較することでメンブラン上のペプチド合成における好ましい試薬および反応条件の範囲を特定した。
　アミノ酸の伸長効率を評価するにあたり、出発原料残存率を確認するためにＧｌｙｃｉｎｅ　ｃａｐｐｉｎｇを実施した。すなわち、目的のアミノ酸の伸長反応を実施した後、続けてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの伸長反応を実施し未反応のアミンと反応させた。その後実施例１－２に記載の方法でメンブランから切り出し、目的のアミノ酸が伸長したペプチドとＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチドのＵＶエリア値を比較することで目的のアミノ酸の伸長効率を算出した。
参照例２－１：Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174記載の反応条件でのメンブラン上のペプチド合成実験
参照例２－１－１：メンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅ上のＦｍｏｃ基の除去
　実施例１－２－１にて既に調製済みのペプチドの担持されたメンブランディスク（化合物ＳＳ０２）１枚を反応容器に入れ、ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）を４．０μＬ添加し、室温にて５分間反応させた後、再度４．０μＬ添加し室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液を排出した後、メンブランをＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり１００μＬ）で４回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり１００μＬ）で３回洗浄し、空気乾燥することで化合物ＳＳ０８を得た。
参照例２－１－２：メンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を使用したメンブラン上への天然ペプチド合成の報告（Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174）を参考に、メンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ（０．４５ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＢｔ（０．６７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させた溶液とＤＩＣ（１．４８５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させた溶液を３：１の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を反応容器に入れた参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で所定の時間静置した。続いて、メンブランをＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり１００μＬ）で３回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり１００μＬ）で３回洗浄し、空気乾燥した。続いてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させた溶液とＤＩＣ（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液を５：６の比率で混合し、１０～１５分間静置した後にその溶液を反応容器内のメンブランに対し３．０μＬ添加した。蓋をして室温で２５～６０分間静置した後、溶液をメンブランから排出し、再度上記のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの伸長反応を行った。溶液を排出した後、メンブランをＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり１００μＬ）で３～４回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり１００μＬ）で３回洗浄し、空気乾燥した。
参照例２－１－３：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　参照例２－１－２で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５１４．５［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．６４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４５８．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．２０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ＬＣデータの各化合物ピークのＵＶエリア値（波長２９９ｎｍ）を用いて、伸長効率を以下の式から算出した。
伸長効率（％）＝（ＳＳ０９＊のＵＶエリア値）／（ＳＳ０９＊のＵＶエリア値とＳＳ１０＊のＵＶエリア値の合算値）ｘ１００
　参照例２－１の条件および結果を以下の表６に示す。
　Methods Mol. Biol., 2009, 570, 157-174を参考にした反応条件における伸長効率は、６０分後でも４％と極めて低い結果であった。
参照例２－２：ＷＯ２０１８／２２５８５１記載の反応条件でのメンブラン上のペプチド合成実験
参照例２－２－１：メンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法（ＷＯ２０１８／２２５８５１）を参考に反応条件を設定し、メンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰもしくはＤＭＦに溶解させた溶液とＤＩＣ（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液を５：６の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を反応容器に入れた参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で所定の時間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
参照例２－２－２：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　参照例２－２－１で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。伸長効率は参照例２－１記載の計算式に従い算出した。
　参照例２－２の条件および結果を以下の表７に示す。
　ＷＯ２０１８／２２５８５１記載の反応条件における伸長効率は、６０分後でも５２％（ＮＭＰ/ＤＭＦ＝５/６の混合溶媒使用）および６４％（ＤＭＦ溶媒使用）と低い結果であった。なお、反応時間３０分と６０分で伸長効率の変化は軽微であった。
参照例２－３：試薬高濃度条件でのメンブラン上のペプチド合成実験
参照例２－３－１：メンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、伸長効率を上げるために試薬濃度を上げてメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ（０．６２ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１９３ｍｏｌ／Ｌもしくは０．３８７ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰ／ＤＭＦ＝５／６もしくは６．６８／４．３４の溶液、あるいはＤＭＦに溶解させた溶液とＤＩＣ（原液）を１０：１．３５３の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で６０分間静置した。この際、１５分間静置した溶液の一部をＭｅＣＮで希釈し、その溶液をＬＣＭＳを用いて分析した（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）。また、反応時間経過したメンブランに１ｍＬのＭｅＣＮを添加し、メンブランに染み込んだ反応溶液を溶解させ、そのＭｅＣＮ溶液をＬＣＭＳを用いて分析した（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３５４．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．８９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４７２．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：１．０２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）
　それぞれの分析結果における活性エステル（化合物ＳＳ１１）のＵＶエリア値の割合（波長２９９ｎｍ）を以下の式から算出した。
活性エステルのＵＶエリア値の割合（％）＝（活性エステルのＵＶエリア値）／（Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨのＵＶエリア値＋活性エステルのＵＶエリア値＋ピーク１のＵＶエリア値＋ピーク２のＵＶエリア値）ｘ１００
　なお、ピーク１は保持時間１．０７分のピークで、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨとＤＩＣから成る生成物と推定され、ピーク２は保持時間１．２２分のピークで、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの二量体と推定される。
　以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
参照例２－３－２：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　参照例２－３－１で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。伸長効率は参照例２－１記載の計算式に従い算出した。
　縮合剤としてＤＩＣを用いた試薬高濃度条件における伸長効率は、後述の表９に記載の通り、８３％～９６％と高い結果を与えた。しかしながら、いずれの条件においても析出物が発生し、自動合成に適用することが困難な条件であった。
実施例２－４：ＤＩＣをＤｓＢＣに変えた反応条件でのメンブラン上のペプチド合成実験
実施例２－４－１：メンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、ＤＩＣをＤｓＢＣに変更した反応条件でメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ（０．６３ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌもしくは０．３９７ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰ／ＤＭＦ＝５／６もしくは６．６８／４．３４の溶液、あるいはＤＭＦに溶解させた溶液とＤｓＢＣ（原液）を１０：１．６４２の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で所定の時間静置した。この際、１５分間静置した溶液の一部をＭｅＣＮで希釈し、その溶液をＬＣＭＳを用いて分析した（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）。また、反応時間経過したメンブランに１ｍＬのＭｅＣＮを添加し、メンブランに染み込んだ反応溶液を溶解させ、そのＭｅＣＮ溶液をＬＣＭＳを用いて分析した（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１）。それぞれの分析結果における活性エステル（化合物ＳＳ１１）のＵＶエリア値の割合（波長２９９ｎｍ）を以下の式から算出した。
活性エステルのＵＶエリア値の割合（％）＝（活性エステルのＵＶエリア値）／（Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨのＵＶエリア値＋活性エステルのＵＶエリア値＋ピーク２のＵＶエリア値＋ピーク３のＵＶエリア値）ｘ１００
　なお、ピーク３は保持時間１．１５分のピークで、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨとＤｓＢＣから成る生成物と推定され、ピーク２は保持時間１．２２分のピークで、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの二量体と推定される。
　以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－４－２：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　実施例２－４－１で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。伸長効率は参照例２－１記載の計算式に従い算出した。
　参照例２－３および実施例２－４の条件および結果を以下の表８および表９に示す。
　縮合剤としてＤｓＢＣを用い、試薬高濃度条件において縮合を検討した結果、表９に記載の通り伸長効率は９０％～９８％と高い結果を示した。本条件ではいずれも析出物の発生がないことから、自動合成への適用が可能である。
実施例２－５：他のＦｍｏｃ保護アミノ酸および種々の活性化剤を用いたメンブラン上のペプチド合成におけるＤｓＢＣ使用とＤＩＣ使用の効果比較実験
実施例２－５－１：ＤｓＢＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、実施例２－４－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨの伸長反応を行った。Ｆｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ（０．６３ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔもしくはＨＯＯＢｔ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とＤｓＢＣ（原液）を１０：１．６４２の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
参照例２－５－２：ＤＩＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、参照例２－３－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨの伸長反応を行った。Ｆｍｏｃ－ＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ（０．６２ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔもしくはＨＯＯＢｔ（０．１９３ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とＤＩＣ（原液）を１０：１．３５３の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－５－３：ＤｓＢＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＡｌａに対するＦｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応
　実施例１－２－１にて既に調製済みのペプチドの担持されたメンブランディスク（化合物ＳＳ２４）を用いて、参照例２－１－１記載の方法に従いＦｍｏｃ基を除去し、化合物ＳＳ３１を得た。
　得られたメンブラン（化合物ＳＳ３１）を使用し、実施例２－４－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＡｌａに対するＦｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応を行った。Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨとＯｘｙｍａ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とＤｓＢＣ（原液）を１０：１．６４２の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液をメンブラン（化合物ＳＳ３１）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
参照例２－５－４：ＤＩＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＡｌａに対するＦｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応
　実施例２－５－３で得られたメンブラン（化合物ＳＳ３１）を使用し、参照例２－３－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＡｌａに対するＦｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応を行った。Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨ（０．６２ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａ（０．１９３ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とＤＩＣ（原液）を１０：１．３５３の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液をメンブラン（化合物ＳＳ３１）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－５－５：ＤｓＢＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）に対するＦｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨの伸長反応
　実施例１－２－１にて既に調製済みのペプチドの担持されたメンブランディスク（化合物ＳＳ２５）を用いて、参照例２－１－１記載の方法に従いＦｍｏｃ基を除去し、化合物ＳＳ３３を得た。
　得られたメンブラン（化合物ＳＳ３３）を使用し、実施例２－４－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）に対するＦｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨの伸長反応を行った。Ｆｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨ（０．６３ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とＤｓＢＣ（原液）を１０：１．６４２の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液をメンブラン（化合物ＳＳ３３）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
参照例２－５－６：ＤＩＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）に対するＦｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨの伸長反応
　実施例２－５－５で得られたメンブラン（化合物ＳＳ３３）を使用し、参照例２－３－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＳｅｒ（ＴＨＰ）に対するＦｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨの伸長反応を行った。Ｆｍｏｃ－ＭｅＰｈｅ－ＯＨ（０．６２ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１９３ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とＤＩＣ（原液）を１０：１．３５３の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液をメンブラン（化合物ＳＳ３３）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－５－７：メンブラン上に担持された各種ペプチドの切り出しおよび分析
　実施例（参照例）２－５－１～２－５－６で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ１２＊、ＳＳ３２＊およびＳＳ３４＊）ならびに望みのＦｍｏｃ保護アミノ酸の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊、ＳＳ３５＊およびＳＳ３６＊）（これらをＧｌｙｃｉｎｅ　ｃａｐｐｉｎｇ体と呼ぶこともある）の生成を確認した。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５８６．５［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．６１分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５７２．５［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．５２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５８６．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．５６分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３８２．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：２．５８分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４８２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．０３分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ＬＣデータの各化合物ピークのＵＶエリア値（波長２９９ｎｍ）を用いて、伸長効率を参照例２－１記載の計算式に従い以下の式から算出した。
伸長効率（％）＝（目的ペプチドのＵＶエリア値）／（目的ペプチドのＵＶエリア値とＧｌｙｃｉｎｅ　ｃａｐｐｉｎｇ体のＵＶエリア値の合算値）ｘ１００
　実施例（参照例）２－５－１～２－５－６の条件および結果を以下の表１０に示す。
　縮合剤としてＤＩＣを用いた条件においては、いずれも析出物が発生し自動合成に適用することが困難な条件であった。一方で縮合剤としてＤｓＢＣを用いた本条件では、種々のＦｍｏｃ保護アミノ酸および活性化剤を用いた種々のペプチドへの縮合においても析出物の発生がなく、自動合成に適用が可能な条件であり、また伸長効率においてもＤＩＣを用いた条件と同等かそれ以上の高い伸長効率であった。
実施例２－６：ウレアの溶解度検証実験
実施例２－６－１：ＤＩＣウレア、ＤｓＢＣウレアおよびｔＢＥＣウレアのＤＭＦに対する溶解度確認実験
　参照例２－３、実施例２－４および２－５の伸長工程にて実施されているPreactivationの際のカルボジイミドの濃度は０．７７ｍｏｌ／Ｌである。カルボジイミドが全てウレアに変換された場合にその析出が起こるリスクを確認するため、参照例２－３で析出物が確認されたＤＩＣおよび実施例２－４および２－５にて析出物が確認されなかったＤｓＢＣ由来のウレアを用いて、それらのＮＭＰおよびＤＭＦへの溶解度を以下の手順に従い確認した。
　１．５ｍＬスクリューキャップバイアルに実施例１－３にて合成したＤＩＣウレア（化合物ＳＳ０５）およびＤｓＢＣウレア（化合物ＳＳ０６）を表１１記載の重量測り取り、各濃度になるようにＮＭＰあるいはＤＭＦを添加した。室温にて５分以上攪拌し、その後静置してウレアの溶解の有無を確認した。その結果、ＤＩＣウレアである化合物ＳＳ０５はＮＭＰでは０．３４Ｍ以上、ＤＭＦでは０．１７Ｍ以上の濃度で固体が溶解しきらなかったのに対し、ＤｓＢＣウレアである化合物ＳＳ０６はＮＭＰ、ＤＭＦいずれも０．７７Ｍで完全に溶解し２４時間以上経過しても再析出が確認されなかった。
実施例２－６－２：ｔＢＥＣウレアのＤＭＦに対する溶解度確認実験
　ＤＩＣおよびＤｓＢＣとアルキル基の異なるｔＢＥＣを用いて実施例２－６－１と同様の実験を行った。１．５ｍＬスクリューキャップバイアルに、実施例１－３にて合成したｔＢＥＣウレア（化合物ＳＳ０７）を１０．１８ｍｇおよび１０．１９ｍｇ測り取り、０．７７ｍｏｌ／ＬになるようにそれぞれＮＭＰあるいはＤＭＦを添加した。室温にて５分以上攪拌し、その後静置してウレアの溶解の有無を確認した。その結果、ｔＢＥＣウレアもＤｓＢＣウレアと同様に完全に溶解し２４時間以上経過しても再析出は確認されなかった。
実施例２－７：他のカルボジイミドを用いた高濃度条件でのメンブラン上のペプチド合成実験
実施例２－７－１：ｔＢＥＣを用いたメンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、実施例２－４－１の反応条件を参考に実施例２－６でそのウレアのＤＭＦへの良好な溶解度が確認されたｔＢＥＣを用いてメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ（０．６２ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１９４ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とｔＢＥＣ（原液）を１０：１．３５５の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－７－２：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　実施例２－７－１で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。伸長効率は参照例２－１記載の計算式に従い算出した。
　実施例２－７の結果を以下の表１２に示す。
　縮合剤としてＤｓＢＣの代わりにｔＢＥＣを用いた縮合反応においても、表１２に記載の通り析出物の発生がなくＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長が可能であった。
実施例２－７－３：種々の縮合剤を用いたメンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、実施例２－４－１の反応条件を参考に実施例１－４で合成した種々のカルボジイミドを用いてメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　以下の表１３に従いＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨとＨＯＡｔをＤＭＦに溶解させた溶液とカルボジイミド（原液）を混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－７－４：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　実施例２－７－３で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。伸長効率は参照例２－１記載の計算式に従い算出した。
　結果を以下の表１４に示す。
　縮合剤として、いずれのカルボジイミドを用いた場合でも、表１４に記載の通り伸長効率は９７％～９９％と高い結果を示した。また、化合物ＳＳ２６、ＳＳ２７、ＳＳ２８およびＳＳ３０を用いた縮合反応においては析出物の発生がなくＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長が可能であり、自動合成に適用することが可能な条件であった。
実施例２－８：種々の反応温度、反応溶媒および試薬の当量でのメンブラン上のペプチド合成実験
実施例２－８－１：種々の反応温度、反応溶媒および試薬の当量比でのメンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、実施例２－４－１の反応条件をもとに反応温度、反応溶媒および試薬の当量を変更してメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長反応を行った。
　以下の表１５に従いＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨとＨＯＡｔを各種反応溶媒に溶解させた溶液とＤｓＢＣ（原液）を混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、種々の温度で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例２－８－２：メンブラン上に担持されたＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅの切り出しおよび分析
　実施例２－８－１で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊）およびＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。伸長効率は参照例２－１記載の計算式に従い算出した。
　結果を以下の表１６に示す。
　表１６に記載の通り、反応温度が４０℃または６０℃の場合においても、析出物の発生がなく、高い伸長効率を示した。また、ウレア系溶媒、ベンゼン系溶媒、ハロゲン系溶媒およびエーテル系溶媒を含む反応溶媒を用いた場合においても、析出物の発生がなく、高い伸長効率を示した。さらに、添加剤（ここではＨＯＡｔの場合を示した。）および縮合剤の比率を変更した場合においても、析出物の発生がなく、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の伸長が可能であった。
　一般的な天然アミノ酸から成るペプチドアレイ合成において広く実施されている伸長工程である参照例２－１記載の伸長工程において、またＮ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法として報告されている反応条件を参考にした参照例２－２の伸長工程においては、メンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨの伸長効率は３～４％ならびに５０～６４％にとどまった。伸長効率を上げるために試薬濃度を上げて伸長反応を行った参照例２－３記載の方法では伸長効率は８３％～９６％まで向上したが、活性エステルの濃度は伸長反応開始後３０分後の時点ですでに顕著に低下しており、また１５分間のPreactivationの間に生成したＤＩＣウレアの析出が別の課題となることが確認できた。OxymaPureとＤＣＣ，ＤＩＣなどのカルボジイミドとの組み合わせにおいて発生する青酸の回避を目的としてカルボジイミドの種類を検討した論文があり、ＤＩＣを使用した場合に比べるとＤｓＢＣの使用はアミド化の反応性が劣る旨の記載がある（Org. Lett. 2021, 23, 6900-6904.）。しかしながら、参照例２－３記載の高濃度条件において、使用するカルボジイミドをＤｓＢＣへ変更した実施例２－４記載の方法では、参照例２－３の結果と比較して伸長効率の改善が確認された。この際、ＤＩＣを用いた場合よりも活性エステルが高濃度状態を長時間維持できていることが確認できた。さらに、ＤｓＢＣを用いた場合には１５分間のPreactivationの間に生成したＤｓＢＣウレアの析出は見られなかった。また、実施例２－５の通り、本反応条件はアミノ酸や活性化剤が異なる場合にも適用可能であり、ウレアの析出は見られることなく望みのペプチドの生成が確認できた。実際、実施例２－６の通りＤｓＢＣは全てウレアに変換されても析出のリスクは極めて低いことが確認できた。また、ＤｓＢＣとアルキル基の異なるｔＢＥＣにおいても同様にウレアの析出のリスクが極めて低いことが確認できた。さらに、化合物ＳＳ２６、ＳＳ２７、ＳＳ２８およびＳＳ３０を用いた縮合反応においても、実施例２－７の通りPreactivation溶液中に析出物は観測されずＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長が可能であった。さらに、実施例２－８の通り、ウレアの析出なく望みのペプチドの生成が可能なＤｓＢＣを用いた反応条件として、４０℃、６０℃などの昇温条件や多様な反応溶媒、試薬の当量比に関しても変更可能な点を確認した。
　以上、実施例２の結果より、メンブラン上のペプチド合成の伸長工程において、伸長効率を改善しつつカルボジイミド由来のウレア析出の抑制が可能なカルボジイミドの種類含む反応条件の一部が特定された。
実施例３：基質の適用範囲拡大、ペプチド合成機による自動合成への適用実験
　本実験では、実施例２で特定したメンブラン上のペプチド合成における好まれる反応条件を用いて、他のアミノ酸の伸長反応を実施した。アミノ酸の伸長効率の評価は実施例２と同様の方法にて行った。また、本条件のペプチド合成機への適用を実施した。
実施例３－１：様々なアミノ酸および活性化剤を用いたメンブラン上のペプチド合成実験
実施例３－１－１：メンブラン上に担持されたＰｒｏ上のＦｍｏｃ基の除去
　実施例１－２－１にて既に調製済みのペプチドの担持されたメンブランディスク（化合物ＳＳ０３）を用いて、参照例２－１－１記載の方法に従いＦｍｏｃ基を除去し、化合物ＳＳ１３を得た。
実施例３－１－２：メンブラン上に担持されたＰｒｏに対するＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長反応
　実施例３－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ１３）を使用し、ＤＩＣをｔＢＥＣに変更した反応条件でメンブラン上のＰｒｏに対するＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨ（０．６２ｍｏｌ／Ｌ）と活性化剤（０．１９４ｍｏｌ／Ｌもしくは０．３８７ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させた溶液とｔＢＥＣ（原液）を１０：１．３５５の比率で混合し、１５分間静置した後にその溶液をメンブランに対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例３－１－３：メンブラン上に担持された各種ペプチドの切り出しおよび分析
　実施例３－１－２で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ１４＊）および望みのＦｍｏｃ保護アミノ酸の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１５＊）の生成を確認した。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５８４．５［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．５５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３９４．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：２．６１～２．６２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　伸長効率は実施例２－５記載の計算式に従い算出した。
　結果を以下の表１７に示す。
　いずれの配列およびいずれの活性化剤を用いた場合においても、Preactivation溶液中の析出物は観測されず目的ペプチドの合成が可能であった。
参照例３－１－４：ＤＩＣ使用条件でのメンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長反応
　種々のＮ－アルキルアミノ酸の伸長反応について、本条件の有効性を確認すべく、参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、参照例２－３－１の反応条件を参考にメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応を行った。
　後述の表１８に従いＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨとＯｘｙｍａをＤＭＦに溶解させた溶液とＤＩＣ（原液）を混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例３－１－５：メンブラン上に担持されたＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長反応
　参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）を使用し、実施例２－７－３の反応条件を参考に実施例１－４で合成した種々のカルボジイミドを用いてメンブラン上のＭｅＰｈｅに対するＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨの伸長反応を行った。
　以下の表１８に従いＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）－ＯＨとＯｘｙｍａをＤＭＦに溶解させた溶液と各種カルボジイミド（原液）を混合し、１５分間静置した後にその溶液を参照例２－１－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０８）に対し１．２μＬ添加し、室温で３０分間静置した。以降は参照例２－１と同様の方法で行った。
実施例３－１－６：メンブラン上に担持された各種ペプチドの切り出しおよび分析
　参照例３－１－４ならびに実施例３－１－５で得られたメンブランに対し実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ３７＊）および望みのＦｍｏｃ保護アミノ酸の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨが伸長したペプチド（化合物ＳＳ１０＊）の生成を確認した。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６４８．５［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．８０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　伸長効率は実施例２－５記載の計算式に従い算出した。
　結果を以下の表１９に示す。
　縮合剤としてＤＩＣを用いた条件においては、伸長効率は４９％にとどまり、さらに析出物が発生し自動合成に適用することが困難な条件であった。一方で縮合剤としてＤｓＢＣや種々のカルボジイミドを用いた場合では、表１９に記載の通り伸長効率は５５％～７１％とＤＩＣ使用時よりも高い結果を示した。またＤｓＢＣや化合物ＳＳ２６、ＳＳ２７、ＳＳ２８およびＳＳ３０を用いた縮合反応においては析出物の発生がなくＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長が可能であり、自動合成に適用することが可能な条件であった。
実施例３－２：ペプチド合成機によるメンブラン上のペプチド合成実験
　実施例２で特定したメンブラン上のペプチド合成における好まれる反応条件を自動合成機での合成に適用した。ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従い、以下の方法で実施した。なお、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の種類が違っていても安定して高い伸長効率を獲得するために、自動合成機ではダブルカップリングを実施した。例えば、シングルカップリングで伸長効率が９０％程度であれば、ダブルカップリングを実施することで伸長効率は９９％程度となることが期待される。
　伸長するＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．６３ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔもしくはＯｘｙｍａもしくはＨＯＯＢｔ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌもしくは０．３９７ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させて溶液１を調製した。ＤｓＢＣは原液のまま溶液２として用いた。
　Ｆｍｏｃ保護アミノ酸伸長後にＧｌｙｃｉｎｅ　ｃａｐｐｉｎｇをするために、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液３を調製した。ＤＩＣ（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）とＤＭＦを混合し、溶液４を調製した。
　CelluSpots 384 frame with acid stable discs（Ｉｎｔａｖｉｓ社製）に実施例１－２－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ０２）を装着し、ペプチド合成機にセットした。溶液１～４をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）を、メンブランディスク１枚あたり２．０μＬおよび４．０μＬ添加し、室温にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。２．０μＬ添加後に５分間反応させた後、一度溶液を排出し、４．０μＬ添加しさらに１０分間反応させ、その後溶液を排出した。続いてＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で７回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。
伸長工程（ダブルカップリング）
　溶液１と溶液２を１０：１．６４２の比率で合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合し１５分間静置した後に、メンブランディスクに１枚あたり１．２μL添加し、室温にて４０分間反応することでメンブランディスク上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液を排出した。次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で４回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で３回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。その後縮合反応、洗浄および乾燥を更にもう１回繰り返して行った。
Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｃａｐｐｉｎｇ工程
　続いて溶液３と溶液４を５：６の比率で合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合し１５分間静置した後に、メンブランディスクに１枚あたり３．０μL添加し、室温にて４０分間反応することでＧｌｙｃｉｎｅ　ｃａｐｐｉｎｇを行った後、溶液を排出した。その後上記のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの伸長反応を再度行った。次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で７回洗浄し、引圧で１０分間乾燥した。アミノ酸の伸長後は脱Ｆｍｏｃ工程を行わずに、さらにＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で７回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で２回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり２５μＬ）で３回洗浄し、引圧で１０分間乾燥した。
　調製した化合物ＳＳ０９、化合物ＳＳ１２、化合物ＳＳ１６および化合物ＳＳ１７を用いて実施例１－２に記載の方法でペプチドの切り出しを行い、目的ペプチド（化合物ＳＳ０９＊、化合物ＳＳ１２＊、化合物ＳＳ１６＊および化合物ＳＳ１７＊）の生成を確認した。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５１４．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．６３分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５８６．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．６１分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５９８．３［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．７２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５１４．４［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：３．４９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　実施例３－２の結果を以下の表２０に示す。
　いずれの基質においてもＤｓＢＣ由来のウレアの析出は観察されず、ペプチド合成機による自動合成が可能であった。
実施例３－３：ペプチド合成機を利用したメンブラン上の環状ペプチド合成実験
　実施例２で特定したメンブラン上のペプチド合成における好まれる反応条件を自動合成機での合成に適用し、環状ペプチドの並列合成を行った。
実施例３－３－１：ペプチド合成機によるメンブラン上のペプチド伸長
　実施例１－２および３－２の反応条件を参考に自動合成機にてペプチドの伸長を実施し以下の表２１記載の配列を伸長した。
　ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従い、以下の方法で実施した。なお、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の種類が違っていても安定して高い伸長効率を獲得するために、自動合成機ではダブルカップリングを実施した。
　１残基目の伸長でメンブラン上の反応点の数を調整するために、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ（０．０７２ｍｏｌ／Ｌ）、４－フェノキシ酪酸（０．２２ｍｏｌ／Ｌ）およびＨＯＢｔ（０．１８１ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させて溶液１を調製した。ＤＩＣは原液のまま溶液２として用いた。２残基目以降の伸長で使用する溶液として、伸長するＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．６３ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔもしくはＯｘｙｍａもしくはＨＯＯＢｔ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌもしくは０．３９７ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦもしくはＮＭＰに溶解させて溶液３を調製した。その組み合わせを以下の表２２に記載した。ＤｓＢＣは原液のまま溶液４として用いた。
　CelluSpots 384 frame with acid stable discs（Ｉｎｔａｖｉｓ社製）をペプチド合成機にセットした。溶液１～４をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
脱Ｆｍｏｃ工程
［１残基目］
　メンブラン上のＮ末端にはＦｍｏｃ基が存在していないためこの操作は省略した。
［２残基目以降］
　ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）を、メンブランディスク１枚あたり６．０μＬ添加し、室温にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。６．０μＬ添加後に１５分間反応させ、その後溶液を排出した。続いてＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で７回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で６回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。
伸長工程（ダブルカップリング）
［１残基目］
　溶液１と溶液２を１１．２９：０．７２の比率で合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合し１５分間静置した後に、メンブランディスクに１枚あたり１．２μＬ添加し、室温にて４０分間反応することでメンブランディスク上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液を排出した。次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で４回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で３回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。その後縮合反応を更にもう１回３０分間行い、次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で７回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で５回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。
［２残基目以降］
　溶液３と溶液４を１０．３１：０．１６９の比率で合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合し１０分間静置した後に、メンブランディスクに１枚あたり１．２μＬ添加し、室温にて３０分間反応することでメンブランディスク上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液を排出した。次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で４回、エタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で３回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。その後縮合反応を更にもう１回３０分間行い、続いて無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）のＤＭＦ溶液（４％ｖ／ｖ）を、メンブランディスク１枚あたり４．０μＬ添加し、室温にて未反応アミンのアセチルキャッピングを行った。５分間反応させた後、溶液を排出した。次いでＤＭＦ（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で７回洗浄し、引圧で１０分間乾燥した。
　このＦｍｏｃ基の脱保護反応に次ぐＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応、アセチルキャッピングを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでメンブランディスク表面上にペプチドを伸長させた。最後のアミノ酸の伸長、アセチルキャッピング、ＤＭＦ洗浄、乾燥後にさらにエタノール（メンブランディスク１枚あたり３７．５μＬ）で６回洗浄し、引圧で１５分間乾燥した。
実施例３－３－２：メンブラン上の各種ペプチドの脱保護、環化、切り出しおよび分析
　実施例３－３－１で得られたメンブラン（化合物ＳＳ３８～ＳＳ４６）を使用し、脱保護反応、環化反応、メンブランからの切り出しならびに分析を実施し以下の表２３記載の目的ペプチド（化合物ＳＳ４７～ＳＳ５５）の生成を確認した。
［Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去］
　メンブランディスクを１枚ずつ反応容器に入れ、ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ）をメンブランディスク１枚あたり４．０μＬ添加し、室温にて５分間反応させた後、再度４．０μＬ添加し室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の除去を行った。続いてメンブランディスク１枚あたり１００μＬのＤＭＦで４回、１００μＬのＤＣＭで３回洗浄し、風乾した。
［側鎖官能基の保護基の除去］
　ＨＦＩＰ（２．４７ｍＬ）、ＴＩＰＳ（５１．２μＬ）、ＤＣＥ（２１．３μＬ）を混合した溶液に２１．９ｍｇの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させて０．０５Ｍの硫酸水素テトラメチルアンモニウム溶液を調製した。
　メンブランディスクを１枚ずつ反応容器に入れ、調製した溶液をメンブランディスク１枚あたり１５０μＬ添加し、室温にて４．５時間反応させてＰｉｓ基およびＴＨＰ基の除去を行った。続いてメンブランディスク１枚あたり１００μＬのＮＭＰで２回洗浄し、その後１００μＬのＤＩＰＥＡのＮＭＰ溶液（６０ｍＭ）を添加し室温で５分間静置した。溶液を排出し、続いて１００μＬのＮＭＰで１回、ＤＣＭで３回洗浄し、風乾した。
［環化反応］
　ＮＭＰ（１８４μＬ）とＴＨＦ（１．６６ｍＬ）を混合した溶液にＰｙＯｘｉｍ（４９．８ｍｇ）を溶解させ、ＤＩＰＥＡ（１９．７μＬ）を添加することで５０ｍＭ ＰｙＯｘｉｍ／６０ｍＭ ＤＩＰＥＡ溶液を調製した。
　メンブランディスクを１枚ずつ反応容器に入れ、調製した溶液をメンブランディスク１枚あたり１５０μＬ添加し、５０℃に昇温して２時間反応させて環化反応を行った。続いてメンブランディスク１枚あたり１００μＬのＤＭＦで４回、１００μＬのＤＣＭで３回洗浄し、風乾した。
［切り出し、分析］
　メンブランディスクを１枚ずつ反応容器に入れ、実施例１－２に記載の方法を参考にして以下の手順でペプチドの切り出しおよび分析を行い、目的のペプチド（化合物ＳＳ４７～ＳＳ５５）の生成を確認した。
　室温下に置いた反応容器中のメンブランディスクに対しＤＭＳＯを１０μＬ添加した。続いてＵＶ波長３６５ｎｍ、照度３８０～６００ｍＷ／ｃｍ２で２分３０秒間光照射した。その後メンブランに対し１０μＬのＤＭＳＯを添加し、１５分以上静置しペプチドを溶解させた。その溶液をＬＣＭＳにて分析した。
　ＬＣデータの各化合物ピークのＵＶエリア値（波長２１０－４００ｎｍ　ＰＤＡｔｏｔａｌ）を用いて、目的ペプチドの純度を以下の式から算出した。
純度（％）＝（目的ペプチドのＵＶエリア値）／（バックグラウンドおよびＦｍｏｃ－ＰＥＧ６－ＯＨ中に含まれる不純物由来のピークを除いた全ピークのＵＶエリア値の合算値）ｘ１００
　なお、Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ６－ＯＨ中に含まれる不純物はＦｍｏｃ基が酸化され脱保護されなくなった化合物と推定される。
　実施例３－３の結果を以下の表２４に示す。
　精製工程を行う前の粗生成物の段階において、３７～６９％の純度で目的の環状ペプチドを得た。本反応条件を自動合成機でのペプチド伸長に適用し、メンブラン上での環状ペプチドの並列合成が可能であることが示された。
実施例４：適用可能な担体の範囲の検討実験
　本実験では、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法（ＷＯ２０１８／２２５８５１）に従った反応条件および実施例２で特定したメンブラン上のペプチド合成における好まれる反応条件を用いて、レジン上のペプチド合成実験を実施した。Ｃｌ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）レジン（１．２５～１．６０ｍｍｏｌ／ｇ，１００－２００ｍｅｓｈ，１％ＤＶＢ）は渡辺化学工業株式会社またはＳＵＮＲＥＳＩＮ社から購入した。
実施例４－１：Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ＮＭｅ２の合成
実施例４－１－１：（３Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＮＭｅ２、ＳＳ１８）の合成
　上記のスキームに従い（３Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＮＭｅ２、ＳＳ１８）を合成した。
実施例４－１－２：（３Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソブタン酸－２－メチルプロパン－２－イル（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＮＭｅ２、化合物ＳＳ１８ａ）の合成
　商業的供給業者から購入したＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２５．０ｇ，６０．８ｍｍｏｌ）を出発原料として合成を実施した。窒素気流下にて、反応容器にＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２５．０ｇ，６０．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１４．０ｇ，７２．９ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１２２ｍＬ）を加え、室温にて５分攪拌した後、０℃に冷却した。０℃にてＨＯＢｔ（９．０３ｇ，６６．８ｍｍｏｌ）を加え、４５分間攪拌した。０℃にてジメチルアミン（２ｍｏｌ／Ｌ　ＴＨＦ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，３１．３ｍＬ，６２．６ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下後、０℃にて１時間攪拌した。さらに水浴にて１時間攪拌した後、反応液に酢酸エチル／ＴＢＭＥ（１／１，２５０ｍＬ）を加え、有機層を０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液（２００ｍＬ）で１回、水（２００ｍＬ）で２回で順に洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥材を濾去後、濾液を減圧濃縮し、化合物ＳＳ１８ａを粗生成物として２９．８ｇ（収率１１２％）得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４６１．３［Ｍ＋Ｎａ］＋
保持時間：０．８８分（分析条件分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿２）
実施例４－１－３：（３Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＮＭｅ２、化合物ＳＳ１８）の合成
　反応容器に化合物ＳＳ１８ａの粗生成物（２９．８ｇ）、ＴＦＥ（２７０ｍＬ）を加え、次いで４ｍｏｌ／Ｌ塩酸ジオキサン溶液（１５．２ｍＬ，６０．８ｍｍｏｌ）を滴下した後、反応液を室温にて１時間攪拌した。反応液をＴＢＭＥ（５００ｍＬ）で希釈した後、５％炭酸ナトリウム水溶液（６００ｍＬ）で抽出した。得られた水層に８５％リン酸水溶液（４０～５０ｍＬ）を加えてｐＨ２～３付近まで酸性とし、水層をＴＢＭＥ（４００ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を１０％塩化ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）、水（４００ｍＬ）で洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥材を濾去後、濾液を減圧濃縮し、化合物ＳＳ１８を２１．４ｇ（収率９２％）得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３８３．２［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．６６分（分析条件分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿２）
実施例４－１－４：（３Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ＮＭｅ２、化合物ＳＳ１９）の合成
　フィルター付きの反応容器に２－クロロトリチルクロライドレジン（１．４４ｍｍｏｌ／ｇ，３９．０ｇ，５６．２ｍｍｏｌ）とＤＣＭ（３９０ｍＬ）を入れ、室温にて２０分間振盪した。窒素圧をかけてＤＣＭを除いた後、化合物ＳＳ１８（１０．７ｇ，２８．０ｍｍｏｌ）、メタノール（９．０５ｍＬ，２２４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２３．５ｍＬ，１３４ｍｍｏｌ）、およびＤＣＭ（２７３ｍＬ）の混合液を反応容器に添加し、室温にて６０分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、メタノール（３６．２ｍＬ，８９５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２３．５ｍＬ，１３４ｍｍｏｌ）、およびＤＣＭ（２７３ｍＬ）の混合液を反応容器に添加し、室温にて９０分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ＤＣＭ（３９０ｍＬ）を入れ５分間振盪した後に窒素圧をかけて反応液を除いた。このＤＣＭを用いたレジンの洗浄操作を３回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、化合物ＳＳ１９を４５．０ｇ得た。
Ｆｍｏｃ定量法
　担持量の確認のため、得られた化合物ＳＳ１９（１０．４８ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を加えて、室温にて３０分間振盪した。その後、ＤＢＵ（４０μＬ）を加えて３０℃で１５分間振盪した。その後、反応混合液が１０．０ｍＬになるようにＤＭＦを加え、その溶液８０μＬをＤＭＦ（９２０μＬ）で希釈した。得られた希釈溶液をＬＣ／ＭＳで分析し（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿１、injection volume：５μＬ）、ジベンゾフルベンのＵＶａｒｅａ値（２９４ｎｍにおけるＵＶａｒｅａ値：４９２９．８２、３０４ｎｍにおけるＵＶａｒｅａ値：４４２８．７６）より、化合物ＳＳ１９の担持量を０．４６９ｍｍｏｌ／ｇと算出した。（濃度既知のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（商業的供給業者から購入）とＤＢＵの混合溶液を標準物質として測定日毎に波長２９４ｎｍと３０４ｎｍにおけるジベンゾフルベンのＵＶａｒｅａ値をもとに作成した検量線を用い、各々の波長で算出された担持量の平均値をレジンの担持量とした。）
　なお、同様に合成した担持量が異なる別ロットについてもペプチド合成や検討等に使用した。
実施例４－２：レジン上の異なる反応条件でのペプチド合成実験
実施例４－２－１：化合物ＳＳ２０（ＭｅＶａｌ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ＮＭｅ２）の調製
　化合物ＳＳ２０の調製は、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法（ＷＯ２０１８／２２５８５１）に従い、ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
　目的とするペプチドを構成するＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とカルボン酸の活性化剤としてＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液１を調製した。ＤＩＣ（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）とＤＭＦを混合し、溶液２を調製した。
　実施例４－１－４にて調製した（３Ｓ）－４－（ジメチルアミノ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソブタン酸－２－クロロトリチルレジン（化合物ＳＳ１９、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ＮＭｅ２）（１カラムあたり１００ｍｇ）を固相反応容器に加え、ペプチド合成機にセットした。このレジン（１００ｍｇ）にＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加えて３０分程度静置することでレジンの膨潤を行った。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）にて２回洗浄した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温～３０℃にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。４．５分間反応させた後、溶液をフリットから排出した。続いてＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄した。
伸長工程
　溶液１（０．３ｍＬ）と溶液２（０．３６ｍＬ）を合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合した後に、レジンに添加し、固相反応容器を４０℃まで加温し、２．５時間反応することでレジン上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液をフリットから排出した。次いでレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温～３５℃にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。１０分間反応させた後、溶液をフリットから排出した。続いてＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄した。
　反応終了後も合成機にセットしたままの状態で参照例４－２－２ａまたは実施例４－２－２ｂ記載の実験に用いた。
実施例４－２－２：種々の反応条件でのレジン上に担持されたＭｅＶａｌに対するＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨの伸長反応
　レジン上に担持されたＭｅＶａｌに対するＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨの伸長反応を、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法（ＷＯ２０１８／２２５８５１）に従った反応条件あるいは実施例２で特定したメンブラン上のペプチド合成における好まれる反応条件を用いて実施し化合物ＳＳ２１を合成した。
参照例４－２－２ａ：ＷＯ２０１８／２２５８５１記載の反応条件でのレジン上に担持されたＭｅＶａｌに対するＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨの伸長反応
　実施例４－２－１で調製したＭｅＶａｌ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ＮＭｅ２（化合物ＳＳ２０、１カラムあたり１００ｍｇ）を使用し、ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、実施例２－４のNo.1記載の反応条件で、Ｆｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨの伸長反応を行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
　Ｆｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液１を調製した。ＤＩＣ（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）とＤＭＦを混合し、溶液２を調製した。
　溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
　溶液１（０．３ｍＬ）と溶液２（０．３６ｍＬ）を合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合した後に、レジンに添加し、固相反応容器を４０℃まで加温し、２．５時間反応することでレジン上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液をフリットから排出した。次いでレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
実施例４－２－２ｂ：ＤｓＢＣを用いた試薬高濃度反応条件でのレジン上に担持されたＭｅＶａｌに対するＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨの伸長反応
　実施例４－２－１で調製したＭｅＶａｌ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ＮＭｅ２（化合物ＳＳ２０、１カラムあたり１００ｍｇ）を使用し、実施例２－４の反応条件を参考にしてＤｓＢＣを用いて試薬濃度を上げて、実施例２－４のNo.2～No.5記載の反応条件で、レジン上のＭｅＶａｌに対するＦｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨの伸長反応を行った。
　Ｆｍｏｃ－ＭｅＶａｌ－ＯＨ（０．６３ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１９８ｍｏｌ／Ｌもしくは０．３９７ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶解させて調製した溶液１（６０１μＬ）とＤｓＢＣ（原液）（９８．７μＬ）を混合した後に、その混合溶液６６０μＬをレジンに添加し、固相反応容器を４０℃または５０℃まで加温し、２．５時間反応することでレジン上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った。その後、溶液をフリットから排出した。次いでレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
実施例４－２－３：化合物ＳＳ２２の調製
　参照例４－２－２ａあるいは実施例４－２－２ｂで得られた化合物ＳＳ２１を使用し、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法（ＷＯ２０１８／２２５８５１）に従い、レジン上のＭｅＶａｌに対するＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの伸長反応を行った。本実施例は、ペプチド合成機（Multipep RS；Ｉｎｔａｖｉｓ社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
　目的とするペプチドを構成するＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とカルボン酸の活性化剤としてＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液１を調製した。ＤＩＣ（０．７１ｍｏｌ／Ｌ）とＤＭＦを混合し、溶液２を調製した。
　参照例４－２－２ａあるいは実施例４－２－２ｂにて調製した化合物ＳＳ２１（１カラムあたり１００ｍｇ）を固相反応容器に加え、ペプチド合成機にセットした。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　ＤＢＵのＤＭＦ溶液（２％ｖ／ｖ、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温～３５℃にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。１０分間反応させた後、溶液をフリットから排出した。続いてＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄した。
伸長工程
　溶液１（０．３ｍＬ）と溶液２（０．３６ｍＬ）を合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合した後に、レジンに添加し、固相反応容器を４０℃まで加温し、２．５時間反応することでレジン上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液をフリットから排出した。次いでレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。さらにＤＣＭ（１カラムあたり１．０ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた後、以後の検討に用いた。
　得られたレジンの一部に対し、ＤＩＰＥＡ（０．０４２ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳにて分析したところ、目的ペプチド（化合物ＳＳ２２＊）の生成が確認された。また、目的ペプチドの他にＭｅＶａｌが一つ欠損した化合物ＳＳ２３＊の生成も確認された。
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６６６．７［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿３）
ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５５３．５［Ｍ＋Ｈ］＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿３）
　ＬＣデータの各化合物ピークのＵＶエリア値（波長２９９ｎｍ）を用いて、伸長効率を以下の式から算出した。
伸長効率（％）＝（化合物ＳＳ２２＊のＵＶエリア値）／（化合物ＳＳ２２＊のＵＶエリア値と化合物ＳＳ２３＊のＵＶエリア値の合算値）ｘ１００
　実施例４の結果を以下の表２５に示す。
　レジン上でのＦｍｏｃ保護アミノ酸の伸長においても、本発明反応条件下で伸長を行うことで伸長効率の改善が確認された。
 

Claims (15)

  1. 　固相法によるペプチド化合物の製造方法であって、
    　固相に担持された、アミノ基を有する第一のアミノ酸またはアミノ基を有する第一のペプチドを準備する準備工程；および
    　第一のアミノ酸または第一のペプチドと、保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のアミノ酸、または保護アミノ基および／または保護ヒドロキシ基、ならびにカルボキシ基を有する第二のペプチドとを、下記一般式（Ａ）で表される少なくとも１種のカルボジイミド系縮合剤、
    ＲＡ－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－ＲＢ　・・・（Ａ）
    （式中、ＲＡはＣ４～Ｃ１０第２級または第３級アルキルであり、ＲＢはＣ２～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリールまたはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルであり、ＲＡおよびＲＢにおける各基は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、ジＣ１～Ｃ６アルキルアミノ、または４～８員環状アミノより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい。）
    　および添加剤の存在下で縮合させる縮合工程
    を含む、前記方法。
  2. 　ＲＡはＣ４～Ｃ８第２級または第３級アルキルであり、ＲＢはＣ４～Ｃ１０第２級または第３級アルキル、またはＣ７～Ｃ１４アリールアルキルである、請求項１に記載の方法。
  3. 　カルボジイミド系縮合剤が、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、Ｎ’－（１－フェニルエチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン、Ｎ’－（１－メチルへプチル）－Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－メタンジイミン、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－メチルブチル）メタンジイミン、Ｎ，Ｎ’－ビス（１－エチルプロピル）メタンジイミン、およびＮ’－（１－エチルプロピル）－Ｎ－（１－メチルブチル）メタンジイミンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　添加剤が、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）、および５－（ヒドロキシイミノ）－１，３－ジメチルピリミジン－２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）－トリオン（Ｏｘｙｍａ　Ｂ）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　縮合工程が溶媒中で行われ、溶媒中におけるカルボジイミド系縮合剤の濃度が、０．４ｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、０．６ｍｏｌ／Ｌ以上、または０．７ｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　固相がメンブランまたは固相合成用樹脂である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　メンブランがセルロースメンブラン、ポリプロピレンメンブラン、またはポリアミノエチルメタクリルアミドメンブランである、請求項６に記載の方法。
  8. 　固相と、第一のアミノ酸または第一のペプチドとが、光開裂性部位、ジスルフィド結合、または酸不安定部位を介して結合されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのＮ末端のアミノ酸が、α，α－ジ置換アミノ酸、β－分岐アミノ酸、またはＮ－アルキルアミノ酸（ただし、Ｎ－アルキルアミノ酸におけるアルキルはＣ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、またはＣ６～Ｃ１０アリールより独立して選択される１つまたは複数の基によって置換されていてもよい）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのＣ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法における、式（Ａ）で表されるカルボジイミド系縮合剤の使用。
  13. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法を含む、メンブランに担持されたペプチド化合物の製造方法。
  14. 　請求項１３に記載の方法によって、メンブランに担持された１０種類以上のペプチド化合物を得る工程を含む、メンブランに担持されたペプチドライブラリの製造方法。
  15. 　自動合成機を用いる、請求項１３または１４に記載の方法。
     
PCT/JP2023/014205 2022-04-08 2023-04-06 ペプチド化合物の製造方法 Ceased WO2023195516A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020247036206A KR20240169679A (ko) 2022-04-08 2023-04-06 펩타이드 화합물의 제조 방법
US18/854,568 US20250276995A1 (en) 2022-04-08 2023-04-06 Production method for peptide compound
JP2024514310A JPWO2023195516A1 (ja) 2022-04-08 2023-04-06
EP23784800.7A EP4488283A1 (en) 2022-04-08 2023-04-06 Production method for peptide compound
CN202380022408.6A CN118715234A (zh) 2022-04-08 2023-04-06 肽化合物的制造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022064409 2022-04-08
JP2022-064409 2022-04-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023195516A1 true WO2023195516A1 (ja) 2023-10-12

Family

ID=88243067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/014205 Ceased WO2023195516A1 (ja) 2022-04-08 2023-04-06 ペプチド化合物の製造方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20250276995A1 (ja)
EP (1) EP4488283A1 (ja)
JP (1) JPWO2023195516A1 (ja)
KR (1) KR20240169679A (ja)
CN (1) CN118715234A (ja)
TW (1) TW202402781A (ja)
WO (1) WO2023195516A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12281141B2 (en) 2017-06-09 2025-04-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid
US12312379B2 (en) 2021-05-07 2025-05-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing cyclic compounds comprising N-substituted amino acid residues
US12404299B2 (en) 2019-11-07 2025-09-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing peptide compound comprising highly sterically hindered amino acid
US12415835B2 (en) 2011-12-28 2025-09-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peptide-compound cyclization method

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010510304A (ja) * 2006-11-21 2010-04-02 イプセン・マニュファクチュアリング・アイルランド・リミテッド ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相ペプチド合成
WO2013100132A1 (ja) 2011-12-28 2013-07-04 中外製薬株式会社 ペプチド化合物の環化方法
JP2016138090A (ja) * 2014-12-19 2016-08-04 シーイーエム・コーポレーション 高温でのペプチド合成のための改良されたカップリング法
JP2016523891A (ja) * 2013-06-28 2016-08-12 オークランド ユニサービシーズ リミティド アミノ酸及びペプチド接合体及び接合方法
JP2018070590A (ja) * 2016-09-02 2018-05-10 シーイーエム・コーポレーション 高温でのペプチド合成のための過剰カルボジイミドの使用
WO2018124162A1 (ja) 2016-12-28 2018-07-05 中外製薬株式会社 化合物の膜透過性を改善するための自己乳化型製剤
WO2018225851A1 (ja) 2017-06-09 2018-12-13 中外製薬株式会社 Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法
WO2018225864A1 (ja) 2017-06-09 2018-12-13 中外製薬株式会社 膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010510304A (ja) * 2006-11-21 2010-04-02 イプセン・マニュファクチュアリング・アイルランド・リミテッド ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相ペプチド合成
WO2013100132A1 (ja) 2011-12-28 2013-07-04 中外製薬株式会社 ペプチド化合物の環化方法
JP2016523891A (ja) * 2013-06-28 2016-08-12 オークランド ユニサービシーズ リミティド アミノ酸及びペプチド接合体及び接合方法
JP2016138090A (ja) * 2014-12-19 2016-08-04 シーイーエム・コーポレーション 高温でのペプチド合成のための改良されたカップリング法
JP2018070590A (ja) * 2016-09-02 2018-05-10 シーイーエム・コーポレーション 高温でのペプチド合成のための過剰カルボジイミドの使用
WO2018124162A1 (ja) 2016-12-28 2018-07-05 中外製薬株式会社 化合物の膜透過性を改善するための自己乳化型製剤
WO2018225851A1 (ja) 2017-06-09 2018-12-13 中外製薬株式会社 Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法
WO2018225864A1 (ja) 2017-06-09 2018-12-13 中外製薬株式会社 膜透過性の高い環状ペプチド化合物、及びこれを含むライブラリ

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Building Blocks", CATALYSIS AND COUPLING CHEMISTRY, vol. 3, 2011
"Peptide synthesis experiments on membrane under the reaction conditions", METHODS MOL. BIOL., vol. 570, 2009, pages 157 - 174
"Preparation of a Cellulose Membrane for Spot Synthesis", METHODS MOL. BIOL, vol. 570, 2009, pages 157 - 174
"Solid phase peptide synthesis", 18 January 2022, BACHEM HOLDING AG
ACC.CHEM. RES., vol. 41, 2008, pages 1331 - 1342
ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 52, 2013, pages 254 - 269
BIOTECHNOLOGY AND BIOPROCESS ENGINEERING, vol. 21, 2016, pages 119 - 127
FUTURE MED. CHEM., vol. 1, 2009, pages 1289 - 1310
GREENE: "Protective Groups in Organic Synthesis", 2014, JOHN WILEY & SONS
MANNE SRINIVASA RAO, LUNA OMAR, ACOSTA GERARDO A., ROYO MIRIAM, EL-FAHAM AYMAN, OROSZ GYORGY, DE LA TORRE BEATRIZ G., ALBERICIO FE: "Amide Formation: Choosing the Safer Carbodiimide in Combination with OxymaPure to Avoid HCN Release", ORGANIC LETTERS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 23, no. 17, 3 September 2021 (2021-09-03), US , pages 6900 - 6904, XP093097478, ISSN: 1523-7060, DOI: 10.1021/acs.orglett.1c02466 *
ORG. LETT., vol. 23, 2021, pages 6900 - 6904

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12415835B2 (en) 2011-12-28 2025-09-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peptide-compound cyclization method
US12281141B2 (en) 2017-06-09 2025-04-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid
US12404299B2 (en) 2019-11-07 2025-09-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing peptide compound comprising highly sterically hindered amino acid
US12312379B2 (en) 2021-05-07 2025-05-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing cyclic compounds comprising N-substituted amino acid residues

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2023195516A1 (ja) 2023-10-12
TW202402781A (zh) 2024-01-16
EP4488283A1 (en) 2025-01-08
CN118715234A (zh) 2024-09-27
US20250276995A1 (en) 2025-09-04
KR20240169679A (ko) 2024-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023195516A1 (ja) ペプチド化合物の製造方法
Feichtinger et al. Triurethane-protected guanidines and triflyldiurethane-protected guanidines: new reagents for guanidinylation reactions
Alfano et al. Amide bonds meet flow chemistry: a journey into methodologies and sustainable evolution
JP2019059777A (ja) 二置換アミノ酸ならびにその調製および使用の方法
TW201639867A (zh) 胜肽合成方法
CN108727468B (zh) 环肽、包含其的医药或化妆品组成物及其制备方法
WO2022145444A1 (ja) アミノ酸の固相合成用樹脂への担持方法
CN1367789B (zh) 模板固定的β-发夹环模拟物的合成
Kumar et al. In situ Fmoc removal–a sustainable solid-phase peptide synthesis approach
US20250232831A1 (en) Method for predicting cell membrane permeability of cyclic peptide
JP2006501150A (ja) ペプチド合成のためのプロセス
Nelli et al. An activated building block for the introduction of the histidine side chain in aliphatic oligourea foldamers
JPH06256225A (ja) アミド類およびペプチド類の製造方法
Jacobsen et al. Synthesis of cyclic peptide analogues of the 3 10 helical Pro138-Gly144 segment of human aquaporin-4 by olefin metathesis
Zhang et al. Synthesis of alanine and proline amino acids with amino or guanidinium substitution on the side chain
TW201938576A (zh) 環胜肽、包含其之醫藥或化妝品組成物及其製備方法
US6277958B1 (en) Method for preparing peptide thiol ester
CN105646675A (zh) 柯义巴肽a类似物及其合成方法与应用
CN116675726A (zh) 一种以临时保护的氨基酸作为氨组分合成酰胺和/或多肽的方法
JP2018177790A (ja) シクロペプチド、それを含む医薬または化粧用組成物、及びその製造方法
RU2458066C1 (ru) Способ получения пептида эксенатида
Olma et al. A convenient route to optically pure α-alkyl-β-(sec-amino) alanines
CN114249801A (zh) 一种环肽化合物及其制备方法和应用
Verdié et al. Oxyfold: A Simple and Efficient Solid‐Supported Reagent for Disulfide Bond Formation
CN1649892A (zh) 合成肽的方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23784800

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024514310

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202380022408.6

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023784800

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023784800

Country of ref document: EP

Effective date: 20241001

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18854568

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20247036206

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11202406921Q

Country of ref document: SG

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 18854568

Country of ref document: US