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WO2005079847A1 - Cdc42タンパク質の核内移行促進剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Cdc42タンパク質の核内移行促進剤及びそのスクリーニング方法 Download PDF

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WO2005079847A1
WO2005079847A1 PCT/JP2005/003008 JP2005003008W WO2005079847A1 WO 2005079847 A1 WO2005079847 A1 WO 2005079847A1 JP 2005003008 W JP2005003008 W JP 2005003008W WO 2005079847 A1 WO2005079847 A1 WO 2005079847A1
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WO
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inhibitor
protein
cdc42
hmg
cdc42 protein
Prior art date
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PCT/JP2005/003008
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French (fr)
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Takahide Kohro
Yoshikazu Sibasaki
Takao Hamakubo
Tatsuhiko Kodama
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Kowa Co Ltd
Nissan Chemical Corp
Original Assignee
Kowa Co Ltd
Nissan Chemical Corp
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Definitions

  • the present invention relates to an agent for promoting nuclear import of Cdc42 protein and a method for screening the same.
  • the present invention relates to an isoprenoid synthesis inhibitor and a Z or gera-rugeranyl transferase inhibitor
  • the present invention relates to an agent for promoting nuclear translocation of Cdc42 protein comprising an isoprenoid synthesis inhibitor and a Z or gera-rugeranyl transferase inhibitor, preferably an isoprenoid synthesis inhibitor, and more preferably an HMG-CoA reductase inhibitor.
  • the present invention relates to the use of the drug as a nuclear translocation promoter, a method for promoting the nuclear translocation of Cdc42 protein using the drug, and a pharmaceutical composition comprising the drug.
  • the present invention relates to a vascular therapeutic agent containing the Cdc42 protein nuclear translocation promoter as an active ingredient, and a method for screening a vascular therapeutic agent by measuring the nuclear translocation ability of Cdc42 protein.
  • GTP-binding protein is a generic term for proteins having endogenous GTP hydrolyzing activity, and a group of G proteins involved in mRNA translation, and a trimer G that is coupled to a seven-transmembrane receptor. Proteins and low molecular weight G proteins are known (Experimental Medicine 2003; 21: 1377-145). Among them, the low-molecular-weight G protein group has a subunit structure and has been reported as more than 100 types of proteins with a molecular weight of 21,30,000. It is involved in intracellular signaling as GTP-bound (on) and ZGDP-bound (off).
  • Rho family 1 regulates cellular functions through rearrangement of the actin cytoskeleton and, like the Ras family, is involved in regulating gene expression. Rho induces the formation of actin stress fibers and adhesion spots, Rac induces the formation of lamellipodia, and Cdc42 induces the formation of filamentous processes (filopodia).
  • Cdc42 a low-molecular-weight G protein belonging to the Rho family, is a protein with a molecular weight of 21 kDa and is involved in various cell activities such as filamentous process formation, cell adhesion, cell motility, cell polarity, and regulation of gene expression.
  • GTP-bound (GT P-bound) Cdc42 target proteins include PAK (p21-activated kinase), MRCK (.myotonic dystrophy kinase-related Cdc42 binding kinase), WAPS, and IwGAP1 I have.
  • Cdc42 regulates the expression of various genes through MAP kinase cascade by PAR activation, and is involved in the formation of focal contacts and filamentous processes (filopodia) in association with WASP and MRCK. It also controls intercellular adhesion in relation to IQGAP1.
  • HMG-CoA (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA) reductase inhibitors catalyze the early rate-limiting step in cholesterol biosynthesis, that is, the conversion of HMG-CoA to mevalonic acid. It is known to be an inhibitor of the enzyme that causes hypercholesterolemia.
  • HMG-CoA reductase inhibitors have been shown to reduce the incidence of atherosclerotic disease in large-scale studies, but overlap analysis and other studies show that HMG-CoA reductase inhibitors It has been shown that, apart from the cholesterol lowering effect exerted by inhibiting cholesterol, an effect exerted on the blood vessel wall is involved.
  • HMG-CoA reductase inhibitor inhibits HMG-CoA reductase in vascular wall cells and reduces the activity of low-molecular-weight G protein through the action of decreasing isoprenoid production, It is thought to have various effects on cell function and to inhibit arteriosclerosis by showing an anti-inflammatory response in the blood vessel wall.
  • HMG-CoA reductase inhibitors inhibit endothelial cell activation, improve endothelial function, inhibit or improve adhesion of monocyte Z macrophages and foam, and inhibit smooth muscle migration and proliferation. Forces having effects such as suppression and plaque stabilization, etc. It has been reported that these effects involve Rho, Rac, and Cdc42, which are low-molecular-weight G proteins of the Rho subfamily.
  • the endothelial function-improving effect of the HMG-CoA reductase inhibitor is remarkably manifested in a short time after the start of administration, and is considered to be important among various actions.
  • the present inventors examined the effect of pitapastatin, an HMG-CoA reductase inhibitor, on gene expression in vascular endothelial cells, and examined the effects of pitapastatin on the inflammatory site force-in IL-8 and MCP- Suppresses the expression of NO1, endothelin, and PAI-1 while promoting the expression of NO synthase involved in vasodilation and contraction, and the expression of thrombomodulin in the coagulation and fibrinolysis system (J. Atheroscler. Thromb. , 2002; 9: 178-183) and suppressing the expression of PTX3 (which promotes the expression of TF and is an indicator of atherosclerosis progression) (J. Atheroscler. Thromb., 2004; 11: 62-183). I've found it.
  • the present invention relates to an isoprenoid synthesis inhibitor and an HMG-CoA reductase inhibitor, which is one type of an isoprenoid synthesis inhibitor, preferably an isoprenoid synthesis inhibitor, more preferably an isoprenoid synthesis inhibitor.
  • an isoprenoid synthesis inhibitor preferably an isoprenoid synthesis inhibitor, more preferably an isoprenoid synthesis inhibitor.
  • the present invention also relates to HMG-CoA reduction which is an isoprenoid synthesis inhibitor and one of Z or geranylgeral transferase inhibitors, preferably an isoprenoid synthesis inhibitor, more preferably one of isoprenoid synthesis inhibitors.
  • the present invention relates to the use of an enzyme inhibitor as a promoter of nuclear translocation of Cdc42 protein, and comprising administering to a cell an inhibitor of isoprenoid synthesis and a Z or gera-rugeral transferase inhibitor.
  • the present invention provides a vascular therapeutic agent comprising a Cdc42 protein nuclear translocation promoter as an active ingredient, a Cdc42 protein nuclear translocator promoter, and a vascular therapeutic drug comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a composition is provided.
  • the present invention provides use of an agent for promoting nuclear transfer of Cdc42 protein for the manufacture of a vascular therapeutic agent, and use of an effective amount of the agent for promoting nuclear transfer of Cdc42 protein required for the treatment and prevention of vascular disorders.
  • a method of treating and preventing vascular disorders consisting of administration to patients in need of treatment.
  • the present invention further provides a method for screening a vascular therapeutic agent, which comprises measuring the translocation of Cdc42 protein into the nucleus. More specifically, the present invention provides a screening method for a vascular therapeutic agent that expresses Cdc42 protein, adds a test substance to cells, and measures the translocation of Cdc42 protein into the nucleus. .
  • FIG. 1 is a photograph of a transformed cell cultured in the absence of pitapastatin, into which a gene encoding a fusion protein of green fluorescent protein (GFP) and Cdc42 was introduced, and observed by a fluorescence microscope.
  • GFP green fluorescent protein
  • FIG. 2 is a photograph of a transformed cell cultured in the presence of pytanostatin, into which a gene encoding a fusion protein of GFP and Cdc42 has been introduced, and observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 3 A gene encoding a fusion protein of GFP and Cdc42 was introduced, cultured in the presence of pytanostatin, and the nucleus was stained (red) by adding a nuclear dye, Hoechst. It is a photograph at the time of observing a transformed cell with a fluorescence microscope.
  • the present inventors measured the behavior of Cdc42 protein in HU VEC using an HMG-CoA reductase inhibitor, particularly pitapastatin.
  • an HMG-CoA reductase inhibitor particularly pitapastatin.
  • a gene encoding a fusion protein of Cdc42 and a fluorescent protein, GFP was introduced into HUVEC to prepare a transformed cell expressing the GFP-Cdc42 fusion protein.
  • the transformed cells were cultured, and the distribution state of intracellular Cdc42 with and without pitapastatin was observed as fluorescence by GFP.
  • FIG. 1 shows the distribution of Cdc42 in transformed cells cultured in the absence of pitapastatin. It is a photograph instead of a drawing which shows the result of having observed the cloth state with a fluorescence microscope. In Fig. 1, fluorescence from GFP can be observed over almost the entire area of the cells, indicating that Cdc42 protein is distributed throughout the transformed cells.
  • FIG. 2 the result of observing the distribution state of Cdc42 in the transformed cells cultured in the presence of pitapatin using a fluorescence microscope is shown in FIG. 2 by a photograph as a drawing.
  • FIG. 2 it can be observed that the GFP fluorescence is localized at a certain location of the cell.
  • Hoechst (Lydon M., et al, J. Cell Physiol, 102, 175-181 (1980); Sriram M., et. al., Biochemistry, 31, 11823-11834 (1992)).
  • FIG. 3 the nucleus stained with Hoechst was observed in red. This was consistent with the site where the GFP fluorescence was localized.
  • the Hoechst used here is a fluorescent dye having cell membrane permeability and specifically binds to the AT sequence in the minor groove of DNA. From the above experiments, it was shown that when vascular endothelial cells were treated with pitavastatin, GFP-Cdc42 translocated to the same position as the site stained by the nuclear staining dye Hoechst, ie, to the nucleus. Thus, it was found that the HMG-CoA reductase inhibitor had an effect of transferring intracellular Cdc42 protein to the nucleus.
  • the nuclear transfer promoter of the Cdc42 protein of the present invention is useful for the functions related to the Cdc42 protein: control of cell motility, cell polarity, intracellular signal transduction, gene expression, etc., particularly, control of gene expression in vascular wall cells. It has an important effect and is considered to be useful as a vascular treatment agent, particularly an endothelial cell function improving agent and a cell adhesion inhibitor.
  • Examples of the isoprenoid synthesis inhibitor which is a Cdc42 protein nuclear translocation promoter in the present invention include HMG-CoA synthase inhibitor (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
  • HMG-CoA reductase inhibitor HMG-CoA reductase inhibitor
  • AMPK activator such as fibrate
  • funaresyl pyrophosphate synthase such as N-containing bisphosphonate Inhibitors (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999; 264: 108-111).
  • examples of the gera-rugeranyltransferase inhibitor which is a Cdc42 protein nuclear translocation promoter in the present invention, include those described in known literature, such as those described in Biochemical Pharmacology 2000; 60: 1061-1068. it can. This Any of these enzyme inhibitors may have an activity capable of completely or partially inhibiting the activity of the target enzyme.
  • Lonostatin (Dani name: (+) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR) -l, 2, 3, 7, 8, 8a-Hexahydro-1,3,7-dimethyl- 8— [2— [( 2R, 4R) -tetrahydro-4-hydroxy-1oxo-2H-pyran-2-yl] ethyl] -1 naphthyl (S) 2-methylbutyrate (see U.S. Pat. No. 4,231,938);
  • Pravastatin (Dani name: (+) (3R, 5R) -3,5-dihydroxy-7— [(IS, 2S, 6S, 8S, 8aR) — 6-hydroxy-2-methyl-8— [(S) — 2 —Methylbutyryloxy] —1,2,6,7,8,8a-hexahydro-1naphthyl] heptanoic acid (see US Pat. No. 4,346,227));
  • Atorvastatin (Dani name: (3R, 5R) — 7— [2- (4 Fluorophenyl) -5 isopropyl 3-Fu-ru 4 Phenyl-carbamoyl 1H—Pyrrolo 1-yl] —3,5-Dihydro Xyheptanoic acid (see US Pat. No. 5,273,995);
  • a particularly preferred inhibitor is pitanostatin.
  • Another method for screening a vascular therapeutic agent which is characterized by measuring nuclear translocation of Cdc42 protein, according to the present invention, comprises labeling or staining Cdc42 protein and translocating it into the nucleus. And the like.
  • Methods for labeling Cdc42 protein include genetic engineering techniques. Specifically, using fluorescent proteins BFP, CFP, and YFP, including GFP (Atsushi Takawaki: Visualizing intracellular phenomena with fluorescent bioimaging. RIKEN-Use 255: September 2002) A method using a fusion protein of these with the Cdc42 protein may be mentioned.
  • Examples of a method for staining the Cdc42 protein include immunological techniques. Specifically, use of a fluorescent antibody or an enzyme antibody can be mentioned. In particular, a method in which a fusion protein of a fluorescent protein such as GFP and the Cdc42 protein is prepared by a genetic engineering technique and the nuclear translocation of the fusion protein is visually identified is preferable.
  • the Cdc42 protein nuclear translocation promoter of the present invention localizes the Cdc42 protein in the nucleus of cells in a test using various cells that can be used not only as a medicament for the prevention of treatment of vascular disorders. It can also be used as a reagent when it is desired to keep it. That is, it can be used not only as an active ingredient in medicine but also as a reagent for experiments and a reagent in diagnostics.
  • the vascular therapeutic agent of the present invention the above-described agent for promoting nuclear import of the Cdc42 protein of the present invention is used, or the agent comprises the agent for promoting nuclear import of the Cdc42 protein and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutical compositions for vascular treatment are included.
  • the administration route of the vascular therapeutic agent of the present invention includes, for example, oral administration using tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or intravenous injections, intramuscular injections, suppositories, inhalants. And parenteral administration using a percutaneous absorbent, eye drops, nasal drops and the like.
  • the active ingredient is used alone or in combination with other pharmaceutically acceptable excipients, binders, bulking agents, disintegrants, A surfactant, a lubricant, a dispersant, a buffer, a preservative, a flavoring agent, a fragrance, a coating agent, a carrier, a diluent and the like can be used in appropriate combination with one or more kinds.
  • oral administration is preferred as the administration route of the HMG-CoA reductase inhibitor.
  • the pH is adjusted in consideration of the stability of the active ingredient (Japanese Patent Laid-Open No. 2-6406, Japanese Patent No. 2,774,037, WO97Z23200, etc.). And incorporated herein by reference.).
  • the dose of these drugs varies depending on the weight, age, sex, symptoms, etc. of the patient.
  • the active ingredient is an isoprenoid synthesis inhibitor and Z or geranylgeral transferase inhibitor. It is preferred that 0.01 to 1000 mg, especially 0.1 to 100 mg, per day be orally administered once or in several divided doses.
  • a gene encoding the entire region of the translation region of Cdc42 was introduced into a predetermined position of a sales plasmid pEGF P-C1 for preparing a fusion protein of GFP and a desired protein, and the GFP-Cdc42 gene was obtained.
  • a plasmid containing was constructed.
  • FIG. 2 shows the results of fixing the cells thus prepared on a preparation and observing them with a fluorescence microscope.
  • Fig. 3 shows the results of staining the cells with a nuclear staining dye Hoechst.
  • the present invention relates to an agent for promoting nuclear translocation of Cdc42 protein, and it is known that Cdc42 protein is involved in proliferation of vascular endothelial cells and restoration of barrier function, and in endothelin signaling. And plays an important role in the development of vascular disease through regulation of the expression of various genes related to vasoconstriction 'expansion, inflammation and blood coagulation'fibrinolysis. It is extremely useful industrially as a drug for treating and preventing various vascular diseases.
  • the present invention also provides a method for screening a blood vessel therapeutic agent, which comprises measuring the translocation of Cdc42 protein into the nucleus, and develops a new therapeutic agent or a preventive agent for vascular disease. Industrially useful as a method for this.

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Abstract

　本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ＡＭＰＫ活性化剤、ファルネシルピロリン酸合成酵素剤等のイソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなるＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤、その使用、その方法に関する。また、本発明は、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤を有効成分とする血管治療剤及びＣｄｃ４２タンパク質の核内移行能を測定することによる、血管治療剤のスクリーニング方法に関する。

Description

明 細 書
Cdc42タンパク質の核内移行促進剤及びそのスクリーニング方法 技術分野
[oooi] 本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラ -ルゲラニル転移酵素阻害剤
、特にイソプレノイド合成阻害剤である HMG— CoA還元酵素阻害剤力 Cdc42タン ノ ク質の核内への移行を促進する作用を有することを見出したことに基づくものであ る。即ち、本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラ -ルゲラニル転移酵 素阻害剤、好ましくはイソプレノイド合成阻害剤、より好ましくは HMG— CoA還元酵 素阻害剤からなる Cdc42タンパク質の核内移行促進剤、同薬剤の核内移行促進剤 としての使用、同薬剤を用いた Cdc42タンパク質の核内移行を促進させる方法、同 薬剤を含有してなる医薬組成物に関する。また、本発明は、当該 Cdc42タンパク質 の核内移行促進剤を有効成分とする血管治療剤、及び Cdc42タンパク質の核内移 行能を測定することによる血管治療剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] GTP結合タンパク質 (Gタンパク質）は内在性の GTP加水分解活性をもつタンパク 質の総称であり、 mRNAの翻訳に関与する Gタンパク質群、 7回膜貫通型レセプター に共役する三量体 Gタンパク質群、低分子量 Gタンパク質群などが知られて 、る (実 験医学 2003 ;21 : 137-145)。この内、低分子量 Gタンパク質群はサブユニット構造をも たな 、分子量が 2万一 3万のタンパク質として、これまで 100種類以上報告されてお り、イソプレニルイ匕を受けた後に細胞膜に移行することで、 GTP結合型 (on) ZGDP 結合型 (off)として細胞内シグナル伝達に関与して 、る。
[0003] 低分子量 Gタンパク質群は、さらに、 Ras、 Rho、 Rab、 Arf及び Ranの五つのスー パーファミリーに分けられる (Physiol. Rev., 2001;81:153- 208)。この内、 Rhoファミリー は、 Rho、 Rac、 Cdc42などのサブファミリーにさらに分けられる。 Rhoファミリ一はァ クチン細胞骨格の再編成を介して細胞機能を制御し、 Rasファミリーと同様に遺伝子 発現の調節に関与している。そして、 Rhoはァクチンストレスファイバーや接着斑の、 Racはラメリポディアの、 Cdc42は糸状突起 (フイロポディア）の形成を誘導する。 [0004] Rhoファミリーに属する低分子量 Gタンパク質である Cdc42は、分子量 21kDaのタ ンパク質で、糸状突起の形成、細胞接着、細胞運動、細胞極性、遺伝子発現の制御 などの種々の細胞活動に関与する Gタンパク質である。 GTPと結合した活性型 (GT P結合型） Cdc42の標的タンパク質としては、 PAK(p21- activated kinase)、 MRCK (.myotonic dystrophy kinase- related Cdc42 binding kinase)、 WAPS、及び IwGAP 1などが知られている。すなわち、 Cdc42は、 PARの活性化による MAPキナーゼカ スケードを介して種々の遺伝子の発現を制御し、 WASPや MRCKと関連して接着斑 (focal contact)及び糸状突起（フイロポディア）の形成に関与し、また IQGAP1と関連 して細胞間接着を制御して 、る。
[0005] 一方、 HMG— Co A (3—ヒドロキシー3—メチルーグルタリルー Co A)還元酵素阻害剤 は、コレステロールの生合成における早期律速段階、すなわち HMG—CoAのメバロ ン酸への転換を触媒する酵素の阻害剤であり、高コレステロール血症治療剤として 知られている。 HMG— CoA還元酵素阻害剤は、大規模試験において動脈硬化疾 患の発症を低下させることが検証されているが、オーバーラップ解析などから、この発 症低下には、肝臓において HMG— CoA還元酵素を阻害することで発揮されるコレス テロール低下作用とは別に、血管壁において発揮される作用が関与していることが 示されてきている。
[0006] すなわち、 HMG— Co A還元酵素阻害剤は、血管壁細胞にお!、て HMG— CoA還 元酵素を阻害しイソプレノイド生成の低下作用を介して低分子量 Gタンパク質の活性 を低下させ、細胞機能に様々な影響を及ぼし、血管壁において抗炎症反応を示すこ とで、動脈硬化を抑制すると考えられている。
[0007] さらに、 HMG— CoA還元酵素阻害剤は、内皮細胞活性ィ匕の抑制、内皮機能の改 善、単球 Zマクロファージの接着や泡沫ィヒの抑制または改善、平滑筋の遊走'増殖 の抑制、プラークの安定ィ匕などの作用を有している力 これらの作用には、 Rhoサブ ファミリーの低分子量 Gタンパク質である Rho、 Rac、 Cdc42が関与することが報告さ れている。特に、 HMG - CoA還元酵素阻害剤の内皮機能改善効果は、服用開始後 短期間で著明に発現し、諸作用の中で重要と考えられて 、る。
[0008] 最近、血管壁におけるアンジォテンシン II、 PDGF、トロンビン、エンドセリン、ロイコ トリェン B4などが介在するシグナル伝達に Racが関与し、 NADPHの活性を亢進し て、血管病の進展に重要な役割を果たすことが明らかにされた (Am. J. Physiol. Cell Physiol, 2003;285:C723-734)が、 Cdc42についても、血管内皮細胞の増殖及びバ リア一機能の回復（J. Cell Sci" 2001;114:1343-55、 J. Biol. Chem.,
2002;277:4003-9., Circ. Res., 2004;94:159- 166)、さらにエンドセリンのシグナル伝 達 (J. Biol. Chem., 2003;278:29890-900)に関与していることが報告されるようになつ た。
[0009] さらに本発明者らは、 HMG— CoA還元酵素阻害剤であるピタパスタチンの血管内 皮細胞における遺伝子発現に及ぼす影響を検討し、ピタパスタチンが炎症性サイト 力イン IL—8や MCP—1の発現、エンドセリンの発現、 PAI— 1の発現をそれぞれ抑制 する一方、血管拡張.収縮に関与する NOシンターゼの発現、凝固線溶系のトロンボ モジュリンの発現を促進すること（J. Atheroscler. Thromb., 2002;9:178-183)、また PTX3 (TFの発現を促進、動脈硬化進展の指標になる）の発現を抑制すること (J. Atheroscler. Thromb., 2004;11:62- 183)を見出してきた。
発明の開示
[0010] 発明者らは、鋭意研究の結果、驚くべきことに、イソプレノイド合成阻害剤及び Z又 はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤処理、特に HMG - CoA還元酵素阻害剤処理 により、 Racと Cdc42が核内に移行することを見出し、本発明を完成した。
[0011] すなわち、本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラ -ルゲラニル転移 酵素阻害剤、好ましくはイソプレノイド合成阻害剤、より好ましくはイソプレノイド合成 阻害剤の 1種である HMG— CoA還元酵素阻害剤からなる Cdc42タンパク質の核内 移行促進剤に関する。
[0012] また本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラニルゲラ-ル転移酵素阻 害剤の、好ましくはイソプレノイド合成阻害剤の、より好ましくはイソプレノイド合成阻 害剤の 1種である HMG— CoA還元酵素阻害剤の、 Cdc42タンパク質の核内移行促 進剤としての使用に関し、またイソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラ -ルゲラ- ル転移酵素阻害剤を細胞に投与することからなる、 Cdc42タンパク質の核内への移 行を促進させる方法を提供する。 [0013] さらに本発明は、 Cdc42タンパク質の核内移行促進剤を有効成分とする血管治療 剤、 Cdc42タンパク質の核内移行促進剤及び製薬上許容される担体を含有してなる 血管治療用の医薬組成物を提供する。
[0014] また本発明は、 Cdc42タンパク質の核内移行促進剤の血管治療剤の製造のため の使用、及び治療'予防に必要な有効量の Cdc42タンパク質の核内移行促進剤を 血管障害の予防'治療を必要とする患者に投与することからなる血管障害の治療，予 防方法を提供する。
[0015] さらに本発明は、 Cdc42タンパク質の核内への移行を測定することを特徴とする血 管治療剤のスクリーニング方法を提供する。より詳細には、 Cdc42タンパク質を発現 して 、る細胞に被検物質を添加し、 Cdc42タンパク質の核内への移行を測定するこ と力もなる、血管治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]緑色蛍光タンパク質 (GFP)と Cdc42との融合タンパク質をコードする遺伝子を 導入して、ピタパスタチンの非存在下で培養した形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察 した写真である。
[図 2]GFPと Cdc42との融合タンパク質をコードする遺伝子を導入して、ピタノスタチ ンの存在下で培養した形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。
[図 3]GFPと Cdc42との融合タンパク質をコードする遺伝子を導入して、ピタノスタチ ンの存在下で培養し、さらに核染色色素へキスト (Hoechst)を添加して核を染色 (赤 色)した形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明者らは、 HMG— Co A還元酵素阻害剤、特にピタパスタチンを用いて、 HU VECにおける Cdc42タンパク質の挙動を測定した。そのために、 Cdc42と蛍光タン ノ ク質である GFPとの融合タンパク質をコードする遺伝子を HUVECに導入し、 GF P-Cdc42融合タンパク質が発現する形質転換細胞を調製した。この形質転換細胞 を培養し、ピタパスタチンの有無による細胞内 Cdc42の分布状態を、 GFPによる蛍 光として観察した。これらの結果を図 1一図 3に示す。
[0018] 図 1は、ピタパスタチンの非存在下で培養した形質転換細胞における Cdc42の分 布状態を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す、図面に代わる写真である。図 1では G FPによる蛍光が細胞のほぼ全域にわたって観察でき、 Cdc42タンパク質が形質転 換細胞全域に分布して ヽることが分かる。
[0019] 一方、ピタパスタチンの存在下で培養した形質転換細胞における Cdc42の分布状 態を蛍光顕微鏡で観察した結果を、図 2として図面に代わる写真で示す。図 2では、 GFPによる蛍光が細胞のある一箇所に局在して 、ることが観察できる。この Cdc42 の細胞内局在位置をさらに確認するために、上記細胞をへキスト（Hoechst) (Lydon M., et al, J. Cell Physiol, 102, 175—181 (1980); Sriram M., et al., Biochemistry, 31, 11823-11834 (1992))で染色した結果を、図 3として図面に代わる写真で示す。図 3では、へキストで染色された核が赤く観察されている力 これは GFPによる蛍光が 局在化して 、る部位と一致して 、た。
[0020] ここで使用したへキストは、細胞膜透過性を有する蛍光色素であり、 DNAの副溝の AT配列に特異的に結合するものである。以上の実験から、血管内皮細胞をピタバス タチンで処理すると、 GFP— Cdc42が核染色色素へキストによる染色部位と同位置 に、すなわち核に移行することが示された。この様に、 HMG— CoA還元酵素阻害剤 は、細胞内の Cdc42タンパク質を核に移行させる作用を有していることが判明した。
[0021] 本発明の Cdc42タンパク質の核内移行促進剤は、 Cdc42タンパク質の関わる作 用：細胞運動、細胞極性、細胞内シグナル伝達、遺伝子発現などの制御、特に血管 壁細胞における遺伝子発現の制御に重要な影響を及ぼし、血管治療剤、特に内皮 細胞機能改善剤、細胞接着阻害剤として有用であると考えられる。
[0022] 本発明における Cdc42タンパク質の核内移行促進剤であるイソプレノイド合成阻害 剤としては、 HMG— CoA合成酵素阻害剤 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
1987;84:7488-92), HMG— Co A還元酵素阻害剤、フイブラート等の AMPK活性化 剤 (Biochem. Soc. Trans., 1997;25:S676)、 N含有ビスホスホネート等のフアルネシル ピロリン酸合成酵素阻害剤 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999;264:108- 111)な どを挙げることができる。また、本発明における Cdc42タンパク質の核内移行促進剤 であるゲラ -ルゲラニル転移酵素阻害剤としては、公知の文献、例えば Biochemical Pharmacology 2000; 60:1061-1068等に記載されたものなどを挙げることができる。こ れらの酵素阻害剤は、対象となる酵素の活性を完全に又は部分的に阻害することが できる活性を有するものであればょ 、。
より具体的には、以下の化合物を挙げることができる。
ロノ スタチン（ィ匕学名：（ + ) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR)-l, 2, 3, 7, 8, 8a—へキ サヒドロ一 3, 7—ジメチルー 8— [2— [ (2R, 4R)—テトラヒドロー 4—ヒドロキシ一 6 ォキソ 2H—ピラン 2—ィル]ェチル ]ー1 ナフチル (S) 2—メチルプチレート（米国特許第 4, 231, 938号参照））；
シンパスタチン（ィ匕学名：（ + ) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR)-l, 2, 3, 7, 8, 8a—へ キサヒドロ一 3, 7 ジメチルー 8— [2— [ (2R, 4R)—テトラヒドロー 4ーヒドロキシー 6 ォキソ 2H—ピラン 2—ィル]ェチル ]ー1 ナフチル 2, 2—ジメチルブタノエート（米国特許 第 4, 444, 784号参照））；
プラバスタチン（ィ匕学名：（ + ) (3R, 5R)-3, 5—ジヒドロキシー 7— [ (IS, 2S, 6S, 8S, 8aR)— 6—ヒドロキシー 2—メチルー 8— [ (S)— 2—メチルブチリルォキシ ]—1, 2, 6, 7, 8, 8a—へキサヒドロー 1 ナフチル]ヘプタン酸（米国特許第 4, 346, 227号参照） ) ;
フルパスタチン（ィ匕学名：（3RS, 5SR, 6E)— 7— [3— (4 フルオロフェ-ル）— 1— (1 ーメチルェチル)—1H インドールー 2 ィル]—3, 5—ジヒドロキシー 6 ヘプテン酸（米 国特許第 5, 354, 772号参照)）；
アトルバスタチン（ィ匕学名： (3R, 5R)— 7— [2— (4 フルオロフェ-ル )—5 イソプロ ピル 3—フエ-ルー 4 フエ-ルカルバモイルー 1H—ピロルー 1 ィル]—3 , 5—ジヒドロ キシヘプタン酸 (米国特許第 5, 273, 995号参照)）；
セリバスタチン（ィ匕学名： (3R, 5S)—エリスロー (E)—7—[4—(4—フルオロフヱ-ル) 2, 6—ジイソプロピル 5—メトキシメチルーピリジン— 3 ィル]—3, 5—ジヒドロキシー 6— ヘプテン酸 (米国特許第 5, 177, 080号参照)）；
メパスタチン（ィ匕学名：（ + ) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR)-l, 2, 3, 7, 8, 8a—へキ サヒドロ一 7—メチルー 8— [2— [ (2R, 4R)—テトラヒドロー 4ーヒドロキシー 6 ォキソ 2H— ピラン 2 ィル]ェチル] 1 ナフチル （S)— 2 メチルプチレート (米国特許第 3, 9 83, 140号参照）)； ロスパスタチン（ィ匕学名： 7— [4— (4—フルオロフェ-ル）一6 イソプロピル 2— (N—メ チルー N メタンスルホ -ルァミノピリミジン) 5—ィル]一（3R, 5S)ージヒドロキシー (E) - 6 ヘプテン酸 (米国特許第 5, 260, 440号、日本国特許第 2, 648, 897号参照）） ピタパスタチン（（3R, 5S, 6E)— 7— [2—シクロプロピル 4— (4—フルオロフェ -ル） —3 キノリル]— 3, 5—ジヒドロキシー 6 ヘプテン酸（米国特許第 5, 856, 336号、 日 本国特許第 2, 569, 746号参照)）
これらは、製剤学的に必要であれば塩や溶媒和物として使用することもできる。特 に好まし ヽ阻害剤はピタノくスタチンである。
[0024] また、もうひとつの本発明である、 Cdc42タンパク質の核内移行を測定することを特 徴とする血管治療剤のスクリーニング方法としては、 Cdc42タンパク質を標識又は染 色し、その核内移動を同定する方法などが挙げられる。 Cdc42タンパク質を標識す る方法としては、遺伝学工学的手法が挙げられる。具体的には、 GFP (宫脇敦史:蛍 光バイオイメージングで細胞内現象を可視化する.理研-ユース 255： 2002年 9月） をはじめとする蛍光タンパク質 BFP、 CFP及び YFPなどを利用して、これらと Cdc42 タンパク質との融合タンパク質を利用する方法が挙げられる。また、 Cdc42タンパク 質を染色する方法としては、免疫学的手法などが挙げられる。具体的には、蛍光抗 体又は酵素抗体の利用が挙げられる。特に、遺伝学工学的手法により、 GFP等の蛍 光タンパク質と Cdc42タンパク質との融合タンパク質を用意し、該融合タンパク質の 核内移行を視覚的に同定する方法が好ましい。
[0025] 本発明の Cdc42タンパク質の核内移行促進剤は、医薬として血管障害の治療'予 防に使用されるだけでなぐ各種の細胞を用いた試験において Cdc42タンパク質を 細胞の核内に局在させておきたいときの試薬として使用することもできる。即ち、医薬 における有効成分として使用されるだけでなぐ実験用の試薬や診断薬における試 薬などとして使用することもできる。
[0026] 本発明の血管治療剤としては、前記した本発明の Cdc42タンパク質の核内移行促 進剤を用いるか、あるいは同核内移行促進剤と製薬学的に許容される担体とからな る血管治療用の医薬組成物が挙げられる。 [0027] 本発明の血管治療剤の投与経路としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散 剤、シロップ剤等による経口投与、又は静脈内注射剤、筋肉内注射剤、坐剤、吸入 剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。
[0028] また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、 又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢 剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を 1種又はそ れ以上と適宜組み合わせて用いることができる。
[0029] 特に、 HMG-CoA還元酵素阻害剤の投与経路としては経口投与が好ま 、。経 口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮して pHを調整 (特開 平 2— 6406号、日本国特許第 2, 774, 037号、 WO97Z23200号等。これらの文 献を参照して本明細書に取り込む。）するのが好ま 、。
[0030] これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって異なるが、通 常成人の場合、有効成分をイソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラニルゲラ-ル 転移酵素阻害剤として、一日 0. 01— 1000mg、特に 0. 1— lOOmgを、 1回又は数 回に分けて経口投与するのが好ま U、。
[0031] 実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこの実施例により何ら 限定されるものではない。
実施例 1
[0032] GFPと所望のタンパク質との融合タンパク質を調製するための巿販プラスミド pEGF P— C1の所定の位置に、 Cdc42の翻訳領域の全領域をコードする遺伝子を導入して 、 GFP-Cdc42遺伝子を含有するプラスミドを構築した。
1 X 10 個の HUVECを 6ゥエルのプレートに播種した後、 1夜 EGM— 2培地で培 養した。この細胞に、フゲネ 6 (Fugene6)を用いて、前記で調製したプラスミド構築物 DNAを 1ゥエル当たり 0. 添加した。さらに 21時間 EGM— 2培地で培養した後、 GFPによる蛍光を蛍光顕微鏡で観察した結果を図 1に示す。
一方、プラスミド構築物 DNAを添加した HUVECの培養を開始してから 6時間後に 、ピタパスタチンを最終濃度が 1 Mとなるように添加し、さらに静置して 15時間培養 した細胞をプレパラート上に固定し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図 2に示す。さら に、この細胞を核染色色素へキストで染色した結果を図 3に示す。
産業上の利用可能性
本発明は、 Cdc42タンパク質の核内移行促進剤に関するものであり、 Cdc42タン ノ ク質は、血管内皮細胞の増殖及びバリアー機能の回復、又エンドセリンのシグナ ル伝達に関与していることが知られており、又、血管収縮'拡張、炎症、血液凝固 '線 溶に関わる種々の遺伝子の発現調節を介して血管病の進展に重要な役割を果して いるものであることから、本発明の薬剤は、各種の血管病の治療や予防のための医 薬として産業上の極めて有用なものである。
また、本発明は、 Cdc42タンパク質の核内への移行を測定することを特徴とする血 管治療剤のスクリーニング方法を提供するものであり、血管病の新たな治療薬ゃ予 防薬を開発するための手法として産業上有用である。

Claims

請求の範囲
[I] イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤を含有して なる、 Cdc42タンパク質の核内移行促進剤。
[2] イソプレノイド合成阻害剤力 HMG— CoA合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵 素阻害剤、 AMPK活性化剤又はフアルネシルピロリン酸合成酵素剤である、請求の 範囲第 1項に記載の Cdc42タンパク質の核内移行促進剤。
[3] HMG— CoA還元酵素阻害剤がピタパスタチンである、請求の範囲第 2項に記載の
Cdc42タンパク質の核内移行促進剤。
[4] イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤の Cdc42 タンパク質の核内移行促進剤としての使用。
[5] イソプレノイド合成阻害剤力 HMG— CoA合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵 素阻害剤、 AMPK活性化剤又はフアルネシルピロリン酸合成酵素剤である、請求の 範囲第 4項に記載の Cdc42タンパク質の核内移行促進剤としての使用。
[6] HMG— CoA還元酵素阻害剤がピタパスタチンである、請求の範囲第 5項に記載の
Cdc42タンパク質の核内移行促進剤としての使用。
[7] イソプレノイド合成阻害剤及び Z又はゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤を細胞に 投与することからなる、 Cdc42タンパク質の核内移行を促進させる方法。
[8] イソプレノイド合成阻害剤力 HMG— CoA合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵 素阻害剤、 AMPK活性化剤又はフアルネシルピロリン酸合成酵素剤である、請求の 範囲第 7項に記載の方法。
[9] HMG— CoA還元酵素阻害剤がピタパスタチンである、請求の範囲第 8項に記載の 方法。
[10] 請求の範囲第 1項一第 3項のいずれかに記載の Cdc42タンパク質の核内移行促 進剤及び製薬上許容される担体を含有してなる血管治療用の医薬組成物。
[II] 請求の範囲第 1項一第 3項のいずれかに記載の Cdc42タンパク質の核内移行促 進剤の血管治療剤の製造のための使用。
[12] 治療 '予防に有効量の請求の範囲第 1項一第 3項のいずれかに記載の Cdc42タン パク質の核内移行促進剤を血管障害の予防'治療を必要とする患者に投与すること からなる血管障害の治療 ·予防方法。
[13] Cdc42タンパク質を発現している細胞に被検物質を添カ卩し、 Cdc42タンパク質の 核内への移行を測定することからなる血管治療剤のスクリーニング方法。
[14] Cdc42タンパク質が蛍光蛋白質との融合タンパク質の形態である、請求の範囲第 1 3項に記載のスクリーニング方法。
[15] Cdc42タンパク質の核内への移行の測定が蛍光観察によるものである、請求の範 囲第 13項または第 14項に記載のスクリーニング方法。
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