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WO2023195509A1 - 血管内皮バリア破綻の阻害剤及びその使用 - Google Patents

血管内皮バリア破綻の阻害剤及びその使用 Download PDF

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WO2023195509A1
WO2023195509A1 PCT/JP2023/014182 JP2023014182W WO2023195509A1 WO 2023195509 A1 WO2023195509 A1 WO 2023195509A1 JP 2023014182 W JP2023014182 W JP 2023014182W WO 2023195509 A1 WO2023195509 A1 WO 2023195509A1
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WO
WIPO (PCT)
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vascular endothelial
cldn5
inhibitor
sars
endothelial barrier
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Application number
PCT/JP2023/014182
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English (en)
French (fr)
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和雄 高山
里菜 橋本
欣晃 岡田
慈 藤尾
理徳 尾花
潤也 高橋
靖雄 吉岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Kyoto University NUC
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Publication date
Application filed by Osaka University NUC, Kyoto University NUC filed Critical Osaka University NUC
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Publication of WO2023195509A1 publication Critical patent/WO2023195509A1/ja
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown and its use. More specifically, the present invention relates to an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown, a pharmaceutical composition for treating respiratory infections, and a method for screening for an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown.
  • pathogenic bacteria or viruses overcome the defense mechanism and invade the body through the respiratory tract, multiply, and induce inflammation, causing symptoms such as coughing, phlegm, fever, chest pain, and difficulty breathing. Disruption of vascular endothelial barrier function is often observed in patients with severe respiratory infections.
  • SARS coronavirus-2 SARS coronavirus-2
  • SARS-CoV-2 SARS coronavirus-2
  • ACE2 angiotensin converting enzyme
  • vascular endothelial cells hardly express ACE2, SARS-CoV-2 hardly infects vascular endothelial cells (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • Vascular endothelial cells that line the lumen of blood vessels firmly adhere to each other by forming tight junctions with multiple adhesion factors, and play a barrier function to prevent foreign substances such as pathogens from entering blood vessels from outside. .
  • breakdown of vascular endothelial barrier function is observed, as in patients with other respiratory infections (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • Disruption of this barrier function facilitates the movement of SARS-CoV-2 from the respiratory tract to other organs via blood vessels.
  • failure of the barrier function induces infiltration of immune cells and blood components into the lungs, leading to respiratory failure including pneumonia and acute respiratory distress syndrome (ARDS) (see, for example, Non-Patent Document 4).
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown that can effectively prevent vascular endothelial barrier breakdown, and a screening method for an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown. do.
  • Claudin-5 (CLDN5) as a gene that plays an important role in vascular endothelial barrier function, and overexpressed CLDN5 or expressed CLDN5.
  • CLDN5 Claudin-5
  • the present inventors have discovered that vascular endothelial barrier breakdown can be prevented in pulmonary microvascular endothelial cells by applying a substance that induces this, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • An inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown which contains Claudin-5, a nucleic acid encoding Claudin-5, or a Claudin-5 expression inducer as an active ingredient.
  • the inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown according to (1), wherein the Claudin-5 expression inducer is a statin compound.
  • the statin compound is at least one selected from the group consisting of fluvastatin, pitavastatin, atorvastatin, cerivastatin, simvastatin, and lovastatin.
  • the inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown according to (1), wherein the Claudin-5 expression inducer is a TGF- ⁇ inhibitor.
  • the vascular endothelial barrier according to (5), wherein the TGF- ⁇ inhibitor is at least one selected from the group consisting of SB525334, R268712, EW-7197, RepSox, TP0427736, A83-01, and K02288. Inhibitor of bankruptcy.
  • the inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown according to (7), wherein the virus is SARS coronavirus-2.
  • a pharmaceutical composition for treating respiratory infections comprising the inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown according to any one of (1) to (8) and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the expression level of Claudin-5 in the pulmonary microvascular endothelial cells is measured after culturing the pulmonary microvascular endothelial cells, and the expression level of Claudin-5 is A method for screening for an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown, which indicates that the test substance is an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown when the test substance is significantly increased compared to the absence of the substance.
  • a first substrate including a first flow path configured to allow air to be injected; and a first substrate disposed below the first substrate and having a size that is permeable to the medium but not permeable to the cells.
  • the membrane has a plurality of through holes and forms the bottom surface of the first flow path, and is configured to be able to inject a culture medium, so that at least a portion thereof overlaps the first flow path in a plan view. using a cell culture container formed by laminating a second flow path having a top surface made of the membrane, and a second substrate disposed below the membrane.
  • airway epithelial cells infected with a virus or bacteria are seeded in the first flow path
  • pulmonary microvascular endothelial cells are seeded in the second flow path
  • the airway epithelium is infected in the presence of the test substance.
  • a method for screening for an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown which indicates that the test substance is an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown when the test substance is significantly reduced compared to the absence of the substance.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an airway-on-a-chip used in Examples.
  • 2 is a graph showing changes over time in the virus copy number in the cell culture supernatant of the airway channel and vascular channel of the airway-on-a-chip in Experimental Example 1.
  • 1 is a volcano plot of genes showing differential expression between human lung microvascular endothelial cells (HMVEC-L) not infected with SARS-CoV-2 and HMVEC-L infected with SARS-CoV-2 in Experimental Example 1.
  • HMVEC-L human lung microvascular endothelial cells
  • Claudin-5 Claudin-5
  • VE-cadherin vascular endothelial cadherin
  • IL-6 interleukin-6
  • VCAM-1 VCAM-1 and intercellular adhesion molecule (ICAM-1). 2 is an image of immunofluorescence staining of CLDN5 and VE-cadherin in airway-on-a-chip HMVEC-L in Experimental Example 2.
  • 3 is a graph showing the expression level of CLDN5 when a medium containing 0.1 MOI and 1 MOI of SARS-CoV-2 is applied to HMVEC-L in Experimental Example 3.
  • 3 is a phase contrast microscopic image of SARS-CoV-2 infected and non-infected HMVEC-L in Experimental Example 3.
  • 3 is a graph showing the gene expression levels of CLDN5, VE-cadherin, IL-6, VCAM-1, and ICAM-1 in SARS-CoV-2-infected and uninfected HMVEC-L in Experimental Example 3.
  • TEER transendothelial electrical resistance
  • 3 is a graph showing the amount of Evans blue detected in each organ of hCLDN5-KI mice injected with anti-CLDN5 antibody or control IgG in Experimental Example 4.
  • 3 is a bright field image of each organ of a hCLDN5-KI mouse injected with anti-CLDN5 antibody or control IgG in Experimental Example 4.
  • 3 is a bright field image of the lungs (left) and a graph (right) showing the wet weight/dry weight ratio of the lungs of hCLDN5-KI mice injected with anti-CLDN5 antibody or control IgG in Experimental Example 4.
  • Spike protein in Experimental Example 5 SARS-CoV-2, or CLDN5, VE-cadherin, IL-6 in HMVEC-L treated with UV-irradiated SARS-CoV-2 (UV-SARS-CoV-2) , VCAM-1, and ICAM-1.
  • 2 is an immunofluorescence staining image of VE-cadherin in HMVEC-L treated with spike protein, SARS-CoV-2, or UV-SARS-CoV-2 in Experimental Example 5.
  • FIG. 6 is an image of immunofluorescence staining of VE-cadherin in HMVEC-L exposed to SARS-CoV-2 in the presence or absence of DOX in Experimental Example 6.
  • CLDN5 VE-cadherin
  • IL-6 VCAM-1
  • ICAM-1 interferon- ⁇
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • MxA Myxovirus resistance A
  • FIG. 7 is a graph showing virus copy numbers in cell culture supernatants of airway channels and vascular channels of airway-on-a-chip with or without fluvastatin in Experimental Example 7.
  • 2 is an image of immunofluorescence staining of VE-cadherin in HMVEC-L exposed to SARS-CoV-2 in the presence or absence of fluvastatin in Experimental Example 7.
  • CLDN5 VE-cadherin, IL-6, VCAM-1, ICAM-1, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ in HMVEC-L exposed to SARS-CoV-2 with or without fluvastatin treatment in Experimental Example 7 , ISG15, ISG56, and MxA.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of measuring the CLDN5 concentration in the serum of mild/moderate and severe COVID-19 patients within one week after onset of symptoms by ELISA in Experimental Example 8.
  • 3 is a graph showing the expression level of CLDN5 after the action of a statin drug on HMVEC-L in Experimental Example 9.
  • 3 is a graph showing the expression level of CLDN5 after the action of a TGF- ⁇ inhibitor on HMVEC-L in Experimental Example 10. It is a graph showing the virus genome copy number in the cell culture supernatant when SARS-CoV-2 is introduced into the airway channel after the action of any of six types of statin drugs on the blood vessel channel in Experimental Example 11. .
  • the inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown of the present embodiment contains CLDN5, a nucleic acid encoding CLDN5, or a CLDN5 expression inducer as an active ingredient.
  • containing as an active ingredient means containing a therapeutically effective amount of CLDN5, a nucleic acid encoding CLDN5, or a CLDN5 expression inducer.
  • therapeutically effective amount means that when administered in accordance with the desired therapeutic regimen, the biological or medical amount required by a physician, clinician, veterinarian, researcher, or other appropriate professional It refers to the amount of CLDN5 or CLDN5 expression inducer, or the amount of CLDN5 or a nucleic acid encoding CLDN5 or a combination of CLDN5 expression inducer and one or more active agents that elicits an effect or response.
  • a preferred therapeutically effective amount is an amount that ameliorates the symptoms of respiratory infections, particularly COVID-19.
  • a "therapeutically effective amount” also includes a prophylactically effective amount, ie, an amount suitable for preventing a disease state.
  • the inhibitor of this embodiment vascular endothelial barrier breakdown can be effectively prevented. Therefore, the inhibitor of this embodiment is expected to be applied as a therapeutic agent for stopping the progression of symptoms of respiratory infections (especially COVID-19). Moreover, the inhibitor of this embodiment can also be called a vascular endothelial barrier function improving agent.
  • vascular endothelial barrier breakdown is caused directly by viruses, bacteria, etc., or indirectly by inflammatory reactions induced by them.
  • viruses that cause vascular endothelial barrier breakdown include RS virus (respiratory syncytial virus), SARS coronavirus (SARS-CoV), MERS coronavirus (MERS-CoV), SARS-CoV-2, etc. but not limited to.
  • bacteria that cause vascular endothelial barrier breakdown include, but are not limited to, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, and Streptococcus pneumoniae.
  • the inhibitor of this embodiment is preferably used as a therapeutic agent for respiratory infections accompanied by vascular endothelial barrier breakdown caused by the above-mentioned viruses, bacteria, or the like.
  • the inhibitor of the present embodiment is preferably applied to vascular endothelial barrier breakdown caused by viruses, and more preferably applied to vascular endothelial barrier breakdown caused by SARS-CoV-2.
  • CLDN5 is a four-transmembrane protein of approximately 23 kDa. Until now, it has been reported that it is involved in regulating the blood-brain barrier, but its functions in other organs were completely unknown. As shown in the Examples below, the inventors conducted a comprehensive gene expression analysis of pulmonary microvascular endothelial cells co-cultured with airway epithelial cells infected with SARS-CoV-2. We have identified CLDN5 as a gene that plays an important role, and have completed the present invention.
  • the amino acid sequence of human CLDN5 is disclosed in Genbank accession numbers NP_001124333.1 (SEQ ID NO: 1), NP_001349995.1 (SEQ ID NO: 2), NP_001349996.1 (SEQ ID NO: 3), NP_003268.2 (SEQ ID NO: 4), etc. ing.
  • CLDN5 includes both the full-length protein and its fragments.
  • a fragment is a polypeptide that includes any region of CLDN5 and has an activity of inhibiting vascular endothelial barrier breakdown. The presence or absence of inhibitory activity on vascular endothelial barrier breakdown can be evaluated using the screening method described below.
  • a protein having the same function as the CLDN protein a protein consisting of a sequence containing the amino acid sequence (a) or (b) below and having an activity of inhibiting vascular endothelial barrier breakdown can also be used.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5.
  • nucleic acid encoding CLDN5 can be used instead of the CLDN5 protein.
  • the nucleic acid encoding CLDN5 is preferably used in the form of an expression vector containing the nucleic acid encoding CLDN5.
  • the base sequences of the nucleic acids encoding human CLDN5 have Genbank accession numbers NM_001130861.1 (SEQ ID NO: 5), NM_001363066.2 (SEQ ID NO: 6), NM_001363067.2 (SEQ ID NO: 7), and NM_003277.4 (SEQ ID NO: 8). etc. are disclosed.
  • the nucleotide sequence encoding human CLDN5 includes, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is the sequence near the CDS extracted from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of Genbank accession number NM_001130861.1.
  • nucleic acid encoding CLDN5 a nucleic acid consisting of a sequence containing any of the following base sequences (c) to (e) and encoding a protein having inhibitory activity on vascular endothelial barrier breakdown can also be used.
  • nucleotide sequence having an identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOS: 5 to 9;
  • the number of bases that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, particularly preferably 1 to 10, and 1 to 15. Most preferably, the number is 5 or more.
  • stringent conditions refers to, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Labor Examples include the method described in Ratory Press).
  • 5 ⁇ SSC composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0
  • 0.1% by mass N-lauroylsarcosine 0.2% by mass SDS
  • Examples of conditions for hybridization include incubation for several hours to overnight at 55° C. or higher and 70° C. or lower in a hybridization buffer consisting of a blocking reagent for nucleic acid hybridization and 50% formamide.
  • the washing buffer used for washing after incubation is preferably a 1 ⁇ SSC solution containing 0.1% by mass SDS, more preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1% by mass SDS.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding CLDN5 may be codon-optimized for expression in the animal species to be introduced (mainly mammals including humans).
  • codon optimization is achieved by replacing at least one codon in the native sequence with a codon that is more frequently or most frequently used in the gene of the animal species into which it is introduced, while maintaining the native amino acid sequence.
  • Codon bias (differences in codon usage between animals) is often correlated with mRNA translation efficiency, which is thought to depend, among other things, on the characteristics of the codons being translated and the availability of specific tRNAs. There is. The predominance of selected tRNAs in a cell is generally a reflection of the codons most frequently used in peptide synthesis. Thus, genes can be personalized for optimal gene expression in a given organism based on codon optimization. Codon usage tables are easily available, for example, in the "Codon Usage Database" posted at www.kazusa.or.jp/codon/, and these tables can be used to optimize codons.
  • the expression vector may be a vector that expresses the protein in cultured cells derived from the recipient (mainly mammals including humans) or in cells of an individual recipient (mainly mammals including humans). It is not particularly limited, and may be a plasmid or a virus vector.
  • Examples of the plasmid include pRK5 (European Patent No. 307247), pSV16B (International Publication No. 91/08291), pCAGGS (Niwa K et al., “Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector ”, Gene, vol.108, no.2, p193-199, 1991.), pVL1392 (manufactured by Invitrogen), pBK-CMV, pZeoSV, pcDNA3, pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen and Stratagene), pVC0396 (Japanese Patent Publication No. 11-511009) and the like, but are not limited thereto.
  • the viral vector examples include adenovirus, adeno-associated virus (AAV), retrovirus, poxvirus, herpesvirus, herpes simplex virus, lentivirus (HIV), Sendai virus, Epstein-Barr virus (EBV), and vaccinia virus.
  • AAV adeno-associated virus
  • retrovirus poxvirus
  • herpesvirus herpes simplex virus
  • lentivirus HIV
  • Sendai virus Epstein-Barr virus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • vaccinia virus examples include, but are not limited to, viral vectors derived from , poliovirus, Cymbivirus, SV40, and the like.
  • the viral vector is preferably a replication-defective viral vector that completely or almost completely deletes the viral genes.
  • the expression vector may contain a promoter, a marker gene operably linked in the cells of the animal to be introduced (mainly mammals including humans), various regulatory elements, and the like. Examples of regulatory elements include terminators and enhancers.
  • the type of expression vector, promoter, and regulatory element to be used may be selected as appropriate depending on the animal species to be introduced and the method of introduction.
  • the CLDN5 expression inducer may be any substance that increases the expression level of CLDN5 in the presence of the substance compared to its absence, and includes a substance that increases the expression of CLDN5 and a substance that suppresses the expression of CLDN5. Included are inhibitors of substances that inhibit
  • CLDN5 examples include statin compounds, glucocorticoids, estrogens, cyclic adenosine monophosphate (cAMP), adenomedullin, and the transcription factor SOX (SRY-related HMG-box)-18. can be mentioned.
  • statin compounds examples include fluvastatin (LESCOL (registered trademark); see US Pat. No. 5,354,772), simvastatin (ZOCOR (registered trademark); US Pat. No. 4, 444,784), atorvastatin (LIPITOR®; see US Pat. No. 5,273,995), lovastatin (JP 5-178841 (US Pat. 5,260,440)), pravastatin (PRAVACHOL®; see U.S. Pat. No. 4,346,227), rosuvastatin (MEVACOR®; U.S. Pat. No. 4,231,938), cerivastatin (also known as rivastatin; see US Pat. No.
  • mevastatin (compactin, US Pat. 3,983,140), pitavastatin (see JP-A-1-279866 (US Pat. No. 5,854,259 and US Pat. No. 5,856,336) ) etc.
  • mevastatin compactin, US Pat. 3,983,140
  • pitavastatin see JP-A-1-279866 (US Pat. No. 5,854,259 and US Pat. No. 5,856,336)
  • fluvastatin fluvastatin
  • atorvastatin atorvastatin
  • cerivastatin cerivastatin
  • simvastatin simvastatin
  • lovastatin lovastatin
  • glucocorticoids examples include dekitamethasone (CAS No. 50-02-2).
  • estrogen examples include 17 ⁇ -estradiol (CAS No. 50-28-2).
  • Substances that suppress the expression of CLDN5 include forkhead box protein O1 (FoxO1), vascular endothelial growth factor (VEGF) and factors involved in the VEGF signaling pathway, tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), transforming Examples include growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), and these inhibitors can be used as inhibitors for substances that suppress the expression of CLDN5.
  • FoxO1 forkhead box protein O1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • TGF- ⁇ growth factor- ⁇
  • FoxO1 inhibitors examples include AS1842856 (CAS No. 835520-48-5).
  • VEGF signal inhibitors examples include LY-317615 (PKC ⁇ inhibitor; CAS No. 170364-57-5).
  • TNF- ⁇ inhibitors examples include H-1152 (CAS No. 871543-07-6), Y-27632 (CAS No. 331752-47-7), and the like.
  • TGF- ⁇ inhibitors examples include SB525334 (CAS No. 356559-20-1), R268712 (CAS No. 879487-87-3), and EW-7197, which are inhibitors of TGF- ⁇ receptor (ALK5). (CAS No. 1352608-82-2), RepSox (CAS No. 446859-33-2), TP0427736 (CAS No. 2459963-17-6), A83-01 (CAS No. 909910-43-6), K02288 (CAS No. 1431985-92-0), etc.
  • CLDN5 expression inducer breakdown of the vascular endothelial barrier can be inhibited.
  • TGF- ⁇ inhibitors Bintrafusp Alfa (CAS No. 1918149-01-5), NIS793, Remedisc, HCW9218, AdAPT-001, BCA101, BNC-1021, GS-1423, PF-069522 29 (CAS No. .1801333-55-0), SRK-181, TST-005, YL-13027, Seprehvec, ZGGS-18, 6MW-3511, AGMB-129, AK-130, BA1201, ES014, GFH018, JS201, SHR-1701, CUE-401, NCE-401, PLN-75068, SON-3015, STP355, TrexTAM, ACE-1332, Galunisertib (CAS No. 700874-72-2), GSK3845097, IDL-2965, LY30228 59, LY3200882 (CAS No. 1898283 -02-7).
  • siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, etc. against the substance that suppresses the expression of CLDN5 can be used as an inhibitor of a substance that suppresses the expression of CLDN5 as an inhibitor of a substance that suppresses the expression of CLDN5.
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA introduced into cells binds to RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to siRNA. This suppresses gene expression in a sequence-specific manner.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNA is prepared by synthesizing sense strand and antisense strand oligonucleotides using an automatic DNA/RNA synthesizer, for example, after denaturing the oligonucleotides at 90°C or higher and 95°C or lower for about 1 minute in an appropriate annealing buffer. It can be prepared by annealing at a temperature of about 1 to 8 hours at a temperature of about 1 to 70 degrees Celsius.
  • siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, and antisense nucleic acid may contain various chemical modifications to improve stability and activity.
  • phosphoric acid residues may be substituted with chemically modified phosphoric acid residues such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, and phosphorodithionate.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate phosphorodithionate
  • at least a portion thereof may be composed of a nucleic acid analog such as peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • a substance that specifically binds to a substance that suppresses the expression of CLDN5 can also be used as an inhibitor of a substance that suppresses the expression of CLDN5
  • Such substances include antibodies, antibody fragments, aptamers, and the like.
  • Antibodies can be produced, for example, by immunizing animals such as mice with FMO or a fragment thereof using FMO or a fragment thereof as an antigen. Alternatively, it can be produced, for example, by screening a phage library.
  • Antibody fragments include Fv, Fab, scFv, and the like.
  • the above-mentioned antibody is a monoclonal antibody. Alternatively, a commercially available antibody may be used.
  • An aptamer is a substance that has the ability to specifically bind to a target substance.
  • aptamers include nucleic acid aptamers, peptide aptamers, and the like.
  • Nucleic acid aptamers that have the ability to specifically bind to a target peptide can be selected, for example, by the systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • peptide aptamers that have the ability to specifically bind to a target peptide can be selected, for example, by the Two-hybrid method using yeast.
  • the pharmaceutical composition for treating respiratory infections of this embodiment contains the above-mentioned inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier. include.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is applied to respiratory infections accompanied by vascular endothelial barrier breakdown, and can effectively prevent vascular endothelial barrier breakdown. Therefore, the pharmaceutical composition of this embodiment is expected to be applied as a therapeutic agent for stopping the progression of symptoms of respiratory infections.
  • respiratory infections accompanied by vascular endothelial barrier breakdown include novel coronavirus infection-2019 (COVID-19), respiratory syncytial virus infection, severe acute respiratory syndrome (SARS), Middle East respiratory syndrome (MERS), etc. viral respiratory infections; bacterial respiratory infections such as tuberculosis, anthrax, and pneumococcal infections; and the like, but are not limited to these.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is preferably applied to COVID-19.
  • ⁇ Pharmaceutically acceptable carrier those commonly used in the formulation of pharmaceutical compositions can be used without particular limitation. More specifically, for example, binders such as gelatin, cornstarch, gum tragacanth, and gum arabic; excipients such as starch and crystalline cellulose; leavening agents such as alginic acid; solvents for injections such as water, ethanol, and glycerin; Examples include adhesives such as rubber adhesives and silicone adhesives.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may further contain an additive.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; phosphoric acid. Buffers such as salts and sodium acetate; solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives and the like.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be prepared by appropriately combining the above-mentioned inhibitor and the above-mentioned pharmaceutically acceptable carriers and excipients in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. It can be formulated into a formulation.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be in a dosage form that can be used orally or parenterally, but a dosage form that can be used parenterally is preferable.
  • dosage forms for oral use include tablets, capsules, elixirs, and microcapsules.
  • dosage forms used parenterally include injections, sprays, ointments, and patches.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be used in combination with other therapeutic agents.
  • vascular endothelial barrier function can be restored while alleviating the symptoms of COVID-19.
  • each formulation may be administered by the same administration route or by separate administration routes. Furthermore, each formulation may be administered simultaneously, sequentially, or separately at a certain time or period. In one embodiment, the inhibitor and other therapeutic agents may be provided in a kit containing them.
  • Subjects to be administered include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cows, horses, sheep, pigs, rabbits, mice, rats, guinea pigs, hamsters, and cells thereof. Among these, mammals or mammalian cells are preferred, and humans or human cells are particularly preferred.
  • Administration to a patient can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example, intrathecally, intraarterially, intravenously, subcutaneously, intranasally, transbronchially, intramuscularly, percutaneously, or orally. This can be done by
  • the dosage varies depending on the weight and age of the patient, the patient's symptoms, the method of administration, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is generally about 0.2 mg or more and 3 g or less, preferably about 2 mg or more and 300 mg or less per day for an adult (assuming a body weight of 60 kg) as the amount of the above-mentioned inhibitor. It is considered appropriate to administer, more preferably about 20 mg or more and 30 mg or less, once a day or divided into several doses.
  • the dose When administered parenterally, for example in the form of an injection, for adults (assuming a body weight of 60 kg), the dose is generally about 0.3 mg or more and 100 g or less, preferably about 3 mg or more and 10 g or less, more preferably about 3 mg or more and 10 g or less per day. It is considered appropriate to administer approximately 30 mg or more and 1 g or less once a day or in divided doses.
  • the method for screening for inhibitors of vascular endothelial barrier breakdown according to the first embodiment of the present invention comprises: in the presence of a test substance; After culturing the pulmonary microvascular endothelial cells (hereinafter sometimes referred to as the "first culture step"), measuring the expression level of CLDN5 in the pulmonary microvascular endothelial cells (hereinafter referred to as the "first measuring step”). ), including When the expression level of CLDN5 is significantly increased compared to the absence of the test substance, it is indicated that the test substance is an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown (hereinafter referred to as "first evaluation step”). ).
  • the screening method according to the first embodiment of the present invention it is possible to easily screen for substances that inhibit vascular endothelial barrier breakdown.
  • First culture step In the first culture step, pulmonary microvascular endothelial cells are cultured in the presence of the test substance.
  • the test substance is not particularly limited, and includes, for example, a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, a metabolite library, and the like.
  • test substance By adding the test substance to the culture medium, it can be brought into contact with pulmonary microvascular endothelial cells.
  • Examples of the medium include those commonly used for culturing pulmonary microvascular endothelial cells, such as EGM-2-MV medium (manufactured by Lonza).
  • pulmonary microvascular endothelial cells that have been exposed to a high titer virus or bacteria of 1.0 MOI (Multiplicity of Infection) or higher may be used.
  • virus As the virus, SARS-CoV-2 is preferably used. As shown in the Examples below, SARS-CoV-2 does not infect pulmonary microvascular endothelial cells, but it reduces the expression level of CLDN5 produced by pulmonary microvascular endothelial cells, causing vascular endothelial barrier breakdown.
  • the culture can be carried out at a temperature of 30° C. or higher and 37° C. or lower, and under 5% CO 2 .
  • the expression level of CLDN5 can be measured at the gene level and protein level. Measurement at the gene level can be performed, for example, by real-time PCR. Measurement at the protein level can be performed, for example, by Western blotting, ELISA, immunostaining, etc.
  • the test substance is evaluated as an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown when the expression level of CLDN5 is significantly increased compared to the absence of the test substance.
  • the expression level of CLDN5 is at least the same as that under non-exposed virus or bacteria. , it indicates that the test substance is an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown.
  • the method for screening for inhibitors of vascular endothelial barrier breakdown according to the second embodiment of the present invention includes the following steps: a first substrate including a first flow path configured; a membrane that is disposed in a lower layer of the first substrate, has a plurality of through-holes of a size that allows the culture medium to pass through but does not allow the cells to pass through, and that forms the bottom surface of the first channel;
  • the second flow path is configured such that a culture medium can be injected therein, and is configured such that at least a portion thereof overlaps the first flow path in a plan view, and a second flow path whose top surface is formed of the membrane.
  • a second substrate comprising: a second substrate disposed below the membrane;
  • a cell culture container made by stacking Airway epithelial cells infected with a virus or bacteria are seeded in the first flow path, pulmonary microvascular endothelial cells are seeded in the second flow path, and the airway epithelial cells are infected in the presence of the test substance.
  • the second culture step After co-culturing the pulmonary microvascular endothelial cells and the pulmonary microvascular endothelial cells (hereinafter sometimes referred to as the "second culture step"), the number of the viruses or bacteria in the culture supernatant of the pulmonary microvascular endothelial cells is measured.
  • second measurement step If the number of viruses or bacteria is significantly reduced compared to the absence of the test substance, this indicates that the test substance is an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown (hereinafter referred to as “second evaluation”). (sometimes referred to as “process”).
  • the screening method according to the second embodiment of the present invention it is possible to easily screen for substances that inhibit vascular endothelial barrier breakdown. Furthermore, by screening the test substance selected in the screening method according to the first embodiment with the screening method according to the second embodiment, it is possible to screen for substances that inhibit vascular endothelial barrier breakdown with higher accuracy. can.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an example of a cell culture container used in the screening method according to the second embodiment of the present invention.
  • the structure of the cell culture container 10 will be described in detail with reference to FIG. 1.
  • the cell culture container 10 is a system in which airway epithelial cells A and pulmonary microvascular endothelial cells B are co-cultured via a membrane 3, and is a microfluidic device that reproduces the human lung.
  • the inventors named the cell culture container 10 "airway-on-a-chip.”
  • the cell culture container 10 is formed by laminating a second substrate 2, a membrane 3, and a first substrate 1 in this order.
  • the first substrate 1 has a first flow path 1a.
  • the first channel 1a is configured to allow air to be injected, and is used for culturing airway epithelial cells A.
  • the bottom surface of the first flow path 1a is made up of a membrane 3.
  • the cross-sectional size of the first channel 1a can be, for example, a width of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less (preferably 1.0 mm), and a height of 200 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less (preferably 330 ⁇ m).
  • the second substrate 2 has a second flow path 2a.
  • the second channel 2a is configured so that a medium can be injected therein, and is used for culturing the pulmonary microvascular endothelial cells B.
  • the second flow path 2a is configured so that at least a portion thereof overlaps the first flow path 1a in a plan view, and the top surface is configured with the membrane 3.
  • the pulmonary microvascular endothelial cells B can be co-cultured with the airway epithelial cells A via the membrane 3, and the viruses or bacteria that have infected the airway epithelial cells A and proliferated are transferred to the pulmonary microvascular endothelial cells B. Can be moved.
  • the cross-sectional size of the second channel 2a can be, for example, a width of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less (preferably 1.0 mm), and a height of 200 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less (preferably 330 ⁇ m).
  • the first substrate 1 and the second substrate 2 may be made of the same material or may be made of different materials. Among these, it is preferable that they be made of the same material because manufacturing is easy.
  • the material forming the first substrate 1 and the second substrate 2 is a material that has relatively low toxicity to cells that is normally used for cell culture, and has translucency for ease of observation. Examples of the material include transparent glass; various polymers such as acrylic resin, fluororesin, and silicone rubber (for example, poly(dimethylsiloxane): PDMS). These materials may be used alone or in combination.
  • the membrane 3 has a plurality of through holes that are sized to allow the medium to pass through but not to allow the cells to pass through. That is, the membrane 3 can also be called a semipermeable membrane.
  • the diameter of the through hole can be, for example, 0.1 ⁇ m or more and 10.0 ⁇ m or less, preferably 1.0 ⁇ m or more and 5.0 ⁇ m or less, and more preferably about 3.0 ⁇ m ⁇ 0.5 ⁇ m.
  • the material for the membrane 3 may be any material that has relatively low toxicity to cells, and may be a natural polymer compound or a synthetic polymer compound.
  • natural polymer compounds include components derived from extracellular matrix that gel, polysaccharides (e.g., alginate, cellulose, dextran, pullulane, polyhyaluronic acid, and derivatives thereof), chitin, poly(3 -hydroxyalkanoates) (especially poly( ⁇ -hydroxybutyrate), poly(3-hydroxyoctanoate)), poly(3-hydroxy fatty acids), fibrin, agar, agarose, etc., but are not limited to these. .
  • polysaccharides e.g., alginate, cellulose, dextran, pullulane, polyhyaluronic acid, and derivatives thereof
  • chitin e.g., alginate, cellulose, dextran, pullulane, polyhyaluronic acid, and derivatives thereof
  • poly(3 -hydroxyalkanoates) especially poly( ⁇ -hydroxybutyrate), poly(3-hydroxyoctanoate)
  • poly(3-hydroxy fatty acids) especially fibrin
  • Extracellular matrix-derived components to be gelled include, for example, collagen (type I, type II, type III, type V, type XI, etc.), mouse EHS tumor extract (type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.) ) reconstituted basement membrane components (trade name: Matrigel), glycosaminoglycans, hyaluronic acid, proteoglycans, gelatin, etc., but are not limited to these.
  • Examples of synthetic polymer compounds include polyphosphazene, poly(vinyl alcohol), polyamide (such as nylon), polyesteramide, poly(amino acid), polyanhydride, polysulfone, polycarbonate, polyacrylate (acrylic resin), and polyamide.
  • Alkylene e.g., polyethylene, etc.
  • polyacrylamide polyalkylene glycol (e.g., polyethylene glycol, etc.), polyalkylene oxide (e.g., polyethylene oxide, etc.), polyalkylene terephthalate (e.g., polyethylene terephthalate, etc.), polyorthoester, polyvinyl ether , polyvinyl ester, polyvinyl halide, polyvinylpyrrolidone, polyester, polysiloxane, polyurethane, polyhydroxy acid (e.g., polylactide, polyglycolide, etc.), poly(hydroxybutyric acid), poly(hydroxyvaleric acid), poly[lactide-co-( Examples include, but are not limited to, poly[glycolide-co-( ⁇ -caprolactone)], poly(hydroxyalkanoate), and copolymers thereof.
  • the cell culture container 10 is produced, for example, by forming a first flow path 1a and a second flow path 2a on a first substrate 1 and a second substrate 2, respectively, using a known method such as lithography. It can be manufactured by bonding the second substrate 2, membrane 3, and first substrate 1 in this order using an adhesive or the like that has relatively low toxicity to cells.
  • ⁇ Second culture step> In the second culture step, using the cell culture container 10, airway epithelial cells A infected with a virus or bacteria are seeded in the first channel 1a, and pulmonary microvascular endothelial cells A are inoculated in the second channel 2a. Cells B are seeded, and airway epithelial cells A and pulmonary microvascular endothelial cells B are co-cultured in the presence of the test substance.
  • virus and bacteria the same ones as exemplified for the above-mentioned inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown can be used, but among them, it is preferable to use a virus, and it is more preferable to use SARS-CoV-2.
  • airway epithelial cells A and pulmonary microvascular endothelial cells B are each filled with a medium, and after the start of co-culture, airway epithelial cells A are supplied with air from the end of the first channel 1a. is injected, and a medium is injected into the pulmonary microvascular endothelial cells B from the end of the second channel 2a to perform co-culture.
  • Examples of the medium for culturing airway epithelial cells A include those commonly used for culturing airway epithelial cells A, such as an airway organoid differentiation medium.
  • the titer of the virus to infect the airway epithelial cells A can be, for example, 0.1 MOI or more and 1.0 MOI or less.
  • airway epithelial cells A are cultured in a medium containing a virus or bacteria with a titer within the above range, and after 1 to 3 hours (preferably 2 hours) have elapsed from the start of co-culturing, the medium is incubated with virus or bacteria.
  • the medium may be replaced with a bacteria-free medium.
  • the medium for culturing the pulmonary microvascular endothelial cells B As the medium for culturing the pulmonary microvascular endothelial cells B, the same medium as described in the screening method according to the first embodiment can be used.
  • the test substance is used by being added to the medium for culturing pulmonary microvascular endothelial cells B at the start of co-culture.
  • Scaffolding materials for pulmonary microvascular endothelial cells B include, for example, collagen (type I, type II, type III, type V, type XI, etc.), gelatin, elastin, proteoglycan, glycosaminoglycan, fibronectin, vitronectin, laminin, pectin. , hyaluronic acid, chitin, chitosan, alginic acid, starch, polyethylene glycol, polydimethylsiloxane, polylactic acid, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyglutamic acid, polyglycolic acid, polycaprolactone, polyacrylic acid, etc., and polymer gels containing them as appropriate.
  • a modified polymer gel may be coated on the bottom surface of the second channel 2a.
  • Co-culture conditions can be, for example, at a temperature of 30° C. or higher and 37° C. or lower and 5% CO 2 .
  • ⁇ Second measurement process> the number of viruses or bacteria in the culture supernatant of pulmonary microvascular endothelial cells is measured.
  • the number of viruses or bacteria can be calculated, for example, by measuring their genome copy numbers by real-time PCR or the like.
  • test substance is evaluated to be an inhibitor of vascular endothelial barrier breakdown when the number of viruses or bacteria is significantly reduced compared to the absence of the test substance.
  • test substance screened by the screening method of the present embodiment can effectively prevent vascular endothelial barrier breakdown caused by viruses (preferably SARS-CoV-2) or bacteria. Therefore, the test substance is expected to be applied as a therapeutic agent to stop the progression of COVID-19 symptoms.
  • the invention provides a method for treating a respiratory tract infection, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of Claudin-5, a nucleic acid encoding Claudin-5, or an inducer of Claudin-5 expression.
  • a method for preventing or treating COVID-19 is provided.
  • the present invention provides the above three substances for use in the prevention or treatment of respiratory infections (preferably COVID-19).
  • the present invention provides the use of the above three substances for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of respiratory infections (preferably COVID-19).
  • Claudin-5 a nucleic acid encoding Claudin-5
  • Claudin-5 expression inducer a nucleic acid encoding Claudin-5
  • SARS-CoV-2 strain B. 1.1.214 and B. 1.617.2 was isolated from a nasopharyngeal swab sample of a novel coronavirus disease-2019 (COVID-19) patient. This study was approved by the Research Ethics Committee of Kyoto University. The virus was grown in TMPRSS2/Vero cells (JCRB1818, JCRB Cell Bank) and stored at -80°C. TMPRSS2/Vero cells were cultured in minimum essential medium (MEM, manufactured by Sigma-Aldrich) supplemented with 5 w/v% fetal bovine serum (FBS) and 1 w/v% penicillin/streptomycin. All virus infection experiments were performed in a biosafety level 3 facility at Kyoto University in strict accordance with regulations.
  • MEM minimum essential medium
  • HMVEC-L Human lung microvascular endothelial cells
  • EGM-2-MV medium Lonza
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • FIG. 2A the lower channel of the polydimethylsiloxane (PDMS) device was first precoated with fibronectin (3 ⁇ g/mL, manufactured by Sigma). HMVEC-L were suspended in EGM2-MV medium at 5 ⁇ 10 6 cells/mL. 10 ⁇ L of cell suspension was injected into the fibronectin-coated bottom channel of the PDMS device. The PDMS device was then turned upside down and incubated for 1 hour.
  • fibronectin 3 ⁇ g/mL, manufactured by Sigma
  • EGM2-MV medium was added to the bottom channel of the device.
  • human airway organoids were isolated and seeded into the upper channel of the device. Specifically, airway organoids (AO) were separated into single cells and suspended in AO differentiation medium at 5 ⁇ 10 6 cells/mL. 10 ⁇ L of cell suspension was injected into the upper channel of the PDMS device. After 1 hour, AO differentiation medium was added to the upper channel. Cells were cultured at 37°C in a humidified atmosphere of 5v/v% CO2 .
  • SARS-CoV-2 In patients with COVID-19, SARS-CoV-2 is present in the blood, and SARS-CoV-2 protein is expressed in many organs, including the respiratory tract.
  • SARS-CoV-2 protein is hardly detected in organs other than the respiratory tract. This is thought to be due to species differences in the distribution of SARS-CoV-2 within the body. Therefore, we considered it desirable to use a human model to investigate the movement of SARS-CoV-2 from the respiratory tract to the blood vessels and the disruption of the endothelial barrier through SARS-CoV-2 infection.
  • the airway-on-a-chip was used to examine the effects of SARS-CoV-2 replicated in airway epithelial cells on vascular endothelial cells.
  • the airway-on-a-chip is a co-culture system for airway epithelial cells and endothelial cells that mimics the dynamic microenvironment in vivo by flowing air and culture medium.
  • organs-on-a-chip technology three-dimensional and dynamic in vitro models can be generated. It can also be used to study interactions between multiple organs (such as the respiratory tract and blood vessels).
  • AO Airway organoid
  • NHBE normal human bronchial epithelial cells
  • NHBE normal human bronchial epithelial cells
  • NHBE normal human bronchial epithelial cells
  • a 50 ⁇ L drop of the cell suspension was solidified in a preheated cell culture-treated multidish (24-well plate; manufactured by Thermo Fisher Scientific) at 37° C. for 10 minutes, and then 500 ⁇ L of growth medium was added to each well.
  • AO was cultured in AO growth medium for 10 days.
  • the expanded AO was cultured in AO differentiation medium for 5 days. Mature AOs were isolated and seeded into PDMS devices prior to SARS-CoV-2 infection experiments.
  • Microfluidic devices were prepared according to previous reports. Briefly, a microfluidic device consists of two layers of microchannels separated by a semipermeable membrane. The microchannel layer was fabricated from pPDMS using a soft lithography method. A PDMS prepolymer (SYLGARD 184, manufactured by Dow Corning) with a ratio of base material and curing agent of 10:1 was poured into a mold configured with an SU-8 2150 (manufactured by MicroChem) pattern formed on a silicon wafer. . The cross-sectional size of the microchannel was 1 mm in width and 330 ⁇ m in height.
  • SARS-CoV-2 infection AO differentiation medium containing SARS-CoV-2 (0.1 MOI) was injected into the upper channel (airway channel) of the airway-on-a-chip. After 2 hours, the medium containing SARS-CoV-2 was replaced with fresh medium.
  • HMVEC-L were infected with 0.1 or 1 MOI SARS-CoV-2 for 120 minutes and then cultured in EGM2-MV medium.
  • RNA sequencing Total RNA was prepared using Rneasy Mini Kit (manufactured by Qiagen). RNA integrity was evaluated using 2100 Bioanalyzer (manufactured by Agilent Technologies). Library preparation was performed using the TruSeq Strand mRNA Sample Prep Kit (Illumina) according to the manufacturer's instructions. Sequencing was performed on an Illumina NextSeq500. fastq files were generated using bcl2fastq-2.20. Adapter sequences and low quality bases were trimmed from raw data reads by Cutadapt ver v3.4.28.
  • the trimmed reads were mapped to the human reference genome sequence (hg38) using STAR ver 2.7.9a29 and GENCODE (Release 36, GRCh38.p13) 30gtf file.
  • Raw counts of protein-encoding genes can be found in the GENCODE gtf file, htseq-count ver. Calculated using 0.13.531.
  • Gene expression levels were determined using Deseq2 v1.30.132 as TPM.
  • RNA lysis buffer 0.U/ ⁇ L SUPERase InRnase Inhibitor (Thermo Fisher Scientific), 2v/v% Triton X-100, 50mM KCl, 100mM Tris-HCl (p H7. 4) and distilled water containing 40 v/v% glycerol) and incubated for 10 minutes at room temperature. The mixture was diluted 10 times with distilled water.
  • Viral RNA was collected using the QuantStudio 1 Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific) using the One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR kit (Perfect Real-Time) (Takara Bio). Quantitated. The primers used in this experiment are shown in the table below. A standard curve was created using SARS-CoV-2 RNA (10 5 copies/ ⁇ L) purchased from Japan Gene Research Institute.
  • Relative quantification of target mRNA levels was performed using the 2- ⁇ CT method or by calculating the copy number of the target transcript from a standard curve generated using known amounts of plasmid containing the target sequence. . Values were normalized to the housekeeping gene glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). PCR primer sequences are shown in the table above.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • HMVEC-L was seeded on a chamber slide (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and cultured in EGM-2-MV medium containing SARS-CoV-2.
  • the resulting cells were fixed with 4v/v% paraformaldehyde, permeabilized with PBS containing 0.3v/v% Triton X-100, and blocked with PBS containing 1w/v% bovine serum albumin.
  • HMVEC-L 3 ⁇ 10 4 cells were seeded in cell culture inserts (for 24-well plates) with a pore size of 3.0 ⁇ m (manufactured by BD Falcon) and incubated for 72 hours.
  • the medium in the upper chamber was replaced with EGM-2-MV medium containing 1 MOI SARS-CoV-2, and transendothelial electrical resistance (TEER) was measured with a Millicell ERS-2 volt-ohmmeter (Merck Millipore).
  • the TEER value was calculated using the following formula.
  • TEER value ⁇ (resistance of experimental well) - (resistance of blank well) ⁇ x 0.32 (membrane area of cell culture insert)
  • HMVEC-L was electroporated with pPB-TRE3G-CLDN-5-V2 and pHL-EF1a-hcPBase-A33 vectors using a NEPA21 electroporator (Nepa Gene), and treated with 1 ⁇ g/mL puromycin ( (manufactured by InvivoGen).
  • the piggyBac-based CLDN5 expression plasmid pPB-TRE3G-CLDN-5-V2 contains human CLDN5 in the multiple cloning site of pPB-TRE3G-MCS(A)-P2AMCS(B)V2 (kindly provided by Dr.
  • Tsuyoshi Maruyama (Waseda University)). It was constructed by inserting a gene (SEQ ID NO: 9; the sequence near the CDS was extracted from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of Genbank accession number NM_001130861.1).
  • [Preparation of human CLDN5 knock-in mouse] A donor vector consisting of a homology arm sequence (2 kb) derived from the mouse genome ligated to both ends of human CLDN5 (GenBank: BC002404.2, SEQ ID NO: 50) was created. Cas9 protein, sgRNA, and donor vector were introduced into mouse ES cells for homologous recombination. ES cells containing human CLDN5 at the appropriate locus were selected by genotyping by PCR and DNA sequencing. ES cells with normal karyotype were introduced into early embryos. The resulting chimeric mouse was crossed with a C57BL/6N mouse to establish a human CLDN5 homozygous knock-in mouse (hCLDN5-KI mouse). For genotyping, DNA fragments were amplified using hCLDN5 knock-in mouse tail genomic DNA and primers (table above) and digested with EagI to confirm genomic DNA containing the human CLDN5 sequence.
  • mice Male, 7-8 weeks old.
  • mice were injected intravenously with 100 ⁇ L of PBS containing 1 g of Evans Blue.
  • mice were perfused with 2mM ethylenediaminetetraacetic acid in PBS, and organs were harvested, minced, and incubated in formamide at 55°C for 48 hours.
  • Eluted Evans blue was quantified by measuring optical density at 620 nm.
  • hCLDN5-KI mice male, 7-8 weeks old were injected with anti-CLDN5 antibody (R9) or control rat IgG (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • R9 or control rat IgG manufactured by Sigma-Aldrich.
  • lungs were harvested from mice and weighed immediately (wet weight).
  • the lungs were dried in an incubator at 60°C for 48 hours, and the dry weight was measured. Pulmonary edema was assessed by calculating the wet weight/dry weight ratio.
  • a transparent flat-bottom non-sterile 96-well plate (Thermo Fisher Scientific) was plated with anti-CLDN5 antibody No. 1 (initial concentration 0.403 ⁇ g/mL diluted to final concentration 1.1 ⁇ g/mL), incubated for 1 hour at room temperature, and then coated with 1 w/v % bovine serum albumin in PBS. Blocked. Samples and standard CLDN5 protein were diluted 2-fold in dilution buffer (0.05 v/v % Tween 20 in PBS) and 100 ⁇ L of sample was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature. After washing three times with washing buffer, 100 ⁇ L of anti-CLDN5 antibody No.
  • a solution containing 2 (initial concentration of 854 ⁇ g/mL was diluted to a final concentration of 0.2 ⁇ g/mL) was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing three times with wash buffer, 100 ⁇ L of biotin-SP-AffiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 711-065-152) was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature. After washing three times with washing buffer, 100 ⁇ L of Pierce High Sensitivity Streptavidin-HRP (Thermo Fisher Scientific, 21130) was added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • TMB substrate solution manufactured by R&D Systems
  • TMB substrate solution manufactured by R&D Systems
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ L of stop solution to each well.
  • the optical density of each sample at 450 nm was measured using TriStar LB 941 (manufactured by Berthold). CLDN5 concentration was calculated from the calibration curve.
  • the virus genome copy number in the culture supernatant of cells infected with airway-on-a-chip SARS-CoV-2 was measured (see FIG. 2B).
  • the viral genome copy number in the airway channel increased and reached a maximum at 4 dpi, whereas the viral genome copy number in the vascular channel started increasing at 3 dpi and reached a maximum at 7 dpi. This suggested that SARS-CoV-2 inoculated from airway channels replicated in airway epithelial cells and entered vascular channels.
  • RNA-seq analysis was performed on HMVEC-L infected with SARS-CoV-2 airway-on-a-chip. HMVEC-L was cultured for 8 days under airway-on-a-chip infection, and HMVEC-L was collected for RNA-seq analysis.
  • SARS-CoV-2 infection up-regulated and down-regulated the 767 and 668 genes by more than two-fold, respectively (see Figure 2C).
  • upregulated genes included innate immune response, inflammation, and viral response related genes (not shown).
  • down-regulated genes included cell adhesion-related genes (see Figure 2D).
  • the top five down-regulated genes in the “plasma membrane adhesion molecule-mediated hemophilia cell adhesion” and “plasma membrane adhesion molecule-mediated cell-cell adhesion” categories were CLDN3, CLDN5, PCDHGB1, PCDHB8, and IGSF9B (see Figure 2E).
  • CLDN5 was the endogenous gene with the highest expression level in uninfected HMVEC-L in the above two categories (see FIG. 2F).
  • CLDN5 was suggested to be a potential causative gene for respiratory vascular barrier breakdown mediated by SARS-CoV-2 infection. Although SARS-CoV-2 does not infect HMVEC-L, the gene expression profile of HMVEC-L can be significantly altered upon contact with SARS-CoV-2.
  • HMVEC-Ls are continuously exposed to high titers of SARS-CoV-2, to induce CLDN5 downregulation, HMVEC-Ls are We expected that continuous exposure to high titers of SARS-CoV-2 secreted from infected airway epithelial cells would be necessary.
  • HMVEC-L were exposed to high titer (1 MOI) of SARS-CoV-2 for 4 consecutive days. This treatment destroyed the HMVEC-L monolayer, suggesting weakening of intercellular adhesion (see FIG. 3B), and a significant decrease in the expression level of CLDN5 was confirmed (see FIGS. 3A and 3C).
  • the medium containing SARS-CoV-2 was allowed to act on HMVEC-L for 4 consecutive days while changing the medium every day, and then the expression level of CLDN5 was measured by qRT-PCR. Determined by analysis.
  • SARS-CoV-2 significantly decreased the expression of CLDN5 at both mRNA and protein levels (see Figures 3C and 3D), whereas the downregulation of VE-cadherin was slight (see Figures 3C and 3D). See 3D. Furthermore, SARS-CoV-2 exposure increased VCAM-1 and ICAM-1 expression levels, but did not change the expression level of IL-6 (see Figure 3C).
  • Immunofluorescence staining showed decreased CLDN5 expression and impaired VE-cadherin-mediated adhesion (see Figure 3E). This was similar to the phenomenon observed in airway-on-a-chip infected with SARS-CoV-2. Immunofluorescence staining also showed that SARS-CoV-2 exposure disrupted and reduced ⁇ -catenin localization at cell junctions (see Figure 3E). Furthermore, phalloidin staining showed that SARS-CoV-2 exposure increased the localization of F-actin along the cell membrane and the distance between cells (see Figure 3E). Consistently, SARS-CoV-2 was able to penetrate the monolayer endothelium (see Figure 3F), and transendothelial electrical resistance was transiently reduced in the presence of SARS-CoV-2 (see Figure 3G).
  • FIG. 3H is a morphological observation image obtained by HE staining the airways and lungs of lung specimens from a healthy person and a severe COVID-19 patient.
  • FIG. 3I is a scatter plot comparing the expression levels of various genes between lung samples from healthy individuals and lung samples from severe COVID-19 patients through RNA-seq analysis.
  • CLDN5 The expression level of CLDN5 was decreased in the lungs of severe COVID-19 patients compared to the lungs of healthy individuals.
  • FIG. 3J shows the relative value of the expression level of each gene in severe COVID-19 patients, when the expression level of each gene in the lung sample of a healthy person is set to 1.
  • lung samples from healthy people and severe COVID-19 patients were tested for vascular endothelial markers VE-Cadherin and PECAM1, and markers specific for lung endothelial cells (aerocytes) that perform gas exchange, HPGD and TBX2.
  • vascular endothelial markers VE-Cadherin and PECAM1 markers specific for lung endothelial cells that perform gas exchange, HPGD and TBX2.
  • UV-SARS-CoV-2 and SARS-CoV-2 increased the expression of inflammatory genes including IL-6, ICAM-1, and VCAM-1 (see Figure 5A).
  • SARS-CoV-2 spike (S) protein did not change the expression of any genes (see Figure 5A). Consistent with these, UV-SARS-CoV-2, but not the spike protein, induced disordered localization of VE-cadherin (see Figure 5B).
  • fluvastatin treatment increases the expression of CLDN5 and suppresses respiratory vascular endothelial barrier breakdown mediated by SARS-CoV-2 exposure.
  • the amount of CLDN5 in serum was 484 pg/mL in mild and moderate COVID-19 patients, but 180 pg/mL in severe COVID-19 patients. Serum CLDN5 concentrations were significantly lower in severe patients than in mild/moderate patients.
  • Example 9 Upregulation of CLDN5 expression by various statin drugs
  • statin drugs fluvastatin, pitavastatin, atorvastatin, cerivastatin, simvastatin, and lovastatin were each allowed to act on HMVEC-L at 10 ⁇ M.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the gene expression level of CLDN5 after 24 hours.
  • control means a drug non-effect group.
  • TGF- ⁇ 2 (5 ng/mL) was added, and the expression level of CLDN5 was measured 24 hours later.
  • HMVEC-L was cultured in a serum-free medium for 15 hours before the action of the TGF- ⁇ inhibitor in order to remove medium components such as growth factors that may affect the action of TGF- ⁇ 2. .
  • FIG. 10 shows the results of the expression level of CLDN5 under each inhibitor, when the expression level of CLDN5 in the "control" in which no TGF- ⁇ inhibitor or TGF- ⁇ 2 was applied was set to 1.
  • the "DMSO” group is a group in which TGF- ⁇ 2 was treated without the action of a TGF- ⁇ inhibitor.
  • statin drugs fluvastatin, pitavastatin, atorvastatin, cerivastatin, simvastatin, and lovastatin
  • TGF vascular endothelial growth factor
  • - ⁇ inhibitors SB525334, R268712, EW-7197, RepSox, TP0427736, A83-01, K02288, were applied at 10 ⁇ M each.
  • the airway channel of the airway-on-a-chip was infected with SARS-CoV-2 (B.1.1.214) at an MOI of 0.1.
  • Figures 11A and 11B show the results of measuring the virus genome copy number contained in the cell culture supernatant of the airway channel and blood vessel channel 8 days after infection.
  • statin drugs or TGF- ⁇ inhibitors when treated with statin drugs or TGF- ⁇ inhibitors, the virus genome contained in the cell culture supernatant was Copy number decreased.
  • SB525334 was applied at 10 ⁇ M to the airway-on-a-chip vascular channel. Thereafter, SARS-CoV-2 was introduced into the airway channel of the airway-on-a-chip.
  • CLDN5 VE-cadherin, inflammatory genes (IL-6, VCAM-1, ICAM-1) and interferon response-related genes (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , ISG15, ISG56, MxA) in cells of vascular channels 8 days after infection ) is shown in FIG. 12.
  • vascular endothelial barrier breakdown can be effectively prevented.
  • First substrate 1a First channel 2: Second substrate 2a: Second channel 3: Membrane 10: Cell culture container A: Airway epithelial cells B: Pulmonary microvascular endothelial cells

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Abstract

血管内皮バリア破綻の阻害剤は、Ｃｌａｕｄｉｎ－５若しくはＣｌａｕｄｉｎ－５をコードする核酸又はＣｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質を有効成分として含有する。

Description

血管内皮バリア破綻の阻害剤及びその使用
　本発明は、血管内皮バリア破綻の阻害剤及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、血管内皮バリア破綻の阻害剤、呼吸器感染症治療用医薬組成物、及び血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法に関する。
　本願は、２０２２年４月８日に、日本に出願された特願２０２２－０６４４８６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　呼吸器感染症では、病原菌又はウイルスが防御機構を乗り超えて気道から体内に侵入及び増殖し、炎症を誘導することで、咳、痰、発熱、胸の痛み、呼吸困難等の症状を引き起こす。重度の呼吸器感染症患者では、血管内皮バリア機能の破綻がしばしば見受けられる。
　一方、２０１９年の終わり頃に発生し、現在でも世界中で感染が拡大している新型コロナウイルス感染症－２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を原因ウイルスとする感染症である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染及び増殖する主な臓器は肺や気道であるが、その後、血管を介して炎症を誘発し、他の臓器へ感染することが知られている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ２）を介して線毛細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞に感染する（例えば、非特許文献１等参照）。一方、血管内皮細胞は、ＡＣＥ２をほとんど発現しないことから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は血管内皮細胞にはほとんど感染しない（例えば、非特許文献２等参照）。血管の内腔を覆う血管内皮細胞は、複数の接着因子によりタイトジャンクションを形成することで互いに強固に接着し、外部からの血管内への病原体等の異物の侵入を防ぐバリア機能を担っている。しかし、ＣＯＶＩＤ－１９の患者では、その他呼吸器感染症患者と同様に、血管内皮バリア機能の破綻がみられる（例えば、非特許文献３等参照）。このバリア機能の破綻は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の呼吸器から他の臓器への血管を介した移動を促進する。さらに、バリア機能の破綻は、免疫細胞や血液成分の肺への浸潤を誘発し、肺炎や急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸不全を誘発する（例えば、非特許文献４等参照）。
Zhu n et al., "Morphogenesis and cytopathic effect of SARS-CoV-2 infection in human airway epithelial cells.", Nat Commun., Vol. 11, Article No. 3910, 2020. Nascimento C J et al., "Recombinant ACE2 Expression Is Required for SARS-CoV-2 To Infect Primary Human Endothelial Cells and Induce Inflammatory and Procoagulative Responses.", mBio, Vol. 11, Issue 6, 2020. Varga Z et al., "Endothelial cell infection and endotheliitis in COVID-19.", Lancet, Vol. 395, Issue 10234, pp. 1417-1418, 2020. Jin Y et al., "Endothelial activation and dysfunction in COVID-19: from basic mechanisms to potential therapeutic approaches.", Signal Transduct Target Ther., Vol. 5, Article No. 293, 2020.
　しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のウイルス又は細菌が血管内皮バリア機能を破綻させるメカニズムは全く明らかとなっておらず、その治療法は未だ開発されていない。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、効果的に血管内皮バリア破綻を防ぐことができる血管内皮バリア破綻の阻害剤、及び、血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、血管内皮バリア機能に重要な役割を担う遺伝子としてＣｌａｕｄｉｎ－５（ＣＬＤＮ５）を同定し、ＣＬＤＮ５を過剰発現させる又はＣＬＤＮ５の発現を誘導する物質を作用させることで肺微小血管内皮細胞において、血管内皮バリア破綻を防げることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　Ｃｌａｕｄｉｎ－５、Ｃｌａｕｄｉｎ－５をコードする核酸又はＣｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質を有効成分として含有する、血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（２）　前記Ｃｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質が、スタチン系化合物である、（１）に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（３）　前記スタチン系化合物が、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトロバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチン及びロバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種である、（２）に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（４）　前記スタチン系化合物が、フルバスタチンである、（２）又は（３）に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（５）　前記Ｃｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質が、ＴＧＦ－β阻害剤である、(１)に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（６）　前記ＴＧＦ－β阻害剤が、ＳＢ５２５３３４、Ｒ２６８７１２、ＥＷ－７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＴＰ０４２７７３６、Ａ８３－０１及びＫ０２２８８からなる群より選択される少なくとも１種である、（５）に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（７）　前記血管内皮バリア破綻がウイルスによるものである、（１）から（６）のいずれか１つに記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（８）　前記ウイルスが、ＳＡＲＳコロナウイルス－２である、（７）に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
（９）　（１）から（８）のいずれか一つに記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含む、呼吸器感染症治療用医薬組成物。
（１０）　被験物質存在下で、肺微小血管内皮細胞を培養した後、前記肺微小血管内皮細胞のＣｌａｕｄｉｎ－５の発現量を測定することを含み、前記Ｃｌａｕｄｉｎ－５の発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に上昇した場合に、前記被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す、血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法。
（１１）　空気を注入できるように構成された第１の流路を含む第１の基板と、前記第１の基板の下層に配置されており、培地を透過し、細胞を透過しない大きさの貫通孔を複数有し、且つ、前記第１の流路の底面を構成するメンブレンと、培地を注入できるように構成されており、平面視で少なくとも一部が前記第１の流路に重なるように構成されており、且つ、天面が前記メンブレンで構成される第２の流路を含み、前記メンブレンの下層に配置された第２の基板と、を積層してなる細胞培養容器を用いて、前記第１の流路に、ウイルス又は細菌を感染させた気道上皮細胞を播種し、前記第２の流路に、肺微小血管内皮細胞を播種して、被験物質存在下で、前記気道上皮細胞と前記肺微小血管内皮細胞を共培養した後、前記肺微小血管内皮細胞の培養上清中の前記ウイルス又は細菌の数を測定することを含み、前記ウイルス又は細菌の数が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少した場合に、前記被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す、血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法。
（１２）　前記ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルス－２である、（１１）に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法。
　上記態様の血管内皮バリア破綻の阻害剤によれば、血管内皮バリアの破綻を防ぐことができる。
本発明の第２実施形態に係るスクリーニング方法で用いられる細胞培養容器の一例を示す概略構成図である。 実施例で用いられたａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの概略構成図である。 実験例１におけるａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの気道チャネル及び血管チャネルの細胞培養上清中のウイルスコピー数の経時変化を示すグラフである。 実験例１におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染していないヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｌ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染したＨＭＶＥＣ－Ｌの間で異なる発現を示す遺伝子の火山プロットである。 実験例１におけるａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染ＨＭＶＥＣ－Ｌに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＨＭＶＥＣ－Ｌの遺伝子オントロジーエンリッチメント解析の結果である。 実験例１におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染ＨＭＶＥＣ－Ｌに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ＨＭＶＥＣ－Ｌで発現が減少した、「原形質膜接着分子を介した同種親和性細胞接着」及び「原形質膜接着分子を介した細胞間接着」に含まれる上位５つの遺伝子の発現量を示すグラフである。 実験例１におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染ＨＭＶＥＣ－Ｌの「原形質膜接着分子を介した同種親和性細胞接着」及び「原形質膜接着分子を介した細胞間接着」に含まれる上位７つの遺伝子の内因性遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例１におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染ＨＭＶＥＣ－ＬのＣＬＤＮファミリーの遺伝子発現量を比較したグラフである。 実験例２におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び非感染のＨＭＶＥＣ－ＬでのＣｌａｕｄｉｎ－５（ＣＬＤＮ５）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、血管細胞接着分子－１（ＶＣＡＭ－１）、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ－１）の遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例２におけるａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐのＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５及びＶＥ－カドヘリンの免疫蛍光染色像である。 実験例３における０．１ＭＯＩ及び１ＭＯＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む培地をＨＭＶＥＣ－Ｌに作用させたときのＣＬＤＮ５の発現量を示すグラフである。 実験例３におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び非感染のＨＭＶＥＣ－Ｌの位相差顕微鏡像である。 実験例３におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び非感染のＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、ＩＬ－６、ＶＣＡＭ－１、及びＩＣＡＭ－１の遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例３におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び非感染のＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５及びＶＥ－カドヘリンのタンパク質発現量を示す画像（左）及びグラフ（右）である。 実験例３におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び非感染のＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、β－カテニン、及びＦ－アクチンの免疫蛍光染色像である。 実験例３におけるＨＭＶＥＣ－Ｌ単層を使用したウイルス透過性アッセイの概略構成図（左）、及び、該アッセイでの上部チャンバーから下部チャンバーに移動したウイルス量の経時的な変化を示すグラフ（右）である。 実験例３におけるＨＭＶＥＣ－Ｌ単層を使用したウイルス透過性アッセイでの経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の経時的な変化を示すグラフである。 健常者の肺検体と重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体について、気道及び肺をＨＥ染色した形態観察画像である。 ＲＮＡ－ｓｅｑ分析により健常者の肺検体と重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体との間で種々の遺伝子の発現量を比較したスキャッタープロットである。 健常人に対する重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。 健常人の肺検体に対する重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体のＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＰＥＣＡＭ１、ＨＰＧＤ、及びＴＢＸ２の発現量を示すグラフである。 健常人の肺検体に対する重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体のＣＬＤＮ５の発現量を、ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＰＥＣＡＭ１、ＨＰＧＤ、ＴＢＸ２で補正した値を示すグラフである。 健常人及び重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体を用いた免疫蛍光染色像である。 実験例４におけるヒトＣＬＤＮ５ホモ接合型ノックインマウス（ｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウス）の各臓器におけるＣＬＤＮ５の遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例４における抗ＣＬＤＮ５抗体又はコントロールＩｇＧを注射したｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウスの各臓器におけるエバンスブルーの検出量を示すグラフである。 実験例４における抗ＣＬＤＮ５抗体又はコントロールＩｇＧを注射したｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウスの各臓器の明視野像である。 実験例４における抗ＣＬＤＮ５抗体又はコントロールＩｇＧを注射したｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウスの肺の明視野像（左）及び肺の湿重量／乾重量比を示すグラフ（右）である。 実験例５におけるスパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＵＶ照射されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）で処理されたＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、ＩＬ－６、ＶＣＡＭ－１、及びＩＣＡＭ－１の遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例５におけるスパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＵＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で処理されたＨＭＶＥＣ－ＬでのＶＥ－カドヘリンの免疫蛍光染色像である。 実験例５におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で処理されたＨＭＶＥＣ－Ｌでのフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）の免疫蛍光染色像（左側）、並びに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の処理及び未処理時ＨＭＶＥＣ－Ｌの核のＦｏｘＯ１の蛍光シグナルを定量化したグラフ（右側）である。 実験例６におけるドキシサイクリン（ＤＯＸ）存在又は非存在のＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５の遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例６におけるＤＯＸ存在又は非存在のａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの気道チャネル及び血管チャネルの細胞培養上清中のウイルスコピー数を示すグラフである。 実験例６におけるＤＯＸ存在又は非存在でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたＨＭＶＥＣ－ＬでのＶＥ－カドヘリンの免疫蛍光染色像である。 実験例６におけるＤＯＸ存在又は非存在でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、ＩＬ－６、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）、インターフェロン刺激遺伝子５６（ＩＳＧ５６）、及びＭｙｘｏｖｉｒｕｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ａ（ＭｘＡ）の遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例７におけるフルバスタチン処理又は未処理のＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５及びＶＥ－カドヘリンの遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例７におけるフルバスタチン存在又は非存在のａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの気道チャネル及び血管チャネルの細胞培養上清中のウイルスコピー数を示すグラフである。 実験例７におけるフルバスタチン存在又は非存在でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたＨＭＶＥＣ－ＬでのＶＥ－カドヘリンの免疫蛍光染色像である。 実験例７におけるフルバスタチン処理又は未処理のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、ＩＬ－６、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ５６、及びＭｘＡの遺伝子発現量を示すグラフである。 実験例８における発症後１週間以内の軽度／中等度、及び、重度のＣＯＶＩＤ－１９患者の血清中のＣＬＤＮ５濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。 実験例９におけるＨＭＶＥＣ－Ｌへのスタチン系薬剤の作用後のＣＬＤＮ５の発現量を示すグラフである。 実験例１０におけるＨＭＶＥＣ－ＬへのＴＧＦ－β阻害剤の作用後のＣＬＤＮ５の発現量を示すグラフである。 実験例１１における血管チャネルに６種類のスタチン系薬剤のいずれかを作用させた後に、気道チャネルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を導入した場合の細胞培養上清中のウイルスゲノムコピー数を示すグラフである。 実験例１１における血管チャネルに７種類のＴＧＦ－β阻害剤のいずれかを作用させた後に、気道チャネルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を導入した場合の細胞培養上清中のウイルスゲノムコピー数を示すグラフである。 実験例１２におけるＴＧＦ－β阻害剤の一つであるＳＢ５２５３３４が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時のＣＬＤＮ５、血管内皮マーカー、及び炎症性マーカーの発現に与える影響をａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐで確認した結果を示すグラフである。
≪血管内皮バリア破綻の阻害剤≫
　本実施形態の血管内皮バリア破綻の阻害剤（以下、単に「本実施形態の阻害剤」と称する場合がある）は、ＣＬＤＮ５若しくはＣＬＤＮ５をコードする核酸又はＣＬＤＮ５発現誘導物質を有効成分として含有する。
　なお、本明細書において、「有効成分として含有する」とは、治療的に有効量のＣＬＤＮ５若しくはＣＬＤＮ５をコードする核酸又はＣＬＤＮ５発現誘導物質を含有することを意味する。なお、ここでいう「治療的に有効な量」とは、望ましい治療措置に従って投与したときに、医師、臨床医、獣医、研究者、又は他の適切な専門家が求める生物学的、医学的効果若しくは応答を誘発するＣＬＤＮ５又はＣＬＤＮ５発現誘導物質の量、又は、ＣＬＤＮ５若しくはＣＬＤＮ５をコードする核酸又はＣＬＤＮ５発現誘導物質及び１種類以上の活性剤の組み合わせの量を意味する。好ましい治療的に有効な量は、呼吸器感染症（特に、ＣＯＶＩＤ－１９）の症状を改善する量である。また、「治療的に有効な量」には、予防に有効な量、すなわち、疾患状態の予防に適する量が包含される。
　本実施形態の阻害剤によれば、血管内皮バリア破綻を効果的に防ぐことができる。そのため、本実施形態の阻害剤は、呼吸器感染症（特に、ＣＯＶＩＤ－１９）の症状の進行を止める治療薬への応用が期待される。また、本実施形態の阻害剤は、血管内皮バリア機能向上剤ということもできる。
　なお、血管内皮バリア破綻は、ウイルス又は細菌等により直接的に、又は、それらが誘導する炎症反応により間接的に引き起こされる。
　血管内皮バリア破綻を引き起こすウイルスとしては、例えば、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等が挙げられるが、これらに限定されない。
　血管内皮バリア破綻を引き起こす細菌としては、例えば、結核菌、炭疽菌、肺炎球菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本実施形態の阻害剤は、上述したウイルス又は細菌等による血管内皮バリア破綻を伴う呼吸器感染症治療薬として好ましく用いられる。中でも、本実施形態の阻害剤は、ウイルスによる血管内皮バリア破綻に対して好ましく適用され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による血管内皮バリア破綻に対してより好ましく適用される。
＜ＣＬＤＮ５＞
　ＣＬＤＮ５は、約２３ｋＤａの４回膜貫通タンパク質である。これまで、血液脳関門の制御に関与していると報告されているが、その他の臓器での機能は全く知られていなかった。発明者らは、後述する実施例に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた気道上皮細胞と共培養させた肺微小血管内皮細胞の網羅的な遺伝子発現解析から、血管内皮バリア機能に重要な役割を担う遺伝子としてＣＬＤＮ５を同定し、本発明を完成するに至った。
　ヒトＣＬＤＮ５のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２４３３３．１（配列番号１）、ＮＰ＿００１３４９９９５．１（配列番号２）、ＮＰ＿００１３４９９９６．１（配列番号３）、ＮＰ＿００３２６８．２（配列番号４）等に開示されている。
　本明細書において、ＣＬＤＮ５には、全長タンパク質及びその断片の両方が含まれる。断片とは、ＣＬＤＮ５の任意の領域を含むポリペプチドであって、且つ、血管内皮バリア破綻の阻害活性を有するものである。なお、血管内皮バリア破綻の阻害活性の有無は、後述するスクリーニング方法を用いて評価することができる。
　また、ＣＬＤＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質として、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、血管内皮バリア破綻の阻害活性を有するタンパク質を用いることもできる。
　（ａ）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１～４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
　ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１個以上１５個以下が好ましく、１個以上１０個以下がより好ましく、１個以上５個以下が特に好ましい。
　また、本実施形態の阻害剤において、ＣＬＤＮ５タンパク質の代わりに、ＣＬＤＮ５をコードする核酸を用いることができる。ＣＬＤＮ５をコードする核酸は、該ＣＬＤＮ５をコードする核酸を含む発現ベクターの形態で好ましく用いられる。
　ヒトＣＬＤＮ５をコードする核酸の塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１３０８６１．１（配列番号５）、ＮＭ＿００１３６３０６６．２（配列番号６）、ＮＭ＿００１３６３０６７．２（配列番号７）、ＮＭ＿００３２７７．４（配列番号８）等に開示されている。ヒトＣＬＤＮ５をコードする塩基配列として具体的には、例えば、配列番号９で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。なお、配列番号９で表されるアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１３０８６１．１のアミノ酸配列（配列番号５）からＣＤＳ付近の配列を抜粋したものである。
　ＣＬＤＮ５をコードする核酸としては、下記（ｃ）～（ｅ）のいずれかの塩基配列を含む配列からなり、且つ、血管内皮バリア破綻の阻害活性を有するタンパク質をコードする核酸を用いることもできる。
　（ｃ）配列番号５～９のいずれかで表される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列；
　（ｄ）配列番号５～９のいずれかで表される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列；
　（ｅ）配列番号５～９のいずれかで表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
　ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上１５個以下がより好ましく、１個以上１０個以下が特に好ましく、１個以上５個以下が最も好ましい。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ　塩化ナトリウム，０．３Ｍ　クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１質量％　Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２質量％のＳＤＳ、２質量％の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
　また、ＣＬＤＮ５をコードする核酸の塩基配列は、導入対象となる動物種（主に、ヒトを含む哺乳動物）における発現のためにコドン最適化されていてもよい。一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される動物種の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される動物種における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス(動物間のコドン使用頻度における差異)は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/に掲載されている「Codon　Usage　Database」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（Nakamura Y et al., “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000”, Nucl Acids Res, vol.28, no.1, p292, 2000.）。特定の生物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge（Aptagen社;Jacobus、PA）等において入手可能である。ＣＬＤＮ５をコードする核酸の塩基配列中の１つ又は複数のコドンは、導入対象となる動物種において、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
　発現ベクターとしては、導入対象（主に、ヒトを含む哺乳動物）由来の培養細胞内、又は導入対象（主に、ヒトを含む哺乳動物）の個体中の細胞内でタンパク質を発現するベクターであれば特に制限されず、プラスミドであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。
　前記プラスミドとしては、例えば、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７２４７号明細書）、ｐＳＶ１６Ｂ（国際公開第９１／０８２９１号）、ｐＣＡＧＧＳ（Niwa K et al., “Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector”, Gene, vol.108, no.2, p193-199, 1991.）、ｐＶＬ１３９２（インビトロジェン社製）、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（各インビトロジェン社製、ストラタジーン社製）、ｐＶＣ０３９６（特表平１１－５１１００９号公報）等が挙げられ、これに限定されない。
　前記ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等由来のウイルスベクターが挙げられ、これに限定されない。また、ウイルスベクターは、ウイルス遺伝子を完全又はほぼ完全に欠失する複製欠失ウイルスベクターであることが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーター、導入対象となる動物（主に、ヒトを含む哺乳動物）の細胞中で作動可能に連結されたマーカー遺伝子、又は種々の調節エレメント等を含んでいてもよい。調節エレメントとしては、例えば、ターミネーター及びエンハンサー等が挙げられる。
　使用される発現ベクター、プロモーター、及び調節エレメントの種類は、導入対象となる動物種及び導入方法に応じて適宜選択すればよい。
＜ＣＬＤＮ５発現誘導物質＞
　ＣＬＤＮ５発現誘導物質としては、該物質の非存在下に対して、該物質の存在下におけるＣＬＤＮ５の発現量が向上するものであればよく、ＣＬＤＮ５の発現を増加させる物質と、ＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質に対する阻害物質が包含される。
　ＣＬＤＮ５の発現を増加させる物質としては、例えば、スタチン系化合物、グルココルチコイド、エストロゲン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、アデノメデュリン、転写因子であるＳＯＸ（ＳＲＹ－ｒｅｌａｔｅｄ　ＨＭＧ－ｂｏｘ）－１８等が挙げられる。
　スタチン系化合物としては、例えば、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号明細書参照）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（ＺＯＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号明細書参照）、アトロバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号明細書参照）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）（特開平５－１７８８４１号公報（米国特許第５，２６０，４４０号明細書）参照）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号明細書参照）、ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，２３１，９３８号明細書参照）、セリバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）（別名リバスタチン（ｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）；米国特許第５，１７７，０８０号明細書参照）、メバスタチン（ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）（コンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）、米国特許第３，９８３，１４０号明細書参照）、ピタバスタチン（ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）（特開平１－２７９８６６号公報（米国特許第５，８５４，２５９号明細書及び米国特許第５，８５６，３３６号明細書）参照）等が挙げられる。中でも、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトロバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチン及びロバスタチンからなる群より選択される１種又は２種以上の組み合わせをＣＬＤＮ５発現誘導物質として用いることで、血管内皮バリアの破綻を阻害することができる。
　グルココルチコイドとしては、例えば、デキタメタゾン（ＣＡＳ　Ｎｏ．５０－０２－２）等が挙げられる。
　エストロゲンとしては、例えば、１７β－エストラジオール（ＣＡＳ　Ｎｏ．５０－２８－２）等が挙げられる。
　ＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質としては、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及びＶＥＧＦシグナル伝達経路に関与する因子、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）等が挙げられ、これらの阻害剤をＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質に対する阻害物質として用いることができる。
　ＦｏｘＯ１阻害剤としては、例えば、ＡＳ１８４２８５６（ＣＡＳ　Ｎｏ．８３５５２０－４８－５）等が挙げられる。
　ＶＥＧＦシグナル阻害剤としては、例えば、ＬＹ－３１７６１５（ＰＫＣβ阻害剤；ＣＡＳ　Ｎｏ．１７０３６４－５７－５）等が挙げられる。
　ＴＮＦ－α阻害剤としては、例えば、Ｈ－１１５２（ＣＡＳ　Ｎｏ．８７１５４３－０７－６）、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ　Ｎｏ．３３１７５２－４７－７）等が挙げられる。
　ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、ＴＧＦ－β受容体（ＡＬＫ５）の阻害剤であるＳＢ５２５３３４（ＣＡＳ　Ｎｏ．３５６５５９－２０－１）、Ｒ２６８７１２（ＣＡＳ　Ｎｏ．８７９４８７－８７－３）、ＥＷ－７１９７（ＣＡＳ　Ｎｏ．１３５２６０８－８２－２）、ＲｅｐＳｏｘ（ＣＡＳ　Ｎｏ．４４６８５９－３３－２）、ＴＰ０４２７７３６（ＣＡＳ　Ｎｏ．２４５９９６３－１７－６）、Ａ８３－０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．９０９９１０－４３－６）、Ｋ０２２８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．１４３１９８５－９２－０）等が挙げられる。これらのＴＧＦ－β阻害剤から選択される１種又は２種以上の組み合わせをＣＬＤＮ５発現誘導物質として用いることで、血管内皮バリアの破綻を阻害することができる。
　加えて、ＴＧＦ－β阻害剤として、さらにＢｉｎｔｒａｆｕｓｐ　Ａｌｆａ（ＣＡＳ　Ｎｏ．１９１８１４９－０１－５）、ＮＩＳ７９３、Ｒｅｍｅｄｉｓｃ、ＨＣＷ９２１８、ＡｄＡＰＴ－００１、ＢＣＡ１０１、ＢＮＣ－１０２１、ＧＳ－１４２３、ＰＦ－０６９５２２２９（ＣＡＳ　Ｎｏ．１８０１３３３－５５－０）、ＳＲＫ－１８１、ＴＳＴ－００５、ＹＬ－１３０２７、Ｓｅｐｒｅｈｖｅｃ、ＺＧＧＳ－１８、６ＭＷ－３５１１、ＡＧＭＢ－１２９、ＡＫ－１３０、ＢＡ１２０１、ＥＳ０１４、ＧＦＨ０１８、ＪＳ２０１、ＳＨＲ－１７０１、ＣＵＥ－４０１、ＮＣＥ－４０１、ＰＬＮ－７５０６８、ＳＯＮ－３０１５、ＳＴＰ３５５、ＴｒｅｘＴＡＭ、ＡＣＥ－１３３２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．７００８７４－７２－２）、ＧＳＫ３８４５０９７、ＩＤＬ－２９６５、ＬＹ３０２２８５９、ＬＹ３２００８８２（ＣＡＳ　Ｎｏ．１８９８２８３－０２－７）が挙げられる。
　また、ＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質の阻害剤としては、ＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等を用いることができる。
　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１塩基対以上２３塩基対以下の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０℃以上９５℃以下程度で約１分程度変性させた後、３０℃以上７０℃以下程度で約１時間以上８時間以下アニーリングさせることにより調製することができる。
　ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
　また、ＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質の阻害剤としては、ＣＬＤＮ５の発現を抑制する物質に特異的に結合する物質を用いることもできる。そのような物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＦＭＯ又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。
　アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
≪呼吸器感染症治療用医薬組成物≫
　本実施形態の呼吸器感染症治療用医薬組成物（以下、単に「本実施形態の医薬組成物」と称する場合がある）は、上述した阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含む。
　本実施形態の医薬組成物は、血管内皮バリア破綻を伴う呼吸器感染症に適用され、血管内皮バリア破綻を効果的に防ぐことができる。そのため、本実施形態の医薬組成物は、呼吸器感染症の症状の進行を止める治療薬への応用が期待される。
　血管内皮バリア破綻を伴う呼吸器感染症としては、例えば、新型コロナウイルス感染症－２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＲＳウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）等のウイルス性呼吸器感染症；結核、炭疽、肺炎球菌感染症等の細菌性呼吸器感染症等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、本実施形態の医薬組成物は、ＣＯＶＩＤ－１９に好ましく適用される。
＜薬学的に許容される担体＞
　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
＜添加剤＞
　本実施形態の医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物は、上述した阻害剤と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　本実施形態の医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよいが、非経口的に使用される剤型が好ましい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、噴霧剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物は、他の治療薬と組合せて、使用してもよい。例えば、上記阻害剤を、抗炎症剤等と組み合わせて使用することで、ＣＯＶＩＤ－１９の症状を軽減しながら、血管内皮バリア機能を修復することができる。
　上記阻害剤と他の治療薬とは、同一の製剤にしてもよく、別々の製剤にしてもよい。また、各製剤は、同一の投与経路で投与してもよく、別々の投与経路で投与してもよい。更に、各製剤は、同時に投与してもよく、逐次的に投与してもよく、一定の時間乃至期間を空けて別々に投与してもよい。一実施態様において、上記阻害剤と他の治療薬とは、これらを包含するキットとしてもよい。
＜投与方法＞
　投与する対象としては、限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、及びそれらの細胞等が挙げられる。中でも、哺乳動物又は哺乳動物細胞が好ましく、ヒト又はヒト細胞が特に好ましい。
　患者への投与は、例えば、髄腔内注射、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行うことができる。
　投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
　医薬組成物の投与量は、上記阻害剤の量として、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．２ｍｇ以上３ｇ以下、好ましくは約２ｍｇ以上３００ｍｇ以下、より好ましくは約２０ｍｇ以上３０ｍｇ以下程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
　非経口的に投与を行う場合は、例えば注射剤の形で一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．３ｍｇ以上１００ｇ以下、好ましくは約３ｍｇ以上１０ｇ以下、より好ましくは約３０ｍｇ以上１ｇ以下程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
≪血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法≫
＜第１実施形態＞
　本発明の第１実施形態に係る血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法（以下、単に「本発明の第１実施形態に係るスクリーニング方法」と称する場合がある）は、被験物質存在下で、肺微小血管内皮細胞を培養（以下、「第１の培養工程」と称する場合がある）した後、前記肺微小血管内皮細胞のＣＬＤＮ５の発現量を測定すること（以下、「第１の測定工程」と称する場合がある）を含み、
　前記ＣＬＤＮ５の発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に上昇した場合に、前記被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す（以下、「第１の評価工程」と称する場合がある）。
　本発明の第１実施形態に係るスクリーニング方法によれば、血管内皮バリア破綻を阻害する物質を容易にスクリーニングすることができる。
＜第１の培養工程＞
　第１の培養工程では、被験物質存在下で、肺微小血管内皮細胞を培養する。
　被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
　被験物質は培地に添加することで、肺微小血管内皮細胞に接触させることができる。
　培地としては、肺微小血管内皮細胞の培養に一般的に用いられるものが挙げられ、例えば、ＥＧＭ－２－ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ社製）等が挙げられる。
　或いは、肺微小血管内皮細胞は、１．０　ＭＯＩ（Multiplicity of Infection）以上の高力価のウイルス、又は、細菌に曝露されたものを用いてもよい。ウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が好ましく用いられる。後述する実施例に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は肺微小血管内皮細胞に感染しないが、肺微小血管内皮細胞の産生するＣＬＤＮ５の発現量を低下させて、血管内皮バリア破綻を引き起こす。
　培養条件としては、例えば、３０℃以上３７℃以下の温度、５％ＣＯ２下で行うことができる。
＜第１の測定工程＞
　第１の測定工程では、上記第１の培養工程の後に回収された肺微小血管内皮細胞におけるＣＬＤＮ５の発現量を測定する。
　ＣＬＤＮ５の発現量は、遺伝子レベル、タンパク質レベルで測定することができる。　遺伝子レベルでの測定は、例えば、リアルタイムＰＣＲ等により行うことができる。　タンパク質レベルでの測定は、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により行うことができる。
＜第１の評価工程＞
　第１の評価工程では、ＣＬＤＮ５の発現量が、被験物質の非存在下と比較して有意に上昇した場合に、被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であると評価する。
　或いは、ウイルス（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）又は細菌に曝露された肺微小血管内皮細胞を用いた場合には、ＣＬＤＮ５の発現量が、ウイルス又は細菌非曝露下と比較して同程度以上である場合に、被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す。
＜第２実施形態＞
　本発明の第２実施形態に係る血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法（以下、単に「本発明の第２実施形態に係るスクリーニング方法」と称する場合がある）は、　空気を注入できるように構成された第１の流路を含む第１の基板と、
　前記第１の基板の下層に配置されており、培地を透過し、細胞を透過しない大きさの貫通孔を複数有し、且つ、前記第１の流路の底面を構成するメンブレンと、
　培地を注入できるように構成されており、平面視で少なくとも一部が前記第１の流路に重なるように構成されており、且つ、天面が前記メンブレンで構成される第２の流路を含み、前記メンブレンの下層に配置された第２の基板と、
を積層してなる細胞培養容器を用いて、
　前記第１の流路に、ウイルス又は細菌を感染させた気道上皮細胞を播種し、前記第２の流路に、肺微小血管内皮細胞を播種して、被験物質存在下で、前記気道上皮細胞と前記肺微小血管内皮細胞を共培養（以下、「第２の培養工程」と称する場合がある）した後、前記肺微小血管内皮細胞の培養上清中の前記ウイルス又は細菌の数を測定すること（以下、「第２の測定工程」と称する場合がある）を含み、
　前記ウイルス又は細菌の数が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少した場合に、前記被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す（以下、「第２の評価工程」と称する場合がある）。
　本発明の第２実施形態に係るスクリーニング方法によれば、血管内皮バリア破綻を阻害する物質を容易にスクリーニングすることができる。また、上記第１実施形態に係るスクリーニング方法において選択された被験物質を、第２実施形態に係るスクリーニング方法でスクリーニングすることでより高い精度で、血管内皮バリア破綻を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
＜細胞培養容器＞
　図１は、本発明の第２実施形態に係るスクリーニング方法で用いられる細胞培養容器の一例を示す概略構成図である。以下、図１を参照しながら、細胞培養容器１０の構成について詳細を説明する。
　細胞培養容器１０は、気道上皮細胞Ａと肺微小血管内皮細胞Ｂを、メンブレン３を介して共培養する系であり、ヒトの肺を再現したマイクロ流体デバイスである。細胞培養容器１０について、発明者らは「ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ」と命名した。細胞培養容器１０は、第２の基板２、メンブレン３及び第１の基板１がこの順に積層してなる。
［第１の基板］
　第１の基板１は、第１の流路１ａを有する。第１の流路１ａは、空気を注入できるように構成されており、気道上皮細胞Ａを培養するためのものである。第１の流路１ａは、底面がメンブレン３で構成されている。第１の流路１ａの断面サイズは、例えば、幅０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下（好ましくは、１．０ｍｍ）、高さ２００μｍ以上４００μｍ以下（好ましくは、３３０μｍ）とすることができる。
［第２の基板］
　第２の基板２は、第２の流路２ａを有する。第２の流路２ａは、培地を注入できるように構成されており、肺微小血管内皮細胞Ｂを培養するためのものである。第２の流路２ａは、平面視で少なくとも一部が第１の流路１ａに重なるように構成されており、且つ、天面がメンブレン３で構成されている。これにより、肺微小血管内皮細胞Ｂは、気道上皮細胞Ａとメンブレン３を介して共培養することができ、気道上皮細胞Ａに感染し、増殖したウイルス又は細菌が、肺微小血管内皮細胞Ｂに移動することができる。
　第２の流路２ａの断面サイズは、例えば、幅０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下（好ましくは、１．０ｍｍ）、高さ２００μｍ以上４００μｍ以下（好ましくは、３３０μｍ）とすることができる。
　第１の基板１及び第２の基板２は、同一の材料で形成されていてもよく、異なる材料で形成されていてもよい。中でも、製造が容易であることから、同一の材料で形成されていることが好ましい。第１の基板１及び第２の基板２を形成する材料としては、通常細胞培養に用いられる細胞への毒性が比較的低い材料であって、且つ、観察の容易性から、透光性を有するものであればよく、例えば、透明なガラス；アクリル樹脂、フッ素樹脂、シリコーンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等の各種ポリマーが挙げられる。これらの材料を単独で使用してもよく、組み合わせて使用してもよい。
［メンブレン］
　メンブレン３は、培地を透過し、細胞を透過しない大きさの貫通孔を複数有する。すなわち、メンブレン３は、半透膜ということもできる。貫通孔の孔径は、例えば、０．１μｍ以上１０．０μｍ以下、好ましくは１．０μｍ以上５．０μｍ以下、より好ましくは３．０μｍ±０．５μｍ程度とすることができる。
　メンブレン３の材料としては、細胞への毒性が比較的低い材料であればよく、天然高分子化合物であってもよく、合成高分子化合物であってもよい。
　天然高分子化合物としては、例えば、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、多糖類（例えば、アルギネート、セルロース、デキストラン、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、ポリヒアルロン酸、及びそれらの誘導体等）、キチン、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（特に、ポリ（β－ヒドロキブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート））、ポリ（３－ヒドロキシ脂肪酸）、フィブリン、寒天、アガロース等が挙げられ、これらに限定されない。ゲル化する細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。
　合成高分子化合物としては、例えば、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ無水物、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン等）、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール等）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド等）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリエチレンテレフタレート等）、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
　細胞培養容器１０は、例えば、第１の基板１及び第２の基板２にそれぞれ第１の流路１ａ及び第２の流路２ａをリソグラフィー法等の公知の方法を用いて形成させた後、第２の基板２、メンブレン３及び第１の基板１の順になるように、細胞への毒性が比較的低い接着剤等を用いて貼り合わせることで製造することができる。
＜第２の培養工程＞
　第２の培養工程では、細胞培養容器１０を用いて、第１の流路１ａに、ウイルス又は細菌を感染させた気道上皮細胞Ａを播種し、第２の流路２ａに、肺微小血管内皮細胞Ｂを播種して、被験物質存在下で、気道上皮細胞Ａと肺微小血管内皮細胞Ｂを共培養する。
　ウイルス及び細菌としては、上記血管内皮バリア破綻の阻害剤において例示されたものと同じものを用いることができるが、中でも、ウイルスを用いることが好ましく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いることがより好ましい。
　共培養開始時は、気道上皮細胞Ａ及び肺微小血管内皮細胞Ｂは、それぞれ培地を満たした状態とし、共培養開始後は、気道上皮細胞Ａには第１の流路１ａの端部から空気を注入し、肺微小血管内皮細胞Ｂには第２の流路２ａの端部から培地を注入して共培養を行う。
　気道上皮細胞Ａを培養する培地としては、気道上皮細胞Ａの培養に一般的に用いられるものが挙げられ、例えば、気道オルガノイド分化培地等が挙げられる。
　気道上皮細胞Ａに感染させるウイルスの力価としては、例えば、０．１　ＭＯＩ以上１．０　ＭＯＩ以下とすることができる。共培養開始時に上記範囲内の力価のウイルス、又は細菌を含む培地で気道上皮細胞Ａを培養し、共培養開始から１時間以上３時間以下（好ましくは２時間）経過後に、培地をウイルス又は細菌を含まない培地に交換してもよい。
　肺微小血管内皮細胞Ｂを培養する培地としては、上記第１実施形態に係るスクリーニング方法で記載されたものと同様のものを用いることができる。被験物質は、共培養開始時に肺微小血管内皮細胞Ｂを培養する培地に添加して用いられる。
　肺微小血管内皮細胞Ｂの足場材として、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、ゼラチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、デンプン、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリアクリル酸等からなるポリマーゲル及びそれらを適宜修飾させてなるポリマーゲルを第２の流路２ａの底面にコートしてもよい。
　共培養条件としては、例えば、３０℃以上３７℃以下の温度、５％ＣＯ２下で行うことができる。
＜第２の測定工程＞
　第２の測定工程では、肺微小血管内皮細胞の培養上清中のウイルス又は細菌の数を測定する。
　ウイルス又は細菌の数は、例えば、リアルタイムＰＣＲ等によりこれらのゲノムコピー数を測定することで算出することができる。
＜第２の評価工程＞
　第２の評価工程では、ウイルス又は細菌の数が、被験物質の非存在下と比較して有意に減少した場合に、被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であると評価する。
　本実施形態のスクリーニング方法でスクリーニングされた被験物質は、ウイルス（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）又は細菌による血管内皮バリア破綻を効果的に防ぐことができる。そのため、該被験物質は、ＣＯＶＩＤ－１９の症状の進行を止める治療薬への応用が期待される。
≪その他の実施形態≫
　一実施形態において、本発明は、Ｃｌａｕｄｉｎ－５、Ｃｌａｕｄｉｎ－５をコードする核酸又はＣｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、呼吸器感染症（好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９）の予防又は治療方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、呼吸器感染症（好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９）の予防又は治療における使用のための上記３種類の物質を提供する。
　一実施形態において、本発明は、呼吸器感染症（好ましくは、ＣＯＶＩＤ－１９）治療用医薬組成物を製造するための上記３種類の物質の使用を提供する。
　上記３種類の物質、すなわち、Ｃｌａｕｄｉｎ－５、Ｃｌａｕｄｉｎ－５をコードする核酸、Ｃｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質にはそれぞれ、上記実施形態と同様のものを使用することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜方法＞
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の準備］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株Ｂ．１．１．２１４及びＢ．１．６１７．２は、新型コロナウイルス感染症－２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）患者の鼻咽頭スワブサンプルから分離した。この研究は、京都大学の研究倫理委員会によって承認された。ウイルスはＴＭＰＲＳＳ２／Ｖｅｒｏ細胞（ＪＣＲＢ１８１８、ＪＣＲＢ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ）で増殖させて、－８０℃で保存した。ＴＭＰＲＳＳ２／Ｖｅｒｏ細胞は、５ｗ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１ｗ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で培養した。全てのウイルス感染実験は、規則に厳密に従って、京都大学のバイオセーフティーレベル３の施設で行われた。
［細胞培養及びａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ］
　ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ－Ｌ）はＬｏｎｚａから入手し、ＥＧＭ－２－ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ社製）で維持した。ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ（図２Ａ参照）を準備するために、最初に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）デバイスの下部の流路をフィブロネクチン（３μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）でプレコートした。ＨＭＶＥＣ－ＬをＥＧＭ２－ＭＶ培地に５×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液をＰＤＭＳデバイスのフィブロネクチンでコーティングされた下部の流路に注入した。次に、ＰＤＭＳデバイスを逆さまにして、１時間インキュベートした。１時間後、デバイスを裏返し、ＥＧＭ２－ＭＶ培地をデバイスの下部の流路に加えた。４日後、ヒト気道オルガノイドを分離し、デバイスの上部の流路に播種した。具体的には、気道オルガノイド（ＡＯ）を単一細胞に分離し、ＡＯ分化培地に５×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液をＰＤＭＳデバイスの上部の流路に注入した。１時間後、ＡＯ分化培地を上部の流路に加えた。細胞は、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。
　ＣＯＶＩＤ－１９患者では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は血中に存在し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は呼吸器を含む多くの臓器で発現する。一方、ＣＯＶＩＤ－１９研究で広く使用されているハムスター及びフェレットでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、呼吸器以外の臓器ではほとんど検出されない。これは、体内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分布の種差によるものと考えられる。したがって、ヒトモデルを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の呼吸器から血管への移動及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を介した内皮バリアの破壊を調査することが望ましいと考えた。そのため、気道上皮細胞で複製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が血管内皮細胞に及ぼす影響を調べるために、上記ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐを使用した。ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐは、気道上皮細胞及び内皮細胞の共培養システムであり、空気と培地を流すことにより、生体内の動的微小環境を模倣している。ｏｒｇａｎｓ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐテクノロジーを使用することにより、３次元で動的なｉｎｖｉｔｒｏモデルを生成することができる。また、複数の臓器（呼吸器や血管など）間の相互作用を研究するためにも使用できる。
［気道オルガノイド（ＡＯ）］
　ＡＯは、以前の報告に従って調製した。簡単に説明すると、正常なヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ、＃ＣＣ－２５４０、Ｌｏｎｚａ社）を使用してＡＯを調製した。ＮＨＢＥを１０ｍｇ／ｍＬの冷マトリゲル成長因子還元基底膜マトリックス（コーニング社製）に懸濁した。細胞懸濁液の５０μＬ滴を、予熱した細胞培養処理マルチディッシュ（２４ウェルプレート;Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で３７℃、１０分間固化させた後、５００μＬの増殖培地を各ウェルに添加した。ＡＯは、ＡＯ増殖培地で１０日間培養した。ＡＯを成熟させるために、増殖したＡＯをＡＯ分化培地で５日間培養した。成熟したＡＯは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染実験の前に、分離され、ＰＤＭＳデバイスに播種した。
［マイクロ流体デバイス］
　マイクロ流体デバイスは、以前の報告に従って調製した。簡単に説明すると、マイクロ流体デバイスは、半透膜で分離された２層のマイクロ流路で構成されている。マイクロ流路層は、ソフトリソグラフィー法を使用してｐＰＤＭＳから製造された。主剤と硬化剤の比率が１０：１のＰＤＭＳプレポリマー（ＳＹＬＧＡＲＤ　１８４、Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を、シリコンウェーハ上に形成されたＳＵ－８　２１５０（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ社製）パターンで構成された型に注いだ。マイクロ流路の断面サイズは、幅１ｍｍ、高さ３３０μｍであった。マイクロ流路に溶剤を導入するために、６ｍｍの生検パンチ（Ｋａｉ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を使用してＰＤＭＳに交通孔を開けた。モルタルとして液体ＰＤＭＳプレポリマーの薄層を使用して、２つのＰＤＭＳ層を３．０μｍの細孔を含む２つの半透性ＰＥＴ膜（＃３５３０９１　Ｆａｌｃｏｎ社製）に結合した。ＰＤＭＳプレポリマーをスライドガラス上にスピンコーティング（４０００ｒｐｍ、６０秒間）した。続いて、上部と下部の両方の流路層をスライドガラス上に配置して、ＰＤＭＳプレポリマーの薄層をエンボス加工されたＰＤＭＳ表面に転写した。次に、半透膜を下層に置き、上層で挟んだ。合わせた層を室温で１日間放置して気泡を除去し、次に６０℃のオーブンに一晩置いてＰＤＭＳ接着剤を硬化させた。ＰＤＭＳデバイスは、細胞培養の前に１時間、紫外線（ＵＶ）光の下に置くことによって滅菌した。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（０．１　ＭＯＩ）を含むＡＯ分化培地を、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの上部の流路（気道流路）に注入した。２時間後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む培地を新しい培地と交換した。内皮細胞単層の感染については、ＨＭＶＥＣ－Ｌを０.１又は１　ＭＯＩ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に１２０分間感染させた後、ＥＧＭ２－ＭＶ培地で培養した。
［ＲＮＡシーケンシング］
　Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、総ＲＮＡを調製した。ＲＮＡの完全性は、２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して評価した。ライブラリの準備は、ＴｒｕＳｅｑストランドｍＲＮＡサンプル準備キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を使用して、製造元の指示に従って実行した。シーケンスはイルミナＮｅｘｔＳｅｑ５００で実行した。ｆａｓｔｑファイルはｂｃｌ２ｆａｓｔｑ－２．２０を使用して生成した。アダプター配列と低品質の塩基は、Ｃｕｔａｄａｐｔ　ｖｅｒ　ｖ３．４．２８によってｒａｗデータの読み取りからトリミングした。トリミングされた読み取りは、ＳＴＡＲ　ｖｅｒ　２．７．９ａ２９とＧＥＮＣＯＤＥ（リリース３６、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）３０ｇｔｆファイルを使用してヒトリファレンスゲノム配列（ｈｇ３８）にマッピングした。タンパク質をコードする遺伝子のｒａｗカウントは、ＧＥＮＣＯＤＥ　ｇｔｆ　ファイルで、ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ　ｖｅｒ．０．１３．５３１を使用して計算した。遺伝子発現レベルは、Ｄｅｓｅｑ２　ｖ１．３０.１３２をＴＰＭとして決定した。
［ウイルスＲＮＡコピー数の定量化］
　細胞培養上清を等量の２×ＲＮＡ溶解バッファー（０．４Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ　ＩｎＲｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、２ｖ／ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、及び４０ｖ／ｖ％グリセロールを含む蒸留水）と混合しし、室温で１０分間インキュベートした。混合物を蒸留水で１０倍に希釈した。ウイルスＲＮＡは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　１　Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＰＬＵＳ　ＲＴ－ＰＣＲキット（パーフェクトリアルタイム）（タカラバイオ社製）を使用して定量した。この実験で使用したプライマーを以下の表に示す。検量線は、日本遺伝子研究所から購入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＲＮＡ（１０５コピー／μＬ）を使用して作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ［定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応］
　ＩＳＯＧＥＮＥ（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製）及びＦａｓｔＧｅｎｅ　ＲＮＡ　Ｂａｓｉｃキット（ＮＩＰＰＯＮ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を使用して、細胞及びマウス組織から総ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）又はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で実行した。標的ｍＲＮＡレベルの相対的定量は、２－ΔΔＣＴ法を使用するか、又は標的配列を含む既知量のプラスミドを使用して作成された標準曲線から標的転写物のコピー数を計算することによって実行した。値は、ハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化された。ＰＣＲプライマー配列を上記表に示す。
［ウエスタンブロット分析］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＥＧＭ－２－ＭＶ培地で培養したＨＭＶＥＣ－Ｌからの全細胞抽出物を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ＰＶＤＦ膜は、ＣＬＤＮ５（４Ｃ３Ｃ２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン）（Ｆ－８、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、又はＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に対する一次抗体と、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートした。免疫反応性バンドは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ４０１０システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用して検出した。
［免疫蛍光及びアクチン染色］
　ＨＭＶＥＣ－Ｌをチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＥＧＭ－２－ＭＶ培地で培養した。得られた細胞を４ｖ／ｖ％パラホルムアルデヒドで固定し、０．３ｖ／ｖ％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳで透過処理し、１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでブロックした。得られた細胞を、ＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、β－カテニン（Ｅ－５、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、及びフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）（Ｃ２９Ｈ４、細胞シグナル伝達）に対する抗体とインキュベートした後、Ａｌｅｘａ、Ｆｌｕｏｒ５５５又は４８８（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と結合した二次抗体とインキュベートした。Ｆ－アクチンはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８　ファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色した。スライドは、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を備えたＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍでマウントし、ＢＺ－Ｘ７００（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で分析した。核のＦｏｘＯ１の蛍光強度はＦｉｊｉ／ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。
［経内皮電気抵抗の測定］
　ＨＭＶＥＣ－Ｌ（３×１０４細胞）を孔径３．０μｍ（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製）の細胞培養インサート（２４ウェルプレート用）に播種し、７２時間インキュベートした。上部チャンバーの培地を１ＭＯＩ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＥＧＭ－２－ＭＶ培地に交換し、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＥＲＳ－２ボルトオームメーター（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で測定した。ＴＥＥＲ値は、以下の式で計算した。
　ＴＥＥＲ値＝｛（実験ウェルの抵抗）－（ブランクウェルの抵抗）｝×０．３２（細胞培養インサートの膜面積）
［ヒトＣＬＤＮ５を発現するＨＭＶＥＣ－Ｌの調製］
　ＨＭＶＥＣ－Ｌは、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（Ｎｅｐａ　Ｇｅｎｅ社製）を使用して、ｐＰＢ－ＴＲＥ３Ｇ－ＣＬＤＮ－５－Ｖ２及びｐＨＬ－ＥＦ１ａ‐ｈｃＰＢａｓｅ－Ａ３３ベクターでエレクトロポレーションし、１μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）で選択した。ｐｉｇｇｙＢａｃベースのＣＬＤＮ５発現プラスミドｐＰＢ－ＴＲＥ３Ｇ－ＣＬＤＮ－５－Ｖ２は、ｐＰＢ－ＴＲＥ３Ｇ－ＭＣＳ（Ａ）－Ｐ２ＡＭＣＳ（Ｂ）Ｖ２（丸山剛（早稲田大学）博士からの提供）のマルチクローニングサイトにヒトＣＬＤＮ５遺伝子（配列番号９；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１３０８６１．１のアミノ酸配列（配列番号５）からＣＤＳ付近の配列を抜粋したもの）を挿入することによって構築した。
［ヒトＣＬＤＮ５ノックインマウスの作製］
　ヒトＣＬＤＮ５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ００２４０４．２、配列番号５０）の両端に結合されたマウスゲノムに由来する相同性アーム配列（２ｋｂ）からなるドナーベクターを作製した。Ｃａｓ９タンパク質、ｓｇＲＮＡ、及びドナーベクターを相同組換えのためにマウスＥＳ細胞に導入した。適切な遺伝子座にヒトＣＬＤＮ５を含むＥＳ細胞を、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシングによるジェノタイピングによって選択した。核型が正常なＥＳ細胞を初期胚に導入した。生まれたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスと交配させて、ヒトＣＬＤＮ５ホモ接合型ノックインマウス（ｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウス）を樹立した。ジェノタイピングでは、ｈＣＬＤＮ５ノックインマウスの尾部のゲノムＤＮＡとプライマー（上記表）を使用して、ＤＮＡ断片を増幅し、ＥａｇＩで消化してヒトＣＬＤＮ５配列を含むゲノムＤＮＡを確認した。
［血管透過性アッセイ（マイルズアッセイ）］
　ｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウス（雄、７～８週齢）に２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＬＤＮ５抗体（Ｒ９）１４又は対照ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を静脈内投与した。１時間後、マウスに１ｇのエバンスブルーを含む１００μＬのＰＢＳを静脈内注射した。３０分後、マウスに２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むＰＢＳを灌流し、臓器を採取して細かく切り刻み、ホルムアミド中で５５℃、４８時間インキュベートした。溶出されたエバンスブルーは、６２０ｎｍでの光学密度を測定することによって定量した。
［肺の湿重量／乾重量比の定量化］
　ｈＣＬＤＮ５－ＫＩマウス（雄、７～８週齢）に抗ＣＬＤＮ５抗体（Ｒ９）又は対照ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を注射した。注射の１時間半後、マウスから肺を採取し、すぐに体重を測定した（湿重量）。次に、肺をインキュベーター内で６０℃、４８時間乾燥させ、乾燥重量を測定した。肺水腫は、湿重量／乾重量の比率を計算することによって評価した。
［ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清ＣＬＤＮ５レベルの測定］
　本研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、京都大学大学院及び医学部倫理委員会（Ｒ２３７９－３）の承認を得て実施した。インフォームドコンセントは、教育機関のＷｅｂサイトのオプトアウトフォームの形式で取得した。組織倫理委員会は、このインフォームドコンセント計画を承認した。この研究では、京都大学医学部附属病院に紹介されたＣＯＶＩＤ－１９患者からのアーカイブされた残留血清サンプルを使用した。これらの臨床検体は、疾患進行の新規バイオマーカーを特定するための将来の研究のために以前にアーカイブされていたが、現在の研究のために再利用した。患者の重症度は、２０２０年５月２７日にリリースされたＣＯＶＩＤ－１９の臨床管理に関するＷＨＯガイダンス（https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/332196/WHO-2019-nCoV-clinical-2020.5-eng.pdf？sequence=1＆isAllowed=y）で使用されている基準に従って定義された。
　透明な平底免疫非滅菌９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を抗ＣＬＤＮ５抗体Ｎｏ．１（初濃度０．４０３μｇ／ｍＬを、終濃度１．１μｇ／ｍＬに希釈して使用）を含む溶液でコーティングし、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳを含む１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンでブロックした。サンプルと標準ＣＬＤＮ５タンパク質を希釈バッファー（ＰＢＳ中０．０５ｖ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で２倍に希釈し、１００μＬのサンプルを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで３回洗浄した後、１００μＬの抗ＣＬＤＮ５抗体Ｎｏ．２（初濃度８５４μｇ／ｍＬを、終濃度０．２μｇ／ｍＬに希釈して使用）を含む溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで３回洗浄した後、１００μＬのビオチン－ＳＰ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、７１１－０６５－１５２）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで３回洗浄した後、１００μＬのＰｉｅｒｃｅ　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、２１１３０）を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄バッファーで３回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ基質溶液（Ｒ＆Ｄシステム社製）を基質として各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの停止溶液を加えることにより反応を停止した。次に、ＴｒｉＳｔａｒ　ＬＢ　９４１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を使用して、４５０ｎｍでの各サンプルの光学密度を測定した。ＣＬＤＮ５濃度は検量線から計算した。
［統計分析］
　データは平均値±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表した。正規性は、シャピロ－ウィルク検定を使用してテストした。正規分布のサンプルの場合、ｐ値は、対応なしｔ検定、マンホイットニーＵ検定、一元又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くＴｕｋｅｙ検定、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、又はシダック補正を使用して計算した。全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ　９ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｉｎｃ．）を使用して実行した。平均の差の統計的有意性は、図の凡例に示されているテストを使用して決定した。
＜結果＞
［実験例１］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した血管内皮バリア破綻の原因遺伝子の調査）
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の呼吸器から血管への移動、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を介した内皮バリア破綻を模倣するために、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐを使用した（図２Ａ参照）。ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐは、気道上皮細胞（線毛細胞、クラブ細胞、ゴブレット細胞、基底細胞）とＨＭＶＥＣ－Ｌで構成されている。気道チャネル及び血管チャネルにそれぞれ空気及び培地を流すことにより、インビボ気道微小環境を模倣する機械的刺激を与えることが可能である。ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた細胞の培養上清中のウイルスゲノムコピー数を測定した（図２Ｂ参照）。気道チャネルのウイルスゲノムコピー数は増加し、４ｄｐｉで最大に達したが、血管チャネルのウイルスゲノムコピー数は３ｄｐｉで増加し始め、７ｄｐｉで最大に達した。これは、気道チャネルから接種されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が気道上皮細胞で複製し、血管チャネルに侵入することを示唆した。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を介した血管バリア破綻の原因遺伝子を検索するために、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＨＭＶＥＣ－ＬでＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った。ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐで感染させた状態で８日間培養し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析のためにＨＭＶＥＣ－Ｌを回収した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、７６７及び６６８遺伝子をそれぞれ２倍以上アップレギュレーション及びダウンレギュレーションした（図２Ｃ参照）。エンリッチメント分析では、アップレギュレーションされた遺伝子には自然免疫応答、炎症、及びウイルス応答関連遺伝子が含まれた（図示せず）。一方ダウンレギュレーションされた遺伝子には細胞接着関連遺伝子が含まれた（図２Ｄ参照）。「原形質膜接着分子を介した血友病細胞接着」及び「原形質膜接着分子を介した細胞間接着」カテゴリーに含まれる上位５つのダウンレギュレートされた遺伝子は、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ５、ＰＣＤＨＧＢ１、ＰＣＤＨＢ８、及びＩＧＳＦ９Ｂであった（図２Ｅ参照）。このうち、ＣＬＤＮ５は、上記２つのカテゴリーにおいて、非感染ＨＭＶＥＣ－Ｌで最も発現量が多い内因性遺伝子であった（図２Ｆ参照）。
　加えて、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの非感染のＨＭＶＥＣ－ＬについてＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った結果からＣＬＤＮファミリーの遺伝子発現量を比較したところ、ＣＬＤＮ５の発現量（ＴＰＭ値）が最も多かった（図２Ｇ参照）。
　従って、ＣＬＤＮ５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を介した呼吸器血管バリア破綻の潜在的な原因遺伝子となることが示唆された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＨＭＶＥＣ－Ｌに感染しないが、ＨＭＶＥＣ－Ｌの遺伝子発現プロファイルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との接触によって大幅に変化する可能性がある。
［実験例２］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による肺微小血管内皮細胞におけるＣＬＤＮ５の発現抑制）
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を介した呼吸器血管バリア崩壊をさらに調査するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染したａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐから分離されたＨＭＶＥＣ－ＬにおけるＣＬＤＮ５を含む密着結合関連遺伝子の発現を分析した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータと一致して、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＣＬＤＮ５発現レベルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって減少したことを示した（図２Ｈ参照）。一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、ＶＥ－カドヘリンの発現レベルを変化させなかったが、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１等の炎症性遺伝子の発現レベルを増加させた（図２Ｈ参照）。
　さらに、免疫蛍光染色は、ＨＭＶＥＣ－Ｌ間の接合部でのＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションを示した（図２Ｉ）。興味深いことに、ＶＥ－カドヘリン染色は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、ＶＥ－カドヘリン発現に変化を与えないが、ＶＥ－カドヘリンを介するアドヘレンスジャンクション（接着結合）を引き裂き、ＨＭＶＥＣ－Ｌ間に自由空間を形成することを示した。
　これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染がＨＭＶＥＣ－ＬにおけるＣＬＤＮ５発現を減少させ、ＶＥ－カドヘリン局在を変化させたことを示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がタイトジャンクション（密着結合）とアドヘレンスジャンクション（接着結合）の両方を破壊することによって、呼吸内皮バリア機能を制御することが示唆された。
［実験例３］
（感染した気道上皮細胞とは無関係な、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介したＣＬＤＮ５発現の減少）
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染したａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐのＨＭＶＥＣ－ＬでのＣＬＤＮ５発現の減少が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は気道上皮細胞に由来する他の分泌分子との接触によって引き起こされたかどうかを調査するために、ＨＭＶＥＣ－Ｌ単層での感染実験を実施した。ＨＭＶＥＣ－Ｌが０．１ＭＯＩ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された場合、ＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションは観察されなかった（図３Ａ参照）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染したａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐのＨＭＶＥＣ－Ｌは高力価のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に継続的にさらされるため、ＣＬＤＮ５のダウンレギュレーションを引き起こすには、ＨＭＶＥＣ－Ｌを、感染した気道上皮細胞から分泌された高力価のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に継続的に曝露する必要があると予想した。
　この仮説を検証するために、ＨＭＶＥＣ－Ｌを高力価（１ＭＯＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に４日間連続して曝露した。この処理はＨＭＶＥＣ－Ｌ単層を破壊し、細胞間接着の弱体化を示唆するとともに（図３Ｂ参照）、有意にＣＬＤＮ５の発現量の低下が確認された（図３Ａ，図３Ｃ参照）。
　なお、０．１ＭＯＩ、１ＭＯＩのいずれの場合も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む培地を日毎に培地交換しつつ、４日間連続でＨＭＶＥＣ－Ｌに作用させ、その後にＣＬＤＮ５の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ分析により測定した。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方でＣＬＤＮ５の発現を有意に減少させたが（図３Ｃ及び図３Ｄ参照）、ＶＥ－カドヘリンのダウンレギュレーションはわずかであった（図３Ｃ及び図３Ｄ参照。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露はＶＣＡＭ－１及びＩＣＡＭ－１発現レベルを増加させたが、ＩＬ－６の発現レベルを変化させなかった（図３Ｃ参照）。
　免疫蛍光染色は、ＣＬＤＮ５発現の減少とＶＥ－カドヘリンを介した接着の障害を示した（図３Ｅ参照）。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染したａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐで観察された現象と類似していた。また、免疫蛍光染色はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露が細胞結合でのβ－カテニン局在化を破壊及び減少させたことを示した（図３Ｅ参照）。さらに、ファロイジン染色は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露が細胞膜に沿ったＦ－アクチンの局在と細胞間の距離を増加させることを示した（図３Ｅ参照）。一貫して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は単層内皮を突破することができ（図３Ｆ参照）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で経内皮電気抵抗は一時的に減少した（図３Ｇ参照）。
　これらの結果は、豊富なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への継続的な曝露が、感染した気道上皮細胞とは無関係に、ＨＭＶＥＣ－ＬにおけるＣＬＤＮ５のダウンレギュレーションとＶＥ－カドヘリンを介した細胞結合の破壊を引き起こすことを示した。
　以上、細胞レベルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＣＬＤＮ５のダウンレギュレーションを示す結果について詳述したが、以下のように、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体からも同様の結果が得られた。
　まず、図３Ｈは、健常者の肺検体と重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体について、気道及び肺をＨＥ染色した形態観察画像である。
　重症ＣＯＶＩＤ－１９患者においては、肺胞や気道などの構造がすべて潰れてしまっている様子が観察された。加えて、高度な繊維化及び免疫細胞の湿潤も確認された。
　図３Ｉは、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析により健常者の肺検体と重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体との間で種々の遺伝子の発現量を比較したスキャッタープロットである。
　健常者の肺に対して、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺ではＣＬＤＮ５の発現量が減少していた。
　さらに、健常人及び重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体についてもｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行ったところ、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者では健常人よりもＣＬＤＮ５の発現量が低下していることが明らかになった（図３Ｊ参照）。図３Ｊには、健常人の肺検体の各遺伝子の発現量を１としたときの重症ＣＯＶＩＤ－１９患者における各遺伝子の発現量の相対値が示されている。
　加えて、健常人及び重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体について、血管内皮マーカーであるＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＰＥＣＡＭ１と、ガス交換を行う肺の内皮細胞（ａｅｒｏｃｙｔｅｓ）に特異的なマーカーであるＨＰＧＤ及びＴＢＸ２の発現量をＲＮＡ－ｓｅｑ分析により確認したところ、各遺伝子について、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者における発現量は、健常人の発現量よりも少なかった（図３Ｋ）。
　また、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析により明らかになったＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＰＥＣＡＭ１、ＨＰＧＤ、ＴＢＸ２の各発現量でＣＬＤＮ５の発現量を補正したところ、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体では、健常人の肺検体に比して、ＣＬＤＮ５の発現量が低下していた（図３Ｌ）。
　さらに、健常人及び重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺検体を用いた免疫蛍光染色でも、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺ではＣＬＤＮ５がほとんど確認できなかった（図３Ｍ）。
［実験例４］
（ＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションによる、肺でのより深刻な血管漏出の誘発）　インビボでの血管漏出に対するＣＬＤＮ５の急性機能障害の影響を調査するために、抗体を介した機能喪失試験を実施した。霊長類ＣＬＤＮ５の細胞外ドメインに特異的に結合し、サルの脳でその機能を阻害するＣＬＤＮ５に対する十分に特徴づけられた抗体をこれまでに製造し、報告している。この抗体をマウスに適用するために、ヒトＣＬＤＮ５ノックインマウスを樹立した。マウスでは、ＣＬＤＮ５の発現は他の臓器と比較して肺で最も高く（図４Ａ参照）、データベース（ＣＬＤＮ５トランスクリプトミクスデータ－Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｔｌａｓ）に示されているヒトの臓器での発現パターンと類似していた。ＣＬＤＮ５抗体の静脈内注射は、肺ではエバンスブルー（アルブミンに結合し、高分子として振る舞う）の血管外漏出を誘発したが、他の臓器では誘発されなかった（図４Ｂ及び図４Ｃ参照）。さらに、ＣＬＤＮ５抗体は肺水腫を誘発し、肺の湿重量／乾重量比を増加させた（図４Ｄ参照）。これは、ＣＬＤＮ５機能の喪失が、特に肺に重度の血管漏出と浮腫を誘発することを示しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を介したＣＬＤＮ５のダウンレギュレーションが、ＣＯＶＩＤ－１９患者の血管内皮バリア破綻の重要な原因の１つであることを示唆した。
［実験例５］
（肺微小血管内皮細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介したＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションのメカニズム）
　ＨＭＶＥＣ－ＬのＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が必要かどうかを調べるために、ＨＭＶＥＣ－Ｌ単層を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、紫外線照射により宿主細胞での増殖力が欠如したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、及び組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質に曝露した。ＵＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方においてＣＬＤＮ５の発現が減少したが、ＶＥ－カドヘリンの発現は減少しなかった（図５Ａ参照）。さらに、ＵＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＩＬ－６、ＩＣＡＭ－１、及びＶＣＡＭ－１を含む炎症性遺伝子の発現を増加させた（図５Ａ参照）。一方、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質は、どの遺伝子の発現も変化させなかった（図５Ａ参照）。これらと一致して、スパイクタンパク質ではなく、ＵＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＶＥ－カドヘリンの無秩序な局在化を誘発した（図５Ｂ参照）。
　これらの結果から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製が、ＨＭＶＥＣ－ＬのＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーション及び血管内皮バリア崩壊に必須ではなく、またスパイクタンパク質だけではそれらを誘導できないことが示された。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露によるＣＬＤＮ５　ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の減少のメカニズムを解明するために、ＣＬＤＮ５の発現を制御する転写因子の分析を試みた。以前の報告では、転写因子であるフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）が、細胞質から核に移行することによってＣＬＤＮ５の発現を抑制することが示されていた。ＦｏｘＯ１がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介したＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションに関与しているかどうかを調べるために、免疫蛍光染色を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露が核に移行するＦｏｘＯ１の量を増加させることが明らかとなった（図５Ｃ参照）。　以上のことから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介したＣＬＤＮ５発現のダウンレギュレーションは、核に局在するＦｏｘＯ１の量の増加によって引き起こされることが示された。
［実験例６］
（ＣＬＤＮ５の過剰発現によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した血管内皮バリア破綻の抑制）
　外因性ＣＬＤＮ５の発現がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘発性呼吸器血管内皮バリア破綻を阻害するかどうかを調べるために、ｐｉｇｇｙＢａｃシステムを使用してドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ＣＬＤＮ５ベクターをトランスフェクトすることにより、ヒトＣＬＤＮ５発現ＨＭＶＥＣ－Ｌ（ＨＭＶＥＣ－Ｌ－ＣＬＤＮ５）を確立した。ＤＯＸ処理によりＨＭＶＥＣ－Ｌ－ＣＬＤＮ５におけるＣＬＤＮ５の発現量を増加できることを確認した（図６Ａ参照）。重要なことに、ＣＬＤＮ５の過剰発現は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の血管チャネルへの侵入（図６Ｂ参照）及びＶＥ－カドヘリンを介した付着接合部の破壊（図６Ｃ参照）を防いだ。これらの結果は、ＨＭＶＥＣ－Ｌにおける外因性ＣＬＤＮ５の発現が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した血管内皮バリア破綻を抑制することを示唆した。さらに、外因性ＣＬＤＮ５の発現は、ＶＥ－カドヘリンの発現を変化させなかったが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した炎症反応性遺伝子（ＩＬ－６、ＩＣＡＭ－１、及びＶＣＡＭ－１）並びに自然免疫関連遺伝子の誘導を抑制した（図６Ｄ参照）。
　これらの結果から、ＣＬＤＮ５の過剰発現が、呼吸器血管内皮バリアを保護することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した内皮炎症を抑制することを示唆した。
［実験例７］
（フルバスタチン治療によるＣＬＤＮ５の発現のアップレギュレート及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した血管内皮バリア破綻の抑制）
　スタチン系薬剤の１つであるシンバスタチンは、肺動脈ＥＣでのＣＬＤＮ５発現を増加させることによって急性肺損傷を軽減することが報告されている。フルバスタチン処理がＣＬＤＮ５発現を増加させるかどうかを調べるために、ＨＭＶＥＣ－Ｌをフルバスタチンで処理し、ＣＬＤＮ５発現を分析した（図７Ａ参照）。フルバスタチン治療はＣＬＤＮ５の発現レベルを増加させた。重要なことに、フルバスタチン治療は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の血管チャネルへの侵入（図７Ｂ参照）及びＶＥ－カドヘリン媒介性付着接合部の破壊（図７Ｃ参照）を部分的に防止した。さらに、フルバスタチン治療はＣＬＤＮ５の発現を増加させ、炎症性遺伝子（ＩＬ－６、ＩＣＡＭ－１、及びＶＣＡＭ－１）並びに自然免疫関連遺伝子の誘導を抑制した（図７Ｄ参照）。
　以上のことから、フルバスタチン治療はＣＬＤＮ５の発現を増加させ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露を介した呼吸器血管内皮バリア破綻を抑制することが示された。
［実験例８］
（ＣＯＶＩＤ－１９患者における血清中ＣＬＤＮ５量）
　ＣＯＶＩＤ－１９とＣＬＤＮ５の関係を調べるために、重症度の異なるＣＯＶＩＤ－１９患者の血清中のＣＬＤＮ５濃度を測定した（図８参照）。ＣＬＤＮ５の主な供給源は血管内皮細胞であるため、血清中のＣＬＤＮ５の量は、血管内皮細胞におけるＣＬＤＮ５の発現レベルと相関していると考えられる。ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐを使用した分析では、感染後４日以内にＨＭＶＥＣ－ＬのＣＬＤＮ５発現が有意に減少したことが示された。この結果を踏まえて、発症直後（１週間以内）にＣＯＶＩＤ－１９患者のＣＬＤＮ５濃度を測定した。血清中のＣＬＤＮ５の量は軽度及び中等度のＣＯＶＩＤ－１９患者で４８４ｐｇ／ｍＬであったが、重度のＣＯＶＩＤ－１９患者では１８０ｐｇ／ｍＬであった。血清中のＣＬＤＮ５濃度は重症患者では軽度／中等度の患者よりも有意に低かった。
［実験例９］
　（種々のスタチン系薬剤によるＣＬＤＮ５の発現のアップレギュレート）
　スタチン系薬剤として、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトロバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチン、及びロバスタチンをそれぞれ、１０μＭでＨＭＶＥＣ－Ｌに作用させた。２４時間後に、ＣＬＤＮ５の遺伝子発現量を測定した結果が図９である。なお、図９において「対照」は薬剤非作用群を意味する。
　図９に示すように、上記６種類のスタチン系薬剤を作用させた系ではいずれも、「対照」に比して、ＣＬＤＮ５の発現量が上昇した。このことから、スタチン系薬剤を用いて、呼吸器血管内皮バリア破綻を抑制できることが明らかになった。
［実験例１０］
　（ＴＧＦ－β阻害剤によるＣＬＤＮ５の発現のアップレギュレート）
　ＴＧＦ－β阻害剤として、ＳＢ５２５３３４、Ｒ２６８７１２、ＥＷ－７１９７、ＲｅｐＳｏｘ（ＣＡＳ　Ｎｏ．４４６８５９－３３－２）、ＴＰ０４２７７３６（ＣＡＳ　Ｎｏ．２４５９９６３－１７－６）、Ａ８３－０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．９０９９１０－４３－６）、Ｋ０２２８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．１４３１９８５－９２－０）をそれぞれ、１０μＭでＨＭＶＥＣ－Ｌに作用させた。
　その後、ＴＧＦ－β２（５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、２４時間後にＣＬＤＮ５の発現量を測定した。このとき、ＴＧＦ－β２の作用に影響を及ぼす可能性のある成長因子などの培地成分を除去すべく、ＴＧＦ－β阻害剤の作用前１５時間は血清を含まない培地でＨＭＶＥＣ－Ｌを培養した。
　ＴＧＦ－β阻害剤及びＴＧＦ－β２を作用させなかった「対照」におけるＣＬＤＮ５の発現量を１としたときの各阻害剤下でのＣＬＤＮ５の発現量の結果が図１０である。なお、「ＤＭＳＯ」の群は、ＴＧＦ－β阻害剤を作用させず、ＴＧＦ－β２を作用させた群である。
　図１０の「ＤＭＳＯ」から分かるように、ＴＧＦ－β２を作用させた場合、ＣＬＤＮ５の発現量が大幅に減少した。
　これに対し、ＴＧＦ－β阻害剤及びＴＧＦ－β２を作用させた群では、ＣＬＤＮ５の発現量の減少が有意に抑制された。
　以上の実験例１０から、ＴＧＦ－β阻害剤を用いることで、ＴＧＦ－β２の作用によるＣＬＤＮ５の発現抑制を防止できることが明らかになった。
［実験例１１］
　（スタチン系薬剤及びＴＧＦ－β阻害剤による血管内皮バリア破綻の抑制）
　スタチン系薬剤及びＴＧＦ－β阻害剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染による血管内皮バリア破綻に与える影響を、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐを用いて評価した。
　具体的には、まず、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの血管チャネルに、上述の６種類のスタチン系薬剤（フルバスタチン、ピタバスタチン、アトロバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチン、及びロバスタチン）又は上述の７種類のＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ５２５３３４、Ｒ２６８７１２、ＥＷ－７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＴＰ０４２７７３６、Ａ８３－０１、Ｋ０２２８８）をそれぞれ１０μＭで作用させた。
　また、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの気道チャネルに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｂ．１．１．２１４）を０．１ＭＯＩで感染させた。
　感染８日後に、気道チャネル及び血管チャネルの細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムコピー数を測定した結果が図１１Ａ及び図１１Ｂである。
　図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、スタチン系薬剤又はＴＧＦ－β阻害剤を作用させることで、これらを作用させなかった「対照」群に比して、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムコピー数が減少した。この結果から、スタチン系薬剤又はＴＧＦ－β阻害剤を用いることで、血管内皮バリア破綻を阻害でき、ウイルスの通過を抑制できることが明らかになった。
［実験例１２］
　（ＴＧＦ－β阻害剤ＳＢ５２５３３４の作用によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時の炎症抑制効果）
　本実験例では、ＴＧＦ－β阻害剤の一つであるＳＢ５２５３３４が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時の血管における血管内皮マーカーや炎症性マーカーの発現に与える影響を、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐを用いて評価した。
　具体的には、まず、ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの血管チャネルにＳＢ５２５３３４を１０μＭで作用させた。その後、当該ａｉｒｗａｙ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐの気道チャネルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を導入した。
　感染８日後の血管チャネルの細胞におけるＣＬＤＮ５、ＶＥ－カドヘリン、炎症性遺伝子（IL-6, VCAM-1、ICAM-1）及びインターフェロン応答関連遺伝子（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＳＧ１５、ＩＳＧ５６，ＭｘＡ）の各発現量を測定した結果が図１２である。
　図１２に示すように、ＳＢ５２５３３４を作用させた場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって抑制された（ＤＷ：蒸留水の結果を参照）ＣＬＤＮ５の発現量を回復させることができた。また、ＳＢ５２５３３４を作用させることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による炎症性遺伝子及びインターフェロン応答関連遺伝子の発現上昇が抑制された。
　本実施形態の血管内皮バリア破綻の阻害剤によれば、血管内皮バリア破綻を効果的に防ぐことができる。
　１：第１の基板
　１ａ：第１の流路
　２：第２の基板
　２ａ：第２の流路
　３：メンブレン
　１０：細胞培養容器
　Ａ：気道上皮細胞
　Ｂ：肺微小血管内皮細胞

Claims (12)

  1. 　Ｃｌａｕｄｉｎ－５、Ｃｌａｕｄｉｎ－５をコードする核酸又はＣｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質を有効成分として含有する、血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  2. 　前記Ｃｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質が、スタチン系化合物である、請求項１に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  3. 　前記スタチン系化合物が、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトロバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチン及びロバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  4. 　前記スタチン系化合物が、フルバスタチンである、請求項３に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  5. 　前記Ｃｌａｕｄｉｎ－５発現誘導物質が、ＴＧＦ－β阻害剤である、請求項１に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  6. 　前記ＴＧＦ－β阻害剤が、ＳＢ５２５３３４、Ｒ２６８７１２、ＥＷ－７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＴＰ０４２７７３６、Ａ８３－０１及びＫ０２２８８からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  7. 　前記血管内皮バリア破綻がウイルスによるものである、請求項１から６のいずれか１項に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  8. 　前記ウイルスが、ＳＡＲＳコロナウイルス－２である、請求項７に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤。
  9. 　請求項１から８のいずれか１項に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含む、呼吸器感染症治療用医薬組成物。
  10. 　被験物質存在下で、肺微小血管内皮細胞を培養した後、前記肺微小血管内皮細胞のＣｌａｕｄｉｎ－５の発現量を測定することを含み、
    　前記Ｃｌａｕｄｉｎ－５の発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に上昇した場合に、前記被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す、血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法。
  11. 　空気を注入できるように構成された第１の流路を含む第１の基板と、
    　前記第１の基板の下層に配置されており、培地を透過し、細胞を透過しない大きさの貫通孔を複数有し、且つ、前記第１の流路の底面を構成するメンブレンと、
    　培地を注入できるように構成されており、平面視で少なくとも一部が前記第１の流路に重なるように構成されており、且つ、天面が前記メンブレンで構成される第２の流路を含み、前記メンブレンの下層に配置された第２の基板と、
    を積層してなる細胞培養容器を用いて、
    　前記第１の流路に、ウイルス又は細菌を感染させた気道上皮細胞を播種し、前記第２の流路に、肺微小血管内皮細胞を播種して、被験物質存在下で、前記気道上皮細胞と前記肺微小血管内皮細胞を共培養した後、前記肺微小血管内皮細胞の培養上清中の前記ウイルス又は細菌の数を測定することを含み、
    　前記ウイルス又は細菌の数が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少した場合に、前記被験物質が血管内皮バリア破綻の阻害剤であることを示す、血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法。
  12. 　前記ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルス－２である、請求項１１に記載の血管内皮バリア破綻の阻害剤のスクリーニング方法。
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